JP2003174888A - 新規生理活性ペプチドおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規ペプチドおよびその用途の提供 【解決手段】新規ペプチドおよびそれをコードするＤＮ
Ａ、該ペプチドもしくはＤＮＡを含有してなる医薬、該
ペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング方法／スクリーニング用キット、該
スクリーニングによって得られる化合物またはその塩、
該化合物またはその塩を含有してなる医薬など。 【効果】本発明のペプチドおよびそれをコードするＤＮ
Ａは、例えば、消化器疾患などの診断、治療、予防など
に使用することができる。また、本発明のペプチドは、
それが結合し得るレセプタータンパク質の活性を促進も
しくは阻害する化合物またはその塩のスクリーニングの
ための試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、（i）配列番号：
８または配列番号：３７で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを
特徴とするペプチドまたはその塩、および（ii）オーフ
ァンレセプタータンパク質である配列番号：４７、配列
番号：５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番
号：６６もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸
配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るタンパク質またはその塩と、配列番号：８または配列
番号：３７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペ
プチドまたはその塩を用いることを特徴とする、消化器
疾患の予防・治療剤として有用な化合物またはその塩な
どのスクリーニング方法などに関する。

【０００２】

【従来の技術】生体のホメオスタシスの維持、生殖、個
体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消
化器系、代謝系の調節、感覚受容などの重要な機能調節
は、様々なホルモンや神経伝達物質のような内在性因子
あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこれらに対して生体
が備えている細胞膜に存在する特異的な受容体を介して
細胞が受容し、それに応じた反応をすることによって行
われている。このような機能調節に与るホルモンや神経
伝達物質の受容体の多くは guanine nucleotide-bindin
g protein（以下、Ｇタンパク質と略称する場合があ
る）と共役しており、このＧタンパク質の活性化によっ
て細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させる
ことを特徴とする。また、これらの受容体タンパク質は
共通して７個の膜貫通領域を有する。これらのことから
こうした受容体はＧタンパク質共役型受容体あるいは７
回膜貫通型受容体と総称される。このように生体機能の
調節には様々なホルモンや神経伝達物質およびそれに対
する受容体タンパク質が存在して相互作用し、重要な役
割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物
質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対する
受容体が存在するかどうかについてはいまだ不明なこと
が多い。近年、ヒトゲノムＤＮＡあるいは各種ヒト組織
由来のｃＤＮＡのランダムな配列決定による配列情報の
蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの
遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともな
い、機能未知のタンパクをコードすると予想される多く
の遺伝子の存在が明らかになっている。Ｇタンパク質共
役型受容体は、７個の膜貫通領域を有するのみでなくそ
の核酸あるいはアミノ酸に多くの共通配列が存在するた
めそのようなタンパクの中から明確にＧタンパク質共役
型受容体として区分することができる。一方でこうした
構造の類似性を利用したポリメラーゼ・チェーン・リア
クション（Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲ
と略称する）法によってもこうしたＧタンパク質共役型
受容体遺伝子が得られている。このようにしてこれまで
に得られたＧタンパク共役型受容体のうちには既知の受
容体との構造の相同性が高いサブタイプであって容易に
そのリガンドを予測することが可能な場合もあるが、ほ
とんどの場合その内在性リガンドは予測不能であり、こ
れらの受容体は対応するリガンドが見いだされていな
い。このことからこれらの受容体はオーファン受容体と
呼ばれている。このようなオーファン受容体の未同定の
内因性リガンドは、リガンドが知られていなかったため
に十分な解析がなされていなかった生物現象に関与して
いる可能性がある。そして、このようなリガンドが重要
な生理作用や病態と関連している場合には、その受容体
作動薬あるいは拮抗薬の開発が革新的な医薬品の創製に
結びつくことが期待される（Stadel, J. et al.、TiP
S、18巻、430-437頁、1997年、Marchese, A. et al.、T
iPS、20巻、370-375頁、1999年、Civelli, O. et al.、
Brain Res.、848巻、63-65頁、1999年）。しかし、これ
まで実際にオーファンＧタンパク質共役型受容体のリガ
ンドを同定した例はそれほど多くない。最近、幾つかの
グループによってこうしたオーファン受容体のリガンド
探索の試みがなされ、新たな生理活性ペプチドであるリ
ガンドの単離・構造決定が報告されている。Reinsheid
らおよびMeunierらは独立に、動物細胞にオーファンＧ
タンパク質共役型受容体LC132あるいはORL1をコードす
るcDNAを導入して受容体を発現させ、その応答を指標と
してorphanin FQあるいはnociceptinと名付けられた新
規ペプチドをブタ脳あるいはラット脳の抽出物より単離
し、配列を決定した（Reinsheid, R. K. et al.、Scien
ce、270巻、792-794頁、1995年、Meunier, J.-C. et a
l.、Nature、377巻、532-535頁、1995年）。このペプチ
ドは痛覚に関与していることが報告されたが、さらに、
受容体のノックアウトマウスの研究により記憶に関与し
ていることが明らかにされた（Manabe, T. et al.、Nat
ure、394巻、577-581頁、1998年）。その後これまでに
上記と同様な方法によりPrRP（prolactin releasing pe
ptide）、orexin、apelin、ghrelinおよびGALP（galani
n-like peptide）などの新規ペプチドがオーファンＧタ
ンパク質共役型受容体のリガンドとして単離された（Hi
numa, S. et al.、Nature、393巻、272-276頁、1998
年、Sakurai, T. et al.、Cell、92巻、573-585頁、199
8年、Tatemoto, K. et al.、Bichem. Biophys. Res. Co
mmun.、251巻、471-476頁、1998年、Kojima, M. et a
l.、Nature、402巻、656-660頁、1999年、Ohtaki, T. e
t al.、J. Biol. Chem.、274巻、37041-37045頁、1999
年）。一方、これまで明らかでなかった生理活性ペプチ
ドの受容体が同様な方法によって解明される場合もあ
る。腸管収縮に関与するmotilinの受容体がGPR38である
ことが明らかにされた（Feighner, S. D. et al.、Scie
nce、284巻、2184-2188頁、1999年）ほか、SLC-1がメラ
ニン凝集ホルモン（MCH）の受容体として同定され（Cha
mbers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999
年、Saito, Y. etal.、Nature、400巻、265-269頁、199
9年、Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res.
Commun.、261巻、622-626頁、1999年、Lembo, P. M. C.
et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999
年、Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524
頁、1999年）、またGPR14（SENR）がurotensin IIの受
容体であることが報告された（Ames, R. S. et al.、Na
ture、401巻、282-286頁、1999年、Mori, M. et al.、B
iochem. Biophys. Res. Commun.、265巻、123-129頁、1
999年、Nothacker, H.-P. et al.、Nature Cell Bio
l.、1巻、383-385頁、1999年、Liu, Q. et al.、Bioche
m. Biophys. Res. Commun.、266巻、174-178頁、1999
年）。MCHはそのノックアウトマウスが羸痩のphenotype
を示すことから肥満に関与することが示されていたが
（Shimada, M. et al.、Nature、396巻、670-674頁、19
98年）、その受容体が明らかにされたことにより抗肥満
薬としての可能性を有する受容体拮抗薬の探索が可能と
なった。また、urotensin IIはサルに静脈内投与するこ
とによって心虚血を惹起することから心循環系に強力な
作用を示すことも報告されている（Ames, R. S. et a
l.、Nature、401巻、282-286頁、1999年）。このよう
に、オーファン受容体およびそのリガンドは新たな生理
作用に関与する場合が多く、その解明は新たな医薬品開
発に結びつくことが期待される。しかし、オーファン受
容体のリガンド探索においては多くの困難さが伴い、こ
れまでに数多くのオーファン受容体の存在が明らかにさ
れながらそのリガンドが明らかにされた受容体はごく一
部に過ぎない。本発明者らは、オーファンＧタンパク質
共役型受容体である新規受容体ＺＡＱ（本願明細書の配
列番号：４７で表されるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質：以下、本
明細書において、単にＺＡＱと称する場合がある）を見
出したが、そのリガンドが何であるのかはこれまで不明
であった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】オーファンレセプター
タンパク質であるＺＡＱに対するリガンドの探索と、Ｚ
ＡＱおよびそのリガンドを用いることを特徴とする化合
物などのスクリーニング方法の確立が課題とされてい
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、以前、牛
乳抽出液中にＺＡＱ特異的なリガンド活性を有する物質
が存在することを見出し、該物質を分離後構造決定をお
こない、本活性成分のヒト型ペプチドをコードする遺伝
子を見出し、これを動物細胞に発現させたところ、培養
上清中にＺＡＱ発現細胞を活性化するペプチド性物質が
分泌されていることを確認した。さらに、鋭意研究を重
ねた結果、マウス型およびラット型ペプチド（マウス型
／ラット型ＺＡＱリガンド）をコードするｃＤＮＡを単
離し、その全塩基配列を解析することに成功した。かか
る知見に基づいて、ＺＡＱおよびマウス型／ラット型Ｚ
ＡＱリガンドを用いたスクリーニング系を用いて、ＺＡ
Ｑの介在する疾患の治療薬（ＺＡＱ拮抗薬または作動薬
など、具体的には消化器疾患の予防・治療薬など）のス
クリーニングができることを見出し、本発明を完成する
に至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）配列番号：８
もしくは配列番号：３７で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを
特徴とするペプチドまたはその塩、（２）配列番号：８
で表わされるアミノ酸配列を含有する前記（１）記載の
ペプチドまたはその塩、（３）配列番号：３７、配列番
号：３９または配列番号：４１で表わされるアミノ酸配
列を含有する前記（１）記載のペプチドまたはその塩、
（４）配列番号：６もしくは配列番号：３１で表わされ
るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配
列を含有することを特徴とする前記（１）記載のペプチ
ドまたはその塩、（５）配列番号：６で表わされるアミ
ノ酸配列を含有する前記（１）記載のペプチドまたはそ
の塩、（６）配列番号：３１、配列番号：３３または配
列番号：３５で表わされるアミノ酸配列を含有する前記
（１）記載のペプチドまたはその塩、（７）前記（１）
記載のペプチドの部分ペプチドまたはその塩、（８）前
記（１）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含有するポリヌクレオチド、（９）ＤＮＡである前記
（７）記載のポリヌクレオチド、（１０）配列番号：
９、配列番号：３８、配列番号：４０または配列番号：
４２で表される塩基配列を含有する前記（９）記載のＤ
ＮＡ、（１１）配列番号：７、配列番号：３２、配列番
号：３４または配列番号：３６で表される塩基配列を有
する前記（９）記載のＤＮＡ、（１２）前記（８）記載
のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、（１
３）前記（１２）記載の組換えベクターで形質転換され
た形質転換体、（１４）前記（１３）記載の形質転換体
を培養し、前記（１）記載のペプチドを生成・蓄積せし
めることを特徴とする前記（１）記載のペプチドまたは
その塩の製造法、（１５）前記（１）記載のペプチドも
しくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（１６）前記（１）記載のペプチドもしくはその部分ペ
プチドまたはその塩および配列番号：４７、配列番号：
５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６
６もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる
ことを特徴とする、前記（１）記載のペプチドまたはそ
の塩と配列番号：４７、配列番号：５６、配列番号：６
３、配列番号：６５、配列番号：６６もしくは配列番
号：６７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその
塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法、（１７）前記（１）記載のペプチドもし
くはその部分ペプチドまたはその塩および配列番号：４
７、配列番号：５６、配列番号：６３、配列番号：６
５、配列番号：６６もしくは配列番号：６７で表わされ
るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配
列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩を含有することを特徴とする、前記（１）記載
のペプチドまたはその塩と配列番号：４７、配列番号：
５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６
６もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング用キット、（１８）前記（１
６）記載のスクリーニング方法または前記（１１）記載
のスクリーニング用キットを用いて得られる、前記
（１）記載のペプチドまたはその塩と配列番号：４７、
配列番号：５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配
列番号：６６もしくは配列番号：６７で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる
化合物またはその塩、（１９）前記（１８）記載の化合
物またはその塩を含有してなる医薬、（２０）消化器疾
患の予防・（及び／又は）治療剤である前記（１９）記
載の医薬、（２１）前記（１５）記載の抗体を含有して
なる診断薬、（２２）消化器疾患の診断薬である前記
（２１）記載の診断薬、（２３）外来性の、前記（９）
記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有する非ヒト哺
乳動物、（２４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である前
記（２３）記載の動物、（２５）ゲッ歯動物がマウスま
たはラットである前記（２４）記載の動物、（２６）外
来性の、前記（９）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡ
を含有し、非ヒト哺乳動物において発現しうる組換えベ
クター、（２７）前記（９）記載のＤＮＡが不活性化さ
れた非ヒト哺乳動物胚幹細胞、（２８）ＤＮＡがレポー
ター遺伝子を導入することにより不活性化された前記
（２７）記載の胚幹細胞、（２９）非ヒト哺乳動物がゲ
ッ歯動物である前記（２７）記載の胚幹細胞、（３０）
ゲッ歯動物がマウスである前記（２９）記載の胚幹細
胞、（３１）前記（９）記載のＤＮＡが不活性化された
該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（３２）ＤＮＡがレ
ポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該
レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの制御下で発現しうる前記（３１）記載の非ヒト哺乳
動物、（３３）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である前記
（３１）記載の非ヒト哺乳動物、（３４）ゲッ歯動物が
マウスである前記（３３）記載の動物、（３５）前記
（３２）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポータ
ー遺伝子の発現を検出することを特徴とする前記（９）
記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻
害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（３
６）哺乳動物に対し、前記（１８）記載の化合物または
その塩の有効量を投与することを特徴とする消化器疾患
の予防・（及び／又は）治療方法、（３７）消化器疾患
予防・（及び／又は）治療剤を製造するための、前記
（１８）記載の化合物またはその塩の使用などを提供す
るものである。

【０００６】さらには、本発明は、（３８）配列番号：
８または配列番号：３７で表されるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：８または配列番
号：３７で表されるアミノ酸配列と９５％以上（好まし
くは約９７％以上、さらに好ましくは約９９％以上）の
相同性を有するアミノ酸配列である前記（１）記載のペ
プチドまたはその塩、（３９）配列番号：８または配列
番号：３７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列が、（i）配列番号：８または配列番号：３
７で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ま
しくは１〜４個、より好ましくは１〜２個程度）のアミ
ノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：８また
は配列番号：３７で表されるアミノ酸配列に１または２
個以上（好ましくは、１〜４０個程度、より好ましくは
１〜３０個程度、なかでも好ましくは１〜２０個程度）
のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番
号：８または配列番号：３７で表されるアミノ酸配列中
の１または２個以上（好ましくは、１〜４個）のアミノ
酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または
（iv）それらを組み合わせたアミノ酸配列である前記
（１）記載のペプチドまたはその塩、（４０）配列番
号：３７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列が、配列番号：３９または配列番号：４１で表
されるアミノ酸配列である前記（１）記載のペプチドま
たはその塩、

【０００７】（４１）（ｉ）前記（１）記載のペプチド
もしくはその部分ペプチドまたはその塩を配列番号：４
７、配列番号：５６、配列番号：６３、配列番号：６
５、配列番号：６６もしくは配列番号：６７で表わされ
るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配
列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩に接触させた場合と、（ii）前記（１）記載の
ペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩および
試験化合物を配列番号：４７、配列番号：５６、配列番
号：６３、配列番号：６５、配列番号：６６もしくは配
列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と同一または実
質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしく
はその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合にお
ける、標識した前記（１）記載のペプチドもしくはその
部分ペプチドまたはその塩の配列番号：４７、配列番
号：５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番
号：６６もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸
配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に
対する結合量を測定し、比較することを特徴とする前記
（１）記載のペプチドまたはその塩と配列番号：４７、
配列番号：５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配
列番号：６６もしくは配列番号：６７で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる
化合物またはその塩のスクリーニング方法、（４２）
（ｉ）前記（１）記載のペプチドもしくはその部分ペプ
チドまたはその塩を配列番号：４７、配列番号：５６、
配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６６もし
くは配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質
またはその部分ペプチドもしくはその塩を含有する細胞
または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（ii）前記
（１）記載のペプチドもしくはその部分ペプチドまたは
その塩および試験化合物を配列番号：４７、配列番号：
５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６
６もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質またはその部分ペプチドもしくはその塩を含有す
る細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合におけ
る、標識した前記（１）記載のペプチドもしくはその部
分ペプチドまたはその塩の該細胞に対する結合量を測定
し、比較することを特徴とする前記（１）記載のペプチ
ドまたはその塩と配列番号：４７、配列番号：５６、配
列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６６もしく
は配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質ま
たはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩
のスクリーニング方法、

【０００８】（４３）配列番号：４７、配列番号：５
６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６６
もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質またはその部分ペプチドもしくはその塩が、該タン
パク質またはその部分ペプチドもしくはその塩をコード
するＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっ
て細胞膜上に発現したタンパク質またはその部分ペプチ
ドもしくはその塩である前記（４２）記載のスクリーニ
ング方法、（４４）前記（１）記載のペプチドもしくは
その部分ペプチドまたはその塩が、標識した前記（１）
記載のペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩
である前記（４１）〜（４３）記載のスクリーニング方
法、（４５）前記（４０）〜（４４）記載のスクリーニ
ング方法で得られる、前記（１）記載のペプチドまたは
その塩と配列番号：４７、配列番号：５６、配列番号：
６３、配列番号：６５、配列番号：６６もしくは配列番
号：６７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその
塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、（４
６）前記（４５）記載の化合物またはその塩を含有する
医薬、

【０００９】（４７）配列番号：４７、配列番号：５
６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６６
もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質を含有する細胞を含有することを特徴とする前記
（１７）記載のスクリーニング用キット、（４８）配列
番号：４７、配列番号：５６、配列番号：６３、配列番
号：６５、配列番号：６６もしくは配列番号：６７で表
わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞の膜画分
を含有することを特徴とする前記（１７）記載のスクリ
ーニング用キット、（４９）配列番号：４７、配列番
号：５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番
号：６６もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸
配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含
有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を培
養することによって該形質転換体の細胞膜に発現したタ
ンパク質を含有することを特徴とする前記（１７）記載
のスクリーニング用キット、（５０）前記（４７）〜
（４９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
る、前記（１）記載のペプチドまたはその塩と配列番
号：４７、配列番号：５６、配列番号：６３、配列番
号：６５、配列番号：６６もしくは配列番号：６７で表
わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性
を変化させる化合物またはその塩、（５１）前記（５
０）記載の化合物またはその塩を含有する医薬、

【００１０】（５２）前記（１５）記載の抗体と、前記
（１）記載のペプチドまたはその塩とを接触させること
を特徴とする、前記（１）記載のペプチドまたはその塩
の定量法、（５３）前記（１５）記載の抗体と、被検液
および標識化された前記（１）記載のペプチドまたはそ
の塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化さ
れた前記（１）記載のペプチドまたはその塩の割合を測
定することを特徴とする被検液中の前記（１）記載のペ
プチドまたはその塩の定量法、（５４）被検液と担体上
に不溶化した前記（１５）記載の抗体および標識化され
た前記（１５）記載の抗体とを同時または連続的に反応
させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定するこ
とを特徴とする被検液中の前記（１）記載のペプチドま
たはその塩の定量法、（５５）前記（９）記載のＤＮＡ
とハイストリンジェントな条件でハイブリダイズするポ
リヌクレオチド、（５６）前記（９）記載のＤＮＡの塩
基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有するポ
リヌクレオチド、（５７）配列番号：７または配列番
号：３２で表される塩基配列と相補的な塩基配列または
その一部を含有する前記（５６）記載のポリヌクレオチ
ド、（５８）前記（８）、（５５）、（５６）及び（５
７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する医
薬などを提供する。

【００１１】

【発明の実施の形態】配列番号：８もしくは配列番号：
３７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同
一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド
またはその塩（以下、「本発明のペプチド」と略記する
ことがある）は、配列番号：４７、配列番号：５６、配
列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６６もしく
は配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質ま
たはその塩（以下、「本発明のタンパク質」と略記する
ことがある）と結合する能力を有するペプチドまたはそ
の塩であり、本発明のタンパク質またはその塩と結合
し、活性化する能力を有するペプチドまたはその塩であ
る。本発明のペプチドは、配列番号：８もしくは配列番
号：３７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的
に同一のアミノ酸配列を含有し、本発明のタンパク質と
結合し、その機能を活性化する能力を有することを特徴
とするペプチドまたはその塩である。本発明のペプチド
の本発明のタンパク質と結合する能力および本発明のタ
ンパク質活性化する能力は後述の方法により測定するこ
とができる。

【００１２】本発明のペプチドは、例えば、ヒトや非ヒ
ト哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウ
サギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）（好ましくはラ
ット、マウスなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、
神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサン
ギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細
胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細
胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、
ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、
好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細
胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間
質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは
ガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が
存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、
嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視
床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭
葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、
膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血
管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前
立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格
筋など（特に、脳や脳の各部位）に由来するペプチドで
あってもよく、また合成ペプチドであってもよい。本発
明のペプチドがシグナル配列を有している場合は該ペプ
チドを効率良く細胞外に分泌させることができる。

【００１３】配列番号：８または配列番号：３７で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし
ては、例えば、配列番号：８または配列番号：３７で表
されるアミノ酸配列と９５％以上（好ましくは約９７％
以上、さらに好ましくは約９９％以上）の相同性を有す
るアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：８または
配列番号：３７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例え
ば、配列番号：８または配列番号：３７で表わされるア
ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配
列番号：８または配列番号：３７で表わされるアミノ酸
配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペ
プチドなどが好ましい。配列番号：３７で表わされるア
ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペ
プチドとして具体的には、配列番号：３９で表されるア
ミノ酸配列を含有するペプチド、配列番号：４１で表さ
れるアミノ酸配列を含有するペプチドなどが挙げられ
る。以下、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有
するペプチドをマウス型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチ
ド、配列番号：３７、配列番号：３９または配列番号：
４１で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをラッ
ト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドと記載することがあ
る。

【００１４】配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプ
チドとしては、例えば、配列番号：８で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有し、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有する
ペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが
好ましく、具体的には配列番号：８または配列番号：６
で表わされるアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げら
れる。配列番号：３７で表わされるアミノ酸配列と同一
または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド
としては、例えば、配列番号：３７で表わされるアミノ
酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有
し、配列番号：３７で表わされるアミノ酸配列を有する
ペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが
好ましく、具体的には配列番号：３１、配列番号：３
３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９
または配列番号：４１で表わされるアミノ酸配列を有す
るペプチド等が挙げられる。以下、配列番号：６で表わ
されるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス型ＺＡＱ
リガンド前駆体ペプチドと記載することがある。以下、
配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５
で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをラット型
ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドと記載することがある。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のタンパ
ク質に対する結合活性、本発明のタンパク質を介するシ
グナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質と
は、それらの活性が性質的に同質であることを示す。し
たがって、本発明のタンパク質に対する結合活性、本発
明のタンパク質を介するシグナル情報伝達作用などの活
性が同等（例、約０．５〜２倍）であることが好ましい
が、これらの活性の程度やペプチドの分子量などの量的
要素は異なっていてもよい。これらの活性の測定は、公
知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後述
するスクリーニング方法などに従って測定することがで
きる。本発明のペプチドの具体例としては、例えば、配
列番号：８で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス
由来のペプチド、配列番号：３７、配列番号：３９また
は配列番号：４１で表わされるアミノ酸配列を含有する
ラット由来のペプチドなどがあげられる。

【００１５】また、本発明のペプチドとしては、（i）
配列番号：８または配列番号：３７で表されるアミノ酸
配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程
度、より好ましくは１〜２０個程度）のアミノ酸が欠失
したアミノ酸配列、（ii）配列番号：８または配列番
号：３７で表されるアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、１〜４０個程度、より好ましくは１〜３
０個程度、なかでも好ましくは１〜２０個程度）のアミ
ノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：８ま
たは配列番号：３７で表されるアミノ酸配列中の１また
は２個以上（好ましくは、１〜４個）のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（iv）それ
らを組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドなど
も用いられる。本発明のペプチドの部分ペプチドとして
は、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることの
できるものであれば、いかなるものであってもよく、本
発明のペプチドと実質的に同質の活性を有していればよ
い。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のペプチ
ドの構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好
ましくは２０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドな
どが好ましい。ここで、「実質的に同質の活性」とは、
上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は
上記と同様に行なうことができる。該部分ペプチドは、
（i）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好まし
くは数個（１〜４個））のアミノ酸が欠失し、（ii）上
記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜
２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好
ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、また
は（iii）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好
ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が他のアミノ酸
で置換されていてもよい。以下、本発明のペプチドとの
本発明のペプチドの部分ペプチドとをまとめて本発明の
ペプチドと称することがある。

【００１６】本発明のタンパク質は、例えば、ヒトや哺
乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサ
ギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞
（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細
胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細
胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維
細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファー
ジ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細
胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜
細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細
胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆
細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞
（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，Ｗ
ＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，Ｍ
Ｌ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１
０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，
ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵ
Ｔ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−
１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ
−０１など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる
組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大
脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮
質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状
核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝
臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋
肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸
腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、
精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など（特
に、脳や脳の各部位）に由来するタンパク質であっても
よく、また合成タンパク質であってもよい。本発明の蛋
白質がシグナル配列を有している場合は該ペプチドまた
はタンパク質を効率良く細胞外に分泌させることができ
る。本発明のタンパク質（Ｇタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質）として、好ましくは、配列番号：４７で
表わされるアミノ酸配列（図１〜図３または図４〜図６
中のアミノ酸配列）と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するレセプタータンパク質などが用いら
れる。

【００１７】配列番号：４７で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列
番号：４７で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、
好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上
の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列
番号：４７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列を有するタンパク質としては、例えば、配
列番号：４７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一
のアミノ酸配列を有し、配列番号：４７で表わされるア
ミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を
有するタンパク質などが好ましい。配列番号：４７で表
わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列
番号：４７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４７で表
わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタ
ンパク質などが好ましい。実質的に同質の活性として
は、例えば、本発明のペプチドに対する結合活性、シグ
ナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質と
は、それらの活性が性質的に同質であることを示す。し
たがって、本発明のペプチドに対する結合活性やシグナ
ル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．５〜２
倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタ
ンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。本発明のペプチドに対する結合活性やシグナル情報
伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行な
うことができる。以下、配列番号：４７で表わされるア
ミノ酸配列を有するタンパク質をＺＡＱと記載すること
がある。

【００１８】配列番号：５６で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列
番号：５６で表わされるアミノ酸配列と約９７％以上、
好ましくは約９８％以上、より好ましくは約９９％以
上、最も好ましくは約９９．５％以上の相同性を有する
アミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：５６で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有
するタンパク質としては、例えば、配列番号：５６で表
わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
有し、配列番号：５６で表わされるアミノ酸配列を有す
るタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質
などが好ましい。配列番号：５６で表わされるアミノ酸
配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るタンパク質としては、例えば、配列番号：５６で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有し、配列番号：５６で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好
ましい。配列番号：６３で表わされるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番
号：６３で表わされるアミノ酸配列と約９５％以上、好
ましくは約９６％以上、より好ましくは約９７％以上、
最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸
配列などが挙げられる。配列番号：６３で表わされるア
ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタン
パク質としては、例えば、配列番号：６３で表わされる
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配
列番号：６３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好
ましい。配列番号：６３で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質としては、例えば、配列番号：６３で表わされるア
ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を
含有し、配列番号：６３で表わされるアミノ酸配列と実
質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：６５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：６５で
表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約
９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有
するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：６５で
表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を有するタンパク質としては、例えば、配列番号：６５
で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
列を有し、配列番号：６５で表わされるアミノ酸配列を
有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパ
ク質などが好ましい。配列番号：６５で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するタンパク質としては、例えば、配列番号：６５で
表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有し、配列番号：６５で表わされるアミ
ノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質など
が好ましく、具体的にはＷＯ ９８／４６６２０に記載
のタンパク質などが挙げられる。配列番号：６６で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし
ては、例えば、配列番号：６６で表わされるアミノ酸配
列と約９５％以上、好ましくは約９６％以上、より好ま
しくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上の相
同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番
号：６６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列を有するタンパク質としては、例えば、配列
番号：６６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列を有し、配列番号：６６で表わされるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有
するタンパク質などが好ましい。配列番号：６６で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番
号：６６で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的
に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：６６で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタン
パク質などが好ましく、具体的には、Biochem. Biophy
s. Acta, 1491巻, 369-375頁, 2000年に記載のタンパク
質などが挙げられる。配列番号：６７で表わされるアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例え
ば、配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と約９５
％以上、好ましくは約９６％以上、より好ましくは約９
７％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有す
るアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：６７で表
わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
有するタンパク質としては、例えば、配列番号：６７で
表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を有し、配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有
するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク
質などが好ましい。配列番号：６７で表わされるアミノ
酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するタンパク質としては、例えば、配列番号：６７で表
わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有し、配列番号：６７で表わされるアミノ
酸配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが
好ましく、具体的にはＷＯ ９８／４６６２０に記載の
タンパク質などが挙げられる。実質的に同質の活性とし
ては、例えば、本発明のペプチドに対する結合活性、シ
グナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質と
は、それらの活性が性質的に同質であることを示す。し
たがって、本発明のペプチドに対する結合活性やシグナ
ル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．５〜２
倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタ
ンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。本発明のペプチドに対する結合活性やシグナル情報
伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行な
うことができる。また、本発明のタンパク質としては、
（i）配列番号：４７、配列番号：５６、配列番号：６
３、配列番号：６５、配列番号：６６または配列番号：
６７で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））の
アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：４
７、配列番号：５６、配列番号：６３、配列番号：６
５、配列番号：６６または配列番号：６７で表わされる
アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３
０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ま
しくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列、（iii）配列番号：４７、配列番号：５
６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６６
または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列中の１
または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好
ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１ま
たは２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたア
ミノ酸配列、または（iv）それらを組み合わせたアミノ
酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。本発明
のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：４
７または配列番号：６５で表わされるアミノ酸配列を含
有するヒト由来（より好ましくはヒト脳由来）のタンパ
ク質、配列番号：６２または配列番号：６３で表わされ
るアミノ酸配列を含有するラット由来のタンパク質、配
列番号：６６または配列番号：６７で表わされるアミノ
酸配列を含有するマウス由来のタンパク質などがあげら
れる。

【００１９】本明細書におけるペプチドおよびタンパク
質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミ
ノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
配列番号：４７で表わされるアミノ酸配列を含有するタ
ンパク質をはじめとする本発明のタンパク質は、Ｃ末端
がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート
(−ＣＯＯ^-）、アミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル
（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけ
るＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アル
キル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなど
のＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナ
フチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベンジル、フ
ェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基もしくはα
−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキル
基などのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステルと
して汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いら
れる。本発明のペプチドおよび本発明のタンパク質（以
下、「本発明のペプチド・タンパク質」と略す場合があ
る）がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシ
レート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化
またはエステル化されているものも本発明ペプチド・タ
ンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例
えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さら
に、本発明のペプチド・タンパク質には、上記したペプ
チド・タンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基の
アミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基な
どのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で
保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成し
たグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内
のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−Ｓ
Ｈ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニ
ジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、ア
セチル基などのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル
基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合し
たいわゆる糖ペプチド・糖タンパク質などの複合ペプチ
ド・複合タンパク質なども含まれる。

【００２０】本発明のタンパク質の部分ペプチド（以
下、「本発明の部分ペプチド」と略記する場合がある）
としては、本発明のタンパク質の部分ペプチドであれば
何れのものであってもよいが、例えば、本発明のタンパ
ク質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であっ
て、実質的に同質のリガンド結合活性を有するものなど
が用いられる。具体例としては、配列番号：４７で表わ
されるアミノ酸配列を有するタンパク質の部分ペプチド
としては、図７で示される疎水性プロット解析において
細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分
析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hy
drophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いる
ことができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも
用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチ
ドでも良い。本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、
前記した本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち
少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好
ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチド
などが好ましい。実質的に同一のアミノ酸配列とは、こ
れらアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約７０％
以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは
約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を
有するアミノ酸配列を示す。ここで、「実質的に同質の
リガンド結合活性」とは、前記と同意義を示す。「実質
的に同質のリガンド結合活性」の測定は公知の方法に準
じて行なうことができる。

【００２１】また、本発明の部分ペプチドは、配列番
号：４７、配列番号：５６、配列番号：６３、配列番
号：６５、配列番号：６６または配列番号：６７で表わ
されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または
２個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配
列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、
より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個
（１または２個））のアミノ酸が付加し、または、その
アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜
１０個程度、より好ましくは１〜５個程度、さらに好ま
しくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ
酸で置換されていてもよい。また、本発明の部分ペプチ
ドはＣ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボ
キシレート（−ＣＯＯ^-）、アミド（−ＣＯＮＨ₂）また
はエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。本発明の部
分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカル
ボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がア
ミド化またはエステル化されているものも本発明の部分
ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例
えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さら
に、本発明の部分ペプチドには、本発明のタンパク質と
同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で
保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成し
たＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミ
ノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されている
もの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなど
の複合ペプチドなども含まれる。

【００２２】本発明のペプチドまたは本発明のタンパク
質もしくはその部分ペプチドの塩としては、とりわけ生
理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩と
しては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水
素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、
ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク
酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メ
タンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用
いられる。

【００２３】本発明のペプチド及び本発明のタンパク質
は、前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から公知
のペプチド・タンパク質の精製方法によって製造するこ
ともできるし、例えば後述する本発明のペプチド、配列
番号：４７、配列番号：５６または配列番号：６３で表
されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養する方法またはこれに
準じた方法によっても製造することができる。また、後
述のペプチド・タンパク質合成法またはこれに準じて製
造することもできる。さらに、配列番号：６６で表され
るアミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩は、Bi
ochem. Biophys. Acta, 1491巻, 369-375頁, 2000年に
記載の方法に準じて製造できる。配列番号：６５または
配列番号：６７で表されるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質またはその塩は、ＷＯ ９８／４６６２０に記載の
方法に準じて製造できる。ヒトや哺乳動物の組織または
細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細
胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽
出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせること
により精製単離することができる。

【００２４】本発明のペプチドまたは本発明のタンパク
質もしくはその部分ペプチドまたはそれらのアミド体ま
たはそれらの塩の合成には、通常市販のペプチド・タン
パク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹
脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメ
チル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹
脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−
メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒ
ドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹
脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２'，４'−ジメト
キシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４
−（２'，４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエ
チル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。この
ような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に
保護したアミノ酸を、目的とするペプチド・タンパク質
の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮
合させる。反応の最後に樹脂からペプチド・タンパク質
を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈
溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目
的のペプチド・タンパク質またはそれらのアミド体を取
得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプ
チド・タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用
いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。
カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソ
プロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジ
メチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられ
る。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例え
ば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直
接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢ
ｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじ
め保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加する
ことができる。

【００２５】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、ペプチド・タンパク質縮合反応
に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択され
うる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ
−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの
酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲ
ン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコ
ール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、
ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエー
テル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニト
リル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類ある
いはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度
はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ
ている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃
の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導
体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン
反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保
護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことによ
り十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返して
も十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはア
セチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル
化することができる。

【００２６】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシ
ャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの
直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、ア
ラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−
ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステ
ル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護
することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステ
ル化またはエーテル化によって保護することができる。
このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル
基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロ
イル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボ
ニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。
また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジ
ル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジ
ル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕ
ｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。

【００２７】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチ
オール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオ
ン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミ
ダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェ
ニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプト
ファンのインドール保護基として用いられるホルミル基
は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジ
チオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希
水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカ
リ処理によっても除去される。

【００２８】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。ペプチド・タンパク質のアミド体
を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末
端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護し
た後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばし
た後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基の
みを除いたペプチド・タンパク質とＣ末端のカルボキシ
ル基の保護基のみを除去したペプチド・タンパク質とを
製造し、この両ペプチド・両タンパク質を上記したよう
な混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については
上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチド・
保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての
保護基を除去し、所望の粗ペプチド・粗タンパク質を得
ることができる。この粗ペプチド・粗タンパク質は既知
の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥
することで所望のペプチド・タンパク質のアミド体を得
ることができる。ペプチド・タンパク質のエステル体を
得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カル
ボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エス
テルとした後、ペプチド・タンパク質のアミド体と同様
にして、所望のペプチド・タンパク質のエステル体を得
ることができる。

【００２９】本発明のペプチド及び本発明のタンパク質
は、公知のペプチドの合成法に従って製造することがで
きる。また、本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは
本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明のペプチドもしくは本発
明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドまたはアミノ
酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場
合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造
することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離とし
ては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法が
挙げられる。 （i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シ
ンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publish
ers, New York (1966年) （ii）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Pepti
de), Academic Press, New York (1965年) （iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善
(株) （1975年） （iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、
タンパク質の化学IV、 205、(1977年) （v）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド
合成 広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチド、本発
明のタンパク質またはその部分ペプチドを精製単離する
ことができる。上記方法で得られるペプチド、タンパク
質または部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方
法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩
で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換す
ることができる。

【００３０】本発明のペプチドまたは本発明のタンパク
質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本
発明のペプチドまたは本発明のタンパク質をコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲ
ノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤ
ＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライ
ブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、
プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであっ
てもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ
ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅する
こともできる。

【００３１】具体的には、本発明の配列番号：８で表さ
れるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮ
Ａとしては、例えば、配列番号：９で表わされる塩基配
列を含有するＤＮＡ、または配列番号：９で表わされる
塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするＤＮＡを含有し、本発明のペプ
チドと実質的に同質の活性（例、本発明のタンパク質に
対する結合活性、本発明のタンパク質を介するシグナル
情報伝達作用など）を有するペプチドをコードするＤＮ
Ａであれば何れのものでもよい。配列番号：９で表わさ
れる塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：９
または配列番号：７で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡ等が挙げられる。配列番号：９で表わされる塩基配
列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
９で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは約９
７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有す
る塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。具体的
には、本発明の配列番号：３７、配列番号：３９または
配列番号：４１で表されるアミノ酸配列を有するペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３
８、配列番号：４０または配列番号：４２で表わされる
塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３８、配
列番号：４０または配列番号：４２で表わされる塩基配
列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするＤＮＡを有し、本発明のペプチドと実
質的に同質の活性（例、本発明のタンパク質に対する結
合活性、本発明のタンパク質を介するシグナル情報伝達
作用など）を有するペプチドをコードするＤＮＡであれ
ば何れのものでもよい。配列番号：３８、配列番号：４
０または配列番号：４２で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡとしては、配列番号：３２、配列番号：３４、
配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０また
は配列番号：４２で表わされる塩基配列を含有するＤＮ
Ａ等が挙げられる。配列番号：３８、配列番号：４０ま
たは配列番号：４２で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３８、配列番
号：４０または配列番号：４２で表わされる塩基配列と
９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは
約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮ
Ａなどが用いられる。

【００３２】配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を
含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：４５または配列番号：４６で表わされる
塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４５また
は配列番号：４６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ＤＮＡを有し、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列
を有するタンパク質と実質的に同質の活性（例、本発明
のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用な
ど）を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何
れのものでもよい。配列番号：４５または配列番号：４
６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：４５または配列番号：４６で表
わされる塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％
以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩
基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：
５６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５５で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：
５５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有
し、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチド
に対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのもので
もよい。配列番号：５５で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５５で表
わされる塩基配列と約９７％以上、好ましくは約９８％
以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩
基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：
６３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６２で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：
６２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有
し、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチド
に対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのもので
もよい。配列番号：６２で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６２で表
わされる塩基配列と約９５％以上、好ましくは約９７％
以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩
基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：
６５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６８で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：
６８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有
し、配列番号：６８で表されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチド
に対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのもので
もよい。配列番号：６８で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６８で表
わされる塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％
以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩
基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：
６６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６９で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：
６９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有
し、配列番号：６９で表されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチド
に対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのもので
もよい。配列番号：６９で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６９で表
わされる塩基配列と約９５％以上、好ましくは約９７％
以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩
基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：
６７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７０で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：
７０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有
し、配列番号：７０で表されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチド
に対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのもので
もよい。配列番号：７０で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７０で表
わされる塩基配列と約９５％以上、好ましくは約９７％
以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩
基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００３３】ハイブリダイゼーションは、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）２ｎｄ（J. Sambrook e
t al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載
の方法などに従って行なうことができる。また、市販の
ライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載
の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、
ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができ
る。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリ
ウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０
ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６
５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ
で温度が約６５℃の場合が最も好ましい。

【００３４】より具体的には、配列番号：８で表わされ
るアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：９で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡがあげられ、配列番号：６で表わされるアミノ
酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列番号：７で表わされる塩基配列を含有するＤＮ
Ａがあげられ、配列番号：３７で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：３８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡが
あげられ、配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列を
含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号：４０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあげ
られ、配列番号：４１で表わされるアミノ酸配列を含有
するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：
４２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあげら
れ、配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列を含有す
るペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３
２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、
配列番号：３３で表わされるアミノ酸配列を含有するペ
プチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３４で
表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列
番号：３５で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３６で表わ
される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられる。また、
配列番号：４７で表わされるアミノ酸配列を含有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４５
または配列番号：４６で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡがあげられ、配列番号５６：で表わされるアミノ
酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：５５で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡがあげられ、配列番号６３：で表わされるアミノ酸
配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：６２で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡがあげられ、配列番号：６５で表わされるアミノ酸
配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：６８で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡがあげられ、配列番号：６６で表わされるアミノ酸
配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：６９で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡがあげられ、配列番号：６７で表わされるアミノ酸
配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：７０で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡがあげられる。

【００３５】本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩
基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有してな
るヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）とは、本発明の
ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、
ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。本発明に従え
ば、本発明のペプチドの遺伝子の複製又は発現を阻害す
ることのできるアンチセンス・（オリゴ）ヌクレオチド
（核酸）を、クローン化したあるいは決定されたペプチ
ドをコードするＤＮＡの塩基配列の塩基配列情報に基づ
き設計し、合成しうる。そうした（オリゴ）ヌクレオチ
ド（核酸）は、本発明のペプチドの遺伝子のＲＮＡとハ
イブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成又は機能
を阻害することができるか、あるいは本発明のペプチド
関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のペプチドの遺
伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のペ
プチド関連ＲＮＡの選択された配列に相補的な（オリ
ゴ）ヌクレオチド、及び本発明のペプチド関連ＲＮＡと
特異的にハイブリダイズすることができる（オリゴ）ヌ
クレオチドは、生体内及び生体外で本発明のペプチドの
遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病
気などの治療又は診断に有用である。用語「対応する」
とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列又は核酸
の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であるこ
とを意味する。ヌクレオチド、塩基配列又は核酸とペプ
チドとの間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）
の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチ
ドのアミノ酸を通常指している。本発明のペプチドの遺
伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・
リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コ
ドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、
３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、及び
３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択し
うるが、本発明のペプチドの遺伝子内の如何なる領域も
対象として選択しうる。

【００３６】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的な（オリゴ）ヌクレオチドとの関係は、対象物と
ハイブリダイズすることができる（オリゴ）ヌクレオチ
ドとの関係は、「アンチセンス」であるということがで
きる。アンチセンス・（オリゴ）ヌクレオチドは、２−
デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌ
クレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシ
ヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコ
シドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるい
は非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例え
ば、市販のタンパク質核酸及び合成配列特異的な核酸ポ
リマー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー
（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるよ
うな塩基のペアリナグや塩基の付着を許容する配置をも
つヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それら
は、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本
鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであるこ
とができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オ
リゴヌクレオチド、さらには公知の修飾の付加されたも
の、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャッ
プの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然
のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレ
オチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、
メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルア
ミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有す
る結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタ
ンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビタ
ー、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リ
ジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）など
の側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物
（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、
キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、
ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル
化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例え
ば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで
「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」と
は、プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、
修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含
んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリ
ン及びピリミジン、アシル化されたプリン及びピリミジ
ン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。
修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドは
また糖部分が修飾されていてよく、例えば１個以上の水
酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていた
り、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換され
ていてよい。

【００３７】本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ、あるいは修飾された核酸である。修飾された核酸
の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート
誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレ
オシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、そ
れに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核
酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわ
ち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにす
る、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標
とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにす
る、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性
をより小さなものにする。こうして修飾は当該分野で数
多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,Pharm
Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395,
1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research
and Applications, CRC Press, 1993 などに開示があ
る。本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられた
り、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リ
ポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与さ
れたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形
態で与えられることができうる。こうして付加形態で用
いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和する
ように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜
との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめる
ような脂質（例えば、ホスホリピッド、コレステロール
など）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに
好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体
（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸な
ど）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端ある
いは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内
ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。
その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特
異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアー
ゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止す
るためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基と
しては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリ
コールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知ら
れた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定される
ものではない。アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明
の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現
系、あるいはタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用
いて調べることができる。該核酸それ公知の各種の方法
で細胞に適用できる。

【００３８】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reactionによって増
幅することもできる。具体的には、本発明の部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４
５または配列番号：４６で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（ii）
配列番号：４５または配列番号：４６で表わされる塩基
配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするＤＮＡを有し、本発明のタンパク質
と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナ
ル情報伝達作用など）を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：４５または配列番号：４６で表わされる
塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列
番号：４５または配列番号：４６で表わされる塩基配列
と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好まし
くは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有する
ＤＮＡなどが用いられる。さらに本発明の部分ペプチド
をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５
５、配列番号：６２、配列番号：６８、配列番号：６９
または配列番号：７０で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（ii）配
列番号：５５、配列番号：６２、配列番号：６８、配列
番号：６９または配列番号：７０で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡを有し、本発明のタンパク質と実
質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情
報伝達作用など）を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配
列番号：５５、配列番号：６２、配列番号：６８、配列
番号：６９または配列番号：７０で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５
５、配列番号：６２、配列番号：６８、配列番号：６９
または配列番号：７０で表わされる塩基配列と約９０％
以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８
％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなど
が用いられる。

【００３９】本発明のペプチドを完全にコードするＤＮ
Ａのクローニングの手段としては、本発明のペプチドを
コードするＤＮＡの塩基配列の部分塩基配列を有する合
成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅する
か、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明
のペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断
片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブ
リダイゼーションによって選別することができる。ハイ
ブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２ｎｄ（J. Sambro
ok et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に
記載の方法などに従って行なうことができる。また、市
販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に
記載の方法に従って行なうことができる。本発明のタン
パク質またはその部分ペプチド（以下、本発明のタンパ
ク質と略記する）を完全にコードするＤＮＡのクローニ
ングも本発明のペプチドを完全にコードするＤＮＡのク
ローニングと同様にして行うことができる。

【００４０】ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、Mutan^TM-superExpress Km（宝酒造
（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA
-LAPCR法、Gupped duplex法、Kunkel法等の公知の方法
あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができ
る。クローン化されたペプチド・タンパク質をコードす
るＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限
酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用する
ことができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コ
ドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終
止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有して
いてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
は、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加すること
もできる。本発明のペプチドおよび本発明のタンパク質
の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のペプチドお
よび本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的と
するＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当
な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結すること
により製造することができる。

【００４１】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ
／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Invitrogen社）などが用
いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、
遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を
宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４
０プロモーター、ＨＩＶ-ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ
プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げら
れる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロ
モーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒ
ア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロ
モーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Lプロモータ
ー、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌で
ある場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモー
ター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場
合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｇ
ＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好まし
い。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモ
ーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。

【００４２】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞
を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても
選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグ
ナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチ
ルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配
列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母で
ある場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナ
ル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュ
リン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル
配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用でき
る。このようにして構築された本発明のペプチド・タン
パク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用い
て、形質転換体を製造することができる。

【００４３】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. . Sci. USA），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１
巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス
（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用い
られる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サ
チルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２
４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistr
y），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。酵
母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。

【００４４】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞とし
ては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１
細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Viv
o）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫とし
ては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。

【００４５】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０
(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８
２)などに記載の方法に従って行なうことができる。バ
チルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular
＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)
などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を
形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイ
モロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８
２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に
従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質
転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Te
chnology）,6, 47-55(1988）などに記載の方法に従って
行なうことができる。動物細胞を形質転換するには、例
えば、細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコー
ル．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィ
ロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記
載の方法に従って行なうことができる。このようにし
て、Ｇタンパク質共役型タンパク質をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が
得られる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌であ
る形質転換体を培養する際、培養に使用される培地とし
ては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の
生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せし
められる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキ
ストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、
例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ
・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バ
レイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物とし
ては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エ
キス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよ
い。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

【００４６】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主
がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃
で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加
えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は
通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要によ
り通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である
形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バー
クホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０
５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培
地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. . Sci. US
A），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は
通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要
に応じて通気や撹拌を加える。

【００４７】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜ま
たは細胞外に本発明のペプチド・タンパク質を生成せし
めることができる。

【００４８】上記培養物から本発明のペプチド・タンパ
ク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行
なうことができる。本発明のペプチド・タンパク質を培
養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、
公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩
衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結
融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠
心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法な
どが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジ
ンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００^TMな
どの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にペプ
チド・タンパク質が分泌される場合には、培養終了後、
それ公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、
上清を集める。このようにして得られた培養上清、ある
いは抽出液中に含まれるペプチド・タンパク質の精製
は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうこ
とができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩
析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、
限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電
点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用
いられる。

【００４９】かくして得られるペプチド・タンパク質が
遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で
得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法
により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するペプチド・タンパク質を、精
製前または精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させ
ることにより、任意に修飾を加えたり、ペプチド・ポリ
ペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修
飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシ
ン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナー
ゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成す
る本発明のペプチドの活性は、標識した本発明のペプチ
ドと本発明のタンパク質との結合実験および特異抗体を
用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定するこ
とができる。また、生成する本発明のタンパク質の活性
は、標識した本発明のペプチドとの結合実験および特異
抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定
することができる。

【００５０】また、本発明のペプチドは、遺伝子工学的
に原核細胞宿主中で発現させ、レドックスバッファー中
でリフォールディングして活性型のペプチドとして製造
してもよい。詳細を以下に述べる。本発明のペプチドが
宿主原核細胞中で不溶成分（封入体）を形成する場合に
は、培養後、遠心分離等の方法により集菌した後、細胞
を破砕し、封入体を変性剤を用いて可溶化することによ
って、本発明のペプチドを抽出することができる。細胞
の破砕は、常法で、たとえば超音波処理により実施でき
る。懸濁媒体として中性付近のｐＨ値（ｐＨ６．５〜
７．５）に調整した好適な緩衝液（例えばリン酸緩衝液
等）を用いることが好ましい。この際、細胞の破砕を促
進させるためＥＤＴＡを添加してもよい。このようにし
て細胞を破砕した後に、不溶成分（封入体）を任意の方
法で、遠心分離するか、濾過することにより分取する。
原核細胞由来のタンパク質をできる限り除去するため、
たとえば水、リン酸緩衝液を用いて洗浄することが好ま
しいが、場合により４Ｍ程度の尿素で洗浄してもよい。
得られた沈殿（ペレット）を変性剤を用いて可溶化する
際の変性剤としては、公知の変性剤、特にグアニジンま
たは尿素等を使用することができる。変性剤は通常水溶
液として用いられ、水溶液中の変性剤の濃度は、グアニ
ジンでは４〜８モル／リットル、好ましくは約６〜７モ
ル／リットル、尿素では５〜９モル／リットル、好まし
くは約８モル／リットルである。グアニジンは通常グア
ニジン塩酸塩等のグアニジンの酸付加塩として用いられ
る。

【００５１】本発明のペプチドが宿主原核細胞中で封入
体を形成しない場合には、培養後、遠心分離等の方法に
より集菌した後、細胞を変性剤を用いて可溶化するか、
あるいは細胞を破砕後変性剤で可溶化することによって
本発明のペプチドを抽出することができる。集菌した細
胞の可溶化に用いられる変性剤としては、例えばグアニ
ジンまたは尿素などが挙げられる。変性剤は通常水溶液
として用いられ、水溶液中の変性剤の濃度は、グアニジ
ンでは通常４〜８モル／リットル、好ましくは約６〜７
モル／リットルである。グアニジンは通常グアニジン塩
酸塩等のグアニジンの酸付加塩として用いられる。細胞
の破砕は、常法で、たとえば超音波処理、フレンチ・プ
レスにより実施できる。破砕された細胞の可溶化に用い
られる変性剤としては、公知の変性剤を使用してよく、
好ましくは、グアニジンまたは尿素などを使用する。変
性剤は通常、水溶液として用いられ、水溶液中の変性剤
の濃度は、グアニジンでは４〜８モル／リットル、好ま
しくは約６〜７モル／リットル、尿素では５〜９モル／
リットル、好ましくは約８モル／リットルである。グア
ニジンは通常グアニジン塩酸塩等のグアニジンの酸付加
塩として用いられる。

【００５２】上記のようにして封入体の可溶化を行う
か、菌体を変性剤で直接可溶化するか、または細胞を破
砕後変性剤で可溶化した後、遠心分離等で不純物を除去
し、得られた上澄液を必要により精製工程に付した後、
本発明のペプチドのリフォールディング（活性化、再生
化）を行う。リフォールディングは、精製した本発明の
ペプチドにレドックスバッファーを添加するか、または
本発明のペプチドを含有する上澄液をレドックスバッフ
ァーで希釈することにより行われる。レドックスバッフ
ァーとしては、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）および
還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を含有する緩衝液、シス
テインおよびシスチンを含有する緩衝液、システアミン
およびシスタミンを含有する緩衝液などが挙げられる。
中でもＧＳＳＧおよびＧＳＨを含有する緩衝液が好まし
い。上記緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液、リン
酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられ、
中でもトリス緩衝液等が好ましい。レドックスバッファ
ー中の酸化剤（酸化型物質）および還元剤（還元型物
質）の濃度は、例えば、それぞれ０．０１〜１００ミリ
モル／リットルおよび０．０１〜１００ミリモル／リッ
トルである。より具体的には、ＧＳＳＧおよびＧＳＨを
用いる場合、レドックスバッファー中のＧＳＳＧの濃度
は０．０１〜１００ミリモル／リットル、好ましくは
０．１〜１０ミリモル／リットル、好ましくは０．１〜
１．０ミリモル／リットルが用いられ、ＧＳＨの濃度は
０．０１〜１００ミリモル／リットル、好ましくは０．
１〜１０ミリモル／リットル、好ましくは０．２〜２．
０ミリモル／リットルが用いられる。この際、たとえば
メルカプト基を有さないアミノ酸などをレドックスバッ
ファーにさらに含有させておくことが好ましい。本発明
のペプチドを含有する上澄液をレドックスバッファーで
希釈する場合、変性剤の濃度を活性化に適した中性ｐＨ
において不作用濃度まで希釈することが好ましい。たと
えば変性剤としてグアジニンを使用する場合、希釈液中
のグアニジンの濃度を０〜２．０モル／リットル、好ま
しくは約１モル／リットル以下まで、変性剤として尿素
を使用する場合、希釈液中の尿素の濃度を０〜４．０モ
ル／リットル、好ましくは約２モル／リットル以下まで
希釈することが望ましい。

【００５３】上記メルカプト基を有さないアミノ酸とし
ては、例えばアルギニン、アスパラギン酸、バリン、リ
ジン、アラニン、シトルリン等が挙げられる。アルギニ
ン等が収率の点で好ましい。レドックスバッファー中の
該アミノ酸の添加濃度は、０．１〜１．０モル／リット
ル、好ましくは０．２〜０．８モル／リットルである。
上記リフォールディングに当っての温度は０〜３０℃、
好ましくは４〜１５℃である。ｐＨは７〜９、好ましく
はｐＨ７．５〜８．５である。リフォールディングに要
する時間は通常０．５〜７日間、好ましくは１〜３日
間、さらに好ましくは１〜２日間である。なお、可溶化
後かつリフォールディングの前に、例えば抽出、塩析、
透析、分配、結晶化、再結晶、ゲルろ過、クロマトグラ
フィー等の公知で常用の精製工程を導入することがで
き、好ましくは、たとえば０．１モル／リットル リン
酸緩衝液中セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２
５（アマシャム ファルマシア バイオテク（株））に
かけることにより精製することができる。変性剤の分離
は場合により０．１モル／リットル リン酸緩衝液に対
して透析することによっても可能である。精製工程はリ
フォールディングに続いて行うこともできる。一般にそ
のような精製としては例えば抽出、塩析、透析、分配、
結晶化、再結晶、ゲルろ過、クロマトグラフィー等が挙
げられ、好ましい例として透析や、たとえばＳＰ−セフ
ァロース（アマシャム ファルマシア バイオテク
（株））、ＣＭ−５ＰＷ（トーソー（株））あるいは、
ＤＥＡＥ−５ＰＷ（トーソー（株））を介したイオン交
換クロマトグラフィー、たとえばＣ４Ｐ−５０（昭和電
工（株））を用いた逆相クロマトグラフィー等による精
製法が挙げられる。

【００５４】本発明のペプチドまたは本発明のタンパク
質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する
抗体は、本発明のペプチドまたは本発明のタンパク質も
しくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る
抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体の何れであってもよい。本発明のペプチドまたは本発
明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれら
の塩（本文中、本発明のペプチド・タンパク質と略記す
る場合がある）に対する抗体は、本発明のペプチドを抗
原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従っ
て製造することができる。

【００５５】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のペプチドは、哺乳動物に対して投与により抗体
産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とと
もに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺
乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモ
ット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、
マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクロー
ナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された
温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体
を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を
採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と
融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の
測定は、例えば、後記の標識化した本発明のペプチドと
抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活
性を測定することにより行なうことができる。融合操作
は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法
〔ネイチャー（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７
５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤とし
ては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセ
ンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧ
が用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−
１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ
１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾
臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜
２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０
００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添
加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で
約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく
細胞融合を実施できる。

【００５６】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、本発明のペプチド抗原を直接あるいは担体とともに
吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリド
ーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標
識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細
胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用い
られる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモ
ノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗
体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドー
マ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した
本発明のペプチドを加え、固相に結合したモノクローナ
ル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナ
ル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従っ
て行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用
培地などで行なうことができる。選別および育種用培地
としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどの
ような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ま
しくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和
光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清
培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いる
ことができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好まし
くは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、
好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭
酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上
清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様に
して測定できる。

【００５７】（ｂ）モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。

【００５８】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
したがって製造することができる。例えば、免疫抗原
（本発明のペプチドの抗原）とキャリアータンパク質と
の複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法
と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発
明のペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分
離精製を行なうことにより製造できる。哺乳動物を免疫
するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質
との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類および
キャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋
させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ
ば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい
が、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリ
ン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比
でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１
〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハ
プテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を
用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジ
イミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオ
ビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられ
る。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能
な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与さ
れる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロ
イントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを
投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ず
つ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクロ
ーナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血
液、腹水など、好ましくは血液から採取することができ
る。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の
血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリク
ローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体
の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従っ
て行なうことができる。

【００５９】本発明のペプチド、本発明のペプチドをコ
ードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合
がある）および本発明のペプチドに対する抗体（以下、
本発明の抗体と略記する場合がある）は、（i）本発明
のペプチドが関与する各種疾病の治療・予防剤、（ii）
本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変
化させる化合物またはその塩のスクリーニング、（ii
i）本発明のペプチドまたはその塩の定量、（iv）遺伝
子診断剤、（v）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬、
（vi）本発明の抗体を含有する医薬および診断薬、（vi
i）本発明のＤＮＡを有する非ヒト動物の作製、（vii
i）構造的に類似したリガンド・レセプターとの比較に
もとづいたドラッグデザインなどの実施のために有用で
ある。特に、本発明の組換えタンパク質の発現系を用い
たレセプター結合アッセイ系を用いることによって、ヒ
トや哺乳動物に特異的な本発明のタンパク質に対するリ
ガンドの結合性を変化させる化合物（例、ＺＡＱアゴニ
スト、ＺＡＱアンタゴニストなど）をスクリーニングす
ることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを各
種疾病の予防・治療剤などとして使用することができ
る。本発明のペプチド、本発明のＤＮＡおよび本発明の
抗体の用途について、以下に具体的に説明する。

【００６０】（１）本発明のペプチドが関与する各種疾
病の治療・予防剤 本発明のペプチドは、ヘビ毒 Mamba Intestinal Toxin
1（以下、ＭＩＴ１と略称する；配列番号：６４； FEBS
Letters、461巻、183-188頁、1999年）とアミノ酸レベ
ルで約５６％の相同性が認められる。ＭＩＴ１は回腸や
遠位大腸の収縮、あるいは近位大腸の弛緩を引き起こ
し、その程度は４０ｍＭ塩化カリウムに匹敵するほど強
いことが報告されている(FEBSLetters、 461巻、183-18
8頁、1999年)が、その作用点や作用メカニズムは解明さ
れていなかった。しかしながら、本発明者らは、ＭＩＴ
１が本発明のタンパク質を活性化し、本発明のタンパク
質を発現した細胞の細胞内Ｃａイオン濃度を上昇させる
ことを明らかにした。以上のことより、本発明のペプチ
ドは、本発明のタンパク質を活性化するリガンドであ
り、腸管の収縮などを制御する活性を有する。したがっ
て、本発明のＤＮＡ等が欠損している場合あるいは発現
量が異常に減少している場合、例えば、消化器疾患
（例、腸炎、下痢、便秘、吸収不良性症候群など）等、
種々の疾病が発症する。したがって、本発明のペプチド
および本発明のＤＮＡは、例えば、消化器疾患（例、腸
炎、下痢、便秘、吸収不良性症候群など）等、種々の疾
病の治療・予防剤等の医薬として使用することができ
る。例えば、生体内において本発明のペプチドが減少あ
るいは欠損しているために、本発明のタンパク質が発現
している細胞における情報伝達が十分に、あるいは正常
に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮ
Ａを該患者に投与し、生体内で本発明のペプチドを発現
させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿
入し、本発明のペプチドを発現させた後に、該細胞を患
者に移植することによって、または（ハ）本発明のペプ
チドを該患者に投与すること等によって、該患者におけ
る本発明のペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発
揮させることができる。本発明のＤＮＡを上記の治療・
予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいは
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ア
デノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適
当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトま
たは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡ
は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤等の
生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃
やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって
投与できる。本発明のペプチドを上記の治療・予防剤と
して使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９
５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましく
は９９％以上に精製されたものを使用するのが好まし
い。

【００６１】本発明のペプチドは、例えば、必要に応じ
て糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤等として経口的に、あるいは水もしくは
それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、また
は懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。例
えば、本発明のペプチドを生理学的に認められる担体、
香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等
とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用
量形態で混和することによって製造することができる。
これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当
な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセ
ル剤等に混和することができる添加剤としては、例え
ば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビア
ゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形
剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等のような
膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、シ
ョ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミ
ント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤等が用
いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前
記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有す
ることができる。注射のための無菌組成物は注射用水の
ようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油等のよう
な天然産出植物油等を溶解または懸濁させる等の通常の
製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性
液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の
補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−
マンニトール、塩化ナトリウム等）等が挙げられ、適当
な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノー
ル等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性
剤（例えば、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０等）
等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ
油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベ
ンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。ま
た、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム
緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清ア
ルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例え
ば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤
等と配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当
なアンプルに充填される。本発明のＤＮＡが挿入された
ベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に
使用される。

【００６２】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えばヒト、ラッ
ト、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与すること
ができる。本発明のペプチドの投与量は、対象疾患、投
与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、消
化器疾患の治療目的で本発明のペプチドを経口投与する
場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一
日につき本発明のペプチドを約１ｍｇ〜１０００ｍｇ、
好ましくは約１０〜５００ｍｇ、より好ましくは約１０
〜２００ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、本
発明のペプチドの１回投与量は投与対象、対象疾患等に
よっても異なるが、例えば、消化器疾患の治療目的で本
発明のペプチドを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとし
て）に投与する場合、一日につき該ペプチドを約１〜１
０００ｍｇ程度、好ましくは約１〜２００ｍｇ程度、よ
り好ましくは約１０〜１００ｍｇ程度を患部に注射する
ことにより投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。

【００６３】（２）本発明のペプチドと本発明のタンパ
ク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク
リーニング 本発明のペプチドおよび本発明のタンパク質（本発明の
タンパク質の部分ペプチドも含む）を用いることを特徴
とする、本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結
合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング
方法、または本発明のペプチドおよび本発明のタンパク
質質を用いることを特徴とする本発明のペプチドと本発
明のタンパク質の結合性を変化させる化合物またはその
塩のスクリーニング用キット（以下、本発明のスクリー
ニング方法、本発明のスクリーニング用キットと略記す
る）について以下に詳述する。

【００６４】本発明のタンパク質を用いるか、または組
換え型本発明のタンパク質の発現系を構築し、該発現系
を用いた本発明のペプチドとの結合アッセイ系（リガン
ド・レセプターアッセイ系）を用いることによって、本
発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化
させる化合物、本発明のペプチドと本発明のタンパク質
との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タ
ンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物など）またはその塩をスクリーニングすることができ
る。このような化合物には、本発明のタンパク質を介し
て細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチル
コリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、
細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜
電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する
活性など）を有する化合物（ＺＡＱアゴニスト）と該細
胞刺激活性を有しない化合物（ＺＡＱアンタゴニスト）
などが含まれる。「本発明のペプチドと本発明のタンパ
ク質の結合性を変化させる」とは、本発明のペプチドと
本発明のタンパク質との結合を阻害する場合と促進する
場合の両方を包含するものである。すなわち、本発明
は、（ｉ）本発明のタンパク質に、本発明のペプチドを
接触させた場合と（ii）上記した本発明のタンパク質
に、本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させた場
合との比較を行なうことを特徴とする本発明のペプチド
と本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明の
スクリーニング方法においては、（ｉ）上記本発明のタ
ンパク質に本発明のペプチドを接触させた場合と（ii）
上記本発明のタンパク質に本発明のペプチドおよび試験
化合物を接触させた場合における、例えば本発明のタン
パク質に対する本発明のペプチドの結合量、細胞刺激活
性などを測定して比較する。

【００６５】本発明のスクリーニング方法としての具体
例としては、例えば、（a）本発明のペプチドを本発明
のタンパク質に接触させた場合と、本発明のペプチドお
よび試験化合物を本発明のタンパク質に接触させた場合
における、本発明のペプチドの本発明のタンパク質に対
する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発
明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化さ
せる化合物またはその塩のスクリーニング方法、（b）
本発明のペプチドを、本発明のタンパク質を含有する細
胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発明の
ペプチドおよび試験化合物を本発明のタンパク質を含有
する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合におけ
る、本発明のペプチドの該細胞または該膜画分に対する
結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明の
ペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる
化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（c）本発明のタンパク質が、本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することに
よって細胞膜上に発現した本発明のタンパク質である上
記（b）記載のスクリーニング方法、（d）本発明のペプ
チドが、標識したリガンドである上記（a）〜（c）のス
クリーニング方法などのレセプター結合アッセイ系、
（e）本発明のペプチドを本発明のタンパク質に接触さ
せた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発
明のタンパク質に接触させた場合における、本発明のタ
ンパク質を介した細胞刺激活性を測定し、比較すること
を特徴とする、本発明のペプチドと本発明のタンパク質
との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー
ニング方法、（f）本発明のペプチドを本発明のタンパ
ク質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた
場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の
タンパク質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触
させた場合における、本発明のタンパク質を介した細胞
刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明
のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させ
る化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（g）本発明のタンパク質が、本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することに
よって細胞膜上に発現した本発明のタンパク質である上
記（f）のスクリーニング方法などの細胞刺激アッセイ
系などが挙げられる。

【００６６】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に
用いる本発明のタンパク質としては、上記本発明のタン
パク質を含有するものであれば何れのものであってもよ
い。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難な
ことから、スクリーニングに用いられるものとしては、
組換え体を用いて大量発現させた本発明のタンパク質な
どが適している。本発明のタンパク質を製造するには、
前述の方法などが用いられる。本発明のスクリーニング
方法において、本発明のタンパク質を含有する細胞ある
いは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従
えばよい。本発明のタンパク質を含有する細胞を用いる
場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行
うことができる。本発明のタンパク質を含有する細胞と
しては、本発明のタンパク質を発現した宿主細胞をいう
が、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵
母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられる。膜画分とし
ては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜
が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法とし
ては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し
潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinema
tica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプ
レスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させ
ることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画に
は、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力
による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕
液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間
（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速
（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分
〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画
分中には、発現した本発明のタンパク質と細胞由来のリ
ン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。該
本発明のタンパク質を含有する細胞や膜画分中の本発明
のタンパク質の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子で
あるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適で
ある。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド
結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニン
グ系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大
量の試料を測定できるようになる。前記のレセプター結
合アッセイ系や細胞刺激アッセイ系などのスクリーニン
グ方法を実施するためには、例えば、本発明のタンパク
質画分と、本発明のペプチド（例、標識した本発明のペ
プチド）などが用いられる。本発明のタンパク質画分と
しては、天然型の本発明のタンパク質画分か、またはそ
れと同等の活性を有する組換え型本発明のタンパク質画
分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリ
ガンド結合活性などを示す。標識したリガンドとして
は、例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³²Ｐ〕、
〔³³Ｐ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを用
いることができる。特に、ボルトン−ハンター試薬を用
いて公知の方法で調製した本発明のペプチドの標識体を
利用することもできる。具体的には、本発明のペプチド
と本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物の
スクリーニングを行うには、まず本発明のタンパク質を
含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに
適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品
を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましく
はｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッ
ファーなどのリガンドとタンパク質との結合を阻害しな
いバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的
結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８
０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレ
ートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもでき
る。さらに、プロテアーゼによる本発明のタンパク質や
本発明のペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイ
ペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチ
ンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。
０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量
（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本
発明のペプチドを添加し、同時に１０^-4〜１０^-1μＭの
試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を
知るために大過剰の未標識の本発明のペプチドを加えた
反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ま
しくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましく
は３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で
濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維
濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウン
ターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質が
ない場合のカウント(Ｂ₀）から非特異的結合量（ＮＳ
Ｂ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とし
た時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下
になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として
選択することができる。また、本発明のタンパク質と本
発明のペプチドとの結合を測定する方法として、ＢＩＡ
ｃｏｒｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を
用いることもできる。この方法では、本発明のペプチド
を装置に添付のプロトコールに従ったアミノカップリン
グ法によってセンサーチップに固定し、本発明のタンパ
ク質を含有する細胞または本発明のタンパク質コードす
るＤＮＡを含有する形質変換体から精製した本発明のタ
ンパク質または本発明のタンパク質を含む膜画分、ある
いは精製した本発明のタンパク質または本発明のタンパ
ク質を含む膜画分および試験化合物を含むリン酸バッフ
ァーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチ
ップ上を毎分２−２０μｌの流量で通過させる。 セン
サーチップ上の本発明のペプチドと本発明のタンパク質
とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の
変化を共存する試験化合物が変化させることを観察する
ことによって本発明のタンパク質と本発明のペプチドと
の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうこ
とができる。この方法は、本発明のタンパク質をセンサ
ーチップに固定し、本発明のペプチドまたは本発明のペ
プチドおよび試験化合物を含むリン酸バッファーまたは
トリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通
過させる方法を用いても同様に測定することができる。
試験化合物としては、上記と同様のものなどがあげられ
る。前記の細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法を
実施するためには、本発明のタンパク質を介する細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合
活性などを促進する活性または抑制する活性など）を、
公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定する
ことができる。具体的には、まず、本発明のタンパク質
を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。
スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地
あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換
し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベート
した後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成し
た産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活
性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生
成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合
は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行
なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性につ
いては、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増
大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出す
ることができる。

【００６７】細胞刺激活性を測定してスクリーニングを
行なうには、適当な本発明のタンパク質を発現した細胞
が用いられる。本発明のタンパク質を発現した細胞とし
ては、前述の組換え型本発明のタンパク質発現細胞株な
どが望ましい。形質転換体である本発明のタンパク質発
現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。ま
た、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペ
プチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。

【００６８】上記細胞刺激アッセイ系のスクリーニング
方法について、さらに具体的に以下〔１〕〜〔１２〕に
記載する。 〔１〕受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激
されると細胞内のＧタンパク質が活性化されてＧＴＰが
結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分において
も観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへ
と変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加し
ておくと、ＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧタンパクに結
合するが、加水分解されずにＧタンパクを含む細胞膜に
結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用い
ると細胞膜に残存した標識されたＧＴＰγＳを測定する
ことにより、受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活
性を測定することができる。この反応を利用して、本発
明のペプチドの本発明のタンパク質発現細胞に対する刺
激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発
明のタンパク質との結合性を変化させる化合物をスクリ
ーニングすることができる。この方法は、本発明のタン
パク質を含む膜画分を用いて行う。本測定法において本
発明のタンパク質膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を
示す物質はアゴニストである。具体的には、標識したＧ
ＴＰγＳの存在下、本発明のペプチドを本発明のタンパ
ク質細胞膜画分に接触させた場合と、本発明のペプチド
および試験化合物を本発明のタンパク質細胞膜画分に接
触させた場合における、本発明のタンパク質細胞膜画分
へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定し、比較することに
より、本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合
性を変化させる化合物をスクリーニングする。本方法に
おいて、本発明のペプチドによる本発明のタンパク質細
胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制する活性を
示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として
選択することができる。一方、試験化合物のみを本発明
のタンパク質細胞膜画分に接触させ、本発明のタンパク
質細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定するこ
とにより、アゴニストのスクリーニングを行なうことも
できる。

【００６９】スクリーニング法の一例についてより具体
的に以下に述べる。公知の方法に準じて調製した本発明
のタンパク質を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１μＭ ＧＤＰ、０．１％ ＢＳＡ；ｐＨ７．
４）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異な
る。これをＦａｌｃｏｎ２０５３に０．２ｍｌずつ分注
し、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試
験化合物を加え、さらに終濃度２００ｐＭとなるように
［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳを加える。２５℃で１時間保温した
後、氷冷した洗浄用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＢＳ
Ａ，０．０５％ ＣＨＡＰＳ；ｐＨ７．４）１．５ｍｌ
を加えて、ガラス繊維ろ紙ＧＦ／Ｆでろ過する。６５
℃、３０分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウ
ンターでろ紙上に残った膜画分に結合した［ ³⁵Ｓ］ＧＴ
ＰγＳの放射活性を測定する。本発明のペプチドのみを
加えた実験区の放射活性を１００％、本発明のペプチド
を加えなかった実験区の放射活性を０％とし、本発明の
ペプチドによるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験化
合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例え
ば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候
補物質として選択することができる。

【００７０】〔２〕本発明のタンパク質発現細胞は、本
発明のペプチドの刺激により、細胞内ｃＡＭＰの産生が
抑制される。この反応を利用して、本発明のペプチドの
本発明のタンパク質発現細胞に対する刺激活性を測定す
ることにより、本発明のペプチドと本発明のタンパク質
との結合性を変化させる化合物をスクリーニングするこ
とができる。具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させ
る物質の存在下、本発明のペプチドを本発明のタンパク
質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよ
び試験化合物を本発明のタンパク質発現細胞に接触させ
た場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生抑制活
性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと
本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物をス
クリーニングする。細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質
としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなど
が用いられる。本発明のタンパク質発現細胞内のｃＡＭ
Ｐ産生量は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなど
を免疫して得られた抗ｃＡＭＰ抗体と〔¹²⁵Ｉ〕標識ｃ
ＡＭＰ（ともに市販品）を使用することによるＲＩＡ
系、または抗ｃＡＭＰ抗体と標識ｃＡＭＰとを組み合わ
せたＥＩＡ系で測定することができる。また、抗ｃＡＭ
Ｐ抗体を、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａまたは抗ｃＡＭＰ抗体産
生に用いた動物のＩｇＧなどに対する抗体などを使用し
て固定したシンチラントを含むビーズと〔¹²⁵Ｉ〕標識
ｃＡＭＰとを使用するＳＰＡ（Scintillation Proximit
y Assay）法による定量も可能である（アマシャムファ
ルマシアバイオテク社製のキットを使用する）。本方法
において、本発明のペプチドによる本発明のタンパク質
発現細胞のｃＡＭＰ産生抑制活性を阻害する活性を示す
試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択
することができる。一方、試験化合物のみを本発明のタ
ンパク質発現細胞に接触させて、ｃＡＭＰ産生抑制活性
を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスク
リーニングを行なうことができる。

【００７１】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明のタンパク質発現細胞（例、ＣＨＯ細胞など
の動物細胞）（（ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞；後述の実施例
７））を２４穴プレートに５ｘ１０⁴ｃｅｌｌ／ｗｅｌ
ｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ ３
−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％ ＢＳＡ
および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー
（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと
略記する）。その後、０．５ｍｌの反応用バッファーを
加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを
除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に
加えた後、１μＭの本発明のペプチドまたは１μＭの本
発明のペプチドおよび試験化合物を添加した２μＭ フ
ォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファー
を、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。１００
μｌの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、その後
氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出す
る。抽出液中のｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ ＥＩＡキット
（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定す
る。フォルスコリンの刺激によって産生されたｃＡＭＰ
量を１００％とし、１μＭの本発明のペプチドの添加に
よって抑制されたｃＡＭＰ量を０％として、本発明のペ
プチドによるｃＡＭＰ産生抑制活性に対する試験化合物
の影響を算出する。本発明のペプチドの活性を阻害し
て、ｃＡＭＰ産生活性が例えば５０％以上になる試験化
合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択するこ
とができる。また、本発明のペプチドの刺激により、細
胞内ｃＡＭＰ量が増加する性質を示す本発明のタンパク
質発現細胞を使用する場合、本発明のペプチドを本発明
のタンパク質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペ
プチドおよび試験化合物を本発明のタンパク質発現細胞
に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの
産生促進活性を測定し、比較することにより、本発明の
ペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる
化合物をスクリーニングすることができる。本方法にお
いて、本発明のペプチドによる本発明のタンパク質発現
細胞のｃＡＭＰ産生促進活性を阻害する活性を示す試験
化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択する
ことができる。一方、試験化合物のみを本発明のタンパ
ク質発現細胞に接触させてｃＡＭＰ産生促進活性を調べ
ることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニ
ングを行なうことができる。ｃＡＭＰ産生促進活性は、
上記のスクリーニング法においてフォルスコリンを添加
せずに本発明のタンパク質発現細胞（例、ＣＨＯ細胞な
どの動物細胞）に本発明のペプチドまたは本発明のペプ
チドおよび試験化合物を添加して産生されたｃＡＭＰを
上記の方法で定量して測定する。

【００７２】〔３〕ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター
を用いて、本発明のペプチドの本発明のタンパク質発現
細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明の
ペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる
化合物をスクリーニングすることができる。ＣＲＥ（cA
MP response element）を含むＤＮＡを、ベクターのレ
ポーター遺伝子上流に挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝
子ベクターを得る。ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター
を導入した本発明のタンパク質発現細胞において、ｃＡ
ＭＰの上昇を伴う刺激は、ＣＲＥを介したレポーター遺
伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子
産物（タンパク質）の産生を誘導する。つまり、レポー
ター遺伝子タンパク質の酵素活性を測定することによ
り、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のｃ
ＡＭＰ量の変動を検出することができる。具体的には、
細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明の
ペプチドを、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター本発明
のタンパク質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペ
プチドおよび試験化合物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子
ベクター導入本発明のタンパク質発現細胞に接触させた
場合における、レポーター遺伝子タンパク質の酵素活性
を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本
発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物をスク
リーニングする。細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質と
しては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが
用いられる。ベクターとしては、例えば、ピッカジーン
ベイシックベクター、ピッカジーン エンハンサーベ
クター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。Ｃ
ＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝
子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニ
ングサイトに挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクタ
ーとする。本方法において、本発明のペプチドによるレ
ポーター遺伝子タンパク質の酵素活性抑制を回復させる
試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択
することができる。一方、試験化合物のみを本発明のタ
ンパク質発現細胞に接触させて、フォルスコリン刺激に
よって上昇した発光量の本発明のペプチドと同様な抑制
を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行
なうこともできる。

【００７３】レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ
を利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体
例を以下に述べる。ＣＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフ
ェラーゼ）を導入した本発明のタンパク質発現細胞を、
２４穴プレートに５ｘ１０³ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種
し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ ３−イソブ
チル−メチルキサンチン、０．０５％ ＢＳＡおよび２
０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ
７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記す
る）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３
０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新
たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた
後、１μＭの本発明のペプチドまたは１μＭの本発明の
ペプチドおよび試験化合物を添加した２μＭ フォルス
コリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞
に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジ
ーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、
溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加す
る。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液
体シンチレーションカウンターまたはトップカウンター
により測定する。本発明のペプチド単独を添加した場合
と、１μＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加
した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比
較する。本発明のペプチドは、フォルスコリン刺激に基
づくルシフェラーゼによる発光量の増加を抑制する。該
抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候補物質
として選択することができる。

【００７４】レポーター遺伝子として、例えば、アルカ
リフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチル
トランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransfer
ase）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いても
よい。これらのレポーター遺伝子タンパク質の酵素活性
は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用い
て測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば
和光純薬製Lumi-Phos530を用いて、クロラムフェニコー
ル・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純
薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Ass
ay KiTを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば
和光純薬製Aurora Gal-XEを用いて測定する。

【００７５】〔４〕本発明のタンパク質発現細胞は、本
発明のペプチドの刺激により、アラキドン酸代謝物を細
胞外に放出する。この反応を利用して、本発明のペプチ
ドの本発明のタンパク質発現細胞に対する刺激活性を測
定することにより、本発明のペプチドと本発明のタンパ
ク質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングす
ることができる。あらかじめ、標識したアラキドン酸
を、本発明のタンパク質発現細胞に取り込ませておくこ
とによって、アラキドン酸代謝物放出活性を、細胞外に
放出された標識されたアラキドン酸代謝物を測定するこ
とによって測定することができる。具体的には、本発明
のペプチドを、標識したアラキドン酸を含有する本発明
のタンパク質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペ
プチドおよび試験化合物を、標識したアラキドン酸を含
有する本発明のタンパク質発現細胞に接触させた場合に
おける、アラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較
することにより、本発明のペプチドと本発明のタンパク
質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングす
る。本方法において、本発明のペプチドによるアラキド
ン酸代謝物放出活性を阻害する試験化合物を、拮抗阻害
能力のある候補物質として選択することができる。ま
た、試験化合物のみを本発明のタンパク質発現細胞に接
触させ、本発明のタンパク質発現細胞のアラキドン酸代
謝物放出活性を公知の方法で調べることによりアゴニス
ト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともで
きる。

【００７６】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明のタンパク質発現細胞を２４穴プレートに５
ｘ１０⁴ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養
後、［³Ｈ］アラキドン酸を０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ
となるよう添加し、１６時間後、細胞を０．０５％ Ｂ
ＳＡおよび２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファ
ー（ｐＨ７．４）（以下、反応用バッファーと略記す
る）で洗浄する。終濃度１０μＭの本発明のペプチドま
たは終濃度１０μＭの本発明のペプチドおよび試験化合
物を含む反応用バッファー ５００μｌを、各ｗｅｌｌ
に添加する。３７℃で６０分間インキュベートした後、
反応液４００μｌをシンチレーターに加え、反応液中に
遊離した［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の量をシンチレー
ションカウンターにより測定する。反応用バッファー
５００μｌのみを添加した場合（本発明のペプチド非添
加・試験化合物非添加）の遊離［³Ｈ］アラキドン酸代
謝物の量を０％、１０μＭの本発明のペプチドを含む反
応用バッファーを添加した場合（試験化合物非添加）の
遊離［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を１００％とし
て、試験化合物を添加した場合の遊離［³Ｈ］アラキド
ン酸代謝物の量を算出する。アラキドン酸代謝物放出活
性が、例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能
力のある候補物質として選択することができる。

【００７７】〔５〕本発明のタンパク質発現細胞は、本
発明のペプチドの刺激により、細胞内のＣａ濃度が上昇
する。この反応を利用して、本発明のペプチドの本発明
のタンパク質発現細胞に対する刺激活性を測定すること
により、本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結
合性を変化させる化合物をスクリーニングすることがで
きる。具体的には、本発明のペプチドを、本発明のタン
パク質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチド
および試験化合物を、本発明のタンパク質発現細胞に接
触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性
を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本
発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物をスク
リーニングする。測定は公知の方法に従って行う。本方
法において、本発明のペプチドによる細胞内カルシウム
濃度の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のあ
る候補物質として選択することができる。一方、試験化
合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することに
よってアゴニストのスクリーニングを行なうこともでき
る。スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。本発
明のタンパク質発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグ
ラス上に播き、２日後、培養液を、４ｍＭ Ｆｕｒａ−
２ ＡＭ（同仁化学研究所）を縣濁したＨＢＳＳに置換
し、室温で２時間３０分おく。ＨＢＳＳで洗浄した後、
キュベットにカバーグラスをセットし、本発明のペプチ
ドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、
励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの、５０５ｎｍ
の蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較す
る。また、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社製）を
使って行ってもよい。本発明のタンパク質発現細胞縣濁
液にＦｌｕｏ−３ ＡＭ（同仁化学研究所製）を添加
し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄
後、９６穴プレートに細胞を播く。ＦＬＩＰＲ装置にセ
ットし、Ｆｕｒａ−２の場合と同様に、本発明のペプチ
ドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、
蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
さらに、本発明のタンパク質発現細胞に、細胞内Ｃａイ
オンの上昇によって発光するようなタンパク質の遺伝子
（例、aequorinなど）を共発現させておき、細胞内Ｃａ
イオン濃度の上昇によって、該遺伝子タンパク質（例、
aequorinなど）がＣａ結合型となり発光することを利用
して、本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合
性を変化させる化合物をスクリーニングすることもでき
る。細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するようなタ
ンパク質の遺伝子を共発現させた本発明のタンパク質発
現細胞を、９６穴プレートに播き、上記と同様に、本発
明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物
を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、
比較する。本発明のペプチドによる蛍光強度の上昇を、
抑制する試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質とし
て選択することができる。

【００７８】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。対照としてＥＴＡ（エンドセリンＡレセプター）発
現ＣＨＯ細胞２４番クローン（以後ＥＴＡ２４細胞と略
称する。Journal of Pharmacology and Experimental T
herapeutics, 279巻、675-685頁、1996年参照）を用
い、アッセイ用サンプルについて、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞
（後述の実施例７）およびＥＴＡ２４細胞における細胞
内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定をＦＬＩＰＲ（モレキ
ュラーデバイス社製）を用いて行う。ＺＡＱＣ−Ｂ１細
胞、ＥＴＡ２４細胞共に１０％透析処理済ウシ胎児血清
（以後ｄ ＦＢＳとする）を加えたＤＭＥＭで継代培養
しているものを用いる。ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞、ＥＴＡ２
４細胞をそれぞれ15×10⁴cells/mlとなるように培地（1
0％ d FBS-DMEM）に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレー
ト(Black plate clear bottom、Coster社)に分注器を用
いて各ウェルに200 μlずつ植え込み（3.0×10⁴cells/2
00μl/ウェル）、5％ CO₂インキュベーター中にて37℃
で一晩培養した後用いる（以後、細胞プレートとす
る）。H/HBSS（ニッスイハンクス２（日水製薬株式会
社） 9.8g、炭酸水素ナトリウム 0.35g、HEPES 4.77 g
、水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、フィ
ルター滅菌処理）20 ml、250 mM Probenecid 200 μ
l、ウシ胎児血清(FBS) 200 μlを混合する。また、Fluo
3-AM（同仁化学研究所） 2バイアル(50 μg)をジメチ
ルスルフォキサイド 40 μl、20% Pluronic acid（Mole
cular Probes社） 40 μlに溶解し、これを上記H/HBSS
−Probenecid−FBS に加え、混和後、8連ピペットを用
いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル 100 μlず
つ分注し、5％ CO₂インキュベーター中にて37℃で1時間
インキュベートする（色素ローディング）。アッセイ用
サンプル（各フラクション）に、2.5 mM Probenecid、
0.1％ CHAPSを含むH/HBSS 150 μlを加えて希釈し、Ｆ
ＬＩＰＲ用９６穴プレート（V-Bottomプレート、Coster
社）へ移す（以後、サンプルプレートとする）。細胞プ
レートの色素ローディング終了後、H/HBSSに2.5 mM Pro
benecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャ
ー(Molecular Devices社)を用いて細胞プレートを４回
洗浄し、洗浄後100 μlの洗浄バッファーを残す。この
細胞プレートとサンプルプレートをFLIPRにセットしア
ッセイを行う（FLIPRにより、サンプルプレートから50
μlのサンプルが細胞プレートへと移される）。

【００７９】〔６〕受容体を発現する細胞に、受容体ア
ゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃
度は上昇する。本発明のペプチドの、本発明のタンパク
質発現細胞における細胞内イノシトール三リン酸産生活
性を利用することにより、本発明のペプチドと本発明の
タンパク質との結合性を変化させる化合物をスクリーニ
ングすることができる。具体的には、標識したイノシト
ールの存在下、本発明のペプチドを、本発明のタンパク
質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよ
び試験化合物を、本発明のタンパク質発現細胞に接触さ
せた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測
定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明
のタンパク質との結合性を変化させる化合物をスクリー
ニングする。測定は公知の方法に従って行う。本方法に
おいて、イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験
化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択する
ことができる。一方、試験化合物のみを本発明のタンパ
ク質発現細胞に接触させ、イノシトール三リン酸産生上
昇を測定することによってアゴニストのスクリーニング
を行なうこともできる。

【００８０】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明のタンパク質発現細胞を２４穴プレートに播
き、１日間培養する。その後、ｍｙｏ−［２−³Ｈ］ｉ
ｎｏｓｉｔｏｌ（２．５μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加した
培地で１日間培養し、細胞を放射活性を有するイノシト
ールを無添加の培地でよく洗浄する。本発明のペプチド
または本発明のペプチドおよび試験化合物を添加後、１
０％過塩素酸を加え、反応を止める。１．５Ｍ 水酸化
カリウムおよび６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液で中和し、
０．５ｍｌのＡＧ１ｘ８樹脂（Bio-Rad）を詰めたカラ
ムに通し、５ｍＭ 四ホウ酸ナトリウム（Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇）
および６０ｍＭ ギ酸アンモニウムで洗浄した後、１Ｍ
ギ酸アンモニウムおよび０．１Ｍギ酸で溶出した放射活
性を、液体シンチレーションカウンターで測定する。本
発明のペプチドを添加しない場合の放射活性を０％、本
発明のペプチドを添加した場合の放射活性を１００％と
し、試験化合物の、本発明のペプチドと本発明のタンパ
ク質の結合に対する影響を算出する。イノシトール三リ
ン酸産生活性が、例えば５０％以下になる試験化合物を
拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができ
る。

【００８１】〔７〕ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター
を用いて、本発明のペプチドの本発明のタンパク質発現
細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明の
ペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる
化合物をスクリーニングすることができる。ＴＲＥ（TP
A response element）を含むＤＮＡを、ベクターのレポ
ーター遺伝子上流に挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子
ベクターを得る。ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを
導入した本発明のタンパク質発現細胞において、細胞内
カルシウム濃度の上昇を伴う刺激は、ＴＲＥを介したレ
ポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝
子の遺伝子産物（タンパク質）の産生を誘導する。つま
り、レポーター遺伝子タンパク質の酵素活性を測定する
ことにより、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細
胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。具
体的には、本発明のペプチドを、ＴＲＥ−レポーター遺
伝子ベクター本発明のタンパク質発現細胞に接触させた
場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、ＴＲＥ
−レポーター遺伝子ベクター導入本発明のタンパク質発
現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子タ
ンパク質の酵素活性を測定し、比較することにより、本
発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化
させる化合物をスクリーニングする。ベクターとして
は、例えば、ピッカジーン ベイシックベクター、ピッ
カジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造
（株））などが用いられる。ＴＲＥを含むＤＮＡを、上
記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ
遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＴＲ
Ｅ−レポーター遺伝子ベクターとする。本方法におい
て、本発明のペプチドによるレポーター遺伝子タンパク
質の酵素活性を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力の
ある候補物質として選択することができる。一方、試験
化合物のみをＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本
発明のタンパク質発現細胞に接触させ、本発明のペプチ
ドと同様な発光量の増加を測定することによりアゴニス
トのスクリーニングを行なうこともできる。

【００８２】レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ
を利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体
例を以下に述べる。ＴＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフ
ェラーゼ）を導入した本発明のタンパク質発現細胞を、
２４穴プレートに５ｘ１０³ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種
し、４８時間培養する。細胞を０．０５％ ＢＳＡおよ
び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐ
Ｈ７．４）で洗浄した後、１０ｎＭの本発明のペプチド
または１０ｎＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を
添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジ
ーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、
溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加す
る。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液
体シンチレーションカウンターまたはトップカウンター
により測定する。本発明のペプチドを添加した場合と、
１０ｎＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し
た場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較
する。本発明のペプチドによる細胞内カルシウムの上昇
によって、ルシフェラーゼによる発光量が増加する。こ
の増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質
として選択することができる。

【００８３】レポーター遺伝子として、例えば、アルカ
リフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチル
トランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransfer
ase）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いても
よい。これらのレポーター遺伝子タンパク質の酵素活性
は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用い
て測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば
和光純薬製Lumi-Phos530を用いて、クロラムフェニコー
ル・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純
薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Ass
ay KiTを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば
和光純薬製Aurora Gal-XEを用いて測定する。

【００８４】〔８〕本発明のタンパク質発現細胞は、本
発明のペプチドの刺激により、ＭＡＰキナーゼが活性化
され、増殖する。この反応を利用して、本発明のペプチ
ドの本発明のタンパク質発現細胞に対する刺激活性を測
定することにより、本発明のペプチドと本発明のタンパ
ク質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングす
ることができる。具体的には、本発明のペプチドを、本
発明のタンパク質発現細胞に接触させた場合と、本発明
のペプチドおよび試験化合物を、本発明のタンパク質発
現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、
比較することにより、本発明のペプチドと本発明のタン
パク質との結合性を変化させる化合物をスクリーニング
する。本発明のタンパク質発現細胞の増殖は、例えば、
ＭＡＰキナーゼ活性、チミジン取り込み活性、細胞数な
どを測定すればよい。具体例としては、ＭＡＰキナーゼ
活性については、本発明のペプチドまたは本発明のペプ
チドおよび試験化合物を、本発明のタンパク質発現細胞
に添加した後、細胞溶解液から抗ＭＡＰキナーゼ抗体を
用いた免疫沈降によりＭＡＰキナーゼ分画を得た後、公
知の方法、例えば和光純薬製ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓ
ｓａｙＫｉｔおよびγ−［³²Ｐ］−ＡＴＰを使用してＭ
ＡＰキナーゼ活性を測定し、比較する。チミジン取り込
み活性については、本発明のタンパク質発現細胞を２４
穴プレートに播種し、培養し、本発明のペプチドまたは
本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した後、放射
活性により標識したチミジン（例、［ｍｅｔｈｙｌ−³
Ｈ］−チミジンなど）を加え、その後、細胞を溶解し、
細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性を、液体シン
チレーションカウンターで計数することにより、チミジ
ン取り込み活性を測定し、比較する。細胞数の測定につ
いては、本発明のタンパク質発現細胞を２４穴プレート
に播種し、培養し、本発明のペプチドまたは本発明のペ
プチドおよび試験化合物を添加した後、ＭＴＴ（3-(4,5
-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium
bromide）を添加する。細胞内に取り込まれてＭＴＴが
変化したＭＴＴホルマザンを、塩酸にて酸性としたイソ
プロパノール水溶液で細胞を溶解した後、５７０ｎｍの
吸収によって測定し、比較する。本方法において、本発
明のタンパク質発現細胞の増殖を抑制する試験化合物
を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することが
できる。一方、試験化合物のみを本発明のタンパク質発
現細胞に接触させ、本発明のペプチドと同様な細胞増殖
活性を測定することによりアゴニストのスクリーニング
を行なうこともできる。

【００８５】チミジン取り込み活性を利用するスクリー
ニング法の一具体例を以下に述べる。本発明のタンパク
質発現細胞を２４穴プレートに５０００個／ウェル播
き、１日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間
培養し、細胞を飢餓状態にする。本発明のペプチドまた
は本発明のペプチドおよび試験化合物を、細胞に添加し
て２４時間培養した後、［ｍｅｔｈｙｌ−³Ｈ］−チミ
ジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し、６時間培
養する。細胞をＰＢＳで洗った後、メタノールを添加し
て１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸を添加し
て１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で４回洗
う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶
解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで
測定する。本発明のペプチドを添加した場合の放射活性
の増加を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候
補物質として選択することができる。

【００８６】

〔９〕本発明のタンパク質発現細胞は、本
発明のペプチドの刺激により、カリウムチャネルが活性
化し、細胞内にあるＫイオンが、細胞外に流出する。こ
の反応を利用して、本発明のペプチドの本発明のタンパ
ク質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、
本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変
化させる化合物をスクリーニングすることができる。Ｋ
イオンと同族元素であるＲｂイオン（ルビジウムイオ
ン）は、Ｋイオンと区別無く、カリウムチャネルを通っ
て細胞外に流出する。よって、本発明のタンパク質発現
細胞に、放射活性同位体であるＲｂ（［⁸⁶Ｒｂ］）を取
り込ませておいた後、本発明のペプチドの刺激によって
流出する⁸⁶Ｒｂの流れ（流出活性）を測定することによ
り、本発明のペプチドの本発明のタンパク質発現細胞に
対する刺激活性を測定する。具体的には、⁸⁶Ｒｂの存在
下、本発明のペプチドを、本発明のタンパク質発現細胞
に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合
物を、本発明のタンパク質発現細胞に接触させた場合に
おける、⁸⁶Ｒｂの流出活性を測定し、比較することによ
り、本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性
を変化させる化合物をスクリーニングする。本方法にお
いて、本発明のペプチド刺激による⁸⁶Ｒｂの流出活性の
上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補
物質として選択することができる。一方、試験化合物の
みを本発明のタンパク質発現細胞に接触させ、本発明の
ペプチドと同様な⁸⁶Ｒｂの流出活性の上昇を測定するこ
とによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともで
きる。

【００８７】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明のタンパク質発現細胞を２４穴プレートに播
き、２日間培養する。その後、１ｍＣｉ／ｍｌの⁸⁶Ｒｂ
Ｃlを含む培地中で２時間保温する。細胞を培地でよく
洗浄し、外液中の⁸⁶ＲｂＣｌを完全に除く。本発明のペ
プチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を細胞
に添加し、３０分後外液を回収し、γカウンターで放射
活性を測定し、比較する。本発明のペプチド刺激による
⁸⁶Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗
阻害能力のある候補物質として選択することができる。

【００８８】〔１０〕本発明のタンパク質発現細胞が本
発明のペプチドに反応し、細胞外のｐＨが変化する。こ
の反応を利用して、本発明のペプチドの本発明のタンパ
ク質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、
本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変
化させる化合物をスクリーニングすることができる。具
体的には、本発明のペプチドを、本発明のタンパク質発
現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試
験化合物を、本発明のタンパク質発現細胞に接触させた
場合における、細胞外のｐＨ変化を測定し、比較するこ
とにより、本発明のペプチドと本発明のタンパク質の結
合性を変化させる化合物をスクリーニングする。細胞外
ｐＨ変化は、例えば、Ｃｙtｏｓｅｎｓｏｒ装置（モレ
キュラーデバイス社）を使用して測定する。本方法にお
いて、本発明のペプチドによる細胞外ｐＨ変化を抑制す
る試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選
択することができる。一方、試験化合物のみを本発明の
タンパク質発現細胞に接触させ、本発明のペプチドと同
様な細胞外ｐＨ変化を測定することによりアゴニストの
スクリーニングを行なうこともできる。

【００８９】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明のタンパク質発現細胞をＣｙtｏｓｅｎｓｏ
ｒ装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバー
にセットして細胞外ｐＨが安定するまで約２時間、０．
１％ ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地（モレキュラ
ーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、本
発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合
物を含む培地を細胞上に灌流させる。灌流によって生じ
た培地のｐＨ変化を測定し、比較する。本発明のペプチ
ドによる細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物を拮抗阻害能
力のある候補物質として選択することができる。

【００９０】〔１１〕酵母（Saccharomyces cerevisia
e）のhaploidα-mating Type (MATα) の性フェロモン
受容体ＳＴｅ２は、Ｇタンパク質Ｇｐａ１と共役してお
り、性フェロモンα-mating factorに応答してＭＡＰキ
ナーゼを活性化し、これに引き続き、Ｆａｒ１（cell-c
ycle arrest）および転写活性化因子Ｓｔｅ１２が活性
化される。Ｓｔｅ１２は、種々のタンパク質（例えば、
接合に関与するＦＵＳ１）の発現を誘導する。一方、制
御因子Ｓｓｔ２は上記の過程に抑制的に機能する。この
系において、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受
容体アゴニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達
系を活性化し、その結果生じる増殖などを指標として用
いる、受容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試
みが行なわれている（Trends in Biotechnology, 15巻,
487-494頁, 1997年）。上記の受容体遺伝子導入酵母の
系を利用して、本発明のペプチドと本発明のタンパク質
との結合性を変化させる化合物をスクリーニングするこ
とができる。

【００９１】具体例を以下に示す。ＭＡＴα酵母のＳｔ
ｅ２およびＧｐａ１をコードする遺伝子を除去し、代わ
りに、本発明のタンパク質遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａ
ｉ２融合タンパク質をコードする遺伝子を導入する。Ｆ
ａｒをコードする遺伝子を除去してcell-cycle arrest
が生じないようにし、また、Ｓｓｔをコードする遺伝子
を除去して本発明のペプチドに対する応答の感度を向上
させておく。さらに、ＦＵＳ１にヒスチジン生合成遺伝
子ＨＩＳ３を結合したＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子を導入
する。この遺伝子組換え操作は、例えば、Molecular an
d Cellular Biology, 15巻, 6188-6195頁, 1995年に記
載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ２（SS
TR2）遺伝子を、本発明のタンパク質に置き換えて実施
することができる。このように構築された形質変換酵母
は、本発明のペプチドに高感度で反応し、その結果、Ｍ
ＡＰキナーゼの活性化が起き、ヒスチジン生合成酵素が
合成されるようになり、ヒスチジン欠乏培地で生育可能
になる。従って、上記の本発明のタンパク質発現酵母
（Ｓｔｅ２遺伝子およびＧｐａ１遺伝子が除去され、本
発明のタンパク質遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合
タンパク質コード遺伝子が導入され、Ｆａｒ遺伝子およ
びＳｓｔ遺伝子が除去され、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子
が導入されたＭＡＴα酵母）を、ヒスチジン欠乏培地で
培養し、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよ
び試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較
することにより、本発明のペプチドと本発明のタンパク
質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする
ことができる。本方法において、該酵母の生育を抑制す
る試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選
択することができる。一方、試験化合物のみを上記の本
発明のタンパク質発現酵母に接触させ、本発明のペプチ
ドと同様な酵母の生育を測定することによりアゴニスト
のスクリーニングを行なうこともできる。

【００９２】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。上記の本発明のタンパク質発現酵母を完全合成培地
の液体培地で終夜培養し、その後、ヒスチジンを除去し
た溶解寒天培地に、２ｘ１０⁴ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度に
なるように加える。ついで、９ｘ９ｃｍの角形シャーレ
に播く。寒天が固化した後、本発明のペプチドまたは本
発明のペプチドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾
紙を寒天表面におき、３０℃で３日間培養する。試験化
合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育を、本発明のペ
プチドのみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較
する。また、あらかじめ、ヒスチジンを除去した寒天培
地に本発明のペプチドを添加しておき、滅菌濾紙に試験
化合物のみをしみこませて酵母を培養し、シャーレ全面
での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察
してもよい。酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能
力のある候補物質として選択することができる。

【００９３】〔１２〕本発明のタンパク質遺伝子ＲＮＡ
をアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、本発明のペプ
チドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇し
て、calcium-activated chloride currentが生じる。こ
れは、膜電位の変化としてとらえることができる（Ｋイ
オン濃度勾配に変化がある場合も同様）。本発明のペプ
チドによって生じる本発明のタンパク質導入アフリカツ
メガエル卵母細胞における上記反応を利用して、本発明
のペプチドの本発明のタンパク質発現細胞に対する刺激
活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明
のタンパク質との結合性を変化させる化合物をスクリー
ニングすることができる。具体的には、本発明のペプチ
ドを、本発明のタンパク質遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツ
メガエル卵母細胞に接触させた場合と、本発明のペプチ
ドおよび試験化合物を、本発明のタンパク質遺伝子ＲＮ
Ａ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合に
おける、細胞膜電位の変化を測定し、比較することによ
り、本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性
を変化させる化合物をスクリーニングする。本方法にお
いて、細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、拮抗阻
害能力のある候補物質として選択することができる。一
方、試験化合物のみを本発明のタンパク質遺伝子ＲＮＡ
導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させ、本発明の
ペプチドと同様な細胞膜電位変化を測定することにより
アゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

【００９４】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルか
ら取り出した、卵母細胞塊を、ＭＢＳ液（88mM NaCl, 1
mM KCl, 0.41mM CaCl₂, 0.33mM Ca(NO₃)₂, 0.82mMMgS
O₄, 2.4mM NaHCO₃, 10mM HEPES； pH7.4）に溶かしたコ
ラーゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で卵塊がほぐれるま
で１９℃、１〜６時間、１５０ｒｐｍで処理する。外液
をＭＢＳ液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニ
ピュレーターで本発明のタンパク質遺伝子ｐｏｌｙ Ａ
付加ｃＲＮＡ（５０ｎｇ／５０ｎｌ）を卵母細胞にマイ
クロインジェクションする。本発明のタンパク質遺伝子
ｍＲＮＡは、組織や細胞から調製してもよく、プラスミ
ドからin vitroで転写してもよい。本発明のタンパク質
遺伝子ｍＲＮＡをＭＢＳ液中で２０℃で３日培養し、こ
れをRinger液を流しているvoltage clamp装置のくぼみ
に置き、電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガ
ラス微小電極を細胞内に刺入し、（−）極は細胞外に置
く。電位が安定したら、本発明のペプチドまたは本発明
のペプチドおよび試験化合物を含むRinger液を流して電
位変化を記録する。試験化合物の影響は、本発明のタン
パク質遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞の
細胞膜電位変化を、本発明のペプチドのみ含むRinger液
を流した場合と比較することによって測定することがで
きる。細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力
のある候補物質として選択することができる。上記の系
において、電位の変化量を増大させると、測定しやすく
なるため、各種のＧタンパク質遺伝子のｐｏｌｙ Ａ付
加ＲＮＡを導入してもよい。また、カルシウム存在下で
発光を生じるようなタンパク質（例、aequorinなど）の
遺伝子のｐｏｌｙ Ａ付加ＲＮＡを共インジェクション
することにより、膜電位変化ではなく発光量を測定する
こともできる。

【００９５】本発明のペプチドと本発明のタンパク質と
の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニ
ング用キットは、本発明のタンパク質、本発明のタンパ
ク質を含有する細胞、あるいは本発明のタンパク質を含
有する細胞の膜画分、および本発明のペプチドを含有す
るものである。本発明のスクリーニング用キットの例と
しては、次のものがあげられる。 １．スクリーニング用試薬 （i）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 （ii）本発明のタンパク質の標品 本発明のタンパク質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴
プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 （iii）標識リガンド 〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識し
た本発明のペプチド。適当な溶媒または緩衝液に溶解し
たものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定
用緩衝液にて１μＭに希釈する。 （iv）リガンド標準液 本発明のペプチドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグ
マ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−
２０℃で保存する。 ２．測定法 （i）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の
タンパク質を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで
２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加
える。 （ii）１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加
えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温
にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには
試験化合物のかわりに１０^-3Ｍの本発明のペプチドを５
μｌ加えておく。 （iii）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回
洗浄する。細胞に結合した標識した本発明のペプチドを
０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液
体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。 （iv）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社
製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Bind
ing（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。

【数１】 ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１０
０ ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【００９６】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合を
変化させる（結合を阻害または促進する）化合物であ
り、具体的には本発明のタンパク質を介して細胞刺激活
性を有する化合物またはその塩（いわゆる本発明のタン
パク質のアゴニスト（ＺＡＱアゴニスト））、または該
刺激活性を有しない化合物（いわゆる本発明のタンパク
質アンタゴニスト（ＺＡＱアンタゴニスト））である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性
化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これ
ら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合
物であってもよい。上記本発明のタンパク質のアゴニス
トであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法
は以下の（Ａ）または（Ｂ）に従えばよい。 （Ａ）前記のスクリーニング方法で示されるバインディ
ング・アッセイを行い、本発明のペプチドと本発明のタ
ンパク質との結合性を変化させる（特に、結合を阻害す
る）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明のタン
パク質を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定
する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発
明のタンパク質のアゴニストであり、該活性を有しない
化合物またはその塩は本発明のタンパク質のアンタゴニ
ストである。 （Ｂ）(a)試験化合物を本発明のタンパク質を含有する
細胞に接触させ、上記本発明のタンパク質を介した細胞
刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物また
はその塩は本発明のタンパク質のアゴニストである。 (b) 本発明のタンパク質を活性化する化合物（例えば、
本発明のペプチドまたは本発明のタンパク質のアゴニス
トなど）を本発明のタンパク質を含有する細胞に接触さ
せた場合と、本発明のタンパク質を活性化する化合物お
よび試験化合物を本発明のタンパク質を含有する細胞に
接触させた場合における、本発明のタンパク質を介した
細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明のタンパク質
を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る
化合物またはその塩は本発明のタンパク質のアンタゴニ
ストである。 該本発明のタンパク質のアゴニストは、本発明のタンパ
ク質に対する本発明のペプチドが有する生理活性と同様
の作用を有しているので、本発明のペプチドと同様に安
全で低毒性な医薬として有用である。逆に、本発明のタ
ンパク質のアンタゴニストは、本発明のタンパク質に対
する本発明のペプチドが有する生理活性を抑制すること
ができるので、該レセプター活性を抑制する安全で低毒
性な医薬として有用である。

【００９７】本発明のペプチドは腸管の収縮などを制御
する活性を有することから、消化器疾患（例、腸炎、下
痢、便秘、吸収不良性症候群など）などの疾病の治療・
予防剤等の医薬として使用することができるため、上記
のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを
用いて得られる化合物のうち、本発明のタンパク質のア
ゴニスト（ＺＡＱアゴニスト）は消化器疾患（例、腸
炎、下痢、便秘、吸収不良性症候群など）などの疾病の
治療・予防剤などとして用いることができる。また、本
発明のタンパク質のアンタゴニスト（ＺＡＱアンタゴニ
スト）は消化器疾患（例、腸炎、下痢、便秘、吸収不良
性症候群など）などの疾病の治療・予防剤などとして用
いることができる。上記のスクリーニング方法またはス
クリーニング用キットを用いて得られる化合物の塩とし
ては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられ
る。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸
との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との
塩などがあげられる。無機塩基との塩の好適な例として
は、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金
属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土
類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩な
どがあげられる。有機塩基との塩の好適な例としては、
例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジ
ン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、
ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘ
キシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ
ベンジルエチレンジアミンなどとの塩などがあげられ
る。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭
化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。有機
酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロ
ピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、
クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアル
ギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸
性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン
酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。本発明のス
クリーニング方法またはスクリーニング用キットを用い
て得られる化合物またはその塩を上述の医薬として使用
する場合、上記の本発明のペプチドを医薬として実施す
る場合と同様にして実施することができる。

【００９８】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実
施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶
性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしく
はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、ま
たは懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき
る。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認めら
れる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定
剤、結合剤などとともに一般に認められた単位用量形態
で混和することによって製造することができる。これら
製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量
が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤な
どに混和することができる添加剤としては、例えばゼラ
チン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム
のような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コ
ーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化
剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ
糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミン
ト、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用
いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前
記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有す
ることができる。注射のための無菌組成物は注射用水の
ようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのよ
うな天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの
通常の製剤実施にしたがって処方することができる。注
射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖
やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビト
ール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが
あげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（た
とえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピ
レングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン
性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ
−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ
油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸
ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウ
ム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通
常、適当なアンプルに充填される。

【００９９】このようにして得られる製剤は安全で低毒
性であるので、例えば哺乳動物（例えば、ヒト、マウ
ス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投
与することができる。本発明のスクリーニング方法また
はスクリーニング用キットを用いて得られる化合物また
はその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経
口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）に
おいては、一日につき約０.１から１０００ｍｇ、好ま
しくは約１．０から３００ｍｇ、より好ましくは約３．
０から５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、そ
の１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法な
どによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の
消化器疾患患者（体重６０ｋｇとして）への投与におい
ては、ＺＡＱアンタゴニストを一日につき約０．０１か
ら３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注
射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。

【０１００】（３）本発明のペプチドまたはその塩の定
量 本発明の抗体は、本発明のペプチドを特異的に認識する
ことができるので、被検液中の本発明のペプチドの定
量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量等に使用す
ることができる。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明の
抗体と、被検液および標識化された本発明のペプチドと
を競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本
発明のペプチドの割合を測定することを特徴とする被検
液中の本発明のペプチドの定量法、および（ii）被検液
と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された
本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させた
のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特
徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法を提供す
る。

【０１０１】また、本発明のペプチドに対するモノクロ
ーナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称す
る場合がある）を用いて本発明のペプチドの定量を行な
えるほか、組織染色等による検出を行なうこともでき
る。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよ
く、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるいは
Ｆａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発
明のペプチドの定量法は、 特に制限されるべきもので
はなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明のペプチ
ド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体
の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既
知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より
算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよ
い。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリッ
ク法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるの
が特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる
標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質等が用いられる。放射性同位元素として
は、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、
〔¹⁴Ｃ〕等が用いられる。上記酵素としては、安定で比
活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が用いら
れる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、
フルオレッセンイソチオシアネート等が用いられる。発
光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導
体、ルシフェリン、ルシゲニン等が用いられる。さら
に、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−ア
ビジン系を用いることもできる。

【０１０２】抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、
物理吸着を用いてもよく、また通常ペプチドあるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキス
トラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、
ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいは
ガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては不溶
化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ
（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクロ
ーナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体
上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発
明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２
次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なっても
よいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および
不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。ま
た、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用
抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１
種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的
で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明の
サンドイッチ法による本発明のペプチドの測定法におい
ては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノク
ローナル抗体は、本発明のペプチドの結合する部位が相
異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応
および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応
で用いられる抗体が、本発明のペプチドのＣ端部を認識
する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ
端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。

【０１０３】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリー等に用いることができ
る。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に
対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体等を用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量
を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈
降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用する
レーザーネフロメトリー等が好適に用いられる。

【０１０４】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般
的な技術手段の詳細については、総説、成書等を参照す
ることができる。例えば、入江 寛編「ラジオイムノア
ッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続
ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、
石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３
年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）
（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免
疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、
「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Tec
hniques(Part A))、同書 Vol. 73(ImmunochemicalTechn
iques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techn
iques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochemical Techni
ques(Part D:Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92
(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antib
odies andGeneral Immunoassay Methods))、 同書 Vol.
121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Te
chnology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデ
ミックプレス社発行)等を参照することができる。以上
のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本
発明のペプチドを感度良く定量することができる。さら
には、本発明の抗体を用いて本発明のペプチドの濃度を
定量することによって、（１）本発明のペプチドの濃度
の増加が検出された場合、例えば、消化器疾患（例、腸
炎、下痢、便秘、吸収不良性症候群など）に罹患してい
る、または将来罹患する可能性が高いと診断することが
できる。また、（２）本発明のペプチドの濃度の減少が
検出された場合、例えば、消化器疾患（例、腸炎、下
痢、便秘、吸収不良性症候群など）に罹患している、ま
たは将来罹患する可能性が高いと診断することができ
る。また、本発明の抗体は、体液や組織等の被検体中に
存在する本発明のペプチドを検出するために使用するこ
とができる。また、本発明のペプチドを精製するために
使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明
のペプチドの検出、被検細胞内における本発明のペプチ
ドの挙動の分析等のために使用することができる。

【０１０５】（４）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル等）における本発明のペプチド
をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異
常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡま
たはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該
ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多等の遺伝
子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上
記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダ
イゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ge
nomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、
プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Procee
dings of theNational Academy of Sciences of the Un
ited States of America），第８６巻，２７６６〜２７
７０頁（１９８９年））、 ＤＮＡマイクロアレイ等に
より実施することができる。例えば、ノーザンハイブリ
ダイゼーションやＤＮＡマイクロアレイにより発現低下
が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法やＤＮＡマイク
ロアレイによりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、
例えば、消化器疾患（例、腸炎、下痢、便秘、吸収不良
性症候群など）に罹患している可能性が高いと診断する
ことができる。 （５）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内にお
ける本発明のペプチドまたは本発明のＤＮＡの機能を抑
制することができるので、例えば、本発明のペプチドの
発現過多に起因する疾患（例えば、消化器疾患（例、腸
炎、下痢、便秘、吸収不良性症候群など））の治療・予
防剤として使用することができる。上記アンチセンスＤ
ＮＡを上記の治療・予防剤として、前記した本発明のＤ
ＮＡを含有する各種疾病の治療・予防剤と同様に使用す
ることができる。例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独
あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベク
ター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクタ
ー等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って
投与することができる。該アンチセンスＤＮＡは、その
ままで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的
に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイド
ロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞にお
ける本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるため
の診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用するこ
ともできる。さらに、本発明は、（i）本発明のペプチ
ドをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、
（ii）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、（iii）
本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部を含有する
リボザイム、（iv）前記リボザイムを含有してなる医薬
も提供する。上記アンチセンスヌクレオチドと同様に、
二重鎖ＲＮＡ（RNAi；RNA interference法）、リボザイ
ムなども、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオ
チド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができ、生体
内における本発明のペプチドまたはＤＮＡの機能抑制す
ることができるので、例えば消化器疾患（例、腸炎、下
痢、便秘、吸収不良性症候群など）の予防・治療剤など
として使用することができる。二重鎖ＲＮＡは、公知の
方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、
本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造す
ることができる。リボザイムは、公知の方法（例、TREN
DS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準
じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して
製造することができる。例えば、本発明のペプチドをコ
ードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結するこ
とによって製造することができる。本発明のペプチドを
コードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムに
よって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接
した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。上記の二重鎖Ｒ
ＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用す
る場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製
剤化し、投与することができる。

【０１０６】（６）本発明の抗体を含有する医薬および
診断薬 本発明のペプチドの活性を中和する作用を有する本発明
の抗体は、例えば、本発明のペプチドの発現過多に起因
する疾患（例えば、消化器疾患（例、腸炎、下痢、便
秘、吸収不良性症候群など））の治療・予防剤等の医薬
として、あるいは本発明のペプチドの発現過多に起因す
る疾患（例えば、消化器疾患（例、腸炎、下痢、便秘、
吸収不良性症候群など））の診断薬として使用すること
ができる。本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予
防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬
組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対し
て経口的または非経口的に投与することができる。投与
量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっ
ても異なるが、例えば、消化器疾患治療の目的で本発明
の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ
体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程
度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度
を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、
静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口
投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与する
ことができる。症状が特に重い場合には、その症状に応
じて増量してもよい。本発明の抗体は、それ自体または
適当な医薬組成物として投与することができる。上記投
与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理
学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含
むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与
に適する剤形として提供される。すなわち、例えば、経
口投与のための組成物としては、固体または液体の剤
形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠
を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカ
プセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげ
られる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、
製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは
賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、
賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸
マグネシウム等が用いられる。

【０１０７】非経口投与のための組成物としては、例え
ば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、
皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の
剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従っ
て、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用い
られる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳
化することによって調製する。注射用の水性液として
は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を
含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、
アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非
イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−
５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenat
ed castor oil）〕等と併用してもよい。油性液として
は、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤
として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用
してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプ
ルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗
体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによ
って調製される。上記の経口用または非経口用医薬組成
物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤
形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の
剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アン
プル）、坐剤等が例示され、それぞれの投薬単位剤形当
たり通常５〜５００ｍｇ程度、とりわけ注射剤では５〜
１００ｍｇ程度、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ程
度の上記抗体が含有されていることが好ましい。なお前
記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくな
い相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよ
い。

【０１０８】（７）本発明のＤＮＡを有する非ヒト動物
の作出 本発明のＤＮＡを用いて、本発明のペプチド等を発現す
るトランスジェニック非ヒト動物を作出することができ
る。非ヒト動物としては、哺乳動物（例えば、ラット、
マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サ
ルなど）など（以下、動物と略記する）が挙げられる
が、特に、マウス、ウサギなどが好適である。本発明の
ＤＮＡを対象動物に導入させるにあたっては、該ＤＮＡ
を動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し
た遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利で
ある。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを導入させ
る場合、これと相同性が高い動物由来の本発明のＤＮＡ
を動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結
合した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウサギ受精卵
へマイクロインジェクションすることによって本発明の
ペプチド等を高産生するＤＮＡ導入動物を作出できる。
このプロモーターとしては、例えば、ウイルス由来プロ
モーター、メタロチオネイン等のユビキアスな発現プロ
モーターも使用しうるが、好ましくは脳で特異的に発現
するＮＧＦ遺伝子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロ
モーターなどが用いられる。

【０１０９】受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの
導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽
細胞において本発明のペプチド等が存在することは、作
出動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本
発明のペプチド等を有することを意味する。遺伝子を受
け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細
胞の全てに本発明のペプチド等を有する。本発明のＤＮ
Ａ導入動物は、交配により遺伝子を安定に保持すること
を確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で
飼育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保
有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を
相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、
この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該
ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発
明のＤＮＡが導入された動物は、本発明のペプチド等が
高発現させられているので、本発明のペプチドの機能解
析に好適に用いられる。すなわち、本発明のＤＮＡ導入
動物を、組織培養のための細胞源として使用することも
できる。例えば、本発明のＤＮＡ導入マウスの組織中の
ＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝
子により発現された本発明のペプチドが存在する組織を
分析することにより、本発明のペプチド等について分析
することができる。本発明のペプチド等を有する組織の
細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用し
て、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難
な組織からの細胞の機能を研究することができる。ま
た、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の
機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高
発現細胞株があれば、そこから、本発明のペプチド等を
単離精製することも可能である。

【０１１０】（８）ノックアウト動物 本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、 １）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚
幹細胞、 ２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活
性化された上記１）記載の胚幹細胞、 ３）ネオマイシン耐性である上記１）記載の胚幹細胞、 ４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記１）記載の
胚幹細胞、 ５）ゲッ歯動物がマウスである上記４）記載の胚幹細
胞、 ６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物、 ７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活
性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対す
るプロモーターの制御下で発現しうる上記６）記載の非
ヒト哺乳動物、 ８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記６）記載の
非ヒト哺乳動物、 ９）ゲッ歯動物がマウスである上記８）記載の非ヒト哺
乳動物、および １０）上記７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レ
ポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発
明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害
する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供す
る。 本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細
胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人
為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制
するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のペ
プチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡ
が実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以
下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）
非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記す
る）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のも
のが用いられる。

【０１１１】本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方
法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ
配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換
させることによって行なうことができる。これらの変異
により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プ
ロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することによ
り本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。本発
明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞
（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明
のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例として
は、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明
のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐
性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬
剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝
子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊する
か、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転
写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シ
グナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを
合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊
するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以
下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば
相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られた
ＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍の
ＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーシ
ョン解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ
配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明
のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとし
たＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細
胞を選別することにより得ることができる。

【０１１２】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知
EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでも
よい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的
には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的
背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免
疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなど
の目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／
６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善し
たＢＤＦ₁マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２との
Ｆ₁）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。Ｂ
ＤＦ₁マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫である
という利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持
つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマ
ウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバックク
ロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウス
に代えることが可能である点で有利に用い得る。また、
ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の
胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚
盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期
胚を取得することができる。また、雌雄いずれのＥＳ細
胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列
キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の
手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行
なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法として
は、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の
遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげる
ことができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析
をするのに約１０⁶個の細胞数を要していたのに対し
て、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むの
で、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを
雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の
選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削
減できる。

【０１１３】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス
培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気また
は５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で
培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、ト
リプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリ
プシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１
％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化
し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法な
どがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行
なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細
胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが
望まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至
るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで
浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの
種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.
J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第
292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）
第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら、ジャー
ナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメ
ンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本
発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発
現不全細胞は、インビトロにおける本発明のペプチドの
細胞生物学的検討において有用である。本発明のＤＮＡ
発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知
方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較するこ
とにより、正常動物と区別することが可能である。該非
ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられ
る。

【０１１４】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のペプチド
のヘテロ発現不全個体であり、本発明のペプチドのヘテ
ロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明
のペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。卵
細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロ
インジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することにより
ターゲッティングベクターを染色体内に導入したトラン
スジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これら
のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子
相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを
選択することにより得られる。このようにして本発明の
ＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得
られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされているこ
とを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことが
できる。さらに、生殖系列の取得および保持についても
常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有す
る雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを
相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しう
る。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対し
て、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態
で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテ
ロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活
化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴー
ト動物を繁殖継代する。本発明のＤＮＡが不活性化され
た非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。ま
た、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明
のペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失す
るため、本発明のペプチドの生物活性の不活性化を原因
とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原
因究明及び治療法の検討に有用である。

【０１１５】（７ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷など
に起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物
のスクリーニング方法 本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予
防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることが
できる。すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を
観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠
損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を
有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供
する。該スクリーニング方法において用いられる本発明
のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様
のものがあげられる。試験化合物としては、例えば、ペ
プチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、
発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出
液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物
であってもよいし、公知の化合物であってもよい。具体
的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試
験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物
の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試
験化合物の治療・予防効果を試験することができる。試
験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、
経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、
試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することがで
きる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化
合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。

【０１１６】例えば、消化器疾患に対して予防・治療効
果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明の
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、
該動物の拘束ストレスに対する排便量変化を経時的に測
定する。該スクリーニング方法を用いて得られる化合物
は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本
発明のペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされ
る疾患に対して予防・治療効果を有するので、該疾患に
対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使
用することができる。さらに、上記スクリーニングで得
られた化合物から誘導される化合物も同様に用いること
ができる。

【０１１７】該スクリーニング方法で得られた化合物は
塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理
学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基
（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とり
わけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様
な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸
（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレ
イン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸
など）との塩などが用いられる。該スクリーニング方法
で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記
した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして製造
することができる。このようにして得られる製剤は、安
全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物
（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対し
て投与することができる。該化合物またはその塩の投与
量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異
はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般
的に成人（体重６０ｋｇとして）の消化器疾患の患者に
おいては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合
は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などに
よっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通
常成人（６０ｋｇとして）の消化器疾患の患者に投与す
る場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。

【０１１８】（７ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニン
グ方法 本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法
において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物とし
ては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入す
ることにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発
明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる
ものが用いられる。試験化合物としては、前記と同様の
ものがあげられる。レポーター遺伝子としては、前記と
同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子
またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。

【０１１９】本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換
された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レ
ポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーター
の支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードす
る物質の発現をトレースすることにより、プロモーター
の活性を検出することができる。例えば、本発明のペプ
チドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場
合、本来、本発明のペプチドの発現する組織で、本発明
のペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現す
る。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のよ
うなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染
色することにより、簡便に本発明のペプチドの動物生体
内における発現状態を観察することができる。具体的に
は、本発明のペプチド欠損マウスまたはその組織切片を
グルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩
液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室
温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させ
た後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄
することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止さ
せ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃ
ＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。上記スクリ
ーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、
上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明
のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害す
る化合物である。

【０１２０】該スクリーニング方法で得られた化合物は
塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理
学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有
機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に
許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、
例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、
硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用
いられる。本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を
促進する化合物またはその塩は、本発明のペプチドの発
現を促進し、該タンパク質の機能を促進することができ
るので、例えば、消化器疾患（例、腸炎、下痢、便秘、
吸収不良性症候群など）などの予防・治療剤などの医薬
として有用である。

【０１２１】また、本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ー活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のペプ
チドの発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害するこ
とができるので、例えば消化器疾患（例、腸炎、下痢、
便秘、吸収不良性症候群など）などの予防・治療剤など
の医薬として有用である。さらに、上記スクリーニング
で得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いる
ことができる。該スクリーニング方法で得られた化合物
またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプ
チドを含有する医薬と同様にして製造することができ
る。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であ
るので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラッ
ト、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例
えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進
する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６
０ｋｇとして）の消化器疾患患者においては、一日につ
き該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．
０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与
する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与
量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例え
ば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進す
る化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の
消化器疾患の患者に投与する場合、一日につき該化合物
を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２
０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を
静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の
場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することが
できる。

【０１２２】一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、
一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の消化器疾患の患
者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００
ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは
約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合
は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などに
よっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成
人（６０ｋｇとして）の消化器疾患の患者に投与する場
合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、
好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算
した量を投与することができる。このように、本発明の
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対
するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物ま
たはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であ
り、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因
究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することが
できる。また、本発明のＤＮＡのプロモーター領域を含
有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコ
ードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入し
ていわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）
を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、
その生体での作用を検討することも可能となる。さらに
上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合
させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発
明のペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促
進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系と
して使用できる。

【０１２３】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｙ ：チミンまたはシトシン Ｎ ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン Ｒ ：アデニンまたはグアニン Ｍ ：シトシンまたはアデニン Ｗ ：チミンまたはアデニン Ｓ ：シトシンまたはグアニン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅtまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｘａａ ：未同定アミノ酸残基

【０１２４】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬等を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅt ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 Ａｃ ：アセチル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロルベンジルオキシカルボニル Ｃｌ₂Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｃ ：t−ブチルオキシカルボニル ＨＯＢt ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＰＡＭ ：フェニルアセトアミドメチル Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｂｕｍ ：ターシャリーブトキシメチル Ｔｒt ：トリチル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン ＨＯＮＢ ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボ キシイミド ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＣＨＡＰＳ ：３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]− １−プロパンスルホナート ＰＭＳＦ ：フェニルメチルスルホニルフルオリド ＧＤＰ ：グアノシン−５'−二リン酸 Ｆｕｒａ−２ＡＭ ：１−［６−アミノ−２−（５−カルボキシ−２−オキサ ゾリル）−５−ベンゾフラニロキシ］−２−（２−アミ ノ−５メチルフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ' −四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル Ｆｌｕｏ−３ＡＭ ：１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒド ロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］ −２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン− Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸ペンタアセトキシメチルエス テル ＨＥＰＥＳ ：２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニ ル]エタンスルホン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン ＨＢＳＳ ：ハンクス平衡塩液 ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ

【０１２５】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 〔配列番号：１〕後述の実施例１で用いられたプライマ
ーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２〕後述の実施例１で用いられたプライマ
ーの塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕後述の実施例１で用いられたプライマ
ーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕後述の実施例１で用いられたプライマ
ーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕後述の実施例１で得られたＤＮＡ断片
の塩基配列を示す。 〔配列番号：６〕マウス型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：７〕マウス型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチ
ドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：８〕マウス型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：９〕マウス型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチ
ドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０〕マウス型ＺＡＱリガンド前駆体ペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を
示す。 〔配列番号：１１〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１４〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５〕後述の実施例２で得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 〔配列番号：１６〕後述の実施例２で得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 〔配列番号：１７〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１９〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２０〕後述の実施例２で得られたラット型
ＺＡＱリガンドペプチドをコードするＤＮＡの５’端塩
基配列を示す。 〔配列番号：２１〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２２〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２３〕後述の実施例２で得られたラット型
ＺＡＱリガンドペプチドをコードするＤＮＡの５’端塩
基配列を示す。 〔配列番号：２４〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２５〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２６〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２７〕後述の実施例２で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２８〕後述の実施例２で得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す（ノーマルタイプ）。 〔配列番号：２９〕後述の実施例２で得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す（Ｙタイプ）。 〔配列番号：３０〕後述の実施例２で得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す（Ｑタイプ）。

【０１２６】〔配列番号：３１〕ラット型ＺＡＱリガン
ド前駆体ぺプチド（ノーマルタイプ）のアミノ酸配列を
示す。 〔配列番号：３２〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプ
チド（ノーマルタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列
を示す。 〔配列番号：３３〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプ
チド（Ｙタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３４〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプ
チド（Ｙタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：３５〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプ
チド（Ｑタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３６〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプ
チド（Ｑタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：３７〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプ
チド（ノーマルタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３８〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプ
チド（ノーマルタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列
を示す。 〔配列番号：３９〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプ
チド（Ｙタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４０〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプ
チド（Ｙタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：４１〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプ
チド（Ｑタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４２〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプ
チド（Ｑタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：４３〕後述の実施例３で用いられたプライ
マー１の塩基配列を示す。 〔配列番号：４４〕後述の実施例３で用いられたプライ
マー２の塩基配列を示す。 〔配列番号：４５〕ヒト脳由来タンパク質ＺＡＱをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す（ＺＡＱＣ）。 〔配列番号：４６〕ヒト脳由来タンパク質ＺＡＱをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す（ＺＡＱＴ）。 〔配列番号：４７〕ヒト脳由来タンパク質ＺＡＱのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：４８〕後述の実施例４で用いられたプライ
マー３の塩基配列を示す。 〔配列番号：４９〕後述の実施例４で用いられたプライ
マー４の塩基配列を示す。 〔配列番号：５０〕後述の実施例４で用いられた ＺＡ
Ｑｐｒｏｂｅの塩基配列を示す。 〔配列番号：５１〕後述の実施例４で用いられたプライ
マーＺＡＱＣ Ｓａｌの塩基配列を示す。 〔配列番号：５２〕後述の実施例４で用いられたプライ
マーＺＡＱＣ Ｓｐｅの塩基配列を示す。 〔配列番号：５３〕後述の実施例５で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５４〕後述の実施例５で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５５〕新規Ｇタンパク質共役型レセプター
タンパク質（ｒＺＡＱ１）をコードするｃＤＮＡの塩基
配列を示す。 〔配列番号：５６〕新規Ｇタンパク質共役型レセプター
タンパク質（ｒＺＡＱ１）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：５７〕後述の実施例６で用いられたプロー
ブの塩基配列を示す。 〔配列番号：５８〕後述の実施例６で用いられたプロー
ブの塩基配列を示す。 〔配列番号：５９〕後述の実施例６で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：６０〕後述の実施例６で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：６１〕後述の実施例６で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：６２〕新規Ｇタンパク質共役型レセプター
タンパク質（ｒＺＡＱ２）をコードするｃＤＮＡの塩基
配列を示す。 〔配列番号：６３〕新規Ｇタンパク質共役型レセプター
タンパク質（ｒＺＡＱ２）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：６４〕ヘビ毒ＭＩＴ１のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：６５〕ヒト型Ｉ５Ｅレセプタータンパク質
のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：６６〕マウス由来Ｇタンパク質共役型レセ
プタータンパク質（ＧＰＲ７３）のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：６７〕マウス由来Ｇタンパク質共役型レセ
プタータンパク質（ｍＩ５Ｅ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：６８〕ヒト型Ｉ５Ｅレセプタータンパク質
をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：６９〕マウス由来Ｇタンパク質共役型レセ
プタータンパク質（ＧＰＲ７３）をコードするＤＮＡの
塩基配列を示す。 〔配列番号：７０〕マウス由来Ｇタンパク質共役型レセ
プタータンパク質（ｍＩ５Ｅ）をコードするＤＮＡの塩
基配列を示す。

【０１２７】後述の実施例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒア コリ（Escherichia coli) ＴＯＰ１０/ｐＭ
ＭＩＴは、平成１３（２００１）年１月１１日から、日
本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便
番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託センター（旧ＮＩＢＨ）に受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−７４２５として、２０００年１２月２
２日から、日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１
７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・
発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １６５２０と
して寄託されている。後述の実施例２で得られた形質転
換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＴＯＰ１
０/ｐＲＭＩＴは、平成１３（２００１）年１月１１日
から、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託
センター（旧ＮＩＢＨ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７
４２６として、２０００年１２月２２日から、財団法人
・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １６５２１
として寄託されている。後述の実施例３で得られた形質
転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ５
α／ｐＣＲ２．１−ＺＡＱＣは、平成１１（１９９９）
年８月２３日から、独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター（旧ＮＩＢＨ）に受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６８５５として、平成１１（１９９９）年８
月４日から、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番
号ＩＦＯ １６３０１として寄託されている。後述の実
施例３で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Esch
erichia coli) ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ＺＡＱＴは、
平成１１（１９９９）年８月２３日から、独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧ＮＩＢ
Ｈ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８５６として、平成
１１（１９９９）年８月４日から、財団法人・発酵研究
所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １６３０２として寄託
されている。後述の実施例５で得られた形質転換体エシ
ェリヒア コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ
２．１−ｒＺＡＱ１は、平成１２（２０００）年８月２
１日から、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物
寄託センター（旧ＮＩＢＨ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−７２７５として、平成１２（２０００）年８月１日か
ら、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ
１６４５９として寄託されている。後述の実施例６で
得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia
coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＣＭＶ−ｒＺＡＱ２は、平成１２
（２０００）年８月２１日から、独立行政法人産業技術
総合研究所 特許生物寄託センター（旧ＮＩＢＨ）に受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２７６として、平成１２（２
０００）年８月１日から、財団法人・発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ １６４６０として寄託されてい
る。

【０１２８】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載さ
れている方法に従った。

【０１２９】実施例１ マウス型ＺＡＱリガンドぺプチ
ドｃＤＮＡのクローニング マウスMultiple Tissue cDNA Panel（CLONTECH社）のbr
ainを鋳型としてプライマーmMIT1-F3（配列番号：
１）、mMIT1-R3 （配列番号：２）、mMIT1-F4（配列番
号：３）およびmMIT1-R4（配列番号：４）を作成し、以
下に記したPCR反応を実施した。 mMIT1-F3: 5'-CTTGGCCTTCTCGGCTTGTCTAG-3' （配列
番号：１） mMIT1-R3: 5'-GGTGTAAAGCAAGAGGTCACCCAGT-3' （配列
番号：２） mMIT1-F4: 5'-ACAAGGCAGCGCAGAAGGAAGT-3' （配列
番号：３） mMIT1-R4: 5'-GGCTCCAGTACAGAGTCCAGACAA-3' （配列
番号：４） PCR反応液は、50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CL
ONTECH社)を0.6 μl、添付の5x Advantage-GC 2 PCR bu
ffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5mM Mg(OA
c)₂, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BSA, 0.02
5%Tween-20, 0.025% Nonidet-P40）を6 μl、2.5 mM dN
TP mixtureを2.4 μl、10 μMプライマーmMIT1-F3およ
びmMIT1-R3を各0.6 μl 、鋳型DNAを3μl、および蒸留
水を16.8μlを混合して作製した。反応条件は94℃・3分
の初期変性後、94℃・30秒-68℃・3分のサイクル反応を35
回、および68℃・3分の最終伸長反応とした。続いて、該
PCR反応の反応液を蒸留水で50倍に希釈したものをを鋳
型としてnested PCRを行った。50X Advantage-GC 2 Pol
ymerase Mix (CLONTECH社)を0.6 μl、添付の5x Advant
age-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOA
c, 17.5 mM Mg(OAc)₂, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75
μg/ml BSA, 0.025%Tween-20,0.025% Nonidet-P40)を6
μl、2.5 mM dNTP mixtureを2.4 μl、10 μMプライマ
ーmMIT1-F4およびmMIT1-R4を各0.6 μl 、鋳型DNAを3μ
l、および蒸留水を16.8 μlを混合して作製した。反応
条件は94℃・3分の初期変性後、94℃・30秒-68℃・3分のサ
イクル反応を35回、および68℃・3分の最終伸長反応とし
た。得られたDNA断片をTOPO TA Cloning Kit (Invitrog
en社)を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従
ってクローニングした。クローニングされたDNA配列をA
BI377DNA sequencerを用いて解読し、マウスZAQリガン
ド全長ペプチドをコードする410 bpのDNA断片（配列番
号：５）を有するプラスミドを取得し、これをpMMITと
命名した。また、該塩基配列からプライマーにより規定
される部分の配列を差し引いた配列をcDNA塩基配列とし
て確定した(配列番号：１０)。該プラスミドにより大腸
菌（Escherichia coli）TOP10をトランスフォームさ
せ、大腸菌TOP10/pMMITと命名した。このDNA断片の塩基
配列を解析した結果、配列番号：５で表わされるDNA断
片は、配列番号：６で表わされるマウス型ＺＡＱリガン
ド前駆体ペプチド(105アミノ酸残基）をコードするDNA
（配列番号：７）を含んでいることが明らかとなった。
また、配列番号：７で表わされる塩基配列は典型的なシ
グナル配列を有しており、配列番号：７で表わされる塩
基配列を有するDNAは、配列番号：８で表わされるマウ
ス型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチド（86アミノ酸残基）
をコードする258塩基対からなるDNA（配列番号：９）を
含んでいることが明らかとなった。

【０１３０】実施例２ ラット型ＺＡＱリガンドぺプチ
ドｃＤＮＡのクローニング ラット脳QUICK-clone cDNA (CLONTECH社)を鋳型とし
て、degenerateプライマー MF1（配列番号：１１)、MR1
（配列番号：１２)、MF2（配列番号：１３)およびMR2
（配列番号：１４)を作成し、以下に記したPCR反応を実
施した。 MF1: 5'-TCACCYCAAGTGAYCATGAGAGG-3' （配列番
号：１１) MR1: 5'-CTAAAARTTGRYRTTCTTCAAGTCC-3' （配列番
号：１２) MF2: 5'-ATCACAGGGGCCTGTGARCG-3' （配列
番号：１３) MR2: 5'-AGCAGCGGTACCTGCCGTCC-3' （配列
番号：１４) PCR反応液は50X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTEC
H社)を0.6 μl、添付の10x Advantage 2 PCR buffer (4
00 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc)₂, 3
7.5μg/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet-P40)を
3 μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を2.4 μ
l、10 μMプライマーMF1およびMR1を 0.6 μl、鋳型cDN
Aを1 μl、および蒸留水を20.6 μlを混合して作製し
た。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-55℃
・1分-68℃・1分のサイクル反応を35回、および68℃・5分
の最終伸長反応とした。続いて、該PCR反応の反応液を
蒸留水で15倍希釈したものを鋳型としてnestedPCRを実
施した。反応液は50X Advantage 2 Polymerase Mix (CL
ONTECH社)を0.6μl、添付の10x Advantage 2 PCR buffe
r (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc,35 mM Mg(OAc)₂,
37.5μg/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet-P40)
を3 μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.4
μl、10 μMプライマーMF1およびMR1を 0.6 μl、鋳型c
DNAを1 μl、および蒸留水を20.6 μlを混合して作製し
た。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-55℃
・1分-68℃・1分のサイクル反応を35回、および68℃・5分
の最終伸長反応とした。得られたDNA断片をZaro Blunt
TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen社)を用いて添付の
マニュアルに記載された方法に従ってクローニングし
た。クローニングされたDNA配列をABI377DNA sequencer
を用いて解読し、配列番号：１５（Ｔタイプ）および配
列番号：１６（Ｃタイプ）で表される部分配列を得た。

【０１３１】上記配列の情報よりプライマー RM3-1（配
列番号：１７）、RM3-2（配列番号：１８）およびRM3-3
（配列番号：１９）を作成し、以下に記した5'RACE実験
を実施した。 RM3-1: 5'-GTGGCACTCCTCTCCTTCCCGCCCCAGA-3' （配
列番号：１７) RM3-2: 5'-CAGGCCCCGCAGCCACAGGCTGATAGCA-3' （配
列番号：１８) RM3-3: 5'-AGCAGGTGCCAGCCCCACACTGGACATC-3' （配
列番号：１９) 5'RACEのPCR反応液は50X Advantage-GC 2 Polymerase M
ix (CLONTECH社)を0.6μl、添付の5x Advantage-GC 2 P
CR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM
Mg(OAc)₂, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BS
A, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet-P40)を6 μl、dNT
P mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.4μl、10 μMプ
ライマーRM3-1を 0.6 μl、10 μMプライマーAP1（プラ
イマーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添
付のもの）を0.6 μl、鋳型cDNA（CLONTECH社、ラット
脳Marathon-Ready cDNA）を3 μl、および蒸留水を16.8
μlを混合して作製した。反応条件は94℃・30秒の初期変
性後、94℃・5秒-72℃・3分のサイクル反応を5回、94℃・5
秒-70℃・3分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-68℃・3分
のサイクル反応を25回行った。続いて、該PCR反応の反
応液を鋳型としてnested PCRを実施した。反応液は50XA
dvantage-GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社)を0.6 μ
l、添付の5x Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tric
ine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(OAc)₂, 25%Dimethyl
Sulfoxide, 18.75μg/ml BSA, 0.025%Tween-20, 0.025
% Nonidet-P40)を6 μl、dNTP mixture (2.5 mM each,
宝酒造)を2.4 μl、10 μMプライマーRM3-2またはRM3-3
を 0.6 μl、10 μMプライマーAP2（プライマーAP2はCL
ONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付のもの）を
0.6 μl、鋳型DNA（該PCR反応液50倍希釈液）を3 μl、
および蒸留水を16.8 μlを混合して作製した。反応条件
は94℃・30秒の初期変性後、94℃・5秒-68℃・3分のサイク
ル反応を30回行った。

【０１３２】得られたDNA断片をTOPO TA Cloning Kit
(Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記載された
方法に従ってクローニングした。クローニングされたDN
A配列をABI377DNA sequencerを用いて解読し、5'端の配
列（配列番号：２０）を得た。配列番号：１５および配
列番号：１６の情報よりプライマー RM5-1（配列番号：
２１)とRM5-4（配列番号：２２)を作成し、以下に記し
た3'RACE実験を実施した。 RM5-1: 5'-GGAAGGAGAGGAGTGCCACCCTGGAAG-3' （配
列番号：２１) RM5-4: 5'-ACCATACCTGTCCCTGTTCACCCAGCCT-3' （配列
番号：２２) 3'RACEのPCR反応液は50X Advantage-GC 2 Polymerase M
ix (CLONTECH社)を0.6μl、添付の5x Advantage-GC 2 P
CR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM
Mg(OAc)₂, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BS
A, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet-P40)を6 μl、dNT
P mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.4μl、10 μMプ
ライマーRM5-1を 0.6 μl、10 μMプライマーAP1（プラ
イマーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添
付のもの）を0.6 μl、鋳型cDNA（CLONTECH社、ラット
脳Marathon-Ready cDNA）を3 μl、および蒸留水を16.8
μlを混合して作製した。反応条件は94℃・1分の初期変
性後、94℃・30秒-72℃・3分のサイクル反応を5回、94℃・
30秒-70℃・3分のサイクル反応を5回、94℃・30秒-68℃・3
分のサイクル反応を25回、および68℃・3分の最終伸長反
応とした。続いて、該PCR反応の反応液を鋳型としてnes
ted PCRを実施した。反応液は50XAdvantage-GC 2 Polym
erase Mix (CLONTECH社)を0.6 μl、添付の5x Advantag
e-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc,
17.5 mM Mg(OAc)₂, 25%Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg
/ml BSA, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet-P40)を6 μ
l、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.4 μl、10
μMプライマーRM5-4またはRM3-3を 0.6 μl、10 μMプ
ライマーAP2（プライマーAP2はCLONTECH社のMarathon-R
eady cDNA Kitに添付のもの）を0.6 μl、鋳型DNA（該P
CR反応液50倍希釈液）を3 μl、および蒸留水を16.8 μ
lを混合して作製した。反応条件は94℃・1分の初期変性
後、94℃・30秒-68℃・3分のサイクル反応を35回、および
68℃・3分の最終伸長反応とした。得られたDNA断片をTOP
O TA Cloning Kit (Invitrogen社)を用いて添付のマニ
ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。ク
ローニングされたDNA配列をABI377DNA sequencerを用い
て解読し、3'端の配列（配列番号：２３）を得た。

【０１３３】ラット脳QUICK-clone cDNA (CLONTECH社）
またはラット脳cDNA (Wistar rat)を鋳型として5'RACE
および3'RACEの情報よりプライマーRBv8-WF1（配列番
号：２４)、RBv8-WF2 （配列番号：２５)、RBv8-WR1
（配列番号：２６）およびRBv8-WR2（配列番号：２７）
を作成し、以下に記したPCR反応を実施した。 RMIT-WF1: 5'-ATTCCAGAGTGGACAGTGTTTGCCTTCACC-3'
（配列番号：２４) RMIT-WF2: 5'-GATCATGAGAGGTGCTGTGCAAGTCTTC-3'
（配列番号：２５) RMIT-WR1: 5'-CTCTCTGCACGCTGCTGGACTGTTCC-3'
（配列番号：２６) RMIT-WR2: 5'-CAGATGTAACACAAGAGGTCACCCAGTAGG-3'
（配列番号：２７) PCR反応液はPfuTurbo DNA polymerase(Stratagene社)を
0.6 μl、添付の10x PCR bufferを3 μl、2.5 mM dNTP
mixtureを2.4 μl、10 μMプライマーRMIT-WF1およびRM
IT-WR1を各1.5 μl 、鋳型DNAを1μl、および蒸留水を2
0 μlを混合して作製した。反応条件は95℃・1分の初期
変性後、95℃・30秒-55℃・30秒-72℃・1分のサイクル反応
を35回、および72℃・5分の最終伸長反応とした。続い
て、該PCR反応の反応液を蒸留水で50倍に希釈したもの
をを鋳型としてnested PCRを行った。PCR反応液はPfuTu
rbo DNA polymerase (Stratagene社)を0.6μl、添付の1
0x PCR bufferを3 μl、2.5 mM dNTP mixtureを2.4 μ
l、10 μMプライマーRMIT-WF2およびRMIT-WR2を各1.5
μl 、鋳型DNAを3μl、および蒸留水を18 μlを混合し
て作製した。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・3
0秒-55℃・30秒-72℃・1分のサイクル反応を35回、および
72℃・5分の最終伸長反応とした。得られたDNA断片をZar
o Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen社)を用い
て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニ
ングした。クローニングされたDNA配列をABI377DNA seq
uencerを用いて解読し、ラットZAQリガンド全長ペプチ
ドをコードする3種の375bpのDNA断片（配列番号：２
８、配列番号：２９および配列番号：３０；塩基置換が
起こっているそれぞれをノーマルタイプ、Ｙタイプ、Ｑ
タイプとする）を有するプラスミドを、pRMIT、pRMITY
およびpHMITQとそれぞれ命名した。該プラスミドにより
大腸菌（Escherichia coli ）TOP10をトランスフォーム
させ、大腸菌TOP10/pRMIT、大腸菌TOP10/pRMITYおよび
大腸菌TOP10/pRMITQとそれぞれ命名した。

【０１３４】これらのDNA断片の塩基配列を解析した結
果、配列番号：２８で表わされるDNA断片は、配列番
号：３１で表わされるラット型ＺＡＱリガンド前駆体ペ
プチド(105アミノ酸残基）をコードするDNA（配列番
号：３２）を含んでいることが、配列番号：２９で表わ
されるDNA断片は、配列番号：３３で表わされるラット
型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド(105アミノ酸残基）を
コードするDNA（配列番号：３４）を含んでいること
が、配列番号：３０で表わされるDNA断片は、配列番
号：３５で表わされるラット型ＺＡＱリガンド前駆体ペ
プチド(105アミノ酸残基）をコードするDNA（配列番
号：３６）を含んでいることが明らかとなった。また、
配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５
で表わされる塩基配列は典型的なシグナル配列を有して
おり、配列番号：３１で表わされる塩基配列を有するDN
Aは、配列番号：３７で表わされるラット型ＺＡＱリガ
ンド成熟体ペプチド（86アミノ酸残基）をコードする25
8塩基対からなるDNA（配列番号：３８）を含んでいるこ
とが、配列番号：３３で表わされる塩基配列を有するDN
Aは、配列番号：３９で表わされるラット型ＺＡＱリガ
ンド成熟体ペプチド（86アミノ酸残基）をコードする25
8塩基対からなるDNA（配列番号：４０）を含んでいるこ
とが、配列番号：３５で表わされる塩基配列を有するDN
Aは、配列番号：４１で表わされるラット型ＺＡＱリガ
ンド成熟体ペプチド（86アミノ酸残基）をコードする25
8塩基対からなるDNA（配列番号：４２）を含んでいるこ
とが明らかとなった。配列番号：３７のアミノ酸配列に
おいて、配列番号：３９では４６番目のＨｉｓがＴｙｒ
に、配列番号：４１では３６番目のＡｒｇがＧｌｎにそ
れぞれ置換されている。

【０１３５】実施例３ Ｇタンパク質共役型レセプター
タンパク質ＺＡＱをコードするｃＤＮＡのクローニング
と塩基配列の決定 ヒト脳下垂体ｃＤＮＡ（CLONTECH社）を鋳型とし、２個
のプライマー、プライマー１（5'- GTC GAC ATG GA
G ACC ACC ATG GGG TTC ATG G -3'；配列番
号：４３）およびプライマー２（5'- ACT AGT TTA
TTT TAG TCT GAT GCA GTC CAC CTC TTC -3'；
配列番号：４４）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応
における反応液の組成は上記ｃＤＮＡの１０分の１量を
鋳型として使用し、Advantage2 Polymerase Mix（CLO
NTECH社）１／５０量、プライマー１およびプライマー
２を各0.2μM, dNTPs 200μM、および酵素に添付のバ
ッファーを加え、25μlの液量とした。ＰＣＲ反応は、
９４℃・２分の後、９４℃・２０秒、７２℃・１００秒
のサイクルを３回、９４℃・２０秒、６８℃・１００秒
のサイクルを３回、９４℃・２０秒、６４℃・２０秒、
６８℃・１００秒のサイクルを３８回繰り返し、最後に
６８℃・７分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反
応産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen社）の処
方に従いプラスミドベクターpCR2.1（Invitrogen社）へ
サブクローニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入
し、ｃＤＮＡをもつクローンをアンピシリンを含むＬＢ
寒天培地中で選択した後、個々のクローンの配列を解析
した結果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク
質をコードする２種類のｃＤＮＡ配列ＺＡＱＣ（配列番
号：４５）およびＺＡＱＴ（配列番号：４６）を得た。
このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質はいずれも同一配列（配列番号：４７）を有し
たためＺＡＱと命名し、配列番号：４５で表されるＤＮ
Ａを含有する形質転換体を大腸菌（Escherichia col
i）DH5α/pCR2.1-ZAQCならびに配列番号：４６で表され
るＤＮＡを含有する形質転換体を大腸菌DH5α/pCR2.1-Z
AQTと命名した。

【０１３６】実施例４ Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲによるＺ
ＡＱの発現分布の解析 Taqman PCRに用いるプライマーおよびプローブは、Prim
er Express ver．1.0( PEバイオシステムスジャパン)を
用いて検索し、プライマー３( 5'- TCATGTTGCTCCACTGGA
AGG - 3'（配列番号：４８）)，プライマー４（5'-CCAA
TTGTCTTGAGGTCCAGG-3'（配列番号：４９））, ZAQprobe
（5' - TTCTTACAATGGCGGTAAGTCCAGTGCAG - 3'（配列番
号：５０））を選択した。プローブのリポーター色素と
して、FAM（6-carboxyfluorescein ）を付加した。スタ
ンダードDNAとして、pAK−ZAQCを鋳型に、プライマーZA
QC Sal（5'- GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG- 3'
（配列番号：５１））およびZAQC Spe( 5'-ACTAGTTTATT
TTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC - 3' （配列番号：５２）)
を用いて増幅したPCR断片を、CHROMA SPIN200（ CLONTE
CH Laboratories，Inc．（CA，USA））を用いて精製
し、10⁰−10⁶コピ−/ μlに調整して使用した。各組識
のcDNAソースとして、Human Multiple Tissue cDNA Pan
el IおよびPanel II（CLONTECHLaboratories， Inc．）
を 使用した。プライマー、プローブ、鋳型に、TaqmanU
niversal PCR Master Mix（PEバイオシステムスジャパ
ン）を添付書類記載の規定量加え、ABI PRISM 7700 Seq
uence Detection System（PEバイオシステムズジャパ
ン）でPCR反応および解析をおこなった。結果を図８お
よび表１に示した。主に精巣、ついで肺、脳等の部位で
ZAQの発現がみられた。

【表１】組 織 ＺＡＱ（コピー数／μl） 脳（Brain） ６．１ 心臓（Heart） ２．９ 腎臓（Kidney） ２．８ 肝臓（Liver） ２．６ 肺（Lung） ７．０ 膵臓（Pancreas） ２．１ 胎盤（Placenta） ３．２ 骨格筋（Skeletal Muscle） ２．６ 大腸（Colon） １．８ 卵巣（Ovary） ３．４ 白血球（Leukocyte） ０．０ 前立腺（Prostate） ０．７ 小腸（Small Intestine） ２．２ 脾臓（Spleen） ２．１ 精巣（Testis） ２８．０ 胸腺（Thymus） １．１

【０１３７】実施例５ ラット脳ｃＤＮＡ由来新規Ｇタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質（ｒＺＡＱ１）を
コードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定 ラット全脳cDNAライブラリー（CLONTECH社）を鋳型と
し、２種類のプライマー（配列番号：５３および配列番
号：５４）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応におけ
る反応液の組成は上記cDNAを10分の１量鋳型として使用
し、 Advantage-2cDNApolymerase Mix （CLONTECH社）1
/50量、プライマー各0.2μM、dNTPs 200μM、および酵
素に添付のバッファーを加え、25μｌの液量とした。PC
R反応は、（i）94℃・2分の後、（ii）94℃・20秒、72℃
・１分30秒のサイクルを3回、（iii）94℃・20秒、68℃
・１分30秒のサイクルを3回、（iv）94℃・20秒、62℃・2
0秒、68℃１分のサイクルを36回繰り返し、最後に68℃
・7分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応産物
をTOPO−ＴＡクローニングキット（Invitrogen社）の処
方に従いプラスミドベクターpCR2.1‐TOPO（Invitrogen
社）へサブクローニングした。これを大腸菌DH5αに導
入し、cDNAを持つクローンを，アンピシリンを含むLB寒
天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した
結果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を
コードするcDNA（配列番号：５５）を得た。該cDNAの塩
基配列から導き出されるアミノ酸配列（配列番号：５
６）には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と83.7
％の相同性がみられた。このアミノ酸配列を含有する新
規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をrZAQ1と
命名した。また配列番号：５５で表わされる塩基配列を
有するDNAを含有する形質転換体（大腸菌）について
は、エシェリヒア コリ ( Escherichia coli )DH5α /
pCR2.1‐rZAQ1と命名した。

【０１３８】実施例６ ラット脳ｃＤＮＡ由来 新規Ｇ
タンパク質共役型レセプタータンパク質（ｒＺＡＱ２）
をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定 rZAQ2をコードするクローンは、genetrapper法で取得し
た。すなわち、プローブ（配列番号：５７および配列番
号：５８）をビオチン化したのち、一本鎖にしたラット
全脳cDNAライブラリー（GIBCO−BRL社）とハイブリダイ
ゼーションし、得られた一本鎖遺伝子をプライマー（配
列番号：５９および配列番号：６０）を用いて二本鎖に
修復した。この遺伝子を大腸菌DH10Bにエレクトロポー
レーションのより導入し、アンピシリン耐性を指標とし
て形質転換体を得た。さらに、プローブ（配列番号：５
７）とプライマー（配列番号：６１）を用いたコロニー
PCRで、目的とする塩基配列をコードするクローンを選
択した。このクローンの塩基配列から予測されるORF（o
pen reading frame）の塩基配列（配列番号：６２）よ
り導き出されるアミノ酸配列（配列番号：６３）は、rZ
AQ1と80.6%の相同性がみられた。このアミノ酸配列を有
する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をrZ
AQ2と命名した。また、このgenetrapper法で取得した形
質転換体（大腸菌）を、エシェリヒア コリ (Escheric
hia coli )DH10B /pCMV-rZAQ2と命名した。

【０１３９】実施例７ 本発明のタンパク質発現ＣＨＯ
細胞（ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞）の調製 実施例３で得たDH5α／pCR2.1−ZAQCの１クローンを、
アンピシリンを含むLB培地で振とう培養し、プラスミド
pCR2.1−ZAQCを得た。これを制限酵素Sal IおよびSpe I
で処理し、ZAQCをコードするインサート部分を切り出し
た。同様に制限酵素Sal IおよびSpe Iで処理したpAKKO
−1.11H（Biochemica et Biophysica Acta 1219 (1994)
251-259）と、該インサート部分をLigation Express K
it （CLONTECH Laboratories，Inc．(CA，USA））を用
いて連結し、大腸菌DH10Bにエレクトロポーレーション
法にて導入した。得られたクローンの有するプラスミド
の構造を、制限酵素処理ならびに配列解析で確認し、正
しい構築のものをCHO細胞発現用プラスミドpAK−ZAQCと
して使用した。このプラスミドpAK−ZAQCをCHO/dhfr^-細
胞（American Type Culture Collection）にCellPhect
Transfection kit（Amersham Pharmacia Biotech社）を
用いて形質導入することにより取得した。まず、蒸留水
120 μlに溶解したプラスミドDNA 4 μgに対してBuffer
A（CellPhect Transfection Kitに添付）120 μlを添
加し、撹拌し、10分間静置後、Buffer B（CellPhect Tr
ansfection Kitに添付）240 μlを添加し、激しく撹拌
し該DNAを含有するＤＮＡ−リン酸カルシウム複合体を
形成させた。 5 x 10⁵個のCHO/ dhfr^- 細胞を60 mmシャ
ーレに播き、10%のウシ胎児血清（BIO WHITTAKER 社）
を含む Ham's F-12培地（日水製薬株式会社）中で37
℃、5％炭酸ガス中で１日間培養した後、該ＤＮＡ−リ
ン酸カルシウム複合体の懸濁液480 μl をシャーレの該
細胞上に滴下させた。これを、37℃、5％炭酸ガス中に
て６時間培養した後、血清を含まない Ham's F-12培地
で２回細胞を洗浄し、シャーレの該細胞上に15％グリセ
ロールを含む緩衝液(140 mM NaCl, 25 mM HEPES, 1.4 m
M Na₂HPO₄, pH7.1) 1.2mlを添加し２分間処理した。こ
れを、再度、血清を含まないHam's F-12培地で２回洗浄
した後、10%のウシ胎児血清を含む Ham's F-12培地中で
37℃、5％炭酸ガス中で一晩培養した。該細胞をトリプ
シン処理により分散させてシャーレから回収し、2 x 10
⁴ 個ずつ6-well plateに植え込み、透析済み10%ウシ胎
児血清（JRH BIOSCIENCES 社）、1 mM MEM非必須アミノ
酸溶液（大日本製薬株式会社）、100 units/ml Penicil
lin、100 μg/ml Streptomycinを含む Dulbecco's modi
fied Eagle medium (DMEM) 培地（日水製薬株式会社）
中にて37℃、5％炭酸ガス中にて培養を開始した。 プラ
スミドの導入された形質転換CHO細胞は該培地中で生育
するが、非導入細胞は次第に死滅していくので、培養開
始後２日毎に培地を交換して死滅細胞を除去した。培養
開始８-10日後に生育してきた形質転換CHO細胞のコロニ
ーを約21個選んだ。 それぞれ選択された細胞からRNAを
市販のRNA単離用キットを用いて回収し、以降公知のRT-
PCR法によりZAQを高発現するZAQ発現CHO細胞B-1番クロ
ーン(以後ZAQC-B1細胞と略称する)を選別した。

【０１４０】

【発明の効果】本発明のペプチド、本発明のペプチドを
コードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場
合がある）および本発明のペプチドに対する抗体（以
下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、（i）本
発明のペプチドが関与する各種疾病の治療・予防剤、
（ii）本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング、
（iii）本発明のペプチドまたはその塩の定量、（iv）
遺伝子診断剤、（v）アンチセンスＤＮＡを含有する医
薬、（vi）本発明の抗体を含有する医薬、（vii）本発
明のＤＮＡを有する非ヒト動物の作製、（viii）構造的
に類似したリガンド・レセプターとの比較にもとづいた
ドラッグデザインなどの実施のために有用である。

【０１４１】

【配列表】 [SEQUENCE LISTING] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Phisiological Active Peptide and Its Use <130> P01-0294 <150> JP2001-026798 <151> 2001-02-02 <160> 70 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 1 cttggccttc tcggcttgtc tag 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 2 ggtgtaaagc aagaggtcac ccagt 25 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 3 acaaggcagc gcagaaggaa gt 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 4 ggctccagta cagagtccag acaa 24 <210> 5 <211> 410 <212> DNA <213> Mouse <400> 5 acaaggcagc gcagaaggaa gtgaggggta ccaaagtaga ctgtgtttgt cgtcacctca 60 agtgatcatg agaggcgctg tgcatatctt catcatgctc cttctagcaa cggcgtccga 120 ctgtgcggtc atcacagggg cctgtgaacg agatatccag tgtggggccg gcacctgctg 180 cgctatcagt ctgtggctgc ggggcctgcg gttgtgtacc ccactggggc gtgaaggaga 240 ggagtgccac ccaggaagcc acaagatccc cttcttgagg aaacgccaac accatacctg 300 tccctgctca cccagcctgc tgtgctccag gttcccggac ggcaggtacc gctgcttccg 360 ggacttgaag aatgccaact tttagtttgt ctggactctg tactggagcc 410 <210> 6 <211> 105 <212> PRT <213> Mouse <400> 6 Met Arg Gly Ala Val His Ile Phe Ile Met Leu Leu Leu Ala Thr Ala 1 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Ile Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Leu Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 His Lys Ile Pro Phe Leu Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Phe Arg Asp Leu Lys Asn Ala Asn Phe 100 105 <210> 7 <211> 315 <212> DNA <213> Mouse <400> 7 atgagaggcg ctgtgcatat cttcatcatg ctccttctag caacggcgtc cgactgtgcg 60 gtcatcacag gggcctgtga acgagatatc cagtgtgggg ccggcacctg ctgcgctatc 120 agtctgtggc tgcggggcct gcggttgtgt accccactgg ggcgtgaagg agaggagtgc 180 cacccaggaa gccacaagat ccccttcttg aggaaacgcc aacaccatac ctgtccctgc 240 tcacccagcc tgctgtgctc caggttcccg gacggcaggt accgctgctt ccgggacttg 300 aagaatgcca acttt 315 <210> 8 <211> 86 <212> PRT <213> Mouse <400> 8 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Ile Gln Cys Gly Ala Gly 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Leu Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Leu Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Phe Arg Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ala Asn Phe 85 <210> 9 <211> 258 <212> DNA <213> Mouse <400> 9 gcggtcatca caggggcctg tgaacgagat atccagtgtg gggccggcac ctgctgcgct 60 atcagtctgt ggctgcgggg cctgcggttg tgtaccccac tggggcgtga aggagaggag 120 tgccacccag gaagccacaa gatccccttc ttgaggaaac gccaacacca tacctgtccc 180 tgctcaccca gcctgctgtg ctccaggttc ccggacggca ggtaccgctg cttccgggac 240 ttgaagaatg ccaacttt 258 <210> 10 <211> 364 <212> DNA <213> Mouse <400> 10 gaggggtacc aaagtagact gtgtttgtcg tcacctcaag tgatcatgag aggcgctgtg 60 catatcttca tcatgctcct tctagcaacg gcgtccgact gtgcggtcat cacaggggcc 120 tgtgaacgag atatccagtg tggggccggc acctgctgcg ctatcagtct gtggctgcgg 180 ggcctgcggt tgtgtacccc actggggcgt gaaggagagg agtgccaccc aggaagccac 240 aagatcccct tcttgaggaa acgccaacac catacctgtc cctgctcacc cagcctgctg 300 tgctccaggt tcccggacgg caggtaccgc tgcttccggg acttgaagaa tgccaacttt 360 tagt 364 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 11 tcaccycaag tgaycatgag agg 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 12 ctaaaarttg ryrttcttca agtcc 25 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 13 atcacagggg cctgtgarcg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 14 agcagcggta cctgccgtcc 20 <210> 15 <211> 186 <212> DNA <213> Rat <400> 15 agatgtccag tgtggggctg gcacctgctg tgctatcagc ctgtggctgc ggggcctgag 60 gctgtgtacc cctctggggc gggaaggaga ggagtgccac cctggaagcc acaagatccc 120 tttctttagg aaacgccaac accatacctg tccctgttca cccagcctgc tgtgctccag 180 gttccc 186 <210> 16 <211> 186 <212> DNA <213> Rat <400> 16 agatgtccag tgtggggctg gcacctgctg tgctatcagc ctgtggctgc ggggcctgag 60 gctgtgcacc cctctggggc gggaaggaga ggagtgccac cctggaagcc acaagatccc 120 tttctttagg aaacgccaac accatacctg tccctgttca cccagcctgc tgtgctccag 180 gttccc 186 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 17 gtggcactcc tctccttccc gccccaga 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 18 caggccccgc agccacaggc tgatagca 28 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 19 agcaggtgcc agccccacac tggacatc 28 <210> 20 <211> 244 <212> DNA <213> Rat <400> 20 agagagatga ggcatttaga ggcagccctg gatccgacta tataaatctg aaggaggtaa 60 ggtaggacag cttggccttc ttagcttgtc tagtgcaagg cagtgcagaa ggaagtgagg 120 gattccagag tggacagtgt ttgccttcac cccaagtgat catgagaggt gctgtgcaag 180 tcttcatcat gctccttcta gcaactgtct ctgactgtgc ggtgatcaca ggggcctgtg 240 aacg 244 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 21 ggaaggagag gagtgccacc ctggaag 27 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 22 accatacctg tccctgttca cccagcct 28 <210> 23 <211> 464 <212> DNA <213> Rat <400> 23 ctgttcaccc agcctgctgt gctccaggtt cccagatggc aggtaccgct gctcccagga 60 cttgaagaat gtcaactttt agtttatctg gactctgtct gggtccctac tgggtgacct 120 cttgtgttac atctgtgtga cttagttccg tgcaacttct ccactcccca ccctgtccgt 180 gtgtgtgcag acaagcatat cttccactac ggaacagtcc agcagcgtgc agagaggagt 240 ttgcagcctt gagaagtggg ccagcctggc cttcctggcc agaccgcctg aagttgtgac 300 actgggacct cctcaattgt ctgcccttcc tgcatgtgcc cttctcccta aaccacacct 360 cccaggccct ggcctgtggg tgcgtcacta agtcacgggg tctatggggg gaagatcaac 420 attctcctca ttttctttca ttggctagct ccttgtttta ggag 464 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 24 attccagagt ggacagtgtt tgccttcacc 30 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 25 gatcatgaga ggtgctgtgc aagtcttc 28 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 26 ctctctgcac gctgctggac tgttcc 26 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 27 cagatgtaac acaagaggtc acccagtagg 30 <210> 28 <211> 375 <212> DNA <213> Rat <400> 28 gatcatgaga ggtgctgtgc aagtcttcat catgctcctt ctagcaactg tctctgactg 60 tgcggtgatc acaggggcct gtgaacgaga tgtccagtgt ggggctggca cctgctgtgc 120 tatcagcctg tggctgcggg gcctgaggct gtgtacccct ctggggcggg aaggagagga 180 gtgccaccct ggaagccaca agatcccttt ctttaggaaa cgccaacacc atacctgtcc 240 ctgttcaccc agcctgctgt gctccaggtt cccagatggc aggtaccgct gctcccagga 300 cttgaagaat gtcaactttt agtttatctg gactctgtct gggtccctac tgggtgacct 360 cttgtgttac atctg 375 <210> 29 <211> 375 <212> DNA <213> Rat <400> 29 gatcatgaga ggtgctgtgc aagtcttcat catgctcctt ctagcaactg tctctgactg 60 tgcggtgatc acaggggcct gtgaacgaga tgtccagtgt ggggctggca cctgctgtgc 120 tatcagcctg tggctgcggg gcctgaggct gtgtacccct ctggggcggg aaggagagga 180 gtgccaccct ggaagctaca agatcccttt ctttaggaaa cgccaacacc atacctgtcc 240 ctgttcaccc agcctgctgt gctccaggtt cccagatggc aggtaccgct gctcccagga 300 cttgaagaat gtcaactttt agtttatctg gactctgtct gggtccctac tgggtgacct 360 cttgtgttac atctg 375 <210> 30 <211> 375 <212> DNA <213> Rat <400> 30 gatcatgaga ggtgctgtgc aagtcttcat catgctcctt ctagcaactg tctctgactg 60 tgcggtgatc acaggggcct gtgaacgaga tgtccagtgt ggggctggca cctgctgtgc 120 tatcagcctg tggctgcggg gcctgaggct gtgtacccct ctggggcagg aaggagagga 180 gtgccaccct ggaagccaca agatcccttt ctttaggaaa cgccaacacc atacctgtcc 240 ctgttcaccc agcctgctgt gctccaggtt cccagatggc aggtaccgct gctcccagga 300 cttgaagaat gtcaactttt agtttatctg gactctgtct gggtccctac tgggtgacct 360 cttgtgttac atctg 375 <210> 31 <211> 105 <212> PRT <213> Rat <400> 31 Met Arg Gly Ala Val Gln Val Phe Ile Met Leu Leu Leu Ala Thr Val 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Leu Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 His Lys Ile Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Ser Gln Asp Leu Lys Asn Val Asn Phe 100 105 <210> 32 <211> 315 <212> DNA <213> Rat <400> 32 atgagaggtg ctgtgcaagt cttcatcatg ctccttctag caactgtctc tgactgtgcg 60 gtgatcacag gggcctgtga acgagatgtc cagtgtgggg ctggcacctg ctgtgctatc 120 agcctgtggc tgcggggcct gaggctgtgt acccctctgg ggcgggaagg agaggagtgc 180 caccctggaa gccacaagat ccctttcttt aggaaacgcc aacaccatac ctgtccctgt 240 tcacccagcc tgctgtgctc caggttccca gatggcaggt accgctgctc ccaggacttg 300 aagaatgtca acttt 315 <210> 33 <211> 105 <212> PRT <213> Rat <400> 33 Met Arg Gly Ala Val Gln Val Phe Ile Met Leu Leu Leu Ala Thr Val 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Leu Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 Tyr Lys Ile Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Ser Gln Asp Leu Lys Asn Val Asn Phe 100 105 <210> 34 <211> 315 <212> DNA <213> Rat <400> 34 atgagaggtg ctgtgcaagt cttcatcatg ctccttctag caactgtctc tgactgtgcg 60 gtgatcacag gggcctgtga acgagatgtc cagtgtgggg ctggcacctg ctgtgctatc 120 agcctgtggc tgcggggcct gaggctgtgt acccctctgg ggcgggaagg agaggagtgc 180 caccctggaa gctacaagat ccctttcttt aggaaacgcc aacaccatac ctgtccctgt 240 tcacccagcc tgctgtgctc caggttccca gatggcaggt accgctgctc ccaggacttg 300 aagaatgtca acttt 315 <210> 35 <211> 105 <212> PRT <213> Rat <400> 35 Met Arg Gly Ala Val Gln Val Phe Ile Met Leu Leu Leu Ala Thr Val 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Leu Cys Thr Pro Leu Gly Gln Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 His Lys Ile Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Ser Gln Asp Leu Lys Asn Val Asn Phe 100 105 <210> 36 <211> 315 <212> DNA <213> Rat <400> 36 atgagaggtg ctgtgcaagt cttcatcatg ctccttctag caactgtctc tgactgtgcg 60 gtgatcacag gggcctgtga acgagatgtc cagtgtgggg ctggcacctg ctgtgctatc 120 agcctgtggc tgcggggcct gaggctgtgt acccctctgg ggcaggaagg agaggagtgc 180 caccctggaa gccacaagat ccctttcttt aggaaacgcc aacaccatac ctgtccctgt 240 tcacccagcc tgctgtgctc caggttccca gatggcaggt accgctgctc ccaggacttg 300 aagaatgtca acttt 315 <210> 37 <211> 86 <212> PRT <213> Rat <400> 37 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Leu Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Gln Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Val Asn Phe 85 <210> 38 <211> 258 <212> DNA <213> Rat <400> 38 gcggtgatca caggggcctg tgaacgagat gtccagtgtg gggctggcac ctgctgtgct 60 atcagcctgt ggctgcgggg cctgaggctg tgtacccctc tggggcggga aggagaggag 120 tgccaccctg gaagccacaa gatccctttc tttaggaaac gccaacacca tacctgtccc 180 tgttcaccca gcctgctgtg ctccaggttc ccagatggca ggtaccgctg ctcccaggac 240 ttgaagaatg tcaacttt 258 <210> 39 <211> 86 <212> PRT <213> Rat <400> 39 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Leu Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser Tyr Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Gln Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Val Asn Phe 85 <210> 40 <211> 258 <212> DNA <213> Rat <400> 40 gcggtgatca caggggcctg tgaacgagat gtccagtgtg gggctggcac ctgctgtgct 60 atcagcctgt ggctgcgggg cctgaggctg tgtacccctc tggggcggga aggagaggag 120 tgccaccctg gaagctacaa gatccctttc tttaggaaac gccaacacca tacctgtccc 180 tgttcaccca gcctgctgtg ctccaggttc ccagatggca ggtaccgctg ctcccaggac 240 ttgaagaatg tcaacttt 258 <210> 41 <211> 86 <212> PRT <213> Rat <400> 41 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Leu Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Gln Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Gln Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Val Asn Phe 85 <210> 42 <211> 258 <212> DNA <213> Rat <400> 42 gcggtgatca caggggcctg tgaacgagat gtccagtgtg gggctggcac ctgctgtgct 60 atcagcctgt ggctgcgggg cctgaggctg tgtacccctc tggggcagga aggagaggag 120 tgccaccctg gaagccacaa gatccctttc tttaggaaac gccaacacca tacctgtccc 180 tgttcaccca gcctgctgtg ctccaggttc ccagatggca ggtaccgctg ctcccaggac 240 ttgaagaatg tcaacttt 258 <210> 43 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 43 gtcgacatgg agaccaccat ggggttcatg g 31 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 44 actagtttat tttagtctga tgcagtccac ctcttc 36 <210> 45 <211> 1179 <212> DNA <213> Human <400> 45 atggagacca ccatggggtt catggatgac aatgccacca acacttccac cagcttcctt 60 tctgtgctca accctcatgg agcccatgcc acttccttcc cattcaactt cagctacagc 120 gactatgata tgcctttgga tgaagatgag gatgtgacca attccaggac gttctttgct 180 gccaagattg tcattgggat ggccctggtg ggcatcatgc tggtctgcgg cattggaaac 240 ttcatcttta tcgctgccct ggtccgctac aagaaactgc gcaacctcac caacctgctc 300 atcgccaacc tggccatctc tgacttcctg gtggccattg tctgctgccc ctttgagatg 360 gactactatg tggtgcgcca gctctcctgg gagcacggcc acgtcctgtg cacctctgtc 420 aactacctgc gcactgtctc tctctatgtc tccaccaatg ccctgctggc catcgccatt 480 gacaggtatc tggctattgt ccatccgctg agaccacgga tgaagtgcca aacagccact 540 ggcctgattg ccttggtgtg gacggtgtcc atcctgatcg ccatcccttc cgcctacttc 600 accaccgaga cggtcctcgt cattgtcaag agccaggaaa agatcttctg cggccagatc 660 tggcctgtgg accagcagct ctactacaag tcctacttcc tctttatctt tggcatagaa 720 ttcgtgggcc ccgtggtcac catgaccctg tgctatgcca ggatctcccg ggagctctgg 780 ttcaaggcgg tccctggatt ccagacagag cagatccgca agaggctgcg ctgccgcagg 840 aagacggtcc tggtgctcat gtgcatcctc accgcctacg tgctatgctg ggcgcccttc 900 tacggcttca ccatcgtgcg cgacttcttc cccaccgtgt tcgtgaagga gaagcactac 960 ctcactgcct tctacatcgt cgagtgcatc gccatgagca acagcatgat caacactctg 1020 tgcttcgtga ccgtcaagaa cgacaccgtc aagtacttca aaaagatcat gttgctccac 1080 tggaaggctt cttacaatgg cggtaagtcc agtgcagacc tggacctcaa gacaattggg 1140 atgcctgcca ccgaagaggt ggactgcatc agactaaaa 1179 <210> 46 <211> 1179 <212> DNA <213> Human <400> 46 atggagacca ccatggggtt catggatgac aatgccacca acacttccac cagcttcctt 60 tctgtgctca accctcatgg agcccatgcc acttccttcc cattcaactt cagctacagc 120 gactatgata tgcctttgga tgaagatgag gatgtgacca attccaggac gttctttgct 180 gccaagattg tcattgggat ggccctggtg ggcatcatgc tggtctgcgg cattggaaac 240 ttcatcttta tcgctgccct ggtccgctac aagaaactgc gcaacctcac caacctgctc 300 atcgccaacc tggccatctc tgacttcctg gtggccattg tctgctgccc ctttgagatg 360 gactactatg tggtgcgcca gctctcctgg gagcacggcc acgtcctgtg cacctctgtc 420 aactacctgc gcactgtctc tctctatgtc tccaccaatg ccctgctggc catcgccatt 480 gacaggtatc tggctattgt ccatccgctg agaccacgga tgaagtgcca aacagccact 540 ggcctgattg ccttggtgtg gacggtgtcc atcctgatcg ccatcccttc cgcctacttc 600 accaccgaga cggtcctcgt cattgtcaag agccaggaaa agatcttctg cggccagatc 660 tggcctgtgg accagcagct ctactacaag tcctacttcc tctttatctt tggcatagaa 720 ttcgtgggcc ccgtggtcac catgaccctg tgctatgcca ggatctcccg ggagctctgg 780 ttcaaggcgg tccctggatt ccagacagag cagatccgca agaggctgcg ctgccgcagg 840 aagacggtcc tggtgctcat gtgcatcctc accgcctacg tgctatgctg ggcgcccttc 900 tacggcttca ccatcgtgcg cgacttcttc cccaccgtgt ttgtgaagga gaagcactac 960 ctcactgcct tctacatcgt cgagtgcatc gccatgagca acagcatgat caacactctg 1020 tgcttcgtga ccgtcaagaa cgacaccgtc aagtacttca aaaagatcat gttgctccac 1080 tggaaggctt cttacaatgg cggtaagtcc agtgcagacc tggacctcaa gacaattggg 1140 atgcctgcca ccgaagaggt ggactgcatc agactaaaa 1179 <210> 47 <211> 393 <212> PRT <213> Human <400> 47 Met Glu Thr Thr Met Gly Phe Met Asp Asp Asn Ala Thr Asn Thr Ser 5 10 15 Thr Ser Phe Leu Ser Val Leu Asn Pro His Gly Ala His Ala Thr Ser 20 25 30 Phe Pro Phe Asn Phe Ser Tyr Ser Asp Tyr Asp Met Pro Leu Asp Glu 35 40 45 Asp Glu Asp Val Thr Asn Ser Arg Thr Phe Phe Ala Ala Lys Ile Val 50 55 60 Ile Gly Met Ala Leu Val Gly Ile Met Leu Val Cys Gly Ile Gly Asn 65 70 75 80 Phe Ile Phe Ile Ala Ala Leu Val Arg Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Thr Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Ala Ile Ser Asp Phe Leu Val Ala 100 105 110 Ile Val Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp Tyr Tyr Val Val Arg Gln Leu 115 120 125 Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys Thr Ser Val Asn Tyr Leu Arg 130 135 140 Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn Ala Leu Leu Ala Ile Ala Ile 145 150 155 160 Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Pro Leu Arg Pro Arg Met Lys Cys 165 170 175 Gln Thr Ala Thr Gly Leu Ile Ala Leu Val Trp Thr Val Ser Ile Leu 180 185 190 Ile Ala Ile Pro Ser Ala Tyr Phe Thr 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Cys Phe Val Thr Val Lys Asn Asn 325 330 335 Thr Met Lys Tyr Phe Lys Lys Met Leu Arg Leu His Trp Arg Pro Ser 340 345 350 His Tyr Gly Ser Lys Ser Ser Ala Asp Leu Asp Leu Lys Thr Ser Gly 355 360 365 Val Pro Ala Thr Glu Glu Val Asp Cys Ile Arg Leu Lys 370 375 380 <210> 68 <211> 1152 <212> DNA <213> Human <400> 68 atggcagccc agaatggaaa caccagtttc acacccaact ttaatccacc ccaagaccat 60 gcctcctccc tctcctttaa cttcagttat ggtgattatg acctccctat ggatgaggat 120 gaggacatga ccaagacccg gaccttcttc gcagccaaga tcgtcattgg cattgcactg 180 gcaggcatca tgctggtctg cggcatcggt aactttgtct ttatcgctgc cctcacccgc 240 tataagaagt tgcgcaacct caccaatctg ctcattgcca acctggccat ctccgacttc 300 ctggtggcca tcatctgctg ccccttcgag atggactact acgtggtacg gcagctctcc 360 tgggagcatg gccacgtgct ctgtgcctcc gtcaactacc tgcgcaccgt ctccctctac 420 gtctccacca atgccttgct ggccattgcc attgacagat atctcgccat cgttcacccc 480 ttgaaaccac ggatgaatta tcaaacggcc tccttcctga tcgccttggt ctggatggtg 540 tccattctca ttgccatccc atcggcttac tttgcaacag aaaccgtcct ctttattgtc 600 aagagccagg agaagatctt ctgtggccag atctggcctg tggatcagca gctctactac 660 aagtcctact tcctcttcat ctttggtgtc gagttcgtgg gccctgtggt caccatgacc 720 ctgtgctatg ccaggatctc ccgggagctc tggttcaagg cagtccctgg gttccagacg 780 gagcagattc gcaagcggct gcgctgccgc aggaagacgg tcctggtgct catgtgcatt 840 ctcacggcct atgtgctgtg ctgggcaccc ttctacggtt tcaccatcgt tcgtgacttc 900 ttccccactg tgttcgtgaa ggaaaagcac tacctcactg ccttctacgt ggtcgagtgc 960 atcgccatga gcaacagcat gatcaacacc gtgtgcttcg tgacggtcaa gaacaacacc 1020 atgaagtact tcaagaagat gatgctgctg cactggcgtc cctcccagcg ggggagcaag 1080 tccagtgctg accttgacct cagaaccaac ggggtgccca ccacagaaga agtggactgt 1140 atcaggctga ag 1152 <210> 69 <211> 1179 <212> DNA <213> Mouse <400> 69 atggagacca ctgtcggggc tctgggtgag aataccacag acaccttcac cgacttcttt 60 tctgcactcg atggccatga agcccaaacc ggctcgttac cattcacttt cagctacggt 120 gactatgaca tgcccctgga tgaagaggaa gatgtgacca attctcggac tttctttgct 180 gccaagattg tcattggcat ggctttggtg ggtatcatgc tagtgtgtgg catcggcaac 240 ttcatcttta tcactgccct ggcccgctac aaaaagctcc gcaacctcac caacctgctt 300 atcgccaacc tggccatttc agacttcctc gtggccatcg tgtgctgccc ctttgagatg 360 gactactatg tggtgcgcca gctctcctgg gagcatggtc atgtcctgtg cgcctctgtc 420 aactacttgc gtaccgtctc cctctacgtc tccactaacg ccctactggc cattgccatt 480 gacaggtatc tggccattgt gcacccgctg agaccgcgga tgaagtgtca aacagccgcc 540 ggcctgatct tcctggtgtg gtcagtatcc atcctcatcg ccattccagc tgcctacttc 600 accactgaga ccgtgctggt catcgtggag agacaggaga agatcttctg tggtcagatc 660 tggccggtgg atcagcagtt ctactacagg tcctatttcc ttttggtttt cggcctcgag 720 ttcgtgggcc ccgtagtcgc catgaccttg tgctatgcca gggtgtcccg ggagctctgg 780 ttcaaggcgg tgccaggctt ccagacagag cagatccgcc ggacggtgcg ctgccgccgc 840 aggacggtgc tggggctcgt gtgcgtcctc tctgcctatg tgctgtgctg ggctcccttc 900 tatggcttca ctatcgtgcg tgacttcttc ccctccgtgt ttgtgaagga gaagcactac 960 ctcaccgcct tctatgtggt ggagtgcatc gccatgagca acagcatgat caatacgctc 1020 tgctttgtga ctgtcaggaa taacaccagt aagtacctca agaggatcct gcggcttcag 1080 tggagggcct ctcccagcgg gagcaaggcc agcgctgacc tcgacctcag gaccacggga 1140 atacctgcca ccgaggaggt ggactgcatc cgactgaaa 1179 <210> 70 <211> 1143 <212> DNA <213> Mouse <400> 70 atgggacccc agaacagaaa cactagcttt gcaccagact tgaatccacc ccaagaccat 60 gtctccttaa actacagtta tggtgattat gacctccccc tgggtgagga tgaggatgtg 120 accaagacac agaccttctt tgcagccaaa attgtcattg gcgtggcact ggcaggcatc 180 atgctggtct gcggcattgg caactttgtc ttcattgctg ccctcgcccg ctacaagaag 240 ctgcgcaacc ttaccaacct cctcattgct aacctggcca tctctgactt cctggtggcg 300 atcgtctgct gcccctttga gatggactat tatgtagtac ggcagctttc ctgggcgcat 360 ggtcacgtgc tttgtgcctc cgtcaactac cttcgtacgg tctccctgta cgtctccacc 420 aacgctctgc tggccatcgc tattgacaga tacctcgcta ttgtccaccc tttgaaacca 480 cggatgaatt atcagaccgc ttccttcctg atcgctttgg tctggatggt ctccatcctc 540 atcgctgtcc catctgccta cttcaccaca gaaaccatcc tcgttatcgt caagaatcaa 600 gaaaaaatct tctgtggtca gatctggtcg gtggaccagc agctctacta caaatcctac 660 ttcctcttcg tcttcgggct tgagttcgtg ggtcccgtgg tcactatgac cctgtgctat 720 gccaggatct cccaagagct ctggttcaag gctgtacctg gcttccagac ggagcaaatc 780 cgcaagcggc tgcgttgccg ccgcaagaca gtgctactgc tcatgggcat cctcacagcc 840 tacgtgctgt gctgggcgcc gttctatggc tttaccatag tgcgagactt cttccccacg 900 gtagttgtga aggagaagca ctacctcacc gccttctacg tcgtggagtg cattgccatg 960 agcaacagca tgatcaatac tatatgcttc gtgacggtca agaacaacac catgaaatac 1020 ttcaagaaga tgctgcggct ccactggcgg ccctctcact acgggagtaa gtccagcgct 1080 gacctcgacc tcaaaaccag cggggtgcct gccactgaag aggtggattg tatcagacta 1140 aag 1143

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３で得られたヒト脳由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列（ＺＡＱＣ）、およびそれか
ら推定されるアミノ酸配列を示す（図２に続く）。

【図２】実施例３で得られたヒト脳由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列（ＺＡＱＣ）、およびそれか
ら推定されるアミノ酸配列を示す（図１の続き、図３に
続く）。

【図３】実施例３で得られたヒト脳由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列（ＺＡＱＣ）、およびそれか
ら推定されるアミノ酸配列を示す（図２の続き）。

【図４】実施例３で得られたヒト脳由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列（ＺＡＱＴ）、およびそれか
ら推定されるアミノ酸配列を示す（図５に続く）。

【図５】実施例３で得られたヒト脳由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列（ＺＡＱＴ）、およびそれか
ら推定されるアミノ酸配列を示す（図４の続き、図６に
続く）。

【図６】実施例３で得られたヒト脳由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列（ＺＡＱＴ）、およびそれか
ら推定されるアミノ酸配列を示す（図５の続き）。

【図７】実施例３で得られたヒト脳由来タンパク質の疎
水性プロットを示す。

【図８】実施例４で行われたＺＡＱの発現分布の解析結
果を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/10 Ａ６１Ｐ 1/12 ４Ｈ０４５ 1/12 1/14 1/14 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ Ｂ (72)発明者 高津 吉広 茨城県つくば市竹園１丁目６番地２ つく ば・さくら団地905−505 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 HA01 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90 AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 ZA66 ZA72 ZA73 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA21 CA40 DA75 EA25 EA50 FA74

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：８もしくは配列番号：３７で表
   わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
   ノ酸配列を含有することを特徴とするペプチドまたはそ
   の塩。
2. 【請求項２】配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を
   含有する請求項１記載のペプチドまたはその塩。
3. 【請求項３】配列番号：３７、配列番号：３９または配
   列番号：４１で表わされるアミノ酸配列を含有する請求
   項１記載のペプチドまたはその塩。
4. 【請求項４】配列番号：６もしくは配列番号：３１で表
   わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
   ノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１記載のペ
   プチドまたはその塩。
5. 【請求項５】配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を
   含有する請求項１記載のペプチドまたはその塩。
6. 【請求項６】配列番号：３１、配列番号：３３または配
   列番号：３５で表わされるアミノ酸配列を含有する請求
   項１記載のペプチドまたはその塩。
7. 【請求項７】請求項１記載のペプチドの部分ペプチドま
   たはその塩。
8. 【請求項８】請求項１記載のペプチドをコードするポリ
   ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】ＤＮＡである請求項７記載のポリヌクレオ
   チド。
10. 【請求項１０】配列番号：９、配列番号：３８、配列番
    号：４０または配列番号：４２で表される塩基配列を含
    有する請求項９記載のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】配列番号：７、配列番号：３２、配列番
    号：３４または配列番号：３６で表される塩基配列を有
    する請求項９記載のＤＮＡ。
12. 【請求項１２】請求項８記載のポリヌクレオチドを含有
    する組換えベクター。
13. 【請求項１３】請求項１２記載の組換えベクターで形質
    転換された形質転換体。
14. 【請求項１４】請求項１３記載の形質転換体を培養し、
    請求項１記載のペプチドを生成・蓄積せしめることを特
    徴とする請求項１記載のペプチドまたはその塩の製造
    法。
15. 【請求項１５】請求項１記載のペプチドもしくはその部
    分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
16. 【請求項１６】請求項１記載のペプチドもしくはその部
    分ペプチドまたはその塩および配列番号：４７、配列番
    号：５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番
    号：６６もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸
    配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を
    用いることを特徴とする、請求項１記載のペプチドまた
    はその塩と配列番号：４７、配列番号：５６、配列番
    号：６３、配列番号：６５、配列番号：６６もしくは配
    列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と同一または実
    質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質または
    その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のス
    クリーニング方法。
17. 【請求項１７】請求項１記載のペプチドもしくはその部
    分ペプチドまたはその塩および配列番号：４７、配列番
    号：５６、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番
    号：６６もしくは配列番号：６７で表わされるアミノ酸
    配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を
    含有することを特徴とする、請求項１記載のペプチドま
    たはその塩と配列番号：４７、配列番号：５６、配列番
    号：６３、配列番号：６５、配列番号：６６もしくは配
    列番号：６７で表わされるアミノ酸配列と同一または実
    質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質または
    その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のス
    クリーニング用キット。
18. 【請求項１８】請求項１６記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項１１記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、請求項１記載のペプチドまたはその塩と配列
    番号：４７、配列番号：５６、配列番号：６３、配列番
    号：６５、配列番号：６６もしくは配列番号：６７で表
    わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
    ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性
    を変化させる化合物またはその塩。
19. 【請求項１９】請求項１８記載の化合物またはその塩を
    含有してなる医薬。
20. 【請求項２０】消化器疾患の予防・治療剤である請求項
    １９記載の医薬。
21. 【請求項２１】請求項１５記載の抗体を含有してなる診
    断薬。
22. 【請求項２２】消化器疾患の診断薬である請求項２１記
    載の診断薬。
23. 【請求項２３】外来性の、請求項９記載のＤＮＡまたは
    その変異ＤＮＡを含有する非ヒト哺乳動物。
24. 【請求項２４】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求
    項２３記載の動物。
25. 【請求項２５】ゲッ歯動物がマウスまたはラットである
    請求項２４記載の動物。
26. 【請求項２６】外来性の、請求項９記載のＤＮＡまたは
    その変異ＤＮＡを含有し、非ヒト哺乳動物において発現
    しうる組換えベクター。
27. 【請求項２７】請求項９記載のＤＮＡが不活性化された
    非ヒト哺乳動物胚幹細胞。
28. 【請求項２８】ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入するこ
    とにより不活性化された請求項２７記載の胚幹細胞。
29. 【請求項２９】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求
    項２７記載の胚幹細胞。
30. 【請求項３０】ゲッ歯動物がマウスである請求項２９記
    載の胚幹細胞。
31. 【請求項３１】請求項９記載のＤＮＡが不活性化された
    該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物。
32. 【請求項３２】ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入するこ
    とにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明の
    ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる請求
    項３１記載の非ヒト哺乳動物。
33. 【請求項３３】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求
    項３１記載の非ヒト哺乳動物。
34. 【請求項３４】ゲッ歯動物がマウスである請求項３３記
    載の動物。
35. 【請求項３５】請求項３２記載の動物に、試験化合物を
    投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴
    とする請求項９記載のＤＮＡに対するプロモーター活性
    を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
    ング方法。
36. 【請求項３６】哺乳動物に対し、請求項１８記載の化合
    物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする消
    化器疾患の予防・治療方法。
37. 【請求項３７】消化器疾患予防・治療剤を製造するため
    の、請求項１８記載の化合物またはその塩の使用。