KR20070004699A - 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명자들은, SALPR과 결합하는 릴락신-3을 래트 뇌실 내에 투여하고, 투여 후의 섭식량, 체중, 지방량 등을 관찰함으로써, 릴락신-3이 유용한 섭식 항진 작용, 체중 증가 작용 및 비만 작용을 갖는 것을 발견하였다. 본 발명에 의해, 유용한 섭식 항진 작용, 체중 증가 작용 및 비만 작용을 갖는 폴리펩티드, 해당 폴리펩티드를 함유하는 질환 치료제, 해당 폴리펩티드의 수용체의 활성화 또는 억제화를 하는 화합물, 물질 또는 그의 염의 스크리닝 방법, 해당 스크리닝용 키트, 및 해당 폴리펩티드의 발현을 저해하는 물질 등을 포함하는 섭식 억제제, 비만 치료제, 당뇨병 치료제 등이 제공된다.
섭식, 릴락신-3, 비만, SALPR

Description

스크리닝 방법{SCREENING METHOD}
본 발명은, 유용한 섭식 항진 작용, 체중 증가 작용 및 비만 작용을 갖는 폴리펩티드, 해당 폴리펩티드를 함유하는 질환 치료제, 해당 폴리펩티드의 수용체의 활성화 또는 억제하는 화합물, 물질 또는 그의 염의 스크리닝 방법, 해당 스크리닝용 키트, 및 해당 폴리펩티드의 발현을 저해하는 물질 등을 함유하여 이루어지는 섭식 억제제, 비만 치료제 또는 당뇨병 치료제 등에 관한 것이다.
섭식은 동물이 살아가기 위해서 필수적인 행동이다. 비만은 포식 시대의 현대 사회에 있어서, 섭식량과 에너지 소비의 조절·밸런스가 무너진 결과로서 생긴 것이라고 생각되고 있다. 비만은 생활 습관병을 비롯한 각종 질환의 위험 인자이기도 하기 때문에, 사회적인 관심이 높아지고 있다. 식사 요법이나 운동 요법 등, 섭식량과 에너지 소비의 밸런스를 개선하는 기본적인 치료법은 있지만, 현상에서는 비만 환자·그 예비군은 증가하고 있다. 최근에는 말초 조직에서의 영향 흡수를 억제하는 약제나 중추신경계에 작용하여 섭식량을 감소시키는 약제도 개발되고 있는데, 비만 치료제로서 섭식량을 억제하는 유효하면서 안전한 약제의 개발은 요망되고 있다.
섭식 행동은 뇌중추 신경으로부터의 지령과, 말초 조직으로부터의 피드 백에 의해 중추 신경이 다시 지령을 보내는 순환으로 제어되고 있음이 계속 판명되고 있고, 그 주체인 뇌에서의 섭식 제어 기구에 초점을 맞춘 연구가 활발하게 행해지고 있다. 뇌의 특정 영역을 파괴한 동물의 연구나, 신경 펩티드나 신경 전달 물질을 이용한 기능 해석에 의해, 시상 하부 영역이 섭식 행동에 중요한 역할을 하고 있음을 알게 되었다. 또한, 시상 하부에는 많은 신경 전달 물질이나 신경 펩티드 및 이들에 대한 수용체(리셉터)가 발현하고 있고, 이들과 섭식 행동과의 관련이 나타나 있다. 예를 들면 섭식의 항진에는 시상 하부 궁상핵(arcuate nucleus)에 존재하는 뉴로펩티드 Y나 아그치 관련 펩티드 등이 관계되는 점, 또한 섭식의 억제에는 동소에 존재하는 멜라노코르틴(melanocortin)이나 시상 하부 실방핵(paraventricular nucleus)으로부터 방출되는 코르티코트로핀 방출 호르몬이나 사이로트로핀 방출 호르몬이 관계되어 있는 점이 보고되어 있다(비특허 문헌 1). 그러나, 섭식을 제어하는 복잡한 신경 네트워크에는 아직 불분명한 부분이 많고, 여전히 신규한 신경 전달 인자나 그 국재에 대한 새로운 지견이 얻어지고 있는 상황이다.
섭식 행동의 제어에 관계되는 신경 전달 물질이나 신경 펩티드 등의 생리 활성 물질은, 세포막에 존재하는 특이적인 리셉터를 통해 기능을 발휘한다. 이들 리셉터 중에서 세포막을 7회 관통하는 구조를 갖고, 세포 내에서 3량체 G 단백질과 공액하는 리셉터는 특히 G 단백질 공액형 수용체(GPCR)와 분류되어 있다. GPCR은 특이적인 리간드가 결합하였을 때에 세포 내에 시그널을 전달하고, 세포의 활성화나 억제화를 함으로써, 각종 장기·기관에서의 기능 발현에 중요한 역할을 담당하 고 있다. 그 때문에 GPCR을 활성화하는 아고니스트나 억제하는 안타고니스트라 불리는 물질은, 의약품으로서 사용되고 있다. GPCR로 분류되는 리셉터 중에서도 그 특이적인 리간드가 동정되지 않은 것이 수많이 알려져 있고, 그들은 오판 GPCR이라고 불리고 있다. 오판 GPCR은 새로운 치료약의 표적으로서의 잠재적 가능성을 가지고 있고, 생체 내의 리간드 동정이나 기능을 부활 또는 억제하는 물질의 연구가 진행되고 있다. 이와 같이 하여 동정된 리간드나 물질을 생체에 투여하여 리셉터와 그 리간드의 기능을 해명하는 것은, 의약품의 개발을 제공하는 데 있어서 매우 중요하다.
근년의 유전자 배열 정보의 충실에 의해, 기지의 단백질·펩티드의 배열을 기초로 그 상동성이나 법칙성을 도출하고, 미지의 펩티드나 단백질을 예측하여, GPCR의 새로운 리간드로서 동정하는 방법도 가능하게 되었다. 인슐린·릴락신(Insulin·Relaxin) 패밀리에 속하는 릴락신은 황체(corpus luteum)나 태반으로부터 생산되는 분비 펩티드이고, 임신의 유지와 출산에 관계되는 작용을 갖는 것이 이전부터 알려져 있었다. 그 이외의 작용으로서는, 예를 들면 릴락신-2의 래트 정맥 내 투여에 의한 섭수량의 항진이라고 하는 보고는 이루어져 있지만(비특허 문헌 2), 릴락신의 섭식 행동과의 관련에 대해서는 알려져 있지 않다. 릴락신을 코드하는 DNA의 염기 서열을 기초로 유전자 서열 데이터 베이스로부터 새로 동정된 DNA가 코드하는 단백질이, 릴락신-3(Relaxin-3)/INSL7이라고 명명된 폴리펩티드이다(특허 문헌 1). 발견된 릴락신-3은, 면역 세포계인 THP-1의 세포 내 사이클릭 AMP(cAMP)의 상승을 수반하여 세포를 활성화하는 것이 보고되었다(특허 문헌 2, 비특허 문헌 3). 그 후 릴락신-3은, 릴락신-2와 함께, GPCR인 LGR7에 결합하는 리간드의 하나인 것이 나타났다(비특허 문헌 4). LGR7은 뇌와 말초 조직에 발현하고 있고, 지금까지는 생식 기관의 발달이나 임신·출산에 관계되는 것이 시사되어 있지만, 섭식과의 관련에 대해서는 잘 모르고 있었다.
최근, 생체 내의 리간드가 미동정의 GPCR이었던, SALPR(GPCR135)로 명명되어 있는 리셉터나, GPR100(hGPCR11, GPCR142)이라고 불리는 리셉터의 리간드가 릴락신-3인 것이 보고되었다(비특허 문헌 5, 6, 특허 문헌 3). 또한, 특허 문헌 4∼7에도 이들 리셉터에 관련하는 기재가 있다. SALPR은 뇌에 국재하는 것이 알려져 있고(비특허 문헌 7), 특히 시상 하부의 실방핵과 시색상핵(supraoptic nucleus)에 존재하고 있는 것이 보고되었다(특허 문헌 3, 비특허 문헌 6). 한편, GPR100은 전신성으로 발현하고 있는 리셉터인 것이 보고되어 있지(비특허 문헌 8, 9)만, 그 기능에 대해서는 불명료한 상태이다.
한편, 릴락신-3은 뇌 내의 다리라고 불리는 영역에 존재하는 것이 보고되어 있고(비특허 문헌 6), 릴락신-3이 뇌 내 펩티드로서 중추신경계에 어떠한 기능을 발휘하고 있을 가능성은 고려되고 있었지만, 지금까지 릴락신-3이 섭식을 조절하는지의 여부에 대해서도, 릴락신-3이 체중 조절에 관여하는지의 여부에 대해서도 보고되어 있지 않았다. 또한, 릴락신-3이 비만과 관련하는지에 대해서도 알려져 있지 않았다.
특허 문헌 1:국제 공개 제01/068862호 팸플릿
특허 문헌 2:일본 특허 공개 2002-345468호 명세서
특허 문헌 3:국제 공개 2004/082598호 팸플릿
특허 문헌 4:국제 공개 제00/24891호 팸플릿
특허 문헌 5:국제 공개 제01/48189호 팸플릿
특허 문헌 6:국제 공개 제02/31111호 팸플릿
특허 문헌 7:국제 공개 제02/61087호 팸플릿
비특허 문헌 1:Spiegelman 등, Cell, 104, p.541-543, 2001
비특허 문헌 2:Sinnayah 등, Endocrinology, 140, p.5082-5086, 1999
비특허 문헌 3:Bathgate 등, J. Biol. Chem., 277, p.1148-1157, 2002
비특허 문헌 4:Sudo 등, J. Biol. Chem., 278, p.7855-7862, 2003
비특허 문헌 5:Takeda 등, FEBS Letter, 520, p.97-101, 2002
비특허 문헌 6:Liu 등, J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003
비특허 문헌 7:Matsumoto 등, Gene, 248, p.183-189, 2000
비특허 문헌 8:Liu 등, J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003
비특허 문헌 9:Boels 등, Br. J. Pharmacol., 140, p.932-938, 2003
<발명의 개시>
<발명이 해결하고자 하는 과제>
본 발명은, 유용한 섭식 항진 작용, 체중 증가 작용 및 비만 작용을 갖는 폴리펩티드, 해당 폴리펩티드를 함유하는 질환 치료제, 해당 폴리펩티드의 수용체의 활성화, 억제화를 하는 화합물, 물질 또는 그의 염의 스크리닝 방법, 해당 스크리닝용 키트, 및 해당 폴리펩티드의 발현을 저해하는 물질 등을 함유하여 이루어지는 섭식 억제제, 비만 치료제 또는 당뇨병 치료제 등에 관한 것이다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 릴락신-3을 래트 뇌실 내에 투여하고, 투여 후의 섭식량을 관찰함으로써, 릴락신-3이 섭식 항진 작용을 갖는 것을 발견하였다. 또한, 래트에게 릴락신-3을 단회 투여한 후에, 해당 래트로부터 채취한 혈액을 측정한 결과, 체지방 증가의 지표로서 알려지는 렙틴 농도가 혈액 중에서 상승하고 있는 것을 발견하였다. 또한, 래트 뇌실 내에 릴락신-3의 지속 투여를 행한 결과, 릴락신-3 투여군에서는 대조군의 비히클 투여군에 비교하여 유의적인 섭식량 증가와 체중 증가 작용이 인정되었다. 릴락신-3의 지속 투여에 의해 양군에서 운동량에 차는 없었다. 이러한 점으로부터, 릴락신-3은 섭식 항진 작용과 함께 체중 증가 작용도 갖는 것이 비로소 분명해졌다. 또한, 릴릭신-3을 투여하여 체중이 증가한 래트에서는 지방량의 증가 및, 체지방 함량과 상관하는 혈중 렙틴 농도가 상승하였다. 또한, 당뇨병과 관련한 인슐린 농도도 상승하였다. 이상으로부터, 릴락신-3은 섭식 항진 작용, 체중 증가 작용, 비만 작용을 갖는 폴리펩티드라고 생각된다. 본 발명은 이들 지견에 기초하여 구성된 것이다.
즉, 본 발명은 하기 나열된 것들에 관한 것이다.
(1) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드(modified polypeptide) 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 섭식 항진제.
(2) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 체중 증가제.
(3) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 지방량 증가제.
(4) (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(5) (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염 및 피험 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(6) 상기 (5)에 있어서,
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(7) 상기 (4) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 릴락신-3 수용체가, SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
(8) 상기 (7)에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
(9) (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
(10) (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
(11) 상기 (10)에 있어서,
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
(12) 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 릴락신-3 수용체가, SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
(13) 상기 (12)에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
(14) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 체중 증가를 필요로 하는 질환의 치료제.
(15) 상기 (14)에 있어서, 질환이 거식증 또는 악액질인 치료제.
(16) (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중 증가 작용을 갖는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(17) (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(18) 상기 (17)에 있어서,
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(19) 상기 (16) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
(20) 상기 (19)에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
(21) (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중 증가 작용을 갖는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
(22) (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
(23) 상기 (22)에 있어서,
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
(24) 상기 (21) 내지 (23) 중 어느 하나에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
(25) 상기 (24)에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
(26) (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(27) (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(28) 상기 (27)에 있어서,
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(29) 상기 (26) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
(30) 상기 (29)에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
(31) (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
(32) (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
(33) 상기 (32)에 있어서,
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정,
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
(34) 상기 (31) 내지 (33) 중 어느 하나에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
(35) 상기 (34)에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
(36) SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 섭식 억제제.
(37) 상기 (36)에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 상기 (7) 또는 (8)에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
(38) SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 체중 감소제.
(39) 상기 (38)에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 상기 (19) 또는 (20)에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
(40) SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 지방량 감소제.
(41) 상기 (41)에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 상기 (29) 또는 (30)에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
(42) SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 비만 치료제.
(43) 상기 (42)에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 상기 (19), (20), (29) 또는 (30) 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
(44) SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 당뇨병 치료제.
(45) 상기 (44)에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 상기 (19), (20), (29) 또는 (30) 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
(46) 상기 (36) 내지 (45) 중 어느 하나에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제제.
(47) 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물을 인간 또는 인간 이외의 생물에 투여하고, 투여 후의 섭식량을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(48) 상기 (47)에 있어서, 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물이 상기 (4) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 화합물인 방법.
(49) 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물을 인간 또는 인간 이외의 생물에 투여하고, 투여 후의 체중을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(50) 상기 (49)에 있어서, 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물이 상기 (16) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 화합물인 방법.
(51) 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물을 인간 또는 인간 이외의 생물에 투여하고, 투여 후의 비만의 지표를 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
(52) 상기 (51)에 있어서, 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물이 상기 (26) 내지 (30) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 화합물인 방법.
도 1은 pBabeCL(SALPR)IH의 구축도를 나타낸다.
도 2A는 CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)의 구축도를 나타낸다.
도 2B는 pBabeCLX의 구축도를 나타낸다.
도 2C는 pBabeCLcre4vPdNN의 구축도를 나타낸다.
도 3은 SALPR을 발현시킨 SE302 세포에서의 폴스콜린(forskolin) 첨가에 의해 상승한 전사 활성의 릴락신-3에 의한 특이적인 용량 의존적 억제를 나타낸다. 흑 사각은 릴락신-3을 첨가한 경우를 나타낸다. 백 사각은 인슐린을 첨가한 경우를 나타낸다. 횡축의 숫자는 첨가한 각 리간드의 최종 농도(nmol/L)를 나타낸다. 종축은 폴스콜린 1μmol/L를 첨가한 세포 상청의 알칼리포스파타아제의 활성을 100, 폴스콜린을 첨가하지 않은 세포 상청의 활성을 0으로 하여 산출한 각 활성의 비율을 나타낸다. 각 점은 평균값(N=3)과 표준편차를 나타낸다.
도 4는 SALPR-SE302 세포를 이용한 릴락신-3 길항 화합물의 평가(스크리닝)를 나타내는 도면이다. 도 4A는 SALPR-SE302 세포를 사용하고, 도 4B는 SE302 세포를 사용하였다. 도면 중, FK(-)는 폴스콜린 무처리군, FK(+)는 3μM 폴스콜린 처리군, FK(+)&RLX-3은 폴스콜린과 3nM 릴락신-3의 처리군, FK(+)&RLX-3&화합물 1은 폴스콜린과 릴락신-3과 화합물 1을 공존시킨 처리군을 나타낸다.
도 5는 정상 래트 뇌실 내로의 릴락신-3의 단회 투여에 의한 섭식량으로의 작용을 나타낸다. 백 사각은 비히클 투여군(대조군)을, 흑 사각은 릴락신-3 투여군을 나타낸다. 횡축은 각 군의 1마리당의 섭이량(g)의 평균값과 표준편차를 나타낸다.
도 6은 정상 래트 뇌실(intracerebroventricular) 내로의 릴락신-3의 단회 투여에 의한 혈중 렙틴 농도로의 작용을 나타낸다. 백 사각은 비히클 투여군(대조군)을, 흑 사각은 릴락신-3 투여군을 나타낸다. 종축은 각 군의 혈중의 렙틴 농도 (ng/mL)의 평균값과 표준편차를 나타낸다.
도 7은 정상 래트의 뇌실 내에 지속 투여한 릴락신-3에 의한 체중 증가량으로의 작용을 나타낸다. 백 사각은 비히클 투여군(대조군)을, 흑 사각은 릴락신-3 투여군을 나타낸다. 종축은 각 군의 1마리당의 체중 증가량(g)의 평균값과 표준편차를 나타낸다.
도 8은 정상 래트의 뇌실 내에 지속 투여한 릴락신-3에 의한 섭이량으로의 작용을 나타낸다. 백 사각은 비히클 투여군(대조군)을, 흑 사각은 릴락신-3 투여군을 나타낸다. 종축은 각 군의 1마리당의 체중 증가량(g)의 평균값과 표준편차를 나타낸다.
도 9는 정상 래트의 뇌실 내에 지속 투여한 릴락신-3에 의한 정소 주위 지방 중량으로의 작용을 나타낸다. 백 사각은 비히클 투여군(대조군)을, 흑 사각은 릴락신-3 투여군을 나타낸다. 종축은 각 군의 1마리당의 지방 중량(g)의 평균값과 표준편차를 나타낸다.
도 10은 정상 래트의 뇌실 내에 지속 투여한 릴락신-3에 의한 혈중 호르몬의 변동을 나타낸다. 도 10A는 혈중 렙틴 농도로의 작용을 나타낸다. 백 사각은 비히클 투여군(대조군)을, 흑 사각은 릴락신-3 투여군을 나타낸다. 종축은 각 군의 1마리당의 혈중 렙틴 농도(ng/ml)의 평균값과 표준편차를 나타낸다. 도 10B는 혈중 인슐린 농도로의 작용을 나타낸다. 백 사각은 비히클 투여군을, 흑 사각은 릴락신-3 투여군을 나타낸다. 종축은 각 군의 1마리당의 혈중 인슐린 농도(ng/ml)의 평균값과 표준편차를 나타낸다.
도 11은 뇌실 내에 릴락신-3을 지속 투여한 후, 자발 운동량을 측정하면서 사육한 래트의 체중 증가량의 변화를 나타낸다. 백 사각은 비히클 투여군(대조군)을, 흑 사각은 릴락신-3 투여군을 나타낸다. 종축은 각 군의 1마리당의 체중 증가량(g)의 평균값과 표준편차를 나타낸다. 도면 중의 백 삼각은, 명기의 운동량 측정일, 흑 삼각은 암기의 운동량 측정일을 나타낸다.
도 12는 뇌실 내에 릴락신-3을 지속 투여한 래트의 자발 운동량에 대한 작용을 나타낸다. 백 사각은 비히클 투여군(대조군)을, 흑 사각은 릴락신-3 투여군을 나타낸다. 종축은 각 군의 1마리당의 전체 활동량(카운트)의 평균값과 표준편차를 나타낸다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
릴락신 -3( relaxin -3)
본 발명에서 사용하는 「릴락신-3」이란, 유전자 서열의 데이터 베이스로부터 새롭게 동정된 릴락신-3(Relaxin-3)(INSL7(진뱅크 등록번호(GeneBank accession number) NM_080864)이라고도 칭함)이라고 불리고 있는 폴리펩티드이고(J. Biol. Chem. 277, 1148-1157(2002)), (ⅰ) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 릴락신-3에는, (ⅱ) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드, (ⅲ) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명에 사용하는 릴락신-3으로서는, 「서열 번호 2로 표시되는 아미 노산 서열로 이루어진 폴리펩티드」가 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩티드에는 폴리펩티드의 염이 포함되고, 나아가서는 당쇄를 갖지 않는 것과 당쇄를 갖는 것의 양쪽이 포함된다.
여기서, 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드(이하, 「개질 폴리펩티드」라고 칭함)란, 그 아미노산 서열이, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열이며, 또한 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성[예를 들면 릴락신-3 수용체와의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 칼슘의 유리, 아데닐산시클라아제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도 활성, 아라키돈산 유리 등), 섭식 항진 작용, 체중 증가 작용 또는 비만 작용]을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에서 「치환」이란, 펩티드의 활성을 실질적으로 개변하지 않도록, 1 또는 복수개의 아미노산 잔기를, 별도의 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 예를 들면, 임의의 소수성 잔기를 별도의 소수성 잔기에 의해 치환하는 경우, 임의의 극성 잔기를 동일한 전하를 갖는 별도의 극성 잔기에 의해 치환하는 경우 등을 들 수 있다. 이와 같은 치환을 행할 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산은, 아미노산마다 해당 기술 분야에서 공지이다. 구체예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산으로서는, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 트립토 판, 페닐알라닌, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성(중성) 아미노산으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 들 수 있다. 양 전하를 갖는 (염기성) 아미노산으로서는, 아르기닌, 히스티딘, 리신 등을 들 수 있다. 또한, 부 전하를 갖는 (산성) 아미노산으로서는, 아스파르트산, 글루타민산 등을 들 수 있다.
여기서, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어 있어도 좋은 아미노산의 수는, 예를 들면 1∼30개, 바람직하게는 1∼20개, 더 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개, 특히 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 상기 개질 폴리펩티드에는, 개질 폴리펩티드의 염이 포함되고, 나아가서는 당쇄를 갖지 않는 것과 당쇄를 갖는 것의 양쪽이 포함된다. 따라서, 이들 조건을 만족하는 한, 상기 개질 폴리펩티드의 기원은, 인간에 한정되지 않는다. 예를 들면 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유동물(예를 들면 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등] 유래의 릴락신-3 또는 그 변이체가 포함된다.
전술한 상동 폴리펩티드란, 릴락신-3의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 릴락신-3에 관하여, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열이며, 또한 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3 수용체와의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 섭식 항진 작용, 체중 증가 작용 또는 비만 작용)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 본 명세서에서, 「상동성」의 수치는 모두, 당업자에게 공지의 상동성 검색 프로그램을 이용하여 산출되는 수치이면 되고, 예를 들면 전미 바이오테크놀로지 정보 센터(NCBI)의 상동성 알고리즘 BLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 이용함으로써 산출할 수 있다. 또한, 상기 상동 폴리펩티드에는, 상동 폴리펩티드의 염이 포함되고, 나아가서는 당쇄를 갖지 않는 것과 당쇄를 갖는 것의 양쪽이 포함된다. 따라서, 이들 조건을 만족시키는 한, 상기 상동 폴리펩티드의 기원은, 인간에 한정되지 않는다. 예를 들면 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유동물(예를 들면 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등] 유래의 릴락신-3 또는 그 변이체가 포함된다.
또한, 본원에서 사용된 용어 「변이체(variation)」란 동일 종 내의 동일 폴리펩티드에 보이는 개체 차, 또는 다른 종 간의 상동 폴리펩티드에 보이는 차이를 의미한다.
이들 본 발명에 사용하는 릴락신-3(즉, 릴락신-3, 개질 폴리펩티드, 상동 폴리펩티드)은 여러 가지의 공지의 방법, 예를 들면 유전자 공학적 방법, 합성법 등에 의해 얻을 수 있다. 구체적으로는, 유전자 공학적 방법의 경우, 릴락신-3을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주 세포에 도입하고, 얻어진 형질 전환체로부터 발현 가능한 조건 하에서 배양하고, 발현 단백질의 분리 및 정제에 일반적으로 이용되는 방법에 의해, 그 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 분리 및 정제함으로 써 조제할 수 있다. 또한, 합성법의 경우는, 액상법, 고상법 등 통상의 방법에 따라 합성하는 것이 가능하고, 통상적으로 자동 합성기를 이용할 수 있다. 화학적으로 개질된 화합물의 합성은 통상적인 방법에 의해 행할 수 있다. 또한, 사용하는 폴리펩티드는 서열 번호 2의 전장 및 일부이어도 되고, 시스테인 간의 가교나, N 말단 환상 글루타민화, C 말단 아미드화 등, 분비 단백질의 프로세싱을 받은 형태의 폴리펩티드이어도 된다.
릴락신 -3을 코드하는 폴리뉴클레오티드
본 발명에 사용하는 릴락신-3을 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명에 사용하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서의 「폴리뉴클레오티드」에는 DNA 및 RNA의 양쪽이 포함된다. 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드에는, 구체적으로는 하기의 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 들 수 있다.
(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(b) 「서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 「서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기한 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 「서열 번호 2로 표시되는 염기 서열의 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 개소에서, 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기한 릴락신 -3과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및
(e) 「서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기한 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 개소에서, 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기한 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다. 여기서, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어도 좋은 아미노산의 수는, 예를 들면 1∼30개, 바람직하게는 1∼20개, 더 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개, 특히 바람직하게는 1∼2개이다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기한 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다.
본 명세서에서, 스트린젠트한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드란, 구체적으로는, FASTA, BLAST, Smith-Waterman[Meth. Enzym, 164, 765(1988)] 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해, 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 이용하여 계산하였 을 때, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한, 「스트린젠트한 조건 하」란, 당업자가 통상 사용할 수 있는 하이브리다이제이션 완충액 중에서, 온도가 40℃∼70℃, 바람직하게는 60℃∼65℃ 등에서 반응을 행하고, 염 농도가 15∼300mmol/L, 바람직하게는 15∼60mmol/L 등의 세정액 중에서 세정하는 방법에 따라서 행할 수 있다. 온도, 염 농도는 사용하는 프로브의 길이에 부합하여 적절하게 조정하는 것이 가능하다.
본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 천연 유래의 것일 수도 있고, 또는 생합성한 것일 수도 있다. 나아가서는, 천연 유래의 것의 일부를 이용하여 합성을 행한 것일 수도 있다. 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드의 전형적인 취득 방법으로서는, 예를 들면 시판의 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터, 유전자 공학의 분야에서 관용되고 있는 방법, 예를 들면 부분 아미노산 서열(예를 들면 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열)의 정보를 기초로 하여 작성한 적당한 DNA 프로브를 이용하여 스크리닝을 행하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드로서는, 「서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드」가 바람직하다. 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열은, 1번째∼3번째의 ATG에서 시작되고, 427번째∼429번째의 TAG에서 종료하는 오픈 리딩 프레임을 갖는다.
릴락신 -3을 함유하는 의약 조성물
본 발명에 사용하는 릴락신-3은, 섭식 항진제로서 식욕 부진이나 섭식량이 저하한 영양 장해 등의 치료, 체중 증가제, 지방량 증가제로서 체중 증가를 필요로 하는 질환의 치료, 비만 조절에서의 어떠한 이상에 기인하는 질환의 치료, 및 릴락신-3 또는 릴락신-3을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 이상 등에 기인하는 질환의 치료의 의약으로서 이용할 수 있다. 또한, 각종 질환의 발증 또는 각종 질환의 치료(예를 들면 술중, 술후)에 수반하여 감소한 섭식(또는 식욕) 및/또는 체중의 회복을 목적으로 하는 치료의 의약으로서 이용할 수도 있다. 상기 각종 질환은, 예를 들면 소화관의 운동 또는 기능에 관한 질환(예를 들면 설사, 변비, 기능성 변비증, 과민성 장증후군, 소환관 검사시 또는 수술 전후에서의 장관 내용물 배제를 위한 배변 촉진 등), 면역 기능 조절에 관한 질환(예를 들면 만성 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 신장 질환, 강피증, 아토피성 피부염, 기관지 천식, 다발성 경화증, 류머티즘성 간질성 폐렴, 사르코이도시스, 크론병, 염증성 대장염, 간경변, 만성 간염, 극증 간염, 뇌척수염, 중증 근무력증 등), 섭식 장해, 거식증, AIDS, 암, 또는 악액질 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 거식증, 악액질을 들 수 있다.
해당 폴리펩티드 또는 그의 염을 단독으로 이용하는 것도 가능하지만, 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 배합하여 의약품 조성물로서 이용할 수도 있다.
본원 명세서에서의 「염」이란, 본 발명에 관한 화합물과 염을 형성하고, 또한 약학적으로 허용될 수 있는 염이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 할로겐화수소산염(예를 들면 플루오르화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화 수소산염 등), 무기산염(예를 들면 황산염, 질산염, 과염소산염, 인산염, 탄산염, 중탄산염 등) 유기 카르복실산염(예를 들면 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 말레산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 시트르산염 등), 유기 술폰산염(예를 들면 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염, 캄파술폰산염 등), 아미노산염(예를 들면 아스파르트산염, 글루타민산염 등), 사급 아민염, 알칼리 금속염(예를 들면 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리토류금속염(마그네슘염, 칼슘염 등) 등을 들 수 있고, 해당 「약학적으로 허용될 수 있는 염」으로서, 더 바람직하게는 염산염, 옥살산염 등이다.
이 때의 유효 성분의 담체에 대한 비율은, 1∼90중량%의 사이에서 변동될 수 있다. 또한, 이러한 약제는, 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유동물(예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에, 여러 가지의 형태, 경구 또는 비경구(예를 들면 정맥 주사, 근육 주사, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여) 중 어느 하나의 투여 경로로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 릴락신-3을 함유하는 의약 조성물은, 투여 경로에 부합하여 적당한 제형으로 되고, 구체적으로는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 또는 시럽제 등에 의한 경구제, 또는 주사제, 점적제, 리포솜제, 좌약제 등에 의한 비경구제를 들 수 있다. 이들 제제는 통상 이용되고 있는 부형제, 증량제, 결합제, 습윤화제, 붕괴제, 표면 활성화제, 활택제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해 보조제, 방부제, 교미 교취제, 무통화제, 안정화제 등을 이용하여 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 사용 가능한 무독성의 상기 첨가제로서는, 예를 들 면 젖당, 과당, 포도당, 전분, 젤라틴, 스테아르산마그네슘, 메틸셀룰로오스, 또는 그의 염, 에탄올, 시트르산, 염화나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다.
이들의 투여 형태로서는, 또한, 필요한 투여량 범위는, 폴리펩티드의 선택, 투여 대상, 투여 경로, 제제의 성질, 환자의 상태, 그리고 의사의 판단에 좌우된다. 그러나, 적당한 투여량은 환자의 체중 1㎏당 예를 들면 약 0.1∼500㎍, 바람직하게는 약 0.1∼100㎍, 더 바람직하게는 1∼50㎍ 정도를 투여하는 것이 바람직한 범위이다. 투여 경로의 효율이 서로 다른 것을 고려하면, 필요로 되는 투여량은 광범위하게 변동하는 것이 예측된다. 예를 들면 경구 투여는 정맥 주사에 의한 투여보다 높은 투여량을 필요로 한다고 예상된다. 이러한 투여량 레벨의 변동은, 당업계에서 잘 이해되고 있는 바와 같은, 표준적 경험적인 최적화 수순을 이용하여 조정할 수 있다.
릴락신 -3 수용체를 이용한 섭식 조절에 관한 화합물의 스크리닝 방법
본 발명에 사용하는 릴락신-3에 대한 수용체로서는, 여러 가지의 수용체 중, 본 발명에 사용하는 릴락신-3과 결합 활성을 갖고, 릴락신-3 수용체 발현 세포의 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 칼슘의 유리, 아데닐산시클라아제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도 활성, 아라키돈산 유리 등)을 갖는 것을 사용할 수 있다.
구체적으로는, 릴락신-3 수용체로서, 보고되어 있는 공지의 수용체, 예를 들면 LGR7(진뱅크 등록번호 NM_021634), SALPR(진뱅크 등록번호 NM_016568)(GPCR135 라고도 칭함) 또는 GPR100(진뱅크 등록번호 AB_083593)(hGPCR11, GPCR142라고도 칭함) 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 이들 수용체의 부분 폴리펩티드로서 후술하는 스크리닝 방법에 사용 가능하다면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 릴락신-3에 대한 결합능을 갖는 부분 폴리펩티드, 세포막외 영역에 상당하는 아미노산 서열을 포함하는 부분 폴리펩티드 등도 사용할 수도 있다.
이하, 본 명세서에서는, 본 발명의 바람직한 일례로서, SALPR을 사용하는 스크리닝 방법에 대하여 본 발명의 내용을 상세하게 설명한다. 즉, 본 발명은, SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드에 결합하고, 섭식 조절(섭식을 촉진 또는 억제함)에 관한 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 또한, SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드에 피험 물질을 작용시키고, 세포 자극 활성을 측정함으로써, 해당 피험 물질에 섭식을 촉진 또는 억제하는 작용을 갖는지의 여부를 결정할 수 있다.
여기서, 본 발명에 사용하는 SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드는, 여러 가지의 공지의 방법에 의해 얻을 수 있고, 예를 들면 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드(진뱅크 등록번호 NM_016568)를 이용하여 공지의 유전자 공학적 수법에 의해 조제할 수 있다. 또한 다른 양태로서, 공지의 폴리펩티드의 합성법에 의해 얻을 수 있고, 예를 들면 액상법, 고상법 등 통상의 방법에 따라서 합성하는 것이 가능하고, 통상, 자동 합성기를 이용할 수 있다. 또한, 다른 양태에 따르면, SALPR의 부분 폴리펩티드는, SALPR을 적당한 단백질 분해 효소로 절단함으로써 조제할 수 있다.
본 발명에 사용하는 SALPR을 코드하는 폴리펩티드는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드, 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 70% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열이며, 또한 SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 또는 섭식 조절 작용)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
여기서, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드란, 그 아미노산 서열이, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열이며, 또한 SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 또는 섭식 조절 작용)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
또한, SALPR의 부분 폴리펩티드도, SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 또는 섭식 조절 작용)을 갖는 한, 사용할 수 있다.
이하, 유전자 공학적 수법에 대하여, 더 구체적으로는 SALPR을 사용하는 경우에 대하여 상세하게 설명하는데, 그 부분 폴리펩티드에 대해서도, 후술하는 스크리닝 방법에 사용 가능하다면 특별히 한정되지 않는다.
SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주 세포에 도입하고, 얻어진 형질 전환체로부터 발현 가능한 조건 하에서 배양하고, 발현 단백질의 분리 및 정제에 일반적으로 이용되는 방법에 의해, 그 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 분리 및 정제함으로써 조제할 수 있다. 상기한 분리 및 정제 방법으로서는, 예를 들면 황안염석, 이온 교환 셀룰로오스를 이용하는 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 분자체 겔을 이용하는 분자체 컬럼 크로마토그래피, 프로테인 A 결합 다당류를 이용하는 친화성 컬럼 크로마토그래피, 투석, 또는 동결 건조 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용하는 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명에 사용하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서의 용어 「폴리뉴클레오티드」에는, DNA 및 RNA의 양쪽이 포함된다. 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드에는, 구체적으로는 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 들 수 있다.
(a) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드
(b) 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 개소에서, 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및
(e) 「서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 서열 번호 3으로 표시되는 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SALPR을 코드한다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 개소에서, 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다. 여기서, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어도 좋은 아미노산의 수는, 예를 들면 1∼30개, 바람직하게는 1∼20개, 더 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개, 특히 바람직하게는 1∼2개이다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 하나 의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다.
상기 형질 전환에 사용되는 플라스미드는, 상기한 바와 같은 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 사용하는 숙주 세포에 부합하여 적절히 선택한 공지의 발현 벡터에, 해당 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 얻어지는 플라스미드를 들 수 있다.
또한, 상기 형질 전환체도, 상기한 바와 같은 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 해당 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 염색체에 도입된 형질 전환체(transformant)일 수도 있고, 또는, 해당 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드의 형태로 함유하는 형질 전환체일 수도 있고, 또는, SALPR을 발현하고 있지 않은 형질 전환체일 수도 있다. 해당 형질 전환체는, 예를 들면 상기 플라스미드에 의해, 또는, 상기 폴리뉴클레오티드 그 자체에 의해, 원하는 숙주 세포를 형질 전환함으로써 얻을 수 있다.
상기 숙주 세포로서는, 예를 들면 통상 사용되는 공지의 미생물, 예를 들면 대장균(예를 들면 Escherichia coli JM109주) 또는 효모(예를 들면 Saccharomyces cerevisiae W303주), 또는 공지의 배양 세포, 예를 들면 동물 세포(예를 들면 CHO 세포, HEK-293 세포, 또는 COS 세포) 또는 곤충 세포(예를 들면 BmN4 세포)를 들 수 있다.
또한, 공지의 상기 발현 벡터로서는, 예를 들면 대장균에 대해서는, pUC, pTV, pGEX, pKK, 또는 pTrcHis를; 효모에 대해서는, pEMBLY 또는 pYES2를; CHO 세포, HEK-293 세포 및 COS 세포에 대해서는, pcDNA3, pMAMneo 또는 pBabe Puro를; BmN4 세포에 대해서는, 누에 핵다각체 바이러스(BmNPV)의 폴리헤드린 프로모터를 갖는 벡터(예를 들면 pBK283)를 들 수 있다.
SALPR을 함유하는 세포는, SALPR을 세포막 표면에 발현하고 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들면 상기 형질 전환체(즉, SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 형질 전환된 세포)를, SALPR의 발현이 가능한 조건 하에서 배양함으로써 얻을 수도 있고, 또는, 적당한 세포에, SALPR을 코드하는 RAN를 주입하고, SALPR의 발현이 가능한 조건 하에서 배양함으로써 얻을 수도 있다.
또한, SALPR을 함유하는 본 발명에 사용하는 세포막 분획은, 예를 들면 본 발명에 따른 SALPR을 발현하는 세포를 파쇄한 후, 세포막이 많이 포함되는 분획을 분리함으로써 얻을 수 있다. 세포의 파쇄 방법으로서는, 예를 들면 호모지나이저(예를 들면 포터-엘베하임(Potter-Elvehiem)형 호모지나이저)로 세포를 눌러 찌부러뜨리는 방법, 워링 블렌더 또는 폴리트론(Kinematica사 제조)에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 또는, 프렌치 프레스 등으로 가압하면서 가는 노즐로부터 세포를 분출시키는 것에 의한 파쇄 등을 들 수 있다. 또한, 세포막의 분획 방법으로서는, 예를 들면 원심력에 의한 분획법, 예를 들면 분획 원심 분리법 또는 밀도 구배 원심 분리법을 들 수 있다.
SALPR을 통한, 본 발명에 따른 섭식을 촉진 또는 억제하는 화합물의 스크리닝 방법에서는, SALPR 또는 상기 세포막 분획(즉, SALPR을 함유하는 세포막 분획), 또는 상기 세포(즉, SALPR을 함유하는 세포)를 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 스크리닝 세포에서는, 피험 물질이 SALPR에 특이적으로 결합하는지의 여부를 조사하는 방법과, SALPR에 피험 물질이 결합함으로써 발생하는 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 칼슘의 유리, 아데닐산시클라아제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도 활성, 아라키돈산 유리 등)을 조사하는 방법을 들 수 있고, 이들을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에서는, 예를 들면 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포와, 피험 물질을 접촉시키고, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포와, 피험 물질이 결합하는지의 여부를 분석함으로써, SALPR을 통한 섭식을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하지 않고 화합물을 스크리닝할 수 있다.
구체적으로는, 피험 물질 비존재 하 및 피험 물질 존재 하의 각 조건 하에서, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포와, 표지한 천연의 리간드(즉, 릴락신-3)를 접촉시키고, 상기 조건 하에서의 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 통한 상기 천연 리간드의 특이적 결합량을 비교함으로써, SALPR을 통한 섭식을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하지 않고 화합물을 스크리닝할 수 있다. 즉, 상기 피험 물질이, SALPR을 통한 섭식을 촉진 또는 억제하는 능력을 갖는 경우에는, 피험 물질 비존재 하에서의 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 통한 천연 리간드의 특이적 결합량에 대하여, 피험 물질 존재 하에서의 상기 특이적 결합량이 저하한다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에서, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 통한 상기 천연 리간드의 특이적 결합량을 비교하는 경우에는, 상기 천연 리간드로서, 표지한 천연 리간드를 이용할 수 있다. 상기 지표로서는, 예를 들면, 방사성 동위 원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등이 이용된다. 방사성 동위 원소로서는, 예를 들면, [3H], [14C], [125I], [35S] 등을 이용할 수 있다. 상기 효소로서는, 예를 들면 β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제 등을 이용할 수 있다. 형광 물질로서는, 예를 들면 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), BODIPY 등을 이용할 수 있다. 발광 물질로서는 루시페린, 루시게닌 등을 이용할 수 있다. 경우에 따라서는, 천연 리간드와 표지 물질을 결합시키기 위해서 비오틴-아비딘의 계를 이용할 수도 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 스크리닝 방법에서, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포에 결합하여, 이들과 천연 리간드의 결합을 저해하는 화합물을, SALPR을 통한 섭식을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하지 않고 스크리닝할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에서의 다른 양태에서는, 피험 물질 비존재 하 및 피험 물질 존재 하의 각 조건 하에서, 상기 세포와 표지화한 천연의 리간드(즉, 릴락신-3)를 접촉시키고, 상기 각 조건 하에서의 상기 세포를 통한 상기 천연 리간 드의 특이적 결합량을 비교하고, 또한, 상기 조건 하에서의 상기 천연 리간드의 특정의 세포 자극 활성을 비교함으로써, SALPR을 통한 섭식을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다.
상기 양태에서는, 상기 세포에 결합하고, 상기 세포에 포함되는 수용체를 통해 세포 자극 활성을 갖는 피험 물질을, SALPR을 통한 섭식을 촉진하는 화합물로서 선택할 수 있다.
한편, 상기 양태에서, 상기 세포와 천연 리간드의 결합을 저해하지만, 세포 자극 활성을 갖지 않는 피험 물질을, SALPR을 통한 섭식을 억제하는 화합물로서 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법은, 세포 자극 활성으로서, 예를 들면 아데닐산시클라아제의 활성 억제를 이용함으로써 실시할 수 있다.
이 양태의 스크리닝 방법에서는, 예를 들면 아데닐산시클라아제의 활성화에 의해 세포 내에 생성하는 cAMP를 공지의 수법으로 측정하면 되고, SALPR을 통한 섭식을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이 양태는, SALPR에 천연 리간드를 결합함으로써 발생하는 세포 내 시그널 전달, 즉, SALPR의 세포 자극 활성의 하나인 아데닐산시클라아제의 활성 억제를 이용하는 것이다. 구체적으로는, SALPR에 천연 리간드가 결합하면, SALPR에 공액하고 있는 G 단백질 패밀리의 하나인 Gi 패밀리가, 아데닐산시클라아제를 억제하고, 세포 내에 생성되는 사이클릭 AMP(cAMP:아데닐산시클라아제에 의해 ATP로부터 생성됨) 양을 감소시키는 것에 의한다.
예를 들면 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는, SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)한 포유동물 유래 세포(예를 들면 HEK-293 세포 또는 CHO 세포)에 아데닐산시클라아제의 활성화제[예를 들면 폴스콜린(FSK)]를 첨가하면, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승한다.
또한, 아데닐산시클라아제 활성화제를 첨가할 때에, SALPR의 천연 리간드를 첨가하면, 아데닐산시클라아제 활성화제에 기인하는 상기 아데닐산시클라아제 활성 촉진에 외에 추가로, 상기 천연 리간드가 본 발명에 따른 SALPR에 작용하여 발생하는 아데닐산시클라아제의 활성 억제도 일어나기 때문에, 결과적으로, 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독 투여한 경우에 비하여, cAMP의 생성량이 감소한다. 따라서, 섭식을 촉진하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 이 스크리닝계에서 SALPR을 통한 천연의 리간드 대신에, 피험 물질을 단독으로 접촉시켜 cAMP의 생성량을 감소시키는(즉 천연 리간드와 마찬가지의 작용을 갖는) 화합물을 선택하면 된다.
섭식을 억제하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 아데닐산시클라아제 활성화제, SALPR의 천연 리간드, 및 피험 물질을 스크리닝용 세포에 첨가하면 된다. 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독으로 첨가한 경우에 비하여, 천연 리간드의 작용으로 cAMP의 생성량이 감소하지만, 피험 물질이 천연 리간드의 작용에 길항하는 경우에는, cAMP 생성량의 감소를 억제한다. 이 때에는, 상기 피험 물질은 섭식 억제 작용을 갖는 화합물로서 선택할 수 있다.
세포 내 cAMP량을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 이무노아세이 등이 있 는데, 예를 들면 시판의 cAMP 정량 키트를 사용할 수도 있다.
다른 양태의 스크리닝 방법에서는, 예를 들면 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는, SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)하고, 또한, cAMP 응답 서열(CRE)이 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자(예를 들면 알칼리포스 파타아제 유전자, 루시페라아제 유전자, 베타락타마아제 유전자, 니트로리덕타아제 유전자, 클로람페니콜아세틸트랜스페라아제 유전자, 베타갈락토시다아제 유전자 등, 또는 GPE(Green Fluorescent Protein) 등의 형광 단백질 유전자 등)를 함유하는 세포(이하, 「스크리닝용 세포」라고 칭하는 경우도 있음)를 이용함으로써, SALPR을 통한 섭식을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이 양태는, 전술한 cAMP의 생성이 감소하면 그 결과, 상기 스크리닝용 세포에 도입되어 있는 CRE를 프로모터 영역에 갖는 리포터 유전자의 전사가 억제되는 것을 이용하고 있다.
이하, 상기 양태에 의한, SALPR을 통한 섭식을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝하는 수순에 대하여, 더 구체적으로 설명한다.
즉, 상기 스크리닝용 세포에 도입되어 있는 CRE는, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승하면 발현이 항진하는 유전자군(cAMP 유도성 유전자)의 전사 조절 영역에 공통하여 존재하는 염기 서열이다. 따라서, 아데닐산시클라아제의 활성화제(예를 들면 FSK)를 스크리닝용 세포에 첨가하면, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승하고, 그 결과, CRE의 하류에 위치하는 리포터 유전자의 발현량이 증가한다. 리포터 유전자 산물의 발현량은, 리포터 유전자 산물과 반응하여 기질로부터 생성한 발광 물질의 양에 서 유래하는 발광을 측정함으로써 또는 리포터 유전자로서 생산된 형광 단백질 유래의 형광을 측정함으로써 용이하게 측정하는 것이 가능하다.
또한, 아데닐산시클라아제 활성화제를 첨가할 때에, SALPR의 천연 리간드를 첨가하면, 아데닐산시클라아제 활성화제에 기인하는 상기한 아데닐산시클라아제 활성 촉진 외에 추가로, 상기 천연 리간드가 본 발명에 따른 SALPR에 작용하여 발생하는 아데닐산시클라아제의 활성 억제도 일어나기 때문에, 결과적으로, 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독 투여한 경우에 비하여, 리포터 유전자 산물의 발현량이 저하한다. 따라서, 섭식을 촉진하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 이 스크리닝계에서, SALPR을 통한 천연의 리간드 대신에 피험 물질을 단독으로 접촉시켜 리포터 유전자 산물의 발현량을 감소시키는(즉 천연 리간드와 마찬가지의 작용을 갖는) 화합물을 선택하면 된다.
섭식을 억제하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 아데닐산시클라아제 활성화제, SALPR의 천연 리간드, 및 피험 물질을 스크리닝용 세포에 첨가하면 된다. 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독으로 첨가한 경우에 비하여, 천연 리간드의 작용으로 리포터 유전자 산물의 발현량은 감소하지만, 피험 물질이 천연 리간드의 작용에 길항하는 경우에는, 리포터 유전자 산물의 발현 감소를 억제한다. 이 때에는, 상기 피험 물질은 섭식 억제 작용을 갖는 화합물로서 선택할 수 있다.
피험 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합을 통한 작용인지의 여부는, 간단히 확인할 수 있다. 예를 들면 스크리닝용 세포(즉, SALPR을 세포막 상에 발현하고, 또한, CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하는 세포)를 이용한 상기 시험과 병행하여, 컨트롤용 세포(예를 들면 CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하지만, SALPR을 세포막 상에 발현하고 있지 않은 세포)를 이용하여 마찬가지의 시험을 실시한다. 그 결과, 상기 피험 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합에 의한 작용이 아닌 경우에는, 스크리닝용 세포 및 컨트롤 세포로 리포터 유전자 산물의 발현량에 관하여 동일한 현상이 관찰되는 것에 대하여, 상기 피험 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합에 의한 작용인 경우에는, 스크리닝용 세포와 컨트롤용 세포에서 리포터 유전자 산물의 발현량에 관하여 상이한 현상이 관찰된다.
또한, 다른 양태로서, 상기한 스크리닝 방법에 의해 선택된 피험 물질을 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유동물(예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에 투여하고, 투여 후의 섭식량이나 혈중 파라미터의 변동 등의 지표를 해석함으로서 섭식 조절에 영향을 미치는 피험 물질을 확인 및 결정할 수 있다. 상기 포유동물로서는, 정상의 동물에 한하지 않고, 유전성의 병태 모델 동물(예를 들면 비만병 모델인 ob/ob 마우스, db/db 마우스, Zucker fatty 래트 등)이나 유전자 개변 동물이어도 된다. 피험 물질의 투여 형태로서는 경구적 또는 비경구적으로 투여한다. 비경구적인 투여 경로의 양태로서는, 예를 들면 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내, 기도 내, 직장 내, 뇌 내, 바람직하게는 시상 하부 근방의 뇌실 내 투여를 들 수 있다. 스크리닝을 위한 지표로서는 섭식량 외에도, 예를 들면 체중, 운동량, 에너지 대사량, 혈중의 당 및 지질의 양, 또는 호르몬이나 분비 펩티드의 양 등을 측정하는 것도 유효하다. 또한, 투여 시에 절식 또는 포식, 또한 지질 과잉식 등의 조건을 부과할 수도 있다.
피험 물질의 투여 횟수는 1일당 1회이어도 수회로 나누어도 되고, 피험 물질을 투여하는 기간이나 관찰하는 기간은 1일 내지 수주간에 걸쳐도 된다.
릴락신 -3 수용체를 이용한 체중 조절에 관한 화합물의 스크리닝 방법
본 발명에 사용하는 릴락신-3에 대한 수용체로서는, 여러 가지의 수용체 중, 본 발명에 사용하는 릴락신-3과 결합 활성을 갖고, 릴락신-3 수용체 발현 세포의 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 칼슘의 유리, 아데닐산시클라아제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도 활성, 아라키돈산 유리 등)을 갖는 것을 사용할 수 있다.
구체적으로는, 릴락신-3 수용체로서, 보고되어 있는 공지의 수용체, 예를 들면 LGR7(진뱅크 등록번호 NM_021634), SALPR(진뱅크 등록번호 NM_016568)(GPCR135라고도 칭함) 또는 GPR100(진뱅크 등록번호 AB_083593)(hGPCR11, GPCR142라고도 칭함) 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 이들 수용체의 부분 폴리펩티드로서 후술하는 스크리닝 방법에 사용 가능하다면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 릴락신-3에 대한 결합능을 갖는 부분 폴리펩티드, 세포막 외 영역에 상당하는 아미노산 서열을 포함하는 부분 폴리펩티드 등도 사용할 수도 있다.
이하, 본 명세서에서는, 본 발명의 바람직한 일례로서, SALPR을 사용하는 스크리닝 방법에 대하여 본 발명의 내용을 상세하게 설명한다. 즉, 본 발명은, SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드에 결합하고, 체중 조절(체중을 증가 또는 감소함)에 관한 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 또한, SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드에 피험 물질을 작용시키고, 세포 자극 활성을 측정함으로써, 해당 피험 물질에 체중을 증가 또는 감소하는 작용을 갖는지의 여부를 결정할 수 있다.
여기서, 본 발명에 사용하는 SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드는, 여러 가지의 공지의 방법에 의해 얻을 수 있고, 예를 들면 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드(진뱅크 등록번호 NM_016568)를 이용하여 공지의 유전자 공학적 수법에 의해 조제할 수 있다. 또한 다른 양태로서, 공지의 폴리펩티드의 합성법에 의해 얻을 수 있고, 예를 들면 액상법, 고상법 등 통상의 방법에 따라서 합성하는 것이 가능하고, 통상, 자동 합성기를 이용할 수 있다. 또한, 다른 양태에 따르면, SALPR의 부분 폴리펩티드는, SALPR을 적당한 단백질 분해 효소로 절단함으로써 조제할 수 있다.
본 발명에 사용하는 SALPR을 코드하는 폴리펩티드는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드, 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 70% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열이며, 또한 SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 또는 체중 조절 작용)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
여기서, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드란, 그 아미노산 서열이, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열이며, 또한 SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 또는 체중 조절 작용)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
또한, SALPR의 부분 폴리펩티드도, SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 또는 체중 조절 작용)을 갖는 한, 사용할 수 있다.
이하, 유전자 공학적 수법에 대하여, 더 구체적으로는 SALPR을 사용하는 경우에 대하여 상세하게 설명하는데, 그 부분 폴리펩티드에 대해서도, 후술하는 스크리닝 방법에 사용 가능하다면 특별히 한정되지 않는다.
SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주 세포에 도입하고, 얻어진 형질 전환체로부터 발현 가능한 조건 하에서 배양하고, 발현 단백질의 분리 및 정제에 일반적으로 이용되는 방법에 의해, 그 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 분리 및 정제함으로써 조제할 수 있다. 상기한 분리 및 정제 방법으로서는, 예를 들면 황안염석, 이온 교환 셀룰로오스를 이용하는 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 분자체 겔을 이용하는 분자체 컬럼 크로마토그래피, 프로테인 A 결합 다당류를 이용하는 친화성 컬럼 크로마토그래피, 투석, 또는 동결 건조 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용하는 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명에 사용 하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서의 용어 「폴리뉴클레오티드」에는, DNA 및 RNA의 양쪽이 포함된다. 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드에는, 구체적으로는 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 들 수 있다.
(a) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(b) 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 개소에서, 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및
(e) 「서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 서열 번호 3으로 표시되는 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SALPR을 코드한다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 개소에서, 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다. 여기서, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어도 좋은 아미노산의 수는, 예를 들면 1∼30개, 바람직하게는 1∼20개, 더 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개, 특히 바람직하게는 1∼2개이다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다.
상기 형질 전환에 사용되는 플라스미드는, 상기한 바와 같은 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 사용하는 숙주 세포에 부합하여 적절히 선택한 공지의 발현 벡터에, 해당 폴리뉴클레오티드를 삽 입함으로써 얻어지는 플라스미드를 들 수 있다.
또한, 상기 형질 전환체도, 상기한 바와 같은 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 해당 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 염색체에 짜 넣어진 형질 전환체일 수도 있고, 또는, 해당 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드의 형태로 함유하는 형질 전환체일 수도 있고, 또는, SALPR을 발현하고 있지 않은 형질 전환체일 수도 있다. 해당 형질 전환체는, 예를 들면 상기 플라스미드에 의해, 또는, 상기 폴리뉴클레오티드 그 자체에 의해, 원하는 숙주 세포를 형질 전환함으로써 얻을 수 있다.
상기 숙주 세포로서는, 예를 들면 통상 사용되는 공지의 미생물, 예를 들면 대장균(예를 들면 Escherichia coli JM109주) 또는 효모(예를 들면 Saccharomyces cerevisiae W303주), 또는 공지의 배양 세포, 예를 들면 동물 세포(예를 들면 CHO 세포, HEK-293 세포, 또는 COS 세포) 또는 곤충 세포(예를 들면 BmN4 세포)를 들 수 있다.
또한, 공지의 상기 발현 벡터로서는, 예를 들면 대장균에 대해서는, pUC, pTV, pGEX, pKK, 또는 pTrcHis를; 효모에 대해서는, pEMBLY 또는 pYES2를; CHO 세포, HEK-293 세포 및 COS 세포에 대해서는, pcDNA3, pMAMneo 또는 pBabe Puro를; BmN4 세포에 대해서는, 누에 핵다각체 바이러스(BmNPV)의 폴리헤드린 프로모터를 갖는 벡터(예를 들면 pBK283)를 들 수 있다.
SALPR을 함유하는 세포는, SALPR을 세포막 표면에 발현하고 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들면 상기 형질 전환체(즉, SALPR을 코드하는 폴리뉴 클레오티드를 포함하는 플라스미드로 형질 전환된 세포)를, SALPR의 발현이 가능한 조건 하에서 배양함으로써 얻을 수도 있고, 또는, 적당한 세포에, SALPR을 코드하는 RAN를 주입하고, SALPR의 발현이 가능한 조건 하에서 배양함으로써 얻을 수도 있다.
또한, SALPR을 함유하는 본 발명에 사용하는 세포막 분획은, 예를 들면 본 발명에 따른 SALPR을 발현하는 세포를 파쇄한 후, 세포막이 많이 포함되는 분획을 분리함으로써 얻을 수 있다. 세포의 파쇄 방법으로서는, 예를 들면 호모지나이저(예를 들면 Potter-Elvehiem형 호모지나이저)로 세포를 눌러 찌부러뜨리는 방법, 워링 블렌더 또는 폴리트론(Kinematica사 제조)에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 또는, 프렌치 프레스 등으로 가압하면서 가는 노즐로부터 세포를 분출시키는 것에 의한 파쇄 등을 들 수 있다. 또한, 세포막의 분획 방법으로서는, 예를 들면 원심력에 의한 분획법, 예를 들면 분획 원심 분리법 또는 밀도 구배 원심 분리법을 들 수 있다.
SALPR을 통한, 본 발명에 따른 체중을 증가 또는 감소하는 화합물의 스크리닝 방법에서는, SALPR 또는 상기 세포막 분획(즉, SALPR을 함유하는 세포막 분획), 또는 상기 세포(즉, SALPR을 함유하는 세포)를 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 스크리닝 세포에서는, 피험 물질이 SALPR에 특이적으로 결합하는지의 여부를 조사하는 방법과, SALPR에 피험 물질이 결합함으로써 발생하는 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 칼슘의 유리, 아데닐산시클라아제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도 활성, 아라키돈산 유리 등)을 조사하는 방법을 들 수 있고, 이들을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에서는, 예를 들면 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포와, 피험 물질을 접촉시키고, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포와, 피험 물질이 결합하는지의 여부를 분석함으로써, SALPR을 통한 체중을 증가 또는 감소하는 능력을 구별하지 않고 화합물을 스크리닝할 수 있다.
구체적으로는, 피험 물질 비존재 하 및 피험 물질 존재 하의 각 조건 하에서, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포와, 표지한 천연의 리간드(즉, 릴락신-3)를 접촉시키고, 상기 조건 하에서의 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 통한 상기 천연 리간드의 특이적 결합량을 비교함으로써, SALPR을 통한 체중을 증가 또는 감소하는 능력을 구별하지 않고 화합물을 스크리닝할 수 있다. 즉, 상기 피험 물질이, SALPR을 통한 체중을 증가 또는 감소하는 능력을 갖는 경우에는, 피험 물질 비존재 하에서의 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 통한 천연 리간드의 특이적 결합량에 대하여, 피험 물질 존재 하에서의 상기 특이적 결합량이 저하한다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에서, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 통한 상기 천연 리간드의 특이적 결합량을 비교하는 경우에는, 상기 천연 리간드로서, 표지한 천연 리간드를 이용할 수 있다. 상기 지표로서는, 예를 들면, 방사성 동위 원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등이 이용된다. 방사성 동위 원소 로서는, 예를 들면, [3H], [14C], [125I], [35S] 등을 이용할 수 있다. 상기 효소로서는, 예를 들면 β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제 등을 이용할 수 있다. 형광 물질로서는, 예를 들면 플루오레세이소티오시아네이트, BODIPY 등을 이용할 수 있다. 발광 물질로서는 루시페린, 루시게닌 등을 이용할 수 있다. 경우에 따라서는, 천연 리간드와 표지 물질을 결합시키기 위해서 비오틴-아비딘의 계를 이용할 수도 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 스크리닝 방법에서, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포에 결합하여, 이들과 천연 리간드의 결합을 저해하는 화합물을, SALPR을 통한 체중을 증가 또는 감소하는 능력을 구별하지 않고 스크리닝할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에서의 다른 양태에서는, 피험 물질 비존재 하 및 피험 물질 존재 하의 각 조건 하에서, 상기 세포와 표지화한 천연의 리간드(즉, 릴락신-3)를 접촉시키고, 상기 각 조건 하에서의 상기 세포를 통한 상기 천연 리간드의 특이적 결합량을 비교하고, 또한, 상기 조건 하에서의 상기 천연 리간드의 특정의 세포 자극 활성을 비교함으로써, SALPR을 통한 체중을 증가 또는 감소하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다.
상기 양태에서는, 상기 세포에 결합하고, 상기 세포에 포함되는 수용체를 통해 세포 자극 활성을 갖는 피험 물질을, SALPR을 통한 체중을 증가하는 화합물로서 선택할 수 있다.
한편, 상기 양태에서, 상기 세포와 천연 리간드의 결합을 저해하지만, 세포 자극 활성을 갖지 않는 피험 물질을, SALPR을 통한 체중을 감소하는 화합물로서 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법은, 세포 자극 활성으로서, 예를 들면 아데닐산시클라아제의 활성 억제를 이용함으로써 실시할 수 있다.
이 양태의 스크리닝 방법에서는, 예를 들면 아데닐산시클라아제의 활성화에 의해 세포 내에 생성하는 cAMP를 공지의 수법으로 측정하면 되고, SALPR을 통한 체중을 증가 또는 감소하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이 양태는, SALPR에 천연 리간드를 결합함으로써 발생하는 세포 내 시그널 전달, 즉, SALPR의 세포 자극 활성의 하나인 아데닐산시클라아제의 활성 억제를 이용하는 것이다. 구체적으로는, SALPR에 천연 리간드가 결합하면, SALPR에 공액하고 있는 G 단백질 패밀리의 하나인 Gi 패밀리가, 아데닐산시클라아제를 억제하고, 세포 내에 생성되는 사이클릭 AMP(cAMP:아데닐산시클라아제에 의해 ATP로부터 생성됨) 양을 감소시키는 것에 의한다.
예를 들면 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는, SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)한 포유동물 유래 세포(예를 들면 HEK-293 세포 또는 CHO 세포)에 아데닐산시클라아제의 활성화제[예를 들면 폴스콜린(FSK)]를 첨가하면, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승한다.
또한, 아데닐산시클라아제 활성화제를 첨가할 때에, SALPR의 천연 리간드를 첨가하면, 아데닐산시클라아제 활성화제에 기인하는 상기 아데닐산시클라아제 활성 촉진에 외에 추가로, 상기 천연 리간드가 본 발명에 따른 SALPR에 작용하여 발생하는 아데닐산시클라아제의 활성 억제도 일어나기 때문에, 결과적으로, 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독 투여한 경우에 비하여, cAMP의 생성량이 감소한다. 따라서, 체중을 증가하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 이 스크리닝계에서 SALPR을 통한 천연의 리간드 대신에, 피험 물질을 단독으로 접촉시켜 cAMP의 생성량을 감소시키는(즉 천연 리간드와 마찬가지의 작용을 갖는) 화합물을 선택하면 된다.
체중을 감소하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 아데닐산시클라아제 활성화제, SALPR의 천연 리간드, 및 피험 물질을 스크리닝용 세포에 첨가하면 된다. 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독으로 첨가한 경우에 비하여, 천연 리간드의 작용으로 cAMP의 생성량이 감소하지만, 피험 물질이 천연 리간드의 작용에 길항하는 경우에는, cAMP 생성량의 감소를 억제한다. 이 때에는, 상기 피험 물질은 체중 감소 작용을 갖는 화합물로서 선택할 수 있다.
세포 내 cAMP량을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 이무노아세이 등이 있는데, 예를 들면 시판의 cAMP 정량 키트를 사용할 수도 있다.
다른 양태의 스크리닝 방법에서는, 예를 들면 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는, SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)하고, 또한, cAMP 응답 서열(CRE)이 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자(예를 들면 알칼리포스 파타아제 유전자, 루시페라아제 유전자, 베타락타마아제 유전자, 니트로렌덕타아제 유전자, 클로람페니콜아세틸트랜스페라아제 유전자, 베타갈락토시다아제 유전자 등 , 또는 GPE(Green Fluorescent Protein) 등의 형광 단백질 유전자 등)를 함유하는 세포(이하, 「스크리닝용 세포」라고 칭하는 경우도 있음)를 이용함으로써, SALPR을 통한 체중을 증가 또는 감소하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이 양태는, 전술한 cAMP의 생성이 감소하면 그 결과, 상기 스크리닝용 세포에 도입되어 있는 CRE를 프로모터 영역에 갖는 리포터 유전자의 전사가 억제되는 것을 이용하고 있다.
이하, 상기 양태에 의한, SALPR을 통한 체중을 증가 또는 감소하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝하는 수순에 대하여, 더 구체적으로 설명한다.
즉, 상기 스크리닝용 세포에 도입되어 있는 CRE는, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승하면 발현이 항진하는 유전자군(cAMP 유도성 유전자)의 전사 조절 영역에 공통하여 존재하는 염기 서열이다. 따라서, 아데닐산시클라아제의 활성화제(예를 들면 FSK)를 스크리닝용 세포에 첨가하면, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승하고, 그 결과, CRE의 하류에 위치하는 리포터 유전자의 발현량이 증가한다. 리포터 유전자 산물의 발현량은, 리포터 유전자 산물과 반응하여 기질로부터 생성한 발광 물질의 양에서 유래하는 발광을 측정함으로써 또는 리포터 유전자로서 생산된 형광 단백질 유래의 형광을 측정함으로써 용이하게 측정하는 것이 가능하다.
또한, 아데닐산시클라아제 활성화제를 첨가할 때에, SALPR의 천연 리간드를 첨가하면, 아데닐산시클라아제 활성화제에 기인하는 상기한 아데닐산시클라아제 활성 촉진 외에 추가로, 상기 천연 리간드가 본 발명에 따른 SALPR에 작용하여 발생하는 아데닐산시클라아제의 활성 억제도 일어나기 때문에, 결과적으로, 아데닐산시 클라아제 활성화제를 단독 투여한 경우에 비하여, 리포터 유전자 산물의 발현량이 저하한다. 따라서, 체중을 증가하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 이 스크리닝계에서, SALPR을 통한 천연의 리간드 대신에 피험 물질을 단독으로 접촉시켜 리포터 유전자 산물의 발현량을 감소시키는(즉 천연 리간드와 마찬가지의 작용을 갖는) 화합물을 선택하면 된다.
체중을 감소하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 아데닐산시클라아제 활성화제, SALPR의 천연 리간드, 및 피험 물질을 스크리닝용 세포에 첨가하면 된다. 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독으로 첨가한 경우에 비하여, 천연 리간드의 작용으로 리포터 유전자 산물의 발현량은 감소하지만, 피험 물질이 천연 리간드의 작용에 길항하는 경우에는, 리포터 유전자 산물의 발현 감소를 억제한다. 이 때에는, 상기 피험 물질은 체중 감소 작용을 갖는 화합물로서 선택할 수 있다.
피험 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합을 통한 작용인지의 여부는, 간단히 확인할 수 있다. 예를 들면 스크리닝용 세포(즉, SALPR을 세포막 상에 발현하고, 또한, CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하는 세포)를 이용한 상기 시험과 병행하여, 컨트롤용 세포(예를 들면 CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하지만, SALPR을 세포막 상에 발현하고 있지 않은 세포)를 이용하여 마찬가지의 시험을 실시한다. 그 결과, 상기 피험 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합에 의한 작용이 아닌 경우에는, 스크리닝용 세포 및 컨트롤 세포로 리포터 유전자 산물의 발현량에 관하여 동일한 현상이 관찰되는 것에 대하여, 상기 피험 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합에 의한 작용인 경우에는, 스크리닝용 세포와 컨트롤용 세포에서 리포터 유전자 산물의 발현량에 관하여 상이한 현상이 관찰된다.
또한, 다른 양태로서, 상기한 스크리닝 방법에 의해 선택된 피험 물질을 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유동물(예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에 투여하고, 투여 후의 섭식량, 체중, 비만의 지표(예를 들면 체지방률, BMI(체격 지수), 비만도, 체형, 신체 연령, 임피던스, 체지방량, 제지방량, 체수분량, 단백질량, 근육량, 무기질량, 세포량, 부위별 근육량, 부위별 수분량, BMR(기초 대사량), 에너지 소요량, 복부 비만율(VSR), 내장 지방량, 피하 지방량, 내장 지방량 레벨, 장기 중량, 혈중 파라미터의 변동, 혈중의 렙틴, 당 및 지질의 양, 또는 호르몬이나 분비 펩티드의 양 등)를 측정함으로써 체중 조절에 영향을 미치는 피험 물질을 확인 및 결정할 수 있다. 상기 포유동물로서는, 정상의 동물에 한하지 않고, 유전성의 병태 모델 동물(예를 들면 비만병 모델인 ob/ob 마우스, db/db 마우스, Zucker fatty 래트 등)이나 유전자 개변 동물이어도 된다. 피험 물질의 투여 형태로서는 경구적 또는 비경구적으로 투여한다. 비경구적인 투여 경로의 양태로서는, 예를 들면 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내, 기도 내, 직장 내, 뇌 내, 바람직하게는 시상 하부 근방의 뇌실 내 투여를 들 수 있다. 스크리닝을 위한 지표로서는, 체중의 측정을 들 수 있고, 또한 섭식량 및 비만의 지표를 측정하는 것도 유효하다. 또한, 투여 시에 절식 또는 포식, 또한 지질 과잉식 등의 조건을 부과할 수도 있다.
피험 물질의 투여 횟수는 1일당 1회이어도 수회로 나누어도 되고, 피험 물질을 투여하는 기간이나 관찰하는 기간은 1일 내지 수주간에 걸쳐도 된다.
릴락신 -3 수용체를 이용한 비만 조절에 관한 화합물의 스크리닝 방법
본 발명에 사용하는 릴락신-3에 대한 수용체로서는, 여러 가지의 수용체 중, 본 발명에 사용하는 릴락신-3과 결합 활성을 갖고, 릴락신-3 수용체 발현 세포의 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 칼슘의 유리, 아데닐산시클라아제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도 활성, 아라키돈산 유리 등)을 갖는 것을 사용할 수 있다.
구체적으로는, 릴락신-3 수용체로서, 보고되어 있는 공지의 수용체, 예를 들면 LGR7(진뱅크 등록번호 NM_021634), SALPR(진뱅크 등록번호 NM_016568)(GPCR135라고도 칭함) 또는 GPR100(진뱅크 등록번호 AB_083593)(hGPCR11, GPCR142라고도 칭함) 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 이들 수용체의 부분 폴리펩티드로서 후술하는 스크리닝 방법에 사용 가능하다면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 릴락신-3에 대한 결합능을 갖는 부분 폴리펩티드, 세포막 외 영역에 상당하는 아미노산 서열을 포함하는 부분 폴리펩티드 등도 사용할 수도 있다.
이하, 본 명세서에서는, 본 발명의 바람직한 일례로서, SALPR을 사용하는 스크리닝 방법에 대하여 본 발명의 내용을 상세하게 설명한다. 즉, 본 발명은, SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드에 결합하고, 비만 조절(비만을 촉진 또는 억제함)에 관한 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 또한, SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드에 피험 물질을 작용시키고, 세포 자극 활성을 측정함으로써, 해당 피험 물질에 비만을 촉진 또는 억제하는 작용을 갖는지의 여부를 결정할 수 있다.
여기서, 본 발명에 사용하는 SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드는, 여러 가지의 공지의 방법에 의해 얻을 수 있고, 예를 들면 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드(진뱅크 등록번호 NM_016568)를 이용하여 공지의 유전자 공학적 수법에 의해 조제할 수 있다. 또한 다른 양태로서, 공지의 폴리펩티드의 합성법에 의해 얻을 수 있고, 예를 들면 액상법, 고상법 등 통상의 방법에 따라서 합성하는 것이 가능하고, 통상, 자동 합성기를 이용할 수 있다. 또한, 다른 양태에 따르면, SALPR의 부분 폴리펩티드는, SALPR을 적당한 단백질 분해 효소로 절단함으로써 조제할 수 있다.
본 발명에 사용하는 SALPR을 코드하는 폴리펩티드는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드, 또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 70% 이상의 상동성, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열이며, 또한 SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 또는 비만 조절 작용)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
여기서, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드란, 그 아미노산 서열이, 서열 번호 4로 표시되는 아 미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열이며, 또한 SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 또는 비만 조절 작용)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
또한, SALPR의 부분 폴리펩티드도, SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그에 의해 발생하는 여러 가지의 세포 자극 활성, 또는 비만 조절 작용)을 갖는 한, 사용할 수 있다.
이하, 유전자 공학적 수법에 대하여, 더 구체적으로는 SALPR을 사용하는 경우에 대하여 상세하게 설명하는데, 그 부분 폴리펩티드에 대해서도, 후술하는 스크리닝 방법에 사용 가능하다면 특별히 한정되지 않는다.
SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주 세포에 도입하고, 얻어진 형질 전환체로부터 발현 가능한 조건 하에서 배양하고, 발현 단백질의 분리 및 정제에 일반적으로 이용되는 방법에 의해, 그 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 분리 및 정제함으로써 조제할 수 있다. 상기한 분리 및 정제 방법으로서는, 예를 들면 황안염석, 이온 교환 셀룰로오스를 이용하는 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 분자체 겔을 이용하는 분자체 컬럼 크로마토그래피, 프로테인 A 결합 다당류를 이용하는 친화성 컬럼 크로마토그래피, 투석, 또는 동결 건조 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용하는 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명에 사용하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서의 용어 「폴리뉴클레오티드」에는, DNA 및 RNA의 양쪽이 포함된다. 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드에는, 구체적으로는 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 들 수 있다.
(a) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(b) 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 개소에서, 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및
(e) 「서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 서열 번호 3으로 표시되는 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SALPR을 코드한다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티 드는, 「서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 개소에서, 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다. 여기서, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되어도 좋은 아미노산의 수는, 예를 들면 1∼30개, 바람직하게는 1∼20개, 더 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개, 특히 바람직하게는 1∼2개이다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 폴리뉴클레오티드는, 「서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 혼성화하고, 또한, 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코드하여 이루어지는 것이다.
상기 형질 전환에 사용되는 플라스미드는, 상기한 바와 같은 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 사용하는 숙주 세포에 부합하여 적절히 선택한 공지의 발현 벡터에, 해당 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 얻어지는 플라스미드를 들 수 있다.
또한, 상기 형질 전환체도, 상기한 바와 같은 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레 오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 해당 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 염색체에 짜 넣어진 형질 전환체일 수도 있고, 또는, 해당 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드의 형태로 함유하는 형질 전환체일 수도 있고, 또는, SALPR을 발현하고 있지 않은 형질 전환체일 수도 있다. 해당 형질 전환체는, 예를 들면 상기 플라스미드에 의해, 또는, 상기 폴리뉴클레오티드 그 자체에 의해, 원하는 숙주 세포를 형질 전환함으로써 얻을 수 있다.
상기 숙주 세포로서는, 예를 들면 통상 사용되는 공지의 미생물, 예를 들면 대장균(예를 들면 Escherichia coli JM109주) 또는 효모(예를 들면 Saccharomyces cerevisiae W303주), 또는 공지의 배양 세포, 예를 들면 동물 세포(예를 들면 CHO 세포, HEK-293 세포, 또는 COS 세포) 또는 곤충 세포(예를 들면 BmN4 세포)를 들 수 있다.
또한, 공지의 상기 발현 벡터로서는, 예를 들면 대장균에 대해서는, pUC, pTV, pGEX, pKK, 또는 pTrcHis를; 효모에 대해서는, pEMBLY 또는 pYES2를; CHO 세포, HEK-293 세포 및 COS 세포에 대해서는, pcDNA3, pMAMneo 또는 pBabe Puro를; BmN4 세포에 대해서는, 누에 핵다각체 바이러스(BmNPV)의 폴리헤드린 프로모터를 갖는 벡터(예를 들면 pBK283)를 들 수 있다.
SALPR을 함유하는 세포는, SALPR을 세포막 표면에 발현하고 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들면 상기 형질 전환체(즉, SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 형질 전환된 세포)를, SALPR의 발현이 가능한 조건 하에서 배양함으로써 얻을 수도 있고, 또는, 적당한 세포에, SALPR을 코드하 는 RAN를 주입하고, SALPR의 발현이 가능한 조건 하에서 배양함으로써 얻을 수도 있다.
또한, SALPR을 함유하는 본 발명에 사용하는 세포막 분획은, 예를 들면 본 발명에 따른 SALPR을 발현하는 세포를 파쇄한 후, 세포막이 많이 포함되는 분획을 분리함으로써 얻을 수 있다. 세포의 파쇄 방법으로서는, 예를 들면 호모지나이저(예를 들면 Potter-Elvehiem형 호모지나이저)로 세포를 눌러 찌부러뜨리는 방법, 워링 블렌더 또는 폴리트론(Kinematica사 제조)에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 또는, 프렌치 프레스 등으로 가압하면서 가는 노즐로부터 세포를 분출시키는 것에 의한 파쇄 등을 들 수 있다. 또한, 세포막의 분획 방법으로서는, 예를 들면 원심력에 의한 분획법, 예를 들면 분획 원심 분리법 또는 밀도 구배 원심 분리법을 들 수 있다.
SALPR을 통한, 본 발명에 따른 비만을 촉진 또는 억제하는 화합물의 스크리닝 방법에서는, SALPR 또는 상기 세포막 분획(즉, SALPR을 함유하는 세포막 분획), 또는 상기 세포(즉, SALPR을 함유하는 세포)를 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 스크리닝 세포에서는, 피험 물질이 SALPR에 특이적으로 결합하는지의 여부를 조사하는 방법과, SALPR에 피험 물질이 결합함으로써 발생하는 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 칼슘의 유리, 아데닐산시클라아제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도 활성, 아라키돈산 유리 등)을 조사하는 방법을 들 수 있고, 이들을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에서는, 예를 들면 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포와, 피험 물질을 접촉시키고, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포와, 피험 물질이 결합하는지의 여부를 분석함으로써, SALPR을 통한 비만을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하지 않고 화합물을 스크리닝할 수 있다.
구체적으로는, 피험 물질 비존재 하 및 피험 물질 존재 하의 각 조건 하에서, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포와, 표지한 천연의 리간드(즉, 릴락신-3)를 접촉시키고, 상기 조건 하에서의 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 통한 상기 천연 리간드의 특이적 결합량을 비교함으로써, SALPR을 통한 비만을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하지 않고 화합물을 스크리닝할 수 있다. 즉, 상기 피험 물질이, SALPR을 통한 비만을 촉진 또는 억제하는 능력을 갖는 경우에는, 피험 물질 비존재 하에서의 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 통한 천연 리간드의 특이적 결합량에 대하여, 피험 물질 존재 하에서의 상기 특이적 결합량이 저하한다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에서, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 통한 상기 천연 리간드의 특이적 결합량을 비교하는 경우에는, 상기 천연 리간드로서, 표지한 천연 리간드를 이용할 수 있다. 상기 지표로서는, 예를 들면, 방사성 동위 원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등이 이용된다. 방사성 동위 원소로서는, 예를 들면, [3H], [14C], [125I], [35S] 등을 이용할 수 있다. 상기 효소로서는, 예를 들면 β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제 등을 이용 할 수 있다. 형광 물질로서는, 예를 들면 플루오레세이소티오시아네이트, BODIPY 등을 이용할 수 있다. 발광 물질로서는 루시페린, 루시게닌 등을 이용할 수 있다. 경우에 따라서는, 천연 리간드와 표지 물질을 결합시키기 위해서 비오틴-아비딘의 계를 이용할 수도 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 스크리닝 방법에서, SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포에 결합하여, 이들과 천연 리간드의 결합을 저해하는 화합물을, SALPR을 통한 비만을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하지 않고 스크리닝할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에서의 다른 양태에서는, 피험 물질 비존재 하 및 피험 물질 존재 하의 각 조건 하에서, 상기 세포와 표지화한 천연의 리간드(즉, 릴락신-3)를 접촉시키고, 상기 각 조건 하에서의 상기 세포를 통한 상기 천연 리간드의 특이적 결합량을 비교하고, 또한, 상기 조건 하에서의 상기 천연 리간드의 특정의 세포 자극 활성을 비교함으로써, SALPR을 통한 비만을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다.
상기 양태에서는, 상기 세포에 결합하고, 상기 세포에 포함되는 수용체를 통해 세포 자극 활성을 갖는 피험 물질을 SALPR을 통한 비만을 촉진하는 화합물로서 선택할 수 있다.
한편, 상기 양태에서, 상기 세포와 천연 리간드의 결합을 저해하지만, 세포 자극 활성을 갖지 않는 피험 물질을 SALPR을 통한 비만을 억제하는 화합물로서 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법은, 세포 자극 활성으로서, 예를 들면 아데닐산시클라아제의 활성 억제를 이용함으로써 실시할 수 있다.
이 양태의 스크리닝 방법에서는, 예를 들면 아데닐산시클라아제의 활성화에 의해 세포 내에 생성하는 cAMP를 공지의 수법으로 측정하면 되고, SALPR을 통한 비만을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이 양태는, SALPR에 천연 리간드를 결합함으로써 발생하는 세포 내 시그널 전달, 즉, SALPR의 세포 자극 활성의 하나인 아데닐산시클라아제의 활성 억제를 이용하는 것이다. 구체적으로는, SALPR에 천연 리간드가 결합하면, SALPR에 공액하고 있는 G 단백질 패밀리의 하나인 Gi 패밀리가, 아데닐산시클라아제를 억제하고, 세포 내에 생성되는 사이클릭 AMP(cAMP:아데닐산시클라아제에 의해 ATP로부터 생성됨) 양을 감소시키는 것에 의한다.
예를 들면 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는, SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)한 포유동물 유래 세포(예를 들면 HEK-293 세포 또는 CHO 세포)에 아데닐산시클라아제의 활성화제[예를 들면 폴스콜린(FSK)]를 첨가하면, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승한다.
또한, 아데닐산시클라아제 활성화제를 첨가할 때에, SALPR의 천연 리간드를 첨가하면, 아데닐산시클라아제 활성화제에 기인하는 상기 아데닐산시클라아제 활성 촉진에 외에 추가로, 상기 천연 리간드가 본 발명에 따른 SALPR에 작용하여 발생하는 아데닐산시클라아제의 활성 억제도 일어나기 때문에, 결과적으로, 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독 투여한 경우에 비하여, cAMP의 생성량이 감소한다. 따라 서, 비만을 촉진하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 이 스크리닝계에서 SALPR을 통한 천연의 리간드 대신에, 피험 물질을 단독으로 접촉시켜 cAMP의 생성량을 감소시키는(즉 천연 리간드와 마찬가지의 작용을 갖는) 화합물을 선택하면 된다.
비만을 억제하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 아데닐산시클라아제 활성화제, SALPR의 천연 리간드, 및 피험 물질을 스크리닝용 세포에 첨가하면 된다. 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독으로 첨가한 경우에 비하여, 천연 리간드의 작용으로 cAMP의 생성량이 감소하지만, 피험 물질이 천연 리간드의 작용에 길항하는 경우에는, cAMP 생성량의 감소를 억제한다. 이 때에는, 상기 피험 물질은 비만 억제 작용을 갖는 화합물로서 선택할 수 있다.
세포 내 cAMP량을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 이무노아세이 등이 있는데, 예를 들면 시판의 cAMP 정량 키트를 사용할 수도 있다.
다른 양태의 스크리닝 방법에서는, 예를 들면 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는, SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)하고, 또한, cAMP 응답 서열(CRE)이 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자(예를 들면 알칼리포스 파타아제 유전자, 루시페라아제 유전자, 베타락타마아제 유전자, 니트로렌덕타아제 유전자, 클로람페니콜아세틸트랜스페라아제 유전자, 베타갈락토시다아제 유전자 등, 또는 GPE(Green Fluorescent Protein) 등의 형광 단백질 유전자 등)를 함유하는 세포(이하, 「스크리닝용 세포」라고 칭하는 경우도 있음)를 이용함으로써, SALPR을 통한 비만을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있 다. 이 양태는, 전술한 cAMP의 생성이 감소하면 그 결과, 상기 스크리닝용 세포에 도입되어 있는 CRE를 프로모터 영역에 갖는 리포터 유전자의 전사가 억제되는 것을 이용하고 있다.
이하, 상기 양태에 의한, SALPR을 통한 비만을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝하는 수순에 대하여, 더 구체적으로 설명한다.
즉, 상기 스크리닝용 세포에 도입되어 있는 CRE는, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승하면 발현이 항진하는 유전자군(cAMP 유도성 유전자)의 전사 조절 영역에 공통하여 존재하는 염기 서열이다. 따라서, 아데닐산시클라아제의 활성화제(예를 들면 FSK)를 스크리닝용 세포에 첨가하면, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승하고, 그 결과, CRE의 하류에 위치하는 리포터 유전자의 발현량이 증가한다. 리포터 유전자 산물의 발현량은, 리포터 유전자 산물과 반응하여 기질로부터 생성한 발광 물질의 양에서 유래하는 발광을 측정함으로써 또는 리포터 유전자로서 생산된 형광 단백질 유래의 형광을 측정함으로써 용이하게 측정하는 것이 가능하다.
또한, 아데닐산시클라아제 활성화제를 첨가할 때에, SALPR의 천연 리간드를 첨가하면, 아데닐산시클라아제 활성화제에 기인하는 상기한 아데닐산시클라아제 활성 촉진 외에 추가로, 상기 천연 리간드가 본 발명에 따른 SALPR에 작용하여 발생하는 아데닐산시클라아제의 활성 억제도 일어나기 때문에, 결과적으로, 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독 투여한 경우에 비하여, 리포터 유전자 산물의 발현량이 저하한다. 따라서, 비만을 촉진하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 이 스크리닝계에서, SALPR을 통한 천연의 리간드 대신에 피험 물질을 단독으로 접촉시켜 리포터 유전자 산물의 발현량을 감소시키는(즉 천연 리간드와 마찬가지의 작용을 갖는) 화합물을 선택하면 된다.
비만을 억제하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 아데닐산시클라아제 활성화제, SALPR의 천연 리간드, 및 피험 물질을 스크리닝용 세포에 첨가하면 된다. 아데닐산시클라아제 활성화제를 단독으로 첨가한 경우에 비하여, 천연 리간드의 작용으로 리포터 유전자 산물의 발현량은 감소하지만, 피험 물질이 천연 리간드의 작용에 길항하는 경우에는, 리포터 유전자 산물의 발현 감소를 억제한다. 이 때에는, 상기 피험 물질은 비만 억제 작용을 갖는 화합물로서 선택할 수 있다.
피험 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합을 통한 작용인지의 여부는, 간단히 확인할 수 있다. 예를 들면 스크리닝용 세포(즉, SALPR을 세포막 상에 발현하고, 또한, CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하는 세포)를 이용한 상기 시험과 병행하여, 컨트롤용 세포(예를 들면 CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하지만, SALPR을 세포막 상에 발현하고 있지 않은 세포)를 이용하여 마찬가지의 시험을 실시한다. 그 결과, 상기 피험 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합에 의한 작용이 아닌 경우에는, 스크리닝용 세포 및 컨트롤 세포로 리포터 유전자 산물의 발현량에 관하여 동일한 현상이 관찰되는 것에 대하여, 상기 피험 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합에 의한 작용인 경우에는, 스크리닝용 세포와 컨트롤용 세포에서 리포터 유전자 산물의 발현량에 관하여 상이한 현상이 관찰된다.
또한, 다른 양태로서, 상기한 스크리닝 방법에 의해 선택된 피험 물질을 인 간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유동물(예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에 투여하고, 투여 후의 섭식량, 체중, 비만의 지표(예를 들면 체지방률, BMI(체격 지수), 비만도, 체형, 신체 연령, 임피던스, 체지방량, 제지방량, 체수분량, 단백질량, 근육량, 무기질량, 세포량, 부위별 근육량, 부위별 수분량, BMR(기초 대사량), 에너지 소요량, 복부 비만율(VSR), 내장 지방량, 피하 지방량, 내장 지방량 레벨, 장기 중량, 혈중 파라미터의 변동, 혈중의 렙틴, 당 및 지질의 양, 또는 호르몬이나 분비 펩티드의 양 등)를 측정함으로써 비만 작용에 영향을 미치는 피험 물질을 확인 및 결정할 수 있다. 상기 포유동물로서는, 정상의 동물에 한하지 않고, 유전성의 병태 모델 동물(예를 들면 비만병 모델인 ob/ob 마우스, db/db 마우스, Zucker fatty 래트 등)이나 유전자 개변 동물이어도 된다. 피험 물질의 투여 형태로서는 경구적 또는 비경구적으로 투여한다. 비경구적인 투여 경로의 양태로서는, 예를 들면 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내, 기도 내, 직장 내, 뇌 내, 바람직하게는 시상 하부 근방의 뇌실 내 투여를 들 수 있다. 스크리닝을 위한 지표로서는, 비만의 지표를 측정하는 것을 들 수 있고, 또한 섭식량 및 체중을 측정하는 것도 유효하다. 또한, 투여 시에 절식 또는 포식, 또한 지질 과잉식 등의 조건을 부과할 수도 있다.
피험 물질의 투여 횟수는 1일당 1회이어도 수회로 나누어도 되고, 피험 물질을 투여하는 기간이나 관찰하는 기간은 1일 내지 수주간에 걸쳐도 된다.
여기서, 본 발명에 사용하는 피험 물질은 어떠한 화합물이어도 되지만, 예를 들면 유전자 라이브러리의 발현 산물, 합성 저분자 화합물 라이브러리, 핵산(올리고 DNA, 올리고 RNA), 합성 펩티드 라이브러리, 항체, 세균 방출 물질, 세포(미생물, 식물 세포, 동물 세포) 추출액, 세포(미생물, 식물 세포, 동물 세포) 배양 상청, 정제 또는 부분 정제 폴리펩티드, 해양 생물, 식물 또는 동물 등 유래의 추출물, 토양, 랜덤 파지 펩티드 디스플레이 라이브러리를 들 수 있다.
스크리닝 키트
본 발명의 스크리닝 키트는, 릴락신-3 수용체, 바람직하게는 SALPR 또는 상기 세포막 분획(즉, SALPR을 함유하는 세포막 분획), 또는 상기 세포(즉, SALPR을 함유하는 세포)를 포함한다. 상기 스크리닝 키트는, 원하는 바에 따라, 여러 가지의 시약, 예를 들면 표지한 릴락신-3, 비표지의 릴락신-3, 결합 반응용 완충액, 및/또는 세정용 완충액, 설명서, 기구를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로는, 상기 스크리닝 키트는 SALPR 또는 상기 세포막 분획 또는 상기 세포를 포함하고, 원하는 바에 따라 표지한 천연 리간드(즉, 릴락신-3), 비표지의 천연 리간드, 및/또는 결합 반응용 완충액, 설명서, 기구를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태의 스크리닝 키트는, 릴락신-3 수용체, 바람직하게는 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는 SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)하고, 또한, cAMP 응답 서열(CRE)DL 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하는 세포를 포함하고, 원하는 바에 따라, 알칼리포스파타아제 또는 루시페라아제 등의 기질, 아데닐산시클라아제 활성화제(예를 들면 FSK), 천연 리간드(즉, 릴락신-3) 및/또는 결합 반응용 완충액, 설명서, 기구를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태의 스크리닝 키트는, 릴락신-3 수용체, 바람직하게는 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는, SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)하고, 또한, cAMP 응답 서열(CRE)이 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하는 세포와, CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하는 것의, SALPR을 세포막 상에 발현하고 있지 않은 세포를 포함하고, 원하는 바에 따라, 리포터 유전자 산물의 기질, 아데닐산시클라아제 활성화제(예를 들면 FSK), 및/또는 결합 반응용 완충액, 설명서, 기구를 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물을 함유하는 의약
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물은, 섭식을 촉진 또는 억제하는 화합물, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물, 또는 비만을 촉진 또는 억제하는 화합물이다. 해당 화합물은 염을 형성하여도 되고, 약학적으로 허용할 수 있는 염을 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물 또는 그의 염은, 섭식(또는 식욕) 조절에서의 어떠한 이상에 기인하는 질환의 치료, 체중 조절에서의 어떠한 이상에 기인하는 질환의 치료, 비만 조절에서의 어떠한 이상에 기인하는 질환의 치료, 및 릴락신-3 또는 릴락신-3을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 이상에 기인하는 질환의 치료의 의약으로서 이용할 수 있다. 또한, 각종 질환의 발증 또는 각종 질환의 치료(예를 들면 시술(operation)중, 시술후)에 수반하여 증가 또는 감소한 섭식(또는 식욕) 및/또는 체중의 회복을 목적으로 하는 치료의 의약으로서 이용할 수도 있다. 상기 질환은, 예를 들면 소화관의 운동 또는 기능에 관한 질환(예를 들면 설사, 변비, 기능성 변비증, 과민성 장증후군, 소환관 검사시 또는 수술 전후에서의 장관 내용물 배제를 위한 배변 촉진 등), 면역 기능 조절에 관한 질환(예를 들면 만성 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 신장 질환, 강피증, 아토피성 피부염, 기관지 천식, 다발성 경화증, 류머티즘성 간질성 폐렴, 사르코이도시스, 크론병, 염증성 대장염, 간경변, 만성 간염, 극증 간염, 뇌척수염, 중증 근무력증 등), 에너지 대사에 관한 질환(예를 들면 당뇨병, 비만성 당뇨병, 내당능 장해, 케토시스, 아시도시스, 당뇨병성 신경 장해, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증, 고지혈증, 동맥 경화, 협심증, 심근경색, 비만, 비만증, 섭식 장해, 거식증 등), AIDS, 암, 또는 악액질 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에 의해, 릴락신-3 수용체, 바람직하게는 SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드를 통한 세포 자극 활성, 더 구체적으로는, SALPR 또는 그 부분 폴리펩티드에 천연 리간드가 결합하면 일어나는 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 칼슘의 유리, 아데닐산시클라아제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도 활성, 아라키돈산 유리 등)의 저해 작용(SALPR 저해 작용)을 갖는 화합물이 제공된다. 이와 같은 화합물을 함유하는 약제로서, 섭식 억제제, 체중 감소제, 지방량 감소제, 비만 치료제, 당뇨병 치료제 등을 들 수 있다.
얻어진 화합물 또는 그의 염을 단독을 이용하는 것도 가능하지만, 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 배합하여 의약품 조성물로서 이용할 수도 있다. 이 때의 유효 성분의 담체에 대한 비율은, 1∼90중량%의 사이에서 변동될 수 있다. 또 한, 이러한 약제는, 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유동물(예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에, 여러 가지의 형태, 경구 또는 비경구(예를 들면 정맥 주사, 근육 주사, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여) 중 어느 하나의 투여 경로로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물 또는 그의 염을 함유하는 의약 조성물은, 투여 경로에 부합하여 적당한 제형으로 되고, 구체적으로는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 또는 시럽제 등에 의한 경구제, 또는 주사제, 점적제, 리포솜제, 좌약제 등에 의한 비경구제를 들 수 있다. 이들 제제는 통상 이용되고 있는 부형제, 증량제, 결합제, 습윤화제, 붕괴제, 표면 활성화제, 활택제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해 보조제, 방부제, 교미 교취제, 무통화제, 안정화제 등을 이용하여 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 사용 가능한 무독성의 상기 첨가제로서는, 예를 들면 젖당, 과당, 포도당, 전분, 젤라틴, 스테아르산마그네슘, 메틸셀룰로오스, 또는 그의 염, 에탄올, 시트르산, 염화나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다.
이들의 투여 형태로서는, 또한, 필요한 투여량 범위는, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물 또는 그의 염의 선택, 투여 대상, 투여 경로, 제제의 성질, 환자의 상태, 그리고 의사의 판단에 좌우된다. 그러나, 적당한 투여량은 환자의 체중 1㎏당 예를 들면 약 1.0∼1,500㎍, 바람직하게는 약 10∼500㎍ 정도를 투여하는 것이 바람직한 범위이다. 투여 경로의 효율이 서로 다른 것을 고려하면, 필요로 되는 투여량은 광범위하게 변동하는 것이 예측된다. 예를 들면 경구 투여 는 정맥 주사에 의한 투여보다 높은 투여량을 필요로 한다고 예상된다. 이러한 투여량 레벨의 변동은, 당업계에서 잘 이해되고 있는 바와 같은, 표준적 경험적인 최적화 수순을 이용하여 조정할 수 있다.
릴락신 -3의 활성을 저해하는 물질 및 그 사용
본 발명에 사용하는 릴락신-3(즉, 릴락신-3, 개질 폴리펩티드, 상동 폴리펩티드)의 활성을 저해하는 물질에 따르면, 섭식 항진 작용, 체중 증가 작용, 비만 작용을 억제 또는 저해할 수 있다. 따라서, 릴락신-3의 발현을 저해하는 것은, 릴락신-3의 in vivo, ex vivo 및 in vitro에서의 섭식 제어 및 체중 제어에 수반하는 기능(예를 들면 에너지 대사 조절, 성장 등), 비만을 제한하는 데 이용할 수 있는 가능성이 있다.
본 발명에 사용하는 릴락신-3의 활성을 저해하는 물질에는, 해당 활성을 갖는 한 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 릴락신-3을 코드하는 염기 서열의 안티센스 서열을 갖는 DNA나, 릴락신-3을 코드하는 염기 서열을 갖는 이중가닥 RNA(small interfering RNA;siRAN), 리보자임 등 릴락신-3의 발현을 저해하는 것, 또는 릴락신-3의 항체나 당 단백질, 나아가서는 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물 등의 릴락신-3 또는 릴락신-3 수용체(바람직하게는, SALPR)와 상호 작용하여 릴락신-3이 갖는 활성을 저해하는 물질 등을 들 수 있다.
해당 물질은 염을 형성하여도 되고, 약학적으로 허용할 수 있는 염을 들 수 있다. 따라서, 릴락신-3(즉, 릴락신-3, 개질 폴리펩티드, 상동 폴리펩티드)의 활성을 저해하는 물질 또는 그의 염은, 섭식(또는 식욕) 조절에서의 어떠한 이상에 기인하는 질환의 치료, 체중 조절에서의 어떠한 이상에 기인하는 질환의 치료, 비만 조절에서의 어떠한 이상에 기인하는 질환의 치료, 및 릴락신-3 또는 릴락신-3을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 이상에 기이하는 질환의 치료의 의약으로서 이용할 수 있다. 또한, 질환의 발증 또는 질환의 치료(예를 들면 술중, 술후)에 수반하여 증가 또는 감소한 섭식(또는 식욕) 및/또는 체중의 감소를 목적으로 하는 치료의 의약으로서 이용할 수도 있다. 상기 질환은, 예를 들면 소화관의 운동 또는 기능에 관한 질환(예를 들면 설사, 변비, 기능성 변비증, 과민성 장증후군, 소환관 검사시 또는 수술 전후에서의 장관 내용물 배제를 위한 배변 촉진 등), 면역 기능 조절에 관한 질환(예를 들면 만성 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 신장 질환, 강피증, 아토피성 피부염, 기관지 천식, 다발성 경화증, 류머티즘성 간질성 폐렴, 사르코이도시스, 크론병, 염증성 대장염, 간경변, 만성 간염, 극증 간염, 뇌척수염, 중증 근무력증 등), 또는 에너지 대사에 관한 질환(예를 들면 당뇨병, 비만성 당뇨병, 내당능 장해, 케토시스, 아시도시스, 당뇨병성 신경 장해, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증, 고지혈증, 동맥 경화, 협심증, 심근경색, 비만, 비만증, 섭식 장해 등) 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 섭식 억제제, 체중 감소제, 지방량 감소제, 비만 치료제, 당뇨병 치료제 등으로서 사용할 수 있다.
안티센스 핵산이 표적 유전자의 발현을 억제하는 기구로서는, (1) 3중쇄 형성에 의한 전사 개시 저해, (2) RNA 폴리메라아제에 의해 형성되는 국소적 개상 루프 구조 부위와의 하이브리드 형성에 의한 전사 억제, (3) 합성 중의 RNA와의 하이브리드 형성에 의한 전사 저해, (4) 인트론-엑손 접합법에서의 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, (5) 스플라이소솜 형성 부위와의 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, (6) mRMA와의 하이브리드 형성에 의한, mRNA의 세포질로의 이행 억제, (7) 캐핑 부위 또는 폴리 A 부가 부위와의 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, (8) 번역 개시 인자 결합 부위와의 하이브리드 형성에 의한 번역 개시 억제, (9) 리보솜 결합 부위와의 하이브리드 형성에 의한 번역 억제, (10) mRNA 번역 영역 또는 폴리솜 결합 부위와의 하이브리드 형성에 의한 펩티드쇄의 신장 억제, 및 (11) 핵산과 단백질의 상호 작용 부위와의 하이브리드 형성에 의한 유전자 발현 억제를 들 수 있다.(히라시마 및 이노우에 『신생 화학 실험 강좌 2 핵산Ⅳ 유전자의 복제와 발현』일본생화학회 편, 동경화학동인, pp.319-347(1993)).
본 발명에 사용하는 릴락신-3의 안티센스 핵산은, 전술한 (1)∼(11)의 어느 기구에 의해 유전자 발현을 억제하는 핵산이어도 된다. 즉, 발현을 저해하는 목적의 유전자의 번역 영역뿐만 아니라, 비번역 영역의 서열에 의한 안티센스 서열을 포함하는 것이어도 된다. 안티센스 핵산을 코드하는 DNA는, 그 발현을 가능하게 하는 적당한 제어 서열 하에 연결하여 사용될 수 있다. 안티센스 핵산은, 표적으로 하는 유전자의 번역 영역 또는 비번역 영역에 대하여 완전하게 상보적일 필요는 없고, 효과적으로 해당 유전자의 발현을 저해하는 것이면 된다. 이와 같은 안티센스 핵산은, 적어도 15bp 이상, 바람직하게는 100bp 이상, 더욱 바람직하게는 500bp 이상이고, 통상 3000bp 이내, 바람직하게는 2000bp 이내, 더 바람직하게는 1000bp 이내의 장쇄를 갖고, 표적 유전자의 전사 산물의 상보쇄에 대하여 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상 동일하다. 이와 같은 안티센스 핵산은, 릴락 신-3의 서열 정보를 기초로, 포스포로티오네이트법(Stein(1988) Nucleic Acids Res. 16: 3209-21) 등에 의해 조제할 수 있다.
리보자임이란, RNA를 구성 성분으로 하는 촉매의 총칭으로서, 크게 라지 리보자임(large ribozyme) 및 스몰 리보자임(small libozyme)으로 분류된다. 라지 리보자임은, 핵산의 인산에스테르 결합을 절단하고, 반응 후에 5'-인산과 3'-히드록실기를 반응 부위에 남기는 효소이다. 라지 리보자임은, 추가로 (1) 구아노신에 의한 5'-스플라이스 부위에서의 트랜스에스테르화 반응을 행하는 그룹Ⅰ 인트론 RNA, (2) 래리어트 구조를 거치는 이단계 반응에 의해 자기 스플라이싱을 행하는 그룹Ⅱ 인트론 RNA, 및 (3) 가수 분해 반응에 의한 tRNA 전구체를 5'측에서 절단하는 리보뉴클레아제 P의 RNA 성분으로 분류된다. 이에 대하여, 스몰 리보자임은, 비교적 작은 구조 단위(40bp 정도)이고, RNA를 절단하여, 5'-히드록실기와 2'-3' 환상 인산을 발생시킨다. 스몰 리보자임에는, 해머 헤드형(Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228:225), 헤어핀형(Buzayan (1986) Nature 323: 349; Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751: 기쿠치 히로시(1992) 화학과 생물 30:112) 등의 리보자임이 포함된다. 리보자임은, 개변 및 합성이 용이하기 때문에 다양한 개량 방법이 공지이고, 예를 들면 리보자임의 기질 결합부를 표적 부위 근처의 RNA 서열과 상보적으로 되도록 설계함으로써, 표적 RNA 중의 염기 서열 UC, UU 또는 UA를 인식하여 절단하는 해머 헤드형 리보자임을 만들 수 있다(Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228: 225; 코이즈미 마코토 및 오오츠카 에이코 (1990) 단백질 핵산 효소 35: 2191; Koizumi et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7059). 헤어핀형 리보자임에 대해서도, 공지의 방법에 따라서 설계, 제조가 가능하다(Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751; 기쿠치 히로시(1992) 화합과 생물 30: 112).
1998년에, 선충에서 RNA끼리가 서로 방해하여 기능을 상실하는 현상(RNA 간섭)이 관찰되었다(Fire et al. (1998) Nature 391: 806-11). RNA 간섭이란, 이중가닥의 인공 RNA를 세포에 도입함으로써, 동일한 염기 서열을 갖는 RNA가 분해되는 현상이다. 그 후의 연구에 의해, RNA 간섭 등의 RNA 사일런싱의 현상은, 결함을 갖는 mRNA의 배제, 및 트랜스포존, 바이러스 등의 기생체에 대한 방어를 위한 세포 기구인 것이 시사되어 있다. 현재로서는, 많은 유전자의 발현을 억제하기 위한 툴로서, 이중가닥 RNA(small interfering RNA; siRNA)가 이용되고 있고, 병의 원인 유전자 등의 발현 억제를 siRNA를 이용하여 행함으로써 병을 치료·예방하는 방법도 검토되고 있다. 본 발명의 siRNA는, 릴락신-3의 mRNA의 전사를 저해하는 한, 특별히 한정되지 않는다. 통상, siRNA는, 표적 mRNA의 서열에 대한 센스쇄 및 안티센스쇄의 조합으로서, 적어도 10개부터 표적 mRNA와 동일한 개수까지의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 바람직하게는, 15∼75개, 더 바람직하게는 18∼50개, 더욱 바람직하게는 20∼25개의 뉴클레오티드 길이이다. 릴락신-3의 발현을 억제하기 위해서, siRAN는 공지의 방법에 의해 세포에 도입할 수 있다. 예를 들면 siRNA를 구성하는 2개의 RNA쇄를, 단일가닥 상에 코드하는 DNA를 설계하고, 해당 DNA를 발현 벡터에 짜 넣고, 세포를 해당 발현 벡터로 형질 전환하고, siRNA를 헤어핀 구조를 갖는 이중가닥 RNA로서 세포 내에서 발현시킬 수 있다. 트랜스펙션에 의해 지속적 으로 siRNA를 생산하는 플라스미드 발현 벡터도 설계되어 있다(예를 들면 RNAi-Ready pSIREN Vector, RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector(BD Biosciences Clontech사)). siRNA의 염기 서열은, 예를 들면 Ambion website(http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)의 컴퓨터 프로그램을 이용하여 설계할 수 있다. 기능적 siRNA를 스크리닝하기 위한 키트(예를 들면 BD Knockout RNAi System(BD Biosciences Clontech사)) 등도 시판되고 있어 이용 가능하다.
환자의 세포 내에서의 유전자의 발현을 억제하기 위한 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 핵산, 리보자임 및 siRNA를, 직접 조직에 투여하여도 되고, 또는 이들을 발현하도록 작성된 구축물을 갖는 임의의 벡터(예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스 등의 바이러스 유래의 벡터, 리포솜 등을 이용한 비 바이러스 벡터)를, 직접 조직에 투여하여도 된다(in vivo법). 이들은, 예를 들면 근육 주사, 피하 주사, 동맥 내 주사, 정맥 내 주사 등에 의해, 조직 부위로 주입할 수 있다.
또는, 미리 체외에서, 세포에, 본 발명의 안티센스 핵산, 리보자임 및 siRNA를 발현하도록 작성된 구축물을 갖는 벡터를 도입하여도 된다. 얻어진 세포를, 예를 들면 근육 주사, 피하 주사, 동맥 내 주사, 정맥 내 주사 등에 의해 환자의 조직에 주입한다(ex vivo법). 사용 세포는, 환자의 세포와 이종 또는 동종이어도 되지만, 바람직하게는 동종, 더 바람직하게는 환자로부터 채취한 세포이다.
본 발명의 안티센스 핵산, 리보자임 및 siRNA, 또는 이들을 발현하도록 작성 된 임의의 벡터는, 단독으로 이용하는 것도 가능하지만, 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 배합되어, 의약품 조성물(예를 들면 섭식 억제제, 비만 치료제, 당뇨병 치료제)로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 주사제의 형태로 투여하는 경우에는, 의약품 조성물은, 증류수, 염화나트륨 또는 염화나트륨과 무기염의 혼합물 등의 염 용액, 만니톨, 락토오스, 덱스트란, 글루코오스 등의 당 용액, 글리신, 아르기닌 등의 아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염 용액과 글루코오스 용액의 혼합 용액 등을 포함하여도 된다.
이들의 투여량은, 환자의 체중, 연령, 증상, 투여 형태 등에 따라 변동하지만, 당업자라면, 필요에 따라 적당한 투여량을 선택할 수 있다.
본 발명에 사용하는 항체에는, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 항체 단편이 포함된다.
본 발명에 사용하는 모노클로날 항체는, 면역용 항원 및 스크리닝용 항원으로서, 릴락신-3(즉, 릴락신-3, 개질 폴리펩티드, 상동 폴리펩티드) 또는 이들의 부분 단편을 이용하는 것을 제외하고, 그 자체 공지의 수단에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면 상기 면역용 항원을 이용하여 마우스를 면역하고, 그 마우스로부터 취득한 비장 세포와, 마우스 골수종 세포를, 세포 융합법(Nature, 256, 495(1975)), 또는 전기 세포 융합법(J. Immunol. Method, 100, 181-189(1987))을 이용하여 세포 융합하고, 상기 스크리닝용 항원을 이용하여 스크리닝함으로써, 본 발명에 사용하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있다.
상기 하이브리도마를 배양하는 배지로서는, 하이브리도마의 배양에 적합한 배지이면 되고, 바람직하게는 덜베코씨 변법 이글씨 최소 필수 배지(Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium)에 태아 소 혈청, L-글루타민, L-피루브산 및 항생 물질(페니실린 G 및 스트렙토마이신)을 포함하는 배지가 이용된다. 상기 하이브리도마의 배양은, 배지 중에서 행하는 경우에는, 5% CO2 농도, 37℃의 조건 하에서 약 3일간 행할 수 있다. 또한, 마우스의 복강 내에서 배양하는 경우에는, 약 14일간으로 행할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 배양액 또는 마우스의 복수로부터, 단백질의 분리 및 정제 상법에 따라서, 상기 모노클로날 항체를 분리 및 정제하는 것이 가능하다. 이와 같은 방법으로서는, 예를 들면 황안염석, 이온 교환 셀룰로오스를 이용하는 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 분자체 겔을 이용하는 분자체 컬럼 크로마토그래피, 프로테인 A 결합 다당류를 이용하는 친화성 컬럼 크로마토그래피, 투석 또는 동결 건조 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 사용하는 폴리클로날 항체도, 면역용 항원 및 스크리닝용 항원으로서, 릴락신-3(즉, 릴락신-3, 개질 폴리펩티드, 상동 폴리펩티드) 또는 이들의 부분 단편을 이용하는 것을 제외하고, 그 자체 공지의 방법, 예를 들면 이하에 나타내는 방법에 의해 조제할 수 있다. 즉, 항원을 포함하는 생리 식염수를 등량의 프룬드씨 완전 애주번트(Freund's complete adjuvant) 또는 불완전 애주번트, 또는 그 등가물, 예를 들면 헌터스 티터맥스(Hunter's TiterMaxTM)(푸나코시사)와 유화 혼합하여, 포유동물(특히는 토끼 또는 염소 등)의 피하, 복강 내 또는 근육 내 등의 어느 하나에 투여한다(초회 면역). 이후, 2∼4주간의 간격으로 마찬가지의 조작을 행하여, 수회 면역한다. 최종 면역으로부터 1∼2주간 후에 포유동물의 경동맥 또는 심장으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 황산암모늄에 의해 염석함으로써 조제할 수 있다.
본 발명에 사용하는 항체 단편은, 상기 항체(모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 포함함)의 부분 단편이며, 또한, 원래의 항체와 동일한 반응 특이성을 갖는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 항체 단편으로서는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv를 들 수 있다. 본 발명에 사용하는 항체 단편은, 예를 들면 상기에 의해 얻어질 수 있는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 통상의 방법에 의해 단백질 분해 효소(예를 들면 트립신 등)에 의해 소화하고, 계속해서, 단백질의 분리 및 정제의 통상의 방법에 따라서 얻을 수 있다.
또한 다른 양태에 따르면, 본 발명에 사용하는 항체는, 국제 공개 제01/068862호 팸플릿, 일본 특허 공개 2002-345468호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한, 공지로 된 릴락신-3의 항체를 사용할 수 있고, 예를 들면 일본 특허 공개 2002-345468호 명세서의 실시예에 기재된 항체(모노클로날 항체:HK4-144-10)를 들 수 있다.
본 발명에 사용하는 항체는, 의약품 조성물로서 이용할 수도 있고, 예를 들면 섭식(또는 식욕) 억제제, 비만 치료제, 당뇨병 치료제로서 사용할 수 있다. 본 발명에 사용하는 항체는, 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 배합하여 의약품 조성 물로서 이용할 수 있다. 이 때의 유효 성분의 담체에 대한 비율은, 1∼90중량%의 사이에서 변동될 수 있다. 또한, 이러한 약제는, 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유동물(예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에, 여러 가지의 형태, 경구 또는 비경구(예를 들면 정맥 주사, 근육 주사, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여) 중 어느 하나의 투여 경로로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체를 함유하는 의약 조성물은, 투여 경로에 부합하여 적당한 제형으로 되고, 구체적으로는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 또는 시럽제 등에 의한 경구제, 또는 주사제, 점적제, 리포솜제, 좌약제 등에 의한 비경구제를 들 수 있다. 이들 제제는 통상 이용되고 있는 부형제, 증량제, 결합제, 습윤화제, 붕괴제, 표면 활성화제, 활택제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해 보조제, 방부제, 교미 교취제, 무통화제, 안정화제 등을 이용하여 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 사용 가능한 무독성의 상기 첨가제로서는, 예를 들면 젖당, 과당, 포도당, 전분, 젤라틴, 스테아르산마그네슘, 메틸셀룰로오스, 또는 그의 염, 에탄올, 시트르산, 염화나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다.
이들의 투여 형태로서는, 또한, 필요한 투여량 범위는, 항체의 선택, 투여 대상, 투여 경로, 제제의 성질, 환자의 상태, 그리고 의사의 판단에 좌우된다. 그러나, 적당한 투여량은 환자의 체중 1㎏당 예를 들면 약 0.01∼30㎎, 바람직하게는 약 0.1∼10㎎ 정도를 투여하는 것이 바람직한 범위이다. 투여 경로의 효율이 서로 다른 것을 고려하면, 필요로 되는 투여량은 광범위하게 변동하는 것이 예측된다. 예를 들면 경구 투여는 정맥 주사에 의한 투여보다 높은 투여량을 필요로 한다고 예상된다. 이러한 투여량 레벨의 변동은, 당업계에서 잘 이해되고 있는 바와 같은, 표준적 경험적인 최적화 수순을 이용하여 조정할 수 있다.
릴락신-3 또는 릴락신-3 수용체(바람직하게는 SALPR)와 상호 작용하고, 릴락신-3의 활성을 저해하는 물질은, 본 발명의 스크리닝법에 의해 얻을 수 있다. 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물의 적합한 예로서, 후술하는 실시예에 기재된 1,2,5-옥사디아졸로[3,4-a]1,2,5-옥사디아졸로[3,4-e]1,2,5-옥사디아졸로[3,4-i]1,2,5-옥사디아졸로[3,4-m][16]아눌렌(이하, 「화합물 1」이라고 칭하는 경우도 있음)을 들 수 있다. 해당 화합물의 투여 형태는, 상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물을 함유하는 의약에 관한 기재를 참조하면 된다.
본 명세서에서 「치료」란, 일반적으로, 원하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 얻을 수 있는 것을 의미한다. 효과는, 질병 및/또는 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 점에서는 예방적이고, 질병 및/또는 질병에 기인하는 악영향의 부분적 또는 완전한 치유라고 하는 점에서는 치료적이다. 본 명세서에서 「치료」란, 포유동물, 특히 인간의 질병의 임의의 치료를 포함하고, 예를 들면 이하의 (a)∼(c)의 치료를 포함한다.
(a) 질병 또는 증상의 소인을 가질 수 있지만, 아직 갖고 있다고 진단되지 않은 환자에서, 질병 또는 증상이 일어나는 것을 예방하는 것;
(b) 질병 증상을 저해하는, 즉, 그 진행을 저지 또는 지연하는 것;
(c) 질병 증상을 완화하는 것, 즉, 질병 또는 증상의 후퇴, 또는 증상의 진 행의 역전을 일으키는 것.
또한, 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서에 도입된다.
이하, 실시예에 의해 본 발명에 대하여 더 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] SALPR 을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조제
SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 단리는, 서열 번호 3으로 표시되는 핵산 서열을 기초로 하여, 이하와 같이 행하였다. 서열 번호 3에서는 1857 염기쌍이 나타나 있고, SALPR을 코드하는 영역은, 361번째부터 1770번째(1410 염기쌍, 470 아미노산 잔기)로 되어 있다(진뱅크 등록번호 NM_016568). PCR(polymerase chain reaction)에 의해 유전자를 단리하기 위해서, 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 표시되는 PCR 프라이머를 통상의 방법에 따라서 제작하였다.
인간 게놈 DNA(Roche Diagostics법)를 주형으로 하여 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 조합으로 이루어지는 PCR 프라이머와, 익스팬드 하이 피델리티 PCR 시스템(Expand High Fidelity PCR System)(Roche Diagnostics사)을 이용하고, (98℃ 1분-57℃, 1분-72℃ 3분)을 첨부의 조작 방법에 따라서, 30회 반복함으로써 PCR을 행하였다. 그 결과, 약 1,400 염기쌍의 DNA 단편을 얻엇다.
이 DNA 단편을, pCR2.1(Invitrogen사)에 삽입하고, ABI 프리즘 DNA 시퀀싱 키트(ABI prism DNA sequencing kit)(Perkin-Elmer Applied Biosystems사)에 의해 서열을 확인하였다. 그 결과, 서열 번호 5 및 6으로 이루어지는 프라이머의 조합에 의해 얻어진 pCR2.1-SALPR에 삽입된 1410 염기쌍의 서열은, 서열 번호 3에서의 361번째부터 1770번째와 길이는 동일하였지만, 서열 중에는 1개의 변이가 보였다. 이 변이는, 해당 부위의 핵산 서열로부터 번역되는 아미노산에는 영향을 미치지 않는 것은 명백하고, SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있었다.
[실시예 2] 레트로바이러스 벡터 플라스미드의 조제
pBabe Puro(Morgenstern, J. P. and Lnad, H. Nucleic Acids Res. vol. 18 3587-3596(1990))(서열 번호 7)로부터 SalI 및 ClaI로 절단함으로써 SV40 promoter-puro(r) 영역을 제거하고, 말단을 클레노브 단편(Klenow fragment)에 의해 평활화하였다. 여기에 pIREShyg(Clontech사)로부터 NsiI 및 XbaI로 절단함으로써 IRES-hyg(r) 영역을 잘라내고, T4 폴리메라아제에 의해 말단을 평활화한 것을 삽입하여 pBabeXIH를 얻었다.
pBabeXIH로부터 SspI 및 BamHI로 절단함으로써 5'-LTR-패키징 시그날 (packaging signal)을 제거하였다. 여기에 pCLXSN(IMGENEX사)으로부터 SspI 및 BamHI로 절단함으로써 잘래낸 5'LTR-CMV 프로모터-패키징 시그날을 삽입하여 pBabeCLXIH를 얻었다.
[실시예 3] SALPR 유전자 도입용 레크로바이러스 벡터 플라스미드의 조제
상기 실시예 2에 기재한 레트로바이러스 발현용 플라스미드 pBabeCLXIH를 제한 효소 HpaI로 절단하였다. 여기에 상기 실시예 1에서 얻은 pCR2.1-SALPR로부터 EcoRV로 절단함으로써 SALPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 잘라내고, T4 폴리메 라아제에 의해 말단을 평활화한 것을 삽입하여 pBabeCL(SALPR)IH를 얻었다(도 1).
[실시예 4] SALPR 유전자 도입용 레트로 바이러스 벡터의 조제
2×106개의 293-EBNA 세포(Invitrogen사)를 10㎝ 콜라겐 코트 디시(IWAKI사)에서 DMEM(Sigma사)-10% 태아 소혈청(FCS)-페니실린(penicillin) 100units/ml 스트렙토마이신(streptomycin) 100㎍/ml(PS)(이하, 「EBNA 배양액」이라고 칭함) 10ml를 이용하여 배양하였다. 익일, pV-gp(pVPack-GP(Stratagene사)로부터 NsiI 및 XbaI로 절단함으로써 IRES-hisD를 제거하고 T4 폴리메라아제에 의한 평활화 후, 자기 환화한 것), pVPack-VSV-G(Stratagene사), 및 실시예 3에서 얻은 SALPR 유전자 도입용 레트로바이러스 벡터 플라스미드(pBabeCL(SALPR)IH) 각각 3.3㎍을 리포펙션 시약인 TransIT(Panvera사)를 이용하여, 상기 293-EBNA 세포에 트랜스펙션하였다. 그 6∼12시간 후에 EBNA 배양액을 교환하고, 37℃에서 배양을 계속하였다.
트랜스펙션 2일 후에 배양액을 회수하고, 1,200×g으로 10분간 원심하였다. 그 상청을 0.45㎛의 필터(Millipore사)로 여과한 것을 비농축 레트로바이러스 벡터로 하여, 또한 바이러스 벡터의 농축을 이하와 같이 행하였다.
초원심용 튜브50 울트라-클리어 튜브(Ultra-Clear Tubes)(Beckman사)를 70% 에탄올로 소독 후에 증류수로 헹구고, 여기에 비농축 바이러스 벡터 약 35㎖를 넣었다. 이것을 초원심 로터 SW28(Beckman사)에 넣고, 초원심 장치 XL-90(Beckman사)을 사용하여 19,500rpm 100분간의 원심 조작을 행하였다. 원심 후, 상청을 버린 튜브를 얼음에 넣어 방치하였다. 1시간 후, 튜브 벽면에 남은 배양액 약 100㎕ 정도의 농축 바이러스 벡터 용액이 얻어졌다.
[실시예 5] 사이클릭 AMP 응답 서열을 포함하는 리포터계 도입 세포 SE302 의 구축
(1) 사이클릭 AMP 응답 서열을 포함하는 리포터 DNA 의 작성
공표된 논문(Durocher et al. Anal Biochem 2000 284(2):316-26)을 참고로 cAMP에 부합한 전사가 보이는 유니트를 이하와 같이 구축하였다.
cAMP 반응성 요소(responsive element)(CRE)를 포함하는 유니트의 작성을 위해서, CREx2hb용으로서 서열 번호 8 및 서열 번호 9, CREx2bp용으로서 서열 번호 10 및 서열 번호 11로 표시되는 올리고 DNA를 통상의 방법에 따라서 작성하였다.
각각의 조합으로 이루어지는 올리고 DNA를 95℃로 열 처리 후, 서서히 온도를 실온까지 낮춤으로써 이중가닥 DNA(CREx2hb, CREx2bp)를 형성시켰다. CREx2hb를 HindIII, BamHI, CREx2bp를 BamHI, PstI로 소화함과 함께, pBluescriptIISK(+)(Stratagene사)를 HindIII, PstI로 소화하였다. 소화한 DNA를 전기 영동하여 양단에 제한 효소 소화 부위를 갖는 DNA를 정제한 후, 이들 3개의 DNA(CREx2hb, CREx2bp, pBluescriptIISK(+))를 한번에 연결하고(ligation), 얻어진 플라스미드의 서열을 해석하여, CRE4/pBluescriptIISK를 작성하였다.
다음으로 VIP(vasoactive intestinal peptide) 프로모터를 포함하는 DNA를 얻기 위해서 서열 번호 12 및 서열 번호 13으로 표시되는 PCR 프라이머를 통상의 방법에 따라서 작성하였다.
인간 게놈 DNA(Roche Diagostics사)를 주형으로 하고, 서열 번호 12 및 서열 번호 13의 조합으로 이루어지는 PCR 프라이머와, 재조합 Tag 폴리머라아제(Takara사)를 이용하여 (94℃ 30초-55℃ 30초-70℃ 1분)을 35회 반복함으로써 PCR한 결과, 264 염기쌍의 DNA(서열 번호 14)가 얻어졌다. 이 264 염기쌍의 DNA를 PstI로 소화함과 함께 CRE4/pBluescriptIISK(+)의 PstI 사이트에 삽입하고, 얻어진 플라스미드의 서열을 확인하여 CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)를 작성하였다(도 2A). 얻어진 CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)로부터 HindIII와 SmaI로 소화한 후, 얻어진 CRE4VIP프로모터 단편의 말단 평활화를 행하였다.
전술한 발현용 바이러스 벡터 플라스미드 pBabeCLXIH로부터 IRES∼hygro(r) 영역을 제거한 pBabeCLX를 작성하였다(도 2B). pBabeCLX로부터 레트로바이러스 본래의 엔핸서 활성(LTR) 중의 NheI∼NarI 영역을 제거함으로써 얻어진 외래성 프로모터 도입용 레트로바이러스 벡터 플라스미드에, CRE와 VIP 프로모터를 포함하는 서열과, 리포터 유전자인 태반 유래 알칼리포스파타아제(PLAP)(Goto 등, Molecular Pharmacology, 49, p.860-873, 1996)를 도입하고, pBabeCLcre4vPdNN을 얻었다(도 2C).
(2) 사이클릭 AMP 응답 서열을 포함하는 리포터계 도입 세포 SE302 의 수립
사이클릭 AMP 응답 서열에 의해 리포터 유전자 PLAP가 유도되는 레트로바이러스벡터 플라스미드 pBabeCLcre4vPdNN을 이용하고, 실시예 4에 기재된 방법에 준하여 레트로바이러스 벡터를 조제하였다. 조제한 레트로바이러스 벡터를 HEK293 세포에 도입하고, 한계 희석법에 의해 세포를 클론화하여, PLAP 유도의 반응성이 가장 좋았던 클론(이하, 「SE302 세포」라고 칭함)을 이하의 실험에 이용하였다.
[실시예 6] SALPR 유전자 도입용 레트로바이러스 벡터에 의한 SALPR 발현 세포의 조제
상기한 실시예 4에서 조제한 레트로바이러스 벡터에 의한 세포로의 SALPR 유전자 도입을 이하와 같이 행하였다.
상기 실시예 5에서 구축한 3×103개의 SE302 세포를 96 웰 플레이트(아사히테크노글라스사)에 DMEM(SIGMA사)-10% 태아 소혈청(FCS)-PS(이하, 「배양액」이라고 칭함) 100㎕를 이용하여 배양하였다. 익일, 실시예 4에서 조제한 레트로바이러스 벡터를 적절히 희석하고, 그 100㎕를 배양액으로 조제한 폴리브렌(polybrene)(최종 농도 8㎍/ml)(별명 헥사디메트린 브로미드 (hexadimethrine bromide); Sigma사)과 함께 SE302 세포에 첨가하였다. 그 익일, 배양액을 500㎍/ml의 하이그로마이신(Hygromycin)(Invitrogen사) 함유의 배양액 200μl와 교환하여 배양하였다. 이 조건에서 증식하여 온 SALPR 유전자 도입 SE302 세포(이하, 「SALPR-SE302 세포」라고 칭함)를 적시에 계대하여 실험에 이용하였다.
[실시예 7] SALPR - SE302 세포에서의 폴스콜린 첨가에 의해 증가시킨 전사 활성의 릴락신 -3에 의한 억제
상기 실시예 6에서 구축한 SALPR-SE302 세포를, 전사 활성 측정용 배지(DMEM-10% FBS(65℃에서 30분 비동화)를 첨가한 것)에서 현탁한 후, 96 웰 플레이트(Beckton Dickison사)에 1구멍당 1×104 세포로 되도록 뿌렸다. 익일, 아세이용 배지(DMEM에 0.1% 소 혈청 알부민을 첨가한 것)로 희석한 각 농도의 릴락신- 3(Relaxin-3)(Phoenix Pharamaceuticals사) 또는 인슐린(Invitrogen사)을 첨가하고, 그 후 폴스콜린(Carbio Chem사)을 최종 농도 1μmol/L로 되도록 첨가하였다. 다시 1일 배양 후, 세포 상청을 15㎕ 회수하여 화학 발광 측정용의 96 웰 플레이트(스미토모 베크라이트사)에 옮기고, 아세이용 완충액(280mmol/L Na2CO3-NaHCO3, 8mmol/L MgSO4, pH10)을 60㎕, 루미포스(Lumiphos) 530(Lumigen사) 70㎕를 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시킨 후, 각 well의 화학 발광을 융합 플레이트 리더(Perkin Elmer사)로 측정하여 전사 활성량으로 하였다. 폴스콜린 1μmol/L를 첨가한 세포 상청의 전사 활성을 100%로 하고, 폴스콜린을 첨가하지 않은 세포의 상청의 활성을 0%로 하여 각 시험 샘플을 첨가한 세포 상청 중의 활성을 %로 표시하였다(도 3).
그 결과, 폴스콜린에 의한 전사 활성의 상승을 릴락신-3은 SALPR의 활성화를 통하여 억제하는 것을 알 수 있었다. 이 전사 활성의 상승은 관련 펩티드인 인슐린에서는 영향이 없었기 때문에, 릴락신 -3 특이적인 반응인 것을 알 수 있었다. 즉 이 실험계를 이용함으로써, 릴락신-3에 의한 SALPR의 활성화에 영향을 미치는 화합물, 물질을 판별한 수 있음이 나타났다.
[실시예 8] SALPR - SE302 세포를 이용한 릴락신 -3 길항 물질의 스크리닝
실시예 7에서 나타낸 실험계를 이용하여, 릴락신-3의 작용을 길항하는 화합물의 스크리닝을 실시하고, 길항 작용을 갖는 화합물을 발견하였다.
SALPR-SE302 세포를, 전사 활성 측정용 배지(DMEM-F12-10% FBS(65℃에서 30 분 비동화)를 첨가한 것)에서 현탁한 후, 384 웰 플레이트(Greiner사)에 1구멍당 5000세포로 되도록 뿌렸다. 익일, 폴스콜린(Fermentek사) 용액에 피험 화합물(1,2,5-옥사디아졸로[3,4-a]1,2,5-옥사디아졸로[3,4-e]1,2,5-옥사디아졸로[3,4-i]1,2,5-옥사디아졸로[3,4-m][16]아눌렌(화합물 1))을 용해하고, 세포 상청에 첨가하였다(최종 농도:폴스콜린 3μmol/L, 피험 화합물 20㎍/mL, DMSO(dimethylsurfoxide) 0.5%). 그 후, 아세이용 배지(DMEM-F12에 0.1% 소 혈청 알부민을 첨가한 것)로 희석한 릴락신-3(주식회사 펩티드연구소)을 최종 농도 3nmol/L로 되도록 첨가하였다. 다시 1일 배양 후, 세포 상청 5㎕를 회수하여 화학 발광 측정용의 384 웰 플레이트(Corning사)에 옮기고, 아세이용 완충액을 20μL, 루미포스 530을 25μL 첨가하여, 실온에서 2시간 반응시킨 후, 각 well의 화학 발광을 ARVOsx3 플레이트 리더(Perkin Elmer사)로 측정하여 전사 활성량으로 하였다. SALPR을 발현하고 있지 않은 SE302 세포에 대해서도 마찬가지로 조작하고, 피험 물질의 특이성을 확인하였다.
그 결과, SALPR-SE302 세포에서의 폴스콜린에 의한 전사 활성의 상승을 릴락신-3이 억제하고, 피험 물질인 화합물 1이 릴락신-3에 의한 전사 활성의 억제에 길항하였다(도 4A). 또한, SALPR을 발현하고 있지 않은 SE302 세포에서의 검토에서는, 화합물 1이 전사 활성을 상승시키는 일은 없었다(도 4B). 따라서 피험 물질에 의한 작용이, SALPR의 릴락신-3에 의한 활성화를 특이적으로 억제하는 화합물임을 확인할 수 있었다.
[실시예 9] 릴락신 -3 뇌실 내 투여에 의한 섭식량 항진 작용
(1) 실험 동물과 뇌실 내 투여를 위한 전처치
위스타(Wistar) 수컷 래트(7주령, 닛폰찰스리버사)에 실험 동물용 사료 MF(오리엔탈효모사)를 주어 순화하였다. 래트(250∼300g)의 마취 하에서, 측뇌실에 캐뉼러를 삽입하였다. 그 후 일주간 이상 사육한 후에 투여 실험을 행하였다.
(2) 릴락신 -3 용액의 조제
60㎍의 릴락신-3(Phoenix Pharmaceutical사)을 DMSO로 용해한 후, 최종 농도가 200μmol/L로 되도록 인공적 척수 수액(artificial cerebrospinal fluid)을 첨가하여 조제하였다. 석출한 침전은 원심 조작을 하여 제거하고, 상청을 릴락신-3 투여액으로서 이용하였다. 래트로의 투여량(투여액 중의 릴락신-3 농도)은 실시예 7에 나타난 실험계에서, 릴락신-3에 의한 표준 곡선을 이용하여 산출한 결과, 약 50pmol/래트였다.
(3) 릴락신 -3 용액의 뇌실 내 투여
가이드 캐뉼러를 장착한 래트를 2군으로 나누고(1군 6마리), 릴락신-3 투여액 또는 비히클(릴락신-3을 제외한 상기 (2)와 동일한 조성의 용액)을 5μL/2분의 속도로 인퓨전 펌프를 이용하여 래트에 투여하였다.
(4) 섭식량의 측정
투여액의 뇌실 내 투여 후 바로, 래트는 미리 중량을 측정한 먹이를 담아 둔 케이지에 넣고 자유 섭식시켰다. 2시간 후에 먹이의 감소량을 측정함으로써 섭이량을 산출하였다. 각 군의 평균 섭이량과 표준편차를 도 5에 나타낸다. 그 결과, 투여 후 2시간의 섭이량은, 릴락신-3을 약 50pmol 투여한 래트에서는 대조군의 비 히클 투여의 래트에 비하여 유의하게 증가하였다(t-검정, p＜0.01). 따라서, 릴락신-3은 섭식 행동을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
[실시예 10] 릴락신 -3의 단회 뇌실 내 투여시의 혈중 렙틴 농도 상승
혈중 렙틴 농도의 측정
섭이량 측정 후(투여 후 약 3시간 후)에 상기 래트를 넴부탈로 마취하고, 그 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 1,750×g으로 15분간 원심하고, 그 상청을 -80℃로 보존하였다. 후일, 상청 중의 렙틴량을 래트 렙틴 정량 ELISA 키트(아마샴 바이오사이언스사)에 의해 정량하였다.
그 결과, 단회의 릴락신-3 투여 래트에서는 대조군의 비히클 투여의 래트로부터 혈중의 렙틴 농도가 유의하게 상승하는 것이 명백하게 나타났다(t-검정, p＜0.05, 도 6).
[실시예 11] 릴락신 -3 지속 투여에 의한 체중 증가·비만 작용의 항진
(1) 릴락신 -3 용액의 조제
릴락신-3(펩티드연구소사)을 생리 식염수로 100μmol/L로 되도록 용해하고, 비히클(생리 식염수) 또는 릴락신-3 용액을 삼투압 펌프(alzet osmotic pump model1002(DURECT사) 투여량 6μL/일)와 튜브·투여용 캐뉼러에 주입하여 이들을 접속하였다.
(2) 실험 동물과 뇌실 내 투여를 위한 처치
위스타 수컷 래트(6주령, 닛폰찰스리버사)에 실험 동물용 사료 MF(오리엔탈효모사)를 주고, 개별 사육으로 4일간 순화하였다. 상기 래트(250∼270g)를 마취 하에서, 측뇌실에 가이드 캐뉼러를 삽입하고, 삼투압 펌프를 피하에 넣었다.
(3) 체중 증가 작용 및 섭이량의 측정
수술일을 0일째로 하여 자유 섭식 하에서 사육하고, 매일 아침, 체중과 먹이량을 측정하였다. 0일째부터의 체중의 증가량을 도 7에 나타냈다. 또한, 섭이량은, 수술 전일부터 수술일까지를 0일째로 하고, 1일당 먹이의 감소량을 섭이량으로서 나타냈다(도 8).
수술 후 1일째부터 릴락신-3 투여 래트군에서는 유의한 체중의 증가가 확인되었다. 또한, 릴락신-3 투여군의 섭이량도 1일째부터 유의적으로 증가하였다(t-검정, ** p＜0.01, * p＜0.05).
(4) 지방량, 혈중 렙틴량 및 인슐린량의 정량
실험 종료일(14일째)에 체중과 먹이량을 측정한 후, 래트를 넴부탈로 마취하고, 정소 주위의 지방을 꺼내서 양 정소 주위의 지방 중량을 합하여 측정하였다(도 9). 또한, 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 1,750×g으로 15분간 원심하고, 그 상청을 -80℃에서 보존하였다. 후일, 상충 중의 렙틴량을 래트 렙틴 측정 키트(L)(IBL사)에 의해 정량하였다(도 10A). 또한 상청 중의 인슐린량을 초고감도 래트 인슐린 측정 키트(모리나가 생화학연구소사)에 의해 정량하였다(도 10B).
그 결과, 정소 주위 지방량은 대조군의 비히클 투여의 래트에 비교하여, 릴락신-3 지속 투여군에서 유의하게 증가하였다. 또한 혈중의 렙틴 농도와 인슐린 농도도, 릴락신-3을 지속 투여한 래트에서 유의하게 상승하고 있는 것이 분명해졌 다(t-검정, ** p＜0.01, * p＜0.05). 따라서, 릴락신-3 투여에 의해 지방 축적을 수반하는 비만 작용이 항진함과 함께, 인슐린량이 증가하는 것이 분명해졌다.
[실시예 12] 릴락신 -3 지속 투여에 의한 체중 증가, 운동량에의 작용
(1) 릴락신 -3 용액의 조제
릴락신-3(펩티드연구소사)을 생리 식염수로 100μmol/L로 되도록 용해하고, 비히클(생리 식염수) 또는 릴락신-3 용액을 삼투압 펌프(alzet osmotic pump model1002(DURECT사) 투여량 6μL/일)와 튜브·투여용 캐뉼러에 주입하여 이들을 접속하였다.
(2) 실험 동물과 뇌실 내 투여를 위한 처치
위스타 수컷 래트(6주령, 닛폰찰스리버사)에 실험 동물용 사료 MF(오리엔탈효모사)를 주고, 개별 사육으로 5일간 순화하였다. 상기 래트(170∼200g)를 마취 하에서, 측뇌실에 가이드 캐뉼러를 삽입하고, 삼투압 펌프를 피하에 넣었다. 수술일을 0일로 하여 운동량의 측정일 이외는 자유 섭식·음수 하에서 사육하고, 매일 아침 체중을 측정하였다(도 11).
상기 실시예 11과 마찬가지로, 투여 후 1일 후부터 릴락신-3 투여 래트군에서는 유의한 체중의 증가가 확인되었다(t-검정, ** p＜0.01, * p＜0.05).
(3) 자발 운동량의 측정
상기 (2)에서, 릴락신-3 투여 래트의 체중 증가 작용에 유의한 차가 인정된 날의 명기 및 암기의 자발 운동량을, 베르사맥스(Versamax)(Accuscan사)를 이용하여 측정하였다. 명기(투여 개시 후 2, 7일 후), 암기(투여 개시 후 3, 8일 후)의 래트를 실험 개시의 1시간 이상 전에 개별 사육대로부터 실험실로 이동하여 순화한 후, 베르사맥스 케이지 내에 래트를 넣고 직후부터 90분간의 행동량을 기록하였다. 90분간의 전체 활동량을 도 12에 나타냈다.
모든 날짜에서 각 군의 래트에서 운동량에는 유의적인 변화는 인정되지 않았다. 즉, 릴락신-3에 의한 체중 증가 작용은 자발 운동량의 변화가 작용하고 있는 것이 아님이 분명해졌다.
본 발명에 따라, 유용한 섭식 항진 작용, 체중 증가 작용 및 비만 작용을 갖는 폴리펩티드, 해당 폴리펩티드를 함유하는 질환 치료제, 해당 폴리펩티드의 수용체의 활성화, 억제화를 하는 화합물, 물질 또는 그의 염의 스크리닝 방법, 해당 스크리닝용 키트, 또는 해당 폴리펩티드의 발현을 저해하는 물질 등을 포함하는 섭식 억제제, 비만 치료제 또는 당뇨병 치료제 등이 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> EISAI CO., LTD. <120> Screening method <130> E1-A0410Y1P <150> JP 2004-31591 <151> 2004-02-09 <150> JP 2004-368509 <151> 2004-12-20 <160> 14 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 429 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(429) <223> <400> 1 atg gcc agg tac atg ctg ctg ctg ctc ctg gcg gta tgg gtg ctg acc 48 Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr 1 5 10 15 ggg gag ctg tgg ccg gga gct gag gcc cgg gca gcg cct tac ggg gtc 96 Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val 20 25 30 agg ctt tgc ggc cga gaa ttc atc cga gca gtc atc ttc acc tgc ggg 144 Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly 35 40 45 ggc tcc cgg tgg aga cga tca gac atc ctg gcc cac gag gct atg gga 192 Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly 50 55 60 gat acc ttc ccg gat gca gat gct gat gaa gac agt ctg gca ggc gag 240 Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu 65 70 75 80 ctg gat 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ttg ctg 1128 Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu 245 250 255 ggc cgc gac agg cag ttc tgg ctg ggc ctc tac cac tcg cag aag gtg 1176 Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val 260 265 270 ctg ttg ggc ttc gtg ctg ccg ctg ggc atc att atc ttg tgc tac ctg 1224 Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu 275 280 285 ctg ctg gtg cgc ttc atc gcc gac cgc cgc gcg gcg ggg acc aaa gga 1272 Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly 290 295 300 ggg gcc gcg gta gcc gga gga cgc ccg acc gga gcc agc gcc cgg aga 1320 Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg 305 310 315 320 ctg tcg aag gtc acc aaa tca gtg acc atc gtt gtc ctg tcc ttc ttc 1368 Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe 325 330 335 ctg tgt tgg ctg ccc aac cag gcg ctc acc acc tgg agc atc ctc atc 1416 Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile 340 345 350 aag ttc aac gcg gtg ccc ttc agc cag gag tat ttc ctg tgc cag gta 1464 Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val 355 360 365 tac gcg ttc cct gtg agc gtg tgc cta gcg cac tcc aac agc tgc ctc 1512 Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu 370 375 380 aac ccc gtc ctc tac tgc ctc gtg cgc cgc gag ttc cgc aag gcg ctc 1560 Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu 385 390 395 400 aag agc ctg ctg tgg cgc atc gcg tct cct tcg atc acc agc atg cgc 1608 Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg 405 410 415 ccc ttc acc gcc act acc aag ccg gag cac gag gat cag ggg ctg cag 1656 Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln 420 425 430 gcc ccg gcg ccg ccc cac gcg gcc gcg gag ccg gac ctg ctc tac tac 1704 Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr 435 440 445 cca cct ggc gtc gtg gtc tac agc ggg ggg cgc tac gac ctg ctg ccc 1752 Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro 450 455 460 agc agc tct gcc 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Ala Met 165 170 175 Ser Val Thr Arg Tyr His Ser Val Ala Ser Ala Leu Lys Ser His Arg 180 185 190 Thr Arg Gly His Gly Arg Gly Asp Cys Cys Gly Arg Ser Leu Gly Asp 195 200 205 Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu 210 215 220 Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys 225 230 235 240 Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu 245 250 255 Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val 260 265 270 Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu 275 280 285 Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly 290 295 300 Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg 305 310 315 320 Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe 325 330 335 Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile 340 345 350 Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val 355 360 365 Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu 370 375 380 Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu 385 390 395 400 Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg 405 410 415 Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln 420 425 430 Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr 435 440 445 Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro 450 455 460 Ser Ser Ser Ala Tyr 465 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sense primer <400> 5 gatatcgccg ccaccatgca gatggccgat gcagccac 38 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An antisense primer <400> 6 gatatctcag taggcagagc tgctgggc 28 <210> 7 <211> 5020 <212> DNA <213> Plasmid <400> 7 ctgcagcctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca 60 gggccaagaa cagatggaac agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt 120 tcctgccccg gctcagggcc aagaacagat ggtccccaga tgcggtccag ccctcagcag 180 tttctagaga accatcagat gtttccaggg tgccccaagg acctgaaatg accctgtgcc 240 ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga 300 gctcaataaa agagcccaca acccctcact cggggcgcca gtcctccgat tgactgagtc 360 gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct cttgcagttg catccgactt gtggtctcgc 420 tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat tgactacccg tcagcggggg tctttcattt 480 gggggctcgt ccgggatcgg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg 540 taagctggcc agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg actgatttta 600 tgcgcctgcg tcggtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa 660 ctgacgagtt ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc 720 gtttttgtgg cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg 780 tggttctggt aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt 840 cggtttggaa ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagca tcgttctgtg ttgtctctgt 900 ctgactgtgt ttctgtattt gtctgaaaat tagggccaga ctgttaccac tcccttaagt 960 ttgaccttag atcactggaa agatgtcgag cggctcgctc acaaccagtc ggtagatgtc 1020 aagaagagac gttgggttac cttctgctct gcagaatggc caacctttaa cgtcggatgg 1080 ccgcgagacg gcacctttaa ccgagacctc atcacccagg ttaagatcaa ggtcttttca 1140 cctggcccgc atggacaccc agaccaggtc ccctacatcg tgacctggga agccttggct 1200 tttgaccccc ctccctgggt caagcccttt gtacacccta agcctccgcc tcctcttctt 1260 ccatccgcgc cgtctctccc ccttgaacct cctctttcga ccccgcctca atcctccctt 1320 tatccagccc tcactccttc tctaggcgcc ggccggatcc cagtgtggtg gtacgtagga 1380 attcgccagc acagtggtcg acctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc 1440 aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg 1500 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1560 agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 1620 ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 1680 ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa 1740 acgctgcttg aggctgaagg tgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1800 gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1860 taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1920 accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1980 tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2040 cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2100 agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2160 gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 2220 gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 2280 tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 2340 acgatcgata aaataaaaga ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa tgaaagaccc 2400 cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac 2460 ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg 2520 gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg 2580 aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 2640 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc cagccctcag cagtttctag agaaccatca 2700 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 2760 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 2820 acaacccctc actcggggcg ccagtcctcc gattgactga gtcgcccggg tacccgtgta 2880 tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga cttgtggtct cgctgttcct tgggagggtc 2940 tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg gggtctttca catgcagcat gtatcaaaat 3000 taatttggtt ttttttctta agtatttaca ttaaatggcc atagttgcat taatgaatcg 3060 gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 3120 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 3180 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 3240 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 3300 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 3360 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 3420 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 3480 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 3540 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 3600 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 3660 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 3720 ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 3780 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 3840 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 3900 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 3960 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagtttgcg gccgcaaatc aatctaaagt 4020 atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 4080 gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 4140 atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 4200 ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 4260 cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 4320 agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 4380 cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 4440 tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 4500 agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 4560 gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 4620 gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg 4680 ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 4740 tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 4800 tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 4860 gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 4920 caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 4980 atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 5020 <210> 8 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sense strand for CREx2hb <400> 8 cccaagcttg atatcgaatt cgacgtcaca gtatgacggc catgggaatt cgacgtcaca 60 gtatgacggc catggggatc ccg 83 <210> 9 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An antisense strand for CREx2hb <400> 9 cgggatcccc atggccgtca tactgtgacg tcgaattccc atggccgtca tactgtgacg 60 tcgaattcga tatcaagctt ggg 83 <210> 10 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sense strand for CREx2bp <400> 10 tgcactgcag gaattcccat ggccgtcata ctgtgacgtc gaattcccat ggccgtcata 60 ctgtgacgtc ggatcccg 78 <210> 11 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An antisense strand for CREx2bp <400> 11 cgggatccga cgtcacagta tgacggccat gggaattcga cgtcacagta tgacggccat 60 gggaattcct gcagtgca 78 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sense primer <400> 12 tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An antisense primer <400> 13 tgcactgcag gtcggagctg actgttctgg 30 <210> 14 <211> 264 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vasoactive intestinal peptide promoter <400> 14 tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg tgacgtcttt cagagcactt tgtgattgct 60 cagtcctaag tataagccct ataaaatgat gggctttgaa atgctggtca gggtagagtg 120 agaagcacca gcaggcagta acagccaacc cttagccatt gctaagggca gagaactggt 180 ggagcctttc tcttactccc aggacttcag cacctaagac agctccaaaa caaaccagaa 240 cagtcagctc cgacctgcag tgca 264

Claims (52)

  1. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 섭식 항진제(feeding-stimulating agent).
  2. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 체중 증가제.
  3. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 지방량 증가제.
  4. (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  5. (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막 분획에 접촉시키는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  9. (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
  10. (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
  13. 제12항에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
  14. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 체중 증가를 필요로 하는 질환의 치료제.
  15. 제14항에 있어서, 질환이 거식증(anorexia) 또는 악액질(cachexia)인 치료제.
  16. (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중 증가 작용을 갖는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  17. (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  20. 제19항에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하 는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  21. (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중 증가 작용을 갖는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
  22. (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
  23. 제22항에 있어서,
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
  25. 제24항에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
  26. (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  27. (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  30. 제29항에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  31. (A) 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정, 및
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
  32. (A) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 그의 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그의 염, 및 피험 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막분획에 접촉시키는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
  33. 제32항에 있어서,
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 키트.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
  35. 제34항에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 키트.
  36. SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 섭식 억제제.
  37. 제36항에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 제7항 또는 제8항의 스 크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
  38. SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 체중 감소제.
  39. 제38항에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 제19항 또는 제20항의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
  40. SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 지방량 감소제.
  41. 제40항에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 제29항 또는 제30항의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
  42. SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 비만 치료제.
  43. 제42항에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 제19항, 제20항, 제29항 또는 제30항 중 어느 한 항의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
  44. SALPR 저해 작용을 갖는 화합물을 함유하는 당뇨병 치료제.
  45. 제44항에 있어서, SALPR 저해 작용을 갖는 화합물이 제19항, 제20항, 제29항 또는 제30항 중 어느 한 항의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제제.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, SALPR이 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제제.
  47. 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물을 인간 또는 인간 이외의 생물에 투여하고, 투여 후의 섭식량을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 섭식을 항진 또는 억제하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  48. 제47항에 있어서, 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물이 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는 화합물인 방법.
  49. 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물을 인간 또는 인간 이외의 생물에 투여하고, 투여 후의 체중을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체중을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  50. 제49항에 있어서, 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물이 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는 화합물인 방법.
  51. 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물을 인간 또는 인간 이외의 생물에 투여하고, 투여 후의 비만의 지표를 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 조절에 관한 화합물 또는 그의 염의 스크리닝 방법.
  52. 제51항에 있어서, 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물이 상기 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는 화합물인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2555469A1 (en) 2004-02-09 2005-08-18 Eisai R & D Management Co., Ltd. Use of relaxin-3 for promoting food intake, increasing body weight gain, increasing fat weight and for others
AU2005255198A1 (en) * 2004-06-21 2005-12-29 Paradigm Therapeutics Limited Uses of Gpr100 receptor in diabetes and obesity regulation
GB0504856D0 (en) * 2005-03-09 2005-04-13 Imp College Innovations Ltd Improvements in or relating to appetite influencing medicaments
JP2006290826A (ja) * 2005-04-13 2006-10-26 Eisai R & D Management Co Ltd スクリーニング方法
GB0717450D0 (en) * 2007-09-07 2007-10-17 Takeda Cambridge Ltd Medicament
EP2743704A3 (en) 2010-07-23 2014-06-25 Beckman Coulter, Inc. System or method of including analytical units
WO2022051254A2 (en) * 2020-09-01 2022-03-10 Massachusetts Institute Of Technology Target for modulating body mass

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1126029A1 (en) 1998-10-28 2001-08-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel g protein-coupled receptor proteins and dnas thereof
AU2230401A (en) 1999-12-28 2001-07-09 Helix Research Institute Novel guanosine triphosphate-binding protein-coupled receptors, genes thereof and production and use of the same
JP2003526373A (ja) 2000-03-10 2003-09-09 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド インスリン相同体ポリペプチドｚｉｎｓ４
KR20020093053A (ko) 2000-04-21 2002-12-12 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 신규 인슐린/ｉｇｆ/릴랙신 패밀리 폴리펩티드 및 그의ｄｎａ
WO2002031111A2 (en) 2000-10-12 2002-04-18 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
AUPR814401A0 (en) 2001-10-08 2001-11-01 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Human 3 relaxin
JP2007524371A (ja) 2003-03-04 2007-08-30 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ レラキシン３−ｇｐｃｒ１３５複合体ならびにそれらの生産及び使用
US20050026194A1 (en) 2003-06-20 2005-02-03 Tularik Inc. Gene amplification and overexpression in cancer
US20050059089A1 (en) 2003-08-07 2005-03-17 Chester Kuei Complexes of GPCR142 and relaxin3 or INSL5, and their production and use
CA2555469A1 (en) 2004-02-09 2005-08-18 Eisai R & D Management Co., Ltd. Use of relaxin-3 for promoting food intake, increasing body weight gain, increasing fat weight and for others
AU2005255198A1 (en) 2004-06-21 2005-12-29 Paradigm Therapeutics Limited Uses of Gpr100 receptor in diabetes and obesity regulation

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