CN104096239B - hALR基因微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及人肝再生增强因子基因（hALR）微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用。本发明通过研究发现，将人肝再生增强因子基因（hALR）微环真核表达载体通过水动力转染方法，可靶向性地将人肝再生增强因子基因导入肝细胞内，并使其在肝脏中有效表达，从而有效抑制降低肝脏胶原蛋白合成。因此，人肝再生增强因子基因微环真核表达载体在制备降低肝脏胶原蛋白合成的药物方面具有很大的应用前景。

Description

hALR基因微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的 应用

技术领域

本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及人肝再生增强因子基因(hALR)微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用。

背景技术

肝纤维化、肝硬化等慢性肝病均存在以肝脏胶原蛋白合成为主的病理变化，所以，抑制肝脏胶原蛋白合成，成为治疗和预防肝纤维化、肝硬化等慢性肝病的有效方式。有大量文献表明肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)能减少肝脏纤维化时胶原蛋白的产生，因此，肝再生增强因子成为了基因治疗肝纤维化的靶标基因。现有技术中以肝再生增强因子为靶标来治疗肝纤维化的方法主要有以下几种：(1)通过外源物质增加动物体内肝再生增强因子基因的表达量，从而通过降低肝脏胶原蛋白合成来治疗肝纤维化。如彭彦辉等发表的文献“中药方剂对肝纤维化大鼠肝脏ALR基因表达的影响”证明：其文献中记载的中药方剂可显著升高肝纤维化大鼠肝组织ALR mRNA表达，从而抑制肝纤维化。(2)借助常规表达载体将肝再生增强因子基因导入动物细胞，使肝再生增强因子基因在细胞内高表达，从而通过降低肝脏胶原蛋白合成来治疗肝纤维化。但是，通过常规表达载体来介导肝再生增强因子基因的效率很低，而且，常规载体在基因治疗中可能会引起严重的生物安全问题。如病毒载体中的病毒基因会整合到宿主基因组，病毒载体中的病毒基因编码蛋白具有免疫原性等；传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因未甲基化的CpG基因序列和一些可能隐藏的表达信号，这些序列在质粒是必须的，但在基因治疗中可能引起严重的生物安全问题。除此之外，抗性基因会通过水平基因转移的方式在宿主体内传播；隐藏在真核表达信号上游的抗性基因还会导致哺乳动物细胞中基因的表达发生改变；甚至细菌序列的存在也会导致目的基因的沉默。这些因素都严重影响基因治疗的效果。

微环DNA(minicircle DNA，MC)是1997年发展起来的除细菌序列和仅编码外源基因的小超螺旋高效载体。具有安全性能好，同时转染效率高、表达时间持久的优点。微环DNA载体仅由外源基因的表达盒构成,不含有来自细菌质粒的骨架结构，在生物安全性、转染效率、生物活性方面都优于传统质粒载体。相关文献报道，体内、外试验证明微环DNA载体的表达效率是亲本质粒载体的几十至几百倍。

目前，国内外尚无用微环载体来介导人肝再生增强因子(human augmenter ofliver regeneration,hALR)基因的相关报道。因为，微环质粒种类纷杂，微环质粒与宿主工程菌的匹配度是很难选择的，而且，微环质粒中携带的目的基因能否与宿主工程菌相兼容也是很难控制的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中利用肝再生增强因子进行基因治疗存在的缺陷，提供一种人肝再生增强因子基因微环真核表达载体及其构建方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种人肝再生增强因子基因微环真核表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明选取微环质粒ZY781作为表达载体，将人肝再生增强因子序列通过酶切连接技术连接到质粒ZY781中，得到携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒，将获得的携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒转入工程菌E.coli ZYCY10P3S2T中，通过工程菌自身重组酶的作用下制备出高纯度的人肝再生增强因子基因微环真核表达载体。

本发明之所以选择微环质粒ZY781作为表达载体是经过优化筛选的。现有技术微环质粒种类纷杂，微环质粒与宿主工程菌的匹配度是很难选择的，而且，微环质粒中携带的目的基因能否与宿主工程菌相兼容也是很难控制的。另外，本发明通过合理优化重组工程菌E.coli ZYCY10P3S2T的发酵条件，高效率制备得到高纯度的人肝再生增强因子基因微环真核表达载体。

所述重组工程菌的优化发酵及诱导条件为：将重组工程菌种子液按照0.1～0.3％的接种量接种到含50μg/ml卡那霉素的TB培养液中，37℃，250rpm/min，培养15h；然后向培养液中加入1.2倍体积的诱导液，32℃，250rpm/min培养6h；所述诱导液为含有3％(v/v)1NNaOH和0.3％(v/v)20％L-Arabinose的LB液体培养基。

所述重组工程菌种子液的制备方法为将重组工程菌接种到TB培养液中，37℃，250rpm/min，培养15～18h得OD600值为4～5的重组工程菌种子液。

本发明的有益效果是：

本发明通过研究发现，将人肝再生增强因子基因(hALR)微环真核表达载体通过水动力转染方法，可靶向性地将人肝再生增强因子基因导入肝细胞内，并使其在肝脏中有效表达，从而有效抑制降低肝脏胶原蛋白合成。因此，人肝再生增强因子基因微环真核表达载体在制备降低肝脏胶原蛋白合成的药物方面具有很大的应用前景，例如可以使用该载体制备出hALR蛋白作为药物使用，也可以用于基因治疗，即直接将基因打到动物体内进行基因治疗。

说明书附图

图1.pcDNA3.1(+)-hALR质粒图谱。

图2.ZY781空载体结构图。

图3.hALR基因表达序列图。

图4.hALR基因表达序列酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中，1、Marker:DL5000bp；6、Marker:DL2000bp；2、3、4、5：hALR基因表达序列酶切样品。

图5.酶切、连接、转化技术将hALR微环亲本质粒导入工程菌过程图。

图6.ZY781-CMV-hALR质粒图谱。

图7.转化结果酶切电泳鉴定图；Marker:DL15000bp；2、3、4、5：NdeI酶切结果；6、7、8：KpnI酶切结果9、Marker:DL2000bp。

图8.hALR基因微环真核表达载体制备流程图。

图9.hALR基因微环真核表达载体电泳鉴定图；1:Marker DL15000bp；2:亲本质粒KpnI酶切结果；3、5:微环KpnI、EcoRI酶切结果；4、6:对照pcDNA3.1(+)-hALR载体KpnI、EcoRI酶切结果：7:Marker DL5000bp。

图10.hALR基因微环真核表达载体结构图。

图11.采用新老制备条件制备出的hALR微环真核表达载体纯度比较；左图：文献制备条件制备的hALR微环质粒；右图：新制备条件制备的hALR微环真核表达载体；左图：1、2：maker；3：亲本质粒KpnI酶切结果；4、5：hALR微环真核表达载体KpnI酶切结果；右图：1、2、7：maker；3：亲本质粒KpnI酶切结果；4、5、6：hALR微环真核表达载体KpnI酶切结果。

图12.大鼠肝脏外观裸视观察结果。

图13.大鼠肝功能指标。

图14.各组肝脏病理切片HE染色图

图15.各组肝脏切片胶原染色图。

图16.各组肝组织胶原蛋白I mRNA检测。

图17.pMC-CMV-hALR和pcDNA3.1(+)-hALR在体内表达比较图；1.健康对照组；2.为生理盐水对照组；3.模型对照组；4、5.pcDNA3.1(+)-hALR治疗组48小时和7天ALR表达情况；6、7：pMC-CMV-hALR治疗组48小时和7天ALR表达情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。

pcDNA3.1(+)-hALR质粒(6013bp)是由解放军458医院全军肝病中心构建并保藏，其结构图如图1所示；E.coli ZYCY10P3S2T和ZY781空载体由斯坦福大学陈志英教授惠赠，ZY781空载体结构图如图2所示。

实施例1

S1.人肝再生增强因子基因序列的获得：以解放军458医院全军肝病中心构建并保藏pcDNA3.1(+)-hALR质粒(质粒序列如SEQ ID NO：2所示)为模版，设计扩增人肝再生增强因子基因序列的正向和反向引物：

正向引物F：5’-GACTGAAGATCTATGTACGGGCCAGATATA-3’

反向引物R：5’-ATACCGCTCGAGGGTTCTTTCCGCCTCAGA-3’

PCR反应体系及反应程序如下：

PCR反应程序：(1)98℃反应10s，62℃反应15s，72℃反应30s，共35个循环；(2)72℃反应10min；(3)10℃∞。

PCR反应结束后，回收、测序PCR产物，获得1671bp的CMV-hALR-BGHpolyA基因片段，CMV-hALR-BGHpolyA基因片段经BglII(NEB)和XhoI(NEB)双酶切获得CMV-hALR-BGHpolyA(1647bp)，即hALR基因表达序列，hALR基因表达序列如SEQ ID NO：3所示，hALR基因表达序列结构图如图3所示，酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定如图4所示。

S2.将人肝再生增强因子基因序列通过酶切连接技术转入空白微环DNA亲本质粒中；得到携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒；将携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒转入工程菌E.coli ZYCY10P3S2T中得重组工程菌，重组菌构建图如图5所示；具体步骤为：

酶切所用酶：hALR基因表达序列用BglII(NEB)和XhoI(NEB)双酶切，ZY781空载体用BglII(NEB)和SalI(NEB)双酶切。

酶切反应体系及条件：反应物37℃，酶切过夜。酶切反应体系如下：

酶切产物纯化方法：切胶回收，采用胶回收试剂盒(TaKaRa,DV805A)纯化。

酶切产物连接：采用连接试剂盒(NEB，M2200S)，连接体系如下：

回收连接产物，得ZY781-CMV-hALR质粒，即hALR基因亲本质粒；

ZY781-CMV-hALR质粒的质粒图谱图如图6所示。

转化：采用氯化钙法制备E.coli ZYCY10P3S2T感受态细胞，将构建的ZY781-CMV-hALR质粒转入工程菌E.coli ZYCY10P3S2T中，通过亲本质粒携带的卡那霉素抗性筛选得到转化子E.coliZYCY-ZY781-CMV-hALR205。

转化子鉴定：提取质粒酶切电泳鉴定以及测序鉴定，电泳鉴定结果如图7。

S3.优化重组工程菌E.coliZYCY-ZY781-CMV-hALR205发酵及诱导条件，通过工程菌自身重组酶的作用下制备出高纯度的人肝再生增强因子微环真核表达载体。操作流程图如图8所示，具体步骤如下：将重组工程菌接种到含50μg/ml卡那霉素的TB培养液中，37℃，250rpm/min，培养15～18h得OD600值为4～5的重组工程菌种子液。将重组工程菌种子液按照0.1～0.3％的接种量接种到含50μg/ml卡那霉素的TB培养液中，37℃，250rpm/min，培养15h；然后向培养液中加入1.2倍体积的诱导液，32℃，250rpm/min培养6h；所述诱导液为含有3％(v/v)1N NaOH和0.3％(v/v)20％L-Arabinose的LB液体培养基。发酵及诱导结束后离心回收发酵液，采用常规的去毒素质粒提取方法提取hALR基因微环真核表达载体。hALR基因微环真核表达载体经电泳鉴定得阳性hALR基因微环真核表达载体；电泳鉴定结果如图9所示。阳性hALR基因微环真核表达载体送公司测序，其序列如SEQ ID NO：1所示。hALR基因微环真核表达载体的结构图如图10所示。

实施例2重组工程菌E.coli ZYCY-ZY781-CMV-hALR205发酵条件优化过程

本研究发现：不同的诱导时间、加碱的量以及L-(+)-Arabinose加入量都会影响hALR基因微环真核表达载体的产量和质量。而且hALR基因微环真核表达载体的产量和质量并不是仅仅靠改变一个因素就可以的，诱导时间、加碱的量以及L-(+)-Arabinose的加入量之间存在复杂的相互作用关系，尤其是L-(+)-Arabinose的加入量直接影响后续诱导时间的控制。

现有文献报道：包括微环质粒ZY781和工程菌E.coli ZYCY10P3S2T微环载体系统的发酵条件为：加入等体积的诱导液，诱导液为1体积的LB液体培养基中加入0.04体积的1NNaOH，0.02％L-Arabinose；诱导条件为32℃，5h，如果需要可适当延长1～3小时。本发明针对特定的目的基因hALR摸索出一套特定的发酵工艺条件，与文献方法相比，此制备工艺获得的hALR基因微环真核表达载体的纯度高于文献中方法，几乎没有亲本质粒及其他杂质粒的存在(图11)。图11中左图为文献方法制备出的hALR基因微环真核表达载体带有亲本质粒，右图为改进方法制备出的hALR基因微环真核表达载体很纯净，未见亲本质粒条带。

实施例3 hALR基因微环真核表达载体的应用

试验方法

模型建立及hALR转染：为了比较微环hALR表达载体和pcDNA3.1(+)-hALR质粒载体(pcDNA3.1(+)-hALR质粒载体的构建参照本技术领域常规方法)在降低肝脏胶原蛋白合成方面的效果，我们选择了CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，同时体内转染采用水动力转染方法。

CCl4诱导大鼠肝纤维化模型的给药途径采用灌胃法，根据文献对CCl4灌胃方法进行了部分修改，CCl4灌胃前让大鼠自由饮用含35mg/dL苯巴比妥(phenobarbital)的饮用水两周。CCl4/花生油溶液浓度为0.08ml CCl4/1ml花生油，灌胃起始剂量为412mg CCl4/kgbw，每三天一次。

50只健康SD大鼠(120±10g)随机分成6组，Group I为健康对照组(n＝5)；GroupII为生理盐水对照组(n＝5)，尾静脉水动力方法注射生理盐水(5％BW,每一周一次)；GroupIII为模型对照组(n＝10)，CCl4灌胃；Group IV为pcDNA3.1(+)-hALR质粒对照组(n＝10)，CCl4灌胃，尾静脉水动力方法注射pcDNA3.1(+)-hALR质粒(500μg/kg溶于5％BW生理盐水中，每一周一次；GroupV为微环低剂量治疗组(n＝10)，CCl4灌胃，尾静脉水动力方法注射pMC-CMV-hALR质粒(200μg/kg溶于5％BW体积的生理盐水中，5～8秒通过尾静脉打入，每隔一周一次)；GroupVI为微环高剂量治疗组(n＝10)，CCl4灌胃，尾静脉水动力方法注射pMC-CMV-hALR质粒(200μg/kg溶于5％BW体积的生理盐水中，5～8秒通过尾静脉打入，每周一次)。

所述水动力转染技术是一种快速方便高效的外源基因转染方法，是指通过鼠尾静脉快速注射大体积含有目的基因的生理盐水，从而实现外源目的基因在鼠体内的高效表达，尤其是很好的在肝脏表达。参考文献：Zhang G，Budker V，Wolff JA.High levels offoreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of nakedPlasmid DNA[J].HumGene Ther，1999，10(10):1735－1737.

实验结果

(1)大鼠肝脏裸眼观察：裸眼观察大鼠肝脏外观结构，结果见图12，图中显示正常组(I、II)大鼠肝脏外观色深，表面光滑如镜，柔软有韧性；肝硬化(III)大鼠肝脏表面呈现颗粒状、粗糙不平、质地坚硬、色浅、个别地方如砂石状，但是，pcDNA3.1(+)-hALR质粒(IV)和pMC-CMV-hALR(V、VI)治疗明显减少肝脏这些非正常的表观(如图1)。而且pMC-CMV-hALR(V、VI)较pcDNA3.1(+)-hALR质粒(IV)效果明显，pMC-CMV-hALR高剂量组(VI)较pMC-CMV-hALR低剂量组(V)肝脏外观更光滑平整。

(2)大鼠肝功能指标：大鼠的肝纤维化程度直接影响到肝脏的功能，肝功能检测结果(图13)显示，模型组(III)大鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)水平均明显高于健康(I)，差异显著(p<0.01)，hALR质粒治疗组(IV、V和VI)较肝硬化造模组(III)在血清AST和ALT水平均有显著性差异(P<0.01)，ALP水平也有一定程度的降低。与健康组大鼠相比较，造模组ALB水平均有显著性差异(P<0.01)，微环hALR治疗低剂量组和微环hALR高剂量治疗组大鼠较造模组的ALB水平也有所改善。从血清转氨酶指标看，ALR基因表达产物对大鼠肝脏功能具有良好的保护作用，从而降低了肝纤维化的发生。

(3)大鼠肝脏病理学变化：从各组肝脏病理切片HE染色图(图14)中可知：健康组(I)和生理盐水水动力对照组(II)的大鼠肝细胞索绕中央静脉呈放射状排列，未见病变；模型组(III)大鼠肝组织小叶内、小叶间有炎性细胞浸润，有脂肪空泡产生，肝纤维化明显，增生的胶原延伸至小叶间，并向邻近肝小叶延伸，包绕、分割肝组织形成网络状的纤维间隔，肝脏固有的小叶结构不清楚，胶原包绕形成假小叶；hALR质粒治疗组(IV、V和VI)较肝硬化造模组(III)均有明显改善，尤其是pMC-CMV-hALR治疗组(V、VI)结缔组织增生减少，纤维间隔变窄，部分纤维间隔断裂，炎性浸润程度明显减轻。pMC-CMV-hALR高剂量组(VI)较pMC-CMV-hALR低剂量组(V)结果更为明显。

(4)胶原蛋白染色：从肝脏切片Sirius-red胶原染色图(图15)结果显示，健康组(I)和生理盐水水动力对照组(II)的大鼠肝小叶结构正常，中央静脉壁周围及肝窦周有少量胶原纤维着色；肝硬化模型组(III)肝组织中可见大量胶原沉积，胶原层层盘绕形成宽大纤维间隔并向肝组织穿插形成大小不等的假小叶；hALR质粒治疗组(IV、V和VI)较肝硬化造模组(III)肝纤维化程度显著减轻，胶原沉积的纤维间隔变窄，切片中部分纤维中断，尤其是pMC-CMV-hALR治疗组(V、VI)部分纤维间隔断裂，纤维脉络舒展开；pMC-CMV-hALR高剂量组(VI)较pMC-CMV-hALR低剂量组(V)纤维面积更为明显的减少。

(5)胶原蛋白I检测：经qRT-PCR检测胶原蛋白I mRNA表达得出如图16结果。大鼠的各组肝组织胶原蛋白I含量检测结果(图15)显示，模型组(III)大鼠胶原蛋白I(ColI)mRNA水平均明显高于健康(I)，差异显著(p<0.01)，hALR质粒治疗组(IV、V和VI)较肝硬化造模组(III)在胶原蛋白I(ColI)mRNA水平上均有显著性差异(P<0.01)。与健康组大鼠相比较，微环hALR治疗低剂量组和微环hALR高剂量治疗组大鼠较造模组的有大幅度降低。证明了微环hALR基因治疗在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中有较好降低胶原蛋白合成的作用。

实施例4

本发明同时也使用其他载体以及其他制备方法来制备人肝再生增强因子微环真核表达载体，如用传统质粒pcDNA3.1(+)加载人肝再生增强因子，再用酶切连接的技术来产生环化人肝再生增强因子基因，即人肝再生增强因子微环载体。但是，通试验发现：此方法步骤多，成本高，成功率低，后续提取处理很复杂等不足。综上，我们采用本发明中提及的质粒ZY781和工程菌E.coli ZYCY10P3S2T来制备人肝再生增强因子微环真核表达载体，优化发酵和诱导微环产生工艺条件，最终一步得到人肝再生增强因子微环真核表达载体，减少步骤，免去提取过程，节省成本，且人肝再生增强因子微环真核表达载体在细胞以及动物实验中的转染和表达效果明显高于传统质粒，且持续表达时间长，见图17。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第四五八医院

<120> hALR基因微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1720

<212> DNA

<213> 1hALR基因微环真核表达载体基因序列

<400> 1

actagtgaat tcagatctat gtacgggcca gatatacgcg ttgacattga ttattgacta 60

gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 120

ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 180

cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 240

gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 300

gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 360

tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 420

tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 480

ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 540

actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 600

ggtgggaggt ctatataagc agagctctct ggctaactag agaacccact gcttactggc 660

ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa 720

gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattcatggc ggcgcccggc 780

gagcggggcc gcttccacgg cgggaacctc ttcttcctgc cggggggcgc gcgctccgag 840

atgatggacg acctggcgac cgacgcgcgg ggccggggcg cggggcggag agacgcggcc 900

gcctcggcct cgacgccagc ccaggcgccg acctccgatt ctcctgtcgc cgaggacgcc 960

tcccggaggc ggccgtgccg ggcctgcgtc gacttcaaga cgtggatgcg gacgcagcag 1020

aagcgggaca ccaagtttag ggaggactgc ccgccggatc gcgaggaact gggccgccac 1080

agctgggctg tcctccacac cctggccgcc tactaccccg acctgcccac cccagaacag 1140

cagcaagaca tggcccagtt catacattta ttttctaagt tttacccctg tgaggagtgt 1200

gctgaagacc taagaaaaag gttgtgcagg aaccacccag acacccgcac ccgggcatgc 1260

ttcacacagt ggctgtgcca cctgcacaat gaagtgaacc gcaagctggg caagcctgac 1320

ttcgactgct caaaagtgga tgagcgctgg cgcgacggct ggaaggatgg ctcctgtgac 1380

tagtctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 1440

ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 1500

gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 1560

ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat 1620

gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccctcga cccatggggg 1680

cccgccccaa ctggggtaac ctttgggctc cccgggcgcg 1720

<210> 2

<211> 6013

<212> DNA

<213> 2 pcDNA3.1(+)-hALR质粒

<400> 2

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

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attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

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ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattcatg 960

gcggcgcccg gcgagcgggg ccgcttccac ggcgggaacc tcttcttcct gccggggggc 1020

gcgcgctccg agatgatgga cgacctggcg accgacgcgc ggggccgggg cgcggggcgg 1080

agagacgcgg ccgcctcggc ctcgacgcca gcccaggcgc cgacctccga ttctcctgtc 1140

gccgaggacg cctcccggag gcggccgtgc cgggcctgcg tcgacttcaa gacgtggatg 1200

cggacgcagc agaagcggga caccaagttt agggaggact gcccgccgga tcgcgaggaa 1260

ctgggccgcc acagctgggc tgtcctccac accctggccg cctactaccc cgacctgccc 1320

accccagaac agcagcaaga catggcccag ttcatacatt tattttctaa gttttacccc 1380

tgtgaggagt gtgctgaaga cctaagaaaa aggttgtgca ggaaccaccc agacacccgc 1440

acccgggcat gcttcacaca gtggctgtgc cacctgcaca atgaagtgaa ccgcaagctg 1500

ggcaagcctg acttcgactg ctcaaaagtg gatgagcgct ggcgcgacgg ctggaaggat 1560

ggctcctgtg actagtctag agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct 1620

tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 1680

gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 1740

tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 1800

aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc 1860

tggggctcta gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg 1920

gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct 1980

ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg 2040

ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag 2100

ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg 2160

gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc 2220

tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat 2280

gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt 2340

gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt 2400

cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 2460

atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc 2520

cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg 2580

ccgaggccgc ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc 2640

taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcaagaga 2700

caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg 2760

cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg 2820

ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt 2880

ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg 2940

gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat 3000

tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat 3060

ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg 3120

accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg 3180

atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc 3240

tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc 3300

cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg 3360

tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg 3420

gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca 3480

tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac 3540

cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga 3600

aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga 3660

tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3720

ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 3780

tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta 3840

gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 3900

tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 3960

ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 4020

ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 4080

ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 4140

agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 4200

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 4260

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 4320

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 4380

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 4440

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 4500

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 4560

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 4620

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 4680

taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 4740

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggttt 4800

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 4860

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 4920

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 4980

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 5040

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 5100

gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 5160

cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 5220

cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 5280

tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 5340

cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 5400

gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 5460

cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 5520

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 5580

gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 5640

taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 5700

gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 5760

acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 5820

aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 5880

cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 5940

atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 6000

gccacctgac gtc 6013

<210> 3

<211> 1647

<212> DNA

<213> 3 hALR基因表达序列

<400> 3

atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 60

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 120

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 180

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 240

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 300

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 360

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 420

agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 480

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 540

acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 600

gcagagctct ctggctaact agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga 660

ctcactatag ggagacccaa gctggctagc gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg 720

atccactagt ccagtgtggt ggaattcatg gcggcgcccg gcgagcgggg ccgcttccac 780

ggcgggaacc tcttcttcct gccggggggc gcgcgctccg agatgatgga cgacctggcg 840

accgacgcgc ggggccgggg cgcggggcgg agagacgcgg ccgcctcggc ctcgacgcca 900

gcccaggcgc cgacctccga ttctcctgtc gccgaggacg cctcccggag gcggccgtgc 960

cgggcctgcg tcgacttcaa gacgtggatg cggacgcagc agaagcggga caccaagttt 1020

agggaggact gcccgccgga tcgcgaggaa ctgggccgcc acagctgggc tgtcctccac 1080

accctggccg cctactaccc cgacctgccc accccagaac agcagcaaga catggcccag 1140

ttcatacatt tattttctaa gttttacccc tgtgaggagt gtgctgaaga cctaagaaaa 1200

aggttgtgca ggaaccaccc agacacccgc acccgggcat gcttcacaca gtggctgtgc 1260

cacctgcaca atgaagtgaa ccgcaagctg ggcaagcctg acttcgactg ctcaaaagtg 1320

gatgagcgct ggcgcgacgg ctggaaggat ggctcctgtg actagtctag agggcccgtt 1380

taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 1440

tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat 1500

gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg 1560

caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc 1620

tctatggctt ctgaggcgga aagaacc 1647

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 正向引物F

<400> 4

gactgaagat ctatgtacgg gccagatata 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 反向引物 R

<400> 5

ataccgctcg agggttcttt ccgcctcaga 30

Claims (3)

1.hALR微环真核表达载体在制备降低肝脏胶原蛋白合成药物中的应用，所述hALR微环真核表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述降低肝脏胶原蛋白合成药物用于治疗肝纤维化。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述降低肝脏胶原蛋白合成药物用于治疗肝硬化。