KR100884214B1

KR100884214B1 - Ｃａｅｖ-계 벡터 시스템

Info

Publication number: KR100884214B1
Application number: KR1020077007725A
Authority: KR
Inventors: 김연수; 이수경; 김종필
Original assignee: 주식회사 마크로젠
Priority date: 2007-04-04
Filing date: 2004-09-07
Publication date: 2009-02-19
Also published as: KR20070053798A

Abstract

본 발명은 비-분열 및 분열 세포로 핵산을 전달하는 데 유용한 염소 관절염 뇌염 바이러스-계 벡터 및 벡터 시스템에 관한 것이다. 상기 벡터 시스템을 사용하여 비-분열 및 분열 세포에 핵산을 전달하는 방법 또한 개시하고 있다.

Description

ＣＡＥＶ-계 벡터 시스템{CAEV-BASED VECTOR SYSTEMS}

본 발명은 폴리뉴클레오티드(polynucleotide) 전달에 유용한 렌티바이러스 벡터, 및 더 구체적으로 폴리뉴클레오티드를 비분열 및 분열 세포들로 전달하는데 유용한 염소 관절염 뇌염 바이러스-계 벡터(caprine arthritis encephalitis virus)에 관한 것이다.

렌티바이러스는 분열 세포 뿐 아니라 비분열 세포도 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 서브그룹이다. 렌티바이러스 유래의 벡터들은 분열 및 비분열 세포의 유전체(genome)에 안정적으로 유전자를 통합(integration)하여 장기간 유전자 발현을 매개할 수 있기 때문에 외래 유전자를 표적 세포로 전달하기 위한 이상적인 도구이다(Gilbert and Wong-Staal, 2001; Mitrophanous et al., 1999; Naldini et al., 1996; Sauter and Gasmi, 2001).

렌티바이러스는 비-영장류(예: 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV), 말 감염 바이러스(EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV) 및 비스나 바이러스) 뿐 아니라, 영장류(예: 사람 및 원숭이 면역결핍 바이러스(HIV-1, HIV-2, SIV))를 포함하는 여러 척추동물 종들로부터 분리된 바 있다. 이들 중, HIV 및 SIV가 현재 가장 잘 알려져 있다. 그러나, 벡터가 전염성 및 병원성 형태로 재조합될 수 있는 가능성으로 인해, 이러한 시스템을 인간에서 사용하는 것은 심각한 안전성 문제를 일으킨다. 따라서, 유전자 치료에서는 비-영장류 렌티바이러스를 사용하는 것이 바람직하다.

비-영장류 렌티바이러스 벡터들 중에는, FIV(Curran 및 Nolan, 2002) 및 EIAV[US 2001/0044149] 유래 벡터들이 가장 잘 연구되었으며, 기타 비-영장류 벡터들에 대해서는 거의 진전된 바가 없다.

CAEV는, 모든 렌티바이러스들이 그렇듯이, 최종적으로 분화된 세포 및 비분열 세포 뿐 아니라 분열 세포들에서도 감염 및 복제가 가능하다. CAEV의 생물학적 몇가지 특징들은 본 바이러스가 유전자 전이/치료 벡터로 개발시키기에 흥미로운 후보임을 보여준다. 첫째, CAEV의 일반 숙주는 염소류이며, CAEV에 의해 인간이 감염된 경우는 보고된 바 없다. 둘째, CAEV 유전체는 렌티바이러스들 중 HIV-1과 계통분류학적으로 가장 거리가 있다. 셋째, CAEV의 유전체 구성은 다른 렌티바이러스들과 비교해 상대적으로 간단하다. CAEV 유전체는 세 개의 구조 유전자(gag, pol, env) 및 세 개의 조절/악세서리 유전자(vif, tat 및 rev)를 포함한다.

그러나, 이러한 장점들에도 불구하고, CAEV-계 전달 시스템을 개발시키기 위한 노력들은 성공하지 못했으며, 그 결과 CAEV-계 유전자 전달 시스템의 사용을 비현실적으로 만드는 안전하지 못하고 비효율적인 재조합 바이러스 벡터 생산 시스템만을 얻었다.

1998년에, L. 셀리-라칼 등(L. Mselli-Lakhal et al.)은 제1세대 CAEV-계 벡터 시스템을 보고하였으나, 상기 시스템의 바이러스 역가(즉, 10-187 TU/㎖)는 유효한 수준 이하였다. 상기 저자들은 이러한 비효율성이 세포질 내로의 유전체 RNA 축적의 부족 및 벡터 RNA의 낮은 패키징 효율 때문이라고 설명하였다. 상기 연구의 다른 문제점으로는 패키징 시스템으로서 전염성 야생형 바이러스("헬퍼 바이러스")를 사용하는 점인데, 이로 인해 인간에 적용하기에는 거의 실용 가치가 없다.

따라서, 광범위한 분열 및 비분열 세포로의 유전자 전이를 매개할 수 있는 안전하고 효과적인 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 시스템이 요구되고 있다.

발명의 개요

본 발명은, 넓게는 외래 폴리뉴클레오티드를 표적 세포로 전달하는데 유용한 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 입자(particles)의 생산에 관한 것이다. 이러한 벡터 입자는 항-바이러스, 항-종양 및/또는 유전자 치료에 사용될 수 있다.

본 발명은 상술된 CAEV-계 벡터 생산 시스템에서 사용되는 전이 벡터를 제공하며, 상기 전이 벡터는,

(a) (i) CAEV 5' LTR과 CAEV gag-코딩 서열 사이의 비번역 영역, 및

(ⅱ) 상기 비번역 영역의 3' 말단에 연결된 CAEV gag-코딩 서열의 1 내지 X번째 뉴클레오티드(이때, X는 613 미만)

로 필수적으로 이루어진, CAEV 패키징 서열; 및

(b) 상기 패키징 서열과 작동가능하게 연관된, 폴리아데닐화 반응, RNA 수 송, 역전사 및 통합(integration)에 요구되는 시스-작용 요소(cis-acting elements)

를 포함한다.

본 발명의 일 실시양태에서, X는 60, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 및 600으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, X는

(a) X는 25 초과 600 미만,

(b) X는 25 초과 500 미만,

(c) X는 25 초과 400 미만,

(d) X는 25 초과 300 미만,

(e) X는 25 초과 200 미만,

(f) X는 50 초과 600 미만,

(g) X는 50 초과 500 미만,

(h) X는 50 초과 400 미만,

(i) X는 50 초과 300 미만,

(j) X는 50 초과 200 미만,

(k) X는 75 초과 600 미만,

(l) X는 75 초과 500 미만,

(m) X는 75 초과 400 미만,

(n) X는 75 초과 300 미만,

(o) X는 75 초과 200 미만,

(p) X는 100 초과 600 미만,

(q) X는 100 초과 500 미만,

(r) X는 100 초과 400 미만,

(s) X는 100 초과 300 미만,

(t) X는 100 초과 200 미만,

(u) X는 125 초과 600 미만,

(v) X는 125 초과 500 미만,

(w) X는 125 초과 400 미만,

(x) X는 125 초과 300 미만,

(y) X는 125 초과 200 미만,

(z) X는 150 초과 600 미만,

(aa) X는 150 초과 500 미만,

(bb) X는 150 초과 400 미만,

(cc) X는 150 초과 300 미만,

(dd) X는 150 초과 200 미만,

(ee) X는 200 초과 600 미만,

(ff) X는 200 초과 500 미만,

(gg) X는 200 초과 400 미만,

(hh) X는 200 초과 300 미만,

(ii) X는 200 초과 200 미만,

(jj) X는 250 초과 600 미만,

(kk) X는 250 초과 500 미만,

(ll) X는 250 초과 400 미만, 및

(mm) X는 250 초과 300 미만

으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, X는 40 초과 613 미만이다.

다른 실시양태에서, X는 57 초과 613 미만이다.

또 다른 실시양태에서, X는 약 327이다.

본 발명의 일 실시양태에서, gag-코딩 서열의 시작 코돈은 gag 단백질의 번역을 방지하도록 변이된다. 또 다른 실시양태에서, 시작 코돈은 TAG로 변이된다.

본 발명의 전이 벡터의 다른 실시양태에서, gag-코딩 서열의 ATG 코돈은 시작 코돈 ATG의 하류 X번째 염기쌍에 위치하며, 이때 상기 시작 코돈은 gag 단백질의 번역을 방지하도록 변이되고, 이때 상기 X는 30 미만이다. 또 다른 실시양태에서 X는 약 21이다.

본 발명의 전이 벡터는 RRE 영역을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 전이 벡터는 U3 영역이 삭제된 CAEV 3' LTR을 포함한다.

본 발명의 전이 벡터는 이종의 프로모터(heterologous promoter)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 이종의 프로모터는 인간 거대세포바이러스 주 극초기 프로모터(human cytomegalovirus major immediate early promoter; HCMV MIEP)이다. 또 다른 실시양태에서, 전이 벡터는 pCAH/SINd1(서열번호: 68)이다.

본 발명의 전이 벡터는 이종의 프로모터(예: 인간 거대세포바이러스 주 극초기 프로모터 HCMV MIEP, 또는 쥐 거대세포바이러스 주 극초기 프로모터 MCMV MIEP)에 작동가능하게 연결된 이종의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전사 카세트를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 전이 벡터는 바이러스 입자내로 관심 폴리뉴클레오티드가 결합하는 것을 가능하게 함으로써, 내부에 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감염된 숙주 세포의 수를 증대시키기 위한 수단을 제공한다.

본 발명은 또한 외래 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에 전달하는데 유용한 CAEV-계, 복제-결함 벡터 입자를 생산하는 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 시스템을 제공한다. 상기 벡터 입자는 포유류 세포를 감염 및 형질도입 시킬 수 있다. 벡터 시스템은, 상술된 전이 벡터; 및 GAEV gag-pol-코딩 서열 및 RRE를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 바이러스 외피 코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 패키징 벡터 시스템을 포함한다.

일 실시양태에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 비-CAEV env-코딩 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 VSV-G- 또는 GaLV-코딩 서열을 포함한다.

다른 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템은 rev-코딩 서열을 포함하는 제3 폴리 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다른 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템은 vif-코딩 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 상술된 각 CAEV 벡터 시스템의 제1 폴리뉴클레오티드는 CAEV gag-pol-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 이종의 조절 서열을 추가로 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 상술된 CAEV 벡터 시스템의 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 바이러스 외피-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 이종의 조절 서열을 추가로 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 제3 폴리뉴클레오티드는 rev-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 이종의 조절 서열을 추가로 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 제4 폴리뉴클레오티드는 vif-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 이종의 조절 서열을 추가로 포함한다.

본 발명의 일 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템은 적격(competent) CAEV 패키징 서열이 없는 패키징 벡터 시스템을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 패키징 벡터 시스템은 CAEV 유전체의 스플라이싱 제공 위치(splice donor site)와 gag 시작 코돈 사이의 5' 말단 영역이 결여되어 있다.

일 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템은 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터 시스템은 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 제2 폴리뉴클레오 티드를 포함하는 제2 벡터, 및 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터 시스템은 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터, 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 벡터, 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 벡터를 포함한다. 상기 제3 벡터는 pHYK/rev(서열번호: 75)일 수 있고, 상기 제4 벡터는 pHYK/vif(서열번호: 76)일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 벡터 시스템은 제1 폴리뉴클레오티드, 제3 폴리뉴클레오티드 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다.

일 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템의 제1 벡터는 CAEV gag-코딩 서열 및 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결된 RRE를 포함한다. 상기 프로모터는 MCMV MIEP일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템은 제1 벡터 pMGP/RRE(서열번호: 77)를 포함한다.

일 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템의 제2 벡터는 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결된 VSV-G-코딩 서열이다. 상기 프로모터는 HCMV MIEP일 수 있다. 상기 제2 벡터는 베타 글로빈 인트론(beta globin intron)을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템은 제2 벡터 pHGVSV-G(서열번호: 74)를 포함한다.

일 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템의 제2 벡터는 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결된 GaLV env-코딩 서열이다. 상기 프로모터는 MCMV MIEP일 수 있다. 상기 제2 벡터는 진핵성 연장 인자-1 알파 인트론(eukaryotic elongation factor-1 alpha intron)을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CAEV 벡터 시스템은 제2 벡터 pMYKEF-1/env(서열변호: 72)를 포함한다.

본 발명의 다른 태양은 포유류 세포를 감염시키는데 유용한 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 입자를 생산하는 방법이다. 상기 방법은 (a) CAEV-계 입자 생산에 적합한 조건하에 상술된 벡터 시스템으로 세포를 형질감염시키는 단계(이때, 상기 벡터 입자는 감염- 및 형질도입-적격이며, 복제-결함임), 및 (b) 상기 벡터 입자를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 입자 및 선택적으로 담체를 포함하는 조성물을 제공하며, 이때 상기 벡터 입자는 상술된 방법에 의해 생산된다.

본 발명은 또한 상술된 전이 벡터 또는 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 시스템을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 CAEV gag-pol-코딩 서열 및 RRE, 및 선택적으로 바이러스 env-코딩 서열을 포함하는 패키징 세포를 제공한다. 상기 패키징 세포는 rev-코딩 및/또는 vif-코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 세포는 전이 벡터의 RNA 형태를 감염- 및 형질도입-적격이면서 복제-결함인 벡터 입자내로 패키징하는데 유용하다.

일 실시양태에서, 벡터 시스템은 상술된 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 포함한다. 상기 벡터 시스템은 상술된 제3 및/또는 제4 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 벡터 시스템은 상술된 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 포함한다. 상기 벡터 시스템은 상술된 제3 및/또는 제4 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 벡터 시스템은 CAEV gag-pol-코딩 서열 및 RRE를 포함하는 제1 벡터를 포함하는 세포를 포함한다. 상기 제1 벡터는 rev-코딩 및/또는 vif-코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 한편, 상기 세포는 CAEV gag-pol-코딩 서열 및 RRE를 포함하는 제1 벡터, rev-코딩 서열을 포함하는 제2 벡터, 및/또는 vif-코딩 서열을 포함하는 제3 벡터를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 벡터 시스템은 CAEV gag-pol-코딩 서열 및 RRE를 포함하는 제1 벡터, 및 바이러스 env-코딩 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 세포를 포함한다. 상기 제1 벡터는 rev-코딩 및/또는 vif-코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 다른 한편으로, 상기 세포는 CAEV gag-pol-코딩 서열 및 RRE를 포함하는 제1 벡터, 바이러스 env-코딩 서열을 포함하는 제2 벡터, 및 선택적인 rev-코딩 서열을 포함하는 제3 벡터 및/또는 vif-코딩 서열을 포함하는 제4 벡터를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 태양은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드를 포유류 세포로 전달하거나 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 복제하는 방법이며, 상기 방법은 상기 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포의 유전체 내로 통합할 수 있는 조건 및 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 상기 폴리펩타이드가 증식할 수 있는 조건하에, 상기 포유류 세포를 상술된 벡터 입자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 포유류 세포는 분열 세포, 비-분열 세포 또는 CD34+ 줄기 세포일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드를 포유류 세포로 전달하는 방법 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 복제하는 방법은, 세포를 벡터 입자와 접촉시키기 전에 포유동물로부터 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포를 벡터 입자와 접촉시킨 후에 배양액에서 상기 세포를 증식시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 접촉된 세포를 증식시키기 전 또는 후에 세포를 포유동물에 재도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 전달된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩타이드가 척추동물에서의 생물학적 반응을 검출 또는 유도하기에 충분한 양으로 척추동물에서 발현되도록 하기 위해, 이종의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 입자를 척추동물에 투여하는 단계(이때, 상기 벡터 입자는 상술된 방법에 의해 생산됨)를 포함하는, 폴리펩타이드를 척추동물에 전달하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) CAEV 5' LTR과 CAEV gag-코딩 서열 사이의 비번역 영역, 및 (b) 상기 비번역 영역의 3' 말단에 연결된 CAEV gag-코딩 서열의 1 내지 X번째 뉴클레오티드(이때, X는 613 미만임)로 필수적으로 이루어진, CAEV 패키징 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명자들은, 본원에서 제시된 바와 같이, 상기 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 입자의 생산이 렌티바이러스 벡터 설계에 있어서 기존 CAEV-계 벡터 입자들에 비해 향상된 효율성 및 안전성을 나타내는 것을 발견하였다. 상기 향상된 효율성은 효율적인 캡시드화를 가능하게 하는 효율적인 패키징 서열을 제공하는, 5' LTR과 gag 시작 코돈 사이의 비번역 영역 및 gag-코딩 영역의 최적의 길이를 발견함으로써 달성되며, 이는 바이러스 역가를 증대시킨다. 바이러스 역가는 또한 패키징 플라스미드의 설계시 강력한 이종의 프로모터를 사용하여 향상된다. 상기 향상된 안전성은 tat-독립적인 전이 벡터 및 플라스미드-계 패키징 시스템의 제작을 통해 달성된다.

도 1은 CAEV 프로바이러스 유전체 구조에 대한 개략도이다.

도 2a는 플라스미드 pMGP/RRE(서열번호: 77)의 개략도이다. pMGP/RRE(서열번호: 77)는 CAEV gag-pol 코딩 영역(bp 709-5,243)의 상류에 위치하는 MCMV MIEP 영역(bp 1-660), RRE 영역(bp 5,426-5,627 또는 bp 5,368-5,669), 및 소 성장호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호(bp 5,751-5,984)를 포함하는 9,446 bp의 플라스미드이다. 상기 벡터는 또한 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 8,151-7,155), SV40 복제 기점(origin of replicaiton)(bp 8,509-8,152), Col E1 복제 기점(bp 6,115-6,698), 및 암피실린 내성 유전자 영역(bp 9,362-8,528)을 포함한다.

도 2b는 플라스미드 pMGP/REV/RRE의 개략도이다. pMGP/REV/RRE는 CAEV gag-pol 코딩 영역(bp 726-5,258)의 상류에 위치하는 MCMV MIEP 영역(bp 1-660에 위치) 및 CAEV의 주 스플라이싱 제공 위치(bp 688-704), rev 코딩 영역의 제1 엑 손(exon)(bp 5,383-5,494), RRE 영역(bp 5,540-5,841), rev 코딩 영역의 제2 엑손(bp 5,888-6,177), 및 소 성장호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호(bp 6,229-6,462)를 포함하는 9,924 bp의 플라스미드이다. 상기 벡터는 또한 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 7,633-8,629), SV40 복제 기점(bp 8,987-8,630), Col E1 복제 기점(bp 6,593-7,176), 및 암피실린 내성 유전자 영역(bp 9,840-9,006)을 포함한다.

도 3a는 플라스미드 pCAH/SINd(서열번호: 73)의 개략도이다. pCAH/SINd (서열번호: 73)는 HCMV MIEP(bp 1-588), CAEV 5'LTR에서의 R-U5 서열 영역(bp 611-772), RRE 영역(bp 796-1,154), 및 U3-삭제된 CAEV 3'LTR 영역(bp 1,275-1,458)을 포함하는 3,566 bp의 플라스미드이다. 상기 벡터는 또한 Col E1 복제 기점(bp 1,863-2,466), 및 카나마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 2,698-3,510)을 포함한다.

도 3b는 플라스미드 pCAH/SINd0(서열번호: 67)의 개략도이다. pCAH/SINd0(서열번호: 67)은 HCMV MIEP(bp 1-588), CAEV 5'LTR에서의 R-U5 서열 영역(bp 611-772), 프라이머 결합 위치(PBS)를 포함하는 잔여 비번역 서열(bp 773-789), RRE 영역(bp 1,141-1,499), 및 U3-삭제된 CAEV 3'LTR 영역(bp 1,620-1,803)을 포함하는 3,911 bp의 플라스미드이다. 상기 벡터는 또한 Col E1 복제 기점(bp 2,208-2,791) 및 카나마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 3,043-3,855)을 포함한다.

도 3c는 플라스미드 pCAH/SINd1(서열번호: 68)의 개략도이다. pCAH/SINd1(서열번호: 68)은 HCMV MIEP(bp 1-588) 프로모터; CAEV 5'LTR에서의 R-U5 서열 영역(bp 610-772); PBS 위치를 포함하는 잔여 비번역 영역(bp 773-789); 시작 ATG 코돈(bp1121-1123) 및 상기 시작 ATG 코돈의 하류에 위치하는 ATG 코 돈(bp1142-1144)에서 ATG로부터 TAG로의 점변이(point mutation)를 갖는, gag 유전자의 327 bp의 절편(bp 1,121-1,448); RRE 영역(bp 1,468-1,826); 및 U3-삭제된 CAEV 3'LTR 영역(bp 1,947-2,130)을 포함하는 4,238 bp의 플라스미드이다. 상기 벡터는 또한 Col E1 복제 기점(bp 2,535-3,118) 및 카나마이신 내성 유전자 영역(bp 3,370-4,182)을 포함한다.

도 3d는 플라스미드 pCAH/SINd2(서열 번호: 69)의 개략도이다. 플라스미드 pCAH/SINd2(서열 번호: 69)는 HCMV MIEP(bp 1-588); CAEV 5'LTR에서의 R-U5 서열 영역(bp 610-772); PBS위치를 포함하는 잔여 비번역 영역(bp 773-789); 시작 ATG 코돈(bp1121-1123) 및 상기 시작 ATG 코돈의 하류에 위치하는 ATG 코돈(bp1142-1144)에서 점변이를 갖는, gag 유전자의 612 bp의 절편(bp 1,121-1,733); RRE 영역(bp 1,753-2,111); 및 U3-삭제된 CAEV 3'LTR 영역(bp 2,232-2,415)을 포함하는 4,523 bp 플라스미드이다. 상기 벡터는 또한 Col E1 복제 기점(bp 2,820-3,403) 및 카나마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 3,655-4,467)을 포함한다.

도 3e는 플라스미드 pCAH/SINd3(서열 번호: 70)의 개략도이다. pCAH/SINd3(서열 번호: 70)는 HCMV MIEP(bp 1-588); CAEV 5'LTR에서의 R-U5 서열 영역(bp 610-772); PBS 위치를 포함하는 잔여 비번역 영역(bp 773-789); 시작 ATG 코돈(bp 1121-1123) 및 상기 시작 ATG 코돈의 하류에 위치하는 ATG 코돈(bp 1142-1144)에서 점변이를 갖는, gag 유전자의 908 bp의 절편(bp1,121-2,029); RRE 영역(bp 2,049-2,407); 및 U3-삭제된 CAEV 3'LTR 영역(bp 2,549-2,711)을 포함하는 4,819 bp의 플라스미드이다. 상기 벡터는 또한 Col E1 복제 기점(bp 3,116-3,699) 및 카나마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 3,951-4,763)을 포함한다.

도 3f는 플라스미드 pCAH/SINd4(서열 번호: 71)의 개략도이다. pCAH/SINd4(서열 번호: 71)는 HCMV MIEP(bp 1-588); CAEV 5'LTR에서의 R-U5 서열 영역(bp 610-772); PBS 위치를 포함하는 잔여 비번역 영역(bp 773-1,120); 시작 ATG 코돈(bp 1121-1123) 및 상기 시작 ATG 코돈의 하류에 위치하는 ATG 코돈(bp 1142-1144)에서 점변이를 갖는, gag 유전자의 1198 bp의 절편(bp 1,121-2,319); RRE 영역(bp 2,342-2,700); 및 U3-삭제된 CAEV 3'LTR 영역(bp 2,842-3,004)을 포함하는 5,112 bp의 플라스미드이다. 상기 벡터는 또한 Col E1 복제 기점(bp 3,409-3,992) 및 카나마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 4,244-5,056)을 포함한다.

도 3g는 플라스미드 pCAH/SINd1/hlacZ(서열 번호: 79)의 개략도이다. pCAH/SINd1/hlacZ(서열 번호: 79)는 lacZ 리포터 유전자(reporter 유전자)를 발현하는 pCAH/SINd1(서열 번호: 68)로부터 유래된 8,127 bp의 플라스미드이다. 상기 벡터는 두 개의 HCMV MIEP 프로모터 영역(각각 bp 1-588 및 bp 1,866-2,460에 위치); CAEV 5'LTR에서의 R-U5 서열 영역(bp 610-772); PBS 위치를 포함하는 잔여 비번역 영역(bp 773-789); 시작 ATG 코돈(bp 1121-1123) 및 상기 시작 ATG 코돈의 하류에 위치하는 ATG 코돈(bp 1142-1144)에서 점변이를 갖는, gag 유전자의 325 bp의 절편(bp 1,121-1,446); lacZ 유전자 코딩 서열(bp 2,541-5,711); 및 U3-삭제된 CAEV 3'LTR 영역(bp 5,782-6,019)을 포함한다. 상기 벡터는 또한 Col E1 복제 기점(bp 6,424-7,007), 및 카나마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 7,259-8,071)을 포함한다.

도 3h는 플라스미드 pCAH/SINd60/hlacZ(서열 번호: 78)의 개략도이다. 플라스미드 pCAH/SINd60/hlacZ(서열 번호: 78)는 두 개의 프로모터 영역 HCMV MIEP(각각 bp 1-588 및 bp 1,595-2,189에 위치); CAEV 5'LTR에서의 R-U5 서열 영역(bp 610-772); PBS 위치를 포함하는 잔여 비번역 영역(bp 773- 789 bp); 시작 ATG 코돈(bp 1121-1123) 및 상기 시작 ATG 코돈의 하류에 위치하는 ATG 코돈(bp 1142-1144)에서 점변이를 갖는, gag 유전자의 60 bp의 절편(bp 1,121-1,181); RRE 영역(bp 1,195-1,565); lacZ 유전자 코딩 서열(bp 2,270-5,440); 및 U3-삭제된 CAEV 3'LTR 영역(bp 5,511-5,748)을 포함하는 7,856 bp이다. 상기 벡터는 또한 Col E1 복제 기점(bp 6,153-6,736), 및 카나마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 6,988-7,800)을 포함한다.

도 4는 플라스미드 pHYK/vif(서열 번호: 76)의 개략도이다. pHYK/vif(서열 번호: 76)는 HCMV MIEP(bp 1-596), vif 유전자 코딩 영역(bp 691-1,380), BGH 폴리아데닐화 신호(bp 1,467-1,695), Col E1 복제 기점(bp 1,826-2,409), 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 3,862-2,866), 및 암피실린 내성 유전자 코딩 영역(bp 5,270-4,239)을 포함하는 5,729 bp의 플라스미드이다.

도 5는 플라스미드 pHYK/rev(서열 번호: 75)의 개략도이다. pHYK/rev(서열 번호: 75)는 HCMV MIEP(bp 1-596), rev 유전자 코딩 영역(bp 672-1,073), BGH 폴리아데닐화 신호(bp 1,157-1,385), Col E1 복제 기점(bp 1,516-2,099), 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 3,552-2,556), 및 암피실린 내성 유전자 코딩 영역(bp 4,960-3,929)을 포함하는 5,419 bp의 플라스미드이다.

도 6a는 플라스미드 pHGVSV-G(서열 번호: 74)의 개략도이다. pHGVSV-G(서열 번호: 74)는 HCMV MIEP(bp 1-596), β-글로빈 인트론 영역(bp 714-1,599), VSV-G 코딩 영역(bp 1,632-3,312), BGH 폴리아데닐화 신호(bp 3,361-3,589), Col E1 복제 기점(bp 3,720-4,303), 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 5,756-4,760), 암피실린 내성 유전자 코딩 영역(bp 7,164-6,133), 및 F1 복제 기점(bp 7,165-7,621)을 포함하는 7,623 bp의 플라스미드이다.

도 6b는 플라스미드 pMYKEF1/env(서열 번호: 72)의 개략도이다. pMYKEF1/env(서열 번호: 72)는 MCMV MIEP (bp 1-665), 인간 EF1-α 인트론 영역(bp 668-1,618), GaLV env 코딩 영역(bp 1,699-3701), BGH 폴리아데닐화 신호(bp 3,885-4,118), Col E1 복제 기점(bp 4,349-4,832), 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역(bp 6,290-5,284), 및 암피실린 내성 유전자 코딩 영역(bp 7,496-6,666)을 포함하는 7,579 bp의 플라스미드이다.

도 7은 인간 293T 표적 세포로 형질감염된 유전자 전이 벡터로부터 전사된, 전이 벡터 RNA의 상대량을 나타내는 사진이다.

도 8은 CAEV (A) 및 MuLV (B) 벡터에 의해 유전자 전이시킨 인간 293T 표적 세포를 나타내는 두 개의 사진이다.

도 9는 형질감염된 293T 세포에서 발현되거나(레인 1, 2 및 3) 293T 패키징 세포에서 캡시드화되고 방출된(레인 4, 5 및 6), 전이 벡터 RNA의 상대량을 나타내는 사진이다.

도 10은 인간 293T 패키징 세포에서 캡시드화되고 방출된 전이벡터 RNA의 상 대량을 나타내는 사진이다.

도 11은 VSV-G 또는 GaLV 외피 단백질에 의해 의사형화된(pseudotyped) 렌티바이러스 벡터의 감염 및 역전사 후, 통합된 레트로바이러스 cDNA의 상대량을 나타내는 사진이다.

도 12는 감염된 숙주 세포 염색체(chromosome)내로 통합된 바이러스 벡터 cDNA의 상대량을 나타내는 사진이다.

도 13은 (A) 대조군 세포 및 (B) G1-정체된 세포에 대한 FACS 분석 결과를 나타내는 두 개의 그래프이다.

도 14는 (A) 형질도입된 세포의 수 및 (B) 분열 및 비분열 세포에 대한 HIV-1-, CAEV-, 및 MuLV-유래 바이러스 벡터의 상대적 형질도입 효율성을 나타내는 두 개의 그래프이다.

본 발명은, 특히, CAEV-계 렌티바이러스 벡터 시스템 및 상기 벡터를 사용하여 관심 폴리펩타이드를 분열 및 비분열 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다.

CAEV 유전체

야생형 CAEV 바이러스는, 이중-가닥 DNA 중간 물질을 통해 복제되고 핵단백질 코어(nucleoprotein core)를 포함하는 구형의 외피 비리온(virion)으로 패키징되는, 2량체 RNA 유전체를 갖는다(단일-가닥, 양성 극성). 상기 유전체는 구조 및 효소 단백질인 Gag, Pol 및 Env를 코딩하는 세 개의 유전자, 및 통합된 바이러스 유전체 각 말단에서의 긴 말단 반복(long terminal repeat; LTR)을 포함한다. 또한, 상기 유전체는 세 개의 조절 단백질인 vif, tat 및 rev를 코딩한다.

상기 gag 유전자는 내부 구조 단백질을 코딩하고, pol 유전자는 바이러스 복제 효소를 코딩하며, env 유전자는 바이러스가 세포 표면에 부착하는데 매개하는 외피 당단백질(glycoprotein)을 코딩한다. Vif 단백질은 바이러스 감염성(infectivity)에 연관되어 있고, Tat 단백질은 5' LTR의 전사활성화(transactivation)에 연관되어 있다. Rev 단백질 및 그 표적 서열 RRE(Rev 반응 요소)는 바이러스 RNA의 안정성, 바이러스 RNA 스플라이싱의 조절, 및 대형 RNA(비-스플라이싱되거나 단일-스플라이싱된)을 핵으로부터 세포질로 수송하는데 연관되어 있다. 프로바이러스 LTR 서열은 U3(구조 단백질들의 하류에 위치하는 특이(unique) 서열 요소), R(각 유전체 말단의 짧은 반복서열), 및 U5(상기 R 서열 바로 다음의 특이 서열 요소) 영역들을 포함한다. 5'LTR의 U3 영역은 바이러스 프로모터 및 인핸서(enhancer)를 포함한다. 유전체의 3' 말단은 3'LTR에서의 폴리아데닐화 신호를 포함한다.

CAEV의 야생형 유전체는 또한 프로바이러스 통합을 위한 LTR 말단의 att(부착 위치) 등의 여러 시스-작용 요소; 5'LTR에서 통합된 프로바이러스의 전사 개시를 조절하는 프로모터 요소; 5'LTR의 하류에 위치하는 PBS(프라이머 결합 위치); 5'-스플라이싱 제공 위치; 패키징 서열(본원에서는 호환가능하게 패키징 위치 또는 패키징 신호를 의미한다.); 3'LTR 부근에 위치하는 ppt(폴리퓨린 트랙) 위치; 및 3'LTR에서의 폴리아데닐화 신호를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "시스"는 핵산의 동일 염색체 또는 선형 부분 상에 존재하는 유전자들을 의미한다. 따라서, 용어 "시스-결함"은 핵산의 선형 서열 상에서 발견된 결함을 의미한다. 용어 "시스-작용"은 핵산의 동일 염색체 또는 선형 부분 상에 존재하는 유전자에 대한 조절 유전자의 제어 효과를 의미한다. 예를 들면, 하류 mRNA의 합성에 영향을 주는 프로모터는 시스-작용 조절 요소이다.

CAEV의 두 분리주에 대한 전장 유전체 서열이 공지되어 있으며, 상기 서열들은 생명공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 데이터베이스에 NC_001463(서열번호: 1) 및 AF322109(서열번호: 2)(Saltarelli et al., 1990, 및 Gjerset, B.J. et al., 비공개)로서 기탁되어 있다. 청구된 본 발명의 핵산은 CAEV의 특정 분리주에 한정되지는 않으나, 그 유전체 서열의 공지된 기능을 유지하는 서열일 수 있다. 예를 들면, 유전자 서열에서의 자연적인 변이들이 바이러스 복제 중에 일어남으로써 유사한 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유사 핵산 서열들이 발생된다는 것이 당 분야에 공지되어 있다.

NC_001463(서열번호: 1) 및 AF322109(서열번호: 2) 유전체 서열들의 서열 정렬(sequence alignment)을 표 1에 나타내었다. 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 서열들간에 상당한 핵산 상동성이 있으나, 핵산 수준에서의 차이가 명백하다. 표 2(서열번호: 3 내지 6)에 기재된 CAEV gag 영역의 변이가능성은 특히 중요하다. NC_001463 5'LTR, pol, rev 및 vif 유전자들, 및 그에 상응하는 AF322109로부터의 유전자들의 서열 정렬은 표 3-6(서열번호: 7-14)에서 확인될 수 있다. 또한, CAEV 유전체의 많은 부분 서열들이 공지되고 기탁되어 있다. 예를 들면, 기탁 번호 AY081139, AY101347, AY101348, AY047362, AF402668, AF402667, AF402666, AF402665, AF402664, AJ305042, AJ305041, 및 AJ305040는 모두 CAEV의 브라질 분리주로부터의 gag 유전자 서열을 제공한다. 기탁 번호 AF015181, L78453, L78451, L78450, L78447 및 L78446은 또한 다양한 CAEV 분리주들로부터의 gag 유전자 서열을 포함한다. 기탁번호 X64828 및 M63106은 다양한 CAEV 분리주들로부터의 rev 유전자 서열을 포함한다. 기탁번호 AF015182, AJ305053, K03327, L78448, L78452 및 U35814는 다양한 CAEV 분리주들로부터의 pol 유전자를 포함한다. NC_001463의 gag 유전자(서열번호: 15, 17)와, AF015181(서열번호: 16, 17), AF402664(서열 번호: 20, 26), AF402665(서열 번호: 21, 27), AF402666(서열 번호: 22, 28), AF402667(서열 번호: 23, 29) 및 AF402668(서열 번호: 24, 30)로부터의 gag 유전자들간의 서열 정렬은 표 8에서 확인된다. NC_001463의 gag 유전자(서열 번호: 31, 35)와, AJ305040(서열 번호: 32, 36), AJ305041(서열 번호: 33, 37) 및 AJ305042(서열 번호: 34, 38)로부터의 gag 유전자들 간의 서열 정렬은 표 9에서 확인된다. NC_001463의 gag 유전자(서열 번호: 39, 41)와 AY047362(서열 번호: 40, 42)로부터의 gag 유전자 간의 서열 정렬은 표 10에서 확인된다. NC_001463 gag 유전자(서열 번호: 43, 45)와 AY081139(서열 번호: 44, 46)로부터의 gag 유전자 간의 서열 정렬은 표 11에서 확인된다. NC_001463(서열 번호: 47, 50)의 gag 유전자와, AY101347(서열 번호: 48, 51) 및 AY101348(서열 번호: 49, 52)로부터의 gag 유전자들 간의 서열 정렬은 표 12에서 확인된다. NC_001463 gag 유전자(서열 번호: 53, 59)와, L78446(서열 번호: 54, 60), L78447(서열 번호: 55, 61), L78450(서열 번호: 56, 62), L78451(서열 번호: 57, 63) 및 L78453(서열 번호: 58, 64)으로부터의 gag 유전자들 간의 서열 정렬은 표 13에서 확인된다.

상기 정렬들은 벡터 NTI(VectorNTI, Informax, USA)를 사용하여 하기 파라미터를 사용하여 수행되었다:

이중정렬(pairwise alignment)의 경우: 공백(gap) 개시 벌점: 15

공백 연장 벌점: 6.6

다중정렬(multiple alignment)의 경우: 공백 개시 벌점: 15

공백 연장 벌점: 6.6

공백 분리 벌점 범위 : 8

표 14에는 상기 제시된 gag 유전자 서열들의 서열 정렬에 대한 상동성 백분율 값들이 요약되어 있다. 표 15에는 NC_001463(서열 번호: 1) 및 AF322109(서열 번호: 2)의 전체 유전체 정렬, 및 gag, 5 LTR, pol, rev 및 vif 영역들의 정렬들의 상동성 백분율이 요약되어 있다. 다양한 CAEV 분리주들로부터의 많은 부분 서열들 뿐 아니라 두 CAEV 분리주들의 유전체 서열이 공지되어 있으며, 일치되는 서열들을 용이하게 식별할 수 있으므로, 다양한 CAEV 서열들을 사용하여 청구된 본 발명을 실시하기 위해 과도한 실험이 요구되지 않는다.

본 발명의 CAEV 벡터

본 발명의 벡터는 넓은 계통분류학적 범위의 숙주 세포에서 숙주 세포의 핵과 무관한 폴리뉴클레오티드 또는 유전자들을 복제하고 발현하기 위한 수단을 제공한다. 이러한 이종 핵산의 벡터-매개된 숙주세포로의 결합은 숙주 세포의 형질감염 또는 감염을 의미하며, 이때 감염은 바이러스 입자의 사용을 의미하고, 형질감염은 핵산 분자 그대로의 사용을 의미한다.

용어 "유전자"는 폴리펩티드 또는 전구체의 생산에 필요한 조절(control) 및 코딩 서열들을 포함하는 DNA 서열을 의미한다. 본원에서 상호호환적으로 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"는 두 개 이상과 같이 임의의 길이를 갖는 뉴클레오티드 폴리머를 의미하며, DNA 및 RNA 둘 다를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사물(analogs)(변형된 인산기, 염기 또는 당 등), 또는 DNA 중합효소 또는 RNA 중합효소 등의 적절한 효소에 의해 폴리머로 결합될 수 있는 임의의 치환기일 수 있다. 폴리펩타이드는 전장 코딩 서열 또는 폴리펩타이드의 목적하는 활성이 유지되는 정도의 길이를 갖는 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 코딩될 수 있다.

용어 "야생형"은 자연발생원(naturally occurring source)으로부터 분리되어 그 유전자 또는 유전자 산물의 특징을 갖는 유전자 또는 유전자 산물을 의미한다. 야생형 유전자는 개체군들 중에서 가장 빈번하게 관찰되어 임의로 그 유전자의 "일반적인" 또는 "야생의" 형태로서 고안된 것이다. 반면에, 용어 "변이된" 또는 "변이체"는 상기 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교할 때, 서열 또는 기능적 특징에서의 변형(즉, 대체된 특징)을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 의미한다. 자연-발생적 변이체는 분리될 수 있으며, 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교할 때, 변화된 특징을 갖는다는 사실에 의해 식별될 수 있다.

본원 명세서 및 청구항에서 사용되는 "a", "an", "the" 등의 단일형 형태들은 문맥상 명확하게 기재하고 있지 않는 한 복수의 인용물들을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "폴리뉴클레오티드"의 의미에는 폴리뉴클레오티드들도 포함되며, "줄기 세포"의 의미에는 복수의 세포들도 포함된다.

본원에 사용된 용어 "레트로바이러스"는 그들의 복제 주기 동안 역전사효소를 이용하는 RNA 바이러스들을 의미한다. 레트로바이러스 유전체 RNA는 역전사 효소에 의해 이중-가닥 DNA로 전환된다. 바이러스의 이러한 이중-가닥 DNA 형태는 감염된 세포의 염색체내로 통합될 수 있으며; 일단 통합되면, 이것을 "프로바이러스"라고 일컫는다. 프로바이러스는 RNA 중합효소 Ⅱ에 대한 주형(template)으로 제공되며 신규 바이러스 입자들을 생산하는데 필요한 구조 단백질들 및 효소들을 코딩하는 RNA 분자들의 발현을 지배한다.

본원에 사용된 용어 "렌티바이러스"는 질병을 서서히 진행시키는 레트로바이러스의 한 군(또는 속)을 의미한다. 이러한 군에 포함되는 바이러스들로는 인간 면역결핍 바이러스(HIV); 양에서 뇌염(비스나) 또는 폐렴(매디)을 일으키는 비스나-매디, 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역결핍 바이러스(BIV); 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)가 있다. 이러한 바이러스들에 의해 발병되는 질병들은 긴 잠복기와 장기화된 경로를 특징으로 한다. 일반적으로, 상기 바이러스들은 단핵세포 및 대식세포들을 잠재적으로 감염시키고, 이들로부터 다른 세포들로 퍼져나간다.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 전이 폴리뉴클레오티드(예: DNA) 조각들을 하나의 세포로부터 다른 세포로 전이하는 핵산 분자들을 의미한다. 용어 "전달물질(vehicle)"은 때때로 "벡터"와 상호호환적으로 사용된다. 전달물질 또는 벡터의 임의의 형태는 이러한 정의 내에 포함된다. 예를 들면, 벡터로는 이에 한정되는 것은 아니나, 바이러스 입자, 플라스미드, 트랜스포존(transposon) 등이 포함된다.

본 발명의 벡터의 제작을 위한 기본 기술들은 통상의 기술자들에게 이미 공지되어 있으며, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)]와 같은 인용문헌에서 확인될 수 있다. 다양한 방법들이 DNA 절편을 결합하기 위해 활용가능하며, 이의 선택은 DNA 절편의 말단 성질에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 이루어진다.

본 발명의 적합한 폴리아데닐화 서열로는 이들로 한정되는 것은 아니나, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호(Pfarr et al., 1986), SV40 초기 영역 폴리아데닐화 위치(Hall et al., 1983) 및 SV40 후기 영역 폴리아데닐화 위치(Carswell and Alwine, 1989), β-글로빈 폴리A, 및 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 카이네이즈 폴리A 등이 포함된다.

본 발명의 프로모터는 포유류 또는 바이러스 기점에 대한 프로모터를 포함할 수 있으며, 세포에서 말단에 위치하는 서열(즉, 프로모터 서열의 5' 말단에 연결된 서열)의 전사를 지배하기에 충분할 것이다. 프로모터 영역으로는 또한 전사의 증대 또는 감소에 대한 조절 요소들이 포함될 수 있다. 본 발명에 적합한 프로모터로는 이에 한정되는 것은 아니나, 인간 또는 쥐 거대세포바이러스 극초기 프로모터(HCMV MIEP 또는 MCMV MIEP), 연장 인자 1 알파(ef-1α), 및 로우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터(pRSV) 등이 있다. 인트론 서열들은 또한 프로모터와 결합될 수 있다. 인트론 서열들로는 이에 한정되는 것은 아니나, ef-1α 인트론 및 β-글로빈 인트론 등이 있다. 또한, 유도발현 시스템(inducible expression systems)이 사용될 수 있다. 유도 시스템의 예로는 이에 한정되는 것은 아니나, 엑시존(ecdysone)-유도 포유류 발현 시스템(Invitrogen, CA, USA) 및 Tet-On 및 Tet-Off 유전자 발현 시스템(Clontech, CA, USA) 등이 있다. 세포 또는 조직 특이적 프로모터들은 특정 세포 개체군내 유전자 서열의 표적 발현을 위해 이용될 수 있다.

프로모터 또는 터미네이터(terminator) 서열들의 상류, 및 코딩 영역의 하류로부터의 인핸서(enhancer) 서열들은 발현을 촉진하기 위해 본 발명의 벡터에 선택적으로 포함될 수 있다. 본 발명의 벡터는 또한 세포가 벡터의 핵산에 의해 발현된 단백질을 효율적 및 효과적으로 처리하도록, 인트론 서열, 이동 서열(localization sequence) 또는 신호 서열과 같은 추가의 핵산 서열들을 포함할 수 있다. 인트론 서열의 예로는 β-글로빈 인트론(Kim et al., 2002) 및 인간 EF-1α 인트론(Kim et al., 2002) 등이 포함된다. 이같은 추가의 서열들은 벡터에 삽입되어, 전사를 목적으로 하는 경우에는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되거나, 번역 및 처리를 목적으로 하는 경우에는 개시 및 처리 서열에 추가적으로 연결된다. 한편, 삽입된 서열들은 벡터 내 어떤 곳에도 위치할 수 있다.

용어 "작동가능하게 연결된"은, 유전자 서열의 전사가 작동가능하게 연결된 프로모터 서열에 의해 지배되고, 유전자 서열의 번역이 작동 가능하게 연결된 번역 조절 서열에 의해 지배되고, 또한 유전자 서열의 번역-후 처리가 작동가능하게 연결된 처리 서열에 의해 지배되는, 유전자 서열과 프로모터 또는 다른 조절 또는 처리 서열간의 연결을 의미한다.

용어 "SIN 벡터"는 3'LTR에서의 절단된(truncated) U3 영역을 갖는 자가-불활성(self-inactivating) 벡터를 의미한다. 역전사 기간 동안, 절단된 U3는 5'LTR에서 복제되고, 그 결과 전사 용량(capacity)의 손실 및 내부 프로모터에 대한 저해 효과가 나타난다.

전이 벡터의 패키징 서열은 (ⅰ) CAEV 5' LTR과 CAEV gag-코딩 서열 간의 비번역 영역, 및 (ii) 상기 비번역 영역의 3' 말단에 연결된 CAEV gag-코딩 서열의 1 내지 X번째 뉴클레오티드(이때, X는 613 미만임)로 필수적으로 이루어진다. 일 실시양태에서, X는 60, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 및 600으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, X는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(a) X는 25 초과 600 미만,

(b) X는 25 초과 500 미만,

(c) X는 25 초과 400 미만,

(d) X는 25 초과 300 미만,

(e) X는 25 초과 200 미만,

(f) X는 50 초과 600 미만,

(g) X는 50 초과 500 미만,

(h) X는 50 초과 400 미만,

(i) X는 50 초과 300 미만,

(j) X는 50 초과 200 미만,

(k) X는 75 초과 600 미만,

(l) X는 75 초과 500 미만,

(m) X는 75 초과 400 미만,

(n) X는 75 초과 300 미만,

(o) X는 75 초과 200 미만,

(p) X는 100 초과 600 미만,

(q) X는 100 초과 500 미만,

(r) X는 100 초과 400 미만,

(s) X는 100 초과 300 미만,

(t) X는 100 초과 200 미만,

(u) X는 125 초과 600 미만,

(v) X는 125 초과 500 미만,

(w) X는 125 초과 400 미만,

(x) X는 125 초과 300 미만,

(y) X는 125 초과 200 미만,

(z) X는 150 초과 600 미만,

(aa) X는 150 초과 500 미만,

(bb) X는 150 초과 400 미만,

(cc) X는 150 초과 300 미만,

(dd) X는 150 초과 200 미만,

(ee) X는 200 초과 600 미만,

(ff) X는 200 초과 500 미만,

(gg) X는 200 초과 400 미만,

(hh) X는 200 초과 300 미만,

(ii) X는 200 초과 200 미만,

(jj) X는 250 초과 600 미만,

(kk) X는 250 초과 500 미만,

(ll) X는 250 초과 400 미만, 및

(mm) X는 250 초과 300 미만.

다른 실시양태에서, X는 40 초과 613 미만이다. 또 다른 실시양태에서, X는 약 327이다. 전이 벡터의 일 실시양태에서, gag 번역을 개시하는 코돈은 변이되거나(예: ATG가 TAG, TTG, CTG 또는 ATT로 치환) 삭제된다. 용어 "코돈"은, 특정 아미노산의 성장 폴리펩타이드 쇄로의 결합에 대한 지령을 의미하는, DNA 또는 전령(messenger) RNA 분자에서의 세 개 뉴클레오티드로 이루어진 하나의 서열을 의미한다. 전이 벡터는 이종의 프로모터 및 하나 이상의 시스-작용 서열들을 추가로 포함한다.

본원에 사용된 용어 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"은 바이러스 RNA가 바이러스 캡시드 또는 입자로 캡시드화하는데 요구되는, CAEV 유전체의 5' LTR에 인접하여 위치하는 서열을 의미한다. 여러 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전체의 캡시드화에 요구되는 최소한의 패키징 신호(또한 싸이(psi[ψ]) 서열이라고도 함)를 사용한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "패키징 서열", "패키징 신호", "싸이", 및 기호 "ψ"은 바이러스 입자 형성 기간 동안에 CAEV RNA 가닥들의 캡시드화에 요구되는 비-코딩 서열을 의미한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 전이 벡터는 또한 전사 카세트(transcription cassette)를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "전사 카세트"는 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결된, 유전학적 요소들의 특정 그룹, 일반적으로 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 관심 폴리펩타이드를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산의 절편(fragment) 또는 조각(segment)을 의미한다. 상기 카세트는 단일 단위로서 제거되거나 벡터 또는 플라스미드에 삽입될 수 있다.

본 발명의 전이 벡터에 대한 실례가 도 3c에 나타나 있다. 도 3c는 플라스미드 pCAH/SINd1(서열 번호: 68)을 나타낸다. pCAH/SINd1(서열 번호: 68)은 HCMV MIEP 프로모터, CAEV 5'LTR에서의 R-U5 서열 영역, PBS 위치를 포함하는 잔여 비번역 서열, ATG→TAG 이중 점변이를 갖는 gag 유전자의 327 bp 절편, RRE 영역 및 U3-삭제된 CAEV 3'LTR 영역을 포함하는, 4,238 bp의 플라스미드이다. 상기 벡터는 또한 Col E1 복제 기점(bp 2535-3118) 및 카나마이신 내성 유전자 영역(bp 3370-4182)을 포함한다. 전이 벡터의 다른 실례들이 도 3a 내지 3h에 나타나 있다.

본 발명은 상술된 전이 벡터 및 패키징 벡터 시스템을 포함하는 CAEV 벡터 시스템을 제공한다. 상기 패키징 벡터 시스템은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 벡터 서열을 포함한다. 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 CAEV gag-pol 및 RRE-코딩 서열을 포함하며, 제2 폴리뉴클레오티드는 바이러스 외피 코딩 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 비-CAEV 외피를 코딩한다.

본원에서 사용된 문구 "구조 유전자"는 바이러스 유전체의 캡시드화(예: 패키징)에 요구되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하며, gag, pol 및 env 등이 이에 속한다.

본 발명의 제1 패키징 벡터의 실례가 도 2a에 나타나 있다. 도 2a는 플라스미드 pMGP/RRE(서열 번호: 77)를 나타낸다. 상기 플라스미드는 9,446 염기쌍(bp)을 가지며, MCMV MIEP 영역, CAEV gag-pol 코딩 영역, RRE 영역, 및 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 상기 벡터는 또한 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역, SV40 복제 기점, Col E1 복제 기점, 및 암피실린 내성 유전자 영역을 포함한다.

본 발명의 바이러스 벡터가 감염시킬 수 있는 세포들의 숙주 범위는 다른 근친관계의 바이러스로부터의 외피 유전자를 이용함으로써 대체될 수 있다. 즉, 특정 바이러스의 외피 단백질이 갖는 다른 바이러스의 캡시드화에 관여하는 능력의 장점을 취하여 본원 발명의 CAEV 벡터의 숙주 범위를 넓히는 것이 가능하다. 레트로바이러스-유래 env 유전자의 예로는 이에 한정되는 것은 아니나 다음과 같다: 소수포성 구내염 바이러스의 G-단백질(VSV-G), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMuLV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 및 인간 면역결핍성 바이러스(HIV). 이들 바이러스 외피 단백질은 모두 다른 바이러스의 유전체 및 매트릭스 구성원들과 함께 의사형 비리온을 효과적으로 형성한다. 본원에서 사용된 용어 "의사형(pseudotype)"은 어떤 바이러스의 핵산과 다른 바이러스의 외피 단백질을 포함하는 바이러스 입자를 의미한다. 일반적으로, VSV-G나 GaLV 의사형 벡터는 매우 넓은 숙주 범위를 가지며, 여전히 높은 수준의 감염성을 나타내는 반면, 초원심분리에 의해 높은 농도의 역가로 펠렛화 될 수 있다(Burns et al., 1993).

본 발명의 제2 패키징 벡터의 다른 실례가 도 6a 및 6b에 나타나 있다. 도 6a는 플라스미드 pHGVSV-G(서열 번호: 74)를 나타낸다. pHGVSV-G(서열 번호: 74)는 HCMV MIEP, β-글로빈 인트론 영역, VSV-G 코딩 영역, BGH 폴리아데닐화 신호, Col E1 복제 기점, 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역, 암피실린 내성 유전자 코딩 영역, 및 F1 복제기점을 포함하는 7,623 bp의 플라스미드이다. 도 6b는 플라스미드 pMYKEF1/env(서열 번호: 72)를 나타낸다. 상기 플라스미드는 MCMV MIEP, 인간 EF1-α 인트론 영역, GaLV env 코딩 영역, BGH 폴리아데닐화 신호, Col E1 복제 기점, 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역, 및 암피실린 내성 유전자 코딩 영역을 포함하는 7,579 bp를 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 패키징 벡터는 Rev를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 감염된 세포에서, Rev는 바이러스 전사물에서의 Rev-반응 요소(RRE)와 결합하여 복제 후기에 바이러스 구조 단백질의 특징적인 단일-스플라이싱되거나 비스플라이싱된 전사물들의 전사를 일으킨다. 따라서, Rev는 바이러스 유전자 발현의 일시적인 조절을 매개한다. 포유류 세포의 스플라이싱 기작은 mRNA가 핵내 합성 위치로부터 세포질로 이동하는 것과 짝을 이루기 때문에, Rev는 또한 RRE를 포함하는 바이러스 전사물의 수송에도 영향을 미친다.

본 발명의 제3 패키징 벡터의 실례가 도 5에 제시되어 있다. 도 5는 플라스미드 pHYK/rev(서열 번호: 75)를 나타낸다. pHYK/rev(서열 번호: 75)는 HCMV MIEP, rev 유전자 코딩 영역, BGH 폴리아데닐화 신호, Col E1 복제 기점, 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역, 및 암피실린 내성 유전자 코딩 영역을 포함하는 5,419 bp의 플라스미드이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 패키징 벡터는 Vif를 코딩하는 제4 폴리뉴클레오티드를 포함한다. Vif의 결합은 선택된 패키징 세포주에 따라 비리온의 감염 및 패키징에 필수적일 수 있다.

본 발명의 제4 패키징 벡터의 실례가 도 4에 제시되어 있다. pHYK/vif(서열 번호: 76)는 HCMV MIEP, vif 유전자 코딩 영역, BGH 폴리아데닐화 신호, Col E1 복제 기점, 네오마이신 내성 유전자 코딩 영역, 및 암피실린 내성 유전자 코딩 영역을 포함하는 5,729 bp의 플라스미드이다.

레트로바이러스 벡터 DNA가 세포 내로 형질감염될 때, 이는 염색체 DNA로 통합되거나 통합되지 않을 수도 있고, 이후 전사됨으로써 ψ 서열을 포함하는 전장 레트로바이러스 벡터 RNA를 생산한다. 이러한 조건 하에, 오직 벡터 RNA만 바이러스 캡시드 구조물로 패키징된다. 이러한 완성된, 그러나 복제-결함의, 바이러스 입자들은 상대적으로 높은 효율성을 가지고 레트로바이러스 벡터를 표적세포로 전달하는데 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "복제-결함"은 감염성 비리온이 생산되지 않도록, 완전하고 효과적으로 복제할 수 없는 바이러스를 의미한다(예: 복제-결함 렌티바이러스 프로제니(progeny)). 용어 "복제-적격"은 바이러스 복제에 의해 감염성 비리온이 생산될 수 있도록 하는 복제 능력이 있는, 야생형 바이러스 또는 변이 바이러스를 의미한다(예: 복제-적격 렌티바이러스 프로제니).

패키징은 또한 비-유도성(non-inducible)일 뿐 아니라 유도성(inducible)일 수 있다. 유도 패키징 세포 및 패키징 세포주에서, CAEV 입자들은 최소 하나 이상의 유도물질(inducer)에 반응하여 생산된다. 유도 세포주를 사용한 바람직한 실시양태에서, 유도물질은 Tat이다. 비-유도 패키징 세포주 및 패키징 세포에서는, 렌티바이러스 입자 생산을 일으키기 위해 유도성 물질을 필요로 하지 않는다.

CAEV 벡터 서열

본 발명의 기능적으로 동등한 서열들은 또한 각각의 고유 서열(native sequence)과 실질적으로 동일한 기능을 유지하는 CAEV 유전체의 다양한 절편들이 포함된다. 이러한 절편들은 특정 관심 유전자의 요소들의 최소 약 10, 15개의 연속적인 뉴클레오티드, 최소 약 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 최소 약 24, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 340, 360, 380, 또는 그 이상 전체길이의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 절편들은 고유의 바이러스 유전체를 절단하는 제한 효소의 사용에 의해; 바이러스 유전체의 고유의 뉴클레오티드 서열로부터 뉴클레오티드서열을 합성함으로써; 또는 PCR 기술의 사용을 통하여 얻어질 수 있다(특히, (Mullis 및 Faloona, 1987) 및 (Erlich, 1989) 참조). 또한, 위치-유도 돌연변이(site-directed mutagenesis)의 결과에서처럼, 다양한 벡터 구성원들의 변이체들이 본 발명의 방법에 포함된다. 좀 더 자세히 설명하면, 방법들은 기능적 동등성을 결정하는 당분야에 통상적인 것이다.

"변이체"로는 실질적으로 유사한 서열들이 포함된다. 따라서, 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 경우, 변이체로는 바이러스 벡터 시스템의 다양한 구성원들과 기능적으로 동등한 서열들이 포함된다. 변이 뉴클레오티드 서열에는 또한 예를 들면, 고유 서열의 기능을 여전히 유지하는 위치 유도 돌연변이에 의해 발생된 합성적으로 유도된 뉴클레오티드 서열들이 포함된다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체 또는 아미노산 서열 변이체들은 그 각각의 고유 뉴클레오티드 서열에 대해 최소 70%, 일반적으로 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 상동성을 가질 것이다.

본 발명의 변이체로는 본원에 개시된 벡터(서열 번호:67-79)들의 서열과 최소 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 서열들을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진, 폴리뉴클레오티드(예: 벡터)가 포함된다.

통상의 기술자는 개시된 핵산 구조물의 많은 보존적 변이(conservative variation)들이 기능적으로 동일한 구조물을 생산한다는 것을 인식할 것이다. 특정 핵산 서열의 보존적 변이는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 의미하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않을 경우 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 많은 기능적으로 동일한 핵산들은 임의이 주어진 폴리펩타이드를 코딩한다. 예를 들면, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, "침묵 치환(silent substitutions)"(즉, 코딩된 폴리펩타이드의 변이를 야기하지 않는 핵산 서열의 치환)은 아미노산을 코딩하는 모든 핵산 서열의 특징을 내재한다. 유사하게, 패키징 또는 패키징 가능한 구조물의 아미노산 서열의 하나 또는 소수의 아미노산에서 "보존적 아미노산 치환"은 매우 유사한 특징을 갖는 다른 아미노산으로 치환되며, 또한 개시된 구조물과 매우 유사하여 용이하게 확인된다. 예를 들면, 코돈 CGU, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 코딩한다. 따라서, 아르기닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 코딩된 폴리펩타이드를 변화시키지 않고 제시된 임의의 대응 코돈으로 대체될 수 있다. 이러한 핵산 변이가 "보존적으로 변형된 변이"의 한 종류인, "침묵 변이"이다. 폴리펩타이드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 모든 가능한 침묵 변이를 제시한다. 통상의 기술자는 핵산에서의 각 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG는 제외)이 기본 기술에 의해 기능적으로 동일한 분자를 생산하도록 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각 "침묵 변이"는 임의의 제시된 서열에 내재되어 있다. 또한, 통상의 기술자는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 일부 아미노산(일반적으로 5% 미만, 더 일반적으로 1% 미만)을 대체하거나, 첨가하거나 또는 삭제하는 개개의 치환, 삭제 또는 첨가가 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 "보존적 변형 변이(conservertively modified variations)"인 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환표가 이미 당 분야에 공지되어 있다. 다음의 각 6 군은 서로 보존적 치환인 아미노산들을 포함한다:

1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W).

또한, 문헌 (Creighton(1984) Proteins W. H. Freeman and Company)을 참조하라. 끝으로, 비-기능적 서열과 같이, 핵산 분자의 활성을 변화시키지 않는 서열의 첨가는 기본 핵산의 보존적 변형이다. 각 개시된 서열의 이러한 보존적 치환 변이는 본 발명의 특징이다.

본 발명의 벡터 시스템에서 사용되는 다양한 전장 또는 성숙(mature) 폴리펩타이드에 대한 아미노산 서열과 관련하여, 변이체로는 고유의 폴리펩타이드에서 N-말단 및/또는 C-말단에서의 하나 이상의 아미노산의 삭제(절단이라고도 함) 또는 첨가; 고유의 폴리 펩타이드에서 하나 이상의 위치에서의 하나 이상의 아미노산의 삭제 또는 첨가; 또는 고유의 폴리펩타이드에서 하나 이상의 위치에서의 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해, 고유의 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드들이 포함된다. 이러한 변이체들은, 예를 들면, 유전자 다형성(polymorphism) 또는 인간의 조작으로부터 야기될 수 있다. 이러한 조작 방법은 일반적으로 당분야에 공지되어 있다.

통상의 기술자는 주어진 핵산 구조물 내에서 치환을 일으키는 여러 방법들을 인식할 것이다. 이러한 공지된 방법들에는 위치-유도 돌연변이, 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR 증폭, 핵산을 포함하는 세포의 변이 시약 또는 방사선으로의 노출, (예를 들어, 대형 핵산을 만드는 연결(ligation) 및/또는 클로닝에 관련된) 목적하는 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성 및 기타 공지된 기술들이 포함된다(Gillam 및 Smith, 1979), (Roberts, Cheetham, 및 Rees, 1987), 및 Sambrook, Innis, Ausbel, Berger, Needham VanDevanter 및 Mullis(모두 상기 문헌) 참조).

고유의 핵산 또는 고유의 폴리펩타이드의 변이체는 고유의 서열 또는 고유의 폴리펩타이드와 실질적인 상동성을 갖는다. 변이체는 1 내지 10개의 아미노산 잔기와 같이 적은, 6-10개와 같은, 5개와 같이 적은, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 잔기와 같이 적은 수에 의해 달라질 수 있다. 핵산 서열의 변이체는 1 내지 30개의 핵산과 같이 적은, 6 내지 20개와 같은, 5개와 같이 적은, 4, 3, 2 또는 1개의 핵산 잔기와 같이 적은 수에 의해 달라질 수 있다.

"서열 상동성"은 변이체의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 특정의 연속적인 절편을 인용 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에 대해 정렬하고 비교할 때, 변이체 서열과 인용 서열내에 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 확인되는 것을 의미한다. 서열들간의 서열 정렬(sequence alignment) 및 상동성 결정 방법은 당분야에 공지되어 있다. 두 뉴클레오티드 서열들의 최적의 정렬과 관련하여, 변이 뉴클레오티드 서열의 연속적인 절편은 인용 뉴클레오티드 서열에 대해 추가의 뉴클레오티드 또는 삭제된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 마찬가지로, 두 아미노산 서열의 최적의 정렬을 위해서, 변이 아미노산 서열의 연속적인 절편은 인용 아미노산 서열에 대해 추가의 아미노산 잔기 또는 삭제된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 인용 뉴클레오티드 서열 또는 인용 아미노산 서열과의 비교를 위해 사용되는 연속적인 절편은 최소 20개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 포함할 것이며, 30, 40, 50, 100, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 변이체의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에서 공백을 포함하는 것과 관련하여, 증가된 서열 상동성에 대한 보정은 공백 벌점을 부과함으로써 이루어질 수 있다.

두 서열들 간의 상동성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열의 상동성 백분율은 12의 공백 개시 벌점 및 2의 공백 연장 벌점을 갖는 아핀 6 공백 검색(affine 6 gap search)인 블로섬 매트릭스 62(BLOSUM matrix 62)를 사용하는 스미스-워터만 상동성 검색 알고리즘(Smith-Waterman homology search algorithm)을 사용하여 결정될 수 있다. 한편, 뉴클레오티드 서열의 상동성 백분율은 25의 공백 개시 벌점 및 5의 공백 연장 벌점을 사용하는 스미스-워터만 상동성 검색 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 서열 상동성 결정법은, 예를 들면, 타임로직 버전 G(TimeLogic Version G)로부터의 디사이퍼 하드웨어 가속장치(DeCypher Hardware Accelerator)을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 스미스-워터만 상동성 검색 알고리즘은 스미스 및 워터만에 의해 교시되고 있으며, 본원에서 인용되었다. 한편, 디폴트 파라미터(default parameters)를 사용하는 정렬 프로그램 GCG 갭(GCG Gap, Wisconsin Genetic Computing Group, Suite Version 10.1)이 사용될 수 있다. GCG 갭 프로그램은 니들만 및 운츠 알고리즘(Needleman and Wunch algorithm)을 적용하며, 3의 공백 개시 벌점 및 1의 공백 연장 벌점을 가지고 뉴클레오티드 서열 정렬을 위해 사용될 수 있다. 이외 바람직하나 이에 한정되는 것은 아닌 두 서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 예는 카를린 및 알트술(Karlin and Altschul, 1993)에 의해 변형된 카를린 및 알트술의 알고리즘(Karlin and Altschul, 1990)이 있다. 이러한 알고리즘은 알트술 등(Altschul et al., 1990)의 N블라스트(NBLAST) 및 X블라스트(XBLAST) 프로그램에 반영되었다. 블라스트(BLAST) 뉴클레오티드 검색법은 N블라스트 프로그램, 스코어(score)=100, 워드길이(wordlength)=12의 조건으로 수행되어 충분한 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열들을 얻을 수 있다. 블라스트 단백질 검색법은 X블라스트 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3의 조건으로 수행되어 충분한 서열 상동성을 갖는 아미노산들을 얻을 수 있다. 비교의 목적으로 공백이 있는 정렬(gapped alignments)을 얻기 위해서는, 알트술 등(Altschul et al., 1997)에 제시된 바에 따라 공백 블라스트(Gapped BLAST)가 이용될 수 있다. 한편, 분자들간의 원연 관계(distant relationships)를 검색하는 반복 검색(iterated search)을 수행하기 위해 PSI-블라스트(PSI-Blast)가 사용될 수 있다(상기 알트술 등(Altschul et al., 1997) 참조). 블라스트, 공백 플라스트 및 PSI-블라스트 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램(예: X블라스트 및 N블라스트)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조). 서열 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 비한정적인 예로는 마이어스 및 밀러(Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17)의 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 팩키지(GCG sequence alignment software package)의 일부인 얼라인 프로그램(ALIGN program, version 2.0)에 반영되어 있다. 아미노산 서열 비교를 위해 얼라인 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 분자량 잔기 표(PAM120 weight residue table), 12의 공백 길이 벌점, 및 4의 공백 벌점에 사용될 수 있다. 아미노산 서열의 상동성 백분율은 또한 벡터NTI(VectorNTI, Informax, USA)를 사용하여 결정될 수 있다.

통상의 기술자는 제공된 서열 및 일반적으로 CAEV에 관련하여 당분야에 공지된 것을 근거로 본 발명의 목적하는 핵산을 선별할 수 있다. 렌티바이러스의 생명주기, 유전체 구조, 발생 조절 및 관련 분자 생물학은 지난 10년간의 집중적인 연구의 초점이 되어왔다. 많은 레티바이러스 유전체에서 여러 변이들의 특정 효과가 공지되어 있다. 또한, 일부 CAEV 균주들의 핵산 서열 다양성이 공지되어 있다. 아울러, 통상의 단백질 및 핵산의 특성과 관련된 통상의 지식으로 인해 통상의 기술자는 본원의 서열 목록에 개시된 핵산 및 폴리펩타이드와 유사하거나 동등한 활성을 갖는 적절한 서열을 선택할 수 있다.

끝으로, 대부분의 핵산에 대한 변형은 목적하는 특성에 대한 적합한 분석에서의 일련의 스크리닝 기술에 의해 확인된다. 예를 들면, 코딩된 폴리펩타이드의 면역학적 특성에서의 변형은 적절한 면역학적 분석에 의해 검색될 수 있다. 상보적인 핵산에 대한 핵산 혼성화(hybridization), 코딩된 단백질의 산화환원 반응 또는 열안정성, 소수성, 단백질분해에 대한 감수성, 또는 응집 경향 등과 같은 다른 성질에 대한 변형도 기본 기술들에 따라 모두 분석된다.

관심 폴리뉴클레오티드

통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 삽입된 관심 폴리펩타이드의 뉴클레오티드 서열은 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열은 리포터(reporter) 유전자 또는 선별 마커(selectable marker) 유전자 서열일 수 있다. 본원에서 사용된 리포터 유전자 서열은 발현시 그 존재 또는 활성이 감지될 수 있는 단백질을 생산하게 하는 임의의 유전자 서열이다. 적합한 리포터 유전자의 대표적인 예로는 갈락토카이네이즈(galactokinase), β-갈락토시데이즈(β-galactosidase), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈(chloramphenicol acetyltransferase), β-락타메이즈(β-lactamase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 강화 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein) 등이 있다. 한편, 리포터 유전자는 그 발현이 세포 생리에 영향을 주는 유전자 산물을 생산해내는 임의의 유전자 서열일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 이미 하나 이상의 프로모터, 개시 서열, 또는 처리 서열을 갖는 하나 이상의 유전자 서열들을 포함할 수 있다.

선별 마커 유전자 서열은 그 존재로 인해 이를 포함하는 세포를 선택적으로 증식시키는 단백질을 발현할 수 있는 임의의 유전자 서열이다. 선별 마커 유전자의 예로는 항생제(예: 퓨로마이신, 하이그로마이신, 네오마이신, 테오신 등)에 대한 숙주 내성을 부여하거나, 아미노산 유사체에 대한 숙주 내성을 부여하거나, 기타 가혹(impermissible) 배양 조건 하에 추가의 탄소원 상에서 박테리아의 성장을 가능하게 할 수 있는 유전자 서열들이 포함된다.

리포터 또는 선별 마커 유전자 서열은 일반 세포에서 벡터의 인식 또는 선별을 가능하게 하기에 충분하다. 본 발명의 일 실시양태에서, 리포터 유전자 서열은 일반적으로 포유류 세포에 없으며, 따라서 그 존재로 이러한 세포들에서의 벡터의 존재를 명확하게 입증할 수 있는 효소 또는 기타 단백질을 코딩할 수 있다.

본 발명의 전이 벡터는 추가적으로 이종의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 바이러스 입자로 결합하도록 하여, 이로써 내부에 이종 핵산을 포함하는 감염된 숙주세포의 수를 증대시키기 위한 수단을 제공할 수 있다. 이종의 폴리뉴클레오티드의 결합은 바이러스 입자내 이종 핵산의 복제, 및 이후의 이종 단백질의 생산을 촉진시킨다. 본원에서 이종의 단백질은 단백질의 전부 또는 부분이 숙주 세포에 의해 발현되지 않는 단백질 또는 그의 절편으로 정의된다. 핵산 또는 유전자 서열은 유전자를 세포내로 전달하기 위해 사용된 바이러스 벡터의 야생형 내에 본래부터 존재하는 것이 아니라면, 이종이라고 일컫는다. 본원에서 사용된 용어 이종의 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 분자(바람직하게는 DNA)를 의미한다. 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이종의 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 적절한 생물학적 활성 단백질 또는 폴리펩타이드, 면역성 또는 항원성 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 치료 활성 단백질 또는 폴리펩타이드와 같은 목적하는 산물의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 숙주 세포내 내인성 단백질의 결핍 또는 비존재(nonexistent) 발현을 보충할 수 있다. 이러한 유전자 서열들은 DNA, cDNA, 합성 DNA, RNA 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 출처로부터 유래될 수 있다. 이러한 유전자 서열들은 또한 자연적으로 발생하는 인트론을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 유전체 DNA를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 유전체 DNA는 프로모터 서열 또는 폴리아데닐화 서열과 관련하여 수득될 수 있다. 본 발명의 유전자 서열은 바람직하게 cDNA이다. 유전체 또는 cDNA는 여러 방법에 의해 얻어질 수 있다. 유전체 DNA는 당분야에 공지된 방법에 의해 적절한 세포로부터 추출되고 분리될 수 있다. 한편, mRNA는 세포로부터 분리되어 역전사 또는 다른 방법을 통해 cDNA를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 한편, 폴리뉴클레오티드 서열은 안티센스(antisense) RNA 서열과 같이 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 이러한 안티센스 서열은 개체내에 투여되어 개체 세포 내 상보적인 폴리뉴클레오티드의 발현을 저해할 수 있다.

이종 유전자의 발현은 항체반응을 달성하는 면역성 또는 항원성 단백질 또는 폴리펩타이드를 제공할 수 있다. 이렇게 발생된 항체들은 동물의 혈액, 혈청 또는 복수(ascites)와 같은 체액으로부터 회수될 수 있다.

이종의 유전자는 또한 전사될 수 있는 임의의 관심 핵산일 수 있다. 일반적으로 외래 유전자는 폴리펩타이드를 코딩한다. 바람직하게 폴리펩타이드는 특정 치료적 장점을 가진다. 폴리펩타이드는 숙주 세포 내 내인성 단백질의 결핍 또는 비존재 발현을 보충할 수 있다. 폴리펩타이드는 숙주세포에 키메라 신호전달 수용체(chimeric signaling receptor)(미국 특허 제5,359,046호 참조)와 같은 새로운 성질들을 부여할 수 있다. 통상의 기술자는 본원에서 교시되고 당분야에 공지된 외래 유전자 시행 기술들의 적합성을 결정할 수 있다. 예를 들면, 상기 기술자는 외래 유전자가 캡시드화에 적절한 크기를 갖는지와 외래 유전자 산물이 적절히 발현되는지를 인식할 것이다.

본 발명에서 사용될 수 있는 특정의 이종 단백질은 본 발명에 필수적인 것은 아니다.

본 발명에서 사용될 수 있는 이러한 이종 단백질의 구체적인 예로는 디스트로핀(dystrophin)(Hoffman, Brown, and Kunkel, 1987), 응고 인자 VIII (Wion et al., 1985), 낭성섬유증 막전도 조절 단백질(cystic fbrosis transmembrane regulator protein; CFTR)(Anderson et al., 1991; Crawford, 1991), 오르니틴 트랜스카바밀레이즈(Ornithine Transcarbamylase; OTC)(Murakami et al., 1988), 및 α1-안티트립신(α1-antitrypsin)(Fagerhol and Cox, 1981) 등이 있다.

여러 이종 단백질을 코딩하는 유전자들이 당분야에 공지되어 있으며, 유전체 또는 cDNA 라이브러리(libraries)로부터 클로닝될 수 있다[Sambrook et al, supra]. 이러한 유전자들의 예로는 디스트로핀 유전자(Lee et al., 1991), 응고 인자 VIII 유전자(Toole et al., 1984), CFTR 유전자(Rommens et al., 1989; Riordan, 1989), OTC 유전자(Horwich et al., 1984), 및 α1-안티트립신 유전자(Lemarchand et al., 1992) 등이 있다.

또한, 동맥경화증과 같은 혈관 증식성 질환의 치료를 위한 Rb(Chang et al., 1995), 및 암(Wills et al., 1994; Clayman, 1995) 및 HIV 질환(Bridges and Sarver, 1995)의 치료를 위한 p53과 같은 이종 단백질을 코딩하는 유전자들이 본 발명에 사용될 수 있다.

벡터는 항상 기능적인 이종의 유전자 산물을 코딩할 필요가 없으며, 즉, 진핵성 효소의 저해 물질로서 작용하는 부분 유전자 산물을 또한 코딩할 수 있다(Warne, Viciana, and Downward, 1993; Wang, 1991).

본 발명의 방법에 의한 분자 도입에 의해 세포내 유전자 조절 분자의 발현을 조정하는 것이 바람직하다. 용어 "조정하다(modulate)"는 유전자가 과발현되는 경우 그 발현을 억제하거나, 저발현되는 경우 그 발현을 증대시키는 것을 의미한다. 세포 증식성 질환이 유전자의 발현에 관련되는 경우, 번역 수준에서의 유전자 발현을 저해하는 핵산 서열이 사용될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산 또는 삼중 항원(triplex agent)으로 mRNA를 차폐시키거나 리보자임으로 이를 절단함으로써 특정 mRNA의 전사 또는 번역을 차단하기 위해, 안티센스 핵산, 리보자임 또는 삼중 항원 등이 이용될 수 있다.

안티센스 핵산은 특정 mRNA 분자의 최소 일부분에 대해 상보적인 DNA 또는 RNA 분자들이다. 세포 내에서, 안티센스 핵산은 대응 mRNA와 혼성화 결합하여 이중-가닥 분자를 형성한다. 세포는 이중-가닥 mRNA를 번역하지 못하므로, 안티센스 핵산은 mRNA의 번역을 저해한다. 약 15개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 갖는 안티센스 올리고머는 용이하게 합성되면서도 표적세포내로 도입될 때 큰 분자들에 비해 문제를 덜 발생시키므로 바람직하다. 유전자의 생체외 번역을 저해하는 안티센스 방법의 용도는 당 분야에 공지되어 있다((Marcus-Sekura, 1988).

안티센스 핵산은 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease)에서 축적되는 아밀로이드 전구체 단백질과 같이, 변이 단백질 또는 과도한 활성의 유전자 산물의 발현을 차단하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 또한 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 유전성 파킨슨 질환 및 기타 질환들의 치료에 유용하다. 안티센스 핵산은 또한 독성과 관련된 단백질의 발현을 저해하는 데에도 유용하다.

올리고뉴클레오티드는 올리고머가 이중-나선(double-helical) DNA 주위에 결합됨으로 인한 삼중화 방법(triplex strategy)으로 공지된 기작을 통해, 전사를 지연시키기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 삼중 화합물들은 선택된 유전자의 특정 위치를 인식하도록 고안될 수 있다(Maher, Wold, and Dervan, 1991; Helene, 1991).

리보자임은 DNA 제한 엔도뉴클리에이즈(endonuclease)와 유사한 방법으로 다른 단일-가닥 RNA를 특이적으로 절단할 수 있는 능력은 갖는 RNA 분자이다. 이러한 RNA를 코딩하는 핵산 서열들의 변형을 통해 RNA 분자에서 특정 핵산 서열을 인식하고 절단하는 분자들을 가공하는 것이 가능하다(Cech, 1988). 이러한 접근의 주된 장점은 특정 서열을 갖는 mRNA만을 불활성화시킨다는 것이다.

생물학적 반응 변형 물질(biological response modifier)을 코딩하는 핵산을 전이 시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 범주에는, 예를 들면, 인터루킨(interleukin) 1 내지 12의 "인터루킨"으로 분류되는 여러 사이토카인을 코딩하는 핵산 등의 면역강화제가 포함된다. 상기 범주에는 또한, 동일 기작에 따라 필수적으로 작용하지는 않으나, 인터페론(interferons), 특히 감마 인터페론(γ-IFN), 종양괴사인자(TNF) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 등이 포함된다. 선천적 효소 결핍 또는 면역 결핍을 치료하기 위해 이러한 핵산을 골수 세포 또는 대식세포로 전달하는 것이 바람직하다. 성장인자, 독성 펩타이드, 리간드, 수용체 또는 기타 생리학적 중요 단백질들을 코딩하는 핵산들이 또한 특정 비-분열 세포들에 도입될 수 있다.

따라서, 본 발명의 재조합 CAEV 벡터 시스템은 항-HIV 분자로 HIV-감염된 세포(예: T-세포 또는 대식세포)를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 예를 들면, 낭성 섬유증의 치료를 위해 낭성섬유증 전이막 전도 조절 물질(CFTR)에 대한 유전자를 갖는 본 발명의 재조합 렌티바이러스로 호흡기 상피세포를 감염시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 재조합 CAEV 벡터 시스템은 여러 인간의 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. CAEV 벡터 시스템이 적용 가능한 인간 질환의 대표적인 예로는, 이에 한정되는 것은 아니나, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis disease), 헌팅톤 질환, 베타-용혈성빈혈 (beta-thalassemia), 색소성 망막염(retinitis pigmentosa), 점액성다당 질환(mucopolysaccharide disease), 백질이양성 질환(leukodystrophy diseases), 반성유전성 SCID(X-linked SCID), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 티로신혈증(tyrosinemia), A 및 B형 혈우병(hemophilia A and B), 윌슨 질환(Wilsons diseases), LDL 수용체 결핍(LDL receptor deficiency), 인간 면역 결핍(Human Immunodeficiency), 및 듀센형 근이영양증(Duchennes dystrophy) 등이 포함된다.

CAEV 벡터 입자

본 발명의 방법에서, 감염성 및 복제-결핍 CAEV 벡터 입자들은 당분야에 공지된 기술과 접목된 본원에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 방법에는 본 발명의 벡터 발현 시스템으로 렌티바이러스-허용 세포를 형질감염시키는 단계; 형질감염된 세포에서 CAEV-유래 입자들을 생산하는 단계; 및 상기 세포로부터 바이러스 입자를 회수하는 단계들을 포함한다.

용어 "형질감염(transfection)"은 외래 DNA를 진핵 세포로 도입하는 것을 의미한다. 형질감염은 이에 한정되지는 않으나 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "형질도입(transduction)"은 형질감염에 의해서라기 보다는 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하는 유전자 전달을 의미한다. 어떤 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 형질도입된다. 따라서, "형질도입된 유전자"는 렌티바이러스 또는 벡터 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포로 도입된 유전자이다. 특정 실시양태에서, CAEV 바이러스 벡터 입자들은 "표적 세포" 또는 숙주 세포로 유전자를 형질도입한다.

세포내 감염성 바이러스 입자의 생산을 촉진하는 단계는 또한 기본 세포 배양 성장 기법과 같이 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다.

감염성 바이러스 입자를 회수하는 단계는 통상의 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 감염성 입자들은 공지된 바와 같이, 세포 배양액의 상등액을 회수하여 회수될 수 있다. 선택적으로, 회수된 바이러스 입자들은 필요에 따라 정제될 수 있다. 적절한 정제 기법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

통상의 기술자의 필요에 따라, CAEV 모액(stock solution)을 본 발명의 벡터 및 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 바이러스 모액의 제조방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 [(Soneoka et al., 1995) 및 (Landau and Littman, 1992)]에 기재되어 있다. 본 발명의 모액을 생산하는 방법에서, 렌티바이러스-허용 세포들은 본 발명의 벡터 시스템으로 형질감염된다. 상기 세포들은 적절한 세포 배양 조건 하에 배양되고, 상술된 세포 배양액으로부터 CAEV 입자들을 회수한다. 적절한 허용 세포주로는 이에 한정되는 것은 아니나, 인간 세포주 293, 293T, 및 HeLa 원숭이 세포주 Vero, 및 염소 세포주 GSM 및 Ch1Es 등이 포함된다. 본 발명의 벡터는 또한 안정(stable) 패키징 세포(즉, 그 자체로서는 감염성 바이러스 입자를 만들어낼 수 없으면서 CAEV 구조 단백질들을 안정되게 발현하는 세포) 및 바이러스 생산 세포(virus producing cells; VPC)를 제조하는데 유용하다. 레트로바이러스 단백질을 발현하는 패키징 세포를 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 미국 특허 제 4,650,764호(Temin et al.) 등에 이러한 방법이 실시되어 있으며, 이는 그대로 본원에 접목되어 있다. 본 발명의 범위 내에서, 패키징 세포는 본 발명에 제시된 최소 하나의 CAEV 패키징 벡터로부터의 CAEV 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스-허용 숙주 세포를 포함할 것이며, 상기 핵산 서열은 패키징-신호 결함이므로 세포가 복제-적격 감염성 바이러스를 생산할 수는 없으나, 최소 하나 이상의 CAEV 구조 단백질을 생산할 수 있도록 한다.

패키징 세포는 CAEV-허용 숙주 세포(예: 인간 배아 신장 293 또는 293T 세포)를 상기 제시된 바와 같이 공지된 방법에 따라 적절한 CAEV 핵산 서열로 형질감염시켜 만들 수 있다. 따라서, 그 결과 얻어진 패키징 세포는 최소 하나의 CAEV 구조 단백질을 발현하고 생산할 수 있다. 그러나, 패키징 세포는 여전히 재조합 CAEV 바이러스를 생산할 수 없다. 패키징 세포는 그 후 다른 핵산 서열, 즉, 관심 이종 유전자 및 적절한 패키징 신호를 포함하는 전이 벡터로 형질감염될 수 있다. 일단 추가의 서열 또는 서열들로 형질감염되면, 상기 패키징 세포는 이종의 유전자를 포함하는 CAEV 바이러스 스탁(stocks)을 제공하는데 사용될 수 있으며, 이때 바이러스는 그 자체로서 복제-부적격이다. 따라서, 그 결과 얻어진 바이러스 생산 세포(VPC)는 이종의 관심 유전자를 포함하는 감염성 바이러스 입자들을 생산할 수 있다.

유전자 전이 및 치료

단일 유전자에서의 변경으로 인한 여러 인간 유전 질환은 유전자 치료의 주요 후보들이다. 본원에서 사용된 용어 "유전자 치료" 또는 "유전자 전이"는 임상 치료를 목적으로 세포내로 유전자를 삽입하는 것으로 정의된다. 유전자 치료의 많은 적용방법, 특히 줄기세포 유전자 삽입을 통한 방법들이 공지되어 있으며, 광범위하게 검토되고 있다. 생체외 또는 생체내 치료 유전자 전이를 위한 표적 세포로는 이에 한정되는 것은 아니나, 조혈 줄기 세포, 림프구, 혈관내피세포(vascular endothelial cell), 호흡기 상피 세포(respiratory epithelial cell), 케라틴 형성 세포(keratinocyte), 골근 세포(skeletal and muscle cells), 간세포(liver cell), 신경세포(neuron cell), 및 암 세포(cancer cell) 등이 포함된다.

본 발명의 유전자 전이 기술은 또한 펩타이드 처리 공정의 확인 및 다양한 단백질의 기능 도메인의 확인에 사용될 수 있다. 처리 및 세포 운명에서의 세포-특이적 차이를 연구하기 위해, 단백질에 대한 클로닝된 cDNA 또는 유전체 서열을 생체 외 또는 생체 내의 서로 다른 표적 세포로 도입할 수 있다. 강력한 프로모터의 조절 하에 코딩 서열을 위치시킴으로써, 상당량의 목적 단백질을 만들 수 있다. 또한, 단백질 처리, 세포내 저장 또는 생물학적 활성에 관여하는 특정 잔기는 코딩 서열의 구분 잔기들의 변이적 변화에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 유전자 전이 기술은 또한 단백질의 발현을 조절하고 그 세포수준의 현상을 조절하는 능력을 확인하는 수단을 제공하는데 적용될 수 있다. 분화에서의 그 역할과 같은 단백질의 특정 기능은 조직 배양에서 연구될 수 있는 반면, 다른 것들은 관련 특성에서의 변화를 관찰하기 위해 발달과정의 서로 다른 시기에 생체내 시스템으로의 재도입이 필요할 것이다.

유전자 전이는 특정 유전자의 발현을 조절하는 핵산 서열 및 세포 인자들을 연구하기 위한 수단을 제공한다. 이러한 연구의 일례로 리포터 유전자에 조절 요소들을 융합시켜 리포터 유전자의 발현을 분석하는 연구가 있다.

유전자 전이는 또한 질환 상태에 대해 이해하고 치료를 제공하는데 있어서 실질적으로 중요한 용도를 갖는다. 결함 유전자들이 공지되고 클로닝된 여러 유전 질환이 있다. 일부의 경우, 이러한 클로닝된 유전자의 기능은 공지되어 있다. 일반적으로, 상기 질환의 상태는 두 부류로 나뉠 수 있다: 일반적으로 열성으로 유전되는, 일반적으로 효소에서의, 결핍상태, 및 우성으로 유전되는, 최소한 때때로 조절 또는 구조 단백질에 관련된, 불균형 상태. 결핍 상태 질환의 경우, 유전자 전이는 안티센스 돌연변이를 사용하여 상기 질환에 대한 동물 모델을 만들어낼 뿐 아니라, 대체 요법을 위해 발병 조직에 정상 유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, 유전자 전이는 모델 시스템에서 질환 상태를 만들어내기 위해서 사용될 수 있고, 이 모델 시스템은 질환 상태를 역전시키기 위한 연구에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 유전적 질환의 치료를 가능하게 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 질환 상태는 질환을 일으키고 점차 악화시키는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 치료함으로써 치료된다. 변이를 일으키거나 결함을 고치는 핵산 서열의 위치-특이적 통합도 역시 사용할 수 있다.

본 발명의 방법은 신경 세포, 아교 세포(glial cell), 섬유아세포(fibroblast) 또는 간엽세포(mesenchymal cell)의 이식(transplantation), 또는 본 발명의 재조합 렌티바이러스로 감염된 세포의 생체외 이식, 중추 신경계 또는 심실강(ventricular cavities)으로의 생체내 감염, 또는 숙주 뇌 표면의 경막하(subdurally) 감염과 관련된 "그래프팅(grafting)"에 유용할 수 있다. 이러한 그래프팅 방법은 통상의 기술자들에게 공지되어 있으며, 문헌 [Neural Grafting in the Mammalian CNS, Bjorklund & Stenevi, eds. (1985)]에 제시되어 있다.

단백질 산물의 결핍으로 인한 질병의 경우, 유전자 전이는 안티센스 변이를 사용하여 질병에 대한 동물 모델을 만들 뿐 아니라, 대체 요법을 위해 환부 조직으로 정상 유전자를 도입하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 근육, 비장 또는 간 세포의 감염을 위해 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ 코딩 핵산을 CAEV 입자내로 도입시킬 수 있다.

유전자 치료, 특히 줄기 세포 유전자 삽입을 통한 유전자 치료의 많은 적용방법이 공지되어 있고 광범위하게 검토되고 있다. 본원에서 사용된 용어 "줄기 세포"로는, 이에 한정되는 것은 아니나, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간엽(특히 근육의) 줄기세포, 및 간 줄기 세포 등이 포함된다. 줄기세포는 생체내 조직들을 재증식(repopulation)할 수 있다. 조혈 줄기 세포는 발달 초기의 인간 조혈 세포로부터 유래된 전구 세포(progenitor cells)이다.

조혈 줄기 세포를 이용한 유전자 치료는 또한 일반적으로 결함 단백질의 생산 또는 이상(abnormal) 수준의 유전자 발현을 야기하는 림프계(lymphoid) 또는 골수계(myeloid) 세포들에서의 유전자 이상(abnormality)을 치료하는데 유용하다.

이러한 여러 질환에 대해, 결함 유전자의 정상 복사체(copy) 또는 기능적 상동체(homolog)의 도입, 및 소량일지라도 소실 유전자(missing gene)의 생산은 유익한 효과를 갖는다. 동시에, 유전자 산물의 과발현이 해로운 효과를 가져오리라고는 예상되지 않는다. 조혈 줄기 세포로의 유전자 전이가 매우 유용한 질환의 비한정적 예는 다음과 같다. 이러한 질환에는 일반적으로 골수 질환, 적혈구 세포 결함, 대사 질환 등이 포함된다. 조혈 줄기 세포 유전자 치료는 글로빈 유전자 또는 응고 인자 유전자(예: 인자 Ⅸ 및 인자 Ⅹ 유전자)에 결함이 있는 α- 및 β-탈라세미아 빈혈, 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia) 및 A형 및 B형 혈우병(hemophilia A and B)과 같은 혈액 세포들의 유전자 질환 치료에 유익하다. 다른 바람직한 예로는 T 및 B 림프세포에 독성인 특정 부산물을 제거하도록 돕는 아데노신 디아미네이즈(adenosine deaminase; ADA) 효소가 결여되어 환자가 감염에 대해 무방비상태가 되는, 중증 합병성 면역결핍증 장애(severe combined immunodeficiency disease; SCIDS)의 치료가 있다. 이러한 환자들은 과거에 행해졌던 환자의 림프세포 대신, ADA 유전자를 그들의 조혈 줄기 세포로 도입하여 유전자 치료를 받기 위한 이상적인 후보들이다. 다른 질병들로는 호중구(neutrophils)가 결함 사이토크롬 b(cytochrome b)를 발현하는 만성 육아종증(chronic granulomatosis) 및 대식세포에서의 비정상 글루코세레프로시데이즈(glucocerebrosidase) 유전자 생산으로 인한 고세병(Gaucher disease) 등이 있다.

또한, 파킨슨 질환(Parkinsons disease) 등의 신경 퇴행성 질환은 GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) 유전자를 선조체(striatum) 및 흑색질(substantia)로 도입시키는 유전자 치료의 좋은 표적이다(Kordower et al., 2000).

암의 다양한 형태를 치료하는 방법 또한 유전자 치료에 포함된다. CAEV 벡터는 예를 들면, 암 세포를 특이적으로 사멸시키는데 효과적인 독소(toxin) 또는 세포 사멸(apoptosis) 유도 물질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 종양 세포 특이적 사멸은 단지 종양세포만이 자살 유전자(suicide gene)를 발현한다는 조건 하에 암 조혈 세포로 자살 유전자를 도입하여 수행될 수 있다. 자살 유전자 산물은 일반적으로 비독성 약제를 독성 유도체로 전환시켜 세포에 치사 감수성을 부여한다. 예를 들면, 효소 사이토신 디아미네이즈는 비독성 물질 5'-플루오로사이토신을 독성 유도체인 5-플루오로우라실로 전환시킨다(Mullen, Kilstrup, and Blaese, 1992). 종양-특이적 림프 세포는, 예를 들면, 항-종양 활성을 갖는 유전자 산물을 종양 위치에 위치특이적으로 전달하여 이러한 유전자 산물의 전신 전달과 관련된 독성을 피하도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 유전자 치료의 접근법은 또한 화학치료(chemotherapy)의 독성 효과에 대해 내성인 골수 세포들에 적용될 수 있다.

유전자 치료는 또한 HIV 및 HTLV-1 감염과 같은 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 조혈 줄기 세포는 HIV 감염에 대해 내성을 부여하도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 한 접근법은 특별히 안티센스 RNA를 사용하거나 존재하는 바이러스 조절 경로를 파괴하여 바이러스 유전자 발현을 저해한다. 레트로바이러스 RNA에 상보적인 안티센스 RNA는 HIV(Rhodes and James, 1991) 및 HTLV-1(von Ruden and Gilboa, 1989)을 포함하는 여러 레트로바이러스의 복제를 저해하는 것으로 나타났다(To, Booth, and Neiman, 1986).

조혈 줄기 세포에서의 유전자 치료가 사용될 수 있는 다른 영역으로는 자가면역 질환(autoimmune disease)의 완화가 있다. 치료 유전자는 예를 들면, 자가반응성(autoreactive) 세포의 사멸 및 제거를 야기하는 정상 세포사멸 신호를 재구성할 수 있는, B 또는 T 세포 신호 분자를 코딩할 수 있다.

진단, 연구 또는 유전자 치료를 위한 생체 외 세포 형질전환법(예: 형질전환된 세포의 숙주세포로의 재-융합을 통한)이 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 세포는 대상 유기체로부터 분리되고, 관심 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 벡터로 형질감염되며, 대상 유기체(예: 환자)로 다시 재융합된다.

생체외 형질전환에 적합한 다양한 세포형이 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 특히 바람직한 세포는 상술된 줄기 세포(예: Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition Wiley-Liss, New York, 및 여기에 인용된 환자로부터의 세포를 분리하고 배양하는 방법에 관한 논의 참조)이다. 형질전환된 세포는 당분야에 공지된 방법(Kuchler (1977) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R. J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., 및 Atlas (1993) CRC Handbook of Microbiological Media (Parks ed) CRC press, Boca Raton, Fl. 참조)에 의해 배양된다. 포유류 세포 시스템은 종종 세포 단일층으로 형성될 것이나, 포유류 세포 부유물(suspension) 또한 사용될 수 있다. 한편, 세포는 세포은행(예: 혈액은행)에 저장된 것으로부터 유래될 수 있다. 포유류 세포주의 바람직한 예로는 HEC-1-B 세포주, VERO 및 Hela 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포주, W138, BHK, Cos-7 또는 MDCK 세포주(예: Freshney, supra 참조) 등이 포함된다.

T 세포 또는 B 세포는 또한 일부 생체외 유전자 전이 공정에서 사용될 수 있다. T 및 B 세포를 분리해내는 여러 기법이 공지되어 있다. 표면 마커의 발현은 이러한 세포의 분리 및 정제를 용이하게 한다.

요약하면, 본 발명의 바이러스 벡터는 분열 또는 비분열 세포를 안정되게 형질도입시키고 이종의 유전자를 안정되게 발현하는데 사용될 수 있다. 이러한 벡터 시스템을 사용하면, 상기 세포의 생리작용에 영향을 줄 수 있는 단백질 코딩 유전자를 분열 또는 비분열 세포로 도입하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 벡터는 질병 또는 세포 생리 작용의 실험적 변형을 위한 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

키트(Kits)

본 발명의 또 다른 목적은 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 벡터를 포함하는 키트 또는 약제 전달 시스템을 제공하는 것이다. 모든 표적 레트로바이러스 입자의 투여에 요구되는 필수 물질 및 시약이 키트에 포함될 수 있다(예: 패키징 세포 구조물 또는 세포주). 키트의 구성성분은 다양한 제형으로 제공된다. 하나 이상의 CAEV 입자들은 하나 이상의 약제(예: 화학치료제)를 가지고 단일 약학적으로 허용가능한 조성물 또는 분리된 약학적으로 허용가능한 조성물로 제형화될 수 있다.

이러한 키트 또는 약제 전달 시스템의 구성원은 또한 건조 또는 감압 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 시약 또는 구성원이 건조 형태로 제공되었을 경우, 일반적으로 다른 용기 수단에 제공될 수 있는 적절한 용매의 첨가로 인해 재구성된다. 본 발명의 키트는 또한 표적 CAEV 입자에 대한 복용 및/또는 투여 정보와 관련된 지시서를 포함한다. 본 발명의 키트 또는 약제 전달 시스템으로는 또한, 바이얼(vial)이 유지되도록 일반적으로 주사 또는 블로우 몰딩된(blow-molded) 가소성 용기(container)와 같은 시판용 밀집 바이얼 등의 수단이 포함될 것이다. 상기 용기의 수와 형태에 상관 없이, 키트는 또한 최종 구조체 조성물의 대상 체내 주사/투여 또는 위치이동을 돕기 위한 기구를 포함하거나 또는 이로 패키징될 수 있다. 이러한 기구는 어플리케이터(applicator), 흡입기, 시린지(syringe), 피펫(pipette), 포셉(forceps), 측정 수저(measured spoon), 안구-점적기(eye-dropper) 또는 이러한 임의의 의학적으로 승인된 전달 물질일 수 있다.

이하 실시예는 본 발명을 다양한 측면에서 설명하나, 본 발명의 방법을 한정하는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예들은 본 발명의 특정 실시양태 및 측면을 제시하고 있으며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

하기 실시예들은 본 발명의 재조합 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 시스템이 공지된 HIV-1 계 렌티바이러스 시스템에서와 같이 발현에 있어서 효과적이라는 발견을 입증한다. 상기 실시예들은 본 발명의 CAEV-계 벡터 입자 생산 시스템의 유전체 RNA 전사, 캡시드화, 번역, 역전사, 및 통합 수준이, 오랜 기간 매우 효과적인 유전자 전이 시스템으로 인정받고 있는 HIV-1-계 렌티바이러스 벡터 시스템(Naldini et al., 1996)과 비교할만 하다는 것을 보여준다.

본 발명은 최소 세 개의 플라스미드 공-형질감염 방법을 근거로 하면서, gag-pol 및 env 유전자, 및 선택적으로 rev 유전자의 발현을 요구하는, 높은 역가의 CAEV-계 벡터 시스템의 구조에 대한 첫 번째 보고이다.

물질 및 방법

플라스미드 구조

모체 플라스미드(parent plasmids). 본 발명의 CAEV 벡터가 유래된 모체 플라스미드는 마리 수잔 박사(Dr. Marie Suzan, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, France)에 의해 제공된 플라스미드 pWTE-BM 및 플라스미드 pCAEV-LTR이다. pWTE-BM 플라스미드는 env, rev, 및 U3 영역을 포함하는 0.4 kb Hind III 절편을 제외한 전장 유전체 CAEV cDNA 및 1337 염기쌍의 비필수 절편(stuffer fragment)을 포함한다. 플라스미드 pCAEV-LTR는 pWTE-BM에서 제외된 0.4 kb Hind III 절편을 포함한다(Saltarelli et al., 1990; Saltarelli, 1993). 두 벡터 모두 야생형 바이러스를 생산할 수 없다.

CAEV gag-pol 발현 벡터(pMGP/RRE(서열번호: 77) 및 pMGP/REV/RRE). pMGP/RRE (서열번호: 77) 플라스미드는 pWTE-BM 유래 gag-pol 발현 플라스미드이다(도 2a에 제시됨). pMGP/RRE(서열번호: 77) 플라스미드는 강력하고 이종인 MCMV 주 극초기 프로모터(MCMV MIEP), gag-pol 유전자, 및 rev 반응 요소(RRE)를 포함한다. pMGP/RRE(서열번호: 77) 플라스미드는 또한 항생물질 선별 마커로서 네오마이신 내성 유전자를 코딩한다. 상기 플라스미드 구조에서, pWTE-BM 유래 gag-pol 유전자 절편(CAEV 유전체의 512 내지 5046번째 뉴클레오티드)은 몇몇 PCR 및 서브클로닝 단계에 대한 표준방법을 사용하여 pGL2-Basic(Promega, WI, USA) 클로닝 벡터로 서브클로닝 되었다. MCMV MIEP 절편은 플라스미드 pMYK(Kim et al., 2002)로부터 절단되어 gag 유전자의 상류에 삽입되었고, RRE 영역(CAEV 유전체의 7824 내지 8183번째 뉴클레오티드 또는 7849 내지 8150번째 뉴클레오티드)은 pol 유전자의 하류에 삽입되었다. pMGP/REV/RRE는 CAEV rev 유전자를 포함하는 다른 gag-pol 발현 플라스미드이다(도 2b에 제시됨). 또한, CAEV의 주 스플라이싱 제공 위치(CAEV 유전체의 330 내지 346번째 뉴클레오티드)가 MCMV 프로모터의 하류에 삽입되었다.

전이 벡터(pCAH/SINd 시리즈). pCAH/SINd 시리즈에 속하는 플라스미드들(도 3a-3h에 제시됨) (서열번호: 67-71, 73, 78, 및 79)은 본 발명의 전이 벡터 설계를 위한 최적의 패키징 서열을 확인하기 위해 제작되었다. 상기 시리즈내 각 플라스미드는 서로 다른 길이의 5' 비번역 영역 및 gag-코딩 영역의 개시부분을 포함하도록 설계되어 이러한 영역에서의 다양한 길이의 효과를 나란히 비교할 수 있게 하였다. 특히 안전성 문제를 처리하기 위해, 이러한 플라스미드는 3'LTR이 삭제된 U3 영역을 갖는 SIN(self-inactivation) 벡터로서 설계되었다. 트랜스-작용 인자인 tat가 없는 전이벡터로부터 벡터 RNA가 높은 수준으로 발현되도록, 5'LTR의 U3 영역을 HCMV MIEP로 치환하였다. 또한, 폴리아데닐화, RNA 수송, 역전사, 및 통합에 요구되는 모든 공지된 시스-작용 서열 요소가 상기 전이 벡터 시리즈에 포함되었다.

pCAH/SINd 시리즈의 플라스미드들(서열 번호: 67-71, 73, 78, 79)은 다음과 같은 방법으로 제작되었다. pCAH/SINd(PBS-결핍 음성 대조군 벡터)(서열번호: 73)(도 3a)는 단지 5'LTR 내 5' 비번역 서열(R 및 U5 영역)(CAEV 유전체의 1 내지 163번째 뉴클레오티드)만을 포함하도록 설계되었다. pCAH/SINd0(서열번호: 67)(도 3c)는 5' 비번역 영역 전부(CAEV 유전체의 1 내지 511번째 뉴클레오티드)를 포함하도록 설계되었다. pCAH/SINd1(서열번호: 68)(도 3c)는 5' 비번역 영역 전부 및 점변이를 갖는 gag 유전자의 327 bp 절편(CAEV 유전체의 1 내지 839번째 뉴클레오티드)을 포함하도록 설계되었다. pCAH/SINd2(서열번호: 69)(도 3d)는 5' 비번역 영역 전부 및 점변이를 갖는 gag 유전자의 612 bp 절편(CAEV 유전체의 1 내지 1124번째 뉴클레오티드)을 포함하도록 설계되었다. 플라스미드 pCAH/SINd3(서열번호: 70)(도 3e)는 5' 비번역 영역 전부 및 점변이를 갖는 gag 유전자의 908 bp 절편(CAEV 유전체의 1 내지 1420번째 뉴클레오티드)을 포함하도록 설계되었다. 플라스미드 pCAH/SINd4(서열번호: 71)(도 3f)는 5' 비번역 영역 전부 및 점변이를 갖는 gag 유전자의 1,198 bp 절편(CAEV 유전체의 1 내지 1710번째 뉴클레오티드)을 포함하도록 설계되었다. pCAH/SINd1/hlacZ(서열번호: 78)(도 3g)는 HCMV MIEP 및 lacZ 유전자로 이루어진 발현 카세트를 pCAH/SINd1(서열번호: 68) 내로 삽입시켜 제작되었다. 플라스미드 pCAH/SINd60/hlacZ(서열번호: 78)(도 3h)는 점변이를 갖는 gag 유전자의 처음 60 bp 절편을 포함하는 gag 유전자의 길이(CAEV의 1 내지 569번째 뉴클레오티드)에 대한 것을 제외하고는, pCAH/SINd1(서열번호: 68)에서와 동일한 설계를 갖는다.

CAEV vif 발현 벡터(pHYK/vif)(서열번호: 76). 신속하고 효율적인 바이러스 복제를 위해 요구되는 것으로 알려진 vif 유전자(CAEV 유전체의 5006 내지 5695번째 뉴클레오티드)는 진핵세포 발현 벡터 pHYK(Kim et al., 2002)(도 4)에 클로닝되었다.

CAEV rev 발현 벡터(pHYK/rev)(서열번호: 75). RRE와의 상호작용으로 바이러스 유전자 발현을 전사 후 수준에서 조절하는 rev 유전자는 두 개의 엑손(제1 엑손은 CAEV 유전체의 6,012 내지 6,123번째 뉴클레오티드, 그리고 제2 엑손은 CAEV 유전체의 8514 내지 8803번째 뉴클레오티드)으로 이루어진다. Rev/RRE 시스템은 비-스플라이싱된 RNA의 핵 배출을 촉진하며 렌티바이러스 복제에 필수적인 것으로 알려져 있다. rev 유전자의 전장 cDNA는 RT-PCR에 의해 합성되었으며 pHYK 벡터로 서브클로닝되었다(도 5).

바이러스 외피 유전자 발현 벡터. 본원에서 사용된 외피 유전자 발현 벡터 시스템은 플라스미드 pHGVSV-G(서열번호: 74) 및 플라스미드 pMYKEF1/env(서열번호: 72)(도 6a 및 6b)이다. 플라스미드 pHGVSV-G(서열번호: 74)는 소수포성 구내염 바이러스-G(VSV-G) 당단백질을 발현하도록 설계되었으며, 프로모터로서 β-글로빈 인트론을 갖는 HCMV MIEP를 포함한다. pMYKEF-1/env(서열번호: 72)는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV) 외피 단백질을 발현하도록 고안되었으며 프로모터로서 진핵세포 연장 인자-1α를 갖는 MCMV MIEP를 포함한다.

MuLV- 및 HIV-1-계 플라스미드. 대조군 벡터 시스템으로서, pMFG/lac/Zpuro 및 pHR/lacZ 벡터들이 본 발명에 사용되었으며, 이들은 각각 쥐 백혈병 바이러스(MuLV)(Kim et al., 1997) 및 1형 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1)(Naldini et al., 1996)로부터 유래된 lacZ-함유 레트로바이러스 벡터였다. MuLV 및 HIV-1 벡터 시스템의 패키징 플라스미드로는, pEQPAM3(Persons et al., 1998) 및 pCMVΔR8-2가 각각 사용되었다. HIV-1 패키징 플라스미드 pCMVΔR8-2는, HIV-1 vpu 유전자를 코딩하고 env 유전자에서 1.3-kb BglII 절편이 삭제된 것을 제외하고, pCMVΔR9(Naldini et al., 1996)와 동일하다.

벡터 입자 생산

의사형 CAEV-계 렌티바이러스 벡터 입자들은, 형질감염 하루 전에 6-웰 배양 디쉬(dish) 당 5×10⁵ 세포 농도로 분주된 293T 세포들에, 세 개 이상의 플라스미드의 리포좀 매개 일시적 형질전환을 수행하여 생산하였다. 세 개의 플라스미드 공형질감염은 gag-pol 발현 플라스미드, 전이 벡터 플라스미드, 및 env-코딩 플라스미드의 1:1:1 몰비로 수행하였다. 네 개의 플라스미드 공형질감염은 gag-pol 발현 플라스미드, 전이 벡터 플라스미드, env-코딩 플라스미드, 및 rev-발현 플라스미드의 3:3:3:1 몰비로 수행하였다. 다섯 개의 플라스미드 공형질감염은 gag-pol 발현 플라스미드, 전이 벡터 플라스미드, env-코딩 플라스미드, rev-발현 플라스미드 및 vif-발현 플라스미드의 3:3:3:1:1 몰비로 수행하였다. 바이러스 벡터 입자를 포함하는 배양 상등액은 48 시간 후에 회수되고, 0.45 μM 막 여과로 여과한 후(Nalgene, NY, USA), 바로 사용하거나 -70℃ 딥-프리저(deep-freezer)에 보관하였다.

생체 내 형질도입

형질도입은 바이러스 벡터 입자를 8 ㎍/㎖ 폴리브렌(polybrene) 존재하에 293T 세포에 4시간 동안 가한 후 신선한 배지를 첨가하여 수행되었다. 48시간 후, 상기 세포를 1% 폼알데하이드 및 0.2% 글루타알데하이드로 이루어진 용액으로 고정시키고 300 ㎍의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토사이드(X-Gal, Promega, WI, USA), 4 mM 포타슘 페로사이아나이드(potassium ferrocyanide), 4 mM 포타슘 페리사이아나이드(potassium ferricyanide) 및 2 mM MgCl₂를 포함하는 용액으로 37℃에서 12시간 동안 염색한 후, 베타-gal 발현(Beta-Gal expression)을 분석하였다. 역가는 ㎖ 당 LacZ-형성 단위(LacZ-forming units)(LFU/ml)로서 청색 포커스(foci)의 수를 측정하여 결정될 수 있다.

RT-PCR 분석

트리졸 LS 시약(TRIzol LS Reagent, GIBCO BRL, CA, USA)을 사용하는 방법에 의해 배양된 세포 또는 세포 상등액으로부터 총 RNA를 추출하였다. 상기 총 RNA는 RNA 분해효소가 없는 DNA 분해효소 Ⅰ(RNase free-DNase I, 1 unit/mg의 DNA를 37℃에서 20분간 처리, Promega, WI, USA)으로 처리하여 DNA 오염물을 제거하였다. DNA 분해효소 I의 반응은 상기 DNA 분해효소와 함께 제공되는 RQ1 DNA 분해효소 중지 용액(RQ1 DNase stop solution)을 가하여 중지시켰으며, RNA는 알앤이지 미니 키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 사용하는 방법을 통해 정제되었다. 정제된 RNA를 역전사(RT) 반응(37℃에서 90분)을 통해 cDNA로 역전사하였다. 구체적으로, RT 반응은 MuLV 역전사효소, 올리고-dT 프라이머 또는 C-말단 특이적 프라이머, 및 dNTPs 혼합물 존재하에 수행되었다. PCR 증폭은 주형 DNA의 반-정량 분석(semi-quantitative analysis)을 위해 특이적 프라이머를 가지고 수행되었다. 구체적으로, PCR 산물 DNA는 열안정성 Ex Taq 중합효소, 서열 특이적 DNA 프라이머, 및 dNTPs 혼합물 존재하에 cDNA 또는 염색체 DNA로부터 합성되었다.

서던 블럿 분석(Southern Blot Analysis)

유전체 DNA는 디앤이지 조직 키트(DNeasy Tissue Kit, Qiagen, Germany)를 사용하여 의사형 HIV-1 또는 CAEV 벡터 입자 중 하나로 형질도입된 세포, 및 비-형질도입된 대조군 세포(mock-transduced control cells)로부터 제조되었다. HIV-1 벡터로 형질도입된 세포로부터의 유전체 DNA 10 ㎍을 BamH I 및 Kpn I으로 절단하였다. CAEV 벡터 형질도입된 세포로부터의 유전체 DNA 각 10 ㎍을 EcoR I 및 Ssp I으로 절단하였다. 절단된 유전체 DNA들을 0.7% 아가로즈 겔 상의 전기영동에 의해 분리하고 양이온 전하된 나일론막(Roche, Germany)으로 전이시켰다. Dig-표지된 프로브를 lacZ 유전자 특이적인 프라이머(전방향 프라이머: CTGGCGTAATAGCGAAGAGG(서열번호: 65), 역방향 프라이머: AACTCGCCGCACATCTGAAC(서열번호: 66))들을 이용한 PCR에 의해 제조하였으며, 서던 혼성화는 Dig 적용 매뉴얼(Dig application manual, Roche, Germany)에 따라 수행되었다.

세포의 성장 정체(Growth Arrest) 및 성장 정체된 세포의 FACS 분석

293T 세포들을 아피디콜린(aphidicolin, Sigma, USA) 처리(25 ㎍/ml)로 성장정체시켰으며, 그 후 CAEV 바이러스 벡터 입자들로 형질도입시켰다. 양성 대조군 또는 음성 대조군으로서, 세포들을 HIV-1 벡터 또는 MuLV 레트로바이러스 벡터 중 하나로 나란히 형질도입시켰다. 형질도입후 2일에, 세포들의 베타-gal 활성을 알아보기 위해 X-gal로 염색시켰다. 아피디콜린 처리된 세포에서, 아피딘 콜린은 감염 전 또는 후에 존재하였다.

세포의 성장 정체를 FACS 분석에 의해 확인하였다. 아피디콜린 처리된 또는 처리되지 않은 대조군 세포들을 PBS로 세척하고, 70% 에탄올로 -20℃에서 밤새 고정시켰으며, 프로피듐 아이오다이드(100 ㎍/ml)(Sigma, USA) 및 RNAse A(100 ㎍/ml)(Qiagen, Germany)로 실온에서 1 시간 처리하였다. 세포들을 FACS 분석에 의해 분석하였으며, 세포 주기의 G1, S 및 G2/M 단계에서의 총 살아있는 세포들의 백분율을 산출하였다(Becton Dickinson, Sanjose, CA).

실시예 1: CAEV-계 렌티바이러스 벡터 입자의 생산

복제 결함 렌티바이러스 벡터 입자들은 CAEV gag-pol 발현 플라스미드, CAEV env-발현 플라스미드 및 전이 벡터 플라스미드의 최소 3-플라스미드 시스템을 이용한 인간 293T 세포의 일시적 공-형질감염에 의해 생산되었다. 4-플라스미드 시스템에서는, CAEV rev 발현 플라스미드가 추가되고, 5-플라스미드 시스템에서는, CAEV vif 발현 플라스미드가 추가된다. 효율적인 패키징을 위해, 전이 벡터는 gag 단백질의 발현을 방지하기 위해 시작 ATG 코돈 및 하류에 위치한 ATG 코돈에 변이(ATG에서 TAG로)가 도입된, gag-코딩 서열의 처음 부분을 포함하도록 고안되었다. RRE는 패키징 효율을 증대시키기 위해 포함되었으며, 4- 및 5-플라스미드 시스템에서의 rev는 CAEV mRNA 배출을 위해 벡터로부터 발현되었다. 전이 벡터 플라스미드에서의 내부 HCMV-MIEP 프로모터로 작동되는 β-갈락토시데이즈 유전자는 리포터 유전자로서 삽입되었다. 5'LTR의 U3 영역은 강력한 바이러스 프로모터인, HCMV-MIEP로 대체되어 벡터 유전체가 tat 독립적이 되도록 하였다.

전이 벡터 RNA 전사 수준. 전이 벡터로부터의 유전체 RNA의 전사 수준은 패키징 세포로부터의 재조합 바이러스 벡터의 높은 역가 생산에 매개하는 중요한 요소 중 하나이다. 본 발명에서, HCMV 인핸서/프로모터 요소는 전이 벡터 RNA의 안전하고 효율적인 전사를 위한 HCMV/CAEV 하이브리드 LTR 프로모터 시스템을 제작하는데 사용되었다. 하이브리드 LTR 프로모터를 포함하는 pCAH/SINd(서열번호: 67-71, 73, 78, 및 79) 시리즈의 전이 벡터 플라스미드들의 전사 수준을 시험하기 위해, 각 전이벡터 플라스미드를 패키징 플라스미드(pMGP/RRE (서열번호: 77), pHYK/rev (서열번호: 75), pHYK/vif (서열번호: 76), pHGVSV-G (서열번호: 74) 또는 pMYKEF1/env (서열번호: 72))와 함께, 리포좀-매개 형질감염에 의해 인간 T 세포로 도입시켰다. 48시간 배양 후, 형질감염된 세포로부터 총 RNA를 정제하여, 벡터 RNA 전사물을 측정하기 위한 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석을 수행하였다. CAEV 전이 벡터에 대한 PCR 프라이머 세트(RRE primer set)는 RRE 영역 부분을 코딩하는 348-bp PCR 산물을 합성하도록 설계되었다. HIV-1 전이 벡터인 pHRlacZ(Naldini et al., 1996)에 대한 다른 PCR 프라이머 세트(lacZ primer set)는 lacZ 유전자를 코딩하는 645 bp PCR 산물을 합성하도록 설계되었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 CAEV 전이 벡터는 HIV-1-계 렌티바이러스 전이 벡터와 비교할만한 수준의 RNA 전사물을 생산하였다.

벡터 입자의 형성 및 방출. 성숙 및 감염성 바이러스 벡터 입자의 형성 및 방출을 시험하기 위해, pMGP/RRE (서열번호: 77) gag-pol 발현 플라스미드, pHGVSV-G(서열번호: 74) env 발현 플라스미드, pHYK/rev(서열번호: 75) rev 발현 플라스미드, pHYK/vif(서열번호: 76) vif 발현 플라스미드, 및 pCAH/SINd60/hlacZ(서열번호: 78) 전이 벡터 플라스미드를 인간 293T 세포(DuBridge et al., 1987)로 리포좀-매개 공-형질감염시켜 CAEV 벡터 입자를 생산하였다. 형질감염후 48시간에, 감염을 위해 배양 상등액을 형질감염된 세포로부터 회수하여 8 ㎍/ml 폴리브렌 존재하에 신선한 인간 293T 세포에 적용시켰다. 그 결과는 본 발명의 5개의 플라스미드 시스템이 MuLV-계 렌티 바이러스 벡터 시스템(pEQPAM3, pMFG/lacZ/puro, pHGVSV-G (서열번호: 74))(Ory, Neugeboren, and Mulligan, 1996; Persons et al., 1998)의 것과 비교할만한 바이러스 벡터 입자 역가를 생산할 수 있음을 보여주었다(도 8에 제시).

실시예 2: 벡터 입자 생산에 대한 Rev 및 Vif 발현 효과

벡터 입자 생산에 대한 CAEV rev 및 vif 조절 유전자 발현의 효과를 결정하기 위해, (1) rev- 및 vif-코딩 서열을 갖지 않는, 3-플라스미드 시스템(pCAH/SIN, pMGP/RRE(서열번호: 77), pHGVSV-G(서열번호: 74) 또는 pMYKEF1/env(서열번호: 72)), (2) vif-코딩 서열을 갖지 않는, 4-플라스미드 시스템(pCAH/SIN, pMGP/RR (서열번호: 77), pHGVSV-G(서열번호: 74) 또는 pMYKEF1/env(서열번호: 72), pHYK/rev(서열번호: 75)), 및 (3) rev- 및 vif-코딩 서열을 모두 포함하는, 5-플라스미드 시스템(pCAH/SIN, pMGP/RRE(서열번호: 77), pHGVSV-G(서열번호: 74) 또는 pMYKEF1/env(서열번호: 72), pHYK/rev(서열번호: 75), pHYK/vif(서열번호: 76))의 벡터 입자 생산 시스템을 벡터 입자 생산에서의 그 효율성에 대해 나란히 시험하였다. 각 시스템의 플라스미드들을 293T 세포로 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일에, 전이 벡터 RNA 및 비리온 RNA를 형질감염된 세포 및 형질감염된 세포의 배지로부터 각각 추출하여, 전이 벡터 RNA 유전체를 검출하기 위해 lacZ 프라이머 세트와 함께 RT-PCR 주형으로 사용하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 패키징 세포에서의 전이 벡터 RNA의 발현 수준이 rev 또는 vif 유전자 발현에 비의존적이기는 하나(도 9에서의 레인 1, 2 및 3), rev가 없이 캡시드화된 전이 벡터 RNA의 양(도 9의 레인 4)은 rev 존재하에서의 양(도 9의 레인 5)보다 훨씬 낮았다. 그러나, 놀랍게도, vif 존재하에 캡시드화된 RNA를 가지고 RT-PCR로 측정된 벡터 입자의 역가(도 9의 레인 6)는 CAEV vif가 없을때의 양(도 9의 레인 5)보다 낮았다. 이러한 결과는 벡터 입자 생산을 위해 CAEV rev 및 vif가 요구되지는 않으나, rev는 효율적인 벡터 입자 생산을 위해 바람직하다는 것을 의미한다.

vif 발현과 관련된 본 발명의 결과는, vif 유전자가 염소 활막 세포에서 CAEV의 효율적 복제를 위해 필수적이며 바이러스 복제 주기의 말기(예: RNA 캡시드화, 숙주 세포로부터의 바이러스 입자 방출)에 영향을 미친다는, 하르마쉐 등(Harmache et al., 1995; Harmache et al., 1996)에 의해 보고된 결과와 일치하지 않는다. 상기 불일치에 대한 적절한 설명으로는 재조합 CAEV 벡터 입자의 생산에서 염소 세포 대신 인간 293T 세포를 사용했기 때문일 수 있다. 이러한 해석은 vif 및 바이러스-생산 세포가 바이러스 감염성에 대한 vif 작용을 조절할 수 있다는 세로드 등에 의해 제시된 가설(Seroude et al., 2002)을 지지한다.

실시예 3: 최적의 패키징 신호 서열의 확인

CAEV 전이 벡터 RNA의 캡시드화를 위한 최적의 패키징 신호 서열을 확인하기 위해, CAEV gag-코딩 영역의 서로 다른 부분들 및 5'LTR과 gag 시작 코돈 사이의 비번역 영역을 포함하는 시리즈 플라스미드들을 다음과 같은 방법으로 이들의 벡터 입자 생산 효율성에 대해 비교하였다. 인간 293T 세포를 pMGP/RRE(서열번호: 77) gag-pol 발현 플라스미드, pHGVSV-G(서열번호: 74) env 발현 플라스미드, pHYK/rev(서열번호: 75) rev 발현 플라스미드, pHYK/vif(서열번호: 76) vif 발현 플라스미드, 및 pCAH/SINd(서열번호: 67-71, 73, 78, 및 79) 전이 벡터 시리즈 플라스미드로 공-형질감염시켰다. 음성 대조군으로서, CAEV 전이 벡터 pCAM/lacZ(L)를 패키징 플라스미드 없이 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일에, 비리온 RNA를 형질감염된 세포의 배양액으로부터 추출하여 CAEV 전이 벡터 시리즈 RNA 유전체를 검출하기 위한 RRE 프라이머 세트 또는 HIV-1 전이 벡터 RNA 유전체를 검출하기 위한 lacZ 프라이머 세트와 함께 RT-PCR 주형으로 사용하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, gag 영역의 처음 327 bp 뿐 아니라 전장 5'LTR을 포함하는 pCAH/SINd1(서열번호: 68)로 형질감염된 바이러스 생산 293T 세포로부터 회수된 배양액에서 바이러스 RNA를 포함하는 바이러스 입자의 효율적인 방출을 의미하는 강력한 PCR 산물 신호를 확인하였다(도 10의 레인 3). 이러한 신호는 양성 대조군인 HIV-1 벡터를 이용하여 얻어진 것과 비교할만한 것으로, 본 발명의 캡시드화된 CAEV 전이 벡터 RNA의 양이 HIV-1-계 전이 벡터의 것(도 10의 레인 8)과 비교할만하다는 것을 의미한다. gag-코딩 영역의 처음 612 bp 또는 그 이상을 갖는 CAEV 전이 벡터의 패키징 효율은 현저히 감소되었다(레인 4, 5 및 6). 전이 벡터가 gag-코딩 서열 없이 사용되었을 때에는 PCR 산물 신호가 검출되지 않았다(도 10의 레인 1 및 2). 음성 대조군은 전이벡터만으로 형질감염되었으며, 양성대조군인 HIV-1 벡터는 pCMVΔR8-2, pHR/lacZ 및 pHGVSV-G(서열번호: 74)와 함께 형질감염되었다(도 10의 레인 7 및 8).

결론적으로, 전이 벡터가 5'LTR과 gag 개시 코돈 간의 비번역 영역 전부 뿐 아니라 N-말단 gag-코딩 서열의 약 600 bp 미만을 포함할 때, 전이 벡터 RNA는 패키징 세포에서 효율적으로 캡시드화되었다. 이러한 결과는 패키징 서열 내 RNA의 2차 구조의 역할이 RNA 캡시드화에서의 1차 구조보다 더 중요하다는 것을 의미한다.

실시예 4: CAEV 벡터 비리온의 의사형화

재조합 CAEV 벡터 비리온이 VSV-G 당단백질 뿐 아니라 GaLV 당단백질로 의사형화될 수 있는지를 결정하기 위해, GaLV 발현 벡터 및 pMYKEF1/env(서열번호: 72), 또는 VSV-G 발현 벡터 및 pHGVSV-G(서열번호: 74)로 전이 벡터 플라스미드 및 패키징 플라스미드와 함께 인간 293T 세포를 공형질감염시켰다. 형질감염후 42시간에, 형질감염된 세포로부터 방출된 의사형 비리온 입자들을 포함하는 배양 상등액을 회수하고, 0.45 ㎛ 막 여과로 정화하여, 293T 인간 표적 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 감염 하루 후, 유전체 DNA를 유전체 DNA 분리 키트(Genomic DNA Isolation kit, Qiagen, HL, Germany)를 사용하여 정제한 후, PCR 실험을 수행하여 통합된 프로바이러스 cDNA를 검출하였다. 예상했던 바와 같이, CAEV 벡터(도 11의 레인 1)는 MuLV-(도 11의 레인 3) 및 HIV-1-계 벡터(도 11의 레인 4)에 비해 VSV-G 단백질에 의해 효율적으로 의사형화되었다. 또한, HIV-1 렌티바이러스 벡터 시스템과는 다르게, 본 발명의 CAEV 벡터는 GaLV 외피(도 11의 레인 2)로도 성공적으로 의사형화되었다. 이러한 CAEV 벡터의 GaLV 외피를 이용한 의사형화 능력은 임상 수준의 렌티바이러스 벡터 시스템의 개발에 큰 장점을 부여할 수 있다. MuLV(pEQPAM3, pMFG/lacZ/puro 및 pHGVSV-G(서열번호: 74)로 형질감염됨) 및 HIV-1(pCMVΔR8-2, pHR/lacZ 및 pHGVSV-G(서열번호: 74)로 형질감염됨) 벡터 대조군은 레인 3 및 4에 각각 제시되어 있다.

실시예 5: CAEV 패키징 세포주의 생산

pMGP/RRE(서열번호: 77) 및 pHYK/rev(서열번호: 75) 벡터는 진핵세포에서의 선별을 위한 neo ^r 유전자를 코딩한다. gag-pol 및 rev 발현 벡터로 공형질감염 후 효율적인 선별을 위해, neo ^r 유전자를 박테리아 gpt 유전자와 같은 다른 항생제 내성 유전자로 치환시켜 다른 CAEV gag-pol 발현 벡터를 제작할 수 있다. 한편, gag, pol 및 rev 유전자를 코딩하는 패키징 플라스미드 시스템이 사용될 수 있다. CAEV 패키징 단백질을 발현하는 안정(stable) 293T 세포가 만들어질 수 있는지를 결정하기 위해, 선별 배지하에 항생제 내성 콜로니가 선별된다. 안정 293T 세포로부터의 재조합 CAEV 벡터의 생산은 CAEV 벡터 생산을 위한 안정 패키징 세포주 생산의 용이성을 보여준다.

실시예 6: 숙주 염색체내로의 CAEV-계 벡터 cDNA의 통합

형질도입 후 CAEV 벡터 cDNA의 통합을 시험하기 위해, pMGP/REV/RRE gag-pol 발현 플라스미드, pHGVSV-G(서열번호: 74) env 발현 플라스미드, 및 pCAH/SINd1/hlacZ(서열번호: 79) 전이 벡터 플라스미드를 인간 293T 세포로 리포좀-매개 공-형질감염시켜 CAEV 벡터 입자들을 생산하였다. 양성 대조군으로, pCMVΔR8.2 gag-pol 발현 플라스미드, pHGVSV-G(서열번호: 74) env 발현 플라스미드, 및 pHR/lacZ 전이 벡터를 293T 세포로 공형질감염시켜 HIV-1 벡터 입자들을 생산하였다. 음성 대조군으로, 단지 pCAH/SINd1/hlacZ(서열번호: 79) 전이 벡터 플라스미드만을 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간에, 감염을 위해 배양 상등액을 각 형질감염된 세포로부터 회수하여 8 ㎍/ml 폴리브렌 존재하에 신선한 293T 세포에 적용시켰다. 48시간 후, 유전체 DNA를 각 형질도입된 세포로부터 제조한 후, 제한 효소로 절단하여 서던 블럿 분석을 수행하였다. Dig-표지된 lacZ 프로브로 HIV-1-계 전이 벡터에 대한 3.15kb BamH I-Kpn I 절편, 및 CAEV-계 전이 벡터 및 음성 대조군에 대한 1.35kb Hind III-Ssp I 절편을 검출하였다. 양성 대조군에 대해서는, pCAH/SINd1/hlacZ(서열번호: 79) 전이 벡터 플라스미드의 Hind III-Ssp I DNA 절편 0.3 ng 및 3 ng이 사용되었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 CAEV-계 전이 벡터는 HIV-1-계 렌티바이러스 전이 벡터의 것과 비교할만한 수준으로 통합되었다.

실시예 7: 비분열 세포로의 유전자 전이

293T 세포를 DNA 합성 저해물질인 아피디콜린(aphidicolin)으로 처리하여 6-웰 배양 플레이트에 분주한 후, lacZ 마커 유전자를 코딩하는 CAEV 벡터 입자로 형질도입시켰다. 대조군으로서, 세포들을 lacZ 발현 MuLV 레트로바이러스 벡터 및 HIV-1 렌티바이러스 벡터로 나란히 감염시켰다. 감염 후 48시간에, 형질도입 효율성을 시험하기 위해, 형질 도입된 lacZ 유전자의 발현을 X-gal 염색법으로 측정하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, MuLV-유래 벡터는 DNA 합성 저해물질로 처리되지 않은 세포를 효율적으로 감염시켰다. 그러나, 세포가 DNA 합성 저해물질의 처리에 의해 세포주기에서 정체되었을 때, 형질도입 효율은 현저하게 떨어졌다. 반면, CAEV-계 벡터는 분열 세포 뿐 아니라 비분열 인간 세포를 HIV-1-계 벡터의 것과 비교할만한 수준으로 효율적으로 형질도입시킬 수 있었다.

실시예 8: 근육 세포의 생체내 형질도입

본 실시예에서, pCAH/SINd1/hlacZ(서열번호: 79) CAEV 벡터는 생체내에서 근육세포를 형질도입시키기 위해 사용된다. 마우스(Beige strain)의 뒷다리를 4 ㎍/㎖의 폴리브렌 존재하에 상기 CAEV 벡터 100 ㎕로 근육내 주사하였다. 이틀 후 상기 마우스들을 희생시키고, 감염된 조직을 동결 절편법(frozen section) 및 β-갈락코시데이즈 분석을 위해 준비하였다. 예상된 결과대로 pCAH/SINd1lacZ(서열번호: 79) CAEV 벡터는 생체내에서 근육 세포로 효과적으로 형질도입된다.

상기 특정 실시양태 및 실시예를 포함하는 상세한 설명은 본 발명을 설명하기 위한 것이지 한정하기 위한 것은 아니다. 많은 다른 변형 및 수정이 본 발명의 사상 및 범위내에서 이루어질 수 있다. 본원에서 인용된 NCBI 데이터베이스에 기탁된 서열, 특허 및 특허출원은 인용에 의해 그 전체가 상세한 설명에 도입된다.

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SEQUENCE LISTING <110> MACROGEN CO., LTD <120> CAEV-BASED VECTOR SYSTEMS <160> 79 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9189 <212> DNA <213> Caprine arthritis-encephalitis virus <400> 1 gagttctagg agagtccctc ctagtctctc ctctccgagg aggtaccgag acctcaaaat 60 aaaggagtga ttgccttact gccgagtgga gagtgattac tgagcggccg gtgtatcggg 120 agtcgtccct taatctgtgc aataccagag cggctctcgc agctggcgcc caacgtgggg 180 cccgaggaga agaaaagaaa gcggccctga gaactcggct tctgaaaaag aggaagagga 240 caagttgcta tagcaacaag agagaagaag tagagcaaag gtccagtggc tcggaaaaag 300 aggaactgaa acttcgggga cgcctgaagg agtaaggtaa gtgactctgc tgtacgcggg 360 gcgaggcaga ggtttccttc taaattgaaa gagaagtgtt gctgcgagag gtcttggtgg 420 tcgagaatcc tgtacaaaaa aaaggaggga tctcggtcag gaccaggacc cctgggagta 480 atacaacagc aacaccgtaa gaaaatccgc catggtgagt ctagatagag acatggcgag 540 gcaagtctcc ggggggaaaa gagattatcc tgagctcgaa aaatgtatca agcatgcatg 600 caagataaaa gttcgactca gaggggagca cttgacagaa ggaaattgtt tatggtgcct 660 taaaacatta gattacatgt ttgaggacca taaagaggaa 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DNA <213> Caprine arthritis-encephalitis virus <400> 61 cagcatggaa tagtatcaga agagtttgag aggcaactgt cttattatgc taccacttgg 60 acaagcaagg atatcttaga ggtactagcc atgatgcctg gcaatagagc attaaaagag 120 ctaatacaa 129 <210> 62 <211> 129 <212> DNA <213> Caprine arthritis-encephalitis virus <400> 62 caacatggga tagtatcaga ggaatttgag agacaaatgt cttattatgc taccacatgg 60 acaagtaagg atattttaga agtactagca atgatgcccg ggaacagagc attaaaggag 120 ctgatacaa 129 <210> 63 <211> 129 <212> DNA <213> Caprine arthritis-encephalitis virus <400> 63 cagcatggac tagtatcaga agaatttgaa aggcagctag catactatgc cacaacgtgg 60 acaagcaaag acatactaga ggtgttagcc atgatgccag ggaatagagc acaaaaagaa 120 ctaatacaa 129 <210> 64 <211> 129 <212> DNA <213> Caprine arthritis-encephalitis virus <400> 64 cagcatggac ttgtgtccga agattttgag aggcaattgg catattatgc tacaacctgg 60 actagtgaag atatattaga agtattggct atgatgcctg ggaatagagc acagaaagaa 120 ttaatacaa 129 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used to construct dig-labeled probe <400> 65 ctggcgtaat agcgaagagg 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer used to construct dig-labeled probe <400> 66 aactcgccgc acatctgaac 20 <210> 67 <211> 3911 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pCAH/SINd0 <400> 67 atccagcaca gtggcggccg ctagcacaaa aataaaaaaa gaaagggtgg actgtgagac 60 atgggctaaa gaggagcggc cgctcgagtc tagaactagt ggatcagctt tgctgcttgc 120 acttcagagt tctaggagag tccctcctag tctctcctct ccgaggaggt accgagacct 180 caaaataaag gagtgattgc cttactgccg agtggagagt gattactgag cggccggtgt 240 atcgggagtc gtcccttaat ctgtgcaata ccagagcggc tctcgcagcc gacctcgagg 300 gggggcccta ttctatagtg tcacctaaat gctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg 360 ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 420 ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 480 aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 540 gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc 600 agtggcggta 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atccagcaca gtggcggccg ctagcacaaa aataaaaaaa gaaagggtgg actgtgagac 60 atgggctaaa gaggagcggc cgctcgagtc tagaactagt ggatcagctt tgctgcttgc 120 acttcagagt tctaggagag tccctcctag tctctcctct ccgaggaggt accgagacct 180 caaaataaag gagtgattgc cttactgccg agtggagagt gattactgag cggccggtgt 240 atcgggagtc gtcccttaat ctgtgcaata ccagagcggc tctcgcagcc gacctcgagg 300 gggggcccta ttctatagtg tcacctaaat gctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg 360 ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 420 ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 480 aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 540 gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc 600 agtggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 660 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 720 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 780 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 840 tccgaccctg ccgcttaccg 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tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 6600 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 6660 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 6720 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 6780 gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 6840 agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 6900 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 6960 aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 7020 aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 7080 ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 7140 aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaacctg atcaggactc 7200 ttccttttca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat 7260 gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc taggccgcga ttaaattcca acatggatgc 7320 tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta 7380 tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt 7440 tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct 7500 tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat 7560 ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt 7620 tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt 7680 taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt 7740 tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga 7800 aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact 7860 tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg 7920 aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc 7980 ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt 8040 gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaagaattc gcgcaattaa ccctcactaa 8100 agggaacaaa agctgggtac cgggccc 8127

Claims

1) (가) CAEV 유전체의 1 내지 511번째 뉴클레오티드로 이루어진 5' 비번역 영역, 및 (나) 상기 5' 비번역 영역의 3' 말단에 연결된 CAEV gag-코딩 서열의 1 내지 X번째 뉴클레오티드(이때, X는 613 미만임)로 필수적으로 이루어진 CAEV 패키징 서열; 및

2) 상기 CAEV 패키징 서열에 작동가능하게 연결된, 폴리아데닐화 반응, RNA 수송, 역전사 및 통합(integration)으로부터 선택된 하나 이상에 요구되는 시스-작용 요소

를 포함하는, 재조합 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV)-계 전이 벡터.

제 1 항에 있어서,

상기 X가 327인 것을 특징으로 하는, 전이 벡터.

제 1 항에 있어서,

상기 gag-코딩 서열의 시작 코돈이 gag 단백질의 번역을 방지하도록 변이된 것을 특징으로 하는, 전이 벡터.

제 3 항에 있어서,

상기 시작 코돈이 TAG로 변이된 것을 특징으로 하는, 전이 벡터.

제 3 항에 있어서,

상기 시작 코돈 ATG의 21 염기쌍 하류에 위치하는 gag-코딩 서열의 ATG 코돈이 gag 단백질의 번역을 방지하도록 변이된 것을 특징으로 하는, 전이 벡터.

제 1 항에 있어서,

상기 시스-작용 요소가 RRE(rev-반응 요소) 영역, U3가 결실된 CAEV 3' LTR, 및 이종의 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 전이 벡터.

제 6 항에 있어서,

상기 이종의 프로모터가 인간 거대세포바이러스 주 극초기 프로모터(HCMV MIEP)인 것을 특징으로 하는, 전이 벡터.

제 1 항에 있어서,

상기 벡터가 도 3c에 제시된 pCAH/SINd1의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 전이 벡터.

제 8 항에 있어서,

상기 벡터가 서열번호: 68과 최소 70%의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는, 전이 벡터.

제 1 항에 있어서,

이종의 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종의 유전자를 포함하는 전사 카세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 전이 벡터.

제 1 항의 전이 벡터 및 패키징 벡터 시스템을 포함하며, 이때 상기 패키징 벡터 시스템은 CAEV gag-pol-코딩 서열 및 RRE를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 바이러스 외피-코딩 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 CAEV-계 벡터 시스템.

제 11 항에 있어서,

상기 전이 벡터가 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종의 유전자를 포함하는 전사 카세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.

제 11 항에 있어서,

상기 바이러스 외피-코딩 서열이 비-CAEV 외피-코딩 서열인 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.

제 13 항에 있어서,

상기 비-CAEV 외피-코딩 서열이 VSV-G(vesicular stomatitis virus G; 수포성 구내염 바이러스 G) 당단백질-코딩 서열 또는 GaLV(gibbon ape leukemia virus; 원숭이 백혈병 바이러스) 외피 단백질-코딩 서열인 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.

제 11 항에 있어서,

상기 벡터 시스템이 rev-코딩 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.

제 11 항에 있어서,

상기 벡터 시스템이 vif-코딩 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.

제 11 항에 있어서,

상기 패키징 벡터 시스템이 CAEV 패키징 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.

제 11 항에 있어서,

상기 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터 및 상기 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터 시스템.

제 12 항의 재조합 CAEV-계 벡터 시스템으로 세포를 형질감염시켜 제조된 복제-결함 벡터 입자.

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