CN107312782B - 鸭坦布苏病毒e蛋白截短体基因、重组鸭瘟病毒及构建方法和应用 - Google Patents

鸭坦布苏病毒e蛋白截短体基因、重组鸭瘟病毒及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因、重组鸭瘟病毒及构建方法和应用。所述鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。一种重组鸭瘟病毒，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有所述的鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因。本发明筛选获得了一种鸭坦布苏病毒E蛋白的截短体基因，通过将该E蛋白截短体基因插入到重组鸭瘟病毒的基因组中获得一种新的重组鸭瘟病毒，感染CEFs细胞后，该E蛋白截短体基因获得高效表达。该插入了E蛋白截短体基因的重组鸭瘟病毒能够用于鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒二联疫苗的制备。

Description

鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因、重组鸭瘟病毒及构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因、重组鸭瘟病毒及构建方法和应用。
背景技术
2010年4月以来，我国鸭主产区的蛋鸭和种鸭爆发一种新的传染病，该病以传播迅速、产蛋量骤降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征。通过病原分离鉴定和全序列测定，明确该病原属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)、蚊媒病毒类(Mosquito-borne)、Ntaya病毒群，与该群Tembusu病毒(TMUV)具有最近的遗传进化关系，可以认为是TMUV的一个新成员，暂定名为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)(Su J,Li S,Hu X,et al.Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus,a new Tembusu-related flavivirus[J].PLoS One,2011,6(3):e18106.)。该病可危害不同品种的种鸭和蛋鸭，发病率高低不一，群内发病率高达100％，死淘率5％～15％，继发感染时死淘率可达30％。临床上主要表现为发病后2～5d内，鸭群的产蛋量骤然下降，从产蛋高峰迅速下降至30％～10％，严重的甚至停产。研究发现，该病毒主要危害除番鸭外的所有品种产蛋鸭、肉种鸭及野鸭等，最近也有产蛋鸡(陈仕龙,陈少莺,王劭,等.一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定[J].福建农业学报,2011,26(2):170-174.)、鹅自然感染发病的报道(赵冬敏,黄欣梅,刘宇卓,等.新型黄病毒在种鹅中垂直传播的研究[J].南方农业学报,2012,43(1):99-102.)。该病的流行给养殖业造成了巨大的损失，而目前尚没有有效的疫苗及药物控制该病的发生。
随着病原学研究的深入和病毒基因组的破译，发现该病毒对鸡红细胞无血凝活性，病毒直径约45nm，有囊膜。病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，由10990个核苷酸组成，具有典型的黄病毒基因组结构特点。病毒基因组编码一个大多聚蛋白，由3426个氨基酸构成，该多聚蛋白前体经过病毒自身和宿主细胞的蛋白酶，被切割成至少十种成熟的蛋白，其中包括3个结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白prM、囊膜蛋白E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b与NS5)。E蛋白全长501个氨基酸，位于成熟病毒颗粒表面，构成病毒颗粒的突起。E蛋白是黄病毒的主要结构蛋白，在病毒感染靶细胞的受体结合、膜融合和侵入过程中起着关键作用；同时，E蛋白具有较好的免疫原性和反应原性，是宿主抗感染免疫的主要保护性抗原，也是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。
本发明人在公开号为CN105039268A的中国发明专利中公开了一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用，该重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基因，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。所述构建方法包括：(1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EF1；(2)将Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-E；(3)将pDEV-E转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒。所述重组鸭瘟病毒与亲本毒株相比，其病毒蚀斑大小不具有显著差异，说明鸭坦布苏病毒E蛋白基因的插入不影响鸭瘟病毒在鸡胚成纤维细胞上的扩散。所述重组鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞后成功表达E蛋白，为鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联疫苗的研制奠定了基础。但后续研究发现，该发明中重组鸭瘟病毒最后鸭坦布苏病毒E蛋白表达量较低，用于制备鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联疫苗时效果较差。
发明内容
本发明针对现有技术中重组鸭瘟病毒的鸭坦布苏病毒E蛋白表达量较低的问题，提供了一种鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因，将该截短体插入重组鸭瘟病毒的基因组中所得的重组鸭瘟病毒其感染鸡胚成纤维细胞(CEFs)后，鸭坦布苏病毒E蛋白截短体蛋白表达量提高。
鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明又提供了一种重组鸭瘟病毒，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有所述的鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因。
鸭瘟病毒(Duck plaque virus，DPV)，又称鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)，是引起鸭瘟的病原体，主要感染雁形目的鸭、鹅和天鹅等。在分类上属疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科。α-疱疹病毒是一类极具有优势的病毒活载体，不仅具有基因组大、非必需基因多、能插入外源基因的容量大、遗传稳定、受母源抗体干扰小、体内存活时间较长等优点，而且已成功研制了许多基因缺失疫苗株，是作为病毒活载体极佳的候选之一。
优选的，所述基因组插入有Pcmv-E451-dk-BGH-pA表达框；其中E451-dk表示鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因组中gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子。
优选的，所述鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因插入在所述基因组的US7基因和US8基因之间。
本发明还提供了一种重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)将Pcmv-E451-dk-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-E451-dk；
(2)将pDEV-E451-dk转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒，
其中，pDEV-EF1为携带鸭瘟病毒疫苗株全基因组的感染性细菌人工染色体克隆pDEV-vac中GFP基因的CMV启动子替换成EF1启动子；E451-dk表示鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾。
优选的，所述Pcmv-E451-dk-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1的方法为：
(1)将鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因E451-dk插入pEP-BGH-end，获得pEP-BGH-E451-dk；
(2)以pEP-BGH-E451-dk为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的引物，扩增获得目标片段；
(3)将所述目标片段转入pDEV-EF1/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanE451-dk；
(4)敲除pDEV-kanE451-dk中的kan抗性基因，获得pDEV-E451-dk。
本发明还提供了所述重组鸭瘟病毒在制备动物疫苗中的应用。
优选的，所述动物疫苗为鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联疫苗。
本发明筛选获得了一种鸭坦布苏病毒E蛋白的截短体基因，通过将该E蛋白截短体基因插入到重组鸭瘟病毒的基因组中获得一种新的重组鸭瘟病毒，感染CEFs细胞后，该E蛋白截短体基因获得高效表达。该插入了E蛋白截短体基因的重组鸭瘟病毒能够用于鸭瘟病毒和鸭坦布苏病毒二联疫苗的制备。
附图说明
图1为重组克隆pDEV-E-dk和pDEV-E451-dk的Pst I酶切鉴定结果图，其中，泳道M为DL15000分子量Marker(下同)，泳道1～5分别为rDEV-EF1、rDEV-E-dk.Kan、rDEV-E-dk、rDEV-E451-dk.kan、rDEV-E451-dk。
图2为重组克隆pDEV-Eori、pDEV-Etpa-ori、pDEV-Etpa-451-ori、pDEV-E451-ori、pDEV-E451-ch和pDEV-E-ch的BamH I酶切鉴定结果图，泳道1～13分别为1：rDEV-EF1；2：rDEV-EoriKan；3：rDEV-Eori；4：rDEV-Etpa-ori.Kan；5：rDEV-Etpa-ori；6：rDEV-Etpa-451-ori.Kan；7：rDEV-Etpa-451-ori；8：rDEV-E451-ori.Kan；9：rDEV-E451-ori；10：rDEV-E451-ch.Kan；11：rDEV-E451-ch；12：rDEV-E-ch.kan；13：rDEV-E-ch。
图3为重组克隆的PCR鉴定核酸电泳结果图，其中，泳道1～17分别为：1：EF1；2：rDEV-EoriKan；3：rDEV-Eori；4：rDEV-Etpa-ori.Kan；5：rDEV-Etpa-ori；6：rDEV-Etpa-451-ori.Kan；7：rDEV-Etpa-451-ori；8：rDEV-E451-ori.Kan；9：rDEV-E451-ori；10：rDEV-E451-ch.Kan；11：rDEV-E451-ch；12：rDEV-E-ch.kan；13：rDEV-E-ch；14：rDEV-E-dk.Kan；15：rDEV-E-dk；16：rDEV-E451-dk.Kan；17：rDEV-E451-dk。
图4为病毒拯救荧光显微镜观察结果图，放大倍数为100倍。
图5为各拯救病毒感染CEFs细胞后的蚀斑大小结果比较图。
图6为Western blotting方法检测重组病毒感染细胞中E蛋白的表达结果图，其中上半部分为DⅢ检测结果，下半部分为GFP检测结果，泳道M1为预染Marker：PageRulerPrestained Protein Ladder，泳道M2为预染Marker：EasySee Western Marker，泳道1～9分别为：1：rDEV-EF1；2：rDEV-Eori；3：rDEV-E-ch；4：rDEV-E-dk；5：rDEV-Etpa-ori；6：rDEV-Etpa-451-ori；7：rDEV-E451-ori；8：rDEV-E451-dk；9：rDEV-E451-ch。
具体实施方式
菌株、质粒和病毒
E.coli DH5α、pEP-BGH-end质粒(序列如SEQ ID NO.5所示)均由浙江省农科院畜牧兽医研究所保存；
携带有DEV疫苗株全基因组感染性细菌人工染色体(BAC)克隆的pDEV-EF1/GS1783菌株及相应的病毒rDEV-EF1由本实验室构建并保存(中国发明专利CN105039268A；文献：陈柳，余斌，倪征，华炯钢，叶伟成，云涛，张存.表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性.浙江农业学报[J].浙江农业学报，2015,27(11):1889-1895.)。
主要试剂
KOD酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，快速连接试剂盒、限制性内切酶、DNA凝胶纯化试剂盒，均购于大连宝生物工程有限公司；质粒提取纯化试剂盒购于OMEGA公司；DMEM、胎牛血清均购于Gibco BRL公司；磷酸钙转染试剂盒购于Promega公司。兔抗TUMV E蛋白DIII结构域多克隆抗体由本实验制备。HRP标记的山羊抗小鼠IgG和HRP标记的山羊抗兔IgG购于中杉金桥生物公司；GFP单抗购自碧云天生物技术公司，EasySee Western Marker购自北京全式金生物技术有限公司；
Figure BDA0001292538220000041
West Pico化学发光底物购自ThermoScientific公司。
试验用SPF鸡胚
9-11日龄SPF鸡胚购自浙江荐量生物技术公司。参照常规方法(马兴树.禽传染病试验诊断技术[M].北京：化学工业出版社，2006.)制备鸡胚成纤维细胞(CEFs)。
实施例1
1、序列优化、引物设计及合成
由GenScript公司参照鸡和鸭密码子偏性对E基因(序列参考GenBankJF270480.1)进行优化合成，得到原始E基因(序列如SEQ ID NO.1所示)、以鸡为宿主进行密码子优化的E基因(序列如SEQ ID NO.2所示)、以鸭为宿主进行密码子优化的E基因(序列如SEQ ID NO.3所示)。引物分别参考序列GenBank(EU082088.2)、鸭坦布苏病毒E基因优化序列设计，由上海生工合成。
本文所用引物见表1：
Eori+/Eori-引物对用于扩增原始E基因(Eori)；
Eori+/E451(ori-)用于扩增C端截短E基因(保留1-451位aa)(E451-ori)；
Etpa(ori+)/Eori-用于扩增N端引入了鸡TPA信号肽序列的原始E基因(Etpa-ori)；
Etpa(ori+)/E451(ori-)用于引入鸡TPA信号肽序列且C端截短的E基因(Etpa-451-ori)；
E451ch+/E451ch-用于扩增以鸡为宿主进行密码子优化的E基因(E451-ch)；
Edk-F/Edk-R用于扩增以鸭为宿主进行密码子优化的E基因(E-dk)；
Edk-F//Edk(1-451)-R用于扩增以鸭为宿主进行密码子优化且C短截短的E基因(E451-dk)。
pDEV vac-in-s和pDEV vac-in-as用于将各表达框pCMV-EG-BGH-pA插入到DEV基因组的US7和US8基因之间。下划线部分与pEP-BGH-EG同源，粗体部分分别与位于US7和US8基因间插入位点上、下游的序列同源。
引物Rec-JD-F和Rec-JD-R用于外源基因插入BAC基因组中的验证。
表1本发明所用引物。
Figure BDA0001292538220000051
2、pEP-BGH-EG质粒的构建。
分别以相应的原始E基因、以鸡为宿主进行密码子优化的E基因、以鸭为宿主进行密码子优化的E基因为模板，采用表1引物进行PCR扩增获得的Eori、E451-ori、Etpa-ori、Etpa-451-ori、E-dk、E451-dk基因在5’和3’端分别引入了Pst I和Not I酶切位点，将片段用Pst I和Not I进行双酶切之后插入到pEP-BGH-end(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)相应的酶切位点中(质粒事先也经双酶切)。E451-ch基因在5’和3’端分别引入了Kpn I和NotI酶切位点，将片段用Kpn I和Not I进行双酶切之后插入到pEP-BGH-end相应的酶切位点中。通过PCR和酶切鉴定筛选获得阳性克隆，送上海博尚生物公司测序，获得阳性克隆分别命名为pEP-BGH-EG(Eori)、pEP-BGH-EG(E451-ori)、pEP-BGH-EG(Etpa-ori)、pEP-BGH-EG(Etpa-451-ori)、pEP-BGH-EG(E-dk)、pEP-BGH-EG(E451-dk)、pEP-BGH-EG(E451-ch)。
3、重组鸭瘟突变体克隆的构建
参照文献方法(邓晓辉，陈柳，叶伟成，等.共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定[J].中国预防兽医学报，2012,4(34):251-256.)，通过“Red E/T两步重组”将Pcmv-EG-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1。将pDEV-EF1/GS1783菌株接种于氯霉素(CAM)抗性的LB培养基中，32℃220r/min培养至OD600为0.5～0.7，42℃水浴摇床摇15min以诱导Red重组酶表达，按常规方法制备电转化感受态细胞。
以上述获得的各pEP-BGH-EG质粒为模板，用引物pDEV vac-in-s和pDEV vac-in-as(序列见表1)扩增长度为3542～3782bp不等的片段，胶回收纯化片段，取200ng电转化至pDEV-EF1/GS1783感受态细胞中，涂布于CAM/卡那霉素(Kan)双抗性平板上，于32℃培养36h。挑取阳性克隆提取质粒，Pst I或BamH I酶切筛选正确重组的克隆(即各pDEV-kan.EG)进行第二次重组。第二步Red重组将各pDEV-kan.EG质粒中的Kan抗性基因删除。具体方法为：接种各pDEV-kan.EG菌落于液体培养基，于32℃220r/min培养过夜，次日转接于2mLCAM-LB中，振荡培养2～4h，加入等量2％L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶，然后再转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，最后32℃培养1h。将细菌悬液作10-3～10-5稀释后涂布于CAM平板，32℃孵育24～48h，挑取菌落同时点种于CAM和Kan平板。Pst I或BamH I酶切分析Cam阳性和Kan阴性的菌落，以筛选正确重组的克隆(pDEV-EG)。以各pDEV-EG为模板，用引物对EF1-JD-F和EF1-JD-R(序列见表1)进行PCR扩增，胶回收后克隆至pMD18-T载体，选取阳性克隆送至Invitrogen公司测序以确认插入片段的序列正确。
4、重组病毒在CEFs细胞中的拯救
用碱裂解法分别提取各pDEV-EG质粒，根据Promega磷酸钙转染试剂盒说明书转染CEFs，于37℃5％CO2继续培养，待出现70～80％病变后收取病毒，拯救的病毒分别命名为rDEV-Eori、rDEV-E451-ori、rDEV-Etpa-ori、rDEV-Etpa-451-ori、rDEV-E-dk、rDEV-E451-dk、rDEV-E451-ch。同时以相同方法获得rDEV-E(即rDEV-E-ch，前期实验中所得，具体参见专利CN105039268A及文献：陈柳，余斌，倪征，华炯钢，叶伟成，云涛，张存.表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性.浙江农业学报[J].浙江农业学报，2015,27(11):1889-1895.)及对照毒株rDEV-EF1(空白对照，未插入鸭坦布苏病毒全长或截断的E基因)。
分别提取各突变体克隆及kan中间体DNA，经过Pst I或BamH I酶切鉴定(图1和图2)，电泳图谱与以参考序列GenBank(EU082088.2)进行预测的结果基本一致，且以引物对Rec-JD-F和Rec-JD-R9(序列见表1)进行PCR扩增片段测序结果也与预期一致(图3)，说明外源基因按照预期结果插入。
磷酸钙转染细胞48h后荧光显微镜下观察发现转染孔内均出现荧光噬斑，结果如图4所示。
9株病毒感染CEFs细胞2天后，各拍摄病毒蚀斑照片100个，并用ImageJ软件测量各个蚀斑面积并计算平均值。将各病毒的蚀斑面积与rDEV-EF1进行比较，发现rDEV-Eori、rDEV-E-ch、rDEV-E-dk、rDEV-Etpa-ori、rDEV-E451-ch、rDEV-E451-dk和rDEV-E451-ori蚀斑面积分别较rDEV-EF1减少了31.2％、39.7％、1.77％、46.5％、11.6％、35.3％、35.2％，而rDEV-Etpa-451-ori蚀斑面积较rDEV-EF1增加了72.26％(图5)。
5、蛋白表达分析
分别接种rDEV-Eori、rDEV-E451-ori、rDEV-Etpa-ori、rDEV-Etpa-451-ori、rDEV-E-dk、rDEV-E451-dk、rDEV-E451-ch和毒株rDEV-E及对照毒株rDEV-EF1于CEFs细胞中，培养72h，PBS(pH7.0)洗涤三次，收获细胞。
细胞样品于SDS-PAGE电泳完毕，采用半干转移法将蛋白转移至PVDF膜上，取出PVDF膜，放入封闭液中4℃封闭过夜。转膜细胞样品准备两份，其中一块膜以兔抗TUMV E蛋白DIII结构域多克隆抗体(1∶500稀释)作为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5000稀释)作为二抗于37℃孵育1h，最后用ECL方法进行显色。与此同时，另一块膜以GFP单抗来检测对照内参GFP蛋白的表达，以GFP单抗为一抗(1∶1000稀释)，HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶5000稀释)作为二抗于37℃孵育1h，最后用ECL方法进行显色。
结果如图6所示，rDEV-Eori、rDEV-E-ch、rDEV-Etpa-ori、rDEV-E451-ori、rDEV-E451-dk和rDEV-E451-ch感染的细胞样品较rDEV-EF1感染的细胞样品在约54.3和49kD处多出特异性条带，与预测基本一致，说明蛋白获得了表达。且以GFP表达作为对照可以看出rDEV-E451-dk样品蛋白表达量最大。细胞培养上清样品中皆未检测到目的蛋白表达。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省农业科学院
<120> 鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因、重组鸭瘟病毒及构建方法和应用
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1503
<212> DNA
<213> 鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus）
<400> 1
ttcagctgtc tggggatgca gaaccgagac tttgttgagg gagtgaatgg tgttgagtgg 60
atcgatgtcg ttctggaagg aggctcatgt gtgaccatca cggcaaaaga caggccgacc 120
atagacgtca agatgatgaa catggaggct acggaattag cggttgtgag atcttactgc 180
tatgagccga aagtgtcgga cgtgacgaca gaatccagat gcccaaccat gggagaggct 240
cataatccca aggcaactta tgctgaatac atatgcaaaa aagattttgt ggacaggggt 300
tggggcaatg gctgtggctt gtttggaaag gggagcatac agacatgtgc caagtttgac 360
tgcacaaaga aagcagaagg caggattgtg cagaaggaaa acgtccagtt tgaagttgca 420
gttttcatac atggttccac ggaagcgagc acctaccaca attattcagc ccagcagtcg 480
ctgaaacatg ccgctagatt cgttataacg cccaaaagtc ccgtctacac cgctgagatg 540
gaggattatg gtaccgtcac actcgaatgt gaaccccgat ctggggttga catggggcaa 600
ttctatgtct ttaccatgaa cacaaaaagc tggcttgtta acagagactg gtttcatgat 660
ctcaacttac catggacagg gtcatcagcg gggacgtggc aaaacaaaga gtcattgata 720
gaatttgagg aggcccacgc caccaaacaa tcagtggtgg ctttggcatc acaagaagga 780
gccctccatg cagcattggc gggagctatt ccagtgaagt actctggaag caaattggaa 840
atgacctcag gtcatcttaa atgcagggtt aaaatgcagg gtttgaagct gaaaggaatg 900
acctacccga tgtgtagcaa tacattttcc ctagtgaaga atcctaccga cactgggcat 960
ggcactgtcg tggtggaatt gtcttatgca ggtaccgatg ggccctgtag agttcccata 1020
tccatgtcgg cagatctgaa tgacatgaca ccagttggac gcttgataac agtcaaccca 1080
tacgtgtcga cctcctccac gggtgccaag ataatggtgg aagtggaacc tccattcggg 1140
gattcattca tcttagtagg aagtggaaaa ggacagatca ggtaccagtg gcatagaagt 1200
gggagcacaa ttggaaaagc ttttacgtca acactcaaag gagcacaaag gatggttgct 1260
ttgggtgaca ctgcatggga ttttggctca gttgggggtg tactcacttc cattgggaaa 1320
ggcattcatc aggttttcgg ctcagcattt aaaagcttat ttggaggaat gtcatggatt 1380
actcaaggca tgttgggggc actgctattg tggatggggc tgaatgcaag ggacagatcc 1440
atttctatga cttttctagc cgtaggagga attttagtct tcctggcggt aaatgtcaat 1500
gcc 1503
<210> 2
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttagttgcc tggggatgca gaatagagac tttgtggaag gggtgaacgg cgtggaatgg 60
acagatgtgg tgctggaagg gggtagctgc gtgactatca ccgctaagga tcgccccacc 120
attgacgtga aaatgatgaa catggaggcc acagaactgg ctgttgtgag atcctactgc 180
tatgagccta aagtgagcga tgtgaccaca gagtccaggt gtcccactat gggagaagca 240
cacaacccta aagctaccta cgcagagtat atctgcaaga aagattttgt ggaccgcggc 300
tggggaaatg ggtgtggtct gtttggcaag ggaagcattc agacctgcgc aaaattcgac 360
tgtacaaaga aagccgaggg acggatcgtg cagaaggaga acgtgcagtt tgaagtggcc 420
gtgttcattc acgggtctac tgaagcttca acctaccata attatagtgc acagcagagc 480
ctgaagcacg ccgctagatt cgtgatcact ccaaaaagcc ccgtgtacac cgctgagatg 540
gaagattatg gcacagtgac tctggagtgc gaaccaagat caggagtgga catggggcag 600
ttctacgtgt ttacaatgaa cactaagagt tggctggtga atagggattg gtttcatgac 660
ctgaacctgc cctggacagg tagctccgct ggcacttggc agaataagga gtctctgatc 720
gaattcgagg aagctcacgc aacaaaacag tctgtggtgg ccctggcttc acaggagggt 780
gcactgcatg cagcactggc aggtgccatt cctgtgaagt acagtggcag caaactggaa 840
atgactagcg gacacctgaa gtgcagggtg aaaatgcagg gtctgaagct gaaaggcatg 900
acatacccta tgtgttccaa cactttttct ctggtgaaga atccaaccga tacagggcat 960
ggtacagtgg tggtggagct gtcttatgca ggaactgacg ggccttgtcg cgtgccaatc 1020
tccatgtctg ccgatctgaa cgacatgacc ccagtggggc ggctgatcac agtgaatccc 1080
tacgtgtcaa cctcttcaac aggggcaaag attatggtgg aggtggaacc ccctttcggc 1140
gatagtttta tcctggtggg cagcggaaaa gggcagattc gctatcagtg gcaccggtca 1200
ggaagtacca ttgggaaggc ctttactagc accctgaaag gcgcacagag aatggtggcc 1260
ctgggagata ctgcttggga cttcgggtcc gtgggcggag tgctgacctc tatcggaaag 1320
ggcattcatc aggtgttcgg ctcagctttt aaaagtctgt tcgggggtat gtcctggatc 1380
acacagggta tgctgggcgc cctgctgctg tggatgggac tgaatgctag agacaggagc 1440
atttccatga ctttcctggc agtgggaggt atcctggtgt ttctggcagt gaatgtgaac 1500
gca 1503
<210> 3
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttttcttgcc tggggatgca gaacagggac ttcgtggagg gtgtcaatgg cgtggaatgg 60
atcgatgtgg tcctggaggg cgggagctgt gtcacaatca ctgctaagga cagaccaacc 120
attgatgtga aaatgatgaa catggaggcc acagaactgg ctgtggtcag gtcctactgc 180
tacgagccta aggtctctga cgtgactacc gagagcagat gtccaactat gggcgaagcc 240
cacaacccta aagctaccta cgcagagtac atctgcaaga aagacttcgt ggatcgcggc 300
tgggggaatg gatgtggtct gtttggcaag gggagcattc agacctgcgc caaattcgat 360
tgtacaaaga aagctgaggg gcggatcgtc cagaaggaga acgtgcagtt tgaagtggcc 420
gtcttcattc atggatccac cgaagcatct acataccaca attacagcgc ccagcagtcc 480
ctgaagcacg cagccaggtt cgtcatcact ccaaaaagcc ctgtgtacac cgctgagatg 540
gaagactacg ggaccgtgac actggagtgc gaacctaggt ccggggtcga tatgggacag 600
ttctacgtgt ttactatgaa caccaagtct tggctggtga atagagactg gtttcacgat 660
ctgaacctgc catggacagg tagctccgct ggcacttggc agaataagga gagcctgatc 720
gaattcgagg aagcacatgc caccaaacag tccgtggtcg ctctggcatc tcaggaaggc 780
gcactgcacg ctgcactggc aggagctatt cccgtgaagt acagcggctc caaactggaa 840
atgacctccg ggcatctgaa gtgcagagtg aaaatgcagg ggctgaagct gaaaggaatg 900
acatacccaa tgtgttctaa cactttcagc ctggtgaaga atcctactga caccggacac 960
ggtacagtgg tcgtggagct gagctacgct gggactgatg gaccttgccg cgtgcccatc 1020
tctatgagcg cagacctgaa cgatatgacc cccgtggggc ggctgatcac agtcaatcca 1080
tacgtgtcca catctagcac tggcgcaaag attatggtgg aggtcgaacc cccattcggg 1140
gacagcttta tcctggtggg ctccgggaaa ggacagatta ggtaccagtg gcatagatcc 1200
gggtctacca tcggaaaggc ctttacaagc actctgaaag gggcacagag aatggtggca 1260
ctgggtgaca ctgcttggga tttcggctct gtcggaggtg tgctgaccag catcggcaag 1320
ggcattcacc aggtgttcgg ctccgctttt aaatctctgt tcggcggaat gagctggatc 1380
acccagggta tgctgggcgc tctgctgctg tggatggggc tgaacgcaag ggacagaagc 1440
atctccatga catttctggc cgtcggaggt attctggtgt tcctggcagt gaacgtcaat 1500
gcc 1503
<210> 4
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttttcttgcc tggggatgca gaacagggac ttcgtggagg gtgtcaatgg cgtggaatgg 60
atcgatgtgg tcctggaggg cgggagctgt gtcacaatca ctgctaagga cagaccaacc 120
attgatgtga aaatgatgaa catggaggcc acagaactgg ctgtggtcag gtcctactgc 180
tacgagccta aggtctctga cgtgactacc gagagcagat gtccaactat gggcgaagcc 240
cacaacccta aagctaccta cgcagagtac atctgcaaga aagacttcgt ggatcgcggc 300
tgggggaatg gatgtggtct gtttggcaag gggagcattc agacctgcgc caaattcgat 360
tgtacaaaga aagctgaggg gcggatcgtc cagaaggaga acgtgcagtt tgaagtggcc 420
gtcttcattc atggatccac cgaagcatct acataccaca attacagcgc ccagcagtcc 480
ctgaagcacg cagccaggtt cgtcatcact ccaaaaagcc ctgtgtacac cgctgagatg 540
gaagactacg ggaccgtgac actggagtgc gaacctaggt ccggggtcga tatgggacag 600
ttctacgtgt ttactatgaa caccaagtct tggctggtga atagagactg gtttcacgat 660
ctgaacctgc catggacagg tagctccgct ggcacttggc agaataagga gagcctgatc 720
gaattcgagg aagcacatgc caccaaacag tccgtggtcg ctctggcatc tcaggaaggc 780
gcactgcacg ctgcactggc aggagctatt cccgtgaagt acagcggctc caaactggaa 840
atgacctccg ggcatctgaa gtgcagagtg aaaatgcagg ggctgaagct gaaaggaatg 900
acatacccaa tgtgttctaa cactttcagc ctggtgaaga atcctactga caccggacac 960
ggtacagtgg tcgtggagct gagctacgct gggactgatg gaccttgccg cgtgcccatc 1020
tctatgagcg cagacctgaa cgatatgacc cccgtggggc ggctgatcac agtcaatcca 1080
tacgtgtcca catctagcac tggcgcaaag attatggtgg aggtcgaacc cccattcggg 1140
gacagcttta tcctggtggg ctccgggaaa ggacagatta ggtaccagtg gcatagatcc 1200
gggtctacca tcggaaaggc ctttacaagc actctgaaag gggcacagag aatggtggca 1260
ctgggtgaca ctgcttggga tttcggctct gtcggaggtg tgctgaccag catcggcaag 1320
ggcattcacc aggtgttcgg ctccgctttt aaa 1353
<210> 5
<211> 5073
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 960
agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1020
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1080
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1140
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1200
gaggattggg aagacaatag caggcatgcg ggtaatgcca gtgttacaac caattaacca 1260
attctgatta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat 1320
tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc 1380
agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa 1440
tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag 1500
tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa 1560
caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc 1620
gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag 1680
gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat 1740
caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg gtgagtaacc 1800
atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca 1860
gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt 1920
tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt 1980
gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta 2040
atcgcggcct cgagcaagac gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc cttgtattac 2100
tgtttatgta agcagacagt tttattgttc atgatgatat atttttatct tgtgcaatgt 2160
aacatcagag attttgagac acaacgtggc tttgttgaat aaatcgatta ccctgttatc 2220
cctacttatc gtcgtcatcc ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 2280
gcatggtggg gatgcggtgg gctctatggg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 2340
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 2400
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 2460
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 2520
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg 2580
actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat 2640
tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg 2700
atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt 2760
gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 2820
ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt 2880
ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 2940
aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 3000
tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 3060
cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 3120
ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 3180
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 3240
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 3300
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 3360
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 3420
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 3480
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 3540
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 3600
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 3660
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 3720
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 3780
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 3840
accaccgctg gtagcggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 3900
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 3960
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 4020
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 4080
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 4140
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 4200
gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 4260
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 4320
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 4380
gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 4440
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 4500
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 4560
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 4620
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 4680
tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 4740
attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 4800
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 4860
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 4920
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 4980
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 5040
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtc 5073
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgcagccac catgggattc agctgtctgg ggatgc 36
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcggccgctt aggcattgac atttaccgc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcggccgctt atttaaatgc tgagccgaaa ac 32
<210> 9
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aactgcagcc accatgggaa tgtggaaaac actcagaatg aaaggcaagc tcctgagtct 60
cctcctgctg gtgggagtaa tcaagactgc ccaatgccag ggcacacact tcagctgtct 120
ggggatgc 128
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<212> DNA
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<400> 10
ggtaccgcca ccatgggatt tagttgcctg gggatgcag 39
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 15
tactaattta agtgtgcagc ctggttaact gtattatgcg cggagcgatg tacgggccag 60
ata 63
<210> 16
<211> 66
<212> DNA
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<400> 16
tccgtagtct ggccggcagt atgttggtgt ttagtactcc aaacccatag agcccaccgc 60
atcccc 66
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctaccacaag cgtcatcaac ca 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tgtccattac caaatccgaa aa 22

Claims (8)

1.鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.一种重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因。
3.如权利要求2所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述基因组插入有Pcmv-E451-dk-BGH-pA表达框；其中E451-dk表示鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因组中gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子。
4.如权利要求2所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因插入在所述基因组的US7基因和US8基因之间。
5.一种重组鸭瘟病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Pcmv-E451-dk-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-E451-dk；
(2)将pDEV-E451-dk转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒，
其中，pDEV-EF1为携带鸭瘟病毒疫苗株全基因组的感染性细菌人工染色体克隆pDEV-vac中GFP基因的CMV启动子替换成EF1启动子；E451-dk表示鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述Pcmv-E451-dk-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1的方法为：
(1)将鸭坦布苏病毒E蛋白截短体基因E451-dk插入pEP-BGH-end，获得pEP-BGH-E451-dk；
(2)以pEP-BGH-E451-dk为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的引物，扩增获得目标片段；
(3)将所述目标片段转入pDEV-EF1/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanE451-dk；
(4)敲除pDEV-kanE451-dk中的kan抗性基因，获得pDEV-E451-dk。
7.如权利要求2～4任一所述重组鸭瘟病毒在制备动物疫苗中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述动物疫苗为鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联疫苗。
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坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备;李鑫;《中国优秀硕士学位论文全文数据库——农业科技辑》;20140430(第4期);第24页第1、3段 *

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