JP2006290826A - スクリーニング方法 - Google Patents

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Tomoko Hirohashi
智子 広橋
Toru Sawai
徹 澤井
Hisashi Namaki
尚志 生木
Hideki Takahashi
英機 高橋
Michiko Ozasa
美智子 小笹
Kokichi Harada
耕吉 原田
Toru Arai
徹 新井
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Abstract

【課題】
有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチドを提供すること。
【解決手段】
本発明者らは、ＳＡＬＰＲと結合するリラキシン−３をラット脳室内に投与し、投与後の摂食量、体重、脂肪量などを観察することにより、リラキシン−３が有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有することを見出した。本発明により、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、当該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、当該スクリーニング用キット、および当該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などが提供される。
【選択図】なし。

Description

本発明は、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、当該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、当該スクリーニング用キット、および当該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などに関する。
摂食は動物が生きていくために欠かせない行動である。肥満は飽食時代の現代社会にあって、摂食量とエネルギー消費の調節・バランスが崩れた結果として生じたものであると考えられている。肥満は生活習慣病を始めとする各種疾病の危険因子でもあるため、社会的な関心が高まってきている。食事療法や運動療法など、摂食量とエネルギー消費のバランスを改善する基本的な治療法はあるものの、現状では肥満患者・その予備群は増加している。最近では末梢組織での栄養吸収を抑制する薬剤や中枢性に作用し摂食量を減少させる薬剤も開発されているが、肥満治療剤として摂食量を抑制する有効かつ安全な薬剤の開発は望まれている。
摂食行動は脳中枢神経からの指令と、末梢組織からのフィードバックによって中枢神経がさらに指令を送る循環で制御されていることがわかりつつあり、その主体である脳での摂食制御機構に焦点を当てた研究が盛んに行なわれている。脳の特定領域を破壊した動物の研究や、神経ペプチドや神経伝達物質を用いた機能解析により、視床下部領域が摂食行動に重要な役割を果たしていることが分かってきている。また、視床下部には多くの神経伝達物質や神経ペプチドおよびそれらに対する受容体（レセプター）が発現しており、これらと摂食行動との関連が示されている。例えば摂食の亢進には視床下部弓状核に存在するニューロペプチドＹやアグーチ関連ペプチドなどが関わること、さらに摂食の抑制には同所に存在するメラノコルチンや視床下部室傍核から放出されるコルチコトロピン放出ホルモンやサイロトロピン放出ホルモンが関わっていることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、摂食を制御する複雑な神経ネットワークには未だ不明な部分が多く、未だなお新規な神経伝達因子やその局在についての新たな知見が得られつつある状況である。
摂食行動の制御に関わる神経伝達物質や神経ペプチドなどの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して機能を発揮する。これらのレセプターの中で細胞膜を７回貫通する構造を有し、細胞内で３量体Ｇタンパク質と共役するレセプターは特にＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と分類されている。ＧＰＣＲは特異的なリガンドが結合した時に細胞内にシグナルを伝達し、細胞の賦活化や抑制化をすることで、各種臓器・器官での機能発現に重要な役割を担っている。それ故にＧＰＣＲを賦活化するアゴニストや抑制するアンタゴニストと呼ばれる物質は、医薬品として使用されている。ＧＰＣＲに分類されるレセプターの中でもその特異的なリガンドが未同定のものが数多く知られており、それらはオーファンＧＰＣＲと呼ばれている。オーファンＧＰＣＲは新たな治療薬のターゲットとしての可能性を秘めており、生体内のリガンド同定や機能を賦活もしくは抑制する物質の研究が進められている。このようにして同定されたリガンドや物質を生体に投与してレセプターとそのリガンドの機能を解明することは、医薬品の開発を提供する上できわめて重要である。
近年の遺伝子配列情報の充実により、既知のタンパク質・ペプチドの配列を元にその相同性や法則性を導きだし、未知のペプチドやタンパク質を予測して、ＧＰＣＲの新たなリガンドとして同定する方法も可能となった。インスリン・リラキシン（Ｉｎｓｕｌｉｎ・Ｒｅｌａｘｉｎ）ファミリーに属するリラキシンは、黄体や胎盤から産生される分泌ペプチドであり、妊娠の維持と出産に関わる作用をもつことが以前から知られていた。それ以外の作用としては、例えばリラキシン−２のラット静脈内投与による摂水量の亢進という報告はなされているが（非特許文献２）、リラキシンの摂食行動との関連については知られていない。リラキシンをコードするＤＮＡの塩基配列を元に遺伝子配列データベースから新たに同定されたＤＮＡのコードするタンパク質が、リラキシン−３（Ｒｅｌａｘｉｎ−３）（またはＩＮＳＬ７とも称される。）と名づけられたポリペプチドである（特許文献１）。成熟型または活性型のリラキシン−３は、リラキシン−３のプレプロプロテイン（ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）から切断されたＢ鎖およびＡ鎖から構成され、当該Ｂ鎖および当該Ａ鎖がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである。リラキシン−３（ｒｅｌａｘｉｎ−３）は、免疫細胞系であるＴＨＰ−１の細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の上昇をともなって細胞を賦活化することが報告された（特許文献２、非特許文献３）。その後、リラキシン−３はリラキシン−２と共に、ＧＰＣＲであるＬＧＲ７に結合するリガンドの一つであることが示された（非特許文献４）。ＬＧＲ７は脳と末梢組織に発現しており、これまでには生殖器官の発達や妊娠・出産に関わることが示唆されているが、摂食との関連については良く分かっていない。
最近、生体内のリガンドが未同定のＧＰＣＲであった、ＳＡＬＰＲ（ＧＰＣＲ１３５）と名づけられているレセプターや、ＧＰＲ１００（ｈＧＰＣＲ１１、ＧＰＣＲ１４２）と呼ばれるレセプターのリガンドがリラキシン−３であることが報告された（非特許文献５、６、特許文献３）。また、特許文献４〜７にもこれらのレセプターに関連する記載がある。ＳＡＬＰＲは脳に局在することが知られており（非特許文献７）、特に視床下部の室傍核と視索上核に存在することが報告された（特許文献３、非特許文献６）。一方、ＧＰＲ１００は全身性に発現しているレセプターであることが報告されている（非特許文献８、９）が、その機能については不明なままである。
一方、リラキシン−３は脳内の特定の領域に存在することが報告されており（非特許文献６）、リラキシン−３が脳内ペプチドとして中枢性に何らかの機能を発揮している可能性は考えられていたが、これまでにリラキシン−３が摂食を調節するか否かについても、リラキシン−３が体重調節に関与するか否かについても報告されていなかった。また、リラキシン−３が肥満と関連するかについても知られていなかった。
国際公開第０１／６８８６２号パンフレット 国際公開第０１／８１５６２号パンフレット 国際公開第２００４／８２５９８号パンフレット 国際公開第００／２４８９１号パンフレット 国際公開第０１／４８１８９号パンフレット 国際公開第０２／３１１１１号パンフレット 国際公開第０２／６１０８７号パンフレット Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎら、Ｃｅｌｌ， １０４， ｐ．５４１−５４３， ２００１ Ｓｉｎｎａｙａｈら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １４０， ｐ．５０８２−５０８６， １９９９ Ｂａｔｈｇａｔｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， ｐ．１１４８−１１５７， ２００２ Ｓｕｄｏら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８， ｐ．７８５５−７８６２， ２００３ Ｔａｋｅｄａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ， ５２０， ｐ．９７−１０１， ２００２ Ｌｉｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８， ｐ．５０７５４−５０７６４， ２００３ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｇｅｎｅ， ２４８， ｐ．１８３−１８９， ２０００ Ｌｉｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７８， ｐ．５０７６５−５０７７０， ２００３ Ｂｏｅｌｓら、Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒａｍａｃｏｌ．， １４０， ｐ．９３２−９３８， ２００３
本発明は、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、当該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、当該スクリーニング用キット、および当該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などに関する。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、リラキシン−３をラット脳室内に投与し、投与後の摂食量を観察することにより、リラキシン−３が摂食亢進作用を有することを見出した。また、ラットにリラキシン−３を単回投与した後に、当該ラットから採取した血液を測定した結果、体脂肪増加の指標として知られるレプチン濃度が血液中で上昇していることを見出した。さらに、ラット脳室内へリラキシン−３の持続投与を行なったところ、リラキシン−３投与群では対照のｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べて有意な摂餌量の増加と体重増加作用が認められた。リラキシン−３の持続投与によって両群において運動量に差はなかった。これらのことから、リラキシン−３は摂食亢進作用と共に体重増加作用も有することが初めて明らかとなった。さらに、リラキシン−３を投与し体重が増加したラットにおいては脂肪量の増加および、体脂肪含量と相関する血中レプチン濃度が上昇していた。また、糖尿病と関連するインスリン濃度も上昇していた。以上より、リラキシン−３は摂食亢進作用、体重増加作用、肥満作用を有するポリペプチドであると考えられる。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は、
（１）リラキシン−３を含有してなる摂食亢進剤。
（２）リラキシン−３を含有してなる体重増加剤。
（３）リラキシン−３を含有してなる脂肪量増加剤。
（４）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（５）次の工程；
リラキシン−３および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（６）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（５）に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（７）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（４）〜（６）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
（８）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（７）に記載のスクリーニング方法。
（９）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（１０）次の工程；
リラキシン−３および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（１１）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（１０）に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（１２）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
（１３）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（１２）に記載のスクリーニング用キット。
（１４）リラキシン−３を含有してなる体重増加を必要とする疾患の治療剤。
（１５）疾患が拒食症または悪液質である前記（１４）に記載の治療剤。
（１６）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１７）次の工程；
リラキシン−３および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１８）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（１７）に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１９）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（１６）〜（１８）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
（２０）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（１９）に記載のスクリーニング方法。
（２１）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（２２）次の工程；
リラキシン−３および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（２３）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（２２）に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（２４）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（２１）〜（２３）のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
（２５）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（２４）に記載のスクリーニング用キット。
（２６）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２７）次の工程；
リラキシン−３および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２８）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（２７）に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２９）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（２６）〜（２８）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
（３０）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（２９）に記載のスクリーニング方法。
（３１）次の工程；被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（３２）次の工程；
リラキシン−３および被験物質を、
（Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（３３）次の工程；
（Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記（３２）に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
（３４）リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（３１）〜（３３）のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
（３５）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（３４）に記載のスクリーニング用キット。
（３６）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する摂食抑制剤。
（３７）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（７）または（８）に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（３６）に記載の剤。
（３８）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する体重減少剤。
（３９）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（１９）または（２０）に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（３８）に記載の剤。
（４０）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する脂肪量減少剤。
（４１）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（２９）または（３０）に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（４０）に記載の剤。
（４２）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する肥満治療剤。
（４３）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（１９）、（２０）、（２９）または（３０）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（４２）に記載の剤。
（４４）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する糖尿病治療剤。
（４５）ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、前記（１９）、（２０）、（２９）または（３０）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（４４）に記載の剤。
（４６）ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（３６）〜（４５）のいずれか一項に記載の剤。
（４７）リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の摂食量を測定する工程を含むことを特徴とする、摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（４８）リラキシン−３受容体に作用する化合物が、前記（４）〜（８）のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（４７）に記載の方法。
（４９）リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の体重を測定する工程を含むことを特徴とする、体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（５０）リラキシン−３受容体に作用する化合物が、前記（１６）〜（２０）のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（４９）に記載の方法。
（５１）リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の肥満の指標を測定する工程を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（５２）リラキシン−３受容体に作用する化合物が、前記（２６）〜（３０）のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（５１）に記載の方法。
などに関する。
ｐＢａｂｅＣＬ（ＳＡＬＰＲ）ＩＨの構築図を示す。 ＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の構築図を示す。 ｐＢａｂｅＣＬＸの構築図を示す。 ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮの構築図を示す。 ＳＡＬＰＲを発現させたＳＥ３０２細胞におけるフォルスコリン添加によって上昇した転写活性のヒト型リラキシン−３による特異的な用量依存的抑制を示す。黒四角はヒト型リラキシン−３を添加した場合を示す。白四角はインスリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの最終濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）を示す。縦軸はフォルスコリン１μｍｏｌ／Ｌを添加した細胞上清のアルカリフォスファターゼの活性を１００、フォルスコリンを添加していない細胞上清の活性を０として算出した各活性の割合を示す。各点は平均値（Ｎ＝３）と標準偏差を示す。 ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を用いたリラキシン−３拮抗化合物の評価（スクリーニング）を示す図である。（Ａ）は、ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を使用し、（Ｂ）は、ＳＥ３０２細胞を使用した。図中、ＦＫ（−）はフォルスコリン無処置群、ＦＫ（＋）は３μＭフォルスコリン処置群、ＦＫ（＋）&ＲＬＸ−３はフォルスコリンと３ｎＭ ヒト型リラキシン−３の処置群、ＦＫ（＋）&ＲＬＸ−３&化合物１はフォルスコリンとヒト型リラキシン−３と化合物１を共存させた処置群を示す。 正常ラット脳室内へのヒト型リラキシン−３の単回投与による摂餌量への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はヒト型リラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの摂餌量（ｇ）の平均値と標準誤差を示す。 正常ラット脳室内へのヒト型リラキシン−３の単回投与による血中レプチン濃度への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はヒト型リラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の血中のレプチン濃度（ｎｇ／ｍＬ）の平均値と標準偏差を示す。 正常ラットの脳室内に持続投与したヒト型リラキシン−３による体重増加量への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はヒト型リラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹当たりの体重増加量（ｇ）の平均値と標準偏差を示す。 正常ラットの脳室内に持続投与したヒト型リラキシン−３による摂餌量への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はヒト型リラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの摂餌量（ｇ）の平均値と標準偏差を示す。 正常ラットの脳室内に持続投与したヒト型リラキシン−３による精巣周囲脂肪重量への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はヒト型リラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの脂肪量（ｇ）の平均値と標準偏差を示す。 正常ラットの脳室内に持続投与したヒト型リラキシン−３による血中ホルモンの変動を示す。（Ａ）は血中レプチン濃度への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はヒト型リラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの血中レプチン濃度（ｎｇ／ｍｌ）の平均値と標準偏差を示す。（Ｂ）は血中インスリン濃度への作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群を、黒四角はヒト型リラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの血中インスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）の平均値と標準偏差を示す。 脳室内にヒト型リラキシン−３を持続投与した後、自発運動量を測定しながら飼育したラットの体重増加量の変化を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はヒト型リラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹当たりの体重増加量（ｇ）の平均値と標準偏差を示す。図中の白三角は、明期の運動量測定日、黒三角は暗期の運動量測定日を示す。 脳室内にヒト型リラキシン−３を持続投与したラットの自発運動量に対する作用を示す。白四角はｖｅｈｉｃｌｅ投与群（対照）を、黒四角はヒト型リラキシン−３投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの全活動量（カウント）の平均値と標準偏差を示す。
リラキシン−３
本発明のリラキシン−３は、リラキシン−３（またはＩＮＳＬ７とも称される。）と名づけられたポリペプチドであり、成熟型または活性型のリラキシン−３を意味する。
具体的には、本発明のリラキシン−３は、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド（以下、単に「Ｂ鎖」と略記する場合がある。）と配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド（以下、単に「Ａ鎖」と略記する場合がある。）が、Ｂ鎖およびＡ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを意味する。ジスルフィド結合は、Ｂ鎖およびＡ鎖のシステイン残基が、分子間および分子内で結合していることが望ましい。
より具体的には、本発明のリラキシン−３は、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）と配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを意味し、Ｂ鎖およびＡ鎖のシステイン残基が分子間および分子内でジスルフィド結合を形成しているポリペプチドである。当該ジスルフィド結合は、配列番号２のＮ末端から第３５番目のＢ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１２９番目のＡ鎖のシステインが結合し、配列番号２のＮ末端から第４７番目のＢ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１４２番目のＡ鎖のシステインが結合し、並びに配列番号２のＮ末端から第１２８番目のＡ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１３３番目のＡ鎖のシステインが結合していることが望ましい。
Ｂ鎖およびＡ鎖のアミノ酸配列は、本発明のリラキシン−３のプレプロプロテインのアミノ酸配列に含まれる。本発明のリラキシン−３のプレプロプロテインは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０８０８６４）または当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド（以下、単に「プレプロプロテイン」と略記する場合もある。）が挙げられる。本発明のリラキシン−３は、前記プレプロプロテインから切断されたＢ鎖およびＡ鎖が、Ｂ鎖およびＡ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを含む。
本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖およびプレプロプロテインは、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に由来する天然由来のポリペプチドであっても良く、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドであっても良い。本発明のリラキシン−３には、本発明のリラキシン−３の塩が含まれ、さらには本発明のリラキシン−３またはその塩は糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。塩については、後述の塩の記載を参照するとよい。また、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖およびプレプロプロテインには、Ｎ末端環状グルタミン化、Ｃ末端アミド化など、分泌タンパクのプロセッシングを受けた形のポリペプチドを含む。
上述の機能的に等価な改変ポリペプチドとは、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）、配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン）において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＢ鎖およびＡ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン−３と実質的に同じ活性［例えばリラキシン−３受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用］を有するのであれば、上述の生物由来のポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドのいずれであってもよい。
配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）、配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン）のアミノ酸配列が欠失、置換および／または挿入される場合は、その位置は、特に限定されないが、前記のアミノ酸配列中のシステイン残基以外のアミノ酸残基が挙げられる。
本明細書において「置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行なうことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
前記の欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸残基の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
上述の相同ポリペプチドとは、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）、配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン）のアミノ酸配列に関して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、しかもＢ鎖およびＡ鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン−３と実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用）を有するのであれば、上述の生物由来のポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドのいずれであってもよい。
本明細書において、「相同性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
上述の機能的に等価な改変ポリペプチドまたは相同ポリペプチドのＢ鎖、Ａ鎖、リラキシン−３またはプレプロプロテインの好ましい例としては、例えば、それ自体公知のマウス型、ラット型またはブタ型のＢ鎖、Ａ鎖、リラキシン−３またはプレプロプロテインなどが挙げられる（国際公開第０１／８１５６２号パンフレット）。
本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。
リラキシン−３をコードするポリヌクレオチド
本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチド（以下、単に「本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチド」と略記する場合もある。）は、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を意味する。
本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の５'末端から第７６番目（ｃ）〜第１５６番目（ｇ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ヒト型Ｂ鎖をコードするポリヌクレオチド）、配列番号１の５'末端から第３５５番目（ｇ）〜第４２６番目（ｃ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ヒト型Ａ鎖をコードするポリヌクレオチド）、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ヒト型プレプロプロテインをコードするポリヌクレオチド）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインと実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ．， １６４， ７６５ （１９８８）〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の５'末端から第７６番目（ｃ）〜第１５６番目（ｇ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の５'末端から第３５５番目（ｇ）〜第４２６番目（ｃ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０℃〜７０℃、好ましくは６０℃〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。
本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインの部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
Ｂ鎖（配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１の５'末端から第７６番目（ｃ）〜第１５６番目（ｇ）の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
Ａ鎖（配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１の５'末端から第３５５番目（ｇ）〜第４２６番目（ｃ）の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
プレプロプロテイン（配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。また、分離および精製の操作を容易にするために、必要に応じて本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインを切り出す融合タンパク質として発現することのできるプラスミドであってもよい。
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のような本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明のリラキシン−３を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。また、別の態様によれば、前記形質転換体は、Ｂ鎖、Ａ鎖が切り出される切断部位に作用するプロテアーゼを発現するプラスミドを同時に含んでいてもよい。
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株）または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
前記形質転換体を、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインをコードするＲＮＡを注入し、本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
本発明のリラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインを、前記形質転換体の培養物から取得する場合は、培養後に、菌体、細胞または培養液を集め、分離および精製の公知の方法を組合せ、リラキシン−３、Ｂ鎖、Ａ鎖またはプレプロプロテインの生化学的性質または物理的性質などを利用しながら行なうことができる。例えば、限外濾過、液体クロマトグラフィー（例えば、アフィニティクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）、透析法などの技術を利用することができる。
本発明のリラキシン−３のＢ鎖およびＡ鎖をそれぞれ独立に調製した場合、または融合タンパク質からＢ鎖またはＡ鎖を切り出して調製する場合は、生産されたまたは切り出されたＢ鎖およびＡ鎖を、常法に従い、単離精製し、それぞれ同士をジスルフィド結合で結合させることもできる。
リラキシン−３を含有する医薬組成物
本発明のリラキシン−３は、摂食亢進作用、体重増加作用、肥満作用を有するため、摂食亢進剤として食欲不振や摂食量が低下した栄養障害などの治療、体重増加剤、脂肪量増加剤として体重増加を必要とする疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、および本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの異常などに起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症もしくは各種疾患の治療（例えば術中、術後）に伴い減少した摂食（もしくは食欲）および／または体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記各種疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患（例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など）、免疫機能調節に係る疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など）、摂食障害、拒食症、ＡＩＤＳ、癌、または悪液質などが挙げられる。好ましくは、拒食症、悪液質が挙げられる。
本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドは塩を形成していてもよく、さらにそれらは水和物を形成していてもよく、本発明に含まれる。本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドもしくはその塩またはそれらの水和物は単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。
本願明細書における前記の「塩」とは、本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドと塩を形成し、かつ薬学的に許容され得る塩であれば特に限定されないが、好ましくはハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられ、当該「薬学的に許容され得る塩」として、より好ましくは塩酸塩、シュウ酸塩、などである。
この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のリラキシン−３またはリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のリラキシン−３または本発明のリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約０．１〜５００μｇ、好ましくは約０．１〜１００μｇ、より好ましくは１〜５０μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
リラキシン−３受容体を用いた摂食調節に係る化合物のスクリーニング方法
リラキシン−３受容体
本発明のリラキシン−３に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のリラキシン−３と結合活性を有し、リラキシン−３受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］のリラキシン−３受容体を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、リラキシン−３受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば本発明のリラキシン−３に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。この場合、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、リラキシン−３受容体のアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
具体的には、リラキシン−３受容体として、報告されている公知の受容体、例えばＬＧＲ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１６３４）、ＳＡＬＰＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）（ＧＰＣＲ１３５とも称されている。）またはＧＰＲ１００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ＿０８３５９３）（ｈＧＰＣＲ１１、ＧＰＣＲ１４２とも称されている。）などを使用することが可能である。
ＳＡＬＰＲを用いた摂食調節に係る化合物のスクリーニング方法
以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、リラキシン−３受容体としてＳＡＬＰＲを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに結合し、摂食調節（摂食を促進または抑制する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に摂食を促進または抑制する作用を有するか否かを決定することができる。
ここで、本発明のＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドは、ＳＡＬＰＲを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。
本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有するポリペプチドを意味する。
ここで、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有するポリペプチドを意味する。
さらに、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドも、ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有する限り、使用することができる。
以下、遺伝子工学的手法について、より具体的にはＳＡＬＰＲを使用する場合について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
ＳＡＬＰＲの調製方法
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することにより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチド
本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドには、具体的には下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ｂ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および
（ｅ）「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
本発明の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号３で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＬＰＲをコードする。
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、ＳＡＬＰＲを発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株）または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
ＳＡＬＰＲを含有する細胞は、ＳＡＬＰＲを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体（すなわち、ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＳＡＬＰＲをコードするＲＮＡを注入し、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
細胞膜画分
また、ＳＡＬＰＲを含有する本発明の細胞膜画分は、例えば本発明によるＳＡＬＰＲを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
ＳＡＬＰＲを介する、本発明による摂食を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞）もしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞膜画分）を用いることができる。
また、本発明によるスクリーニング方法においては、被験物質がＳＡＬＰＲに特異的に結合するか否かを調べる方法と、ＳＡＬＰＲに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。
本発明によるスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質とを接触させ、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識した本発明のリラキシン−３とを接触させ、前記条件下におけるＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン−３の特異的結合量を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下におけるＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン−３の特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。
本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する本発明のリラキシン−３の特異的結合量を比較する場合には、当該リラキシン−３として、標識した当該リラキシン−３を用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［3Ｈ］、［14Ｃ］、［125Ｉ］、［35Ｓ］などを用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、本発明のリラキシン−３と標識物質を結合させるためにビオチン−アビジンの系を用いることもできる。
このように、本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと本発明のリラキシン−３との結合を阻害する化合物を、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。
本発明によるスクリーニング方法における別の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した本発明のリラキシン−３とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する当該リラキシン−３の特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における当該リラキシン−３の特定の細胞刺激活性を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。
前記態様においては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進する化合物として選択することができる。
一方、前記態様において、前記細胞と当該リラキシン−３との結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する摂食を抑制する化合物として選択することができる。
本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。
この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するｃＡＭＰを公知の手法で測定すればよく、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＳＡＬＰＲに本発明のリラキシン−３が結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、ＳＡＬＰＲの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、ＳＡＬＰＲに当該リラキシン−３が結合すると、ＳＡＬＰＲに共役しているＧタンパク質ファミリーの一つであるＧｉファミリーが、アデニル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ：アデニル酸シクラーゼによりＡＴＰから生成される）量を減少させることによる。
例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）した哺乳動物由来細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞）にアデニル酸シクラーゼの活性化剤［例えばフォルスコリン（ＦＳＫ）］を添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇する。
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−３を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−３が本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、ｃＡＭＰの生成量が減少する。従って、摂食を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＳＡＬＰＲを介する当該リラキシン−３に代わり、被験物質を単独で接触させてｃＡＭＰの生成量を減少させる（すなわち当該リラキシン−３と同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
摂食を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−３、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−３の作用でｃＡＭＰの生成量が減少するが、被験物質が当該リラキシン−３の作用に拮抗する場合には、ｃＡＭＰ生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は摂食抑制作用を有する化合物として選択できる。
細胞内ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、例えばイムノアッセイなどがあるが、例えば市販のｃＡＭＰ定量キットを使用することもできる。
別の態様のスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、またはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述のｃＡＭＰの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。
以下、前記態様による、ＳＡＬＰＲを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−３を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−３が本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、摂食を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＳＡＬＰＲを介する当該リラキシン−３に代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち当該リラキシン−３と同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
摂食を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−３、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−３の作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少するが、被験物質が当該リラキシン−３の作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は摂食抑制作用を有する化合物として選択できる。
被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
また、別の態様として、被験物質、好ましくは上記のスクリーニング方法により選択された被験物質（以下、単に「被験物質」と略記する場合がある。）を被験動物、例えばヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、投与後の摂食量や血中パラメーターの変動などの指標を解析することにより摂食調節に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルであるｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Ｚｕｃｋｅｒ ｆａｔｔｙラットなど）や遺伝子改変動物でもよい。
具体的には、本発明のリラキシン−３を投与することにより摂食を促進させる場合は、以下の工程により行なうことができる。
工程Ａ：被験動物に所定量の被験物質を投与する。
工程Ｂ：被験動物に所定量のリラキシン−３を投与する。なお、リラキシン−３の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。
工程Ｃ：被験動物を摂食の有無（程度）を解析および評価する環境下に置く。
工程Ｄ：試験結果に基づいて被験動物の摂食の有無（程度）について解析および評価し、被験物質が摂食調節作用を有するものであるか否かを判断および選択する。
または、
工程Ａ：被験動物に所定量のリラキシン−３を投与する。なお、リラキシン−３の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。
工程Ｂ：被験動物に所定量の被験物質を投与する。
工程Ｃ：被験動物を摂食の有無（程度）を解析および評価する環境下に置く。
工程Ｄ：試験結果に基づいて被験動物の摂食の有無（程度）について解析および評価し、被験物質が摂食調節作用を有するものであるか否かを判断および選択する。
または、
工程Ａ：被験動物に所定量の被験物質および所定量のリラキシン−３を同時に投与する。なお、リラキシン−３の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。また、同時に投与するとは、被験物質およびリラキシン−３の両方を混合した状態で投与することには限定されず、実質的に同時と考えられる範囲内であれば、例えば、両方の投与に多少の時間差があってもよいし、また各々投与経路が異なっていてもよく、投与形態は適宜設定できる。
工程Ｂ：被験動物を摂食の有無（程度）を解析および評価する環境下に置く。
工程Ｃ：試験結果に基づいて被験動物の摂食の有無（程度）について解析および評価し、被験物質が摂食調節作用を有するものであるか否かを判断および選択する。
被験物質の投与形態としては、経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。被験物質の被験動物の脳室内への投与方法は、薬物などを脳室内の所定の位置へ投与する際の常法に従えばよく、限定はされない。例えば、まず被験動物を麻酔した上で、ガイドカニューレを所定の位置に固定する手術を施しておき、適当な回復期間（例えば７日間〜１４日間、好ましくは少なくとも１週間程度）の経過後、ガイドカニューレにインジェクションニードルを挿し込み、還流ポンプを接続したマイクロシリンジを用い、上記ニードルを介して被験物質を投与することが好ましい。被験物質の投与量は、限定はされず、適宜設定できる。被験物質は、一般的には人工的脳脊髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）または生理食塩水などを用いて所望の濃度の溶液として調製しておく。人工的脳脊髄液としては、公知の常用されているものを用いればよく、限定はされないが、例えば、ａＣＳＦ（ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｍＭ、ＫＣｌ ２ｍＭ、ＮａＣｌ １１５ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １．２ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２５ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ ２．２ｍＭ；ｐＨ７．４）などが好ましい。被験物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。
リラキシン−３の被験動物への投与方法などは、前記の被験物質の場合と同様の方法が好ましい。また、リラキシン−３の被験動物の脳室内への投与方法も、前記の被験物質と同様に、一般的には人工的脳脊髄液を用いて所望の濃度の溶液となるよう調製しておくことが好ましい。
スクリーニングのための指標としては摂食量のほかにも、例えば体重、運動量、エネルギー代謝量、血中の糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量などを測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食などの条件を課すこともできる。
リラキシン−３受容体を用いた体重調節に係る化合物のスクリーニング方法
リラキシン−３受容体
本発明のリラキシン−３に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のリラキシン−３と結合活性を有し、リラキシン−３受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］のリラキシン−３受容体を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、リラキシン−３受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば本発明のリラキシン−３に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。この場合、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、リラキシン−３受容体のアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
具体的には、リラキシン−３受容体として、報告されている公知の受容体、例えばＬＧＲ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１６３４）、ＳＡＬＰＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）（ＧＰＣＲ１３５とも称されている。）またはＧＰＲ１００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ＿０８３５９３）（ｈＧＰＣＲ１１、ＧＰＣＲ１４２とも称されている。）などを使用することが可能である。
ＳＡＬＰＲを用いた体重調節に係る化合物のスクリーニング方法
以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、ＳＡＬＰＲを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに結合し、体重調節（体重を増加または減少する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に体重を増加または減少する作用を有するか否かを決定することができる。
ここで、本発明のＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドは、ＳＡＬＰＲを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。
本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有するポリペプチドを意味する。
ここで、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有するポリペプチドを意味する。
さらに、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドも、ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有する限り、使用することができる。
以下、遺伝子工学的手法について、より具体的にはＳＡＬＰＲを使用する場合について詳述するが、その部分ポリペプチドについても後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
ＳＡＬＰＲの調製方法
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することにより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチド
本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドには、具体的には下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ｂ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および
（ｅ）「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
本発明の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号３で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＬＰＲをコードする。
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、ＳＡＬＰＲを発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株）または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
ＳＡＬＰＲを含有する細胞は、ＳＡＬＰＲを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体（すなわち、ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＳＡＬＰＲをコードするＲＮＡを注入し、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
細胞膜画分
また、ＳＡＬＰＲを含有する本発明の細胞膜画分は、例えば本発明によるＳＡＬＰＲを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
ＳＡＬＰＲを介する、本発明による体重を増加または減少する化合物のスクリーニング方法では、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞）もしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞膜画分）を用いることができる。
また、本発明によるスクリーニング方法においては、被験物質がＳＡＬＰＲに特異的に結合するか否かを調べる方法と、ＳＡＬＰＲに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。
本発明によるスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質とを接触させ、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識した本発明のリラキシン−３とを接触させ、前記条件下におけるＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン−３の特異的結合量を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を有する場合には、被験物質非存在下におけるＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン−３の特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。
本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する本発明のリラキシン−３の特異的結合量を比較する場合には、当該リラキシン−３として、標識した当該リラキシン−３を用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［3Ｈ］、［14Ｃ］、［125Ｉ］、［35Ｓ］などを用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、本発明のリラキシン−３と標識物質を結合させるためにビオチン−アビジンの系を用いることもできる。
このように、本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと本発明のリラキシン−３との結合を阻害する化合物を、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。
本発明によるスクリーニング方法における別の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した本発明のリラキシン−３とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する当該リラキシン−３の特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における当該リラキシン−３の特定の細胞刺激活性を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。
前記態様においては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加する化合物として選択することができる。
一方、前記態様において、前記細胞と当該リラキシン−３との結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する体重を減少する化合物として選択することができる。
本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。
この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するｃＡＭＰを公知の手法で測定すればよく、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＳＡＬＰＲに本発明のリラキシン−３が結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、ＳＡＬＰＲの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、ＳＡＬＰＲに当該リラキシン−３が結合すると、ＳＡＬＰＲに共役しているＧタンパク質ファミリーの一つであるＧｉファミリーが、アデニル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ：アデニル酸シクラーゼによりＡＴＰから生成される）量を減少させることによる。
例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）した哺乳動物由来細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞）にアデニル酸シクラーゼの活性化剤［例えばフォルスコリン（ＦＳＫ）］を添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇する。
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−３を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−３が本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、ｃＡＭＰの生成量が減少する。従って、体重を増加する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＳＡＬＰＲを介する当該リラキシン−３に代わり、被験物質を単独で接触させてｃＡＭＰの生成量を減少させる（すなわち当該リラキシン−３と同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
体重を減少する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−３、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−３の作用でｃＡＭＰの生成量が減少するが、被験物質が当該リラキシン−３の作用に拮抗する場合には、ｃＡＭＰ生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は体重減少作用を有する化合物として選択できる。
細胞内ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、例えばイムノアッセイなどがあるが、例えば市販のｃＡＭＰ定量キットを使用することもできる。
別の態様のスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、またはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述のｃＡＭＰの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。
以下、前記態様による、ＳＡＬＰＲを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−３を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−３が本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、体重を増加する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＳＡＬＰＲを介する当該リラキシン−３に代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち当該リラキシン−３と同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
体重を減少する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−３、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−３の作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少するが、被験物質が当該リラキシン−３の作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は体重減少作用を有する化合物として選択できる。
被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
また、別の態様として、被験物質、好ましくは上記のスクリーニング方法により選択された被験物質（以下、単に「被験物質」と略記する場合がある。）をヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、投与後の摂食量、体重、肥満の指標（例えば体脂肪率、ＢＭＩ(体格指数)、肥満度、体型、身体年齢、インピーダンス、体脂肪量、除脂肪量、体水分量、蛋白質量、筋肉量、無機質量、細胞量、部位別筋肉量、部位別水分量、ＢＭＲ(基礎代謝量)、エネルギー所要量、腹部肥満率（ＶＳＲ）、内臓脂肪量、皮下脂肪量、内臓脂肪量レベル、臓器重量、血中パラメーターの変動、血中のレプチン、糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量など）を測定することにより体重調節に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルであるｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Ｚｕｃｋｅｒ ｆａｔｔｙラットなど）や遺伝子改変動物でもよい。
具体的には、本発明のリラキシン−３を投与することにより体重を増加させる場合は、以下の工程により行なうことができる。
工程Ａ：被験動物に所定量の被験物質を投与する。
工程Ｂ：被験動物に所定量のリラキシン−３を投与する。なお、リラキシン−３の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。
工程Ｃ：被験動物を体重の増減を解析および評価する環境下に置く。
工程Ｄ：試験結果に基づいて被験動物の体重の増減について解析および評価し、被験物質が体重調節作用を有するものであるか否かを判断および選択する。
または、
工程Ａ：被験動物に所定量のリラキシン−３を投与する。なお、リラキシン−３の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。
工程Ｂ：被験動物に所定量の被験物質を投与する。
工程Ｃ：被験動物を体重の増減を解析および評価する環境下に置く。
工程Ｄ：試験結果に基づいて被験動物の体重の増減について解析および評価し、被験物質が体重調節作用を有するものであるか否かを判断および選択する。
または、
工程Ａ：被験動物に所定量の被験物質および所定量のリラキシン−３を同時に投与する。なお、リラキシン−３の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。また、同時に投与するとは、被験物質およびリラキシン−３の両方を混合した状態で投与することには限定されず、実質的に同時と考えられる範囲内であれば、例えば、両方の投与に多少の時間差があってもよいし、また各々投与経路が異なっていてもよく、投与形態は適宜設定できる。
工程Ｂ：被験動物を体重の増減を解析および評価する環境下に置く。
工程Ｃ：試験結果に基づいて被験動物の体重の増減について解析および評価し、被験物質が体重調節作用を有するものであるか否かを判断および選択する。
被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。被験物質の被験動物の脳室内への投与方法は、薬物などを脳室内の所定の位置へ投与する際の常法に従えばよく、限定はされない。例えば、まず被験動物を麻酔した上で、ガイドカニューレを所定の位置に固定する手術を施しておき、適当な回復期間（例えば７日間〜１４日間、好ましくは少なくとも１週間程度）の経過後、ガイドカニューレにインジェクションニードルを挿し込み、還流ポンプを接続したマイクロシリンジを用い、上記ニードルを介して被験物質を投与することが好ましい。被験物質の投与量は、限定はされず、適宜設定できる。被験物質は、一般的には人工的脳脊髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）または生理食塩水などを用いて所望の濃度の溶液として調製しておく。人工的脳脊髄液としては、公知の常用されているものを用いればよく、限定はされないが、例えば、ａＣＳＦ（ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｍＭ、ＫＣｌ ２ｍＭ、ＮａＣｌ １１５ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １．２ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２５ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ ２．２ｍＭ；ｐＨ７．４）などが好ましい。被験物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。
リラキシン−３の被験動物への投与方法などは、前記の被験物質の場合と同様の方法が好ましい。また、リラキシン−３の被験動物の脳室内への投与方法も、前記の被験物質と同様に、一般的には人工的脳脊髄液を用いて所望の濃度の溶液となるよう調製しておくことが好ましい。
スクリーニングのための指標としては、体重の測定が挙げられ、さらに摂食量及び肥満の指標を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食などの条件を課すこともできる。
リラキシン−３受容体を用いた肥満調節に係る化合物のスクリーニング方法
リラキシン−３受容体
本発明のリラキシン−３に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のリラキシン−３と結合活性を有し、リラキシン−３受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］のリラキシン−３受容体を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、リラキシン−３受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば本発明のリラキシン−３に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。この場合、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、リラキシン−３受容体のアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
具体的には、リラキシン−３受容体として、報告されている公知の受容体、例えばＬＧＲ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１６３４）、ＳＡＬＰＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）（ＧＰＣＲ１３５とも称されている。）またはＧＰＲ１００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ＿０８３５９３）（ｈＧＰＣＲ１１、ＧＰＣＲ１４２とも称されている。）などを使用することが可能である。
ＳＡＬＰＲを用いた肥満調節に係る化合物のスクリーニング方法
以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、ＳＡＬＰＲを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに結合し、肥満調節（肥満を促進または抑制する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に肥満を促進または抑制する作用を有するか否かを決定することができる。
ここで、本発明のＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドは、ＳＡＬＰＲを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。
本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有するポリペプチドを意味する。
ここで、配列番号４で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有するポリペプチドを意味する。
さらに、ＳＡＬＰＲの部分ポリペプチドも、ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性（例えばリラキシン−３との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有する限り、使用することができる。
以下、遺伝子工学的手法について、より具体的にはＳＡＬＰＲを使用する場合について詳述するが、その部分ポリペプチドについても後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
ＳＡＬＰＲの調製方法
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することにより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチド
本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドには、具体的には下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ｂ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および
（ｅ）「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
本発明の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号３で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＬＰＲをコードする。
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号４で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明のＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記ＳＡＬＰＲと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のようなＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、ＳＡＬＰＲを発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株）または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
ＳＡＬＰＲを含有する細胞は、ＳＡＬＰＲを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体（すなわち、ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＳＡＬＰＲをコードするＲＮＡを注入し、ＳＡＬＰＲの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
細胞膜画分
また、ＳＡＬＰＲを含有する本発明の細胞膜画分は、例えば本発明によるＳＡＬＰＲを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
ＳＡＬＰＲを介する、本発明による肥満を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞）もしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＳＡＬＰＲを含有する細胞膜画分）を用いることができる。
また、本発明によるスクリーニング方法においては、被験物質がＳＡＬＰＲに特異的に結合するか否かを調べる方法と、ＳＡＬＰＲに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。
本発明によるスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質とを接触させ、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識した本発明のリラキシン−３とを接触させ、前記条件下におけるＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン−３の特異的結合量を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下におけるＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン−３の特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。
本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する本発明のリラキシン−３の特異的結合量を比較する場合には、当該リラキシン−３として、標識した当該リラキシン−３を用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［3Ｈ］、［14Ｃ］、［125Ｉ］、［35Ｓ］などを用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、本発明のリラキシン−３と標識物質を結合させるためにビオチン−アビジンの系を用いることもできる。
このように、本発明によるスクリーニング方法において、ＳＡＬＰＲまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと本発明のリラキシン−３との結合を阻害する化合物を、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。
本発明によるスクリーニング方法における別の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した本発明のリラキシン−３とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する当該リラキシン−３の特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における当該リラキシン−３の特定の細胞刺激活性を比較することにより、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。
前記態様においては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進する化合物として選択することができる。
一方、前記態様において、前記細胞と当該リラキシン−３との結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、ＳＡＬＰＲを介する肥満を抑制する化合物として選択することができる。
本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。
この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するｃＡＭＰを公知の手法で測定すればよく、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＳＡＬＰＲに当該リラキシン−３が結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、ＳＡＬＰＲの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、ＳＡＬＰＲに当該リラキシン−３が結合すると、ＳＡＬＰＲに共役しているＧタンパク質ファミリーの一つであるＧｉファミリーが、アデニル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ：アデニル酸シクラーゼによりＡＴＰから生成される）量を減少させることによる。
例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）した哺乳動物由来細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞）にアデニル酸シクラーゼの活性化剤［例えばフォルスコリン（ＦＳＫ）］を添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇する。
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−３を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−３が本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、ｃＡＭＰの生成量が減少する。従って、肥満を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＳＡＬＰＲを介する当該リラキシン−３に代わり、被験物質を単独で接触させてｃＡＭＰの生成量を減少させる（すなわち当該リラキシン−３と同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
肥満を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−３、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−３の作用でｃＡＭＰの生成量が減少するが、被験物質が当該リラキシン−３の作用に拮抗する場合には、ｃＡＭＰ生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は肥満抑制作用を有する化合物として選択できる。
細胞内ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、例えばイムノアッセイなどがあるが、例えば市販のｃＡＭＰ定量キットを使用することもできる。
別の態様のスクリーニング方法においては、例えばＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現（好ましくは、ＳＡＬＰＲを含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、またはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述のｃＡＭＰの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。
以下、前記態様による、ＳＡＬＰＲを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−３を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−３が本発明によるＳＡＬＰＲに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、肥満を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＳＡＬＰＲを介する本発明のリラキシン−３に代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち当該リラキシン−３と同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
肥満を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−３、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−３の作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少するが、被験物質が当該リラキシン−３の作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は肥満抑制作用を有する化合物として選択できる。
被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＳＡＬＰＲを細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
また、別の態様として、上記のスクリーニング方法により選択された被験物質をヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、投与後の摂食量、体重、肥満の指標（例えば体脂肪率、ＢＭＩ(体格指数)、肥満度、体型、身体年齢、インピーダンス、体脂肪量、除脂肪量、体水分量、蛋白質量、筋肉量、無機質量、細胞量、部位別筋肉量、部位別水分量、ＢＭＲ(基礎代謝量)、エネルギー所要量、腹部肥満率（ＶＳＲ）、内臓脂肪量、皮下脂肪量、内臓脂肪量レベル、臓器重量、血中パラメーターの変動、血中のレプチン、糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量など）を測定することにより肥満作用に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルであるｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、Ｚｕｃｋｅｒ ｆａｔｔｙラットなど）や遺伝子改変動物でもよい。
具体的には、本発明のリラキシン−３を投与することにより肥満を促進させる場合は、以下の工程により行なうことができる。
工程Ａ：被験動物に所定量の被験物質を投与する。
工程Ｂ：被験動物に所定量のリラキシン−３を投与する。なお、リラキシン−３の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。
工程Ｃ：被験動物を肥満の程度を解析および評価する環境下に置く。
工程Ｄ：試験結果に基づいて被験動物の肥満の程度について解析および評価し、被験物質が肥満調節作用を有するものであるか否かを判断および選択する。
または、
工程Ａ：被験動物に所定量のリラキシン−３を投与する。なお、リラキシン−３の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。
工程Ｂ：被験動物に所定量の被験物質を投与する。
工程Ｃ：被験動物を肥満の程度を解析および評価する環境下に置く。
工程Ｄ：試験結果に基づいて被験動物の肥満の程度について解析および評価し、被験物質が肥満調節作用を有するものであるか否かを判断および選択する。
または、
工程Ａ：被験動物に所定量の被験物質および所定量のリラキシン−３を同時に投与する。なお、リラキシン−３の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。また、同時に投与するとは、被験物質およびリラキシン−３の両方を混合した状態で投与することには限定されず、実質的に同時と考えられる範囲内であれば、例えば、両方の投与に多少の時間差があってもよいし、また各々投与経路が異なっていてもよく、投与形態は適宜設定できる。
工程Ｂ：被験動物を肥満の程度を解析および評価する環境下に置く。
工程Ｃ：試験結果に基づいて被験動物の肥満の程度について解析および評価し、被験物質が肥満調節作用を有するものであるか否かを判断および選択する。
被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。被験物質の被験動物の脳室内への投与方法は、薬物などを脳室内の所定の位置へ投与する際の常法に従えばよく、限定はされない。例えば、まず被験動物を麻酔した上で、ガイドカニューレを所定の位置に固定する手術を施しておき、適当な回復期間（例えば７日間〜１４日間、好ましくは少なくとも１週間程度）の経過後、ガイドカニューレにインジェクションニードルを挿し込み、還流ポンプを接続したマイクロシリンジを用い、上記ニードルを介して被験物質を投与することが好ましい。被験物質の投与量は、限定はされず、適宜設定できる。被験物質は、一般的には人工的脳脊髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）または生理食塩水などを用いて所望の濃度の溶液として調製しておく。人工的脳脊髄液としては、公知の常用されているものを用いればよく、限定はされないが、例えば、ａＣＳＦ（ｇｌｕｃｏｓｅ １０ｍＭ、ＫＣｌ ２ｍＭ、ＮａＣｌ １１５ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １．２ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２５ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ ２．２ｍＭ；ｐＨ７．４）などが好ましい。被験物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。
リラキシン−３の被験動物への投与方法などは、前記の被験物質の場合と同様の方法が好ましい。また、リラキシン−３の被験動物の脳室内への投与方法も、前記の被験物質と同様に、一般的には人工的脳脊髄液を用いて所望の濃度の溶液となるよう調製しておくことが好ましい。
スクリーニングのための指標としては、肥満の指標を測定することが挙げられ、さらに摂食量及び体重を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食などの条件を課すこともできる。
被験物質
ここで、上述の被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸（オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物など由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよく、これらは本発明の被験物質に含まれる。
本願明細書において「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば好ましくはハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。
スクリーニング用キット
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のリラキシン−３、およびリラキシン−３受容体または前記細胞（すなわち、リラキシン−３受容体を含有する細胞）もしくは前記細胞膜画分（すなわち、リラキシン−３受容体を含有する細胞膜画分）とを少なくとも含有する。当該リラキシン−３は、標識した当該リラキシン−３であってもよい。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。ここで、リラキシン−３受容体の好適な例は、ＳＡＬＰＲである。
本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、本発明のリラキシン−３、およびリラキシン−３受容体を細胞膜上に発現（好ましくは、リラキシン−３受容体を含む発現ベクターを導入して過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）を含有する細胞とを少なくとも含有する。当該リラキシン−３は、標識した当該リラキシン−３であってもよい。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばレポーター遺伝子産物（例えば、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼなど）の基質、アデニル酸シクラーゼ活性化剤（例えばＦＳＫ）、結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、リラキシン−３受容体を細胞膜上に発現していない細胞を含んでいてもよい。ここで、リラキシン−３受容体の好適な例は、ＳＡＬＰＲである。
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、摂食を促進もしくは抑制する化合物、体重を増加もしくは減少させる化合物、または肥満を促進もしくは抑制する化合物である。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよい。
従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、摂食（もしくは食欲）調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン−３またはリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症または各種疾患の治療（例えば術中、術後）に伴い増加もしくは減少した摂食（もしくは食欲）および／または体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患（例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など）、免疫機能調節に係る疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など）、エネルギー代謝に係る疾患（例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症など）、ＡＩＤＳ、癌、または悪液質などが挙げられる。
本発明によるスクリーニング方法によって、リラキシン−３受容体、好ましくはＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドを介した細胞刺激活性、より具体的には、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドに本発明のリラキシン−３が結合すると引き起こされる細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）の阻害作用（ＳＡＬＰＲ阻害作用）を有する化合物が提供される。このような化合物を含有する薬剤として、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などが挙げられる。
得られた化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約１．０〜１，５００μｇ、好ましくは約１０〜５００μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
リラキシン−３の活性を阻害する物質およびその使用
本発明のリラキシン−３の活性を阻害する物質によれば、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用を抑制または阻害することができる。そこで、当該リラキシン−３の発現を阻害するものは、当該リラキシン−３のｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける摂食制御および体重制御に伴う機能（例えばエネルギー代謝調節、成長など）、肥満を制限するのに利用できる可能性がある。
本発明のリラキシン−３の活性を阻害する物質には、当該活性を有する限り特に制限はないが、例えば当該リラキシン−３をコードする塩基配列のアンチセンス配列を有するＤＮＡや、当該リラキシン−３をコードする塩基配列を有する２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）、リボザイムなど当該リラキシン−３の発現を阻害するもの、あるいは当該リラキシン−３の抗体や糖タンパク質、さらには上記スクリーニング方法により得られる化合物などの当該リラキシン−３もしくはリラキシン−３受容体（好ましくは、ＳＡＬＰＲ）と相互作用して当該リラキシン−３が有する活性を阻害する物質などが挙げられる。
当該物質は塩を形成してもよく、薬学的に許容し得る塩が挙げられる。従って、本発明のリラキシン−３の活性を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの水和物は、摂食（もしくは食欲）調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン−３またはリラキシン−３をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、疾患の発症または疾患の治療（例えば術中、術後）に伴い増加した摂食（もしくは食欲）および／または体重の減少を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患（例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など）、免疫機能調節に係る疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など）、またはエネルギー代謝に係る疾患（例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害など）などが挙げられる。好ましくは、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などとして使用することができる。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する機構としては、（１）３重鎖形成による転写開始阻害、（２）ＲＮＡポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部位とのハイブリッド形成による転写抑制、（３）合成中のＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、（４）イントロン−エキソン接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（５）スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（６）ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による、ｍＲＮＡの細胞質への移行抑制、（７）キャッピング部位またはポリＡ付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（８）翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、（９）リボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、（１０）ｍＲＮＡ翻訳領域またはポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長抑制、並びに（１１）核酸と蛋白質の相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制が挙げられる（平島および井上『新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ 遺伝子の複製と発現』日本生化学会編、東京化学同人、ｐｐ．３１９−３４７ （１９９３））。
本発明のリラキシン−３のアンチセンス核酸は、上述の（１）〜（１１）のどの機構により遺伝子発現を抑制する核酸であってもよい。すなわち、発現を阻害する目的の遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列に対するアンチセンス配列を含むものであってもよい。アンチセンス核酸をコードするＤＮＡは、その発現を可能とする適当な制御配列下に連結して使用され得る。アンチセンス核酸は、標的とする遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に対して完全に相補的である必要はなく、効果的に当該遺伝子の発現を阻害するものであればよい。このようなアンチセンス核酸は、少なくとも１５ｂｐ以上、好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは５００ｂｐ以上であり、通常３０００ｂｐ以内、好ましくは２０００ｂｐ以内、より好ましくは１０００ｂｐ以内の鎖長を有し、標的遺伝子の転写産物の相補鎖に対して好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一である。このようなアンチセンス核酸は、本発明のリラキシン−３の配列情報を基に、ホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ３２０９−２１）などにより調製することができる。
リボザイムとは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称であり、大きくラージリボザイム（ｌａｒｇｅ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）およびスモールリボザイム（ｓｍａｌｌ ｌｉｂｏｙｍｅ）に分類される。ラージリボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断し、反応後に５’−リン酸と３’−ヒドロキシル基を反応部位に残す酵素である。ラージリボザイムは、さらに（１）グアノシンによる５’−スプライス部位でのトランスエステル化反応を行なうグループＩイントロンＲＮＡ、（２）ラリアット構造を経る二段階反応により自己スプライシングを行なうグループＩＩイントロンＲＮＡ、および（３）加水分解反応によるｔＲＮＡ前駆体を５’側で切断するリボヌクレアーゼＰのＲＮＡ成分に分類される。それに対して、スモールリボザイムは、比較的小さな構造単位（４０ｂｐ程度）であり、ＲＮＡを切断して、５’−ヒドロキシル基と２’−３’環状リン酸を生じさせる。スモールリボザイムには、ハンマーヘッド型（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２２８： ２２５）、ヘアピン型（Ｂｕｚａｙａｎ （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ３４９； Ｋｉｋｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ６７５１； 菊地洋（１９９２）化学と生物 ３０： １１２）などのリボザイムが含まれる。リボザイムは、改変および合成が容易なため多様な改良方法が公知であり、例えばリボザイムの基質結合部を標的部位近くのＲＮＡ配列と相補的となるように設計することにより、標的ＲＮＡ中の塩基配列ＵＣ、ＵＵまたはＵＡを認識して切断するハンマーヘッド型リボザイムを作ることができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２２８： ２２５； 小泉誠および大塚栄子 （１９９０） 蛋白質核酸酵素３５： ２１９１； Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７： ７０５９）。ヘアピン型のリボザイムについても、公知の方法に従って設計、製造が可能である（Ｋｉｋｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ６７５１； 菊地洋（１９９２） 化学と生物 ３０： １１２）。
１９９８年に、線虫においてＲＮＡ同士が邪魔し合い働きを失う現象（ＲＮＡ干渉）が観察された（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１： ８０６−１１）。ＲＮＡ干渉とは、二本鎖の人工ＲＮＡを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有するＲＮＡが分解される現象である。その後の研究により、ＲＮＡ干渉などのＲＮＡサイレンシングの現象は、欠陥を持つｍＲＮＡの排除、並びにトランスポゾン、ウイルスなどの寄生体に対する防御のための細胞機構であることが示唆されている。現在では、多くの遺伝子の発現を抑制するためのツールとして、二本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ； ｓｉＲＮＡ）が利用されており、病気の原因遺伝子などの発現抑制を、ｓｉＲＮＡを用いて行なうことにより病気を治療・予防する方法も検討されている。本発明のｓｉＲＮＡは、本発明のリラキシン−３のｍＲＮＡの転写を阻害する限り、特に限定されない。通常、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの配列に対するセンス鎖およびアンチセンス鎖の組合せであり、少なくとも１０個から標的ｍＲＮＡと同じ個数までのヌクレオチド長を有する。好ましくは、１５〜７５個、より好ましくは１８〜５０個、さらに好ましくは２０〜２５個のヌクレオチド長である。本発明のリラキシン−３の発現を抑制するために、ｓｉＲＮＡは公知の方法により細胞に導入することができる。例えばｓｉＲＮＡを構成する二本のＲＮＡ鎖を、一本鎖上にコードするＤＮＡを設計し、当該ＤＮＡを発現ベクターに組み込み、細胞を当該発現ベクターで形質転換し、ｓｉＲＮＡを、ヘアピン構造を有する二本鎖ＲＮＡとして細胞内で発現させることができる。トランスフェクションにより持続的にｓｉＲＮＡを産生するプラスミド発現ベクターも設計されている（例えばＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ ｐＳＩＲＥＮ Ｖｅｃｔｏｒ、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ Ｖｅｃｔｏｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））。ｓｉＲＮＡの塩基配列は、例えばＡｍｂｉｏｎ ｗｅｂｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）のコンピュータープログラムを用いて設計することができる。機能的ｓｉＲＮＡをスクリーニングするためのキット（例えばＢＤ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））なども市販されており利用可能である。
患者の細胞内における遺伝子の発現を制御するための遺伝子治療において、本発明のアンチセンス核酸、リボザイムおよびｓｉＲＮＡを、直接組織に投与してもよく、またはこれらを発現するように作成された構築物を有する任意のベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクター、リポソームなどを利用した非ウイルスベクター）を、直接組織に投与してもよい（ｉｎ ｖｉｖｏ法）。これらは、例えば筋肉注射、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射などによって、組織部位へ注入することができる。
または、予め体外で、細胞に、本発明のアンチセンス核酸、リボザイムおよびｓｉＲＮＡを発現するように作成された構築物を有するベクターを導入してもよい。得られた細胞を、例えば筋肉注射、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射などにより患者の組織に注入する（ｅｘ ｖｉｖｏ法）。使用細胞は、患者の細胞と異種または同種であってよいが、好ましくは同種、より好ましくは患者から採取した細胞である。
本発明のアンチセンス核酸、リボザイムおよびｓｉＲＮＡ、またはこれらを発現するように作成された任意のベクターは、単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合されて、医薬品組成物（例えば摂食抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤）として使用され得る。例えば、注射剤の形態で投与する場合には、医薬品組成物は、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの糖溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などを含んでもよい。
これらの投与量は、患者の体重、年齢、症状、投与形態などにより変動するが、当業者であれば、必要に応じて適当な投与量を選択することができる。
本発明の抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体フラグメントが含まれる。
本発明のモノクローナル抗体は、免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、本発明のリラキシン−３またはそれらの部分断片を用いることを除いて、それ自体公知の手段により得ることができる。例えば前記免疫用抗原を用いてマウスを免疫し、そのマウスから取得した脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞とを、細胞融合法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））、または電気細胞融合法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，１００，１８１−１８９（１９８７））を用いて細胞融合し、前記スクリーニング用抗原を用いてスクリーニングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
前記ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好ましくはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅａｇｌｅ'ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧおよびストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。前記ハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、５％ＣＯ2濃度、３７℃の条件下で約３日間行なうことができる。また、マウスの腹腔内で培養する場合には、約１４日間で行なうことができる。
このようにして得られた培養液またはマウスの腹水から、タンパク質の分離および精製常法に従って、前記モノクローナル抗体を分離および精製することが可能である。このような方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析または凍結乾燥などを挙げることができる。
また、本発明のポリクローナル抗体も、免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、本発明のリラキシン−３またはそれらの部分断片を用いることを除いて、それ自体公知の方法、例えば以下に示す方法により調製することができる。すなわち、抗原を含む生理食塩水を等量のフロイント氏完全アジュバンドもしくは不完全アジュバンド、またはその等価物、例えばＨｕｎｔｅｒ'ｓ ＴｉｔｅｒＭａｘTM（フナコシ社）と乳化混合して、哺乳動物（特にはウサギまたはヤギなど）の皮下、腹腔内または筋肉内などのいずれかに投与する（初回免疫）。以後、２〜４週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から１〜２週間後に哺乳動物の頚動脈または心臓から血液を採取して血清を硫酸アンモニウムによって塩析することにより調製することができる。
本発明の抗体フラグメントは、前記抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む）の部分断片であって、しかも、元の抗体と同じ反応特異性を有する限り、特に限定されるものではない。本発明による抗体フラグメントとしては、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2 またはＦｖを挙げることができる。本発明の抗体フラグメントは、例えば前記によって得られることができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）によって消化し、続いて、タンパク質の分離および精製の常法に従って得ることができる。
また別の態様によれば、本発明の抗体は、国際公開第０１／０６８８６２号パンフレット、特開２００２−３４５４６８号明細書に記載の方法により得ることができる。また。公知となった抗リラキシン-３抗体を使用することができ、例えば特開２００２−３４５４６８号明細書の実施例に記載された抗体（モノクローナル抗体：ＨＫ４−１４４−１０）を挙げることができる。
本発明の抗体は、医薬品組成物として用いることもでき、例えば摂食（もしくは食欲）抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤として使用することができる。本発明の抗体は、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることができる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明の抗体を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、抗体の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
本発明のリラキシン−３もしくはリラキシン−３受容体（好ましくはＳＡＬＰＲ）と相互作用し、本発明のリラキシン−３の活性を阻害する物質は、本発明のスクリーニング法によって得ることができる。前記スクリーニング方法によって得られる化合物の好適例として、後述する実施例に記載された１，２，５−ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［３，４−ａ］１，２，５−ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［３，４−ｅ］１，２，５−ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［３，４−ｉ］１，２，５−ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［３，４−ｍ］［１６］ａｎｎｕｌｅｎｅ（以下、「化合物１」と称する場合もある。）を挙げることができる。当該化合物の投与形態は、前記本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬に関する記載を参照すればよい。
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a）〜(c)の治療を含む：
（a）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
（b）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
（c）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
［実施例１］ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドの調製
ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号３で表される塩基配列を基にして、以下のように行った。配列番号３では１４１０塩基対が示されており、ＳＡＬＰＲをコードする領域は、１番目から１４０７番目（１４１０塩基対，４６９アミノ酸残基）とされている（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により遺伝子を単離するために、配列番号５および配列番号６で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作製した。
ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｏｓｔｉｃｓ社）を鋳型として、配列番号５および配列番号６の組合せからなるＰＣＲプライマーと、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用い、（９８℃ １分−５７℃ １分−７２℃ ３分）を添付の操作方法に従い、３０回繰り返すことによりＰＣＲを行った。その結果、約１，４００塩基対のＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により配列を確認した。その結果、配列番号５および６からなるプライマーの組合せによって得られたｐＣＲ２．１−ＳＡＬＰＲに挿入された１４１０塩基対の配列は、配列番号３における３６１番目から１７７０番目と長さは同一であったが、配列中には１つの変異が見られた。この変異は、該当部位の核酸配列から翻訳されるアミノ酸には影響を与えないことは明らかであったので、ＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを得ることができた。
［実施例２］レトロウイルスベクタープラスミドの調製
ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ， Ｊ．Ｐ． ａｎｄ Ｌａｎｄ， Ｈ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ｖｏｌ．１８ ３５８７−３５９６（１９９０））（配列番号７）からＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）領域を除き、末端をＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔにより平滑化した。ここへｐＩＲＥＳｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）領域を切り出し、Ｔ４ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＸＩＨを得た。
ｐＢａｂｅＸＩＨからＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより５’−ＬＴＲ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを除いた。ここへｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ社）からＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを得た。
［実施例３］ＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
前記実施例２に記載のレトロウイルス発現用プラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを制限酵素ＨｐａＩで切断した。ここへ前記実施例１で得たｐＣＲ２．１−ＳＡＬＰＲからＥｃｏＲＶで切断することによりＳＡＬＰＲをコードするポリヌクレオチドを切り出し、Ｔ４ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ＳＡＬＰＲ）ＩＨを得た（図１）。
［実施例４］ＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製
２×１０6個の２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１０ｃｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）でＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＦＣＳ）−ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ） １００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ） １００μｇ／ｍｌ（ＰＳ）（以下、「ＥＢＮＡ培養液」と称する）１０ｍｌを用いて培養した。翌日、ｐＶ−ｇｐ（ｐＶＰａｃｋ−ＧＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｉｓＤを除きＴ４ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの）、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、および実施例３で得たＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ＳＡＬＰＲ）ＩＨ）それぞれ３．３μｇをリポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（Ｐａｎｖｅｒａ社）を用いて、前記２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションした。その６〜１２時間後にＥＢＮＡ培養液を交換し、３７℃で培養を続けた。
トランスフェクション２日後に培養液を回収し、１，２００×ｇで１０分間遠心した。
その上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして、さらにウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。
超遠心用チューブ５０ Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ Ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を７０％エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約３５ｍｌを入れた。これを超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ社）に入れ、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を使って１９，５００ｒｐｍ １００分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。１時間後、チューブ壁面に残った培養液約１００μｌ程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。
［実施例５］サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の構築（１）サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーターＤＮＡの作成
公表された論文（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０００ ２８４（２）：３１６−２６）を参考にｃＡＭＰに応じた転写がみられるｕｎｉｔを以下のように構築した。
ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）を含むｕｎｉｔの作成のために、ＣＲＥｘ２ｈｂ用として配列番号８および配列番号９、ＣＲＥｘ２ｂｐ用として配列番号１０および配列番号１１で表されるオリゴＤＮＡを常法に従い作成した。
それぞれの組合せからなるオリゴＤＮＡを９５℃に熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖ＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ）を形成させた。ＣＲＥｘ２ｈｂをＨｉｎｄＩＩＩ，ＢａｍＨＩ、ＣＲＥｘ２ｂｐをＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩで消化するとともに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩで消化した。消化したＤＮＡを電気泳動して両端に制限酵素消化部位をもつＤＮＡを精製した後、これら３つのＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋））を一度に連結し（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、得られたプラスミドの配列を解析して、ＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫを作成した。
次にＶＩＰ（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）プロモーターを含むＤＮＡを得るために配列番号１２および配列番号１３で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作成した。
Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｏｓｔｉｃｓ社）を鋳型とし、配列番号１２および配列番号１３の組合せからなるＰＣＲプライマーと、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて（９４℃ ３０秒−５５℃ ３０秒−７２℃ １分）を３５回繰り返すことによりＰＣＲしたところ、２６４塩基対のＤＮＡ（配列番号１４）が得られた。この２６４塩基対のＤＮＡをＰｓｔＩで消化するとともにＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＰｓｔＩサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認してＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を作成した（図２Ａ）。得られたＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）からＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化した後、得られたＣＲＥ４ＶＩＰプロモーター断片の末端平滑化を行なった。
前述の発現用ウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨよりＩＲＥＳ〜ｈｙｇｒｏ（ｒ）領域を除去したｐＢａｂｅＣＬＸを作成した（図２Ｂ）。ｐＢａｂｅＣＬＸよりレトロウイルス本来のエンハンサー活性（ＬＴＲ）中のＮｈｅＩ〜ＮａｒＩ領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、ＣＲＥとＶＩＰプロモーターを含む配列と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ）（Ｇｏｔｏら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ４９， ｐ．８６０−８７３， １９９６）を導入し、ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを得た（図２Ｃ）。
（２）サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の樹立
サイクリックＡＭＰ応答配列によりレポーター遺伝子ＰＬＡＰが誘導されるレトロウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを用い、実施例４に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローン化して、ＰＬＡＰ誘導の反応性が最も良かったクローン（以下、「ＳＥ３０２細胞」と称する）を以下の実験に供した。
［実施例６］ＳＡＬＰＲ遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるＳＡＬＰＲ発現細胞の調製
前記の実施例４で調製したレトロウイルスベクターによる細胞へのＳＡＬＰＲ遺伝子導入を以下のように行った。
前記実施例５で構築した３×１０3個のＳＥ３０２細胞を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（旭テクノガラス社）にＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）−１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＦＣＳ）−ＰＳ（以下、「培養液」と称する）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例４で調製したレトロウイルスベクターを適宜希釈し、その１００μｌを培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）（別名 ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ Ｓｉｇｍａ社）とともにＳＥ３０２細胞に加えた。その翌日、培養液を５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）含有の培養液２００μｌと交換し培養した。この条件で増殖してきたＳＡＬＰＲ遺伝子導入ＳＥ３０２細胞（以下、「ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞」と称する）を適時継代して実験に供した。
［実施例７］ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞におけるフォルスコリン添加によって増加させた転写活性のリラキシン−３による抑制
前記実施例６で構築したＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を、転写活性測定用培地（ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（６５℃にて３０分非働化）を加えたもの）にて縣濁した後、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社）に１穴あたり１×１０4細胞となるようにまいた。翌日、アッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミンを加えたもの）で希釈した各濃度のヒト型リラキシン−３（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）またはインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加し、その後フォルスコリン（Ｃａｒｂｉｏ Ｃｈｅｍ社）を最終濃度１μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清を１５μｌ回収して化学発光測定用の９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（住友ベークライト社）に移し、アッセイ用緩衝液（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ2ＣＯ3−ＮａＨＣＯ3、８ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ4、ｐＨ１０）を６０μｌ、Ｌｕｍｉｐｈｏｓ５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ社）７０μｌを添加して、室温にて１時間反応させた後、各ｗｅｌｌの化学発光をＦｕｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）にて測定し転写活性量とした。フォルスコリン１μｍｏｌ／Ｌを添加した細胞上清の転写活性を１００％ととし、フォルスコリンを添加していない細胞の上清の活性を０％として各被験サンプルを加えた細胞上清中の活性を％で表示した（図３）。
その結果、フォルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン−３はＳＡＬＰＲの活性化を介して抑制することが分かった。この転写活性の上昇は関連ペプチドであるインスリンでは影響がなかったので、リラキシン−３特異的な反応であることが分かった。すなわちこの実験系を用いることで、リラキシン−３によるＳＡＬＰＲの活性化に影響を与える化合物、物質を判別できることが示された。
［実施例８］ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を用いたリラキシン−３拮抗物質のスクリーニング
実施例７で示した実験系を用いて、リラキシン−３の作用を拮抗する化合物のスクリーニングを実施し、拮抗作用を持つ化合物を見出した。
リラキシン−３は、株式会社ペプチド研究所にて合成されたヒト型リラキシン−３（以下、単に「ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）」と略記する場合もある。）を用いて実験を行った。ヒト型リラキシン−３は、配列番号２のＮ末端から第２６番目（Ａｒｇ）〜第５２番目（Ｔｒｐ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ｂ鎖）と配列番号２のＮ末端から第１１９番目（Ａｓｐ）〜第１４２番目（Ｃｙｓ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型Ａ鎖）が、配列番号２のＮ末端から第３５番目のＢ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１２９番目のＡ鎖のシステインが結合し、配列番号２のＮ末端から第４７番目のＢ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１４２番目のＡ鎖のシステインが結合し、並びに配列番号２のＮ末端から第１２８番目のＡ鎖のシステインおよび配列番号２のＮ末端から第１３３番目のＡ鎖のシステインが結合しているポリペプチドである。
ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞を、転写活性測定用培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２−１０％ＦＢＳ（６５℃にて３０分非働化）を加えたもの）にて縣濁した後、３８４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に１穴当たり５０００細胞となるようにまいた。翌日、フォルスコリン（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｋ社）溶液に被験化合物（１，２，５−ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［３，４−ａ］１，２，５−ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［３，４−ｅ］１，２，５−ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［３，４−ｉ］１，２，５−ｏｘａｄｉａｚｏｌｏ［３，４−ｍ］［１６］ａｎｎｕｌｅｎｅ（化合物１））を溶解し、細胞上清に添加した（最終濃度：フォルスコリン３μｍｏｌ／Ｌ、被験化合物２０μｇ／ｍＬ，ＤＭＳＯ （ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｒｆｏｘｉｄｅ）０．５％）。その後、アッセイ用培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２に０．１％ウシ血清アルブミンを加えたもの）で希釈したヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）を最終濃度３ｎｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。
さらに一日培養後、細胞上清５μｌを回収して化学発光測定用の３８４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に移し、アッセイ用緩衝液を２０μＬ、Ｌｕｍｉｐｈｏｓ５３０を２５μＬ添加して、室温にて２時間反応させた後、各ｗｅｌｌの化学発光をＡＲＶＯｓｘ３プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）にて測定し転写活性量とした。ＳＡＬＰＲを発現していないＳＥ３０２細胞についても同様に操作し、被験物質の特異性を確認した。
その結果、ＳＡＬＰＲ−ＳＥ３０２細胞におけるフォルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン−３が抑制し、被験物質である化合物１がリラキシン−３による転写活性の抑制に拮抗した（図４（Ａ））。また、ＳＡＬＰＲを発現していないＳＥ３０２細胞における検討では、化合物１は、転写活性を上昇させることはなかった（図４（Ｂ））。したがって被験物質による作用が、ＳＡＬＰＲのリラキシン−３による活性化を特異的に抑制する化合物であることが確認できた。
［実施例９］リラキシン−３脳室内投与による摂食量亢進作用
（１）被験ラットと脳室内投与のための前処置
Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（７週齢、日本チャールズリバー社）に実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母社）を与えて馴化した。ラット（２５０〜３００ｇ）を麻酔下で、側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上、前記ラットを飼育した後にリラキシン−３の投与実験を行った。
（２）リラキシン−３溶液の調製
６０μｇのヒト型リラキシン−３（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社）をＤＭＳＯにて溶解した後、最終濃度が２００μｍｏｌ／Ｌとなるように人工的脳脊髄液を添加して調製した。析出した沈殿は遠心操作をして取り除き、上清をヒト型リラキシン−３投与液として用いた。ラットへの投与量（投与液中のリラキシン−３濃度）は実施例７に示された実験系にて、リラキシン−３による標準曲線を用いて算出したところ、約５０ｐｍｏｌ／ラットであった。
（３）リラキシン−３溶液の脳室内投与
ガイドカニューレを装着した被験ラットを２群に分け（１群６匹）、ヒト型リラキシン−３投与液もしくはｖｅｈｉｃｌｅ（ヒト型リラキシン−３を除いた前記（２）と同じ組成の溶液）を５μＬ／２分の速度でインフュージョンポンプを用いて被験ラットに投与した。
（４）摂餌量の測定
投与液の脳室内投与後すぐに、被験ラットは予め重量を測定した餌を入れてあるケージに入れ自由摂食させた。２時間後に餌の減少量を測定することで摂餌量を算出した。各群の平均摂餌量と標準偏差を図５に示す。その結果、投与後２時間の摂餌量は、ヒト型リラキシン−３を約５０ｐｍｏｌ投与したラットでは対照のｖｅｈｉｃｌｅ投与のラットに比べて有意に増加していた（ｔ−検定、ｐ<０．０１）。従って、リラキシン−３は摂食行動を増加させることが分かった。
［実施例１０］リラキシン−３の単回脳室内投与時の血中レプチン濃度上昇
血中レプチン濃度の測定
摂餌量測定後（投与後約３時間後）に前記ラットをネンブタールにて麻酔し、その腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を１，７５０×ｇで１５分間遠心し、その上清を−８０℃にて保存した。後日、上清中のレプチン量をラットレプチン定量ＥＬＩＳＡキット（アマシャムバイオサイエンス社）により定量した。
その結果、単回のヒト型リラキシン−３投与ラットでは対照のｖｅｈｉｃｌｅ投与のラットより血中のレプチン濃度が有意に上昇することが明らかとなった（ｔ−検定、ｐ<０．０５、図６）。
［実施例１１］リラキシン−３持続投与による体重増加・肥満作用の亢進
（１）リラキシン−３溶液の調製
ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）を生理食塩水にて１００μｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、ｖｅｈｉｃｌｅ（生理食塩水）またはヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）溶液を浸透圧ポンプ（ａｌｚｅｔ ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｕｍｐ ｍｏｄｅｌ１００２（ＤＵＲＥＣＴ社） 投与量 ６μＬ／日）とチューブ・投与用カニューレに注入しそれらを接続した。
（２）実験動物と脳室内投与のための処置
Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（６週齢、日本チャールズリバー社）に実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母社）を与え、個別飼育で４日間馴化した。前記ラット（２５０〜２７０ｇ）を麻酔下で、側脳室にガイドカニューレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。
（３）体重増加作用および摂餌量の測定
手術日を０日目として自由摂食下で飼育し、毎朝、体重と餌量を測定した。０日目からの体重の増加量を図７に示した。また、摂餌量は、手術前日から手術日までを０日目とし、一日当たりの餌の減少量を摂餌量として示した（図８）。
手術後１日目よりヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）投与ラット群では有意な体重の増加が確認された。また、ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）投与群の摂餌量も１日目より有意に増加した（ｔ−検定、＊＊ ｐ<０．０１、＊ ｐ<０．０５）。
（４）脂肪量、血中レプチン量およびインスリン量の定量
実験終了日（１４日目）に体重と餌量を測定した後、ラットをネンブタールにて麻酔し、精巣周囲の脂肪を取り出し両精巣周囲の脂肪量を合わせて測定した（図９）。さらに、腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を１，７５０×ｇで１５分間遠心し、その上清を−８０℃にて保存した。後日、上清中のレプチン量をラットレプチン測定キット（Ｌ）（ＩＢＬ社）により定量した（図１０（Ａ））。また上清中のインスリン量を超高感度ラットインスリン測定キット（森永生化学研究所社）により定量した（図１０（Ｂ））。
その結果、精巣周囲脂肪量は対照のｖｅｈｉｃｌｅ投与のラットに比較し、ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）持続投与群で有意に増加していた。また、血中のレプチン濃度とインスリン濃度も、ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）を持続投与したラットで有意に上昇していることが明らかとなった（ｔ−検定、＊＊ ｐ<０．０１、＊ ｐ<０．０５）。従って、リラキシン−３投与により脂肪蓄積を伴う肥満作用が亢進するとともに、インスリン量が増加することが明らかとなった。
［実施例１２］リラキシン−３持続投与による体重増加、運動量への作用
（１）リラキシン−３溶液の調製
ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）を生理食塩水にて１００μｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、ｖｅｈｉｃｌｅ（生理食塩水）またはヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）溶液を浸透圧ポンプ（ａｌｚｅｔ ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｕｍｐ ｍｏｄｅｌ１００２（ＤＵＲＥＣＴ社） 投与量 ６μＬ／日）とチューブ・投与用カニューレに注入しそれらを接続した。
（２）実験動物と脳室内投与のための処置
Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（５週齢、日本チャールズリバー社）に実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母社）を与え、個別飼育で５日間馴化した。前記ラット（１７０〜２００ｇ）を麻酔下で、側脳室にガイドカニューレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。手術日を０日として運動量の測定日以外は自由摂食・飲水下で飼育し、毎朝体重を測定した（図１１）。
前記実施例１１と同様に、投与後１日後からヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）投与ラット群では有意な体重の増加が確認された（ｔ−検定、＊＊ ｐ<０．０１、＊ ｐ<０．０５）。
（３）自発運動量の測定
前記（２）にて、ヒト型リラキシン−３（ペプチド研究所社製）投与ラットの体重増加作用に有意な差が認められた日の明期および暗期の自発運動量を、Ｖｅｒｓａｍａｘ（Ａｃｃｕｓｃａｎ社）を用いて測定した。明期（投与開始後２、７日後）、暗期（投与開始後３、８日後）のラットを実験開始の１時間以上前に個別飼育台から実験室へ移動して馴化した後、Ｖｅｒｓａｍａｘケージ内にラットを入れ直後から９０分間の行動量を記録した。９０分間の全活動量を図１２に示した。
いずれの日においても各群のラットで運動量には有意な変化は認められなかった。すなわち、リラキシン−３による体重増加作用は自発運動量の変化が作用しているのではないことが明らかとなった。
本発明により、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、当該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、当該スクリーニング用キット、あるいは当該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などが提供される。

Claims (52)

  1. リラキシン−３を含有してなる摂食亢進剤。
  2. リラキシン−３を含有してなる体重増加剤。
  3. リラキシン−３を含有してなる脂肪量増加剤。
  4. 次の工程；被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  5. 次の工程；
    リラキシン−３および被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  6. 次の工程；
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする請求項５に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  7. リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  8. ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項７に記載のスクリーニング方法。
  9. 次の工程；被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  10. 次の工程；
    リラキシン−３および被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  11. 次の工程；
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする請求項１０に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  12. リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
  13. ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１２に記載のスクリーニング用キット。
  14. リラキシン−３を含有してなる体重増加を必要とする疾患の治療剤。
  15. 疾患が拒食症または悪液質である請求項１４に記載の治療剤。
  16. 次の工程；被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  17. 次の工程；
    リラキシン−３および被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  18. 次の工程；
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする請求項１７に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  19. リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  20. ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項１９に記載のスクリーニング方法。
  21. 次の工程；被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  22. 次の工程；
    リラキシン−３および被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  23. 次の工程；
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする請求項２２に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  24. リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
  25. ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項２４に記載のスクリーニング用キット。
  26. 次の工程；被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  27. 次の工程；
    リラキシン−３および被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  28. 次の工程；
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする請求項２７に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  29. リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  30. ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項２９に記載のスクリーニング方法。
  31. 次の工程；被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  32. 次の工程；
    リラキシン−３および被験物質を、
    （Ａ）リラキシン−３受容体またはリラキシン−３受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
    を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  33. 次の工程；
    （Ｂ）リラキシン−３受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
    を含むことを特徴とする請求項３２に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  34. リラキシン−３受容体が、ＳＡＬＰＲまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
  35. ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項３４に記載のスクリーニング用キット。
  36. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する摂食抑制剤。
  37. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、請求項７または８に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項３６に記載の剤。
  38. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する体重減少剤。
  39. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、請求項１９または２０に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項３８に記載の剤。
  40. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する脂肪量減少剤。
  41. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、請求項２９または３０に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項４０に記載の剤。
  42. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する肥満治療剤。
  43. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、請求項１９、２０、２９または３０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項４２に記載の剤。
  44. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物を含有する糖尿病治療剤。
  45. ＳＡＬＰＲ阻害作用を有する化合物が、請求項１９、２０、２９または３０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項４４に記載の剤。
  46. ＳＡＬＰＲが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項３６〜４５のいずれか一項に記載の剤。
  47. リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の摂食量を測定する工程を含むことを特徴とする、摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  48. リラキシン−３受容体に作用する化合物が、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項４７に記載の方法。
  49. リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の体重を測定する工程を含むことを特徴とする、体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  50. リラキシン−３受容体に作用する化合物が、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項４９に記載の方法。
  51. リラキシン−３受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の肥満の指標を測定する工程を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  52. リラキシン−３受容体に作用する化合物が、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項５１に記載の方法。

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