CN114686449A - 一种表达绿色荧光蛋白分裂肽的重组乙型肝炎病毒复制子及其构建方法 - Google Patents

一种表达绿色荧光蛋白分裂肽的重组乙型肝炎病毒复制子及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属生物技术及基因工程技术领域，涉及一种表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(split peptide)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV/GFPc)复制子及其构建方法。本发明还公开了一种内含肽(intein)介导的GFP分裂肽高效拼接的方法。本发明中，在乙肝病毒(HBV)基因组核心蛋白(HBc)编码区删除部分序列，并插入增强绿色荧光蛋白EGFP碳端分裂肽C11(EGFPC11)编码序列，构建一种重组HBV(rHBV)复制子系统。rHBV/EGFPc11为一种缺陷病毒，能够在HBc互补条件下实现功能性复制，并表达EGFPC11，在细胞中能与超级折叠绿色荧光蛋白sfGFP氮端分裂肽(sfGFPN1‑10)，通过内含肽实现高效拼接，形成完整的功能性荧光蛋白。本发明能应用于HBV感染性细胞克隆的筛选，并能广泛用于HBV抗病毒药物的筛选和评价，具有重要的病毒学意义和应用前景。

Description

一种表达绿色荧光蛋白分裂肽的重组乙型肝炎病毒复制子及 其构建方法
技术领域
本发明属生物技术及基因工程领域，涉及一种表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(split peptide)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV/GFPc)复制子及其构建方法。本发明还公开了一种内含肽(intein)介导的GFP分裂肽高效拼接的方法。本发明的技术方案能应用于HBV感染性细胞克隆的筛选，并能广泛应用于HBV抗病毒药物的筛选和评价，具有重要的病毒学意义和应用前景。
背景技术
现有技术公开了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属于嗜肝DNA病毒科。HBV感染已成为重要的公共卫生问题，据有关统计显示，全球已感染全球人数超3亿人，慢性HBV感染会增加罹患严重肝病的风险，包括肝硬化和肝癌，导致每年约100万人死亡。
研究公开了HBV成熟粒子中含有约3.2kb松弛环状DNA(rcDNA)基因组在病毒感染的肝细胞核内，rcDNA修复为共价闭合环状DNA(cccDNA)，是HBV转录复制的原始模板；以cccDNA为模板转录的前基因组RNA(pgRNA)转运至细胞浆，由病毒多聚酶蛋白识别，通过反转录生成负链DNA，并合成不完全的正链DNA；部分双链的rcDNA通过成熟的核衣壳颗粒再次转运至细胞核，完成HBV的细胞内复制周期。另一方面,HBV核衣壳颗粒通过内体分选转运复合体机制，经由多泡体结构完成包膜化和出芽。细胞外成熟的病毒粒子则通过从头感染(denovo infection)途径实现细胞间传播，包括(i.)受体介导的病毒粒子内吞，(ii.)内体囊泡运输，(iii.)内膜融合逃逸，(iv.)核衣壳颗粒释放入细胞浆，以及(v.)转运入核等步骤。值得指出的是，细胞核cccDNA是HBV复制的中心环节，具有显著的稳定性，是病毒持续感染的分子基础，现有的抗病毒药物能有效抑制病毒复制,但难以清除cccDNA,是慢乙肝患者难以彻底治愈的根本原因。
研究实践显示，HBV研究长期受限于基于细胞培养的体外感染模型。牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)被证明是HBV的高亲和力受体,稳定表达外源性NTCP使得HepG2和Huh7细胞能够被HBV感染。近期有研究显示，表皮生长因子(EGF)能够刺激HBV对HepG2NTCP细胞的感染,敲低EGF受体(EGFR)表达，能够显著抑制病毒感染以及cccDNA形成,进一步研究则显示EGFR的细胞内转位可能协同介导了病毒粒子的内化过程。然而，HBV病毒粒子经受体内吞后的研究报道尚不多，相关病毒学认识仍较为局限；另一方面，HepG2NTCP感染体系仍具有较大的局限性，体现为较大病毒细胞感染复数(MOI)，病毒感染细胞比例，以及子代病毒颗粒对培养细胞二次感染效率等，因此，许多关键科学问题值得业内不断探索。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(split peptide)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV/GFPc)复制子及其构建方法以及内含肽(intein)介导的GFP分裂肽高效拼接的方法。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种评价HBV感染的荧光蛋白复制子系统。具体涉及一种表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(split peptide)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV/GFPc)复制子及其构建方法以及内含肽(intein)介导的GFP分裂肽高效拼接的方法。本发明构建了一种HBc基因缺陷的rHBV复制子,使其表达外源性报告基因EGFPC11。rHBV是一种缺陷病毒，能够在HBV核心蛋白HBc反式互补条件下实现功能性复制。
本发明中，在乙肝病毒(HBV)基因组核心蛋白(HBc)编码区删除部分序列，并插入增强绿色荧光蛋白EGFP碳端分裂肽C11(EGFPC11)编码序列，构建一种重组病毒复制子系统。rHBV/EGFPc11是一种缺陷病毒，但能够在HBc互补条件下实现功能性复制，并表达EGFPC11，在细胞中能够与超级折叠绿色荧光蛋白sfGFP氮端分裂肽(sfGFPN1-10)，通过内含肽实现高效拼接，形成完整的功能性荧光蛋白。
基于本研究的前期研究，HBV基因组高度压缩，四个主要阅读框架相互重叠，每一个碱基都具有编码功能和潜在顺式调控功能。本研究在HBV复制子质粒中将HBV核心蛋白(HBc)23-136氨基酸编码序列删除，构建了复制缺陷的ΔHBC113载体，在HBc反式互补条件下能够拯救HBV的复制；基于此，进一步建立了一种能够携带外源基因的重组HBV(rHBV)缺陷复制子系统，使得HBV能够成为一种基因治疗载体(Refs)；然而，ΔHBC113复制子载体中难以耐受较大DNA片段的插入，外源基因通常不能超过180nt。
本发明中，选取了内含肽(Intein)和超级绿色荧光蛋白(sfGFP)作为报告基因。Intein在蛋白质剪接过程中，自催化地从前体蛋白上切除自身，并同时用肽链连接两个侧接序列。本发明使用的Intein是来自念珠藻类(Npu)，可以被分割成Intein N(IntN)和Intein C(IntC)两部分，在IntN-和IntC-侧端连接外显肽分裂的两部分。IntN和IntC有高度亲和力可以自发结合形成完整的Intein，催化自身切除后，用肽键将外显肽的N端和C端连接起来形成完整的外显肽[(Shah and Eryilmaz et al.,2013)]。
本发明中，加强的绿色荧光蛋白(EGFP)是由β片层组成的稳定桶状结构，超级折叠绿色荧光蛋白(Super folder GFP，sfGFP)则是一种优化折叠版本的GFP。Cabantous S等将sfGFP分割1-10个β片层(1-214aa)和第11个β片层(215-230aa)，构建了sfGFPN1-10/sfGFPC11的sfGFP分裂系统[(Cabantous and Terwilliger et al.,2004)]，本发明基于此，进一步设计了sfGFPN1-10-IntN和IntC-EGFPC11两部分融合蛋白，基于后两者的拼接证实更加高效。
本发明中，在ΔHBC113缺陷复制子中插入IntC-EGFPC11编码基因，与sfGFPN1-10-intN表达质粒共转染细胞，能够高效拼接完整的GFP荧光蛋白；ΔHBC113/IntC-EGFP11复制子在HBc反式互补条件下，能够支持重组病毒(rHBV/IntC-EGFPC11)功能复制。鉴于IntC-EGFPC11/sfGFPN1-10-IntN系统的高效性，本；发明将为HBV高通量药物筛选和药物评价提供平台，也为深入HBV病毒学研究，包括病毒进入、cccDNA形成、宿主限制性因子等提供极为便利的工具，具有重要的病毒学意义和应用前景。
更具体的，本发明同时构建了sfGFPN1-10-intN融合表达质粒，在稳定表达sfGFPN1 -10-intN蛋白细胞中，或在共转染条件下，能够与rHBV复制子表达的IntC-EGFPC11高效拼接，形成功能性荧光蛋白GFP，在普通荧光显微镜下能够清晰分辨。
本发明提供了上述rHBV复制子和重组融合蛋白的构建方法，在HBV复制子质粒中将HBV核心蛋白(HBc)23-136氨基酸编码序列删除，构建了复制缺陷的ΔHBC113载体，能够在HBc反式互补条件下拯救rHBV复制。基于ΔHBC113载体外源性基因容量有限，本发明中设计IntC-EGFPc11融合蛋白，将其编码序列插入ΔHBC113载体的HBc缺失区域，通过优化的KOZAK序列引导IntC-EGFPc11表达；通过IntC-EGFPc11羧端融合T2A断裂肽，引导rHBV复制子中病毒多聚酶基因的表达，以保证rHBV能够在HBc互补条件下高效复制。
本发明还提供了编码IntC-EGFPc11重组蛋白的基因序列SEQ ID NO.1；sfGFPN1-10-intN序列如SEQ ID NO.2所示；以及rHBV/IntC-EGFPc11复制子质粒pCMV-rHBV1.1/IntC-EGFPC11的全序列，如SEQ ID NO.3。IntN编码序列如SEQ ID NO.4所示；IntC编码序列如SEQID NO.5所示；T2A编码序列如SEQ ID NO.6所示；ΔHBC113复制子载体质粒pCMV-rHBV1.1ΔHBC113，如SEQ ID NO.7所示。
本发明提供了一种表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(split peptide)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV/GFPc)复制子及其构建方法以及内含肽(intein)介导的GFP分裂肽高效拼接的方法；缺陷病毒rHBV/EGFPc11能够在HBc互补条件下实现功能性复制，并表达EGFPC11，在细胞中能够与超级折叠绿色荧光蛋白sfGFP氮端分裂肽(sfGFPN1-10)，通过内含肽实现高效拼接，形成完整的功能性荧光蛋白。
附图说明
图1显示分裂肽GFPN-IntN/IntC-GFPC，拼接成完整GFP蛋白的示意图，其中GFPN为sfGFPN1-10，GFPC为EGFPC11。
图2为pCMV-rHBV1.1/IntC-EGFPC11复制子质粒中IntC-EGFPC11-T2A基因插入位点的上下游位置关系。
图3显示，将构建的pCMV-rHBV1.1/IntC-EGFPC11复制子和pCDH-sfGFPN1-10-IntN共转染HepG2细胞，显示显著的绿色荧光，单独转染其中的一个质粒，或阴性对照质粒，未见到绿色荧光。
图4显示，将pCMV-rHBV1.1/IntC-EGFPC11复制子和HBc表达质粒共转染HepG2细胞，应用Southern Blot印迹法检测，显示反式互补HBc能够拯救rHBV1.1/IntC-EGFPC11在细胞中的复制能力。
具体实施方式
实施例1
本发明通过以下技术方案实现：
融合基因sfGFPN1-10-IntN的表达载体的构建。在慢病毒载体pCDH-puro中HindⅢ和EcoRⅠ两个单酶切位点之间插入sfGFPN1-10-IntN编码序列，构建pCDH-sfGFPN1-10-IntN编码质粒。IntC-EGFPC11-T2A编码基因以及搭头序列由DNA合成获得，通过双酶切接入pCMV-HBV1.1ΔHBC113质粒中，构建rHBV/IntC-EGFPC11复制子质粒pCMV-rHBV1.1/IntC-EGFPC11。
本发明还提供了rHBV复制子细胞内复制的Southern-blot检测方法：
胞质核衣壳相关HBV DNA提取，细胞转染3～4天后，将细胞从培养基取出弃上清，用预冷PBS洗两遍。六孔板每孔加入400μl裂解液裂解细胞37℃30min。14000rpm离心后收集上清，加入4μl 1M MgCl2和8μl 10mg/ml DNase，37℃水浴消化30min。然后用PEG沉淀病毒颗粒，4℃沉淀过夜。将沉淀用100μl DNase1溶液重悬，37℃消化30min。接着用蛋白酶K消化，去除病毒核衣壳，37℃消化过夜。用饱和的酚氯仿抽提1次，震荡后14000rpm离心10min，取上清水相，加入2μl 20mg/ml糖原、十分之一体积3M醋酸钠(pH5.2)溶液和等体积的异丙醇，混匀后置于-20℃沉淀过夜。14000rpm离心15min弃上清，沉淀用75％乙醇洗2遍并尽弃乙醇，静置待留乙醇挥发，用20μl Sca1单酶切，水浴37℃30min。
Southern blot印迹法，配置160ml 1％琼脂糖胶，80v电泳跑3h，用变性液洗15min两次，接着蒸馏水润洗，再用中性液15min洗两次。蒸馏水润洗后，用20×SSC浸泡。按照草纸、滤纸、凝胶、尼龙膜、滤纸由下至上的顺序进行搭桥过夜。将膜取出在2×SSC中漂洗一下，在烘箱中80℃烘烤2h。用10ml DIG Eassy Hyba在杂交炉进行预杂交42℃30min。将预杂交液倒出，将预热好的探针置于杂交管中，42℃旋转孵育过夜。用10ml 2×SSC,0.1％SDS常温15min洗两次，然后用68℃预热的0.5×SSC,0.1％SDS 68℃15min洗两次。用Washingbuffer润洗2min，用吸水纸吸干，然后Blocking solution室温孵育30min，然后用anti-DIGantibody溶液室温孵育30min。Washing Buffer溶液室温润洗3次，每次10min。接着用detection buffer溶液室温平衡2～5min。加入CSPD溶液常温孵育5min，曝光显色。
完整绿色荧光蛋白拼接形成的验证：
将构建载体pCMV-rHBV1.1/IntC-EGFPC11与pCDH-sfGFPN1-10-IntN共转染293T细胞或HepG2细胞，单独转染pCMV-rHBV1.1/IntC-EGFPC11，或单独转染pCDH-sfGFPN1-10-IntN设置为阴性对照。换液后12h在荧光显微镜下观察；
共转染实验中，EGFPN1-10-IntN和IntC-EGFPC11不能有效拼接为功能性荧光蛋白。sfGFPN1-10-IntN和IntC-sfGFPC11能够有效拼接，但荧光强度较sfGFPN1-10-IntN和IntC-EGFPC11弱。单独转染其中的一个质粒或者阴性对照都不能观察到绿色荧光。
本发明的实施例结果表明，本发明提供了一种rHBV复制子及其构建方法，以及一种应用分裂内含肽intein融合绿色荧光蛋白(sfGFP)分裂肽的技术方法。rHBV/GFPc11是一种缺陷病毒，但能够在HBc互补条件下实现功能性复制，并表达GFPC11，在细胞质中能够与预存的sfGFP氮端分裂肽(sfGFPN1-10)，通过内含肽介导的高效拼接，形成完整的功能性荧光蛋白。
序列表
一种表达绿色荧光蛋白分裂肽的重组乙型肝炎病毒复制子及其构建方法
SEQ ID NO.1，编码IntC-EGFPc11重组蛋白的基因序列：
ATGGTGAAGATCGTGAGGAGAAGGTCCCTGGGCGTGCAGCCTGTGTACGACCTGGGCGTGGCCACAGTGCACAATTTCGTGCTGGCCAACGGCCTGGTGGCCAGCAATTGCTTTAATTCTAGAGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTTACCGCCGCCGGGATCACT
SEQ ID NO.2，编码sfGFPN1-10-intN的基因序列：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCTATCCTGGTGGAGCTGGATGGCGATGTGAATGGACACAAATTTTCTGTGAGAGGAGAGGGAGAGGGCGATGCCACAAATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTTATCTGTACCACCGGCAAGCTGCCTGTGCCTTGGCCAACACTGGTGACAACACTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTTAGCCGGTACCCTGATCACATGAAACAGCATGATTTCTTTAAGTCTGCCATGCCTGAAGGATACGTGCAGGAGAGGACAATCAGCTTTAAGGATGATGGCACATATAAGACAAGAGCTGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAATAGAATCGAGCTGAAGGGCATTGATTTTAAGGAGGACGGCAATATTCTGGGACACAAGCTGGAGTATAATTTTAATAGCCACAACGTGTACATCACCGCCGATAAGCAGAAGAATGGCATCAAAGCTAATTTTAAGATTAGACACAATGTGGAGGATGGCTCTGTGCAGCTGGCCGATCACTATCAGCAGAATACCCCTATTGGAGATGGCCCAGTGCTGCTGCCTGATAATCACTATCTGAGCACCCAGAGCGTGCTGAGCAAAGACCCTAATGAGAAGTCTAGATGCCTGGCTGCCGATACCGAGGTGCTGACCGTGGAGTACGGCCCCATCGCCATCGGCAAGCTGGTGGAGGAGAACATCAGATGTCAGGTGTACTGTTGCAACCCTGACGGCTACATCTACAGCCAGCCCATCGGCCAGTGGCACCAGAGGGGCGAGCAGGAGGTCATTGAGTACGAGCTGTCCGATGGCAGAATCATCAGGGCCACAGCCGACCACAGATTCATGACAGAGGAGGGCGAGATGCTGTCCCTGGATGAGATCTTCGAGAGGAGCCTGGAGCTGAAGCAGATCCCCACCCCCCTGCTGGCCATCGCCCAGCCTAGCCCACTGGCCACCGCC
SEQ ID NO.3，pCMV-rHBV1.1/IntC-EGFPC11的全序列：
CAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCCTCTAGCACCAGCACCTGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCGTGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCGCCACCATGGTGAAGATCGTGAGGAGAAGGTCCCTGGGCGTGCAGCCTGTGTACGACCTGGGCGTGGCCACAGTGCACAATTTCGTGCTGGCCAACGGCCTGGTGGCCAGCAATTGCTTTAATTCTAGAGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTTACCGCCGCCGGGATCACTGGCAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTGCCCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGGAACTTTACTGGGCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCTTTAATCCTCATTGGAAAACACCATCTTTTCCTAATATACATTTACACCAAGACATTATCAAAAAATGTGAACAGTTTGTAGGCCCACTCACAGTTAATGAGAAAAGAAGATTGCAATTGATTATGCCTGCCAGGTTTTATCCAAAGGTTACCAAATATTTACCATTGGATAAGGGTATTAAACCTTATTATCCAGAACATCTAGTTAATCATTACTTCCAAACTAGACACTATTTACACACTCTATGGAAGGCGGGTATATTATATAAGAGAGAAACAACACATAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACCGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACTTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCTGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACAACCAGCACGGGACCATGCCGGACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACAACCAGCACGGGACCATGCCGGACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAACAAAACAAAGAGATGGGGTTACTCTCTAAATTTTATGGGTTATGTCATTGGATGTTATGGGTCCTTGCCACAAGAACACATCATACAAAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAACTTCCTATTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGTTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGTTATCCTGCGTTGATGCCTTTGTATGCATGTATTCAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATACCTGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGCCAGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGTCATGGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTTCGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACATTATCGGGACTGATAACTCTGTTGTCCTATCCCGCAAATATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCTTCTCGGGGTCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAAATATTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACT
SEQ ID NO.4，IntN编码序列：
TGCCTGGCTGCCGATACCGAGGTGCTGACCGTGGAGTACGGCCCCATCGCCATCGGCAAGCTGGTGGAGGAGAACATCAGATGTCAGGTGTACTGTTGCAACCCTGACGGCTACATCTACAGCCAGCCCATCGGCCAGTGGCACCAGAGGGGCGAGCAGGAGGTCATTGAGTACGAGCTGTCCGATGGCAGAATCATCAGGGCCACAGCCGACCACAGATTCATGACAGAGGAGGGCGAGATGCTGTCCCTGGATGAGATCTTCGAGAGGAGCCTGGAGCTGAAGCAGATCCCCACCCCCCTGCTGGCCATCGCCCAGCCTAGCCCACTGGCCACCGCC
SEQ ID NO.5，IntC编码序列：
ATGGTGAAGATCGTGAGGAGAAGGTCCCTGGGCGTGCAGCCTGTGTACGACCTGGGCGTGGCCACAGTGCACAATTTCGTGCTGGCCAACGGCCTGGTGGCCAGCAATTGCTTTAAT
SEQ ID NO.6，T2A编码序列：
GGCAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT
SEQ ID NO.7，ΔHBC113复制子载体质粒pCMV-rHBV1.1ΔHBC113序列：
CAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCCTCTAGCACCAGCACCTGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCGTGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGGAACTTTACTGGGCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCTTTAATCCTCATTGGAAAACACCATCTTTTCCTAATATACATTTACACCAAGACATTATCAAAAAATGTGAACAGTTTGTAGGCCCACTCACAGTTAATGAGAAAAGAAGATTGCAATTGATTATGCCTGCCAGGTTTTATCCAAAGGTTACCAAATATTTACCATTGGATAAGGGTATTAAACCTTATTATCCAGAACATCTAGTTAATCATTACTTCCAAACTAGACACTATTTACACACTCTATGGAAGGCGGGTATATTATATAAGAGAGAAACAACACATAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACCGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACTTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCTGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACAACCAGCACGGGACCATGCCGGACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAACAAAACAAAGAGATGGGGTTACTCTCTAAATTTTATGGGTTATGTCATTGGATGTTATGGGTCCTTGCCACAAGAACACATCATACAAAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAACTTCCTATTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGTTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGTTATCCTGCGTTGATGCCTTTGTATGCATGTATTCAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATACCTGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGCCAGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGTCATGGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTTCGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACATTATCGGGACTGATAACTCTGTTGTCCTATCCCGCAAATATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCTTCTCGGGGTCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAAATATTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACT
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种表达绿色荧光蛋白分裂肽的重组乙型肝炎病毒复制子及其构建方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 168
<212> DNA
<213> IntC-EGFPc11
<400> 1
atggtgaaga tcgtgaggag aaggtccctg ggcgtgcagc ctgtgtacga cctgggcgtg 60
gccacagtgc acaatttcgt gctggccaac ggcctggtgg ccagcaattg ctttaattct 120
agagatcaca tggtcctgct ggagttcgtt accgccgccg ggatcact 168
<210> 2
<211> 990
<212> DNA
<213> sfGFPN1-10-intN
<400> 2
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggcgtggtgc ctatcctggt ggagctggat 60
ggcgatgtga atggacacaa attttctgtg agaggagagg gagagggcga tgccacaaat 120
ggcaagctga ccctgaagtt tatctgtacc accggcaagc tgcctgtgcc ttggccaaca 180
ctggtgacaa cactgaccta cggcgtgcag tgctttagcc ggtaccctga tcacatgaaa 240
cagcatgatt tctttaagtc tgccatgcct gaaggatacg tgcaggagag gacaatcagc 300
tttaaggatg atggcacata taagacaaga gctgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaatagaa tcgagctgaa gggcattgat tttaaggagg acggcaatat tctgggacac 420
aagctggagt ataattttaa tagccacaac gtgtacatca ccgccgataa gcagaagaat 480
ggcatcaaag ctaattttaa gattagacac aatgtggagg atggctctgt gcagctggcc 540
gatcactatc agcagaatac ccctattgga gatggcccag tgctgctgcc tgataatcac 600
tatctgagca cccagagcgt gctgagcaaa gaccctaatg agaagtctag atgcctggct 660
gccgataccg aggtgctgac cgtggagtac ggccccatcg ccatcggcaa gctggtggag 720
gagaacatca gatgtcaggt gtactgttgc aaccctgacg gctacatcta cagccagccc 780
atcggccagt ggcaccagag gggcgagcag gaggtcattg agtacgagct gtccgatggc 840
agaatcatca gggccacagc cgaccacaga ttcatgacag aggagggcga gatgctgtcc 900
ctggatgaga tcttcgagag gagcctggag ctgaagcaga tccccacccc cctgctggcc 960
atcgcccagc ctagcccact ggccaccgcc 990
<210> 3
<211> 7023
<212> DNA
<213> pCMV-rHBV1.1 /IntC-EGFPC11
<400> 3
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 60
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 120
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 180
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 240
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 300
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 360
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 420
gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct 480
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt 540
ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga 600
caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc 660
cagatatacg cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 720
attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 780
tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 840
aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca 900
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 960
taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 1020
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa 1080
tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa 1140
tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc 1200
cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcctctagca 1260
ccagcacctg caactttttc acctctgcct aatcatctct tgttcatgtc ctactgttca 1320
agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcgtggac atcgaccctt ataaagaatt 1380
tggagctact gtggagttac tctcgttttt gccttctgac ttcgccacca tggtgaagat 1440
cgtgaggaga aggtccctgg gcgtgcagcc tgtgtacgac ctgggcgtgg ccacagtgca 1500
caatttcgtg ctggccaacg gcctggtggc cagcaattgc tttaattcta gagatcacat 1560
ggtcctgctg gagttcgtta ccgccgccgg gatcactggc agcggagagg gcagaggaag 1620
tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct gcccccctat cctatcaaca 1680
cttccggaga ctactgttgt tagacgacga ggcaggtccc ctagaagaag aactccctcg 1740
cctcgcagac gaaggtctca atcgccgcgt cgcagaagat ctcaatctcg ggaatctcaa 1800
tgttagtatt ccttggactc ataaggtggg gaactttact gggctttatt cttctactgt 1860
acctgtcttt aatcctcatt ggaaaacacc atcttttcct aatatacatt tacaccaaga 1920
cattatcaaa aaatgtgaac agtttgtagg cccactcaca gttaatgaga aaagaagatt 1980
gcaattgatt atgcctgcca ggttttatcc aaaggttacc aaatatttac cattggataa 2040
gggtattaaa ccttattatc cagaacatct agttaatcat tacttccaaa ctagacacta 2100
tttacacact ctatggaagg cgggtatatt atataagaga gaaacaacac atagcgcctc 2160
attttgtggg tcaccatatt cttgggaaca agatctacag catggggcag aatctttcca 2220
ccagcaatcc tctgggattc tttcccgacc accagttgga tccagccttc agagcaaaca 2280
ccgcaaatcc agattgggac ttcaatccca acaaggacac ctggccagac gccaacaagg 2340
taggagctgg agcattcggg ctgggtttca ccccaccgca cggaggcctt ttggggtgga 2400
gccctcaggc tcagggcata ctacaaactt tgccagcaaa tccgcctcct gcctccacca 2460
atcgccagtc aggaaggcag cctaccccgc tgtctccacc tttgagaaac actcatcctc 2520
aggccatgca gtggaattcc acaaccttcc accaaactct gcaagatccc agagtgagag 2580
gcctgtattt ccctgctggt ggctccagtt caggaacagt aaaccctgtt ctgactactg 2640
cctctccctt atcgtcaatc ttctcgagga ttggggaccc tgcgctgaac atggagaaca 2700
tcacatcagg attcctagga ccccttctcg tgttacaggc ggggtttttc ttgttgacaa 2760
gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat tttctagggg 2820
gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac tcaccaacct 2880
cttgtcctcc aacttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt atcatcttcc 2940
tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat caaggtatgt 3000
tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcct caacaaccag cacgggacca tgccggacct 3060
gcatgactac tgctcaagga acctctatgt atccctcctg tgcccgtttg tcctctaatt 3120
ccaggatcct caacaaccag cacgggacca tgccggacct gcatgactac tgctcaagga 3180
acctctatgt atccctcctg ttgctgtacc aaaccttcgg acggaaattg cacctgtatt 3240
cccatcccat catcctgggc tttcggaaaa ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc 3300
tcctggctca gtttactagt gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt 3360
tggctttcag ttatatggat gatgtggtat tgggggccaa gtctgtacag catcttgagt 3420
ccctttttac cgctgttacc aattttcttt tgtctttggg tatacattta aaccctaaca 3480
aaacaaagag atggggttac tctctaaatt ttatgggtta tgtcattgga tgttatgggt 3540
ccttgccaca agaacacatc atacaaaaaa tcaaagaatg ttttagaaaa cttcctatta 3600
acaggcctat tgattggaaa gtatgtcaac gaattgtggg tcttttgggt tttgctgccc 3660
cttttacaca atgtggttat cctgcgttga tgcctttgta tgcatgtatt caatctaagc 3720
aggctttcac tttctcgcca acttacaagg cctttctgtg taaacaatac ctgaaccttt 3780
accccgttgc ccggcaacgg ccaggtctgt gccaagtgtt tgctgacgca acccccactg 3840
gctggggctt ggtcatgggc catcagcgca tgcgtggaac cttttcggct cctctgccga 3900
tccatactgc ggaactccta gccgcttgtt ttgctcgcag caggtctgga gcaaacatta 3960
tcgggactga taactctgtt gtcctatccc gcaaatatac atcgtttcca tggctgctag 4020
gctgtgctgc caactggatc ctgcgcggga cgtcctttgt ttacgtcccg tcggcgctga 4080
atcctgcgga cgacccttct cggggtcgct tgggactctc tcgtcccctt ctccgtctgc 4140
cgttccgacc gaccacgggg cgcacctctc tttacgcgga ctccccgtct gtgccttctc 4200
atctgccgga ccgtgtgcac ttcgcttcac ctctgcacgt cgcatggaga ccaccgtgaa 4260
cgcccaccaa atattgccca aggtcttaca taagaggact cttggactct cagcaatgtc 4320
aacgaccgac cttgaggcat acttcaaaga ctgtttgttt aaagactggg aggagttggg 4380
ggaggagatt aggttaaagg tctttgtact aggaggctgt aggcataaat tggtctgcgc 4440
accagcacca tgcaactttt tcacctctgc ctaatcatct cttgttcatg tcctactgtt 4500
caagcctcca agctgtgcct tgggtggctt tggggcatgg acatcgaccc ttataaagaa 4560
tttggagcta ctgtggagtt actctcgttt ttgccttctg acttctttcc ttcagtacga 4620
gatccactag ttctagagcg gccgccaccg cggtggagct ccagcttttg ttccctttag 4680
tgagggttaa ttgcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 4740
tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 4800
ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 4860
cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 4920
cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg 4980
aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 5040
tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 5100
gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg 5160
gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 5220
ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct 5280
ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 5340
tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 5400
gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 5460
tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 5520
ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 5580
cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 5640
gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 5700
tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 5760
agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 5820
tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 5880
cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 5940
ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 6000
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 6060
ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 6120
ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 6180
cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 6240
gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 6300
atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 6360
ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 6420
gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 6480
tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 6540
ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 6600
taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 6660
gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 6720
gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 6780
ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 6840
aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 6900
gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 6960
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 7020
act 7023
<210> 4
<211> 339
<212> DNA
<213> IntN
<400> 4
tgcctggctg ccgataccga ggtgctgacc gtggagtacg gccccatcgc catcggcaag 60
ctggtggagg agaacatcag atgtcaggtg tactgttgca accctgacgg ctacatctac 120
agccagccca tcggccagtg gcaccagagg ggcgagcagg aggtcattga gtacgagctg 180
tccgatggca gaatcatcag ggccacagcc gaccacagat tcatgacaga ggagggcgag 240
atgctgtccc tggatgagat cttcgagagg agcctggagc tgaagcagat ccccaccccc 300
ctgctggcca tcgcccagcc tagcccactg gccaccgcc 339
<210> 5
<211> 117
<212> DNA
<213> IntC
<400> 5
atggtgaaga tcgtgaggag aaggtccctg ggcgtgcagc ctgtgtacga cctgggcgtg 60
gccacagtgc acaatttcgt gctggccaac ggcctggtgg ccagcaattg ctttaat 117
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> T2A
<400> 6
ggcagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60
cct 63
<210> 7
<211> 6686
<212> DNA
<213> pCMV-rHBV1.1ΔHBC113
<400> 7
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 60
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 120
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 180
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 240
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 300
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 360
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 420
gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct 480
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt 540
ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga 600
caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc 660
cagatatacg cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 720
attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 780
tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 840
aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca 900
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 960
taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 1020
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa 1080
tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa 1140
tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc 1200
cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcctctagca 1260
ccagcacctg caactttttc acctctgcct aatcatctct tgttcatgtc ctactgttca 1320
agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcgtggac atcgaccctt ataaagaatt 1380
tggagctact gtggagttac tctcgttttt gccttctgac ttcatgcccc tatcctatca 1440
acacttccgg agactactgt tgttagacga cgaggcaggt cccctagaag aagaactccc 1500
tcgcctcgca gacgaaggtc tcaatcgccg cgtcgcagaa gatctcaatc tcgggaatct 1560
caatgttagt attccttgga ctcataaggt ggggaacttt actgggcttt attcttctac 1620
tgtacctgtc tttaatcctc attggaaaac accatctttt cctaatatac atttacacca 1680
agacattatc aaaaaatgtg aacagtttgt aggcccactc acagttaatg agaaaagaag 1740
attgcaattg attatgcctg ccaggtttta tccaaaggtt accaaatatt taccattgga 1800
taagggtatt aaaccttatt atccagaaca tctagttaat cattacttcc aaactagaca 1860
ctatttacac actctatgga aggcgggtat attatataag agagaaacaa cacatagcgc 1920
ctcattttgt gggtcaccat attcttggga acaagatcta cagcatgggg cagaatcttt 1980
ccaccagcaa tcctctggga ttctttcccg accaccagtt ggatccagcc ttcagagcaa 2040
acaccgcaaa tccagattgg gacttcaatc ccaacaagga cacctggcca gacgccaaca 2100
aggtaggagc tggagcattc gggctgggtt tcaccccacc gcacggaggc cttttggggt 2160
ggagccctca ggctcagggc atactacaaa ctttgccagc aaatccgcct cctgcctcca 2220
ccaatcgcca gtcaggaagg cagcctaccc cgctgtctcc acctttgaga aacactcatc 2280
ctcaggccat gcagtggaat tccacaacct tccaccaaac tctgcaagat cccagagtga 2340
gaggcctgta tttccctgct ggtggctcca gttcaggaac agtaaaccct gttctgacta 2400
ctgcctctcc cttatcgtca atcttctcga ggattgggga ccctgcgctg aacatggaga 2460
acatcacatc aggattccta ggaccccttc tcgtgttaca ggcggggttt ttcttgttga 2520
caagaatcct cacaataccg cagagtctag actcgtggtg gacttctctc aattttctag 2580
ggggaactac cgtgtgtctt ggccaaaatt cgcagtcccc aacctccaat cactcaccaa 2640
cctcttgtcc tccaacttgt cctggttatc gctggatgtg tctgcggcgt tttatcatct 2700
tcctcttcat cctgctgcta tgcctcatct tcttgttggt tcttctggac tatcaaggta 2760
tgttgcccgt ttgtcctcta attccaggat cctcaacaac cagcacggga ccatgccgga 2820
cctgcatgac tactgctcaa ggaacctcta tgtatccctc ctgttgctgt accaaacctt 2880
cggacggaaa ttgcacctgt attcccatcc catcatcctg ggctttcgga aaattcctat 2940
gggagtgggc ctcagcccgt ttctcctggc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt 3000
tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt cagttatatg gatgatgtgg tattgggggc 3060
caagtctgta cagcatcttg agtccctttt taccgctgtt accaattttc ttttgtcttt 3120
gggtatacat ttaaacccta acaaaacaaa gagatggggt tactctctaa attttatggg 3180
ttatgtcatt ggatgttatg ggtccttgcc acaagaacac atcatacaaa aaatcaaaga 3240
atgttttaga aaacttccta ttaacaggcc tattgattgg aaagtatgtc aacgaattgt 3300
gggtcttttg ggttttgctg ccccttttac acaatgtggt tatcctgcgt tgatgccttt 3360
gtatgcatgt attcaatcta agcaggcttt cactttctcg ccaacttaca aggcctttct 3420
gtgtaaacaa tacctgaacc tttaccccgt tgcccggcaa cggccaggtc tgtgccaagt 3480
gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg cttggtcatg ggccatcagc gcatgcgtgg 3540
aaccttttcg gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg 3600
cagcaggtct ggagcaaaca ttatcgggac tgataactct gttgtcctat cccgcaaata 3660
tacatcgttt ccatggctgc taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt 3720
tgtttacgtc ccgtcggcgc tgaatcctgc ggacgaccct tctcggggtc gcttgggact 3780
ctctcgtccc cttctccgtc tgccgttccg accgaccacg gggcgcacct ctctttacgc 3840
ggactccccg tctgtgcctt ctcatctgcc ggaccgtgtg cacttcgctt cacctctgca 3900
cgtcgcatgg agaccaccgt gaacgcccac caaatattgc ccaaggtctt acataagagg 3960
actcttggac tctcagcaat gtcaacgacc gaccttgagg catacttcaa agactgtttg 4020
tttaaagact gggaggagtt gggggaggag attaggttaa aggtctttgt actaggaggc 4080
tgtaggcata aattggtctg cgcaccagca ccatgcaact ttttcacctc tgcctaatca 4140
tctcttgttc atgtcctact gttcaagcct ccaagctgtg ccttgggtgg ctttggggca 4200
tggacatcga cccttataaa gaatttggag ctactgtgga gttactctcg tttttgcctt 4260
ctgacttctt tccttcagta cgagatccac tagttctaga gcggccgcca ccgcggtgga 4320
gctccagctt ttgttccctt tagtgagggt taattgcgcg catgcccgac ggcgaggatc 4380
tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 4440
ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 4500
ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 4560
acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 4620
tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg 4680
agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga 4740
cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa 4800
cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa 4860
taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 4920
tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt 4980
tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 5040
gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 5100
gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 5160
ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 5220
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 5280
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 5340
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 5400
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 5460
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 5520
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag 5580
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 5640
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 5700
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 5760
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt 5820
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 5880
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 5940
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 6000
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 6060
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 6120
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 6180
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 6240
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 6300
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 6360
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 6420
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 6480
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 6540
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 6600
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 6660
atgcttttct gtgactggtg agtact 6686

Claims (7)

1.一种表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(EGFPc11)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV)复制子，其特征在于，通过下述方法构建获得：
在乙肝病毒(HBV)基因组核心蛋白(HBc)编码区删除部分序列，并插入增强绿色荧光蛋白EGFP碳端分裂肽C11(EGFPC11)编码序列，构建获得一种重组HBV(rHBV)复制子系统；所述的复制子系统,在HBV核心蛋白(HBc)反式互补条件下，能实现重组病毒rHBV的复制。
2.如权利要求1所述的表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(EGFPc11)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV)复制子，其特征在于，所述的EGFPc11片段能与超级折叠sfGFP绿色荧光蛋白N端分裂肽(sfGFPN1-10)通过内含肽(intein)介导，高效拼接形成功能性的GFP荧光蛋白，指示重组病毒的对宿主细胞的感染。
3.如权利要求1或2所述的表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(EGFPc11)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV)复制子，其特征在于，所述述的EGFPc11编码序列插入在HBV复制子的HBc编码区，替换HBc氨基酸23-136片段。
4.如权利要求1或2或3所述的表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(EGFPc11)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV)复制子，其特征在于，所述的EGFPc11，在其氮端融合念珠藻类(Npu)来源内含肽(Intein)的羧端肽段IntC；在其羧基融合T2A断裂肽，引导rHBV复制子中病毒多聚酶基因的表达。
5.如权利要求2所述的表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(EGFPc11)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV)复制子，其特征在于，所述的sfGFPN1-10，在其羧基融合Intein的氮端肽段(IntN)。
6.权利要求1所述的表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(EGFPc11)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV)复制子在制备用于抗病毒药物研发的制品中的用途。
7.权利要求1所述的表达绿色荧光蛋白GFP分裂肽(EGFPc11)的重组人乙型肝炎病毒(rHBV)复制子在制备HBV感染性细胞克隆的筛选的制品中的用途。
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