KR20080010441A - 항불안 작용을 갖는 펩티드 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

항불안 작용을 갖는 펩티드 및 이의 스크리닝 방법 Download PDF

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KR20080010441A
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도루 아라이
도모꼬 세끼야
에이끼 다까하시
고도 시까따
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에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 항불안 작용을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 함유하는 치료제, 상기 폴리펩티드를 이용하는 불안의 치료 방법, 상기 폴리펩티드 수용체의 활성화 또는 억제화시킬 수 있는 불안 조절에 관련된 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물을 스크리닝하는 방법 및 그의 스크리닝용 키트 등을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따르면, 릴락신-3을 함유하는 항불안제가 제공된다.
항불안 작용, 릴락신-3, SALPR, 스크리닝용 키트

Description

항불안 작용을 갖는 펩티드 및 이의 스크리닝 방법 {PEPTIDE HAVING ANTI-ANXIETY EFFECT AND METHOD FOR SCREENING THEREOF}
본 발명은 항불안 작용을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 이용하는 불안의 치료 방법, 상기 폴리펩티드 수용체를 활성화 또는 억제화시키는 불안 조절에 관련된 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물을 스크리닝하는 방법 및 그의 스크리닝용 키트 등에 관한 것이다.
뇌 장관 호르몬, 케모카인, 신경 펩티드나 신경 전달 물질 등의 생리 활성 물질은 세포막에 존재하는 특이적인 수용체를 통해 기능을 발휘한다. 이들 수용체 중에서 세포막을 7회 관통하는 구조를 가지고, 세포 내에서 3량체 G 단백질과 공액하는 수용체는 특히 G 단백질 공액형 수용체(GPCR)로 분류되어 있다. GPCR은 특이적인 리간드가 결합하였을 때에 세포 내에 신호를 전달하여 세포의 활성화나 억제화를 행함으로써, 각종 장기·기관에서의 기능 발현에 중요한 역할을 담당하고 있다. 그 때문에 GPCR을 활성화하는 아고니스트나 억제하는 길항제라 불리는 물질은 의약품으로서 사용되고 있다. GPCR로 분류되는 수용체 중에서도 그의 특이적인 리간드가 미동정된 것이 수많이 알려져 있고, 이들은 고아(orphan) GPCR라 불리고 있다. 고아 GPCR은 새로운 치료약의 타겟으로서 가능성을 가지고 있고, 생체 내의 리간드 동정이나 기능을 활성화 또는 억제하는 물질의 연구가 진행되었다. 이와 같이 하여 동정된 리간드나 물질을 생체에 투여하여 수용체와 그의 리간드 기능을 해명하는 것은, 의약품 개발을 제공하기 위해 매우 중요하다.
최근의 유전자 서열 정보 충실에 의해, 기지의 단백질·펩티드 서열을 바탕으로 그의 상동성이나 법칙성을 유도해내고, 미지의 펩티드나 단백질을 예측하여 GPCR의 새로운 리간드로서 동정하는 방법도 가능해졌다. 인슐린·릴락신(Insulin·Relaxin) 패밀리에 속하는 릴락신은 황체나 태반으로부터 생산되는 분비 펩티드이고, 임신 유지와 출산에 관한 작용을 갖는 것이 이전부터 알려져 있었다. 릴락신을 코딩하는 DNA의 염기 서열을 바탕으로 유전자 서열 데이타베이스로부터 새롭게 동정된 DNA 서열을 코딩하는 단백질이, 릴락신-3(또는 INSL7이라고도 함)이라 명명된 폴리펩티드이다(국제 공개 제01/068862호 공보). 성숙형 또는 활성형 릴락신-3은 릴락신-3의 프리프로프로테인(preproprotein)으로부터 절단된 B쇄 및 A쇄로 구성되고, 상기 B쇄 및 상기 A쇄가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드이다. 릴락신-3은 면역 세포계인 THP-1의 세포 내 시클릭 AMP(cAMP)의 상승을 수반하여 세포를 활성화하는 것으로 보고되었다(국제 공개 제01/81562호 공보, [Bathgate et. al., J. Biol. Chem., 277, p.1148-1157, 2002]). 그 후, 릴락신-3은 릴락신-2와 함께, GPCR인 LGR7에 결합하는 리간드 중 하나인 것이 개시됨과 동시에, 릴락신-3에 의한 cAMP의 상승에는 LGR7이 관여된 것이 개시되었다(Sudo et al., J. Biol. Chem., 278, p.7855-7862, 2003). LGR7은 뇌와 말초 조직에 발현되고, 지금까지는 생식 기관의 발달이나 임신·출산에 관한 것이 시사되었지만, 정신 증상과의 관련에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
최근, 생체 내의 리간드가 미동정된 GPCR이었던, SALPR(GPCR135)이라 명명된 수용체나 GPR100(hGPCR11, GPCR142)이라 불리는 수용체의 리간드가 릴락신-3인 것이 보고되었다([Takeda et al., FEBS Letter, 520, p.97-101, 2002], [Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003], [Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003], 국제 공개 제2004/082598호 공보). 또한, 릴락신-3에 의한 cAMP의 저하에는 SALPR[Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003]이나 GPR100[Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003]이 관여하고 있는 것이 보고되었다. 또한, 국제 공개 제00/24891호 공보, 국제 공개 제01/48189호 공보, 국제 공개 제02/31111호 공보 및 국제 공개 제02/61087호 공보에도 이들 수용체에 관련된 기재가 있다. SALPR은 뇌에 국재하는 것으로 알려져 있고[Matsumoto et al., Gene, 248, p.183-189, 2000], 특히 시상 하부의 실방핵과 시색상핵에 존재하는 것으로 보고되었다(국제 공개 제2004/082598호 공보, [Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003]). 또한, SALPR에의 선택적인 결합을 나타내는 릴락신-3과 INSL5의 키메라 펩티드를 이용하여, 펩티드의 뇌 내에서의 결합 영역을 나타냄으로써 SALPR의 발현을 조사하는 보고도 있지만[Sutton et al., Neuroendocrinology, 180, p.298-307, 2004], SALPR의 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 한편, GPR100은 전신성으로 발현되는 수용체인 것으로 보고되었지만([Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003], [Boels et al., Br. J. Pharamacol., 140, p.932-938, 2003]), GPR100의 기능에 대해서도 불명한 그대로이다.
한편, 릴락신-3은 뇌 내의 특정 영역에 존재하는 것으로 보고되었고[Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003], 릴락신-3이 뇌 내 펩티드로서 중추신경계에 어떠한 기능을 발휘하고 있을 가능성은 생각되었지만, 지금까지 릴락신-3이 불안이나 우울을 시작으로 하는 정신 상태를 조절하는가의 여부에 대해서는 알려져 있지 않았다.
<발명의 개요>
본 발명은 항불안 작용을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 함유하는 치료제, 상기 폴리펩티드를 이용하는 불안의 치료 방법, 상기 폴리펩티드 수용체를 활성화 또는 억제화시키는 불안 조절에 관련된 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물을 스크리닝하는 방법 및 그의 스크리닝용 키트 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 릴락신-3을 래트 또는 마우스 뇌실 내에 투여하고, 불안 야기 작용, 항불안 작용을 평가하기 위한 실험계에서 투여 후의 상기 래트 또는 상기 마우스의 행동을 관찰함으로써, 릴락신-3이 항불안 작용을 갖는 것을 발견하였다. 본 발명은 이들 발견에 기초하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명에 따르면, 이하의 발명이 제공된다.
(1) 릴락신-3, 그의 염 또는 이들의 수화물을 함유하는 항불안제.
(2) 릴락신-3이 인간형 릴락신-3인 상기 (1)에 기재된 항불안제.
(3) 릴락신-3이 릴락신-3의 프리프로프로테인과 기능적으로 등가인 개질 폴 리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지거나 또는 릴락신-3의 프리프로프로테인의 상동 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지는 폴리펩티드이며, 여기서 A쇄 및 B쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드인 상기 (1)에 기재된 항불안제.
(4) (A) 피검 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획에 접촉시키는 단계; 및
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항불안 작용을 갖는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
(4') (A) 피검 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획에 접촉시키는 단계;
(B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 단계; 및
(C) 릴락신-3 수용체(예를 들면 소마토스타틴- 및 안지오제닌-유사 펩티드 수용체(SALPR))를 통한 세포 자극 활성이 아데닐산시클라제의 활성 억제를 나타낸 경우에, 상기 피검 물질이 불안 작용을 억제하는 작용을 갖는 화합물이라고 판정하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항불안 작용을 갖는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
(5) (A) 릴락신-3, 그의 염 또는 이들의 수화물과 피검 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획에 접촉시키는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 불안 작용을 억제 또는 촉진시키는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
(6) 릴락신-3이 인간형 릴락신-3인 상기 (5)에 기재된 스크리닝 방법.
(7) 릴락신-3이 릴락신-3의 프리프로프로테인과 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지거나 또는 릴락신-3의 프리프로프로테인의 상동 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지는 폴리펩티드이며, 여기서 A쇄 및 B쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드인 상기 (5)에 기재된 스크리닝 방법.
(8) (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 단계
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 (5) 내지 (7) 중 어느 한 항에 기재된 불안 작용을 억제 또는 촉진시키는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
(8') (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 단계; 및
(C) 릴락신-3 수용체(예를 들면 SALPR)를 통한 세포 자극 활성이 아데닐산시클라제의 활성 억제를 나타낸 경우에, 상기 피검 물질이 불안 작용을 억제하는 작용을 갖는 화합물이라고 판정하는 단계
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 (5) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 불안을 억제하는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
(9) 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 상기 (4), (4'), (5), (6), (7), (8) 및 (8') 중 어느 하나에 기재된 스크리 닝 방법.
(10) SALPR이 서열 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 상기 (9)에 기재된 스크리닝 방법.
(11) 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항불안 작용을 갖는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝용 키트.
(12) 릴락신-3, 그의 염 또는 이들의 수화물을 더 포함하는 상기 (11)에 기재된 스크리닝용 키트.
(13) 릴락신-3이 인간형 릴락신-3인 상기 (12)에 기재된 스크리닝용 키트.
(14) 릴락신-3이 릴락신-3의 프리프로프로테인과 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지거나 또는 릴락신-3의 프리프로프로테인의 상동 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지는 폴리펩티드이며, 여기서 A쇄 및 B쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드인 상기 (12)에 기재된 스크리닝용 키트.
(15) 릴락신-3이 표지되어 있는 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 스크리닝용 키트.
(16) 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 상기 (11) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 스크리닝용 키트.
(17) SALPR이 서열 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 상기 (16)에 기재된 스크리닝용 키트.
(18) 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물을 인간 또는 인간 이외의 생물에게 투여하는 단계; 및 투여 후의 불안 작용을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 불안 작용을 억제 또는 촉진시키는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
(19) 불안 작용을 측정하는 공정이 방어적으로 덮어 숨기는 시험(defensive burying test) 또는 고가식 십자 미로 시험(elevated plus-maze test)인 상기 (18)에 기재된 스크리닝 방법.
(20) 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물이 상기 (4), (4'), (5), (6), (7), (8), (8'), (9) 및 (10) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 화합물인 상기 (18) 또는 (19)에 기재된 스크리닝 방법.
도 1은 pBabeCL(SALPR)IH의 구축도를 나타낸다.
도 2A는 CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)의 구축도를 나타낸다.
도 2B는 pBabeCLX의 구축도를 나타낸다.
도 2C는 pBabeCLcre4vPdNN의 구축도를 나타낸다.
도 3은 SALPR을 발현시킨 SE302 세포에 있어서의 포스콜린(forskolin) 첨가에 의해서 상승된 전사 활성의 릴락신-3에 의한 특이적인 용량 의존적 억제를 나타낸다. 흑사각은 릴락신-3을 첨가한 경우를 나타낸다. 백사각은 인슐린을 첨가한 경우를 나타낸다. 횡축의 숫자는 첨가한 각 리간드의 최종 농도(nmol/L)를 나타낸다. 종축은 포스콜린 1 μmol/L를 첨가한 세포 상등액의 알칼리 포스파타제의 활 성을 100, 포스콜린을 첨가하지 않은 세포 상등액의 활성을 0이라 하여 산출한 상대적 활성을 나타낸다. 각 점은 평균값(N=3)과 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 방어적으로 덮어 숨기는 시험을 이용한, 래트 뇌실 내에의 릴락신-3의 단회 투여에 의한 항불안 작용을 나타낸다. 백사각은 대조(비히클) 투여군을, 사선형 사각은 릴락신-3의 0.05 nmol 투여군을, 흑사각은 릴락신-3의 1 nmol 투여군을 나타낸다. 종축은 각 군의 피검 동물이 전극을 마루깔기로 덮어 숨기는 시간(초)의 평균값과 표준 오차를 나타낸다. 도면 중에 있어서 *는 인간형 릴락신-3 투여군이 대조(비히클) 투여군에 유의차(둔넷(Dunnett)형 다중 비교 검정, P<0.05)가 있는 것을 의미한다.
도 5는 마우스를 이용한 고가식 십자 미로 시험(5 분간)에 있어서의 오픈 및 클로즈드 아암에의 진입 횟수의 합계를 나타낸 도면이다.
도 6은 마우스를 이용한 고가식 십자 미로 시험(5 분간)에 있어서의 오픈 아암에 있어서의 체재 시간의 비율을 나타낸 도면이다. 도면 중에 있어서 *는 인간형 릴락신-3 투여군이 대조(비히클) 투여군에 유의차(t 검정, P<0.05)가 있는 것을 의미한다.
도 7은 래트를 이용한 고가식 십자 미로 시험에 있어서의 오픈 및 클로즈드 아암에의 진입 횟수의 합계를 나타낸 도면이다.
도 8은 래트를 이용한 고가식 십자 미로 시험(5 분간)에 있어서의 오픈 아암에 있어서의 체재 시간의 비율을 나타낸 도면이다. 도면 중에 있어서 *는 인간형 릴락신-3 투여군이 대조(비히클) 투여군에 유의차(둔넷형 다중 비교 검정, P<0.05) 가 있는 것을 의미한다.
릴락신 -3
본 발명에 사용된 용어 「릴락신-3」은 릴락신-3(또는 INSL7이라고도 함)이라 명명된 폴리펩티드이고, 성숙형 또는 활성형 릴락신-3을 의미한다.
구체적으로는, 본 발명에 사용된 용어 「릴락신-3」은 서열 2의 N 말단으로부터 제26번째(Arg) 내지 제52번째(Trp)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드의 상동 폴리펩티드(이하, 간단하게 「B쇄」라고 약기하는 경우가 있음) 및 서열 2의 N 말단으로부터 제119번째(Asp) 내지 제142번째(Cys)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드의 상동 폴리펩티드(이하, 간단하게 「A쇄」라고 약기하는 경우가 있음)를 갖는 폴리펩티드로서, B쇄 및 A쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 의미한다. 디술피드 결합은 B쇄 및 A쇄의 시스테인 잔기가 분자 사이 및 분자 내에서 결합되어 있는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 릴락신-3은 서열 2의 N 말단으로부터 제26번째(Arg) 내지 제52번째(Trp)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄)와 서열 2의 N 말단으로부터 제119번째(Asp) 내지 제142번째(Cys)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 A쇄)가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 의미하고, B쇄 및 A쇄의 시스테인 잔기가 분자 사이 및 분자 내에서 디술피드 결합을 형성한 폴리펩티드이다. 상기 디술피드 결합은 서열 2의 N 말단으로부터 제35번째의 B쇄의 시스테인과 서열 2의 N 말단으로부터 제129번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 2의 N 말단으로부터 제47번째의 B쇄의 시스테인과 서열 2의 N 말단으로부터 제142번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 그리고 서열 2의 N 말단으로부터 제128번째의 A쇄의 시스테인과 서열 2의 N 말단으로부터 제133번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 것이 바람직하다.
본 발명의 릴락신-3으로서는 하기의 것을 들 수 있다. (숫자는 디술피드 결합하는 시스테인 잔기를 나타내고, 동일한 숫자끼리의 시스테인 잔기가 디술피드 결합한다.)
[인간형 릴락신-3]
Figure 112007084540181-PCT00001
B쇄 및 A쇄의 아미노산 서열은 본 발명의 릴락신-3의 프리프로프로테인의 아미노산 서열에 포함된다. 본 발명의 릴락신-3의 프리프로프로테인은 서열 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 프리프로프로테인)(진뱅크 접속 번호 NM_080864) 또는 상기 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 상동 폴리펩티드(이하, 간단하게 「프리프로프로테인」이라 약기하는 경우도 있음)를 들 수 있다. 본 발명의 릴락신-3은 상기 프리프로프로테인으로부터 절단된 B쇄 및 A쇄를 포함하는 폴리펩티드로서, B쇄 및 A쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 및 프리프로프로테인은 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유 동물(예를 들면 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에서 유래하는 천연 유래의 폴리펩티드일 수도 있고, 재조합 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드일 수도 있다. 본 발명의 릴락신-3에는 본 발명의 릴락신-3의 염이 포함되고, 또한 본 발명의 릴락신-3 또는 그의 염은 당쇄를 갖지 않는 것과 당쇄를 갖는 것 둘다 포함한다. 염에 대해서는, 후술하는 염에 대한 기재를 참조할 수 있다. 또한, 본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 및 프리프로프로테인에는, N 말단 환상 글루타민화, C 말단 아미드화 등, 분비 단백질의 프로세싱을 받은 형태의 폴리펩티드를 포함한다.
상술한 「기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드」란, 서열 2의 N 말단으로부터 제26번째(Arg) 내지 제52번째(Trp)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄), 서열 2의 N 말단으로부터 제119번째(Asp) 내지 제142번째(Cys)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 A쇄) 또는 서열 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 프리프로프로테인)를 갖는 폴리펩티드로서, 이들 중 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열이며, 또한 B쇄 및 A쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 의미하는데, 이는 본 발명의 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성[예를 들면 릴락신-3 수용체와의 결합능 및 그와 연관된 각종 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 Ca2 +의 유리, 아데닐산시클라제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨 인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도/활성, 아라키돈산 유리 등), 불안 작용의 조절]을 갖는 것이면, 상술한 생물 유래의 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드 중 어느 것이어도 좋다.
서열 2의 N 말단으로부터 제26번째(Arg) 내지 제52번째(Trp)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄), 서열 2의 N 말단으로부터 제119번째(Asp) 내지 제142번째(Cys)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 A쇄) 또는 서열 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 프리프로프로테인)의 아미노산 서열이 결실, 치환 및/또는 삽입되는 경우에는, 그의 위치는 특별히 한정되지 않지만, 상기 아미노산 서열 중의 시스테인 잔기 이외의 아미노산 잔기를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「치환」은, 바람직하게는 펩티드 활성을 실질적으로 변화시키지 않도록 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개)의 아미노산 잔기를 다른 화학적으로 상동인 아미노산 잔기로 치환하는 보존적 치환을 의미한다. 예를 들면, 어떤 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기에 의해 치환하는 경우, 어떤 극성 잔기를 동일한 전하를 갖는 다른 극성 잔기에 의해 치환하는 경우 등을 들 수 있다. 이러한 치환을 행할 수 있는 기능적으로 상동인 아미노산은 아미노산마다 상기 기술 분야에서 공지되어 있다. 구체적인 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산으로서는, 알라닌, 발린, 이소루신, 루신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성(중성) 아미노산으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 들 수 있다. 양전하를 갖는 (염기성) 아미노산으로서는, 아르기닌, 히스티딘, 리신 등을 들 수 있다. 또한, 음전하를 갖는 (산성) 아미노산으로서는, 아스파르트산, 글루탐산 등을 들 수 있다.
상기 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가될 수도 있는 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 2개이다.
상술한 「상동 폴리펩티드」란, 서열 2의 N 말단으로부터 제26번째(Arg) 내지 제52번째(Trp)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄), 서열 2의 N 말단으로부터 제119번째(Asp) 내지 제142번째(Cys)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 A쇄) 또는 서열 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 프리프로프로테인)의 아미노산 서열에 대하여 70 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며, 또한 B쇄 및 A쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 의미하는데, 이는 본 발명의 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3 수용체와의 결합능 및 그와 연관된 각종 세포 자극 활성, 불안 작용의 조절)을 갖는 것이면, 상술한 생물 유래의 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드 중 어느 것이어도 좋다.
본 명세서에 있어서 「상동성」(「동일성」이라 하는 경우도 있음)의 수치는 모두 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 이용하여 산출되는 수치일 수 있고, 예를 들면 전미(全米) 생물공학 정보 센터(NCBI)의 상동성 알고리즘 BLAST(Basic local alignment search tool) http://www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/에 있어서 디폴트(default)의 파라미터를 이용함으로써 산출할 수 있다.
상술한 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드 또는 상동 폴리펩티드의 B쇄, A쇄, 릴락신-3 또는 프리프로프로테인의 바람직한 예로서는, 예를 들면 그 자체 공지된 마우스, 래트 또는 돼지 기원의 B쇄, A쇄, 릴락신-3 또는 그의 프리프로프로테인(국제 공개 제01/81562호 공보)이나, 릴락신-1, 릴락신-2, 또는 인슐린 유사 펩티드 3(INSL-3)의 프리프로프로테인 또는 B쇄(국제 공개 제2006/026355호 공보) 등을 들 수 있다.
「릴락신-3의 프리프로프로테인과 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지거나 또는 릴락신-3의 프리프로프로테인의 상동 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지는 폴리펩티드이며, 여기서 A쇄 및 B쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드」는 바람직하게는 본 발명의 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3 수용체와의 결합능 및 그와 연관된 각종 세포 자극 활성, 불안 작용의 조절)을 갖는 하기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드이다:
(1) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 개질 인간형 B쇄, 및 서열 6의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 A쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 개질 인간형 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 6의 N 말단으로부터 제11번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 6의 N 말단으로부터 제24번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 6의 N 말단으로부터 제10번째의 A쇄의 시스테인과 서열 6의 N 말단으로부터 제15번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드; 및
(2) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 B쇄, 및 서열 6의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 A쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 6의 N 말단으로부터 제11번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 6의 N 말단으로부터 제24번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 6의 N 말단으로부터 제10번째의 A쇄의 시스테인과 서열 6의 N 말단으로부터 제15번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드.
또한, 「릴락신-3의 프리프로프로테인과 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지거나 또는 릴락신-3의 프리프로프로테인의 상동 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지는 폴리펩티드이며, 여기서 A쇄 및 B쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드」의 예로서는 국제 공개 제2006/026355호 공보나 [Changlu Liu et al., Mo1 Pharmacol. 67(1): 231-40(2005)]에 개시된 릴락신-3의 키메라 펩티드를 들 수 있다.
릴락신-3의 키메라 펩티드는 바람직하게는 본 발명의 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3 수용체와의 결합능 및 그와 연관된 각종 세포 자극 활성, 불안 작용의 조절)을 갖는 이하 (3) 내지 (10)의 폴리펩티드이다:
(3) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 개질 인간형 B쇄, 및 서열 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 릴락신-1의 A쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 개질 인간형 릴락신-1의 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 7의 N 말단으로부터 제11번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 7의 N 말단으로부터 제24번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 7의 N 말단으로부터 제10번째의 A쇄의 시스테인과 서열 7의 N 말단으로부터 제15번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드;
(4) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 B쇄, 및 서열 7의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 릴락신-1의 A쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 릴락신-1의 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 7의 N 말단으로부터 제11번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 7의 N 말단으로부터 제24번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 7의 N 말단으로부터 제10번째의 A쇄의 시스테인과 서열 7의 N 말단으로부터 제15번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드;
(5) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 개질 인간형 B쇄, 및 서열 8의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 릴락신-2의 A쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 개질 인간형 릴락신-2의 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 8의 N 말단으로부터 제11번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 8의 N 말단으로부터 제24번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 8의 N 말단으로부터 제10번째의 A쇄의 시스테인과 서열 8의 N 말단으로부터 제15번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드;
(6) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 B쇄, 및 서열 8의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 릴락신-2의 A쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 릴락신-2의 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 8의 N 말단으로부터 제11번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 8의 N 말단으로부터 제24번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 8의 N 말단으로부터 제10번째의 A쇄의 시스테인과 서열 8의 N 말단으로부터 제15번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드;
(7) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 개질 인간형 B쇄, 및 서열 9의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 인슐린 유사 펩티드 3의 개질 A쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 개질 인간형 인슐린 유사 펩티드 3의 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 9의 N 말단으로부터 제9번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 9의 N 말단으로부터 제22번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 9의 N 말단으로부터 제8번째의 A쇄의 시스테인과 서열 9의 N 말단으로부터 제13번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드;
(8) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 B쇄, 및 서열 9의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 인슐린 유사 펩티드 3의 개질 A쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 인슐린 유사 펩티드 3의 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 9의 N 말단으로부터 제9번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 9의 N 말단으로부터 제22번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 9의 N 말단으로부터 제8번째의 A쇄의 시스테인과 서열 9의 N 말단으로부터 제13번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드;
(9) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 개질 인간형 B쇄, 및 서열 10의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 인슐린 유사 펩티드 6의 개질 A쇄) 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개, 보다 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 개질 인간형 인슐린 유사 펩티드 6의 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 10의 N 말단으로부터 제7번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 10의 N 말단으로부터 제20번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 10의 N 말단으로부터 제6번째의 A쇄의 시스테인과 서열 10의 N 말단으로부터 제11번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드; 및
(10) 서열 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 B쇄, 및 서열 10의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 인슐린 유사 펩티드 6의 개질 A쇄) 또는 그 아미노산 서열과 70 ％ 이상(바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 상동 인간형 인슐린 유사 펩티드 6의 A쇄로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 5의 N 말단으로부터 제10번째의 B쇄의 시스테인과 서열 10의 N 말단으로부터 제7번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 5의 N 말단으로부터 제22번째의 B쇄의 시스테인과 서열 10의 N 말단으로부터 제20번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 10의 N 말단으로부터 제6번째의 A쇄의 시스테인과 서열 10의 N 말단으로부터 제11번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드.
릴락신-3의 키메라 펩티드는 보다 바람직하게는 하기의 것을 들 수 있다. (숫자는 디술피드 결합하는 시스테인 잔기를 나타내고, 동일한 숫자끼리의 시스테인 잔기가 디술피드 결합한다.) 이들 키메라 펩티드는 SALPR(GPCR135), GPR100(GPCR142) 및 LGR7에 대한 리간드 활성이 확인되었다(국제 공개 제2006/O26355호 공보 및 [Changlu Liu et al., Mol Pharmacol. 67(1): 231-40(2005)])
[인간형 B쇄와 인간형 릴락신-1의 A쇄와의 키메라 펩티드]
Figure 112007084540181-PCT00002
[인간형 B쇄와 인간형 릴락신-2의 A쇄와의 키메라 펩티드]
Figure 112007084540181-PCT00003
[인간형 B쇄와 인간형 인슐린 유사 펩티드 3의 개질 A쇄와의 키메라 펩티드]
Figure 112007084540181-PCT00004
[인간형 B쇄와 인간형 인슐린 유사 펩티드 6의 개질 A쇄와의 키메라 펩티드]
Figure 112007084540181-PCT00005
본 발명에서 사용되는 릴락신-3은 또한, 릴락신-3과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것이면, B쇄 및 A쇄의 분자 내 또는 분자 사이에서 디술피드 결합 또는 그 이외의 결합 형식에 의해 결합될 수도 있다. 이러한 펩티드의 예는 국제 공개 제2004/113381호 공보, 문헌 [Halls et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 313, p.677-687, 2005], [Rosengren et al., J. Biol. Chem., 281, p.5845-5851, 2006], 및 [Bathgate et al., Biochemistry, 45, p.1043-1053, 2006] 등에 기재되어 있다.
본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인은 각종 공지된 방법, 예를 들면 유전자 공학적 수법, 합성법 등에 의해서 얻을 수 있다. 구체적으로는, 유전자 공학적 수법의 경우, 본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주 세포에 도입하고, 얻어진 형질 전환체를 발현 가능한 조건하에서 배양하여, 발현 단백질의 단리 및 정제에 일반적으로 이용되는 방법에 의해, 그의 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 단리 및 정제함으로써 제조할 수 있다. 또한, 합성법의 경우에는, 액상법, 고상법 등 통상법에 따라서 합성하는 것이 가능하고, 통상적으로 자동 합성기를 이용할 수 있다. 화학 수식물의 합성은 통상법에 의해 행할 수 있다.
릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(이하, 간단하게 「본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드」라 약기하는 경우도 있음)는 본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 한, 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서 「폴리뉴클레오티드」란, DNA 및 RNA 둘다를 의미한다.
본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들면 서열 1의 5' 말단으로부터 제76번째(c) 내지 제156번째(g)의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드(인간형 B쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드), 서열 1의 5' 말단으로부터 제355번째(g) 내지 제426번째(c)의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드(인간형 A쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드), 서열 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드(인간형 프리프로프로테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)와 엄격한 조건하에서 혼성화될 수 있는 염기 서열을 가지고, 본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 명세서에 있어서 「엄격한 조건에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드」란, 구체적으로는 FASTA, BLAST, 스미쓰-워터만(Smith-Waterman)[Meth. Enzym., 164, 765, 1988] 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해 디폴트의 파라미터를 이용하여 계산하였을 때, 서열 1의 5' 말단으로부터 제76번째(c) 내지 제156번째(g)의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 서열 1의 5' 말단으로부터 제355번째(g) 내지 제426번째(c)의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 서열 1로 표시되는 염기 서열과 70 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한, 「엄격한 조건하」의 혼성화는, 당업자가 통상 사용할 수 있는 혼성화 완충액 중에서 40 ℃ 내지 70 ℃, 바람직하게는 60 ℃ 내지 65 ℃ 등의 온도에서 반응을 행하고, 염 농도가 15 내지 300 mmol/L, 바람직하게는 15 내지 60 mmol/L 등인 세정액 중에서 세정하는 방법에 의해서 행해질 수 있다. 온도, 염 농도는 사용되는 프로브 길이에 따라서 적절하게 조정하는 것이 가능하다.
본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 천연 유래의 것도 가능하고, 또는 전합성된 것도 가능하다. 또한, 천연 유래의 것 중 일부를 이용하여 합성을 행한 것도 가능하다. 본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전형적인 취득 방법으로서는, 예를 들면 시판용 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터, 유전자 공학 분야에서 관용되는 방법, 예를 들면 본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인의 부분 아미노산 서열 정보를 기초로 하여 제조한 적당한 DNA 프로브를 이용하여 스크리닝을 행하는 방법 등을 들 수 있다.
B쇄(서열 2의 N 말단으로부터 제26번째(Arg) 내지 제52번째(Trp)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는, 서열 1의 5' 말단으로부터 제76번째(c) 내지 제156번째(g)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
A쇄(서열 2의 N 말단으로부터 제119번째(Asp) 내지 제142번째(Cys)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는, 서열 1의 5' 말단으로부터 제355번째(g) 내지 제426번째(c)의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
프리프로프로테인(서열 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는, 서열 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
플라스미드
상기 형질 전환에 사용되는 플라스미드는, 상기와 같은 본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되지 않고, 이용되는 숙주 세포에 따라서 적절하게 선택한 공지된 발현 벡터에, 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 얻어지는 플라스미드를 들 수 있다. 또한, 단리 및 정제 조작을 용이하게 하기 위해서, 필요에 따라서 본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인을 절단하는 융합 단백질로서 발현할 수 있는 플라스미드일 수도 있다.
형질 전환체
또한, 상기 형질 전환체도 상기와 같은 본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 상기 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 염색체에 혼입된 형질 전환체인 것도 가능하고, 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 플라스미드 형태로 함유하는 형질 전환체인 것도 가능하고, 또는 본 발명의 릴락신-3을 발현하지 않는 형질 전환체인 것도 가능하다. 상기 형질 전환체는 예를 들면 상기 플라스미드에 의해 또는 상기 폴리뉴클레오티드 그 자체에 의해, 원하는 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 얻을 수 있다. 또한, 다른 양태에 따르면, 상기 형질 전환체는, B쇄, A쇄가 절단되는 절단 부위에 작용하는 프로테아제를 발현하는 플라스미드를 동시에 포함할 수도 있다.
상기 숙주 세포로서는, 예를 들면 통상 사용되는 공지된 미생물, 예를 들면 대장균(예를 들면 Escherichia coli JM109주) 또는 효모(예를 들면 Saccharomyces cerevisiae W303주), 또는 공지된 배양 세포, 예를 들면 동물 세포(예를 들면 CHO 세포, HEK-293 세포 또는 COS 세포) 또는 곤충 세포(예를 들면 BmN4 세포)를 들 수 있다.
또한, 공지된 상기 발현 벡터로서는, 예를 들면 대장균에 대해서는 pUC, pTV, pGEX, pKK 또는 pTrcHis를; 효모에 대해서는 pEMBLY 또는 pYES2를; CHO 세포, HEK-293 세포 및 COS 세포에 대해서는 pcDNA3, pMAMneo 또는 pBabe Puro를; BmN4 세포에 대해서는 누에 핵 다각체 바이러스(BmNPV)의 폴리헤드린 프로모터를 갖는 벡터(예를 들면 pBK283)를 들 수 있다.
상기 형질 전환체를, 본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인의 발현이 가능한 조건하에서 배양함으로써 얻을 수도 있고, 또는 적당한 세포에 본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인을 코딩하는 RNA를 주입하여, 본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인의 발현이 가능한 조건하에서 배양함으로써 얻을 수도 있다.
본 발명의 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인을 상기 형질 전환체의 배양물로부터 취득하는 경우에는, 균체, 세포 또는 배양액을 모아서 단리 및 정제의 공지된 방법을 조합하여 행하는데, 이 때 릴락신-3, B쇄, A쇄 또는 프리프로프로테인의 생화학적 성질 또는 물리적 성질 등을 이용한다. 예를 들면 한외 여과, 액체 크로마토그래피(예를 들면 친화성 크로마토그래피 또는 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 등), 투석법 등의 기술을 이용할 수 있다.
본 발명의 릴락신-3의 B쇄 및 A쇄를 각각 독립적으로 제조한 경우, 또는 융합 단백질로부터 절단하여 B쇄 또는 A쇄를 제조하는 경우에는, 생산된 또는 절단된 B쇄 및 A쇄를 통상법에 따라서 단리 정제하고, 각각 그들끼리 디술피드 결합으로 결합시킬 수도 있다.
릴락신 -3을 함유하는 의약 조성물
정의
본원 명세서에 있어서 「정신 상태」란, 예를 들면 불안, 긴장, 및/또는 우울 상태를 의미한다.
본원 명세서에 있어서 「불안(anxiety)」이란, 신체적 징후(예를 들면 발한, 빈박, 빨라진 호흡, 떨림)를 수반하는 감각(예를 들면 염려, 공포)으로 표시되는 감정 상태, 불쾌한 정서 상태를 의미한다. 불안은 정상적인 감정이지만, 심하게되면 불안 장애가 되기 때문에, 상기 「불안」에는 불안 장애도 포함된다. 불안 장애에는, 예를 들면 광장 공포를 갖거나 또는 갖지 않는 공황 장애, 공황 장애의 병력을 갖지 않는 광장 공포, 특별한 공포증, 예를 들면 특정 동물 공포증, 사회 공포증, 강박성, 외상성 스트레스 장애 및 급성 스트레스 장애를 포함하는 스트레스 장애, 알코올, 약물(藥物)(예를 들면 암페타민, 카페인, 대마, 코카인, 환각제, 흡입제, 펜시크딘(phencychdine)), 진정제, 최면약, 항불안제, 기타 물질에 의해 야기되는 불안 장애, 불안 또는 불안과 우울을 모두 수반하는 불안 장애를 포함한다. 불안 또는 불안 장애는 종종 다른 질환(예를 들면 정신 질환, 면역 질환, 대사 질환, 소화관 질환 등) 및 다른 증상과 관련되어 있거나, 또는 그와 같은 다른 증상에 의해 야기되는 것을 포함한다. 불안은 다른 장애, 예를 들면 우울 장애에 있어서의 우울을 수반하거나 또는 수반하지 않고 존재할 수 있다.
본원 명세서에 있어서 용어 「우울(depression)」이란, 비관적인 고민, 심한 슬픔, 실망, 동요, 정신 활동의 지연, 집중력 저하 및 비하의 감정 상태를 의미한다. 우울은 정도에 따라서는 식욕 부진, 체중 감소, 과식, 불면, 과민증, 성적 충동, 정상인 1 주기성 리듬(예를 들면 체온, 내분비 기능)의 파괴를 일으키는 상태를 포함한다.
본 발명의 릴락신-3 또는 본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 정신 상태의 치료, 바람직하게는 불안 치료의 항불안제로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 이들은 정신 상태의 조절, 바람직하게는 불안 작용의 조절에서의 어떠한 이상(異常)에서 기인하는 질환의 치료; 다른 병(예를 들면 정신 질환, 면역 질환, 대사 질환, 소화관 질환 등) 및 다른 증상과 관련되어 있거나, 또는 그와 같은 다른 증상에 의해서 야기되는 불안의 치료; 알코올, 약물 등의 다른 물질에 의해서 야기되는 불안 장애의 치료; 및 검사시 또는 수술 전후의 불안 완화 치료에 사용될 수 있다. 또한, 이들은 불안 증상을 수반하는 정신 질환의 치료, 릴락신-3 또는 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 이상에서 기인하는 질환 치료의 의약으로서도 사용할 수 있다.
구체적으로는, 불안 작용은 불쾌한 정서 상태로서, 종종 공포에 의해 야기되는 것과 유사한 생리학적 변화나 행동을 수반하기 때문에, 항불안 작용을 갖는 릴락신-3은 인간 또는 인간 이외의 생물의 정신 상태를 안정화시키는 작용을 갖는다. 예를 들면, 불안증, 전반성 불안 장애, 공황 장애, 공포증, 강박성 장애, 심리적 외상 후 스트레스 장애, 심리적 외상 후 스트레스 장애의 치료, 정신 질환(예를 들면 우울증, 우울 증상, 쌍극성 장애, 순환 성격, 감정 장애, 정서 장애, 수면 장애, 통합 실조증), 면역 질환(예를 들면 만성 관절 류마티스, 전신성 홍반루푸스, 신장 질환, 강피증, 아토피성 피부염, 기관지 천식, 다발성 경화증, 류마티스성 간질성 폐렴, 사르코이드증, 크론병, 염증성 대장염, 간경변, 만성 간염, 극증 간염, 뇌 척수염, 중증 근무력증), 대사 질환(예를 들면 당뇨병, 비만성 당뇨병, 내당능 장애, 케톤증, 산증, 당뇨병성 신경 장애, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증, 고지혈증, 동맥 경화, 협심증, 심근 경색, 비만, 비만증, 섭식 장애, 거식증), 소화관 질환(예를 들면 설사, 변비, 기능성 변비증, 과민성 장 증후군), AIDS, 암, 악액질 및 그와 같은 증상과 관련되어 있거나, 또는 그와 같은 증상에 의해서 야기되는 불안의 치료, 알코올, 약물(예를 들면 암페타민, 카페인, 대마, 코카인, 환각제, 흡입제, 펜시크딘), 진정제, 최면약, 항불안제, 기타 물질에 의해 야기되는 불안 장애의 치료에 사용할 수 있다. 또한, 불안 증상을 수반하는 정신 질환(예를 들면 우울증, 우울 증상, 쌍극성 장애, 순환 성격, 감정 장애, 정서 장애, 수면 장애, 통합 실조증)의 치료에도 사용할 수 있다.
상기 질환 치료의 의약으로서 사용하는 데 있어서, 본 발명의 릴락신-3 또는 본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 염을 형성할 수도 있고, 또한 이들은 수화물을 형성할 수도 있는데, 이러한 염 및 수화물은 본 발명에 포함된다. 상기 질환 치료의 의약으로서 사용하는 데 있어서, 본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단독 또는 적당한 벡터에 삽입하거나, 또는 시그널 서열, 폴리펩티드 안정화 서열 등의 서열을 부가하여 사용할 수 있다. 상기 벡터로서는, 예를 들면 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지미드, 코스미드 등의 공지된 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 릴락신-3 또는 본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그의 염 또는 이들의 수화물은 단독으로 이용하는 것도 가능하지만, 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 배합하여 의약 조성물로서 이용할 수도 있다.
본원 명세서에 있어서의 용어 「염」이란, 본 발명의 릴락신-3 또는 본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 염을 형성하면서, 또한 약학적으로 허용될 수 있는 염이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 할로겐화수소산염(예를 들면 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염 등), 무기산염(예를 들면 황산염, 질산염, 과염소산염, 인산염, 탄산염, 중탄산염 등) 유기 카르복실산염(예를 들면 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 말레산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 시트르산염 등), 유기 술폰산염(예를 들면 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염, 캄포술폰산염 등), 아미노산염(예를 들면 아스파르트산염, 글루탐산염 등), 4급 아민염, 알칼리 금속염(예를 들면 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토류 금속염(마그네슘염, 칼슘염 등) 등을 들 수 있고, 상기 「약학적으로 허용될 수 있는 염」으로서, 보다 바람직하게는 트리플루오로아세트산염, 염산염, 옥살산염 등이다.
이 때의 유효 성분의 담체에 대한 비율은 1 내지 90 중량％ 사이에서 변동될 수 있다. 또한, 이러한 약제는 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유 동물(예를 들면 소, 원숭이, 닭, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 비충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에 다양한 형태로, 경구 또는 비경구(예를 들면 정맥 주사, 근육 주사, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여) 중 어느 투여 경로로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 릴락신-3 또는 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물은 투여 경로에 따라서 적당한 제형으로 제제화된다. 구체적으로는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 또는 시럽제 등에 의한 경구제, 또는 주사제, 점적제, 리포솜제, 좌약제 등에 의한 비경구제를 들 수 있다. 이들 제제는 통상 이용되는 부형제, 증량제, 결합제, 습윤화제, 붕해제, 계면 활성화제, 활택제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해 보조제, 방부제, 교미 교취제, 무통화제, 안정화제 등을 이용하여 통상법에 의해 제조할 수 있다. 사용 가능한 무독성의 상기 첨가제로서는, 예를 들면 젖당, 과당, 포도당, 전분, 젤라틴, 스테아르산 마그네슘, 메틸셀룰로오스 또는 그의 염, 에탄올, 시트르산, 염화나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다.
이들 투여 형태 및 필요한 투여량 범위는 본 발명의 릴락신-3 또는 본 발명의 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 선택, 투여 대상, 투여 경로, 제제의 성질, 환자의 상태, 그리고 의사의 판단에 좌우된다. 적당한 투여량은 환자의 체중 1 kg당, 예를 들면 약 0.1 내지 500 μg, 바람직하게는 약 0.1 내지 100 μg, 보다 바람직하게는 1 내지 50 μg 정도를 투여하는 것이 바람직한 범위이다. 효율이 투여 경로에 따라 다른 것을 고려하면, 필요한 투여량은 광범위하게 변동되는 것으로 예측된다. 예를 들면 경구 투여는 정맥 주사에 의한 투여보다 높은 투여량을 필요로 한다고 예상된다. 이러한 투여량 수준의 변동은 당업계에서 잘 이해되는 것과 같은 표준적 경험적인 최적화 절차를 이용하여 조정할 수 있다.
릴락신-3 수용체를 이용한 정신 상태의 조절에 관련된 화합물의 스크리닝 방법
릴락신-3 수용체
본 발명의 릴락신-3에 대한 수용체는, 각종 수용체 중, 본 발명의 릴락신-3과 결합 활성을 가지고, 릴락신-3 수용체 발현 세포의 다양한 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 Ca2 +의 유리, 아데닐산시클라제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨 인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도/활성, 아라키돈산 유리 등)을 갖는 것이면, 그의 기원은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유 동물(예를 들면 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]의 릴락신-3 수용체를 발현하는 장기, 조직, 세포 등의 천연 유래의 것, 공지된 유전자 공학적 수법, 합성법 등에 의해 인위적으로 제조한 것도 포함된다. 또한, 릴락신-3 수용체의 부분 폴리펩티드로서 후술하는 스크리닝 방법에 사용 가능하면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 본 발명의 릴락신-3에 대한 결합능을 갖는 부분 폴리펩티드, 세포막외 영역에 상당하는 아미노산 서열을 포함하는 부분 폴리펩티드 등도 사용할 수도 있다. 이 경우, 부분 폴리펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 릴락신-3 수용체의 아미노산 수의 90 ％, 80 ％, 70 ％, 60 ％, 50 ％, 40 ％, 30 ％, 20 ％, 10 ％ 또는 5 ％이다.
구체적으로는, 릴락신-3 수용체로서 보고되어 있는 공지된 수용체, 예를 들면 LGR7(진뱅크 접속 번호 NM_021634), SALPR(진뱅크 접속 번호 NM_016568)(GPCR135라고도 함) 또는 GPR100(진뱅크 접속 번호 AB_083593)(hGPCR11, GPCR142라고도 함) 등을 사용하는 것이 가능하다.
SALPR을 사용한 불안 작용의 조절에 관련된 화합물의 스크리닝 방법
이하, 본원 명세서에 있어서는, 본 발명의 바람직한 일례로서, SALPR을 사용하여 정신 상태의 조절, 예를 들면 불안 작용의 조절(불안 작용을 억제 또는 촉진시킴)에 관련된 화합물의 스크리닝 방법에 대하여 본 발명의 내용을 상술한다. 즉, 본 발명은 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드에 결합하여 불안 작용의 조절(불안 작용을 억제 또는 촉진시킴)에 관련된 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 또한, SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드에 피검 물질을 작용시켜 세포 자극 활성을 측정함으로써, 상기 피검 물질이 불안 작용을 억제 또는 촉진시키는 작용을 갖는가 아닌가를 결정할 수 있다.
여기서, 본 발명의 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드는 각종 공지된 방법에 의해 얻을 수 있고, 예를 들면 본 발명의 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(진뱅크 접속 번호 NM_016568)를 이용하여 공지된 유전자 공학적 수법에 의해 제조할 수 있다. 또 다른 양태로서, 공지된 폴리펩티드의 합성법에 의해 얻을 수 있고, 예를 들면 액상법, 고상법 등 통상법에 따라서 합성하는 것이 가능하며, 통상 자동 합성기를 이용할 수 있다. 추가로, 다른 양태에 따르면, SALPR의 부분 폴리펩티드는 SALPR을 적당한 단백질 분해 효소로 절단함으로써 제조할 수 있다. 다른 양태에 따르면, SALPR의 부분 폴리펩티드는, 결합 활성 부위를 갖는 부분 폴리펩티드를 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 SALPR을 코딩하는 폴리펩티드는 서열 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 서열 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드, 또는 서열 4로 표시되는 아미노산 서열에 대하여 70 ％ 이상의 상동성, 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그와 연관된 각종 세포 자극 활성, 또는 불안 작용의 조절)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
여기서, 서열 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드란, 서열 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열이며, 또한 SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그와 연관된 각종 세포 자극 활성, 또는 불안 작용의 조절)을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
또한, SALPR의 부분 폴리펩티드도 SALPR과 실질적으로 동일한 활성(예를 들면 릴락신-3과의 결합능 및 그와 연관된 각종 세포 자극 활성, 또는 불안 작용의 조절)을 갖는 한, 사용할 수 있다. SALPR의 부분 폴리펩티드에는, 릴락신-3과의 결합 활성 부위를 갖는 부분 폴리펩티드를 사용할 수 있다.
이하, 유전자 공학적 수법에 대하여, 보다 구체적으로는 SALPR을 사용하는 경우에 대하여 상술하지만, 그의 부분 폴리펩티드에 대해서도 후술하는 스크리닝 방법에 사용 가능하면 특별히 한정되지 않는다.
SALPR의 제조 방법
SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주 세포에 도입하여, 얻어진 형질 전환체를 발현 가능한 조건하에서 배양하여, 그 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 정제하지 않고 제조한 것을 사용할 수도 있거나, 또는 발현 단백질의 단리 및 정제에 일반적으로 이용되는 방법에 의해 그 배양물로부터 원하는 폴펩티드를 단리 및 정제함으로써 제조할 수 있다. 상기 단리 및 정제 방법으로서는, 예를 들면 황산암모늄 염석, 이온 교환 셀룰로오스를 이용하는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 분자체 겔을 이용하는 분자체 칼럼 크로마토그래피, 프로테인 A 결합 다당류를 이용하는 친화성 칼럼 크로마토그래피, 투석 또는 동결 건조 등을 들 수 있다.
SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 한, 특별히 한정되지 않는다.
또한, 본 명세서에 있어서의 용어 「폴리뉴클레오티드」에는, DNA 및 RNA 둘다 포함된다. 본 발명의 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에는, 구체적으로는 하기의 (a) 내지 (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 들 수 있다.
(a) 서열 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(b) 「서열 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드」를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 「서열 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 「서열 4로 표시되는 아미노산 서열의 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개)의 부분에서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
(e) 「서열 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 또한 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본 발명의 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 서열 3으로 표시되는 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SALPR을 코딩한다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명의 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 「서열 4로 표시되는 아미노산 서열의 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개)의 부분에서 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 수개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 여기서, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가될 수도 있는 아미노산의 수는, 예를 들면 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 2개이다.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명의 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 「서열 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 또한 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 또한, 본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명의 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 「서열 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 또한 상기 SALPR과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드」를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
플라스미드
상기 형질 전환에 사용되는 플라스미드는 상기와 같은 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되지 않고, 이용되는 숙주 세포에 따라서 적절하게 선택한 공지된 발현 벡터에, 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 얻어지는 플라스미드를 들 수 있다.
형질 전환체
또한, 상기 형질 전환체도 상기와 같은 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 상기 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 염색체에 혼입된 형질 전환체일 수도 있거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 플라스미드 형태로 함유하는 형질 전환체일 수도 있거나, 또는 SALPR을 발현하지 않는 형질 전환체일 수도 있다. 상기 형질 전환체는, 예를 들면 상기 플라스미드에 의해 또는 상기 폴리뉴클레오티드 그 자체에 의해, 원하는 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 얻을 수 있다.
상기 숙주 세포로서는, 예를 들면 통상 사용되는 공지된 미생물, 예를 들면 대장균(예를 들면 Escherichia coli JM109주) 또는 효모(예를 들면 Saccharomyces cerevisiae W303주) 또는 공지된 배양 세포, 예를 들면 동물 세포(예를 들면 CHO 세포, HEK-293 세포, 또는 COS 세포) 또는 곤충 세포(예를 들면 BmN4 세포)를 들 수 있다.
또한, 공지된 상기 발현 벡터로서는, 예를 들면 대장균에 대해서는 pUC, pTV, pCEX, pKK 또는 pTrcHis를; 효모에 대해서는 pEMBLY 또는 pYES2를; CHO 세포, HEK-293 세포 및 COS 세포에 대해서는 pcDNA3, pMAMneo 또는 pBabe Puro를; BmN4 세포에 대해서는 누에 핵 다각체 바이러스(BmNPV)의 폴리헤드린 프로모터를 갖는 벡터(예를 들면 pBK283)를 들 수 있다.
SALPR을 함유하는 세포는 SALPR을 세포막 표면에 발현하는 한, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 상기 형질 전환체(즉, SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 형질 전환된 세포)를 SALPR 발현이 가능한 조건하에서 배양함으로써 얻을 수도 있으며, 또는 적당한 세포에 SALPR을 코딩하는 RNA를 주입하여 SALPR 발현이 가능한 조건하에서 배양함으로써 얻을 수도 있다.
세포의 막 분획
또한, SALPR을 함유하는 본 발명의 세포의 막 분획은, 예를 들면 본 발명에 의한 SALPR을 발현하는 세포를 파쇄한 후, 세포막이 많이 포함되는 분획을 단리함으로써 얻을 수 있다. 세포의 파쇄 방법으로서는, 예를 들면 균질기(예를 들면 Potter-Elvehiem형 균질기)로 세포를 으깨는 방법, 와링 블렌더 또는 폴리트론(Kinematica사)에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 또는 프렌치 프레스 등으로 가압하면서 미세 노즐로부터 세포를 분출시키는 것에 의한 파쇄 등을 들 수 있다. 또한, 세포막의 분획 방법으로서는, 예를 들면 원심력에 의한 분획법, 예를 들면 분획 원심 분리법 또는 밀도 구배 원심 분리법을 들 수 있다.
본 발명에 의한 SALPR을 통한 불안 작용을 촉진 또는 억제하는 화합물의 스크리닝 방법으로서는, SALPR, 상기 세포(즉, SALPR을 함유하는 세포) 또는 상기 세포의 막 분획(즉, SALPR을 함유하는 세포의 막 분획)을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 스크리닝 방법에 있어서는, 제1 양태로서, 피검 물질이 SALPR에 특이적으로 결합하는가 아닌가를 조사하는 방법과, 제2 양태로서, SALPR에 피검 물질이 결합함으로써 생기는 세포 자극 활성(예를 들면 세포 내의 Ca2+의 유리, 아데닐산시클라제의 활성화, 세포 내 cAMP 생성, 세포 내 cGMP 생성, 이노시톨 인지질 생성, 세포막 전위 변화, 세포막 근방 pH 변화, 세포 내 단백질의 인산화, c-fos 및 c-jun의 유도/활성, 아라키돈산 유리 등)을 조사하는 방법을 들 수 있고, 이들을 이용할 수 있다.
본 발명에 의한 스크리닝 방법의 제1 양태로서는, 예를 들면 SALPR, 상기 세포 또는 상기 세포의 막 분획과, 피검 물질을 접촉시켜, SALPR, 상기 세포 또는 상기 세포의 막 분획과 피검 물질이 결합하는 가 아닌가를 분석함으로써, SALPR을 통한 불안 작용을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하지 않고 화합물을 스크리닝할 수 있다.
구체적으로는, 피검 물질 부존재하 및 피검 물질 존재하의 각 조건하에서, SALPR, 상기 세포 또는 상기 세포의 막 분획과, 표지된 본 발명의 릴락신-3을 접촉시켜, 상기 조건하에서의 SALPR, 상기 세포 또는 상기 세포의 막 분획과 상기 릴락신-3의 특이적 결합량을 비교함으로써, SALPR을 통한 불안 작용을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하지 않고 화합물을 스크리닝할 수 있다. 즉, 상기 피검 물질이, SALPR을 통한 불안 작용을 촉진 또는 억제하는 능력을 갖는 경우에는, 피검 물질 부존재하에서의 SALPR, 상기 세포 또는 상기 세포의 막 분획과 상기 릴락신-3의 특이적 결합량에 대하여, 피검 물질 존재하에서의 상기 특이적 결합량이 저하된다.
본 발명에 의한 스크리닝 방법에 있어서, SALPR, 상기 세포 또는 상기 세포의 막 분획과 본 발명의 릴락신-3의 특이적 결합량을 비교하는 경우에는, 상기 릴락신-3으로서 표지된 상기 릴락신-3을 사용할 수 있다. 상기 표지로서는, 예를 들면 방사성 동위 원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등이 이용된다. 방사성 동위 원소로서는, 예를 들면 [3H], [14C], [125I], [35S] 등을 사용할 수 있다. 상기 효소로서는, 예를 들면 β-갈락토시다제, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다아제 등을 사용할 수 있다. 형광 물질로서는, 예를 들면 플루오레세인 이소티오시아네이트, BODIPY 등을 사용할 수 있다. 발광 물질로서는 루시페린, 루시게닌 등을 사용할 수 있다. 경우에 따라서는, 본 발명의 릴락신-3과 표지 물질을 결합시키기 위해서 비오틴-아비딘계, 릴락신-3에 대한 항체를 이용할 수도 있다.
이와 같이, 본 발명에 의한 스크리닝 방법에 있어서, SALPR, 상기 세포 또는 상기 세포의 막 분획에 결합하여, 이들과 본 발명의 릴락신-3과의 결합을 저해하는 화합물을, SALPR을 통한 불안 작용을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하지 않고 스크리닝할 수 있다.
본 발명에 의한 스크리닝 방법에 있어서의 제2 양태로서는, 피검 물질 부존재하 및 피검 물질 존재하의 각 조건하에서, 상기 세포와 표지화한 본 발명의 릴락신-3을 접촉시켜, 상기 각 조건하에서의 상기 세포를 통한 상기 릴락신-3의 특이적 결합량을 비교하고, 또한 상기 조건하에서의 상기 릴락신-3의 특정 세포 자극 활성을 비교함으로써, SALPR을 통한 불안 작용을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다.
상기 양태에 있어서는, 상기 세포에 결합하고, 상기 세포에 포함되는 수용체를 통해 세포 자극 활성을 갖는 피검 물질을 SALPR을 통한 불안 작용을 억제하는 화합물로서 선택할 수 있다.
한편, 상기 양태에 있어서, 상기 세포와 상기 릴락신-3과의 결합을 저해하지만, 세포 자극 활성을 갖지 않는 피검 물질을 SALPR을 통한 불안 작용을 촉진시키는 화합물로서 선택할 수 있다.
본 발명에 의한 스크리닝 방법은 세포 자극 활성으로서, 예를 들면 아데닐산시클라제의 활성 억제를 이용함으로써 실시할 수 있다.
이러한 양태의 스크리닝 방법에 있어서는, 예를 들면 아데닐산시클라제의 활성화에 의해서 세포 내에 생성되는 cAMP를 공지된 수법으로 측정함으로써, SALPR을 통한 불안 작용을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이러한 양태는, SALPR에 본 발명의 릴락신-3이 결합됨으로써 생기는 세포 내 시그널 전달, 즉, SALPR의 세포 자극 활성 중 하나인 아데닐산시클라제의 활성 억제를 이용하는 것이다. 구체적으로는, SALPR에 상기 릴락신-3이 결합되면, SALPR에 공액되어 있는 G 단백질 패밀리 중 하나인 Gi 패밀리가, 아데닐산시클라제를 억제하여 세포 내에 생성되는 시클릭 AMP(cAMP: 아데닐산시클라제에 의해 ATP로부터 생성됨)량을 감소시키는 것에 의한다.
예를 들면 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는 SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)시킨 포유 동물 유래 세포(예를 들면 HEK-293 세포 또는 CHO 세포)에 아데닐산시클라제의 활성화제[예를 들면 포스콜린(FSK)]을 첨가하면, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승된다.
또한, 아데닐산시클라제 활성화제를 첨가할 때, 본 발명의 릴락신-3을 첨가하면, 아데닐산시클라제 활성화제에서 기인하는 상기 아데닐산시클라제 활성 촉진뿐 아니라, 상기 릴락신-3이 본 발명에 의한 SALPR에 작용하여 생기는 아데닐산시클라제의 활성 억제도 발생하기 때문에, 결과적으로 아데닐산시클라제 활성화제를 단독 투여한 경우에 비해, cAMP의 생성량이 감소된다. 따라서, 불안 작용을 억제하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 이러한 스크리닝계에서 SALPR을 통한 상기 릴락신-3 대신에, 피검 물질을 단독으로 접촉시켜 cAMP의 생성량을 감소시키는(즉, 상기 릴락신-3과 동일한 작용을 갖는) 화합물을 선택하면 된다.
불안 작용을 촉진시키는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 아데닐산시클라제 활성화제, 본 발명의 릴락신-3 및 피검 물질을 스크리닝용 세포에 첨가하면 된다. 아데닐산시클라제 활성화제를 단독으로 첨가한 경우에 비해, 상기 릴락신-3의 작용으로 cAMP의 생성량이 감소되지만, 피검 물질이 상기 릴락신-3의 작용에 길항하는 경우에는, cAMP 생성량의 감소를 억제한다. 이 때에는, 상기 피검 물질은 불안 작용을 촉진시키는 화합물로서 선택될 수 있다.
세포 내 cAMP양을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 면역분석법 등이 있지만, 예를 들면 시판용 cAMP 정량 키트를 사용할 수도 있다.
다른 양태의 스크리닝 방법에 있어서는, 예를 들면 SALPR을 세포막 상에 발현(바람직하게는 SALPR을 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)시키고, 또한 cAMP 응답 서열(CRE)이 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자(예를 들면 알칼리 포스파타제 유전자, 루시페라제 유전자, 베타락타마제 유전자, 니트로리덕타제 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자, 베타갈락토시다제 유전자 등, 또는 GFP(녹색 형광 단백질) 등의 형광 단백질 유전자 등)를 함유하는 세포(이하, 「스크리닝용 세포」라 하는 경우도 있음)를 이용함으로써, SALPR을 통한 불안 작용을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이러한 양태는, 상술한 cAMP의 생성이 감소되면 그 결과, 상기 스크리닝용 세포에 도입되는 CRE를 프로모터 영역에 갖는 리포터 유전자의 전사가 억제되는 것을 이용한다.
이하, 상기 양태에 의한, SALPR을 통한 불안 작용을 촉진 또는 억제하는 능력을 구별하여 화합물을 스크리닝하는 절차에 대하여, 보다 구체적으로 설명한다.
즉, 상기 스크리닝용 세포에 도입되는 CRE는, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승하면 발현이 촉진되는 유전자군(cAMP 유도성 유전자)의 전사 조절 영역에 공통적으로 존재하는 염기 서열이다. 따라서, 아데닐산시클라제의 활성화제(예를 들면 FSK)를 스크리닝용 세포에 첨가하면, 세포 내의 cAMP의 농도가 상승하고, 그 결과, CRE의 하류에 위치하는 리포터 유전자의 발현량이 증가한다. 리포터 유전자 산물의 발현량은, 리포터 유전자 산물과 반응하여 기질로부터 생성된 발광 물질의 양에서 유래하는 발광을 측정함으로써 또는 리포터 유전자로서 생산된 형광 단백질 유래의 형광을 측정함으로써 용이하게 측정할 수 있다.
또한, 아데닐산시클라제 활성화제를 첨가할 때, 본 발명의 릴락신-3을 첨가하면, 아데닐산시클라제 활성화제에서 기인하는 상기 아데닐산시클라제 활성 촉진뿐 아니라, 상기 릴락신-3이 본 발명에 의한 SALPR에 작용하여 생기는 아데닐산시클라제의 활성 억제도 발생하기 때문에, 결과적으로 아데닐산시클라제 활성화제를 단독 투여한 경우에 비해, 리포터 유전자 산물의 발현량이 저하된다. 따라서, 불안 작용을 억제하는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 이 스크리닝계에서 SALPR을 통한 상기 릴락신-3 대신에, 피검 물질을 단독으로 접촉시켜 리포터 유전자 산물의 발현량을 감소시키는(즉, 상기 릴락신-3과 동일한 작용을 갖는) 화합물을 선택하면 된다.
불안 작용을 촉진시키는 작용을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우에는, 아데닐산시클라제 활성화제, 본 발명의 릴락신-3 및 피검 물질을 스크리닝용 세포에 첨가할 수 있다. 아데닐산시클라제 활성화제를 단독으로 첨가한 경우에 비해, 상기 릴락신-3의 작용으로 리포터 유전자 산물의 발현량은 감소되지만, 피검 물질이 상기 릴락신-3의 작용에 길항하는 경우에는, 리포터 유전자 산물의 발현 감소를 억제한다. 이 때에는, 상기 피검 물질은 불안 작용을 촉진시키는 화합물로서 선택될 수 있다.
피검 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합을 통한 작용인가 아닌가는 간단하게 확인할 수 있다. 예를 들면 스크리닝용 세포(즉, SALPR을 세포막 상에 발현시키고, 또한 CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하는 세포)를 이용한 상기 시험과 병행하여, 대조용 세포(예를 들면 CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하지만, SALPR을 세포막 상에 발현하지 않는 세포)를 이용하여 동일한 시험을 실시한다. 그 결과, 상기 피검 물질에 의한 작용이, SALPR에 대한 결합에 의한 작용이 아닌 경우에는, 스크리닝용 세포 및 대조용 세포에서 리포터 유전자 산물의 발현량에 대하여 동일한 현상이 관찰되지만, 상기 피검 물질에 의한 작용이 SALPR에 대한 결합에 의한 작용인 경우에는, 스크리닝용 세포와 대조용 세포에서 리포터 유전자 산물의 발현량에 대하여 다른 현상이 관찰된다.
또한, 다른 양태로서, 피검 물질, 바람직하게는 상기 스크리닝 방법에 의해 선택되는 피검 물질(이하, 간단하게 「피검 물질」이라 약기하는 경우가 있음)을 피검 동물, 예를 들면 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유 동물(예를 들면 소, 원숭이, 닭, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에 투여하고, 투여 후의 행동 관찰, 자발 운동량, 혈중 파라미터(예를 들면 혈중 또는 뇌 내의 호르몬이나 분비 펩티드의 양 등)의 변동 등의 지표를 해석함으로써 불안 작용의 조절에 영향을 주는 피검 물질(즉, 불안 작용을 억제 또는 촉진시키는 화합물)을 확인 및 결정할 수 있다. 구체적으로는 방어적으로 덮어 숨기는 시험[Treit 등, 문헌[Pharamacology Biochemistry and Behavior, 15, p.619-626, 1981], 오픈 필드 시험, 명암 시험, 고가식 십자 미로 시험, 겔러-세이프터(Geller-Seifter)형 컨플릭트 테스트, 보겔(Vogel)형 컨플릭트 테스트, 사회적 상호작용(social interaction) 시험, 홀-보드(Hole-board) 시험, 대리석을 덮어 숨기는(Marble burying) 시험, 공포 조건하에 스트레스 시험, 강제 수영 시험, 꼬리 매달기(tail suspension) 시험에 의한 행동을 관찰할 수 있다. 비인간 포유 동물로서는, 정상 동물로 한정되지 않고, 유전성 질병 동물 모델 또는 유전자 변형 동물을 들 수 있다.
피검 물질은, 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여 경로의 형태로서는, 예를 들면 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 기도내, 직장내, 뇌 내, 바람직하게는 시상 하부 근방의 뇌실 내 투여를 들 수 있다. 피검 물질의 피검 동물의 뇌실 내 투여 방법은, 약물 등을 뇌실 내 소정의 위치에 투여할 때의 통상법에 따를 수 있으며, 한정되지 않는다.
예를 들면, 우선 피검 동물을 마취한 후에, 가이드 캐뉼러를 소정의 위치에 고정시키는 수술을 실시해두고, 적당한 회복 기간(예를 들면 7 일간 내지 14 일간, 바람직하게는 1 주간 이상 정도)의 경과 후, 가이드 캐뉼러에 주입 니들을 삽입하고, 환류 펌프를 접속시킨 마이크로실린지를 이용하여, 상기 니들을 통해 피검 물질을 투여하는 것이 바람직하다. 피검 물질의 투여량은 한정되지 않고, 적절하게 설정할 수 있다. 피검 물질은 일반적으로는 인공적 뇌 척수액 또는 생리 식염수 등을 이용하여 원하는 농도의 용액으로서 제조해둔다. 인공적 뇌 척수액으로서는, 공지된 상용되는 것을 이용할 수 있고, 예를 들면 aCSF(포도당 10 mM, KCl 2 mM, NaCl 115 mM, CaCl2 2.5 mM, MgSO4 1.2 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 2.2 mM; pH 7.4) 등이 바람직하지만, 이로 한정되지 않는다. 피검 물질은 1 일당 1회로 또는 수회로 나누어 투여될 수도 있고, 피검 물질을 투여하는 기간이나 관찰하는 기간은 1 일부터 수 주간에 걸칠 수도 있다.
릴락신-3의 피검 동물에의 투여 방법 등은, 상기 피검 물질의 경우와 동일한 방법이 바람직하다. 또한, 릴락신-3의 피검 동물의 뇌실 내 투여시, 릴락신-3이 상기 피검 물질과 동일하게 일반적으로는 인공적 뇌 척수액을 이용하여 원하는 농도의 용액이 되도록 제조해두는 것이 바람직하다.
피검 물질
여기서, 상술한 피검 물질은 어떠한 화합물이어도 좋지만, 예를 들면 유전자 라이브러리의 발현 산물, 합성 저분자량 화합물 라이브러리, 핵산(올리고 DNA, 올리고 RNA), 합성 펩티드 라이브러리, 항체, 세균 방출 물질, 세포(미생물, 식물 세포, 동물 세포) 추출액, 세포(미생물, 식물 세포, 동물 세포) 배양 상등액, 정제 또는 부분 정제 폴리펩티드, 해양 생물, 식물 또는 동물 등 유래의 추출물, 토양, 랜덤 파지 펩티드 디스플레이 라이브러리를 들 수 있다. 상기 화합물은 염을 형성할 수도 있고, 또한 상기 화합물 및 그의 염은 수화물을 형성할 수도 있으며, 이러한 염 및 수화물은 본 발명의 피검 물질에 포함된다.
본원 명세서에 있어서 용어 피검 화합물의 「염」이란, 약학적으로 허용되는 염을 나타내고, 화합물과 약학적으로 허용되는 염을 형성하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 예를 들면 바람직하게는 할로겐화수소산염(예를 들면 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염 등), 무기산염(예를 들면 황산염, 질산염, 과염소산염, 인산염, 탄산염, 중탄산염 등), 유기 카르복실산염(예를 들면 아세트산염, 옥살산염, 말레산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 시트르산염 등), 유기 술폰산염(예를 들면 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염, 캄포술폰산염 등), 아미노산염(예를 들면 아스파르트산염, 글루탐산염 등), 4급 아민염, 알칼리 금속염(예를 들면 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토류 금속염(예를 들면 마그네슘염, 칼슘염 등) 등을 들 수 있다.
스크리닝용 키트
본 발명의 스크리닝용 키트는 릴락신-3 수용체, 상기 세포(즉, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포) 또는 상기 세포의 막 분획(즉, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포의 막 분획)을 함유하며, 경우에 따라서는 릴락신-3을 함유할 수 있다. 상기 릴락신-3은 표지된 상기 릴락신-3일 수도 있다. 상기 스크리닝용 키트는 목적에 따라서 각종 시약, 예를 들면 결합 반응용 완충액, 세정용 완충액, 설명서 및/또는 기구 등을 더 포함할 수 있다. 여기서, 릴락신-3 수용체의 바람직한 예는 SALPR이다.
본 발명의 다른 양태의 스크리닝용 키트는 본 발명의 릴락신-3 및, 릴락신-3 수용체를 세포막 상에 발현(바람직하게는 릴락신-3 수용체를 포함하는 발현 벡터를 도입하여 과잉으로 발현)시키고, 또한 cAMP 응답 서열(CRE)이 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자(예를 들면 알칼리 포스파타제 유전자, 루시페라제 유전자 등)를 함유하는 세포를 적어도 함유한다. 상기 스크리닝용 키트는 목적에 따라서 각종 시약, 예를 들면 리포터 유전자 산물(예를 들면 알칼리 포스파타제 또는 루시페라제 등)의 기질, 아데닐산시클라제 활성화제(예를 들면 FSK), 결합 반응용 완충액, 세정용 완충액, 설명서 및/또는 기구 등을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝용 키트는 CRE가 5' 상류에 위치하는 리포터 유전자를 함유하지만, 릴락신-3 수용체를 세포막 상에 발현하지 않는 세포를 포함할 수도 있다.
여기서, 릴락신-3 수용체의 바람직한 예는 SALPR이다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물을 함유하는 의약 조성물
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물은 정신 상태의 조절, 바람직하게는 불안 작용의 조절(불안 작용을 억제 또는 촉진시킴)에 관련된 화합물이다. 상기 화합물은 염을 형성할 수도 있고, 또한 상기 화합물 및 그의 염은 수화물을 형성될 수도 있다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물은 정신 상태의 치료에, 바람직하게는 불안 치료의 항불안제로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 이들은, 정신 상태의 조절, 바람직하게는 불안 작용의 조절에 있어서 어떠한 이상에서 기인하는 질환의 치료; 다른 병(예를 들면 정신 질환, 면역 질환, 대사 질환, 소화관 질환 등) 및 다른 증상과 관련되어 있거나, 또는 그와 같은 다른 증상에 의해서 야기되는 불안의 치료; 알코올, 약물 등의 다른 물질에 의해서 야기되는 불안 장애의 치료; 및 검사시 또는 수술 전후의 불안 완화 치료에 사용될 수 있다. 또한, 이들은 불안 증상을 수반하는 정신 질환의 치료, 릴락신-3 또는 릴락신-3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 이상에서 기인하는 질환 치료의 의약으로서도 사용될 수 있다.
구체적으로는, 불안 작용은 불쾌한 정서 상태로서, 종종 공포에 의해 야기되는 것과 유사한 생리학적 변화나 행동을 수반하기 때문에, 불안 작용을 억제하는 화합물은 인간 또는 인간 이외의 생물의 정신 상태를 안정화시키는 작용을 갖는다. 따라서, 예를 들면 불안증, 전반성 불안 장애, 공황 장애, 공포증, 강박성 장애, 심리적 외상 후 스트레스 장애, 심리적 외상 후 스트레스 장애의 치료, 정신 질환(예를 들면 우울증, 우울 증상, 쌍극성 장애, 순환 성격, 감정 장애, 정서 장애, 수면 장애, 통합 실조증), 면역 질환(예를 들면 만성 관절 류마티스, 전신성 홍반루푸스, 신장 질환, 강피증, 아토피성 피부염, 기관지 천식, 다발성 경화증, 류마티스성 간질성 폐렴, 사르코이드증, 크론병, 염증성 대장염, 간경변, 만성 간염, 극증 간염, 뇌 척수염, 중증 근무력증), 대사 질환(예를 들면 당뇨병, 비만성 당뇨병, 내당능 장애, 케톤증, 산증, 당뇨병성 신경 장애, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증, 고지혈증, 동맥 경화, 협심증, 심근 경색, 비만, 비만증, 섭식 장애, 거식증), 소화관 질환(예를 들면 설사, 변비, 기능성 변비증, 과민성 장 증후군), AIDS, 암, 악액질 및 그와 같은 증상과 관련되어 있거나, 또는 그와 같은 증상에 의해서 야기되는 불안의 치료, 알코올, 약물(예를 들면 암페타민, 카페인, 대마, 코카인, 환각제, 흡입제, 펜시크딘), 진정제, 최면약, 불안 해약에 의해 야기되는 불안 장애의 치료에 사용할 수 있다. 또한, 불안 증상을 수반하는 정신 질환(예를 들면 우울증, 우울 증상, 쌍극성 장애, 순환 성격, 감정 장애, 정서 장애, 수면 장애, 통합 실조증)의 치료에도 사용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물을 단독으로 이용하는 것도 가능하지만, 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 배합하여 의약 조성물로서 이용할 수도 있다. 이 때의 유효 성분의 담체에 대한 비율은 1 내지 90 중량％ 사이에서 변동될 수 있다. 또한, 이러한 약제는 인간 또는 인간 이외의 생물[예를 들면 비인간 포유 동물(예를 들면, 소, 원숭이, 닭, 고양이, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 개 등), 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 등]에 다양한 형태, 경구 또는 비경구(예를 들면 정맥 주사, 근육 주사, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여) 중 어느 투여 경로로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물을 함유하는 의약 조성물은 투여 경로에 따라서 적당한 제형으로 제조된다. 구체적으로는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제 또는 시럽제 등에 의한 경구제, 또는 주사제, 점적제, 리포솜제, 좌약제 등에 의한 비경구제를 들 수 있다. 이들 제제는 통상 이용되는 부형제, 증량제, 결합제, 습윤화제, 붕해제, 계면 활성화제, 활택제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해 보조제, 방부제, 교미 교취제, 무통화제, 안정화제 등을 이용하여 통상법에 의해 제조될 수 있다. 사용 가능한 무독성의 상기 첨가제로서는, 예를 들면 젖당, 과당, 포도당, 전분, 젤라틴, 스테아르산 마그네슘, 메틸셀룰로오스, 또는 그의 염, 에탄올, 시트르산, 염화나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다.
이들 투여 형태 및 필요한 투여량 범위는 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 선택, 투여 대상, 투여 경로, 제제의 성질, 환자의 상태, 그리고 의사의 판단에 좌우된다. 그러나, 적당한 투여량은 환자의 체중 1 kg당, 예를 들면 약 1.0 내지 1,500 μg, 바람직하게는 약 10 내지 500 μg 정도를 투여하는 것이 바람직한 범위이다. 투여 경로의 효율이 다른 것을 고려하면, 필요한 투여량은 광범위하게 변동되는 것으로 예측된다. 예를 들면 경구 투여는 정맥 주사에 의한 투여보다 높은 투여량을 필요로 한다고 예상된다. 이러한 투여량 수준의 변동은, 당업계에서 잘 이해되는 것과 같은 표준적 경험적인 최적화 절차를 이용하여 조정할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「치료」란, 일반적으로 원하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 효과는 질병 및/또는 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 점에서는 예방적이고, 질병 및/또는 질병에서 기인하는 악영향을 완전히 또는 부분적으로 치유한다는 점에서는 치료적이다. 본 명세서에 있어서 「치료」란, 포유 동물, 특히 인간 질병의 치료를 포함하고, 예를 들면 이하의 (a) 내지 (c)의 치료를 포함한다:
(a) 질병 또는 증상의 소인(素因)을 가질 수 있지만, 아직 가지고 있다고 진단되지 않은 환자에 있어서, 질병 또는 증상이 발병하는 것을 예방하는 것;
(b) 질병 증상을 저해하는, 즉, 그의 진행을 저지 또는 지연시키는 것;
(c) 질병 증상을 완화시키는 것, 즉, 질병 또는 증상의 후퇴, 또는 증상 진행의 역전을 야기하는 것.
또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
이하, 실시예에 의해 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 조금도 한정되지 않는다.
[실시예 1] SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 제조
SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 단리는 서열 3으로 표시되는 염기 서열을 기초로 하여 이하와 같이 행하였다. 서열 3에서는 1410 염기쌍이 개시되어 있고, SALPR을 코딩하는 영역은 1번째로부터 1407번째(1410 염기쌍, 469 아미노산 잔기)로 되어 있다(진뱅크 접속 번호 NM_016568). PCR(중합효소 연쇄 반응)에 의해 유전자를 단리하기 위해서, 서열 11 및 서열 12로 표시되는 PCR 프라이머를 통상법에 따라서 제조하였다.
인간 게놈 DNA(Roche Diagostics사)를 주형으로 하여, 서열 11 및 서열 12의 조합으로 이루어지는 PCR 프라이머와, 증식 고 충실성(Expand High Fidelity) PCR 시스템(Roche Diagnostics사)을 이용하여 (98 ℃ 1 분 - 57 ℃ 1 분 - 72 ℃ 3 분)을 첨부된 조작 방법에 따라서 30회 반복함으로써 PCR을 행하였다. 그 결과, 약 1,400 염기쌍의 DNA 단편을 얻었다.
이 DNA 단편을 pCR2.1(Invitrogen사)에 삽입하고, ABI 프리즘 DNA 시퀀싱 키 트(Perkin-Elmer Applied Biosystems사)에 의해 서열을 확인하였다. 그 결과, 서열 11 및 12로 이루어지는 프라이머의 조합에 의해 얻어진 pCR2.1-SALPR에 삽입된 1410 염기쌍의 서열은, 서열 3에 있어서의 361번째로부터 1770번째까지의 길이는 동일하였지만, 서열 중에는 하나의 변이가 보였다. 이러한 변이는, 해당 부위의 핵산 서열로부터 번역되는 아미노산에는 영향을 주지 않는 것은 분명하였기 때문에, SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있었다.
[실시예 2] 레트로바이러스 벡터 플라스미드의 제조
pBabc Puro[Morgenstern, J.P. and Land, H. Nucleic Acids Res., 18, p.3587-3596, 1990](서열 13)을 SalI 및 ClaI로 절단함으로써 SV40 프로모터-puro(r) 영역을 제거하고, 말단을 클레나우 단편(Klenow fragment)에 의해 평활화하였다. 이 절단 지점에, NsiI 및 XbaI를 사용하여 pIREShyg(Clontech사)로부터 절단되었고 FT4 폴리머라제에 의해 말단이 평활화된 IRES-hyg(r) 영역을 삽입하여 pBabeXIH를 얻었다.
pBabeXIH로부터 SspI 및 BamHI로 절단함으로써 5'-LTR-패키징 신호를 제거하였다. 이 절단 지점에, SspI 및 BamHI를 사용하여 pCLXSN(IMGENEX사)으로부터 절단되었고 5' LTR-CMV 프로모터-패키징 신호를 삽입하여 pBabeCLXIH를 얻었다.
[실시예 3] SALPR 유전자 도입용 레트로바이러스 벡터 플라스미드의 제조
상기 실시예 2에 기재된 레트로바이러스 발현용 플라스미드 pBabeCLXIH를 제한 효소 HpaI로 절단하였다. 이 절단 지점에, EcoRV를 사용하여 상기 실시예 1에서 얻은 pCR2.1-SALPR로부터 절단되었고 T4 폴리머라제에 의해 말단이 평활화된 SALPR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 pBabeCL(SALPR) IH를 얻었다(도 1).
[실시예 4] SALPR 유전자 도입용 레트로바이러스 벡터의 제조
2×106개의 293-EBNA 세포(Invitrogen사)를 10 cm 콜라겐 코팅 접시(IWAKI사)에서 10 ％ 소 태아 혈청(FCS), 페니실린(penicil1in) 100 units/mL 스트렙토마이신(streptomycin), 및 100 μg/ml PS로 보충된 DMEM(Sigma사)(이하, 「EBNA 배양액」이라 함) 10 mL를 이용하여 배양하였다. 다음날, pV-gp(pVPack-GP(Stratagene사)를 NsiI 및 XbaI로 절단함으로써 IRES-hisD를 제거하여 T4 폴리머라제에 의한 평활화 후, 생성된 단편을 자가 라이게이션한 것), pVPack-VSV-G(Stratagene사), 및 실시예 3에서 얻은 SALPR 유전자 도입용 레트로바이러스 벡터 플라스미드(pBabeCL(SALPR)IH) 각각 3.3 μg을 사용하고 리포펙션 시약인 TransIT(Panvera사)를 이용하여 상기 293-EBNA 세포를 형질감염시켰다. 그의 6 내지 12 시간 후에 EBNA 배양액을 교환하고, 37 ℃에서 배양을 계속하였다.
형질감염 2 일 후에 배양액을 회수하고, 1,200×g으로 10 분간 원심하였다.
그의 상등액을 0.45 ㎛의 필터(Millpore사)로 여과한 것을 비농축 레트로바이러스 벡터로 하여, 또한 바이러스 벡터의 농축을 이하와 같이 행하였다.
초원심분리용 튜브 50 울트라-클리어 튜브(Ultra-Clear Tubes, Beckman사)를 70 ％ 에탄올로 소독 후에 증류수로 헹구고, 여기에 비농축 바이러스 벡터 약 35 mL를 넣었다. 이것을 초원심분리 로터 SW28(Beckman사)에 넣고, 초원심분리 장치 XL-90(Beckman사)를 사용하여 19,500 rpm에서 100 분간의 원심분리하였다. 원심분리 후, 생성된 상등액을 버리고, 튜브를 얼음에 넣어 방치하였다. 1 시간 후, 튜브 벽면에 남은 배양액 약 100 μL 정도의 농축 바이러스 벡터 용액이 얻어졌다.
[실시예 5] 시클릭 AMP 반응 서열을 포함하는 리포터 유전자 도입용 세포 SE302의 구축
(1) 시클릭 AMP 반응 서열을 포함하는 리포터 DNA의 구축
공표된 논문[Durocher et al. Anal Biochem 2000 284(2): 316-26]을 참고로 cAMP에 따른 전사를 수반하는 유닛을 이하와 같이 구축하였다.
cAMP 반응 서열(CRE)를 포함하는 유닛의 구축을 위해서, CREx2hb용으로서 서열 14 및 서열 15로 표시되는 올리고 DNA 및, CREx2bp용으로서 서열 16 및 서열 17로 표시되는 올리고 DNA를 통상법에 따라서 제조하였다.
각각의 조합으로부터 이루어지는 올리고 DNA를 95 ℃로 열 처리 후, 서서히 온도를 실온까지 내림으로써 이중-나선 DNA(CREx2hb, CREx2bp)를 형성시켰다. CREx2hb를 HindIII 및 BamHI로 소화시키고, CREx2bp를 BamHI 및 PstI로 소화시킴과 동시에, pBluescriptIISK(+)(Stratagene사)를 HindIII 및 PstI로 소화시켰다. 소화된 DNA를 전기 영동하여 양쪽 말단에 제한 효소 소화 부위를 갖는 DNA를 정제한 후, 이들 3개의 DNA(CREx2hb, CREx2bp, pBluescriptIISK(+))를 한번에 라이게이션시켜, 얻어진 플라스미드의 서열을 해석하여 CRE4/pBluescriptIISK를 제조하였다.
다음에 VIP(혈관활성 창자 펩티드(vasoactive intestinal peptide)) 프로모 터를 포함하는 DNA를 얻기 위해서 서열 18 및 서열 19로 표시되는 PCR 프라이머를 통상법에 따라서 제조하였다.
인간 게놈 DNA (Roche Diagostics사)를 주형으로 하여, 서열 18 및 서열 19의 조합으로 이루어지는 PCR 프라이머와, 재조합 Taq 중합효소(Takara사)를 이용하여 (94 ℃ 30 초 - 55 ℃ 30 초 - 72 ℃ 1 분)을 35회 반복함으로써 PCR을 행한 결과, 264 염기쌍의 DNA(서열 20)가 얻어졌다. 이 264 염기쌍의 DNA를 PstI로 소화시켜 CRE4/pBluescriptIISK(+)의 PstI 부위에 삽입하고, 얻어진 플라스미드의 서열을 확인하여 CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)를 제조하였다(도 2A). 이렇게 얻어진 CRE4VIP/pBluescriptIISK(+)에서 HindIII과 SmaI로 소화시킨 후, 얻어진 CRE4VIP 프로모터 단편의 말단을 평활화시켰다.
상술한 발현용 바이러스 벡터 플라스미드 pBabeCLXIH로부터 IRES-hygro(r) 영역을 제거하여 pBabeCLX를 제조하였다(도 2B). pBabeCLX로부터 레트로바이러스 내재성 인핸서 활성(LTR) 중의 NheI-NarI 영역을 제거함으로써 얻어진 외래성 프로모터 도입용 레트로바이러스 벡터 플라스미드에, CRE와 VIP 프로모터를 포함하는 서열과, 리포터 유전자인 태반 유래 알칼리 포스파타제(PLAP)[Goto et al., Molecular Pharmacology, 49, p.860-873, 1996]를 도입하여 pBabeCLcre4vPdNN을 얻었다(도 2C).
(2) 시클릭 AMP 반응 서열을 포함하는 리포터 유전자 도입용 세포 SE203 의 수립
시클릭 AMP 응답 서열에 의해 리포터 유전자 PLAP가 유도되는 레트로바이러 스 벡터 플라스미드 pBabeCLcre4vPdNN을 이용하여, 실시예 4에 기재된 방법에 준하여 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. 제조된 레트로바이러스 벡터를 HEK293 세포에 도입하고, 한계 희석법에 의해 생성된 세포를 클론화하여, PLAP 유도 반응성이 가장 양호한 클론 세포(이하, 「SE302 세포」라 함)을 이하의 실험에 사용하였다.
[실시예 6] SALPR 유전자 도입용 레트로바이러스 벡터에 의한 SALPR 발현 세포의 제조
상기 실시예 4에서 제조한 레트로바이러스 벡터에 의한 세포에의 SALPR 유전자 도입을 이하와 같이 행하였다.
상기 실시예 5에서 구축한 3×103개의 SE302 세포를 96웰 플레이트(아사히 테크노 글래스사)에 10 ％ 소 태아 혈청 (FCS) 및 PS로 보충된 DMEM(SIGMA사)(이하, 「배양액」이라 함) 100 μL를 이용하여 배양하였다. 다음날, 실시예 4에서 제조한 레트로바이러스 벡터를 적절하게 희석하고, 그 100 μL를 배양액으로 제조한 폴리브렌(최종 농도 8 μg/mL)(별명 헥사디메트린 브로마이드, Sigma사)과 함께 SE302 세포에 첨가하였다. 그 다음날, 배양액을 500 μg/mL의 하이그로마이신(Hygromycin)(Invitrogen사) 함유의 배양액 200 μL로 교환하였다. 이 조건에서 증식된 SALPR 유전자 도입용 SE302 세포(이하, 「SALPR-SE302 세포」라 함)를 적시에 계대하여 실험에 사용하였다.
[실시예 7] SALPR-SE302 세포에서의 포스콜린 첨가에 의해 증가된 전사 활성 의 릴락신 -3에 의한 억제
상기 실시예 6에서 구축한 SALPR-SE302 세포를, 전사 활성 측정용 배지(10 ％ FBS(65 ℃에서 30 분 동안 불활성화됨)로 보충된 DMEM)로 현탁시킨 후, 96웰 플레이트(Beckton Dickinson사)에 1웰당 1×104 세포가 되도록 접종하였다. 다음날, 분석용 배지(0.1 ％ 소 혈청 알부민이 보충된 DMEM)로 희석된, 특정 농도의 인간형 릴락신-3(Phoenix Pharamaceuticals사) 또는 인슐린(Invitrogen사)을 첨가하고, 그 후 포스콜린(Carbio Chem사)를 최종 농도 1 μmol/L가 되도록 첨가하였다. 또한 1 일 배양 후, 세포 상등액을 15 μL 회수하여 화학 발광 측정용 96웰 플레이트(스미또모 베이클라이트사)에 옮기고, 분석용 완충액(280 mmol/L Na2CO3-NaHCO3, 8 mmol/L MgSO4, pH 10)을 60 μL, 루미포스(Lumiphos)530(Lumigen사) 70 μL를 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 각 웰의 화학 발광을 융합(Fusion) 플레이트 리더(Perkin Elmer사)로써 측정하여 전사 활성을 평가하였다. 포스콜린 1 μmol/L이 첨가된 세포 상등액의 전사 활성을 100 ％로 하고, 포스콜린을 첨가하지 않은 세포 상등액의 활성을 0 ％로 하여 각 피검 샘플이 첨가된 세포 상등액 중의 활성을 ％로 표시하였다(도 3).
그 결과, 릴락신-3이 포스콜린에 의한 전사 활성의 상승을 SALPR의 활성화를 통해 억제하는 것을 알 수 있었다. 이 전사 활성의 상승은 관련 펩티드인 인슐린에서는 영향이 없었기 때문에, 릴락신-3 특이적인 반응인 것으로 밝혀졌다. 즉, 이러한 실험계를 이용함으로써, 릴락신-3에 의한 SALPR의 활성화에 영향을 주는 화 합물, 또는 물질을 판별할 수 있는 것이 개시되었다.
[실시예 8] 방어적으로 덮어 숨기는 시험을 이용한 릴락신 -3 뇌실 내 투여에 의한 항불안 작용( 래트 )
방어적으로 덮어 숨기는 시험[Treit et al., Pharamacology Biochemistry and Behavior, 15, p.619-626, 1981]을 이용하여 릴락신-3의 불안 작용에 미치는 영향을 조사하였다. 방어적으로 덮어 숨기는 시험은, 피검 동물에게 전극을 통해 전류 자극을 주면, 그 직후에 전극을 마루깔기로 덮어 숨기는 행동을 취하는 것을 이용하여, 불안 작용이나 그 밖의 정신 증상(예를 들면 우울 상태)를 평가하는 실험계이다.
릴락신-3은 가부시끼가이샤 펩티드 겡뀨쇼에서 합성된 인간형 릴락신-3(이하, 간단하게 인간형 릴락신-3(펩티드 겡뀨쇼사 제조)」라 약기하는 경우도 있음)을 이용하여 실험을 행하였다. 인간형 릴락신-3은, 서열 2의 N 말단으로부터 제26번째(Arg) 내지 제52번째(Trp)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 B쇄)와 서열 2의 N 말단으로부터 제119번째(Asp) 내지 제142번째(Cys)의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(인간형 A쇄)로 이루어지는 폴리펩티드로서, 서열 2의 N 말단으로부터 제35번째의 B쇄의 시스테인과 서열 2의 N 말단으로부터 제129번째의 A쇄의 시스테인이 결합하고, 서열 2의 N 말단으로부터 제47번째의 B쇄의 시스테인과 서열 2의 N 말단으로부터 제142번째의 A쇄의 시스테인이 결합하며, 그리고 서열 2의 N 말단으로부터 제128번째의 A쇄의 시스테인과 서열 2의 N 말단으로부터 제133번째의 A쇄의 시스테인이 결합한 폴리펩티드이다.
(1) 피검 래트와 뇌실 내 투여를 위한 전처리
F344 웅성 래트(7 주령, 닛본 찰스 리버(주))에 실험 동물용 사료 MF(오리엔탈 이스트사)를 주어 순화하였다. 래트(150 내지 200 g)를 마취하에서 측뇌실에 캐뉼러를 삽입하였다. 그 후 1 주간 이상, 상기 래트를 사육한 후에 릴락신-3의 투여 실험을 행하였다.
(2) 시험 상자에의 순화
방어적으로 덮어 숨기는 시험 실시의 3 일전부터 매일 1회, 5 cm의 높이까지 마루깔기를 깐 시험 상자에 피검 래트를 도입하여 30 분간 이상 방치하고, 피검 래트를 시험 환경에 순화시켰다. 시험 실시시까지 시험 상자에 자극용 전극을 부착시키지 않고 피검 래트를 환경에 순화시켰다.
(3) 릴락신-3 용액의 제조
인간형 릴락신-3(펩티드 겡뀨쇼사 제조)를 생리 식염수에 용해시킨 후, 최종 농도 0.05 nmol/래트 또는 1 nmol/래트가 되도록 제조하였다.
(4) 릴락신-3 용액의 뇌실 내 투여
가이드 캐뉼러를 장착한 피검 래트를 3군으로 나누고, 인간형 릴락신-3 투여액(0.05 nmol/래트, N=6, 1 nmol/래트, N=8) 또는 비히클(생리 식염수, N=6) 각 5 μL를 주입 펌프를 이용하여 5 μL/2 분의 속도로 투여하였다.
(5) 방어적으로 덮어 숨기는 시험의 실시와 행동 관찰
시험 당일에, 자극용 전극을 부착한 시험 상자(높이 5 cm의 마루깔기)에 피검 래트를 도입하여 실험을 개시하였다. 피검 래트가 자극용 전극에 닿았을 때에 5 mA의 전기 쇼크가 주어진다. 그 후, 자극용 전극에 5 mA의 전류를 통전한 채로 피검 래트를 방치하고, 15 분간(900 초)의 행동 관찰을 개시하였다. 피검 래트의 행동은 전부 비디오 카메라로 촬영하고, 녹화 테이프를 이용하여 최초 전기 쇼크를 받고 나서 15 분간 덮어 숨기는 행동 시간(burying time(초))을 측정하였다. 또한, 덮어 숨기는 행동은, 피검 래트가 앞발을 이용하여 전극 방향을 향해 마루깔기를 덮는 행동이라 정의하였다. 인간형 릴락신-3 투여군과 비히클군과의 비교를 위해, 둔넷형 다중 비교 검정법에 의한 유의차 검정을 행하였다. 도면 중에 있어서 *는 P<0.05를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 비히클 투여군에 비해 인간형 릴락신-3 투여군에서, 덮어 숨기는 행동 시간의 저하가 보였고, 1 nmol 투여군에서는 유의한 감소가 관찰되었다. 이 결과로부터, 릴락신-3이 항불안 작용을 갖는 것이 분명해졌다.
[실시예 9] 고가식 십자 미로를 이용한 릴락신-3 뇌실 내 투여에 의한 불안 작용(마우스)
고가식 십자 미로를 이용하여 릴락신-3의 불안 작용에 미치는 영향을 조사하였다. 고가식 십자 미로 시험은 오픈 아암에 있어서의 탐색 행동(오픈 아암 체재 시간 등)을 지표로 하여, 실험 동물(예를 들면 래트 또는 마우스)의 불안 수준의 측정이나 항불안약의 약효 평가에 널리 이용되는 행동 약리학적 시험이다.
(1) 피검 마우스와 뇌실 내 투여를 위한 전처리
마취하의 7 주령의 BALB/c 웅성 마우스(닛본 찰스 리버(주))의 측뇌실에 캐뉼러를 삽입하였다. 그 후 1 주간 이상 마우스를 사육한 후에 릴락신-3의 투여 실 험을 행하였다.
(2) 릴락신-3 용액의 제조
인간형 릴락신-3(펩티드 겡뀨쇼사 제조)를 생리 식염수로 용해시킨 후, 최종 농도가 1 nmol/마우스가 되도록 제조하였다.
(3) 릴락신-3 용액의 뇌실 내 투여
가이드 캐뉼러를 장착한 피검 마우스에, 인간형 릴락신-3 투여액(N=8) 또는 비히클(생리 식염수)(N=9) 각 2 μL를 주입 펌프를 이용하여 1 μL/분의 속도로 뇌실 내에 투여하였다.
(4) 항불안 작용의 측정
항불안 작용의 측정은 고가식 십자 미로를 이용하여 행하였다. 미로는 마루로부터 45 cm의 높이에 설치하고, 4개의 아암을 중심에 위치하는 중심 플랫 폼(5 cm×5 cm)으로부터 펼쳐진 플러스 기호(+)의 형태로 배열하였는데, 여기에는 2개의 대립하는 오픈 아암(길이 30 cm×폭 5 cm)과 2개의 대립하는 클로즈드 아암(길이 30 cm×폭 5 cm×벽 높이 15 cm)이 포함된다. 조명은 오픈 아암의 바닥면이 60 내지 80 룩스가 되도록 세팅하였다. 시험은, 뇌실 내 투여 10 분 후에 마우스를 한쪽 오픈 아암에 머리가 향하도록 중심 플랫 폼에 두고, 5 분간 행하였다. 시험 시간은 오전 11시부터 16시로 한정하였다. 마우스의 행동은 비디오로 기록하고, 시험 종료 후 비디오 해석에 의해, 각 마우스의 오픈 및 클로즈드 아암에의 진입 횟수, 오픈 및 클로즈드 아암에서의 체재 시간을 측정하였다. 도 5 및 도 6에, 오픈 및 클로즈드 아암에의 진입 횟수의 합계, 5 분간 중의 오픈 아암에 체재한 비율 (％)을 각각 나타내었다. 인간형 릴락신-3 투여군과 비히클군과의 비교에는, t 검정법에 의한 유의차 검정을 행하였다. 도면 중에 있어서 *는 P<0.05를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 인간형 릴락신-3 투여군과 비히클군 사이에서의 오픈 및 클로즈드 아암에의 진입 횟수의 합계에 차이는 없었다. 그러나 도 6에 나타낸 바와 같이, 인간형 릴락신-3 투여군은 비히클 군과 비교하여, 오픈 아암 내의 체재 시간의 비율이 유의하게 높았다. 이 결과로부터, 릴락신-3에는 항불안 작용이 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 10] 고가식 십자 미로를 이용한 릴락신-3 뇌실 내 투여에 의한 항불안 작용(래트)
고가식 십자 미로를 이용하여 릴락신-3의 불안 작용에 미치는 영향을 조사하였다.
(1) 피검 마우스와 뇌실 내 투여를 위한 전처리
마취하의 9 주령의 위스타(Wistar) 웅성 래트(닛본 찰스 리버(주))의 측뇌실에 캐뉼러를 삽입하였다. 그 후 1 주간 이상 사육한 후에 릴락신-3의 투여 실험을 행하였다.
(2) 릴락신-3 용액의 제조
인간형 릴락신-3(펩티드 겡뀨쇼사 제조)를 생리 식염수로 용해시킨 후, 최종 농도가 10 pmol/래트 또는 50 pmol/래트가 되도록 제조하였다.
(3) 릴락신-3 용액의 뇌실 내 투여
가이드 캐뉼러를 장착한 피검 래트에, 인간형 릴락신-3 투여액(10 pmol/래 트, N=8, 50 pmol/래트, N=7) 또는 비히클 군(생리 식염수, N=7) 각 5 μL를 2.5 μL/분의 속도로 인퓨전 펌프를 이용하여 뇌실 내에 투여하였다.
(4) 항불안 작용의 측정
항불안 작용의 측정은 고가식 십자 미로를 이용하여 행하였다. 미로는 마루로부터 50 cm의 높이에 설치하고, 중심에 위치하는 중심 플랫 폼(10 cm×10 cm)으로부터 각각 펼쳐진 2개의 대립하는 오픈 아암(길이 50 cm×폭 10 cm)과 2개의 대립하는 클로즈드 아암(길이 50 cm×폭 10 cm×벽 높이 40 cm)을 포함한다. 조명은 오픈 아암의 바닥면이 60 내지 80 룩스가 되도록 세팅하였다. 시험은, 뇌실 내 투여 10 분 후에 래트를 한쪽 오픈 아암으로 머리가 향하도록 중심 플랫 폼에 두고, 5 분간 행하였다. 시험 시간은 오전 11시부터 16시로 한정하였다. 래트의 행동은 비디오로 기록하고, 시험 종료 후 비디오 해석에 의해 각 래트의 오픈 및 클로즈드 아암에의 진입 횟수, 오픈 및 클로즈드 아암에서의 체재 시간을 측정하였다. 도 7 및 도 8에, 오픈 및 클로즈드 아암에의 진입 횟수의 합계, 5 분간 중의 오픈 아암에 체재한 비율(％)을 각각 나타내었다. 인간형 릴락신-3 투여군과 비히클군과의 비교에는, 둔넷형 다중 비교 검정법에 의한 유의차 검정을 행하였다. 도면 중에 있어서 * 표시는 P<0.05를 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 10 pmol/래트 투여군, 50 pmol/래트 투여군은 비히클군과 비교하여, 오픈 및 클로즈드 아암에의 진입 횟수의 합계에 차이는 없었다. 그러나 도 8에 나타낸 바와 같이, 10 pmol/래트 투여군 및 50 pmol/래트 투여군은 비히클군과 비교하여 오픈 아암 내의 체재 시간의 비율이 높고, 10 pmol/래트의 작용은 통계학적으로 유의하였다. 이 결과로부 터, 릴락신-3에는 항불안 작용이 있는 것이 분명하였다.
릴락신-3은 항불안 작용을 갖기 때문에, 예를 들면 불안의 치료에 유용하다. 또한, 릴락신-3이 항불안 작용을 갖기 때문에, 릴락신-3 수용체를 활성화 또는 억제화시키는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물은 불안 치료에 이용 가능하고, 릴락신-3 수용체를 활성화 또는 억제화시키는 불안 조절에 관련된 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물을 스크리닝하는 방법 및 그의 스크리닝용 키트는 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Eisai R&D Management Co., Ltd. <120> Peptides having antianxiety activity and screening methods <130> 158444PX <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 429 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(429) <223> <400> 1 atg gcc agg tac atg ctg ctg ctg ctc ctg gcg gta tgg gtg ctg acc 48 Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr 1 5 10 15 ggg gag ctg tgg ccg gga gct gag gcc cgg gca gcg cct tac ggg gtc 96 Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val 20 25 30 agg ctt tgc ggc cga gaa ttc atc cga gca gtc atc ttc acc tgc ggg 144 Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly 35 40 45 ggc tcc cgg tgg aga cga tca gac atc ctg gcc cac gag gct atg gga 192 Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly 50 55 60 gat acc ttc ccg gat gca gat gct gat gaa gac agt ctg gca ggc gag 240 Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu 65 70 75 80 ctg gat gag gcc atg ggg tcc agc gag tgg ctg gcc ctg acc aag tca 288 Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser 85 90 95 ccc cag gcc ttt tac agg ggg cga ccc agc tgg caa gga acc cct ggg 336 Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly 100 105 110 gtt ctt cgg ggc agc cga gat gtc ctg gct ggc ctt tcc agc agc tgc 384 Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys 115 120 125 tgc aag tgg ggg tgt agc aaa agt gaa atc agt agc ctt tgc tag 429 Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys 130 135 140 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr 1 5 10 15 Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val 20 25 30 Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly 35 40 45 Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly 50 55 60 Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu 65 70 75 80 Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser 85 90 95 Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly 100 105 110 Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys 115 120 125 Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys 130 135 140 <210> 3 <211> 1410 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1410) <223> <400> 3 atg cag atg gcc gat gca gcc acg ata gcc acc atg aat aag gca gca 48 Met Gln Met Ala Asp Ala Ala Thr Ile Ala Thr Met Asn Lys Ala Ala 1 5 10 15 ggc ggg gac aag cta gca gaa ctc ttc agt ctg gtc ccg gac ctt ctg 96 Gly Gly Asp Lys Leu Ala Glu Leu Phe Ser Leu Val Pro Asp Leu Leu 20 25 30 gag gcg gcc aac acg agt ggt aac gcg tcg ctg cag ctt ccg gac ttg 144 Glu Ala Ala Asn Thr Ser Gly Asn Ala Ser Leu Gln Leu Pro Asp Leu 35 40 45 tgg tgg gag ctg ggg ctg gag ttg ccg gac ggc gcg ccg cca gga cat 192 Trp Trp Glu Leu Gly Leu Glu Leu Pro Asp Gly Ala Pro Pro Gly His 50 55 60 ccc ccg ggc agc ggc ggg gca gag agc gcg gac aca gag gcc cgg gtg 240 Pro Pro Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ser Ala Asp Thr Glu Ala Arg Val 65 70 75 80 cgg att ctc atc agc gtg gtg tac tgg gtg gtg tgc gcc ctg ggg ttg 288 Arg Ile Leu Ile Ser Val Val Tyr Trp Val Val Cys Ala Leu Gly Leu 85 90 95 gcg ggc aac ctg ctg gtt ctc tac ctg atg aag agc atg cag ggc tgg 336 Ala Gly Asn Leu Leu Val Leu Tyr Leu Met Lys Ser Met Gln Gly Trp 100 105 110 cgc aag tcc tct atc aac ctc ttc gtc acc aac ctg gcg ctg acg gac 384 Arg Lys Ser Ser Ile Asn Leu Phe Val Thr Asn Leu Ala Leu Thr Asp 115 120 125 ttt cag ttt gtg ctc acc ctg ccc ttc tgg gcg gtg gag aac gct ctt 432 Phe Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Glu Asn Ala Leu 130 135 140 gac ttc aaa tgg ccc ttc ggc aag gcc atg tgt aag atc gtg tcc atg 480 Asp Phe Lys Trp Pro Phe Gly Lys Ala Met Cys Lys Ile Val Ser Met 145 150 155 160 gtg acg tcc atg aac atg tac gcc agc gtg ttc ttc ctc act gcc atg 528 Val Thr Ser Met Asn Met Tyr Ala Ser Val Phe Phe Leu Thr Ala Met 165 170 175 agt gtg acg cgc tac cat tcg gtg gcc tcg gct ctg aag agc cac cgg 576 Ser Val Thr Arg Tyr His Ser Val Ala Ser Ala Leu Lys Ser His Arg 180 185 190 acc cga gga cac ggc cgg ggc gac tgc tgc ggc cgg agc ctg ggg gac 624 Thr Arg Gly His Gly Arg Gly Asp Cys Cys Gly Arg Ser Leu Gly Asp 195 200 205 agc tgc tgc ttc tcg gcc aag gcg ctg tgt gtg tgg atc tgg gct ttg 672 Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu 210 215 220 gcc gcg ctg gcc tcg ctg ccc agt gcc att ttc tcc acc acg gtc aag 720 Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys 225 230 235 240 gtg atg ggc gag gag ctg tgc ctg gtg cgt ttc ccg gac aag ttg ctg 768 Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu 245 250 255 ggc cgc gac agg cag ttc tgg ctg ggc ctc tac cac tcg cag aag gtg 816 Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val 260 265 270 ctg ttg ggc ttc gtg ctg ccg ctg ggc atc att atc ttg tgc tac ctg 864 Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu 275 280 285 ctg ctg gtg cgc ttc atc gcc gac cgc cgc gcg gcg ggg acc aaa gga 912 Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly 290 295 300 ggg gcc gcg gta gcc gga gga cgc ccg acc gga gcc agc gcc cgg aga 960 Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg 305 310 315 320 ctg tcg aag gtc acc aaa tca gtg acc atc gtt gtc ctg tcc ttc ttc 1008 Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe 325 330 335 ctg tgt tgg ctg ccc aac cag gcg ctc acc acc tgg agc atc ctc atc 1056 Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile 340 345 350 aag ttc aac gcg gtg ccc ttc agc cag gag tat ttc ctg tgc cag gta 1104 Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val 355 360 365 tac gcg ttc cct gtg agc gtg tgc cta gcg cac tcc aac agc tgc ctc 1152 Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu 370 375 380 aac ccc gtc ctc tac tgc ctc gtg cgc cgc gag ttc cgc aag gcg ctc 1200 Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu 385 390 395 400 aag agc ctg ctg tgg cgc atc gcg tct cct tcg atc acc agc atg cgc 1248 Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg 405 410 415 ccc ttc acc gcc act acc aag ccg gag cac gag gat cag ggg ctg cag 1296 Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln 420 425 430 gcc ccg gcg ccg ccc cac gcg gcc gcg gag ccg gac ctg ctc tac tac 1344 Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr 435 440 445 cca cct ggc gtc gtg gtc tac agc ggg ggg cgc tac gac ctg ctg ccc 1392 Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro 450 455 460 agc agc tct gcc tac tga 1410 Ser Ser Ser Ala Tyr 465 <210> 4 <211> 469 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gln Met Ala Asp Ala Ala Thr Ile Ala Thr Met Asn Lys Ala Ala 1 5 10 15 Gly Gly Asp Lys Leu Ala Glu Leu Phe Ser Leu Val Pro Asp Leu Leu 20 25 30 Glu Ala Ala Asn Thr Ser Gly Asn Ala Ser Leu Gln Leu Pro Asp Leu 35 40 45 Trp Trp Glu Leu Gly Leu Glu Leu Pro Asp Gly Ala Pro Pro Gly His 50 55 60 Pro Pro Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ser Ala Asp Thr Glu Ala Arg Val 65 70 75 80 Arg Ile Leu Ile Ser Val Val Tyr Trp Val Val Cys Ala Leu Gly Leu 85 90 95 Ala Gly Asn Leu Leu Val Leu Tyr Leu Met Lys Ser Met Gln Gly Trp 100 105 110 Arg Lys Ser Ser Ile Asn Leu Phe Val Thr Asn Leu Ala Leu Thr Asp 115 120 125 Phe Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Glu Asn Ala Leu 130 135 140 Asp Phe Lys Trp Pro Phe Gly Lys Ala Met Cys Lys Ile Val Ser Met 145 150 155 160 Val Thr Ser Met Asn Met Tyr Ala Ser Val Phe Phe Leu Thr Ala Met 165 170 175 Ser Val Thr Arg Tyr His Ser Val Ala Ser Ala Leu Lys Ser His Arg 180 185 190 Thr Arg Gly His Gly Arg Gly Asp Cys Cys Gly Arg Ser Leu Gly Asp 195 200 205 Ser Cys Cys Phe Ser Ala Lys Ala Leu Cys Val Trp Ile Trp Ala Leu 210 215 220 Ala Ala Leu Ala Ser Leu Pro Ser Ala Ile Phe Ser Thr Thr Val Lys 225 230 235 240 Val Met Gly Glu Glu Leu Cys Leu Val Arg Phe Pro Asp Lys Leu Leu 245 250 255 Gly Arg Asp Arg Gln Phe Trp Leu Gly Leu Tyr His Ser Gln Lys Val 260 265 270 Leu Leu Gly Phe Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ile Leu Cys Tyr Leu 275 280 285 Leu Leu Val Arg Phe Ile Ala Asp Arg Arg Ala Ala Gly Thr Lys Gly 290 295 300 Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Thr Gly Ala Ser Ala Arg Arg 305 310 315 320 Leu Ser Lys Val Thr Lys Ser Val Thr Ile Val Val Leu Ser Phe Phe 325 330 335 Leu Cys Trp Leu Pro Asn Gln Ala Leu Thr Thr Trp Ser Ile Leu Ile 340 345 350 Lys Phe Asn Ala Val Pro Phe Ser Gln Glu Tyr Phe Leu Cys Gln Val 355 360 365 Tyr Ala Phe Pro Val Ser Val Cys Leu Ala His Ser Asn Ser Cys Leu 370 375 380 Asn Pro Val Leu Tyr Cys Leu Val Arg Arg Glu Phe Arg Lys Ala Leu 385 390 395 400 Lys Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Ser Pro Ser Ile Thr Ser Met Arg 405 410 415 Pro Phe Thr Ala Thr Thr Lys Pro Glu His Glu Asp Gln Gly Leu Gln 420 425 430 Ala Pro Ala Pro Pro His Ala Ala Ala Glu Pro Asp Leu Leu Tyr Tyr 435 440 445 Pro Pro Gly Val Val Val Tyr Ser Gly Gly Arg Tyr Asp Leu Leu Pro 450 455 460 Ser Ser Ser Ala Tyr 465 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp 20 25 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Lys Trp Gly Cys Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys 20 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Lys Cys Cys Leu Ile Gly Cys Thr 1 5 10 15 Lys Arg Ser Leu Ala Lys Tyr Cys 20 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr 1 5 10 15 Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys 20 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Thr Asn Pro Ala Arg Tyr Cys Cys Leu Ser Gly Cys Thr Gln Gln 1 5 10 15 Asp Leu Leu Thr Leu Cys 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Tyr Ser Glu Lys Cys Cys Leu Thr Gly Cys Thr Lys Glu Glu Leu 1 5 10 15 Ser Ile Ala Cys 20 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense primer <400> 11 gatatcgccg ccaccatgca gatggccgat gcagccac 38 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense primer <400> 12 gatatctcag taggcagagc tgctgggc 28 <210> 13 <211> 5020 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pBabe Puro <400> 13 ctgcagcctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca 60 gggccaagaa cagatggaac agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt 120 tcctgccccg gctcagggcc aagaacagat ggtccccaga tgcggtccag ccctcagcag 180 tttctagaga accatcagat gtttccaggg tgccccaagg acctgaaatg accctgtgcc 240 ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga 300 gctcaataaa agagcccaca acccctcact cggggcgcca gtcctccgat tgactgagtc 360 gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct cttgcagttg catccgactt gtggtctcgc 420 tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat tgactacccg tcagcggggg tctttcattt 480 gggggctcgt ccgggatcgg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg 540 taagctggcc agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg actgatttta 600 tgcgcctgcg tcggtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa 660 ctgacgagtt ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc 720 gtttttgtgg cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg 780 tggttctggt aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt 840 cggtttggaa ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagca tcgttctgtg ttgtctctgt 900 ctgactgtgt ttctgtattt gtctgaaaat tagggccaga ctgttaccac tcccttaagt 960 ttgaccttag atcactggaa agatgtcgag cggctcgctc acaaccagtc ggtagatgtc 1020 aagaagagac gttgggttac cttctgctct gcagaatggc caacctttaa cgtcggatgg 1080 ccgcgagacg gcacctttaa ccgagacctc atcacccagg ttaagatcaa ggtcttttca 1140 cctggcccgc atggacaccc agaccaggtc ccctacatcg tgacctggga agccttggct 1200 tttgaccccc ctccctgggt caagcccttt gtacacccta agcctccgcc tcctcttctt 1260 ccatccgcgc cgtctctccc ccttgaacct cctctttcga ccccgcctca atcctccctt 1320 tatccagccc tcactccttc tctaggcgcc ggccggatcc cagtgtggtg gtacgtagga 1380 attcgccagc acagtggtcg acctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc 1440 aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg 1500 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1560 agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 1620 ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 1680 ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa 1740 acgctgcttg aggctgaagg tgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1800 gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1860 taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1920 accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1980 tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2040 cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2100 agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2160 gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 2220 gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 2280 tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 2340 acgatcgata aaataaaaga ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa tgaaagaccc 2400 cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac 2460 ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg 2520 gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg 2580 aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 2640 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc cagccctcag cagtttctag agaaccatca 2700 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 2760 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 2820 acaacccctc actcggggcg ccagtcctcc gattgactga gtcgcccggg tacccgtgta 2880 tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga cttgtggtct cgctgttcct tgggagggtc 2940 tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg gggtctttca catgcagcat gtatcaaaat 3000 taatttggtt ttttttctta agtatttaca ttaaatggcc atagttgcat taatgaatcg 3060 gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 3120 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 3180 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 3240 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 3300 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 3360 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 3420 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 3480 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 3540 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 3600 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 3660 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 3720 ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 3780 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 3840 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 3900 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 3960 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagtttgcg gccgcaaatc aatctaaagt 4020 atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 4080 gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 4140 atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 4200 ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 4260 cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 4320 agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 4380 cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 4440 tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 4500 agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 4560 gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 4620 gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg 4680 ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 4740 tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 4800 tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 4860 gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 4920 caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 4980 atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 5020 <210> 14 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense strand for CREx2hb <400> 14 cccaagcttg atatcgaatt cgacgtcaca gtatgacggc catgggaatt cgacgtcaca 60 gtatgacggc catggggatc ccg 83 <210> 15 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense strand for CREx2hb <400> 15 cgggatcccc atggccgtca tactgtgacg tcgaattccc atggccgtca tactgtgacg 60 tcgaattcga tatcaagctt ggg 83 <210> 16 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense strand for CREx2bp <400> 16 tgcactgcag gaattcccat ggccgtcata ctgtgacgtc gaattcccat ggccgtcata 60 ctgtgacgtc ggatcccg 78 <210> 17 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense strand for CREx2bp <400> 17 cgggatccga cgtcacagta tgacggccat gggaattcga cgtcacagta tgacggccat 60 gggaattcct gcagtgca 78 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sense primer <400> 18 tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense primer <400> 19 tgcactgcag gtcggagctg actgttctgg 30 <210> 20 <211> 264 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Vasoactive intestinal peptide promoter <400> 20 tcgactgcag cccatggccg tcatactgtg tgacgtcttt cagagcactt tgtgattgct 60 cagtcctaag tataagccct ataaaatgat gggctttgaa atgctggtca gggtagagtg 120 agaagcacca gcaggcagta acagccaacc cttagccatt gctaagggca gagaactggt 180 ggagcctttc tcttactccc aggacttcag cacctaagac agctccaaaa caaaccagaa 240 cagtcagctc cgacctgcag tgca 264

Claims (20)

  1. 릴락신-3, 그의 염 또는 이들의 수화물을 함유하는 항불안제.
  2. 제1항에 있어서, 릴락신-3이 인간형 릴락신-3인 항불안제.
  3. 제1항에 있어서, 릴락신-3이 릴락신-3의 프리프로프로테인과 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지거나 또는 릴락신-3의 프리프로프로테인의 상동 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지는 폴리펩티드이며, 여기서 A쇄 및 B쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드인 항불안제.
  4. (A) 피검 물질을 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획에 접촉시키는 단계; 및
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항불안 작용을 갖는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
  5. (A) 릴락신-3, 그의 염 또는 이들의 수화물과 피검 물질을, 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획에 접촉시키는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 불안 작용을 억제 또는 촉진시키는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서, 릴락신-3이 인간형 릴락신-3인 스크리닝 방법.
  7. 제5항에 있어서, 릴락신-3이 릴락신-3의 프리프로프로테인과 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지거나 또는 릴락신-3의 프리프로프로테인의 상동 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지는 폴리펩티드이며, 여기서 A쇄 및 B쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드인 스크리닝 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (B) 릴락신-3 수용체를 통한 세포 자극 활성을 측정하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 불안 작용을 억제 또는 촉진시키는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 릴락신-3 수용체가 소마토스타틴- 및 안지오제닌-유사 펩티드 수용체(SALPR) 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서, SALPR이 서열 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  11. 릴락신-3 수용체, 릴락신-3 수용체를 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항불안 작용을 갖는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 릴락신-3, 그의 염 또는 이들의 수화물을 더 포함하는 스크리닝용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 릴락신-3이 인간형 릴락신-3인 스크리닝용 키트.
  14. 제12항에 있어서, 릴락신-3이 릴락신-3의 프리프로프로테인과 기능적으로 등가인 개질 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지거나 또는 릴락신-3의 프리프로프로테인의 상동 폴리펩티드로부터 얻어질 수 있는 A쇄 및 B쇄로 이루어지는 폴리펩티드이며, 여기서 A쇄 및 B쇄의 시스테인 잔기가 디술피드 결합에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드인 스크리닝용 키트.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 릴락신-3이 표지되어 있는 스크리닝용 키트.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 릴락신-3 수용체가 SALPR 또는 그의 부분 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝용 키트.
  17. 제16항에 있어서, SALPR이 서열 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝용 키트.
  18. 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물을 인간 또는 인간 이외의 생물에게 투여하는 단계; 및 투여 후의 불안 작용을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 불안 작용을 억제 또는 촉진시키는 화합물, 그의 염 또는 이들의 수화물의 스크리닝 방법.
  19. 제18항에 있어서, 불안 작용을 측정하는 공정이 방어적으로 덮어 숨기는 시험(defensive burying test) 또는 고가식 십자 미로 시험(elevated plus-maze test)인 스크리닝 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 릴락신-3 수용체에 작용하는 화합물이 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 화합물인 스크리닝 방법.
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