CN101365804A - 活化的分裂多肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及活化的分裂多肽片段的制备方法，该多肽片段在重新构建时立即形成一种活性蛋白。该方法涉及蛋白的实时互补。本发明还包括分裂和制备处于活化状态的分裂荧光蛋白的方法，该分裂蛋白在重组时立即产生荧光信号。本申请还提供使用本发明的新的活化的分裂多肽片段来实时检测核酸、非核酸分析物以及核酸杂交的方法。

Description

活化的分裂多肽及其制备方法和用途

相关申请的交叉参考

本申请根据35 U.S.C.119(e)要求于2005年10月27日递交的第60/730,752号美国临时专利申请的优先权，该申请的内容在此全文引入作为参考。

领域

本发明提供新的活化的分裂多肽蛋白，用于快速生物分子蛋白互补，以及该活化的分裂多肽蛋白的制备方法和用途。

背景

蛋白互补是一种相对较新的方法，在该方法中，蛋白分裂成两个或两个以上的无活性片段，该无活性片段能够重新组装来形成活性蛋白。使用无活性分裂多肽片段的一个局限在于重组，它们需要进行再折叠和重新组装从而形成活性蛋白。这些差的折叠性质限制了无活性分裂多肽在以快速动力学实时检测生物分子相互作用的方法中蛋白互补中的使用。

目前，GFP及其众多的相关荧光蛋白被广泛地用作蛋白标记试剂(用于综述，参见Verkhusha等人，2003，第18章，第405-439页)。此外，GFP已经被用作末端融合的测试蛋白的溶解性指示物(Waldo等人，1999，Nat.Biotechnol.17：691-695；美国专利No.US 6,448,087)。GFP样蛋白是同源的扩展家族，是共同具有保守的11条β链的“桶”结构的25-30kDa多肽。GFP样蛋白家族目前包括约100个成员，克隆自各种珊瑚虫类和水螅纲类，并且包括红色的、黄色的和绿色的荧光蛋白以及多种无荧光的染色体蛋白(Verkhusha等人，见上文)。广泛的各种荧光蛋白标记分析方法和试剂盒可以商业购买得到，其中包括广谱的GFP光谱变体和GFP样荧光蛋白，包括DsRed和其它红色荧光蛋白(Clontech，Palo Alto，Calif；Amersham，Piscataway，NJ.)。

用于改善GFP和相关蛋白的溶解性的多种策略已经被记载，并由此导致产生许多具有改进的折叠性能、溶解性和干扰耐受性的突变体。现有的蛋白标记和检测平台是十分有效的，但是存在缺点。分裂蛋白标记会干扰(perturb)蛋白的溶解性(Ullmann，Jacob等人，1967；Nixon和Benkovic 2000；Fox，Kapust等人，2001；Wigley，Stidham等人，2001；Wehrman，Kleaveland等人，2002)或者在活细胞中不起作用(Richards和Vithayathil 1959；Kim和Raines 1993；Kelemen，Klink等人，1999)。绿色荧光蛋白融合物会发生错误折叠(Waldo，Standish等人，1999)或者其加工会发生改变(Bertens，Heijne等人，2003)。含砷荧光团FLaSH或ReASH(Adams，Campbell等人，2002)基底能够克服许多这些缺陷，但是它需要聚半胱氨酸标记基序，还原环境，以及细胞转染或渗透作用(Adams，Campbell等人，2002)。

GFP片段重组系统已经被描述，主要是用于检测蛋白与蛋白之间的相互作用，但是没有任何一个系统能够无需辅助地自组装成正确折叠的、可溶性和荧光性的重组GFP。此外，在这些方法中还没有产生通用的分裂GFP折叠报道系统。例如，Ghosh等人在2000年报道了对应于所述GFP结构中的氨基酸1-157和158-238的两个片段，在体外或者在大肠杆菌中共表达，当将这两个单独片段融合成能够形成反向平行亮氨酸拉链结构的卷曲螺旋序列时，上述两个GFP片段能够重组得到一种荧光性的产物(Ghosh等人，2000，J.Am.Chem.Soc.122：5658-5659)。同样地，美国专利No.US6,780,599描述了能够形成反向平行的亮氨酸拉链结构的卷曲螺旋用于将所述GFP分子的分裂片段连接在一起的用途。但是，该方法需要花费两天时间来获得阳性信号，因此在使用上太不切合实际。

类似地，Hu等人在2002年指出，当将相互作用的蛋白bZIP和Rel融合到GFP的两个片段上时，能够通过它们的相互作用来介导GFP的重组(Hu等人，2002，Mol.Cell 9：789-798)。2001年，Nagai等人指出，将黄色荧光蛋白(YFP)的片段融合到钙调蛋白和M13上，在钙离子存在下能够介导YFP重组(Nagai等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：3197-3202)。在该途径的各种变化形式中，Ozawa等人通过自剪接内含肽的多肽序列，将钙调蛋白和M13融合到两个GFP片段上，当存在钙离子时从而能够介导GFP片段共价重组(Ozawa等人，2001，Anal.Chem.72：5151-5157；Ozawa等人，2002Anal.Chem.73：5866-5874)。

尽管前述GFP重组系统提供使用两种光谱上不同的荧光蛋白标记的好处，但是它们受限于所述片段的大小以及相应较差的折叠性能(Ghosh等人，Hu等人，同上文)，要求化学连接(chemical ligation)以及共表达或者共同再折叠来生成可检测的折叠和荧光性的GFP(Ghosh等人，2000；Hu等人，2001，见上文)。

较差的折叠性能限制了这些片段和其它无活性分裂多肽片段的应用，这是由于它们具有减少的荧光性或者在体内花费太长时间来发出荧光以至于不能被用于实时分析。此外，这种片段也不能用于要求各个片段在互补前具有长期稳定性和溶解性的体外分析中。

分裂荧光多肽的制备，将消除用于生成所述活性蛋白的滞后时间，并且能够用于实时的蛋白互补分析，所述多肽在形成活性蛋白的重组方面不需要被再折叠。

理想的分裂多肽片段是可以被遗传编码的，可以在体内和体外进行，提供了灵敏的可逆分析信号，并且立即生成活性蛋白并且由此生成针对靶点识别的信号。然而，迄今还未描述有能够有效地实现实时蛋白互补目的的已活化分裂多肽片段。

发明概述

本发明涉及一种用于实时检测靶核酸分子的新系统，所述靶核酸分子包括DNA、RNA靶点，以及核酸类似物和非核酸分析物。特别地，本发明包括一种分子以及用于其制备的方法和用途。本发明的分子能够i)通过活化的分裂多肽的重组实时检测核酸和非核酸分析物，并且在识别和检测之间几乎没有或是没有滞后时间；和ii)在对其靶点分子如核酸或分析物的检测进行响应时，可逆地增加和减少其信号。在一个实施方案中，该分子基于活化分裂多肽片段的由杂交引发的互补，该活化的分裂多肽片段在重组时立即形成活性蛋白。在另一个实施方案中，该分子基于分裂多肽片段对靶点分析物的结合。用于蛋白互补方法的蛋白可以是任何能够分裂成片段并且能够重组形成活性蛋白的蛋白，特别是生成具有荧光性酶促活性的活性蛋白的标记蛋白，所述荧光性是例如荧光活性或显色活性。在一个实施方案中，所述分裂多肽是荧光蛋白或多肽，其中一个所述的分裂荧光性片段含有预先形成的发色团。在这样的一个实施方案中，由于所述发色团已经形成并处于其成熟构象中，其不需要等待直至发色团形成来产生荧光信号。

本发明的分子对于实时监测各种生物分子的应用是有用的，例如核酸诊断、病原体监测和生物计算。

本发明的所述活化分裂多肽包括任何能够分裂并在重新组合时立即形成活性蛋白的多肽。这种活化的分裂多肽包括，例如具有酶促活性或荧光活性的蛋白，例如具有显色活性的酶或者荧光蛋白。

本发明一方面包括含有成熟的预先形成的发色团的活化荧光多肽片段的制备，当与其相应的荧光多肽伴侣结合时能够立即产生荧光，但是处于非结合状态时无荧光。在一个实施方案中，所述发色团在该片段中是非荧光性的，这是由于该片段暴露于溶剂中并被溶剂淬灭，并且缺乏与其它片段的氨基酸的必要接触。当所述两个蛋白片段通过核酸互补性的相互作用来接近时，所述第二多肽作为屏蔽物将所述发色团与溶液分离并且使得所有缺少的氨基酸接触得到恢复，这导致荧光立即产生。在一个所述片段中预先形成发色团的存在，使得在与其互补蛋白片段结合下实际上立即产生荧光。立即产生荧光是因为所述发色团已经形成，由此消除了用于其正确折叠和形成所需要的延迟时间。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备分裂多肽分子的新方法，在本文中也被称作为生物分子的构建。该方法用于活化的分裂多肽片段的体外分离，例如，所述发色团已经存在于一个片段中的分裂荧光蛋白。特别地，所述分裂多肽片段在大肠杆菌中作为融合蛋白被表达，该融合蛋白具有小的自分裂Ssp DNAB内含肽。将这些多肽在再折叠后从内含体中分离，所述再折叠使得例如在一个片段中的发色团成熟，但是不具有荧光性。由于在使得蛋白纯化而不会使蛋白变性的变性条件下，包含于内含体中的大部分物质容易溶解，从宿主细胞多肽和其它宿主细胞衍生的杂质中以高效方式来纯化含有活化分裂多肽蛋白的内含体是可能的。内含肽促进蛋白纯化，并且不改变所述分裂多肽蛋白片段的结构。除了内含肽之外的肽是本领域技术人员已知的，并且可用于本发明的纯化方法中。

在某些实施方案中，所述分裂多肽片段是分裂荧光蛋白，一个片段含有活性但处于无荧光状态的成熟的预先形成的发色团。对处于其成熟的但是无活性状态中的发色团的分离使得在与相应片段互补时能够立即检测荧光。

在一个实施方案中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)或者增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。在选择性实施方案中，所述荧光蛋白是黄色荧光蛋白(YFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、增强的蓝绿色荧光蛋白(ECFP)或者红色荧光蛋白(dsRED)或者任何其它上面列举的天然或遗传工程化的荧光蛋白。而在进一步的实施方案中，所述重组荧光蛋白包含片段的混合物，这些片段来自相同的上述荧光蛋白或者或者上述荧光蛋白的任意组合。

在所述荧光蛋白是EGFP的实施方案中，EGFP蛋白分裂成α片段(大约是氨基酸1-158)和β片段(大约是氨基酸159-239)。α片段含有成熟发色团，其不能够单独地发出荧光，但是当与β片段配对时将会发出荧光。由于发色团是预先形成的，其能够立即发出荧光。重要的是，在缺乏便利的结合时，α片段和β片段不会重新组合或发出荧光。此外，重新组装的EGFP具有一个激发/发射最大值，与EGFP的488/507nm相比，该最大值红移至490/524nm。而且，在Mg²⁺存在时，本文所述的重新组装的EGFP是稳定的。

在本发明选择性的实施方案中，活化的分裂多肽片段包含活性酶的片段，可用酶活性测定法来检测。在这样的实施方案中，所述酶活性是通过显色反应或荧光反应来检测。在一个实施方案中，所述酶是二氢叶酸还原酶或者β-内酰胺酶。

本发明的另一个方面是活化的分裂多肽分子。在一个实施方案中，该分子包含至少两个活化的分裂多肽片段，所述片段各自偶联到核酸结合部分或者核酸结合基序上。核酸结合部分可以是例如但是不限于核酸如DNA、RNA，以及核酸类似物例如PNA、LNA和其它类似物和寡核苷酸，特异于所期望的核酸靶点。在一个实施方案中，所述核酸结合部分是寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述核酸结合部分可以是核酸结合性蛋白、多肽或肽。所述核酸结合部分被偶联到至少两个活化的分裂多肽片段上，并且它们与最邻近的靶核酸结合，便于立即形成所述活性蛋白和立即产生信号。在活化的分裂多肽分子包含活化的分裂荧光性片段处，所述活化的荧光性片段的紧密结合导致立即产生荧光。所述核酸结合部分可以通过独立发挥作用与靶核酸结合或者协同结合到单个位点上。在一个实施方案中，所述靶核酸可以是例如DNA、RNA、PNA或者核酸的类似物或者变体。

在本发明的一个实施方案中，核酸结合部分通过柔性接头结合到所述活化的分裂多肽片段上。在一个实施方案中，接头是生物素-链霉抗生物素化学(参见，例如图1)。在这样的实施方案中，可以将所述的两个荧光性片段分别在C-末端和N-末端以额外的半胱氨酸残基底来表达，用巯基反应性试剂：生物素-HPDP来进行生物素化。然后C-末端和N-末端生物素化的多肽可以与生物素化的核酸结合部分偶联，例如通过链霉抗生物素处理的寡核苷酸。链霉抗生物素是一种作为接头的高度亲合性的生物素结合性蛋白。在选择性的实施方案中，对柔性接头的修饰包括将每一多肽的N-末端氨基酸和/或C-末端的氨基酸变为半胱氨酸，并且所述核酸结合部分(或者寡核苷酸)3′末端或5′末端的巯基基团使其偶联至N-末端和/或C-末端的半胱氨酸。

在选择性的实施方案中，偶联到本发明的荧光蛋白片段上的核酸结合性部分可以是其它核酸结合性分子，作为非限制性的例子，PNAs、适体、RNA等等。在另一个实施方案中，所述核酸结合部分可以是RNA-或DNA-结合性蛋白。所述荧光蛋白可以是两个无活性片段，所述片段连接到核酸结合基序上，其中所述核酸结合基序可以独立起作用或者协同结合到单一位点上。荧光蛋白重新组合成全长蛋白将仅仅发生于靶点结合位点存在时，例如，RNA-结合性蛋白相互作用到所述RNA上的同类结合位点上。该相互作用将使荧光蛋白的两个部分结合在一起，以便进行信号检测。

本发明的另一个方面是活化的分裂多肽分子，其包含至少两个活化的分裂多肽片段，所述片段各自偶联到非核酸分析物的结合基序上。这样的非核酸结合基序可以是例如但是不限于蛋白、多肽或肽。在其它实施方案中，用于非核酸分析物的结合基序可以是例如生物分子、有机分子或者无机分子。在这样的实施方案中，所述靶点分析物可以是例如生物分子、无机分子或有机分子，或其变体。

当使用荧光蛋白时，所述荧光蛋白可以选自包含如下的组：绿色荧光蛋白(GFP)、GFP样荧光蛋白(GFP样)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、增强的蓝绿色荧光蛋白(ECFP)，以及红色荧光蛋白(dsRED)及其变体。

在一个实施方案中，所述活化的分裂多肽分子提供用于实时检测核酸分子的方法。靶核酸分子可以是DNA、RNA以及核酸类似物。靶核酸可以是单链或双链的。在一些实施方案中，所述靶核酸可以在暴露于所述分裂荧光分子之前被扩增。例如，可以使用滚环扩增(RCA)来生成具有多样化相同杂交位点的单链DNA靶点，其结合至所述互补复合物的探针上。

在一个实施方案中，所述结合部分结合到靶核酸上的两个相邻序列上，这样一个核酸结合部分结合至第一个靶序列，而第二个核酸结合部分结合至第二个靶序列。在该实施方案中，相邻序列相互足够接近，使得当两个结合部分结合到靶点上时，第一多肽和第二多肽发生相互作用，使得所述荧光性片段发生互补。该实施方案提供对单链和双链靶核酸的检测。为了检测双链的核酸靶点，所述单链探针与所述双链靶点发生相互作用以形成三链体。

在选择性的实施方案中，两个核酸结合部分是核酸或寡核苷酸，并结合到单链靶核酸的相同序列上，形成三链体。在该实施方案中，当两个结合部分与核酸靶点上的相同序列相互作用时，所述荧光性片段发生互补。

在提供三链体形成的实施方案中，所述探针可以是寡核苷酸或多肽。优选地，三链体形成性的寡核苷酸富含GC。优选地，三链体是嘌呤三链体，由嘧啶-嘌呤-嘌呤组成。

在一个实施方案中，本发明提供用于实时检测存在于样品中的靶核酸的存在和/或其数量的方法。在杂交条件下，将含有靶核酸的样品与分裂的荧光分子接触，当所述核酸结合部分与靶核酸结合时，分裂的荧光性片段发生互补并立即产生荧光。荧光的存在和/或荧光的大小指示靶核酸的存在和/或靶核酸的数量。

本发明还提供用于分离样品中的靶核酸的方法，甚至是在非靶序列存在的情况下。

在另一个实施方案中，本发明方法可以进行实时的核酸诊断。尤其是样品中病原性核酸的检测。在一个实施方案中，将核酸诊断学用于病毒核酸的实时检测。在这样的实施方案中，对本发明的分子进行设计，从而将分裂的荧光蛋白结合到核酸结合部分或寡核苷酸上，所述核酸结合部分或寡核苷酸特异于特定的病毒核苷序列或者由病毒核苷序列引起的核苷序列异常。

在选择性的实施方案中，本发明的分子可以进行核酸杂交中变化的立即检测。例如，在靶核酸存在下，活化的分裂多肽的两部分结合，以立即形成活性蛋白并因此实时产生信号。特别地，在分子分裂多肽片段包含活化的分裂荧光性片段时，立即产生荧光信号，但是，如果难以获得靶核酸，例如，当存在过量的竞争性抑制剂时，所述活性蛋白发生分解，信号消失并不再被检测到。通过信号和/或荧光的减少可以检测到分解，并且这样的检测是立即的。在本领域中，已有技术中目前还做不到分子水平上对分解进行立即检测。

在另一个实施方案中，本发明提供用于实时立即检测寡核苷酸杂交的方法，该寡核苷酸作为偶联到活化的分裂多肽片段上的核苷酸结合部分。例如，局部加热(如Hamad-Schifferli等人，Nature，415卷，2002年1月10日中所述，该文献在此全文引入作为参考)可用于使被结合的寡核苷酸变性，从而使荧光淬灭。本发明的蛋白片段是独特的因为当其处于分离状态时，所述活性蛋白的信号立即猝灭或者得以改善。本发明的蛋白片段是独特的还因为如果寡核苷酸发生重新组合时，该信号立即重新产生。在该实施方案中，使用本发明的分子可以有效地进行并记录各种需要进行多次开关循环的分析中的结果，并且可以实时从视觉上观察核酸杂交事件。此外，本发明的方法能够筛选干扰或促进杂交和/或妨碍核酸杂交循环事件的试剂。

在另一个实施方案中，本发明可以实时检测个体或受试者中的基因突变、多态现象或者异常。从个体中分离生物学样品，提取DNA和/或RNA。对本发明的分子进行设计，使得活化的分裂多肽片段结合到寡核苷酸上，该寡核苷酸特异于试图被检测的特定基因突变、多态现象或者异常。选择性地，可以使用一个分子群体，可以检测其中的许多基因突变、多态现象或者异常。在该实施方案中，连接到活化的分裂多肽片段上的寡核苷酸相互互补，因此基线是来自活性蛋白的信号。来自样品中的DNA和/或RNA然后与该分子接触。如果获取样品的个体具有特定的突变或多态现象，就会与分裂多肽分子竞争，并降低活性蛋白的信号。在与活化的分裂多肽分子接触之前，对个体的DNA和/或RNA进行扩增。这在检测具有已知多态性的单个核苷多态现象中是特别有用的。由于可以立即产生信号和/或荧光，本发明的分子使得可以进行灵敏检测。

在类似的实施方案中，本发明可以实时检测来自个体的生物学样品中的分析物，特别是非核酸分析物。生物学样品分离自包含靶点分析物的受试者。在一些实施方案中，靶点分析物可以被提取。对本发明分子进行设计，使得活化的分裂多肽片段结合到特异于试图检测的分析物的结合基序上。选择性地，使用包含一个分子或分析物群体的样品，该样品中的一种或多种分析物可被检测。在该实施方案中，分析物的结合基序被连接到活化的分裂多肽片段上，该片段特异于将被检测的分析物，然后与含有分析物的生物学样品接触。如果获取样品的受试者含有特定的分析物，分裂多肽片段将会再聚集，生成活化的分裂多肽分子。尤其当指示蛋白是荧光蛋白的片段，并且当该片段来自荧光谱略有差别的不同荧光蛋白时，这对于检测样品中的单个和多个分析物是特别有用的。由于可以立即产生信号和/或荧光，本发明的分子使得可以进行灵敏检测。

在另一个实施方案中，本发明提供适合检测样品中是否存在靶核酸或靶点非核酸分析物和/或其含量的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒至少包含活化的分裂荧光蛋白分子成分，也即第一个荧光性片段包含预先形成的发色团，而第二个荧光蛋白片段与第一个片段互补而立即产生荧光。在选择性的实施方案中，试剂盒至少包含活化的分裂多肽分子成分，而活化的分裂多肽重组形成具有显色活性的酶。在一些实施方案中，分析物的核酸结合部分或者结合基序已经与活化的分裂多肽蛋白片段结合。在选择性的实施方案中，分裂多肽片段用巯基反应试剂生物素-HPDP进行生物素化。在这种试剂盒中，该试剂盒包含将使用者自身重要的结合部分与分裂多肽片段结合的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含适合捕获和/或检测样品中是否存在靶核酸或靶点非核酸分析物或其含量的试剂。用于检测靶核酸的存在和/或其含量的试剂包括酶促活性试剂或者特异于组装蛋白的抗体。抗体可以是被标记的。

附图简述

图1：由DNA杂交调控的基于荧光蛋白的光学纳米开关的设计。荧光蛋白(EGFP)分裂成两个非荧光性片段，其中一个片段含有预先形成的发色团，该发色团能够在完全大小的蛋白中产生明亮的荧光。两个蛋白片段均通过生物素-链霉抗生物素的相互作用连接到互补性寡核苷酸上；链霉抗生物素能够结合四个生物素分子，在我们的方案中确定得到了比例为1:1:1的蛋白/链霉抗生物素/寡核苷酸复合体。在混合物中，这两种核蛋白构建物通过形成序列特异性双重DNA发生兼并，其引发EGFP大片段和小片段发生互补，导致荧光的迅速产生(打开状态)。加入过量的一种所述寡核苷酸，代替相应的核蛋白成分，并且使得荧光淬灭(关闭状态)。

图2A-2D：通过DMD模拟分析EGFP大片段(1-158N-末端氨基酸)的结构。图2A.作为温度的函数的EGFP大片段的势能(由误差栏显示标准偏差)。在接近转变点T_F约0.60的狭窄温度范围内发生蛋白折叠。图2B.在T＝0.59时作为模拟时间的函数的势能曲线表明，当接近T_F时所述蛋白的结构在折叠状态(下线)和非折叠状态(上线)之间快速变化。图2C.从DMD模拟中获得的EGFP大片段的10个折叠和排列结构的主链显示。从62～70位氨基酸的片段含有发色团形成性氨基酸(T66、Y67和G68)，涂上蓝色。该多肽的C-末端由于与该分子的其它部分接触数目少而非常易变形，因此以忽略其对应氨基酸的方式来进行排列。图2D.DMD折叠的EGFP大片段(蓝色)之一和全长EGFP(黄色)的主链排列。在此，两种多肽中发色团形成性残基显示为红色。图2E.折叠的EGFP大片段的各个残基的均方根偏离(RMSD)。发色团形成性残基在阴影区，它们的空间排列十分固定，偏离值小于2。

图3A-3C：克隆的EGFP片段的光谱特征。图3A.含有EGFP大片段(泳道1)和EGFP小片段(泳道2)的示例性蛋白样品的SDS-PAGE分析(15％PAGE)，该蛋白在大肠杆菌中过表达，并用内含肽自剪接技术进行分离。泳道M对应于蛋白分子量梯度。EGFP大片段和EGFP小片段分别可见于约15kD和约10kD条带(用红色星号标记)。EGFP小片段特别纯，EGFP大片段稍微受到内含肽(约25kD)和未分裂的融合物(约40kD)污染。图3B.具有EGFP大片段(曲线1)和(曲线2)EGFP小片段的蛋白样品的吸收光谱。所述蛋白样品用两个典型光谱来表示(对应于pH 7.4的PBS缓冲液中40μM的EGFP片段)，显示在每一波长下的吸收范围。曲线3：40μM链霉抗生物素；插图：2μM EGFP。图3C.EGFP大片段(PBS缓冲液中浓度为2μM，pH 7.4)的荧光激发光谱(曲线1)和发射光谱(曲线2)。

图4A-4B：DNA杂交驱动的光学纳米开关的组装和性能。图4A：含量增加的生物素化的EGFP片段与固定含量的链霉抗生物素(2μg；60-kD条带)结合的凝胶移位分析(SDS-10％ PAGE)。红色箭头指示所得到的比例为1:1的复合物的蛋白量(70-75-kD条带)，对应于生物素化的产量≥70％。图4B.表明形成图1描述的1:1:1三分子构建物的凝胶移位分析(10％ PAGE)，并且所述三分子构建物包含EGFP大片段或小片段、链霉抗生物素和相应的寡核苷酸。泳道1和2：结合到链霉抗生物素上的EGFP大片段缺乏(1)或存在(2)时的生物素化寡核苷酸1；泳道3和4：结合到链霉抗生物素上的EGFP小片段缺乏(1)或存在(2)时的生物素化寡核苷酸2；M：20-bp大小的标记物。红色箭头标记出所需要的寡核苷酸-蛋白复合物的位置，如所预期，该复合物大大上移。图4C.完整的EGFP(1)和基于分裂EGFP的蛋白复合物(2)的荧光谱，该复合物从三分子构建物中通过DNA杂交重组，每一光谱均是在pH 7.4的PBS缓冲液中于约200nM浓度下测定的(混合后20分钟记录光谱)。曲线3：与样品2相同，添加100倍过量的两种互补性寡核苷酸之一(非生物素化寡核苷酸1)。曲线4：含有偶联到链霉抗生物素上但是无寡核苷酸的两种EGFP片段的对照。插图显示在524nm下记录的样品2中的荧光产生时程。图4D.Mg⁺²阳离子对完整的EGFP(蓝色)和对含有双链体DNA的重新组装的分裂EGFP复合物(紫色)的作用。1栏：无Mg⁺²；2和3栏：加入2mM Mg⁺²后的2分钟和3小时。

图5：全长EGFP比其大片段更稳定。该图显示EGFP大片段(akaα结构域)与全长EGFP相比的折叠热力学；全长EGFP明显具有更高的转变温度T_F。显然，稳定性的提高是EGFP大片段和EGFP小片段相互作用的结果。因此，EGFP较小结构域的存基本上稳定了所述完全大小蛋白的折叠。折叠EGFP的结构：X-射线结构(PDB码Ic4f；S65T GFP突变体/pH 4.6)；我们认为这种构象是EGFP的天然折叠，因为该结构与一些其它EGFP的X-射线结构之间的差别较小。例如PDB Ic4f和PDB lemg(S65T GFP突变体/pH 8.0)之间的rmsd仅为

图6：全长EGFP具有两种折叠-未折叠的中间状态。这两个图显示EGFP的准均衡未折叠，这是用Berendsen′s自动调温装置³¹通过准均衡加热DMD模拟研究得出的。从折叠状态开始，所述蛋白系统的温度从T₁＝0.6<T_F开始缓慢升高到T_h＝0.8>T_F。我们进行了EGFP的10个未折叠模拟。典型曲线被显示(上面)；在平均折叠路径(下面)中观察到两种未折叠中间状态，I₁ ^U和I₂ ^U。从10个准均衡EGFP未折叠模拟中获得了类似结果。

图7：未折叠中间状态I₁ ^U(左方快照)对应于未卷曲的N-末端β链，并且第二种未折叠中间状态I₂ ^U(右方快照)对应于未折叠的几乎整个EGFP较大结构域(浅色)，其C-末端与EGFP的较小结构域(深色)相互作用。

发明的实施方式

本发明已经发现一种快速实时蛋白互补的新方法，包括体外活化的分裂多肽片段的制备方法。该方法还涉及使用活化的分裂多肽片段的蛋白互补(这也被称作为生物分子构建物)，实时检测核酸分子和核酸杂交，或者非核酸分析物。在本发明中，本发明人已经公开制备处于就绪状态度活化的分裂多肽片段，其中如果与类似的活化的互补分裂多肽片段紧密接近时，立即形成活性蛋白。还公开了将荧光蛋白分裂成活化的分裂荧光蛋白的方法。制备处于就绪状态和活性构象中的活化的分裂多肽片段，能够实现实时蛋白互补，而用于以前的蛋白互补方法中的无活性分裂多肽片段需要发生结构变形来形成活性蛋白。本发明的方法使用活化的分裂多肽片段，使得实时蛋白互补是快速、灵敏和可逆的。

在一个实施方案中，本发明的方法包括在微生物宿主细胞中表达编码第一和第二多肽片段的核酸，形成内含体。该内含体能够进行正确的蛋白折叠，从而含有比传统纯化方法更接近于体内状态的折叠状态的蛋白。基于已知技术，可以使用其它手段，例如具有囊泡的细胞。例如，内含体能够生成处于已经激活状态的分裂多肽蛋白。收集内含体，溶解并再溶解来获得分裂多肽蛋白片段。

活化的分裂多肽片段

活化的分裂多肽片段可以是任何多肽，它们紧密接近时发生结合，生成一种蛋白，这可以用组装的多肽片段而不是单个多肽片段识别的任何方法来检测。在本发明的一个实施方案中，该方法包括对分裂多肽片段进行设计，使得它们重组时立即具有活性。

活化的分裂多肽片段可以是任何多肽，它们紧密接近时发生结合，生成一种活性蛋白，这可以用组装的活性蛋白而不是单个多肽片段识别的任何方法来检测。例如，两个多肽再聚集生成具有酶促活性的蛋白，生成具有显色活性或者荧光活性，或者产生能够被抗体识别的蛋白。此外，它们被设计成处于活性状态，并且准备好(即处于就绪状态)重组成活性蛋白，以使得任何延迟时间最小化，这种延迟时间通常存在于体外和体内的蛋白互补中。

在一个实施方案中，活化的分裂多肽片段是荧光蛋白或多肽。在这种实施方案中，活化的分裂荧光蛋白片段之一含有成熟的预先形成的发色团，该发色团准备好并处于就绪状态，以在与其同类的活化的分裂荧光性片段互补时立即产生荧光。例如，使用含有这种分裂荧光的片段的内含体，该片段约包括充分折叠的荧光蛋白的大约一半，具有正确折叠的成熟发色团，不单独发出荧光，但是准备好在与其同类配对结合时发出荧光。

在一个这种实施方案中，组装的蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)，经修饰的GFP，例如EGFP或者GFP样荧光蛋白或者本领域技术人员知晓的任何其它天然的或遗传工程化的荧光蛋白，包括但是不限于CFP、YFP和RFP。

在一些实施方案中，同类的非荧光多肽片段与含有成熟发色团的分裂荧光性片段结合，包含一种以上的活性非荧光性片段。这种活化的非荧光多肽通常通过在适当位置上分裂荧光蛋白的编码核苷酸序列，并独立地表达各个核苷酸序列片段。活化的分裂荧光蛋白片段可以单独表达或者与一种或多种蛋白融合伴侣融合表达。

在本发明的实施方案中，重组的活性蛋白包括活化的分裂EGFP片段，其中第一个片段是EGFP的N-末端片段，包括从氨基酸编号1到大约氨基酸编号158的连续氨基酸链。将C-末端半胱氨酸添加到该片段上，有助于在表达后与各种核酸结合基序结合。第二种活化的分裂EGFP片段是从大约氨基酸编号159到氨基酸编号239的连续氨基酸链。也可以添加N-末端半胱氨酸。

氨基酸1是指EGFP的第一个氨基酸。氨基酸239是指GFP的最后一个氨基酸。所有残基按照野生型维多利亚水母(A.victoria)GFP(GenBank登陆号M62653；SEQ ID NO 7)的编号进行编号，该编号也应用于同源序列的相应位置上。因此，当使用截断的GFP(相比于野生型GFP)或者使用具有额外氨基酸的GFP时，编号进行相应改变。

绿色荧光蛋白(GFP)是一种长238个氨基酸的蛋白，来自维多利亚水母(Aequorea Victoria)(参见SEQ ID NO：8的mRNA序列)。但是，也已经从腔肠动物门的其它成员中分离得到荧光蛋白，例如，从香菇珊瑚(Discosomasp.)分离得到红色荧光蛋白(Matz，M.V.等人，1999，Nature Biotechnology17：969-973)，从海洋腔肠分离得到GFP，从Renilla Muelleri分离得到GFP或者从其它动物、真菌或植物中分离得到荧光蛋白(美国专利No.US7,109,315)。GFP以各种被修饰的形式存在，包括Heim等人公开的GFP的蓝色荧光变体(BFP)(Heim，R.等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.91：26，12501-12504)，它是野生型GFP的Y66H变体；具有S65G，S72A和T203Y突变的GFP的黄色荧光变体(YFP)(WO98/06737)；具有Y66W颜色突变和任选的F64L，S65T，N1461，M153T，V163A折叠/溶解性突变的GFP的蓝色荧光变体(GFP)(Heim，R.，Tsien，R.Y.(1996)Curr.Biol.6，178-182)。最广泛使用的GFP变体是EGFP，具有F64L和S65T突变(WO 97/11094和WO96/23810)，并在第一个Met后插入一个缬氨酸残基。F64L突变是发色团上游的位置1上的氨基酸。当GFP在高于约30℃下在细胞中表达时，含有这些折叠突变的GFP增强了荧光强度(WO 97/11094)。所有上面提及的荧光蛋白及其功能性片段被包括来用于本发明中。还包括本领域技术人员知晓的那些荧光蛋白及其片段。

在选择性的实施方案中，重组的荧光蛋白包括活化的分裂荧光性片段，该片段选自：绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、绿色荧光样蛋白、黄色荧光蛋白(YFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、增强的蓝绿色荧光蛋白(ECFP)或红色荧光蛋白(dsRED)，其中重组荧光蛋白中的片段之一含有成熟的预先形成的发色团。所有上面提及的荧光蛋白及其将生成发出荧光的荧光蛋白的片段被用于本发明中。本发明还包括本领域技术人员知晓的那些荧光蛋白及其片段和遗传工程化的蛋白。

在选择性的实施方案中，重新组装的荧光蛋白包括来自光谱截然不同的荧光蛋白的活化的分裂荧光性片段。重组的活性荧光蛋白具有截然不同的和/或独特的光谱特征，这取决于用于互补的活化的分裂荧光性片段。例如，将来自用于多色生物分子荧光互补的不同荧光蛋白的片段，实现多色荧光互补(multicolor BiFC)(参见Hu等人，Nature Biotechnology，2003；21：539-545；Kerppola，2006，7：449-456，Hu等人，Protein-Protein Interaction(P.Adams和E.Golemis编辑)，Cold Spring Harbor Laboratory Press.2005，在此全文引入作为参考)。本发明中包括使用来自用于多色实时荧光的活化的分裂荧光性片段，其中片段之一含有预先形成的成熟发色团。

在一个实施方案中，可用流式细胞仪、荧光平板读卡器、荧光计、显微镜、荧光能量共振转移(FRET)，通过肉眼，或用本领域技术人员知晓得其它方法检测荧光蛋白。在选择性的实施方案中，用荧光激活细胞筛选器(FACS)或延时显微镜，通过流式细胞计数检测荧光。

在本发明的另一个实施方案中，活化的分裂多肽片段紧密接近结合，形成一种组装的活性酶，该酶用酶活性分析来检测。优选地，通过显色反应或荧光反应来检测酶活性。在一个优选的实施方案中，该酶是二氢叶酸还原酶(DHFR)或β-内酰胺酶。

在另一个实施方案中，该酶是二氢叶酸还原酶(DHFR)。例如，Michnick等人开发出一种由DHFR的N-末端片段和C-末端片段组成的“蛋白互补分析物”，该片段单独不具有任何的酶促活性，但是紧密接近时形成一种功能性酶。参见例如美国专利No.US6,428,951，US6,294,330和US 6,270,964，在此引入作为参考。检测DHFR活性的方法包括本领域公知的显色方法和荧光方法。

在选择性的实施方案中，可以使用其它的分裂多肽。例如，催化基底转化为可检测产物的酶。多个这种用于分裂多肽重新组装的系统包括但是不限于β-半乳糖苷酶(Rossi等人，1997，PNAS，94：8405-8410)；二氢叶酸还原酶(DHFR)(Pelletier等人，PNAS，1998；95：12141-12146)；TEM-1β-内酰胺酶(LAC)(Galarneau等人，Nat.Biotech.2002；20：619-622)以及萤火虫荧光素酶(Ray等人，PNAS，2002，99：3105-3110和Paulmurugan等人，2002；PNAS，99：15608-15613)的重新组装。例如，分裂的β-内酰胺酶已经用于检测双链DNA(参见Ooi等人，Biochemistry，2006；45：3620-3525)。本发明包括使用活化的分裂多肽片段进行实时信号检测，其中该片段处于充分折叠的成熟构象中，互补时能够进行快速的信号检测。

在本发明的另一个实施方案中，活化的分裂多肽片段结合可以形成被组装的蛋白，该蛋白含有一个不连续的抗原表位，可用特异性识别被组装蛋白上的该不连续抗原表位但是不识别位于任一个别多肽上的部分抗原表位的抗体来检测。不连续抗原表位的一个例子存在于HIV的gpl20中。本领域技术人员基于公知技术能够容易地制备这些抗原表位和其它衍生物，筛选识别被组装的蛋白的抗体，该抗体不是通过被组装蛋白的任一蛋白片段识别该蛋白。

在本发明的另一个实施方案中，活化的分裂多肽可以是相互作用形成组装的蛋白的分子。例如，分子可以是蛋白片段，或二聚体或多聚体的亚单位。

对编码感兴趣的分裂多肽片段的核酸序列和密码子进行优化，例如将密码子转化为优先用于期望系统中的密码子，例如用于哺乳动物细胞中。在非哺乳动物细胞中表达蛋白的优化密码子在本领域中也是已知的，当宿主细胞不是哺乳动物细胞(例如昆虫细胞)时，可以使用这些密码子。

本发明的活化的分裂多肽包括任何期望的额外修饰。例如，在一个实施方案中，活化的分裂多肽还包括柔性接头，该接头偶联到核酸结合部分上。

荧光性片段和内含体的表达

已有大量出版物公开了通过内含体途径在微生物/原核生物中重组制备蛋白。这种综述资料的例子为Misawa，S.等人，Biopolymers 51(1999)297-307；Lilie，H.，Curr.Opin.Biotechnol.9(1998)497-501；Hockney，R.C.，TrendsBiotechnol.12(1994)456-463。

在微生物和/或原核生物中过表达本发明的肽。过表达导致内含体形成。在宿主细胞中，起始密码子编码的甲硫氨酸主要是在表达/翻译过程中被去除。在现有技术中，在微生物/原核生物中过表达蛋白的一般方法已经是公知的了。本领域中的出版物的例子是Skelly，J.V.等人，MethodsMol.Biol.56(1996)23-53；Das，A.，Methods Enzymol.182(1990)93-112；和Kopetzki，E.等人，Clin.Chem.40(1994)688-704。

如在此所用，原核生物中的过表达是指用具有启动子的优化表达盒进行表达(美国专利No.US 6,291,245)，启动子如tac或lac启动子(EP-B 0067 540)。通常，这可以用含有化学诱导型启动子或者温度改变诱导型启动子的载体来实施。对于大肠杆菌有用的启动子是温度敏感型λ-PL启动子(EP-B 0 041767)。更有效的启动子是tac启动子(美国专利No.US 4,551,433)。原核生物例如大肠杆菌的这种强大的调控信号通常是由攻击细菌的抗菌素产生的(参见Lanzer，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)8973-8977；Knaus，R.和Bujard，H.，EMBO Journal 7(1988)2919-2923；涉及λT7启动子：Studier，F.W.等人，Methods Enzymol.185(1990)60-89)；涉及T5启动子：EP-A 0 186069；Stuber，D.等人，System for high-level production in Escherichia coli andrapid application to epitope mapping，preparation of antibodies，and structure-function analysis；Immunological Methods IV(1990)121-152)。

通过使用这种过度生产的原核细胞表达系统，本发明的肽以至少占细胞总表达蛋白的10％的水平被生产，通常为30-40％，而有时高达50％。

本文所使用的“内含体”(IBs)是指编码核酸在微生物/原核生物中过表达后重组生成的不溶形式的多肽。

优选用pH约9或更高的水溶液溶解内含体。最优选pH为10或更高。溶解时添加去垢剂或变性剂不是必需的。优化的pH容易确定。由于强碱性条件可能会使多肽变性，显然存在优化的pH范围。优化的范围在pH 9到pH 12之间。

编码荧光性肽的核酸(DNA)可以用现有技术中的已知方法来制备。更为优选的是用其它调控元件和转录元件来扩充该核酸序列，以优化宿主细胞中的表达。适合表达的核酸(DNA)优选通过化学合成来制备。这种方法是本领域技术人员熟悉的，在例如Beattie，K.L.和Fowler，R.F.，Nature352(1991)548-549；EP-B 0 424 990；Itakura，K.等人，Science198(1977)1056-1063中有描述。对本发明的肽的核酸序列进行修饰也是有利的。

这种修饰例如是，但是不限于；修饰核酸序列来导入限制性酶的不同识别序列，为连接、克隆和诱变的步骤提供便利；修饰核酸序列来为宿主细胞引入优选密码子；用其它调控元件和转录元件来延长核酸序列，以优化宿主细胞中的基因表达。

对合成感兴趣的蛋白的密码子进行优化，将它们转换成在期望系统中优选使用的密码子，如在哺乳动物细胞中。在非哺乳动物细胞中表达蛋白的优化密码子也是已知的，当宿主细胞不是哺乳动物细胞(如昆虫细胞)时，使用这些优化密码子。

分裂多肽分子

本发明还包括用本文描述的方法制备的活化的分裂多肽分子，也被称作为生物分子偶联物。在一个实施方案中，活化的分裂多肽分子包含具有显色活性或荧光活性的酶的分裂多肽。在一个实施方案中，该酶是二氢叶酸还原酶或者β-内酰胺酶或荧光素酶。在一个实施方案中，荧光蛋白是GFP或GFP样荧光蛋白。

在一些实施方案中，该分子的活化的分裂多肽还包含核酸结合基序或核酸结合部分。当存在靶核酸时，核酸结合部分结合到核酸靶序列上，便于活化的分裂多肽片段结合形成一种活性蛋白。

在选择性的实施方案中，该分子的活化的分裂多肽还包含非核酸分析物的结合基序。当存在靶点分析物时，通常是非核酸分析物，分析物结合基序结合到靶点分析物上，便于活化的分裂多肽片段结合形成一种活性蛋白。

在另一个实施方案中，活化的分裂多肽分子是分裂的荧光分子。在这种实施方案中，该分子至少包含两个活化的分裂荧光性片段，其选自GFP、GFP样荧光蛋白、荧光蛋白及其变体。分裂荧光性片段之一包含成熟的预先形成的发色团，该发色团是有活性的，但是在分离片段中处于无荧光状态。当活化的荧光性片段，当它们相互结合时，包含了产生荧光所需的β链的完全补充，但它们自己本身不荧光。该分子的各个活化的分裂荧光性片段还包括核酸结合基序。核酸结合基序结合到靶核酸上，便于至少两个活性分裂荧光性片段结合，并且活性荧光蛋白重组和实时荧光显性

核酸结合部分

各个分裂多肽分子的核酸结合部分是可以结合到靶核酸上的任何分子。在一些实施方案中，核酸结合部分包括核酸、核酸类似物和多肽。在一个实施方案中，核酸结合部分是寡核苷酸。一对特定活化的分裂多肽片段的核酸结合部分可以是相同种类的分子，例如寡核苷酸，或者它们可以是不同的，例如活性蛋白包含的一对分裂多肽中的一个具有寡核苷酸核酸结合部分，而其它成员具有多肽核酸结合部分。

核酸结合部分是可以偶联到另一个分子例如多肽上的任何分子，并且在紧密接近时能够结合到靶核酸上。在一个实施方案中，核酸结合部分是核酸或核酸类似物，例如，寡核苷酸。在本发明的另一个实施方案中，核酸结合部分是结合核酸的多肽或蛋白，其与具有高亲合性靶核酸相互作用。核酸类似物包括，例如但是不限于，肽核酸(PNA)、假互补PNA(pcPNA)、锁定核酸、吗啉DNA、硫代磷酸DNAs和2′-O-甲氧基甲基-RNAs，锁定核酸(LNA)是含有2′-O，4′-C亚甲基键的核酸类似物。

核酸结合部分能够结合单链靶点上的相同杂交位置，在杂交位置上产生三链体。选择性地，核酸结合部分能够接近地结合到单链或双链靶核酸上的紧密相邻杂交位置，分别在各个杂交位置上生成二链体或三链体。

在实施方案中，核酸结合部分是核酸，核酸结合部分的长度应该足够长，以使其互补结合到核酸靶点上，当两个探针部分结合到靶核酸上时，应当使得分裂多肽片段之一与相应的分裂多肽片段相互作用。例如，核酸结合部分探针可以长5-30个碱基。更优选为长5-15个碱基。

在形成三链体的实施方案中，核酸结合部分可以是允许形成三链体的任何核酸。优选形成三链体的寡核苷酸是富含GC的，优选的三链体是嘌呤三链体，由嘧啶-嘌呤-嘌呤组成。

一种优选形成三链体的寡核苷酸是富含GC的，优选的三链体是嘌呤三链体，由嘧啶-嘌呤-嘌呤组成。

核酸结合部分可以选自由寡核苷酸、单链RNA分子和肽核酸(PNA)、包括假互补PNAs(pcPNA)的肽核酸(PNAs)、锁定核酸(LNA)和其它核酸类似物。

在一个实施方案中，核酸结合部分是寡核苷酸。设计和合成寡核苷酸的方法在本领域是公知的。寡核苷酸有时被称作为寡核苷酸引物。

用于本发明中有用的寡核苷酸可以用已经建立的寡核苷酸合成方法来合成。合成寡核苷酸的方法在本领域是公知的。这种方法的范围从标准的酶消化后核苷片段分离(参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Wu等人，Methods in Gene Biotechnology(CRC Press，New York，N.Y.，1997)，以及Recombinant Gene Expression Protocols，in Methods in Molecular Biology，第62卷，(Tuan编辑，Humana Press，Totowa，N.J.，1997)，它们的公开内容在此引入作为参考)到纯粹的合成方法，例如，使用Milligen or Beckman系统1Plus DNA合成仪(例如，Milligen-Biosearch的8700型自动合成仪，Burlington，Mass.或者ABI Model 380B)通过氰乙基亚磷酰胺法合成。用于制备寡核苷酸的合成方法在Ikuta等人，Ann.Rev.Biochem.53：323-356(1984)(磷酸三酯及亚磷酸三酯法)和Narang等人，Methods Enzymol.，65：610-620(1980)(磷酸三酯法)中也有描述。

对在此描述的许多寡核苷酸进行设计，与其它寡核苷酸或核酸的特定部分互补，使得在它们之间形成稳定的杂合物。这些杂合物的稳定性用已知方法计算，如Lesnick和Freier，Biochemistry 34：10807-10815(1995)，McGraw等人，Biotechniques 8：674-678(1990)以及Rychlik等人，Nucleus AcidRes.18：6409-6412(1990)中描述的那些方法。

在一个实施方案中，核酸结合部分是单链RNA分子。用于设计和合成单链RNA分子的方法在本领域是公知的。

在一些实施方案中，核酸结合部分是肽核酸(PNAs)，包括假互补PNAs(pcPNA)。用于设计和合成PNAs和pcPNAs的方法在本领域是公知的。肽核酸(PNAs)是DNA的类似物，其中主链是假肽，而不是糖。因此，其行为效仿DNA，并结合互补的核酸链。在肽核酸中，寡核苷酸的脱氧核糖磷酸主链已经被更类似于肽而非糖磷酸二酯的主链替代。每个亚单位具有连接到该主链上的天然存在的或非天然存在的碱基。通过酰胺键连接的N-(2-氨乙基)甘氨酸重复单位来构建这种主链。

PNA结合DNA和RNA。生成的PNA/DNA或者PNA/RNA二链体比相应的DNA/DNA或DNA/RNA二链体具有更高度亲合性和特异性。此外，它们的聚酰胺主链(含有适当的核碱基或者与之连接的侧链基团)不被核酸酶或蛋白酶识别，因此与DNA和肽不同，PNA能够抵抗酶的降解作用。PNA链能够以平行方向或反平行方向结合到DNA或RNA链上。PNA结合单链DNA和双链DNA。

为了解决传统PNA的序列限制，开发了假互补PNAs(pcPNAs)。除了鸟嘌呤和胞嘧啶外，pcPNA’s分别携带2，6-二氨基嘌呤(D)和2-硫脲嘧啶，而非腺嘌呤和胸腺嘧啶。pcPNAs具有迥然不同的结合模式，双二链体入侵，这是基于Watson-Crick识别原理，并补充了假互补的概念。pcPNAs识别并与其天然的A、T、(U)或G、C配对物结合。pcPNAs可以按照本领域知晓的任何方法来制备。例如，化学组装PNAs的方法是公知的(参见，美国专利No.US5,539,082,US5,527,675,US 5,623,049,US5,714,331,US5,736,336,US5,773,571或US5,786,571，在此引入作为参考)。

本发明的其它实施方案提供核酸结合部分，该部分是多肽或肽。多肽可以是对靶核酸具有高亲合性的任何多肽。在该实施方案中，靶核酸可以是双链的、三链的或者单链的DNA或RNA。在一些实施方案中，多肽是肽，少于100的氨基酸，或者全长的蛋白。多肽与靶核酸的亲合性范围从毫微摩尔到高的微微摩尔。多肽包括含有锌指的多肽，可以是天然的或者通过理性设计或筛选获得的。锌指的例子包括Zif2g8、Sp1、Gfi-1的锌指5、YY1的锌指3、CF2 II的锌指4和6、以及TTK的锌指2(PNAS(2000)97：1495-1500；J BiolChem(20010 276(21)：29466-78；Nucl Acids Res(2001)29(24)：4920-9；NuclAcid Res(2001)29(11)：2427-36)。其它多肽包括体外选择获得的多肽，它们结合特定的核酸序列。这种适体的例子包括血小板来源的生长因子(PDGF)(Nat Biotech(2002)20：473-77)和凝血酶(Nature(1992)355：564-6)。还有其它多肽是体外结合DNA三链体的多肽。例子包括异核糖核酸颗粒(hnRNP)蛋白的成员，例如，hnRNP K，L，E1，A2/B1和I(Nucl Acids Res(2001)29(11)：2427-36)。

对于包含多肽作为核酸结合部分的分裂多肽片段来说，整个分裂多肽片段以及核酸结合部分分子可以由单个构建物编码，包括多肽部分、接头和核酸结合部分多肽。该构建物可以在细胞中表达，或者显微注射到细胞中。这些构建物还可用于体外检测感兴趣的核酸。

核酸靶点

通过产生与互补复合物形成相关的可检测信号，本发明的方法可用于检测单链核酸靶点或双链核酸的存在。

核酸靶点可以是含有杂交部位的任何核酸，该杂交部位用于核酸结合部分结合活化的分裂多肽片段上。例如，靶核酸可以是DNA、RNA或核酸类似物。靶核酸可以是单链或双链的。靶核酸可以在体内或体外被检测。在一个实施方案中，本发明的方法用于体外检测靶核酸，活化的分裂多肽相互作用生成具有显色活性和/或荧光活性的活性蛋白。在一些实施方案中，多肽编码GFP、被修饰的GFP，例如，GFP样荧光蛋白的EGFP，或者任何其它天然或遗传工程化的荧光蛋白，包括CFP、YFP和RFP。

在另一个实施方案中，核酸结合部分结合到靶核酸的两个相邻序列上，使得一个核酸结合部分结合到一个靶序列上，而第二个核酸结合部分结合到另一个靶序列上。在该实施方案中，相邻序列相互之间足够接近，使得当相关核酸结合部分结合到靶点上时相关活化的分裂多肽片段发生相互作用，组装活性蛋白。该实施方案提供了对单链和双链靶核酸进行检测。为了检测双链靶点，单链探针与双链靶点相互作用而形成三链体。

任何来自样品的核酸靶点可用于实施本发明，包括但是不限于真核生物的、原核生物的和病毒的DNA或RNA。在一个实施方案中，靶核酸是分离自患者的基因组DNA的样品。该DNA可以从任何细胞来源或体液中获得。临床实践中可获得到细胞来源的非限制性例子包括血细胞、口腔细胞、子宫颈阴道细胞、来自尿液的上皮细胞、胎儿细胞或者任何存在于通过活检获得的组织中的细胞。体液包括血液、尿液、脑脊髓液、精液和感染部位或炎症部位的组织流出物。在另一个实施方案中，在样品中直接检测DNA，无需任何额外的纯化。在另一个实施方案中，用本领域众多标准方法中的任何一种，从细胞来源或体液中提取DNA。应当理解，用于提取DNA的特定方法将取决于来源的性质。在某些实施方案中，被提取用于本发明中的DNA的含量至少为5pg(对应于约1个基因组大小为4 x 10⁹碱基对的细胞等价物)。

在一个实施方案中，在暴露于互补复合物的成分之前，对靶核酸进行扩增。可以使用扩增核酸靶点的任何方法，包括生成在同一杂交部位上具有多样性的单链核酸的方法。扩增反应可以是聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)、Qβ-复制酶扩增(Q-beta)，或者滚环扩增(RCA)。

在一些实施方案中，使用PCR扩增核酸靶点。

可使用任何能够合成所期望核酸的聚合酶。优选聚合酶包括但是不限于测序酶、Vent和Taq聚合酶。优选地，使用高保真的聚合酶(例如，ClontechHF-2)，使得聚合酶导入的突变最小化。

在另一个实施方案中，用滚环扩增(RCA)生成在相同杂交部位上具有多样性的单链DNA靶点。滚环扩增(RCA)是一种等温处理方法，生成多拷贝序列。在体内滚环DNA复制中，DNA聚合酶在环状模板上延伸引物(Romberg，A.和Baker，T.A.DNA Replication，W.H.Freeman，New York，1991)。产物由串联的模板互补序列拷贝组成。RCA已经是一种以适合体外DNA扩增的方法(Fire，A.和Si-Qun Xu，Proc.Natl.Acad Sci.USA，1995，92：4641-4645；Lui，D.等人，J.Am.Chem.Soc，1996，118：1587-1594；Lizardi，P.M.等人，Nature Genetics，1998，19：225-232；Kool的美国专利No.US 5,714,320)。

在另一个实施方案中，分裂多肽分子包含核酸结合基序，可用于免疫RCA(免疫滚环扩增)和免疫PCR中进行核酸检测。在这种实施方案中，分裂多肽分子的核酸结合基序成分便于在存在PCR产物时指示物蛋白分子的重新组装，用于实时体外免疫PCR方法中。此外，在另一个实施方案中，指示物分子的核酸结合成分便于在免疫RCA(滚环扩增)方法中，存在核酸时，分裂的指示物分子的重新组装，从而产生信号，导致体外高度信号放大。

在RCA技术中，具有与扩增靶循环(ATC)互补区域的引物序列与ATC结合。杂交后，酶、dNTP等使引物能够沿着ATC模板延伸，DNA聚合酶转移较早的片段，生成单链的DNA产物，该产物由重复串联的起始ATC序列单位组成。

RCA技术是本领域中公知的，包括线性RCA(LRCA)。任何这种RCA技术可用于本发明中。使用链置换因子，如解旋酶，有利于在RCA过程中发生链置换。通常，任何在存在链置换因子时能够进行滚环复制的DNA聚合酶适合用于本发明的方法中，即使当不存在该因子时DNA聚合酶不能进行滚环复制。用于RCA中的链置换因子包括BMRF1聚合酶附属亚单位(Tsurumi等人，J.Virology 67(12)：7648-7653(1993))、腺病毒DNA-结合蛋白(Zijderveld和van der Vliet，J.Virology 68(2)：1158-1164(1994))、单纯疱疹病毒蛋白ICP8(Boehmer和Lehman，J.Virology 67(2)：711-715(1993)；Skaliter和Lehman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(22)：10665-10669(1994))、单链DNA结合蛋白(SSB；Rigler和Romano，J.Biol.Chem.270：8910-8919(1995))以及小牛胸腺解旋酶(Siegel等人，J Biol.Chem.267：13629-13635(1992))。在滚环复制分析中使用一种聚合酶，可以确定该聚合酶进行滚环复制的能力，如Fire和Xu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4641-4645(1995)以及Lizardi(美国专利No.US 5,854,033，例如其中的实施例1)中描述的那些分析。

结合非核酸分析物的结合基序

在一些实施方案中，分裂多肽分子包含结合非核酸分析物的结合基序。这种基序可以是，例如多肽或肽。在其它实施方案中，非核酸分析物的结合基序是一种生物分子、有机分子或无机分子。在这种实施方案中，靶点分析物可以是任何代谢产物、生物分子、有机分子或无机分子。对这些分子的鉴定是人们已知的或是已有技术以及实施中的普通技术。

在本发明的实施方案中，本发明制备的分裂多肽分子和/或分裂荧光蛋白分子可用于体外实时检测分析和实时检测生物分子的相互作用，例如，但是不限于，病毒核酸和/或基因组的检测，核酸检测(RNA、DNA等)；核酸杂交，例如，形成核酸二链体和三链体，包括同型的核酸相互作用(DNA-DNA；RNA-RNA)和异型的核酸相互作用(DNA-RNA等)。在选择性的实施方案中，本发明的分裂多肽分子可用于体外实时检测非核酸分析物，以及用于实时检测非核酸的相互作用，例如生物分子、有机分子无机分子。在一些实施方案中，本发明的方法可用于检测病原性和/或病毒性的生物分子、无机和有机的病原性和/或病毒性分子。

在这种实施方案中，本发明涉及用于实时蛋白互补的方法。特别地，本发明的方法涉及实时检测靶核酸分子，包括DNA和RNA靶点，以及核酸类似物。在这种方法中，通过与核酸结合部分相结合来检测靶核酸，该核酸结合部分与活化的分裂多肽结合，其中核酸结合部分与靶核酸结合，使得活化的分裂多肽紧密接近，立即形成活性蛋白.

在一个实施方案中，与活化的分裂多肽片段结合的核酸结合部分结合到靶核酸上的两个相邻序列上。在该实施方案中，相邻序列相互足够接近，使得当各个关联核酸结合部分结合到靶核酸上时，活化的分裂多肽片段相互结合并组装成活性蛋白。该实施方案提供对单链和双链靶核酸的检测。为了检测双链靶点，单链探针与双链靶点相互作用，形成一种三链体。

在另一个实施方案中，与活化的分裂多肽片段结合的核酸结合部分是核酸或寡核苷酸，并结合到单链靶核酸上的相同序列上，形成一种三链体。在该实施方案中，当与活化的分裂多肽片段关联的核酸结合部分结合到靶点上时，活化的分裂多肽片段之间相互作用，组装成互补复合物。

例如，本发明涉及用于实时蛋白互补的方法。特别地，本发明的方法涉及实时检测靶点分析物，包括生物分子、有机分子和无机分子，及其片段或代谢产物。在这种方法中，靶点分析物通过其分析物结合基序来检测，该分析物结合基序与活化的分裂多肽关联，其中该基序结合靶点分析物上，使得活化的分裂多肽紧密接近，立即形成活性蛋白。

在特定的实施方案中，本发明的方法可用于体外检测是否存在感兴趣的靶核酸。由于本发明的方法、试剂盒和组合物涉及特异性检测靶核酸和靶点分析物，即使存在非靶点分子，它们尤其适合开发灵敏而可靠的基于探针杂交分析，该杂交分析用于分析点突变，或者可靠地检测靶点分析物。本发明的方法、试剂盒和组合物还可用于检测、量化或分析生物体(微生物)、细菌、真菌和感兴趣的基于遗传临床条件。

在一个实施方案中，本发明提供分离样品中的靶核酸的方法，即使存在非靶序列。在选择性的实施方案中，本发明提供分离样品中的靶点分析物的方法。

本发明的另一个重要方面在于用活化的分裂多肽实时评估核酸杂交和分析核酸相互作用的用途。在这种实施方案中，本发明提供实时立即检测寡核苷酸杂交的方法，该寡核苷酸作为核苷结合部分偶联到活化的分裂多肽蛋白片段上。例如，局部加热(如Hamad-Schifferli等人，Nature，第415卷，2002年1月10日中所述，在此完全引入作为参考)可用于使被结合的寡核苷酸变性，从而使活化的分裂多肽片段分离并关闭信号和/或荧光。本发明的活化的分裂多肽是独一无二的，因为在于当寡核苷酸处于分离状态时，活性蛋白立即分解，并且信号得以改善。在实施方案中，分裂多肽片段是分裂的荧光性片段，在核酸杂交时，荧光实时地立即淬灭或得以改善。此外，分裂多肽也是独一无二的，因为如果通过寡核苷酸杂交促进再结合时，活性蛋白的信号(例如荧光)立即重新产生。

在该实施方案中，使用本发明的分子可以有效地实施和记录各种需要进行多次开关循环的分析中的结果，并且可以实时从视觉上观察核酸杂交事件。此外，本发明的方法能够筛选干扰或促进杂交和/或妨碍核酸杂交循环事件的试剂。例如，本发明的活化的分裂多肽蛋白分子和/或活化的分裂荧光蛋白分子可用于快速实时筛选干扰杂交或杂交循环事件的试剂。作为非限制性例子，本发明的方法可用于快速筛选特异的抑制性核酸序列，例如，反义核酸、RNAi、siRNA、shRNA、mRNAi等和/或筛选促进或妨碍这种抑制性核酸的活性的试剂。在这样的实施方案中，减少与活化的分裂荧光蛋白关联的结合部分之间杂交的试剂或分子，导致活性蛋白的信号消弱或减少，而促进结合部分之间杂交的试剂，导致活性蛋白增加。

在另一个实施方案中，分子可用于核酸的实时量化。在相关的实施方案中，本发明的方法可用于免疫RCA和免疫PCR方法中。本发明的另一个实施方案提供应用实时蛋白互补在体外筛选靶核酸。例如，在其它非靶核酸群体中鉴定感兴趣的靶核酸。在该实施方案中，本发明的靶核酸或者分裂多肽分子以被连接到某类固体支持物上的形式使用，无论何种方式都是便捷的。可以通过某些分子种类连接到这种支持物上，例如某类聚合物生物学的或其它的，它们将所述引物或ATC连接到固体支持物上，以便检测用本发明的方法通过滚环扩增制备的串联DNA序列。

用于本发明方法中的这种固态基底包括任何固体材料，寡核苷酸可以偶联到该固体材料上。包括材料，如丙烯酰胺、纤维素、硝化纤维、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧化乙烯、玻璃、聚硅酸盐、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、碳氟化合物、尼龙、硅橡胶、多聚酐、多聚乙醇酸、多聚乳酸、聚原酸酯、聚丙基富马酸、胶原、粘多糖和多聚氨基酸。固态基底具有任何有用形式，包括薄膜或膜、珠、瓶、培养皿、纤维、编织物、成型多聚体、颗粒和微粒。固态基底的优选形式是玻璃片或者微量滴定盘(例如，标准的96-孔培养皿)。作为其它排列，参见美国专利No.US5,854,033中描述的那些。

将寡核苷酸固定在固态基底上的方法已经确立。采用确立的偶联方法，将寡核苷酸连接到基底上，包括寻址探针和检测探针。例如，合适的连接方法被描述在Pease等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(11)：5022-5026(1994)中。将寡核苷酸连接到固态基底上的优选方法被描述在Guo等人，Nucleic AcidsRes.22：5456-5465(1994)中。

在另一个实施方案中，本发明的分子可用于量化非核酸分析物。在本发明的另一个实施方案中，提供实时蛋白互补用于体外筛选靶点分析物的用途。例如，用于在其它非靶点分析物的群体中鉴定感兴趣的靶点分析物。在该实施方案中，结合到本发明的分裂多肽分子上的分析物的结合基序以连接到某类固体支持物上的形式使用，无论何种方式都是便捷的。可以通过某些分子种类连接到这种支持物上，例如某类聚合物，生物学的或其它的，它们将所述引物或ATC连接到固体支持物上，以便检测用本发明的方法通过滚环扩增制备的DNA分析物。

本发明的另一个重要的实施方案是使用分裂多肽分子体外实时检测特定核酸序列的用途。特别的，本发明可以实时检测个体中的基因突变、多态现象或异常。生物学样品分离自个体，并提取DNA和/或RNA。对本发明的分子进行设计，使得分裂荧光蛋白是结合到寡核苷酸上，该寡核苷酸特异于将要检测的特定突变、多态现象或者异常。选择性地，使用一群分子，其中许多突变、多态现象或异常被检测。在该实施方案中，连接到分裂荧光蛋白上的寡核苷酸相互互补，因此基线是荧光。然后各个DNA和/或RNA与所述分子接触。如果该个体具有特定的突变或多态现象，DNA和/或RNA会与分裂荧光分子竞争，并使荧光降低。优选地，在与荧光分子接触之前对个体的DNA和/或RNA进行扩增。这在检测已知多态现象中的单一核苷多态现象是特别有用的。由于荧光检测的直接性，本发明分子可用于灵敏检测。

在一个实施方案中，该分子可用于体外实时检测病原体。在一个实施方案中，本发明的分子可用于检测病原体核酸序列的存在和/或核酸序列中的异常，作为存在病原体和/或病原体核酸的结果。在选择性的实施方案中，本发明的分子可用于检测非核酸分析物的存在，作为感染病原体的结果。病原体可以是病毒感染、真菌感染、细菌感染、寄生虫感染和其它感染疾病。病毒可选自1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、细胞巨化病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒、6型人疱疹病毒、7型人疱疹病毒、8型人疱疹病毒、天花病毒、水泡性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、流感病毒A、流感病毒B、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、劳氏肉瘤病毒、黄热病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、St.Louis脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、裂谷热病毒、轮状病毒A、轮状病毒B、轮状病毒C、辛德比斯病毒、猿猴免疫缺陷病毒、I型人T细胞白血病病毒、汉坦病毒、风疹病毒、猿猴免疫缺陷病毒、1型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒。

对靶核酸或靶点分析物的检测还可用于检测食物、饮料、水、药品、个人护理品、日用品或环境样品中的细菌和真核生物。优选的饮料包括苏打水、瓶装水、果汁、啤酒、红酒或酒精饮料。所开发的分析方法对于原材料、设备、产品或制造方法的分析是有用的，所述原材料、设备、产品或制造方法是用于加工或存储食物、饮料、水、药品、个人护理品、日用品或环境样品。

在本发明的另一个相关实施方案中，组装活化的分裂荧光的多肽，形成一个含有不连续抗原表位的组装蛋白，该蛋白可用特异性识别组装蛋白上的不连续抗原表位但是不识别存在于任一各个多肽上的部分抗原表位的抗体来检测。不连续抗原表位的一个例子存在于HIV的gpl20中。这些抗原可以作为指示蛋白用本领域知晓的方法进行后续检测，例如免疫检测。本领域技术人员基于公知技术能够容易地制备这些抗原和其它衍生物，筛选识别组装蛋白的抗体，该抗体不是通过组装蛋白的任一蛋白片段识别该蛋白。

靶核酸可以是来自人的。靶核酸可以是DNA或RNA。靶核酸可以是游离在溶液中或者固定到固体支持物上。

在一个实施方案中，靶核酸或靶点分析物是特异于一种遗传疾病或者特异于一种遗传疾病的倾向。所述疾病可以是，例如，β-地中海贫血、镰状细胞血症或者Factor-V Leiden、遗传疾病样囊肿性纤维化(CF)、癌相关靶点样p53和p10，或者易感胸癌的BRC-I和BRC-2。而在另一个实施方案中，对所分离的染色体DNA进行涉及亲子关系、身份确定或者犯罪调查的研究。

靶核酸或靶点分析物特异于病原体或微生物。选择性地，靶核酸或靶点分析物可以来自病毒、细菌、真菌、寄生虫或者酵母；其中互补分子杂交到靶核酸上，指示样品中存在所述病原体或微生物。

在另一个实施方案中，本发明提供适合检测样品中是否存在靶核酸或靶点分析物和/或其含量的试剂盒。试剂盒至少包含连接到第一个分子上的第一探针，和连接到第二个分子上的第二探针，其中探针能够结合到靶核酸中的杂交序列上。优选地，探针装在小瓶中。试剂盒还包含适合捕获和/或检测样品中靶核酸或靶点分析物的存在或含量的试剂。用于检测靶核酸和/或靶点分析物的存在和/或含量的试剂可以包含酶活性试剂或者特异于组装的蛋白的抗体。该抗体可以是被标记的。这种试剂盒任选地包括实施RCA反应所需的试剂，例如DNA聚合酶、DNA聚合酶辅助因子、脱氧核苷酸-5′-三磷酸。可选择地，该试剂盒还包括各种多核苷酸分子、DNA或RNA连接酶、限制性内切酶、逆转录酶、末端转移酶，各种缓冲液和试剂，及抑制DNA聚合酶活性的抗体。这些成分在容器中，例如小瓶。试剂盒还包括实施阳性对照反应和阴性对照反应以及指示所需的试剂。在得益于当前公开内容的情况下，本领域技术人员能够容易地确定用于特定反应中试剂的最佳含量。

在另一个实施方案中，本发明的方法可用于多个核酸靶点或多个分析物的同时蛋白互补。作为一个示例性而非限制性的例子，结合不同核酸结合基序的互补性分裂多肽片段发生蛋白互补。例如，一个靶核酸的存在将促进一对活性分裂多肽片段发生蛋白互补，而另一个靶点的存在将促进另一对活化的分裂多肽片段发生蛋白互补，生成不同的活性蛋白和可检测信号。在这种实施方案中，多个核酸靶点是可以同时检测的。在选择性的实施方案中，同时检测靶核酸，例如，通过实时蛋白互补监控RNA和DNA。在选择性的实施方案中，使用包含特定的分析物结合基序的分裂多肽片段，可以同时检测多个非核酸分析物。这种实施方案是特别有用的，例如评估一种以上的引起症状的分析物的存在或含量，这可用于疾病、异常或功能紊乱的诊断。

在相关的实施方案中，使用来自不同荧光蛋白的分裂荧光蛋白片段，进行多个蛋白互补。在相关实施方案中，本发明的方法能够实时检测和鉴定存在于多种其它假定但是不同的核酸靶点中的特定靶核酸(参见Hu等人，Nature Biotechnology，2003：21：539-545；Kerppola，2006，7：449-456，Hu，等人，Protein-Protein Interactions(P.Adams和E.Golemis编辑)，ColdSpring Harbor Laboratory Press.2005，该文献在此完全引入作为参考)。

定义

除非另外指出，本文所使用的以下术语和表述意在具有如下含义：

术语“再折叠”是指在溶解过程中产生的解离蛋白分子折叠成它们的天然三维构象。该过程受所述蛋白氨基酸序列的影响。众所周知，当在蛋白中形成二硫键之前进行再折叠时，将在正确的位置上形成二硫键，从而导致天然构象的活性蛋白的形成。

本文使用的术语“预先形成的”是指已经形成的构象和结构。术语“预先形成的发色团”是指对于荧光产生是必要的所述发色团的成熟构象。预先形成的发色团存在于所述活性构象中，并且不需要进行结构修饰来变为有活性。

术语“多核苷酸”是指存在于核酸或构建体中的任何一种或多种核酸片段，或是核酸分子，例如DNA或RNA片段。“编码感兴趣的基因的多核苷酸”是指包含这样的多肽的编码区域的多核苷酸。此外，多核苷酸可以编码一种调控元件，例如启动子或者转录终止子，或者编码多肽或蛋白的特定元件，例如分泌性的信号肽或者功能性结构域。

“核苷”是聚合的核酸如DNA或RNA中的单体单元，并且由三个不同的亚部分(subpart)或基序组成：糖、磷酸和核碱基(nucleobase)(Blackburn，M.，1996)。当为二链体的部分时，核苷也被称作为“碱基”或“碱基对”。最普通的天然存在的核碱基，腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)带有氢键结合功能，该功能以序列特异性方式将一条核酸链结合到另一条核酸链上。“核苷”是指不含有磷酸的核苷。在DNA和RNA中，所述核苷单体通过磷酸二酯键来连接，本文所使用的术语“磷酸二酯键”是指磷酸二酯键或包括其磷酸盐类似物的键，包括结合相反离子，例如IT’、NW、Na’等。

本文所使用的术语“寡核苷酸”和“引物”具有其在标准核酸操作中相关的传统含义，即能够杂交到多核苷酸模板上的寡核苷酸，并且作为与所述模板链互补的引物延伸产物的合成起始点。

“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指天然核苷单体或其类似物的线性多聚物，包括双链的和单链的脱氧核糖核酸“DNA”、核糖核酸“RNA”等。换句话说，“寡核苷酸”是脱氧核糖核酸链或核糖核酸链，它们分别是包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的结构单元。通常地，多核苷酸的大小范围从少数单体单元(例如8-4O)到数千个单体单元。无论何时将DNA多核苷酸用字符序列表示，例如“ATGCCTG”，应当理解，除非另外指出，该核苷是以从5′→3′的顺序从左到右，而“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，而“T”表示胸苷。

“Watson/Crick碱基配对”和“Watson/Crick互补”是指核苷及其类似物的特定配对模式，所述核苷及其类似物是通过氢键结合在一起，例如T和U配对，G与C配对。特定的碱基配对的行为是“杂交”。当两条或多条核酸或核酸类似物的互补链发生碱基配对时，形成杂交体。

本文所使用的术语“寡核苷酸”和“引物”具有其在标准核酸操作中相关的传统含义，即能够杂交到多核苷酸模板上的寡核苷酸，并且作为与模板链互补的引物延伸产物的合成起始点。

将许多本文所述的寡核苷酸设计为与其它寡核苷酸或核酸的特定部分互补，从而在它们之间形成稳定的杂交体。这些杂交体的稳定性可用已知的方法来计算，例如在Lesnick和Freier，Biochemistry 34：10807-10815(1995)，McGraw等人，Biotechniques 8：674-678(1990)和Rychlik等人，Nucleic AcidRes.18：6409-6412(1990)中描述的那些方法。

“偶联物”或“偶联的”是指两个或多个实体的连接。所述连接可以是两种或更多种多肽的融合，或是共价的、离子的或疏水的相互作用，其中分子的基序结合在一起并保持在接近的状态。所述实体的连接可以通过接头、化学修饰、肽接头、化学接头、共价键或非共价键，或者蛋白融合或者本领域技术人员知晓的任何手段连接在一起。所述连接可以是永久性的或可逆的。在一些实施方案中，可以包括若干接头，以利用各个接头和偶联物中的各个蛋白的所期望的性质。本文包括预期单独使用或者与其它接头一起使用柔性接头和提高偶联物的溶解性的接头。通过表达编码所述接头的DNA，将肽接头连接到偶联物中的一个或多个蛋白上。接头是可用酸裂解、光裂解的和热敏感的接头。

术语“部分”或“基序”在本文中互换使用，是指能够实现特定功能的分子、核酸或蛋白或其它物质。“核酸结合部分”或“核酸结合基序”是指能够以特定方式结合到所述核酸上的分子。

“检测”是指基于检测标记的性质对构建物进行检测、观察或者测量。

术语“核碱基修饰的”是指在DNA和RNA中天然存在的核碱基AGC，T，U的碱基配对衍生物。

术语“启动子”是指足以指导转录的最小核苷序列。本发明还包括那些足以引起启动子依赖性基因表达的启动子元件，该表达可以受细胞类型特异性、组织特异性的控制或者可由细胞外信号或试剂诱导；这样的元件位于所述天然基因的5′或3′区，或者在所述内含子中。术语“诱导型启动子”是指一种启动子，其与RNA聚合酶结合以及转录起始的速率受到细胞外刺激的调控。术语“组成型启动子”是指与RNA聚合酶结合以及转录起始的速率恒定并且相对独立于细胞外刺激的启动子。“瞬时调控启动子”是与RNA聚合酶结合以及转录起始的速率受发育过程中特定时间调控的启动子。本发明包括所有这些启动子类型。

术语“多肽”或“肽”在本文中互换使用，是指蛋白。

本文所使用的术语“体外”意在包括所述生物体之外的任何溶液或任何细胞。通常，体外是指在试管、小瓶或任何其它容器或支持物中发生的反应，其中所述溶液和/或细胞分离自其通常出现的环境。

本文的非核酸分析物上下文中使用的术语“分析物”是指任何化学上、生物上或结构上的实体，所述实体不是核酸或核苷或核酸类似物。这样的分析物包括但是不限于，有机分子、无机分子、生物分子、代谢产物等。

实施例

实施例1

方法

分子建模：用串珠法¹⁸对EGFP及其片段进行建模。将多肽的每个氨基酸分别用对应于C_α和C_β位置上的两个珠来表示。约束相邻的珠来模拟主链几何学和柔性。氨基酸之间的相互作用基于Gō样结构的势能¹⁸来模拟。在这样的模型中，两个氨基酸被指定为相互吸引或相互排斥的势能，取决于两个氨基酸在天然蛋白状态中是否形成接触。从蛋白数据库银行(X-射线结构；PDB代码为Ic4f)获取天然EGFP的构象。为了选择EGFP片段中的氨基酸的接触势能，我们使用完全大小的蛋白的天然结构。通过离散分子动力学(DMD)方法¹⁸来分析蛋白折叠热力学和动力学。

多肽的克隆、表达和纯化：将含有EGFP-1基因的质粒(Clontech)用作PCR扩增编码大(A)EGFP片段和小(B)EGFP片段的DNA序列的模板。所述大片段含有158个N-末端氨基酸加上一个C-末端半胱氨酸，并且所述小片段含有剩余的C-末端81个氨基酸加上一个N-末端半胱氨酸。将PCR产物克隆到TWIN-I载体(New England Biolabs)中来获得Ssp DNAB内含肽的C-末端融合物(利用内含肽自分裂化学^21，22纯化所期望的蛋白片段)，并且在BL21(DE3)pLys感受态大肠杆菌(Stratagene)中表达。通过测序验证所有构建物的结构。用于PCR扩增的引物为：具有C-末端半胱氨酸的EGFP大片段：引物α-正向(Primer ALPHA_dir)：

5′-AGTTTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCG(SEQ ID NO.1)；

引物α-CYS-反向(Primer ALPHA-CYS_rev)：

5′-ATCGCTCGAGTTAGCACTGCTTGTCGGCCATG(SEQ ID NO.2)；

生物素化的寡核苷酸1：生物素-5′-CGACTGCGTTAGCATGTGTTG(SEQ ID NO.3)。

含有N-末端半胱氨酸的EGFP小片段：引物β-CYS-正向(PrimerBETA-CYS_dir)：5′-ATCGGATATCATGTGCAAGAACGGCATCAAGGTG(SEQ ID NO.4)；

引物β-反向×(Primer BETA_rev)：

5′-ATCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCC(SEQ ID NO.5)；

生物素化的寡核苷酸2：5′-CAACACATGCTAACGCAGTCG-生物素(SEQID NO.6)。

将细胞生长过夜，达到OD₆₀₀＝0.6，25℃下用0.35mM IPTG诱导过夜。通过离心来沉淀细胞，用缓冲液(含有50mM Tris-HCl，pH 8.5，25％蔗糖，1mM EDTA，10mM DTT)洗涤，并且冷冻(-70℃下10分钟)和解冻(37℃下5分钟)3次。当将细胞保持于冰上，以3次30秒的裂解来超声波溶解细胞，每次间隔30秒(Sonifier细胞破裂仪W185c，Branson Sonic Power)。将得到的混合物在4℃下以15000rpm离心5分钟，将所述沉淀悬浮在同样的缓冲液中，并再次超声波处理进行另外3次30秒的裂解。将沉淀洗涤3次，并且随后悬浮在含有25mM MES pH 8.5，8M尿素，10mM NaEDTA，0.1mMDTT的缓冲液中，在室温下放置1小时。以15000rpm对被溶解的蛋白离心5分钟，并且随后通过以1:100的稀释比例，逐滴加入再折叠缓冲液(50mMTris pH 8.5，500mM NaCl，1mM DTT)，使所述上清液再次折叠。按照生产商的推荐使用壳多糖柱来纯化再折叠的蛋白。全部蛋白的纯度通过SDS-PAGE来分析(图3A)。在Hitachi U-3010分光光度计中记录蛋白吸收光谱。

蛋白与寡核苷酸的偶联、蛋白的互补和荧光测量：首先，用G-25微量凝胶过滤柱(Amersham Biosciences)将EGFP蛋白片段凝胶过滤进入PBS-EDTA，pH 7.5缓冲液中。然后，将这些溶液以10:1的体积比与10mM生物素-HPDP(Pierce)在二甲基甲酰胺中混合，并且在室温下孵育2小时，达到≥70％生物素化。通过凝胶过滤，从生物素化的蛋白中除去未反应的生物素-HPDP。接着，37℃下，在PBS-EDTA缓冲液中，将这些片段与等摩尔量的链霉抗生物素(通过滴定试验测定；参见图4A)孵育15分钟，获得生物素化EGFP片段与链霉抗生物素的1:1复合物。最后，将等摩尔量的相应生物素化寡核苷酸加入到每一二元复合物中，得到1:1:1的三分子构建物。将如此获得的三分子构建物在PBS-EDTA缓冲液中以1:1的摩尔比例混合，得到最终浓度约200nM。在Hitachi F-2500分光光度计中监测分裂EGFP已恢复的荧光反应。为了解离由已恢复的寡核苷酸支持的蛋白构建物，加入100倍过量的非生物素化寡核苷酸(具有与用于偶联大EGFP段的生物素化低聚体相同的序列)，记录所产生的荧光变化。

结果

在我们的设计中(图1A)，荧光蛋白的两个片段与互补性寡核苷酸偶联。一条多肽含有能够在完全大小的蛋白中产生荧光的发色团。然而，该发色团在蛋白片段中不发出荧光，这是因为该发色团暴露在溶液中并被溶液淬灭，并且其还缺乏与其它片段氨基酸的必要接触。当通过核酸的互补性相互作用，这两个蛋白片段相互接近，所述第二多肽作为所述发色团的屏蔽物，将该发色团与溶液隔离开来，使所有缺少的氨基酸接触得以恢复，导致荧光产生。在本研究中，我们通过9个氨基酸的柔性环(EGFP残基153-161)¹⁶，将对应于大结构域和小结构域的两个增强的绿色荧光蛋白的片段(EGFP)²连接在一起。已知较大的N-末端EGFP结构域含有形成发色团的3个氨基酸，该发色团在天然蛋白中发荧光，但是在变性蛋白中不发荧光^2，17。而且，该三肽在分离的EGFP大片段中不发荧光^6-9。

所述EGFP发色团的形成是一个需要蛋白正确折叠的自催化过程¹⁷。我们假设N-末端EGFP片段(约为完整EGFP的2/3)足够大，从而能够通过自身形成一个压缩的折叠结构。我们还假设该结构与完整EGFP的相应部分在构象上非常接近，从而在折叠的大EGFP片段中自发地形成发色团，尽管该发色团不发荧光。

使用离散分子动力学(DMD)模拟¹⁸，我们对所述EGFP及其大片段进行分子建模分析。DMD模拟的结果是所述EGFP大片段事实上发生特征为势能大大降低的折叠的温度(T<0.6)；在更高温度下(T>0.6)所述蛋白保持具有高势能的未折叠状态。通常单个结构域蛋白而言，该多肽的折叠热力学和动力学经过两个状态的、全部或无的模式(all-or-none mode)。接近转变温度TF约0.60时，所述EGFP大片段显示折叠的和未折叠的两种状态，两者的概率相同，并且势能发生大的波动(图2B)。在所述的折叠和未折叠的事件中，未观察到EGFP大片段的中间状态。

图2C说明了折叠的EGFP大片段的压缩结构，除了其摇摆的20个残基的长C-末端部分。此外，形成发色团的氨基酸在完全大小的EGFP中和在大片段中的排列基本上是相同的(图2D，E)，从而有可能形成发色团。而且，图2C显示，在EGFP大片段中形成发色团的氨基酸暴露在溶剂中，而在完全大小的EGFP中情况并不如此，其中这些氨基酸深深地隐藏在蛋白内部(图2D)。此外，这些氨基酸缺乏许多与EGFP较小片段的其它残基的重要接触，这些接触存在于完全大小的蛋白中¹⁹。因此，即便形成发色团，该发色团可能不足以在不完整的EGFP中发出强烈的荧光。

EGFP小片段由两个β-发夹结构组成，这两个发夹结构不相互接触，因此该多肽自身不能形成较为确定的压缩结构。然而，我们的EGFP折叠DMD模拟提示，一旦EGFP小片段结合到其较大的配对物上时，其寻找正确位置从而成为联合的压缩蛋白结构的一部分，并且EGFP大片段中的摇摆部分因此也发生折叠。

我们随后通过克隆和分离该蛋白的两个分离片段，在柔性环中的氨基酸158和159之间遗传分割EGFP，这两个片段对应于用于模拟DMD的大结构域和小结构域。为了具有最佳功能，基于分裂EGFP的光学转换应当能够快速应答DNA杂交-去杂交事件。已知核酸的互补性相互作用是迅速的(在几分钟内)^12，13，20。相反，重新形成成熟的前荧光EGFP发色团需要几小时¹⁷。基于分子建模分析，我们猜想可以体外分离含有预先形成的发色团的EGFP片段大。如果情况如此，那么两个EGFP片段的荧光活性互补将快速发生，仅需要几分钟，而不是几小时。在所有先前报道中记载的，体外EGFP重新组装最可能用缺乏成熟发色团的蛋白来进行，所述成熟发色团的形成仅归因于重新组装^6-9。因此，在这些研究中，荧光的产生是非常缓慢的。

EGFP大片段和小片段作为与小的自分裂Ssp DNAB内含肽²¹的融合物在大肠杆菌中过表达，以便于蛋白的纯化²²。这些多肽再折叠后从内含体中分离(详见方法)。已经显示出，与荧光蛋白融合的内含肽不会影响其正确的折叠²²。图3A表明两种EGFP片段均以足够高的纯度获得：再折叠的蛋白样品中含有≥70％的EGFP大片段和约90％的EGFP小片段。

图3B显示这些多肽的吸收光谱。可以看出，两种EGFP片段均缺少在490nm下的特征峰，该特征峰可见于天然EGFP中(图3B的插图)。然而，与EGFP小片段和其它无荧光/发色团游离的蛋白(链霉抗生物素)相反，EGFP大片段的特征在于在300-400nm范围内有显著吸收，这是变性EGFP¹⁷发色团所期望的，并且这也在其它光活性分裂EGFP变体中观察到²³。在EGFP大片段中发色团的存在荧光谱中变得更显著(图3C)：该片段具有微弱的荧光(与完整EGFP的峰值相比，荧光弱约100倍)，在360nm下具有明显的最大激发，在460nm下具有最大的发射光谱。这些光谱完全区别于全长EGFP的光谱(参见图4A中的EGFP发射光谱；EGFP激发光谱与图3B插图中显示的吸收光谱类似)。然而，它们对应于所述合成发色团的荧光谱，并且对应于含有发色团的短肽的光谱，所述短肽通过部分蛋白水解从完整的荧光蛋白中分离²⁴。因此，这些数据表明从内含体中分离和再折叠的EGFP大片段含有预先形成的发色团。

针对DNA支持的EGFP互补，使用生物素-链霉抗生物素化学(图1)，将蛋白片段与互补性寡核苷酸偶联。EGFP大片段和小片段分别用C-末端和N-末端含有额外的半胱氨酸残基来表达，以用于使用巯基反应性试剂、生物素-HPDP的生物素化。然后，C-末端和N-末端生物素化的多肽可以通过链霉抗生物素与生物素化的寡核苷酸偶联；这种高亲合性的生物素结合性蛋白^25，26作为一种接头。我们认为EGFP A片段中的末端Cys将是生物素化的主要靶位点，而内部的Cys₄₉和Cys₇₁在某种程度上隐藏在所述多肽内部(如由图2c，e中的DMD结构所支持的)将是更低反应性的。

我们选择这种非共价的偶联，是由于其允许进行模型设计^27，28，这在制备不同的EGFP光学转换时是有利的。要注意，如果随后的解离是必要的，在所述蛋白和生物素-HPDP之间通过S-S键形成的连接可以容易地以还原剂来分割。在计划该设计时，我们认为其空间排列将同时允许寡核苷酸形成二链体，并且所述EGFP片段之间相互接近。实际上，当两个链霉抗生物素分子并排时，它们的中心相距约60

如果所述生物素结合部位位于靠近每个链霉抗生物素亚单位中间²⁶，可以估计所述相接触蛋白中的这两个部位之间的最小距离为约30

。生物素-HPDP试剂和寡核苷酸中的生物素接头的长度≥25，因此对于所有相应的组装部分的结合是足够的。

将所述生物素化的EGFP片段以1:1的比例连接到链霉抗生物素上(图4a)，并且随后在5′-或3′-端与带有生物素的相应寡核苷酸偶联(图4b；参见图1的图表)。当这些三分子构建物以等摩尔量组合时，检测到荧光的急剧增强，具有类似于EGFP(图4c)的激发/发射光谱。相反，对照实验使用无互补性寡核苷酸的混合链霉抗生物素结合的蛋白片段，未显示出任何可感知的荧光。以DNA为模板的EGFP重新组装的动力学是快速的，其t_1/2≤1min(图4a插图)。这与EGFP从具有成熟发色团的变性蛋白中复性的动力学接近^2，17，并与DNA二链体基本上是立即的形成十分吻合²⁰。重新组装的复合物的荧光强度随实验而变化，具有接近于完整EGFP的最高应答。

应当注意，完整的EGFP和重新组装蛋白的荧光谱之间存在两点区别。首先，针对重新组装的蛋白的激发/发射最大值与EGFP的488/507nm相比红移至490/524nm。所述光谱改变可以通过重新组装蛋白中围绕所述发色团的氨基酸的多少有所不同的排列，以及通过链霉抗生物素和/或复合物中的负电荷性的DNA的存在来解释。第二个区别在Mg²⁺离子增加时变得明显。在加入2mM MgSO₄后，天然EGFP的荧光逐渐减少，在3小时后变为约起始值的70％，这与已知的二价阳离子对EGFP荧光的淬灭效应是一致的²。相反，在加入Mg²⁺后的数分钟内，重新组装的复合物的荧光增加约30％，并且保持基本上不变的状态(图4d)。这种效果可以通过Mg²⁺对双链体DNA的稳定作用来解释，其在DNA-蛋白复合物内EGFP的重新组装中起主要作用。

最后，我们检测了解离被组装的多组分复合物来关闭恢复的分裂EGFP的荧光的可能性。为了这一目的，我们还使用了DNA杂交(参见图1的第二部分)。当将两种互补寡核苷酸之一过量加入到所述荧光复合物中时，已经检测到荧光基本上的立即下降(图4c)。显然，未标记的寡核苷酸的竞争性杂交取代了其蛋白标记的的等价物，结果分裂了所述互补的蛋白复合物。选择性地，通过局部加热²⁰可以远程控制DNA杂交-去杂交事件，使得进行多次在系统中产生光学信号的开-关循环是可能的。我们将这种方法称作为Swift& Winked Illumination Triggered& Controlled by Hybridization(SWITCH)，指明该方法的可能应用。

维多利亚水母(Aequorea Victoria)绿色荧光蛋白(ACCESSION M62653)：MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTfGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKPEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ IDNO.7)。

维多利亚水母(Aequorea Victoria)绿色荧光蛋白的mRNA，完整的cds (ACCESSION M62653)：

tacacacgaa taaaagataa caaagatgag taaaggagaa gaacttttca ctggagttgt cccaattctt

gttgaattag atggtgatgt taatgggcac aaattttctg tcagtggaga gggtgaaggt gatgcaacat

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tactttctct tatggtgttc aatgcttttc aagataccca gatcatatga aacagcatga ctttttcaag

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agatggaaac attcttggac acaaattgga atacaactat aactcacaca atgtatacat catggcagac

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tctatattaa ttacaatttg atttgacttg ctcaaa(SEQ ID NO.8)。

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所有在此描述的参考文献全文引入本文作为参考。

Claims (52)

1.一种用于检测个体中的疾病或障碍的方法，所述方法包括：

a.从个体中获得待测生物学样品；

b.从所述生物学样品中分离DNA或者RNA；

c.将所述DNA或RNA与分裂荧光多肽分子接触，其中将所述分裂荧光多肽片段结合到核酸结合基序上，并且其中至少一个所述的核酸结合基序是特异于与疾病或障碍相关的特定核酸的；和

d.检测所述可检测蛋白的信号改变，其中所述信号改变表明存在一种疾病或障碍。

2.一种用于检测个体中的疾病或障碍的方法，所述方法包括：

a.从个体中获得待测生物学样品；

b.从所述生物学样品中分离出非核酸的分析物；

c.将所述非核酸的分析物与分裂荧光多肽分子接触，其中所述分裂荧光多肽片段结合到所述非核酸分析物的结合基序上，并且其中至少一个分析物结合基序特异于与疾病或障碍相关的特定核酸；和

d.检测可检测蛋白的信号变化，其中信号改变指示存在一种疾病或障碍。

3.权利要求1和2的方法，其中所述分裂荧光多肽包括：

a.EGFR肽的第一片段，包括从氨基酸1至约氨基酸158；和

b.EGFR肽的第二片段，包括大约氨基酸159至氨基酸239；和

c.位于第一和第二EGFR片段之间的切割肽。

4.权利要求1和2的方法，其中该疾病是病原体。

5.权利要求1和2的方法，其中所述病原体选自：病毒、流感病毒、细菌、真菌、寄生虫或酵母。

6.权利要求4的方法，其中该病原体是病毒。

7.权利要求1和2的方法，其中该疾病是疾病遗传倾向的。

8.一种包含分裂荧光多肽的内含体的制剂，其中所述分裂荧光多肽包括：

a.EGFR肽第一片段，包括从氨基酸1到约氨基酸158；和

b.EGFR肽第二片段，包括大约氨基酸159到氨基酸239；和

c.位于第一和第二EGFR片段之间的切割肽。

9.一种分裂多肽蛋白片段分子，所述分裂多肽蛋白片段分子包含可检测蛋白的至少两个多肽片段，其中该片段：(a)处于活化形式；(b)本身无活性；(c)还包含核酸结合基序；以及(d)在靶核酸的存在下迅速互补来实时地重新构建所述的活性蛋白。

10.权利要求7的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述靶核酸选自：DNA、RNA、PNA及其类似物。

11.一种分裂多肽蛋白片段分子，所述分裂多肽蛋白片段分子包含可检测蛋白的至少两条多肽片段，其中所述片段：(a)处于活化形式；(b)本身无活性；(c)还包含非核酸分析物的结合基序；以及(d)在靶分析物分子的存在下迅速互补来实时地重新构建所述活性蛋白。

12.权利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述靶分析物分子是生物分子、有机分子或无机分子。

13.权利要求9和11的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述的可检测蛋白是荧光蛋白。

14.权利要求9和11的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述荧光蛋白选自：绿色荧光蛋白(GFP)、GFP样荧光蛋白(GFP样)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、增强的蓝绿色荧光蛋白(ECFP)，和红色荧光蛋白(dsRED)以及它们的变体。

15.权利要求9和11的分裂多肽蛋白片段分子，其中该分子是分裂荧光蛋白分子，并且其中一个多肽片段包含荧光蛋白的成熟的发色团，且其中该分子的分裂荧光片段：(a)共同含有在荧光蛋白的发色团屏蔽桶(chromophore-shielding barrel)中的完全互补的β链；(b)本身是非荧光性的；(c)还包含核酸结合基序；和(d)在靶核酸或靶分析物分子的存在下迅速互补以实时地重新构建所述荧光蛋白和荧光表型。

16.权利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述的荧光蛋白是EGFP。

17.权利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中所述的核酸结合基序是选自：DNA、RNA、PNA、LNA、DNA结合蛋白或肽、RNA结合蛋白或肽。

18.权利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中一个片段上的核酸结合基序与其它片段上的核酸结合片段是相同类型的。

19.权利要求9的分裂多肽蛋白片段分子，其中一个片段上的核酸结合基序与其它片段上的核酸结合片段是不同类型的。

20.一种实时检测核酸杂交过程中变化的方法，该方法包括：(a)检测如权利要求2中所述分子的基线信号，其中以生物学样品中的核酸将一个片段上的核酸结合基序结合到第二个片段上的核酸结合基序上；(b)改变试验条件，从而可以改变所述样品中两个片段的结合；和(c)立即检测来自于所述生物学样品的荧光信号的变化，其中信号减少表明所述试验条件的改变降低所述分离多肽片段对其原始核酸靶点的亲和力。

21.权利要求20的方法，其中一个片段上的核酸结合基序与第二个片段上的核酸结合基序是相同类型的。

22.权利要求20的方法，其中一个片段上的核酸结合基序与第二个片段上的核酸结合基序是不同类型的。

23.一种制备活化的分裂多肽蛋白片段的方法，所述方法包括：

a.表达编码第一多肽片段和至少一种其它多肽片段的核酸序列，其中在靶核酸或靶非核酸分析物存在时，这两个多肽片段结合以形成处于其活性状态的可检测蛋白，其中当与野生型的活性蛋白相比较时，该多肽片段处于一种活化的且构象正确的形式；和

b.收集所述多肽片段以获得两种处于正确构象和活化状态下的分离蛋白片段。

24.权利要求21的方法，其中将编码第一多肽片段和至少一种其它多肽片段的核酸序列作为一种核酸序列来编码，其中所述核酸序列编码位于第一多肽片段和其它多肽片段之间的可分裂位点，其中所述的第一多肽片段和其它多肽片段可以被分离，并且当与野生型的活性蛋白相比较时，该多肽片段处于一种活化的且构象正确的形式。

25.权利要求24的方法，其中所述可分裂位点能够使得通过选自如下的裂解方式将第一多肽片段与其它多肽片段分离开：酶裂解、化学裂解、光裂解、波长裂解、热裂解、酸裂解。

26.权利要求23的方法，所述方法包括：

a.在微生物宿主细胞中表达核酸序列以形成内含体，所述核酸序列编码第一多肽片段和至少一种其它多肽片段，其中该内含体包含所述多肽片段；和

b.溶解所述宿主细胞，收集所述内含体并且将包含在步骤(a)的所述内含体中的多肽片段再溶解和再折叠，从而获得处于其活化构象中的所述第一多肽片段和至少一种其它多肽片段。

27.权利要求26的方法，所述方法还包括酶促或化学分裂包含第一多肽片段和至少一个其它多肽片段的多肽，以获得处于其活化状态的第一多肽片段和至少一种其它多肽片段。

28.权利要求26的方法，所述方法还包括从所述宿主细胞的可溶部分中收集所述多肽片段，以获得处于其活化构象中的第一多肽和至少一种其它多肽片段。

29.权利要求23的方法，其中所述可检测的蛋白是酶。

30.权利要求25的方法，其中所述酶具有显色活性。

31.权利要求23的方法，其中所述可检测的蛋白是荧光蛋白。

32.权利要求23的方法，其中荧光蛋白的第一多肽片段包含成熟的预先形成的发色团，所述发色团准备用于产生荧光。

33.权利要求31的方法，其中所述荧光蛋白选自：绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、增强的蓝绿色荧光蛋白(ECFP)、红色荧光蛋白(dsRED)及其变体。

34.权利要求31的方法，其中所述荧光蛋白是EGFP荧光蛋白。

35.权利要求34的方法，其中所述EGFP荧光蛋白包括第一多肽片段蛋白，该第一多肽片段蛋白包括氨基酸1至约氨基酸158，且其中所述EGFP荧光蛋白的第二多肽片段是约氨基酸159至氨基酸239。

36.权利要求23的方法，其中所述第一多肽片段还包含C-末端的半胱氨酸，且所述第二多肽片段还包含N-末端的半胱氨酸。

37.权利要求23的方法，所述方法还包括以巯基反应性试剂将第一多肽片段和至少一个其它多肽片段生物素化。

38.权利要求37的方法，其中巯基反应性试剂是生物素-HPDP。

39.权利要求23的方法，其中将所述第一多肽片段和至少另一个多肽片段进一步结合到被链霉亲和素结合的寡核苷酸上。

40.权利要求39的方法，其中所述寡核苷酸选自：DNA、RNA、PNA、LNA及其类似物。

41.权利要求23的方法，其中编码所述第一多肽片段和至少一种多肽片段的核酸还编码核酸结合部分。

42.权利要求41的方法，其中所述核酸结合部分是核酸。

43.权利要求42的方法，其中所述核酸结合部分结合到所述第一多肽片段和至少一种其它多肽片段上。

44.权利要求42的方法，其中所述核酸结合部分选自：DNA结合性蛋白、DNA结合性肽、RNA结合性蛋白、RNA结合性肽。

45.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

a.第一种和至少一种其它活化的分裂多肽片段，其中各个分裂多肽片段均包含核酸结合结构域或用于非核酸分析物的结合基序；

b.用于互补和信号检测的试剂和说明书。

46.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

a.第一种和至少一种其它的活化分裂多肽片段；

b.用于连接感兴趣的使用者自身的核酸结合基序或是非核酸分析物的结合基序的试剂和说明书；

c.用于互补和信号检测的试剂和说明书。

47.权利要求45和46的试剂盒，其中所述第一种和第二种活化的分裂多肽片段重新构建形成可检测的蛋白。

48.权利要求47的试剂盒，其中所述可检测的蛋白选自：β-内酰胺酶、DFHR、荧光素酶、荧光蛋白。

49.权利要求47的试剂盒，其中所述可检测的蛋白是抗原。

50.权利要求45和46的试剂盒，所述试剂盒还包含用于扩增所述样品靶核酸的试剂和说明书。

51.权利要求1和2的方法，其中所述变化是信号的减少。

52.权利要求1和2的方法，其中所述变化是信号的增加。

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