JP2007524371A - レラキシン３−ｇｐｃｒ１３５複合体ならびにそれらの生産及び使用 - Google Patents

Abstract

ＧＰＣＲ１３５レセプター活性のモジュレーターに関するスクリーニングのためのアッセイ試薬として有用なＧＰＣＲ１３５／レラキシン３複合体を記載する。

Description

発明の分野
本発明は、ＧＰＣＲ１３５及びレラキシン３（ｒｅｌａｘｉｎ３）のリガンド−及び−レセプター複合体に関する。本発明はそのような複合体の調製方法及びそれらの使用方法にも関する。本発明はさらにラットＧＰＣＲ１３５レセプターのイソ型に関する。

発明の背景
ＧＰＣＲ１３５
Ｇ−タンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲｓ）は、ホルモン、神経伝達物質、ペプチド、脂質、イオン、光、臭気物質（ｏｄｏｒａｎｔｓ）、ヌクレオチド、脂肪酸誘導体及び他の化学的媒体を含む多様な細胞外シグナルの列の伝達を担う貫膜レセプタータンパク質である。例えば特許文献１を参照されたい。ＧＰＣＲｓは、それらが優れた薬剤標的として確立されているために、薬剤発見のために特に重要である：それらは市販されている薬剤の５０％の標的である。ＧＰＣＲｓと関連していることが見出された疾患の数は増加している。ＧＰＣＲｓを標的とする薬剤は、心臓血管障害から胃−腸障害からＣＮＳ障害まで及び他の広範囲の障害の処置に用いられてきた（非特許文献１）。

ＧＰＣＲ−媒介シグナル伝達の事象は、多くの場合にＧＰＣＲに特異的リガンドが結合すると開始される。各ＧＰＣＲは細胞外Ｎ−末端ドメイン、７つの別個の貫膜セグメント及び細胞内Ｃ−末端ドメインから構成される。ＧＰＣＲの細胞外Ｎ−末端ドメインへのリガンドの結合は、ＧＰＣＲと関連する細胞内ヘテロトリマー（ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ）ＧＴＰ−結合タンパク質（Ｇタンパク質）の活性化に導くコンフォーメーション変化を生ずる。これらの活性化されたＧタンパク質は、今度は細胞生理学を調節する多様な細胞内応答を媒介する。従って、リガンドはＧＰＣＲの生理学的機能の解明の手段ならびにＧＰＣＲのシグナル伝達活性を調節する化合物に関するスクリーニングの方法を与える。

現在、約２００種のＧＰＣＲｓが既知のＧＰＣＲｓとして分類されているのみであり、それらは約７０種の既知のリガンドにより活性化される。配列分析を介し、ＧＰＣＲｓがヒトゲノムの最大のスーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｉｅｓ）の１つに属することが見出された：ＧＰＣＲｓをコードする１０００個を超える遺伝子において評価された（非特許文献２）。多数の推定ＧＰＣＲｓが、それらの自然のリガンドが未知であるために、オーファンレセプターとして記載されている。これらの未特性化オーファンＧＰＣＲｓのいくつかは治療標的として有用であり得る。ＧＰＣＲへの特異的リガンドの同定は、これらのオーファンＧＰＣＲｓの可能な治療的利益を利用するための要点である（非特許文献３）。

ＧＰＣＲ１３５は、ほとんど中枢神経系のみで発現されることが見出されたオーファンレセプターである。ＧＰＣＲ１３５はソマトスタチン−及びアンギオテンシン−様ペプチドレセプター（ＳＡＬＰＲ）とも呼ばれてきた（非特許文献４）。ヒトにおいて、ＧＰＣＲ１３５はソマトスタチン（ＳＳＴＲ５）及びアンギオテンシン（ＡＴ１）のレセプターとそれぞれ約３５％及び３１％のアミノ酸配列類似性を共有する。しかしながら、Ｃｏｓ−１細胞におけるＧＰＣＲ１３５の一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、ソマトスタチン又はアンギオテンシンＩＩに関する結合部位を生じず、これらのリガンドがＧＰＣＲ１３５に結合しないことを示した。ＧＰＣＲ１３５の推定アミノ酸配列は、そのリガンドがペプチド的（ｐｅｐｔｉｄｅｒｇｉｃ）性質のものであることを
示唆している。ＧＰＣＲ１３５ ｍＲＮＡは黒質及び下垂体のような別個の脳領域において低いレベルで発現され、以前は同定されていなかった神経ぺプチドがおそらくＧＰＣＲ１３５リガンドであることを意味している（非特許文献４）。
レラキシン３
ヒトレラキシン３（Ｈ３）及びそのマウス同等物（Ｍ３）は、配列相同性に基づいて、レラキシン−関連ペプチドとしてＣｅｌｅｒａゲノムデータベースから同定された（非特許文献５）。いずれの遺伝子も、古典的な２つの鎖（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ）、レラキシン／インスリン群の３つのシステイン−結合構造及びレラキシンレセプター結合に必須のＢ−鎖中のＲＸＸＸＲＸＸ（Ｉ／Ｖ）モチーフが導入された推定プロホルモン配列をコードする。インスリン／レラキシン群の他のメンバーと比較して、Ｈ３及びＭ３は系統樹上の別の枝の下にグループ分けされ、これらの特定のレラキシンの進化が、主に妊娠のホルモンとして機能するレラキシン１又はレラキシン２のような他のレラキシンから分岐したことを示している。従ってレラキシン３はレラキシン１又はレラキシン２の機能と別個の機能を有し得る。最近の研究は、レラキシン３が生殖、脳、腎臓、心臓血管及び他の機能において役割を有し得るロイシンの豊富な反復−含有オーファンＧＰＣＲ（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｒｐｈａｎ ＧＰＣＲ）であるＬＧＲ７を活性化することを示した。レラキシン３ ｍＲＮＡの発現の低いレベルのために、ヒト組織におけるその分布についてほとんど知られていないが、Ｍ３ ｍＲＮＡはマウス脳において、特に雌のＣ５７ＢＬＫ６Ｊマウスの背面被蓋核の腹側正中部及び網様体核の背面部を取り巻く細胞中の橋／髄質（ｐｏｎｓ／ｍｅｄｕｌｌａ）において検出された。これは、哺乳類脳中の神経ペプチドとしてのレラキシン３の役割の可能性を示唆している（非特許文献５）。
国際公開第０２／００７１９号パンフレット Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １２５：１９９８年，１３８７−１３９２ Ｃｉｖｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．著，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２４：２００１年，２３０−２３７ Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．著，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２：２００１年，１３２−１４０ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．著，Ｇｅｎｅ ２４８：２０００年，１８３−１８９ Ｂａｔｈｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２００２年，１１４８−１１５７ Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，２００２年，６７１−６７４ Ｓｕｄｏ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７８：２００３年，７８５５−７８６２

発明の概略
今回、レラキシン３がＧＰＣＲ１３５に関する自然のリガンドであることが見出された。

従って１つの一般的側面において、本発明は、レラキシン３又はレラキシン３の活性フラグメントを含有するリガンド成分に結合したＧＰＣＲ１３５又はＧＰＣＲ１３５の活性フラグメントを含有するレセプター成分を含んでなり、ここでレセプター及びリガンド成分の少なくとも１つが実質的に純粋な形態にあるレセプター−リガンド複合体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘ）に関する。

他の一般的側面において、本発明は：配列番号：１５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有する単離されたポリヌクレオチド；そのようなアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド；そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター（ｖｅｃｔｏｒ）；ならびにそのようなベクターを含んでなる組換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）に関する。

本発明の追加の一般的側面は：レラキシン３プロペプチドのＡ鎖とＣ鎖の間のペプチド結合及びＣ鎖とＢ鎖の間のペプチド結合から選ばれる少なくとも１つの位置においてプロテアーゼ切断部位（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）を形成するペプチド結合の挿入により改変されたレラキシン３プロペプチドをコードするＤＮＡ分子を構築し；改変されたレラキシン３プロペプチドを発現する第１のベクターを構築し；改変されたレラキシン３プロペプチドを、挿入されたプロテアーゼ切断部位において切断するためのプロテアーゼを発現する第２のベクターを構築し；第１のベクター及び第２のベクターの両方を宿主細胞中に導入し；そして宿主細胞を生育して改変されたレラキシン３プロペプチド及びプロテアーゼの両方を発現させ、それによりプロテアーゼが改変されたレラキシン３プロペプチドを、挿入されたペプチド結合において有効に切断することを含んでなる、組換え細胞からのレラキシン３の生産方法に関する。

本発明のさらに別の一般的側面は、アッセイ又はスクリーニング法に関する。例えばＧＰＣＲ１３５／レラキシン３複合体の生物学的活性を向上させるかもしくは低下させる化合物の同定の１つの一般的方法は：化合物及び緩衝溶液を含んでなる試験試料を、本発明のレセプター−リガンド複合体を含んでなるアッセイ試薬と接触させ；レセプター−リガンド複合体の生物学的活性を決定し；そしてその決定において得られた測定を、レセプター−リガンド複合体を緩衝溶液と接触させた対照測定と比較することを含んでなる。ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントに結合する化合物の同定の他の一般的アッセイ法は：ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを試験化合物及び標識レラキシン３又はその活性フラグメントと接触させ；そしてＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントと結合した標識レラキシン３又はその活性フラグメントの量を決定し、そして次いでその量を、ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを試験化合物の不在下で標識レラキシン３又はその活性フラグメントと接触させた対照測定と比較することを含んでなる。さらに別の一般的アッセイは：ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを含んでなるアッセイ試薬と試験化合物を接触させ；ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントの生物学的活性を決定し；そしてこの結果を、ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを試験化合物の不在下でレラキシン３又はその活性フラグメントと接触させた対照測定の結果と比較することを含んでなる、ＧＰＣＲ１３５に結合し、レラキシン３を模する化合物の同定方法に関する。

本発明の他の側面、特徴及び利点は、発明の詳細な記述及びその好ましい態様ならびに添付の請求項を含む以下の開示から明らかになるであろう。
図面の簡単な記述
図１は、ヒト、マウス及びラットＧＰＣＲ１３５の間のアミノ酸配列の比較を示す。示されるラットの配列はラットＧＰＣＲ１３５ｓである。

図２は、種々のラット組織におけるＧＰＣＲ１３５リガンド活性を示す。種々のラット組織は、エタノール／ＨＣｌ法を用いて抽出された。得られる組織抽出物を種々の希釈において、レセプターの供給源として単離されたヒトＧＰＣＲ１３５発現細胞膜を用いるＧＴＰγＳ結合アッセイにおけるリガンドとして用いた。

図３は、ＧＰＣＲ１３５リガンドの分子量特性化を示す。粗ラット脳エタノール／ＨＣｌ抽出物を、ＨＰＬＣ−ゲル濾過カラムを介して溶離させた。１分当たり１つの画分において画分を集めた。各画分をＧＴＰγＳ結合アッセイにおいてＧＰＣＲ１３５リガンド活性に関して検定した。平行実験において、既知の分子量を有するペプチド及びヌクレオチドを、標準として働く試料条件において溶離させた。

図４は、ヒト、マウス、ラットレラキシン３（Ｒ３）及びブタ脳から精製されたＧＰＣＲ１３５リガンドの間のアミノ酸配列比較を示す。

図５は、ヒトレラキシン３がトランスフェクションされたＣＯＳ細胞からの細胞培養培地におけるＧＰＣＲ１３５リガンド活性を示す。ヒトレラキシン３がトランスフェクションされた（ＣＯＳ７ ＨＲ３）又はヒトレラキシン３なしの（ＣＯＳ Ｃｔ）ＣＯＳ細胞からの細胞培養培地をイオン交換及びＣ−１８カラムにより濃縮した。濃縮された細胞培養培地を種々の希釈度において希釈し、ＧＴＰγＳ結合アッセイを用いてＧＰＣＲ１３５リガンド活性に関して調べた。

図６は、ＧＰＣＲ１３５及びＧｑｉ５を共−発現するＨＥＫ２９３細胞において、レラキシン３がＣａ^２＋動態化を刺激することを示す。トランスフェクションされない（２９３標準）あるいは単独のＧｑｉ５でトランスフェクションされた（２９３／Ｇｑｉ５）、単独のヒトＧＰＣＲ１３５でトランスフェクションされた（ＧＰＣＲ１３５）、又はヒトＧＰＣＲ１３５及びＧｑｉ５により共−トランスフェクションされた（ＧＰＣＲ１３５／Ｇｑｉ５）ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトレラキシン３の刺激下におけるＣａ^２＋動態化アッセイのために用いた。ＦＬＩＰＲを用いてリガンド刺激細胞内Ｃａ^２＋動態化を監視した。

図７は、^１２５Ｉ−レラキシン３がＧＰＣＲ１３５に特異的に結合することを示す。競合物質としての１ □Ｍの非標識ヒトレラキシン３の存在下（「競合」）又は不在下（「全結合」）において、^１２５Ｉ−標識ヒトレラキシン３を用いる結合アッセイのために、トランスフェクションされない（ＮＣ）あるいはそれぞれｐｃＤＮＡ３．１（ベクター標準）、ヒトＧＰＣＲ１３５（ｈＧＰＣＲ１３５）、マウスＧＰＣＲ１３５（ｍＧＰＣＲ１３５）、ラットＧＰＣＲ１３５長鎖形態（ｌｏｎｇ ｆｏｒｍ）（ｒＧＰＣＲ１３５Ｌ）及びラットＧＰＣＲ１３５短鎖形態（ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ）（ｒＧＰＣＲ１３５ｓ）でトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞を用いた。

図８は、ｃＡＭＰ蓄積アッセイから、ＧＰＣＲ１３５へのレラキシン３の結合が細胞内ｃＡＭＰ濃度を低下させることを示す。ヒトＧＰＣＲ１３５を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＧＰＣＲ１３５）及びトランスフェクションされないＣＨＯ−Ｋ１細胞（標準）をｃＡＭＰ蓄積アッセイのために用いた。示される種々の刺激物質を用いて細胞を処理した。細胞内に蓄積したｃＡＭＰをＨＣｌにより抽出し、^１２５Ｉ−標識ｃＡＭＰ及びＦｌａｓｈプレートを用いてＥＬＩＳＡキット（ＮＥＮ）により、ｃＡＭＰの濃度を測定した。
発明の詳細な記述及びその好ましい態様
下記で引用されるすべての公開文献は、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる。他にことわらなければ、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野における通常の熟練者に通常理解されると同じ意味を有
する。

以下は、本明細書下記において時々用いられる略語である：
ｂｐ＝塩基対
Ｃａ^２＋＝カルシウムイオン
ｃＡＭＰ＝サイクリックアデノシン一リン酸
ｃＤＮＡ＝相補的ＤＮＡ
ＣＮＳ＝中枢神経系
ｋｂ＝キロベース；１０００塩基対
ｋＤａ＝キロダルトン；１０００ダルトン
ＧＰＣＲ＝Ｇタンパク質共役レセプター
Ｇタンパク質＝ＧＴＰ−結合タンパク質
ＧＴＰ＝グアノシン５’−三リン酸
ｎｔ＝ヌクレオチド
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＳｉＲＮＡ＝干渉性小分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）
ＵＴＲ＝非翻訳領域
「含む」、「含んでなる」及び「含有する」という用語は、本明細書で、それらの開放された非−制限的な意味で用いられる。

ポリペプチド又は核酸の「活性」、「生物学的活性」又は「機能的活性」は、標準的方法に従って生体内又は試験管内で決定されるポリペプチド又は核酸分子により発揮される活性を指す。そのような活性は、第２のタンパク質との会合又はそれへの酵素活性のような直接的活性あるいはタンパク質の第２のタンパク質との相互作用により媒介される細胞シグナリング活性のような間接的活性であることができる。

レラキシン３の代表的な生物学的活性は、ＧＰＣＲ１３５に結合し、ＧＰＣＲ１３５により行なわれるシグナル伝達事象を開始させるその能力である。ＧＰＣＲ１３５の代表的な生物学的活性は、ＧＰＣＲ１３５がレラキシン３に結合すると、ＧＴＰへの高い親和性を有するＧ−タンパク質の活性化を介し、サイクリックＡＭＰ及びカルシウムのような細胞内シグナリング分子（二次メッセンジャー（ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）分子）の濃度を変える一連の事象を活性化することである。これらの細胞内シグナリング分子が、今度は細胞の生理学及び挙動を変える。

「クローン」は、単細胞又は共通祖先から有糸分裂により誘導される細胞の集団である。「細胞系」は、多くの世代に及んで試験管内で安定して成長できる初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）のクローンである。

「レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体に関連する障害」は、レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体の過剰活性又は不十分な活性に関連する障害又は疾患ならびにそのような障害又は疾患に伴う状態を意味する。「過剰活性」という用語は、リガンド及びレセプター複合体の発現の増加あるいは複合体の生物学的活性の向上を指す。「不十分な活性」という用語は、リガンド及びレセプター複合体の発現の減少又は複合体の生物学的活性の低下を指す。

「遺伝子変異」又は「変異」は、１つの集団中の少なくとも１つの個体において特定の遺伝子座に存在し、且つ野生型と異なる特定の遺伝子変異を意味する。

本明細書で用いられる場合、「ＧＰＣＲ１３５」又は「レセプター成分」は：（１）ＳＡＬＰＲとも呼ばれるヒトＧＰＣＲ１３５（Ｍａｔｓｕｍｏｔｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｇｅｎｅ ２４８：２０００年，１８３−１８９，ＧｅｎＢａｎｋ タンパク質受け入れ番号：ＢＡＡ９３００１）に約６０％より高いアミノ酸配列同一性を有するか；（２）本明細書に記載されるヒトＧＰＣＲ１３５タンパク質に対する抗体、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に結合できるか；あるいは（３）ヒトＧＰＣＲ１３５ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ヌクレオチド受け入れ番号：Ｄ８８４３７）に約６０％より高いヌクレオチド配列同一性を有する配列を持つ核酸分子に、緊縮ハイブリッド形成条件下で特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを指す。「緊縮ハイブリッド形成条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．著，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年に記載されているような、当該技術分野において既知の意味を有する。

好ましい態様において、レセプター成分は、ヒトＧＰＣＲ１３５に６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５パーセントより高いアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。他の好ましい態様において、レセプター成分は、ヒトＧＰＣＲ１３５ｃＤＮＡに６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５パーセントより高いヌクレオチド配列同一性を有する配列を持つ核酸分子に、緊縮ハイブリッド形成条件下で特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。

代表的なＧＰＣＲ１３５レセプター成分には、ヒト（配列番号：１２，ＧｅｎＢａｎｋ
受け入れ番号：ＢＡＡ９３００１，Ｑ９ＮＳＤ７及びＮＰ ０５７６５２）、ラット（配列番号：１４及び配列番号：１５，ヒトの配列に８５．９％の配列同一性）、マウス（配列番号：１３，ヒトの配列に８６．４％の配列同一性）ならびにブタ及びサルを含む他の動物において同定されたオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）が含まれる。「ＧＰＣＲ１３５の活性フラグメント」は、哺乳類レラキシン３への結合及びＧ−タンパク質の活性化のようなＧＰＣＲ１３５の生物学的活性を保持しているＧＰＣＲ１３５タンパク質のフラグメントを意味する。ヒトＧＰＣＲ１３５のタンパク質又はｃＤＮＡ配列は特許出願、国際公開第００／２３１１１号パンフレット、国際公開第００／２４８９１号パンフレット、国際公開第０１／４８１８９号パンフレット、国際公開第０１／６２７９７号パンフレット、国際公開第０１／７４９０４号パンフレット及び国際公開第０１／８５７９１号パンフレットに開示されている。

本明細書で用いられる場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター上の、あるいは細胞染色体中に組み込まれたあるＤＮＡ分子を含有する細胞を指す。宿主細胞は、内在的にそのＤＮＡ分子を含有する本来の宿主細胞又は下記で定義される組換え宿主細胞であることができる。

「単離された」核酸分子は、異なる核酸配列を有する核酸分子から実質的に分離された核酸分子である。本発明の単離された核酸分子の態様には、好ましくはヒト起源のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。

「単離された」又は「精製された」タンパク質又はその生物学的に活性なフラグメントもしくは部分は、タンパク質が生産され且つ単離された細胞もしくは組織源からの細胞材料又は他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、あるいはタンパク質が化学的に合成される場合には、化学的前駆体又は他の化学品を実質的に含まない。例えば細胞材料を実質的に含まないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％もしくは５％（乾燥重量により）未満の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれ得る。タンパク質又はその
生物学的に活性な部分が組換えにより生産される場合、それは好ましくは培地も実質的に含まず、すなわち培地はタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％又は５％未満に相当する。タンパク質が化学合成により生産される場合、それは好ましくは化学的前駆体又は他の化学品を実質的に含まず、すなわちそれはタンパク質の合成に含まれる化学的前駆体又は他の化学品から分離される。従ってそのようなタンパク質の調製物は、約３０％、２０％、１０％又は５％（乾燥重量により）未満の化学的前駆体又は本発明のポリペプチド以外の化合物を有する。

単離された生物学的に活性なポリペプチドはいくつかの異なる物理的形態を有することができる。単離されたポリペプチドは全−長ナセントもしくはプロセシングされないポリペプチドとして、あるいは部分的にプロセシングされたポリペプチド又はプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在することができる。全−長ナセントポリペプチドは、全−長ナセントポリペプチドのフラグメントの形成を生ずる特異的なタンパク質分解的切断事象により、翻訳後に改変され得る。フラグメント又はフラグメントの物理的会合物（ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、全−長ポリペプチドに関連する生物学的活性を有することができる；しかしながら、個々のフラグメントに関連する生物学的活性の程度は変わることができる。

本明細書で用いられる「リンカー領域」又は「リンカードメイン」という用語あるいは類似のそのような記述的用語は、クローニングベクター又は融合タンパク質の構築において用いられる１個もしくはそれより多いポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を指す。リンカー領域の機能には、ヌクレオチド配列中へのクローニング部位の導入、２つのタンパク質ドメインの間における変更可能成分（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）又は空間−形成領域（ｓｐａｃｅ−ｃｒｅａｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）の導入あるいは特異的な分子相互作用を助長するためのアフィニティータグ（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）の形成が含まれ得る。必要ならリンカー領域を、ポリペプチド又はヌクレオチド配列構築の間に融合タンパク質中に導入することができる。

本明細書で用いられる「核酸」という用語は、１個もしくはそれより多いヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は両方を含んでなる分子を指す。該用語はリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドのモノマー及びポリマーを含み、ポリマーの場合には、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドが５’から３’への連結を介して一緒に結合している。リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドポリマーは、１本鎖又は２本鎖であることができる。しかしながら連結は、例えば５’から３’への連結を含んでなる核酸を含む当該技術分野において既知の連結のいずれを含むこともできる。ヌクレオチドは天然に存在することができるか、あるいは天然に存在する塩基対と塩基−対関係を形成することができる合成により生産される類似体であることができる。塩基−対関係を形成することができる天然に存在しない塩基の例にはａｚａ及びｄｅａｚａピリミジン類似体、ａｚａ及びｄｅａｚａプリン類似体ならびにピリミジン環の炭素及び窒素原子の１個もしくはそれより多くがヘテロ原子、例えば酸素、硫黄、セレン、リンなどにより置き換えられている他の複素環式塩基類似体が含まれる。さらに、「核酸配列」という用語は相補的配列を包含し、核酸配列及びその相補的配列の両方に実質的に相同であるいずれの核酸配列をも含む。

「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合により連結した少なくとも２個のヌクレオチドの線状ポリマーを指し、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含んでなることができる。

「多型性」は、１つの集団中の個体の間の特定の遺伝子座における１組の遺伝子変異を指す。

「ポリペプチド」は、線状の鎖においてペプチド結合により互いに連結した２個もしくはそれより多いアミノ酸を含んでなるペプチド又はタンパク質を指す。本明細書で用いられる場合、該用語は、当該技術分野において通常例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる単鎖ならびに当該技術分野において一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指し、タンパク質には多くの型がある。ポリペプチドは多くの場合、通常２０個の天然に存在するアミノ酸と呼ばれる２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含有することができること、ならびに末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸を、プロセシング及び他の翻訳後改変のような自然の方法により、また、当該技術分野において既知の化学的改変法により、与えられたポリペプチドにおいて改変できることが認識されるであろう。ポリペプチドにおいて自然に起こる通常の改変でさえ、本明細書に徹底的に挙げるには多すぎるが、それらは基本的テキストに、及びもっと詳細な専攻論文に、ならびに研究文献に十分に記載されており、従って当該技術分野における通常の熟練者の見識の範囲内である。本発明のポリペプチドに存在し得る既知の改変の中に、例となるいくつかを挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質への転移−ＲＮＡ媒介アミノ酸の付加、例えばアルギニル化ならびにユビキチン化がある。

グリコシル化、脂質の結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化のようないくつかの通常の改変は、ＰＲＯＴＥＩＮＳ――ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３年を含む多くの基本的テキストに記載されている。ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３年中のＷｏｌｄ，Ｆ．著，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ
ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．著，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２，１９９０年，６２６−６４６；及びＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．著，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３，１９９２年，４８−６２により示されているもののような、多くの詳細な総説もこの主題について利用できる。

既知であり且つ上記に記載した通り、ポリペプチドは必ずしも全体的に線状ではないことが認識されるであろう。例えば自然のプロセシングを介するか又は人間の操作を介するものを含み、ポリペプチドを翻訳後に改変することができる。環状、分枝状及び分枝状−環状ポリペプチドを非−翻訳自然法により、及び同様に全く合成的な方法により合成することができる。改変は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノもしくはカルボキシル末端を含むポリペプチド中のいずれに存在することもできる。例えば共有結合改変によるポリペプチド中のアミノ基又はカルボキシル基又は両方の遮断は、天然に存在するポリペプチド及び合成ポリペプチドにおいて普通であり、そのような改変は本発明のポリペプチド中に存在することができる。例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の細胞において作られるポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解的プロセシングの前、ほとんど一定してＮ−ホルミルメチオニンであろう。ペプチドの翻訳後改変の間に、ＮＨ_２−末端に
おけるメチオニン残基は欠失し得る。従って本発明は、タンパク質のメチオニン−含有及びメチオニンのないアミノ末端変異体の両方の使用を包含する。

ポリペプチド中に存在する改変は、多くの場合、それがいかにして作られるかの関数であろう。例えばクローニングされた遺伝子の宿主中での発現により作られるポリペプチドの場合、改変の性質及び程度は大部分、宿主細胞の翻訳後改変能力及びポリペプチドアミノ酸配列中に存在する改変シグナルにより決定されるであろう。例えば既知の通り、グリコシル化は多くの場合、例えばＥ．コリのようなバクテリア宿主において起こらない。従ってグリコシル化が望まれる場合、グリコシル化宿主、一般に真核細胞中でポリペプチドを発現させなければならない。昆虫細胞は多くの場合に哺乳類細胞と同じ翻訳後グリコシル化を行い、この理由のために、昆虫細胞発現系は中でもグリコシル化の本来のパターンを有する哺乳類タンパク質を有効に発現するために開発された。他の改変に類似の考えがあてはまる。与えられるポリペプチドにおけるいくつかの部位に、同じか又は異なる程度で、同じ型の改変が存在し得ることは認識されるであろう。また、与えられるポリペプチドは多くの型の改変を含有することができる。本明細書で用いられる場合一般に、「ポリペプチド」という用語は、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現により組換え的に合成されるポリペプチド中に存在するものを含むすべてのそのような改変を包含する。

「プロホルモンコンバーターゼ（ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）（ＰＣ）」は、Ｃａ^２＋−依存性セリンプロテアーゼの群を指し、それらのすべてはバクテリアエンドプロテアーゼ、ズブチリシン（バクテリア）及び酵母ケキシンへの相同性を有する。フリン／塩基性アミノ酸対−切断酵素（ＰＡＣＥ）としても既知のこの群には、例えばＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／ＰＣ６及びＰＣ７／ＰＣ８／リンパ腫プロタンパク質コンバーターゼ及びＳＫＩ−１が含まれる。それらはそれらの触媒ドメイン内に５０〜７５％の程度のアミノ酸同一性を共有している（ＰＣｓについての総説に関し、Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．著，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２７；８４８（１−２）：１９９９年，４５−６２を参照されたい）。

「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合に含まれるＤＮＡの調節配列を意味する。プロモーターは多くの場合、遺伝子の転写開始部位の上流（「５’」）にある。「遺伝子」は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の生産に含まれるＤＮＡのセグメントであり、コード領域、コード領域の前の（「５’ＵＴＲ」）及び後の（「３’ＵＴＲ」）非コード領域ならびに個々のコードセグメント（「エキソン」）の間に介在する非−コード配列（「イントロン」）を含む。「コードする」は、３塩基「トリプレット」コードにおけるアミノ酸、開始及び停止シグナルの表現を指す。

「組換え宿主細胞」は、外来性ＤＮＡ配列により形質転換もしくはトランスフェクションされた細胞である。本明細書で用いられる場合、外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合、細胞はそのような外来性ＤＮＡにより「形質転換された」。外来性ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれても（共有結合しても）、又はそうでなくても良い。例えば原核生物及び酵母の場合、外来性ＤＮＡをプラスミドのようなエピソーム上に保持することができる。真核細胞に関し、安定に形質転換又はトランスフェクションされた細胞は、外来性ＤＮＡが染色体中に組み込まれ、染色体複製を介してそれが娘細胞により継承される細胞である。この安定性は、外来性ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含んでなる細胞系又はクローンを確立する真核細胞の能力により示される。組換え宿主細胞は原核又は真核であることができ、Ｅ．コリのようなバクテリア、酵母のような菌・カビ細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル及びネズミ起源の細胞系のような哺乳類細胞ならびにドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びカイコ由来細胞系のような昆虫細胞を含む。「組換え宿主細胞」という用語が特定の被検細胞のみでなく、そのような細胞の子孫又は子孫の可能性のあるものも指すことは、さらに理解される。突然変異又は環境の影響のため
に、後の世代にある種の改変が起こり得るので、そのような子孫は実際には親細胞と同一でないかも知れないが、それでも本明細書で用いられる用語の範囲内に含まれる。

「組換えポリペプチド」は組換えＤＮＡ法により生産される；すなわち所望のポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から生産されるポリペプチドを指す。「合成ポリペプチド」は、化学合成により生産されるものを指す。

「レラキシン３」又は「リガンド成分」は：（１）ヒトレラキシン３（Ｂａｔｈｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２００２年，１１４８−１１５７，ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受け入れ番号：ＮＰ ５４３１４０）に約６０％より高いアミノ酸配列同一性を有するか；（２）本明細書に記載されるヒトレラキシン３タンパク質に対する抗体、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に結合できるか；あるいは（３）ヒトレラキシン３ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド受け入れ番号：ＮＭ ０８０８６４）に約６０％より高いヌクレオチド配列同一性を有する配列を持つ核酸分子に、緊縮ハイブリッド形成条件下で特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを指す。

好ましい態様において、リガンド成分は、ヒトレラキシン３に６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５パーセントより高いアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。他の好ましい態様において、リガンド成分は、ヒトレラキシン３ｃＤＮＡに６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５パーセントより高いヌクレオチド配列同一性を有する配列を持つ核酸分子に、緊縮ハイブリッド形成条件下で特異的にハイブリッドするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。

代表的なレラキシン３リガンドには、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受け入れ番号：ＮＰ ５４３１４０）、ラット（Ｂｕｒａｚｉｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８２：２００２年，１５５３−１５５７，ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受け入れ番号
ＮＰ ７３３７６７，ヒトの配列に７６．４％配列同一性）、マウス（Ｂａｔｈｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２００２年，１１４８−１１５７，ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受け入れ番号 ＸＰ １４６６０３，ヒトの配列に７８．７％配列同一性）ならびにブタ及びサルを含む他の動物において同定されたレラキシン３オルソログが含まれる。「レラキシン３」はレラキシン３の３つの形態：１）レラキシン３プレ−プロペプチド又は前駆体、シグナル配列及びレラキシン３プロペプチド配列を含む細胞内ポリペプチド；２）レラキシン３プロペプチド、プロテアーゼ切断部位により連結されたレラキシン３のＡ、Ｃ及びＢ鎖に関する配列を有する分泌ポリペプチド；ならびに３）成熟レラキシン３ペプチド、ジスルフィド架橋により連結したレラキシン３ポリペプチドＡ及びＢ鎖を含む分泌タンパク質のすべてを含む。「レラキシン３の活性フラグメント」は、ＧＰＣＲ１３５への結合のようなレラキシン３の生物学的活性を保持しているレラキシン３タンパク質のいずれのフラグメントをも含む。ヒトレラキシン３のタンパク質又はｃＤＮＡ配列は、国際公開第０１／６８８６２号パンフレット、国際公開第０１／８１５６２号パンフレット及び国際公開第０２／２２８０２号パンフレットに開示されている。ラット又はマウスレラキシン３のタンパク質又はｃＤＮＡ配列は、国際公開第０１／８１５６２号パンフレットに開示されている。

「細胞の二次メッセンジャー応答」は、レラキシン３が結合した時のＧＰＣＲ１３５の活性化により媒介される細胞の細胞応答を指す。それには例えばシグナル伝達事象ならびに二次メッセンジャー分子、例えばプロトン（ｐＨ）、カルシウム又はｃＡＭＰの細胞内濃度における変化が含まれる。

「配列」は、ポリマー中でモノマーが存在する直線的順序、例えばポリペプチド中のア
ミノ酸の順序又はポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序を意味する。

「配列同一性又は類似性」は、当該技術分野において既知の通り、配列の比較により決定される、２つもしくはそれより多いポリペプチド配列又は２つもしくはそれより多いポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合次第でポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の間の、そのような配列の鎖の間の一致により決定される、配列関連性の程度も意味する。

２つのアミノ酸配列又は２つの核酸のパーセント同一性又は類似性の決定のために、配列を最適比較の目的で整列させる（例えば第２のアミノ酸もしくは核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸の配列もしくは核酸配列中に空所を導入することができる）。次いで対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が第２の配列中の対応する位置と同じかもしくは類似のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドにより占められていたら、分子はその位置において同一であるかもしくは類似している。２つの配列の間のパーセント同一性又は類似性は、配列が共有する同一もしくは類似の位置の数の関数である（すなわち％同一性＝同一の位置の数／位置の合計数（例えば重なり位置）ｘ１００）。１つの態様において、２つの配列は同じ長さである。

同一性及び類似性の両方を容易に計算することができる。パーセント同一性の計算においては、正確な一致のみが数えられる。配列間の同一性又は類似性の決定に通常用いられる方法には、例えばＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．著，ＳＩＭＡ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１９８８年，１０７３に開示されているものが含まれる。同一性の決定のための好ましい方法は、調べられる配列間の最大の一致を与えるように設計される。同一性及び類似性の決定のための方法は、コンピュータープログラムに集成されている。

２つの配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの好ましい例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９９３年，５８７３−５８７７におけるように修正されたＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１９９０年，２２６４−２２６８のアルゴリズムである。そのようなアリゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２１５：１９９０年，４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に導入されている。比較目的のための空所のある整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．著，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：１９９７年，３３８９−３４０２に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいはまた、繰り返し研究を行なうためにＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いることができ、それは分子間の遠い関連性を検出する。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプログラムのデフォールトパラメーターを用いることができる（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）。例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。さらにＦＡＳＴＡ法（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５，１９９０年，４０３）があり、それを用いることもできる。

配列の比較のために有用な数学的アルゴリズムの他の好ましい例は、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ
ａｌ．著，ＣＡＢＩＯＳ ４：１９８８年，１１−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン ２．０）中に導入されている（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．著，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１），１９８４年，３８７）。

ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列への言及において本明細書で用いられる「実質的に類似の」という用語は、同一の配列ならびにその生物学的に活性な部分を保持しており且つその保存モチーフを有している改変配列を生ずるそれへの欠失、置換又は付加を含む。

本明細書で用いられる「被検体」という用語は、処置、観察又は実験の目的である動物を指す。好ましくは、被検体は哺乳類、より好ましくはヒトである。

レセプター又はリガンド成分への言及において本明細書で用いられる「実質的に純粋な形態」という用語は、リガンド−レセプター結合を妨げる汚染物質を本質的に含まない生物学的試薬として有用なポリペプチドを意味する。ポリペプチドの実質的に純粋な形態は、例えば単離、精製、ペプチド合成又は組換え発現により生じ得る。代表的な態様において、リガンド成分は単離又は組換え発現により生産されるレラキシン３であり、レセプター成分は全細胞の表面上で発現されるＧＰＣＲ１３５である。他の態様において、レセプター及びリガンド成分の両方は実質的に純粋な形態にあり、得られる複合体をｘ−線結晶学のような用途において用いて共−結晶構造（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を得ることができ、レラキシン３／ＧＰＣＲ１３５相互作用の調節（例えばアゴニズム又はアンタゴニズム）により媒介される障害の処置において有用な薬剤の設計を助けるためのコンフォーメーション研究又はコンピューターモデリングにおいてそれを用いることができる。

本明細書で用いられる「タグ」という用語は、タグを含有するタンパク質の単離、精製又は検出を容易にするアミノ酸配列又はアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。多様なそのようなタグが当該技術分野における熟練者に既知であり、本発明において用いるのに適している。適したタグには、例えばＨＡペプチド、ポリヒスチジンペプチド、ビオチン／アビジン及び多様な抗体エピトープ結合部位が含まれる。

本明細書で用いられる「治療的に有効な量」という用語は、研究者、獣医師、医師又は他の臨床医学者が求めている組織系、動物又はヒトにおける生物学的もしくは医学的応答、例えば処置されている疾患又は障害の症状の軽減を引き出す活性化合物又は製薬学的薬剤の量を意味する。製薬学的組成物に関して治療的に有効な用量を決まった手順で決定するための方法は、当該技術分野において既知である。

「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、それは環状２本鎖ＤＮＡループを指し、その中に追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる。別の型のベクターは、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができるウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律複製することができる（例えばバクテリア性複製起点を有するバクテリアベクター及びエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非−エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクター――発現ベクター――は、それらが操作可能的に連結された遺伝子の発現を方向付けることができる。一般に、組換えＤＮＡ法において有用なベクターは多くの場合にプラスミドの形態にある。しかしながら本発明は、同等の機能を果たす他の形態のベクター、例えばウイルスベクター（例えば複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ−関連ウイルス）を含むものとする。
リガンド／レセプター複合体
本発明のリガンド−及び−レセプター複合体の好ましい態様において、リガンド成分は、ヒト、マウス、ラット又は他の動物に由来するレラキシン３である。好ましくは、リガンド成分は組換えにより発現したレラキシン３である。

本発明のリガンド−及び−レセプター複合体の他の好ましい態様において、リガンド成分は検出可能な薬剤、例えば放射性同位体（ｒａｄｉｏ−ｉｓｏｔｏｐｅ）又は蛍光分子で標識される。標識法は、用いられる標識薬剤の型とともに変わり、当該技術分野における熟練者に既知である。例えばリガンド分子の原子の１つを、対応する放射性同位体で置き換えることにより、標識を行なうことができる。水素原子を：トリチウム、^３Ｈで置き換えることができるか；炭素原子を炭素−１４、^１４Ｃで置き換えることができるか；あるいはスチロンチウム原子をストロンチウム−３８、^３８Ｓｒで置き換えることができる。他の代表的な標識法において、リガンドの原子を放射性同位体で置き換えるのではなく、リガンド分子に同位体を加えることができる。そのような放射性同位体には、例えばヨウ素−１２５、^１２５Ｉ；及び鉄−５９、^５９Ｆｅが含まれる。さらに別の代表的な標識法において、生体内又は試験管内におけるペプチドの合成の間に、適した放射性−標識前駆体、例えばメチオニン−３５（^３５Ｓ）又はホスフェート−３３（^３３Ｐ、タンパク質リン酸化用）を用いることにより、標識を行なうことができる。好ましくは、本発明のリガンド成分はヨウ素−１２５、^１２５Ｉで標識される。

好ましくは、本発明のリガンド及びレセプター複合体は、ヒト、マウス又はラットあるいは他の動物に由来するＧＰＣＲ１３５を含んでなる。より好ましくは、レセプター成分は配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４及び配列番号：１５ならびにそれらのフラグメントから選ばれるアミノ酸配列を有するＧＰＣＲ１３５である。

１つの好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５はＧＰＣＲ１３５宿主細胞、好ましくは組換えＧＰＣＲ１３５宿主細胞の細胞表面上で発現される。他の好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５はＧＰＣＲ１３５宿主細胞、好ましくは組換えＧＰＣＲ１３５宿主細胞から単離された細胞膜に付随する。さらに別の好ましい態様において、複合体のレセプター成分は、レラキシン３に結合することができるＧＰＣＲ１３５のフラグメントである。

複合体のリガンド成分は全−長レラキシン３又はＧＰＣＲ１３５にまだ結合できるその活性フラグメントであることができる。

熟練者に既知のリガンド及びレセプター複合体の構築のためのいずれの適した方法をも、複合体の形成に用いることができる。一般に方法は、リガンドを含んでなる試料をレセプターを含んでなる試料と混合することを含んでなる。

リガンドを含んでなる試料は、リガンドを含有する組織又は細胞抽出物あるいは精製されたリガンドであることができる。天然のリガンド源、すなわちヒトを含む温血動物のリガンドのための内在性宿主細胞もしくは組織からこの試料を調製することができる。好ましくは、リガンドを含んでなる試料は、増加した量のリガンドを発現する組換え宿主細胞から調製される。リガンドのための組換え宿主細胞は、機能性リガンドを発現できるＤＮＡ分子を細胞中に導入することにより構築することができる。レラキシン３のための発現ベクターならびに組換え宿主細胞の構築についての代表的な方法を本明細書に記載する（実施例４を参照されたい）。レラキシン３の組換えによる生産のための方法を、下記に記載する。

ヒト又は他の温血動物の組織又は細胞からの生産において、ヒト又は他の温血動物の組織又は細胞を均質化し、酸又は他の適した抽出剤を用いてホモジネートを抽出し、そして例えばクロマトグラフィー法、例えば逆−相クロマトグラフィー、イオン−交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの組み合わせを介し、抽出物からポリペプチドを単離することを含んでなる方法により、リガンドポリペプチドを精製及び単離することができる。ラット脳抽出物の調製（実施例２を参照されたい）及びブタ脳から
のレラキシン３の精製（実施例３を参照されたい）について、代表的な方法を本明細書に示す。

ペプチド合成のための既知の方法により、本発明におけるリガンドポリペプチドを生産することもできる。ペプチド合成のための方法は、固−相合成及び液−相合成法のいずれであることもできる。かくしてタンパク質を構成できる部分的ペプチド又はアミノ酸をその残留部分と縮合させ、生成物が保護基を有する場合には保護基を除去することにより、所望のペプチドを生産することができる。ペプチド合成の間の縮合及び脱保護のための方法は文献に、例えば：（１）Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｋｙ ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ著，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６年；（２）Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｅｂｋｅ著，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６５年；（３）Ｎｏｂｕｏ，Ｉｚｕｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．著，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍａｒｕｚｅｎ，１９７５年；（４）Ｈａｒｕａｋｉ Ｙａｊｉｍａ ａｎｄ Ｓｈｕｍｐｅｉ Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ，２０５，１９７７年；及び（５）Ｈａｒｕａｋｉ Ｙａｊｉｍａ（編集），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ−Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ，１４，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｈｉｒｏｋａｗａ Ｓｈｏｔｅｎに記載されている。

ペプチド合成反応の後、通常の精製法、例えば溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー及び再結晶の適した組み合わせにより、タンパク質生成物を精製及び単離することができる。単離されるタンパク質が遊離の形態にある場合、既知の方法によりそれを適した塩に転換することができる。逆に、単離される生成物が塩である場合、既知の方法によりそれを遊離のペプチドに転換することができる。

アミド化に適したペプチド合成のための樹脂を用いることにより、ポリペプチドのアミドを得ることができる。代表的な樹脂にはクロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズ−ヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニル−アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂及び４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂が含まれる。そのような樹脂を用い、α−アミノ基及び側鎖の官能基が適切に保護されたアミノ酸を、当該技術分野における熟練者に既知の種々の縮合法により、目的のペプチドの配列に従って樹脂上に縮合させる。反応系列の最後に、ペプチド又は保護されたペプチドを樹脂から分離し、保護基を除去して目的のポリペプチドを得る。

ＧＰＣＲ１３５レセプターを含んでなる試料は、細胞表面上で発現されたレセプターを有する無損傷の宿主細胞、レセプターの宿主細胞から単離された細胞膜又はリガンドに結合できるレセプターの精製されたフラグメントを含んでなることができる。ＧＰＣＲ１３５レセプターのための内在性宿主細胞を用いることができるが、増加した量のＧＰＣＲ１３５を細胞表面上で発現する組換え宿主細胞が好ましい。ヒトＧＰＣＲ１３５のための組換え宿主細胞の構築の代表的な方法を実施例１に記載する。

ＧＰＣＲがその細胞外ドメインを用いてそのリガンドに結合することは既知である。当該技術分野における熟練者に既知の種々の方法、例えば配列分析、タンパク質−タンパク質相互作用分析、タンパク質構造分析又はこれらの方法の組み合わせにより、そのような結合ドメインを同定することができる。例えばメタボトロピックグルタメートレセプター
（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）中のリガンド結合ドメインは、その細胞外ドメイン中のベヌスフライトラップモジュール（Ｖｅｎｕｓ
ｆｌｙｔｒａｐ ｍｏｄｕｌｅ）（ＶＦＴＭ）として同定された（Ｏ’Ｈａｒａ ｅｔ
ａｌ．著，Ｎｅｕｒｏｎ，１１（１）：１９９３年，４１−５２；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７４：１９９９年，３３４８８−３３４９５）。好ましい態様において、上記の方法を用いてＧＰＣＲ１３５のレラキシン３結合ドメインを始めて同定することができ、そのような結合ドメインを組換えにより発現させ、精製し、本発明の複合体の形成において用いることができる。
ラットＧＰＣＲ１３５
本発明の１つの一般的な側面は、ＧＰＣＲ１３５のイソ型、ラットＧＰＣＲ１３５ｓに関する。本発明においてラットＧＰＣＲ１３５の２つのイソ型：より長いイソ型ラットＧＰＣＲ１３５ｌ及びより短いイソ型ラットＧＰＣＲ１３５ｓがクローニングされ、同定された。ラットＧＰＣＲ１３５ｌは配列番号：１４のアミノ酸配列を有し、国際公開第００／２４８９１号パンフレットの配列番号：１と同じである。ラットＧＰＣＲ１３５ｓは配列番号：１５のアミノ酸配列を有し、より長い形態のＮ−末端における最初の７個のアミノ酸残基がない。組換えにより発現されるラットＧＰＣＲ１３５ｓ及びＧＰＣＲ１３５ｌは、放射性リガンド結合又はＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて類似の活性を有し（実施例１）、両方のラットイソ型がＧＰＣＲ１３５活性を有することを示している。

この一般的側面に従う１つの態様において、本発明は、配列番号：１５のアミノ酸配列から成るラットＧＰＣＲ１３５ｓをコードする単離された核酸分子又はその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を提供する。他の態様において、核酸分子は配列番号：１５のアミノ酸配列をコードする。

与えられるヌクレオチド配列の「相補配列」である核酸分子は、与えられるヌクレオチド配列に十分に相補的であり、高緊縮もしくは緊縮ハイブリッド形成条件下でそれが与えられるヌクレオチド配列にハイブリッド形成し、それにより安定な二重らせんを形成できるようなものである。代表的な高緊縮もしくは緊縮ハイブリッド形成条件は：５０％ ホルムアミド，５ｘＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ ４２℃におけるインキュベーション又は５ｘＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ ６５℃におけるインキュベーションならびに０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中における６５℃での洗浄を含む。

好ましい態様において本発明は、本質的に配列番号：１１のヌクレオチド配列又はその相補配列から成る単離された核酸分子を提供する。より好ましい態様において、核酸分子は配列番号：１１のヌクレオチド配列を有する。

本発明は、配列番号：１１に示されるラットｃＤＮＡの縮重変異体又はその相補配列である核酸分子を含む単離された核酸分子を提供する。特定のアミノ酸をコードするために１種より多い遺伝子コドンを用いることができ、従って配列番号：１５に表されるラットＧＰＣＲ１３５ｓのアミノ酸配列を類似のＤＮＡ分子の組のいずれによってもコードできることは既知である。その組の１つのメンバーのみが配列番号：１１に示されるｃＤＮＡ配列と同じであろう；しかしながら、下記で「縮重変異体」と呼ばれるすべての変異体が本発明の範囲内であることが意図されている。本明細書で、配列番号：１５として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする１種もしくはそれより多い代わりのコドンを有する核酸分子は、配列番号：１１に示されるラットｃＤＮＡの縮重変異体と呼ばれる。

これに関して特に好ましいのは、ラットＧＰＣＲ１３５ｓ核酸分子の自然のアレリック変異体である。アミノ酸配列における変化に導くＤＮＡ配列多型性は、動物の集団内に、すなわちラットの集団内に存在し得る。そのような遺伝子多型性は、自然のアレリック変
異の故に、集団内の個体の間で存在し得る。「アレレ」は、与えられる遺伝子座において二者択一的に存在する遺伝子の群の１つである。そのような自然のアレリック変異は、典型的には与えられる遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変異を生じ得る。複数の異なる個体において問題の遺伝子を配列決定することにより、又はハイブリッド形成プローブを用いて多様な個体において同じ遺伝子座を同定することにより、二者択一的アレレを同定することができる。

さらにこれに関して特に好ましいのは、天然に存在するラットＧＰＣＲ１３５ｓタンパク質と異なる性質を有するが、それでもその機能的活性を保持しているポリペプチドをコードする、天然に存在することが知られていないヌクレオチド変異をすっかり全部有する核酸分子である。天然に存在するペプチドの性質と異なる性質を有するペプチドをコードするように、ＤＮＡ配列を手動で（ｍａｎｕａｌｌｙ）改変することができる。ＤＮＡ配列の改変方法には、特定部位の突然変異誘発、キメラ的置換（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び遺伝子融合が含まれる。特定部位の突然変異誘発は１個もしくはそれより多いＤＮＡ残基を変えるために用いられ、サイレント突然変異、保存的突然変異又は非保存的突然変異を生じ得る。キメラ遺伝子は、類似のもしくは異なる遺伝子のドメインを交換し、ラットＧＰＣＲ１３５ｓ遺伝子中のドメインを置き換えることにより調製される。類似して、遺伝子及びタンパク質の同定及び単離を助長するためのアフィニティータグのように、ラットＧＰＣＲ１３５にドメインを加える融合遺伝子を調製することができる。

本発明のラットＧＰＣＲ１３５ｓ核酸分子の変異体は、高緊縮ハイブリッド形成条件下で配列番号：１１にハイブリッド形成することができる。

ラットＧＰＣＲ１３５ｓ転写産物、好ましくは高いレベルの転写産物を有する細胞又は組織は、ラットＧＰＣＲ１３５ｓ ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの単離に適している。ヌクレオチドハイブリッド形成又は配列番号：１１に表されるラットＧＰＣＲ１３５ｓ転写産物に特異的にハイブリッド形成するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ分析により、細胞抽出物又は全細胞においてラットＧＰＣＲ１３５ｓ転写産物の存在に関してスクリーニングすることにより、適したｃＤＮＡ源の選択を行なうことができる。ラットＧＰＣＲ１３５ｓ核酸のより短いイソ型の単離のために好ましい供給源は、ラット脳である。

本発明の核酸分子の単離のために、当該技術分野において既知の多様な方法のいずれを用いることもできる。例えばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリ又は上記で同定された適した細胞からの全ｍＲＮＡを鋳型として、且つ適したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、本発明の核酸分子を標準的なＰＣＲ増幅法により増幅することができる。そのようにしてＰＣＲから増幅される核酸を適したベクター中にクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特性化することができる。通常の熟練者は、配列番号：１１の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドがプライマーとして特に有用であることを認識するであろう。標準的な合成法により、例えば自動ＤＮＡ合成機を用い、プライマーを調製することができる。

本発明の核酸分子を単離する他の方法は、当該技術分野における熟練者により認められている方法を用い、１種もしくはそれより多い天然のもしくは人工的に設計されたプローブを用いてゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリ又は全ｍＲＮＡを精査することである。例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編集），Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年，１９９２を参照されたい。通常の熟練者は、配列番号：１１の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドが特に有用
なプローブであることを認識するであろう。好ましいプローブは、少なくとも３０個の塩基を有するであろう。特に好ましいプローブは５０個もしくはそれ未満の塩基を有するであろう。プローブの同定を助長するために、分析により検出可能な試薬を用いてそのようなプローブを標識することができ、それが好ましい。有用な試薬には、例えば放射性同位体、蛍光色素又は検出可能な生成物の生成を触媒することができる酵素が含まれる。プローブは、ラットＧＰＣＲ１３５ｓをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドの相補的コピーを通常の熟練者が単離することを可能にする。ＧＰＣＲ３１５ｓタンパク質をコードする核酸分子を他の動物供給源、例えば群、型及び／又はサブタイプの追加のメンバーから単離するため、あるいは本明細書に開示されるコード配列に対して５’及び／又は３’領域からの転写調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）及び調節（ｃｏｎｔｒｏｌ）要素ならびに他の安定性、プロセシング、翻訳及び組織特異性−決定領域を含む関連配列に関してそのような供給源をスクリーニングするために、類似の日常的方法を用いることができる。

本発明の核酸分子の全部又は一部に対応する核酸分子を調製する他の方法は、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いる標準的な合成法による。

ゲノムＤＮＡライブラリの構築、ｃＤＮＡライブラリの作製又は同定された供給源細胞からの全ｍＲＮＡの単離は、当該技術分野において既知の標準的な方法により行なうことができる。例えばＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．著，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年）においてこれらの方法を見出すことができる。ラットＧＰＣＲ１３５ｓ核酸分子の単離についての代表的な方法を実施例１に記載する。

他の態様において本発明は、ラットＧＰＣＲ１３５ｓを発現することができる核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。

本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態における本発明の核酸を含んでなる。かくして組換え発現ベクターは、発現されるべき核酸配列に操作可能的に連結された１個もしくはそれより多い調節配列を含み、調節配列は発現に用いられるべき宿主細胞に基づいて選ばれる。組換え発現ベクターへの言及において用いられる場合、「操作可能的に連結された」は、問題のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を許すようなやり方で（例えば試験管内転写／翻訳系において、あるいはベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞において）、調節配列に連結されていることを意味するものとする。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現のレベルなどの因子に依存し得ることが当該技術分野における熟練者に認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより、本明細書に記載される核酸によりコードされる融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチドを生産することができる。

本発明の組換え発現ベクターを、原核細胞（例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ））又は真核細胞（例えば昆虫細胞（バクロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞又は哺乳類細胞）における本発明のポリペプチドの発現のために設計することができる。適した宿主細胞は当該技術分野における熟練者に既知である。あるいはまた、組換え発現ベクターを、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用い、試験管内で転写及び翻訳することができる。

原核生物におけるタンパク質の発現は、融合又は非−融合タンパク質の発現に向けられ
た構成的又は誘導プロモーターを含有するベクターを持つＥ．コリにおいて最も頻繁に行なわれる。融合ベクターは、そこにコードされているタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に複数のアミノ酸を加える。そのような融合ベクターは、典型的には４つの目的のため：１）組換えタンパク質の発現を増加させるため；２）組換えタンパク質の溶解性を向上させるため；３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を助けるため；ならびに４）マーカーとして働くことにより、組換えタンパク質の検出を容易にするために働く。融合発現ベクターにおいて多くの場合、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離できるように、融合部分と組換えタンパク質の連結部分にタンパク質分解的切断部位が導入される。そのような酵素及びそれらの同族認識配列はＸａ因子（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）、トロンビン及びエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターにはｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．著，Ｇｅｎｅ ６７：１９８８年，３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）又はｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ）が含まれ、それらは標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、タンパク質Ａ又はポリ−Ｈｉｓを融合させる。

適した誘導非−融合Ｅ．コリ発現ベクターの例にはｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｇｅｎｅ ６９：１９８８年，３０１−３０５）及びｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．著，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９９０年，６０−８９）が含まれる。Ｅ．コリにおける組換えタンパク質発現を最大にする１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主バクテリア中でタンパク質を発現させることである。他の戦略は、各アミノ酸に関する個々のコドンがＥ．コリにおいて優先的に用いられるものであるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を改変することである。そのような本発明の核酸配列の改変は、標準的なＤＮＡ合成法により行なうことができる。

他の態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．セリビサエ（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現のためのベクターの例にはｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．著，ＥＭＢＯ Ｊ ６：１９８７年，２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒＪａｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｃｅｌｌ ３０：１９８２年，９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．著，Ｇｅｎｅ ５４：１９８７年，１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びｐＰｉｃＺ又はＰｉｃｈｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれる。

あるいはまた、発現ベクターはバクロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞におけるタンパク質の発現のために利用可能なバクロウイルスベクターには、例えばｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：１９８３年，２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．著，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０；１９８９年，３１−３９）が含まれる。組換え発現に有用な商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターにはｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。

さらに別の態様において、発現ベクターは哺乳類発現ベクターである。哺乳類細胞中で用いられる場合、多くの場合に発現ベクターの調節機能はウイルス調節要素により与えられる。例えば通常用いられるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス ２、サイトメ
ガロウイルス及びシミアンウイルス ４０から誘導される。哺乳類発現ベクターの例には、例えばｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ著，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：１９８７年，８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｉｎａｎ ｅｔ ａｌ．著，ＥＭＢＯ Ｊ ６：１９８７年，１８７−１９５）が含まれる。組換えプロテアーゼＣＯＸ−３発現に適してい得る商業的に入手可能な哺乳類発現ベクターには、例えばｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及び１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が含まれる。

他の態様において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を方向付けることができる（例えば核酸の発現のために組織−特異的調節要素を用いる）。組織−特異的調節要素は、当該技術分野において既知である。適した組織−特異的プロモーターの例にはアルブミンプロモーター（肝臓−特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ
ａｌ．著，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：１９８７年，２６８−２７７）、リンパ−特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ｅｔ ａｌ．著，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１９８８年，２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプター（Ｗｉｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．著，ＥＭＢＯ Ｊ ８：１９８９年，７２９−７３３）及び免疫グロブリン（ＢａｎｅｉＪｉ ｅｔ ａｌ．著，Ｃｅｌｌ ３３：１９８３年，７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｃｅｌｌ ３３：１９８３年，７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン−特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｍｅ ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１９８９年，５４７３−５４７７）、膵臓−特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３０：１９８５年，９１２−９１６）及び乳腺−特異的プロモーター（例えば乳漿プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が含まれる。発育的に調節されるプロモーターには、例えばマリンホックス（ｍａｒｉｎｅ ｈｏｘ）プロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１９９０年，３７４−３７９）及びベータ−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ｅｔ ａｌ．著，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：１９８９年，５３７−５４６）も含まれる。

本発明はさらに、アンチセンス配向でベクター中にクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換えベクターを提供する。すなわち、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写により）を許すようなやり方で、ＤＮＡ分子が調節配列に操作可能的に連結される。多様な細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を方向付ける、クローニングされた核酸にアンチセンス配向で操作可能的に連結される調節配列、例えばウイルスプロモーター及び／又はエンハンサーを選ぶことができるか、あるいはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織−特異的又は細胞型特異的発現を方向付ける調節配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの形態にあることができ、それらにおいてアンチセンス核酸が高−効率調節領域の調節下で生産され、その活性はベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の議論に関し、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１），１９８６年）を参照されたい。

本発明は、哺乳類における干渉性小分子ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）の合成に向けられた組換えベクター系も提供する。多くの生物は、遺伝子に対応する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮ
Ａ）が細胞に存在する場合、ＲＮＡ干渉として既知のプロセスを介して遺伝子発現を消す機構を有する。特定の遺伝子の活性を低下させるためのｄｓＲＮＡの使用の方法は、虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を用いて最初に開発され、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれてきた（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１９９８年，８０６−８１１）。それ以来ＲＮＡｉは多くの生物において有用であることが見出され、最近は培養中の哺乳類細胞に拡大された（Ｍｏｓｓ著，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：２００１年，Ｒ７７２−５による総説を参照されたい）。ＲＮＡｉが２１〜２５個のヌクレオチドの小分子ＲＮＡｓの生成を含むことが示された時、重要な進歩が成された（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ４０４：２０００年，２９３−６；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．著，Ｃｅｌｌ １０１：２０００年，２５−３３）。これらの干渉性小分子ＲＮＡｓ又はｓｉＲＮＡｓは最初、プロセスを開始し、結局退化する（ｄｅｇｒａｄｅｄ）標的ＲＮＡに相補的であるもっと大きなｄｓＲＮＡから誘導されることができる。ｓｉＲＮＡｓはそれ自身が、各末端に短い張り出しを有する２本鎖である；それらはガイドＲＮＡｓとして作用し、相補性の領域における標的の１個の切断を方向付ける（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．著，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５：２００１年，１８８−２００；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．著，Ｃｅｌｌ １０１：２０００年，２５−３３）。

配列番号：１１に表されるラットＧＰＣＲ１３５ｓに相補的な２１〜２５個のヌクレオチドを含んでなるｓｉＲＮＡを、例えば国際公開第０１／７５１６４ Ａ２号パンフレットに記載されている方法を用いて試験管内で生産することができるか、あるいは生体内で、適した発現系を用いて哺乳類細胞から生産することができる。哺乳類細胞におけるｓｉＲＮＡｓの合成を方向付ける代表的なベクター系はｐＳＵＰＥＲ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２００２年，５５０−３）である。ｐＳＵＰＥＲ上において、遺伝子特異的標的化配列（同じ配列の逆相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）から短いスペーサーにより隔てられた標的転写産物からの１９−ｎｔ配列）及び停止シグナルとしての５個のチミジン（Ｔ５）の前に、Ｈ１−ＲＮＡプロモーターがクローニングされた。得られる転写産物は自身の上に折り返され、Ｃ．エレガンスＬｅｔ−７の構造に類似の１９−塩基対ステム−ループ構造を形成すると予測される。ループ（短いスペーサー）の寸法は、好ましくは９ｂｐである。ポリアデノシン尾部がなく、十分に定義された転写開始及び列における５個のチミジン（Ｔ５）から成る停止シグナルを有する小分子ＲＮＡ転写産物が生産された。注目すべきことに、停止部位における転写産物の切断は第２のウリジンの後であり、やはり２個の３’張り出しＴ又はＵヌクレオチドを含有する合成ｓｉＲＮＡｓの末端に類似の転写産物を与える。ｐＳＵＰＥＲから発現されるｓｉＲＮＡは、合成ｓｉＲＮＡと同じ位有効に遺伝子発現を打ち倒すことができる。

本発明のベクターに、バクテリア−酵母又はバクテリア−動物細胞又はバクテリア−菌・カビ細胞又はバクテリア−無脊椎動物細胞のような宿主細胞間のＤＮＡのシャトリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）を許す特別に設計されるベクターも含まれる。多数のクローニングベクターが当該技術分野における熟練者に既知であり、適したクローニングベクターの選択は、熟練者の見識の範囲内である。原核及び真核細胞の両方のための他の適した発現系に関し、例えばＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．著，同上の１６及び１７章を参照されたい。

本発明は、本発明の組換えベクターが導入された組換え宿主細胞も提供する。

トランスフェクションに適してい得、且つ商業的に入手可能な哺乳類の種から誘導される細胞系には、例えばＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）又はネズミＬ−細胞及びＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）及びサル腎臓細胞が含まれる。

通常の形質転換又はトランスフェクション法を介し、ベクターＤＮＡを原核もしくは真核細胞中に導入することができる。本明細書で用いられる場合、「形質転換」又は「トランスフェクション」という用語は、細胞が異種ＤＮＡを吸収するプロセスを指し、細胞はその異種ＤＮＡをそれらの染色体中に組み込んでも組み込まなくても良い。トランスフェクションは、例えばリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共−沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション又は原形質融合を含む種々の方法により行なうことができる。宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションのために適した方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．著，（同上）及び他の実験室マニュアル中に見出され得る。

哺乳類細胞の安定したトランスフェクションに関し、用いられる発現ベクター及びトランスフェクション法に依存して、細胞の小さい割合しか異種ＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込めないことが知られている。これらの組み込み産物（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）の同定及び選択のために、一般に選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性に関する）をコードする遺伝子を問題の遺伝子とともに宿主細胞中に導入する。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を与えるものが含まれる。導入された核酸で安定してトランスフェクションされた細胞を薬剤選択により同定することができる（例えば選択可能なマーカー遺伝子が導入された細胞は生き残るが、他の細胞は死亡する）。

他の態様において、問題の内在性遺伝子に異種であるＤＮＡ調節要素を細胞、安定な細胞系又はクローニングされた微生物のゲノム中に挿入し、挿入された調節要素が内在性遺伝子と操作可能的に連結して内在性遺伝子を調節するか（ｃｏｎｔｒｏｌｓ）、調節するか（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）又は活性化するようにすることにより、細胞、細胞系又は微生物内の内在性核酸の発現特性を改変することができる。

例えば米国特許第５，２７２，０７１号明細書及び国際公開第９１／０６６６７号パンフレットに記載されている通り、標的化相同的組換えのような方法を用い、異種調節要素が内在性遺伝子と操作可能的に連結し、且つその発現を活性化するように、それを安定な細胞系又はクローニングされた微生物中に挿入することができる。

本発明の他の態様は、本質的に配列番号：１５のアミノ酸配列から成る実質的に精製されたポリペプチドを提供する。

本発明の単離されたポリペプチドは、異種ポリペプチドに操作可能的に連結された配列番号：１５のポリペプチドを含んでなるキメラ又は融合タンパク質も含み、ここで異種ポリペプチドは自然にはラットＧＰＣＲ１３５ｓイソ型と関連していない。例えばラットＧＰＣＲ１３５のより長いイソ型のＮ−末端における最初の７個のアミノ酸配列は、異種ポリペプチドとなることから排除され、それは、それがラットＧＰＣＲ１３５のより長いイソ型と自然に関連しているからである。融合タンパク質への言及において用いられる場合、「操作可能的に連結した」という用語は、ポリペプチド及び異種ポリペプチドが互いに枠−内で融合していることを示すものとする。異種ポリペプチドはポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端に融合することができる。

有用な融合タンパク質の１つの例は、本発明のポリペプチドがＣ−末端において、ＨＡ
及びポリＨｉｓから作られるタグに融合しているＨＡＨｉｓ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、本発明の組換えポリペプチドの検出及び精製を助長する。

本発明は、本発明のポリペプチドの発現又は単離の方法にも関する。１つの態様において、標準的なタンパク質精製法を用いる適した精製案により、自然にポリペプチドを発現する細胞もしくは組織源から、ポリペプチドを単離することができる。他の態様において、本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ法により生産される。あるいはまた、試験管内翻訳及び／又は転写系において、本発明のポリペプチドを合成することができる。さらにまた、標準的なペプチド合成法を用い、本発明のポリペプチドを化学的に合成することができる。

本発明のＤＮＡ分子を上記の発現ベクター中にクローニングし、そのようなベクターを本明細書に記載される原核もしくは真核宿主細胞中に導入し、組換えタンパク質の生産に適した条件下で宿主細胞を生育することにより、本発明のポリペプチドを組換えにより発現させることができる。発現ベクター−含有細胞をクローン的に増殖させ、個々に分析して、それらが本発明のポリペプチドを生産するかどうかを決定する。ラットのより短いイソ型ＧＰＣＲ１３５を発現する宿主細胞クローンの同定は、抗−ラットＧＰＣＲ１３５抗体との免疫学的反応性ならびに細胞内Ｃａ^２＋濃度におけるレラキシン３活性化変化のような宿主細胞−関連ＧＰＣＲ１３５活性の存在を含むいくつかの手段により行なうことができる。適した生育条件及び回収法の選択は、当該技術分野における熟練の範囲内である。ポリペプチドを組換えにより発現するための方法は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．著，同上に記載されており、且つ当該技術分野において既知である。

試験管内翻訳及び／又は転写系を用いて本発明のポリペプチドを生産することもできる。そのような方法は当該技術分野における熟練者に既知である。例えば合成ラットＧＰＣＲ１３５ｓ ｍＲＮＡ又はラットＧＰＣＲ１３５のより短いイソ型を生産する細胞から単離されたｍＲＮＡを、コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系において有効に翻訳することができる。あるいはまた、ラットＧＰＣＲ１３５ｓ ｃＤＮＡのコード配列をＴ７プロモーターの調節下でクローニングすることができる。次いでこの構築物を鋳型として用い、試験管内転写及び翻訳系において、例えばＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から商業的に入手可能なもののようなＴＮＴ Ｔ７カップリング網状赤血球ライセートシステム（ＴＮＴ Ｔ７ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ
Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、ラットＧＰＣＲ１３５のより短いイソ型タンパク質を生産することができる。

上記のような方法を用い、化学合成により本発明のポリペプチドを生産することもできる。

当該技術分野における熟練者に既知の方法により、ラットＧＰＣＲ１３５ｓタンパク質を精製することができる。例えばそれを、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー、レシチンクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ及びＦＰＬＣならびに抗体／リガンドアフィニティークロマトグラフィーの種々の組み合わせ又は個々の適用により、細胞ライセート及び天然もしくは組換え宿主細胞からの抽出物から精製することができる。
組換え細胞からのレラキシン３の生産
レラキシン３は、ジスルフィド架橋により連結したポリペプチドの２つの鎖（Ａ−鎖及びＢ−鎖）を含んでなる分泌タンパク質なので、レラキシン３のプレ−プロペプチドからの成熟レラキシン３の生産にはプロテアーゼが含まれる。最初に、シグナル配列ペプチダーゼがプロペプチドからシグナル配列を切断し、レラキシン３プロペプチドを与える。プ
ロペプチドは続いて、プロ−ホルモンコンバーターゼによりレラキシン３のＡ、Ｂ及びＣ鎖に切断される。Ａ−鎖及びＢ−鎖は最終的な成熟レラキシン３を形成し、Ｃ−鎖は成熟レラキシン３の一部ではない。プロ−ホルモンコンバーターゼは、ホルモンが分泌されるある種の限られた細胞型、例えばいくつかのニューロン細胞又は内分泌細胞において選択的に発現されるのみなので、レラキシン３がＣＯＳ７のような他の細胞型から組換えにより発現される場合、レラキシン３プロペプチドは多くの場合、有効にプロセシングされない（実施例４）。

本発明は：１）レラキシン３プロペプチドのＡ鎖とＣ鎖及び／又はＣ鎖とＢ鎖の間のペプチド結合において挿入されたプロテアーゼ切断部位を有する改変されたレラキシン３プロペプチドをコードすることができるＤＮＡ分子を構築し；２）改変されたレラキシン３プロペプチドを発現することができるベクターを構築し；３）改変されたレラキシン３プロペプチドを、挿入されたプロテアーゼ切断部位において切断することができるプロテアーゼを発現することができる他のベクターを構築し；４）両方のベクターを宿主細胞中に導入し；そして５）改変されたレラキシン３プロペプチド及びプロテアーゼの両方の発現に適した条件下で宿主細胞を生育し、改変されたレラキシン３プロペプチド上のＡ鎖とＣ鎖又はＣ鎖とＢ鎖の間のペプチド結合をプロテアーゼが有効に切断する段階を含んでなる、組換え細胞からのレラキシン３の生産方法を提供する。

配列分析は、プロ−ホルモンコンバーターゼの１つのメンバーであるフリンが本来のレラキシン３プロペプチド上のＣ鎖とＢ鎖の間のペプチド結合を切断し、他の同定されていないプロテアーゼが本来のプロペプチド上のＡ鎖とＣ鎖の間のペプチド結合を切断することを示唆した。本発明の好ましい態様において、ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｒｇ（ＲＧＲＲ）のアミノ酸配列を有するフリン切断部位がＡ鎖とＣ鎖のペプチド結合において挿入される。この突然変異レラキシン３のための発現ベクター及びフリンのための他の発現ベクターが宿主細胞中に共−トランフェクションされる。適した生育条件下で、レラキシン３プロペプチドはほとんど完全に成熟ペプチドＡ、Ｂ及びＣにプロセシングされた。Ａ鎖とＣ鎖のペプチド結合におけるフリン切断部位の挿入は、成熟レラキシン３を構成するＡ鎖及びＢ鎖においてアミノ酸変化を導入しないことに注意されたい。プロ−ペプチド切断の効率は、Ａ鎖とＣ鎖の間のフリン切断部位の挿入なしのレラキシン３の組換え発現（プロ−ペプチドの２０％未満が成熟形態に切断された）と比較して有意に向上した（プロ−ペプチドの９０％より多くが成熟形態に切断された）（実施例４を参照されたい）。

フリンの代わりに、他のプロテアーゼを本発明の方法において用いることもできる。好ましくは、プロ−ペプチド上のＡ鎖とＣ鎖及びＣ鎖とＢ鎖の間に同じプロテアーゼ切断部位を挿入することができる。用いることができるプロテアーゼの例には、例えばプロ−ホルモンコンバーターゼ、例えばフリン、ＰＣ１及びＰＣ２（Ｈｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９９１年，１２１２７−１２１３０；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１９９１年，３５６４−３５６８；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｃｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１９９１年，５２９７−５３０１）が含まれる。

本発明は、レラキシン３プロペプチド上のＡ鎖とＣ鎖及び／又はＣ鎖とＢ鎖の間のペプチド結合において挿入されたプロテアーゼ切断部位を有する改変されたレラキシン３プロペプチドを発現することができる発現ベクターにも関する。本発明は、上記の改変されたレラキシン３のための発現ベクター及び改変されたレラキシン３プロペプチド上に導入されたプロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼのための発現ベクターの両方を含んでなる宿主細胞にも関する。

１つの好ましい態様において、ＨＡ、ポリＨｉｓ又はＦＬＡＧのようなタグを、改変さ
れたレラキシン３プロペプチドに加え、タンパク質単離又は精製を容易にすることができる。ＤＮＡ分子を改変し、そのようなＤＮＡ分子によりコードされるアミノ酸配列においてある望ましい変化を引き起こす方法は、当該技術分野における熟練者に既知である。実施例４は、そのような方法の１つ、融合ＰＣＲ法を例示する。

同定されたＧＰＣＲ１３５とレラキシン３の間の相互作用は、ＧＰＣＲ１３５遺伝子及び／又はレラキシン３遺伝子が導入されたか、又は崩壊したトランスジェニック動物、例えばノック−アウトマウスの開発を可能にする。同定されたレセプターとリガンドの間の相互作用は、レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体に関連する障害の処置における化合物の有効性の可能性に関して化合物を同定するためのスクリーニング法又はアッセイにおいて、ＧＰＣＲ１３５又はＧＰＣＲ１３５／レラキシン３複合体を使用することも可能にする。
レラキシン３／ＧＰＣＲ１３５複合体の活性のモジュレーターの同定方法
かくして本発明の他の一般的な側面は、レラキシン３／ＧＰＣＲ１３５複合体の生物学的活性を向上させるかもしくは低下させるモジュレーターの同定方法に関する。そのようなモジュレーターは、レラキシン３／ＧＰＣＲ１３５複合体に関連する疾患又は障害、例えばＣＮＳ障害（不安、精神分裂病、うつ病、気分、睡眠／覚醒）、代謝障害、摂食／飲用障害（ｆｅｅｄｉｎｇ／ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、水及び栄養ホメオスタシスならびに内分泌障害に苦しむ患者の処置における治療薬として有用である（Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４３８：２００１年，８６−１２２を参照されたい）。

「阻害剤」は、レラキシン３／ＧＰＣＲ１３５複合体発現又は活性を減少させるか、妨げるか、不活性化するか、脱感作するか、又は下方−調節する化合物を指す。「活性化物質」は、レラキシン３／ＧＰＣＲ１３５複合体発現又は活性を増加させるか、活性化するか、助長するか、感作するか、又は上方−調節する化合物である。「モジュレーター」は、「阻害剤」及び「活性化物質」の両方を含む。

化合物同定法は、通常の実験室フォーマットを用いて、あるいは高処理量に適応させたアッセイにおいて、行なうことができる。「高処理量」という用語は、同時の複数の試料の容易なスクリーニングを許すアッセイ設計を指し、ロボット操作に関する能力を含み得る。高処理量アッセイの他の望ましい特徴は、所望の分析を行なうための試薬使用を減少させるように、あるいは操作の数を最小にするように最適化されるアッセイ設計である。アッセイフォーマットの例には９６−ウェルもしくは３８４−ウェルプレート、浮揚滴（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔｓ）及び液体−取り扱い実験のために用いられる「ラボオンチップ」ミクロチャンネルチップ（“ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ”ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ ｃｈｉｐｓ）が含まれる。当該技術分野における者により既知の通り、プラスチック型及び液体−取り扱い装置の小型化が進むので、又は進歩したアッセイ装置が設計されるので、本発明のアッセイを用いて、より多数の試料をより有効にスクリーニングすることができるであろう。

スクリーニングのための候補化合物を多数の化学的種類から、好ましくは有機化合物の種類から選ぶことができる。候補化合物は巨大分子であることができるが、好ましくは、候補化合物は小分子有機化合物、すなわち５０より大きく且つ２５００未満の分子量を有するものである。候補化合物は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な１個もしくはそれより多い官能性化学基を有する。好ましい候補化合物は、少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは少なくとも２個のそのような官能基、そしてより好ましくは少なくとも３個のそのような官能基を有する。候補化合物は、１個もしくはそれより多い上記で例示した官能基で置換された環状炭素又は複素環式構造部分及び／又は芳香族もしくはポリ芳香族構造部分を含んでなることができる。候補
化合物は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記のものの誘導体もしくは構造的類似体又はそれらの組み合わせなどのような生体分子であることもできる。化合物が核酸の場合、化合物は好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ分子であるが、非−自然結合を有する改変核酸あるいはサブユニットも包含される。

合成又は天然化合物のライブラリを含む多様な供給源から候補化合物を得ることができる。例えば多様な有機化合物及び生体分子の無作為な及び方向付けられる（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成のために、無作為化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機組み合わせライブラリ、無作為ペプチドのファージディスプレーライブラリなどを含む多数の手段を利用できる。当該技術分野において既知の組み合わせライブラリ法中の多数の方法のいずれかを用いて候補化合物を得ることもでき、それには：生物学的ライブラリ；空間的にアドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）平行固−相又は溶液−相ライブラリ：デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法；「ワン−ビーズワン−コンパウンド（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリ法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法が含まれる（例えばＬａｍ著，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１９９７年，１４５を参照されたい）。あるいはまた、バクテリア、菌・カビ、植物及び動物抽出物の形態における天然化合物のライブラリを利用できるか、又は決まりきった操作で生産することができる。さらに、天然の及び合成により生産されるライブラリ及び化合物を、通常の化学的、物理的及び生化学的手段を介して決まりきった操作で改変することができる。

さらに、既知の薬理学的薬剤をアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような方向付けられる又は無作為な化学的改変に供し、薬剤の構造的類似体を作ることができる。候補化合物は無作為に選ばれることができるか、あるいはＧＰＣＲに結合する及び／又はＧＰＣＲ活性の機能を調節する既存の化合物に基づくことができる。従って候補薬剤の供給源は、ＧＰＣＲ１３５に類似の構造を有するＧＰＣＲｓに関する既知の活性化物質又は阻害剤に基づく分子のライブラリであり、ここで化合物の構造は分子の１つもしくはそれより多い位置で変化し、より多いかもしくはより少ない化学的部分又は異なる化学的部分を含有する。類似の活性化物質／阻害剤のライブラリの形成において分子に成される構造的変化は方向付けられるか、無作為であるか、又は方向付けられる及び無作為な置換及び／又は付加の両方の組み合わせであることができる。

多様な他の試薬も混合物中に含まれ得る。これらには塩、緩衝剤、天然のタンパク質（例えばアルブミン）及び最適タンパク質−タンパク質及び／又はタンパク質−核酸結合を助長するために用いられ得る洗剤のような試薬が含まれる。そのような試薬は、反応成分の非−特異的又は背景相互作用を減少させることもできる。アッセイの効率を向上させる他の試薬、例えばヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などを用いることもできる。

分子ライブラリの合成のための方法の例は当該技術分野において、例えば：Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１９９４年，２６７８において見出すことができる。化合物のライブラリは溶液中で（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ著，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：１９９２年，４１２−４２１）又はビーズ上（Ｌａｍ著，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１９９１年，８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ著，Ｎａｔｕｒｅ ３６４：１９９３年，５５５−５５６）、バクテリア上（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号明細書）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１９９２年，１８６５−１８６９）もしくはファージ上（例えばＳｃｏｔｔ ａｎｄ
Ｓｍｉｔｈ著，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１９９０年，３８６−３９０を参照されたい）で与えられることができる。

かくして、１つの一般的側面において、本発明は：
（ａ）緩衝剤及び候補もしくは試験化合物を含んでなる溶液を、レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体をを含んでなるアッセイ試薬と接触させ；
（ｂ）レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体の生物学的活性を測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）の結果を、レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体を緩衝剤のみと接触させた対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果と比較する
段階を含んでなる、レラキシン３／ＧＰＣＲ１３５複合体の生物学的活性を向上させるかもしくは低下させる化合物の同定方法に関する。

上記の通り、レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体は、レラキシン３又はレラキシン３の活性フラグメントならびにＧＰＣＲ１３５又はＧＰＣＲ１３５の活性フラグメントを含んでなる。好ましい態様において、該方法におけるレラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体は、細胞表面上でＧＰＣＲ１３５を発現する細胞に付随している。

「細胞」という用語は、検出法の感度に関して適宜に少なくとも１個の細胞又は複数の細胞を指す。本発明に適した細胞はバクテリア細胞であることができるが、好ましくは真核細胞、例えば酵母、昆虫又は哺乳類細胞である。細胞は内在性ＧＰＣＲ１３５に関する天然の宿主細胞であることができ、好ましくは細胞表面上で増加した量の哺乳類ＧＰＣＲ１３５を発現するＧＰＣＲ１３５に関する組換え宿主細胞である。

純粋なタンパク質の形態で、又はレラキシン３を含有する細胞もしくは組織抽出物の形態で、レラキシン３をＧＰＣＲ１３５宿主細胞に加えることにより、レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体を形成することができる。レラキシン３は全−長成熟ポリペプチドあるいはまだＧＰＣＲ１３５に結合することができるフラグメントであることができる。

好ましい態様において、細胞の二次メッセンジャー応答により、レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体の生物学的活性を測定することができる。例えば活性化されたＧＰＣＲ１３５により開始されるシグナル伝達事象により、レラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体の生物学的活性を測定することができる。このシグナル伝達事象は、細胞形態、移動又は化学走性のような細胞生理学における１つもしくはそれより多い変化を当該技術分野における熟練者に既知の１つもしくはそれより多い適した方法を用いて測定することにより、間接的に測定することができる。シグナル伝達経路に含まれるタンパク質のリン酸化、例えばＧＴＰ−結合タンパク質（Ｇタンパク質）のリン酸化を測定することにより、それを直接測定することもできる。例えばγ−ホスフェート上で放射性標識されたＡＴＰ又はＧＴＰ分子の使用によりタンパク質リン酸化を測定する方法は、当該技術分野における熟練者に既知である。

当該技術分野における熟練者に既知の複数の適した方法のいずれかを用い、二次メッセンジャー分子の細胞内濃度によりレラキシン３及びＧＰＣＲ１３５複合体の生物学的活性を測定することもできる。例えばアクリジンオレンジのようなｐＨ感受性色素を用い、ｐＨ変化を測定することができる。蛍光測定画像形成プレートリーダー（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（ＦＬＩＰＲ）又は同焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用い、フルオ−３（ｆｌｕｏ−３）（五カリウム塩、細胞−不透過性形態；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）又はフルオ−３（ＡＭ）（フルオ−３のアセトキシメチルエステル形態、Ｔｅｆｌａｂｓ）（例えばＬｉｕ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９９：２００１年，１２１−３０を参照されたい）のようなＣａ^２＋に感受性の蛍光指示薬の光学的画像形成を介して、カルシウム濃度を測定することができる（実施例６を参照されたい）。商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットを用いて（ＦＬＡＳＨＰＬＡＴＥサイクリックＡＭＰアッセイシステム（^１２５Ｉ），カタログ番号：ＳＭＰ００１Ａ，ＮＥＮ；Ｓｈｉｍｏｍ
ｕｒａ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：２００２年，３５８２６−３２も参照されたい）（実施例８を参照されたい）あるいはベータ−ガラクトシダーゼのようなリポーター遺伝子の発現がｃＡＭＰ応答性要素（ｃｒｅ）の調節下にあるリポーター系を介して（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ ｅｔ ａｌ．著，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１３（５）：１９９０年，１８４−８）（実施例１を参照されたい）、ｃＡＭＰ濃度を検出することができる。

機能性ＧＰＣＲ１３５を含有する第１の細胞及び機能性ＧＰＣＲ１３５が欠けている以外は第１の細胞に同じ第２の細胞の２つの細胞への試験化合物の効果を比較することにより、試験化合物をさらに特性化することができる。この方法は、これらのアッセイの背景ノイズの確定においても有用である。当該技術分野における通常の熟練者は、この調節機構が機能性ＧＰＣＲ１３５の調節に応答する細胞変化の容易な選択も可能にすることを認識するであろう。従って好ましい態様において、スクリーニング法は：（ａ）細胞表面上で発現されるＧＰＣＲ１３５を有する第１の細胞をレラキシン３又はレラキシン３の活性フラグメント及び試験化合物と接触させ；（ｂ）試験化合物への第１の細胞における二次メッセンジャー応答を決定し、それを、第１の細胞をレラキシン３又はその活性フラグメントのみと接触させて試験化合物と接触させない標準のそれと比較し；（ｃ）第２の細胞をレラキシン３又はレラキシン３の活性フラグメント及び試験化合物と接触させ；ここで第２の細胞は、それが細胞表面上でＧＰＣＲ１３５を発現しないことを除いて他の点では第１の細胞と同じであり；（ｄ）試験化合物への第２の細胞の二次メッセンジャー応答を決定し、二次メッセンジャー応答を、第２の細胞をレラキシン３のみと接触させて試験化合物と接触させない対照のそれと比較し；そして（ｅ）（ｂ）の比較結果を（ｄ）の比較結果と比較する段階を含んでなる。

１つがその細胞表面上でＧＰＣＲ１３５を発現し、他が発現しないことを除いて、他の点では同じである２つの細胞を得るための複数の方法がある。１つの態様において、第１の細胞はその細胞表面上でＧＰＣＲ１３５を構成的に発現するＧＰＣＲ１３５に関する組換え宿主細胞であり、第２の細胞は、ＧＰＣＲ１３５組換え細胞が構築される親細胞である。他の態様において、細胞表面上におけるＧＰＣＲ１３５の発現が誘導プロモーターの調節下にあるように、ＧＰＣＲ１３５に関する組換え宿主細胞を構築する。第１の細胞は、その細胞表面上におけるＧＰＣＲ１３５の発現を許す誘導条件下で生育される組換え細胞であり、第２の細胞は、ＧＰＣＲ１３５の発現を許さない非−誘導条件下で生育される組換え細胞である。さらに別の態様において、第１の細胞は、その細胞表面上でＧＰＣＲ１３５を発現するＧＰＣＲ１３５に関する本来の宿主細胞であり、第２の細胞は、突然変異誘発によりＧＰＣＲ１３５遺伝子が不活性化された、本来の細胞から誘導される突然変異細胞である。ＧＰＣＲ１３５に関する組換え宿主細胞の構築のため、又はＧＰＣＲ１３５遺伝子の不活性化のために、標準的な分子生物学法を用いることができる。

他の好ましい態様において、本発明は：（ａ）ＧＰＣＲ１３５を含んでなる単離された膜調製物をレラキシン３又はレラキシン３の活性フラグメント、試験化合物及び□−ホスフェート上で標識されたＧＴＰ分子と接触させ；そして（ｂ）膜調製物に結合した標識の量ほ決定し；そして（ｃ）（ｂ）における標識の量を、膜調製物をレラキシン３又はその活性フラグメント及び標識されたＧＴＰのみと接触させ、試験化合物と接触させない対照の量と比較する段階を含んでなる、レラキシン３／ＧＰＣＲ１３５複合体の活性を向上させるかもしくは低下させる化合物の同定方法を提供する。

膜調製物は、その細胞表面上でＧＰＣＲ１３５を発現する本来の宿主細胞から、又は好ましくはその細胞表面上で増加した量のＧＰＣＲ１３５を発現する組換え宿主細胞から単離することができる。ＧＰＣＲ１３５宿主細胞を含んでなる組織からそれを単離することもできる。膜調製の方法を下記の実施例に示す。

γ−ホスフェート上でＧＴＰ分子を標識するために、蛍光分子又は放射性同位体、例えば^３５Ｓ、^３２Ｐなどのような多様な標識を用いることができる。標識分子としての［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの使用の代表的な方法を実施例５に記載する。

さらに別の態様において、本発明は：（ａ）ＧＰＣＲ１３５を試験化合物及び標識レラキシン３又はその活性フラグメントと接触させ；（ｂ）ＧＰＣＲ１３５に結合した標識レラキシン３又はそのフラグメントの量を測定し；そして（ｃ）（ｂ）の測定量を、ＧＰＣＲ１３５を標識レラキシン３又はそのフラグメントのみと接触させ、試験化合物と接触させない対照のそれと比較する段階を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５に結合する化合物の同定方法を提供する。

１つの好ましい態様において、細胞表面上でＧＰＣＲ３１５を発現するＧＰＣＲ１３５宿主細胞（組換え又は本来の）を結合アッセイに用いることができる。他の好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５を含んでなる単離された膜調製物を結合アッセイに用いることができる。さらに別の好ましい態様において、レラキシン３に結合することができる、実質的に精製されたＧＰＣＲ１３５の細胞外フラグメントを、結合アッセイに用いることができる。

ＧＰＣＲ１３５に結合する標識されたレラキシン３又はそのフラグメントの量は、最初に結合しない標識されたレラキシン３又はそのフラグメントをＧＰＣＲ１３５から分離し、次いでＧＰＣＲ１３５に伴う標識の量を測定することにより測定することができる。

結合しない標識されたレラキシン３又はそのフラグメントからのＧＰＣＲ１３５タンパク質の分離は、多様な方法で行なうことができる。簡便には、ＧＰＣＲ１３５を固体基質上に固定化し、それから結合しないレラキシン３を容易に分離することができる。固体基質は多様な材料から、且つ多様な形で、例えばミクロタイタープレート、ミクロビーズ、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、樹脂粒子などにおいて作られることができる。基質は、好ましくはシグナル−対−ノイズ比を最大にするように、主に背景結合を最小にするように、ならびに分離を容易にし、コストを軽減するように選ばれる。

分離は、例えば溜め（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）からビーズ又はディップスティックを取り出すことにより、ミクロタイタープレートウェルのような溜めを空にするかもしくは希釈することにより、あるいはビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラム又はフィルターを洗浄溶液又は溶媒で濯ぐことにより行なうことができる。分離段階は、好ましくは多数回の濯ぎ又は洗浄を含む。例えば固体基質がミクロタイタープレートである場合、ウェルを洗浄溶液で数回洗浄することができ、洗浄溶液は、例えば特異的結合に関与しないインキュベーション混合物の成分、例えば塩、緩衝剤、洗剤、非−特異的タンパク質などを含む。個体基質が磁気ビーズである場合、ビーズを洗浄溶液で１回もしくはそれより多数回洗浄し、磁石を用いて単離することができる。

ＧＰＣＲ１３５を複数の方法を用いて固体基質上に固定化することができる。１つの態様において、ＧＰＣＲ１３５タンパク質がマトリックスに結合するのを可能にするドメインを加える融合タンパク質を準備することができる。例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化ミクロタイタープレート上に吸着させることができ、それを次いで試験化合物及び標識されたレラキシン３と一緒にし、混合物を複合体形成に誘導する条件下で（例えば塩及びｐＨに関して生理学的条件下で）インキュベーションする。インキュベーションに続き、ビーズ又はミクロタイタープレートウェルを洗浄して非結
合成分を除去し、例えば上記の通りに複合体形成を直接又は間接的に測定する。あるいはまた、複合体をマトリックスから解離させることができ、標準的な方法を用いて、標識されたレラキシン３のＧＰＣＲ１３５への結合のレベルを決定することができる。

マトリックス上におけるタンパク質の固定化のための他の方法も、本発明のスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。例えばビオチン及びストレプタビジンの共役を用いてＧＰＣＲ３１５を固定化することができる。当該技術分野において既知の方法（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能なビオチニル化キット）を用い、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）からビオチニル化ポリペプチドを調製し、ストレプタビジンがコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェルにおいて固定化することができる。

あるいはまた、ＧＰＣＲ１３５と反応性であるが、レラキシン３又は試験化合物へのＧＰＣＲ１３５の結合を妨げない抗体をプレートの壁に結合させ、次いで抗体共役によりＧＰＣＲ１３５をウェル内に捕獲することができる。

レラキシン３又はそのフラグメントの標識のために、直接の検出を与えるもの（例えば放射性、ルミネセンス、光学もしくは電子密度など）あるいは間接的な検出を与えるもの（例えばＦＬＡＧエピトープのようなエピトープタグ、ホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素タグなど）のような多様な標識を用いることができる。

候補化合物の存在下及び不在下におけるレラキシン３へのＧＰＣＲ１３５の相互作用は、反応物を含有するのに適したいずれの容器において行なうこともできる。そのような容器の例にはミクロタイタープレート、試験管及び微量遠心管が含まれる。

代表的な結合アッセイを下記の実施例７において記載する。

他の一般的な側面において、本発明は：
（ａ）ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを含んでなるアッセイ試薬と試験化合物を接触させ；
（ｂ）ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントの生物学的活性を測定し；そして
（ｃ）段階（ｂ）の結果を、ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを試験化合物の不在下でレラキシン３又はその活性フラグメントと接触させた対照の結果と比較する
ことを含んでなる、ＧＰＣＲ１３５に結合し、レラキシン３を模する化合物の同定方法に関する。

この方法への１つの好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントは組換え細胞から、好ましくは細胞表面上で発現される。他の好ましい態様において、ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントは、単離された細胞膜調製物内にある。

生物学的活性は、レセプター及びリガンド複合体又はＧＰＣＲ１３５とレラキシン３の相互作用に関連する生物学的活性、例えばシグナル伝達事象又は活性化ＧＰＣＲ１３５により開始される二次メッセンジャー分子の細胞内濃度における変化のいずれであることもできる。これらの生物学的活性は、上記の方法を用いて測定することができる。レラキシン３を「模する」（"ｍｉｍｉｃｓ"）試験化合物は、レラキシン３のものと類似のＧＰＣＲ１３５の生物学的活性における変化を引き出す。

哺乳類ＧＰＣＲ１３５のクローニング及び組換え発現
この実施例は、ヒト、マウス及びラットからのＧＰＣＲ１３５のクローニング及び組換え発現を記載する。類似の方法を用い、他の動物からのＧＰＣＲ１３５をクローニングし、組換えにより発現させることもできる。

ＧＰＣＲ１３５は、既知のＧＰＣＲｓ、ソマトスタチンレセプターへのその配列相同性に基づいて、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ 受け入れ番号：ＮＴ ０２３０８５）からオーファンＧＰＣＲとして同定された。配列分析は、ヒト、マウス又はラットにおけるＧＰＣＲ１３５の全コード領域がイントロンを含有しないことを明らかにした。従って、これらの動物におけるＧＰＣＲ１３５に関するコード配列を、鋳型としてゲノムＤＮＡを用い、且つＧＰＣＲ１３５読取り枠の推定翻訳開始及び停止部位に相補的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅により得ることができる。ヒト又はマウスと異なり、ラットはＧＰＣＲ１３５に関する２つの翻訳開始部位を有し、それらは２１ ｎｔ離れている。２つの開始部位はラットＧＰＣＲ１３５の２つのイソ型、長いイソ型ＧＰＣＲ１３５ｌ及び短いイソ型ＧＰＣＲ１３５ｓを生ぜしめ、それらをクローニングし、特性化した。

ヒトＧＰＣＲ１３５をヒトゲノムＤＮＡから、前進プライマー、配列番号：１，５’ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＧＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＡ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＣ Ｇ ３’及び逆プライマー、配列番号：２，５’ＡＣＡ ＴＣＡ
ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ
ＣＡＧ ３’を用いてＰＣＲ増幅させた。マウスＧＰＣＲ１３５コード領域をマウスゲノムＤＮＡから、前進プライマー、配列番号：３，５’ＡＣＧ ＡＴＡ ＣＴＣ ＧＡＧ
ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＣ ＣＣＣ
ＧＣＧ ３’及び逆プライマー、配列番号：４，５’ＡＣＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＧＡ
ＴＣＡ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＧＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＴ ３’を用いてＰＣＲ増幅させた。ラットＧＰＣＲ１３５長鎖形態をラットゲノムＤＮＡから、前進プライマー、配列番号：５，５’ＡＣＧ ＡＴＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＧＣＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＡＡ ＧＴ ３’及び逆プライマー、配列番号：６，５’ＡＣＧ ＡＴＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＧＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＴ ３’を用いてＰＣＲ増幅させた。ラットＧＰＣＲ１３５短鎖形態をラットゲノムＤＮＡから、前進プライマー、配列番号：７，５’ＡＣＧ ＡＴＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＡＡ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＣＡ ３’及び逆プライマー、配列番号：６，５’ＡＣＧ ＡＴＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＧＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＴ ３’を用いてＰＣＲ増幅させた。

これらのＰＣＲ産物を哺乳類発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に、Ｘｈｏ１及びＸｂａ１部位の間で別々にクローニングし、配列決定して配列の同一性を確認した。配列決定の結果は、ヒトＧＰＣＲ１３５、マウスＧＰＣＲ１３５、ラットＧＰＣＲ１３５ｌ及びラットＧＰＣＲ１３５ｓのそれぞれに関するコード配列がそれぞれ配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０及び配列番号１１に表される通りであることを示した。ｃＤＮＡ配列に基づき、ヒトＧＰＣＲ１３５、マウスＧＰＣＲ１３５、ラットＧＰＣＲ１３５Ｌ及びラットＧＰＣＲ１３５Ｓのそれぞれに関する推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４及び配列番号：１５に表される通りである。

配列分析は、哺乳類ＧＰＣＲ１３５が既知のＧ−タンパク質共役レセプター、例えばソマトスタチンレセプター及びアンギオテンシンレセプターへの有意な配列相同性を共有することを示した。ヒト、ラット及びマウスＧＰＣＲ１３５の間のアミノ酸配列比較は、ＧＰＣＲ１３５が異なる動物種において非常に保存された遺伝子であることを示した（図１
）。ラットＧＰＣＲ１３５ｌは、以前に国際公開第００／２４８９１号パンフレットにおいて記載された。しかしながら、配列比較は、ラットＧＰＣＲ１３５ｓの最初のアミノ酸がヒト及びマウスＧＰＣＲ１３５の最初のアミノ酸と整列することを示し、ラットＧＰＣＲ１３５ｓがラットにおいて発現されるようであることを示唆した。組換えにより発現されるラットＧＰＣＲ１３５ｓ及びＧＰＣＲ１３５ｌは、放射性リガンド結合又はＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて類似の活性を有することが示された（図２）。

ヒトＧＰＣＲ１３５ ｍＲＮＡの組織発現パターンの研究のために、種々のヒト組織からのｃＤＮＡｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）につき、ヒトＧＰＣＲ１３５遺伝子にアニーリングするプライマーを用いて定量的ＰＣＲ増幅アッセイを行なった。得られるＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で移動させ、エチジウムブロミド（ｅｔｈｄｉｕｍ ｂｒｉｍｉｄｅ）で染色した。標準として、ヒトアクチンプライマーを用いて同じ組織からのヒトアクチンｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。アガロースゲル分析の結果は、ヒトＧＰＣＲ１３５ ｍＲＮＡが脳で最も強く発現され、胎盤、膵臓及び精巣においていくらかの弱い発現があることを示した。結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、骨格筋及び胸腺を含む、調べられた他の組織においては、発現が見出されないか、もしくは非常に弱い発現が見出された。ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ−保護及びその場ハイブリッド形成のような他のｍＲＮＡ発現分析から、ヒトＧＰＣＲ１３５ ｍＲＮＡの発現について矛盾しない結果が得られた。

組換えＧＰＣＲ１３５宿主細胞を得るために、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号：１８３２４−０２０）を用い、上記のＧＰＣＲ１３５発現ベクターをＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号 ＣＣＬ−６１）細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、放射性−リガンド結合アッセイ又はＧＴＰγＳ結合アッセイのために細胞を用いた（実施例５を参照されたい）。別の実験において、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅを用い、ＧＰＣＲ１３５発現ベクターを２９３（ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−１５７３）細胞中にＧｑｉ５と共−トランスフェクション又はそれのみでトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、ＦＬＩＰＲを用いるリガンド刺激に応答するＣａ^２＋動態化アッセイのために細胞を用いた（実施例６を参照されたい）。さらに、ＣＲＥ−β ｇａｌリポーター遺伝子を保有するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＡＴＣＣ番号 ＨＴＢ−１０）中にもＧＰＣＲ１３５発現ベクターをトランスフェクションした。Ｇ４１８の選択を用い（４００ｍｇ／Ｌ）、最少必須培地プラス１０％胎児ウシ血清中で細胞を培養することにより、安定な細胞系を確立し、細胞内ｃＡＭＰ濃度に関するリポーターアッセイにおいて用いた。ＧＰＣＲ１３５発現ベクターの不在下で、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＫ２９３及びＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞のいずれも、ＧＴＰγＳ結合アッセイから検出可能なレベルでＧＰＣＲ１３５を発現しない。

ラット脳からのＧＰＣＲ１３５リガンド活性の最初の同定及び特性化
この実施例は、ラット脳からのＧＰＣＲ１３５リガンド活性の同定及び特性化を記載する。類似の方法を用い、ヒト、マウス、イヌ及びブタからのような他の動物脳組織においてリガンド活性を調べることもできる。

凍結されたラット脳（５ｇ）を−３０℃において４０ｍｌのエタノール／ＨＣｌ（３：１におけるエタノール対０．８Ｍ ＨＣｌ比）中で均質化した。ホモジネートを４℃において２時間抽出し、次いで４℃において２０，０００ｇで３０分間遠心した。上澄み液を２ｍｌのＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に負荷し、１Ｍ酢酸で洗浄し、２Ｍピリジン及び１Ｍ酢酸で溶離させた。溶離した画分を６ｍｌのＣ−１８ ＢｏｎｄＥｌｕｔカラム上に負荷し、０．１％ＴＦＡで洗浄し、６０％アセトニトリル及び０．１％ＴＦＡで溶離させた。溶離したペプチドを凍結乾燥し、水中で再構築し
、実施例５に記載する通りにＧＴＰγＳ結合アッセイを用いてＧＰＣＲ１３５リガンド活性に関して調べた。

ラットＧＰＣＲ１３５リガンドの分子サイズをＨＰＬＣゲル濾過により特性化した。ラット脳抽出物からの再構築された画分を、１Ｍ酢酸中でＨＰＬＣゲル濾過カラム（ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ ２０００，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を介して移動させた。ＨＰＬＣ分離の間に１．０ｍｌの画分を集め、凍結乾燥し、ＧＴＰγＳ結合アッセイを用いてＧＰＣＲ１３５リガンド活性に関して調べた。平行実験において、種々の分子量を有するタンパク質又はペプチドを同じに移動させ、分子量標準として供した。

結果は、ラット脳抽出物がＧＰＣＲ１３５を含有する単離された膜へのＧＴＰγＳ結合を有力に刺激するが、ＧＰＣＲ１３５を含有しない負の標準に結合しないことを示した。ラット脳抽出物のＨＰＬＣゲル濾過分析は、ＧＰＣＲ１３５リガンド活性が４０００〜５０００の分子量（ＭＷ）当たりで溶離することを示した（図３）。脂質、ヌクレオチド又は小分子のような他の型のＧＰＣＲリガンドは４０００を超える分子量（ＭＷ）をめったに有していないので、分子量研究は、ＧＰＣＲ１３５リガンドがペプチドであることを示唆した。

ブタ脳からのＧＰＣＲ１３５リガンドの精製
ＧＰＣＲ１３５リガンドをさらに特性化するために、それを脳抽出物から精製することができる。この実施例は、ブタ脳からのＧＰＣＲ１３５リガンドの精製を記載する。類似の方法を用いて他の動物からリガンドを精製することができる。

凍結されたブタ脳（５ｋｇ）を、ラット脳抽出に関して上記に記載した通りに冷エタノール／ＨＣｌ中で、規模を大きくして均質化した。ブタ脳抽出物の上澄み液をリソースＳカチオンイオン交換カラム（ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ｃａｔｉｏｎ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ）上に負荷し、０から２ＭへのＮａＣｌ勾配を有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）及び２０％アセトニトリルを用いて溶離させた。ＧＰＣＲ１３５発現細胞膜におけるＧＴＰγＳ結合を刺激する画分をプールし、ｐＨ２．５においてリソースＳカチオンイオン交換カラム上に負荷し、０から２ＭへのＮａＣｌ勾配を有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）及び２０％アセトニトリルを用いて溶離させた。活性な画分をプールし、ＲＰ−ＨＰＬＣ半−調製的カラム上に負荷し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を用いて溶離させた。活性な画分をプールし、凍結乾燥し、０．１％ＴＦＡ中に再溶解し、次いで分析的ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に負荷した。カラムに結合したペプチドを、再び０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を用いて溶離させた。この段階に、活性な画分は純粋であると思われた。画分中のペプチドは５５００の分子量（ＭＷ）を有することが質量分析により示され、Ｅｄｍａｎ分解法を用いてペプチドのＮ−末端を配列決定した。精製された画分は、配列番号：１６，ＤＶＬＡＧＬＳＳＮＸＸＫＷＧＸＳＫＳＥＩ及び配列番号：１７，ＲＡＳＰＹＧＶＫＬＸＧＲＥＦＩＲＡＶＩＦに表されるＮ−末端配列を有する２つのペプチドから成ることが見出された。

誘導される配列を問題として（ａｓ ｑｕｅｒｉｅｓ）用いるデータベース探索は、両方の配列が、インスリン−様ペプチド７（受け入れ番号 ＮＭ １７３１８４，マウス）（図４）とも呼ばれ、ジスルフィド結合により連結した２個のペプチドを含有するインスリン群のメンバーであるレラキシン３の配列と一致することを明らかにした。この結果は、精製され且つ配列決定されたペプチドがブタレラキシン３であることを示し、レラキシン３がＧＰＣＲ１３５に関するリガンドであることを支持した。

ヒト組換えレラキシン３の発現及び精製
ヒトレラキシン３の完全なコード配列を、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、前進プライマー、配列番号：１８，５’ＡＣＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＴＡＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ３’及び逆プライマー、配列番号：１９，５’ＡＣＧ ＡＴＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＣＡ ＡＡＧ ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＣＴ ＴＴＴ ＧＣ ３’を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を哺乳類発現ベクターｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、Ｓａｌ１及びＢａｍＨ１部位の間でクローニングした。クローニングされたｃＤＮＡを配列決定して同一性を確認した。

発現ベクターをＣＯＳ−７細胞中に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから３日後、トランスフェクションされた細胞の上澄み液を集め、ｐＨを３．０に調節し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５カチオン交換カラム上に負荷した。カラムを１Ｍ酢酸で洗浄し、２Ｍピリジン及び１Ｍ酢酸で溶離させた。溶離したタンパク質をＣ−１８ ＢｏｎｄＥｌｕｔカラム上に負荷し、０．１％ＴＦＡで洗浄し、６０％アセトニトリル及び０．１％ＴＦＡで溶離させた。溶離したタンパク質を凍結乾燥し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５中で再構築し、ＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて調べた。結果は、ヒトレラキシン３がトランスフェクションされた細胞培養からの培地が、ＧＰＣＲ１３５発現細胞膜におけるＧＴＰγＳ結合を有力に刺激するが、標準培地は活性を有していないことを示し（図５）、レラキシン３が実際にＧＰＣＲ１３５のリガンドであることを示した。

レラキシン３ペプチドの精製を容易にするために、レラキシン３ペプチド及びレラキシン３のＮ−末端にＦＬＡＧタグを含んでなる分泌融合タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。そのような発現ベクターは、ＦＬＡＧ配列が続くアルファペプチドシグナル配列でレラキシン３のシグナル配列を置き換えることにより構築される。

ヒトレラキシン３のプロ−ペプチドコード領域を、前進プライマー、配列番号：２０，５’ＡＣＧ ＡＴＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＡＴ ＡＡＧ ＣＧＧ ＧＣＡ ＧＣＧ ＣＣＴ ＴＡＣ ＧＧＧ ＧＴＣ ＡＧＧ Ｃ ３’及び逆プライマー、配列番号：２１，５’ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＴＡ ＧＣＡ ＡＡＧ
ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＣＴ ＴＴＴ ＧＣＴ ＡＣ ３’を用い、鋳型としてヒトレラキシン３ ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、改変されたｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１ベクター中にクローニングし、改変されたｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１ベクターにおいては、Ｐｓｔ１及びＥｃｏＲ１部位の間の配列を、ＦＬＡＧタグが続くアルファペプチドシグナル配列をコードする配列、配列番号：２２，５’ＣＴＧ ＣＡＧ
ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＣＡ ＧＣＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＧＣ
ＴＧＴ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＣＣ ＡＣＧ
ＣＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＡＧ
ＧＡＡ ＴＴＣ ３’で置き換えることによりポリ−クローニング部位が改変された。次いでヒトレラキシン３プロ−ペプチドコード領域をＦＬＡＧタグの下流に、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１部位の間でクローニングした。得られるクローンを配列決定し、同一性を確認した。

ＦＬＡＧ−レラキシン３融合ペプチド発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、組換え融合ペプチドを、抗−ＦＬＡＧアフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）を用い、細胞培養培地からアフィニティー精製した。簡単に記載すると、培地を抗−ＦＬＡＧアフィニティーカラム上に負荷した。カラムをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で洗浄し、０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．８で溶離させた。溶離したタンパク質を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５を用いて中
和した。エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）により融合ペプチドからＮ−末端ＦＬＡＧタグを切断し、野生型レラキシン３ペプチドを、Ｃ−１８カラム及び０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を用いる逆相ＨＰＬＣによりさらに精製し、ＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて調べた。結果は、精製されたペプチドがＧＰＣＲ１３５発現細胞膜においてＧＴＰγＳ結合を有力に刺激することを示した。しかしながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び逆−相ＨＰＬＣは、精製されたペプチドが不均一であることを示し、Ｃペプチドプロセシングが完全でなかったことを示唆した。

プロ−レラキシン３の成熟レラキシン３へのプロ−ホルモンコンバーターゼによるプロセシング効率を向上させるために、アミノ酸配列ＲＧＲＲから成るフリン切断部位をプロ−レラキシン３中に、Ｃ−鎖とＡ−鎖の連結部分において作った。この突然変異は、２−段階重複ＰＣＲ反応（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により作られた。前進プライマー（Ｐ１）、配列番号：２３，ＡＣＧ ＡＴＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＣＡ ＧＣＧ ＴＴＧ ＣＴＧ Ａ ３’及び逆プライマー（Ｐ２）、配列番号：２４，５’ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＣＡＴ ＣＴＣ ＧＴＣ ＧＧＣ ＣＣＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＣＣ ＣＡＧ ＧＧＧ ＴＴＣ ＣＴＴ Ｇ ３’を用い、鋳型としてＦＬＡＧ−レラキシン３ ｃＤＮＡを用いて、５’末端をＰＣＲ増幅した。前進プライマー（Ｐ３）、配列番号：２５，５’ＧＧＴ ＴＣＴ ＴＣＧ ＧＧＧ ＣＣＧ ＡＣＧ ＡＧＡ ＴＧＴ ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＣＣＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＡＧ Ｃ ３’及び逆プライマー（Ｐ４）、配列番号：２６，５’ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＴＡ ＧＣＡ ＡＡＧ ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＣＴ ＴＴＴ ＧＣＴ ＡＣ ３’を用い、鋳型としてＦＬＡＧ−レラキシン３ ｃＤＮＡを用いて３’末端をＰＣＲ増幅した。５’末端及び３’末端ＰＣＲ産物を精製し、上記の前進プライマー（Ｐ１）及び逆プライマー（Ｐ４）を用いる第２段階ＰＣＲのための鋳型として混合した。最終的なＰＣＲ産物をｐＣＭＶ−ｓｐｏｒｔ１中に、Ｐｓｔ１及びＢａｍＨ１部位の間においてクローニングし、挿入された領域を配列決定して同一性を確認した。

新しいレラキシン３発現ベクターをヒトプロ−ホルモンコンバーターゼフリン発現ベクターと一緒に、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅを用いてＣＯＳ−７細胞中に共−トランスフェクションした。ヒトフリン発現ベクターは、ヒトｃＤＮＡライブラリからのヒトフリンｃＤＮＡを、前進プライマー、配列番号：２７，５’ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＣＴＡ ＴＧ ３’及び逆プライマー、配列番号：２８，５’ＧＡＣ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＴ ＧＧＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＧＡ ＧＧＧ ＣＧＣ ＴＣＴ Ｇ ３’を有する２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより構築された。ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｏｔ１部位の間においてクローニングした。フリン発現ベクターの挿入された領域を配列決定し、その同一性を確認した。次いで抗−ＦＬＡＧアフィニティーカラムを用いて分泌レラキシン３を精製し、エンテロキナーゼで切断し、上記の通りに逆相ＨＰＬＣに供した。トランスフェクションされた細胞培養培地から精製されたレラキシン３は、この場合もＧＰＣＲ１３５発現細胞膜においてＧＴＰγＳ結合を有力に刺激した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、精製されたタンパク質の１つのバンドを示した。ＨＰＬＣ分析は、レラキシン３プロ−ホルモンが成熟ペプチドに完全にプロセシングされ、保持時間において均一であることを示した。

ＧＴＰγＳ結合アッセイ
ＧＰＣＲ１３５リガンド（又は試験化合物）の活性を、リガンド／ＧＰＣＲレセプター複合体もしくは相互作用の活性を測定する複数の方法により検定することができる。その
ようなアッセイの１つの例はＧＴＰγＳ結合アッセイである。

ＧＰＣＲ１３５発現ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクションされた細胞を収穫し、ＧＴＰγＳ結合緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０及び１００ｍＭ ＮａＣｌ中で均質化した。１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍｌのペプスタイン Ａ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチンの濃度でプロテアーゼ阻害剤を緩衝液に加えた。２０，０００ｇにおける３０分間の遠心により細胞膜を単離した。単離された細胞膜及び種々の濃度のリガンドを９６−ウェルプレートに加え、室温で２０分間インキュベーションした。次いでＧＴＰγＳ結合緩衝液中で希釈された^３５Ｓ−ＧＴＰγＳ（ＮＥＮ）を各ウェルに、２００□ｌの最終的容積中の２００ｐＭの最終的濃度で加えた。次いで室温で１時間反応を進行させ、９６−ウェルＧＦＣフィルタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ）を介して濾過し、冷洗浄緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２で洗浄した。各ウェルにＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−４０（Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、トップカウンター（ｔｏｐ ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＴＸ，Ｐａｃｋａｒｄ）上でプレートをカウントした。

図５は、ヒトＧＰＣＲ１３５発現細胞膜及びレラキシン３組換え細胞からの培地を用いるＧＴＰγＳ結合アッセイの結果を示す。ＧＰＣＲ１３５発現細胞膜への^３５Ｓ−ＧＴＰγＳの導入の増加は、レラキシン３組換え細胞からの培地におけるＧＰＣＲ１３５リガンド結合活性を示した。

カルシウム動態化アッセイ
この実施例は、リガンド／ＧＰＣＲレセプター複合体の活性に関するアッセイのために用いることができる他の方法を記載する。

ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅを用い、ＧＰＣＲ１３５レセプターを発現するプラスミド及び、ＧＰＣＲ１３５の活性化を細胞内Ｃａ^２＋の増加又はＣａ^２＋動態化の向上に置き換える突然変異Ｇ−タンパク質であるＧｑｉ５を発現するプラスミドを用い、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を共−トランスフェクションした（Ｃｏｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：１９９３年，２７４−２７６）。トランスフェクションから２日後、ＰＢＳプラス１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を用いて細胞を引き離した（ｄｅｔａｃｈｅｄ）。引き離された細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（フェノールレッドなし，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、黒いポリ−Ｄリシンがコーティングされた９６−ウェルプレート中に、ウェル当たり５０，０００個の細胞の細胞密度で播種した。カルシウム色素、ＦＬｕｏ−３（ＡＭ）（ＴＥＦＬＡＢＳ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を細胞中に負荷し、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いてリガンド刺激カルシウム動態化を監視した。

トランスフェクションされない（２９３標準）あるいはＧｑｉ５のみ（２９３／Ｇｑｉ５）もしくはヒトＧＰＣＲ１３５のみ（ＧＰＣＲ１３５）でトランスフェクションされた、又はヒトＧＰＣＲ１３５とＧｑｉ５により共−トランスフェクションされた（ＧＰＣＲ１３５／Ｇｑｉ５）ＨＥＫ２９３細胞を、リガンドとしてのレラキシン３の刺激下におけるＣａ^２＋動態化アッセイのために用いた。ＦＬＩＰＲを用いてリガンド−刺激細胞内動態化を監視した。図６に示される通り、レラキシン３は、ＧＰＣＲ１３５及びＧｑｉ５を共−発現するＨＥＫ２９３細胞においてＣａ^２＋動態化を刺激し、レラキシン３がＧＰＣＲ１３５に結合し、且つそれを活性化することを示した。

放射性リガンド結合アッセイ
この実施例は、リガンド／ＧＰＣＲレセプター複合体の活性に関するアッセイのために用いることができるさらに別の方法を記載する。

ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅを用い、６−ウェル組織培養プレート中のＣＯＳ−７細胞をＧＰＣＲ１３５発現プラスミドによりトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、細胞を結合緩衝液：ＤＭＥＭプラス５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２及び１％ ＢＳＡで洗浄した。各ウェルに^１２５Ｉ−標識ヒトレラキシン３を１ｍｌの結合緩衝液中で、競合物質としての１μＭの標識されないレラキシンの存在下又は不在下で加えた。結合アッセイを室温で１時間行い、氷−冷ＰＢＳにより非結合リガンドを洗い流した。結合した^１２５Ｉ−レラキシン３をガンマカウンターにおいてカウントした。図７に示される通り、^１２５Ｉ−レラキシン３はヒト、マウス又はラットからのＧＰＣＲ１３５に特異的に結合する。

細胞内ｃＡＭＰ蓄積アッセイ
この実施例は、リガンド／ＧＰＣＲレセプター複合体の活性に関するアッセイのために用いることができるさらに別の方法を記載する。

ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号 ＣＣＬ−６１）細胞中にＧＰＣＲ１３５発現プラスミドをトランスフェクションし、トランスフェクションされた細胞をＧ４１８（４００ｍｇ／Ｌ）の選択下で培養することにより、ヒトＧＰＣＲ１３５を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を確立した。レセプター発現細胞を９６−ウェルプレート中に、ウェル当たり３０，０００個の細胞の細胞密度で播種した。２４時間後、細胞培養培地をＤＭＥＭ−Ｆ１２プラス２ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）で置き換えた。各ウェルにｃＡＭＰ刺激のための異なる試験化合物を加えた。反応物を室温で２０分間インキュベーションした。２０マイクロ−リットルの０．５Ｎ ＨＣｌを各ウェルに加えて反応を停止させ、蓄積したｃＡＭＰを抽出した。ｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡキット（ＮＥＮ）を用いてｃＡＭＰ濃度を測定した。

図８に示される通り、アデニルシクラーゼの触媒活性を刺激することが知られている薬剤であるフォルスカリンは、ＧＰＣＲ１３５の存在下又は不在下でｃＡＭＰの細胞内濃度を上昇させる。レラキシン３はＧＰＣＲ１３５を活性化させ、それが今度はシクラーゼ活性を阻害し、ｃＡＭＰの細胞内蓄積の減少を生ずる。従ってレラキシン３は、ＧＰＣＲ１３５を発現する細胞においてフォルスカリン−刺激ｃＡＭＰ蓄積を妨げるが、ＧＰＣＲ１３５が不在の標準細胞においては妨げない。

上記で実施例及び好ましい態様に言及して本発明の種々の側面を例示してきたが、本発明の範囲は前の記述によってではなく、特許法の原則の下に正しく解釈される前記の請求項により定義されることが認識されるであろう。

ヒト、マウス及びラットＧＰＣＲ１３５の間のアミノ酸配列の比較。 種々のラット組織におけるＧＰＣＲ１３５リガンド活性を示すグラフ図。 ＧＰＣＲ１３５リガンドの分子量特性化を示すグラフ図。 ヒト、マウス、ラットレラキシン３（Ｒ３）及びブタ脳から精製されたＧＰＣＲ１３５リガンドの間のアミノ酸配列比較。 ヒトレラキシン３がトランスフェクションされたＣＯＳ細胞からの細胞培養培地におけるＧＰＣＲ１３５リガンド活性を示すグラフ図。 ＧＰＣＲ１３５及びＧｑｉ５を共−発現するＨＥＫ２９３細胞において、レラキシン３がＣａ^２＋動態化を刺激することを示すグラフ図。 ^１２５Ｉ−レラキシン３がＧＰＣＲ１３５に特異的に結合することを示すグラフ図。 ｃＡＭＰ蓄積アッセイから、ＧＰＣＲ１３５へのレラキシン３の結合が細胞内ｃＡＭＰ濃度を低下させることを示すグラフ図。

Claims (30)

1. レラキシン３又はレラキシン３の活性フラグメントを含有するリガンド成分に結合したＧＰＣＲ１３５又はＧＰＣＲ１３５の活性フラグメントを含有するレセプター成分を含んでなり、ここでレセプター及びリガンド成分の少なくとも１つが実質的に純粋な形態にあるレセプター−リガンド複合体。
2. レセプター成分がヒト、マウス又はラットに由来し、リガンド成分がヒト、マウス又はラットに由来する請求項１のレセプター−リガンド複合体。
3. 該リガンド成分が^１２５Ｉ放射性同位体標識を保有する請求項１のレセプター−リガンド複合体。
4. ＧＰＣＲ１３５が配列番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１５から選ばれるアミノ酸配列を有する請求項１のレセプター−リガンド複合体。
5. 該ＧＰＣＲ１３５成分が組換えＧＰＣＲ１３５宿主細胞の細胞表面上における発現の産物である請求項１のレセプター−リガンド複合体。
6. 該レセプター成分が単離された細胞膜又は脂質小胞に付随するＧＰＣＲ１３５又はＧＰＣＲ１３５の活性フラグメントを含有する請求項１のレセプター−リガンド複合体。
7. 該レセプター成分及び該リガンド成分の両方が実質的に純粋な形態にある請求項１のレセプター−リガンド複合体。
8. 該リガンド成分が組換え発現の産物として実質的に純粋な形態にある請求項１のレセプター−リガンド複合体。
9. 該レセプター及びリガンド成分の少なくとも１つが単離、ペプチド合成又は組換え発現の産物として実質的に純粋な形態にある請求項１のレセプター−リガンド複合体。
10. 該リガンド成分がペプチド合成の産物として実質的に純粋な形態にある請求項１のレセプター−リガンド複合体。
11. 配列番号：１５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有する単離されたポリヌクレオチド。
12. 配列番号：１５のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
13. 配列番号：１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
14. 配列番号：１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
15. （ａ）レラキシン３プロペプチドのＡ鎖とＣ鎖の間のペプチド結合及びＣ鎖とＢ鎖の間のペプチド結合から選ばれる少なくとも１つの位置においてプロテアーゼ切断部位を形成するペプチド結合の挿入により改変されたレラキシン３プロペプチドをコードするＤＮＡ分子を構築し；
    （ｂ）改変されたレラキシン３プロペプチドを発現する第１のベクターを構築し；
    （ｃ）改変されたレラキシン３プロペプチドを、挿入されたプロテアーゼ切断部位において切断するためのプロテアーゼを発現する第２のベクターを構築し；
    （ｄ）第１のベクター及び第２のベクターの両方を宿主細胞中に導入し；そして
    （ｅ）宿主細胞を生育させて改変されたレラキシン３プロペプチド及びプロテアーゼの両方を発現させ、それにより改変されたレラキシン３プロペプチド上の該位置においてプロテアーゼが有効にペプチド結合を切断する
    ことを含んでなる組換え細胞からのレラキシン３の生産方法。
16. 該改変されたレラキシン３プロペプチドが該少なくとも１つの位置に挿入されたプロ−ホルモンコンバーターゼを有する請求項１５の方法。
17. 該改変されたレラキシン３プロペプチドが、レラキシン３プロペプチドのＡ鎖とＣ鎖の間のペプチド結合において挿入されたフリンを有する請求項１５の方法。
18. （ａ）化合物及び緩衝溶液を含んでなる試験試料を、請求項１で定義されたレセプター−リガンド複合体を含んでなるアッセイ試薬と接触させ；
    （ｂ）レセプター−リガンド複合体の生物学的活性を決定し；そして
    （ｃ）段階（ｂ）で決定された結果を、レセプター−リガンド複合体を緩衝溶液と接触させた対照測定（ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）と比較する
    段階を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５／レラキシン３複合体の生物学的活性を向上させるかもしくは低下させる化合物の同定方法。
19. レセプター−リガンド複合体のＧＰＣＲ１３５成分が組換えＧＰＣＲ１３５宿主細胞の細胞表面上における発現の産物である請求項１８の方法。
20. 該レセプター−リガンド複合体の生物学的活性の決定が二次メッセンジャー応答の測定を含んでなる請求項１９の方法。
21. 該二次メッセンジャー応答を細胞内ｐＨ、細胞内カルシウムイオン濃度又は細胞内ｃＡＭＰ濃度により測定する請求項２０の方法。
22. アッセイ試薬が、ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを含有する単離された膜調製物を含んでなる請求項１９の方法。
23. 該レセプター−リガンド複合体の生物学的活性の決定が単離された膜調製物のタンパク質リン酸化の量の測定を含んでなる請求項２２の方法。
24. 単離された膜調製物のタンパク質リン酸化の量をγ−ホスフェート標識ＧＴＰ分子を用いて測定する請求項２３の方法。
25. γ−ホスフェート標識ＧＴＰ分子が^３５Ｓ−ＧＴＰγＳ、^３３Ｐ−ＧＴＰγＰ及び^３２Ｐ−ＧＴＰγＰから選ばれる請求項２４の方法。
26. （ａ）ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを試験化合物及び標識レラキシン３又はその活性フラグメントと接触させ；
    （ｂ）ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントと結合する標識レラキシン３又はその活性フラグメントの量を決定し；そして
    （ｃ）段階（ｂ）で決定された量を、ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを試験化合物の不在下で標識レラキシン３又はその活性フラグメントと接触させた対照測定と比較する
    段階を含んでなる、ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントに結合する化合物の同定方法。
27. 標識レラキシン３又はその活性フラグメントが^１２５Ｉで標識される請求項２６の方法。
28. （ａ）ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントを含んでなるアッセイ試薬と試験化合物を接触させ；
    （ｂ）ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントの生物学的活性を決定し；そして
    （ｃ）段階（ｂ）で決定された結果を、試験化合物の不在下でＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントをレラキシン３又はその活性フラグメントと接触させた対照測定の結果と比較する
    ことを含んでなる、ＧＰＣＲ１３５に結合し且つレラキシン３を模する化合物の同定方法。
29. ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントが組換え細胞の表面から発現される請求項２８の方法。
30. ＧＰＣＲ１３５又はその活性フラグメントが単離された細胞膜調製物中にある請求項２８の方法。

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