CN1918290A

CN1918290A - 筛选方法

Info

Publication number: CN1918290A
Application number: CN 200580004472
Authority: CN
Inventors: 飞弹隆之; 关矢智子; 泽井彻; 生木尚志; 高桥英机; 小笹美智子; 原田耕吉; 新井彻
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2004-02-09
Filing date: 2005-02-09
Publication date: 2007-02-21

Abstract

本发明人通过用松弛素－3向大鼠脑室内给药，并在给药后观察摄食量、体重和脂肪重量等等，发现松弛素－3具有摄食刺激活性、增加体重活性以及增加脂肪重量活性。根据本发明，提供了在刺激摄食、增加体重和增肥中有有益效果的多肽；含有所述多肽的治疗剂；筛选活化或抑制所述多肽的受体的化合物、物质或其盐的方法；用于所述筛选的试剂盒；以及包含抑制所述多肽表达的物质的试剂，诸如摄食抑制剂、治疗肥胖的治疗剂以及治疗糖尿病的治疗剂。

Description

筛选方法

发明领域

本发明涉及在刺激摄食(进食)、增加体重和增肥中有有益效果的多肽；含有所述多肽的治疗剂；筛选活化或抑制所述多肽受体的化合物、物质或其盐的方法；用于所述筛选的试剂盒；以及包含抑制所述多肽表达的物质的药剂，诸如摄食抑制剂、治疗肥胖的治疗剂以及治疗糖尿病的治疗剂。

背景技术

摄食(进食)为动物存活所必需的行为。肥胖被认为是我们目前社会饱食年代中未能成功控制或平衡摄食和能量消耗的结果。由于肥胖为生活方式疾病和各种其它疾病的危险因素，其社会关注日益增加。尽管已具有诸如饮食疗法和锻炼疗法的改善摄食和能量消耗之间平衡的基础疗法，目前肥胖的患者和候选者数量仍在不断增加。最近，已开发了在外周组织抑制营养吸收的药剂和通过对中枢神经系统起作用而减少摄食量的药剂；但是人们希望开发出有效和安全的用于抑制摄食量的治疗剂作为治疗肥胖的药剂。

已逐渐显示出摄食行为是由循环控制，该循环具有来自大脑中枢神经的指示和外周组织的反馈，由此由中枢神经系统发出进一步的指示。因此，集中在起重要作用的大脑中摄食控制机制的研究已盛行。通过采用脑特定区域已损坏的动物的研究和采用神经肽或神经递质的功能分析，已逐渐揭示下丘脑区域在摄食行为方面起重要作用。另外，下丘脑中表达数种神经递质、神经肽和它们的受体，由此已显示出它们与摄食行为的相关性。例如，已有报道，存在于下丘脑的弓状核中的神经肽Y、肥胖相关基因(agouti gene)相关肽等涉及摄食刺激，以及存在于相同区域的黑皮质素和下丘脑室旁核释放的促肾上腺皮质激素释放激素和促甲状腺激素释放激素涉及摄食抑制(非专利参考文献1)。但是，关于复杂的神经网络控制摄食，未知的还有很多，并且关于新的神经递质和它们的位置的新发现仍然不断出现。

涉及控制摄食行为的诸如神经递质和神经肽的生理活性物质通过存在于细胞膜上的特异受体发挥它们的功能。在这些受体中，具有7次穿过细胞膜的结构并与细胞内G蛋白三聚体偶联的受体特别分类为G蛋白偶联的受体(GPCRs)。当与特异的配体结合时，GPCRs将信号传递进细胞以活化或抑制细胞，并由此在各种器官中表现功能方面起重要作用。因此，活化GPCR的激动剂和抑制GPCR的拮抗剂已用作药物。在分类进GPCR的受体中，已知有许多还未鉴别出特异配体，并称为孤儿GPCR。孤儿GPCR有可能成为新的治疗剂的靶标，因此正在进行它们配体的鉴别和活化或抑制它们功能的物质的研究。在新药物开发方面，通过向身体给予鉴别的配体或物质阐明受体和它们的配体的功能是极其重要的。

近几年，遗传序列信息的丰富使预测和鉴别未知肽或蛋白作为新GPCR配体成为可能，这通过基于已知蛋白或肽的序列推理其同源性和规律性(regularity)进行。胰岛素/松弛素家族的成员松弛素为黄体或胎盘产生的分泌性激素，早就知道其具有涉及妊娠维持和分娩的功能。作为另一功能，例如最近报道了在大鼠中静脉给予松弛素-2刺激水的吸收(非专利参考文献2)；但是，尚不知松弛素和摄食行为的相关性。基于编码松弛素的DNA的碱基序列，由基因序列数据库新鉴定的DNA序列编码的蛋白为称为松弛素-3/INSL的多肽(专利文献1)。据报道由此发现的松弛素-3活化细胞，引起免疫系统的THP-1细胞的细胞内环AMP(cAMP)的增加(专利文献2，非专利文献3)。后来显示松弛素-3以及松弛素-2为结合LGR7，一种GPCR，的配体之一(非专利文献4)。LGR7在脑和外周组织中表达，到目前已显示涉及生殖器官的发育、妊娠和分娩；但是，其与摄食的相关性还未被清楚地了解。

最近报道了未在体内鉴别出配体的GPCR，即称为SALPR(GPCR135)的受体和称为GPR100(hGPCR11，GPCR142)的受体，的配体为松弛素-3(非专利文献5和6；专利文献3)。此外，专利文献4-7也包括涉及这些受体的说明。已知SALPR定位在脑部(非专利文献7)，尤其报道定位在下丘脑的室旁核和视上核(专利文献3；非专利文献6)。另一方面，已报道GPR100为全身性表达的受体(非专利文献8和9)；但是，其功能仍未知。

在另一方面，已报道松弛素-3存在于脑部称为脑桥的区域(非专利文献6)，已考虑到松弛素-3可能在中枢神经系统中作为脑内肽起某些作用；但是，没有关于松弛素-3是否控制摄食或松弛素-3是否涉及体重控制的报道。另外，还未知松弛素-3是否涉及肥胖。

专利文献1：WO 01/068862

专利文献2：日本专利公开No.2002-345468

专利文献3：WO 2004/082598

专利文献4：WO 00/24891

专利文献5：WO 01/48189

专利文献6：WO 02/31111

专利文献7：WO 02/61087

非专利文献1：Spiegelman et al.，Cell，104，p.541-543，2001

非专利文献2：Sinnayah et al.，Endocrinology，140，p.5082-5086，1999

非专利文献3：Bathgate et al.，J.Biol.Chem.，277，p.1148-1157，2002

非专利文献4：Sudo et al.，J.Biol.Chem.，278，p.7855-7862，2003

非专利文献5：Takeda et al.，FEBS Letter，520，p.97-101，2002

非专利文献6：Liu et al.，J.Biol.Chem.，278，p.50754-50764，2003

非专利文献7：Matsumoto et al.，Gene，248，p.183-189，2000

非专利文献8：Liu et al.，J.Biol.Chem.，278，p.50765-50770，2003

非专利文献9：Boels et al.，Br.J.Pharmacol.，140，p.932-938，2003

发明内容

本发明要解决的问题

本发明涉及在刺激摄食(开胃的)、增加体重和增肥中有有益效果的多肽；含有所述多肽的治疗剂；筛选活化或抑制所述多肽的受体的化合物、物质或其盐的方法；用于所述筛选的试剂盒；以及包含抑制所述多肽表达的物质的试剂，诸如摄食抑制剂、治疗肥胖的治疗剂以及治疗糖尿病的治疗剂。

解决问题的手段

作为为解决上述问题而进行的大量研究的结果，本发明人通过用松弛素-3向大鼠脑室内给药并在给药后观察摄食量，发现松弛素-3具有刺激摄食(开胃的)活性。本发明人还发现，通过在向大鼠单次给予松弛素-3后测量大鼠的血液样品，已知为身体脂肪增加指数的血液瘦素浓度增加。此外，当松弛素-3连续地向大鼠脑室内给药时，与对照载体给药组比较，观察到松弛素-3给药组显著的摄食增加和体重增加。在连续给予松驰素-3组和对照组之间没有观察到运动行为的差异。这些结果首次表明，松弛素-3具有增加体重活性以及刺激摄食活性。另外，在通过给予松弛素-3而体重增加的大鼠中，观察到脂肪重量增加和与身体脂肪含量有关的血液瘦素浓度增加。涉及糖尿病的胰岛素浓度也增加了。因此，认为松弛素-3为具有刺激摄食活性、增加体重活性和增肥活性的多肽。本发明基于这些发现而完成。

换言之，本发明涉及

(1)一种摄食刺激剂，包括包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐。

(2)一种增加体重的试剂，包括包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐。

(3)一种增加脂肪重量的试剂，包括包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐。

(4)一种筛选刺激摄食的化合物或其盐的方法，包括步骤

(A)使测试物与松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或所述细胞的膜组分接触，以及

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(5)一种筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的方法，包括步骤

(A)使包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐，以及测试物与松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或所述细胞的膜组分接触。

(6)根据以上(5)所述的筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的方法，其中包括步骤

(B)测量经由松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(7)根据以上(4)、(5)或(6)所述的筛选方法，其中松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

(8)根据以上(7)所述的筛选方法，其中SALPR为含有SEQ IDNO：4表示的氨基酸序列的多肽。

(9)一种筛选刺激摄食的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(10)一种筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

(11)根据以上(10)所述的筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的试剂盒，其中包括步骤

(B)测量经由松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(12)根据以上(9)、(10)或(11)所述的筛选试剂盒，其中松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

(13)根据以上(12)所述的筛选试剂盒，其中SALPR为包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

(14)一种治疗需要增加体重的疾病的治疗剂，包括包含SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列的多肽、其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐。

(15)根据以上(14)所述的治疗剂，其中所述的疾病为厌食症或恶病质。

(16)一种筛选增加体重的化合物或其盐的方法，包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(17)一种筛选增加或降低体重的化合物或其盐的方法，包括步骤

(18)根据以上(17)所述的筛选增加或降低体重的化合物或其盐的方法，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(19)根据以上(16)、(17)或(18)所述的筛选方法，其中所述的松弛素-3为SALPR或其部分多肽。

(20)根据以上(19)所述的筛选方法，其中SALPR为包含SEQID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

(21)一种筛选增加体重的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(22)一种筛选增加或降低体重的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

(23)根据以上(22)所述的筛选增加或降低体重的化合物或其盐的试剂盒，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(24)根据以上(21)、(22)或(23)所述的筛选试剂盒，其中所述的松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

(25)根据以上(24)所述的筛选试剂盒，其中SALPR为包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

(26)一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的方法，包括以下步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(27)一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的方法，包括步骤

(28)根据以上(27)所述的筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的方法，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(29)根据以上(26)、(27)或(28)所述的筛选方法，其中所述的松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

(30)根据以上(29)所述的筛选方法，其中SALPR为包含SEQID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

(31)一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(32)一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

(33)根据以上(32)所述的筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的试剂盒，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

(34)根据以上(31)、(32)或(33)所述的筛选方法，其中所述的松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

(35)根据以上(34)所述的筛选试剂盒，其中SALPR为包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

(36)一种抑制摄食的试剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

(37)根据以上(36)所述的试剂，其中所述具有SALPR抑制活性的化合物为通过以上(7)或(8)所述的筛选方法获得的化合物。

(38)一种降低体重的试剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

(39)根据以上(38)所述的试剂，其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物为通过以上(19)或(20)所述的筛选方法获得的化合物。

(40)一种减少脂肪重量的试剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

(41)根据以上(40)所述的试剂，其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物为通过以上(29)或(30)所述的筛选方法获得的化合物。

(42)一种治疗肥胖的治疗剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

(43)根据以上(42)所述的治疗剂，其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物为通过以上(19)、(20)、(29)和(30)任一项所述的筛选方法获得的化合物。

(44)一种治疗糖尿病的治疗剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

(45)根据以上(44)所述的治疗剂，其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物为通过以上(19)、(20)、(29)和(30)任一项所述的筛选方法获得的化合物。

(46)根据以上(36)-(45)任一项所述的试剂，其中SALPR为包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

(47)一种筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的方法，包括将作用于松弛素-3受体的化合物向人或非人生物体给药并且在给药后测量摄食量的步骤。

(48)根据以上(47)所述的方法，其中所述的作用于松弛素-3受体的化合物为通过以上(4)-(8)任一项所述的筛选方法获得的化合物。

(49)一种筛选增加或降低体重的化合物或其盐的方法，包括将作用于松弛素-3受体的化合物向人或非人生物体给药并且在给药后测量体重的步骤。

(50)根据以上(49)所述的方法，其中所述的作用于松弛素-3受体的化合物为通过以上(16)-(20)任一项所述的方法获得的化合物。

(51)一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的方法，包括将作用于松弛素-3受体的化合物向人或非人生物体给药并且在给药后测量肥胖指标的步骤。

(52)根据以上(51)所述的方法，其中所述的作用于松弛素-3受体的化合物为通过以上(26)-(30)任一项所述的方法获得的化合物。

附图简要说明

图1显示pBabeCL(SALPR)IH的构建。

图2A显示CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)的构建。

图2B显示pBabeCLX的构建。

图2C显示pBabeCLcre4vPdNN的构建。

图3显示松弛素-3特异性地剂量依赖地抑制在表达SALPR的SE302细胞中由于添加毛喉素而增加的转录活性。黑方框显示添加了松弛素-3的情况。白方框显示添加胰岛素的情况。横轴上的数字显示添加的每种配体的最终浓度(nmol/L)。纵轴上的数字显示计算出的相对活性，该计算将添加1μmol/L毛喉素的细胞上清液的碱性磷酸酶活性设为100，无毛喉素的设为0。每一点显示平均值(N＝3)和标准偏差。

图4显示采用SALPR-SE302细胞评估(筛选)松弛素-3拮抗剂化合物。图4A为采用SALPR-SE302细胞的情况，图4B为采用SE302细胞的情况。在图中，FK(-)显示无毛喉素处理组；FK(+)，3μM毛喉素处理组；FK(+)&RLX-3，毛喉素和3nM松弛素-3处理组；以及FK(+)&RLX-3&化合物1，用毛喉素、松弛素-3和化合物1的组合处理的组。

图5显示向正常大鼠脑室内单次给予松弛素-3对摄食量的作用。白长方形条显示载体给药组(对照)，黑长方形条显示给予松弛素-3组。纵轴显示每组每只动物摄食量(g)的平均值和标准误差。

图6显示向正常大鼠脑室内单次给予松弛素-3对血液瘦素浓度的作用。白长方形条显示载体给药组(对照)，黑长方形条显示给予松弛素-3组。纵轴显示每组中血液瘦素浓度(ng/ml)的平均值和标准偏差。

图7显示向正常大鼠脑室内持续给予松弛素-3对体重增加的作用。白长方形条显示载体给药组(对照)，黑长方形条显示给予松弛素-3组。纵轴显示每组中每只动物增加的体重(g)的平均值和标准偏差。

图8显示向正常大鼠脑室内持续给予松弛素-3对摄食量的作用。白方框显示载体给药组(对照)，黑方框显示给予松弛素-3组。纵轴显示每组中每只动物摄食量(g)的平均值和标准偏差。

图9显示向正常大鼠脑室内持续给予松弛素-3对附睾脂肪重量的作用。白长方形条显示载体给药组(对照)，黑长方形条显示给予松弛素-3组。纵轴显示每组中每只动物脂肪重量(g)的平均值和标准偏差。

图10显示向正常大鼠脑室内持续给予松弛素-3时血液激素水平的变化。图10A显示对血液瘦素浓度的作用。白长方形条显示载体给药组(对照)，黑长方形条显示给予松弛素-3组。纵轴显示每组中每只动物血液瘦素浓度(ng/ml)的平均值和标准偏差。图10B显示对血液胰岛素浓度的作用。白长方形条显示载体给药组(对照)，黑长方形条显示给予松弛素-3组。纵轴显示每组中每只动物血液胰岛素浓度(ng/ml)的平均值和标准偏差。

图11显示脑室内连续给予松弛素-3的大鼠的体重增加的变化，并在饲养时测量它们的自发运动行为。白方框显示载体给药组(对照)，黑方框显示给予松弛素-3组。纵轴显示每组中每只动物增加的体重(g)的平均值和标准偏差。图中，白三角表示在有光期间测量运动行为的几天，黑三角表示在黑暗期间测量运动行为的几天。

图12显示向大鼠脑室内持续给予松弛素-3对自发运动行为的影响。白条显示载体给药组(对照)，黑条显示给予松弛素-3组。纵轴显示每组中每只动物总运动行为(计数)的平均值和标准偏差。

实施本发明的最优方式

松弛素-3

用在本发明中的“松弛素-3”为通过基因序列数据库新发现的称为松弛素-3(也即INSL7(GenBank登录号NM_080864))的多肽(J.Biol.Chem.277，1148-1157，2002)，含义为(i)包含SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列的多肽。另外，松弛素-3还意在包括(ii)修饰的多肽，其在功能上等同于包含SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列的多肽，以及(iii)包含氨基酸序列的同源多肽，该氨基酸序列与包含SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列有70％或以上的同源性。用在本发明中的松弛素-3优选为“包含SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列的多肽”。另外，上述多肽意在包括该多肽的盐，以及有和无糖链的那些。

本文采用的术语“功能上等同的修饰多肽(以下称为修饰多肽)”指一种多肽，该多肽具有有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸删除、置换、插入和/或添加并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的修饰的氨基酸序列，并展示与松弛素-3基本相同的活性[例如松弛素-3受体结合能力、与该结合有关的各种细胞刺激活性(例如，细胞内钙释放、腺苷酸环化酶活化、细胞内cAMP生成、细胞内cGMP生成、肌醇磷脂生成、细胞膜的电位改变、细胞膜附近的pH改变、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的诱导/活化、花生四烯酸的释放)、摄食刺激、体重增加和增肥]。

本说明书中的术语“置换”指用其它化学上类似的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基，以便基本上不改变肽活性。例如，特定的疏水残基可由另一疏水残基置换，特定的极性残基可由另一具有相同电荷的极性残基置换。对每一氨基酸来说能进行这些置换的功能上类似的氨基酸为本领域技术人员所知。更具体地，非极性(疏水)氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。极性(中性)氨基酸的实例包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。带正电荷(碱性)氨基酸的实例包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。

要删除、置换、插入和/或添加的氨基酸残基的数目例如为1-30、优选1-20、更优选1-10、再更优选1-5、最优选1-2。另外，上述的修饰多肽意图包括修饰多肽的盐，包括有糖链和无糖链的那些。因此，只要满足以上条件，上述的修饰多肽的来源并不限于人。例如，包括衍生自不同于人的生物体[例如非人的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬)、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类和昆虫]的松弛素-3和其变异体。

只要上述的同源多肽包含与松弛素-3的氨基酸序列有70％或以上的同源性的氨基酸序列，则该同源多肽并无特别限制；这意味着包含与松弛素-3优选有80％或以上、再优选85％或以上、更优选有90％或以上、再更优选有95％或以上、特别优选有98％或以上、最优选有99％或以上的同源性的氨基酸序列并展示与松弛素-3基本相同活性(例如松弛素-3受体结合能力、与该结合有关的各种细胞刺激活性、摄食刺激、体重增加和增肥)的氨基酸序列。本说明书中用于“同源性”的数字可为采用本领域技术人员已知的同源性搜索程序计算的数字；例如它们可采用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的同源性算法BLAST(基本的局部比对搜索工具)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/利用默认参数计算。此外，上述同源多肽包括同源多肽的盐，包括有糖链和无糖链的那些。因此，只要满足以上条件，上述的同源多肽的来源并不限于人。例如，包括衍生自不同于人的生物体[例如非人的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬)、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类和昆虫]的松弛素-3和其变异体。

本文使用的术语“变异体”指相同物种中的相同多肽内个体之间的差异或不同物种之间的同源多肽之间的变异。

用在本发明中的松弛素-3(即松弛素-3、修饰多肽或同源多肽)可通过诸如遗传工程方法和合成方法的各种已知方法获得。更具体地，在遗传工程方法中，将编码松弛素-3的多核苷酸引入合适的宿主细胞中，得到的转化体在能使其表达的条件下培养，并且接着通过通常用于分离和纯化表达的蛋白的方法从培养物中分离和纯化目的多肽。在合成方法中，合成可采用普通的方法，诸如液相方法和固相方法；通常可采用自动合成仪。化学修饰的化合物可通过普通方法合成。另外，要使用的多肽可为SEQ ID NO：2的全长或部分，或经历诸如半胱氨酸交联、N末端环谷氨酰胺化和C末端酰胺化的分泌型蛋白加工的多肽。

编码松弛素-3的多核苷酸

用在本发明中的编码松弛素-3的多核苷酸无特别限制，只要其为编码用在本发明中的多肽的多核苷酸。

这里使用的术语“多核苷酸”包括DNA和RNA。更具体地，用在本发明中的多核苷酸选自以下(a)至(e)构成的组：

(a)由SEQ ID NO：1表示的碱基序列构成的多核苷酸；

(b)编码“由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列构成的多肽”的多核苷酸；

(c)编码“包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列并展示与上述松弛素-3基本相同活性的多肽”的多核苷酸；

(d)编码“包含具有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸删除、置换、插入和/或添加的、SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的修饰氨基酸序列，并展示与上述松弛素-3基本相同活性的多肽”的多核苷酸；以及

(e)在严紧条件下与由SEQ ID NO：1表示的碱基序列构成的多核苷酸杂交并编码具有与上述松弛素-3基本相同活性的多肽的多核苷酸。

根据本发明的一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为编码“包含具有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸删除、置换、插入和/或添加的SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的修饰氨基酸序列，并展示与上述松弛素-3基本相同活性的多肽”的多核苷酸。这里，能被删除、置换、插入和/或添加的氨基酸残基的数目例如为1-30、优选1-20、更优选1-10、再更优选1-5、最优选1-2。

根据本发明的另一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为与由SEQ ID NO：1表示的碱基序列构成的多核苷酸在严紧条件下杂交并编码“具有与上述松弛素-3基本相同活性的多肽”的多核苷酸。

在本说明书中，在严紧条件下杂交的多核苷酸的特定实例为，当同源性通过同源性搜索软件诸如FASTA、BLAST、Smith-Waterman(Meth.Enzym.，164，765，1988)利用默认参数计算时，与SEQ ID NO：1表示的碱基序列有至少70％或以上、优选80％或以上、更优选85％或以上、再优选90％或以上、再更优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上的同源性的多核苷酸。此外，“严紧条件下”的杂交可例如通过如下方法进行，该方法中在40-70℃、优选60-65℃下在本领域技术人员通常采用的杂交缓冲液中进行反应，并且在15-300mmol/L、优选15-60mmol/L的盐浓度的清洗溶液中进行清洗。温度和盐浓度可以根据待用的探针的长度适当地调节。

要用在本发明中的多核苷酸可例如为天然来源或全合成。此外，它可利用部分天然产物合成。典型地，要用在本发明中的多核苷酸可例如通过遗传工程领域常用的方法从商业文库或cDNA文库中获得，例如通过利用基于部分氨基酸序列(例如SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列)的信息而构建的合适DNA探针的筛选方法。

作为要用在本发明中的多核苷酸，“包含SEQ ID NO：1表示的碱基序列的多核苷酸”为优选的。SEQ ID NO：1表示的碱基序列具有以位置1-3处的ATG起始并以位置427-429处的TAG结束的开放阅读框。

含有松弛素-3的药物组合物

用在本发明中的松弛素-3可用作摄食刺激剂以治疗摄食减少的食欲障碍和营养病症、用作体重增加剂和增肥剂以治疗需要体重增加的疾病、用作药物以治疗由控制肥胖中的一些异常引起的疾病以及用作药物以治疗松弛素-3或编码松弛素-3的多核苷酸的异常引起的疾病。此外，它还可用作治疗药物，用于恢复由于多种疾病的发作或多种疾病的治疗(例如，手术期间或之后)导致的摄食(或食欲)和/或体重减少。上述多种疾病的实例包括涉及消化道运动或功能的疾病(例如，腹泻、便秘、功能性便秘、过敏性肠道综合症和在消化道检查时或手术之前或之后需要通便以去除肠道内容物的状况)、涉及免疫功能的控制的疾病(例如，慢性类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾病、硬皮病、特应性皮炎、支气管哮喘、多发性硬化、风湿性间质性肺炎、肉瘤样病、克隆氏疾病、炎性结肠炎、肝硬化、慢性肝炎、暴发型肝炎、脑脊髓炎和重症肌无力)、摄食病症、厌食、AIDS、癌症以及恶病质。它们优选的是厌食和恶病质。

所述多肽或其盐可单独使用；但是它也可通过与药物上可接受的载体混合作为药物组合物使用。

本文中使用的术语“盐”无特别限制，只要它是与本发明的化合物形成的盐并且药物上可接受。这些盐的优选实例包括卤代氢酸盐(例如，氢氟化物、氢氯化物、氢溴化物、氢碘化物)、无机酸盐(例如，硫酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐)、有机羧酸盐(例如，乙酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸盐)、有机磺酸盐(例如，甲烷磺酸盐、三氟甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐)、氨基酸盐(例如，天冬氨酸盐、谷氨酸盐)、季胺盐、碱金属盐(例如，钠盐、钾盐)以及碱土金属盐(例如，镁盐、钙盐)。氢氯化物、草酸盐等优选为所述的“药物上可接受的盐”

这里，载体中活性成分的百分比可在1-90重量％之间变化。上述药物可以各种形式经口或胃肠外(例如，通过静脉、肌内、皮下、直肠或皮肤给药)向人或不同于人的生物体[例如，非人哺乳动物(例如牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬)、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类以及昆虫类]给药。相应地，含有本发明的松弛素-3的药物组合物按照给药途径配制成合适的剂型。更具体地，它可配制成诸如片剂、胶囊、颗粒、分散性粉剂以及糖浆的口服制剂，诸如注射剂、静脉滴液、脂质体组合物以及栓剂的胃肠外制剂。这些药物制剂可通过普通方法采用常用的赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、滑润剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、增溶剂、抗菌剂、矫味剂、镇痛剂、稳定剂等等制成。要采用的上述非毒性添加剂的实例包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、硬脂酸镁、甲基纤维素或其盐、乙醇、柠檬酸、氯化钠和磷酸钠。

剂型和给药量取决于多肽的选择、给药的对象、给药途径、制剂的特性、患者的状况以及医师的判断。但是，每1kg患者体重的合适剂量范围例如为约0.1-500μg，优选约0.1-100μg，更优选约1-50μg。考虑到效率会随给药途径而不同，预计必需剂量会在大范围变化。例如，预计经口给药的所需剂量比静脉注射的高。这种剂量水平的变化可通过使用本领域熟知的标准经验优化程序进行调整。

采用松弛素-3受体筛选涉及摄食控制的化合物的方法

作为用在本发明中的松弛素-3受体，在各种受体中，可采用能结合松弛素-3并展示松弛素-3受体表达细胞的各种细胞刺激活性(例如，细胞内钙释放、腺苷酸环化酶活化、细胞内cAMP生成、细胞内cGMP生成、肌醇磷脂生成、细胞膜的电位改变、细胞膜附近的pH改变、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的诱导/活化、花生四烯酸的释放)的受体。

更具体地，作为松弛素-3受体，可采用经报道的已知受体，例如LGR7(GenBank登录号NM_021634)、SALPR(GenBank登录号NM_016568，也称为GPCR135)或GPR100(GenBank登录号AB_083593，也称为hGPCR11或GPCR142)。另外，这些受体的部分多肽(partial polypeptide)无特别限制，只要它可用在后面描述的筛选方法中，也可采用与松弛素-3有结合能力的部分多肽、包含对应于细胞膜外部区域的氨基酸序列的部分多肽等等。

本发明的内容将参考采用SALPR作为本发明的优选实例的筛选方法，在以下的本说明书中进行详细解释。换言之，本发明提供筛选结合SALPR或其部分多肽并涉及控制摄食(刺激或抑制摄食)的化合物的方法。此外，可通过使测试物作用于SALPR或其部分多肽并测量细胞刺激活性而确定该物质是否具有刺激或抑制摄食的活性。

可通过各种已知的方法获得SALPR或其部分多肽；例如，它可通过已知的遗传工程方法采用编码SALPR的多核苷酸(GenBank登录号NM_016568)制备。在另一实施方案中，它可通过已知的多肽合成方法获得，诸如普通方法，例如液相方法或固相方法；通常可采用自动合成仪。此外，在另一实施方案中，SALPR的部分多肽可通过采用合适的蛋白水解酶剪切SALPR而制备。

编码要用在本发明中的SALPR的多肽指包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽、功能上等同于包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽的修饰多肽或包含与SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列有70％或以上、优选80％或以上、更优选85％或以上、再优选90％或以上、再更优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上同源性的氨基酸序列并展示与松弛素-3基本相同活性(例如，与松弛素-3的结合能力和与该结合有关的各种细胞刺激活性或摄食控制活性)的多肽。

这里，功能上等同于包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽的修饰多肽指包含氨基酸序列并展示与SALPR基本相同活性(例如，与松弛素-3的结合能力和与该结合有关的各种细胞刺激活性或摄食控制活性)的多肽，该氨基酸序列在包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽中具有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸的一处或几处删除、置换、插入和/或添加。

此外，也可采用SALPR的部分多肽，只要它具有与SALPR基本相同的活性(例如，与松弛素-3的结合能力和与该结合有关的各种细胞刺激活性或摄食控制活性)。

遗传工程方法将在以下采用SALPR更加具体地详细解释；但是，也可采用其部分多肽，只要其可用在以后描述的筛选方法中。

将编码SALPR的多核苷酸引入合适的宿主细胞中，在能使其表达的条件下培养得到的转化体，由此通过常用的分离和纯化表达的蛋白的方法从培养物中分离和纯化目的多肽。用于上述分离和纯化的方法的实例包括硫酸胺盐析、采用离子交换纤维素的离子交换柱层析、采用分子筛凝胶的分子筛柱层析、采用蛋白质-A结合多糖的亲和柱层析、透析和冻干。

编码要用在本发明中的SALPR的多核苷酸无特别限制，只要它为编码要用在本发明中的多肽的多核苷酸。

这里使用的术语“多核苷酸”包括DNA和RNA。更具体地，用在本发明中的该多核苷酸选自以下(a)至(e)构成的组：

(a)包含SEQ ID NO：3表示的碱基序列的多核苷酸；

(b)编码“包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽”的多核苷酸；

(c)编码“包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列并展示与上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸；

(d)编码“包含在SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列中具有在一个或多个(优选一个或几个)位点上的一个或多个(优选一个或几个)氨基酸的删除、置换、插入和/或添加的氨基酸序列，并展示与上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸；以及

(e)在严紧条件下与包含SEQ ID NO：3表示的碱基序列的多核苷酸杂交并编码展示与上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。

根据本发明的一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为包含SEQ ID NO：3表示的碱基序列的多核苷酸。上述SEQ ID NO：3表示的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的SALPR。

根据本发明的另一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为编码“包含在SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列中在一个或多个(优选一个或几个)位点上具有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸的删除、置换、插入和/或添加的氨基酸序列，并展示与上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸。这里，能被删除、置换、插入和/或添加的氨基酸残基的数目例如为1-30、优选1-20、更优选1-10、再更优选1-5、最优选1-2。

根据本发明的又一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为在严紧条件下与包含SEQ ID NO：3表示的碱基序列的多核苷酸杂交并编码展示与上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。此外，根据本发明的又一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为在严紧条件下与由SEQ ID NO：3表示的碱基序列构成的多核苷酸杂交并编码展示与上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。

要用在上述转化中的质粒无特别限制，只要它含有编码上述SALPR的多核苷酸；例如，它可通过将所述多核苷酸插入根据采用的宿主细胞适当选择的已知表达载体中而获得。

上述的转化体也无特别限制，只要它含有编码上述SALPR的多核苷酸；例如，它可为所述多核苷酸已并入宿主细胞的染色体中的转化体、以质粒形式含有所述多核苷酸的转化体或不表达SALPR的转化体。所述转化体可例如通过采用上述质粒或上述多核苷酸自身转化希望的宿主细胞而获得。

上述宿主细胞的实例包括通常采用的已知微生物，诸如Escherichia coli(例如，E.coli JM109)和酵母(例如，Saccharomycescerevisiae W303)，以及已知的培养细胞，诸如动物细胞(例如，CHO细胞、HEK-293细胞、COS细胞)和昆虫细胞(例如BmN4细胞)。

上述表达载体的实例包括用于E.coli的pUC、pTV、pGEX、pKK以及pTrcHis；用于酵母的pEMBLY和pYES2；用于CHO细胞、HEK-293细胞以及COS细胞的pcDNA3，pMAMneo以及pBabe Puro；用于BmN4细胞的具有家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体启动子的载体(例如，pBK283)。

含有SALPR的细胞无特别限制，只要它在细胞膜表面表达SALPR，并可例如通过在能使SALPR表达的条件下培养上述转化体(即，用含有编码SALPR的多核苷酸的质粒转化的细胞)或通过将编码SALPR的RNA注射到合适的细胞并在能使SALPR表达的条件下培养它来获得。

要用在本发明中的含有SALPR的细胞膜组分(fraction)例如可通过使本发明的表达SALPR的细胞破裂并分离富含细胞膜的成分而获得。破裂细胞的方法的实例包括如下方法：采用匀浆器(例如，Potter-Elvehiem型匀浆器)破裂细胞、通过韦林氏搅拦器或Polytron(Kinematica)破裂、超生破裂以及采用法国压(French press)等在压力下通过将细胞从细小的管口喷射而破裂。另外，分级分离细胞膜的方法的实例包括通过离心的分级分离方法，该离心诸如为差速离心和密度梯度离心。

在筛选经由本发明的SALPR刺激或抑制摄食的化合物的方法中，可采用上述细胞膜组分(即含有SALPR的细胞膜组分)或上述细胞(即含有SALPR的细胞)。

此外，本发明的筛选方法包括并利用检测测试物是否与SALPR特异结合的方法和检测测试物与SALPR的结合产生的细胞刺激活性(例如，细胞内钙释放、腺苷酸环化酶活化、细胞内cAMP生成、细胞内cGMP生成、肌醇磷脂生成、细胞膜的电位改变、细胞膜附近的pH改变、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos和c-jun的诱导/活化、花生四烯酸的释放)的方法。

在本发明的筛选方法中，例如将SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞与测试物接触，以分析SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞是否与所述测试物结合，由此无需区分经由SALPR的摄食刺激和抑制能力而实现化合物的筛选。

具体地，在有或无测试物存在时，将SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞与标记的天然配体(即松弛素-3)结合，以比较经由SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞特异结合的上述天然配体的量，由此无需区分经由SALPR的摄食刺激和抑制能力而实现化合物的筛选。即，当上述测试物具有经由SALPR的摄食刺激或抑制能力时，则在测试物存在下，经由SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞特异结合的天然配体的量相对于无该测试物存在时的相应的特异结合量会减小。

在本发明的筛选方法中，当比较所述天然配体经由SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞特异结合的量时，标记的天然配体可用作上述天然配体。对于上述标记，可采用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的实例包括[³H]，[¹⁴C]，[¹²⁵I]以及[³⁵S]。酶的实例包括β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和过氧化物酶。荧光物质的实例包括异硫氰酸荧光素和BODIPY。发光物质的实例包括荧光素和光泽精。偶尔，生物素-抗生物素系统可用于天然配体和标记物的结合。

因此，本发明的筛选方法可筛选结合SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞而抑制它们结合天然配体的化合物，无需区分经由SALPR的摄食刺激和抑制能力。

在本发明的筛选方法的另一实施方案中，将上述细胞在有或无测试物存在的条件下与标记的天然配体(即松弛素-3)接触，以比较在这些条件下经由上述细胞特异结合的上述天然配体的量，接着比较在这些条件下上述天然配体的特异细胞刺激活性，由此使得在区分经由SALPR的摄食刺激和抑制能力(stimulating and suppressing abilities infeeding via SALPR)时筛选化合物成为可能。

在上述实施方案中，结合上述细胞并经由包含在上述细胞中的受体展示细胞刺激活性的物质可选作经由SALPR刺激摄食的化合物。

在另一方面，在上述实施方案中，抑制上述细胞与天然配体的结合但不展示细胞刺激活性的测试物可选作经由SALPR抑制摄食的化合物。

本发明的筛选方法例如可采用抑制腺苷酸环化酶活性作为细胞刺激活性来进行。

在该实施方案的筛选方法中，例如通过腺苷酸环化酶的活化而在细胞中生成的cAMP可采用已知方法测量，由此使得区分经由SALPR的摄食刺激和抑制能力时筛选化合物成为可能。该实施方案利用了通过天然配体与SALPR的结合产生的细胞内信号传递，即抑制SALPR的细胞刺激活性之一的腺苷酸环化酶活性。具体地，当天然配体结合SALPR时，偶联到SALPR的G蛋白家族的成员Gi家族抑制腺苷酸环化酶以降低细胞中生成的环状AMP的量(cAMP，通过腺苷酸环化酶从ATP生成)。

例如，当将腺苷酸环化酶活化剂[例如，毛喉素(FSK)]添加到在细胞膜上表达SALPR的哺乳动物衍生的细胞(例如，HEK-293细胞或CHO细胞)时，细胞内cAMP浓度增加。

另外，当SALPR的天然配体在添加腺苷酸环化酶活化剂时添加的情况下，除了腺苷酸环化酶活化剂引起的腺苷酸环化酶活性刺激以外，由于上述天然配体对本发明的SALPR的作用，也可产生腺苷酸环化酶活性抑制，这导致与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比cAMP生成减少。因此，当进行具有摄食刺激活性的化合物的筛选时，通过与测试物单独接触，可选择减少cAMP生成(即具有与天然配体相同的活性)的化合物，以替换在该筛选系统中经由SALPR起作用的天然配体。

当进行具有摄食抑制活性化合物的筛选时，可将腺苷酸环化酶活化剂、SALPR的天然配体和测试物添加到细胞用于筛选。由于天然配体的作用，与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比，cAMP生成减少；但是，当测试物拮抗天然配体的作用时，cAMP生成减少受到抑制。这时，该测试物可被选作具有摄食抑制活性的化合物。

可采用免疫分析等作为测量细胞内cAMP的量的方法；例如，也可采用定量cAMP的商品化试剂盒。

在筛选方法的另一实施方案中，例如，通过采用在细胞膜上表达SALPR(优选通过引入含有SALPR的表达载体而过量表达)并含有位于5′端上游具有cAMP应答元件(CRE)的报告基因[例如，碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因、β-内酰胺酶基因、硝基还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-半乳糖苷酶基因或诸如GFP(绿色荧光蛋白)基因的荧光蛋白基因]的细胞(以下有时指“筛选细胞”)，可在区分经由SALPR的摄食刺激和抑制能力时实现化合物的筛选。该实施方式利用了该事实，即上述筛选细胞中在启动子区域引入了CRE的报告基因的转录由于上述cAMP生成的减少而被抑制。

以下将更加详细地解释，通过上述实施方案在区分经由SALPR的摄食刺激和抑制能力时的化合物筛选方法。

换言之，引入上述筛选细胞中的CRE为常常存在于一组基因(cAMP诱导基因)的转录调节区的碱基序列，该组基因在细胞内cAMP浓度增加时加速表达。因此，当腺苷酸环化酶活化剂(例如FSK)添加到筛选细胞时，细胞内cAMP浓度增加，这导致位于CRE下游的报告基因的表达量增加。可通过测量来自底物与报告基因产物反应产生的发光物质的发光或来自作为报告基因产物生成的荧光蛋白的荧光而容易地测量报告基因产物的表达量。

此外，当在添加腺苷酸环化酶活化剂时添加SALPR的天然配体的情况下，除了由于腺苷酸环化酶活化剂引起的上述腺苷酸环化酶活性刺激以外，由于上述天然配体对本发明SALPR的作用，也会出现腺苷酸环化酶活性抑制，这导致与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比，报告基因产物的表达量降低。因此，当进行具有摄食刺激活性的化合物筛选时，可通过单独接触测试物选择降低报告基因产物表达量的化合物(即与天然配体具有相同活性)，在该筛选系统中替代经由SALPR起作用的天然配体。

当进行具有摄食抑制活性化合物的筛选时，可将腺苷酸环化酶活化剂、SALPR的天然配体和测试物添加到筛选细胞。与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比，由于天然配体的作用，报告基因产物表达量降低；但是，当测试物拮抗天然配体的作用时，报告基因产物表达量的降低受到抑制。这时，测试物可被选作具有摄食抑制活性的化合物。

可容易地证实测试物是否通过与SALPR结合作用而起作用。例如，平行于采用筛选细胞(即，在细胞膜上表达SALPR并含有在5′端上游具有CRE的报告基因的细胞)的上述测试，采用对照细胞(例如，含有在5′端上游具有CRE的报告基因，但不在细胞膜上表达SALPR的细胞)进行类似测试。结果，当上述测试物不通过与SALPR结合起作用时，用于筛选的细胞和用于对照的细胞对于报告基因产物表达量显示相同的现象，而当上述测试物通过与SALPR结合起作用时，用于筛选的细胞和用于对照的细胞对于报告基因产物表达量显示不同的现象。

此外，在另一实施方案中，可通过向人或非人生物体[例如，非人的哺乳动物(例如，牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬)、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类和昆虫类]给予经上述筛选方法选择的测试物，并在给药后分析诸如摄食量和血液参数的变化的指标，来证实和确定影响摄食控制的测试物。上述哺乳动物不限于正常的动物，还可以是遗传突变的疾病动物模型(例如，病态肥胖模型，诸如ob/ob小鼠、db/db小鼠和Zucker肥胖大鼠)和遗传修饰动物。测试物可口服或胃肠外给药。胃肠外途径的实例包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、气管内、直肠内和脑内给药，优选在临近下丘脑的脑室内给药。作为用于该筛选的指标，除了摄食量以外还可有效地测量体重、运动的数量、能量代谢量、血糖和血脂量、激素量、分泌性肽量等等。此外，在给药时，可添加诸如禁食、饱食和过量脂肪食物的条件。

测试物可以每天单一剂量或分开的剂量的方式给药，给药或观察周期可为一天至数周。

采用松弛素-3受体筛选涉及体重控制的化合物的方法

更具体地，作为松弛素-3受体，经报道的已知受体，例如LGR7(GenBank登录号NM_021634)、SALPR(GenBank登录号NM_016568，也称为GPCR135)或GPR100(GenBank登录号AB_083593，也称为hGPCR11或GPCR142)可以被使用。另外，这些受体的部分多肽无特别限制，只要它可用在后面描述的筛选方法中，也可采用与松弛素-3有结合能力的部分多肽、包含对应于细胞膜外部区域的氨基酸序列的部分多肽等等。

本发明的内容将参考采用SALPR作为本发明的优选实例的筛选方法，在以下的本说明书中进行详细解释。换言之，本发明将提供筛选结合SALPR或其部分多肽并涉及体重控制(体重增加或降低)的化合物的方法。此外，可通过使测试物作用于SALPR或其部分多肽并测量细胞刺激活性而确定该物质是否具有增加或降低体重的活性。

编码要用在本发明中的SALPR的多肽指包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽、功能上等同于包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽的修饰多肽或包含与SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列有70％或以上、优选80％或以上、更优选85％或以上、再优选90％或以上、再更优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上同源性的氨基酸序列并展示与松弛素-3基本相同活性(例如，与松弛素-3的结合能力和与该结合有关的各种细胞刺激活性或体重控制活性)的多肽。

这里，功能上等同于包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽的修饰多肽指包含氨基酸序列并展示与SALPR基本相同活性(例如，与松弛素-3的结合能力和与该结合有关的各种细胞刺激活性，或体重控制活性)的多肽，所述氨基酸序列在包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽中具有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸的一处或几处删除、置换、插入和/或添加。

此外，也可采用SALPR的部分多肽，只要它具有与SALPR基本相同的活性(例如，与松弛素-3的结合能力和与该结合有关的各种细胞刺激活性或体重控制活性)。

将编码SALPR的多核苷酸引入合适的宿主细胞中，得到的转化体在能使其表达的条件下培养，然后通过常用的分离和纯化表达的蛋白的方法从培养物中分离和纯化目的多肽，由此制备SALPR。用于上述分离和纯化的方法的实例包括硫酸胺盐析、采用离子交换纤维素的离子交换柱层析、采用分子筛凝胶的分子筛柱层析、采用蛋白质-A结合多糖的亲和柱层析、透析和冻干。

这里使用的术语“多核苷酸”包括DNA和RNA。更具体地，用在本发明中的该多核苷酸选自以下(a)至(e)构成的组中：

(a)包含SEQ ID NO：3表示的碱基序列的多核苷酸；

(d)编码“包含在SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的一个或多个(优选一个或几个)位点处具有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸的删除、置换、插入和/或添加的氨基酸序列，并展示与上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸；以及

根据本发明的另一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为编码“包含在SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的一个或多个(优选一个或几个)位点处具有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸的删除、置换、插入和/或添加的氨基酸序列，并展示与上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸。这里，能被删除、置换、插入和/或添加的氨基酸残基的数目例如为1-30、优选1-20、更优选1-10、再更优选1-5、最优选1-2。

根据本发明的又一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为在严紧条件下与包含SEQ ID NO：3表示的碱基序列的多核苷酸杂交并编码展示与上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。此外，根据本发明的又一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为在严紧条件下与包含SEQ ID NO：3表示的碱基序列的多核苷酸杂交并编码展示与上述SALPR基本相同活性的多肽的多核苷酸。

上述宿主细胞的实例包括通常采用的已知微生物，诸如Escherichia coli(例如， E. coli JM109)和酵母(例如， Saccharomyces cerevisiae W303)，以及已知的培养细胞，诸如动物细胞(例如，CHO细胞、HEK-293细胞、COS细胞)和昆虫细胞(例如BmN4细胞)。

含有SALPR的细胞无特别限制，只要它在细胞膜表面表达SALPR，并可例如通过在能使SALPR表达的条件下培养上述转化体(即，用含有编码SALPR的多核苷酸的质粒转化的细胞)或通过将编码SALPR的RNA注射到合适的细胞中并在能使SALPR表达的条件下培养该细胞来获得。

要用在本发明中的含有SALPR的细胞膜组分例如可通过使本发明的表达SALPR的细胞破裂并分离富含细胞膜的成分(a fraction richin the cell membrane)而获得。破裂细胞的方法的实例包括采用匀浆器(例如，Potter-Elvehiem型匀浆器)碎裂细胞、通过韦林氏搅切器或Polytron(Kinematica)破裂、超生破裂以及采用法国压等在压力下通过将细胞从细小的管口喷射而破裂的方法。另外，分级分离细胞膜的方法的实例包括通过离心的分级分离方法，该离心诸如为差速离心和密度梯度离心。

在筛选经由本发明的SALPR增加或降低体重的化合物的方法中，可采用SALPR、上述细胞膜组分(即含有SALPR的细胞膜组分)或上述细胞(即含有SALPR的细胞)。

在本发明的筛选方法中，例如将SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞与测试物接触，以分析SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞是否与所述测试物结合，由此无需区分经由SALPR的体重增加和降低能力而实现化合物的筛选。

具体地，在有或无测试物存在时，将SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞与标记的天然配体(即松弛素-3)接触，以比较经由SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞而特异结合的上述天然配体的量，由此无需区分经由SALPR的体重增加和降低能力而实现化合物的筛选。即，当上述测试物具有经由SALPR的增加或降低体重能力时，则在测试物存在下，经由SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞特异结合的天然配体的量相对于无该测试物存在时的相应的特异结合量会减小。

在本发明的筛选方法中，当比较经由SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞而特异结合的天然配体的量时，标记的天然配体可用作上述天然配体。对于上述标记，可采用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的实例包括[³H]，[¹⁴C]，[¹²⁵I]以及[³⁵S]。酶的实例包括β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和过氧化物酶。荧光物质的实例包括异硫氰酸荧光素和BODIPY。发光物质的实例包括荧光素和光泽精。偶尔，生物素-抗生物素系统可用于天然配体和标记物的结合。

因此，本发明的筛选方法可筛选结合SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞而抑制它们结合天然配体的化合物，无需区分经由SALPR的增加和降低体重能力。

在本发明的筛选方法的另一实施方案中，将上述细胞在有或无测试物存在的条件下与标记的天然配体(即松弛素-3)接触，以比较在上述条件下经由上述细胞特异结合的上述天然配体的量，接着进一步比较在这些条件下上述天然配体的特异细胞刺激活性，由此使得在区分经由SALPR的增加和降低体重能力时筛选化合物成为可能。

在上述实施方案中，结合上述细胞并经由包含在上述细胞中的受体展示细胞刺激活性的物质可被选作经由SALPR增加体重的化合物。

在另一方面，在上述实施方案中，抑制上述细胞与天然配体的结合但不展示细胞刺激活性的测试物可被选作经由SALPR降低体重的化合物。

本发明的筛选方法例如可采用腺苷酸环化酶活性的抑制作为细胞刺激活性来进行。

在该实施方案的筛选方法中，例如，通过腺苷酸环化酶的活化而在细胞中生成的cAMP可采用已知方法测量，由此使得区分经由SALPR的增加和降低体重能力时筛选化合物成为可能。该实施方案利用了通过天然配体与SALPR的结合产生的细胞内信号传递，即作为SALPR的细胞刺激活性之一的腺苷酸环化酶活性的抑制。具体地，当天然配体结合SALPR时，偶联到SALPR的G蛋白家族的成员Gi家族抑制腺苷酸环化酶以降低细胞中生成的环状AMP(cAMP，通过腺苷酸环化酶从ATP生成)的量。

例如，当将腺苷酸环化酶活化剂[例如，毛喉素(FSK)]添加到在细胞膜上表达SALPR(优选地，通过引入含有SALPR的表达载体而过量表达)的哺乳动物衍生的细胞(例如，HEK-293细胞或CHO细胞)时，细胞内cAMP浓度增加。

另外，当SALPR的天然配体在添加腺苷酸环化酶活化剂的情况下添加时，除了腺苷酸环化酶活化剂引起的腺苷酸环化酶活性刺激以外，由于上述天然配体对本发明的SALPR的作用，也可产生腺苷酸环化酶活性抑制，这导致与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比cAMP生成的减少。因此，当进行具有增加体重活性的化合物的筛选时，通过与测试物单独接触，可以选择减少cAMP生成(即与天然配体的活性相同)的化合物，以替换在该筛选系统中经由SALPR起作用的天然配体。

当进行具有减轻体重活性化合物的筛选时，可将腺苷酸环化酶活化剂、SALPR的天然配体和测试物添加到细胞用于筛选。由于天然配体的作用，与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比，cAMP生成减少；但是，当测试物拮抗天然配体的作用时，cAMP生成的减少受到抑制。这时，该测试物可被选作具有减轻体重活性的化合物。

可采用免疫分析等作为测量细胞内cAMP含量的方法；例如，也可采用定量cAMP的商品化试剂盒。

在筛选方法的另一实施方案中，例如，通过采用在细胞膜上表达SALPR(优选通过引入含有SALPR的表达载体而过量表达)并含有在5′端上游具有cAMP应答元件(CRE)的报告基因[例如，碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因、β-内酰胺酶基因、硝基还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-半乳糖苷酶基因或诸如GFP(绿色荧光蛋白)的荧光蛋白基因]的细胞(以下有时称作“筛选细胞”)，可在区分经由SALPR的增加和降低体重能力的情况下实现化合物的筛选。该实施方式利用了该事实，即上述筛选细胞中在启动子区域引入了CRE的报告基因的转录由于上述cAMP生成的减少而被抑制。

以下将更加详细地解释，通过上述实施方案在区分经由SALPR的增加和减轻体重能力的情况下的化合物筛选方法。

换言之，引入上述筛选细胞中的CRE为常常存在于一组基因(cAMP诱导基因)的转录调节区的碱基序列，该组基因在细胞内cAMP浓度增加时被加速表达。因此，当腺苷酸环化酶活化剂(例如FSK)添加到筛选细胞中时，细胞内cAMP浓度增加，这导致位于CRE下游的报告基因的表达量增加。可通过测量来自底物与报告基因产物反应产生的发光物质的发光或来自作为报告基因产物生成的荧光蛋白的荧光而容易地测量报告基因产物的表达量。

此外，当在添加腺苷酸环化酶活化剂的情况下添加SALPR的天然配体时，除了由于腺苷酸环化酶活化剂引起的上述腺苷酸环化酶活化刺激以外，由于上述天然配体对本发明SALPR的作用，也会出现腺苷酸环化酶活性抑制，这导致与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比，报告基因产物的表达量降低。因此，当进行具有体重增加活性的化合物筛选时，可通过单独接触测试物选择降低报告基因产物表达量的化合物(即与天然配体具有相同活性)，在该筛选系统中替代经由SALPR起作用的天然配体。

当进行具有降低体重活性化合物的筛选时，可将腺苷酸环化酶活化剂、SALPR的天然配体和测试物添加到筛选细胞。与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比，由于天然配体的作用，报告基因产物表达量降低；但是，当测试物拮抗天然配体的作用时，报告基因产物表达量的降低受到抑制。这时，测试物可被选作具有降低体重活性的化合物。

可容易地证实测试物是否通过与SALPR结合而起作用。例如，平行于采用筛选细胞(即，在细胞膜上表达SALPR并含有在5′端上游具有CRE的报告基因的细胞)的上述测试，采用对照细胞(例如，含有在5′端上游具有CRE的报告基因，但不在细胞膜上表达SALPR的细胞)进行类似测试。结果，当上述测试物不通过与SALPR结合起作用时，用于筛选的细胞和用于对照的细胞对于报告基因产物表达量显示相同的现象，而当上述测试物通过与SALPR结合起作用时，用于筛选的细胞和用于对照的细胞对于报告基因产物表达量显示不同的现象。

此外，在另一实施方案中，可通过向人或除人以外的生物体[例如，非人的哺乳动物(例如，牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬)、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类和昆虫类]给予经上述筛选方法选择的测试物，并在给药后测量摄食量、体重和肥胖指标(例如，身体脂肪百分比、BMI(身体质量指数)、肥胖程度、体质、生理年龄(physicalage)、阻抗、体脂重量、无脂肪质量、身体水质量、身体蛋白质量、肌肉质量、无机质量、身体细胞质量、肌肉质量与身体区域之比(musclemass by the region of the body)、水质量与身体区域之比、BMR(基础代谢率)、能量需求、内脏-皮下脂肪比(VSR)、内脏脂肪重、皮下脂肪重、内脏脂肪重量水平、器官重量、血液参数变化以及血液中的瘦素、葡萄糖、脂质、激素、分泌性肽的量)，以证实和确定测试物影响体重控制。上述哺乳动物不限于普通的动物，还可以是遗传突变的疾病动物模型(例如，病态肥胖模型，诸如ob/ob小鼠、db/db小鼠和Zucker肥胖大鼠)和遗传修饰动物。测试物可口服或胃肠外给药。胃肠外途径的实例包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、气管内、直肠内和脑内给药，优选在临近下丘脑的脑室内给药。作为用于该筛选的指标，例如摄食量和肥胖指标以及体重可被有效地测量。此外，在给药时，可添加诸如禁食、饱食和过量脂肪食物的条件。

采用松弛素-3受体筛选涉及肥胖控制的化合物的方法

更具体地，作为松弛素-3受体，经报道的已知受体，例如LGR7(GenBank登录号NM_021634)、SALPR(GenBank登录号NM_016568，也称为GPCR135)或GPR100(GenBank登录号AB_083593，也称为hGPCR11或GPCR142)可被采用。另外，这些受体的部分多肽无特别限制，只要它可用在后面描述的筛选方法中，也可采用与松弛素-3有结合能力的部分多肽、包含对应于细胞膜外部区域的氨基酸序列的部分多肽等等。

本发明的内容将参考采用SALPR作为本发明的优选实例的筛选方法，在以下的本说明书中进行详细解释。换言之，本发明将提供筛选结合SALPR或其部分多肽并涉及肥胖控制(刺激或抑制肥胖)的化合物的方法。此外，可通过使测试物作用于SALPR或其部分多肽并测量细胞刺激活性而确定该物质是否具有刺激或抑制肥胖的活性。

编码要用在本发明中的SALPR的多肽指包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽、功能上等同于包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽的修饰多肽或包含与SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列有70％或以上、优选80％或以上、更优选85％或以上、再优选90％或以上、再更优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上同源性的氨基酸序列并展示与松弛素-3基本相同活性(例如，与松弛素-3的结合能力和与该结合有关的各种细胞刺激活性，或肥胖控制活性)的多肽。

这里，功能上等同于包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽的修饰多肽指包含氨基酸序列并展示与SALPR基本相同活性(例如，与松弛素-3的结合能力和与该结合有关的各种细胞刺激活性，或肥胖控制活性)的多肽，所述氨基酸序列在包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽中具有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸的一处或几处删除、置换、插入和/或添加。

此外，也可采用SALPR的部分多肽，只要它具有与SALPR基本相同的活性(例如，与松弛素-3的结合能力和与该结合有关的各种细胞刺激活性或肥胖控制活性)。

将编码SALPR的多核苷酸引入合适的宿主细胞中，得到的转化体在能使其表达的条件下培养，然后可以通过常用的分离和纯化表达的蛋白的方法从培养物中分离和纯化目的多肽，由此制备SALPR。用于上述分离和纯化的方法的实例包括硫酸铵盐析、采用离子交换纤维素的离子交换柱层析、采用分子筛凝胶的分子筛柱层析、采用蛋白质-A结合多糖的亲和柱层析、透析和冻干。

(a)包含SEQ ID NO：3表示的碱基序列的多核苷酸；

根据本发明的另一个实施方案，要用在本发明中的多核苷酸为编码“包含在SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的一个或多个(优选一个或几个)位点处具有一个或多个(优选一个或几个)氨基酸的删除、置换、插入和/或添加的氨基酸序列，并展示与上述SALPR基本相同活性的多肽”的多核苷酸。这里，可以被删除、置换、插入和/或添加的氨基酸残基的数目例如为1-30、优选1-20、更优选1-10、再更优选1-5、最优选1-2。

上述表达载体的实例包括用于E.coli的pUC、pTV、pGEX、pKK以及pTrcHis；用于酵母的pEMBLY和pYES2；用于CHO细胞、HEK-293细胞以及COS细胞的pcDNA3，pMAMneo以及pBabe Puro；用于BmN4细胞的具有家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体启动子的载体(例如，pBK283) 。

含有SALPR的细胞无特别限制，只要它在细胞膜表面表达SALPR，并可例如通过在能使SALPR表达的条件下培养上述转化体(即，用含有编码SALPR的多核苷酸的质粒转化的细胞)或通过将编码SALPR的RNA注射到合适的细胞并在能使SALPR表达的条件下培养来获得。

要用在本发明中的含有SALPR的细胞膜组分例如可通过使本发明的表达SALPR的细胞破裂并分离富含细胞膜的成分而获得。破裂细胞的方法的实例包括采用匀浆器(例如，Potter-Elvehiem型匀浆器)碎裂细胞、通过韦林氏搅切器或Polytron(Kinematica)破裂、超生破裂以及采用法国压等在压力下通过将细胞从细小的管口喷射而破裂的方法。另外，分级分离细胞膜的方法的实例包括通过离心的分级分离方法，该离心诸如为差速离心和密度梯度离心。

在筛选经由本发明的SALPR刺激或抑制肥胖的化合物的方法中，可采用上述细胞膜组分(即含有SALPR的细胞膜组分)或上述细胞(即含有SALPR的细胞)。

在本发明的筛选方法中，例如将SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞与测试物接触，以分析SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞是否与所述测试物结合，由此无需区分经由SALPR的刺激和抑制肥胖能力而实现化合物的筛选。

具体地，在有或无测试物存在时，将SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞与标记的天然配体(即松弛素-3)结合，以比较经由SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞而特异结合的上述天然配体的量，由此无需区分经由SALPR的肥胖刺激和抑制能力而实现化合物的筛选。即，当上述测试物具有经由SALPR的刺激或抑制肥胖能力时，则在测试物存在下，经由SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞而特异结合的天然配体的量相对于无该测试物存在时的相应的特异结合量会减小。

在本发明的筛选方法中，当比较经由SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞特异结合的天然配体的量时，标记的天然配体可用作上述天然配体。对于上述标记，可采用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的实例包括[³H]，[¹⁴C]，[¹²⁵I]以及[³⁵S]。酶的实例包括β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和过氧化物酶。荧光物质的实例包括异硫氰酸荧光素和BODIPY。发光物质的实例包括荧光素和光泽精。偶尔，生物素-抗生物素系统可用于天然配体和标记物的结合。

因此，本发明的筛选方法可筛选结合SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞而抑制它们结合天然配体的化合物，无需区分经由SALPR的刺激和抑制肥胖能力。

在本发明的筛选方法的另一实施方案中，将上述细胞在有或无测试物存在的条件下与标记的天然配体(即松弛素-3)接触，以比较在上述条件下经由上述细胞特异结合的上述天然配体的量，接着进一步比较在这些条件下上述天然配体的特异细胞刺激活性，由此使得在区分经由SALPR的刺激和抑制肥胖能力时筛选化合物成为可能。

在上述实施方案中，结合上述细胞并经由包含在上述细胞中的受体展示细胞刺激活性的物质可被选作经由SALPR刺激肥胖的化合物。

在另一方面，在上述实施方案中，抑制上述细胞与天然配体的结合但不展示细胞刺激活性的测试物可被选作经由SALPR抑制肥胖的化合物。

在该实施方案的筛选方法中，例如通过腺苷酸环化酶的活化而在细胞中生成的cAMP可采用已知方法测量，由此使得区分经由SALPR的刺激和抑制肥胖能力时筛选化合物成为可能。该实施方案利用了通过天然配体与SALPR的结合产生的细胞内信号传递，即作为SALPR的细胞刺激活性之一的腺苷酸环化酶活性的抑制。具体地，当天然配体结合SALPR时，偶联到SALPR的G蛋白家族的成员Gi家族抑制腺苷酸环化酶以降低细胞中生成的环状AMP(cAMP，通过腺苷酸环化酶从ATP生成)的量。

例如，当将腺苷酸环化酶活化剂[例如，毛喉素(FSK)]添加到在细胞膜上表达SALPR(优选通过引入含有SALPR的表达载体而过量表达)的哺乳动物衍生的细胞(例如，HEK-293细胞或CHO细胞)时，细胞内cAMP浓度增加。

另外，当SALPR的天然配体在添加腺苷酸环化酶活化剂的情况下添加时，除了腺苷酸环化酶活化剂引起的腺苷酸环化酶活性刺激以外，由于上述天然配体对本发明的SALPR的作用，也可产生腺苷酸环化酶活性的抑制，这导致与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比cAMP生成减少。因此，当进行具有刺激肥胖活性的化合物的筛选时，通过与测试物单独接触来选择减少cAMP生成(即与天然配体的活性相同)的化合物，以替换在该筛选系统中经由SALPR起作用的天然配体。

当进行具有抑制肥胖活性化合物的筛选时，可将腺苷酸环化酶活化剂、SALPR的天然配体和测试物添加到细胞用于筛选。由于天然配体的作用，与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比，cAMP生成减少；但是，当测试物拮抗天然配体的作用时，cAMP生成的减少受到抑制。这时，该测试物可被选作具有抑制肥胖活性的化合物。

在筛选方法的另一实施方案中，例如，通过采用在细胞膜上表达SALPR(优选通过引入含有SALPR的表达载体而过量表达)并含有在5′端上游具有cAMP应答元件(CRE)的报告基因[例如，碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因、β-内酰胺酶基因、硝基还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-半乳糖苷酶基因或诸如GFP(绿色荧光蛋白)基因的荧光蛋白基因]的细胞(以下有时称为“筛选细胞”)，可在区分经由SALPR的刺激和抑制肥胖能力时实现化合物的筛选。该实施方式利用了该事实，即上述筛选细胞中在启动子区域引入了CRE的报告基因的转录由于上述cAMP生成的减少而被抑制。

以下将更加详细地解释，通过上述实施方案在区分经由SALPR的刺激和抑制肥胖能力时的化合物筛选方法。

换言之，引入上述筛选细胞中的CRE为常常存在于一组基因(cAMP诱导基因)的转录调节区的碱基序列，该组基因在细胞内cAMP浓度增加时加速表达。因此，当腺苷酸环化酶活化剂(例如FSK)被添加到筛选细胞时，细胞内cAMP浓度增加，这导致位于CRE下游的报告基因的表达量增加。可通过测量来自底物与报告基因产物反应产生的发光物质的发光或来自作为报告基因产物而生成的荧光蛋白的荧光而容易地测量报告基因产物的表达量。

此外，当在添加腺苷酸环化酶活化剂的情况下添加SALPR的天然配体时，除了由于腺苷酸环化酶活化剂引起的上述腺苷酸环化酶活化刺激以外，由于上述天然配体对本发明SALPR的作用，也会出现腺苷酸环化酶活性的抑制，这导致与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比，报告基因产物的表达量降低。因此，当进行展示刺激肥胖活性的化合物筛选时，可通过单独接触测试物选择降低报告基因产物表达量的化合物(即与天然配体具有相同活性)，在该筛选系统中替代经由SALPR起作用的天然配体。

当进行具有抑制肥胖活性化合物的筛选时，可将腺苷酸环化酶活化剂、SALPR的天然配体和测试物添加到筛选细胞。与单独添加腺苷酸环化酶活化剂的情况相比，由于天然配体的作用，报告基因产物表达量降低；但是，当测试物拮抗天然配体的作用时，报告基因产物表达量降低受到抑制。这时，测试物可被选作具有抑制肥胖活性的化合物。

可容易地证实测试物是否通过与SALPR的结合而起作用。例如，平行于采用筛选细胞(即，在细胞膜上表达SALPR并含有在5′端上游具有CRE的报告基因的细胞)的上述测试，采用对照细胞(例如，含有在5′端上游具有CRE的报告基因，但不在细胞膜上表达SALPR的细胞)进行类似测试。结果，当上述测试物不通过与SALPR结合起作用时，用于筛选的细胞和用于对照的细胞对于报告基因产物表达量显示相同的现象，而当上述测试物通过与SALPR结合起作用时，用于筛选的细胞和用于对照的细胞对于报告基因产物表达量显示不同的现象。

此外，在另一实施方案中，可通过向人或除人之外的生物体[例如，非人的哺乳动物(例如，牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬)、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类和昆虫类]给予经上述筛选方法选择的测试物，并在给药后测量摄食量、体重和肥胖指标(例如，身体脂肪百分比、BMI(身体质量指数)、肥胖程度、体质、生理年龄、阻抗、体脂重量、无脂质量、身体水质量、身体蛋白质量、肌肉质量、无机质量、身体细胞质量、肌肉质量与身体区域之比、水质量与身体区域之比、BMR(基础代谢率)、能量需求、内脏-皮下脂肪比(VSR)、内脏脂肪重、皮下脂肪重、内脏脂肪重量水平、器官重量、血液参数变化以及血液中的瘦素、葡萄糖、脂质、激素、分泌性肽的量)，以证实和确定影响导致肥胖的活性的测试物。上述哺乳动物不限于普通的动物，还可以是遗传突变的疾病动物模型(例如，病态肥胖模型，诸如ob/ob小鼠、db/db小鼠和Zucker肥胖大鼠)和遗传修饰的动物。测试物可口服或胃肠外给药。胃肠外途径的实例包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、气管内、直肠内和脑内给药，优选在临近下丘脑的脑室内给药。作为用于该筛选的指标，例如摄食量和体重以及肥胖指标可被有效地测量。此外，在给药时，可添加诸如禁食、饱食和过量脂肪食物的条件。

这里，本发明中采用的测试物可为任何化合物，并且可例如为基因库的表达产物、合成的低分子量化合物库、核酸(寡聚DNA、寡聚RNA)、合成肽库、抗体、细菌释放物质、细胞提取液(微生物、植物细胞或动物细胞)、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)培养上清液、纯化或部分纯化的多肽、来自海洋生物体、植物或动物、土壤的提取物或随机噬菌体肽展示文库。

筛选试剂盒

本发明的筛选试剂盒含有松弛素-3受体，优选为SALPR，或上述细胞膜组分(即含有SALPR的细胞膜组分)，或上述细胞(即，含有SALPR的细胞)。上述筛选试剂盒另外含有各种试剂，如标记的松弛素-3、非标记的松弛素-3、用于结合反应的缓冲液和/或用于清洗的缓冲液、说明书，以及如需要还含有仪器。

具体地，上述筛选试剂盒含有SALPR、上述细胞膜组分或上述细胞以及可以含有标记的天然配体(即松弛素-3)、非标记的天然配体和/或用于结合反应的缓冲液、说明书，以及如需要还含有仪器。

本发明另一个实施方案的筛选试剂盒包括在细胞膜上表达松弛素-3受体，优选为SALPR，(优选通过引入含有SALPR的表达载体而过量表达)而且含有在5′端上游具有cAMP应答元件(CRE)的报告基因的细胞，如果需要，还可包含碱性磷酸酶、荧光素酶等的底物，腺苷酸环化酶活化剂(例如，FSK)、天然配体(即松弛素-3)和/或用于结合反应的缓冲液、说明书，以及仪器。

本发明又一个实施方案的筛选试剂盒包括在细胞膜上表达松弛素-3受体，优选为SALPR，(优选通过引入含有SALPR的表达载体而过量表达)并且含有在5′端上游具有cAMP应答元件(CRE)的报告基因的细胞，以及含有在5′端上游具有cAMP应答元件(CRE)的报告基因但不在细胞膜上表达SALPR的细胞，并且如果需要，可含有报告基因产物的底物、腺苷酸环化酶活化剂(例如，FSK)和/或用于结合反应的缓冲液、说明书，以及仪器。

含有通过本发明筛选方法获得的化合物的药物

通过本发明筛选方法获得的化合物为刺激或抑制摄食的化合物、增加或降低体重的化合物、或刺激或抑制肥胖的化合物。所述化合物可以为盐的形式，例如，药物可接受的盐。相应地，通过本发明筛选方法获得的化合物或其盐可用作药物，用于治疗由某些摄食(或食欲)控制异常引起的疾病、由某些控制体重方面的异常引起的疾病、由某些控制肥胖方面的异常引起的疾病及由于松弛素-3的异常或编码松弛素-3的多核苷酸异常而引起的疾病。另外，其可以用作治疗药物，目的是恢复摄食(或食欲)和/或体重，其由于各种疾病的发作或各种疾病的治疗(例如，手术中或手术后)而增加或降低。上述疾病的实例包括涉及消化道活动或功能的疾病(例如，腹泻、便秘、功能性便秘、过敏性肠综合症和在消化道检查时或手术之前或之后需要通便刺激以除去肠内容物的情况)，涉及控制免疫功能的疾病(例如，慢性类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾病、硬皮病、特应性皮炎、支气管哮喘、多发性硬化、风湿性间质性肺炎、肉瘤样病、克隆氏疾病、炎性结肠炎、肝硬化、慢性肝炎、暴发型肝炎、脑脊髓炎和重症肌无力)，涉及能量代谢的疾病(例如，糖尿病、肥胖型糖尿病、葡萄糖耐受异常、酮症、酸中毒、糖尿病神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、高血脂、动脉硬化、心绞痛、心肌梗塞、肥胖、病态肥胖、摄食障碍和厌食)、AIDs、肿瘤以及恶病质。

根据本发明的筛选方法，提供了具有经由松弛素-3受体、优选SALPR或其部分多肽抑制刺激细胞活性的活性(SALPR-抑制活性)的化合物，更具体地，由天然配体与SALPR或其部分多肽结合引起的细胞刺激活性(例如，细胞内钙释放、腺苷酸环化酶活化、细胞内cAMP生成、细胞内cGMP生成、肌醇磷脂生成、细胞膜的电位改变、细胞膜附近的pH改变、细胞内蛋白质的磷酸化、c-fos和c-jun诱导/活化、花生四烯酸的释放)。含有这种化合物的药物实例包括摄食抑制剂、体重降低剂、脂肪减少剂、用于肥胖治疗的治疗剂和用于糖尿病治疗的治疗剂。

由此获得的化合物或其盐可以单独使用；但其也可与药物可接受的载体混合作为药物组合物使用。载体中活性成份的百分比可在1-90重量％之间变化。上述药物可以各种形式经口或胃肠外(例如，静脉内、肌肉内、皮下、直肠和皮肤给药)向人或不同于人的生物体[例如，非人哺乳动物(例如牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬)、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类以及昆虫类]给药。相应地，含有通过本发明获得的化合物或其盐的药物组合物按照给药途径配制成合适的剂型。具体地，它可配制成诸如片剂、胶囊、颗粒、分散性粉剂以及糖浆的口服制剂，或诸如注射剂、静脉滴液、脂质体组合物以及栓剂的胃肠外制剂。这些制剂可通过普通方法采用常用的赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、滑润剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、增溶剂、抗菌剂、矫味剂、镇痛剂、稳定剂等等制成。要采用的上述非毒性添加剂的实例包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、硬脂酸镁、甲基纤维素或其盐、乙醇、柠檬酸、氯化钠和磷酸钠。

它们的剂型和给药量取决于通过本发明筛选方法获得的化合物或其盐的选择、给药的对象、给药途径、制剂的特性、患者的状况以及医师的判断。但是，每kg患者体重的合适剂量范围例如为约1.0-1,500μg，优选约10-500μg。考虑到效率会随给药途径而不同，预计必需剂量会在大范围变化。例如，预计经口给药的所需剂量比静脉注射的高。这种剂量水平的变化可通过使用本领域熟知的标准经验优化程序进行调整。

抑制松弛素-3活性的物质及其应用

本发明使用的抑制松弛素-3(即松弛素-3、修饰多肽或同源多肽)活性的物质能够抑制或阻止摄食刺激、体重增加和肥胖。因此，抑制松弛素-3表达的物质有可能用于通过松弛素-3在体内、离体和体外控制与摄食控制和体重控制(例如，能量代谢控制，生长)以及肥胖相关的功能。

本发明中使用的抑制松弛素-3活性的物质无特别限制，只要其具有上述活性，例如可为抑制松弛素-3表达的物质，诸如具有编码松弛素-3的碱基序列的反义序列的DNA、具有编码松弛素-3的碱基序列的双链RNA(小干扰RNA(siRNA))或核酶；或者与松弛素-3或松弛素-3受体(优选SALPR)相互作用以抑制松弛素-3的活性的化合物，例如松弛素-3抗体、糖蛋白，或通过上述筛选方法获得的化合物。

上述物质可以盐的形式存在，例如药物可接受的盐。因此，抑制松弛素-3(即松弛素-3、修饰多肽或同源多肽)活性的物质或其盐可用作药物，用于治疗由某些摄食(或食欲)控制异常引起的疾病，由某些体重控制异常引起的疾病，由某些肥胖控制异常引起的疾病以及由于松弛素-3或编码松弛素-3的多核苷酸异常引起的疾病。另外，其可以用作治疗药物，目的是恢复摄食(或食欲)和/或体重，其由于各种疾病的发作或各种疾病的治疗(例如，手术中或手术后)而增加或降低。上述疾病的实例包括涉及消化道运动或功能的疾病(例如，腹泻、便秘、功能性便秘、过敏性肠综合症和在消化道检查时或手术之前或之后需要通便刺激以除去肠内容物的情况)，涉及控制免疫功能的疾病(例如，慢性类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾病、硬皮病、特应性皮炎、支气管哮喘、多发性硬化、风湿性间质性肺炎、肉瘤样病、克隆氏疾病、炎性结肠炎、肝硬化、慢性肝炎、暴发型肝炎、脑脊髓炎和重症肌无力)，涉及能量代谢的疾病(例如，糖尿病、肥胖型糖尿病、葡萄糖耐受异常、酮症、酸中毒、糖尿病神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、高血脂、动脉硬化、心绞痛、心肌梗塞、肥胖、病态肥胖和摄食障碍)。优选地，其可用作摄食控制剂、体重降低剂、脂肪减少剂、用于治疗肥胖的治疗剂或用于治疗糖尿病的治疗剂。

反义核酸抑制靶基因表达的机理为，例如，(1)通过三链链的形成抑制转录的起始，(2)在由RNA聚合酶形成的局部开环结构位点处通过杂交的形成抑制转录，(3)通过与正在合成的RNA形成杂交体抑制转录，(4)通过在内含子-外显子连接处形成杂交体而抑制剪接，(5)通过在剪接体的形成位点形成杂交体而抑制剪接，(6)通过与mRNA形成杂交体而抑制mRNA转移进入细胞质，(7)通过在加帽位点或poly-A添加位点形成杂交体而抑制剪接，(8)通过在翻译起始因子结合位点形成杂交体而抑制翻译起始，(9)通过在核糖体结合位点形成杂交体而抑制翻译，(10)通过在mRNA翻译区或多核糖体结合位点形成杂交体而抑制肽链的延长，和(11)通过在核酸/蛋白质相互作用位点形成杂交体而抑制基因表达(New ExperimentalCourse of Biochemistry 2，Nucleic Acid IV，Gene Replication andExpression，by Hirashima and Inoue，compiled by the JapaneseBiochemical Society，Tokyo Kagaku Dojin，pp.319-347，1993)。

用于本发明的松弛素-3的反义核酸可以为通过任何上述机理(1)-(11)抑制基因表达的任何核酸。也就是，其可以不仅含有抑制表达的基因翻译区，还可含有非翻译区序列的反义序列。编码反义核酸的DNA可通过与合适的调节序列连接使其表达而应用。反义核酸不必完全互补于靶基因的翻译区或非翻译区，只要其有效抑制靶基因表达即可。这种反义核酸为至少15bp或以上，优选100bp或以上，更优选500bp或以上，并且一般链长为3000bp或以下，优选2000bp或以下，更优选100bp或以下，并且与靶基因转录产物的互补链的同源性优选90％或以上，更优选95％或以上。这种反义核酸可基于松弛素-3序列信息采用硫逐磷酸酯方法(Stein(1988)Nucleic Acids Res.16：3209-21)等制备。

核酶是RNA构成的催化剂的一般术语，可不严格地分成大核酶和小核酶。大核酶是切断核酸的磷酸二酯键的酶，反应后在反应位点留下5′-磷酸和3′-羟基基团。大核酶进一步分成(1)组I内含子RNA，其在5′剪接位点通过尿嘌呤核苷进行转酯反应，(2)组II内含子RNA，其经套索结构通过两步反应自剪接，和(3)核糖核酸酶P的RNA组分，其通过水解作用将tRNA前体在5′侧切断。另一方面，小核酶为相对小的结构单元(约40bp)并通过切断RNA产生5′-羟基基团和2′，3′-环磷酸酯。小核糖酶包括锤头型核酶(Koizumi等人(1988)FEBS Lett.228：225)、发夹型核酶(Buzayan(1986)Nature323：349；Kikuchi and Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.19：6751；HiroshiKikuchi(1992)Kagaku to Seibutsu 30：112)等等。由于核酶很容易被修饰和合成，因此已知有各种改进方法。例如，锤头型核酶在可通过将核酶的底物结合位点设计成互补于靶位点附近的RNA序列而生成，其在靶RNA中识别并切断碱基序列UC、UU或UA(Koizumi等人(1988)FEBS Lett.228：225；Makoto Koizumi and Eiko Otsuka(1990)Tampakushitsu Kakusan Koso 35：2191；Koizumi et al.(1989)NucleicAcids Res.17：7059)。根据已知方法，也可以设计并产生发夹型核酶(Kikuchi and Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.19：6751；Hiroshi Kikuchi(1992)Kagaku to Seibutsu 30：112)。

1998年，在秀丽线虫(Caenorhabditis elegance)中观察到RNAs彼此干扰而失去其功能的现象(RNA干扰)(Fire等人(1998)Nature391：806-11)。该RNA干扰是由于将合成的双链RNA引入细胞而分解具有相同碱基序列的RNA的现象。随后的研究显示，诸如RNA干扰的RNA沉默现象是除去缺陷mRNA并防卫诸如转座子和病毒的分子寄生物的细胞机制。如今，双链RNA(小干扰RNA；siNRA)用作抑制许多基因的表达的工具，以及采用siRNA通过控制致病基因等的表达而治疗或预防疾病的方法正在研究中。本发明中的siRNA无特别限制，只要其抑制松弛素-3的mRNA的转录即可。一般地，siRNA是靶mRNA的有义链与反义链的结合并且长度为至少10个核苷酸至与靶mRNA相同的核苷酸数目。该长度优选15-75个，更优选18-50个，进一步更优选20-25个核苷酸。为了抑制松弛素-3表达，可以通过已知方法将siRNA引入细胞。例如，设计在单一链上的构成siRNA的两RNA链的编码DNA并且导入表达载体中，用获得的表达载体转化细胞，由此该siRNA可在细胞中表达为具有发夹结构的双链RNA。已设计通过转染不断产生siRNA的质粒表达载体(例如，RNAi-Ready pSIRENVector，RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector(BD BiosciencesClontech))。也可以设计siRNA的碱基序列，例如，应用在Ambion网址(http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)的计算机程序设计。用于筛选功能性siRNA的试剂盒等等(例如，BD KnockoutRNAi System(BD Biosciences Clontech))也可购得。

在抑制患者细胞内基因表达的基因治疗中，本发明的反义核酸，核酶和siRNA可直接给药进入组织，或具有如此构建以便表达这些元件的结构的载体(例如，病毒衍生的载体，例如逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒载体，以及非病毒载体，例如脂质体)可直接给药进入组织(体内方法)。可通过注射进入组织位点，例如肌肉内注射、皮下注射、动脉内注射或静脉内注射完成给药。

或者，事先，可将具有如此构建以便表达本发明反义核酸的结构的载体、核酶和siRNA引入离体细胞。由此获得的细胞例如通过肌肉注射、皮下注射、动脉注射或静脉注射(离体方法)注射进患者组织。可以使用患者细胞的异源或同源细胞，优选同源细胞，更优选取自患者的细胞。

本发明的反义核酸、核酶和siRNA或如此构建的以便表达这些元件的载体可单独使用；然而，它们可与药物可接受的载体混合用作药物组合物(例如，摄食抑制剂、用于肥胖治疗的治疗剂、用于糖尿病治疗的治疗剂)。例如，当以注射剂形式给药时，该药物组合物可含有蒸馏水，盐如氯化钠的溶液或氯化钠和无机盐的混合物，糖例如甘露醇、乳糖、右旋糖苷和葡萄糖的溶液，氨基酸如甘氨酸和精氨酸的溶液，有机酸溶液或盐溶液和葡萄糖溶液的混合溶液，等等。

给药剂量根据患者体重和年龄、症状情况、给药形式等等而变化；然而，可由本领域技术人员合适地选择剂量。

要用在本发明中的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体以及抗体片段。

除了松弛素-3(即，松弛素-3，修饰多肽或同源多肽)或其部分片段用作免疫抗原和筛选抗原以外，要用在本发明中的单克隆抗体可以通过已知方法获得。例如，用上述免疫抗体免疫小鼠，从该小鼠获得的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞用细胞融合方法(Nature，256，495(1975))或细胞电融合方法(J.Immunol.Method，100，181-189(1987))进行细胞融合，融合的细胞用上述筛选抗原进行筛选，由此可以获得要用在本发明中的产生单克隆抗体的杂交瘤。

作为培养上述杂交瘤的培养基，可采用任何适合培养杂交瘤的培养基，优选补充了胎牛血清、L-谷氨酰胺、L-丙酮酸和抗生素(青霉素G和链霉素)的Dulbecco改良的Eagle最低必需培养基。上述杂交瘤可在培养基中在5％ CO₂气氛中于37℃培养3天。或者，可在小鼠腹膜内培养约14天。

从如此获得的培养液或小鼠腹部液体中，上述单克隆抗体可通过普通蛋白质分离和纯化方法进行分离和纯化。这些方法的实例包括硫酸铵盐析法、采用离子交换纤维素的离子交换柱色谱法、采用分子筛凝胶的分子筛柱色谱法、采用蛋白质-A结合多糖的亲和柱层析法、透析和冻干法。

除了松弛素-3(即，松弛素-3，修饰多肽或同源多肽)或其部分片段用作免疫抗原和筛选抗原之外，要用在本发明中的单克隆抗体可以通过已知方法获得，例如，如下文所述。具体地，含有抗原的生理盐水与等量的弗氏完全佐剂或不完全佐剂或其等同物如Hunter’sTiterMax^TM(Funakoshi)混合并乳化的乳剂，经皮下、腹膜内或肌肉内向哺乳动物(尤其是兔或山羊)给药(初此免疫)。其后，以2-4周时间间隔以同样方式进行数次免疫。最后一次免疫后的1-2周，从哺乳动物的颈动脉或心脏取血，经硫酸铵盐析制备血清。

要用在本发明中的抗体片段为上述抗体(包括单克隆抗体和多克隆抗体)的部分片段，无特别限制，只要其与原始抗体具有相同的反应特异性即可。根据本发明抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv。例如，可将上述方法获得的单克隆抗体或多克隆抗体根据普通方法经蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)消化，然后产物经过普通蛋白分离和纯化方法处理而获得要用在本发明中的抗体片段。

此外，根据另一实施方案，要用在本发明中的抗体可通过WO01/068862和日本专利公开No.2002-345468的说明书描述的方法获得。也可采用已知的松弛素-3抗体，例如，日本专利公开号2002-345468(单克隆抗体HK4-144-10)的实施例中描述的抗体。

要用在本发明中的抗体也可用作药物组合物，例如摄食(或食欲)抑制剂、用于治疗肥胖的治疗剂和用于治疗糖尿病的治疗剂。要用在本发明中的抗体可通过与药物可接受的载体混合用作药物组合物。载体中的活性成分百分比可在1-90重量％之间变化。另外，上述药物可以各种形式经口或胃肠外(例如，静脉内、肌肉内、皮下、直肠或皮肤给药)向人或不同于人的生物体[例如，非人哺乳动物(例如牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬)、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类以及昆虫类]给药。相应地，含有本发明抗体的药物组合物按照给药途径配制成合适的剂型。具体地，它可配制成诸如片剂、胶囊、颗粒、分散性粉剂以及糖浆的口服制剂，或诸如注射剂、静脉滴液、脂质体组合物以及栓剂的胃肠外制剂。这些药物组合物可通过普通方法采用常用的赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、滑润剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、增溶剂、抗菌剂、矫味剂、镇痛剂、稳定剂等等制成。要采用的上述非毒性添加剂的实例包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、硬脂酸镁、甲基纤维素或其盐、乙醇、柠檬酸、氯化钠和磷酸钠。

它们的剂型和给药量取决于抗体的选择、给药的对象、给药途径、制剂的特性、患者的状况以及医师的判断。但是，每kg患者体重的合适剂量范围例如为约0.01-30mg，优选约0.1-10mg。考虑到效率会随给药途径而不同，预计必需剂量会在大范围变化。例如，预计经口给药的所需剂量比静脉内注射的高。这种剂量水平的变化可通过使用本领域熟知的标准经验优化程序进行调整。

与松弛素-3或松弛素-3受体(优选SALPR)作用并抑制松弛素-3活性的物质可通过本发明的筛选方法获得。通过上述筛选方法获得的化合物的合适的实例为在随后的实施例中描述的1，2，5-二唑并[3，4-a]1，2，5-二唑并[3，4-e]1，2，5-二唑并[3，4-i]1，2，5-二唑并[3，4-m][16]环轮烯(下文中有时称为“化合物1”)。该化合物的给药方式可以参考上述那些含有通过本发明筛选方法获得的化合物的药物。

这里所用的术语“治疗(therapy)”一般指获得期望的药理作用和/或生理作用。对于完全或部分预防疾病和/或症状来说，该作用是预防性的，或者，对于完全或部分治愈由疾病和/或症状引起的不良作用来说，它们是治疗性的。这里所用的术语“治疗”包括治疗哺乳动物疾病，尤其是人类，并通过以下疗法举例证明：

(a)在可能有疾病或症状的病因因素但并没有被诊断出具有疾病或症状的患者中，预防疾病或症状发作；

(b)抑制疾病症状，或防止或延迟其发展；以及

(c)减缓疾病症状，即，使疾病或症状减轻或逆转症状的发展。

将本说明书中引用的所有现有技术文献通过引用并入本说明书。

实施例

通过以下实施例对本发明进行详细说明，但不意味着限制本发明的范围。

实施例1：编码SALPR的多核苷酸的制备

基于SEQ ID NO：3表示的核酸序列，编码SALPR的多核苷酸的分离如下进行。在SEQ ID NO：3中，显示有1857碱基对并且已知编码SALPR的区域为从位置361至位置1770(1410碱基对，470个氨基酸残基)(GenBank登录号：NM_016568)。为了通过聚合酶链反应(PCR)分离基因，根据普通方法制备SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6表示的PCR引物。

采用人类基因组DNA(Roche Diagnostics)作为模板，利用SEQID NO：5和SEQ ID NO：6表示的一套PCR引物，采用(Expand HighFidelity PCR系统(Roche Diagnostics)根据制造商的说明书，30次重复循环(98℃ 1分钟，57℃ 1分钟，以及72℃ 3分钟)进行PCR反应。结果，获得约1400碱基对的DNA片段。

将该DNA片段插入pCR2.1(Invitrogen)，该序列经ABI prism DNA测序试剂盒(Perkin-Elmer Applied Biosystems)证实。结果，插入通过由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6组成的该套引物获得的pCR2.1-SALPR中的1410碱基对的序列，其长度与SEQ ID NO：3中从位置361至位置1770的长度一致，但其在序列中有一突变。显然该突变不影响该位点核酸序列到氨基酸的翻译，并且因此可以获得编码SALPR的多核苷酸。

实施例2：逆转录病毒载体质粒的制备

将pBabe Puro(Morgenstern，J.P.and Land，H.Nucleic Acids Res.Vol.18，3587-3596(1990)(SEQ ID NO：7)用SalI和ClaI酶切去除SV40启动子-puro(r)区域，得到的片段用Klenow片段补平。在切断位点插入IRES-hyg(r)区域，从而获得pBabeXIH，其中IRES-hyg(r)区域是采用NsiI和XbaI酶切从pIREShyg(Clontech)中切除并且用T4聚合酶补平的。

用SspI和BamHI酶切pBabeXIH除去5’-LTR-包装信号。在切断位点插入5’LTR-CMV启动子-包装信号，从而获得pBabeCLXIH，其中5’LTR-CMV启动子-包装信号是采用SspI和BamHI酶切从pCLXSN(IMGENEX)切除的。

实施例3：用于SALPR基因转移的逆转录病毒载体质粒的制备

采用限制酶HpaI酶切以上实施例2中描述的逆转录病毒表达质粒pBabeCLXIH。在切断位点插入编码SALPR的多核苷酸以获得pBabeCL(SALPR)IH，其中该多核苷酸是采用EcoRV酶切从以上实施例1获得的pCR2.1-SALPR中切除并用T4聚合酶补平而获得的(图1)。

实施例4：用于SALPR基因转移的逆转录病毒载体的制备

将293-EBNA细胞(Invitrogen)(2×10⁶)在10-cm胶原包被的培养皿(IWAKI)中采用补加了10％胎牛血清(FBS)和100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(PS)的10ml DMEM(Sigma)(以下称为“EBNA培养液”)中培养。第二天，上述293-EBNA细胞采用脂质体转染试剂TransIT(Panvera)以pV-gp(由NsiI和XbaI酶切pVPack-GP(Stratagene)去除IRES-hisD并用T4聚合酶补平，且随后得到的片段自身连接而制备)、pVPack-VSV-A(Stratagene)和实施例3中获得的SALPR基因转移的逆转录病毒载体质粒各3.3μg转染。EBNA培养液6-12小时后更换并且在37℃继续孵育。

转染2天后回收培养液并且以1,200×g离心10分钟。得到的上清用0.45μm滤膜(Millipore)过滤，得到未浓缩的逆转录病毒载体组分，随后按以下方式进行病毒载体的进一步浓缩。

50个用于超速离心的Ultra-Clear Tube(Beckman)用70％乙醇灭菌并用蒸馏水冲洗，向其中倒入35ml未浓缩病毒载体组分。离心管放置在SW28超速离心机转子(Beckman)中，采用XL-90超速离心机(Beckman)以19,500rpm离心100分钟。离心后，弃去得到的上清，离心管冰冻保存。1小时后，获得约100μl浓缩的病毒载体溶液，即保留在试管壁上的培养液。

实施例5：用于转移含有环AMP响应元件的报告基因的SE302细胞的构建

(1)构建含有环AMP应答元件的报告DNA

参考已发表的文章(Durocher等人Anal Biochem 2000，284(2)，316-26)按如下方式构建涉及cAMP应答转录的单元。

为了构建含有cAMP应答元件(CRE)的单元，根据普通方法构建了用于CREx2hb的SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9表示的寡聚DNA以及用于CREx2bp的SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11表示的寡聚DNA。

各个组合的寡聚DNA加热到95℃，之后逐渐降低温度至室温以形成双链DNAs(CREx2hb和CREx2bp)。用HindIII和BamHI消化CREx2hb并且用BamHI and PstI消化CREx2bp，同时，用HindIII和PstI消化pBluescriptIISK(+)(Stratagene)。消化后的DNA经电泳以纯化在两端具有限制性酶切位点的DNA，随后这3DNA(CREx2hb、CREx2bp和pBluescriptIISK(+))同时被连接，得到的质粒序列经分析以构建CRE4/pBluescriptIISK。

接着，为了获得含有VIP(血管活性肠肽)启动子的DNA，根据普通方法构建了SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13表示的PCR引物。

使用人类基因组DNA(Roche Diagnostics)作为模板，以SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13表示的一套PCR引物，采用重组Taq聚合酶(Takara)35次重复循环(94℃ 30秒，55℃ 30秒以及72℃ 1分钟)进行PCR，获得264碱基对的DNA片段(SEQ ID NO：14)。该264碱基对的DNA用PstI消化并插入CRE4/pBluescriptIISK(+)的PstI位点，得到的质粒的序列经证实构建CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)(图2A)。如此得到的CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)用HindIII和SmaI消化，然后得到的CRE4VIP启动子片段被补平。

从上述病毒表达载体质粒pBabeCLXIH去除IRES-hygro(r)区域以构建pBabeCLX(图2B)。将含有CRE和VIP启动子及报告基因的序列引入用于外源启动子转移的逆转录病毒载体质粒中，以获得pBabeCLcre4vPdNN(图2C)，其中报告基因为胎盘衍生的碱性磷酸酯酶(PLAP)基因(Goto等，Molecular Pharmacology，49，860-873，1996)，用于外源启动子转移的逆转录病毒载体质粒是通过从pBabeCLX去除内源性逆转录病毒增强子活性(LTR)的NheI-NarI区域而得到。

(2)用于转移含有环AMP应答元件的报告基因的SE302细胞的建立

采用其中PLAP报告基因由环AMP应答元件诱导的逆转录载体质粒pBabeCLcre4vPdNN，根据实施例4中描述的方法制备逆转录病毒载体。将如此制备的逆转录病毒载体引入HEK293细胞，得到的细胞通过有限稀释方法克隆。在PLAP诱导方面展示最好反应性的克隆的细胞(下文中称“SE302细胞”)用于以下的实验中。

实施例6：通过用于SALPR基因转移的逆转录病毒制备表达SALPR的细胞

通过以上实施例4中制备的逆转录病毒载体，按以下方式将SALPR基因转移进细胞。

在以上实施例5中构建的SE302(3×10³)细胞在96孔板(AsahiTechno Glass)中，采用补加了10％胎牛血清(FBS)和PS的100μlDMEM(Sigma)(下文称为“培养液”)中培养。第二天，适当稀释实施例4中制备的逆转录病毒载体，稀释液的100μl的部分和配制在培养液中的凝聚胺(或称为海美溴铵，Sigma)(终浓度8μg/ml)被加入到SE302细胞。第二天，培养液被补加了500μg/ml潮霉素(Invitrogen)的200μl培养液置换，然后继续孵育。合适地传代培养用于SALPR基因转移的在这些条件下生长的SE302细胞(下文中称为“SALPR-SE302细胞”)，以用于实验用途。

实施例7：通过松弛素-3抑制在SALPR-SE302细胞中通过加入毛喉素引起的转录活性增强

在以上实施例6中构建的SALPR-SE302细胞被悬浮在培养基中用于检测转录活性(补加了10％ FBS(65℃ 30分钟灭活)的DMEM)，然后以1×10⁴细胞/孔接种在96孔板中(Beckton Dickinson)。第二天，添加特定浓度的以检测培养基(补加了0.1％牛血清白蛋白的DMEM)稀释的松弛素-3(Phoenix Pharmaceuticals)或胰岛素(Invitrogen)，然后加入毛喉素(Calbiochem)使终浓度为1μmol/L。孵育1天后，每孔吸取15μl细胞上清液并转移到用于化学发光测量的96孔板中(Sumitomo Bakelite)，加入60μl用于检测的缓冲溶液(280mmol/LNa₂CO₃-NaHCO₃，8mmol/L MgSO₄，pH 10)以及70μl Lumiphos530(Lumigen)，室温反应1小时，然后通过融合板读取器(fusion platereader)(Perkin Elmer)针对每个孔测量化学发光以评估转录活性。对于每一检测样品加入的细胞上清液的活性表示为百分比，其中设定以加入1μmol/L毛喉素的细胞上清液的转录活性为100％而没有加入毛喉素的上清液活性为0％(图3)。

结果显示，松弛素-3经由SALPR活化抑制由毛喉素引起的转录活性增强。由于该转录活性的增强不受相关多肽影响即胰岛素的影响，因此该反应显示为特异于松弛素-3。也就是说，其显示通过采用该实验系统，可区分影响松弛素-3对SALPR活化的化合物或物质。

实施例8：用SALPR-SE302细胞筛选松弛素-3的拮抗物

应用实施例7显示的实验系统，进行拮抗松弛素-3活性的化合物的筛选，以发现具有拮抗活性的化合物。

将SALPR-SE302细胞悬浮在培养基中以便检测转录活性(补加了10％ FBS(65℃ 30分钟灭活)的DMEM-F12)，然后以5000细胞/孔接种在384孔板(Greiner)上。第二天，将测试化合物1，2，5-二唑并[3，4-a]1，2，5-二唑并[3，4-e]1，2，5-二唑并[3，4-i]1，2，5-二唑并[3，4-m][16]环轮烯(化合物1)溶解在毛喉素(Fermentek)溶液中，将得到的溶液加入细胞上清液中(终浓度：3μmol/L毛喉素，20μg/ml测试化合物，0.5％ DMSO(二甲亚砜))。然后，加入在检测培养基(补充了0.1％牛血清白蛋白的DMEM-F12)中稀释的松弛素-3(Peptide Institute，Inc.)，使终浓度为3nmol/L。孵育1天后，每孔吸取5μl细胞上清液，然后转移至384孔板用于化学发光测量(Corning)，加入20μl检测用缓冲溶液和25μl Lumiphos530，反应在室温进行2小时，之后每一孔的化学发光通过ARVOsx3板读取器(Perkin Elmer)测量以评估转录活性。无SALPR表达的SE302细胞也以同样方式处理，以便确定测试物的特异性。

结果显示，在SALPR-SE302细胞中松弛素-3抑制由毛喉素引起的转录活性的增强并且测试物化合物1拮抗松弛素-3对转录活性的抑制(图4A)。另外，在无SALPR表达的SE302细胞中，化合物1不能增强转录活性(图4B)。因此，可以确定测试物为特异性抑制松弛素-3对SALPR的活化(activation of SALPR by relaxin-3)的化合物。

实施例9：松弛素-3脑室内给药引起的摄食刺激

(1)脑室内给药试验动物和预处理

使Wistar雄性大鼠(7周大；Japan Charles River)进食用于实验动物的食物(MF；Oriental Yeast)使之适应。麻醉状态下大鼠(250-300g)在侧部脑室插管。给药试验在一星期或之后进行。

(2)松弛素-3溶液制备

松弛素-3(60μg；Phoenix Pharmaceuticals)溶解于DMSO并加入人工脑脊液，使其终浓度为200μmol/L。离心除去沉积的沉淀物，得到的上清液用作松弛素-3给药溶液。当采用实施例7所示实验系统中的松弛素-3标准曲线计算时，给药量(给药溶液中松弛素-3的浓度)为约50pmol/大鼠。

(3)松弛素-3溶液的脑室内给药

带有植入导管的大鼠分为两组(每组6只)，使用灌输泵以5μl/2分钟速度给予松弛素-3给药溶液或载体溶液(与上述(2)组分相同但无松弛素-3的溶液)。

(4)摄食量的测量

紧接给药溶液的脑室内给药之后，将大鼠放进已放置预先称重饲料的笼中并且随意进食。2小时后，通过测量饲料的减少计算进食量。图5显示平均摄食量和每组的标准偏差。结果显示，接受约50pmol松弛素-3的大鼠与接受对照载体溶液的大鼠相比，其在给药后2小时测量的摄食量显著增加(t-test，p＜0.01)。因此，揭示了松弛素-3刺激摄食行为。

实施例10：松弛素-3单次脑室内给药时血液中瘦素浓度的增加血液瘦素浓度的测量

上述大鼠在摄食测量后(给药后约3小时)，用戊巴比妥钠麻醉，从腹主动脉取血。取出的血液以1,750×g离心15分钟，得到的上清液储存在-80℃。随后，上清液中的瘦素的量用大鼠瘦素定量ELISA试剂盒(Amersham Bioscience)定量检测。

结果揭示，单次松弛素-3给药组与对照载体给药组比较，其血液瘦素浓度显著增加(t-test，p＜0.05；图6)。

实施例11：松弛素-3持续给药对体重增加和增肥的刺激

(1)松弛素-3溶液的制备

将松弛素-3(Peptide Institute，Inc.)以100μmol/L的浓度溶解在生理盐水中制备松弛素-3溶液。载体溶液(生理盐水)或松弛素-3溶液倒入渗透泵(Alzet渗透泵型号1002(DURECT)；递送速率6μl/天)、用于给药的管和插管中，之后将它们连接在一起。

(2)实验动物和脑室内给药处理

使Wistar雄性大鼠(6周大；Japan Charles River)进食用于实验动物的食物(MF；Oriental Yeast)，在单个笼中适应4天。在麻醉状态下，导管插入这些大鼠(250-270g)的侧部脑室中并且将渗透泵植入皮下。

(3)体重增加和摄食量的测量

大鼠自由进食，每天早晨测量其体重和摄食。如图7所示，体重从手术日(0天)增加。另外，每天减少的饲料量显示为摄食量(图8)。

松弛素-3给药组大鼠从术后1天起被确认体重显著增加。另外，也观察到，从1天起松弛素-3给药组大鼠摄食量显著增加(t-test；^**p＜0.01，^*p＜0.05)。

4)测量脂肪重量和定量检测血液瘦素和血液胰岛素水平

在实验最后一天(第14天)测量体重和摄食量后，大鼠用戊巴比妥钠麻醉，取出附睾脂肪并测量全部脂肪重量(图9)。另外，从腹主动脉取血。血液经1,750×g离心15分钟，得到的上清液储存在-80℃。随后，用大鼠瘦素检测试剂盒(L)(IBL)定量检测上清液中瘦素的量(图10A)。另外，用超敏大鼠胰岛素检测试剂盒(Morinaga Institute ofBiological Science)定量检测上清液中胰岛素的量(图10B)。

结果显示，松弛素-3持续给药组大鼠与对照载体给药组的大鼠相比，其附睾脂肪的量显著增加。另外，揭示了在松弛素-3持续给药组大鼠血液中瘦素和胰岛素浓度也有显著增加(t-test；^**p＜0.01，^*p＜0.05)。因此，揭示松弛素-3给药刺激了与脂肪积累有关的增肥活性，并同时增加了胰岛素水平。

实施例12：松弛素-3持续给药对体重增加和运动行为的影响

(1)松弛素-3溶液的制备

将松弛素-3(Peptide Institute，Inc.)以100μmol/L的浓度溶解在生理盐水中以制备松弛素-3溶液。将载体溶液(生理盐水)或松弛素-3溶液倒入渗透泵(Alzet渗透泵型号1002(DURECT)；递送速率6μl/天)、用于给药的管和插管中，之后将其连接在一起。

(2)试验动物和脑室内给药处理

使Wistar雄性大鼠(5周大；Japan Charles River)进食用于实验动物的食物(MF；Oriental Yeast)，在各个笼中适应5天。在麻醉状态下，将导管插入这些大鼠(170-200g)的侧部脑室中，将渗透泵植入皮下。手术当天设为第0天。大鼠自由进食和饮水，并且除了检测运动行为的几天以外，每天早晨测量体重(图11)。

证实松弛素-3给药组大鼠从给药后1天起体重显著增加，同上述实施例11类似(t-test；^**p＜0.01，^*p＜0.05)。

(3)自发性运动行为测量

在识别到接受松弛素-3给药的大鼠体重增长行为的显著差异的几天，应用Versamax系统(Accuscan)在有光期间和黑暗期间中测量自发性运动行为。

有光期间的大鼠(开始给药后第2天和第7天)与黑暗期间的大鼠(开始给药后第3天和第8天)从各自笼子转移至实验室，试验前至少适应1小时，然后将大鼠引入Versamax笼中，立即记录运动行为并持续90分钟。90分钟的总体运动行为如图12所示。

任何天任何组的大鼠中都没有观察到运动行为的明显变化。也就是说，其揭示了松弛素-3的增加体重活性不是因为自发运动行为的变化。

产业实用性

根据本发明，提供了在刺激摄食、增加体重和增肥中有有益效果的多肽；含有所述多肽的治疗剂；筛选活化或抑制所述多肽受体的化合物、物质或其盐的方法；用于所述筛选的试剂盒；以及包含抑制所述多肽表达的物质的药剂，诸如摄食抑制剂、治疗肥胖的治疗剂以及治疗糖尿病的治疗剂。

序列表

<110>EISAI CO.，LTD.

<120>筛选方法

<130>E1-A0410Y1P

<150>JP 2004-31591

<151>2004-02-09

<150>JP 2004-368509

<151>2004-12-20

<160>14

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>429

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(429)

<223>

<400>1

atg gcc agg tac atg ctg ctg ctg ctc ctg gcg gta tgg gtg ctg acc 48

Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr

1 5 10 15

ggg gag ctg tgg ccg gga gct gag gcc cgg gca gcg cct tac ggg gtc 96

Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val

20 25 30

agg ctt tgc ggc cga gaa ttc atc cga gca gtc atc ttc acc tgc ggg 144

Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly

35 40 45

ggc tcc cgg tgg aga cga tca gac atc ctg gcc cac gag gct atg gga 192

Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly

50 55 60

gat acc ttc ccg gat gca gat gct gat gaa gac agt ctg gca ggc gag 240

Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu

65 70 75 80

ctg gat gag gcc atg ggg tcc agc gag tgg ctg gcc ctg acc aag tca 288

Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser

85 90 95

ccc cag gcc ttt tac agg ggg cga ccc agc tgg caa gga acc cct ggg 336

Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly

100 105 110

gtt ctt cgg ggc agc cga gat gtc ctg gct ggc ctt tcc agc agc tgc 384

Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys

115 120 125

tgc aag tgg ggg tgt agc aaa agt gaa atc agt agc ctt tgc tag 429

Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys

130 135 140

<210>2

<211>142

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr

1 5 10 15

Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val

20 25 30

Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly

35 40 45

Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly

50 55 60

Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu

65 70 75 80

Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser

85 90 95

Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly

100 105 110

Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys

115 120 125

Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys

130 135 140

<210>3

<211>1857

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(361)..(1770)

<223>

<400>3

gatttgggga gttatgcgcc agtgccccag tgaccgcggg acacggagag gggaagtctg 60

cgttgtacat aaggacctag ggactccgag cttggcctga gaacccttgg acgccgagtg 120

cttgccttac gggctgcact cctcaactct gctccaaagc agccgctgag ctcaactcct 180

gcgtccaggg cgttcgctgc gcgccaggac gcgcttagta cccagttcct gggctctctc 240

ttcagtagct gctttgaaag ctcccacgca cgtcccgcag gctagcctgg caacaaaact 300

ggggtaaacc gtgttatctt aggtcttgtc ccccagaaca tgacctagag gtacctgcgc 360

atg cag atg gcc gat gca gcc acg ata gcc acc atg aat aag gca gca 408

Met Gln Met Ala Asp Ala Ala Thr Ile Ala Thr Met Asn Lys Ala Ala

1 5 10 15

ggc ggg gac aag cta gca gaa ctc ttc agt ctg gtc ccg gac ctt ctg 456

Gly Gly Asp Lys Leu Ala Glu Leu Phe Ser Leu Val Pro Asp Leu Leu

20 25 30

gag gcg gcc aac acg agt ggt aac gcg tcg ctg cag ctt ccg gac ttg 504

Glu Ala Ala Asn Thr Ser Gly Asn Ala Ser Leu Gln Leu Pro Asp Leu

35 40 45

tgg tgg gag ctg ggg ctg gag ttg ccg gac ggc gcg ccg cca gga cat 552

Trp Trp Glu Leu Gly Leu Glu Leu Pro Asp Gly Ala Pro Pro Gly His

50 55 60

ccc ccg ggc agc ggc ggg gca gag agc gcg gac aca gag gcc cgg gtg 600

Pro Pro Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ser Ala Asp Thr Glu Ala Arg Val

65 70 75 80

cgg att ctc atc agc gtg gtg tac tgg gtg gtg tgc gcc ctg ggg ttg 648

Arg Ile Leu Ile Ser Val Val Tyr Trp Val Val Cys Ala Leu Gly Leu

85 90 95

gcg ggc aac ctg ctg gtt ctc tac ctg atg aag agc atg cag ggc tgg 696

Ala Gly Asn Leu Leu Val Leu Tyr Leu Met Lys Ser Met Gln Gly Trp

100 105 110

cgc aag tcc tct atc aac ctc ttc gtc acc aac ctg gcg ctg acg gac 744

Arg Lys Ser Ser Ile Asn Leu Phe Val Thr Asn Leu Ala Leu Thr Asp

115 120 125

ttt cag ttt gtg ctc acc ctg ccc ttc tgg gcg gtg gag aac gct ctt 792

Phe Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Glu Asn Ala Leu

130 135 140

gac ttc aaa tgg ccc ttc ggc aag gcc atg tgt aag atc gtg tcc atg 840

Asp Phe Lys Trp Pro Phe Gly Lys Ala Met Cys Lys Ile Val Ser Met

145 150 155 160

gtg acg tcc atg aac atg tac gcc agc gtg ttc ttc ctc act gcc atg 888

Val Thr Ser Met Asn Met Tyr Ala Ser Val Phe Phe Leu Thr Ala Met

165 170 175

agt gtg acg cgc tac cat tcg gtg gcc tcg gct ctg aag agc cac cgg 936

Ser Val Thr Arg Tyr His Ser Val Ala Ser Ala Leu Lys Ser His Arg

180 185 190

acc cga gga cac ggc cgg ggc gac tgc tgc ggc cgg agc ctg ggg gac 984

Thr Arg Gly His Gly Arg Gly Asp Cys Cys Gly Arg Ser Leu Gly Asp

195 200 205

agc tgc tgc ttc tcg gcc aag gcg ctg tgt gtg tgg atc tgg gct ttg 1032

Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu

210 215 220

gcc gcg ctg gcc tcg ctg ccc agt gcc att ttc tcc acc acg gtc aag 1080

Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys

225 230 235 240

gtg atg ggc gag gag ctg tgc ctg gtg cgt ttc ccg gac aag ttg ctg 1128

Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu

245 250 255

ggc cgc gac agg cag ttc tgg ctg ggc ctc tac cac tcg cag aag gtg 1176

Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val

260 265 270

ctg ttg ggc ttc gtg ctg ccg ctg ggc atc att atc ttg tgc tac ctg 1224

Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu

275 280 285

ctg ctg gtg cgc ttc atc gcc gac cgc cgc gcg gcg ggg acc aaa gga 1272

Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly

290 295 30O

ggg gcc gcg gta gcc gga gga cgc ccg acc gga gcc agc gcc cgg aga 1320

Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg

305 310 315 320

ctg tcg aag gtc acc aaa tca gtg acc atc gtt gtc ctg tcc ttc ttc 1368

Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe

325 330 335

ctg tgt tgg ctg ccc aac cag gcg ctc acc acc tgg agc atc ctc atc 1416

Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile

340 345 350

aag ttc aac gcg gtg ccc ttc agc cag gag tat ttc ctg tgc cag gta 1464

Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val

355 360 365

tac gcg ttc cct gtg agc gtg tgc cta gcg cac tcc aac agc tgc ctc 1512

Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu

370 375 380

aac ccc gtc ctc tac tgc ctc gtg cgc cgc gag ttc cgc aag gcg ctc 1560

Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu

385 390 395 400

aag agc ctg ctg tgg cgc atc gcg tct cct tcg atc acc agc atg cgc 1608

Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg

405 410 415

ccc ttc acc gcc act acc aag ccg gag cac gag gat cag ggg ctg cag 1656

Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln

420 425 430

gcc ccg gcg ccg ccc cac gcg gcc gcg gag ccg gac ctg ctc tac tac 1704

Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr

435 440 445

cca cct ggc gtc gtg gtc tac agc ggg ggg cgc tac gac ctg ctg ccc 1752

Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro

450 455 460

agc agc tct gcc tac tga cgcaggcctc aggcccaggg cgcgccgtcg 1800

Ser Ser Ser Ala Tyr

465

gggcaaggtg gccttccccg ggcggtaaag aggtgaaagg atgaaggagg gctgggg 1857

<210>4

<211>469

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Met Gln Met Ala Asp Ala Ala Thr Ile Ala Thr Met Asn Lys Ala Ala

1 5 10 15

Gly Gly Asp Lys Leu Ala Glu Leu Phe Ser Leu Val Pro Asp Leu Leu

20 25 30

Glu Ala Ala Asn Thr Ser Gly Asn Ala Ser Leu Gln Leu Pro Asp Leu

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Gly Leu Glu Leu Pro Asp Gly Ala Pro Pro Gly His

50 55 60

Pro Pro Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ser Ala Asp Thr Glu Ala Arg Val

65 70 75 80

Arg Ile Leu Ile Ser Val Val Tyr Trp Val Val Cys Ala Leu Gly Leu

85 90 95

Ala Gly Asn Leu Leu Val Leu Tyr Leu Met Lys Ser Met Gln Gly Trp

100 105 110

Arg Lys Ser Ser Ile Asn Leu Phe Val Thr Asn Leu Ala Leu Thr Asp

115 120 125

Phe Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Glu Asn Ala Leu

130 135 140

Asp Phe Lys Trp Pro Phe Gly Lys Ala Met Cys Lys Ile Val Ser Met

145 150 155 160

Val Thr Ser Met Asn Met Tyr Ala Ser Val Phe Phe Leu Thr Ala Met

165 170 175

Ser Val Thr Arg Tyr His Ser Val Ala Ser Ala Leu Lys Ser His Arg

180 185 190

Thr Arg Gly His Gly Arg Gly Asp Cys Cys Gly Arg Ser Leu Gly Asp

195 200 205

Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu

210 215 220

Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys

225 230 235 240

Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu

245 250 255

Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val

260 265 270

Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu

275 280 285

Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly

290 295 300

Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg

305 310 315 320

Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe

325 330 335

Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile

340 345 350

Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val

355 360 365

Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu

370 375 380

Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu

385 390 395 400

Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg

405 410 415

Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln

420 425 430

Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr

435 440 445

Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro

450 455 460

Ser Ser Ser Ala Tyr

465

<210>5

<211>38

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<213>人工序列

<220>

<223>有义引物

<400>5

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<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义引物

<400>6

gatatctcag taggcagagc tgctgggc 28

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<212>DNA

<213>质粒

<400>7

ctgcagcctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca 60

gggccaagaa cagatggaac agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt 120

tcctgccccg gctcagggcc aagaacagat ggtccccaga tgcggtccag ccctcagcag 180

tttctagaga accatcagat gtttccaggg tgccccaagg acctgaaatg accctgtgcc 240

ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga 300

gctcaataaa agagcccaca acccctcact cggggcgcca gtcctccgat tgactgagtc 360

gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct cttgcagttg catccgactt gtggtctcgc 420

tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat tgactacccg tcagcggggg tctttcattt 480

gggggctcgt ccgggatcgg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg 540

taagctggcc agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg actgatttta 600

tgcgcctgcg tcggtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa 660

ctgacgagtt ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc 720

gtttttgtgg cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg 780

tggttctggt aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt 840

cggtttggaa ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagca tcgttctgtg ttgtctctgt 900

ctgactgtgt ttctgtattt gtctgaaaat tagggccaga ctgttaccac tcccttaagt 960

ttgaccttag atcactggaa agatgtcgag cggctcgctc acaaccagtc ggtagatgtc 1020

aagaagagac gttgggttac cttctgctct gcagaatggc caacctttaa cgtcggatgg 1080

ccgcgagacg gcacctttaa ccgagacctc atcacccagg ttaagatcaa ggtcttttca 1140

cctggcccgc atggacaccc agaccaggtc ccctacatcg tgacctggga agccttggct 1200

tttgaccccc ctccctgggt caagcccttt gtacacccta agcctccgcc tcctcttctt 1260

ccatccgcgc cgtctctccc ccttgaacct cctctttcga ccccgcctca atcctccctt 1320

tatccagccc tcactccttc tctaggcgcc ggccggatcc cagtgtggtg gtacgtagga 1380

attcgccagc acagtggtcg acctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc 1440

aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg 1500

tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1560

agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 1620

ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 1680

ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa l740

acgctgcttg aggctgaagg tgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1800

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1860

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1920

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1980

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2040

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2100

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2160

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 2220

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 2280

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gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 2760

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tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg gggtctttca catgcagcat gtatcaaaat 3000

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gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 3120

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cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 3480

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 3540

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 3600

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 3660

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 3720

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 3780

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 3840

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 3900

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 3960

tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagtttgcg gccgcaaatc aatctaaagt 4020

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 4080

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 4140

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 4200

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 4260

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 4320

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 4380

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 4440

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 4500

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 4560

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 4620

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg 4680

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 4740

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 48O0

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 4860

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 4920

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 4980

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 5020

<210>8

<211>83

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CREx2hb的有义链

<400>8

cccaagcttg atatcgaatt cgacgtcaca gtatgacggc catgggaatt cgacgtcaca 60

gtatgacggc catggggatc ccg 83

<210>9

<211>83

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CREx2hb的反义链

<400>9

cgggatcccc atggccgtca tactgtgacg tcgaattccc atggccgtca tactgtgacg 60

tcgaattcga tatcaagctt ggg 83

<210>10

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CREx2bp的有义链

<400>10

tgcactgcag gaattcccat ggccgtcata ctgtgacgtc gaattcccat ggccgtcata 60

ctgtgacgtc ggatcccg 78

<210>11

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CREx2bp的反义链

<400>11

cgggatccga cgtcacagta tgacggccat gggaattcga cgtcacagta tgacggccat 60

gggaattcct gcagtgca 78

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>有义引物

<400>12

tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg 30

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义引物

<400>13

tgcactgcag gtcggagctg actgttctgg 30

<210>14

<211>264

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>血管活性肠肽启动子

<400>14

tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg tgacgtcttt cagagcactt tgtgattgct 60

cagtcctaag tataagccct ataaaatgat gggctttgaa atgctggtca gggtagagtg 120

agaagcacca gcaggcagta acagccaacc cttagccatt gctaagggca gagaactggt 180

ggagcctttc tcttactccc aggacttcag cacctaagac agctccaaaa caaaccagaa 240

cagtcagctc cgacctgcag tgca 264

Claims

1.一种摄食刺激剂，包括：包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽，其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐。

2.一种增加体重的试剂，包括：包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽，其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐。

3.一种增加脂肪重量的试剂，包括：包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽，其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐。

4.一种筛选刺激摄食的化合物或其盐的方法，包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

5.一种筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的方法，包括步骤

(A)使包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽，其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐，以及测试物与松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或所述细胞的膜组分接触。

6.根据权利要求5所述的筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的方法，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

7.根据权利要求4-6任一项所述的筛选方法，其中所述松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

8.根据权利要求7所述的筛选方法，其中SALPR为含有SEQ IDNO：4表示的氨基酸序列的多肽。

9.一种筛选刺激摄食的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

10.一种筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

11.根据权利要求10所述的筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的试剂盒，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

12.根据权利要求9、10或11所述的筛选试剂盒，其中所述的松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

13.根据权利要求12所述的筛选试剂盒，其中SALPR为包含SEQID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

14.一种治疗需要增加体重的疾病的治疗剂，包括包含SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列的多肽，其功能上等同的修饰多肽，或由与包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列构成的多肽，或其盐。

15.根据权利要求14所述的治疗剂，其中所述的疾病为厌食症或恶病质。

16.一种筛选增加体重的化合物或其盐的方法，包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

17.一种筛选增加或降低体重的化合物或其盐的方法，包括步骤

18.根据权利要求17所述的筛选增加或降低体重的化合物或其盐的方法，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

19.根据权利要求16-18任一项所述的筛选方法，其中所述的松弛素-3为SALPR或其部分多肽。

20.根据权利要求19所述的筛选方法，其中SALPR为包含SEQ IDNO：4表示的氨基酸序列的多肽。

21.一种筛选增加体重的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

22.一种筛选增加或降低体重的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

23.根据权利要求22所述的筛选增加或降低体重的化合物或其盐的试剂盒，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

24.根据权利要求21、22或23所述的筛选试剂盒，其中所述的松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

25.根据权利要求24所述的筛选试剂盒，其中SALPR为包含SEQID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

26.一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的方法，包括以下步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

27.一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的方法，包括步骤

28.根据权利要求27所述的筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的方法，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

29.根据权利要求26-28任一项所述的筛选方法，其中所述的松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

30.根据权利要求29所述的筛选方法，其中SALPR为包含SEQ IDNO：4表示的氨基酸序列的多肽。

31.一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

32.一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的试剂盒，包括步骤

33.根据权利要求32所述的筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的试剂盒，其中包括步骤

(B)测量经由所述松弛素-3受体的细胞刺激活性。

34.根据权利要求31-33任一项所述的筛选方法，其中所述的松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

35.根据权利要求34所述的筛选试剂盒，其中SALPR为包含SEQID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

36.一种抑制摄食的试剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

37.根据权利要求36所述的试剂，其中所述具有SALPR抑制活性的化合物为通过权利要求7或8所述的筛选方法获得的化合物。

38.一种降低体重的试剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

39.根据权利要求38所述的试剂，其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物为通过权利要求19或20所述的筛选方法获得的化合物。

40.一种减少脂肪重量的试剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

41.根据权利要求40所述的试剂，其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物为通过权利要求29或30所述的筛选方法获得的化合物。

42.一种治疗肥胖的治疗剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

43.根据权利要求42所述的治疗剂，其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物为通过权利要求19、20、29和30之任一项所述的筛选方法获得的化合物。

44.一种治疗糖尿病的治疗剂，包含具有SALPR抑制活性的化合物。

45.根据权利要求44所述的治疗剂，其中所述的具有SALPR抑制活性的化合物为通过权利要求19、20、29和30之任一项所述的筛选方法获得的化合物。

46.根据权利要求36-45任一项所述的试剂，其中SALPR为包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的多肽。

47.一种筛选刺激或抑制摄食的化合物或其盐的方法，包括将作用于松弛素-3受体的化合物向人或非人生物体给药并且在给药后测量摄食量的步骤。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述的作用于松弛素-3受体的化合物为通过权利要求4-8之任一项所述的筛选方法获得的化合物。

49.一种筛选增加或降低体重的化合物或其盐的方法，包括将作用于松弛素-3受体的化合物向人或非人生物体给药并且在给药后测量体重的步骤。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述的作用于松弛素-3受体的化合物为通过权利要求16-20之任一项所述的方法获得的化合物。

51.一种筛选涉及肥胖控制的化合物或其盐的方法，包括将作用于松弛素-3受体的化合物向人或非人生物体给药并且在给药后测量肥胖指标的步骤。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述的作用于松弛素-3受体的化合物为通过权利要求26-30之任一项所述的方法获得的化合物。