CN101189019A

CN101189019A - 具有抗焦虑作用的肽及其筛选方法

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Publication number: CN101189019A
Application number: CNA2006800142190A
Authority: CN
Inventors: 飞弹隆之; 新井彻; 关矢智子; 高桥英机; 志方幸道
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2008-05-28
Also published as: KR20080010441A; CA2606162A1; AU2006241928B2; US20090311185A1; EP1880728A1; JPWO2006118131A1; AU2006241928A1; WO2006118131A1; EP1880728A4

Abstract

本发明的目的在于提供具有抗焦虑作用的多肽；含有该多肽的治疗剂；采用该多肽治疗焦虑的方法；筛选可激活或抑制该多肽的受体的、与焦虑调节相关的化合物或其盐或它们的水合物的方法；和这种筛选用的试剂盒。本发明提供含有松弛素－3的抗焦虑剂。

Description

具有抗焦虑作用的肽及其筛选方法

技术分类

本发明涉及具有抗焦虑作用的多肽；采用该多肽治疗焦虑的方法；筛选激活或抑制该多肽的受体的、与焦虑调节有关的化合物或其盐或它们的水合物的方法和这种筛选用的试剂盒。

背景技术

脑肠管激素、趋化因子、神经肽或神经递质等生理活性物质通过存在于细胞膜上的特异受体发挥作用。在这些受体中，具有7次贯穿细胞膜的结构、并在细胞内和G蛋白三聚物偶联的受体，被特别分类为G蛋白偶联受体(GPCR)。GPCR在与特异配体结合时，通过向细胞内传递信号，激活或抑制细胞，从而在各器官的功能表达中起到重要作用。因此，激活GPCR的激动剂或者抑制GPCR的拮抗剂已作为药品使用。在这些被分类为GPCR的受体中，已知特异配体未鉴定的情况很多，被称作孤儿GPCR。孤儿GPCR隐含着作为新型治疗药的靶点的可能性，正在进行它们的配体鉴定和功能激活或抑制的物质的研究。像这样将鉴定的配体或物质施予生体，阐明受体和其配体的功能，在药品开发方面是极为重要的。

由于近年来基因序列信息的丰富，基于已知蛋白质或肽的序列，可以导出其同源性或规律性，预测未知的肽或蛋白质，也可作为GPCR的新配体的鉴定方法。属于胰岛素/松弛素家族的松弛素是由黄体或胎盘产生的分泌肽，具有与妊娠维持和分娩相关的作用，这在以前已被知晓。基于编码松弛素的DNA碱基序列，编码从基因序列数据库中新鉴定的DNA的蛋白质，是被命名为松弛素-3(或称为INSL7)的多肽(国际公开第01/068862号小册子)。成熟型或活化型的松弛素-3为一种多肽，其包括由松弛素-3的前原蛋白(preproprotein)切断的B链和A链，其中该B链和该A链通过二硫键结合。有报道指出，随着免疫细胞系的THP-1细胞内环腺苷酸(cAMP)的上升，松弛素-3可以激活细胞(国际公开第01/81562号小册子，Bathgate等人，J.Biol.Chem.，277，p.1148-1157，2002)。此后表明，松弛素-3连同松弛素-2是结合于作为GPCR的LGR7的配体之一，同时表明松弛素-3引起的cAMP上升与LGR7有关(Sudo等人，J.Biol.Chem.，278，p.7855-7862，2003)。LGR7在脑和末梢组织中表达，截至目前表明与生殖器官的发育或妊娠·生产有关，但是与精神状况的关联方面尚不明确。

最近，有报道指出，生体内的配体为未鉴定的GPCR，被命名为SALPR(GPCR135)的受体、或被称为GPR100(hGPCR11、GPCR142)的受体的配体为松弛素-3(Takeda等人，FEBS Letter，520，p.97-101，2002；Liu等人，J.Biol.Chem.，278，p.50754-50764，2003；Liu等人，J.Biol.Chem.，278，p.50765-50770，2003；国际公开第2004/082598号小册子)。此外有报道指出，松弛素-3引起的cAMP的降低与SALPR(Liu等人，J.Biol.Chem.，278，p.50754-50764，2003)或GPR100(Liu等人，J.Biol.Chem.，278，p.50765-50770，2003)有关。进一步地，国际公开第00/24891号小册子、国际公开第01/48189号小册子、国际公开第02/31111号小册子和国际公开第02/610877号小册子中也有这些受体的相关记载。已知SALPR位于脑中(Matsumoto等人，Gene，248，p.183-189，2000)，特别地，有报道指出，位于下丘脑的室旁核和视上核(国际公开第2004/082598号小册子，Liu等人，J.Biol.Chem.，278，p.50754-50764，2003)。进一步地，有报道采用与SALPR选择性结合的松弛素-3和INSL5的嵌合肽，通过显示肽的脑内结合区域研究了SALPR的表达(Sutton等人，Neuroendocrinology，180，p.298-307，2004)，但是关于SALPR的功能还不清楚。另一方面，有报道指出，GPR100为全身性表达的受体(Liu等人，J.Biol.Chem.，278，p.50765-50770，2003；Boels等人，Br.J.Pharamacol.，140，p.932-938，2003)，但是关于GPR100的功能也不清楚。

另一方面，有报道指出，松弛素-3存在于脑内的特定区域(Liu等人，J.Biol.Chem.，278，p.50754-50764，2003)，松弛素-3作为脑内肽，被认为可能对中枢神经系统发挥某些功能，但是，截至目前尚不知道松弛素-3能否调节焦虑和抑郁等精神状态。

发明内容

本发明的目的在于提供具有抗焦虑作用的多肽；含有该多肽的治疗剂；采用该多肽治疗焦虑的方法；筛选与焦虑调节有关的、激活或抑制该多肽的受体的化合物或其盐或它们的水合物的方法；以及这种筛选用的试剂盒。

本发明者通过对大鼠或小鼠脑室内施予松弛素-3，采用评价焦虑引起作用和抗焦虑作用的实验系统观察施予后上述大鼠或上述小鼠的行为，发现松弛素-3具有抗焦虑作用。基于这些发现，完成了本发明。

即，根据本发明，可以提供：

(1)抗焦虑剂，其含有松弛素-3、其盐或它们的水合物。

(2)上述(1)所述的抗焦虑剂，其中松弛素-3为人松弛素-3。

(3)上述(1)所述的抗焦虑剂，其中松弛素-3为一种多肽，该多肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。

(4)具有抗焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方法，该方法包括如下步骤：

(A)使受试物与松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或该细胞的膜级分接触的步骤，

(B)测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤。

(4’)具有抗焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方法，该方法包括如下步骤：

(B)测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤，和

(C)当松弛素-3受体、例如抑生长素-血管生成素样肽受体(somatostatin and angiogenin-like peptide receptor，SALPR)介导的细胞刺激活性显示抑制腺苷酸环化酶活性时，判定该受试物为具有抑制焦虑作用的作用的化合物的步骤。

(5)抑制或促进焦虑作用的化合物、其盐或它们的水合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：

(A)使受试物和松弛素-3、其盐或它们的水合物与松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或该细胞的膜级分接触的步骤。

(6)上述(5)所述的筛选方法，其中松弛素-3为人松弛素-3。

(7)上述(5)所述的筛选方法，其中松弛素-3为一种多肽，该多肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。

(8)上述(5)～(7)中任一项所述的抑制或促进焦虑作用的化合物、其盐或它们的水合物的筛选方法，其进一步包含下述步骤：

(B)测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤。

(8’)上述(5)～(7)中任一项所述的抑制焦虑的化合物、其盐或它们的水合物的筛选方法，其进一步包含下述步骤：

(B)测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤；

(C)当松弛素-3受体、例如SALPR介导的细胞刺激活性显示出抑制腺苷酸环化酶活性时，判定该受试物为具有抑制焦虑作用的作用的化合物的步骤。

(9)上述(4)、(4’)、(5)、(6)、(7)、(8)和(8’)中任一项所述的筛选方法，其中，松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

(10)上述(9)所述的筛选方法，其中，SALPR为包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽。

(11)具有抗焦虑作用的化合物、其盐或它们的水合物的筛选用试剂盒，该试剂盒包含松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或该细胞的膜级分。

(12)上述(11)所述的筛选用试剂盒，其还含有松弛素-3、其盐或它们的水合物。

(13)上述(12)所述的筛选用试剂盒，其中松弛素-3为人松弛素-3。

(14)上述(12)所述的筛选用试剂盒，其中松弛素-3为一种多肽，该多肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。

(15)上述(12)～(14)中任一项所述的筛选用试剂盒，其中松弛素-3被标记。

(16)上述(11)～(15)中任一项所述的筛选用试剂盒，其中，松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

(17)上述(16)所述的筛选用试剂盒，其中，SALPR为包含SEQID NO：4所示氨基酸序列的多肽。

(18)抑制或促进焦虑作用的化合物、其盐或它们的水合物的筛选方法，该方法包括将作用于松弛素-3受体的化合物施予人或人以外的生物、并测定施予后的焦虑作用的步骤。

(19)上述(18)所述的筛选方法，其中测定焦虑作用的步骤包括defensive burying test或高架十字迷宫实验。

(20)上述(18)或(19)所述的筛选方法，其中作用于松弛素-3受体的化合物是根据上述(4)、(4’)、(5)、(6)、(7)、(8)、(8’)、(9)和(10)中任一项所述的方法得到的化合物。

附图说明

图1表示pBabeCL(SALPR)IH的构建图。

图2A表示CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)的构建图。

图2B表示pBabeCLX的构建图。

图2C表示pBabeCLcre4vPdNN的构建图。

图3表示，通过在表达SALPR的SE302细胞中添加毛喉素而增加了转录活性的松弛素-3，其特异的用量依存的抑制。黑方块表示添加了松弛素-3的情况。白方块表示添加了胰岛素的情况。横轴的数字表示添加的各配体的最终浓度(nmol/L)。纵轴表示，以添加了1μmol/L毛喉素的细胞上清液的碱性磷酸酶活性为100、以未添加毛喉素的细胞上清液的活性为0时，所计算出的各活性的比例。各点表示平均值(N＝3)和标准偏差。

图4表示，采用Defensive burying试验在大鼠脑室内单次施予松弛素-3所产生的抗焦虑作用。白方块表示对照(溶剂)施予组、斜线表示松弛素-3的0.05nmol施予组、黑方块表示松弛素-3的1nmol施予组。纵轴表示，各组中每只动物用铺垫覆盖电极的时间(秒)的平均值和标准误差。图中*的含义是，人松弛素-3施予组与对照(溶剂)施予组相比存在显著差异(Dunnett型多重比较检验，p＜0.05)。

图5表示，在采用小鼠进行的高架十字迷宫实验(5分钟)中，进入开放臂和闭合臂的总次数。

图6表示，在采用小鼠进行的高架十字迷宫实验(5分钟)中，在开放臂中滞留时间的比例。图中*的含义是，人松弛素-3施予组与对照(溶剂)施予组相比，存在显著差异(t检验，p＜0.05)。

图7表示，在采用大鼠进行的高架十字迷宫实验(5分钟)中，进入开放臂和闭合臂的总次数。

图8表示，在采用大鼠进行的高架十字迷宫实验(5分钟)中，在开放臂中滞留时间的比例。图中*的含义是，人松弛素-3施予组与对照(溶剂)施予组相比，存在显著差异(Dunnett型多重比较检验，p＜0.05)。

具体实施方式

松弛素-3

本发明的“松弛素-3”是被命名为松弛素-3(也称为INSL7)的多肽，指成熟型或活化型的松弛素-3。

具体地，本发明的“松弛素-3”是一种多肽，该多肽具有：具有从SEQ ID NO：2的N末端开始第26位(Arg)～第52位(Trp)残基的氨基酸序列的多肽、与该多肽在功能上等价的修饰多肽、或该多肽的同源多肽(以下也简称“B链”)；和具有从SEQ ID NO：2的N末端开始第119位(Asp)～第142位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽、与该多肽在功能上等价的修饰多肽、或该多肽的同源多肽(以下也简称“A链”)，其中B链和A链的半胱氨酸残基通过二硫键进行结合。B链和A链的半胱氨酸残基优选通过二硫键进行分子间和分子内结合。

更具体地，本发明的松弛素-3为一种多肽，该多肽含有：具有从SEQID NO：2的N末端开始第26位(Arg)～第52位(Trp)残基的氨基酸序列的多肽(人B链)、和具有从SEQ ID NO：2的N末端开始第119位(Asp)～第142位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽(人A链)，其中两多肽通过二硫键结合，B链和A链的半胱氨酸残基在分子间和分子内形成二硫键。该二硫键优选为，从SEQ ID NO：2的N末端开始第35位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：2的N末端开始第129位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：2的N末端开始第47位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：2的N末端开始第142位的A链半胱氨酸结合；以及从SEQ ID NO：2的N末端开始第128位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：2的N末端开始第133位的A链半胱氨酸结合。

本发明地松弛素-3的例子如下。数字表示形成二硫键的半胱氨酸残基，相同数字的半胱氨酸残基通过二硫键结合。

[人松弛素-3]

B链：RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(SEQ ID NO：5)

1 2

A链：DVLAGLSSSCCKWGCSKSEISSLC(SEQ ID NO：6)

31 3 2

B链和A链的氨基酸序列包含在本发明松弛素-3的前原蛋白的氨基酸序列中。本发明的松弛素的前原蛋白可以为具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽(人前原蛋白)(GenBank登录号：NM_080864)、或与该多肽在功能上等价的修饰多肽、或该多肽的同源多肽(这些在下文也简称为“前原蛋白”)。本发明的松弛素-3还包括一种多肽，该多肽包含由上述前原蛋白切得的B链和A链，其中B链和A链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。

本发明的松弛素-3、B链、A链和前原蛋白可以是源自人或人以外的生物[例如非人哺乳动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬等)、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类、昆虫类等]的天然来源多肽，也可以是重组多肽、合成多肽。本发明的松弛素-3中包含本发明的松弛素-3的盐，进一步地，本发明的松弛素-3或其盐，包含无糖链和有糖链两种情况。关于盐，可以参照下述对盐的描述。此外，本发明的松弛素-3、B链、A链和前原蛋白还包括受到如N末端环状谷氨酰胺化、C末端酰胺化等分泌蛋白处理的多肽。

上述的“功能等价修饰多肽”为一种多肽，该多肽具有：具有从SEQID NO：2的N末端开始第26位(Arg)～第52位(Trp)残基的氨基酸序列的多肽(人B链)、具有从SEQ ID NO：2的N末端开始第119位(Asp)～第142位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽(人A链)、或具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽(人前原蛋白)，其中，缺失、置换、插入和/或添加了1个或多个(优选1个或几个)氨基酸，而且B链和A链的半胱氨酸残基通过二硫键结合，并且其表现出与松弛素-3基本相同的活性[例如，松弛素-3受体结合能力和通过结合产生的各种细胞刺激活性(如细胞内Ca²⁺游离、腺苷酸环化酶的活化、细胞内cAMP生成、细胞内cGMP生成、肌醇磷脂生成、细胞膜电位变化、细胞膜附近pH变化、细胞内蛋白质的磷酸化、c-fos和c-jun的诱导/活化、花生四烯酸游离)、焦虑作用的调节]。功能等价的修饰多肽可以为上述生物来源的多肽、重组多肽、合成多肽中的任一种，只要其满足上述条件。

所述缺失、置换和/或插入可发生在氨基酸序列的任何位点，但可发生在下述多肽的氨基酸序列的半胱氨酸残基以外的氨基酸残基，其中所述多肽为：具有从SEQ ID NO：2的N末端开始第26个(Arg)～第52个(Trp)残基的氨基酸序列的多肽(人B链)、具有从SEQ ID NO：2的N末端开始第119个(Asp)～第142个(Cys)残基的氨基酸序列的多肽(人A链)、或具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽(人前原蛋白)。

本说明书中的“置换”优选指用其它化学等价(chemicallyhomologous)氨基酸残基对一个或多个氨基酸残基的保守置换(conservative substitution)，且基本上不改变肽活性。例如，将某个疏水性残基用其他疏水性残基置换，将某个极性残基用带同种电荷的其他极性残基置换。每种氨基酸的能够进行这种置换的、功能类似的氨基酸在该技术领域中都是公知的。更具体地，作为非极性(疏水性)氨基酸，例如有丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，例如有甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带正电荷的(碱性)氨基酸，例如有精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。此外，作为带负电荷的(酸性)氨基酸，例如天冬氨酸、谷氨酸等。

上述缺失、置换、插入和/或添加的氨基酸残基数例如为1～30个、优选1～20个、更优选1～10个，进一步优选1～5个，特别优选为1～2个。

上述的“同源多肽”指一种多肽，该多肽所具有的氨基酸序列与下述多肽的氨基酸序列具有70％或以上、优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上的同源性，上述多肽为：具有从SEQID NO：2的N末端开始第26个(Arg)～第52个(Trp)的氨基酸序列的多肽(人B链)、具有从SEQ ID NO：2的N末端开始第119个(Asp)～第142个(Cys)的氨基酸序列的多肽(人A链)、或具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽(人前原蛋白)；其中B链和A链的半胱氨酸残基通过二硫键结合，且其表现出与本发明的松弛素-3基本相同的活性(例如，松弛素-3受体结合能力和通过该结合产生的各种细胞刺激活性、焦虑作用的调节)。对同源多肽没有特别限定，可以为上述生物来源的多肽、重组多肽、合成多肽中的任一种，只要其表现出上述活性。

在本说明书中，“同源性”(有时称“同一性”)的数值可以是采用本领域公知的同源性检索程序算出的数值，例如，在全美生物技术信息中心(NCBI)的同源性算法BLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中，可以通过采用预设(初期设定)的参数算出。

上述的功能等价的修饰多肽或同源多肽的B链、A链、松弛素-3和前原蛋白的优选例子包括：公知的小鼠型、大鼠型或猪型的B链、A链、松弛素-3或其前原蛋白(国际公开第01/81562号小册子)；和松弛素-1、松弛素-2或胰岛素样肽3(INSL-3)的前原蛋白或B链(国际公开第2006/026355号小册子)。

“由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构成、或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成的多肽，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合”中所述的多肽，优选为表现出与本发明的松弛素-3基本相同的活性(例如，松弛素-3受体结合能力和通过该结合产生的各种细胞刺激活性、焦虑作用的调节)的下述多肽(1)和(2)：

(1)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽(人B链)或SEQ ID NO：5氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和具有SEQID NO：6所示氨基酸序列的多肽(人A链)或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人A链，其中，从SEQ ID NO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：6的N末端开始第11位的A链半胱氨酸结合，从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：6的N末端开始第24位的A链半胱氨酸结合，从SEQ ID NO：6的N末端始第10位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：6的N末端始第15位的A链半胱氨酸结合；和

(2)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽(人A链)或具有与人A链氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人A链，其中，从SEQ ID NO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：6的N末端始第11位的A链半胱氨酸结合，从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：6的N末端开始第24位的A链半胱氨酸结合，从SEQID NO：6的N末端开始第10位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：6的N末端开始第15位的A链半胱氨酸结合。

此外，作为“由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构成、或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成的多肽，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合”中所述的多肽的例子包括国际公开第2006/026355号小册子和ChangluLiu等人，Mol Pharmacol.67(1)：231-40(2005)中公开的松弛素-3的嵌合肽。

所述松弛素-3的嵌合肽的优选例子包括表现出与本发明的松弛素-3基本相同的活性(例如，松弛素-3受体结合能力、和由该结合产生的各种细胞刺激活性、焦虑作用的调节)的下述多肽(3)～(10)：

(3)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽(人B链)或在SEQ ID NO：5所示氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的多肽(人松弛素-1A链)或在SEQID NO：7所示氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人松弛素-1A链，其中，从SEQ ID NO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：7的N末端开始第11位的A链半胱氨酸结合，从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：7的N末端开始第24位的A链半胱氨酸结合，从SEQ ID NO：7的N末端开始第10位的A链半胱氨酸与从SEQ IDNO：7的N末端开始第15位的A链半胱氨酸结合；

(4)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的多肽(人松弛素-1A链)或具有与人松弛素-1A链氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人松弛素-1A链，其中，从SEQID NO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：7的N末端开始第11位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：7的N末端开始第24位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：7的N末端开始第10位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：7的N末端开始第15位的A链半胱氨酸结合；

(5)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽(人B链)或SEQ ID NO：5的氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽(人松弛素-2A链)或SEQ IDNO：8的氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人松弛素-2A链，其中，从SEQ ID NO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：8的N末端开始第11位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：8的N末端开始第24位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：8的N末端开始第10位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：8的N末端开始第15位的A链半胱氨酸结合；

(6)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所述氨基酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽(人松弛素-2A链)或具有与人松弛素-2A链氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人松弛素-2A链，其中，从SEQID NO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：8的N末端开始第11位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：8的N末端开始第24位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：8的N末端开始第10位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：8的N末端开始第15位的A链半胱氨酸结合；

(7)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽(人B链)或SEQ ID NO：5的氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的多肽(人胰岛素样肽3的修饰A链)或SEQ ID NO：9的氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人胰岛素样肽3的A链，其中，从SEQ IDNO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：9的N末端开始第9位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：9的N末端开始第22位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：9的N末端开始第8位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：9的N末端开始第13位的A链半胱氨酸结合；

(8)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所述氨基酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链的氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的多肽(人胰岛素样肽3的修饰A链)或具有与人胰岛素样肽3的修饰A链的氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人胰岛素样肽3的A链，其中，从SEQ ID NO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：9的N末端开始第9位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ IDNO：9的N末端开始第22位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：9的N末端开始第8位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：9的N末端开始第13位的A链半胱氨酸结合；

(9)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽(人B链)或SEQ ID NO：5的氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人B链、和具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的多肽(人胰岛素样肽6的修饰A链)或SEQ ID NO：10的氨基酸序列中有1个或多个(优选1个或几个，更优选1、2、3或4个，进一步优选1或2个，特别优选1个)氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的修饰人胰岛素样肽6的A链，其中，从SEQID NO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：10的N末端开始第7位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：10的N末端开始第20位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：10的N末端开始第6位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：10的N末端开始第11位的A链半胱氨酸结合；和

(10)一种多肽，其由下述多肽构成：具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽(人B链)或具有与人B链氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人B链、和具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的多肽(人胰岛素样肽6的修饰A链)或具有与人胰岛素样肽6的修饰A链氨基酸序列具有70％或以上(优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上)同源性的氨基酸序列的同源人胰岛素样肽6的A链，其中，从SEQ ID NO：5的N末端开始第10位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：10的N末端开始第7位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：5的N末端开始第22位的B链半胱氨酸与从SEQ IDNO：10的N末端开始第20位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：10的N末端开始第6位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：10的N末端始第11位的A链半胱氨酸结合。

松弛素-3的嵌合肽的更优选例子包括下述多肽。数字表示通过二硫键结合的半胱氨酸残基，相同数字的半胱氨酸残基通过二硫键互相结合。这些嵌合肽对于SALPR(GPCR135)、GPR100(GPCR142)和LGR7的配体活性已经得到证实(国际公开第2006/026355号小册子和ChangluLiu等人，Mol Pharmacol.67(1)：231-40(2005))。

[人B链和人松弛素-1A链的嵌合肽]

B链：RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(SEQ ID NO：5)

1 2

A链：RPYVALFEKCCLIGCTKRSLAKYC(SEQ ID NO：7)

31 3 2

[人B链和人松弛素-2A链的嵌合肽]

B链：RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(SEQ ID NO：5)

1 2

A链：QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO：8)

31 3 2

[人B链和人胰岛素样肽3修饰A链的嵌合肽]

B链：RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(SEQ ID NO：5)

1 2

A链：ATNPARYCCLSGCTQQDLLTLC(SEQ ID NO：9)

31 3 2

[人B链和人胰岛素样肽6修饰A链的嵌合肽]

B链：RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(SEQ ID NO：5)

1 2

A链：GYSEKCCLTGCTKEELSIAC(SEQ ID NO：10)

31 3 2

此外，本发明中采用的松弛素-3，只要其具有与松弛素-3基本相同的活性，则B链和A链的分子内或分子间可以通过二硫键或其他的结合形式进行结合。这种肽的例子在国际公开第2004/113381号小册子、Halls等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，313，p.677-687，2005；Rosengren等人，J.Biol.Chem.，281，p.5845-5851，2006；Bathgate等人，Biochemistry，45，p.1043-1053，2006等中有记载。

本发明的松弛素-3、B链、A链或前原蛋白可以通过各种公知的方法得到，如基因工程法、合成法等。具体地，在基因工程法的情况下，可以将编码松弛素-3、B链、A链或前原蛋白的多核苷酸导入适当的宿主细胞，将得到的转化体在可以表达的条件下培养，然后通过表达蛋白质分离和纯化中常用的方法从培养物中分离和纯化所要的多肽。此外，在合成法的情况下，可以采用液相法、固相法等常法合成，通常利用自动合成仪进行。化学修饰化合物的合成可以按常法进行。

编码松弛素-3的多核苷酸

编码本发明的松弛素-3、B链、A链或前原蛋白的多核苷酸(以下也简称“编码本发明的松弛素-3的多核苷酸”)，只要其是编码本发明的松弛素-3、B链、A链或前原蛋白的多核苷酸，则没有特别限定。在本说明书中“多核苷酸”包括DNA和RNA两种含义。

编码本发明的松弛素-3的多核苷酸的例子包括：具有从SEQ IDNO：1的5’末端开始第76位(c)～第156位(g)的碱基序列的多核苷酸(编码人B链的多核苷酸)；具有从SEQ ID NO：1的5’末端开始第355位(g)～第426位(c)的碱基序列的多核苷酸(编码人A链的多核苷酸)；具有在严格条件下可与具有SEQ ID NO：1所示碱基序列(编码人前原蛋白的多核苷酸)的多核苷酸杂交的碱基序列、并编码具有与本发明的松弛素-3、B链、A链或前原蛋白基本相同的活性的多肽的多核苷酸。

本说明书中的“在严格条件下杂交的多核苷酸”的具体例子包括：当根据FASTA、BLAST、Smith-Waterman(Meth.Enzym.，164，765，1988)等同源性检索软件，在采用预设参数计算同源性时，与具有从SEQ IDNO：1的5’末端开始第76位(c)～第156位(g)的碱基序列的多核苷酸、具有从SEQ ID NO：1的5’末端开始第355位(g)～第426位(c)的碱基序列的多核苷酸、SEQ ID NO：1所示碱基序列具有至少70％或以上、优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上同源性的多核苷酸。此外，“严格条件下”的杂交可如下进行：在本领域技术人员通常使用的杂交缓冲液中，在40℃～70℃、优选60～65℃进行反应，并在盐浓度为15～300mmol/L、优选15～60mmol的洗涤液中进行洗涤，以此方法可以进行。温度、盐度可以根据所用探针的长度适当调节。温度、盐度可以根据所用探针的长度调节为适当。

编码本发明使用的松弛素-3的多核苷酸可以是天然来源的，也可以是全合成的。进一步地，也可以是利用天然物的一部分合成的。典型地，编码本发明松弛素-3的多核苷酸可如下得到：从市售的文库或cDNA文库中，通过基因工程领域中惯用的方法，如采用以本发明的松弛素-3、B链、A链或前原蛋白的部分氨基酸序列信息为基础制成的适当DNA探针进行筛选的方法等。

编码B链(包含从SEQ ID NO：2的N末端开始第26位(Arg)～第52位(Trp)残基的氨基酸序列的多肽)的多核苷酸的例子包括：包含从SEQ ID NO：1的5’末端开始第76位(c)～第156位(g)碱基序列序列的多核苷酸。

编码A链(包含从SEQ ID NO：2的N末端开始第119位(Asp)～第142位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽)的多核苷酸的例子包括：包含从SEQ ID NO：1的5’末端开始第355位(g)～第426位(c)碱基序列的多核苷酸。

编码前原蛋白(包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽)的多核苷酸的例子包括：包含SEQ ID NO：1所示碱基序列的多核苷酸。

质粒

上述转化中使用的质粒，只要其包含编码本发明松弛素-3的多核苷酸，则没有特别限定。可通过向根据所用宿主细胞适当选择的公知表达载体中插入该多核苷酸得到。此外，为使分离和纯化的操作易于进行，根据需要，也可以是能够表达切出本发明的松弛素-3、B链、A链或前原蛋白的融合蛋白的质粒。

转化体

上述转化体只要包含编码本发明松弛素-3的多核苷酸，则也没有特别限定。如可以是将该多核苷酸整合到宿主细胞的染色体中形成的转化体；或者，可以是以质粒形式包含该多核苷酸的转化体；或者，可以是不表达本发明松弛素-3的转化体。该转化体可以通过用上述质粒、或上述多核苷酸本身转化所需宿主细胞而得到。此外，根据其他技术方案，上述转化体也可以进一步含有可表达作用于B链、A链被切出的切断位点的蛋白酶的质粒。

上述宿主细胞的例子包括：常用的公知微生物，如大肠杆菌(如E.coli JM109)或酵母(如Saccharomyces cerevisiae W303)；公知的培养细胞，例如动物细胞(如CHO细胞、HEK-293细胞、COS细胞)或昆虫细胞(如BmN4细胞)。

此外，公知的表达载体的例子包括：对于大肠杆菌，有pUC、pTV、pGEX、pKK和pTrcHis；对于酵母，有pEMBLY和pYES2；对于CHO细胞、HEK-293细胞和COS细胞，有pcDNA3、pMAMneo和pBabe Puro；对于BmN4细胞，有家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白启动子的载体(如pBK283)。

上述目标多肽可以通过在能够表达本发明松弛素-3、B链、A链或前原蛋白的条件下培养得到；或者，也可以通过向适当的细胞中注入编码本发明松弛素-3、B链、A链或前原蛋白的RNA，在能够表达本发明松弛素-3、B链、A链或前原蛋白的条件下培养得到。

本发明的松弛素-3、B链、A链或前原蛋白可以通过在培养后收集菌体、细胞或培养液，将分离和纯化的公知的方法任意组合，利用松弛素-3、B链、A链或前原蛋白的生化学性质或物理性质等从上述转化体培养物中取得。例如，可以利用超滤、液相色谱法(如亲和色谱法或高效液相色谱法(HPLC)等)、透析法等技术。

在分别独立地制备本发明松弛素-3的B链和A链时，或者从融合蛋白切出制备B链或A链时，可以按照常法，分离纯化产生的或切出的B链和A链，使这些链之间以二硫键结合。

含有松弛素-3的医药组合物

定义

在本说明书中，“精神状态”例如是指焦虑、紧张、抑郁的状态。

在本说明书中，“焦虑(anxiety)”是指伴有体征(如发汗、心动过速、呼吸加速、震颤)的感觉(如恐惧、恐怖)所表现的感情状态、不快的情绪状态。焦虑虽然是正常的感情，但由于重度焦虑会导致焦虑障碍，所以上述焦虑也包括焦虑障碍。焦虑障碍包括，例如，带有或没有广场恐怖的惊恐性障碍、没有惊恐性障碍病史的广场恐怖(Agoraphobia)，特别的恐怖症如特定动物恐怖症、社会恐怖症，包含强迫性、外伤性紧张障碍和急性紧张障碍的紧张障碍，由醇、药物(如苯丙胺、咖啡因、大麻、可卡因、致幻剂、吸入剂、Phencychdine)、镇静剂、催眠药、抗焦虑剂引起的焦虑障碍，伴有焦虑或伴有焦虑和抑郁的焦虑障碍。焦虑或焦虑障碍包括，经常与其他疾病(如精神疾病、免疫疾病、代谢疾病、消化管疾病等)和症状相关联、或由其他症状引起的疾病。焦虑的存在可以伴随或不伴随其他障碍，如抑郁障碍中的抑郁。

在本说明书中，“抑郁(depression)”是指，悲观的烦恼、强烈的悲伤、失望、动摇、精神活动迟缓、注意力下降和自卑的感情状态。根据抑郁的程度不同，包括食欲不振、体重减少、饮食过量、失眠、睡眠过度、性冲动、出现正常昼夜节律(如体温、内分泌机能)破坏的状态。

本发明的松弛素-3或编码本发明松弛素-3的多核苷酸可以用作精神状态治疗、优选焦虑治疗的抗焦虑剂。例如，它们可以用于精神状态调节、优选焦虑作用调节中由某些异常引起的疾病的治疗；与其他疾病和症状相关联的、或由其他症状引起的焦虑治疗；由醇、药物等其他物质引起的焦虑障碍治疗；在检查时或手术前后的焦虑的缓解。此外，它们也可以作为药物，用于伴有焦虑症状的精神疾病的治疗、由松弛素-3或编码松弛素-3的多核苷酸异常引起的疾病。

具体地，由于焦虑作用是指不快的情绪状态，并经常伴有与恐怖引起的状态相似的生理学变化和行为，所以具有抗焦虑作用的松弛素-3具有稳定人或人以外生物的精神状态的作用。例如可以用于，焦虑症、广泛性焦虑症、惊恐性障碍、恐怖症、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、创伤后应激障碍的治疗、精神疾病(如抑郁症、抑郁症状、双相性精神障碍、循环性情感、情感障碍、情绪紊乱、睡眠障碍、精神分裂症)、免疫疾病(如慢性风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、肾疾病、皮肥厚、特应性皮炎、支气管哮喘、多发性硬化症、风湿性肺炎(rheumaticpneumonitis)、结节病(sarcoidosis)、克罗恩病、炎症性结肠炎、肝硬化、慢性肝炎、暴发性肝炎、脑脊髓炎、重症肌无力)、代谢疾病(如糖尿病、肥胖性糖尿病、葡萄糖耐量障碍、酮病、酸中毒、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、高脂血症、动脉硬化、心绞痛、心肌梗塞、肥胖、肥胖症、进食障碍疾患、厌食症)、消化管疾病(如腹泻、便秘、功能性便秘、过敏性肠综合征)AIDS、癌、恶病质)和与这类症状相关的或由这类症状引起的焦虑的治疗，由醇、药物(如苯丙胺、咖啡因、大麻、可卡因、致幻剂、吸入剂、Phencychdine)、镇静剂、催眠药、抗焦虑药引起的焦虑障碍的治疗。此外，也可以用于伴有焦虑症状的精神疾病(如抑郁症、抑郁症状、双相性精神障碍、循环性情感、情感障碍、情绪紊乱、睡眠障碍、精神分裂症)的治疗。

作为上述疾病的治疗药使用时，本发明的松弛素-3或编码本发明松弛素-3的多核苷酸可以形成盐，它们可以进一步形成水合物，这些盐和水合物也包含于本发明中。作为上述疾病的治疗药使用时，编码本发明松弛素-3的多核苷酸可以单独使用，或者也可以插入适当载体、或者添加信号序列或多肽稳定序列等序列后使用。作为上述载体，可以使用腺病毒载体、反转录病毒载体、仙台病毒载体(日本血凝病毒)、质粒、噬菌粒、粘粒等公知的载体。本发明的松弛素-3或编码本发明松弛素-3的多核苷酸或其盐或它们的水合物可以单独使用，也可以和药学上允许的载体配合、作为组合物使用。

这里所用的“盐”只要是与本发明的松弛素-3或编码本发明松弛素-3的多核苷酸形成的盐，且为药学上能够容许的盐，则没有特别限定。这种盐的优选例子包括：氢卤酸盐(如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐)、无机酸盐(如硫酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐等)、有机羧酸盐(如醋酸盐、三氟醋酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐等)、有机磺酸盐(如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐等)、氨基酸盐(如天冬氨酸盐、谷氨酸盐等)、季铵盐、碱金属盐(如钠盐、钾盐等)、碱土金属盐(如镁盐、钙盐等)。作为该“药学上能够容许的盐”，更优选三氟醋酸盐、盐酸盐、草酸盐等。

有效成分在载体中的比例可在1～90重量％范围变动。此外，该药剂可以以各种形式、以经口或非经口(如静脉注射、肌肉注射、皮下给药、直肠给药、经皮给药)中的任一给药途径，施予人或人以外的生物。人以外的生物例如包括非人哺乳动物如牛、猴、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬等)、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类、昆虫类。因此，含有本发明的松弛素-3或编码本发明松弛素-3的多核苷酸的药物组合物，可以根据给药途径制成适当剂型，具体可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂和糖浆剂等口服制剂；或注射剂、静脉滴注剂、脂质体制剂、栓剂等非口服制剂。这些制剂可采用常用的赋型剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、增溶剂、防腐剂、调味剂、止痛剂、稳定剂等，依常法制备。可以使用的无毒性添加剂包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、硬脂酸镁、甲基纤维素或其盐、乙醇、柠檬酸、氯化钠、磷酸钠等。

作为给药形式和必要的给药剂量，取决于本发明的松弛素-3或编码本发明松弛素-3的多核苷酸的选择、给药对象、给药途径、制剂性质、患者状态、还有医师的判断。适当的给药量范围为，如患者体重每1kg约为0.1～500μg、优选约0.1～100μg、更优选1～50μg左右。考虑到给药途径的效率不同，可以预测必要的给药量会大范围变动。例如，可以预测与静脉注射给药相比，经口给药需要更高的给药量。这种给药量的变动，可以采用本领域熟知、标准的、经验上的、最优化的规程进行调整。

使用松弛素-3受体的、与精神状态调节相关的化合物的筛选方法松弛素-3受体

本发明的松弛素-3受体可以为各种受体中的具有与本发明的松弛素-3结合的活性、表现出各种松弛素-3受体表达细胞的细胞刺激活性(如细胞内Ca²⁺的游离、腺苷酸环化酶的活化、细胞内cAMP生成、细胞内cGMP生成、肌醇磷脂生成、细胞膜电位变化、细胞膜附近pH变化、细胞内蛋白质的磷酸化、c-fos和c-jun的诱导/活化、花生四烯酸游离等)的受体。松弛素-3受体可以是任何来源的，只要其满足上述条件，可以为例如表达人或人以外的生物[如非人哺乳动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬等)、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类、昆虫类等]的松弛素-3受体的脏器、组织、细胞等天然来源的物质，也包括按照公知的基因工程技术、合成技术等人为制备的物质。此外，作为松弛素-3的部分多肽，只要其可用于后述的筛选方法中，则没有特别限定。例如可以使用具有与本发明松弛素-3结合的能力的部分多肽、包含相当于细胞膜外区域的氨基酸序列的部分多肽等。这种情况下，构成部分多肽的氨基酸数为松弛素-3受体的氨基酸数的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％。

具体地，松弛素-3可以使用已有报道的公知受体，如LGR7(GenBank登录号NM_021634)、SALPR(GenBank登录号NM_016568，也称GPCR135)或GPR100(GenBank登录号AB_083593，也称hGPCR11、GPCR142)等。

使用SALPR的、与焦虑作用调节相关的化合物的筛选方法

以下在本说明书中，作为本发明的一个优选方案，对采用SALPR筛选与精神状态调节、例如焦虑作用的调节(抑制或促进焦虑作用)有关的化合物的方法进行详细说明。即，本发明提供筛选与SALPR或其部分多肽结合、与焦虑作用的调节(抑制或促进焦虑作用)有关的化合物的方法。此外，通过使受试物作用于SALPR或其部分多肽、测定细胞刺激活性，可以判定该受试物是否具有抑制或促进焦虑作用的效果。

SALPR或其部分多肽可以通过各种公知方法得到。例如可以采用编码SALPR的多核苷酸(GenBank登录号NM_016568)根据公知的基因工程方法制备。此外作为其他的技术方案，可以通过公知的多肽合成法得到，如可以按照液相法、固相法等常法合成。通常利用自动合成仪。进一步地，根据其他技术方案，SALPR的部分多肽可以通过由适当的蛋白水解酶切断SALPR而制备。根据其他技术方案，作为SALPR的部分多肽，优选制备具有结合活性部位的部分多肽。

编码本发明的SALPR的多肽是指，由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列构成的多肽；与由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列构成的多肽在功能上等价的修饰多肽；或者包含与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列具有70％或以上、优选80％或以上、更优选85％或以上、进一步优选90％或以上、更进一步优选95％或以上、特别优选98％或以上、最优选99％或以上同源性的氨基酸序列的多肽，且表现出与SALPR基本相同的活性(例如与松弛素-3结合的能力和由该结合产生的细胞刺激活性、或焦虑作用的调节)。

与包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽在功能上等价的修饰多肽是指，在包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽中，缺失、置换、插入和/或添加了1个或多个(优选1个或几个)氨基酸得到的、且表现出与SALPR基本相同的活性(例如与松弛素-3结合的能力和由该结合产生的细胞刺激活性、或焦虑作用的调节)的多肽。

进一步地，也可以使用SALPR的部分多肽，只要其具有与SALPR基本相同的活性(例如与松弛素-3结合的能力和由该结合产生的细胞刺激活性、或焦虑作用的调节)。作为SALPR的部分多肽，可以使用具有下述部位的部分多肽，所述部位是具有与松弛素-3结合的能力的部位。

以下详述使用SALPR的基因工程的方法；但也可以使用其部分多肽，只要其可用于后述的筛选方法中。

SALPR的制备

将编码SALPR的多核苷酸导入适当的宿主细胞，将得到的转化体在可以表达的条件下培养，可以不经纯化从该培养物中获得所要的多肽，也可按照表达蛋白的分离和纯化中常用的方法、从该培养物中分离和纯化所要的多肽，从而制备出SALPR。上述分离和纯化方法的例子包括硫酸铵盐析、使用离子交换纤维素的离子交换柱色谱法、使用分子筛凝胶的分子筛柱色谱法、使用蛋白A结合多糖类的亲和层析柱色谱法、透析、或冷冻干燥。

编码SALPR的多核苷酸

对于编码本发明的SALPR的多核苷酸没有特别限定，只要其为编码本发明的SALPR的多核苷酸。

在此所用的术语“多核苷酸”包括DNA和RNA。更具体地，本发明所用的多核苷酸选自下述多核苷酸(a)～(e)：

(a)包含SEQ ID NO：3所示碱基序列的多核苷酸；

(b)编码“由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列构成的多肽”的多核苷酸；

(c)编码“包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列、且表现出与SALPR基本相同的活性的多肽”的多核苷酸；

(d)编码“包含在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的1个或多个(优选1个或几个)位点缺失、置换、插入和/或添加了1个或多个(优选1个或几个)氨基酸得到的氨基酸序列，且表现出与上述SALPR基本相同的活性的多肽”的多核苷酸；和

(e)在严格条件下与包含SEQ ID NO：3所示碱基序列的多核苷酸杂交、且编码表现出与SALPR基本相同的活性的多肽的多核苷酸。

根据本发明的一个技术方案，编码本发明的SALPR的多核苷酸为包含SEQ ID NO：3所示碱基序列的多核苷酸。SEQ ID NO：3所示多核苷酸编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的SALPR。

根据本发明的另一个技术方案，本发明所用的多核苷酸为编码下述多肽的多核苷酸，上述多肽为“包含在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的1个或多个(优选1个或几个)位点缺失、置换、插入和/或添加了1个或多个(优选1个或几个)氨基酸的氨基酸序列，且表现出与上述SALPR基本相同的活性的多肽”。这里，可缺失、置换、插入和/或添加的氨基酸数为例如1～30个、优选1～20个、更优选1～10个、进一步优选1～5个，最优选1～2个。

根据本发明的另一个技术方案，编码本发明的SALPR的多核苷酸为“在严格条件下与包含SEQ ID NO：3所示碱基序列的多核苷酸杂交、且编码表现出与SALPR基本相同的活性的多肽”的多核苷酸。进一步地，根据本发明的另一个技术方案，编码本发明的SALPR的多核苷酸为“在严格条件下与包含SEQ ID NO：3所示碱基序列的多核苷酸杂交、且编码表现出与SALPR基本相同的活性的多肽”的多核苷酸。

质粒

对于上述转化中使用的质粒没有特别限定，只要其包含编码SALPR的多核苷酸。其可通过向根据所用宿主细胞适当选择的公知表达载体中插入该多核苷酸得到。

转化体

对于上述转化体也没有特别限定，只要其包含编码SALPR的多核苷酸。例如，其可以是将该多核苷酸整合入宿主细胞的染色体中形成的转化体；以质粒形式包含该多核苷酸的转化体；不表达SALPR的转化体。该转化体可以通过用上述质粒、或上述多核苷酸本身转化所需宿主细胞得到。

上述宿主细胞的例子包括常用的公知微生物，如大肠杆菌(如E.coliJM109)和酵母(如Saccharomyces cerevisiae W303)；公知的培养细胞，例如动物细胞(如CHO细胞、HEK-293细胞和COS细胞)和昆虫细胞(如BmN4细胞)。

上述表达载体的例子包括：对于大肠杆菌，有pUC、pTV、pGEX、pKK和pTrcHis；对于酵母，有pEMBLY和pYES2；对于CHO细胞、HEK-293细胞和COS细胞，有pcDNA3、pMAMneo和pBabe Puro；对于BmN4细胞，有包含家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白启动子的载体(如pBK283)。

这里所用的含有SALPR的细胞，只要在细胞膜表面表达SALPR，则没有特别限定。其可如下得到：例如在可以表达SALPR的条件下培养上述转化体(即，用包含编码SALPR的多核苷酸的质粒转化的细胞)；或将编码SALPR的RNA注入适当的细胞，并在可以表达SALPR的条件下进行培养。

细胞膜级分

本发明的含有SALPR的细胞膜级分可以通过例如将表达本发明的SALPR的细胞破碎后，分离富含细胞膜的级分而得到。细胞的破碎方法包括：采用匀浆器(如Potter-Elvehiem型匀浆器)压碎细胞的方法、用韦林搅切器或Polytron(Kinematica)破碎、超声波破碎、或采用弗氏细胞压碎器在加压的同时使细胞从细小喷嘴中喷出而破碎等。此外，细胞膜的分离方法包括离心分离法，如差速离心分离法或密度梯度离心法。

在通过SALPR的本发明的促进或抑制焦虑作用的化合物的筛选方法中，可以采用SALPR、上述细胞膜级分(即含有SALPR的细胞膜级分)或上述细胞(即含有SALPR的细胞)。

此外，本发明的筛选方法包括和利用：作为第一技术方案，可列举检查受试物是否与SALPR特异结合的方法；作为第二技术方案，可列举检查由受试物与SALPR的结合而产生的细胞刺激活性(如细胞内Ca²⁺的游离、腺苷酸环化酶的活化、细胞内cAMP生成、细胞内cGMP生成、肌醇磷脂生成、细胞膜电位变化、细胞膜附近pH变化、细胞内蛋白质的磷酸化、c-fos和c-jun的诱导活性、花生四烯酸游离等)的方法。

在本发明的筛选方法的第一技术方案中，例如，通过使受试物与SALPR、上述细胞膜级分或上述细胞接触，分析受试物是否与SALPR、上述细胞膜级分或上述细胞结合，从而可以通过SALPR筛选化合物，但对其促进或抑制焦虑作用的能力不作区分。

具体地，在受试物不存在条件下和受试物存在条件下，使SALPR、上述细胞或上述细胞膜级分与标记了的松弛素-3接触，比较在上述条件下SALPR、上述细胞膜级分或上述细胞与松弛素-3的特异结合量，由此可实现化合物的筛选，而不区分SALPR介导的促进或抑制焦虑作用的能力。即，当上述受试物具有SALPR介导的促进或抑制焦虑作用的能力时，与受试物不存在时的SALPR、上述细胞或上述细胞膜级分与松弛素-3的特异结合量相比，受试物存在时的上述特异结合量降低。

在本发明的筛选方法中，作为松弛素-3，可以使用标记了的松弛素-3，以比较SALPR、上述细胞膜级分或上述细胞与松弛素-3的特异结合量。作为上述标记，可以使用例如放射性同位素、酶、荧光物质、或发光物质等。放射性同位素的例子包括[³H]、[¹⁴C]、[¹²⁵I]、[³⁵S]等。上述酶的例子包括β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶等。荧光物质物质的例子包括异硫氰酸荧光素、BODIPY。发光物质的例子包括萤光素、硝酸双-N-甲基吖啶(lucigenin)。根据情况不同，为了使标记物质和本发明的松弛素-3结合，也可以采用生物素-亲和素系统、松弛素-3的抗体。

根据本发明的筛选方法，可以筛选与SALPR、上述细胞膜级分或上述细胞结合的化合物，以抑制它们与本发明的松弛素-3的结合，而不区分通过SALPR促进或抑制焦虑作用的能力。

在本发明筛选方法的第二个技术方案中，在受试物不存在条件下和受试物存在条件下，使上述细胞与标记了的本发明的松弛素-3接触，通过比较在上述各条件下的通过上述细胞的该松弛素-3的特异结合量，进一步地，比较在上述条件下的该松弛素-3的特定细胞活性，从而筛选化合物，并区分其通过SALPR促进或抑制焦虑作用的能力。

在上述技术方案中，与上述细胞结合、并通过包含于上述细胞的受体表现出细胞刺激活性的受试物，可以作为通过SAPLR抑制焦虑作用的化合物被选择。

另一方面，在上述技术方案中，阻碍上述细胞和该松弛素-3的结合、但不表现细胞刺激活性的受试物可以作为通过SAPLR促进焦虑作用的化合物被选择。

本发明的筛选方法可以通过利用如腺苷酸环化酶活性的抑制作为细胞刺激活性来实施。

在该技术方案的筛选方法中，例如可以采用公知的方法测定由腺苷酸环化酶的活化在细胞内生成的cAMP，从而筛选化合物，并区分该化合物通过SALPR促进或抑制焦虑作用的能力。该技术方案利用了由本发明的松弛素-3与SALPR结合所产生的细胞内信号传递，即作为SALPR的细胞刺激活性之一的腺苷酸环化酶的活性抑制。具体地，该松弛素-3与SALPR结合时，偶联于SALPR的G蛋白族之一的Gi族抑制腺苷酸环化酶，使细胞内生成的环腺苷酸(cAMP：通过腺苷酸环化酶从ATP生成)量减少。

例如，当向在细胞膜上表达SALPR(优选通过导入包含SALPR的表达载体过量表达)的来源于哺乳动物的细胞(如HEK-293细胞或CHO细胞)中添加腺苷酸环化酶激活剂[如毛喉素(FSK)]时，细胞内的cAMP的浓度上升。

此外，在添加腺苷酸环化酶激活剂时，如果加入本发明的松弛素-3，则在促进由腺苷酸环化酶激活剂引起的上述腺苷酸环化酶活性的同时，也会产生因该松弛素-3作用于本发明的SALPR所产生的腺苷酸环化酶的活性抑制，结果，与单独施予腺苷酸环化酶激活剂时相比，cAMP的生成量减少。因此，在筛选具有抑制焦虑作用的作用的化合物时，可以选择使受试物单独接触，代替在这种筛选系统中通过SALPR作用的松弛素-3，使cAMP的生成量减少(即与该松弛素-3具有相同作用)的化合物。

在筛选具有促进焦虑作用的作用的化合物时，可在筛选细胞中添加腺苷酸环化酶激活剂、本发明的松弛素-3和受试物。与单独添加腺苷酸环化酶激活剂的情况相比，由于该松弛素-3的作用，cAMP的生成量减少；但当受试物拮抗松弛素-3的作用时，cAMP生成的减少受到抑制。此时，选择上述受试物作为促进焦虑作用的化合物。

作为测定细胞内cAMP的方法，例如有免疫测定法等。该测定也可使用市售的cAMP定量试剂盒实施。

在其他技术方案的筛选方法中，例如，通过采用在细胞膜上表达SALPR(优选通过导入包含SALPR的表达载体过量表达)、且含有cAMP应答序列(CRE)位于5’上游的报道基因(如碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、β-内酰胺酶基因、硝基还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-半乳糖苷酶基因、GFP(green fluorescent protein)等荧光蛋白基因)的细胞，可以筛选通过SALPR促进或抑制焦虑作用的化合物，并区分其促进或抑制能力。该技术方案利用了这一事实，即，当上述cAMP的生成减少时，在启动子区域具有被导入上述筛选用细胞的CRE的报道基因的转录被抑制。

以下根据上述技术方案，对筛选程序进行更具体地说明。其中所述筛选是指，筛选通过SALPR促进或抑制焦虑作用的化合物，并区分其促进或抑制能力。

即，导入上述筛选用细胞的CRE是一种碱基序列，其共存于在细胞内的cAMP浓度上升时表达亢进的基因组(cAMP诱导基因)的转录调节区域。因此，在筛选用细胞中添加腺苷酸环化酶激活剂(如FSK)时，细胞内的cAMP上升，结果位于CRE下游的报道基因的表达量增加。报道基因产物的表达量可如下容易地测定：通过测定与报道基因产物反应的基质产生的发光物质发光，或通过测定来自作为报道基因产物产生的荧光蛋白的荧光。

此外，在添加腺苷酸环化酶激活剂时，如果加入本发明的松弛素-3时，则在促进由腺苷酸环化酶激活剂引起的上述腺苷酸环化酶活性的同时，也会产生因该松弛素-3作用于本发明的SALPR所产生的腺苷酸环化酶的活性抑制，结果，与单独施予腺苷酸环化酶激活剂时相比，报道基因产物表达量减少。因此，在筛选具有抑制焦虑作用的作用的化合物时，选择使受试物单独接触，代替通过SALPR作用的松弛素-3，使报道基因产物的表达量减少(即，与松弛素-3具有相同作用)的化合物即可。

在筛选具有促进焦虑作用的作用的化合物时，可在筛选细胞中添加腺苷酸环化酶激活剂、本发明的松弛素-3和受试物。与单独添加腺苷酸环化酶激活剂的情况相比，由于该松弛素-3的作用，报道基因产物表达量减少；但当受试物拮抗松弛素-3的作用时，报道基因产物的表达量减少受到抑制。此时，选择上述受试物作为促进焦虑作用的化合物。

受试物的作用是否是由于通过与SALPR结合的作用，可以简单确认。例如，与采用筛选用细胞(即，在细胞膜上表达SALPR、且含有CRE位于5’上游的报道基因的细胞)的上述试验并行，采用对照细胞(例如，虽然含有CRE位于5’上游的报道基因，但在细胞膜上不表达SALPR的细胞)实施相同的试验。结果，当上述受试物的作用不是与SALPR结合产生的作用时，关于报道基因产物的表达量，在筛选用细胞和对照细胞中观察到相同现象；与此相对，当上述受试物的作用是与SALPR结合产生的作用时，关于报道基因产物的表达量，在筛选用细胞和对照细胞中观察到不同现象。

此外，作为其他的技术方案，通过将受试物、优选由上述筛选方法选择的受试物施予受试动物，如人或人以外的生物[如非人哺乳动物(如牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬等)、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类、昆虫类等]，通过分析施予后的行为观察、自发运动量、血中参数(如血中或脑中的激素或分泌肽的量等)的变化等指标，可以确认和确定对焦虑作用的调节有影响的化合物(即，抑制或促进焦虑作用的化合物)。具体地，可以通过Defensive burying试验(Treit等人，Pharamacology Biochemistry and Behavior，15，p.619-626，1981)、开电场(open field)试验、明暗试验、高架十字迷宫试验、Geller-Seifter冲突试验、Vogel冲突试验、social interaction试验、Hole-board试验、Marbleburying试验、恐怖条件负荷试验、强迫游泳试验、tail suspension试验，进行行为观察。作为非人哺乳动物，例如，不仅限于正常动物，也包括遗传性疾病模型的动物或遗传修饰动物。

作为受试物的施予形式，有经口或非经口施予。作为非经口的施予途径，举例如静脉内、动脉内、皮下、腹腔内、气管内、直肠内、脑内、优选在下丘脑附近的脑室内施予。将受试物施予受试动物的脑室内的方法，可以按照将药物等施予脑室内规定位置时的常法进行，没有特别限定。

例如，首先将受试动物麻醉后，实施将引导插管固定在规定位置上的手术，经过适当的恢复期(如7天～14天，优选至少1周左右)后，将注射针插入引导插管，使用连接回流泵的微注射器，优选通过上述针施予受试物。受试物的施予量没有限定，可适当设定。受试物一般采用人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid)或生理食盐水等配成所需浓度。作为人工脑脊液，没有特别限定，可以采用公知常用的人工脑脊液，但人工脑脊液的优选例子包括：aCSF(葡萄糖10mM、KCl 2mM、NaCl115mM、CaCl₂ 2.5mM、MgSO₄ 1.2mM、NaHCO₃ 25mM、KH₂PO₄ 2.2mM；pH7.4)等。受试物的施予次数可以为每日1次、或分多次使用，受试物的施予间隔或观察间隔可以为1日至数周。

将松弛素-3施予受试动物的方法优选与上述受试物的情况同样的方法。此外，将松弛素-3施予受试动物脑室内的方法，也优选与上述受试物同样、采用人工脑脊液配成所需浓度的溶液。

受试物

上述受试物可以为任何化合物，可以为例如基因文库的表达产物、合成低分子化合物文库、核酸(寡DNA、寡RNA)、合成肽文库、抗体、细菌释放物质、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)提取液、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)培养上清液、纯化或部分纯化多肽、来源于海洋生物、植物或动物等的提取物、土壤、噬菌体随机肽库(random phage peptide display library)。该化合物可以成盐，进一步地，该化合物及其盐也可以形成水合物，这些也包含于本发明中。

在本说明书中，受试化合物的“盐”表示在药学上容许的盐，只要是与化合物形成药学上容许的盐，则没有特别限定。这种盐优选的例子包括：氢卤酸盐(如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐)、无机酸盐(如硫酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐)、有机羧酸盐(如醋酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐)、有机磺酸盐(如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐)、氨基酸盐(如天冬氨酸盐、谷氨酸盐等)、季铵盐、碱金属盐(如钠盐、钾盐)、碱土金属盐(如镁盐、钙盐)。

筛选用试剂盒

本发明的筛选用试剂盒至少含有松弛素-3受体、上述细胞(即含有松弛素-3受体的细胞)或上述细胞膜级分(即含有松弛素-3受体的细胞膜级分)。其有时还可以含有松弛素-3。该松弛素-3可以为标记的松弛素-3。上述筛选用试剂盒根据需要可进一步包含各种试剂，如结合反应用缓冲液、洗涤用缓冲液、说明书和/或器具。松弛素-3受体的优选例为SALPR。

本发明的其他技术方案的筛选用试剂盒至少含有本发明的松弛素-3、和在细胞膜上表达SALPR(优选通过导入包含SALPR的表达载体过量表达)且含有cAMP应答序列(CRE)位于5’上游的报道基因(如碱性磷酸酶基因、或萤光素酶基因)的细胞。上述筛选用试剂盒，根据需要可进一步包含各种试剂，如报道基因产物(如碱性磷酸酶或萤光素酶等)的基质、腺苷酸环化酶激活剂(如FSK)、结合反应用缓冲液、洗涤用缓冲液、说明书和/或器具等。此外，上述筛选用试剂盒也可以包含虽含有CRE位于5’上游的报道基因，但在细胞膜上不表达松弛素-3受体的细胞。

这里，松弛素-3受体的优选例为SALPR。

含有根据本发明的筛选方法得到的化合物的药物组合物

根据本发明的筛选方法得到的化合物，是与精神状态调节、优选焦虑作用调节(抑制或促进焦虑作用)有关的化合物。该化合物可以成盐，进一步地，该化合物及其盐也可以形成水合物。

因此，根据发明的筛选方法得到的化合物或其盐或它们水合物，可以用于精神状态的治疗、优选作为焦虑治疗的抗焦虑剂。例如，它们可以用于：精神状态调节、优选焦虑作用调节中由某些异常引起的疾病的治疗；与其他疾病(例如精神疾病、免疫疾病、代谢疾病、消化管疾病等)和症状相关联、或由这种其他症状引起的焦虑治疗；由醇、药物等其他物质引起的焦虑障碍治疗；在检查时或手术前后的焦虑的缓解。此外，它们也可以作为治疗伴有焦虑症状的精神疾病、治疗由松弛素-3或编码松弛素-3的多核苷酸异常引起的疾病的药物。

具体地，由于焦虑作用是不快的情绪状态，并经常伴有与恐怖引起的状态相似的生理学变化和行为，所以具有抗焦虑作用的化合物具有稳定人或人以外生物的精神状态的作用。因此，可以用于如焦虑症、广泛性焦虑症、惊恐性障碍、恐怖症、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、创伤后应激障碍的治疗、精神疾病(如抑郁症、抑郁症状、双相性精神障碍、循环性情感、情感障碍、情绪紊乱、睡眠障碍、精神分裂症)、免疫疾病(如慢性风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、肾疾病、皮肥厚、特应性皮炎、支气管哮喘、多发性硬化症、风湿性肺炎、结节病、克罗恩病、炎症性结肠炎、肝硬化、慢性肝炎、暴发性肝炎、脑脊髓炎、重症肌无力)、代谢疾病(如糖尿病、肥胖性糖尿病、葡萄糖耐量障碍、酮病、酸中毒、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、高脂血症、动脉硬化、心绞痛、心肌梗塞、肥胖、肥胖症、进食障碍疾患、厌食症)、消化管疾病(如腹泻、便秘、功能性便秘、过敏性肠综合征)和与这类症状相关的或由这类症状引起的焦虑的治疗，由醇、药物(如苯丙胺、咖啡因、大麻、可卡因、致幻剂、吸入剂、Phencychdine)、镇静剂、催眠药、抗焦虑药引起的焦虑障碍的治疗。此外，也可以用于伴有焦虑症状的精神疾病(如抑郁症、抑郁症状、双相性精神障碍、循环性情感、情感障碍、情绪紊乱、睡眠障碍、精神分裂症)的治疗。

根据本发明的筛选方法得到的化合物或其盐或它们的水合物，可以单独使用，也可以和药学上允许的载体配合、作为药物组合物使用。此时有效成分在载体中的比例可在1～90重量％范围变动。此外，该药剂可以以各种形式、以经口或非经口(如静脉注射、肌肉注射、皮下给药、直肠给药、经皮给药)中的任一给药途径，施予人或人以外的生物[如非人哺乳动物(如牛、猴、家禽、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、犬等)、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类、昆虫类等]。因此，含有根据本发明的筛选方法得到的化合物或其盐或它们的水合物的药物组合物，可以根据给药途径制成适当剂型，具体可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂和糖浆剂等口服制剂；或注射剂、静脉滴注剂、脂质体制剂、栓剂等非口服制剂。这些制剂可采用常用的赋型剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、增溶剂、防腐剂、调味剂、止痛剂、稳定剂等，依常法制备。这里使用的无毒性添加剂包括乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、硬脂酸镁、甲基纤维素或其盐、乙醇、柠檬酸、氯化钠、磷酸钠。

这些给药形式和必要的给药剂量取决于根据本发明的筛选方法得到的化合物或其盐或它们的水合物的选择、给药对象、给药途径、制剂性质、患者状态、还有医师的判断。适当的给药量范围为，例如患者体重每1kg约为1.0～1500μg、优选约10～500μg左右。考虑到给药途径的效率不同，可以料想，必要的给药量会大范围变动。例如，可以料想与静脉注射给药相比，经口给药需要更高的给药量。这种剂量水平的变动可以采用本领域熟知、标准的、经验上的、最优化的规程进行调整。

本说明书中的“治疗”一般是指达到所希望的药理学效果和/或生理学效果。从完全或部分地防止疾病和/或症状的角度而言，效果是指预防性的；从部分地或完全地治愈疾病和/或疾病引起的不良影响的角度而言，效果是指治疗性的。本说明书中“治疗”包含哺乳动物、尤其是人的疾病的任意治疗，例如，包含以下(a)～(c)的治疗：

(a)对于可能带有疾病或症状的诱因，但尚未诊断出带有所述诱因的患者，预防疾病或症状的产生；

(b)抑制疾病症状，或阻止或延迟其发展；

(c)缓和疾病症状，即，引起疾病或症状的退行、或症状发展的逆转。

本说明书中应用的全部先行技术文献，作为参考引入本说明书。μg实施例

以下通过实施例详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例限定。

[实施例1]编码SALPR的多核苷酸的制备

编码SALPR的多核苷酸的分离是基于SEQ ID NO：3所示的碱基序列如下进行的。在SEQ ID NO：3中显示有1410个碱基对，已知编码SALPR的区域是从1位到1407位(1410个碱基对，469个氨基酸残基)(GenBank登录号：NM_016568)。为了通过聚合酶链反应(PCR)分离基因，按常法制备SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的PCR引物。

以human genomic DNA(Roche Diagnostics)为模板，采用包含SEQID NO：11和SEQ ID NO：12的组合的PCR引物和Expand High FidelityPCR System(Roche Diagnostics)，按照说明书的操作方法(98℃1分-57℃1分-72℃分)，重复30次进行PCR。结果得到约1,400个碱基对的DNA片段。

将该DNA片段插入pCR2.1(Invitrogen)，并通过ABI prism DNAsequence kit(Perkin-Elmer Applied Biosystems)确认序列。结果，被插入从由SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12构成的引物组合所得到的pCR2.1-SALPR的1410个碱基对的序列与SEQ ID NO：3中从361位～1770位的长度相等，但是发现序列中1处变异。很明显该变异对于由该位点的核酸序列所翻译的氨基酸没有影响，因此可以得到编码SALPR的多核苷酸。

[实施例2]逆转录病毒载体质粒的制备

通过用SalI和ClaI切断pBabe Puro(Morgenstern，J.P.and Land，H.Nucleic Acids Res.，18，p.3587-3596，1990)(SEQ ID NO：13)，除去SV40promoter-puro(r)区域，通过Klenow fragment使末端平端化。在切点处插入IRES-hyg(r)区域，得到pBabeXIH，其中IRES-hyg(r)区域是通过用NsiI和XbaI切断pIRES hyg(Clontech)而切出的，并通过T4聚合酶对末端进行了平端化。

通过用SspI和BamHI切断pBabeXIH，除去5’-LTR-packagingsignal。在切点处插入5’LTR-CMV promoter-packaging signal，得到pBabeCLXIH，其中5’LTR-CMV promoter-packaging signal是通过用SspI和BamHI切断pCLXSN(IMGENEX)而切出的。

[实施例3]SALPR基因导入用逆转录病毒载体质粒的制备

通过限制酶HpaI切断上述实施例2所述的逆转录病毒表达用质粒pBabeCLXIH。在切点处插入编码SALPR的多核苷酸，得到pBabeCL(SALPR)IH(图1)，其中编码SALPR的多核苷酸是通过用EcoRV切断上述实施例1中得到的pCR2.1-SALPR而切出，并通过T4聚合酶对末端进行了平端化。

[实施例4]SALPR基因导入用逆转录病毒载体的制备

在10cm胶原涂层皿(IWAKI)中，采用DMEM(Sigma)-10％胎牛血清(FCS)-青霉素100units/mL-链霉素100μg/mL(PS)(以下称“EBNA培养液”)10mL，培养2×10⁶个293-EBNA细胞(Invitrogen)。次日，采用脂转染试剂TransIT(Panvera)，通过pV-gp(通过用NsiI和XbaI切断pVPack-GP(Stratagene)除去IRES-hisD、并通过T4聚合酶使末端平端化之后，自身环化而得到)、pVPack-VSV-G(Stratagene)和实施例3中得到的SALPR基因导入用逆转录病毒载体质粒(pBabeCL(SALPR)IH)各3.3μg转染上述293-EBNA细胞。然后在6～12小时后更换EBNA培养液，在37℃下继续培养。

转染2天后回收培养液，以1,200×g离心10分钟。

将得到的上清液采用0.45μm的过滤器(Millipore)过滤，得到非浓缩逆转录病毒载体，进一步如下进行病毒载体的浓缩。

将用于超离心的50Ultra-Clear Tubes(Beckman)用70％乙醇消毒后用蒸馏水冲洗，然后装入约35mL非浓缩病毒载体。将其放入超离心旋转器SW28(Beckman)中，使用超离心装置XL-90(Beckman)进行19,500rpm、100分钟的离心操作。离心后弃去上清液，将管放入冰中保存。1小时后，得到约100μL残留在管壁的培养液，即浓缩病毒载体溶液。

[实施例5]包含环腺苷酸应答序列的报道基因导入细胞SE302的构建

(1)包含环腺苷酸应答序列的报道DNA的构建

参考公开发表的论文(Durocher等人Anal Biochem 2000284(2)：316-26)，如下构建与cAMP应答转录相关的unit。

为构建包含cAMP responsive element(CRE)的unit，采用CREx2hb用的SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示寡DNA、CREx2bp用的SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17所示寡DNA依常法构建。

将包含各组合的寡DNA在95℃热处理后，通过缓缓降温至室温形成双链DNA(CREx2hb、CREx2bp)。在采用HindIII和BarrHI消化CREx2hb、采用BamHI和PstI消化CREx2bp的同时，采用HindIII和PstI消化pBluescriptIISK(+)(Stratagene)。将消化的DNA进行电泳，纯化两端具有限制酶消化位点的DNA，然后将这3个DNA(CREx2hb、CREx2bp、pBluescriptIISK(+))同时连接，分析得到的质粒的序列，构建成CRE4/pBluescriptIISK。

接着，为了得到包含VIP(vasoactive intestinal peptide)启动子的DNA，按常法构建SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的PCR引物。

以human genomic DNA(Roche Diagostics)为模板，采用包括SEQID NO：18和SEQ ID NO：19的组合的PCR引物和recombinant Taqpolymerase(Takara)，经反复35次(94℃30秒-55℃30秒-72℃1分)进行PCR后，得到264个碱基对的DNA(SEQ ID NO：20)。用PstI消化该264个碱基对的DNA，并插入CRE4/pBluescriptIISK(+)的PstI位点，确认得到的质粒的序列，构建CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)(图2A)。将得到的CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)用HindIII和SmaI消化后，将得到的CRE4VIP启动子片段平端化。

从上述病毒表达载体质粒pBabeCLXIH中除去IRES～hygro(r)区域，构建pBabeCLX(图2B)。在通过从pBabeCLX中除去逆转录病毒内源的增强子活性(LTR)中的NheI～NarI区域、而得到的外源性启动子导入用逆转录病毒载体质粒中，导入包含CRE和VIP启动子的序列和报道基因，即来源于胎盘的碱性磷酸酶(PLAP)(Goto等人，MolecularPharmacology，49，p.860-873，1996)，得到pBabeCLcre4vPdNN(图2C)。

(2)包含环腺苷酸应答序列的报道基因导入细胞SE302的构建

采用逆转录病毒载体质粒pBabeCLcre4vPdNN，按照实施例4所述的方法制备逆转录病毒载体，在所述逆转录病毒载体质粒pBabeCLcre4vPdNN中，报道基因PLAP是由环腺苷酸应答序列诱导的。将制备的逆转录病毒载体导入HEK293细胞中，通过有限稀释法克隆得到的细胞，在以下实验中使用在PLAP诱导中表现出最好的反应性的克隆细胞(以下称“SE302细胞”)。

[实施例6]采用SALPR基因导入用逆转录病毒载体制备SALPR 表达细胞

采用上述实施例4制备的逆转录病毒载体，如下将SALPR基因导入细胞。

将上述实施例5中构建的3×10³个SE302细胞，在96孔板(旭テクノガラス公司)中，采用DMEM(Sigma公司)-10％胎牛血清(FCS)-PS(以下称“培养液”)100μL进行培养。次日，将实施例4中制备的逆转录病毒载体适当稀释，将其100μL和用培养液调制的polybrene(最终浓度8μg/mL)(别名hexadimethrine bromide，Sigma公司)一起加入到SE302细胞中。次日，将培养液更换成含有500μg/mL潮霉素(Hygromycin)(Invitrogen公司)的培养液200μL。在该条件下增殖的SALPR基因导入SE302细胞(以下称“SALPR-SE302细胞”)适时传代，用于实验。

[实施例7]通过在SALPR-SE302细胞中添加毛喉素而增加了转录活性的松弛素-3所产生的抑制

将上述实施例6中构建的SALPR-SE302细胞在转录活性测定用培养基(DMEM-10％FBS(65℃下灭活30分钟))中混悬后，接种到96孔板(Beckton Dickison公司)中，每孔1×10⁴细胞。次日，添加用分析培养基(在DMEM中添加了0.1％牛血清白蛋白)稀释的各浓度人松弛素-3(Phoenix Pharmaceuticals公司)或胰岛素(Invitrogen公司)，然后添加毛喉素(Carbio Chem公司)使最终浓度成1μmol/L。再经一日培养后，回收15μL细胞上清液，移至化学发光测定用的96孔板(住友ベクライト公司)中，添加分析用缓冲液(280mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃、8mmol/L MgSO₄、pH10)60μL、Lumiphos530(Lumigen公司)70μL，在室温反应1小时后，通过Fusion平板读取器(Perkin Elmer公司)测定各孔的化学发光，作为转录活性值。以添加毛喉素1μmol/L的细胞上清液的转录活性为100％、以未添加毛喉素的细胞上清液的活性为0％，添加了各受试样品的细胞上清液的活性以％表示(图3)。

结果表明，松弛素-3可以通过SALPR的活化，抑制由毛喉素引起的转录活性上升。这种转录活性的上升不受相关多肽、即胰岛素的影响，因此可知，其为松弛素-3特异反应。即，表明采用该实验系统，可以判别影响松弛素-3对SALPR的激活的化合物、物质。

[实施例8]采用Defensive burying试验研究脑室内施予松弛素-3 的抗焦虑作用(大鼠)

采用Defensive burying试验(Treit等人，Pharmacology Biochemistryand Behavior，15，p.619-626，1981)，研究松弛素-3对焦虑作用的影响。Defensive burying试验为一种试验系统，其利用下述现象评价焦虑作用或其他精神症状，如抑郁状态，所述现象为：当通过电极对受试动物施予电流刺激时，受试动物迅速表现出用铺垫(bedding material)覆盖电极的行为。

采用株式会社ペプチド研究所合成的人松弛素-3(以下也简称“人松弛素-3(ペプチド研究所制)”)进行实验。松弛素-3为一种多肽，其由具有从SEQ ID NO：2的N末端开始第26位(Arg)～第52位(Trp)残基的氨基酸序列的多肽(人B链)、和具有从SEQ ID NO：2的N末端开始第119位(Asp)～第142位(Cys)残基的氨基酸序列的多肽(人A链)构成，其中，从SEQ ID NO：2的N末端开始第35位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：2的N末端开始第129位的A链半胱氨酸结合；从SEQ ID NO：2的N末端开始第47位的B链半胱氨酸与从SEQ ID NO：2的N末端开始第142位的A链半胱氨酸结合；以及从SEQ ID NO：2的N末端开始第128位的A链半胱氨酸与从SEQ ID NO：2的N末端开始第133位的A链半胱氨酸结合。

(1)受试大鼠和脑室内施予的前处理

将实验动物用饲料MF(Oriental Yeast)施予F344雄性大鼠(7周龄、日本Charles river(株))，使其适应。在麻醉下在大鼠(150～200g)的侧脑室中插入插管。然后进行一周以上施予松弛素-3的实验。

(2)对试验箱的适应

从Defensive burying试验实施的3日前，每日一次将受试大鼠放入铺有高至5cm的铺垫的试验箱中30分钟以上，使受试大鼠适应试验环境。在试验实施前，在试验箱中不安装刺激电极，以使受试大鼠适应环境。

(3)松弛素-3溶液的配制

将人松弛素-3(ペプチド研究所制)用生理食盐水溶解后，配制成最终浓度为0.05nmol/大鼠或1nmol/大鼠。

(4)松弛素-3溶液的脑室内施予

将带有引导插管的受试大鼠分成3组，采用输液泵、以5μL/2分的速度，施予松弛素-3施予液(0.05nmol/大鼠、N＝6、1nmol/大鼠、N＝8)或溶剂(vehicle)(生理食盐水、N＝6)各5μL。

(5)Defensive burying试验的实施和行为观察

试验当日，将受试大鼠放入安装有刺激电极的试验箱中(铺垫高5cm)，开始实验。当受试大鼠接触刺激电极时，被施予5mA的电击。然后，在刺激电极保持通5mA电流的条件下放置受试大鼠，并开始15分钟(900秒)的行为观察。受试大鼠的行为全部用摄像机录制下来，用录像带测定从受到最初的电击开始15分钟内的覆盖行为时间(buryingtime(秒))。覆盖行为定义为，受试大鼠用前足向电极方向盖铺垫的行为。在人松弛素-3施予组和溶剂组的比较中，按照Dunnett型多重比较检验法进行显著性差异的检验。图中*表示p＜0.05。如图4所示，与溶剂施予组相比，在人松弛素-3施予组中，发现覆盖行为时间减少，在1nmol施予组中观察到显著减少。该结果表明，松弛素-3具有抗焦虑作用。

[实施例9]采用高架十字迷宫试验研究脑室内施予松弛素-3的抗焦虑作用(小鼠)

采用高架十字迷宫试验，研究了松弛素-3对焦虑作用的影响。高架十字迷宫试验为一种行为药理学试验，其以在开放臂(open arms)中的探索行为(开放臂滞留时间等)为指标，广泛用于实验动物(如，大鼠或小鼠)的焦虑水平的测定、抗焦虑药的药效评价。

(1)受试小鼠和脑室内施予的前处理

在麻醉的7周龄BALB/c雄性小鼠(日本Charles river(株))的侧脑室中插入插管。在对小鼠饲养一周以上后，进行施予松弛素-3的实验。

(2)松弛素-3溶液的调制

将人松弛素-3(ペプチド研究所制)用生理食盐水溶解后，配制成最终浓度为1nmol/小鼠。

(3)松弛素-3溶液的脑室内施予

对带有引导插管的受试小鼠，采用输液泵、以1μL/分的速度施予松弛素-3施予液(N＝8)或溶剂(生理食盐水)(N＝9)各2μL至脑室内。

(4)抗焦虑作用的测定

使用高架十字迷宫进行抗焦虑作用的测定。迷宫设置在离地板45cm高的地方，包括从位于中心的中心平台(5cm×5cm)伸出的以加号(+)形式排列的四个臂。2个对立的开放臂(长30cm×宽5cm)和2个对立的闭合臂(closed arms)(长30cm×宽5cm×壁高15cm)。安装照明以使开放臂的地板为60～80勒克斯。在脑室内施予10分钟后将小鼠放在十字迷宫的中心，面向开放臂的一侧，该试验进行5分钟。试验时间限定于上午11时至16时。小鼠的行为用录像机录制下来，试验结束后通过分析录像，测定各小鼠进入开放臂和闭合臂的次数、在开放臂和闭合臂的滞留时间。图5和图6分别表示进入开放臂和闭合臂的总次数、5分钟内滞留在开放臂的时间比例(％)。在人松弛素-3施予组和溶剂组的比较中，按照t检验法进行显著性差异的检验。在图5和图6中*表示p＜0.05。如图5所示，在人松弛素-3施予组与溶剂组之间，进入开放臂和闭合臂的总次数没有差异。但如图6所示，与溶剂组相比，在人松弛素-3施予组中，在开放臂内滞留的时间比例明显提高。该结果表明，松弛素-3具有抗焦虑作用。

[实施例10]采用高架十字迷宫试验研究脑室内施予松弛素-3的抗焦虑作用(大鼠)

通过高架十字迷宫试验研究了松弛素-3对焦虑作用的影响。

(1)受试大鼠和脑室内施予的前处理

在麻醉的9周龄Wistar雄性大鼠(日本Charles river(株))的侧脑室中插入插管。在饲养一周以上后进行施予松弛素-3的实验。

(2)松弛素-3溶液的配制

将人松弛素-3(ペプチド研究所制)用生理食盐水溶解后，配制成最终浓度为10pmol/大鼠或50pmol/大鼠。

(3)松弛素-3溶液的脑室内施予

对带有引导插管的受试大鼠，采用输液泵、以2.5μL/分的速度施予松弛素-3施予液(10pmol/大鼠、N＝8、50pmol/大鼠、N＝7)或vehicle(生理食盐水、N＝7)各5μL。

(4)抗焦虑作用的测定

使用高架十字迷宫进行抗焦虑作用的测定。迷宫设置在离地板50cm高的地方，包括从位于中心的中心平台(10cm×10cm)伸出的以加号(+)形式排列的四个臂。2个对立的开放臂(长50cm×宽10cm)和2个对立的闭合臂(长50cm×宽10cm×壁高40cm)。安装照明以使开放臂的地板为60～80勒克斯。在脑室内施予10分钟后将小鼠放在十字迷宫的中心，面向开放臂的一侧，该试验进行5分钟。试验时间限定于上午11时至16时。大鼠的行为用录像机录制下来，试验结束后通过分析录像，测定各大鼠进入开放臂和闭合臂的次数、在开放臂和闭合臂的滞留时间。图7和图8分别表示进入开放臂和闭合臂的总次数、5分钟内滞留在开放臂的时间比例(％)。在人松弛素-3施予组和溶剂组的比较中，按照t检验法进行显著性差异的检验。在图7和图8中，*表示p＜0.05。如图7所示，在10pmol/大鼠施予组、50pmol/大鼠施予组与溶剂组之间，进入开放臂和闭合臂的总次数没有差异。但如图8所示，与溶剂组相比，在10pmol/大鼠施予组、50pmol/大鼠施予组中，在开放臂内滞留的时间增加，且对10pmol/大鼠组的作用具有统计学上的显著差异。该结果表明，松弛素-3具有抗焦虑作用。

产业实用性

由于松弛素-3具有抗焦虑作用，例如对于焦虑的治疗是有用的。此外，由于松弛素-3具有抗焦虑作用，激活或抑制松弛素-3受体的化合物或其盐或它们的水合物，可以用于焦虑的治疗；筛选激活或抑制该多肽受体的、与焦虑调节有关的化合物或其盐或它们的水合物的方法以及这种筛选用的试剂盒是有用的。

<110>Eisai R&D Management Co.，Ltd.

<120>具有抗焦虑作用的肽及其筛选方法

<130>158444PX

<160>20

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>429

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(429)

<223>

<400>1

atg gcc agg tac atg ctg ctg ctg ctc ctg gcg gta tgg gtg ctg acc 48

Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr

1 5 10 15

ggg gag ctg tgg ccg gga gct gag gcc cgg gca gcg cct tac ggg gtc 96

Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val

20 25 30

agg ctt tgc ggc cga gaa ttc atc cga gca gtc atc ttc acc tgc ggg 144

Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly

35 40 45

ggc tcc cgg tgg aga cga tca gac atc ctg gcc cac gag gct atg gga 192

Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly

50 55 60

gat acc ttc ccg gat gca gat gct gat gaa gac agt ctg gca ggc gag 240

Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu

65 70 75 80

ctg gat gag gcc atg ggg tcc agc gag tgg ctg gcc ctg acc aag tca 288

Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser

85 90 95

ccc cag gcc ttt tac agg ggg cga ccc agc tgg caa gga acc cct ggg 336

Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly

100 105 110

gtt ctt cgg ggc agc cga gat gtc ctg gct ggc ctt tcc agc agc tgc 384

Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys

115 120 125

tgc aag tgg ggg tgt agc aaa agt gaa atc agt agc ctt tgc tag 429

Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys

130 135 140

<210>2

<211>142

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr

1 5 10 15

Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val

20 25 30

Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly

35 40 45

Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys

130 135 140

<210>3

<211>1410

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1410)

<223>

<400>3

atg cag atg gcc gat gca gcc acg ata gcc acc atg aat aag gca gca 48

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1 5 10 15

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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Arg Lys Ser Ser Ile Asn Leu Phe Val Thr Asn Leu Ala Leu Thr Asp

115 120 125

ttt cag ttt gtg ctc acc ctg ccc ttc tgg gcg gtg gag aac gct ctt 432

Phe Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Glu Asn Ala Leu

130 135 140

gac ttc aaa tgg ccc ttc ggc aag gcc atg tgt aag atc gtg tcc atg 480

Asp Phe Lys Trp Pro Phe Gly Lys Ala Met Cys Lys Ile Val Ser Met

145 150 155 160

gtg acg tcc atg aac atg tac gcc agc gtg ttc ttc ctc act gcc atg 528

Val Thr Ser Met Asn Met Tyr Ala Ser Val Phe Phe Leu Thr Ala Met

165 170 175

agt gtg acg cgc tac cat tcg gtg gcc tcg gct ctg aag agc cac cgg 576

Ser Val Thr Arg Tyr His Ser Val Ala Ser Ala Leu Lys Ser His Arg

180 185 190

acc cga gga cac ggc cgg ggc gac tgc tgc ggc cgg agc ctg ggg gac 624

Thr Arg Gly His Gly Arg Gly Asp Cys Cys Gly Arg Ser Leu Gly Asp

195 200 205

agc tgc tgc ttc tcg gcc aag gcg ctg tgt gtg tgg atc tgg gct ttg 672

Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu

210 215 220

gcc gcg ctg gcc tcg ctg ccc agt gcc att ttc tcc acc acg gtc aag 720

Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys

225 230 235 240

gtg atg ggc gag gag ctg tgc ctg gtg cgt ttc ccg gac aag ttg ctg 768

Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu

245 250 255

ggc cgc gac agg cag ttc tgg ctg ggc ctc tac cac tcg cag aag gtg 816

Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val

260 265 270

ctg ttg ggc ttc gtg ctg ccg ctg ggc atc att atc ttg tgc tac ctg 864

Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu

275 280 285

ctg ctg gtg cgc ttc atc gcc gac cgc cgc gcg gcg ggg acc aaa gga 912

Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly

290 295 300

ggg gcc gcg gta gcc gga gga cgc ccg acc gga gcc agc gcc cgg aga 960

Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg

305 310 315 320

ctg tcg aag gtc acc aaa tca gtg acc atc gtt gtc ctg tcc ttc ttc 1008

Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe

325 330 335

ctg tgt tgg ctg ccc aac cag gcg ctc acc acc tgg agc atc ctc atc 1056

Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile

340 345 350

aag ttc aac gcg gtg ccc ttc agc cag gag tat ttc ctg tgc cag gta 1104

Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val

355 360 365

tac gcg ttc cct gtg agc gtg tgc cta gcg cac tcc aac agc tgc ctc 1152

Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu

370 375 380

aac ccc gtc ctc tac tgc ctc gtg cgc cgc gag ttc cgc aag gcg ctc 1200

Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu

385 390 395 400

aag agc ctg ctg tgg cgc atc gcg tct cct tcg atc acc agc atg cgc 1248

Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg

405 410 415

ccc ttc acc gcc act acc aag ccg gag cac gag gat cag ggg ctg cag 1296

Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln

420 425 430

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Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr

435 440 445

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Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro

450 455 460

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465

<210>4

<211>469

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Met Gln Met Ala Asp Ala Ala Thr Ile Ala Thr Met Asn Lys Ala Ala

1 5 10 15

Gly Gly Asp Lys Leu Ala Glu Leu Phe Ser Leu Val Pro Asp Leu Leu

20 25 30

Glu Ala Ala Asn Thr Ser Gly Asn Ala Ser Leu Gln Leu Pro Asp Leu

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Gly Leu Glu Leu Pro Asp Gly Ala Pro Pro Gly His

50 55 60

Pro Pro Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ser Ala Asp Thr Glu Ala Arg Val

65 70 75 80

Arg Ile Leu Ile Ser Val Val Tyr Trp Val Val Cys Ala Leu Gly Leu

85 90 95

Ala Gly Asn Leu Leu Val Leu Tyr Leu Met Lys Ser Met Gln Gly Trp

100 105 110

Arg Lys Ser Ser Ile Asn Leu Phe Val Thr Asn Leu Ala Leu Thr Asp

115 120 125

Phe Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Glu Asn Ala Leu

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu

210 215 220

Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys

225 230 235 240

Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu

245 250 255

Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val

260 265 270

Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu

275 280 285

Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly

290 295 300

Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg

305 310 315 320

Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe

325 330 335

Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile

340 345 350

Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val

355 360 365

Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu

370 375 380

Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu

385 390 395 400

Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg

405 410 415

Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln

420 425 430

Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr

435 440 445

Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro

450 455 460

Ser Ser Ser Ala Tyr

465

<210>5

<211>27

<212>PRT

<213>智人

<400>5

Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg

1 5 10 15

Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp

20 25

<210>6

<211>24

<212>PRT

<213>智人

<400>6

Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Lys Trp Gly Cys Ser

1 5 10 15

Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys

20

<210>7

<211>24

<212>PRT

<213>智人

<400>7

Arg Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Lys Cys Cys Leu Ile Gly Cys Thr

1 5 10 15

Lys Arg Ser Leu Ala Lys Tyr Cys

20

<210>8

<211>24

<212>PRT

<213>智人

<400>8

Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr

1 5 10 15

Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys

20

<210>9

<211>22

<212>PRT

<213>智人

<400>9

Ala Thr Asn Pro Ala Arg Tyr Cys Cys Leu Ser Gly Cys Thr Gln Gln

1 5 10 15

Asp Leu Leu Thr Leu Cys

20

<210>10

<211>20

<212>PRT

<213>智人

<400>10

Gly Tyr Ser Glu Lys Cys Cys Leu Thr Gly Cys Thr Lys Glu Glu Leu

1 5 10 15

Ser Ile Ala Cys

20

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>人工的(Artificial)

<220>

<223>有义引物(sense primer)

<400>11

gatatcgccg ccaccatgca gatggccgat gcagccac 38

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义引物(antisense primer)

<400>12

gatatctcag taggcagagc tgctgggc 28

<210>13

<211>5020

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>pBabe Puro

<400>13

ctgcagcctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca 60

gggccaagaa cagatggaac agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt 120

tcctgccccg gctcagggcc aagaacagat ggtccccaga tgcggtccag ccctcagcag 180

tttctagaga accatcagat gtttccaggg tgccccaagg acctgaaatg accctgtgcc 240

ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga 300

gctcaataaa agagcccaca acccctcact cggggcgcca gtcctccgat tgactgagtc 360

gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct cttgcagttg catccgactt gtggtctcgc 420

tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat tgactacccg tcagcggggg tctttcattt 480

gggggctcgt ccgggatcgg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg 540

taagctggcc agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg actgatttta 600

tgcgcctgcg tcggtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa 660

ctgacgagtt ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc 720

gtttttgtgg cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg 780

tggttctggt aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt 840

cggtttggaa ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagca tcgttctgtg ttgtctctgt 900

ctgactgtgt ttctgtattt gtctgaaaat tagggccaga ctgttaccac tcccttaagt 960

ttgaccttag atcactggaa agatgtcgag cggctcgctc acaaccagtc ggtagatgtc 1020

aagaagagac gttgggttac cttctgctct gcagaatggc caacctttaa cgtcggatgg 1080

ccgcgagacg gcacctttaa ccgagacctc atcacccagg ttaagatcaa ggtcttttca 1140

cctggcccgc atggacaccc agaccaggtc ccctacatcg tgacctggga agccttggct 1200

tttgaccccc ctccctgggt caagcccttt gtacacccta agcctccgcc tcctcttctt 1260

ccatccgcgc cgtctctccc ccttgaacct cctctttcga ccccgcctca atcctccctt 1320

tatccagccc tcactccttc tctaggcgcc ggccggatcc cagtgtggtg gtacgtagga 1380

attcgccagc acagtggtcg acctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc 1440

aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg 1500

tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1560

agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 1620

ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 1680

ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa 1740

acgctgcttg aggctgaagg tgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1800

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1860

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1920

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1980

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2040

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2100

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2160

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 2220

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 2280

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 2340

acgatcgata aaataaaaga ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa tgaaagaccc 2400

cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac 2460

ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg 2520

gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg 2580

aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 2640

gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc cagccctcag cagtttctag agaaccatca 2700

gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 2760

tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 2820

acaacccctc actcggggcg ccagtcctcc gattgactga gtcgcccggg tacccgtgta 2880

tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga cttgtggtct cgctgttcct tgggagggtc 2940

tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg gggtctttca catgcagcat gtatcaaaat 3000

taatttggtt ttttttctta agtatttaca ttaaatggcc atagttgcat taatgaatcg 3060

gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 3120

actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 3180

tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 3240

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 3300

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 3360

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 3420

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 3480

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 3540

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 3600

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 3660

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 3720

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 3780

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 3840

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 3900

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 3960

tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagtttgcg gccgcaaatc aatctaaagt 4020

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 4080

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 4140

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 4200

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 4260

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 4320

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 4380

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 4440

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 4500

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 4560

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 4620

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg 4680

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 4740

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 4800

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 4860

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 4920

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 4980

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 5020

<210>14

<211>83

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>CREx2hb的有义链

<400>14

cccaagcttg atatcgaatt cgacgtcaca gtatgacggc catgggaatt cgacgtcaca 60

gtatgacggc catggggatc ccg 83

<210>15

<211>83

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>CREx2hb的反义链

<400>15

cgggatcccc atggccgtca tactgtgacg tcgaattccc atggccgtca tactgtgacg 60

tcgaattcga tatcaagctt ggg 83

<210>16

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>CREx2bp的有义链

<400>16

tgcactgcag gaattcccat ggccgtcata ctgtgacgtc gaattcccat ggccgtcata 60

ctgtgacgtc ggatcccg 78

<210>17

<211>78

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>CREx2bp的反义链

<400>17

cgggatccga cgtcacagta tgacggccat gggaattcga cgtcacagta tgacggccat 60

gggaattcct gcagtgca 78

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>有义引物

<400>18

tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg 30

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义引物

<400>19

tgcactgcag gtcggagctg actgttctgg 30

<210>20

<211>264

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>血管活性肠肽启动子

<400>20

tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg tgacgtcttt cagagcactt tgtgattgct 60

cagtcctaag tataagccct ataaaatgat gggctttgaa atgctggtca gggtagagtg 120

agaagcacca gcaggcagta acagccaacc cttagccatt gctaagggca gagaactggt 180

ggagcctttc tcttactccc aggacttcag cacctaagac agctccaaaa caaaccagaa 240

cagtcagctc cgacctgcag tgca 264

Claims

1.抗焦虑剂，其含有松弛素-3、其盐或它们的水合物。

2.权利要求1所述的抗焦虑剂，其中，松弛素-3为人松弛素-3。

3.权利要求1所述的抗焦虑剂，其中，松弛素-3为一种多肽，该多肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。

4.具有抗焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方法，该方法包括如下步骤：

(B)测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤。

5.抑制或促进焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：

6.权利要求5所述的筛选方法，其中松弛素-3为人松弛素-3。

7.权利要求5所述的筛选方法，其中松弛素-3为一种多肽，该多肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。

8.权利要求5～7中任一项所述的抑制或促进焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方法，其进一步包含如下步骤：

(B)测定松弛素-3受体介导的细胞刺激活性的步骤。

9.权利要求4～8中任一项所述的筛选方法，其中，松弛素-3受体为抑生长素一血管生成素样肽受体(SALPR)或其部分多肽。

10.权利要求9所述的筛选方法，其中，SALPR为包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽。

11.具有抗焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选用试剂盒，其包含松弛素-3受体、含有松弛素-3受体的细胞或该细胞的膜级分。

12.权利要求11所述的筛选用试剂盒，其进一步包含松弛素-3、其盐或它们的水合物。

13.权利要求12所述的筛选用试剂盒，其中，松弛素-3为人松弛素-3。

14.权利要求12所述的筛选用试剂盒，其中，松弛素-3为一种多肽，该多肽由可从松弛素-3前原蛋白的功能等价修饰多肽得到的A链和B链构成，或由可从松弛素-3前原蛋白的同源多肽得到的A链和B链构成，其中，A链和B链的半胱氨酸残基通过二硫键结合。

15.权利要求12～14中任一项所述的筛选用试剂盒，其中，松弛素-3被标记。

16.权利要求11～15中任一项所述的筛选用试剂盒，其中，松弛素-3受体为SALPR或其部分多肽。

17.权利要求16所述的筛选用试剂盒，其中，SALPR为包含SEQ IDNO：4所示氨基酸序列的多肽。

18.抑制或促进焦虑作用的化合物或其盐或它们的水合物的筛选方法，该方法包括将作用于松弛素-3受体的化合物施予人或人以外的生物，并测定施予后的焦虑作用的步骤。

19.权利要求18所述的筛选方法，其中测定焦虑作用的步骤包括defensive burying test或高架十字迷宫实验。

20.权利要求18或19所述的筛选方法，其中作用于松弛素-3受体的化合物是根据权利要求4～10中任一项所述的方法得到的化合物。