JP2003292455A - 血管新生阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】血管新生阻害剤の提供 【解決手段】新規蛋白質等の活性を促進または阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング方法／スクリーニ
ング用キット、該スクリーニングによって得られる化合
物またはその塩、該化合物またはその塩を含有してなる
医薬など。 【効果】本発明のスクリーニングで得られる化合物また
はその塩は、例えば、血管新生阻害剤などとして、癌、
卵巣疾患、炎症性疾患、糖尿病性網膜症などの予防・治
療に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、（１）（i）配列
番号：２１、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番
号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：１９もしく
は配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまた
はその塩、および（ii）オーファンレセプター蛋白質で
ある配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、
配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配
列番号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わされる
アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列
を含有する蛋白質またはその塩とを用いる血管新生阻害
剤として有用な化合物またはその塩などのスクリーニン
グ方法／キット、（２）配列番号：１、配列番号：４
４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５
３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番
号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩
の活性を阻害する血管新生阻害剤、（３）配列番号：１
７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
蛋白質またはその塩、その製造法および用途などに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】各種の分泌蛋白質を集めたライブラリー
からウシ副腎毛細血管内皮細胞に対する新たな増殖因子
が見出された（非特許文献１ Nature、412巻、877-884
頁、2001年)。上記物質は、既知の血管内皮細胞増殖因
子VEGFとは異なり、内分泌性組織由来の内皮細胞に特異
的な増殖因子であり、この性質からEG-VEGFと名づけら
れた。EG-VEGFは生理的には内分泌組織を特徴づける透
過性の高い内皮構造（fenestrate）の形成に関与するこ
とが示唆されている。また、その遺伝子の転写制御領域
には低酸素下での発現誘導に関わるhypoxia-inducible
factor-1（HIF-1）の認識部位が存在し、実際に副腎由
来の癌細胞では、低酸素下でのEG-VEGF遺伝子発現誘導
が確認された。さらに、ヒト多嚢胞性卵巣症候群（poly
cystic ovarysyndrome）ではEG-VEGFの強発現が認めら
れたとの記載がなされている。一方、EG-VEGF（ZAQリガ
ンドペプチドとも記載する）はオーファン受容体である
ZAQに結合し、ZAQを活性化する（特許文献１ WO 01/163
09号公報)。回腸収縮活性を有するZAQリガンドペプチド
（WO 02/6483号公報）はヘビから単離されたMIT1（FEBS
Letters 461巻、183-188頁、1999年）に配列上の類似
性が高く、その哺乳類型ペプチドであり、ヒト型ZAQリ
ガンドペプチドのみならず、ヘビ毒MIT1およびそのヒト
型ホモログペプチドもZAQに結合し、これを活性化す
る。

【非特許文献１】Nature、412巻、877-884頁、2001年

【特許文献１】WO 01/16309号公報

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】現在、VEGF受容体の作
用を抑制する化合物が、その血管新生阻害作用に基づい
て抗癌剤として開発されつつあるものの、EG-VEGFが発
見されて以来、VEGF作用の遮断のみでは、十分な血管新
生阻害効果が現れない症例もあり得ると考えられるよう
になってきている。また、今後の医学研究の進展によっ
ては、VEGFよりはむしろEG-VEGFが病態の増悪因子とし
て作用している症例が見出される可能性があり、そのよ
うな場合にはEG-VEGF阻害剤が単体として使用されるこ
とも期待される。これまでの研究では、EG-VEGFが内皮
細胞の増殖を引き起こす過程においてもZAQなどの受容
体が関与しているのかどうか、または、全く異なる受容
体が関与しているのか、といった点について全く明らか
にされていなかった。しかしながら、EG-VEGF拮抗薬の
開発には、拮抗薬探索法の簡便化および作用メカニズム
の記述などの点から、その受容体について明らかにする
ことが必須である。また、安全で、優れた癌の血管新生
阻害剤も望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ウシ副腎
毛細血管内皮細胞（BACE）を用いて研究を行い、BACEに
は、ZAQおよびその類縁受容体であるI5Eが発現されてい
ることを見出した。さらに、BACEがヒト型ZAQリガンド
ペプチド、ヘビ毒MIT1およびそのヒト型ホモログ（ヒト
Bv8ペプチド）に応答して細胞内カルシウムイオンの上
昇、MAPキナーゼの活性化、チミジン取り込み量の増
大、細胞増殖能の増大を起こすことも見出した。これら
の検討結果より、ヒト型ZAQリガンドペプチドの内皮細
胞増殖因子活性は、ZAQおよび（または）I5Eを介して引
き起こされるものと結論した。このような知見に基づい
て、本発明者らは、ZAQまたはI5Eの作用を遮断する化合
物がEG-VEGFまたはBv8ペプチドの阻害剤となり、かつEG
-VEGFまたはBv8ペプチドの阻害剤の簡便な探索法を提供
することを見出し、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完
成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１） 配列番号：
８１、配列番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：
１３８、配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害す
る化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、
（１ａ） 配列番号：８１、配列番号：８２、配列番
号：１０９もしくは配列番号：１３８で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物ま
たはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、（１ｂ）
配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わされるア
ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物
またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、（２）
配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列
番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番
号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物また
はその塩を含有してなる血管新生阻害剤、（３）
（a）配列番号：２１、配列番号：８１、配列番号：８
２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：
１９もしくは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペ
プチドまたはその塩と（b）配列番号：１、配列番号：
４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５
３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番
号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩
との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる
血管新生阻害剤、（３ａ） （a）配列番号：２１で表
わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩と（b）配列
番号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番
号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番
号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質またはその塩との結合を阻害する化合物ま
たはその塩を含有してなる血管新生阻害剤、（３ｂ）
（a）配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：１
０９もしくは配列番号：１３８で表わされるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
ペプチドまたはその塩と（b）配列番号：１、配列番
号：４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番
号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは
配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質または
その塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有し
てなる血管新生阻害剤、（３ｃ） （a）配列番号：１
９もしくは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプ
チドまたはその塩と（b）配列番号：１、配列番号：４
４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５
３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番
号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩
との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる
血管新生阻害剤、（４） 配列番号：２１、配列番号：
８１、配列番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：
１３８、配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するペプチドまたはその塩の、配列番号：
１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：５
２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７
１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋
白質またはその塩の活性化作用を阻害する化合物または
その塩を含有してなる血管新生阻害剤、（４ａ） 配列
番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその
塩の、配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５
１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５
４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性化作用を阻
害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害
剤、（４ｂ） 配列番号：８１、配列番号：８２、配列
番号：１０９もしくは配列番号：１３８で表わされるア
ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するペプチドまたはその塩の、配列番号：１、配列
番号：４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番
号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは
配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質または
その塩の活性化作用を阻害する化合物またはその塩を含
有してなる血管新生阻害剤、（４ｃ） 配列番号：１９
もしくは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチ
ドまたはその塩の、配列番号：１、配列番号：４４、配
列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列
番号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７
３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一
のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性化
作用を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管
新生阻害剤、（５） 配列番号：８１、配列番号：８
２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：
１９もしくは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペ
プチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩
基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列また
はその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有
してなる血管新生阻害剤、（６） 配列番号：８１、配
列番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、
配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わされるア
ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するペプチドまたはその部分ペプチドまたはその塩
に対する抗体を含有してなる血管新生阻害剤、（７）
配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列
番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番
号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配
列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチド
を含有してなる血管新生阻害剤、（８） 配列番号：
１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：５
２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７
１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋
白質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
を含有してなる血管新生阻害剤、（９） 癌、多嚢胞性
卵巣症候群または卵巣過剰刺激症候群の予防・治療剤で
ある上記（１）〜（８）記載のいずれかの血管新生阻害
剤、（９ａ） 癌が、内分泌組織の癌である上記（９）
記載の血管新生阻害剤、（９ｂ） 多嚢胞性卵巣症候群
の予防・治療剤である上記（１）〜（８）記載のいずれ
かの血管新生阻害剤、（１０） （a）配列番号：８
１、配列番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：１
３８、配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わさ
れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするポリ
ヌクレオチド、または（b）配列番号：１、配列番号：
４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５
３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番
号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩
をコードするポリヌクレオチドを含有してなる癌、多嚢
胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激症候群の診断薬、
（１１） 内皮細胞を用いることを特徴とする、配列番
号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：
５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１
７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング方法、（１２） 上記（１１）記載
のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩を
含有してなる血管新生阻害剤、（１３） （a）配列番
号：２１、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番
号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：１９もしく
は配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまた
はその塩、および（または）（b）配列番号：１、配列
番号：４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番
号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは
配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質または
その塩を用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスク
リーニング方法、（１３ａ） （a）配列番号：２１で
表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、および
（または）（b）配列番号：１、配列番号：４４、配列
番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３
で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の
アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いるこ
とを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、
（１３ｂ） （a）配列番号：８１、配列番号：８２、
配列番号：１０９もしくは配列番号：１３８で表わされ
るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配
列を含有するペプチドまたはその塩、および（または）
（b）配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５
１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５
４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特
徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、（１３
ｃ） （a）配列番号：１９もしくは配列番号：３９で
表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、および
（または）（b）配列番号：１、配列番号：４４、配列
番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３
で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の
アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いるこ
とを特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、
（１４） （a）配列番号：２１、配列番号：８１、配
列番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、
配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わされるア
ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するペプチドまたはその塩、および（または）
（b）配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５
１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５
４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを
特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング用キット、
（１５） （a）配列番号：８１、配列番号：８２、配
列番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：１９も
しくは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列と同一
または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド
またはその塩をコードするポリヌクレオチド、および
（または）（b）配列番号：１、配列番号：４４、配列
番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３
で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の
アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードす
るポリヌクレオチドを用いることを特徴とする血管新生
阻害剤のスクリーニング方法、（１５ａ） （a）配列
番号：８１、配列番号：８２、配列番号：１０９もしく
は配列番号：１３８で表わされるアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドま
たはその塩をコードするポリヌクレオチド、および（ま
たは）（b）配列番号：１、配列番号：４４、配列番
号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３
で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の
アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードす
るポリヌクレオチドを用いることを特徴とする血管新生
阻害剤のスクリーニング方法、（１５ｂ） （a）配列
番号：１９もしくは配列番号：３９で表わされるアミノ
酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチ
ド、および（または）（b）配列番号：１、配列番号：
４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５
３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番
号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩
をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とす
る血管新生阻害剤のスクリーニング方法、（１６）
（a）配列番号：２１、配列番号：８１、配列番号：８
２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：
１９もしくは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペ
プチドまたはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗
体、および（または）（b）配列番号：１、配列番号：
４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５
３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番
号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部
分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特
徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法、（１
７） 上記（１３）、（１５）もしくは（１６）記載の
スクリーニング方法または上記（１４）記載のスクリー
ニング用キットを用いて得られる血管新生阻害剤、（１
８） 内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその
塩を含有してなる血管新生阻害剤、（１９） 配列番
号：１７１もしくは配列番号：１３７で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有することを特徴とする蛋白質またはその塩、（２０）
配列番号：１７１で表わされるアミノ酸配列からなる
蛋白質またはその塩、（２１） 配列番号：１３７で表
わされるアミノ酸配列からなる蛋白質またはその塩、
（２２） 上記（１９）記載の蛋白質の部分ペプチドま
たはその塩、（２３） 上記（１９）記載の蛋白質をコ
ードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチ
ド、（２４） ＤＮＡである上記（２３）記載のポリヌ
クレオチド、（２５） 配列番号：１７２または配列番
号：１７４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチ
ド、（２６） 上記（２４）記載のポリヌクレオチドを
含有する組換えベクター、（２７） 上記（２６）記載
の組換えベクターで形質転換された形質転換体、（２
８） 上記（２７）記載の形質転換体を培養し、上記
（１９）記載の蛋白質を生成・蓄積せしめることを特徴
とする上記（１９）記載の蛋白質またはその塩の製造
法、（２９） 上記（１９）記載の蛋白質もしくはその
部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（３０） 上
記（２９）記載の抗体を含有してなる医薬、（３１）
上記（２９）記載の抗体を含有してなる診断薬、（３
２） 上記（１９）記載の蛋白質もしくはその部分ペプ
チドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（１
９）記載の蛋白質またはその塩の活性を促進または阻害
する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（３
３） 上記（１９）記載の蛋白質もしくはその部分ペプ
チドまたはその塩を含有することを特徴とする、上記
（１９）記載の蛋白質またはその塩の活性を促進または
阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キッ
ト、（３４） 上記（３２）記載のスクリーニング方法
または上記（３３）記載のスクリーニング用キットを用
いて得られる、上記（１９）記載の蛋白質またはその塩
の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、（３
５） 上記（３４）記載の化合物またはその塩を含有し
てなる医薬、（３６） 哺乳動物に対して、配列番号：
１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：５
２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７
１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋
白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩
の有効量を投与することを特徴とする血管新生阻害方
法、（３７） 血管新生阻害剤を製造するための、配列
番号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番
号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番
号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物また
はその塩の使用、（３８） 哺乳動物に対して、配列番
号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：
５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１
７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその
塩の有効量を投与することを特徴とする癌、多嚢胞性卵
巣症候群または卵巣過剰刺激症候群の予防・治療方法、
（３９） 癌、多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰刺激
症候群の予防・治療剤を製造するための、配列番号：
１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：５
２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７
１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋
白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩
の使用などを提供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】配列番号：８１、配列番号：８
２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：
１９もしくは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペ
プチドまたはその塩（以下、本発明のペプチドと略記す
ることがある）は、配列番号：１、配列番号：４４、配
列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列
番号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７
３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一
のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩（以下、
本発明の蛋白質と略記することがある）と結合する能力
を有するペプチドまたはその塩であり、本発明の蛋白質
と結合し、本発明の蛋白質を活性化する能力を有するペ
プチドまたはその塩である。本発明のペプチドの本発明
の蛋白質と結合する能力および本発明の蛋白質を活性化
する能力は、後述の方法により測定することができる。

【０００７】本発明のペプチドは、例えば、ヒトや哺乳
動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、
ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例え
ば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞（例えば、
MEL、M1、CTLL-2、HT-2、WEHI-3、HL-60、JOSK-1、K56
2、ML-1、MOLT-3、MOLT-4、MOLT-10、CCRF-CEM、TALL-
1、Jurkat、CCRT-HSB-2、KE-37、SKW-3、HUT-78、HUT-1
02、H9、U937、THP-1、HEL、JK-1、CMK、KO-812、MEG-0
1など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組
織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳
基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、
延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、
脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、
生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、
肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾
臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、
卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など（特に、脳や
脳の各部位）に由来するペプチドであってもよく、また
合成ペプチドであってもよい。本発明のペプチドがシグ
ナル配列を有している場合は、該ペプチドを効率良く細
胞外に分泌させることができる。

【０００８】配列番号：８１または配列番号：８２で表
わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と
しては、例えば、配列番号：８１または配列番号：８２
で表されるアミノ酸配列と約６０％以上（好ましくは約
７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、より好ま
しくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最
も好ましくは約９５％以上）の相同性を有するアミノ酸
配列などが挙げられる。配列番号：８１または配列番
号：８２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列
番号：８１または配列番号：８２で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番
号：８１または配列番号：８２で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドと実質的に同質の性質を有するペ
プチドなどが好ましい。以下、配列番号：８１または配
列番号：８２で表わされるアミノ酸配列を含有するペプ
チドをヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドと記載する
ことがある。

【０００９】配列番号：８１または配列番号：８２で表
わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番
号：８１または配列番号：８２で表わされるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、
配列番号：８１または配列番号：８２で表わされるアミ
ノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有
するペプチドなどが好ましく、具体的には配列番号：８
１、配列番号：８２、配列番号：８３または配列番号：
８４で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチド等が
挙げられる。以下、配列番号：８３または配列番号：８
４で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドをヒト
型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドと記載することがあ
る。

【００１０】配列番号：１０９で表わされるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配
列番号：１０９で表されるアミノ酸配列と９５％以上
（好ましくは約９７％以上、さらに好ましくは約９９％
以上）の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられ
る。配列番号：１０９で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、
例えば、配列番号：１０９で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１０
９で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的
に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。以下、
配列番号：１０９で表わされるアミノ酸配列を有するペ
プチドをマウス型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドと記載
することがある。

【００１１】配列番号：１０９で表わされるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
ペプチドとしては、例えば、配列番号：１０９で表わさ
れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
配列を含有し、配列番号：１０９で表わされるアミノ酸
配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペ
プチドなどが好ましく、具体的には配列番号：１０９ま
たは配列番号：１０７で表わされるアミノ酸配列を有す
るペプチド等が挙げられる。以下、配列番号：１０７で
表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス型Ｚ
ＡＱリガンド前駆体ペプチドと記載することがある。

【００１２】配列番号：１３８で表わされるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配
列番号：１３８で表されるアミノ酸配列と９５％以上
（好ましくは約９７％以上、さらに好ましくは約９９％
以上）の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられ
る。配列番号：１３８で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、
例えば、配列番号：１３８で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１３
８で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的
に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。配列番
号：１３８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するペプチドとして具体的には、配
列番号：１４０で表されるアミノ酸配列を含有するペプ
チド、配列番号：１４２で表されるアミノ酸配列を含有
するペプチドなどが挙げられる。以下、配列番号：１３
８、配列番号：１４０または配列番号：１４２で表わさ
れるアミノ酸配列を有するペプチドをラット型ＺＡＱリ
ガンド成熟体ペプチドと記載することがある。

【００１３】配列番号：１３８で表わされるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
ペプチドとして具体的には配列番号：１３２、配列番
号：１３４または配列番号：１３６で表わされるアミノ
酸配列を有するペプチド等も挙げられる。以下、配列番
号：１３２、配列番号：１３４または配列番号：１３６
で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをラット型
ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドと記載することがある。

【００１４】配列番号：１９または配列番号：３９で表
わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と
しては、例えば、配列番号：１９または配列番号：３９
で表されるアミノ酸配列と約６０％以上（好ましくは約
７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、より好ま
しくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最
も好ましくは約９５％以上）の相同性を有するアミノ酸
配列などが挙げられる。配列番号：１９または配列番
号：３９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列
番号：１９または配列番号：３９で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番
号：１９または配列番号：３９で表わされるアミノ酸配
列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプ
チドなどが好ましい。以下、配列番号：１９で表わされ
るアミノ酸配列を有するペプチドをヒト型Ｂｖ８成熟体
ペプチド、配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列を
有するペプチドをラット型Ｂｖ８成熟体ペプチドまたは
マウス型Ｂｖ８成熟体ペプチドと記載することがある。

【００１５】配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペ
プチドとしては、例えば、配列番号：１９で表わされる
アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列
を含有し、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を
有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチド
などが好ましく、具体的には配列番号：１７または配列
番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するペプチド
等が挙げられる。配列番号：３９で表わされるアミノ酸
配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るペプチドとしては、例えば、配列番号：３９で表わさ
れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
配列を含有し、配列番号：３９で表わされるアミノ酸配
列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプ
チドなどが好ましく、具体的には配列番号：３７、配列
番号：３９または配列番号：５５で表わされるアミノ酸
配列を有するペプチド等が挙げられる。以下、配列番
号：１７で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドを
ヒト型Ｂｖ８前駆体ペプチドと記載することがある。配
列番号：３７で表わされるアミノ酸配列を有するペプチ
ドをラット型Ｂｖ８前駆体ペプチドと記載することがあ
る。配列番号：５５で表わされるアミノ酸配列を有する
ペプチドをマウス型Ｂｖ８前駆体ペプチドと記載するこ
とがある。配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番
号：２１で表されるアミノ酸配列と約６０％以上（好ま
しくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、
より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％
以上、最も好ましくは約９５％以上）の相同性を有する
アミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：２１で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するペプチドとしては、例えば、配列番号：２１で表
わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
含有し、配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を有
するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドな
どが好ましい。以下、配列番号：２１で表わされるアミ
ノ酸配列を有するペプチドをＭＩＴ１と記載することが
ある。

【００１６】実質的に同質の活性としては、例えば、本
発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介す
るシグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同
質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示
す。したがって、本発明の蛋白質に対する結合活性、本
発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などの活性
が同等（例、約０．５〜２倍）であることが好ましい
が、これらの活性の程度やペプチドの分子量などの量的
要素は異なっていてもよい。これらの活性の測定は、自
体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、
後述するスクリーニング方法などに従って測定すること
ができる。

【００１７】また、本発明のペプチドとしては、（i）
配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：１０９、
配列番号：１３８、配列番号：１９または配列番号：３
９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ま
しくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程
度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番
号：８１、配列番号：８２、配列番号：１０９、配列番
号：１３８、配列番号：１９または配列番号：３９で表
されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、
１〜４０個程度、より好ましくは１〜３０個程度、なか
でも好ましくは１〜２０個程度）のアミノ酸が付加した
アミノ酸配列、（iii）配列番号：８１、配列番号：８
２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：
１９または配列番号：３９で表されるアミノ酸配列中の
１または２個以上（好ましくは、１〜４０個程度、より
好ましくは１〜３０個程度、なかでも好ましくは１〜２
０個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ
ノ酸配列、または（iv）それらを組み合わせたアミノ酸
配列を含有するペプチドなども用いられる。本発明のペ
プチドの具体例としては、例えば、配列番号：８１で表
わされるアミノ酸配列を含有するヒト由来のペプチド、
配列番号：８２で表わされるアミノ酸配列を含有するヒ
ト由来のペプチド、配列番号：１０９で表わされるアミ
ノ酸配列を含有するマウス由来のペプチド、配列番号：
１３８で表わされるアミノ酸配列を含有するラット由来
のペプチド、配列番号：１４０で表わされるアミノ酸配
列を含有するラット由来のペプチド、配列番号：１４２
で表わされるアミノ酸配列を含有するラット由来のペプ
チド、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有
するヒト由来のペプチド、配列番号：３９で表わされる
アミノ酸配列を含有するラット由来またはマウス由来の
ペプチドなどがあげられる。

【００１８】本発明のペプチドの部分ペプチドとして
は、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることの
できるものであれば、いかなるものであってもよく、本
発明のペプチドと実質的に同質の活性を有していればよ
い。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のペプチ
ドの構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好
ましくは２０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドな
どが好ましい。ここで、「実質的に同質の活性」とは、
上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は
上記と同様に行なうことができる。該部分ペプチドとし
ては、（i）上記アミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が欠失し、
（ii）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましく
は、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加
し、または（iii）上記アミノ酸配列中の１または２個
以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されていてもよい。以下、本発明のペプ
チドとの本発明のペプチドの部分ペプチドとをまとめて
本発明のペプチドと称することがある。

【００１９】本発明の蛋白質は、例えば、ヒトや哺乳動
物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブ
タ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例え
ば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞（例えば、
MEL、M1、CTLL-2、HT-2、WEHI-3、HL-60、JOSK-1、K56
2、ML-1、MOLT-3、MOLT-4、MOLT-10、CCRF-CEM、TALL-
1、Jurkat、CCRT-HSB-2、KE-37、SKW-3、HUT-78、HUT-1
02、H9、U937、THP-1、HEL、JK-1、CMK、KO-812、MEG-0
1など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組
織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳
基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、
延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、
脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、
生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、
肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾
臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、
卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など（特に、脳や
脳の各部位）に由来する蛋白質であってもよく、また合
成蛋白質であってもよい。本発明の蛋白質がシグナル配
列を有している場合は該ペプチドまたは蛋白質を効率良
く細胞外に分泌させることができる。

【００２０】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、好ま
しくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相
同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白
質などが好ましい。本発明の配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列
を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好まし
い。具体的にはＷＯ ０１／１６３０９に記載の蛋白質
などが挙げられる。以下、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列を有する蛋白質をＺＡＱまたはヒトＺＡＱと
記載することがある。

【００２１】配列番号：４４で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列
番号：４４で表わされるアミノ酸配列と約９７％以上、
好ましくは約９８％以上、より好ましくは約９９％以
上、最も好ましくは約９９．５％以上の相同性を有する
アミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：４４で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有
する蛋白質としては、例えば、配列番号：４４で表わさ
れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有
し、配列番号：４４で表わされるアミノ酸配列を有する
蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ま
しい。配列番号：４４で表わされるアミノ酸配列と同一
または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と
しては、例えば、配列番号：４４で表わされるアミノ酸
配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有
し、配列番号：４４で表わされるアミノ酸配列と実質的
に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。配列番
号：５１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列としては、例えば、配列番号：５１で表わさ
れるアミノ酸配列と約９５％以上、好ましくは約９６％
以上、より好ましくは約９７％以上、最も好ましくは約
９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げら
れる。配列番号：５１で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例え
ば、配列番号：５１で表わされるアミノ酸配列と実質的
に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：５１で表わさ
れるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性
を有する蛋白質などが好ましい。配列番号：５１で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：
５１で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同
一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：５１で表わされ
るアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質な
どが好ましい。

【００２２】配列番号：５２で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列
番号：５２で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、
好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上
の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列
番号：５２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、配列番
号：５２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列を有し、配列番号：５２で表わされるアミノ
酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋
白質などが好ましい。配列番号：５２で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質としては、例えば、配列番号：５２で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有し、配列番号：５２で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好まし
く、具体的にはＷＯ ９８／４６６２０に記載の蛋白質
などが挙げられる。以下、配列番号：５２で表わされる
アミノ酸配列を有する蛋白質をＩ５Ｅまたはヒト型Ｉ５
Ｅなどと記載することがある。

【００２３】配列番号：５３で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列
番号：５３で表わされるアミノ酸配列と約９５％以上、
好ましくは約９６％以上、より好ましくは約９７％以
上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミ
ノ酸配列などが挙げられる。配列番号：５３で表わされ
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する
蛋白質としては、例えば、配列番号：５３で表わされる
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配
列番号：５３で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号：５３で表わされるアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質として
は、例えば、配列番号：５３で表わされるアミノ酸配列
と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配
列番号：５３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質
の活性を有する蛋白質などが好ましく、具体的には、Bi
ochem. Biophys. Acta, 1491巻, 369-375頁, 2000年に
記載の蛋白質などが挙げられる。配列番号：５４で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし
ては、例えば、配列番号：５４で表わされるアミノ酸配
列と約９５％以上、好ましくは約９６％以上、より好ま
しくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上の相
同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番
号：５４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、配列番
号：５４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列を有し、配列番号：５４で表わされるアミノ
酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋
白質などが好ましい。配列番号：５４で表わされるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質としては、例えば、配列番号：５４で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有し、配列番号：５４で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好まし
く、具体的にはＷＯ ９８／４６６２０に記載の蛋白質
などが挙げられる。

【００２４】配列番号：１７１で表わされるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配
列番号：１７１で表わされるアミノ酸配列と９５％以
上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％
以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１７１で表わされるアミノ酸配列と実質的に
同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例え
ば、配列番号：１７１で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１７１で
表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質
の活性を有する蛋白質などが好ましい。本発明の配列番
号：１７１で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例
えば、配列番号：１７１で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番
号：１７１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の
活性を有する蛋白質などが好ましい。以下、配列番号：
１７１で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をウシ
型ＺＡＱと記載することがある。

【００２５】配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配
列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と９５％以
上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％
以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と実質的に
同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例え
ば、配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１７３で
表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質
の活性を有する蛋白質などが好ましい。本発明の配列番
号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例
えば、配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番
号：１７３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の
活性を有する蛋白質などが好ましい。以下、配列番号：
１７３で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をウシ
型Ｉ５Ｅと記載することがある。

【００２６】実質的に同質の活性としては、例えば、本
発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作
用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性
が性質的に同質であることを示す。したがって、本発明
のペプチドに対する結合活性やシグナル情報伝達作用な
どの活性が同等（例、約０．５〜２倍）であることが好
ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの
量的要素は異なっていてもよい。結合活性やシグナル情
報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じ
て行なうことができる。

【００２７】さらに、本発明の蛋白質としては、（i）
配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列
番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番
号：１７１または配列番号：１７３で表わされるアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個（１または２個））のアミノ酸が欠失したアミノ
酸配列、（ii）配列番号：１、配列番号：４４、配列番
号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
号：５４、配列番号：１７１または配列番号：１７３で
表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が
付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１、配列番
号：４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番
号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７１または配
列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列中の１または
２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２
個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
配列、または（iv）それらを組み合わせたアミノ酸配列
を含有する蛋白質なども用いられる。

【００２８】本発明の蛋白質の具体例としては、例え
ば、配列番号：１または配列番号：５２で表わされるア
ミノ酸配列を含有するヒト由来（より好ましくはヒト脳
由来）の蛋白質、配列番号：４４または配列番号：５１
で表わされるアミノ酸配列を含有するラット由来の蛋白
質、配列番号：５３または配列番号：５４で表わされる
アミノ酸配列を含有するマウス由来の蛋白質、配列番
号：１７１または配列番号：１７３で表されるアミノ酸
配列を含有するウシ由来の蛋白質などがあげられる。

【００２９】本発明の蛋白質の部分ペプチド（以下、本
発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、
前記した本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れの
ものであってもよいが、例えば、本発明の蛋白質分子の
うち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的
に同質のリガンド結合活性を有するものなどが用いられ
る。具体例として、本発明の蛋白質の部分ペプチドとし
ては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性
（hydrophilic）部位）であると分析された部分を含む
ペプチドである。また、疎水性（hydrophobic）部位を
一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々
のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数の
ドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。本発明
の部分ペプチドのアミノ酸の数は、前記した本発明の蛋
白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、
好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上の
アミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。実質的
に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約５
０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約
８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ま
しくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示
す。ここで、「実質的に同質のリガンド結合活性」と
は、前記と同意義を示す。「実質的に同質のリガンド結
合活性」の測定は自体公知の方法に準じて行なうことが
できる。

【００３０】また、本発明の部分ペプチドは、配列番
号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：
５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１
７１または配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が
欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））の
アミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ま
しくは１〜５個程度、さらに好ましくは数個（１または
２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていても
よい。

【００３１】本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質も
しくはその部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学
的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩として
は、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素
酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いら
れる。

【００３２】本明細書におけるペプチドおよび蛋白質
は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ
末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配
列番号：４７で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白
質をはじめとする本発明の蛋白質は、Ｃ末端がカルボキ
シル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO^-）、アミド
（-CONH₂）またはエステル（-COOR）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、
エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチ
ルなどのＣ_1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、
シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例え
ば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール
基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ
_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα
−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラ
ルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバ
ロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明のペプ
チドおよび本発明の蛋白質（本発明のペプチド・蛋白
質）がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシ
レート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化
またはエステル化されているものも本発明のペプチド・
蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例え
ば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さら
に、本発明のペプチド・蛋白質には、上記したペプチド
・蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基
が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ
_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護さ
れているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグル
タミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミ
ノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミ
ノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基な
ど）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖ペプチド・糖蛋白質などの複合ペプチド・複合蛋白
質なども含まれる。また、本発明の部分ペプチドはＣ末
端が、カルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-
COO^-）、アミド（-CONH₂）またはエステル（-COOR）で
あってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカ
ルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している
場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化され
ているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場
合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステ
ルなどが用いられる。さらに、本発明の部分ペプチドに
は、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオ
ニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ
端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミ
ン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が
適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結
合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含
まれる。

【００３３】本発明のペプチドもしくは蛋白質またはそ
の塩は、前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から
自体公知のペプチド・蛋白質の精製方法によって製造す
ることもできるし、配列番号：８１、配列番号：８２、
配列番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：１４
０、配列番号：１４２、配列番号：１９、配列番号：３
９、配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、
配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配
列番号：１７１または配列番号：１７３で表されるアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有す
る形質転換体を培養することによっても製造することが
できる。また、後述のペプチド・蛋白質合成法またはこ
れに準じて製造することもできる。さらに、配列番号：
５３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはその
塩は、Biochem. Biophys. Acta,1491巻, 369-375頁, 20
00年に記載の方法に準じて製造できる。配列番号：５２
または配列番号：５４で表されるアミノ酸配列を有する
蛋白質またはその塩は、WO 98/46620に記載の方法に準
じて製造できる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から
製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモ
ジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆
相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精
製単離することができる。

【００３４】本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質も
しくはその部分ペプチドまたはそれらのアミド体または
それらの塩の合成には、通常市販のペプチド・蛋白質合
成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂として
は、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹
脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４
−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチル
ベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキ
シメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリ
アクリルアミド樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェ
ニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−
（２'，４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチ
ル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このよ
うな樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保
護したアミノ酸を、目的とするペプチド・蛋白質の配列
通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合
させる。反応の最後に樹脂からペプチド・蛋白質を切り
出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中
で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のペ
プチド・蛋白質またはそれらのアミド体を取得する。上
記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド・蛋白
質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができ
るが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド
類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボ
ジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプ
ロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによ
る活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，
ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加す
るかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルある
いはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸
の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。

【００３５】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、ペプチド・蛋白質縮合反応に使
用しうることが知られている溶媒から適宜選択されう
る。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸
アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン
化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコー
ル類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピ
リジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテ
ル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリ
ル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるい
はこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は
蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている
範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲
から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通
常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を
用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の
脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分
な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分
な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチル
イミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化する
ことができる。

【００３６】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシ
ャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの
直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、ア
ラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−
ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステ
ル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護
することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステ
ル化またはエーテル化によって保護することができる。
このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル
基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロ
イル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボ
ニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。
また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジ
ル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジ
ル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕ
ｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。

【００３７】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチ
オール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオ
ン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミ
ダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェ
ニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプト
ファンのインドール保護基として用いられるホルミル基
は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジ
チオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希
水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカ
リ処理によっても除去される。

【００３８】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。ペプチド・蛋白質のアミド体を得
る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端ア
ミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した
後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした
後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみ
を除いたペプチド・蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したペプチド・蛋白質とを製造し、こ
の両ペプチド・両蛋白質を上記したような混合溶媒中で
縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様であ
る。縮合により得られた保護ペプチド・保護蛋白質を精
製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所
望の粗ペプチド・粗蛋白質を得ることができる。この粗
ペプチド・粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精
製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチド・
蛋白質のアミド体を得ることができる。ペプチド・蛋白
質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端ア
ミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮
合しアミノ酸エステルとした後、ペプチド・蛋白質のア
ミド体と同様にして、所望のペプチド・蛋白質のエステ
ル体を得ることができる。

【００３９】本発明のペプチドおよび本発明の蛋白質
は、自体公知のペプチドの合成法に従って製造すること
ができる。また、本発明の蛋白質の部分ペプチドまたは
その塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、ある
いは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明のペプチドもしくは本発
明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドまたはアミノ酸と
残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は
保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造する
ことができる。公知の縮合方法や保護基の脱離として
は、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法が挙
げられる。 （i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シ
ンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publish
ers, New York (1966年) （ii）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Pepti
de), Academic Press, New York (1965年) （iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善
(株) （1975年） （iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、
蛋白質の化学IV、 205、(1977年) （v）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド
合成 広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドまたは
本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上
記方法で得られるペプチドまたは部分ペプチドが遊離体
である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換する
ことができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法
によって遊離体に変換することができる。

【００４０】本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を
コードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明
のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードする塩基配列
を含有するものであればいかなるものであってもよい。
好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由
来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライ
ブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリー
に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミ
ド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよ
い。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ ＲＮＡ
またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Rever
se Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、
ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもで
きる。

【００４１】具体的には、配列番号：８１で表されるア
ミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとし
ては、例えば、配列番号：８７で表わされる塩基配列を
含有するＤＮＡ、または配列番号：８７で表わされる塩
基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：８１で
表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同
質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発
明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など）を有す
るペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでも
よい。配列番号：８７で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡとしては、配列番号：８７または配列番号：８９
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられ
る。配列番号：８７で表わされる塩基配列を有するＤＮ
Ａとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８７で表わされ
る塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、
より好ましくは約８０％以上の相同性を有する塩基配列
を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００４２】具体的には、配列番号：８２で表されるア
ミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとし
ては、例えば、配列番号：８８で表わされる塩基配列を
含有するＤＮＡ、または配列番号：８８で表わされる塩
基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：８２で
表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同
質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発
明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など）を有す
るペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでも
よい。配列番号：８８で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡとしては、配列番号：８８または配列番号：９０
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられ
る。配列番号：８８で表わされる塩基配列を有するＤＮ
Ａとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８８で表わされ
る塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、
より好ましくは約８０％以上の相同性を有する塩基配列
を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００４３】具体的には、配列番号：１０９で表される
アミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：１１０で表わされる塩基配
列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１１０で表わさ
れる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：
１０９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実
質的に同質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活
性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用な
ど）を有するペプチドをコードするＤＮＡであれば何れ
のものでもよい。配列番号：１１０で表わされる塩基配
列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：１１０または
配列番号：１０８で表わされる塩基配列を含有するＤＮ
Ａ等が挙げられる。配列番号：１１０で表わされる塩基
配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：１１０で表わされる塩基配列と９５％以上、好まし
くは約９７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同
性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。

【００４４】具体的には、配列番号：１３８、配列番
号：１４０または配列番号：１４２で表されるアミノ酸
配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、
例えば、配列番号：１３９、配列番号：１４１または配
列番号：１４３で表わされる塩基配列を含有するＤＮ
Ａ、または配列番号：１３９、配列番号：１４１または
配列番号：１４３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ＤＮＡを有し、配列番号：１３８、配列番号：１４０ま
たは配列番号：１４２で表されるアミノ酸配列を含有す
るペプチドと実質的に同質の活性（例、本発明の蛋白質
に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情
報伝達作用など）を有するペプチドをコードするＤＮＡ
であれば何れのものでもよい。配列番号：１３９、配列
番号：１４１または配列番号：１４３で表わされる塩基
配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：１３３、配
列番号：１３５、配列番号：１３７、配列番号：１３
９、配列番号：１４１または配列番号：１４３で表わさ
れる塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。配列番
号：１３９、配列番号：１４１または配列番号：１４３
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：１３９、配列番号：１４１また
は配列番号：１４３で表わされる塩基配列と９５％以
上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％
以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが
用いられる。

【００４５】具体的には、配列番号：１９で表されるア
ミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとし
ては、例えば、配列番号：２０で表わされる塩基配列を
含有するＤＮＡ、または配列番号：２０で表わされる塩
基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１９で
表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同
質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発
明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など）を有す
るペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでも
よい。配列番号：２０で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡとしては、配列番号：２０または配列番号：１８
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられ
る。配列番号：２０で表わされる塩基配列を有するＤＮ
Ａとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２０で表わされ
る塩基配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、よ
り好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を
含有するＤＮＡなどが用いられる。具体的には、配列番
号：３９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドを
コードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４０ま
たは配列番号：５７で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡ、または配列番号：４０または配列番号：５７で表
わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番
号：３９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと
実質的に同質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合
活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用な
ど）を有するペプチドをコードするＤＮＡであれば何れ
のものでもよい。配列番号：４０または配列番号：５７
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列
番号：３８、配列番号：４０、配列番号：５６または配
列番号：５７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ等
が挙げられる。配列番号：４０または配列番号：５７で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例
えば、配列番号：４０または配列番号：５７で表わされ
る塩基配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、よ
り好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を
含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００４６】また、配列番号：１で表されるアミノ酸配
列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：２または配列番号：３で表わされる塩基
配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列
番号：３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを
有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する
蛋白質と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、
シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡであれば何れのものでもよい。配列番号：２ま
たは配列番号：３で表わされる塩基配列を含有するＤＮ
Ａとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番
号：３で表わされる塩基配列と約９０％以上、好ましく
は約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性
を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白
質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４
３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列
番号：４３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイ
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
を有し、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有
する蛋白質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチ
ドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有
する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでも
よい。配列番号：４３で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４３で表わ
される塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以
上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：５
１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードす
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５０で表わされ
る塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５０で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列
番号：５１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と
実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結
合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質を
コードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。

【００４７】配列番号：５０で表わされる塩基配列を含
有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５０
で表わされる塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９
５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有す
る塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番
号：５２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６で表わ
される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：６
で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配
列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と
実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結
合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質を
コードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。配列番
号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：６で表わされる塩基配列と
約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましく
は約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤ
ＮＡなどが用いられる。配列番号：５３で表されるアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：６３で表わされる塩基配列を含
有するＤＮＡ、または配列番号：６３で表わされる塩基
配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：６３で表
されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活
性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル
情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
であれば何れのものでもよい。配列番号：６３で表わさ
れる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェント
な条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：６３で表わされる塩基配列と約９５％以
上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９８％
以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが
用いられる。配列番号：５４で表されるアミノ酸配列を
含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：６４で表わされる塩基配列を含有するＤＮ
Ａ、または配列番号：６４で表わされる塩基配列を有す
るＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡを有し、配列番号：６４で表されるアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、
本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達
作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば
何れのものでもよい。配列番号：６４で表わされる塩基
配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：６４で表わされる塩基配列と約９５％以上、好まし
くは約９７％以上、より好ましくは約９８％以上の相同
性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。

【００４８】配列番号：１７１で表されるアミノ酸配列
を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：１７２で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡ、または配列番号：１７２で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１７１で表さ
れるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活
性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル
情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
であれば何れのものでもよい。配列番号：１７２で表わ
される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：１７２で表わされる塩基配列と９５％以
上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％
以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが
用いられる。配列番号：１７３で表されるアミノ酸配列
を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：１７４で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡ、または配列番号：１７４で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１７３で表さ
れるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活
性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル
情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
であれば何れのものでもよい。配列番号：１７４で表わ
される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：１７４で表わされる塩基配列と９５％以
上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％
以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが
用いられる。

【００４９】ハイブリダイゼーションは、自体公知の方
法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２ｎｄ（J. Sambro
ok et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に
記載の方法などに従って行なうことができる。また、市
販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に
記載の方法に従って行なうことができる。より好ましく
は、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことが
できる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナ
トリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜
２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０
〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９
ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。

【００５０】より具体的には、配列番号：８１で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮ
Ａとしては、配列番号：８７で表わされる塩基配列を含
有するＤＮＡがあげられ、配列番号：８２で表わされる
アミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡと
しては、配列番号：８８で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡがあげられ、配列番号：８３で表わされるアミ
ノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列番号：８９で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡがあげられ、配列番号：８４で表わされるアミノ酸
配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号：９０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
があげられ、配列番号：１０９で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１１０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
があげられ、配列番号：１０７で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１０８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
があげられ、配列番号：１３８で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１３９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
があげられ、配列番号：１４０で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１４１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
があげられ、配列番号：１４２で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１４３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
があげられ、配列番号：１３２で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１３３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
があげられ、配列番号：１３４で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１３５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
があげられ、配列番号：１３６で表わされるアミノ酸配
列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１３７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
があげられ、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列
を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列
番号：２０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあ
げられ、配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含
有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあげ
られ、配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列を含有
するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：
４０または配列番号：５７で表わされる塩基配列を含有
するＤＮＡがあげられ、配列番号：３７で表わされるア
ミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとし
ては、配列番号：３８で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡがあげられ、配列番号：５５で表わされるアミノ
酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列番号：５６で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡがあげられる。

【００５１】また、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配
列番号：２または配列番号：３で表わされる塩基配列を
含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：４４で表わされ
るアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡと
しては、配列番号：４３で表わされる塩基配列を含有す
るＤＮＡがあげられ、配列番号：５１で表わされるアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：５０で表わされる塩基配列を含有するＤ
ＮＡがあげられ、配列番号：５２で表わされるアミノ酸
配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配
列番号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあ
げられ、配列番号：５３で表わされるアミノ酸配列を含
有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：
６３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあげら
れ、配列番号：５４で表わされるアミノ酸配列を含有す
る蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６４
で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配
列番号：１７１で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋
白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１７２で
表わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列
番号：１７３で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白
質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１７４で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡがあげられる。

【００５２】本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩
基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有してな
るヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）とは、本発明の
ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、
ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。本発明に従え
ば、本発明のペプチドの遺伝子の複製又は発現を阻害す
ることのできるアンチセンス・（オリゴ）ヌクレオチド
（核酸）を、クローン化したあるいは決定されたペプチ
ドをコードするＤＮＡの塩基配列の塩基配列情報に基づ
き設計し、合成しうる。そうした（オリゴ）ヌクレオチ
ド（核酸）は、本発明のペプチドの遺伝子のＲＮＡとハ
イブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成又は機能
を阻害することができるか、あるいは本発明のペプチド
関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のペプチドの遺
伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のペ
プチド関連ＲＮＡの選択された配列に相補的な（オリ
ゴ）ヌクレオチド、及び本発明のペプチド関連ＲＮＡと
特異的にハイブリダイズすることができる（オリゴ）ヌ
クレオチドは、生体内及び生体外で本発明のペプチドの
遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病
気などの治療又は診断に有用である。用語「対応する」
とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列又は核酸
の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であるこ
とを意味する。ヌクレオチド、塩基配列又は核酸とペプ
チドとの間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）
の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチ
ドのアミノ酸を通常指している。本発明のペプチドの遺
伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・
リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コ
ドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’
端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、及び３’端
ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうる
が、本発明のペプチドの遺伝子内の如何なる領域も対象
として選択しうる。

【００５３】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的な（オリゴ）ヌクレオチドとの関係は、対象物と
ハイブリダイズすることができる（オリゴ）ヌクレオチ
ドとの関係は、「アンチセンス」であるということがで
きる。アンチセンス・（オリゴ）ヌクレオチドは、２−
デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌ
クレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシ
ヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコ
シドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるい
は非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例え
ば、市販の蛋白質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマ
ー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但
し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような
塩基のペアリナグや塩基の付着を許容する配置をもつヌ
クレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、
２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖Ｒ
ＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることが
でき、さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴ
ヌクレオチド、さらには公知の修飾の付加されたもの、
例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの
付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌ
クレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチ
ド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチ
ルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデ
ート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結
合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質
（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシ
ン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）
や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を
有しているもの、インターカレント化合物（例えば、ア
クリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合
物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化
性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有す
るもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマ
ー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシ
ド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」とは、プリン及び
ピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその
他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。
こうした修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジ
ン、アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはそ
の他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌク
レオチド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修
飾されていてよく、例えば１個以上の水酸基がハロゲン
とか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエー
テル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。

【００５４】本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ、あるいは修飾された核酸である。修飾された核酸
の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート
誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレ
オシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、そ
れに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核
酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわ
ち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにす
る、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標
とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにす
る、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性
をより小さなものにする。こうして修飾は当該分野で数
多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,Pharm
Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395,
1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research
and Applications, CRC Press, 1993 などに開示があ
る。本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられた
り、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リ
ポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与さ
れたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形
態で与えられることができうる。こうして付加形態で用
いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和する
ように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜
との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめる
ような脂質（例えば、ホスホリピッド、コレステロール
など）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに
好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体
（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸な
ど）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端ある
いは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内
ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。
その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特
異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアー
ゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止す
るためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基と
しては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリ
コールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知ら
れた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定される
ものではない。アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明
の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現
系、あるいは蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて
調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法
で細胞に適用できる。

【００５５】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reactionによって増
幅することもできる。具体的には、本発明の部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
２、配列番号：３、配列番号：４３、配列番号：５０、
配列番号：６、配列番号：６３、配列番号：６４、配列
番号：１７２または配列番号：１７４で表わされる塩基
配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、
または（ii）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：
４３、配列番号：５０、配列番号：６、配列番号：６
３、配列番号：６４、配列番号：１７２または配列番
号：１７４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａを有し、本発明の蛋白質と実質的に同質の活性（例、
本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達
作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩
基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：
２、配列番号：３、配列番号：４３、配列番号：５０、
配列番号：６、配列番号：６３、配列番号：６４、配列
番号：１７２または配列番号：１７４で表わされる塩基
配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：２、配列番号：３、配列番号：４３、配列番号：５
０、配列番号：６、配列番号：６３、配列番号：６４、
配列番号：１７２または配列番号：１７４で表わされる
塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、よ
り好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を
含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００５６】本発明のペプチドを完全にコードするＤＮ
Ａのクローニングの手段としては、本発明のペプチドを
コードするＤＮＡの塩基配列の部分塩基配列を有する合
成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅する
か、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明
のペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断
片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブ
リダイゼーションによって選別することができる。ハイ
ブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２ｎｄ（J. Sambro
ok et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に
記載の方法などに従って行なうことができる。また、市
販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に
記載の方法に従って行なうことができる。本発明の蛋白
質またはその部分ペプチド（以下、本発明の蛋白質と略
記する）を完全にコードするＤＮＡのクローニングも本
発明のペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニン
グと同様にして行うことができる。

【００５７】ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、Mutan^TM-superExpress Km（宝酒造
（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA
-LAPCR法、Gupped duplex法、Kunkel法等の自体公知の
方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことが
できる。クローン化されたペプチド・蛋白質をコードす
るＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限
酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用する
ことができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コ
ドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終
止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有して
いてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドン
は、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加すること
もできる。本発明のペプチド・蛋白質の発現ベクター
は、例えば、（イ）本発明のペプチド・蛋白質をコード
するＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、
（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモー
ターの下流に連結することにより製造することができ
る。

【００５８】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ
／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Invitrogen社）などが用
いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、
遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を
宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４
０プロモーター、ＨＩＶ-ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ
プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げら
れる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロ
モーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒ
ア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロ
モーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモータ
ー、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌で
ある場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモー
ター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場
合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｇ
ＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好まし
い。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモ
ーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。

【００５９】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞
を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても
選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、本発明の蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主
がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル
配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス
属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サ
ブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場
合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列
など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・
シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、
抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。こ
のようにして構築された本発明のペプチド・蛋白質をコ
ードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換
体を製造することができる。

【００６０】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. . Sci. USA），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y），１２０巻，５１７(１９７８) 〕，ＨＢ１０１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１
巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス
（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用い
られる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サ
チルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２
４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistr
y），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。酵
母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。

【００６１】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞とし
ては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１
細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Viv
o）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫とし
ては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ⁻）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。

【００６２】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０
(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８
２)などに記載の方法に従って行なうことができる。バ
チルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular
＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)
などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を
形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイ
モロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８
２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に
従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質
転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Te
chnology）,6, 47-55(1988）などに記載の方法に従って
行なうことができる。動物細胞を形質転換するには、例
えば、細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコー
ル．２６３2-6７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロ
ロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載
の方法に従って行なうことができる。このようにして、
Ｇ蛋白質共役型蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発
現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。宿
主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体
を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地
が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な
炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭
素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可
溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アン
モニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペ
プトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出
液などの無機または有機物質、無機物としては、例え
ば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マ
グネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタ
ミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐ
Ｈは約５〜８が望ましい。

【００６３】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主
がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃
で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加
えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は
通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要によ
り通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である
形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バー
クホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５
(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地
〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. . Sci. USA），
８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地の
ｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約
２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。

【００６４】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１
５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜ま
たは細胞外に本発明のペプチド・蛋白質を生成せしめる
ことができる。

【００６５】上記培養物から本発明のペプチド・蛋白質
を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なう
ことができる。本発明のペプチド・蛋白質を培養菌体あ
るいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方
法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸
濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解など
によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や
ろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い
られる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白
質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤
が含まれていてもよい。培養液中にペプチド・蛋白質が
分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法
で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に
含まれるペプチド・蛋白質の精製は、自体公知の分離・
精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これ
らの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法な
どの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲル
ろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン
交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方
法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親
和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー
などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法な
どの等電点の差を利用する方法などが用いられる。

【００６６】かくして得られるペプチド・蛋白質が遊離
体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で
得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる
方法により、遊離体または他の塩に変換することができ
る。なお、組換え体が産生するペプチド・蛋白質を、精
製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させるこ
とにより、任意に修飾を加えたり、ペプチド・ポリペプ
チドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素と
しては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギ
ニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコ
シダーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明の
ペプチドの活性は、標識した本発明のペプチドと本発明
の蛋白質との結合実験および特異抗体を用いたエンザイ
ムイムノアッセイなどにより測定することができる。ま
た、生成する本発明の蛋白質の活性は、標識した本発明
のペプチドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイなどにより測定することができる。

【００６７】また、本発明のペプチドは、遺伝子工学的
に原核細胞宿主中で発現させ、レドックスバッファー中
でリフォールディングして活性型のペプチドとして製造
してもよい。詳細を以下に述べる。本発明のペプチドが
宿主原核細胞中で不溶成分（封入体）を形成する場合に
は、培養後、遠心分離等の方法により集菌した後、細胞
を破砕し、封入体を変性剤を用いて可溶化することによ
って、本発明のペプチドを抽出することができる。細胞
の破砕は、常法で、たとえば超音波処理により実施でき
る。懸濁媒体として中性付近のｐＨ値（ｐＨ６．５〜
７．５）に調整した好適な緩衝液（例えばリン酸緩衝液
等）を用いることが好ましい。この際、細胞の破砕を促
進させるためＥＤＴＡを添加してもよい。このようにし
て細胞を破砕した後に、不溶成分（封入体）を任意の方
法で、遠心分離するか、濾過することにより分取する。
原核細胞由来の蛋白質をできる限り除去するため、たと
えば水、リン酸緩衝液を用いて洗浄することが好ましい
が、場合により４Ｍ程度の尿素で洗浄してもよい。得ら
れた沈殿（ペレット）を変性剤を用いて可溶化する際の
変性剤としては、公知の変性剤、特にグアニジンまたは
尿素等を使用することができる。変性剤は通常水溶液と
して用いられ、水溶液中の変性剤の濃度は、グアニジン
では４〜８モル／リットル、好ましくは約６〜７モル／
リットル、尿素では５〜９モル／リットル、好ましくは
約８モル／リットルである。グアニジンは通常グアニジ
ン塩酸塩等のグアニジンの酸付加塩として用いられる。

【００６８】本発明のペプチドが宿主原核細胞中で封入
体を形成しない場合には、培養後、遠心分離等の方法に
より集菌した後、細胞を変性剤を用いて可溶化するか、
あるいは細胞を破砕後変性剤で可溶化することによって
本発明のペプチドを抽出することができる。集菌した細
胞の可溶化に用いられる変性剤としては、例えばグアニ
ジンまたは尿素などが挙げられる。変性剤は通常水溶液
として用いられ、水溶液中の変性剤の濃度は、グアニジ
ンでは通常４〜８モル／リットル、好ましくは約６〜７
モル／リットルである。グアニジンは通常グアニジン塩
酸塩等のグアニジンの酸付加塩として用いられる。細胞
の破砕は、常法で、たとえば超音波処理、フレンチ・プ
レスにより実施できる。破砕された細胞の可溶化に用い
られる変性剤としては、公知の変性剤を使用してよく、
好ましくは、グアニジンまたは尿素などを使用する。変
性剤は通常、水溶液として用いられ、水溶液中の変性剤
の濃度は、グアニジンでは４〜８モル／リットル、好ま
しくは約６〜７モル／リットル、尿素では５〜９モル／
リットル、好ましくは約８モル／リットルである。グア
ニジンは通常グアニジン塩酸塩等のグアニジンの酸付加
塩として用いられる。

【００６９】上記のようにして封入体の可溶化を行う
か、菌体を変性剤で直接可溶化するか、または細胞を破
砕後変性剤で可溶化した後、遠心分離等で不純物を除去
し、得られた上澄液を必要により精製工程に付した後、
本発明のペプチドのリフォールディング（活性化、再生
化）を行う。リフォールディングは、精製した本発明の
ペプチドにレドックスバッファーを添加するか、または
本発明のペプチドを含有する上澄液をレドックスバッフ
ァーで希釈することにより行われる。レドックスバッフ
ァーとしては、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）および
還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を含有する緩衝液、シス
テインおよびシスチンを含有する緩衝液、システアミン
およびシスタミンを含有する緩衝液などが挙げられる。
中でもＧＳＳＧおよびＧＳＨを含有する緩衝液が好まし
い。上記緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液、リン
酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられ、
中でもトリス緩衝液等が好ましい。レドックスバッファ
ー中の酸化剤（酸化型物質）および還元剤（還元型物
質）の濃度は、例えば、それぞれ０．０１〜１００ミリ
モル／リットルおよび０．０１〜１００ミリモル／リッ
トルである。より具体的には、ＧＳＳＧおよびＧＳＨを
用いる場合、レドックスバッファー中のＧＳＳＧの濃度
は０．０１〜１００ミリモル／リットル、好ましくは
０．１〜１０ミリモル／リットル、好ましくは０．１〜
１．０ミリモル／リットルが用いられ、ＧＳＨの濃度は
０．０１〜１００ミリモル／リットル、好ましくは０．
１〜１０ミリモル／リットル、好ましくは０．２〜２．
０ミリモル／リットルが用いられる。この際、たとえば
メルカプト基を有さないアミノ酸などをレドックスバッ
ファーにさらに含有させておくことが好ましい。本発明
のペプチドを含有する上澄液をレドックスバッファーで
希釈する場合、変性剤の濃度を活性化に適した中性ｐＨ
において不作用濃度まで希釈することが好ましい。たと
えば変性剤としてグアジニンを使用する場合、希釈液中
のグアニジンの濃度を０〜２．０モル／リットル、好ま
しくは約１モル／リットル以下まで、変性剤として尿素
を使用する場合、希釈液中の尿素の濃度を０〜４．０モ
ル／リットル、好ましくは約２モル／リットル以下まで
希釈することが望ましい。

【００７０】上記メルカプト基を有さないアミノ酸とし
ては、例えばアルギニン、アスパラギン酸、バリン、リ
ジン、アラニン、シトルリン等が挙げられる。アルギニ
ン等が収率の点で好ましい。レドックスバッファー中の
該アミノ酸の添加濃度は、０．１〜１．０モル／リット
ル、好ましくは０．２〜０．８モル／リットルである。
上記リフォールディングに当っての温度は０〜３０℃、
好ましくは４〜１５℃である。ｐＨは７〜９、好ましく
はｐＨ７．５〜８．５である。リフォールディングに要
する時間は通常０．５〜７日間、好ましくは１〜３日
間、さらに好ましくは１〜２日間である。なお、可溶化
後かつリフォールディングの前に、例えば抽出、塩析、
透析、分配、結晶化、再結晶、ゲルろ過、クロマトグラ
フィー等の公知で常用の精製工程を導入することがで
き、好ましくは、たとえば０．１モル／リットル リン
酸緩衝液中セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５（アマ
シャム ファルマシア バイオテク（株））にかけるこ
とにより精製することができる。変性剤の分離は場合に
より０．１モル／リットル リン酸緩衝液に対して透析
することによっても可能である。精製工程はリフォール
ディングに続いて行うこともできる。一般にそのような
精製としては例えば抽出、塩析、透析、分配、結晶化、
再結晶、ゲルろ過、クロマトグラフィー等が挙げられ、
好ましい例として透析や、たとえばＳＰ−セファロース
（アマシャム ファルマシア バイオテク（株））、Ｃ
Ｍ−５ＰＷ（トーソー（株））、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（ト
ーソー（株））などを介したイオン交換クロマトグラフ
ィー、たとえばＣ４Ｐ−５０（昭和電工（株））を用い
た逆相クロマトグラフィー等による精製法が挙げられ
る。

【００７１】本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質も
しくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体
は、本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはそ
の部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であ
れば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れ
であってもよい。本発明のペプチドまたは本発明の蛋白
質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、
本発明のペプチド・蛋白質と略記することもある）に対
する抗体は、本発明のペプチド・蛋白質を抗原として用
い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造
することができる。

【００７２】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のペプチド・蛋白質は、哺乳動物に対して投与に
より抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６
週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いら
れる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、
モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられ
るが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノ
クローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫
された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗
体価の測定は、例えば、後記の標識化した本発明のペプ
チド・蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合
した標識剤の活性を測定することにより行なうことがで
きる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミル
スタインの方法〔ネイチャー（Nature)、２５６巻、４
９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。
融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好
ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としては、例
えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられ
るが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体
産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比
率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましく
は、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％
程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約
３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすること
により効率よく細胞融合を実施できる。

【００７３】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、本発明のペプチド・蛋白質抗原を直接あるいは担体
とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素
などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用い
られる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗
体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロ
ブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで
標識した本発明のペプチド・蛋白質を加え、固相に結合
したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられ
る。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそ
れに準じる方法に従って行なうことができるが、通常は
ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）
を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。
選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育
できるものならばどのような培地を用いても良い。例え
ば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清
を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血
清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイ
ブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製
薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通
常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００７４】（ｂ）モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。

【００７５】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法にしたがって製造することができる。例えば、免
疫抗原（本発明のペプチド・蛋白質の抗原）とキャリア
ー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗
体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動
物から本発明のペプチド・蛋白質に対する抗体含有物を
採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造でき
る。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキ
ャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の
種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリ
アーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率
良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させ
てもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイロ
グロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等
を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好まし
くは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の
縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドや
カルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール
基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が
用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産
生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤ととも
に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、
完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュ
バントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に
１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポ
リクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物
の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することが
できる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上
記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポ
リクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル
抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に
従って行なうことができる。

【００７６】本発明のペプチド、配列番号：２１で表わ
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するペプチドまたはその塩（以下、ＭＩＴ
１類と略記する場合がある）もしくは本発明の蛋白質、
それらをコードするポリヌクレオチドまたはそれらに対
する抗体は、血管新生阻害剤を得るための簡便な探索法
（スクリーニング）に有用である。特に、本発明の蛋白
質のアンタゴニストは、優れた血管新生阻害剤として有
用である。さらに、本発明の蛋白質、本発明の蛋白質を
コードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場
合がある）、本発明のアンチセンスＤＮＡおよび本発明
のペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗体と略記す
る場合がある）は、（i）本発明の蛋白質が関与する各
種疾病の予防・治療剤、（ii）本発明のペプチドと本発
明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩
のスクリーニング、（iii）本発明の蛋白質の定量、（i
v）遺伝子診断薬、（v）アンチセンスＤＮＡを含有する
医薬、（vi）本発明の抗体を含有する医薬および診断
薬、（vii）本発明のＤＮＡを有する非ヒト動物の作
製、（viii）構造的に類似したリガンド・レセプターと
の比較にもとづいたドラッグデザインなどの実施のため
に有用である。特に、本発明の組換え蛋白質の発現系を
用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによっ
て、ヒトや哺乳動物に特異的な本発明の蛋白質に対する
リガンドの結合性を変化させる化合物（例、ＺＡＱアゴ
ニスト、ＺＡＱアンタゴニストなど）をスクリーニング
することができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを
各種疾病の予防・治療剤などとして使用することができ
る。これら用途について、以下に具体的に説明する。

【００７７】（１）（i）本発明のペプチドの活性を阻
害する化合物またはその塩、（ii）本発明の蛋白質の活
性を阻害する化合物またはその塩、（iii）本発明のペ
プチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻
害する化合物またはその塩、または（iv）本発明のペプ
チドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用
を阻害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生
阻害剤 （i）本発明のペプチドの活性を阻害する化合物として
は、本発明のペプチドの活性を阻害する化合物であれば
よく、例えば、血管内皮細胞増殖活性、腸管収縮制御活
性、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質
を介するシグナル情報伝達作用などを阻害する化合物な
どが挙げられる。 （ii）本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物として
は、本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物であればよ
く、例えば、本発明のペプチドに対する結合活性、シグ
ナル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられ
る。 （iii）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の
蛋白質との結合を阻害する化合物としては、本発明のペ
プチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻
害する化合物であればよい。 （iv）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の
蛋白質の活性化作用を阻害する化合物としては、本発明
のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性
化作用を阻害する化合物であればよく、例えば、本発明
のペプチドまたはＭＩＴ１類による、本発明の蛋白質の
本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達
作用などを阻害する化合物などが挙げられる。 上記（i）〜（iv）の化合物またはその塩は、例えば、
後述の本発明のスクリーニング方法またはスクリーニン
グ用キットを用いることにより得られうる。

【００７８】該塩としては、例えば、薬学的に許容可能
な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機
塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性また
は酸性アミノ酸との塩などがあげられる。無機塩基との
塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム
塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム
塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム
塩、アンモニウム塩などがあげられる。有機塩基との塩
の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエ
チルアミン、ピリジン、ピコリン、2-6−ルチジン、エ
タノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノール
アミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミ
ン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩
などがあげられる。無機酸との塩の好適な例としては、
例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があ
げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ
酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石
酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタ
ンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの
塩があげられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例とし
ては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの
塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例
えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげら
れる。上記化合物またはその塩は、血管新生阻害剤とし
て用いられ、例えば、血管新生を伴う疾患〔例、癌
（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、
卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、
結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫など）、卵巣疾患（例、多
嚢胞性卵巣症候群（卵巣多嚢胞症）、卵巣過剰刺激症な
ど）、炎症性疾患（例、関節リューマチなど）、糖尿病
性網膜症など〕等の予防・治療剤などの医薬として安全
に用いられる。このような医薬として使用する場合、後
述の本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング
用キットを用いることにより得られる化合物を医薬とし
て実施する場合と同様にして実施することができる。

【００７９】（２）本発明のペプチドをコードするＤＮ
Ａの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配
列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチド
を含有してなる血管新生阻害剤 上記アンチセンスヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ
等）は、生体内における本発明のペプチドまたはそのＤ
ＮＡの機能を抑制することができるので、血管新生阻害
剤として、例えば、血管新生を伴う疾患〔例、癌（例、
膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣
癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸
癌、直腸癌、カポジ肉腫など）、卵巣疾患（例、多嚢胞
性卵巣症候群（卵巣多嚢胞症）、卵巣過剰刺激症な
ど）、炎症性疾患（例、関節リューマチなど）、糖尿病
性網膜症など〕等の予防・治療剤などの医薬として安全
に用いられる。例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独あ
るいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター
等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投
与することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのま
まで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に
認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロ
ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。

【００８０】（３）本発明のペプチドに対する抗体また
は本発明の蛋白質に対する抗体を含有してなる血管新生
阻害剤 上記抗体は、例えば、本発明のペプチドまたは本発明の
蛋白質の発現過多に起因する疾患、例えば血管新生阻害
剤として、例えば、血管新生を伴う疾患〔例、癌（例、
膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣
癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸
癌、直腸癌、カポジ肉腫など）、卵巣疾患（例、多嚢胞
性卵巣症候群（卵巣多嚢胞症）、卵巣過剰刺激症な
ど）、炎症性疾患（例、関節リューマチなど）、糖尿病
性網膜症など〕等の予防・治療剤などの医薬として安全
に用いられる。このような医薬として使用する場合、後
述の本発明の抗体を含有する医薬を実施する場合と同様
にして実施することができる。

【００８１】（４）本発明のペプチドまたは本発明の蛋
白質をコードするポリヌクレオチドを含有してなる癌、
卵巣疾患、炎症性疾患、糖尿病性網膜症などの診断薬 上記ポリヌクレオチドは、例えばプローブとして使用す
ることにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、
マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）における本発明のペプ
チドまたは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡまたはｍ
ＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるの
で、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異
あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あ
るいは発現過多等の遺伝子診断薬として有用である。上
記遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリ
ダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Genomics，第5
巻，874〜879頁（1989年）、Proceedings ofthe Nation
al Academy of Sciences of the United States of Ame
rica，第86巻，2766〜2770頁（1989年））、 ＤＮＡマ
イクロアレイ等により実施することができる。例えば、
ノーザンハイブリダイゼーションやＤＮＡマイクロアレ
イにより発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ
法やＤＮＡマイクロアレイによりＤＮＡの突然変異が検
出された場合は、例えば、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓
癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、
膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉
腫など）、卵巣疾患（例、多嚢胞性卵巣症候群（卵巣多
嚢胞症）、卵巣過剰刺激症など）、炎症性疾患（例、関
節リューマチなど）、糖尿病性網膜症などに罹患してい
る可能性が高いと診断することができる。

【００８２】（５）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類
と本発明の蛋白質とを用いるスクリーニング 本発明のペプチド（その部分ペプチドも含む）またはＭ
ＩＴ１類および本発明の蛋白質（本発明の蛋白質の部分
ペプチドも含む）を用いることを特徴とするスクリーニ
ング方法、または本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類お
よび本発明の蛋白質を用いることを特徴とするスクリー
ニング用キット（以下、本発明のスクリーニング方法、
本発明のスクリーニング用キットと略記する場合もあ
る）により、例えば、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１
類と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物、好
ましくは、（i）本発明のペプチドの活性を阻害する化
合物またはその塩、（ii）本発明の蛋白質の活性を阻害
する化合物またはその塩、（iii）本発明のペプチドま
たはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化
合物またはその塩、（iv）本発明のペプチドまたはＭＩ
Ｔ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を阻害する化合
物またはその塩などが得られる。上記（i）〜（iv）の
化合物またはその塩は、血管新生阻害作用を有してお
り、血管新生阻害剤として有用である。

【００８３】本発明のスクリーニング方法または本発明
のスクリーニング用キットについて、以下に詳述する。
本発明の蛋白質を用いるか、または組換え型本発明の蛋
白質の発現系を構築し、該発現系を用いた本発明のペプ
チドとの結合アッセイ系（リガンド・レセプターアッセ
イ系）を用いることによって、本発明のペプチドまたは
ＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化
合物、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋
白質との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチ
ド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生
産物など）またはその塩をスクリーニングすることがで
きる。このような化合物には、本発明の蛋白質を介して
細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコ
リン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、
細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜
電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性
化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性
など）を有する化合物（アゴニスト）と該細胞刺激活性
を有しない化合物（アンタゴニスト）などが含まれる。
「本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化
させる」とは、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との
結合を阻害する場合と促進する場合の両方を包含するも
のである。本発明は、（i）本発明の蛋白質に、本発明
のペプチドを接触させた場合と（ii）上記した本発明の
蛋白質に、本発明のペプチドおよび試験化合物を接触さ
せた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のペ
プチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本スク
リーニングにおいては、ＭＩＴ１類は、本発明のペプチ
ドと同様に使用すればよい。本発明のスクリーニング方
法においては、（i）上記した本発明の蛋白質に本発明
のペプチドを接触させた場合と（ii）上記した本発明の
蛋白質に本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させ
た場合における、例えば該本発明の蛋白質に対する本発
明のペプチドの結合量、細胞刺激活性などを測定して比
較する。

【００８４】本発明のスクリーニング方法としての具体
例としては、例えば、（a）本発明のペプチドを本発明
の蛋白質に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび
試験化合物を本発明の蛋白質に接触させた場合におけ
る、本発明のペプチドの本発明の蛋白質に対する結合量
を測定し、比較することを特徴とする、本発明のペプチ
ドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（b）本発明のペプチ
ドを、本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜
画分に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験
化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の
膜画分に接触させた場合における、本発明のペプチドの
該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較す
ることを特徴とする、本発明のペプチドと本発明の蛋白
質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法、および（c）本発明の蛋白質が、本発明
の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培
養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質
である上記（b）記載のスクリーニング方法、（d）本発
明のペプチドが、標識したペプチドである上記（a）〜
（c）のスクリーニング方法などのレセプター結合アッ
セイ系、（e）本発明のペプチドを本発明の蛋白質に接
触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を
本発明の蛋白質に接触させた場合における、本発明の蛋
白質を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特
徴とする、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、（f）本発明のペプチドを本発明の蛋白質を含有す
る細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発
明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質を含有
する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合におけ
る、本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、比
較することを特徴とする、本発明のペプチドと本発明の
蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のス
クリーニング方法、および（g）本発明の蛋白質が、本
発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体
を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋
白質である上記（f）のスクリーニング方法などの細胞
刺激アッセイ系などが挙げられる。

【００８５】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に
用いる本発明の蛋白質としては、上記の本発明の蛋白質
を含有するものであれば何れのものであってもよい。し
かし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことか
ら、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え
体を用いて大量発現させた本発明の蛋白質などが適して
いる。また、哺乳動物由来の内皮細胞も使用できる。本
発明の蛋白質を製造するには、前述の方法などが用いら
れる。本発明のスクリーニング方法において、本発明の
蛋白質を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用い
る場合、後述の調製法に従えばよい。本発明の蛋白質を
含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒ
ド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は
それ自体公知の方法に従って行うことができる。本発明
の蛋白質を含有する細胞としては、本発明の蛋白質を発
現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の
大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などがあげ
られる。膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体
公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のこと
をいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型
ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレ
ンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超
音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細
胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあ
げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾
配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用い
られる。例えば、細胞破砕液を低速（500〜3000rpm）で
短時間（通常、約1〜10分）遠心し、上清をさらに高速
（15000〜30000rpm）で通常30分〜2時間遠心し、得られ
る沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発
明の蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成
分が多く含まれる。該本発明の蛋白質を含有する細胞や
膜画分中の本発明の蛋白質の量は、１細胞当たり10³〜1
0⁸分子であるのが好ましく、10⁵〜10⁷分子であるのが好
適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガ
ンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリー
ニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロット
で大量の試料を測定できるようになる。

【００８６】上記の哺乳動物由来の内皮細胞としては、
例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウスなど
の内皮細胞（例、動脈血管内皮細胞、毛細血管内皮細胞
など）が挙げられる。例えば、哺乳動物由来の毛細血管
内皮細胞の一つであるウシ毛細血管内皮細胞は、以下の
方法で調製することができる。また、同様の方法で、哺
乳動物の脳、卵巣などからも毛細血管内皮細胞を調製す
ることができる。先ず、ウシ副腎の表面についている脂
質をはさみで除去後、副腎を20％イソジンを含む生理食
塩水に5分間浸し消毒する。その後、生理食塩水で副腎
を洗浄してから半分に切断し副腎髄質を除去する。残っ
た副腎皮質を内側からメスとはさみで採取し細かく切断
する。続いて、副腎皮質半分を用いて以下の操作を実施
する。すなわち、細片に0.5％コラゲナーゼ（和光純
薬）と0.1％ bovine serum albumin (BSA)を含むMinimu
m essential medium（MEM）20 mlを加え、37℃で30分間
インキュベーションする。その後、ピペッティングして
組織塊を崩した後、1〜600 rpmで5分間遠心し、得られ
た沈殿に25％ BSAを含むMEMを25 ml添加し再度2,700rpm
で20分間遠心する。得られた沈殿に上述のコラゲナーゼ
を含むMEMを加えて懸濁し37℃で15分間インキュベーシ
ョンした後、コラゲナーゼ消化物をナイロンガーゼ（10
0ミクロン）で濾過し濾液を回収する。この濾液を再度
ナイロンガーゼ（50ミクロン）で濾過し、ガーゼに捕集
されたくずを10％ fetal bovineserum (FBS)を含むMEM
を用いてゼラチンコートした6穴プレートに洗いこむ。4
時間後、10％ FBS/MEMでプレートを穏やかに洗浄後、2
ng/ml basic fibroblast growth factorと10％ FBSを含
むMEMを添加し5％CO₂下37℃で培養する。以後、培地は3
日毎に全量交換する。5〜6日後に目的とする細胞のコロ
ニーを残して不要細胞を顕微鏡下でパスツールピペット
を用いて除去する。9〜10日後に目的コロニーにクロー
ニングリングをかけ、トリプシン処理により細胞を回収
し24穴プレートに移して培養する。得られた細胞を適当
なスケールになるまで培養し実験に使用する。

【００８７】前記のレセプター結合アッセイ系や細胞刺
激アッセイ系などのスクリーニング方法を実施するため
には、例えば、本発明の蛋白質画分と、本発明のペプチ
ド（例、標識した本発明のペプチド）などが用いられ
る。本発明の蛋白質画分としては、天然型の本発明の蛋
白質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型
本発明の蛋白質画分などが望ましい。ここで、同等の活
性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識した
本発明のペプチドとしては、例えば、放射性同位元素
（例、〔¹²⁵I〕、〔¹³¹I〕、〔³H〕、〔¹⁴C〕、
〔³²P〕、〔³³P〕、〔³⁵S〕など）、蛍光物質〔例、シ
アニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（ア
マシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカ
ミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、酵素
（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸
脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノ
ール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチ
ン、ランタニド元素などで標識された本発明のペプチ
ド、好ましくは放射性同位元素で標識された本発明のペ
プチドなどを用いることができる。また、ボルトン−ハ
ンター試薬を用いて公知の方法で調製した本発明のペプ
チドの標識体を利用することもできる。具体的には、本
発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させ
る化合物のスクリーニングを行うには、まず本発明の蛋
白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニ
ングに適したバッファーに懸濁することにより本発明の
蛋白質標品を調製する。バッファーには、pH4〜10（望
ましくはpH6〜8）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バ
ッファーなどの本発明のペプチドと本発明の蛋白質との
結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
また、非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween
-80^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコ
レートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもで
きる。さらに、プロテアーゼによる本発明の蛋白質や本
発明のペプチドの分解を抑える目的でPMSF、ロイペプチ
ン、E-64（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプ
ロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。0.01〜10ml
の該本発明の蛋白質溶液に、一定量（5000〜500000cp
m）の標識した本発明のペプチドを添加し、同時に10^-4
〜10^-1μMの試験化合物を共存させる。非特異的結合量
（NSB）を知るために大過剰の未標識の本発明のペプチ
ドを加えた反応チューブも用意する。反応は0〜50℃、
望ましくは4〜37℃で、20分〜24時間、望ましくは30分
〜3時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適
量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存
する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたは
γ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合の
カウント(B₀）から非特異的結合量（NSB）を引いたカウ
ント（B₀-NSB）を100％とした時、特異的結合量（B-NS
B）が例えば50％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力
のある候補物質として選択することができる。

【００８８】また、本発明の蛋白質と本発明のペプチド
との結合を測定する方法として、BIAcore（アマシャム
ファルマシア バイオテク社製）を用いることもでき
る。この方法では、本発明のペプチドを装置に添付のプ
ロトコールに従ったアミノカップリング法によってセン
サーチップに固定し、本発明の蛋白質を含有する細胞ま
たは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質
変換体から精製した本発明の蛋白質または本発明の蛋白
質を含む膜画分、あるいは精製した本発明の蛋白質また
は本発明の蛋白質を含む膜画分および試験化合物を含む
リン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液
をセンサーチップ上を毎分2〜20μlの流量で通過させ
る。 センサーチップ上の本発明のペプチドと本発明の
蛋白質とが結合することによって生じる表面プラズモン
共鳴の変化を共存する試験化合物が変化させることを観
察することによって本発明の蛋白質と本発明のペプチド
との結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なう
ことができる。この方法は、本発明の蛋白質をセンサー
チップに固定し、本発明のペプチドまたは本発明のペプ
チドおよび試験化合物を含むリン酸バッファーまたはト
リスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通過
させる方法を用いても同様に測定することができる。試
験化合物としては、上記と同様のものなどがあげられ
る。

【００８９】前記の細胞刺激アッセイ系のスクリーニン
グ方法を実施するためには、本発明の蛋白質を介する細
胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリ
ン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細
胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性
化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性
など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて
測定することができる。具体的には、まず、本発明の蛋
白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養す
る。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な
培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに
交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベ
ートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生
成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺
激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）
の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な
場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイ
を行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性
については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量
を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検
出することができる。

【００９０】細胞刺激活性を測定してスクリーニングを
行なうには、適当な本発明の蛋白質を発現した細胞が用
いられる。本発明の蛋白質を発現した細胞としては、前
述の組換え型本発明の蛋白質発現細胞株などが望まし
い。形質転換体である本発明の蛋白質発現細胞は安定発
現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の
種類は上記と同様のものが用いられる。試験化合物とし
ては、例えばペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動
物組織抽出液などがあげられる。

【００９１】上記細胞刺激アッセイ系のスクリーニング
方法について、さらに具体的に以下〔１〕〜〔１２〕に
記載する。 〔１〕受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激
されると細胞内のＧ蛋白質が活性化されてＧＴＰが結合
する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観
察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変
化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加してお
くと、ＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧ蛋白質に結合する
が、加水分解されずにＧ蛋白質を含む細胞膜に結合した
状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると細胞
膜に残存した標識されたＧＴＰγＳを測定することによ
り、受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定
することができる。この反応を利用して、本発明のペプ
チドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定
することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質と
の結合性を変化させる化合物をスクリーニングすること
ができる。この方法は、本発明の蛋白質を含む膜画分を
用いて行う。本測定法において本発明の蛋白質膜画分へ
のＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質はアゴニストであ
る。具体的には、標識したＧＴＰγＳの存在下、本発明
のペプチドを本発明の蛋白質細胞膜画分に接触させた場
合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋
白質細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の蛋
白質細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定し、
比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白
質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングす
る。本方法において、本発明のペプチドによる本発明の
蛋白質細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制す
る活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物
質として選択することができる。一方、試験化合物のみ
を本発明の蛋白質細胞膜画分に接触させ、本発明の蛋白
質細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定するこ
とにより、アゴニストのスクリーニングを行なうことも
できる。

【００９２】スクリーニング法の一例についてより具体
的に以下に述べる。公知の方法に準じて調製した本発明
の蛋白質を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１μＭＧＤＰ、０．１％ ＢＳＡ；ｐＨ７．４）で
希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。こ
れをＦａｌｃｏｎ２０５３に０．２ｍｌずつ分注し、本
発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合
物を加え、さらに終濃度２００ｐＭとなるように［^３５
Ｓ］ＧＴＰγＳを加える。２５℃で１時間保温した後、
氷冷した洗浄用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ
ＭｇＣｌ_２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＢＳ
Ａ，０．０５％ ＣＨＡＰＳ；ｐＨ７．４）１．５ｍｌ
を加えて、ガラス繊維ろ紙ＧＦ／Ｆでろ過する。６５
℃、３０分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウ
ンターでろ紙上に残った膜画分に結合した［ ^３５Ｓ］Ｇ
ＴＰγＳの放射活性を測定する。本発明のペプチドのみ
を加えた実験区の放射活性を１００％、本発明のペプチ
ドを加えなかった実験区の放射活性を０％とし、本発明
のペプチドによるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験
化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例
えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある
候補物質として選択することができる。

【００９３】〔２〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明
のペプチドの刺激により、細胞内ｃＡＭＰの産生が抑制
される。この反応を利用して、本発明のペプチドの本発
明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することに
より、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を
変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在
下、本発明のペプチドを本発明の蛋白質発現細胞に接触
させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本
発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、該細
胞の細胞内ｃＡＭＰの産生抑制活性を測定し、比較する
ことにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結
合性を変化させる化合物をスクリーニングする。細胞内
ｃＡＭＰ量を増加させる物質としては、例えば、フォル
スコリン、カルシトニンなどが用いられる。本発明の蛋
白質発現細胞内のｃＡＭＰ産生量は、マウス、ラット、
ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗ｃＡＭＰ
抗体と〔^１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰ（ともに市販品）を使
用することによるＲＩＡ系、または抗ｃＡＭＰ抗体と標
識ｃＡＭＰとを組み合わせたＥＩＡ系で測定することが
できる。また、抗ｃＡＭＰ抗体を、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ
または抗ｃＡＭＰ抗体産生に用いた動物のＩｇＧなどに
対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含む
ビーズと〔^１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰとを使用するＳＰＡ
（Scintillation Proximity Assay）法による定量も可
能である（アマシャムファルマシアバイオテク社製のキ
ットを使用する）。本方法において、本発明のペプチド
による本発明の蛋白質発現細胞のｃＡＭＰ産生抑制活性
を阻害する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のあ
る候補物質として選択することができる。一方、試験化
合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて、ｃＡ
ＭＰ産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を
示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。

【００９４】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明の蛋白質発現細胞（例、ＣＨＯ細胞などの動
物細胞）（ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞；後述の参考例２）を２
４穴プレートに５ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種
し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ ３−イソブ
チル−メチルキサンチン、０．０５％ ＢＳＡおよび２
０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ
７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記す
る）。その後、０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて
３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、
新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた
後、１μＭの本発明のペプチドまたは１μＭの本発明の
ペプチドおよび試験化合物を添加した２μＭ フォルス
コリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞
に加え、３７℃で２４分間反応させる。１００μｌの２
０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、その後氷上で１
時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出する。抽出液
中のｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ ＥＩＡキット（アマシャ
ムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォル
スコリンの刺激によって産生されたｃＡＭＰ量を１００
％とし、１μＭの本発明のペプチドの添加によって抑制
されたｃＡＭＰ量を０％として、本発明のペプチドによ
るｃＡＭＰ産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算
出する。本発明のペプチドの活性を阻害して、ｃＡＭＰ
産生活性が例えば５０％以上になる試験化合物を、拮抗
阻害能力のある候補物質として選択することができる。
また、本発明のペプチドの刺激により、細胞内ｃＡＭＰ
量が増加する性質を示す本発明の蛋白質発現細胞を使用
する場合、本発明のペプチドを本発明の蛋白質発現細胞
に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合
物を本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合におけ
る、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生促進活性を測定し、
比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白
質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする
ことができる。本方法において、本発明のペプチドによ
る本発明の蛋白質発現細胞のｃＡＭＰ産生促進活性を阻
害する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候
補物質として選択することができる。一方、試験化合物
のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させてｃＡＭＰ産
生促進活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化
合物のスクリーニングを行なうことができる。ｃＡＭＰ
産生促進活性は、上記のスクリーニング法においてフォ
ルスコリンを添加せずに本発明の蛋白質発現細胞（例、
ＣＨＯ細胞などの動物細胞）に本発明のペプチドまたは
本発明のペプチドおよび試験化合物を添加して産生され
たｃＡＭＰを上記の方法で定量して測定する。

【００９５】〔３〕ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター
を用いて、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞
に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプ
チドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物を
スクリーニングすることができる。ＣＲＥ（cAMP respo
nse element）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター
遺伝子上流に挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクタ
ーを得る。ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入し
た本発明の蛋白質発現細胞において、ｃＡＭＰの上昇を
伴う刺激は、ＣＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、
それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白
質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白
質の酵素活性を測定することにより、ＣＲＥ−レポータ
ー遺伝子ベクター導入細胞内のｃＡＭＰ量の変動を検出
することができる。具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増
加させる物質の存在下、本発明のペプチドを、ＣＲＥ−
レポーター遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞
に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合
物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の
蛋白質発現細胞に接触させた場合における、レポーター
遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することによ
り、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変
化させる化合物をスクリーニングする。細胞内ｃＡＭＰ
量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリ
ン、カルシトニンなどが用いられる。ベクターとして
は、例えば、ピッカジーン ベイシックベクター、ピッ
カジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造
（株））などが用いられる。ＣＲＥを含むＤＮＡを、上
記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ
遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＣＲ
Ｅ−レポーター遺伝子ベクターとする。本方法におい
て、本発明のペプチドによるレポーター遺伝子蛋白質の
酵素活性抑制を回復させる試験化合物を、拮抗阻害能力
のある候補物質として選択することができる。一方、試
験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて、
フォルスコリン刺激によって上昇した発光量の本発明の
ペプチドと同様な抑制を測定することによりアゴニスト
のスクリーニングを行なうこともできる。

【００９６】レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ
を利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体
例を以下に述べる。ＣＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフ
ェラーゼ）を導入した本発明の蛋白質発現細胞を、２４
穴プレートに５ｘ１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、
４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ ３−イソブチル
−メチルキサンチン、０．０５％ＢＳＡおよび２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）
で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。そ
の後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培
養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．
２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１μＭ
の本発明のペプチドまたは１μＭの本発明のペプチドお
よび試験化合物を添加した２μＭ フォルスコリンを含
む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３
７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞
溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発
光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェ
ラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレー
ションカウンターまたはトップカウンターにより測定す
る。本発明のペプチド単独を添加した場合と、１μＭの
本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した場合のル
シフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。本発
明のペプチドは、フォルスコリン刺激に基づくルシフェ
ラーゼによる発光量の増加を抑制する。該抑制を回復さ
せる化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択す
ることができる。

【００９７】レポーター遺伝子として、例えば、アルカ
リフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチル
トランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransfer
ase）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いても
よい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、
公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測
定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光
純薬製Lumi-Phos 530を用いて、クロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬
製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay
KiTを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和
光純薬製Aurora Gal-XEを用いて測定する。

【００９８】〔４〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明
のペプチドの刺激により、アラキドン酸代謝物を細胞外
に放出する。この反応を利用して、本発明のペプチドの
本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定するこ
とにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合
性を変化させる化合物をスクリーニングすることができ
る。あらかじめ、標識したアラキドン酸を、本発明の蛋
白質発現細胞に取り込ませておくことによって、アラキ
ドン酸代謝物放出活性を、細胞外に放出された標識され
たアラキドン酸代謝物を測定することによって測定する
ことができる。具体的には、本発明のペプチドを、標識
したアラキドン酸を含有する本発明の蛋白質発現細胞に
接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物
を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の蛋白質発
現細胞に接触させた場合における、アラキドン酸代謝物
の放出活性を測定し、比較することにより、本発明のペ
プチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物
をスクリーニングする。本方法において、本発明のペプ
チドによるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する試験
化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択する
ことができる。また、試験化合物のみを本発明の蛋白質
発現細胞に接触させ、本発明の蛋白質発現細胞のアラキ
ドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることにより
アゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なう
こともできる。

【００９９】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに５ｘ１
０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養後、［
^３Ｈ］アラキドン酸を０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌとなる
よう添加し、１６時間後、細胞を０．０５％ ＢＳＡお
よび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー
（ｐＨ７．４）（以下、反応用バッファーと略記する）
で洗浄する。終濃度１０μＭの本発明のペプチドまたは
終濃度１０μＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を
含む反応用バッファー ５００μｌを、各ｗｅｌｌに添
加する。３７℃で６０分間インキュベートした後、反応
液４００μｌをシンチレーターに加え、反応液中に遊離
した［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量をシンチレーショ
ンカウンターにより測定する。反応用バッファー ５０
０μｌのみを添加した場合（本発明のペプチド非添加・
試験化合物非添加）の遊離［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物
の量を０％、１０μＭの本発明のペプチドを含む反応用
バッファーを添加した場合（試験化合物非添加）の遊離
［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を１００％として、試
験化合物を添加した場合の遊離［^３Ｈ］アラキドン酸代
謝物の量を算出する。アラキドン酸代謝物放出活性が、
例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のあ
る候補物質として選択することができる。

【０１００】〔５〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明
のペプチドの刺激により、細胞内のＣａ濃度が上昇す
る。この反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の
蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することによ
り、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変
化させる化合物をスクリーニングすることができる。具
体的には、本発明のペプチドを、本発明の蛋白質発現細
胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化
合物を、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合にお
ける、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較す
ることにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との
結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定
は公知の方法に従って行う。本方法において、本発明の
ペプチドによる細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制する
試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択
することができる。一方、試験化合物のみの添加による
蛍光強度の上昇を測定することによってアゴニストのス
クリーニングを行なうこともできる。スクリーニング法
の一具体例を以下に述べる。本発明の蛋白質発現細胞
を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、
培養液を、４ｍＭ Ｆｕｒａ−２ ＡＭ（同仁化学研究
所）を縣濁したＨＢＳＳに置換し、室温で２時間３０分
おく。ＨＢＳＳで洗浄した後、キュベットにカバーグラ
スをセットし、本発明のペプチドまたは本発明のペプチ
ドおよび試験化合物を添加し、励起波長３４０ｎｍおよ
び３８０ｎｍでの、５０５ｎｍの蛍光強度の比の上昇を
蛍光測定器で測定し、比較する。また、ＦＬＩＰＲ（モ
レキュラーデバイス社製）を使って行ってもよい。本発
明の蛋白質発現細胞縣濁液にＦｌｕｏ−３ ＡＭ（同仁
化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清
を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播
く。ＦＬＩＰＲ装置にセットし、Ｆｕｒａ−２の場合と
同様に、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよ
び試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定
器で測定し、比較する。さらに、本発明の蛋白質発現細
胞に、細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するような
蛋白質の遺伝子（例、aequorinなど）を共発現させてお
き、細胞内Ｃａイオン濃度の上昇によって、該遺伝子蛋
白質（例、aequorinなど）がＣａ結合型となり発光する
ことを利用して、本発明のペプチドと本発明の蛋白質と
の結合性を変化させる化合物をスクリーニングすること
もできる。細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するよ
うな蛋白質の遺伝子を共発現させた本発明の蛋白質発現
細胞を、９６穴プレートに播き、上記と同様に、本発明
のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を
添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比
較する。本発明のペプチドによる蛍光強度の上昇を、抑
制する試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として
選択することができる。

【０１０１】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。対照としてＥＴＡ（エンドセリンＡレセプター）発
現ＣＨＯ細胞２４番クローン（以後ＥＴＡ２４細胞と略
称する。Journal of Pharmacology and Experimental T
herapeutics, 279巻、675-685頁、1996年参照）を用
い、アッセイ用サンプルについて、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞
（後述の参考例２）およびＥＴＡ２４細胞における細胞
内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定をＦＬＩＰＲ（モレキ
ュラーデバイス社製）を用いて行う。ＺＡＱＣ−Ｂ１細
胞、ＥＴＡ２４細胞共に１０％透析処理済ウシ胎児血清
（以後ｄ ＦＢＳとする）を加えたＤＭＥＭで継代培養
しているものを用いる。ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞、ＥＴＡ２
４細胞をそれぞれ15×10⁴cells/mlとなるように培地（1
0％ d FBS-DMEM）に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレー
ト(Black plate clear bottom、Coster社)に分注器を用
いて各ウェルに200 μlずつ植え込み（3.0×10⁴cells/2
00μl/ウェル）、5％ CO₂インキュベーター中にて37℃
で一晩培養した後用いる（以後、細胞プレートとす
る）。H/HBSS（ニッスイハンクス２（日水製薬株式会
社） 9.8g、炭酸水素ナトリウム 0.35g、HEPES 4.77 g
、水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、フィ
ルター滅菌処理）20 ml、250 mM Probenecid 200 μ
l、ウシ胎児血清(FBS) 200 μlを混合する。また、Fluo
3-AM（同仁化学研究所） 2バイアル(50 μg)をジメチ
ルスルフォキサイド 40 μl、20％ Pluronic acid（Mol
ecular Probes社） 40 μlに溶解し、これを上記H/HBSS
−Probenecid−FBS に加え、混和後、8連ピペットを用
いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル 100 μlず
つ分注し、5％ CO₂インキュベーター中にて37℃で1時間
インキュベートする（色素ローディング）。アッセイ用
サンプル（各フラクション）に、2.5 mM Probenecid、
0.1％ CHAPSを含むH/HBSS 150 μlを加えて希釈し、Ｆ
ＬＩＰＲ用９６穴プレート（V-Bottomプレート、Coster
社）へ移す（以後、サンプルプレートとする）。細胞プ
レートの色素ローディング終了後、H/HBSSに2.5 mM Pro
benecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャ
ー(Molecular Devices社)を用いて細胞プレートを４回
洗浄し、洗浄後100 μlの洗浄バッファーを残す。この
細胞プレートとサンプルプレートをFLIPRにセットしア
ッセイを行う（FLIPRにより、サンプルプレートから50
μlのサンプルが細胞プレートへと移される）。

【０１０２】〔６〕受容体を発現する細胞に、受容体ア
ゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃
度は上昇する。本発明のペプチドの、本発明の蛋白質発
現細胞における細胞内イノシトール三リン酸産生活性を
利用することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白
質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする
ことができる。具体的には、標識したイノシトールの存
在下、本発明のペプチドを、本発明の蛋白質発現細胞に
接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物
を、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合におけ
る、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較する
ことにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結
合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は
公知の方法に従って行う。本方法において、イノシトー
ル三リン酸産生活性を抑制する試験化合物を、拮抗阻害
能力のある候補物質として選択することができる。一
方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触さ
せ、イノシトール三リン酸産生上昇を測定することによ
ってアゴニストのスクリーニングを行なうこともでき
る。

【０１０３】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに播き、
１日間培養する。その後、myo-[2-³H]inositol（2.5μC
i/well）を添加した培地で１日間培養し、細胞を放射活
性を有するイノシトールを無添加の培地でよく洗浄す
る。本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試
験化合物を添加後、１０％過塩素酸を加え、反応を止め
る。１．５Ｍ 水酸化カリウムおよび６０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ溶液で中和し、０．５ｍｌのＡＧ１ｘ８樹脂（Bio-Ra
d）を詰めたカラムに通し、５ｍＭ 四ホウ酸ナトリウム
（Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７）および６０ｍＭ ギ酸アンモニウム
で洗浄した後、１Ｍ ギ酸アンモニウムおよび０．１Ｍ
ギ酸で溶出した放射活性を、液体シンチレーションカウ
ンターで測定する。本発明のペプチドを添加しない場合
の放射活性を０％、本発明のペプチドを添加した場合の
放射活性を１００％とし、試験化合物の、本発明のペプ
チドと本発明の蛋白質の結合に対する影響を算出する。
イノシトール三リン酸産生活性が、例えば５０％以下に
なる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選
択することができる。

【０１０４】〔７〕ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター
を用いて、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞
に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプ
チドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物を
スクリーニングすることができる。ＴＲＥ（TPA respon
se element）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺
伝子上流に挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター
を得る。ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した
本発明の蛋白質発現細胞において、細胞内カルシウム濃
度の上昇を伴う刺激は、ＴＲＥを介したレポーター遺伝
子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産
物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺
伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＴＲＥ−
レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の
変動を検出することができる。具体的には、本発明のペ
プチドを、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発
明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプ
チドおよび試験化合物を、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベ
クター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合に
おける、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、
比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白
質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングす
る。ベクターとしては、例えば、ピッカジーン ベイシ
ックベクター、ピッカジーン エンハンサーベクター
（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＴＲＥを
含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例え
ばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイ
トに挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとす
る。本方法において、本発明のペプチドによるレポータ
ー遺伝子蛋白質の酵素活性を抑制する試験化合物を、拮
抗阻害能力のある候補物質として選択することができ
る。一方、試験化合物のみをＴＲＥ−レポーター遺伝子
ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、本発
明のペプチドと同様な発光量の増加を測定することによ
りアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

【０１０５】レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ
を利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体
例を以下に述べる。ＴＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフ
ェラーゼ）を導入した本発明の蛋白質発現細胞を、２４
穴プレートに５ｘ１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、
４８時間培養する。細胞を０．０５％ ＢＳＡおよび２
０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ
７．４）で洗浄した後、１０ｎＭの本発明のペプチドま
たは１０ｎＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を添
加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジー
ン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶
解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。
ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シ
ンチレーションカウンターまたはトップカウンターによ
り測定する。本発明のペプチドを添加した場合と、１０
ｎＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した場
合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較す
る。本発明のペプチドによる細胞内カルシウムの上昇に
よって、ルシフェラーゼによる発光量が増加する。この
増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質と
して選択することができる。

【０１０６】レポーター遺伝子として、例えば、アルカ
リフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチル
トランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransfer
ase）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いても
よい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、
公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測
定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光
純薬製Lumi-Phos 530を用いて、クロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬
製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay
KiTを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和
光純薬製Aurora Gal-XEを用いて測定する。

【０１０７】〔８〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明
のペプチドの刺激により、ＭＡＰキナーゼが活性化さ
れ、増殖する。この反応を利用して、本発明のペプチド
の本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定する
ことにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結
合性を変化させる化合物をスクリーニングすることがで
きる。具体的には、本発明のペプチドを、本発明の蛋白
質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよ
び試験化合物を、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた
場合における、細胞増殖を測定し、比較することによ
り、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変
化させる化合物をスクリーニングする。本発明の蛋白質
発現細胞の増殖は、例えば、ＭＡＰキナーゼ活性、チミ
ジン取り込み活性、細胞数などを測定すればよい。具体
例としては、ＭＡＰキナーゼ活性については、本発明の
ペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を、
本発明の蛋白質発現細胞に添加した後、細胞溶解液から
抗ＭＡＰキナーゼ抗体を用いた免疫沈降によりＭＡＰキ
ナーゼ分画を得た後、公知の方法、例えば和光純薬製MA
P Kinase Assay Kitおよびγ−［^{３ ２}Ｐ］−ＡＴＰを使
用してＭＡＰキナーゼ活性を測定し、比較する。チミジ
ン取り込み活性については、本発明の蛋白質発現細胞を
２４穴プレートに播種し、培養し、本発明のペプチドま
たは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した後、
放射活性により標識したチミジン（例、[methyl-³H]-チ
ミジンなど）を加え、その後、細胞を溶解し、細胞内に
取り込まれたチミジンの放射活性を、液体シンチレーシ
ョンカウンターで計数することにより、チミジン取り込
み活性を測定し、比較する。細胞数の測定については、
本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに播種し、培
養し、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび
試験化合物を添加した後、ＭＴＴ（3-(4,5-dimethyl-2-
thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）を
添加する。細胞内に取り込まれてＭＴＴが変化したＭＴ
Ｔホルマザンを、塩酸にて酸性としたイソプロパノール
水溶液で細胞を溶解した後、５７０ｎｍの吸収によって
測定し、比較する。本方法において、本発明の蛋白質発
現細胞の増殖を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力の
ある候補物質として選択することができる。一方、試験
化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、本発
明のペプチドと同様な細胞増殖活性を測定することによ
りアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

【０１０８】チミジン取り込み活性を利用するスクリー
ニング法の一具体例を以下に述べる。本発明の蛋白質発
現細胞を２４穴プレートに５０００個／ウェル播き、１
日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間培養
し、細胞を飢餓状態にする。本発明のペプチドまたは本
発明のペプチドおよび試験化合物を、細胞に添加して２
４時間培養した後、[methyl-³H]-チミジンをウェル当た
り０．０１５ＭＢｑ添加し、６時間培養する。細胞をＰ
ＢＳで洗った後、メタノールを添加して１０分間放置す
る。次に５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置
後、固定された細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸
化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性
を液体シンチレーションカウンターで測定する。本発明
のペプチドを添加した場合の放射活性の増加を抑制する
試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択
することができる。

【０１０９】

〔９〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明
のペプチドの刺激により、カリウムチャネルが活性化
し、細胞内にあるＫイオンが、細胞外に流出する。この
反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発
現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明
のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化
合物をスクリーニングすることができる。Ｋイオンと同
族元素であるＲｂイオン（ルビジウムイオン）は、Ｋイ
オンと区別無く、カリウムチャネルを通って細胞外に流
出する。よって、本発明の蛋白質発現細胞に、放射活性
同位体であるＲｂ（［^８６Ｒｂ］）を取り込ませておい
た後、本発明のペプチドの刺激によって流出する^８６Ｒ
ｂの流れ（流出活性）を測定することにより、本発明の
ペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を
測定する。具体的には、^８６Ｒｂの存在下、本発明のペ
プチドを、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合
と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、本発明の蛋
白質発現細胞に接触させた場合における、^８６Ｒｂの流
出活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチ
ドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をス
クリーニングする。本方法において、本発明のペプチド
刺激による^８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化
合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択するこ
とができる。一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発
現細胞に接触させ、本発明のペプチドと同様な^８６Ｒｂ
の流出活性の上昇を測定することによりアゴニストのス
クリーニングを行なうこともできる。

【０１１０】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに播き、
２日間培養する。その後、１ｍＣｉ／ｍｌの^８６ＲｂＣ
lを含む培地中で２時間保温する。細胞を培地でよく洗
浄し、外液中の^８６ＲｂＣｌを完全に除く。本発明のペ
プチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を細胞
に添加し、３０分後外液を回収し、γカウンターで放射
活性を測定し、比較する。本発明のペプチド刺激による
^８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、拮
抗阻害能力のある候補物質として選択することができ
る。

【０１１１】〔１０〕本発明の蛋白質発現細胞が本発明
のペプチドに反応し、細胞外のｐＨが変化する。この反
応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現
細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明の
ペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合
物をスクリーニングすることができる。具体的には、本
発明のペプチドを、本発明の蛋白質発現細胞に接触させ
た場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、本発
明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、細胞外
のｐＨ変化を測定し、比較することにより、本発明のペ
プチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物
をスクリーニングする。細胞外ｐＨ変化は、例えば、Ｃ
ｙtｏｓｅｎｓｏｒ装置（モレキュラーデバイス社）を
使用して測定する。本方法において、本発明のペプチド
による細胞外ｐＨ変化を抑制する試験化合物を、拮抗阻
害能力のある候補物質として選択することができる。一
方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触さ
せ、本発明のペプチドと同様な細胞外ｐＨ変化を測定す
ることによりアゴニストのスクリーニングを行なうこと
もできる。

【０１１２】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。本発明の蛋白質発現細胞をＣｙtｏｓｅｎｓｏｒ装
置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセ
ットして細胞外ｐＨが安定するまで約２時間、０．１％
ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地（モレキュラーデ
バイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、本発明
のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を
含む培地を細胞上に灌流させる。灌流によって生じた培
地のｐＨ変化を測定し、比較する。本発明のペプチドに
よる細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力の
ある候補物質として選択することができる。

【０１１３】〔１１〕酵母（Saccharomyces cerevisia
e）のhaploidα-mating Type (MATα) の性フェロモン
受容体ＳＴｅ２は、Ｇ蛋白質Ｇｐａ１と共役しており、
性フェロモンα-mating factorに応答してＭＡＰキナー
ゼを活性化し、これに引き続き、Ｆａｒ１（cell-cycle
arrest）および転写活性化因子Ｓｔｅ１２が活性化さ
れる。Ｓｔｅ１２は、種々の蛋白質（例えば、接合に関
与するＦＵＳ１）の発現を誘導する。一方、制御因子Ｓ
ｓｔ２は上記の過程に抑制的に機能する。この系におい
て、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴ
ニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性
化し、その結果生じる増殖などを指標として用いる、受
容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行な
われている（Trends in Biotechnology, 15巻, 487-494
頁, 1997年）。上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用
して、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を
変化させる化合物をスクリーニングすることができる。

【０１１４】具体例を以下に示す。ＭＡＴα酵母のＳｔ
ｅ２およびＧｐａ１をコードする遺伝子を除去し、代わ
りに、本発明の蛋白質遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２
融合蛋白質をコードする遺伝子を導入する。Ｆａｒをコ
ードする遺伝子を除去してcell-cycle arrestが生じな
いようにし、また、Ｓｓｔをコードする遺伝子を除去し
て本発明のペプチドに対する応答の感度を向上させてお
く。さらに、ＦＵＳ１にヒスチジン生合成遺伝子ＨＩＳ
３を結合したＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子を導入する。こ
の遺伝子組換え操作は、例えば、Molecular and Cellul
ar Biology, 15巻, 6188-6195頁, 1995年に記載の方法
において、ソマトスタチン受容体タイプ２（SSTR2）遺
伝子を、本発明の蛋白質に置き換えて実施することがで
きる。このように構築された形質変換酵母は、本発明の
ペプチドに高感度で反応し、その結果、ＭＡＰキナーゼ
の活性化が起き、ヒスチジン生合成酵素が合成されるよ
うになり、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。従っ
て、上記の本発明の蛋白質発現酵母（Ｓｔｅ２遺伝子お
よびＧｐａ１遺伝子が除去され、本発明の蛋白質遺伝子
およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白質コード遺伝子が導
入され、Ｆａｒ遺伝子およびＳｓｔ遺伝子が除去され、
ＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子が導入されたＭＡＴα酵母）
を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、本発明のペプチドま
たは本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させ、該
酵母の生育を測定し、比較することにより、本発明のペ
プチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物
をスクリーニングすることができる。本方法において、
該酵母の生育を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力の
ある候補物質として選択することができる。一方、試験
化合物のみを上記の本発明の蛋白質発現酵母に接触さ
せ、本発明のペプチドと同様な酵母の生育を測定するこ
とによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともで
きる。

【０１１５】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。上記の本発明の蛋白質発現酵母を完全合成培地の液
体培地で終夜培養し、その後、ヒスチジンを除去した溶
解寒天培地に、２ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になる
ように加える。ついで、９ｘ９ｃｍの角形シャーレに播
く。寒天が固化した後、本発明のペプチドまたは本発明
のペプチドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を
寒天表面におき、３０℃で３日間培養する。試験化合物
の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育を、本発明のペプチ
ドのみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較す
る。また、あらかじめ、ヒスチジンを除去した寒天培地
に本発明のペプチドを添加しておき、滅菌濾紙に試験化
合物のみをしみこませて酵母を培養し、シャーレ全面で
の酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察し
てもよい。酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力
のある候補物質として選択することができる。

【０１１６】〔１２〕本発明の蛋白質遺伝子ＲＮＡをア
フリカツメガエル卵母細胞に注入し、本発明のペプチド
によって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、ca
lcium-activated chloride currentが生じる。これは、
膜電位の変化としてとらえることができる（Ｋイオン濃
度勾配に変化がある場合も同様）。本発明のペプチドに
よって生じる本発明の蛋白質導入アフリカツメガエル卵
母細胞における上記反応を利用して、本発明のペプチド
の本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定する
ことにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結
合性を変化させる化合物をスクリーニングすることがで
きる。具体的には、本発明のペプチドを、本発明の蛋白
質遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触
させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、
本発明の蛋白質遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵
母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を
測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発
明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニ
ングする。本方法において、細胞膜電位変化を抑制する
試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択
することができる。一方、試験化合物のみを本発明の蛋
白質遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接
触させ、本発明のペプチドと同様な細胞膜電位変化を測
定することによりアゴニストのスクリーニングを行なう
こともできる。

【０１１７】スクリーニング法の一具体例を以下に述べ
る。氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルか
ら取り出した、卵母細胞塊を、ＭＢＳ液（88mM NaCl, 1
mM KCl, 0.41mM CaCl₂, 0.33mM Ca(NO₃)₂, 0.82mMMgS
O₄, 2.4mM NaHCO₃, 10mM HEPES； pH7.4）に溶かしたコ
ラゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で卵塊がほぐれるまで
１９℃、１〜６時間、１５０ｒｐｍで処理する。外液を
ＭＢＳ液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニピ
ュレーターで本発明の蛋白質遺伝子ｐｏｌｙ Ａ付加ｃ
ＲＮＡ（５０ｎｇ／５０ｎｌ）を卵母細胞にマイクロイ
ンジェクションする。本発明の蛋白質遺伝子ｍＲＮＡ
は、組織や細胞から調製してもよく、プラスミドからin
vitroで転写してもよい。本発明の蛋白質遺伝子ｍＲＮ
ＡをＭＢＳ液中で２０℃で３日培養し、これをRinger液
を流しているvoltage clamp装置のくぼみに置き、電位
固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極
を細胞内に刺入し、（−）極は細胞外に置く。電位が安
定したら、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドお
よび試験化合物を含むRinger液を流して電位変化を記録
する。試験化合物の影響は、本発明の蛋白質遺伝子ＲＮ
Ａ導入アフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化
を、本発明のペプチドのみ含むRinger液を流した場合と
比較することによって測定することができる。細胞膜電
位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質
として選択することができる。上記の系において、電位
の変化量を増大させると、測定しやすくなるため、各種
のＧ蛋白質遺伝子のｐｏｌｙ Ａ付加ＲＮＡを導入して
もよい。また、カルシウム存在下で発光を生じるような
蛋白質（例、aequorinなど）の遺伝子のｐｏｌｙ Ａ付
加ＲＮＡを共インジェクションすることにより、膜電位
変化ではなく発光量を測定することもできる。

【０１１８】さらに、哺乳動物由来の内皮細胞を使用し
たスクリーニング方法について、以下に述べる。哺乳動
物由来の血管内皮細胞、好ましくは大動脈血管内皮細
胞、より好ましくは毛細血管内皮細胞、さらに好ましく
はの内分泌組織（例、副腎、卵巣、精巣など）由来の毛
細血管内皮細胞を用いて以下の方法などにより血管新生
阻害作用を有する化合物をスクリーニングすることがで
きる。 １）試験化合物の存在下および非存在下、培養用プレー
トに培養した内皮細胞または内皮細胞由来の膜画分に、
本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の放射性ヨード標識
体を接触させ、放射性ヨード標識体の内皮細胞または膜
画分への結合を測定し、比較することにより、放射性ヨ
ード標識体の内皮細胞または膜画分への結合を阻害する
化合物をスクリーニングする。 ２）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のペプ
チドまたはＭＩＴ類で内皮細胞刺激し、細胞内カルシウ
ムイオン濃度の上昇反応を測定し、比較することによ
り、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類に依存した細胞
内カルシウムイオン濃度上昇を抑制する化合物をスクリ
ーニングする。 ３）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のペプ
チドまたはＭＩＴ類で内皮細胞を刺激し、ＭＡＰキナー
ゼ量、チミジン取り込み反応量または細胞増殖速度を測
定し、比較することにより、本発明のペプチドあるいは
ＭＩＴに依存したＭＡＰキナーゼ量、チミジン取り込み
反応量または細胞増殖速度上昇を抑制する化合物ををス
クリーニングする。 血管新生阻害剤をスクリーニングするには、直接上記
３）の方法を実施してもよく、上記１）、２)、３）の
順に従い、または上記２)、３）の順に従い実施しても
よい。上記１）、２)、３）の順、または上記２)、３）
の順で実施すると、効率的にスクリーニングを行うこと
ができる。

【０１１９】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明の蛋白質、本発明の蛋白質を含有する細胞、本発明の
蛋白質を含有する細胞の膜画分、または哺乳動物（例、
ヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウスなど）由来の
内皮細胞および本発明のペプチドを含有するものであ
る。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次
のものがあげられる。 １．スクリーニング用試薬 （i）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 （ii）本発明の蛋白質の標品 本発明の蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞、または哺乳動
物（例、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウスな
ど）由来の内皮細胞を、１２穴プレートに５×１０^５個
／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％ａｉｒで２
日間培養したもの。 （iii）標識リガンド 〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３５Ｓ〕など
で標識した本発明のペプチド。適当な溶媒または緩衝液
に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用
時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。 （iv）リガンド標準液 本発明のペプチドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグ
マ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−
２０℃で保存する。 ２．測定法 （i）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の
蛋白質を発現させた細胞または哺乳動物（例、ヒト、サ
ル、ウシ、ブタ、ラット、マウスなど）由来の内皮細胞
を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌ
の測定用緩衝液を各穴に加える。 （ii）１０^−３〜１０^−１０Ｍの試験化合物溶液を５μ
ｌ加えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、
室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るため
には試験化合物のかわりに１０^−３Ｍの本発明のペプチ
ドを５μｌ加えておく。 （iii）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回
洗浄する。細胞に結合した標識した本発明のペプチドを
０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液
体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。 （iv）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社
製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Bind
ing（ＰＭＢ）を次の式で求める。 ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ_０−ＮＳＢ）］×１０
０ ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ_０ ：最大結合量

【０１２０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合を変化
させる（結合を阻害または促進する）化合物であり、具
体的には本発明の蛋白質を介して細胞刺激活性を有する
化合物またはその塩（いわゆる本発明の蛋白質のアゴニ
スト）、または該刺激活性を有しない化合物（いわゆる
本発明の蛋白質のアンタゴニスト）などである。該化合
物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物
は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっ
てもよい。上記の化合物が、本発明の蛋白質のアゴニス
トであるか、アンタゴニストであるかの具体的な評価方
法は、例えば以下の（Ａ）または（Ｂ）に従えばよい。 （Ａ）前記のスクリーニング方法で示されるバインディ
ング・アッセイを行い、本発明のペプチドと本発明の蛋
白質との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）
化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の蛋白質を
介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細
胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の蛋白
質のアゴニストであり、該活性を有しない化合物または
その塩は本発明の蛋白質のアンタゴニストである。 （Ｂ）(a)試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞
に接触させ、上記本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性
を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩
は本発明の蛋白質のアゴニストである。 (b) 本発明の蛋白質を活性化する化合物を本発明の蛋白
質を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の蛋白質
を活性化する化合物および試験化合物を本発明の蛋白質
を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の蛋
白質を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明
の蛋白質を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少
させ得る化合物またはその塩は本発明の蛋白質のアンタ
ゴニストである。 該本発明の蛋白質のアゴニストは、本発明の蛋白質に対
する本発明のペプチドが有する生理活性と同様の作用を
有しているので、本発明のペプチドと同様に安全で低毒
性な医薬として有用である。本発明の蛋白質アンタゴニ
ストは、 本発明の蛋白質に対する本発明のペプチドが
有する生理活性を抑制することができるので、該受容体
活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明の蛋白質アンタゴニストとして、例えば、本発明
のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合
性を変化させる化合物、好ましくは、（i）本発明のペ
プチドの活性を阻害する化合物またはその塩、（ii）本
発明の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、
（iii）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の
蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩、（iv）
本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質
の活性化作用を阻害する化合物またはその塩などが挙げ
られる。

【０１２１】本発明のペプチドは血管内皮細胞の増殖な
どを制御する活性などを有するため、例えば、本発明の
蛋白質のアゴニストは、例えば、血管造成剤などの医薬
として用いることができる。また、本発明の蛋白質のア
ンタゴニストは、血管新生阻害剤として、例えば血管新
生を伴う疾患〔例、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝
臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱
癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫な
ど）、卵巣疾患（例、多嚢胞性卵巣症候群（卵巣多嚢胞
症）、卵巣過剰刺激症など）、炎症性疾患（例、関節リ
ューマチなど）、糖尿病性網膜症など〕などの予防・治
療剤などの医薬として用いることができる。上記の化合
物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが
用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との
塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性ア
ミノ酸との塩などがあげられる。無機塩基との塩の好適
な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などの
アルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの
アルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモ
ニウム塩などがあげられる。有機塩基との塩の好適な例
としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミ
ン、ピリジン、ピコリン、2,6−ルチジン、エタノール
アミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、
シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，
Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩などがあ
げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩
酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられ
る。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢
酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレ
イン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホ
ン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげ
られる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例
えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげ
られ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアス
パラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。

【０１２２】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実
施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶
性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしく
はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、ま
たは懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき
る。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認めら
れる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定
剤、結合剤などとともに一般に認められた単位用量形態
で混和することによって製造することができる。これら
製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量
が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤な
どに混和することができる添加剤としては、例えばゼラ
チン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム
のような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コ
ーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化
剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ
糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミン
ト、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用
いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前
記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有す
ることができる。注射のための無菌組成物は注射用水の
ようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのよ
うな天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの
通常の製剤実施にしたがって処方することができる。注
射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖
やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビト
ール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが
あげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（た
とえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピ
レングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン
性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣ
Ｏ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ
油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸
ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウ
ム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通
常、適当なアンプルに充填される。

【０１２３】このようにして得られる製剤は安全で低毒
性であるので、例えば哺乳動物（例えば、ヒト、マウ
ス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投
与することができる。本発明のスクリーニング方法また
はスクリーニング用キットを用いて得られる化合物また
はその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経
口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）に
おいては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0
〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的
に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば
注射剤の形では成人の癌患者（体重60kgとして）への投
与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約
0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射によ
り投与する。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した
量を投与することができる。本発明のスクリーニング方
法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合
物またはその塩は、他の薬剤、例えば化学療法剤〔例、
イホスファミド（Ifosfamide）、ＵＴＦ、アドリアマイ
シン（Adriamycin）、ペプロマイシン（Peplomycin）、
シスプラチン（Cisplatin）、シクロフォスファミド（C
yclophosphamide）、５−ＦＵ、ＵＦＴ、メトレキセー
ト（Methotrexate）、マイトマイシンＣ（Mitomycin
C）、マイトキサントロン（Mitoxantrone）など〕など
と併用してもよい。

【０１２４】（６）本発明のペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、または本発明の蛋白質をコードするポリ
ヌクレオチドを用いる血管新生阻害剤のスクリーニング
方法 具体的には、例えば、（a）本発明のペプチドまたは本
発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞を培養した場
合と（iv）本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を産
生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養し
た場合との比較を行い、血管新生阻害剤をスクリーニン
グする。上記スクリーニング方法においては、例えば、
（a）と（b）の場合における、本発明のペプチドまたは
本発明の蛋白質の遺伝子の発現量（具体的には、蛋白質
量または該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量）を測定し
て、比較する。試験化合物としては、例えば、ペプチ
ド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生
産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが
挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。本スクリーニング方
法を実施するには、本発明のペプチドまたは本発明の蛋
白質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適
したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、
pH約4〜10（望ましくは、pH約6〜8）のリン酸バッファ
ー、ほう酸バッファーなどが用いられる。本発明のペプ
チドまたは本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞
としては、例えば、前述した本発明のペプチドまたは本
発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターで
形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主
としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好まし
く用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の
方法で培養することによって、本発明のペプチドまたは
本発明の蛋白質を発現させた形質転換体が好ましく用い
られる。本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の蛋白
量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のペプチドま
たは本発明の蛋白質を認識する抗体を用いて、細胞抽出
液中などに存在する前記蛋白質を、ウェスタン解析、EL
ISA法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定す
ることができる。本発明のペプチドまたは本発明の蛋白
質の遺伝子発現量は、自体公知の方法、例えば、ノーザ
ンブロッティングやReverse transcription-polymerase
chain reaction（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣ
Ｒ解析システム（ABI社製、TaqManpolymerase chain re
action）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたが
って測定することができる。例えば、上記（b）の場合
における蛋白質の遺伝子発現量を、上記（a）の場合に
比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好
ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、血管新生
阻害剤として選択することができる。

【０１２５】（７）本発明のペプチド、ＭＩＴ１類また
は本発明の蛋白質に対する抗体を用いる血管新生阻害剤
のスクリーニング方法 具体的には、例えば、（a）本発明のペプチド、ＭＩＴ
１類または本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞
を培養した場合と（b）本発明のペプチド、ＭＩＴ１類
または本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞と試
験化合物の混合物を培養した場合との比較を、本発明の
ペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質に対する抗
体を用いて行い、血管新生阻害剤をスクリーニングす
る。上記スクリーニング方法においては、例えば、
（a）と（b）の場合における、本発明のペプチド、ＭＩ
Ｔ１類または本発明の蛋白質の発現量（具体的には、蛋
白質量）を上記抗体を用いて測定して、比較する。試験
化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチ
ド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植
物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合
物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であ
ってもよい。本スクリーニング方法を実施するには、本
発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質を産
生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッ
ファーに浮遊して調製する。バッファーには、pH約4〜1
0（望ましくは、pH約6〜8）のリン酸バッファー、ほう
酸バッファーなどが用いられる。本発明のペプチド、Ｍ
ＩＴ１類または本発明の蛋白質を産生する能力を有する
細胞としては、例えば、前述した本発明のペプチド、Ｍ
ＩＴ１類または本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含
有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が
用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの
動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングに
は、例えば、前述の方法で培養することによって、本発
明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質を発現
させた形質転換体が好ましく用いられる。例えば、上記
（b）の場合における蛋白質の発現量を、上記（a）の場
合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、よ
り好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、血管
新生阻害剤として選択することができる。

【０１２６】（８）内皮細胞増殖阻害作用を有する化合
物またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤。 内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩とし
ては、内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその
塩であれば、いずれのものでもよい。該化合物またはそ
の塩は、血管新生阻害剤として用いられ、例えば、血管
新生を伴う疾患〔例、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、
肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱
癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫な
ど）、卵巣疾患（例、多嚢胞性卵巣症候群（卵巣多嚢胞
症）、卵巣過剰刺激症など）、炎症性疾患（例、関節リ
ューマチなど）、糖尿病性網膜症など〕等の予防・治療
剤などの医薬として安全に用いられる。このような医薬
として使用する場合、前述の本発明のスクリーニング方
法またはスクリーニング用キットを用いることにより得
られる化合物を医薬として実施する場合と同様にして実
施することができる。

【０１２７】（９）本発明の蛋白質または本発明のペプ
チドの定量 本発明の抗体は、本発明の蛋白質を特異的に認識するこ
とができるので、被検液中の本発明の蛋白質または本発
明のペプチド（以下、（９）項では本発明の蛋白質と略
記する）の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定
量等に使用することができる。すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発
明の蛋白質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標
識化された本発明の蛋白質の割合を測定することを特徴
とする被検液中の本発明の蛋白質の定量法、および（i
i）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標
識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に
反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定す
ることを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質の定量法
を提供する。

【０１２８】また、本発明の蛋白質に対するモノクロー
ナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する
場合がある）を用いて本発明の蛋白質の定量を行なえる
ほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。こ
れらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、ま
た、抗体分子のF(ab')₂ 、Fab'またはFab画分を用いて
もよい。本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質の定量法
は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗
原量（例えば、本発明のペプチド量）に対応した抗体、
抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理
的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液
を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれ
ば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメ
トリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッ
チ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述
するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物
質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例え
ば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ラン
タニド元素等が用いられる。放射性同位元素としては、
例えば、〔¹²⁵I〕、〔¹³¹I〕、〔³H〕、〔¹⁴C〕、
〔³²P〕、〔³³P〕、〔³⁵S〕等が用いられる。上記酵素
としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例え
ば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱
水素酵素等が用いられる。蛍光物質としては、例えば、
シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7
（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレ
スカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等が用い
られる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミ
ノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等が用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。

【０１２９】抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、
物理吸着を用いてもよく、また通常ペプチドあるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキス
トラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、
ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいは
ガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては不溶
化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ
（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクロ
ーナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体
上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発
明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２
次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なっても
よいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および
不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。ま
た、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用
抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１
種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的
で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明の
サンドイッチ法による本発明のペプチドの測定法におい
ては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノク
ローナル抗体は、本発明のペプチドの結合する部位が相
異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応
および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応
で用いられる抗体が、本発明のペプチドのＣ端部を認識
する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ
端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。

【０１３０】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリー等に用いることができ
る。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に
対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体等を用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量
を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈
降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用する
レーザーネフロメトリー等が好適に用いられる。

【０１３１】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明の蛋白質の測定系を構築すればよい。これらの一般的
な技術手段の詳細については、総説、成書等を参照する
ことができる。例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッ
セイ」（講談社、昭和49年発行）、入江 寛編「続ラジ
オイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄
治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医
学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定
法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods
in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques
(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques
(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques
(Part C))、 同書 Vol.84(Immunochemical Techniques
(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol.92(Immu
nochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies
and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121
(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Techno
logy and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミッ
クプレス社発行)等を参照することができる。以上のよ
うにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明
の蛋白質を感度良く定量することができる。さらには、
本発明の抗体を用いて本発明の蛋白質の濃度を定量する
ことによって、本蛋白質は卵巣や精巣などの毛細血管内
皮細胞に発現量が高いため、本発明の蛋白質の濃度の増
多が検出された場合、これらの臓器での毛細血管内皮細
胞の増殖を伴う疾患、例えば、癌（例、膵臓癌、肺癌、
腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃
癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、カポ
ジ肉腫など）、卵巣疾患（例、多嚢胞性卵巣症候群（卵
巣多嚢胞症）、卵巣過剰刺激症など）、炎症性疾患
（例、関節リューマチなど）、糖尿病性網膜症などに罹
患している、または将来罹患する可能性が高いと診断す
ることができる。また、本発明の抗体は、体液や組織等
の被検体中に存在する本発明の蛋白質を検出するために
使用することができる。また、本発明の蛋白質を精製す
るために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中
の本発明の蛋白質の検出、被検細胞内における本発明の
蛋白質の挙動の分析等のために使用することができる。

【０１３２】（１０）遺伝子診断薬 本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル等）における本発明の蛋白質ま
たは本発明のペプチド（以下、（１０）項では本発明の
蛋白質と略記する）をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例
えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるい
は発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは
発現過多等の遺伝子診断薬として有用である。本発明の
ＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知
のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ
法（Genomics，第5巻，874〜879頁,1989年）、Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences of the Uni
ted States of America），第86巻，2766〜2770頁,1989
年）、ＤＮＡマイクロアレイ等により実施することがで
きる。本発明の蛋白質は卵巣や精巣などの毛細血管内皮
細胞に発現量が高いため、例えば、ノーザンハイブリダ
イゼーションやＤＮＡマイクロアレイにより発現増大が
検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法やＤＮＡマイクロ
アレイによりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例
えば、毛細血管内皮細胞の増殖を伴う疾患、例えば、癌
（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、
卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、
結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫など）、卵巣疾患（例、多
嚢胞性卵巣症候群（卵巣多嚢胞症）、卵巣過剰刺激症な
ど）、炎症性疾患（例、関節リューマチなど）、糖尿病
性網膜症などに罹患している可能性が高いと診断するこ
とができる。

【０１３３】（１１）アンチセンスＤＮＡを含有する医
薬 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内にお
ける本発明の蛋白質もしくは本発明のペプチド（以下、
（１１）項では本発明の蛋白質と略記する）または本発
明のＤＮＡの機能を抑制することができるので、例え
ば、本発明の蛋白質の発現過多に起因する疾患、例えば
癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺
癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部
癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫など）、卵巣疾患
（例、多嚢胞性卵巣症候群（卵巣多嚢胞症）、卵巣過剰
刺激症など）、炎症性疾患（例、関節リューマチな
ど）、糖尿病性網膜症などの予防・治療剤として使用す
ることができる。上記アンチセンスＤＮＡを上記の予防
・治療剤として、前記した本発明のＤＮＡを含有する各
種疾病の予防・治療剤と同様に使用することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウ
イルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイ
ルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベク
ターに挿入した後、常套手段に従って投与することがで
きる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは
摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められる担体
とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテル
のようなカテーテルによって投与できる。さらに、該ア
ンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮ
Ａの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌ
クレオチドプローブとして使用することもできる。

【０１３４】さらに、本発明は、（i）本発明の蛋白質
をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、
（ii）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、（iii）
本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部を含有するリ
ボザイム、（iv）前記リボザイムを含有してなる医薬も
提供する。上記アンチセンスヌクレオチドと同様に、二
重鎖ＲＮＡ（RNAi；RNA interference法）、リボザイム
なども、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド
（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができ、生体内に
おける本発明の蛋白質またはＤＮＡの機能、およびそれ
に依存した本発明のペプチドの機能を抑制することがで
きるので、例えば、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝
臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱
癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫な
ど）、卵巣疾患（例、多嚢胞性卵巣症候群（卵巣多嚢胞
症）、卵巣過剰刺激症など）、炎症性疾患（例、関節リ
ューマチなど）、糖尿病性網膜症などの予防・治療剤な
どとして使用することができる。二重鎖ＲＮＡは、公知
の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じ
て、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製
造することができる。リボザイムは、公知の方法（例、
TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）
に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計
して製造することができる。例えば、本発明の蛋白質を
コードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結する
ことによって製造することができる。本発明の蛋白質を
コードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムに
よって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接
した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。上記の二重鎖Ｒ
ＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用す
る場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製
剤化し、投与することができる。

【０１３５】（１２）本発明の抗体を含有する医薬およ
び診断薬 本発明の蛋白質または本発明のペプチド（以下、（１
２）項では本発明の蛋白質と略記する）の活性を中和す
る作用を有する本発明の抗体は、例えば、本発明の蛋白
質の発現過多に起因する疾患、例えば、癌（例、膵臓
癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前
立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直
腸癌、カポジ肉腫など）、卵巣疾患（例、多嚢胞性卵巣
症候群（卵巣多嚢胞症）、卵巣過剰刺激症など）、炎症
性疾患（例、関節リューマチなど）、糖尿病性網膜症な
どの予防・治療剤等の医薬として、あるいは本発明の蛋
白質を発現する内皮細胞の増殖を伴う疾患、例えば、多
嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群などの診断薬と
して使用することができる。本発明の抗体を含有する上
記疾患の予防・治療剤は、そのまま液剤として、または
適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物
（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サル等）に対して経口的または非経口的に投与する
ことができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、
投与ルート等によっても異なるが、例えば、癌治療の目
的で本発明の抗体を１回量として、通常0.01〜20mg/kg
体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好
ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ま
しくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好
都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこ
れに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い
場合には、その症状に応じて増量してもよい。本発明の
抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与す
ることができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、
上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈
剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物
は、経口または非経口投与に適する剤形として提供され
る。すなわち、例えば、経口投与のための組成物として
は、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、
フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散
剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ
剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体
公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用
いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するもので
ある。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、
でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いら
れる。

【０１３６】非経口投与のための組成物としては、例え
ば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、
皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の
剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従
って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用
いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または
乳化することによって調製する。注射用の水性液として
は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を
含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、
アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非
イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−
５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenat
ed castor oil）〕等と併用してもよい。油性液として
は、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤
として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用
してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプ
ルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗
体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによ
って調製される。上記の経口用または非経口用医薬組成
物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤
形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の
剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アン
プル）、坐剤等が例示され、それぞれの投薬単位剤形当
たり通常5〜500mg程度、とりわけ注射剤では5〜100mg程
度、その他の剤形では10〜250mg程度の上記抗体が含有
されていることが好ましい。なお前記した各組成物は、
上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じな
い限り他の活性成分を含有してもよい。例えば、前記し
た各血管新生阻害剤は、例えば化学療法剤（例、イホス
ファミド（Ifosfamide）、アドリアマイシン（Adriamyc
in）、ペプロマイシン（Peplomycin）、シスプラチン
（Cisplatin）、シクロフォスファミド（Cyclophospham
ide）、５−ＦＵ、ＵＦＴ、メトレキセート（Methotrex
ate）、マイトマイシンＣ（Mitomycin C）、マイトキサ
ントロン（Mitoxantrone）など）などと併用してもよ
い。

【０１３７】（１３）本発明のＤＮＡを有する非ヒト動
物の作製 本発明のＤＮＡを用いて、本発明の蛋白質または本発明
のペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物を
作製することができる。非ヒト動物としては、哺乳動物
（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ネコ、イヌ、サルなど）など（以下、動物と略記す
る）が挙げられるが、特に、マウス、ウサギなどが好適
である。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあた
っては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモータ
ーの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いる
のが一般に有利である。例えば、ウサギ由来の本発明の
ＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い動物由来
の本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモ
ーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、例え
ば、ウサギ受精卵へマイクロインジェクションすること
によって本発明の蛋白質または本発明のペプチドを高産
生するＤＮＡ転移動物を作出できる。このプロモーター
としては、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロ
チオネイン等のユビキアスな発現プロモーターも使用し
うるが、好ましくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子
プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用
いられる。

【０１３８】受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの
転移は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽
細胞において本発明の蛋白質等が存在することは、作出
動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発
明の蛋白質または本発明のペプチドを有することを意味
する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚
芽細胞および体細胞の全てに本発明の蛋白質または本発
明のペプチドを有する。本発明のＤＮＡ転移動物は、交
配により遺伝子を安定に保持することを確認して、該Ｄ
ＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うこ
とができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物
を交配することにより、導入遺伝子を相同染色体の両方
に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を
交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するよ
うに繁殖継代することができる。本発明のＤＮＡが転移
された動物は、本発明の蛋白質または本発明のペプチド
が高発現させられているので、本発明の蛋白質に対する
アゴニストまたはアンタゴニスト、本発明のペプチドの
活性を阻害する化合物のスクリーニング用の動物などと
して有用である。本発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養
のための細胞源として使用することもできる。例えば、
本発明のＤＮＡ転移マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現され
た本発明の蛋白質または本発明のペプチドが存在する組
織を分析することにより、本発明の蛋白質について分析
することができる。本発明の蛋白質または本発明のペプ
チドを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養
し、これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来のよ
うな一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究する
ことができる。また、その細胞を用いることにより、例
えば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能
である。また、高発現細胞株があれば、そこから、本発
明の蛋白質または本発明のペプチドを単離精製すること
も可能である。

【０１３９】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｙ ：チミンまたはシトシン Ｎ ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン Ｒ ：アデニンまたはグアニン Ｍ ：シトシンまたはアデニン Ｗ ：チミンまたはアデニン Ｓ ：シトシンまたはグアニン Ｂ ：グアニン、チミンまたはシトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅtまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｘａａ ：未同定アミノ酸残基

【０１４０】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬等を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅt ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 Ａｃ ：アセチル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロルベンジルオキシカルボニル Ｃｌ_２Ｂｚｌ ：2-6−ジクロロベンジル Ｂｏｃ ：t−ブチルオキシカルボニル ＨＯＢt ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＰＡＭ ：フェニルアセトアミドメチル Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｂｕｍ ：ターシャリーブトキシメチル Ｔｒt ：トリチル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン ＨＯＮＢ ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボ キシイミド ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＣＨＡＰＳ ：３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]− １−プロパンスルホナート ＰＭＳＦ ：フェニルメチルスルホニルフルオリド ＧＤＰ ：グアノシン−５'−二リン酸 Ｆｕｒａ−２ＡＭ ：１−［６−アミノ−２−（５−カルボキシ−２−オキサ ゾリル）−５−ベンゾフラニロキシ］−２−（２−アミ ノ−５メチルフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ' −四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル Ｆｌｕｏ−３ＡＭ ：１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒド ロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］ −２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン− Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸ペンタアセトキシメチルエス テル ＨＥＰＥＳ ：２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニ ル]エタンスルホン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン ＨＢＳＳ ：ハンクス平衡塩液 ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ ＣＨＡＰＳ ：3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamino]-1- propanesulfate

【０１４１】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 〔配列番号：１〕ヒト脳由来蛋白質ＺＡＱのアミノ酸配
列を示す。 〔配列番号：２〕ヒト脳由来蛋白質ＺＡＱをコードする
ＤＮＡの塩基配列を示す（ＺＡＱＣ）。 〔配列番号：３〕ヒト脳由来蛋白質ＺＡＱをコードする
ＤＮＡの塩基配列を示す（ＺＡＱＴ）。 〔配列番号：４〕後述の参考例３で用いられたプライマ
ー１の塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕後述の参考例３で用いられたプライマ
ー２の塩基配列を示す。 〔配列番号：６〕ヒト型Ｉ５Ｅレセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：７〕後述の参考例３で用いられたプライマ
ーｈＢｖ８−Ｆ１の塩基配列を示す。 〔配列番号：８〕後述の参考例３で用いられたプライマ
ーｈＢｖ８−Ｒ１の塩基配列を示す。 〔配列番号：９〕後述の参考例３で得られたＤＮＡ断片
の塩基配列を示す。 〔配列番号：１０〕後述の参考例３で用いられたプライ
マーｈＢｖ８−Ｒ２の塩基配列を示す。 〔配列番号：１１〕後述の参考例３で得られたヒト型Ｂ
ｖ８ペプチドをコードするＤＮＡの５’端塩基配列を示
す。 〔配列番号：１２〕後述の参考例３で用いられたプライ
マーｈＢｖ８−ＷＦの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３〕後述の参考例３で用いられたプライ
マーｈＢｖ８−ＷＲの塩基配列を示す。 〔配列番号：１４〕後述の参考例３で用いられたプライ
マーｈＢｖ８−ＣＦの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５〕後述の参考例３で用いられたプライ
マーｈＢｖ８−ＳＲの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６〕後述の参考例３で得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 〔配列番号：１７〕ヒト型Ｂｖ８前駆体ペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：１８〕ヒト型Ｂｖ８前駆体ペプチドをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１９〕ヒト型Ｂｖ８成熟体ペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：２０〕ヒト型Ｂｖ８成熟体ペプチドをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：２１〕ヘビ毒ＭＩＴ１のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：２２〕ヒト型Ｂｖ８成熟体ペプチドのＣ末
端のＬｙｓ欠損体のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２３〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＢＦ２の塩基配列を示す。 〔配列番号：２４〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＢＲ１の塩基配列を示す。 〔配列番号：２５〕後述の参考例５で得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 〔配列番号：２６〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＲＢ５−１の塩基配列を示す。 〔配列番号：２７〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＲＢ５−３の塩基配列を示す。 〔配列番号：２８〕後述の参考例５で得られたラット型
Ｂｖ８をコードするＤＮＡの５’端塩基配列を示す。 〔配列番号：２９〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＲＢ３−１の塩基配列を示す。 〔配列番号：３０〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＲＢ３−２の塩基配列を示す。 〔配列番号：３１〕後述の参考例５で得られたラット型
Ｂｖ８をコードするＤＮＡの３’端塩基配列を示す。 〔配列番号：３２〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＲＢｖ８−ＷＦ１の塩基配列を示す。 〔配列番号：３３〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＲＢｖ８−ＷＦ２の塩基配列を示す。 〔配列番号：３４〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＲＢｖ８−ＷＲ１の塩基配列を示す。 〔配列番号：３５〕後述の参考例５で用いられたプライ
マーＲＢｖ８−ＷＲ２の塩基配列を示す。 〔配列番号：３６〕後述の参考例５で得られたＤＮＡ断
片の塩基配列を示す。 〔配列番号：３７〕ラット型Ｂｖ８前駆体ペプチドのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３８〕ラット型Ｂｖ８前駆体ペプチドをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：３９〕ラット型Ｂｖ８成熟体ペプチドおよ
びマウス型Ｂｖ８成熟体ペプチドのアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：４０〕ラット型Ｂｖ８成熟体ペプチドをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：４１〕後述の参考例６で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４２〕後述の参考例６で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４３〕新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質（ｒＺＡＱ１）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：４４〕新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質（ｒＺＡＱ１）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４５〕後述の参考例７で用いられたプロー
ブの塩基配列を示す。 〔配列番号：４６〕後述の参考例７で用いられたプロー
ブの塩基配列を示す。 〔配列番号：４７〕後述の参考例７で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４８〕後述の参考例７で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４９〕後述の参考例７で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５０〕新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質（ｒＺＡＱ２）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示
す。

【０１４２】〔配列番号：５１〕新規Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質（ｒＺＡＱ２）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：５２〕ヒト型Ｉ５Ｅレセプター蛋白質のア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：５３〕マウス由来Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質（ＧＰＲ７３）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：５４〕マウス由来Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質（ｍＩ５Ｅ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：５５〕マウス型Ｂｖ８前駆体ペプチドのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：５６〕マウス型Ｂｖ８前駆体ペプチドをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５７〕マウス型Ｂｖ８成熟体ペプチドをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５８〕後述の参考例１で用いられたプライ
マー３の塩基配列を示す。 〔配列番号：５９〕後述の参考例１で用いられたプライ
マー４の塩基配列を示す。 〔配列番号：６０〕後述の参考例１で用いられたＺＡＱ
ｐｒｏｂｅの塩基配列を示す。 〔配列番号：６１〕後述の参考例１で用いられたプライ
マーＺＡＱＣ Ｓａｌの塩基配列を示す。 〔配列番号：６２〕後述の参考例４で用いられたプライ
マーＺＡＱＣ Ｓｐｅの塩基配列を示す。 〔配列番号：６３〕マウス由来Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質（ＧＰＲ７３）をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：６４〕マウス由来Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質（ｍＩ５Ｅ）をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：６５〕参考例８で用いられたＤＮＡ断片＃
１の塩基配列を示す。 〔配列番号：６６〕 参考例８で用いられたＤＮＡ断片＃２の塩基配列を示
す。〔配列番号：６７〕参考例８で用いられたＤＮＡ断
片＃３の塩基配列を示す。 〔配列番号：６８〕参考例８で用いられたＤＮＡ断片＃
４の塩基配列を示す。 〔配列番号：６９〕参考例８で用いられたＤＮＡ断片＃
５の塩基配列を示す。 〔配列番号：７０〕参考例８で用いられたＤＮＡ断片＃
６の塩基配列を示す。 〔配列番号：７１〕配列番号：３０で表わされるヒト型
Ｂｖ８をコードする合成ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：７２〕後述の参考例９（８）で精製された
ＺＡＱ活性化ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：７３〕後述の参考例９（II）で用いられた
プライマーＺＦ１の塩基配列を示す。 〔配列番号：７４〕後述の参考例９（II）で用いられた
プライマーＺＦ２の塩基配列を示す。 〔配列番号：７５〕後述の参考例９（II）で用いられた
プライマーＺＦ３の塩基配列を示す。 〔配列番号：７６〕後述の参考例９（II）で得られたヒ
ト型ＺＡＱリガンドペプチドをコードするＤＮＡの３’
端塩基配列を示す。 〔配列番号：７７〕後述の参考例９（II）で用いられた
プライマーＺＡＱＬ−ＣＦの塩基配列を示す。 〔配列番号：７８〕後述の参考例９（II）で用いられた
プライマーＺＡＱＬ−ＸＲ１の塩基配列を示す。 〔配列番号：７９〕後述の参考例９（II）で得られたＤ
ＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：８０〕後述の参考例９（II）で得られたＤ
ＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：８１〕ヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：８２〕ヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：８３〕ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：８４〕ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：８５〕配列番号：８９で表わされるヒト型
ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：８６〕配列番号：９０で表わされるヒト型
ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：８７〕配列番号：８１で表わされるヒト型
ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドをコードするＤＮＡの塩
基配列を示す。 〔配列番号：８８〕配列番号：８２で表わされるヒト型
ＺＡＱリガンド成熟ペプチドをコードするＤＮＡの塩基
配列を示す。 〔配列番号：８９〕配列番号：８３で表わされるヒト型
ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドをコードするＤＮＡの塩
基配列を示す。 〔配列番号：９０〕配列番号：８４で表わされるヒト型
ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドをコードするＤＮＡの塩
基配列を示す。 〔配列番号：９１〕後述の参考例１０（１）で用いられ
たＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：９２〕後述の参考例１１（２）で分析され
た、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドのＮ末端アミノ酸配
列を示す。 〔配列番号：９３〕後述の参考例１２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：９４〕後述の参考例１２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：９５〕参考例１で用いられたＤＮＡ断片＃
１の塩基配列を示す。 〔配列番号：９６〕参考例１で用いられたＤＮＡ断片＃
２の塩基配列を示す。 〔配列番号：９７〕参考例１で用いられたＤＮＡ断片＃
３の塩基配列を示す。 〔配列番号：９８〕参考例１で用いられたＤＮＡ断片＃
４の塩基配列を示す。 〔配列番号：９９〕参考例１で用いられたＤＮＡ断片＃
５の塩基配列を示す。 〔配列番号：１００〕参考例１で用いられたＤＮＡ断片
＃６の塩基配列を示す。

【０１４３】〔配列番号：１０１〕配列番号：８２で表
わされるヒト型ＺＡＱリガンドをコードする合成ＤＮＡ
の塩基配列を示す。 〔配列番号：１０２〕後述の参考例１５で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０３〕後述の参考例１５で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０４〕後述の参考例１５で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０５〕後述の参考例１５で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０６〕後述の参考例１５で得られたＤＮ
Ａ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：１０７〕マウス型ＺＡＱリガンド前駆体ぺ
プチドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１０８〕マウス型ＺＡＱリガンド前駆体ペ
プチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０９〕マウス型ＺＡＱリガンド成熟体ぺ
プチドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１１０〕マウス型ＺＡＱリガンド成熟体ペ
プチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１１１〕マウス型ＺＡＱリガンド前駆体ペ
プチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列
を示す。 〔配列番号：１１２〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１１３〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１１４〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１１５〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１１６〕後述の参考例１６で得られたＤＮ
Ａ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：１１７〕後述の参考例１６で得られたＤＮ
Ａ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：１１８〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１１９〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２０〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２１〕後述の参考例１６で得られたラッ
ト型ＺＡＱリガンドペプチドをコードするＤＮＡの５’
端塩基配列を示す。 〔配列番号：１２２〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２３〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２４〕後述の参考例１６で得られたラッ
ト型ＺＡＱリガンドペプチドをコードするＤＮＡの５’
端塩基配列を示す。 〔配列番号：１２５〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２６〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２７〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２８〕後述の参考例１６で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２９〕後述の参考例１６で得られたＤＮ
Ａ断片の塩基配列を示す（ノーマルタイプ）。 〔配列番号：１３０〕後述の参考例１６で得られたＤＮ
Ａ断片の塩基配列を示す（Ｙタイプ）。 〔配列番号：１３１〕後述の参考例１６で得られたＤＮ
Ａ断片の塩基配列を示す（Ｑタイプ）。 〔配列番号：１３２〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺ
プチド（ノーマルタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３３〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺ
プチド（ノーマルタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。 〔配列番号：１３４〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺ
プチド（Ｙタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３５〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺ
プチド（Ｙタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１３６〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺ
プチド（Ｑタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３７〕ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺ
プチド（Ｑタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１３８〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺ
プチド（ノーマルタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３９〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺ
プチド（ノーマルタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。 〔配列番号：１４０〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺ
プチド（Ｙタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４１〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺ
プチド（Ｙタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１４２〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺ
プチド（Ｑタイプ）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４３〕ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺ
プチド（Ｑタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１４４〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１４５〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１４６〕後述の実施例１で得られたウシ型
ＺＡＱの部分配列の塩基配列を示す。 〔配列番号：１４７〕後述の実施例１で得られたウシ型
Ｉ５Ｅの部分配列の塩基配列を示す。 〔配列番号：１４８〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１４９〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５０〕後述の実施例１で得られたウシ型
ＺＡＱの５’部分配列（ｔｙｐｅ１）の塩基配列を示
す。

【０１４４】〔配列番号：１５１〕後述の実施例１で得
られたウシ型ＺＡＱの５’部分配列（ｔｙｐｅ２）の塩
基配列を示す。 〔配列番号：１５２〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５３〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５４〕後述の実施例１で得られたウシ型
ＺＡＱの３’部分配列（ｔｙｐｅ２）の塩基配列を示
す。 〔配列番号：１５５〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５６〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５７〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５８〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５９〕後述の実施例１で得られたウシ型
ＺＡＱ全長をコードする２０３８ｂｐのＤＮＡ断片の塩
基配列を示す。 〔配列番号：１６０〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６１〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６２〕後述の実施例１で得られたウシ型
Ｉ５Ｅの５’部分配列の塩基配列を示す。 〔配列番号：１６３〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６４〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６５〕後述の実施例１で得られたウシ型
Ｉ５Ｅの３’部分配列の塩基配列を示す。 〔配列番号：１６６〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６７〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６８〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６９〕後述の実施例１で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７０〕後述の実施例１で得られたウシ型
Ｉ５Ｅ全長をコードする１６２３ｂｐのＤＮＡ断片の塩
基配列を示す。 〔配列番号：１７１〕後述の実施例１で得られたウシ型
ＺＡＱのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１７２〕ウシ型ＺＡＱをコードするＤＮＡ
の塩基配列を示す。 〔配列番号：１７３〕後述の実施例１で得られたウシ型
Ｉ５Ｅのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１７４〕ウシ型Ｉ５ＥをコードするＤＮＡ
の塩基配列を示す。 〔配列番号：１７５〕後述の実施例２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７６〕後述の実施例２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７７〕後述の実施例２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７８〕後述の実施例２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７９〕後述の実施例２で用いられたプロ
ーブの塩基配列を示す。配列中、ＦＡＭは、6-carboxyf
luoresceinを、ＴＡＭＲＡは6-carboxy-tetramethylrho
damineをそれぞれ示す。） 〔配列番号：１８０〕後述の実施例２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８１〕後述の実施例２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８２〕後述の実施例２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８３〕後述の実施例２で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８４〕後述の実施例２で用いられたプロ
ーブの塩基配列を示す。配列中、FAMは、6-carboxyfluo
resceinを、TAMRAは6-carboxy-tetramethylrhodamineを
それぞれ示す。）

【０１４５】後述の実施例１で得られた形質転換体大腸
菌（Escherichia coli)DH5α/pBZAQは、平成14（2002）
年1月9日から、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中
央第6（郵便番号305-8566）独立行政法人産業技術総合
研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-7845
として、2001年12月18日から、日本国大阪府大阪市淀川
区十三本町2丁目17番85号（郵便番号532-8686）財団法
人・発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 16740として寄託
されている。後述の実施例１で得られた形質転換体大腸
菌（Escherichia coli)TOP10/pBI5Eは、平成14（2002）
年1月9日から、独立行政法人産業技術総合研究所 特許
生物寄託センターに受託番号FERM BP-7844として、2001
年12月18日から、財団法人・発酵研究所（IFO）に受託
番号IFO 16739として寄託されている。後述の参考例１
で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichi
a coli)DH5α/pCR2.1-ZAQCは、平成11（1999）年8月23
日から、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄
託センター（旧NIBH）に受託番号FERM BP-6855として、
平成11（1999）年8月4日から、財団法人・発酵研究所
（IFO）に受託番号IFO 16301として寄託されている。後
述の参考例１で得られた形質転換体エシェリヒア コリ
（Escherichia coli) DH5α/pCR2.1-ZAQTは、平成11（1
999）年8月23日から独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター（旧NIBH）に受託番号FERM BP-68
56として、平成11（1999）年8月4日から財団法人・発酵
研究所（IFO）に受託番号IFO 16302として寄託されてい
る。後述の参考例５で得られた形質転換体エシェリヒア
コリ（Escherichia coli) TOP10/pRBvは、平成13（20
01）年1月11日から独立行政法人産業技術総合研究所 特
許生物寄託センター（旧NIBH）に受託番号FERM BP-7427
として、2000年12月22日から財団法人・発酵研究所（IF
O）に受託番号IFO 16522として寄託されている。後述の
参考例６で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Es
cherichia coli）DH5α/pCR2.1-rZAQ1は、平成12（200
0）年8月21日から独立行政法人産業技術総合研究所 特
許生物寄託センター（旧NIBH）に受託番号FERM BP-7275
として、平成12（2000）年8月1日から財団法人・発酵研
究所（IFO）に受託番号IFO 16459として寄託されてい
る。後述の参考例７で得られた形質転換体エシェリヒア
コリ（Escherichia coli）DH10B/pCMV-rZAQ2は、平成
12（2000）年8月21日から独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託センター（旧NIBH）に受託番号FERM
BP-7276として、平成12（2000）年8月1日から財団法人
・発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 16460として寄託さ
れている。後述の参考例８で得られたエシェリヒア コ
リ（Escherichia coli）MM294(DE3)/pTCh2ZAQは、平成1
3（2001）年4月27日から独立行政法人産業技術総合研究
所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-7572とし
て、2001年3月15日から財団法人発酵研究所（IFO）に受
託番号IFO 16587として寄託されている。後述の参考例
９で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）TOP10/pHMITAは、平成12（2000）年7月13日
から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ
ンター（旧NIBH）に寄託番号FERM BP-7219として、平成
12年5月26日から財団法人・発酵研究所（IFO）に寄託番
号IFO 16440として寄託されている。後述の参考例９で
得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）TOP10/pHMITGは、平成12（2000）年7月13日から
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ
ー（旧NIBH）に寄託番号FERM BP-7220として、平成12
（2000)年5月26日から財団法人・発酵研究所（IFO）に
寄託番号IFO 16441として寄託されている。後述の参考
例１４で取得されたエシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）MM294(DE3)/pTCh1ZAQは、平成13（2001）年4月27
日から、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄
託センターに寄託番号FERM BP-7571として、2001年1月1
6日から、財団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 16
527として寄託されている。後述の参考例１５で得られ
た形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)
TOP10/pMMITは、平成13（2001）年1月11日から、独立行
政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧
NIBH）に受託番号FERM BP-7425として、2000年12月22日
から、財団法人・発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 165
20として寄託されている。後述の参考例１６で得られた
形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) TO
P10/pRMITは、平成13（2001）年1月11日から、独立行政
法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧NI
BH）に受託番号FERM BP-7426として、2000年12月22日か
ら、財団法人・発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 16521
として寄託されている。

【０１４６】

【実施例】以下に実施例および参考例を示して、本発明
をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定
するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作
法は、モレキュラー・クローニング（Molecular clonin
g）に記載されている方法に従った。

【０１４７】実施例１ ウシ型ＺＡＱおよびウシ型Ｉ５
ＥレセプターｃＤＮＡのクローニングウシ副腎毛細血管
内皮細胞（BACE） およびウシ大動脈血管内皮細胞（BA
E）より、RNeasy Mini Kit (QIAGEN社) を用いて添付の
マニュアルに記載された方法に従ってBACE 由来total R
NA(BACE tRNA)およびBAE由来total RNA(BAE tRNA)を取
得した。これを鋳型として、SUPERSCRIPT First-Strand
Synthesis System for RT-PCR Kit (GIBCO BRL社) を
用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってBACE
由来cDNA(BACE cDNA)およびBAE 由来cDNA(BAE cDNA)を
取得した。続いてBACE cDNAを鋳型としてヒトZAQ、マウ
スZAQ、ラットZAQ、ヒトI5E、マウスI5EおよびGPR73の
情報よりdegenerateプライマー ZAQ-B1F（配列番号：１
４４）、ZAQ-B1R（配列番号：１４５）を作成し、以下
に記したPCR反応を実施した。 ZAQ-B1F: 5'-ATYGTSTGCTGCCCCTTYGAGATG-3' (配列番
号：１４４) ZAQ-B1R: 5'-TAGTAGAGCTGCTGRTCCACBGRCC-3' (配列
番号：１４５) PCR反応液はAmpliTaq Gold (Applied Biosystems社)を
0.5 μl、添付の10x PCR buffer II (100 mM Tris-HCl,
500 mM KCl)を5μl、25 mM MgCl₂を4μl、dNTPmixture
(2.0 mM each, Applied Biosystems社)を5μl、12.5μ
M プライマーZAQ-B1FおよびZAQ-B1Rを 2.5μl、鋳型cDN
Aを1μl、および蒸留水を29.5 μlを混合して作製し
た。反応条件は、95℃・10分の初期変性後、95℃・20秒-6
6℃・30秒のサイクル反応を35回、および66℃・10分の最
終伸長反応とした。得られたDNA断片をTOPO TA Cloning
Kit (Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記載
された方法に従ってクローニングした。クローニングさ
れたDNA配列をABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、
ウシ型ＺＡＱの部分配列（配列番号：１４６）およびウ
シ型Ｉ５Ｅの部分配列（配列番号：１４７）の塩基配列
を得た。ウシ副腎毛細血管内皮細胞（BACE）より、TRIz
ol Reagent (GIBCO BRL社) を用いて添付のマニュアル
に記載された方法に従ってBACE 由来total RNA(BACE tR
NA)を取得した。これを鋳型として、mRNA Purification
Kit (Amersham pharmacia biotech社) を用いて添付の
マニュアルに記載された方法に従ってBACE 由来mRNA(BA
CE mRNA)を取得した。BACE mRNAを鋳型として、Maratho
n cDNA Amplification Kit (CLONTECH社) を用いて添付
のマニュアルに記載された方法に従ってBACE 由来Libra
ry of adaptor-ligated ds cDNA(BACE AL ds cDNA)を作
成した。配列番号：１４６の情報より、プライマー bZA
Q5-2（配列番号：１４８）とbZAQ5-3（配列番号：１４
９）を作成し、BACE AL ds cDNAを鋳型として以下に記
した5'RACE実験を実施した。 bZAQ5-2: 5'-GGCCAGCAGGGCGTTGGTGGAGA-3' (配列番
号：１４８) bZAQ5-3: 5'-GTGCGCAGGTAGTTGACAGAGGCGCACA-3' (配
列番号：１４９) 5'RACEのPCR反応液は50X Advantage-GC 2 Polymerase M
ix (CLONTECH社)を0.5μl、添付の5x Advantage-GC 2 P
CR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc,17.5 mM
Mg(OAc)₂, 25％ Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BS
A, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P40)を5μl、dN
TP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2μl、10μMプラ
イマーbZAQ5-2を 0.5μl、10μMプライマーAP1（プライ
マーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付
のもの）を0.5μl、鋳型cDNA（BACEAL ds cDNAの50倍希
釈液）を2.5μl、および蒸留水を14μlを混合して作製
した。反応条件は94℃・30秒の初期変性後、94℃・5秒-72
℃・4分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-70℃・4分のサイ
クル反応を5回、94℃・5秒-68℃・4分のサイクル反応を25
回行った。続いて、該PCR反応の反応液を鋳型としてnes
ted PCRを実施した。反応液は50XAdvantage-GC 2 Polym
erase Mix (CLONTECH社)を0.5μl、添付の5x Advantage
-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc,
17.5 mM Mg(OAc)₂, 25％Dimethyl Sulfoxide,18.75μg/
ml BSA, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P40)を5μ
l、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.0μl、10
μMプライマーbZAQ5-3を 0.5μl、10μMプライマーAP2
（プライマーAP2はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA K
itに添付のもの）を0.5 μl、鋳型DNA（該PCR反応液50
倍希釈液）を2.5μl、および蒸留水を14μlを混合して
作製した。反応条件は94℃・30秒の初期変性後、94℃・5
秒-72℃・4分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-70℃・4分
のサイクル反応を5回、94℃・5秒-68℃・4分のサイクル反
応を25回行った。得られたDNA断片をTOPO TA Cloning K
it (Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記載さ
れた方法に従ってクローニングした。クローニングされ
たDNA配列をABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、2
種類のウシZAQの5'部分配列 （type1：配列番号：１５
０；type2：配列番号：１５１）の配列を得た。配列番
号：１５０の情報より、プライマー bZAQa-F1（配列番
号：１５２）とbZAQa-F2 （配列番号：１５３）を作成
し、以下に記した3'RACE実験を実施した。 bZAQa-F1: 5'-TCATCAGCCCGACCGCCCACTCTGGC-3' (配
列番号：１５２) bZAQa-F2: 5'-TAGGATGAAGCTTGGATTCTGGACGCCA-3'
(配列番号：１５３) 3'RACEのPCR反応液は、PfuTurbo DNA polymerase (Stra
tagene社)を1μl、添付の10x PCR bufferを5μl、dNTP
mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を4μl、10μMプライマ
ーbZAQa-F1および10μMプライマーAP1（プライマーAP1
はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付のも
の）を各2.5μl 、鋳型cDNA（BACE AL ds cDNAの50倍希
釈液）を1μl、および蒸留水を34μlを混合して作製し
た。反応条件は94℃・30秒の初期変性後、94℃・5秒-72℃
・4分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-70℃・4分のサイク
ル反応を5回、94℃・5秒-68℃・4分のサイクル反応を25回
行った。続いて、該PCR反応の反応液を蒸留水で50倍に
希釈したものをを鋳型としてnested PCRを行った。PCR
反応液は、PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社)を
1μl、添付の10x PCR bufferを5μl、dNTP mixture (2.
5 mM each, 宝酒造)を4μl、10μMプライマーbZAQa-F2
および10μMプライマーAP1（プライマーAP2はCLONTECH
社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付のもの）を各2.5μ
l 、鋳型DNAを1μl、および蒸留水を34μlを混合して作
製した。反応条件は94℃・30秒の初期変性後、94℃・5秒-
72℃・4分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-70℃・4分のサ
イクル反応を5回、94℃・5秒-68℃・4分のサイクル反応を
25回行った。得られたDNA断片をZaro Blunt TOPO PCR C
loning Kit (Invitrogen社)を用いて添付のマニュアル
に記載された方法に従ってクローニングした。クローニ
ングされたDNA配列をABI3100 DNA sequencerを用いて解
読し、ウシZAQの3'端の塩基配列（配列番号：１５４）
を得た。5'RACEおよび3'RACEの情報より、プライマーbZ
AQa-EF1（配列番号：１５５）、bZAQa-IF1 （配列番
号：１５６）、bZAQa-IR1（配列番号：１５７）およびb
ZAQa-ER1 （配列番号：１５８）を作成し、BACE AL ds
cDNAの50倍希釈液を鋳型として、以下に記したPCR反応
を実施した。 bZAQa-EF1: 5'-TTTGAGTCGCTCCCAGTGTGTCCT-3' (配列番
号：１５５) bZAQa-IF1: 5'-GCTCCTCCCGGTTCTTTGAAATC-3' (配列番
号：１５６) bZAQa-IR1: 5'-TGTAGTCTCTGAATCTCACTGGTGCC-3' (配列
番号：１５７) bZAQa-ER1: 5'-GGTGGATTAAAAAGGCCCTCAATAAGCC-3'(配列
番号：１５８) PCR反応液はPfuTurbo DNA polymerase(Stratagene社)を
1 μl、添付の10x PCR bufferを5μl、2.5 mM dNTP mix
tureを4μl、10μMプライマーbZAQa-EF1およびbZAQa-ER
1を各2.5μl 、鋳型DNAを1μl、および蒸留水を34μlを
混合して作製した。反応条件は95℃・1分の初期変性後、
95℃・30秒-60℃・30秒-72℃・3分のサイクル反応を35回、
および72℃・10分の最終伸長反応とした。続いて、該PCR
反応の反応液を蒸留水で50倍に希釈したものを鋳型とし
てnested PCRを行った。PCR反応液はPfuTurbo DNA poly
merase (Stratagene社)を1μl、添付の10x PCR buffer
を5μl、2.5 mM dNTP mixtureを4μl、10μMプライマー
bZAQa-IF1およびbZAQa-IR1を各2.5μl 、鋳型DNAを1μ
l、および蒸留水を34 μlを混合して作製した。反応条
件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-60℃・30秒-72℃
・3分のサイクル反応を35回、および72℃・10分の最終伸
長反応とした。得られたDNA断片をZaro Blunt TOPO PCR
Cloning Kit (Invitrogen社)を用いて添付のマニュア
ルに記載された方法に従ってクローニングした。クロー
ニングされたDNA配列をABI3100 DNA sequencerを用いて
解読し、ウシ型ＺＡＱ全長をコードする2038 bpのDNA断
片（配列番号：１５９）を有するｐＢＺＡＱを得ること
ができた。該プラスミドによりトランスフォームさせた
大腸菌ＤＨ５αを、大腸菌ＤＨ５α／ｐＢＺＡＱと命名
した。配列番号：１５９で表される塩基配列を有するｃ
ＤＮＡ断片には、３９３個のアミノ酸配列（配列番号：
１７１）がコードされており（配列番号：１７２）、該
アミノ酸配列を有する蛋白質をウシ型ＺＡＱと命名し
た。

【０１４８】配列番号：１４７の情報より、プライマー
bI5E5-1（配列番号１６０）およびbI5E5-3（配列番
号：１６１）を作成し、BACE AL ds cDNAを鋳型として
以下に記した5'RACE実験を実施した。 bI5E5-1: 5'-GTAGGCTGATGGGATGGAGATGAGAATGGA-3'
(配列番号：１６０) bI5E5-3: 5'-GCAGGTAGTTGATACAGGCACAGAGCACAT-3'
(配列番号：１６１) 5’RACEのPCR反応液は50X Advantage-GC 2 Polymerase
Mix (CLONTECH社)を0.5μl、添付の5x Advantage-GC 2
PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 m
M Mg(OAc)₂, 25％ Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml B
SA, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P40)を5μl、d
NTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2μl、10μMプラ
イマーbI5E5-1を 0.5μl、10μMプライマーAP1（プライ
マーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付
のもの）を0.5μl、鋳型cDNA（BACE AL ds cDNAの50倍
希釈液）を2.5μl、および蒸留水を14μlを混合して作
製した。反応条件は94℃・30秒の初期変性後、94℃・5秒-
72℃・4分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-70℃・4分のサ
イクル反応を5回、94℃・5秒-68℃・4分のサイクル反応を
25回行った。続いて、該PCR反応の反応液を鋳型としてn
ested PCRを実施した。反応液は50XAdvantage-GC 2 Pol
ymerase Mix (CLONTECH社)を0.5μl、添付の5x Advanta
ge-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOA
c, 17.5 mM Mg(OAc)₂, 25％Dimethyl Sulfoxide, 18.75
μg/ml BSA, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P40)
を5μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.0μ
l、10μMプライマーbI5E5-3を 0.5μl、10μMプライマ
ーAP2（プライマーAP2はCLONTECH社のMarathon-Ready c
DNA Kitに添付のもの）を0.5μl、鋳型DNA（該PCR反応
液50倍希釈液）を2.5μl、および蒸留水を14μlを混合
して作製した。反応条件は94℃・30秒の初期変性後、94
℃・5秒-72℃・4分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-70℃・
4分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-68℃・4分のサイク
ル反応を25回行った。得られたDNA断片をTOPO TA Cloni
ng Kit (Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記
載された方法に従ってクローニングした。クローニング
されたDNA配列をABI3100 DNA sequencerを用いて解読
し、ウシI5Eの5'部分配列（配列番号：１６２）を得
た。配列番号：１４７の情報より、プライマーbI5E3-1
（配列番号：１６３）およびbI5E3-3（配列番号：１６
４）を作成し、以下に記した3'RACE実験を実施した。 bI5E3-1: 5'-AGCCTCCTTCCTGATCGCTCTGGTCTG-3' (配
列番号：１６３) bI5E3-3: 5'-CCCATCAGCCTACTTCACAAAGGAAACCG-3'
(配列番号：１６４) 3'RACEのPCR反応液は50X Advantage-GC 2 Polymerase M
ix (CLONTECH社)を0.5μl、添付の5x Advantage-GC 2 P
CR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM
Mg(OAc)₂, 25％ Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BS
A, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P40)を5μl、dN
TP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2μl、10μMプラ
イマーbI5E3-1を 0.5μl、10μMプライマーAP1（プライ
マーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付
のもの）を0.5μl、鋳型cDNA（BACEAL ds cDNAの50倍希
釈液）を2.5μl、および蒸留水を14μlを混合して作製
した。反応条件は94℃・30秒の初期変性後、94℃・5秒-72
℃・4分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-70℃・4分のサイ
クル反応を5回、94℃・5秒-68℃・4分のサイクル反応を25
回行った。続いて、該PCR反応の反応液を鋳型としてnes
ted PCRを実施した。反応液は50X Advantage-GC 2 Poly
merase Mix (CLONTECH社)を0.5μl、添付の5x Advantag
e-GC2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc,
17.5 mM Mg(OAc)₂, 25％ Dimethyl Sulfoxide, 18.75μ
g/ml BSA, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P40)を5
μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.0μl、1
0μMプライマーbI5E3-3を 0.5μl、10μMプライマーAP2
（プライマーAP2はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA K
itに添付のもの）を0.5μl、鋳型DNA（該PCR反応液50倍
希釈液）を2.5μl、および蒸留水を14μlを混合して作
製した。反応条件は94℃・30秒の初期変性後、94℃・5秒-
72℃・4分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-70℃・4分のサ
イクル反応を5回、94℃・5秒-68℃・4分のサイクル反応を
25回行った。得られたDNA断片をTOPO TA Cloning Kit
(Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記載された
方法に従ってクローニングした。クローニングされたDN
A配列をABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、ウシI5
Eの3'部分配列 （配列番号1-6５）を得た。5'RACEおよ
び3'RACEの情報より、プライマーbZAQb-F（配列番号：
１６６）、bZAQb-F2（配列番号：１６７）、bZAQb-R
（配列番号：１６８）およびbZAQb-R2（配列番号：１６
９）を作成し、BACE AL ds cDNAの50倍希釈液を鋳型と
して、以下に記したPCR反応を実施した。 bZAQb-F: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (配列
番号：１６６) bZAQb-F2: 5'-GCTGGGTGAGAAGGAATAGGGA-3' (配列番
号：１６７) bZAQb-R: 5'-GCAGGTGCCAATTCATTTTGC-3' (配列番号：
１６８) bZAQb-R2: 5'-TGCTCTTTAATCTCGCTGGTGGT-3' (配列番
号：１６９) PCR反応液はPfuTurbo DNA polymerase(Stratagene社)を
1μl、添付の10x PCR bufferを5μl、2.5 mM dNTP mixt
ureを4μl、10μMプライマーbZAQb-FおよびbZAQb-Rを各
2.5μl 、鋳型DNAを1μl、および蒸留水を34μlを混合
して作製した。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃
・30秒-58℃・30秒-72℃・3分のサイクル反応を40回、およ
び72℃・10分の最終伸長反応とした。続いて、該PCR反応
の反応液を蒸留水で50倍に希釈したものを鋳型としてne
sted PCRを行った。PCR反応液はPfuTurbo DNA polymera
se (Stratagene社)を1 μl、添付の10x PCR bufferを5
μl、2.5 mM dNTP mixtureを4μl、10μMプライマーbZA
Qb-F2およびbZAQb-R2を各2.5μl 、鋳型DNAを1μl、お
よび蒸留水を34μlを混合して作製した。反応条件は95
℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-58℃・30秒-72℃・3分の
サイクル反応を40回、および72℃・10分の最終伸長反応
とした。得られたDNA断片をZaro Blunt TOPO PCR Cloni
ng Kit (Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記
載された方法に従ってクローニングした。クローニング
されたDNA配列をABI3100 DNA sequencerを用いて解読
し、ウシ型Ｉ５Ｅ全長をコードする1623 bpのDNA断片
（配列番号：１７０）を有するｐＢＩ５Ｅを得ることが
できた。該プラスミドによりトランスフォームさせた大
腸菌ＴＯＰ１０を、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＩ５Ｅと命
名した。配列番号：１７０で表される塩基配列を有する
ｃＤＮＡ断片には、３８４個のアミノ酸配列（配列番
号：１７３）がコードされており（配列番号：１７
４）、該アミノ酸配列を有する蛋白質をウシ型Ｉ５Ｅと
命名した。

【０１４９】実施例２ ウシ副腎毛細血管内皮細胞（Ｂ
ＡＣＥ）およびウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥ）に発
現しているウシ型ＺＡＱおよびウシ型Ｉ５Ｅレセプター
の同定pBZAQを鋳型としてウシ型ZAQの情報より、プライ
マー bZAQa-IF1（配列番号：１７５）およびbZAQa-temp
IR（配列番号：１７６）を作成し、以下に記した方法で
ZAQ用標準DNA断片を作製した。 bZAQa-IF1: 5'-GCTCCTCCCGGTTCTTTGAAATC-3' （配列番
号：１７５） bZAQa-tempIR: 5'-TGGTGAGGTTGCGTAGCTTCTTG-3'
（配列番号：１７６） PCR反応液はPfuTurbo hotstart DNA polymerase (Strat
agene社)を4μl、添付の10x PCR bufferを20μl、dNTP
mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を16μl、10μMプライ
マーbZAQa-IF1およびbZAQa-tempIRを各10μl 、鋳型cDN
A（pBZAQ）を4μl、および蒸留水を136μlを混合して作
製した。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-
60℃・30秒-72℃・1分のサイクル反応を40回行った。得ら
れたDNA断片をウシ型ZAQ用標準DNA断片とした。ウシ型Z
AQの情報よりPrimer Expressソフトウェアを用いて、ウ
シ型ZAQ用forwardおよびreverse TaqMan primer、bZAQa
-taqF（配列番号：１７７）およびbZAQa-taqR（配列番
号：１７８）、ウシ型ZAQ用TaqMan probe、bZAQa-probe
（配列番号：１７９）を作製した。 bZAQa-taqF: 5'-AACCAACTATTTCCCTCTGCTTGAC-3' （配
列番号：１７７） bZAQa-taqR: 5'-TCACCGTAGCTGAAGTTGAAGG-3' （配列
番号：１７８） bZAQa-probe: 5’ -FAM-CCTCGGAGCCCAAGCTGCTTCTTT-TAM
RA-3' （配列番号：１７９） ウシ型ZAQ遺伝子に対するTaqMan ProbeとTaqMan Primer
との組合せで、BACE由来cDNA(BACE cDNA)およびBAE 由
来cDNA(BAE cDNA)を鋳型としてTaqMan PCR解析によるウ
シ型ZAQ遺伝子転写産物の定量を行った。反応液は2xTaq
Man PCR Master Mix 12.5μl、5μMプライマーbZAQa-ta
qFおよびbZAQa-taqRを各1.5μl 、5μMプローブbZAQa-p
robeを各1μl 、希釈濃度の異なるウシ型ZAQ用標準DNA
断片あるいは鋳型cDNAを4μl (200ng tRNA由来)、およ
び蒸留水を4.5μlを混合して作製した。TaqMan PCR反応
は、50℃・2分95℃・10分の初期反応、95℃・15秒-60℃・1
分のサイクル反応を50回という条件で、SDS7700（Seque
nce Detection System、ABI）を用いて行った。 反応終
了後、ソフトウェア上で各希釈濃度の標準DNA断片に対
する蛍光強度より標準曲線をプロットし、鋳型cDNAサン
プル中のウシ型ZAQ遺伝子転写産物を定量した。

【０１５０】pBI5Eを鋳型としてウシ型I5Eの情報よりプ
ライマー bZAQb-F2（配列番号：１８０）およびbZAQb-t
empIR（配列番号：１８１）を作成し、以下に記した方
法でZAQ用標準DNA断片を作製した。 bZAQb-F2: 5’-GCTGGGTGAGAAGGAATAGGGA-3’ （配列番
号：１８０） bZAQb-tempIR: 5’-GGAGAGCTGATGCACCACATAGTAG-3’
（配列番号：１８１） PCR反応液はPfuTurbo hotstart DNA polymerase (Strat
agene社)を4μl、添付の10x PCR bufferを20μl、dNTP
mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を16μl、10μMプライ
マーbZAQb-F2およびbZAQb-tempIRを各10μl 、鋳型cDNA
（pBI5E）を4μl、および蒸留水を136μlを混合して作
製した。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-
60℃・30秒-72℃・1分のサイクル反応を40回行った。得ら
れたDNA断片をウシ型I5E用標準DNA断片とした。ウシ型I
5Eの情報よりPrimer Expressソフトウェアを用いて、ウ
シ型I5E用forwardおよびreverse TaqMan primer、bZAQb
-taqF（配列番号：１８２）およびbZAQb-taqR（配列番
号：１８３）、ウシ型I5E用TaqMan probe、bZAQb-probe
（配列番号：１８４）を作製した。 bZAQb-taqF: 5’-TCATGAGAGCAGAAGGTCTGGA-3’ (配列
番号：１８２) bZAQb-taqR: 5’ -TGGCTGGAAAACTAGCATTTCC-3’ (配
列番号：１８３) bZAQb-probe: 5’-FAM-CACACACCGCTCACTGGAAAGCTTCA-TA
MRA-3’ (配列番号：１８４) ウシ型I5E遺伝子に対するTaqMan ProbeとTaqMan Primer
との組合せで、BACE由来cDNA(BACE cDNA)およびBAE 由
来cDNA(BAE cDNA)を鋳型としてTaqMan PCR解析によるウ
シ型I5E遺伝子転写産物の定量を行った。反応液は2xTaq
Man PCR Master Mix 12.5μl、5μMプライマーbZAQb-ta
qFおよびbZAQb-taqRを各1.5μl 、5μMプローブbZAQb-p
robeを各1μl 、希釈濃度の異なるウシ型I5E用標準DNA
断片あるいは鋳型cDNAを4μl (200ng tRNA由来)、およ
び蒸留水を4.5μlを混合して作製した。TaqMan PCR反応
は、50℃・2分95℃・10分の初期反応、95℃・15秒-60℃・1
分のサイクル反応を50回という条件で、SDS7700（Seque
nce Detection System、ABI）を用いて行った。 反応終
了後、ソフトウェア上で各希釈濃度の標準DNA断片に対
する蛍光強度より標準曲線をプロットし、鋳型cDNAサン
プル中のウシ型I5E遺伝子転写産物を定量した。結果を
〔図６〕に示す。これより、ウシ副腎毛細血管内皮細胞
にはウシ型ＺＡＱおよびウシ型Ｉ５Ｅが発現されている
ことがわかる。また、ウシ大動脈血管内皮細胞にはウシ
型Ｉ５Ｅが発現されていることがわかる。

【０１５１】実施例３ （１）ウシ副腎毛細血管内皮細胞（ＢＡＣＥ）を用いた
ＦＬＩＰＲによる細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性
の測定 BACEはGospodarowicz等が報告している方法を用いて単
離した（Journal of Cellular Physiology 127, 121-13
6, 1986）。増殖用培地(10％ ウシ胎児血清（FBS）、10
0 units/ml Penicillin、100 μg/ml Streptomycinを含
むDMEM）に分散したBACEを3×10⁴cells/200 μl/wellに
なるようにFLIPR用96穴プレート(Blackplate clear bot
tom、Coster社)に播種し、5％ CO₂インキュベーター中
にて37℃で一晩培養後実験に用いた(以後細胞プレート
とする)。FLIPRアッセイバッファー（ニッスイハンクス
２（日水製薬株式会社） 9.8 g、炭酸水素ナトリウム
0.35 g、HEPES 4.77 g 、6 M水酸化ナトリウム溶液で p
H 7.4に合わせた後、1リットルにフィルアップ後フィル
ター滅菌）10 ml、250 mM Probenecid 100 μl、FBS 10
0 μlを混合した。また、Fluo 3-AM（同人化学研究所）
1バイアル(25 μg)にdimethyl sulfoxideを20 μlと20
％ Pluronic acid（Molecular Probes社） 20 μlを添
加し溶解後、これを上記Hanks'/HBSS−Probenecid−FBS
に加え、培養上清を除いた細胞プレートに各ウエル100
μlずつ分注し、5％ CO₂インキュベーター中にて37℃
で1時間インキュベートした。一方、参考例１４、８お
よび１３に示した方法で調製したヒト型ＺＡＱリガンド
ペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１
を、2.5 mM Probenecid、0.2％ bovine serum albumin
(BSA), 0.1％ CHAPSを含むHanks'/HBSSで希釈し、96穴
プレートに分注した(サンプルプレート)。細胞プレート
の色素ローディング終了後、細胞プレートを2.5 mM Pro
benecidを含むFLIPRアッセイバッファ−（洗浄用バッフ
ァー）でプレートウォッシャー(Molecular Devices社)
を用いて４回洗浄後、100 μlの洗浄バッファーを残し
た。この細胞プレートとサンプルプレートをFLIPRにセ
ットしアッセイを行った（FLIPRにより、サンプルプレ
ートから50 μlのサンプルが細胞プレートへと移され
る）。結果を〔図７〕に示す。これより、ウシ毛細血管
内皮細胞（ＢＡＣＥ）はヒト型ＺＡＱリガンドペプチ
ド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１に応答
して細胞内カルシウムイオンの上昇を起こすことが明ら
かである。従って、試験化合物の存在下または非存在
下、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプ
チドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などの本発明のペプチドを用
いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、試験
化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシグナル情報伝達を阻害
する活性があるのか否かを知ることができ、血管新生阻
害剤を得ることができる。

【０１５２】（２）リン酸化ｐ４２ ＭＡＰキナーゼお
よびリン酸化ｐ４４ ＭＡＰキナーゼのウエスタンブロ
ッティンブによる検出 増殖用培地に分散したBACEを2×10⁵ cells/ml/wellにな
るように12穴プレートに播種し一晩5％ CO₂、37℃で培
養後実験に用いた。10 nM、100 nM、1,000 nMのリガン
ド溶液を10 μl添加し37℃で5分間インキュベーション
した。このリガンド溶液として、参考例１４、８および
１３に示した方法で調製したヒト型ＺＡＱリガンドペプ
チド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を、
0.2％ BSAと0.1％ CHAPSを含むH/HBSSに溶解したものを
用いた。その後、培養上清を除去しLysis Buffer（50 m
M Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA、2 mM Na₃VO₄、50 mM
NaF、4 mM Na₄P₂O₇、1％ NP 40、1 mM phenylmethylsu
lfonyl fluoride (PMSF)、20 μg/ml、leupeptin、10
μg/ml pepstatin A、pH7.4）を100 μl添加した。氷上
で30分間放置後、上清を15,000 rpmで10分間遠心し得ら
れた上清にSDS-PAGE用サンプルバッファー(300 mM Tri
s、10％ sodium dodesylsulfate、0.025％ bromophenol
blue、50％ glycerol、pH 6.8)を20 μl添加し3分間煮
沸した。このうち18 μlを12.5％のゲル（BIO-RAD社）
を用いてSDS-PAGEで分離した。電気泳動後、ゲルをトラ
ンスファー用バッファー（25 mM Tris、192 mM Glycin
e、10％ MeOH）中で15分間しんとうした後、ゲル中の蛋
白をPVDF膜（MiniProBlot、Applied Biosystems）にト
ランスファーした。トランスファーした膜（ブロット）
をブロッキングバッファー（50 mM Tris、150 mM NaC
l、0.1％ Tween 20、1％ BSA、pH 7.4）を用いて一晩4
℃でブロッキングした。この後、ブロットに一次抗体溶
液（Cell Signaling TECHNOLOGY社のPhospho p42/44MAP
Kinase Antibodyを前述のブロッキングバッファ−で5,
000倍希釈したもの）を30 ml添加し室温で2時間インキ
ュベートした。この後、ブロットを洗浄用バッファー
（50 mM Tris、150 mM NaCl、0.1％ Tween 20、pH 7.
4）で洗浄後（20分間×3）、ブロットに二次抗体溶液
（KPL社のAnti Rabbit IgG HRP-linked (Goat)を前述の
ブロッキングバッファーで1,000倍希釈したもの）30 ml
添加し室温で1時間反応させた。この後、ブロットを洗
浄用バッファーで洗浄し（20分間×3）、さらにバッフ
ァー（50 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.4）で洗浄後（2
分間×2）、ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech)を
用いてリン酸化p42/44 MAP Kinaseを検出した。結果を
〔図８〕に示す。図８より、リガンドを添加しないコン
トロールに比べ、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト
型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を添加した場合
にはリン酸化されたＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ−Ｐ）の
バンドの染色強度が増強していることを読み取ることが
できる。また、ヘビ毒ＭＩＴ１は０．１ｎＭという低濃
度からこの増強効果を現すことができ、ヒト型Ｂｖ８ペ
プチドは１ｎＭ から、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド
は１０ ｎＭからこの効果を現した。ウシ毛細血管内皮
細胞（ＢＡＣＥ）はヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒ
ト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などのペプチ
ドの添加によりＭＡＰキナーゼの活性化が起こることが
明らかである。従って、試験化合物の存在下または非存
在下、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペ
プチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などの本発明のペプチドを
用いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、試
験化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシグナル情報伝達を阻
害する活性を有しているのか否かを知ることができ、血
管新生阻害剤を得ることができる。

【０１５３】（３）リン酸化ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの
ウエスタンブロッティングによる検出増殖用培地に分散
したBACEを2×10⁵ cells/ml/wellになるように12穴プレ
ートに播種し一晩5％ CO₂、37℃で培養後実験に用い
た。10 nM、100 nM、1,000 nMのリガンド溶液を10 μl
添加し37℃で5分間インキュベーションした。このリガ
ンド溶液は、参考例１４、８および１３に示した方法で
調製したヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８
ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を、0.2％ BSAと0.1％ C
HAPSを含むH/HBSS に溶解したものを用いた。その後、
培養上清を除去しLysis Buffer（50 mM Tris、150 mM N
aCl、1 mM EDTA、2 mM Na₃VO₄、50 mM NaF、4 mM Na₄P₂
O₇、1％ NP 40、1 mM PMSF、20 μg/ml、leupeptin、10
μg/ml pepstatin A、pH 7.4）を100 μl添加した。氷
上で30分間放置後、上清を15,000 rpmで10分間遠心し得
られた上清にSDS-PAGE用サンプルバッファー20μl添加
し3分間煮沸した。このうち18 μlを12.5％のゲル（BIO
-RAD社）を用いてSDS-PAGEで分離した。電気泳動後、ゲ
ルをトランスファー用バッファー（25 mM Tris、192 mM
Glycine、10％ MeOH）中で15分間しんとうした後、ゲ
ル中の蛋白をPVDF膜（MiniProBlot、Applied Biosystem
s）にトランスファーした。トランスファーした膜（ブ
ロット）をブロッキングバッファー（50 mM Tris、150
mM NaCl、0.1％ Tween 20、1％ BSA、pH 7.4）を用いて
室温で1時間ブロッキングした。この後、ブロットに一
次抗体溶液（Cell Signaling TECHNOLOGY社のPhospho p
38 MAP Kinase (Thr180/Tyr182) Antibodyを前述のブロ
ッキング溶液で1,000倍希釈したもの）を30 ml添加し4
℃で一晩インキュベートした。この後、ブロットを洗浄
用バッファーで洗浄後（20分間×3）、ブロットに二次
抗体溶液（Cell Signaling TECHNOLOGY社のAnti Rabbit
IgG, HRP-linked Antibodyを前述のブロッキングバッ
ファーで1,000倍希釈したもの）30 ml添加し室温で1時
間反応させた。この後、ブロットを洗浄用バッファー
（50 mM Tris、150mM NaCl、0.1％ Tween 20、pH 7.4）
で洗浄し（20分間×3）、さらにバッファー（50 mM Tri
s、150 mM NaCl、pH 7.4）で洗浄後（2分間×2）、ECL
Plus (Amersham Pharmacia Biotech)を用いてリン酸化p
38 MAP Kinaseを検出した。結果を〔図９〕に示す。図
９より、リガンドを添加しないコントロールに比べてヒ
ト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドま
たはヘビ毒ＭＩＴ１などのペプチドを添加した場合には
リン酸化されたＰ３８ ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８ ＭＡ
ＰＫ−Ｐ）のバンドの染色強度が増強していることを読
み取ることができる。また、ヘビ毒ＭＩＴ１は０．１ｎ
Ｍという低濃度からこの増強効果を現すことができ、ヒ
ト型Ｂｖ８ペプチドは１ｎＭから、ヒト型ＺＡＱリガン
ドペプチドは１０ｎＭからこの効果を現した。ウシ毛細
血管内皮細胞（ＢＡＣＥ）はヒト型ＺＡＱリガンドペプ
チド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１など
のペプチドの添加により ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性
化が起こることが明らかである。従って、試験化合物の
存在下または非存在下、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチ
ド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などの
本発明のペプチドを用いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激
することにより、試験化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシ
グナル情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを
知ることができ、血管新生阻害剤を得ることができる。

【０１５４】（４）［^３Ｈ］チミジン取り込みアッセイ 増殖用培地に分散したBACEを1.5×10⁴ cells/200 μl/w
ellになるように48ウエルプレートに播種し一晩培養
後、培養上清を除去しアッセイバッファー（0.5％ BS
A、0.1％ FBSを含むDMEM）495 μlとリガンド溶液5 μl
を添加し、さらに15-18時間培養した。このリガンド溶
液としては、参考例１４、８および１３に示した方法で
調製したヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８
ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を、0.2％ BSAと0.1％ C
HAPSを含むH/HBSS に溶解したものを用いた。その後、
各ウエルに[³H]Thymidine溶液（NEN社、NET-027を血清
不含DMEMで100倍希釈したもの）を50 μl添加しさらに6
時間培養した。この後、培養上清を除去し各ウエルに洗
浄バッファー500 μlを添加し洗浄後、メタノール500
μlを添加し氷上で15分間放置した。その後、各ウエル
の上清を除去し5％トリクロロ酢酸（TCA）500 μlを添
加し氷上で15分間放置後、TCAを除去し水500 μlを添加
し洗浄した。最後に0.3 M NaOHを200μl添加し溶解後、
液体シンチレーターを3 ml添加し放射活性を液体シンチ
レーションカウンターで測定した。結果を〔図１０〕に
示す。図１０より、リガンドを添加しないコントロール
に比べてヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８
ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を添加した場合にはウシ
副腎毛細血管内皮細胞の［^３Ｈ］チミジン取り込み量が
増加していることがわかる。従って、試験化合物の存在
下または非存在下、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒ
ト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などの本発明
のペプチドを用いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激するこ
とにより、試験化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシグナル
情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知るこ
とができ、血管新生阻害剤を得ることができる。

【０１５５】（５）細胞増殖アッセイ 増殖用培地に分散したBACEを5×10³ cells/ml/wellにな
るように24穴プレートに播種し一晩培養した後、参考例
１４および８に示した方法で調製したヒト型ＺＡＱリガ
ンドペプチドまたはヒト型Ｂｖ８ペプチドを、0.2％ BS
Aと0.1％ CHAPSを含むH/HBSS に溶解したものを10 μl
添加し、さらに4-5日間培養した。その後、培養上清を
除去しPBS1mlをウエルに添加し細胞を洗浄後、トリプシ
ン溶液200μlを添加し細胞をピペッティングで回収し、
細胞数を血球計算版で測定した。結果を〔図１１〕に示
す。図１１より、上記ペプチドを添加しないコントロー
ルに比べてヒト型ＺＡＱリガンドペプチドまたはヒト型
Ｂｖ８ペプチドを添加した場合にはウシ副腎毛細血管内
皮細胞の細胞数が増加していることがわかる。従って、
試験化合物の存在下または非存在下、ヒト型ＺＡＱリガ
ンドペプチドおよびヒト型Ｂｖ８ペプチドなどの本発明
のペプチドを用いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激するこ
とにより、試験化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシグナル
情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知るこ
とができ、血管新生阻害剤を得ることができる。

【０１５６】参考例１ Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質ＺＡＱをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配
列の決定およびＺＡＱの発現分布の解析 （１）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ＺＡＱをコード
するｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定 ヒト脳下垂体ｃＤＮＡ（CLONTECH社）を鋳型とし、２個
のプライマー、プライマー１（5'- GTC GAC ATG GA
G ACC ACC ATG GGG TTC ATG G -3'；配列番
号：４）及びプライマー２（5'- ACT AGT TTA TTT
TAG TCT GATGCA GTC CAC CTC TTC -3'；配列
番号：５）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応におけ
る反応液の組成は上記ｃＤＮＡの１０分の１量を鋳型と
して使用し、Advantage2 Polymerase Mix（CLONTECH
社）１／５０量、プライマー１及びプライマー２を各0.
2μM, dNTPs 200μM、及び酵素に添付のバッファーを
加え、25μlの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・２
分の後、９４℃・２０秒、７２℃・１００秒のサイクル
を３回、９４℃・２０秒、６８℃・１００秒のサイクル
を３回、９４℃・２０秒、６４℃・２０秒、６８℃・１
００秒のサイクルを３８回繰り返し、最後に６８℃・７
分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応産物をＴ
Ａクローニングキット（Invitrogen社）の処方に従いプ
ラスミドベクターpCR2.1（Invitrogen社）へサブクロー
ニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、ｃＤＮＡ
をもつクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で
選択した後、個々のクローンの配列を解析した結果、新
規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする２種類
のｃＤＮＡ配列ＺＡＱＣ（配列番号：２）及びＺＡＱＴ
（配列番号：３）を得た。このｃＤＮＡより導き出され
るアミノ酸配列を有する蛋白質はいずれも同一配列（配
列番号：１）を有したためＺＡＱと命名し、配列番号：
２で表されるＤＮＡを含有する形質転換体を大腸菌（Es
cherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ＺＡＱＣ
と、配列番号：３で表されるＤＮＡを含有する形質転換
体を大腸菌ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ＺＡＱＴと命名し
た。

【０１５７】（２）Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲによるＺＡＱ
の発現分布の解析 Taqman PCRに用いるプライマーおよびプローブは、Prim
er Express ver．1.0( PEバイオシステムスジャパン)を
用いて検索し、プライマー３( 5'- TCATGTTGCTCCACTGGA
AGG - 3'（配列番号：５８）)，プライマー４（5'-CCAA
TTGTCTTGAGGTCCAGG-3'（配列番号：２９））, ZAQprobe
（5' - TTCTTACAATGGCGGTAAGTCCAGTGCAG - 3'（配列番
号：６０））を選択した。プローブのリポーター色素と
して、FAM（6-carboxyfluorescein ）を付加した。スタ
ンダードDNAとして、pAK−ZAQCを鋳型に、プライマーZA
QC Sal（5'- GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG- 3'
（配列番号：６１））およびZAQC Spe( 5'-ACTAGTTTATT
TTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC - 3' （配列番号：６２）)
を用いて増幅したPCR断片を、CHROMA SPIN200（ CLONTE
CH Laboratories， Inc．（ CA，USA ））を用いて精
製し、10^０−10^６コピ−/ μlに調整して使用した。各
組識のcDNAソースとして、Human Multiple Tissue cDNA
Panel IおよびPanel II（CLONTECH Laboratories， In
c．）を 使用した。プライマー、プローブ、鋳型に、Ta
qman Universal PCR Master Mix（PEバイオシステムス
ジャパン）を添付書類記載の規定量加え、ABI PRISM 77
00 Sequence Detection System（PEバイオシステムズジ
ャパン）でPCR反応および解析をおこなった。結果を表
１に示す。主に精巣、ついで肺、脳等の部位でZAQの発
現がみられた。

【表１】

【０１５８】参考例２ レセプター安定発現ＣＨＯ細胞
の作製 （２−１）ＺＡＱ安定発現細胞株の作製 ZAQ安定発現細胞株は以下のようにして調製した。すな
わち、参考例１で得たDH5α／pCR2.1−ZAQCの１クロー
ンを、アンピシリンを含むLB培地で振とう培養し、プラ
スミドpCR2.1−ZAQCを得た。これを制限酵素Sal Iおよ
びSpe Iで処理し、ZAQCをコードするインサート部分を
切り出した。同様に制限酵素Sal IおよびSpeIで処理し
たpAKKO−1.11H（Biochemica et Biophysica Acta 1219
(1994) 251-259）と、該インサート部分をLigation Ex
press Kit （CLONTECH Laboratories， Inc．（CA，US
A））を用いて連結し、大腸菌DH10Bにエレクトロポーレ
ーション法にて導入した。得られたクローンの有するプ
ラスミドの構造を、制限酵素処理ならびに配列解析で確
認し、正しい構築のものをCHO細胞発現用プラスミドpAK
−ZAQCとして使用した。このプラスミドpAK−ZAQCをCHO
/dhfr^-細胞（American Type Culture Collection）にCe
llPhect Transfection kit（Amersham Pharmacia Biote
ch社）を用いて形質導入することにより取得した。ま
ず、蒸留水120 μlに溶解したプラスミドDNA 4 μgに対
してBuffer A（CellPhect Transfection Kitに添付）12
0 μlを添加し、撹拌し、10分間静置後、Buffer B（Cel
lPhect Transfection Kitに添付）240 μlを添加し、激
しく撹拌し該DNAを含有するＤＮＡ−リン酸カルシウム
複合体を形成させた。 5 x 10⁵個のCHO/ dhfr^- 細胞を6
0 mmシャーレに播き、10％のウシ胎児血清（BIO WHITTA
KER 社）を含む Ham's F-12培地（日水製薬株式会社）
中で37℃、5％炭酸ガス中で１日間培養した後、該ＤＮ
Ａ−リン酸カルシウム複合体の懸濁液480 μl をシャー
レの該細胞上に滴下させた。これを、37℃、5％炭酸ガ
ス中にて６時間培養した後、血清を含まない Ham's F-1
2培地で２回細胞を洗浄し、シャーレの該細胞上に15％
グリセロールを含む緩衝液（140 mM NaCl, 25 mM HEPE
S, 1.4 mM Na₂PO₄, pH7.1) 1.2mlを添加し２分間処理し
た。これを、再度、血清を含まないHam's F-12培地で２
回洗浄した後、10％のウシ胎児血清を含む Ham's F-12
培地中で37℃、5％炭酸ガス中で一晩培養した。該細胞
をトリプシン処理により分散させてシャーレから回収
し、2 x 10⁴ 個ずつ6-well plateに植え込み、透析済み
10％ウシ胎児血清（JRH BIOSCIENCES 社）、1 mM MEM非
必須アミノ酸溶液（大日本製薬株式会社）、100 units/
ml Penicillin、100 μg/ml Streptomycinを含む Dulbe
cco's modified Eagle medium (DMEM) 培地（日水製薬
株式会社）中にて37℃、5％炭酸ガス中にて培養を開始
した。プラスミドの導入された形質転換CHO細胞は該培
地中で生育するが、非導入細胞は次第に死滅していくの
で、培養開始１日目、および２日目に培地を交換して死
滅細胞を除去した。培養開始８−１０日後に生育してき
た形質転換CHO細胞のコロニーを約21個選んだ。 それぞ
れ選択された細胞からRNAを市販のRNA単離用キットを用
いて回収し、以降、公知のＲＴ−ＰＣＲ法によりZAQを
高発現するZAQ発現CHO細胞B-1番クローン（以後、ZAQC-
B1細胞と略称する）を選別した。

【０１５９】（２−２）Ｉ５Ｅ安定発現細胞株の作製 ヒトI5EレセプターcDNA（配列番号：６）を公知のＰＣ
Ｒ法によりクローニングし、pAKKO1.11H発現ベクターに
組み込んだ。該発現ベクターを（２−１）に記載した方
法によりCHO/dhfr^-細胞（American Type Culture Colle
ction）に形質導入した。培養開始１０−１４日後に生
育してきた形質転換CHO細胞のコロニーを約20個選ん
だ。 選択した細胞を3×10⁴個/wellで96穴プレートに植
え込み、ヘビ毒MIT1（配列番号：２１）に対する反応性
を、後述の（２−３）に記載する試験方法により検討
し、反応性の良いI5E発現CHO細胞4番クローン（以後、I
5E-4細胞と略称する）を選別した。

【０１６０】（２−３）受容体活性化作用の測定 上記（２−１）で得られたZAQC-B1細胞、および上記
（２−２）で得られたI5E-4細胞を、それぞれ15×10⁴ce
lls/mlとなるように培地（10％ d FBS-DMEM）に懸濁
し、FLIPR用96穴プレート(Black plate clear bottom、
Coster社)に分注器を用いて各ウェルに200 μlずつ植え
込み（3.0×10⁴cells/200μl/ウェル）、5％CO₂インキ
ュベーター中にて37℃で一晩培養した後用いた（以後、
細胞プレートとする）。H/HBSS（ニッスイハンクス２
（日水製薬株式会社） 9.8g、炭酸水素ナトリウム 0.35
g、HEPES 4.77 g、6 M水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に
合わせた後、フィルター滅菌処理）20 ml、250 mM Prob
enecid 200 μl、ウシ胎児血清(FBS) 200 μlを混合し
た。また、Fluo 3-AM（同仁化学研究所）2バイアル（50
μg）をジメチルスルフォキサイド 40 μl、20％ Plur
onic acid（MolecularProbes社） 40 μlに溶解し、こ
れを上記H/HBSS−Probenecid−FBS に加え、混和後、８
連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウ
ェル 100 μlずつ分注し、5％ CO₂インキュベーター中
にて37℃で1時間インキュベートした（色素ローディン
グ）。ヘビ毒MIT1を2.5 mM Probenecid、0.2％ BSAを含
むH/HBSS 150 μlを加えて希釈し、FLIPR用96穴プレー
ト(V-Bottomプレート、Coster社)へ移した(以後、サン
プルプレートとする)。細胞プレートの色素ローディン
グ終了後、H/HBSSに2.5 mM Probenecidを加えた洗浄バ
ッファーでプレートウォッシャー(Molecular Devices
社)を用いて細胞プレートを４回洗浄し、洗浄後100 μl
の洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプ
ルプレートをFLIPRにセットし（FLIPRにより、サンプル
プレートから50 μlのサンプルが細胞プレートへと移さ
れる）、蛍光強度変化を継時的に測定することにより、
細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を測定した。

【０１６１】参考例３ ヒト型Ｂｖ８ペプチドの作製 （３−１）ヒト型Ｂｖ８ペプチド ｃＤＮＡのクローニ
ング ヒト精巣Marathon-Ready cDNA (CLONTECH社)を鋳型とし
て、プライマー hBv8-F1（配列番号：７）及びプライマ
ー hBv8-R1（配列番号：８）を作成し、以下に記したＰ
ＣＲ反応を実施した。 hBv8-F1: 5'-CTACTTCTGCTGCTGCCGCTGCTGTT-3' (配列
番号：７) hBv8-R1: 5'-TTGGAAAGTTGAGGAAGCAAGAGCATTT-3' (配列
番号：８) PCR反応液は50X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTEC
H社)を1μl、添付の10x Advantage 2 PCR buffer (400
mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc) ₂, 37.5
μg/ml BSA, 0.05％ Tween-20, 0.05％ Nonidet-P40)を
5μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を4μl、10
μMプライマーhBv8-F1及びhBv8-R1を 1μl、鋳型cDNAを
5μl、及び蒸留水を33μlを混合して作製した。反応条
件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-68℃・1分のサイ
クル反応を35回、および68℃・1分の最終伸長反応とし
た。得られたDNA断片を、TOPO TA Cloning Kit (Invitr
ogen社)を用いて添付のマニュアルに記載された方法に
従ってクローニングした。クローニングされたDNAの塩
基配列をABI377DNA sequencerを用いて解読し、配列番
号：９で表される配列を得た。

【０１６２】ヒト精巣Marathon-Ready cDNA (CLONTECH
社)を鋳型として、プライマー hBv8-R2（配列番号：１
０）を作成し、以下に記した5'RACE実験を実施した。 hBv8-R2: 5' -TGTCTCCCAGTTTGCCCATAGGTGTGC-3'
（配列番号：１０） 5'RACEのPCR反応液は50X Advantage-GC 2 Polymerase M
ix (CLONTECH社)を1μl、添付の5x Advantage-GC 2 PCR
buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc,17.5 mM Mg
(OAc)₂, 25％ Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BSA,
0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P40)を10 μl、dNT
P mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を4 μl、10 μMプラ
イマーhBv8-R1を 1 μl、10 μMプライマーAP1（プライ
マーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付
のもの）を1 μl、鋳型cDNA（CLONTECH社、ヒト精巣Mar
athon-Ready cDNA）を5 μl、及び蒸留水を28 μlを混
合して作製した。反応条件は94℃・1分の初期変性後、94
℃・30秒-72℃・3分のサイクル反応を10回、94℃・30秒-70
℃・3分のサイクル反応を5回、94℃・30秒-68℃・3分のサ
イクル反応を25回行った。続いて、該PCR反応の反応液
を鋳型としてnested PCRを実施した。反応液は50XAdvan
tage-GC 2 Polymerase Mix（CLONTECH社）を1 μl、添
付の5xAdvantage-GC 2 PCR buffer（200 mM Tricine-KO
H, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(OAc)₂, 25％ Dimethyl Sul
foxide, 18.75μg/ml BSA, 0.025％Tween-20, 0.025％
Nonidet-P40）を10 μl、dNTP mixture（2.5 mM each,
宝酒造）を4 μl、10 μMプライマーhBv8-R2を 1 μl、
10 μMプライマーAP2（プライマーAP2はCLONTECH社のMa
rathon-Ready cDNA Kitに添付のもの）を1 μl、鋳型DN
A（該PCR反応液50倍希釈液）を5 μl、及び蒸留水を28
μlを混合して作製した。反応条件は94℃・1分の初期変
性後、94℃・30秒-68℃・3分のサイクル反応を35回行っ
た。得られたDNA断片を、TOPO TA Cloning Kit (Invitr
ogen社)を用いて添付のマニュアルに記載された方法に
従ってクローニングした。クローニングされたDNAの塩
基配列をABI377DNA sequencerを用いて解読し、5'端の
配列（配列番号：１１）を得た。

【０１６３】得られた配列番号：９及び配列番号：１１
の情報より、プライマー hBv8-WF（配列番号：１２）、
プライマー hBv8-WR（配列番号：１３）、プライマー h
Bv8-CF（配列番号：１４）及びプライマー hBv8-SR（配
列番号：１５）を作成し、以下に記したPCR反応を実施
した。 hBv8-WF: 5'-CCATGAGGAGCCTGTGCTGCGCC-3'
（配列番号：１２） hBv8-WR: 5'-CTATTCACATTTGGTTTCTACTC-3'
（配列番号：１３） hBv8-CF: 5'-GTCGACCACCATGAGGAGCCTGTGCTGCG-3' （配
列番号：１４） hBv8-SR: 5'-ACTAGTCGATTACTTTTGGGCTAAAC-3' （配
列番号：１５） PCR反応液はPfuTurbo DNA polymerase(Stratagene社)を
1 μl、添付の10x PCRbufferを5 μl、2.5 mM dNTP mix
tureを4 μl、10 μMプライマーhBv8-WF及びhBv8-WRを
各2.5 μl 、鋳型DNA（ヒト精巣Marathon-Ready cDNA、
CLONTECH社）を鋳型として5μl、及び蒸留水を30 μlを
混合して作製した。反応条件は95℃・1分の初期変性後、
95℃1分-65℃・1分-72℃・1分のサイクル反応を35回、お
よび72℃・5分の最終伸長反応とした。続いて、該PCR反
応の反応液を鋳型としてnested PCRを行った。PCR反応
液はPfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社)を1 μ
l、添付の10x PCR bufferを5 μl、2.5 mM dNTP mixtur
eを4 μl、10 μMプライマーhBv8-CF及びhBv8-SRを各2.
5μl 、鋳型DNAを1μl、及び蒸留水を34 μlを混合して
作製した。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・1分
-65℃・1分-72℃・1分のサイクル反応を35回、および72℃
・5分の最終伸長反応とした。得られたDNA断片をTOPO TA
Cloning Kit (Invitrogen社)を用いて添付のマニュア
ルに記載された方法に従ってクローニングした。クロー
ニングされたDNAの塩基配列をABI377DNA sequencerを用
いて解読し、配列番号：１６で表される346bpの塩基配
列を有していることが明らかとなった。配列番号：１６
で表わされる塩基配列を有するDNA断片を有するプラス
ミドをpHBvと命名した。プラスミドpHBvにより大腸菌
（Escherichia coli）をトランスフォームさせ、エシェ
リヒアコリ（Escherichia coli）TOP10/pHBvと命名し
た。このDNA断片の塩基配列を解析した結果、配列番号1
-6で表わされるDNA断片は、配列番号：１７で表わされ
るヒト型Ｂｖ８前駆体ペプチド(108アミノ酸残基）をコ
ードするDNA（配列番号：１８）を含んでいることが明
らかとなった。また、配列番号：１８で表わされる塩基
配列は典型的なシグナル配列を有しており、配列番号：
１８で表わされる塩基配列を有するDNAは、配列番号：
１９で表わされるヒト型Ｂｖ８成熟体ペプチド（81アミ
ノ酸残基）をコードする243塩基対からなるDNA（配列番
号：２０）を含んでいることが明らかとなった。

【０１６４】（３−２）ヒト型Ｂｖ８ペプチド発現ＣＨ
Ｏ細胞の樹立 上記（３−１）に記載したプラスミドpHBvから、インサ
ートcDNAをSal I及びSpe I制限酵素を用いて切り出しpA
KKO1.11H発現ベクターに組み込んだ。該プラスミドをCH
O/dhFr^-細胞（American Type Culture Collection）にC
ellPhect Transfection kit（Amersham Pharmacia Biot
ech社）を用いて形質導入することにより取得した。は
じめに、蒸留水300 μlに溶解したプラスミドDNA 10 μ
gに対してBuffer A（CellPhect Transfection Kitに添
付）120 μlを添加後撹拌した。10分間静置後、Buffer
B（CellPhect Transfection Kitに添付）240 μlを添加
し、激しく撹拌し該DNAを含有するDNA−リン酸カルシウ
ム複合体を形成させた。 4x 10⁵個のCHO/ dhFr^- 細胞を
60 mmシャーレに植え込み、10％のウシ胎児血清（BIO W
HITTAKER 社）とMEM用非必須アミノ酸を含む Ham's F-1
2培地（日水製薬株式会社）中で37℃、5％炭酸ガス中で
１日間培養した後、該複合体をシャーレの該細胞上に滴
下させた。これを、37℃、5％炭酸ガス中にて7時間培養
した後、血清を含まない Ham's F-12培地で２回細胞を
洗浄し、シャーレの該細胞上に15％グリセロール3 mlを
添加し2分間処理した。これを、再度、血清を含まないH
am'sF-12培地で２回洗浄した後、10％のウシ胎児血清を
含む Ham's F-12培地中で37℃、5％炭酸ガス中で15時間
培養した。該細胞をトリプシン処理により分散させてシ
ャーレから回収し、1.25 x 10⁴個ずつ6穴プレートに植
え込み、透析済み10％ウシ胎児血清（JRH BIOSCIENCES
社）、1 mM MEM非必須アミノ酸溶液、100 units/ml Pen
icillin、100 μg/ml Streptomycinを含む Dulbecco's
Modified Eagle Medium (DMEM) 培地（日水製薬株式会
社）中にて37℃、5％炭酸ガス中にて培養を開始した。
プラスミドの導入された形質転換CHO細胞は該培地中で
生育するが、非導入細胞は次第に死滅していくので、2
日毎に培地を交換して死滅細胞を除去した。培養開始10
-14日後に生育してきた形質転換CHO細胞のコロニーを29
個選択した。それぞれ選択された細胞を24穴プレートに
植え込み、細胞がコンフルエントになった後、培地を10
％ウシ胎児血清（JRH BIOSCIENCES 社）、1 mM MEM非必
須アミノ酸溶液、100 units/ml Penicillin、100 μg/m
l Streptomycinを含む Dulbecco's modified Eagle med
ium 培地（Phenol Red不含、GIBCO社）に交換し3日間培
養した。その後、培養上清を回収し、上記（２−３）の
方法に従って、ZAQ発現CHO細胞でFLIPRによるカルシウ
ムアッセイでZAQ活性化能を測定した。これによりヒト
型Bv8を高発現するZAQL-2発現CHO細胞クローンNo.2（以
後、ZAQL-2/CHO No.4と略称する）を選別した。

【０１６５】（３−３）ヒト型Ｂｖ８ペプチド発現ＣＨ
Ｏ細胞無血清培養上清の調製 透析済み10％ウシ胎児血清（JRH BIOSCIENCES 社）、1
mM MEM非必須アミノ酸溶液、100 units/ml Penicilli
n、100 μg/ml Streptomycinを含む Dulbecco'sModifie
d Eagle Medium (DMEM) 培地（日水製薬株式会社）でSi
ngle Tray(Nunc社)4枚コンフルエントまで培養した ZAQ
L-2/CHO No.4をトリプシン処理して分散後、遠心して回
収した。上記Single Tray 1枚分の細胞を上記培地 1.5
Lに懸濁後、Cell Factories 10（Nunc社）に植え込み、
4基のCell Factories 10について37℃で5％炭酸ガス中
にて3日間培養した。培養上清を除いた後、前述のH/HBS
S1 Lで 1基のCell Factories 10の細胞を洗浄した。H/H
BSSを除いた後、1基のCell Factories 10あたり2 Lの無
血清培地（1 mM MEM非必須アミノ酸溶液、100 units/ml
Penicillin、100 μg/ml Streptomycinを含む Dulbecc
o's Modified Eagle Medium培地）を加えさらに2日間培
養した。回収した培養上清を日立高速遠心機で1,000 rp
mで10分間遠心後、ガーゼを用いてろ過し、清澄な上清
を得た。これに酢酸を最終濃度1 Mになるように添加
し、以下の操作を行った。

【０１６６】（３−４）ヒト型Ｂｖ８ペプチド発現ＣＨ
Ｏ細胞無血清培養上清のオクタドデシル逆相クロマトグ
ラフィーによる粗分画 オクタドデシル基を固定したシリカゲルを充填したPrep
C18（Waters社）をメタノールで膨潤後、ガラス製カラ
ムに充填した（BioRad社製；内径5cm，高さ10cm）。そ
の後、1 M 酢酸で平衡化したカラムに、上記（３−３）
で調製した抽出液を添着した。次にこのカラムを800 m
lの1 M 酢酸で洗浄した。次に、このカラムに1000 mlの
60％ アセトニトリル/0.1％ トリフルオロ酢酸を流し、
目的とする粗ペプチド成分を溶出した。得られた溶出液
を、エバポレーターを用いて濃縮した後、凍結乾燥機
（12EL； VirTis社）にて凍結乾燥した。

【０１６７】（３−５）Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１
８ＨＧ Ｐｒｅｐ逆相高速液体クロマトグラフィーによ
る分離 Wakosil-II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィ
ー用カラム（和光純薬、20mm×250mm）を、40℃にて、
流速 5 ml/minでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸留
水）容量91.7％/Ｂ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/60％
アセトニトリル）容量8.3％を流し平衡化した。上記
（３−４）で得られた凍結乾燥物についてクロマトグラ
フィー操作を行った。即ち、凍結乾燥物を1 M 酢酸36 m
lを加えて溶解し遠心後、その内の1/3を該カラムに添着
した後、流速 5 ml/minで、1分間かけてＡ液容量66.7％
/Ｂ液容量33.3％ まで上昇させ、次いで120分間かけて
Ａ液容量16.7％/Ｂ液容量83.3％まで、Ｂ液濃度を直線
的グラジエントで上昇させた。溶出液を5 mlずつフラ
クション番号をつけて分取した。この操作を３回実施
し、上記（３−４）の凍結乾燥物を処理した。分取フラ
クションより各3 μl を0.2％ BSA 150 μl と混合し、
凍結乾燥機（12EL； VirTis社）で凍結乾燥した。この
乾燥物に、アッセイバッファー〔H/HBSS（ニッスイハン
クス２（日水製薬株式会社） 9.8g、炭酸水素ナトリウ
ム 0.35g、HEPES 4.77 g 、水酸化ナトリウム溶液で pH
7.4に合わせた後、フィルター滅菌処理）に、2.5 mM Pr
obenecid および0.1％ CHAPS を添加したもの〕150 μl
を加えて溶解し、この溶液50 μl を用いて上記（２−
３）の方法に準じ、ZAQ受容体活性化作用を測定した。
その結果、目的とするZAQ受容体活性化作用を有する成
分は、主としてフラクションNo.73-74に溶出されている
ことが判明した。

【０１６８】（３−６）ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−２ＳＷイ
オン交換高速液体クロマトグラフィーによる分離 TSKgel CM-2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー
用カラム（東ソー、4.6mm×250 mm）を25℃にて、流速
1 ml/minでＡ液（4 Mギ酸アンモニウム：蒸留水：アセ
トニトリル = 1 : 299 : 100）容量100％、Ｂ液（4 Mギ
酸アンモニウム：蒸留水：アセトニトリル = 1 : 2 :
1）容量0％を流し平衡化した。上記（３−５）で得られ
たフラクションNo.73-74を凍結乾燥したものをＡ液4 ml
に溶解し、TSKgel CM-2SWイオン交換カラムに添着した
後、流速 2 ml/minで120分間かけてＡ液容量25％／Ｂ液
容量75％まで直線的グラジエントで上昇させ溶出液を回
収した。溶出液を2 mlずつフラクション番号をつけて分
取し、分取フラクションより各2 μl を0.2％ BSA 100
μl と混合し凍結乾燥機（12EL； VirTis社）で凍結乾
燥した。この乾燥物に上記アッセイバッファー 100 μl
を加えて溶解しこれをさらに同バッファーで100倍希釈
し、上記（２−３）の方法に準じ、ZAQ受容体活性化作
用を測定した。その結果、目的とするZAQ受容体活性化
作用を有する成分はフラクションNo.83-85に溶出されて
いることが判明した。

【０１６９】（３−７）ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔ
ｓ逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製 TSKgel ODS-80Ts逆相高速液体クロマトグラフィー用カ
ラム（東ソー、4.6 mmx 100 mm）を、40℃にて、流速 1
ml/minでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸留水）容量
91.7％/Ｂ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/60％ アセトニ
トリル）容量8.3％を流し平衡化した。上記（３−６）
で得られたフラクションNo.83-85の凍結乾燥物について
クロマトグラフィー操作を行った。即ち、凍結乾燥物を
1 M酢酸 2mlを加えて溶解し該カラムに添着した後、流
速 1 ml/minで、1分間かけてＡ液容量75％/Ｂ液容量25
％ まで上昇させ、次いで60分間かけてＡ液容量25％/Ｂ
液容量75％までＢ液濃度を直線的グラジエントで上昇さ
せ溶出液を回収した。溶出液を0.5 mlずつフラクション
番号をつけて分取した。フラクションNo.121-130につい
て各1μlを採取し、上記アッセイバッファーで100倍希
釈し、上記（２−３）の方法に準じ、ZAQ受容体活性化
作用を測定した。その結果、目的とするZAQ受容体活性
化作用を有する成分はフラクションNo.123-125に溶出さ
れていることが判明した。

【０１７０】（３−８）ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ−Ｐ
ｈｅｎｙｌ逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製 TSKgel Super-Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー
用カラム（東ソー、4.6mm x 100 mm）を、40℃にて、流
速 1 ml/minでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸留水）
容量91.7％/Ｂ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/60％ アセ
トニトリル）容量8.3％を流し平衡化した。上記（３−
７）で得られたフラクションNo.123-125についてクロマ
トグラフィー操作を行った。即ち、フラクション溶液を
直接ロードし、該カラムに添着した後、流速 1 ml/min
で、1分間かけてＡ液容量75％/Ｂ液容量25％ まで上昇
させ、次いで60分間かけてＡ液容量25％／Ｂ液容量75％
までＢ液濃度を直線的グラジエントで上昇させ溶出液を
回収した。溶出液を0.5 mlずつフラクション番号をつけ
て分取した。フラクションNo.91-100について各1μlを
採取し、上記アッセイバッファーで100倍希釈し、上記
（２−３）の方法に準じ、ZAQ受容体活性化作用を測定
した。その結果、目的とするZAQ受容体活性化作用を有
する成分はフラクションNo.97-98に溶出されていること
が判明した。

【０１７１】（３−９）ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ−Ｐ
ｈｅｎｙｌ逆相高速液体クロマトグラフィーによる再精
製 TSKgel Super-Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー
用カラム（東ソー、4.6mm x 100 mm）を、40℃にて、流
速 1 ml/minでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸留水）
容量91.7％/Ｂ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/60％ アセ
トニトリル）容量8.3％を流し平衡化した。上記（３−
８）で得られたフラクションNo.97-98についてクロマト
グラフィー操作を行った。即ち、フラクション溶液を直
接ロードし該カラムに添着した後、流速 1 ml/minで、1
分間かけてＡ液容量75％/Ｂ液容量25％ まで上昇させ、
次いで60分間かけてＡ液容量25％／Ｂ液容量75％までＢ
液濃度を直線的グラジエントで上昇させ溶出液を回収し
た。その結果、目的とするZAQ受容体活性化作用を有す
る成分は単一なピークとして溶出された。

【０１７２】（３−１０）精製されたヒト型Ｂｖ８ペプ
チドの構造解析 上記（３−９）で得られたZAQ活性化主成分について、
以下の方法で構造決定を実施した。精製したヒト型Ｂｖ
８ペプチドを凍結乾燥機（12EL；VirTis社）にて凍結乾
燥した。得られたペプチド凍結乾燥物を、ＤＭＳＯ（ジ
メチルスルフォキシド）に溶解した。この溶液の一部を
プロテインシークエンサー(パーキンエルマー社、PE Bi
osystems Procise 491cLC)を用いたＮ末端からのアミノ
酸配列解析に供した。その結果、予想されるヒト型Ｂｖ
８成熟体ペプチド、配列番号：１９で表されるアミノ酸
配列と一致するＮ端アミノ酸配列を得た。また、Finnig
an LCQ LC/MS装置を用いて、エレクトロンスプレーイオ
ン化法により質量分析を行い、分子量が8664.34である
と算定した。本測定値はヒト型Ｂｖ８成熟体ペプチド
（配列番号：１９）の理論値8792.54に比べて128.2小さ
な値となっており、成熟体ペプチドからさらにＣ末端の
Lys残基が脱落したペプチド（配列番号：２２）が取得
できたことが確認された。

【０１７３】参考例４ ヒト型Ｂｖ８ペプチドの反応性
の測定 参考例３で得られた精製ヒト型Ｂｖ８ペプチドの、ＺＡ
Ｑ及びＩ５Ｅ受容体活性化作用を、上記（２−３）に記
載した方法に準じ、測定した。その結果、ＺＡＱレセプ
ター発現ＣＨＯ細胞及びＩ５Ｅレセプター発現ＣＨＯ細
胞において、ヒト型Ｂｖ８ペプチドは濃度依存的に細胞
内カルシウム濃度の上昇を惹起した。また、ヘビ毒ＭＩ
Ｔ１は、ヒト型Ｂｖ８ペプチドに比べて１０倍程度低い
濃度よりＩ５Ｅ受容体活性化作用を現した。結果を〔図
１〕および〔図２〕に示す。

【０１７４】参考例５ ラット型Ｂｖ８ペプチド ｃＤ
ＮＡのクローニング ラット精巣Marathon-Ready cDNA (CLONTECH社)を鋳型と
して、degenerateプライマー BF2（配列番号：２３）と
プライマー BR1（配列番号：２４）を作成し、以下に記
したPCR反応を実施した。 BF2: 5'-GCTTGYGACAAGGACTCYCA-3' (配列番号：２
３) BR1: 5'-GTTYCTACTYCAGAGYGAT-3' (配列番号：２
４) PCR反応液は50X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTEC
H社)を0.4 μl、添付の10x Advantage 2 PCR buffer (4
00 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc)₂, 3
7.5μg/ml BSA, 0.05％Tween-20, 0.05％ Nonidet-P40)
を2μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を1-6μ
l、10μMプライマーBF2及びBR1を 0.4μl、鋳型cDNAを2
μl、及び蒸留水を13.2μlを混合して作製した。反応条
件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-55℃・1分-68℃・
1分のサイクル反応を40回、および68℃・5分の最終伸長
反応とした。得られたDNA断片をTOPO TA Cloning Kit
(Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記載された
方法に従ってクローニングした。クローニングされたDN
Aの塩基配列をABI377DNA sequencerを用いて解読し、配
列番号：２５で表される部分配列を得た。この配列情報
よりプライマー RB5-1（配列番号：２６） とプライマ
ー RB5-3（配列番号：２７）を作成し、以下に記した5'
RACE実験を実施した。 RB5-1: 5'-GTGCATCCTCCGCCCCCAAAATGGAA-3' （配列
番号：２６） RB5-3: 5'-GACAGCGCAGCACATTCCTCCTCCACAC-3' （配列
番号：２７) 5'RACEのPCR反応液は50X Advantage 2 Polymerase Mix
(CLONTECH社)を1μl、添付の10x Advantage 2 PCR buff
er (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mMMg(OA
c)₂, 37.5 μg/ml BSA, 0.05％Tween-20, 0.05％ Nonid
et-P40)を5 μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)
を4 μl、10 μMプライマーRB5-1を 1 μl、10μMプラ
イマーAP1（プライマーAP1はCLONTECH社のMarathon-Rea
dy cDNA Kitに添付のもの）を1 μl、鋳型cDNA（CLONTE
CH社、ラット精巣Marathon-Ready cDNA）を5 μl、及び
蒸留水を33 μlを混合して作製した。反応条件は94℃・1
分の初期変性後、94℃・30秒-72℃・3分のサイクル反応を
5回、94℃・30秒-70℃・3分のサイクル反応を5回、94℃・3
0秒-68℃・3分のサイクル反応を25回行った。続いて、該
PCR反応の反応液を鋳型としてnested PCRを実施した。
反応液は50XAdvantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社)
を1μl、添付の10x Advantage 2 PCR buffer (400 mM T
ricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc)₂, 37.5μg/m
l BSA, 0.05％Tween-20, 0.05％ Nonidet-P40)を5 μ
l、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を4 μl、10
μMプライマーRB5-3を 1 μl、10μMプライマーAP2（プ
ライマーAP2はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに
添付のもの）を1 μl、鋳型cDNA（該PCR反応液50倍希釈
液）を5 μl、及び蒸留水を33 μlを混合して作製し
た。反応条件は94℃・1分の初期変性後、94℃・30秒-68℃
・3分のサイクル反応を35回行った。得られたDNA断片をT
OPO TA Cloning Kit (Invitrogen社)を用いて添付のマ
ニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。
クローニングされたDNAの塩基配列をABI377DNA sequenc
erを用いて解読し、5'端の配列（配列番号：２８）を得
た。

【０１７５】配列番号：２５の情報より、プライマー R
B3-1（配列番号：２９）とプライマーRB3-2（配列番
号：３０）を作成し、以下に記した3'RACE実験を実施し
た。 RB3-1: 5'-GAGACAGCTGCCACCCCCTGACTCGGAA-3' （配
列番号：２９） RB3-2: 5'-GGCGGAGGATGCACCACACTTGTCCCTG-3' （配
列番号：３０） 3' RACEのPCR反応液は50X Advantage 2 Polymerase Mix
(CLONTECH社)を1 μl、添付の10x Advantage 2 PCR bu
ffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35mM Mg(OA
c)₂, 37.5 μg/ml BSA, 0.05％Tween-20, 0.05％ Nonid
et-P40)を5 μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)
を4 μl、10 μMプライマーRB3-1を 1μl、10 μMプラ
イマーAP1（プライマーAP1はCLONTECH社のMarathon-Rea
dy cDNAKitに添付のもの）を1 μl、鋳型cDNA（CLONTEC
H社、ラット精巣Marathon-Ready cDNA）を5 μl、及び
蒸留水を33 μlを混合して作製した。反応条件は94℃・1
分の初期変性後、94℃・30秒-72℃・3分のサイクル反応を
5回、94℃・30秒-70℃・3分のサイクル反応を5回、94℃・3
0秒-68℃・3分のサイクル反応を25回行った。続いて、該
PCR反応の反応液を鋳型としてnested PCRを実施した。
反応液は50XAdvantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社)
を1μl、添付の10x Advantage 2 PCR buffer (400 mM T
ricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc)₂, 37.5μg/m
l BSA, 0.05％Tween-20, 0.05％ Nonidet-P40)を5 μ
l、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を4 μl、10
μMプライマーRB3-2を 1 μl、10 μMプライマーAP2
（プライマーAP2はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA K
itに添付のもの）を1 μl、鋳型cDNA（該PCR反応液50倍
希釈液）を5 μl、及び蒸留水を33 μlを混合して作製
した。反応条件は94℃・1分の初期変性後、94℃・30秒-68
℃・3分のサイクル反応を35回行った。得られたDNA断片
をTOPO TA Cloning Kit (Invitrogen社)を用いて添付の
マニュアルに記載された方法に従ってクローニングし
た。クローニングされたDNAの塩基配列をABI377DNA seq
uencerを用いて解読し、3'端の配列（配列番号：３１）
を得た。

【０１７６】ラット脳Marathon-Ready cDNA (CLONTECH
社)を鋳型として、上記5'RACE及び3'RACEの情報より、
プライマーRBv8-WF1（配列番号：３２)、プライマー RB
v8-WF2（配列番号：３３）、プライマー RBv8-WR1 (配
列番号：３４）およびプライマー RBv8-WR2 (配列番
号：３５）を作成し、以下に記したPCR反応を実施し
た。 RBv8-WF1: 5'-TAACCGCCACCGCCTCCT-3' （配
列番号：３２） RBv8-WF2: 5'-GGGACGCCATGGAGGAC-3' (配列
番号：３３） RBv8-WR1: 5'-CGAGACTTGACAGACATTGTTCAGTG-3' （配
列番号：３４） RBv8-WR2: 5'-TTTCCAGCTCCTGCTTCAGA-3' （配
列番号：３５） PCR反応液はPfuTurbo DNA polymerase(Stratagene社)を
0.6 μl、添付の10x PCR bufferを3 μl、2.5 mM dNTP
mixtureを2.4 μl、10 μMプライマーRBv8-WF1及びRBv8
-WR1を各1.5 μl 、鋳型DNAを3μl、及び蒸留水を18 μ
lを混合して作製した。反応条件は95℃・1分の初期変性
後、95℃・30秒-55℃・30秒-72℃・1分のサイクル反応を35
回、および72℃・5分の最終伸長反応とした。続いて、該
PCR反応の反応液を蒸留水で50倍に希釈したものをを鋳
型としてnested PCRを行った。PCR反応液はPfuTurbo DN
A polymerase (Stratagene社)を0.6μl、添付の10x PCR
bufferを3 μl、2.5 mM dNTP mixtureを2.4 μl、10
μMプライマーRBv8-WF2及びRBv8-WR2を各1.5 μl 、鋳
型DNAを3 μl、及び蒸留水を18μlを混合して作製し
た。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-55℃
・30秒-72℃・1分のサイクル反応を35回、および72℃・5分
の最終伸長反応とした。得られたDNA断片をZero Blunt
TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen社)を用いて添付の
マニュアルに記載された方法に従ってクローニングし
た。クローニングされたDNAの塩基配列をABI377DNA seq
uencerを用いて解読し、配列番号：３６で表される356b
pの塩基配列を有していることが明らかとなった。配列
番号：３６で表わされる塩基配列を有するDNA断片を有
するプラスミドをpRBvと命名した。プラスミドpRBvによ
り大腸菌（Escherichia coli）をトランスフォームさ
せ、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）TOP10/ p
RBvと命名した。このDNA断片の塩基配列を解析した結
果、配列番号：３６で表わされるDNA断片は、配列番
号：３７で表わされるラット型Ｂｖ８前駆体ペプチド(1
07アミノ酸残基）をコードするDNA（配列番号：３８）
を含んでいることが明らかとなった。また、配列番号：
３８で表わされる塩基配列は典型的なシグナル配列を有
しており、配列番号：３８で表わされる塩基配列を有す
るDNAは、配列番号：３９で表わされるラット型Ｂｖ８
成熟体ペプチド（81アミノ酸残基）をコードする243塩
基対からなるDNA（配列番号：４０）を含んでいること
が明らかとなった。

【０１７７】参考例６ ラット脳ｃＤＮＡ由来新規Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質（ｒＺＡＱ１）をコードす
るｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定 ラット全脳cDNAライブラリー（CLONTECH社）を鋳型と
し、２種類のプライマー（配列番号：４１および配列番
号：４２）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応におけ
る反応液の組成は上記cDNAを10分の１量鋳型として使用
し、 Advantage-2cDNApolymerase Mix （CLONTECH社）1
/50量、プライマー各0.2μM、dNTPs 200μM、および酵
素に添付のバッファーを加え、25μｌの液量とした。PC
R反応は、（i）94℃・2分の後、（ii）94℃・20秒、72℃
・１分30秒のサイクルを3回、（iii）94℃・20秒、68℃
・１分30秒のサイクルを3回、（iv）94℃・20秒、62℃・2
0秒、68℃１分のサイクルを36回繰り返し、最後に68℃
・7分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応産物
をTOPO−TAクローニングキット（Invitrogen社）の処方
に従いプラスミドベクターpCR2.1‐TOPO（Invitrogen
社）へサブクローニングした。これを大腸菌DH5αに導
入し、cDNAを持つクローンを，アンピシリンを含むLB寒
天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した
結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
るcDNA（配列番号：４３）を得た。該cDNAの塩基配列か
ら導き出されるアミノ酸配列（配列番号：４４）には、
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と83.7％の相同性
がみられた。このアミノ酸配列を含有する新規Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をrZAQ1と命名した。また配列
番号：４３で表わされる塩基配列を有するDNAを含有す
る形質転換体（大腸菌）については、エシェリヒア コ
リ ( Escherichia coli )DH5α / pCR2.1‐rZAQ1と命名
した。

【０１７８】参考例７ ラット脳ｃＤＮＡ由来 新規Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質（ｒＺＡＱ２）をコード
するｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定 rZAQ2をコードするクローンは、genetrapper法で取得し
た。すなわち、プローブ（配列番号：４５および配列番
号：４６）をビオチン化したのち、一本鎖にしたラット
全脳cDNAライブラリー（GIBCO−BRL社）とハイブリダイ
ゼーションし、得られた一本鎖遺伝子をプライマー（配
列番号：４７および配列番号：４８）を用いて二本鎖に
修復した。この遺伝子を大腸菌DH10Bにエレクトロポー
レーションし、アンピシリン耐性を指標として形質転換
体を得た。さらに、プローブ（配列番号：４５）とプラ
イマー（配列番号：４９）を用いたコロニーPCRで、目
的とする塩基配列をコードするクローンを選択した。こ
のクローンの塩基配列から予測されるORF（open readin
g frame）の塩基配列（配列番号：５０）より導き出さ
れるアミノ酸配列（配列番号：５１）は、rZAQ1と80.6
％の相同性がみられた。このアミノ酸配列を有する新規
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をrZAQ2と命名した。
また、このgenetrapper法で取得した形質転換体（大腸
菌）を、エシェリヒア コリ (Escherichia coli）DH10
B /pCMV-rZAQ2と命名した。

【０１７９】参考例８ 大腸菌でのヒト型Ｂｖ８ペプチ
ド（配列番号：１９）の製造 （１）大腸菌でのヒト型Ｂｖ８ペプチド発現プラスミド
の構築 （a）ヒト型Ｂｖ８の構造遺伝子の調製 ６種のＤＮＡ断片＃１〜＃６（配列番号：６５〜配列番
号：７０）を用いて、ヒト型Ｂｖ８の構造遺伝子を調製
した。 (b)ＤＮＡオリゴマーのリン酸化 ５’側になるべき上記＃１および＃６を除いた４種のＤ
ＮＡオリゴマー（＃２〜＃５）各々を、２５μｌのリン
酸化反応液〔ＤＮＡオリゴマー１０μｇ，５０mＭ Tris
−ＨＣl，pＨ７.６, １０ｍＭ ＭgＣl_２, １ｍＭスペル
ミジン，１０ｍＭ ジチオスレイトール（以後ＤＴＴと
略記），０.１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（以後Ｂ
ＳＡと略記），１ｍＭ ＡＴＰ，１０ユニットＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）〕中で３７℃・１時間
反応させ、各オリゴマーの５'末端をリン酸化した。フ
ェノール処理を行った後、２倍量のエタノールを加え、
−７０℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させた。 (c)ＤＮＡフラグメントの連結 上記（b）で得られたＤＮＡフラグメントと上記＃1およ
び＃６を合わせ、１２０μｌとした。この混合液を９０
℃で１０分間保持した後、室温まで徐冷しアニーリング
を行った後、TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2（宝酒
造）を用いてライゲーション反応を行った。アニーリン
グ液３０μｌにキットに付属のＩＩ液３０μｌを加え、
よく混合した後、キットに付属のＩ液６０μｌを加え、
３７℃・１時間反応させ、ライゲーションを行った。そ
の後、フェノール処理を行ない、水層を回収して２倍量
のエタノールを加え、−７０℃に冷却した後、遠心でＤ
ＮＡを沈殿させた。この様にして得られたＤＮＡフラグ
メントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）によ
るリン酸化を行った後、以下の工程(ｄ)に供した。 (d) ヒト型Ｂｖ８発現ベクターの構築 発現用ベクターとしてはｐＴＣＩＩ（特開2000-178297
号公報に記載）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（宝酒造）
で３７℃・２時間消化した後、１％アガロースゲル電気
泳動により４.３kbのＤＮＡ断片をQIAquick Gel Extrac
tion Kit（キアゲン社）を用いて抽出し、２５μｌのＴ
Ｅ緩衝液に溶解した。このｐＴＣＩＩのＮｄｅＩ、Ｂａ
ｍＨＩ断片と上記により調製したヒト型Ｂｖ８の構造遺
伝子（配列番号：７１）をTaKaRa DNA ligation kit ve
r.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。
この反応液を１０μｌ用いて大腸菌ＪＭ１０９コンピテ
ントセル（東洋紡）を形質転換し、１０μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、３７℃で
１晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニー選ん
だ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QIAprep8
Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミドpＴＣ
ｈ２ＺＡＱを調製した。このヒト型Ｂｖ８ＤＮＡの塩基
配列をアプライドバイオシステムズ社モデル３７７ＤＮ
Ａシーケンサーを用いて確認した。プラスミドpＴＣｈ
２ＺＡＱを大腸菌（Escherichia coli）ＭＭ２９４（Ｄ
Ｅ３）に形質転換し、ヒト型Ｂｖ８発現株Escherichia
coliMM294(DE3)/ pTCh2ZAQを得た。

【０１８０】（２）ヒト型Ｂｖ８ペプチドの製造 上記のEscherichia coli MM294(DE3)/ pTCh2ZAQを５．
０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地・１Ｌ
（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナ
トリウム）を用いて２Ｌ容フラスコ中で３７℃、８時間
振とう培養した。得られた培養液を１９Ｌの主発酵培地
（1-68％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸２水
素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩
化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２
％消泡剤、０．０００２５％硫酸第１鉄、０．０００５
％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％ハイケー
スアミノ）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０
℃で通気攪拌を開始した。培養液の濁度が５００クレッ
ト単位になったところで、イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌになるよ
うに添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了後、
培養液を遠心分離し、約５００ｇの湿菌体を取得し、−
８０℃で保存した。 （３）ヒト型Ｂｖ８ペプチドの活性化 上記（２）で得られた菌体４００ｇに、２００ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ、７Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ８．０）８０
０ｍｌを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０００
０ｒｐｍ、１時間）を行った。上澄液に０．４Ｍアルギ
ニン、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．２ｍＭ ＧＳＳＧ
（酸化型グルタチオン）、１ｍＭ ＧＳＨ（還元型グル
タチオン）（ｐＨ８．０）２０リットルを加えて、４℃
で一晩活性化を行った。 （４）ヒト型Ｂｖ８ペプチドの精製 上記（３）で活性化の終了した再生液をｐＨ６．０に調
整し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し
たＳＰ−セファロースカラム（１１．３ｃｍ×１５ｃ
ｍ）に吸着させた後、６００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出し、ヒト型Ｂｖ８を
含むフラクションをプールした。この画分を５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ
（２１.５ｍｍ×１５０ｍｍＬ）に通液し、吸着、洗浄
した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液
＋１Ｍ ＮaＣl、ｐＨ６．０５）の段階勾配（６０分）
で溶出を行いヒト型Ｂｖ８画分（溶出時間約４０分）を
得た。この画分を、さらに０.１％トリフルオロ酢酸で
平衡化したＣ４Ｐ−５０（２１.５ｍｍＩＤ×３００ｍ
ｍＬ、昭和電工）に通液し、吸着、洗浄した後、２５−
５０％Ｂ（Ｂ：８０％アセトニトリル／ ０.１％トリフ
ルオロ酢酸）の段階勾配（６０分）で溶出を行い、ヒト
型Ｂｖ８画分（溶出時間約３０分）をプールした後、凍
結乾燥を行い、ヒト型Ｂｖ８凍結乾燥粉末約２５ｍｇを
得た。

【０１８１】（５）ヒト型Ｂｖ８ペプチドの特徴決定 （a）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた
分析 上記（４）で得られたヒト型Ｂｖ８を１００ｍＭ ＤＴ
Ｔを添加したSample buffer［Laemmli, Nature, 227, 6
80 (1979)］に懸濁し、９５℃で１分間加熱した後、マ
ルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動を行っ
た。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルー
（Coomassie brilliant blue）で染色した結果、９ｋＤ
ａの位置に単一の蛋白バンドが認められた。このことか
ら、上記（４）で得られた大腸菌由来の組換え型ヒト型
Ｂｖ８の標品は極めて高純度であることが分かった。 （b）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ヒト型Ｂｖ８（配列番号：１９で表されるアミノ酸配列
からなるペプチド）のＤＮＡの塩基配列から推定される
アミノ酸組成と一致した（表２）。

【表２】 （c）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ モデル４９２）を用い
て決定した。その結果、得られたヒト型Ｂｖ８のＤＮＡ
の塩基配列から推定されたヒト型Ｂｖ８のＮ末端アミノ
酸配列と一致した（表３）。

【表３】 （d）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。得られた
ヒト型Ｂｖ８はＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端
アミノ酸と一致した（表４）。

【表４】

【０１８２】（６）ヒト型Ｂｖ８ペプチドの活性測定
（ＦＬＩＰＲを用いた細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の
測定） 上記（４）で得られた純化された大腸菌由来の組換え型
ヒト型Ｂｖ８標品を参考例２（２−３）の方法を用い
て、活性測定（ＦＬＩＰＲを用いた細胞内Ｃａイオン濃
度上昇活性の測定）を行った。その結果、ＣＨＯ細胞由
来の組換え型標品（ヒト型Ｂｖ８の精製品：参考例３）
と同等の活性を有していた。

【０１８３】参考例９ ヒト型ＺＡＱリガンドぺプチド
のｃＤＮＡのクローニング （Ｉ）ＺＡＱを活性化するペプチドの単離 （１）牛乳抽出液の調製 市販の低温殺菌牛乳を用いて、以下の操作を行い抽出液
を調製した。牛乳2 literを高速遠心機（CR26H、R10A型
ローター：日立株式会社）を用いて、10,000 rpm、１５
分間、４℃で遠心し、得られた上清をガーゼでろ過し、
脂質片を取り除いた。上清に最終濃度1 Mになるように
酢酸を加え、４℃にて３０分間攪拌し、次いで高速遠心
機（CR26H、R10A型ローター：日立株式会社）を用いて1
0,000 rpm、１５分間遠心し上清をガーゼでろ過し不溶
物を除去した。上清に撹拌しながら２倍容のアセトンを
加え４℃にて３時間攪拌した。次いで高速遠心機（CR26
H、R10A型ローター：日立株式会社）を用いて10,000 rp
m、１５分間遠心後、得られた上清をガーゼでろ過し不
溶物を除去した。得られた上清をロータリーエバポレー
ターにかけ、アセトンを除去し、最終的に１３５０ｍｌ
まで濃縮した。得られた濃縮液を、６７５ｍｌごとに３
３８ｍｌのジエチルエーテルと混合し、分液ロート中に
て激しく混和し、２相分離後、水相を得た。得られた水
相について同じ操作をさらに１回繰り返し、清澄な水相
を得た。得られた水相を、ロータリーエバポレーターを
用いて８００ｍｌまで濃縮し、最終的な抽出液を得た。 （２）牛乳抽出液のＣ１８逆相クロマトグラフィーによ
る粗分画 オクタデシル基を固定したシリカゲルを充填したカラム
Sep-Pak C18（Waters社）１０ｇをメタノールで膨潤
後、1 M 酢酸で平衡化した。このカラムに、上記（１）
で調製した抽出液（牛乳2 liter分）を添着した。続い
て、このカラムに、１００ｍｌの1 M 酢酸を流しゲルを
洗浄した。次に、このカラムに２００ｍｌの６０％アセ
トニトリル/０．１％トリフルオロ酢酸を流し、目的と
する粗ペプチド成分を溶出した。得られた溶出液を、エ
バポレーターを用いて濃縮した後、凍結乾燥機（12EL；
VirTis社）にて凍結乾燥した。

【０１８４】（３）牛乳抽出液のスルホプロピルイオン
交換クロマトグラフィーによる粗分画 ポリプロピレン製のカラムに100 mM塩酸中で膨潤させた
SP Sephadex C-25（Amersham Pharmacia Biotech 社）
を、容量が２ｍｌになるよう充填し、蒸留水及び2 M ギ
酸アンモニウム(pH 4.0)で洗浄した後、Ｉ液（2 M ギ酸
アンモニウム：アセトニトリル：水＝1:25:74）で平衡
化した。上記（２）で得られた凍結乾燥物をＩ液２０ｍ
ｌに溶解し、SP Sephadex C-25 2 mlにロードした。Ｉ
液１０ｍｌで洗浄後、ＩＩ液（2 M ギ酸アンモニウム：
アセトニトリル：水＝1:2.5:6.5）、ＩＩＩ液（2 M ギ
酸アンモニウム：アセトニトリル：水＝1:1:2）、ＩＶ
液（2 M ギ酸アンモニウム：アセトニトリル：水＝1:0.
5:0.5）各１０ｍｌで順次溶出した。得られたＩ液から
ＩＶ液を、それぞれ凍結乾燥機（12EL； VirTis社）に
て凍結乾燥した。 （４）牛乳抽出液のＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔｓ逆相
高速液体クロマトグラフィーによる分画 TSKgel ODS-80Ts逆相高速液体クロマトグラフィー用カ
ラム（東ソー株式会社、4.6 mm x 25 cm）を、４０℃に
て、流速１ｍｌ／ｍｉｎでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢
酸/蒸留水）容量91.7％/Ｂ液（0.1％トリフルオロ酢酸/
60％アセトニトリル）容量8.3％を流し、平衡化した。
上記（３）で得られたＩ液からＩＶ液の凍結乾燥物を、
それぞれ1 M 酢酸４ｍｌに溶解しクロマトグラフィー操
作に処した。即ち、凍結乾燥物の溶液４ｍｌを当該カラ
ムに添着した後、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、1分間かけて
Ａ液容量６７％／Ｂ液容量３３％まで上昇させ、次いで
４０分間かけてＡ液容量６７％／Ｂ液容量３３％からＡ
液容量０％／Ｂ液容量１００％まで、Ｂ液濃度を直線的
グラジエントで上昇させた。溶出液を、１ｍｌずつフラ
クション番号をつけて分取し、各フラクション2 μlを1
50 μl の0.2％ Bovine Serum Albumin（BSA）/蒸留水
と混合し凍結乾燥した。この乾燥物を後述の（５）に記
した細胞内Ｃａ^２＋イオン濃度上昇活性測定用のアッセ
イ用サンプルとした。

【０１８５】（５）ＦＬＩＰＲを用いた細胞内Ｃａ^２＋
イオン濃度上昇活性の測定 ＺＡＱ安定発現細胞株は以下のようにして調製した。す
なわち、実施例１で得たDH5α／pCR2.1−ZAQCの１クロ
ーンを、アンピシリンを含むＬＢ培地で振とう培養し、
プラスミドpCR2.1−ZAQCを得た。これを制限酵素Ｓａｌ
ＩおよびＳｐｅＩで処理し、ＺＡＱＣをコードするイン
サート部分を切り出した。同様に制限酵素ＳａｌＩおよ
びＳｐｅＩで処理したpAKKO−1.11H（Biochemica et Bi
ophysicaActa 1219 (1994) 251-259）と、当該インサー
ト部分をLigation Express Kit（CLONTECH Laboratori
es， Inc．（CA， USA ））を用いて連結し、大腸菌Ｄ
Ｈ１０Ｂにエレクトロポーレーション法にて導入した。
得られたクローンの有するプラスミドの構造を、制限酵
素処理ならびに配列解析で確認し、正しい構築のものを
ＣＨＯ細胞発現用プラスミドpAK−ZAQCとして使用し
た。このプラスミドpAK−ZAQCをCHO/dhfr^-細胞（Americ
an Type Culture Collection）にCellPhect Transfecti
on kit（Amersham Pharmacia Biotech社）を用いて形質
導入することにより取得した。まず、蒸留水120 μlに
溶解したプラスミドＤＮＡ 4 μgに対してBuffer A（Ce
llPhect Transfection Kitに添付）120 μlを添加し、
撹拌し、１０分間静置後、Buffer B（CellPhect Transf
ection Kitに添付）240 μlを添加し、激しく撹拌し当
該ＤＮＡを含有するＤＮＡ−リン酸カルシウム複合体を
形成させた。 5 x 10⁵個のCHO/ dhfr^- 細胞を６０ｍｍ
シャーレに播き、１０％のウシ胎児血清（BIO WHITTAKE
R 社）を含むHam's F-12培地（日水製薬株式会社）中で
３７℃、５％炭酸ガス中で１日間培養した後、当該ＤＮ
Ａ−リン酸カルシウム複合体の懸濁液480 μl をシャー
レの当該細胞上に滴下させた。これを、３７℃、５％炭
酸ガス中にて６時間培養した後、血清を含まないHam's
F-12培地で２回細胞を洗浄し、シャーレの当該細胞上に
１５％グリセロールを含む緩衝液(140 mM NaCl, 25 mM
HEPES, 1.4 mM Na₂HPO₄, pH7.1) 1.2mlを添加し２分間
処理した。これを、再度、血清を含まないHam's F-12培
地で２回洗浄した後、１０％のウシ胎児血清を含むHam'
s F-12培地中で３７℃、５％炭酸ガス中で一晩培養し
た。当該細胞をトリプシン処理により分散させてシャー
レから回収し、2 x 10⁴ 個ずつ6-well plateに植え込
み、透析済み１０％ウシ胎児血清（JRH BIOSCIENCES
社）、1 mM MEM非必須アミノ酸溶液（大日本製薬株式会
社）、100 units/ml Penicillin、100 μg/ml Streptom
ycinを含むDulbecco's modified Eagle medium（ＤＭＥ
Ｍ）培地（日水製薬株式会社）中にて３７℃、５％炭酸
ガス中にて培養を開始した。プラスミドの導入された形
質転換ＣＨＯ細胞は当該培地中で生育するが、非導入細
胞は次第に死滅していくので、培養開始後２日毎に培地
を交換して死滅細胞を除去した。培養開始８−１０日後
に生育してきた形質転換ＣＨＯ細胞のコロニーを約２１
個選んだ。それぞれ選択された細胞からＲＮＡを市販の
ＲＮＡ単離用キットを用いて回収し、以降公知のＲＴ−
ＰＣＲ法によりＺＡＱを高発現するＺＡＱ発現ＣＨＯ細
胞Ｂ−１番クローン（以後、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞と略称
する）を選別した。また、対照としてＥＴＡ（エンドセ
リンＡ受容体）発現ＣＨＯ細胞２４番クローン（以後Ｅ
ＴＡ２４細胞と略称する。Journal of Pharmacology an
d Experimental Therapeutics, 279巻、675-685頁、199
6年参照）を用いた。上記（４）で得られたアッセイ用
サンプルについて、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞及びＥＴＡ２４
細胞における細胞内Ｃａ^２＋イオン濃度上昇活性の測定
をＦＬＩＰＲ(Molecular Devices社)を用いて行った。
ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞、ＥＴＡ２４細胞共に１０％透析処
理済ウシ胎児血清(以後d FBSとする)を加えたＤＭＥＭ
で継代培養しているものを用いた。ＺＡＱＣ−Ｂ１細
胞、ＥＴＡ２４細胞をそれぞれ15×10⁴cells/mlとなる
ように培地(10％ d FBS-DMEM)に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用9
6穴プレート(Black plate clear bottom、Coster社)に
分注器を用いて各ウェルに200 μlずつ植え込み(3.0×1
0⁴cells/200μl/ウェル)、５％ CO₂インキュベーター中
にて３７℃で一晩培養した後用いた(以後細胞プレート
とする)。H/HBSS（ニッスイハンクス２（日水製薬株式
会社） 9.8g、炭酸水素ナトリウム 0.35g、HEPES4.77 g
、水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、フィ
ルター滅菌処理）20 ml、250 mM Probenecid 200 μ
l、ウシ胎児血清(FBS) 200 μlを混合した。また、Fluo
3-AM（同仁化学研究所）２バイアル(50 μg)をジメチ
ルスルフォキサイド 40 μl、20％ Pluronic acid（Mol
ecular Probes社） 40 μlに溶解し、これを上記H/HBSS
−Probenecid−FBS に加え、混和後、８連ピペットを用
いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル 100 μlず
つ分注し、５％ CO₂インキュベーター中にて３７℃で１
時間インキュベートした(色素ローディング)。上記
（４）で得られたアッセイ用サンプルについて、各フラ
クションに、2.5 mM Probenecid、0.1％ CHAPSを含むH/
HBSS 150 μlを加えて希釈し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレ
ート(V-Bottomプレート、Coster社)へ移した(以後、サ
ンプルプレートとする)。細胞プレートの色素ローディ
ング終了後、H/HBSSに2.5 mM Probenecidを加えた洗浄
バッファーでプレートウォッシャー(Molecular Devices
社)を用いて細胞プレートを４回洗浄し、洗浄後100 μl
の洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプ
ルプレートをＦＬＩＰＲにセットしアッセイを行った
(ＦＬＩＰＲにより、サンプルプレートから50 μlのサ
ンプルが細胞プレートへと移される)。その結果、上記
（３）IV液を上記（４）逆相高速液体クロマトグラフィ
ー分離して得られたフラクションNo.53にＺＡＱＣ−Ｂ
１細胞に特異的な細胞内Ｃａ^{２ ＋}イオン濃度上昇活性が
見られた。

【０１８６】（６）ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ−Ｐｈｅ
ｎｙｌ逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製 TSKgel Super-Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー
用カラム（東ソー株式会社、 0.46 cm x 10 cm）を、４
０℃にて、流速１ｍｌ／ｍｉｎでＡ液（0.1％トリフル
オロ酢酸/蒸留水）容量91.7％/Ｂ液（0.1％ トリフルオ
ロ酢酸/60％ アセトニトリル）容量8.3％を流し平衡化
した。上記（４）で得られたフラクションNo.53につい
てクロマトグラフィー操作を行った。即ち、フラクショ
ンNo.53の溶液１ｍｌを当該カラムに添着した後、流速
１ｍｌ／ｍｉｎで、１分間かけてＡ液容量７５％／Ｂ液
容量２５％まで上昇させ、次いで７５分間かけてＡ液容
量６７％／Ｂ液容量３３％まで、Ｂ液濃度を直線的グラ
ジエントで上昇させた。溶出液を、500 μlずつフラク
ションNo.をつけて分取した。分取フラクションより各2
5 μlづつ0.2％ BSA 150 μlと混合し凍結乾燥機（12E
L； VirTis社）で凍結乾燥させた。この乾燥物に、2.5
mM Probenecid、 0.1％ CHAPSを含むH/HBSS 150 μl を
加えて溶解し、この溶液50 μlを用いて上記（５）の試
験法により、細胞内Ｃａ^２＋イオン濃度上昇活性を測定
することにより、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞に対する受容体活
性化作用を測定した。その結果、目的とするＺＡＱＣ−
Ｂ１細胞に対する受容体活性化作用を有する成分、すな
わち、ＺＡＱ活性化成分は、主としてフラクションNo.1
03-105に溶出されていることが判明した。 （７）μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＴ ４．６／１００逆
相高速液体クロマトグラフィーによる精製 μRPC C2/C18 ST 4.6/100逆相高速液体クロマトグラフ
ィー用カラム（Amersham Pharmacia Biotech社、 0.46
cm x 10 cm）を、４０℃にて、流速１ｍｌ／ｍｉｎでＡ
液（ヘプタフルオロ酪酸/蒸留水）容量９５％/Ｂ液（0.
1％ヘプタフルオロ酪酸/100％ アセトニトリル）容量５
％を流し平衡化した。上記（６）で得られたTSKgel Sup
er-Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー分取フラク
ションのうちフラクションNo.103-105をそのままμRPC
C2/C18 ST 4.6/100逆相カラムに添着した後、流速１ｍ
ｌ／ｍｉｎで１分間でＡ液（0.1％ ヘプタフルオロ酪酸
/蒸留水）容量９５％／Ｂ液（0.1％ ヘプタフルオロ酪
酸/100％ アセトニトリル）容量５％からＡ液容量６５
％／Ｂ液容量３５％まで急速に上昇させ、これを次に、
流速１ｍｌ／ｍｉｎで、６０分間かけてＡ液容量５０％
／Ｂ液容量５０％まで直線的グラジエントで上昇させ溶
出液を回収した。溶出液は、２１０ｎｍの紫外吸収では
単一なピークとして検出された。溶出液を、500 μlず
つフラクション番号をつけて分取し、分取フラクション
より各10 μlづつを0.2％ BSA 150 μlと混合し凍結乾
燥機（12EL；VirTis社）で凍結乾燥させた。この乾燥物
に、2.5 mM Probenecid、 0.1％ CHAPSを含むH/HBSS 75
μlを加えて溶解し、この溶液50 μlを用いて上記
（５）の試験法により、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞に対する受
容体活性化作用を測定した。その結果、目的とするＺＡ
ＱＣ−Ｂ１細胞に対する受容体活性化作用を有する成
分、すなわち、ＺＡＱ活性化成分は、フラクションNo.8
2-84に溶出されていることが判明した。この活性ピーク
は、２１０ｎｍの紫外吸収ピークに完全に一致し、単一
ペプチドにまで精製されたものと判断した。 （８）精製されたＺＡＱ活性化ペプチドの構造解析 上記（７）で得られたＺＡＱ活性化成分について以下の
方法で構造決定を実施した。ＺＡＱ活性化成分精製標品
を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を溶媒ＤＭＳＯ（ジ
メチルサルフォキシド）に溶解した。この溶液の一部を
プロテインシークエンサー(パーキンエルマー社、PE Bi
osystems Procise 491cLC)を用いたＮ末端からのアミノ
酸配列解析に供した。その結果、Ｎ末端のアミノ酸残基
から１6番目のアミノ酸残基のうち、１４残基を同定す
ることができた（Ala Val Ile Thr Gly Ala Xaa Glu Ar
g Asp Val Gln Xaa Arg Ala Gly （配列番号：７２；Xa
aは未同定残基））。

【０１８７】(II）ヒト型ＺＡＱリガンドぺプチドのｃ
ＤＮＡのクローニング 上記（Ｉ）で得られた牛乳から精製されたＺＡＱを活性
化するペプチドのＮ末端アミノ酸配列（配列番号：７
２）をクエリーとしてデータベースをＢｌａｓｔ検索し
たところ、配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列を
有するペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と同等な
配列を含むヒトＥＳＴ（Ｘ４０４６７）を見出した。本
配列は完全長のオープンリーディング・フレームを有し
ていなかったので、以下にＲＡＣＥ法により未確定部分
の配列を明らかにし、引き続いて完全長のオープンリー
ディング・フレームを有すｃＤＮＡクローンを取得し
た。ＥＳＴ（Ｘ４０４６７）の情報よりプライマーＺＦ
１（配列番号：７３）、ＺＦ２（配列番号：７４）とＺ
Ｆ３（配列番号：７５）を作成し、ヒト精巣Marathon-R
eady cDNA （CLONTECH社）を鋳型として以下に記した3'
RACE実験を実施した。 ZF1: 5'-GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3' (配列番
号：７３) ZF2: 5'-GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3' (配列番
号：７４) ZF3: 5'-CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3' (配列番
号：７５) 3'RACEのＰＣＲ反応液は50 x Advantage 2 Polymerase
Mix （CLONTECH社）を1 μl、添付の10 x Advantage 2
PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM
Mg(OAc)₂ , 37.5μg/ml BSA, 0.05％Tween-20, 0.05％
Nonidet-P40)を5 μl、dNTP mixture (2.5 mM each,
宝酒造)を4 μl、10 μMプライマーZF1を 1 μl、10 μ
MプライマーAP1（プライマーAP1はCLONTECH社のMaratho
n-ReadycDNA Kitに添付のもの）を1 μl、鋳型ｃＤＮＡ
（CLONTECH社、ヒト精巣Marathon-Ready cDNA）を5 μ
l、及び蒸留水を33 μlを混合して作製した。反応条件
は94℃・60秒の初期変性後、94℃・30秒-72℃・4分のサイ
クル反応を5回、94℃・30秒-70℃・4分のサイクル反応を5
回、94℃・30秒-68℃・44分のサイクル反応を25回行っ
た。続いて、当該ＰＣＲ反応の反応液を鋳型としてnest
ed PCRを実施した。反応液は50 x Advantage 2 Polymer
ase Mix （CLONTECH社）を1 μl、添付の10 x Advantag
e 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 3
5 mM Mg(OAc)₂, 37.5μg/ml BSA, 0.05％Tween-20, 0.0
5％ Nonidet-P40)を5 μl、dNTP mixture (2.5 mM eac
h, 宝酒造)を4 μl、10 μMプライマーZF2を 1 μl、10
μMプライマーAP2（プライマーAP2はCLONTECH社のMara
thon-Ready cDNA Kitに添付のもの）を1 μl、鋳型ＤＮ
Ａ（当該ＰＣＲ反応液５０倍希釈液）を5 μl、及び蒸
留水を33 μlを混合して作製した。反応条件は94℃・60
秒の初期変性後、94℃・30秒-72℃・４分のサイクル反応
を５回、94℃・30秒-70℃・４分のサイクル反応を５回、9
4℃・30秒-68℃・44分のサイクル反応を２５回行った。さ
らに続いて、当該ＰＣＲ反応の反応液を鋳型として2回
目のnested PCRを実施した。反応液は50 x Advantage 2
Polymerase Mix （CLONTECH社）を1 μl、添付の10 x
Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM
KOAc, 35 mM Mg(OAc)₂ , 37.5μg/ml BSA, 0.05％Twee
n-20, 0.05％ Nonidet-P40)を5 μl、dNTP mixture (2.
5 mM each, 宝酒造)を4 μl、10 μMプライマーZF3を 1
μl、10 μMプライマーAP2（プライマーAP2はCLONTECH
社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付のものを用い
た。）を1 μl、鋳型ＤＮＡ（当該ＰＣＲ反応液50倍希
釈液）を5 μl、及び蒸留水を33 μlを混合して作製し
た。反応条件は94℃・60秒の初期変性後、94℃・30秒-72
℃・4分のサイクル反応を5回、94℃・30秒-70℃・4分のサ
イクル反応を5回、94℃・30秒-68℃・44分のサイクル反応
を25回行った。得られたＤＮＡ断片をTOPO TA Cloning
Kit (Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記載さ
れた方法に従ってクローニングした。クローニングされ
たＤＮＡの塩基配列をABI377DNA sequencerを用いて解
読し、3'端配列（配列番号：７６）を得た。配列番号：
７６で表わされる塩基配列及びＥＳＴ（Ｘ４０４６７）
の情報によりプライマーZAQL-CF（配列番号：７７）及
びZAQL-XR1（配列番号：７８）を作成した。ヒト精巣Ma
rathon-Ready cDNA （CLONTECH社）を鋳型としてプライ
マーZAQL-CF とZAQL-XR1を用いてＰＣＲを実施した。 ZAQL-CF: 5'-CCACCATGAGAGGTGCCACG-3' (配列番号：
７７) ZAQL-XR1: 5'-CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3' (配列
番号：７８) ＰＣＲ反応液はPfuTurbo DNA polymerase(Stratagene
社)を1 μl、添付の10 xPCR bufferを5 μl、2.5 mM dN
TP mixtureを4 μl、10 μMプライマーZAQL-CF及びZAQL
-XR1を各2.5 μl、鋳型ＤＮＡを5μl、及び蒸留水を30
μlを混合して作製した。反応条件は95℃・1分の初期変
性後、95℃・1分-60℃・1分-72℃・1分のサイクル反応を40
回、および72℃・10分の最終伸長反応とした。得られた
ＤＮＡ断片をTOPO TA Cloning Kit (Invitrogen社)を用
いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクロー
ニングした。クローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列
をABI 377 DNA sequencerを用いて解読した結果、３７
１ｂｐの、それぞれ配列番号：７９および配列番号：８
０で表わされる塩基配列を有していることが明らかとな
った。配列番号：７９で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡ断片を有するプラスミドをpHMITAと、配列番号：
８０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有す
るプラスミドをpHMITGと命名した。プラスミドpHMITA及
びpHMITGにより大腸菌（Escherichia coli）を形質転換
し、それぞれエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
TOP10/pHMITAおよびエシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）TOP10/pHMITGと命名した。これらのＤＮＡ断片の
塩基配列を解析した結果、配列番号：７９で表わされる
ＤＮＡ断片は、配列番号：８３で表わされるヒト型ＺＡ
Ｑリガンド前駆体ペプチド(Aタイプ、105アミノ酸残基)
をコードするＤＮＡ（配列番号：８９）を含んでおり、
配列番号：８０で表わされるＤＮＡ断片は、配列番号：
８４で表わされるヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド
(Ｇタイプ、１０５アミノ酸残基)をコードするＤＮＡ
（配列番号：９０）を含んでいることが明らかとなっ
た。また、配列番号：８９および配列番号：９０で表わ
される塩基配列は典型的なシグナル配列を有しており、
配列番号：８９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
は、配列番号：８１で表わされるヒト型ＺＡＱリガンド
成熟体ペプチド(Ａタイプ、８６アミノ酸残基)をコード
する２５８塩基対からなるＤＮＡ（配列番号：８７）を
含んでおり、配列番号：９０で表わされる塩基配列を含
有するＤＮＡは、配列番号：８２で表わされるヒト型Ｚ
ＡＱリガンド成熟体ペプチド(Ｇタイプ、８６アミノ酸
残基)をコードする２５８塩基対からなるＤＮＡ（配列
番号：８８）を含んでいることが明らかとなった。

【０１８８】参考例１０ ヒト型ＺＡＱリガンドペプチ
ドの哺乳動物細胞での産生（１） （１）ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド哺乳動物細
胞発現ベクターの構築 参考例９（II）において取得したプラスミドpHMITGから
ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ制限酵素消化によってヒト型ＺＡ
Ｑリガンド前駆体ペプチドをコードするｃＤＮＡを含む
３８２ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：９１）を切出し
た。すなわち、プラスミドpHMITGをＥｃｏＲＩおよびＸ
ｈｏＩで酵素消化し、得られたＤＮＡを１．５％アガロ
ースゲルを用いて電気泳動し、サイバーグリーン染色さ
れる約３８２ｂｐのバンドを含むゲル片を剃刀で切り取
った。当該ゲル片よりGene Clean spin DNA抽出キット
（BIO 101社）を用いてＤＮＡ断片を回収した。得られ
たＤＮＡ断片をCMV-IEエンハンサーおよびchicken beta
-actin promoterを発現プロモーターとする哺乳動物細
胞発現ベクターpCAN618に対してＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ
制限酵素切断部位に定法に従ってクローニングした。ク
ローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列を前述の方法に
より解読した結果、配列番号：９１で表わされる塩基配
列を有していることが確認された。このヒト型ＺＡＱリ
ガンド前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを含有する哺
乳動物細胞発現ベクターをpCANZAQLg2と命名した。

【０１８９】（２）ＣＯＳ７細胞への発現ベクターの導
入 ＣＯＳ７細胞はＡＴＣＣより購入し、ＤＭＥＭ培地（１
０％ FBSを加えたもの）を用いて継代培養しているもの
を用いた。ＤＭＥＭ培地を用いてＣＯＳ７細胞を1.5×1
0⁶cells/dishとなるよう１０ｃｍシャーレにまき、３７
℃、５％ CO₂インキュベーター中で一晩培養した。ヒト
型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド発現プラスミド（pCAN
ZAQLg2）2μg（2μlのTEバッファーに溶解）にバッファ
ーＥＣ（Effectene transfection reagent、QIAGEN）29
8μlを加え、さらにEnhancer 16μlを加え、１秒間混和
後室温で３分間放置した。さらにEffectene Transfecti
on Reagent 60μlを加え、１０秒間混和後室温で１０分
間放置した。前日にまいた細胞の上清を除き、ＤＭＥＭ
培地１０ｍｌで１回洗浄し、ＤＭＥＭ培地を９ｍｌを加
えた。プラスミド溶液にＤＭＥＭ培地１ｍｌを加えて混
和後細胞に滴下し、全体を混ぜた後３７℃、５％ CO₂イ
ンキュベーター中で一晩培養した。ＤＭＥＭ培地１０ｍ
ｌで２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを加え、３７
℃、５％ CO₂インキュベーター中で一晩培養した。２日
後、培養上清を回収した。

【０１９０】（３）ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチ
ド発現ＣＯＳ７細胞培養上清からのＺＡＱを活性化する
ペプチドの部分精製 （３−１）ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド発現Ｃ
ＯＳ７細胞培養上清抽出液の調製 ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド発現ＣＯＳ７細胞
培養上清を回収し、以下の操作を行い抽出液を調製し
た。先ず、細胞培養上清（約18.5ml）に終濃度が1 Mに
なるように酢酸１．１ｍｌを滴下し、一時間攪拌した。
さらにその２倍容量のアセトンを加え、４℃にて３０分
間攪拌し、次いで高速遠心機（CR26H、23型ローター：
日立株式会社）を用いて15,000 rpm、３０分間遠心し上
清を得た。得られた上清をエバポレーターにかけ、アセ
トンを除去した後、凍結乾燥機（１２ＥＬ； VirTis
社）にて凍結乾燥した。 （３−２）ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド発現Ｃ
ＯＳ７細胞培養上清のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ゲルろ
過クロマトグラフィー及びＳｅｐＰａｋカラムクロマト
グラフィー 上記（３−１）で得られた凍結乾燥粉末を１Ｍ酢酸２ｍ
ｌに溶解後、１Ｍ酢酸で平衡化したSephadex G15 (直径
３cm、35ml、Pharmacia Biotech 社)カラムに吸着させ
た後、１Ｍ酢酸をカラムに流し、溶出液を５ｍｌづつフ
ラクションNo.をつけて分取し、凍結乾燥機（１２Ｅ
Ｌ； VirTis社）で凍結乾燥させた。SepPak C18-5gカラ
ム（10ml）を、メタノールにて膨潤後、0.1％ トリフル
オロ酢酸/蒸留水を流し、平衡化した。Sephadex G50ゲ
ルろ過クロマトグラフィー分取フラクションのうちフラ
クションNo.1-16の凍結乾燥品をまとめて0.1％トリフル
オロ酢酸/蒸留水 3mlに溶解し、SepPak C18-5gカラムに
添着した後、0.1％トリフルオロ酢酸/蒸留水 24mlで洗
浄後、0.1％ トリフルオロ酢酸/60％ アセトニトリル20
mlで溶出した。得られた溶出液をサーバントにかけた。

【０１９１】（３−３）Ｓｕｐｅｒ ＯＤＳ逆相高速液
体クロマトグラフィーによる精製 TSKgel Super ODS逆相高速液体クロマトグラフィー用カ
ラム（東ソー株式会社、 0.46 cm x 10 cm）を、40℃に
て、流速1 ml/minでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸
留水）を流し、平衡化した。（５−３−２）で得られた
SepPak C18-5gカラムフラクションをサーバントにかけ
た後、Super ODS逆相高速液体クロマトグラフィーに添
着し、流速 １ml/minで60分間で Ａ液（0.1％ トリフル
オロ酢酸/蒸留水）容量100％／Ｂ液（0.1％ トリフルオ
ロ酢酸/60％ アセトニトリル）容量0％からＡ液容量0％
／Ｂ液容量100％まで直線的グラジエントで上昇させ、
溶出液を回収した。溶出液を、1 mlずつフラクションN
o.をつけて分取し、分取フラクション全量を凍結乾燥機
（１２ＥＬ； VirTis社）で凍結乾燥させた。この乾燥
物にH/HBSSに2.5mM Probenecid 、0.2％ BSAを加えたも
の150μlを加えて溶解し、この溶液を用いて下記（３−
４）の試験法により、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞に対する受容
体活性化作用を測定した。 （３−４）ＦＬＩＰＲを用いた細胞内Ｃａ^２＋イオン濃
度上昇活性の測定 上記（３−３）で得られたサンプルについて、参考例９
（Ｉ)(５）で得られたＺＡＱ発現細胞（ＺＡＱＣ−Ｂ
１）における細胞内Ｃａ^２＋イオン濃度上昇活性の測定
をＦＬＩＰＲを用いて行った。また、対照としてhOT7T1
75発現細胞(hOT7T175-16；ＷＯ００／２４８９０に記
載)を用いた。ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞、hOT7T1751-6細胞共
に１０％透析処理済ウシ胎児血清(以後d FBSとする)を
加えたＤＭＥＭで継代培養しているものを用いた。ＺＡ
ＱＣ−Ｂ１細胞、hOT7T1751-6細胞をそれぞれ15×10⁴ce
lls/mlとなるように培地(10％dFBS-DMEM)に懸濁し、Ｆ
ＬＩＰＲ用96穴プレート(Black plate clear bottom、C
oster社)に分注器を用いて各ウェルに200μlずつ播き
(3.0×10⁴cells/200μl/ウェル)、５％ CO₂インキュベ
ーター中で３７℃で一晩培養した後、用いた(以後細胞
プレートとする)。H/HBSS(HANKS' 9.8g、炭酸水素ナト
リウム 0.35g、HEPES 4.77 g 、水酸化ナトリウムで pH
7.4に合わせた後、フィルター滅菌処理)21ml、250mM Pr
obenecid 210μl、ウシ胎児血清（ＦＢＳ） 210μlを
混合した。また、Fluo3-AM 2バイアル(50μg)をジメチ
ルスルフォキサイド 42μl、20％ Pluronicacid 42μl
に溶解し、これを上記H/HBSS−Probenecid−FBS に加
え、混和後、8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞
プレートに各ウェル 100μlずつ分注し、５％ CO₂イン
キュベーター中で３７℃で１時間インキュベートした
(色素ローディング)。上記（５−３−３）で得られたア
ッセイ用サンプルについて、各フラクションにH/HBSSに
2.5mM Probenecid 、0.2％ BSAを加えたもの150μlを加
えて溶解し、ＦＬＩＰＲ用96穴プレート(V-Bottomプレ
ート、Coster社)へ移した(以後、サンプルプレートとす
る)。細胞プレートの色素ローディング終了後、H/HBSS
に2.5mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレート
ウォッシャー(Molecular Devices社)を用いて細胞プレ
ートを４回洗浄し、洗浄後100μlの洗浄バッファーを残
した。この細胞プレートとサンプルプレートをＦＬＩＰ
Ｒにセットし、アッセイを行った(ＦＬＩＰＲにより、
サンプルプレートから0.05mlのサンプルが細胞プレート
へと移される)。フラクションNo.48-68にＺＡＱＣ−Ｂ
１細胞特異的な細胞内Ｃａ^２＋イオン濃度上昇活性が見
られた。このことから、目的とするＺＡＱＣ−Ｂ１細胞
に対する受容体活性化作用を有する成分、すなわち、Ｚ
ＡＱ活性化成分は、フラクションNo.48-68に溶出されて
いることが判明した。

【０１９２】参考例１１ ヒト型ＺＡＱリガンドペプチ
ドの哺乳動物細胞での産生（２） （１）培養上清の調製 参考例１０に記載した方法でＣＯＳ７細胞にヒト型ＺＡ
Ｑリガンド前駆体ペプチド発現プラスミド（pCANZAQLg
2）を導入した。すなわち、ＤＭＥＭ培地を用いてＣＯ
Ｓ７細胞を3.0×10⁶cells/dishとなるよう15cmシャーレ
にまき、３７℃、５％ CO₂インキュベーター中で一晩培
養した。ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド発現プラ
スミド（pCANZAQLg2）４μg（４μlのＴＥバッファーに
溶解）にバッファーＥＣ（Effectene transfection rea
gent、QIAGEN）600μlを加え、さらにEnhancer 32μlを
加え、１秒間混和後室温で３分間放置した。さらにEffe
ctene Transfection Reagent 120μlを加え、１０秒間
混和後室温で１０分間放置した。前日にまいた細胞の上
清を除き、ＤＭＥＭ培地１０ｍｌで１回洗浄し、ＤＭＥ
Ｍ培地を３０ｍｌを加えた。プラスミド溶液にＤＭＥＭ
培地１ｍｌを加えて混和後細胞に滴下し、全体を混ぜた
後３７℃、５％ CO₂インキュベーター中で一晩培養し
た。ＤＭＥＭ培地１０ｍｌで１回洗浄し、ＤＭＥＭ培地
２０ｍｌを加え、３７℃、５％ CO₂インキュベーター中
で一晩培養した。１日後、培養上清を回収し、さらにＤ
ＭＥＭ培地２０ｍｌを加え、３７℃、５％ CO₂インキュ
ベーター中で一晩培養した後培養上清を回収した。 （２）培養上清からのヒト型ＺＡＱリガンドペプチドの
精製 上記（１）に記載した方法で１５ｃｍシャーレ８０枚分
の培養上清を回収し、これに酢酸を終濃度１Ｍになるよ
うに添加した。１時間攪拌した後、２倍容のアセトンを
添加し蛋白質を析出させた。４℃にて３０分間攪拌し、
次いで高速遠心機（CR26H、RR10A 型ローター：日立株
式会社）を用いて10,000 rpm、３０分間遠心し上清を得
た。得られた上清をエバポレーターにかけアセトンを除
去し、あらかじめ0.1％トリフルオロ酢酸/蒸留水で平衡
化した逆相カラム（Waters社C18、100 g）に流した。0.
1％トリフルオロ酢酸/蒸留水 1000ml、次いで0.1％トリ
フルオロ酢酸/20％アセトニトリル1000mlでカラムを洗
浄した後、0.1％トリフルオロ酢酸/60％アセトニトリル
1000mlでペプチドを溶出した。得られた溶出液をエバポ
レーターにかけた後、凍結乾燥器（１２ＥＬ； VirTis
社）にて凍結乾燥した。TSKgel ODS80TM逆相高速液体ク
ロマトグラフィー用カラム（東ソー株式会社、21.5 mm
x 30 cm）を、４０℃にて、流速４ｍｌ／ｍｉｎでＡ液
（0.1％トリフルオロ酢酸/蒸留水）を流し、平衡化し
た。得られた凍結乾燥粉末をＡ液に溶解した後、当該OD
S80TMカラムに添着し、流速４ｍｌ／ｍｉｎで１２０分
間に Ａ液（0.1％トリフルオロ酢酸/蒸留水）容量６０
％／Ｂ液（0.1％トリフルオロ酢酸/60％アセトニトリ
ル）容量４０％からＡ液容量０％／Ｂ液容量１００％ま
で直線的グラジエントで上昇させて、ペプチドを溶出さ
せた。溶出液を、８ｍｌずつフラクションNo.をつけて
分取し、分取フラクションから50 μlを取り凍結乾燥機
（１２ＥＬ； VirTis社）で凍結乾燥させた。この乾燥
物にH/HBSSに2.5mM Probenecid 、0.2％ BSAを加えたも
の200μlを加えて溶解し、この溶液を用いて上記（５−
３−４）の試験法により、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞に対する
受容体活性化作用を測定した。その結果、目的とするＺ
ＡＱＣ−Ｂ１細胞に対する受容体活性化作用を有する成
分、すなわち、ＺＡＱ活性化成分は、フラクションNo.
32に溶出されていることが判った。TSKgel CM-2SWイオ
ン交換高速液体クロマトグラフィー用カラム（東ソー株
式会社、4.6 mm x 25 cm）を、２５℃にて、流速１ｍｌ
／ｍｉｎでＡ液（10 mMぎ酸アンモニウム/10％アセトニ
トリル）を流し、平衡化した。上記フラクションNo.32
を当該CM-2SWカラムに添着し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで60
分間にＡ液（10 mMぎ酸アンモニウム/10％ アセトニト
リル）容量１００％／Ｂ液（1000 mMぎ酸アンモニウム/
10％ アセトニトリル）容量０％からＡ液容量０％／Ｂ
液容量１００％まで直線的グラジエントで上昇させて、
ペプチドを溶出させた。溶出液を、１ｍｌずつフラクシ
ョンNo.をつけて分取し、分取フラクションから1.5 μl
を取り、これをH/HBSSに2.5mM Probenecid 、0.2％ BSA
200μl希釈し、この溶液を用いて上記（５−３−４）
の試験法により、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞に対する受容体活
性化作用を測定した。その結果、目的とするＺＡＱＣ−
Ｂ１細胞に対する受容体活性化作用を有する成分、すな
わち、ＺＡＱ活性化成分は、フラクションNo. 56および
57に溶出されていることが判った。TSKgel Super pheny
l逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム（東ソー株
式会社、4.6 mm x 10 cm）を、４０℃にて、流速１ｍｌ
／ｍｉｎでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸留水）を
流し、平衡化した。上記フラクション No.56および57
を当該Super phenylカラムに添着し、流速１ｍｌ／ｍｉ
ｎで６０分間にＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸留
水）容量７０％／Ｂ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/60％
アセトニトリル）容量３０％からＡ液容量５０％／Ｂ液
容量５０％まで直線的グラジエントで上昇させて、ペプ
チドを溶出させた。溶出液を、１ｍｌずつフラクション
No.をつけて分取し、分取フラクションから1.5 μlを取
り、これをH/HBSSに2.5mM Probenecid 、0.2％ BSA 200
μl希釈し、この溶液を用いて参考例１０の試験法によ
り、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞に対する受容体活性化作用を測
定した。その結果、目的とするＺＡＱＣ−Ｂ１細胞に対
する受容体活性化作用を有する成分、すなわち、ＺＡＱ
活性化成分は、フラクションNo. 54、 55および56に溶
出されていることが判った。本活性は単一な紫外吸収ピ
ークと一致し、活性成分が単一にまで精製されたものと
判断した。ＺＡＱ活性化成分精製標品中の溶媒を凍結乾
燥して除去し、得られた凍結乾燥物を溶媒ＤＭＳＯ（ジ
メチルサルフォキシド）に溶解した。この溶液の一部
（約7.5 pmol）をプロテインシークエンサー(パーキン
エルマー社、PE Biosystems Procise 491cLC)を用いた
Ｎ末端アミノ酸配列解析に供した。その結果、Ｎ末端の
アミノ酸残基から１０番目のアミノ酸残基のうち、９残
基を同定することができた（Ala Val Ile Thr Gly Ala
Xaa Glu Arg Asp （配列番号：９２；Xaaは未同定残
基））。得られたアミノ酸配列は、予想されるヒト型Ｚ
ＡＱリガンド成熟体ペプチドのＮ端アミノ酸配列と一致
した。また、ＺＡＱ活性化成分精製標品の質量分析を F
innigan LCQ LC/MS装置(Thermoquest, San Jose, CA)を
用いて、エレクトロスプレーイオン化法により実施し、
分子量が9657.6であることを確認した。これは１０個の
システイン残基がすべてジスルフィド結合を形成した８
６残基のヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチド（配列番
号：８２）の理論値9657.3に良く一致し、ＺＡＱ活性化
成分精製標品が、配列番号：８２で表わされるアミノ酸
配列を有するヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドを有
していることが確認された。 （３）精製ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドのＺＡＱ活性
化作用の測定 上記（２）で精製したヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプ
チドのＺＡＱＣ−Ｂ１細胞に対する受容体活性化作用を
参考例１０の試験法により測定した。その結果、ＺＡＱ
発現ＣＨＯ細胞（ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞）においてヒト型
ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドは濃度依存的に細胞内カ
ルシウム濃度の上昇を惹起した。ＥＣ_{５ ０}値は96 pM
で、ヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドは非常に強い
アゴニスト活性を示すことが明らかとなった。結果を
〔図３〕に示す。

【０１９３】参考例１２ ヒト型ＺＡＱリガンドペプチ
ドの哺乳動物細胞での産生（３） （１）ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド安定発現ＣＨＯ細
胞株の樹立 参考例９（II）に記載したプラスミドpHMITGを鋳型とし
て下記のプライマー 5'GTCGACCACCATGAGAGGTGCCACGC 3' （配列番号：９
３） 5'ACTAGTCGCAGAACTGGTAGGTATGG 3' （配列番号：９
４） を用いてヒト型ＺＡＱリガンドｃＤＮＡをＰＣＲ増幅
し、pCR Blunt IIベクター（Invitrogen社）にクローニ
ングした。得られた正しい配列を有するクローンからイ
ンサートｃＤＮＡをＳａｌＩ及びＳｐｅＩ制限酵素を用
いて切り出し、pAKKO1.11H発現ベクターに組み込んだ。
当該プラスミドをCHO/dhFr⁻細胞（AmericanType Cultu
re Collection）に、参考例９に記載したCellPhect Tra
nsfection kit（Amersham Pharmacia Biotech社）を用
いた方法に従って形質導入した。形質導入株数クローン
から培養上清を回収し、参考例９に記載した試験方法に
より、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞の細胞内Ｃａ^２＋イオン濃度
を上昇させるＺＡＱリガンド活性を測定した。これによ
りＺＡＱリガンドを高発現するＺＡＱＬ−１発現ＣＨＯ
細胞クローンNo.4を選別した。 （２）ヒト型ＺＡＱリガンド（ＺＡＱＬ−１）発現ＣＨ
Ｏ細胞無血清培養上清の調製 透析済み10％ウシ胎児血清（JRH BIOSCIENCES 社）、1
mM MEM非必須アミノ酸溶液、100 units/ml Penicilli
n、100 μg/ml Streptomycinを含む Dulbecco'sModifie
d Eagle Medium (ＤＭＥＭ) 培地（日水製薬株式会社）
でSingle Tray(Nunc社)４枚コンフルエントまで培養し
たＺＡＱＬ−１発現ＣＨＯ細胞クローンNo.4を、トリプ
シン処理して分散後、遠心して回収した。上記Single T
ray 1枚分の細胞を上記培地1.5 Lに懸濁後Cell Factori
es 10（Nunc社）に植え込み、４基のCell Factories 10
について37℃で5％炭酸ガス中にて３日間培養した。培
養上清を除いた後、前述のH/HBSS 1 Lで１基のCell Fac
tories 10の細胞を洗浄した。H/HBSSを除いた後、１基
のCell Factories 10あたり2 Lの無血清培地（1 mM MEM
非必須アミノ酸溶液、100 units/ml Penicillin、100
μg/ml Streptomycinを含む Dulbecco's Modified Eagl
e Medium培地）を加えさらに2日間培養した。回収した
培養上清を日立高速遠心機で1,000 rpmで１０分間遠心
後、ガーゼを用いてろ過し清澄な上清を得た。これに酢
酸を最終濃度1 Mになるように添加し以下の操作を行っ
た。

【０１９４】（３）ＺＡＱＬ−１発現ＣＨＯ細胞無血清
培養上清のオクタドデシル逆相クロマトグラフィーによ
る粗分画 オクタドデシル基を固定したシリカゲルを充填したPrep
C18（Waters社）をメタノールで膨潤後、ガラス製カラ
ムに充填した（50 mm×100 mm）。その後、1 M酢酸で平
衡化したカラムに、参考例１１（２）で調製した抽出液
を添着した。次にこのカラムを８００ｍｌの１Ｍ酢酸で
洗浄した。次に、このカラムに１０００ｍｌの６０％ア
セトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸を流し、目的
とする粗ペプチド成分を溶出した。得られた溶出液を、
エバポレーターを用いて濃縮した後、凍結乾燥機（12E
L； VirTis社）にて凍結乾燥した。 （４）Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ＨＧ Ｐｒｅｐ逆
相高速液体クロマトグラフィーによる分離 Wakosil-II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィ
ー用カラム（和光純薬、20mm×250mm）を、４０℃に
て、流速５ｍｌ／ｍｉｎでＡ液（0.1％トリフルオロ酢
酸／蒸留水）容量91.7％/Ｂ液（0.1％トリフルオロ酢酸
／６０％アセトニトリル）容量8.3％を流し平衡化し
た。上記（３）で得られた凍結乾燥物についてクロマト
グラフィー操作を行った。即ち、凍結乾燥物を１Ｍ酢酸
３６ｍｌを加えて溶解し遠心後、その内の１／３を当該
カラムに添着した後、流速５ｍｌ／ｍｌで、１分間かけ
てＡ液容量66.7％／Ｂ液容量33.3％ まで上昇させ、次
いで１２０分間かけてＡ液容量16.7％Ｂ液容量83.3％ま
で、Ｂ液濃度を直線的グラジエントで上昇させた。溶出
液を５ｍｌずつフラクション番号をつけて分取した。分
取フラクションより各3 μlづつ0.2％ BSA 150 μl と
混合し凍結乾燥機（12EL；VirTis社）で凍結乾燥させ
た。この乾燥物に、アッセイバッファー〔H/HBSS（ニッ
スイハンクス２（日水製薬株式会社） 9.8g、炭酸水素
ナトリウム 0.35g、HEPES 4.77 g 、水酸化ナトリウム
溶液で pH7.4に合わせた後、フィルター滅菌処理）に、
2.5 mM Probenecid および0.1％ CHAPS を添加したも
の〕150 μlを加えて溶解し、この溶液50 μl を用いて
参考例９の試験法に従い、ＺＡＱ−Ｂ１受容体活性化作
用を測定した。その結果、目的とするＺＡＱ−Ｂ１受容
体活性化作用を有する成分は、主としてフラクションN
o.73-75に溶出されていることが判明した。

【０１９５】（５）ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−２ＳＷイオン
交換高速液体クロマトグラフィーによる分離 TSKgel CM-2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー
用カラム（東ソー、7.8×300mm）を25℃にて、流速2 ml
/minでＡ液（4 Mギ酸アンモニウム：蒸留水：アセトニ
トリル = 1 : 299 : 100）容量100％、Ｂ液（4 Mギ酸ア
ンモニウム：蒸留水：アセトニトリル = 1 : 2 : 1）容
量0％を流し平衡化した。上記（４）で得られたWakosil
-II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー分取
フラクションのうちフラクションNo.73-75を凍結乾燥し
たものをＡ液4 mlに溶解しTSKgel CM-2SWイオン交換カ
ラムに添着した後、流速１ｍｌ／ｍｉｎで１２０分間か
けてＡ液容量２５％／Ｂ液容量７５％ まで直線的グラ
ジエントで上昇させ溶出液を回収した。溶出液を２ｍｌ
ずつフラクション番号をつけて分取し、分取フラクショ
ンより各10 μlづつを0.2％ BSA 100 μl 混合し凍結乾
燥機（12EL； VirTis社）で凍結乾燥させた。この乾燥
物に上記アッセイバッファー100 μl を加えて溶解しこ
れをさらに同バッファーで１００倍希釈し上記（３−
５）の試験法に従い、ＺＡＱ受容体活性化作用を測定し
た。その結果、目的とするＺＡＱ受容体活性化作用を有
する成分はフラクションNo.95-100に溶出されているこ
とが判明した。 （６）ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ逆相高速液体ク
ロマトグラフィーによる精製 TSKgel ODS-80Ts 逆相高速液体クロマトグラフィー用カ
ラム（東ソー、4.6 mmx 100 mm）を、４０℃にて、流速
１ｍｌ／ｍｉｎでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸留
水）容量91.7％/Ｂ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/60％
アセトニトリル）容量8.3％を流し平衡化した。上記
（５）で得られたフラクションNo.95-100の凍結乾燥物
についてクロマトグラフィー操作を行った。即ち、凍結
乾燥物を1 M酢酸4 mlを加えて溶解し当該カラムに添着
した後、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、１分間かけてＡ液容量
７５％/Ｂ液容量２５％まで上昇させ、次いで６０分間
かけてＡ液容量２５％Ｂ液容量７５％までＢ液濃度を直
線的グラジエントで上昇させ溶出液を回収した。溶出液
を１ｍｌずつフラクション番号をつけて分取した。参考
例９に記載した方法に従いＺＡＱリガンド活性を測定
し、当該活性が単一な紫外吸収ピークと一致するフラク
ションに溶出されていることを確認した。これよりＺＡ
Ｑリガンドが単一に精製されたものと判断した。 （７）精製されたＺＡＱリガンドペプチドの構造解析 上記（６）で得られたＺＡＱリガンドペプチドについて
以下の方法で構造決定を実施した。ＺＡＱ活性化主成分
精製標品中の凍結乾燥機（12EL； VirTis社）にて凍結
乾燥した。得られた凍結乾燥物を溶媒DMSO(ジメチルサ
ルフォキシド)に溶解した。この溶液の一部をプロテイ
ンシークエンサー(パーキンエルマー社、PE Biosystems
Procise 491cLC)を用いたＮ末端からのアミノ酸配列解
析に供した。その結果、予想されるヒト方ＺＡＱリガン
ドペプチド成熟体(配列番号：８２)と一致するＮ端アミ
ノ酸配列を得た。また、Finnigan LCQ LC/MS装置を用い
て、エレクトロンスプレーイオン化法により質量分析を
行い、分子量が9658.0であると算定した。本測定値はヒ
ト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチド(配列番号：８２)の
理論値9657.3にと良く一致し、目的とする配列番号：８
２で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドが取得
できたことが確認された。

【０１９６】参考例１３ ヘビ毒ＭＩＴ１およびヒト型
ＺＡＱリガンドとＺＡＱおよびＩ５Ｅとの反応性 （１）ヘビ毒ＭＩＴ１の単離 （１−１）Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ５Ｃ１８ＨＧ Ｐｒｅ
ｐ逆相高速液体クロマトグラフィーによる分離 Wakosil-II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィ
ー用カラム（和光純薬、 20mm×250mm）を、40℃にて、
流速5 ml/minでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸留
水）容量91.7％/Ｂ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/60％
アセトニトリル）容量8.3％を流し平衡化した。Black M
amba毒液（Sigma社）凍結乾燥品50 mgに1 MAcOH 4 mlを
加え溶解し、15,000 rpmで10分間遠心して得られた上清
についてクロマトグラフィー操作を行った。サンプルを
当該カラムに添着した後、流速5 ml/minで、1分間かけ
てＡ液容量91.7％/Ｂ液容量8.3％ まで上昇させ、次い
で120分間かけてＡ液容量33.4％Ｂ液容量66.6％まで、
Ｂ液濃度を直線的グラジエントで上昇させた。溶出液を
20分後から10 mlずつフラクション番号をつけて分取し
た。各フラクションから1 μlを採取し、前述のアッセ
イバッファーで10,000倍希釈後、参考例９の試験法に従
い、ＺＡＱ−Ｂ１受容体活性化作用を測定した。その結
果、目的とするZAQ-B1受容体活性化作用を有する成分
は、主としてフラクションNo.21-23に溶出されているこ
とが判明した。 （１−２）ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−２ＳＷイオン交換高速
液体クロマトグラフィーによる分離 TSKgel CM-2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー
用カラム（東ソー、4.6×250 mm）を25℃にて、流速1 m
l/minでＡ液（4 Mギ酸アンモニウム：蒸留水：アセトニ
トリル = 1 : 299 : 100）容量100％、Ｂ液（4 Mギ酸ア
ンモニウム：蒸留水：アセトニトリル = 1 : 2 : 1）容
量0％を流し平衡化した。参考例１２で得られたWakosil
-II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー分取
フラクションのうちフラクションNo.21-23を凍結乾燥し
たものをＡ液4 mlに溶解しTSKgelCM-2SWイオン交換カラ
ムに添着した後、流速 1 ml/minで90分間かけてＡ液容
量0％／Ｂ液容量100％まで直線的グラジエントで上昇さ
せ溶出液を回収した。溶出液を1 mlずつフラクション番
号をつけて分取した。各フラクションから1 μlを採取
し、前述のアッセイバッファーで10,000倍希釈後、参考
例９の試験法に従い、 ZAQ-B1受容体活性化作用を測定
した。その結果、目的とするZAQ-B1受容体活性化作用を
有する成分は、主としてフラクションNo.50-51に溶出さ
れていることが判明した。

【０１９７】（１−３）Ｖｙｄａｃ２３８ＴＰ３４１０
逆相高速液体クロマトグラフィーによる分離 Vydac238TP3410逆相高速液体クロマトグラフィー用カラ
ム（Vydac、 4.6mm×100 mm）を、40℃にて、流速1 ml/
minでＡ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/蒸留水）容量91.7
％/Ｂ液（0.1％ トリフルオロ酢酸/60％ アセトニトリ
ル）容量8.3％を流し平衡化した。上記（１−２）で得
られたTSKgel CM-2SWイオン交換高速液体クロマトグラ
フィー分取フラクションのうちフラクションNo.50-51を
直接当該カラムに添着した後、流速1 ml/minで、1分間
かけてＡ液容量75％/Ｂ液容量25％まで上昇させ、次い
で75分間かけてＡ液容量41.7％Ｂ液容量58.3％まで、Ｂ
液濃度を直線的グラジエントで上昇させた。溶出液を0.
5 mlずつフラクション番号をつけて分取した。各フラク
ションから1 μlを採取し、前述のアッセイバッファー
で10,000倍希釈後、参考例９の試験法により、ＺＡＱ−
Ｂ１受容体活性化作用を測定した。その結果、目的とす
るＺＡＱ−Ｂ１受容体活性化作用を有する成分は、主と
してフラクションNo.108-115に溶出されていることが判
明した。 （１−４）精製されたヘビ毒ＭＩＴ１の構造解析 上記（１−３）で得られたヘビ毒ＭＩＴ１について以下
の方法で構造決定を実施した。精製したＭＩＴ１を凍結
乾燥機（12EL；VirTis社）にて凍結乾燥した。得られた
ペプチド凍結乾燥物を溶媒ＤＭＳＯ（ジメチルサルフォ
キシド）に溶解した。この溶液の一部をプロテインシー
クエンサー(パーキンエルマー社、PE Biosystems Proci
se 491cLC)を用いたＮ末端からのアミノ酸配列解析に供
した。その結果、予想されるヘビ毒ＭＩＴ１（配列番
号：２１）と一致するＮ端アミノ酸配列を得た。また、
Finnigan LCQ LC/MS装置を用いて、エレクトロンスプレ
ーイオン化法により質量分析を行い、分子量が8506.8で
あると算定した。本測定値はヘビ毒ＭＩＴ１の理論値85
06.4に良く一致し、目的とする配列番号：２１で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するペプチドが取得できたこと
が確認された。

【０１９８】（２）Ｉ５Ｅ安定発現細胞株の樹立 ヒト型Ｉ５Ｅ受容体ｃＤＮＡ（配列番号：６）を公知の
ＰＣＲ法によりクローニングし、pAKKO1.11H発現ベクタ
ーに組み込んだ。当該発現ベクターを参考例９に記載し
た方法に従い、CHO/dhFr⁻細胞（American Type Cultur
e Collection）に形質導入した。培養開始10-14日後に
生育してきた形質転換ＣＨＯ細胞のコロニーを約20個選
んだ。 選択した細胞を3×10⁴個/wellで96穴プレートに
植え込み、参考例９に記載した試験法に従い、ＭＩＴ１
に対する反応性を検討した。反応性の良いＩ５Ｅ発現Ｃ
ＨＯ細胞4番クローン（Ｉ５Ｅ−４細胞と略称する）を
選別した。配列番号：６で表される塩基配列がコードす
るアミノ酸配列を配列番号：５２に示す。 （３）ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドおよびＭＩＴ１の
ＺＡＱ受容体およびＩ５Ｅ受容体活性化作用の測定 参考例１２に記載した方法で精製したヒト型ＺＡＱリガ
ンドぺプチド、及び上記（１）に記載した方法で精製し
たヘビ毒ＭＩＴ１について、それらのＺＡＱ受容体活性
化作用、及びＩ５Ｅ受容体活性化作用を参考例９に記載
した方法に従い測定した。結果を〔図４〕および〔図
５〕に示す。その結果、ヒト型ＺＡＱリガンドぺプチド
およびヘビ毒ＭＩＴ１は濃度依存的に細胞内カルシウム
濃度の上昇を惹起した。ヘビ毒ＭＩＴ１のＺＡＱ受容体
活性化作用はヒト型ＺＡＱリガンドペプチドのそれに比
べて１０倍強かった。また、ヘビ毒ＭＩＴ１のヒト型Ｉ
５Ｅ受容体活性化作用はヒト型ＺＡＱリガンドペプチド
のそれに比べて１００倍程度強いものであった。

【０１９９】参考例１４ 大腸菌でのヒトＺＡＱリガン
ド（配列番号：８２）の製造 （１） 大腸菌でのヒトＺＡＱリガンド発現プラスミド
の構築 （a）６種のＤＮＡ断片＃１〜＃６（配列番号：９５〜
１００）を用いて、ＺＡＱリガンドの構造ＤＮＡを調製
した。 (b)ＤＮＡオリゴマーのリン酸化 ５’側になるべき上記＃１および＃６を除いた４種のＤ
ＮＡオリゴマー（＃２〜＃５）各々を、２５μlのリン
酸化反応液〔ＤＮＡオリゴマー１０μg，５０mＭ Tris
−ＨＣl，pＨ７.６, １０mＭ ＭgＣl_２, １mＭスペルミ
ジン，１０mＭジチオスレイトール（以後ＤＴＴと略
記），０.１mg／mlウシ血清アルブミン（以後ＢＳＡと
略記），１mＭ ＡＴＰ，１０ユニットＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造）〕中で３７℃・１時間反応さ
せ、各オリゴマーの５’末端をリン酸化した。フェノー
ル処理を行った後、２倍量のエタノールを加え、−７０
℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させた。 (c)ＤＮＡフラグメントの連結 上記（ｂ）で得られたＤＮＡフラグメントと上記＃1お
よび＃６を合わせ、１２０μｌとした。この混合液を９
０℃で１０分間保持した後、室温まで徐冷しアニーリン
グを行った後、TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2（宝酒
造）を用いてライゲーション反応を行った。アニーリン
グ液３０μｌにキットに付属のＩＩ液３０μｌを加え、
よく混合した後、キットに付属のＩ液６０μｌを加え、
３７℃・１時間反応させ、ライゲーションを行った。そ
の後、フェノール処理を行ない、水層を回収して２倍量
のエタノールを加え、−７０℃に冷却した後、遠心でＤ
ＮＡを沈殿させた。この様にして得られたＤＮＡフラグ
メントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）によ
るリン酸化を行った後、以下の工程(ｄ)に供した。 (d) ＺＡＱリガンド発現ベクターの構築 発現用ベクターとしてはｐＴＣＩＩ（特開2000-178297
号に記載）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（宝酒造）で３
７℃・２時間消化した後、１％アガロースゲル電気泳動
により４.３kbのＤＮＡ断片をQIAquick Gel Extraction
Kit （キアゲン社）を用いて抽出し、２５μｌのＴＥ
緩衝液に溶解した。このｐＴＣＩＩのＮｄｅＩ、Ｂａｍ
ＨＩ断片と上記により調製したＺＡＱリガンドの構造遺
伝子（配列番号：１０１）をTaKaRa DNA ligation kit
ver.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行っ
た。この反応液を１０μl用いて大腸菌ＪＭ１０９コン
ピテントセル（東洋紡）を形質転換し、１０μｇ／ｍｌ
のテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、３７
℃で１晩培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニー
選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QIAp
rep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミドp
ＴＣｈ１ＺＡＱを調製した。このＺＡＱリガンドＤＮＡ
の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル３７
７ＤＮＡシーケンサーを用いて確認した。プラスミドp
ＴＣｈ１ＺＡＱを大腸菌（Escherichiacoli）ＭＭ２９
４（ＤＥ３）に形質転換し、ＺＡＱリガンド発現株Esch
erichiacoli MM294(DE3)/ pTCh1ZAQを得た。

【０２００】（２）ＺＡＱリガンドの製造 上記のEscherichia coli MM294(DE3)/ pTCh1ZAQを５．
０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地・１Ｌ
（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナ
トリウム）を用いて２Ｌ容フラスコ中で３７℃、８時間
振とう培養した。得られた培養液を１９Ｌの主発酵培地
（1-68％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸２水
素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩
化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２
％消泡剤、０．０００２５％硫酸第１鉄、０．０００５
％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％ハイケー
スアミノ）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０
℃で通気攪拌を開始した。培養液の濁度が５００クレッ
ト単位になったところで、イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌになるよ
うに添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了後、
培養液を遠心分離し、約２００ｇの湿菌体を取得し、−
８０℃で保存した。この形質転換大腸菌ＭＭ２９４（Ｄ
Ｅ３）／ｐＴＣｈ１ＺＡＱは、受託番号ＩＦＯ1-6５２
７として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されてい
る。 （３）ＺＡＱリガンドの活性化 上記（２）で得られた菌体２００ｇに、２００ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ、７Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ８．０）４０
０ｍｌを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０００
０ｒｐｍ、１時間）を行った。上澄液に０．４Ｍアルギ
ニン、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．２ｍＭ ＧＳＳ
Ｇ、１ｍＭ ＧＳＨ（ｐＨ８．０）１０リットルを加え
て、４℃で一晩活性化を行った。

【０２０１】（４）ＺＡＱリガンドの精製 上記（３）で活性化の終了した再生液をｐＨ６．０に調
整し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し
たＳＰ−セファロースカラム（１１．３ｃｍ×１５ｃ
ｍ）に吸着させた後、６００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出し、ＺＡＱリガンド
を含むフラクションをプールした。この画分を５０mＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＣＭ−５Ｐ
Ｗ（２１.５mm×１５０mmＬ）に通液し、吸着、洗浄し
た後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０mＭリン酸緩衝液＋１
Ｍ ＮaＣl、pＨ６．０５）の段階勾配（６０分）で溶出
を行いＺＡＱリガンド画分（溶出時間約４０分）を得
た。この画分を、さらに０.１％トリフルオロ酢酸で平
衡化したＣ４Ｐ−５０（２１.５mmＩＤ×３００mmＬ、
昭和電工）に通液し、吸着、洗浄した後、２５−５０％
Ｂ（Ｂ：８０％アセトニトリル／０.１％トリフルオロ
酢酸）の段階勾配（６０分）で溶出を行い、ＺＡＱリガ
ンド画分（溶出時間約４０分）をプールした後、凍結乾
燥を行い、ＺＡＱリガンド凍結乾燥粉末約８０mgを得
た。 （５）ＺＡＱリガンドの特徴決定 （a）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた
分析 上記（４）で得られたＺＡＱリガンドを１００ｍＭ Ｄ
ＴＴを添加したＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［Laemmli,
Nature, 227, 680 (1979)］に懸濁し、９５℃で１分間
加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で
電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリ
アント・ブルー（Coomassie brilliantblue）で染色し
た結果、参考例１０で得られたＣＯＳ７細胞由来の組換
え型ＺＡＱリガンド標品と同じ位置に、単一の蛋白質バ
ンドが認められた。このことから、上記（４）で得られ
た大腸菌由来の組換え型ＺＡＱリガンド標品は極めて高
純度であり、ＣＯＳ７細胞から調製した組換え型ＺＡＱ
リガンドと分子量的に同一であることが分かった。 （b）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ＺＡＱリガンド（配列番号：８２で表されるアミノ酸配
列からなるペプチド）のＤＮＡの塩基配列から推定され
るアミノ酸組成と一致した（表５）。

【表５】 （c）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ モデル４９２）を用い
て決定した。その結果、得られたＺＡＱリガンドのＤＮ
Ａの塩基配列から推定されたＺＡＱリガンドのＮ末端ア
ミノ酸配列と一致した（表６）。

【表６】 （d）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。得られた
ＺＡＱリガンドはＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末
端アミノ酸と一致した（表７）。

【表７】 （e）質量分析 質量分析をnanoESIイオン源を装着したLCQイオントラッ
プ質量分析計（サーモクエスト社製）を用いて行った。
その結果、分子量9657.55±0.89が得られ、配列番号：
８２の、しかも配列番号：８２が含有する１０残基のＣ
ｙｓが５対のジスルフィド結合を形成したＺＡＱリガン
ドの理論分子量(9657.3)と良く一致していた。 （６）ＺＡＱリガンドの活性測定（ＦＬＩＰＲを用いた
細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定） 上記（４）で得られた純化された大腸菌由来の組換え型
ＺＡＱリガンド標品を参考例１０の方法を用いて、活性
測定（ＦＬＩＰＲを用いた細胞内Ｃａイオン濃度上昇活
性の測定）を行った。その結果、参考例１０で得られた
ＣＯＳ７細胞由来の組換え型標品（ＺＡＱリガンドの精
製品）と同等の活性を有していた。

【０２０２】参考例１５ マウス型ＺＡＱリガンドぺプ
チドｃＤＮＡのクローニング マウスMultiple Tissue cDNA Panel（CLONTECH社）のbr
ainを鋳型としてプライマーmMIT1-F3（配列番号：１０
２）、mMIT1-R3 （配列番号：１０３）、mMIT1-F4（配
列番号：１０４）およびmMIT1-R4（配列番号：１０５）
を作成し、以下に記したPCR反応を実施した。 mMIT1-F3: 5'-CTTGGCCTTCTCGGCTTGTCTAG-3' （配列
番号：１０２） mMIT1-R3: 5'-GGTGTAAAGCAAGAGGTCACCCAGT-3' （配列
番号：１０３） mMIT1-F4: 5'-ACAAGGCAGCGCAGAAGGAAGT-3' （配列
番号：１０４） mMIT1-R4: 5'-GGCTCCAGTACAGAGTCCAGACAA-3' （配列
番号：１０５） PCR反応液は、50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CL
ONTECH社)を0.6 μl、添付の5x Advantage-GC 2 PCR bu
ffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5mM Mg(OA
c)₂, 25％ Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BSA, 0.0
25％Tween-20,0.025％ Nonidet-P40）を6 μl、2.5 mM
dNTP mixtureを2.4 μl、10 μMプライマーmMIT1-F3お
よびmMIT1-R3を各0.6 μl 、鋳型DNAを3μl、および蒸
留水を16.8 μlを混合して作製した。反応条件は94℃・3
分の初期変性後、94℃・30秒-68℃・3分のサイクル反応を
35回、および68℃・3分の最終伸長反応とした。続いて、
該PCR反応の反応液を蒸留水で50倍に希釈したものをを
鋳型としてnested PCRを行った。50X Advantage-GC 2 P
olymerase Mix (CLONTECH社)を0.6 μl、添付の5x Adva
ntage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM K
OAc, 17.5 mM Mg(OAc)₂, 25％ Dimethyl Sulfoxide, 1
8.75μg/ml BSA, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P
40)を6 μl、2.5 mM dNTP mixtureを2.4 μl、10 μMプ
ライマーmMIT1-F4およびmMIT1-R4を各0.6 μl 、鋳型DN
Aを3μl、および蒸留水を16.8 μlを混合して作製し
た。反応条件は94℃・3分の初期変性後、94℃・30秒-68℃
・3分のサイクル反応を35回、および68℃・3分の最終伸長
反応とした。得られたDNA断片をTOPO TA Cloning Kit
(Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記載された
方法に従ってクローニングした。クローニングされたDN
A配列をABI377DNA sequencerを用いて解読し、マウスZA
Qリガンド全長ペプチドをコードする410 bpのDNA断片
（配列番号：１０６）を有するプラスミドを取得し、こ
れをpMMITと命名した。また、該塩基配列からプライマ
ーにより規定される部分の配列を差し引いた配列をcDNA
塩基配列として確定した(配列番号：１１１)。該プラス
ミドにより大腸菌（Escherichia coli）TOP10をトラン
スフォームさせ、大腸菌TOP10/pMMITと命名した。このD
NA断片の塩基配列を解析した結果、配列番号：１０６で
表わされるDNA断片は、配列番号：１０７で表わされる
マウス型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド(105アミノ酸残
基）をコードするDNA（配列番号：１０８）を含んでい
ることが明らかとなった。また、配列番号：１０８で表
わされる塩基配列は典型的なシグナル配列を有してお
り、配列番号：１０８で表わされる塩基配列を有するDN
Aは、配列番号：１０９で表わされるマウス型ＺＡＱリ
ガンド成熟体ペプチド（86アミノ酸残基）をコードする
258塩基対からなるDNA（配列番号：１１０）を含んでい
ることが明らかとなった。

【０２０３】参考例１６ ラット型ＺＡＱリガンドぺプ
チドｃＤＮＡのクローニング ラット脳QUICK-clone cDNA (CLONTECH社)を鋳型とし
て、degenerateプライマー MF1（配列番号：１１２)、M
R1（配列番号：１１３)、MF2（配列番号：１１４)およ
びMR2（配列番号：１１５)を作成し、以下に記したPCR
反応を実施した。 MF1: 5'-TCACCYCAAGTGAYCATGAGAGG-3' （配列番
号：１１２) MR1: 5'-CTAAAARTTGRYRTTCTTCAAGTCC-3' （配列番
号：１１３) MF2: 5'-ATCACAGGGGCCTGTGARCG-3' （配列
番号：１１４) MR2: 5'-AGCAGCGGTACCTGCCGTCC-3' （配列
番号：１１５) PCR反応液は50X Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTEC
H社)を0.6 μl、添付の10x Advantage 2 PCR buffer (4
00 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg(OAc)₂, 3
7.5μg/ml BSA, 0.05％Tween-20, 0.05％ Nonidet-P40)
を3 μl、dNTPmixture (2.5 mM each, 宝酒造）を2.4
μl、10 μMプライマーMF1およびMR1を0.6 μl、鋳型cD
NAを1 μl、および蒸留水を20.6 μlを混合して作製し
た。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-55℃
・1分-68℃・1分のサイクル反応を35回、および68℃・5分
の最終伸長反応とした。続いて、該PCR反応の反応液を
蒸留水で15倍希釈したものを鋳型としてnestedPCRを実
施した。反応液は50X Advantage 2 Polymerase Mix (CL
ONTECH社)を0.6μl、添付の10x Advantage 2 PCR buffe
r (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc,35 mM Mg(OAc)₂,
37.5μg/ml BSA, 0.05％Tween-20, 0.05％ Nonidet-P4
0)を3μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.4
μl、10 μMプライマーMF1およびMR1を 0.6 μl、鋳型c
DNAを1 μl、および蒸留水を20.6 μlを混合して作製し
た。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・30秒-55℃
・1分-68℃・1分のサイクル反応を35回、および68℃・5分
の最終伸長反応とした。得られたDNA断片をZaro Blunt
TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen社)を用いて添付の
マニュアルに記載された方法に従ってクローニングし
た。クローニングされたDNA配列をABI377DNA sequencer
を用いて解読し、配列番号：１１６（Ｔタイプ）および
配列番号：１１７（Ｃタイプ）で表される部分配列を得
た。

【０２０４】上記配列の情報よりプライマー RM3-1（配
列番号：１１８）、RM3-2（配列番号：１１９）およびR
M3-3（配列番号：１２０）を作成し、以下に記した5'RA
CE実験を実施した。 RM3-1: 5'-GTGGCACTCCTCTCCTTCCCGCCCCAGA-3' （配
列番号：１１８) RM3-2: 5'-CAGGCCCCGCAGCCACAGGCTGATAGCA-3' （配
列番号：１１９) RM3-3: 5'-AGCAGGTGCCAGCCCCACACTGGACATC-3' （配
列番号：１２０) 5'RACEのPCR反応液は50X Advantage-GC 2 Polymerase M
ix (CLONTECH社)を0.6μl、添付の5x Advantage-GC 2 P
CR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM
Mg(OAc)₂, 25％ Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BS
A, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P40)を6 μl、d
NTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.4 μl、10 μM
プライマーRM3-1を 0.6 μl、10 μMプライマーAP1（プ
ライマーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに
添付のもの）を0.6 μl、鋳型cDNA（CLONTECH社、ラッ
ト脳Marathon-Ready cDNA）を3 μl、および蒸留水を1
6.8 μlを混合して作製した。反応条件は94℃・30秒の初
期変性後、94℃・5秒-72℃・3分のサイクル反応を5回、94
℃・5秒-70℃・3分のサイクル反応を5回、94℃・5秒-68℃・
3分のサイクル反応を25回行った。続いて、該PCR反応の
反応液を鋳型としてnested PCRを実施した。反応液は50
XAdvantage-GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社)を0.6
μl、添付の5x Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tr
icine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(OAc)₂, 25％Dimet
hyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BSA, 0.025％Tween-20,
0.025％ Nonidet-P40)を6 μl、dNTP mixture (2.5 mM
each, 宝酒造)を2.4 μl、10 μMプライマーRM3-2また
はRM3-3を0.6 μl、10 μMプライマーAP2（プライマーA
P2はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付のも
の）を0.6 μl、鋳型DNA（該PCR反応液50倍希釈液）を3
μl、および蒸留水を16.8 μlを混合して作製した。反
応条件は94℃・30秒の初期変性後、94℃・5秒-68℃・3分の
サイクル反応を30回行った。

【０２０５】得られたDNA断片をTOPO TA Cloning Kit
(Invitrogen社)を用いて添付のマニュアルに記載された
方法に従ってクローニングした。クローニングされたDN
A配列をABI377DNA sequencerを用いて解読し、5'端の配
列（配列番号：１２１）を得た。配列番号：１１６およ
び配列番号：１１７の情報よりプライマー RM5-1（配列
番号：１２２)とRM5-4（配列番号：１２３)を作成し、
以下に記した3'RACE実験を実施した。 RM5-1: 5'-GGAAGGAGAGGAGTGCCACCCTGGAAG-3' （配
列番号：１２２) RM5-4: 5'-ACCATACCTGTCCCTGTTCACCCAGCCT-3' （配列
番号：１２３) 3'RACEのPCR反応液は50X Advantage-GC 2 Polymerase M
ix (CLONTECH社)を0.6μl、添付の5x Advantage-GC 2 P
CR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM
Mg(OAc)₂, 25％ Dimethyl Sulfoxide, 18.75μg/ml BS
A, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P40)を6 μl、d
NTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.4 μl、10 μM
プライマーRM5-1を 0.6 μl、10 μMプライマーAP1（プ
ライマーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに
添付のもの）を0.6 μl、鋳型cDNA（CLONTECH社、ラッ
ト脳Marathon-Ready cDNA）を3 μl、および蒸留水を1
6.8 μlを混合して作製した。反応条件は94℃・1分の初
期変性後、94℃・30秒-72℃・3分のサイクル反応を5回、9
4℃・30秒-70℃・3分のサイクル反応を5回、94℃・30秒-68
℃・3分のサイクル反応を25回、および68℃・3分の最終伸
長反応とした。続いて、該PCR反応の反応液を鋳型とし
てnested PCRを実施した。反応液は50XAdvantage-GC 2
Polymerase Mix (CLONTECH社)を0.6 μl、添付の5x Adv
antage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM
KOAc, 17.5 mM Mg(OAc)₂, 25％Dimethyl Sulfoxide, 1
8.75μg/ml BSA, 0.025％Tween-20, 0.025％ Nonidet-P
40)を6 μl、dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造)を2.
4 μl、10 μMプライマーRM5-4またはRM3-3を0.6 μl、
10 μMプライマーAP2（プライマーAP2はCLONTECH社のMa
rathon-Ready cDNA Kitに添付のもの）を0.6 μl、鋳型
DNA（該PCR反応液50倍希釈液）を3 μl、および蒸留水
を16.8 μlを混合して作製した。反応条件は94℃・1分の
初期変性後、94℃・30秒-68℃・3分のサイクル反応を35
回、および68℃・3分の最終伸長反応とした。得られたDN
A断片をTOPO TA Cloning Kit (Invitrogen社)を用いて
添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニン
グした。クローニングされたDNA配列をABI377DNA seque
ncerを用いて解読し、3'端の配列（配列番号：１２４）
を得た。

【０２０６】ラット脳QUICK-clone cDNA (CLONTECH社）
またはラット脳cDNA (Wistar rat)を鋳型として5'RACE
および3'RACEの情報よりプライマーRBv8-WF1（配列番
号：１２５)、RBv8-WF2 （配列番号：１２６)、RBv8-WR
1 （配列番号：１２７）およびRBv8-WR2（配列番号：１
２８）を作成し、以下に記したPCR反応を実施した。 RMIT-WF1: 5'-ATTCCAGAGTGGACAGTGTTTGCCTTCACC-3'
（配列番号：１２５) RMIT-WF2: 5'-GATCATGAGAGGTGCTGTGCAAGTCTTC-3'
（配列番号：１２６) RMIT-WR1: 5'-CTCTCTGCACGCTGCTGGACTGTTCC-3'
（配列番号：１２７) RMIT-WR2: 5'-CAGATGTAACACAAGAGGTCACCCAGTAGG-3'
（配列番号：１２８) PCR反応液はPfuTurbo DNA polymerase(Stratagene社)を
0.6 μl、添付の10x PCR bufferを3 μl、2.5 mM dNTP
mixtureを2.4 μl、10 μMプライマーRMIT-WF1およびRM
IT-WR1を各1.5 μl 、鋳型DNAを1μl、および蒸留水を2
0 μlを混合して作製した。反応条件は95℃・1分の初期
変性後、95℃・30秒-55℃・30秒-72℃・1分のサイクル反応
を35回、および72℃・5分の最終伸長反応とした。続い
て、該PCR反応の反応液を蒸留水で50倍に希釈したもの
をを鋳型としてnested PCRを行った。PCR反応液はPfuTu
rbo DNA polymerase (Stratagene社)を0.6μl、添付の1
0x PCR bufferを3 μl、2.5 mM dNTP mixtureを2.4 μ
l、10 μMプライマーRMIT-WF2およびRMIT-WR2を各1.5
μl 、鋳型DNAを3μl、および蒸留水を18 μlを混合し
て作製した。反応条件は95℃・1分の初期変性後、95℃・3
0秒-55℃・30秒-72℃・1分のサイクル反応を35回、および
72℃・5分の最終伸長反応とした。得られたDNA断片をZar
o Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen社)を用い
て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニ
ングした。クローニングされたDNA配列をABI377DNA seq
uencerを用いて解読し、ラットZAQリガンド全長ペプチ
ドをコードする3種の375bpのDNA断片（配列番号：１２
９、配列番号：１３０および配列番号：１３１；塩基置
換が起こっているそれぞれをノーマルタイプ、Ｙタイ
プ、Ｑタイプとする）を有するプラスミドを、pRMIT、p
RMITYおよびpHMITQとそれぞれ命名した。該プラスミド
により大腸菌（Escherichia coli ）TOP10をトランスフ
ォームさせ、大腸菌TOP10/pRMIT、大腸菌TOP10/pRMITY
および大腸菌TOP10/pRMITQとそれぞれ命名した。

【０２０７】これらのDNA断片の塩基配列を解析した結
果、配列番号：１２９で表わされるDNA断片は、配列番
号：１３２で表わされるラット型ＺＡＱリガンド前駆体
ペプチド(105アミノ酸残基）をコードするDNA（配列番
号：１３３）を含んでいることが、配列番号：１３０で
表わされるDNA断片は、配列番号：１３４で表わされる
ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチド(105アミノ酸残
基）をコードするDNA（配列番号：１３５）を含んでい
ることが、配列番号：１３１で表わされるDNA断片は、
配列番号：１３６で表わされるラット型ＺＡＱリガンド
前駆体ペプチド(105アミノ酸残基）をコードするDNA
（配列番号：１３７）を含んでいることが明らかとなっ
た。また、配列番号：１３２、配列番号：１３４または
配列番号：１３６で表わされる塩基配列は典型的なシグ
ナル配列を有しており、配列番号：１３２で表わされる
塩基配列を有するDNAは、配列番号：１３８で表わされ
るラット型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチド（86アミノ酸
残基）をコードする258塩基対からなるDNA（配列番号：
１３９）を含んでいることが、配列番号：１３４で表わ
される塩基配列を有するDNAは、配列番号：１４０で表
わされるラット型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチド（86ア
ミノ酸残基）をコードする258塩基対からなるDNA（配列
番号：１４１）を含んでいることが、配列番号：１３６
で表わされる塩基配列を有するDNAは、配列番号：１４
２で表わされるラット型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチド
（86アミノ酸残基）をコードする258塩基対からなるDNA
（配列番号：１４３）を含んでいることが明らかとなっ
た。配列番号：１３８のアミノ酸配列において、配列番
号：１４０では４６番目のＨｉｓがＴｙｒに、配列番
号：１４２では３６番目のＡｒｇがＧｌｎにそれぞれ置
換されている。

【０２０８】

【発明の効果】本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本
発明の蛋白質、それらに対する抗体、および本発明のペ
プチドまたは本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオ
チドは、血管新生阻害剤を得るための簡便な探索法（ス
クリーニング）に有用である。特に、本発明の蛋白質の
アンタゴニストは、優れた血管新生阻害剤として有用で
ある。また、本発明のスクリーニング方法は、哺乳動物
由来の内皮細胞を用いて行うことにより、より生理的な
条件下での血管新生阻害剤のスクリーニングが可能とな
る。さらに、本発明の蛋白質、本発明のＤＮＡ、本発明
のアンチセンスＤＮＡおよび本発明の抗体は、（i）本
発明の蛋白質が関与する各種疾病の予防・治療剤、（i
i）本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変
化させる化合物またはその塩のスクリーニング、（ii
i）本発明の蛋白質の定量、（iv）遺伝子診断薬、（v）
アンチセンスＤＮＡを含有する医薬、（vi）本発明の抗
体を含有する医薬および診断薬、（vii）本発明のＤＮ
Ａを有する非ヒト動物の作製、（viii）構造的に類似し
たリガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグ
デザインなどの実施のために有用である。特に、本発明
の組換え蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセ
イ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的な
本発明の蛋白質に対するリガンドの結合性を変化させる
化合物（例、アゴニスト、アンタゴニストなど）をスク
リーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタ
ゴニストを各種疾病、例えば血管新生を伴う疾患〔例、
癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺
癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部
癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫など）、卵巣疾患
（例、多嚢胞性卵巣症候群（卵巣多嚢胞症）、卵巣過剰
刺激症など）、炎症性疾患（例、関節リューマチな
ど）、糖尿病性網膜症など〕等の予防・治療剤などとし
て安全に使用することができる。

【０２０９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Anti-angiogenesis agent <130> B03031 <150> JP2002-27299 <151> 2002-2-4 <160> 184 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Glu Thr Thr Met Gly Phe Met Asp Asp Asn Ala Thr Asn Thr Ser 5 10 15 Thr Ser Phe Leu Ser Val Leu Asn Pro His Gly Ala His Ala Thr Ser 20 25 30 Phe Pro Phe Asn Phe Ser Tyr Ser Asp Tyr Asp Met Pro Leu Asp Glu 35 40 45 Asp Glu Asp Val Thr Asn Ser Arg Thr Phe Phe Ala Ala Lys Ile Val 50 55 60 Ile Gly Met Ala Leu Val Gly Ile Met Leu Val Cys Gly Ile Gly Asn 65 70 75 80 Phe Ile Phe Ile Ala Ala Leu Val Arg Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Thr Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Ala Ile Ser Asp Phe Leu Val Ala 100 105 110 Ile Val Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp Tyr Tyr Val Val Arg Gln Leu 115 120 125 Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys Thr Ser Val Asn Tyr Leu Arg 130 135 140 Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn Ala Leu Leu Ala Ile Ala Ile 145 150 155 160 Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Pro Leu Arg Pro Arg Met Lys Cys 165 170 175 Gln Thr Ala Thr Gly Leu Ile Ala Leu Val Trp Thr Val Ser Ile Leu 180 185 190 Ile Ala Ile Pro Ser Ala Tyr Phe Thr Thr Glu Thr Val Leu Val Ile 195 200 205 Val Lys Ser Gln Glu Lys Ile Phe Cys Gly Gln Ile Trp Pro Val Asp 210 215 220 Gln Gln Leu Tyr Tyr Lys Ser Tyr Phe Leu Phe Ile Phe Gly Ile Glu 225 230 235 240 Phe Val Gly Pro Val Val Thr Met Thr Leu Cys Tyr Ala Arg Ile Ser 245 250 255 Arg Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro Gly Phe Gln Thr Glu Gln Ile 260 265 270 Arg Lys Arg Leu Arg Cys Arg Arg Lys Thr Val Leu Val Leu Met Cys 275 280 285 Ile Leu Thr Ala Tyr Val Leu Cys Trp Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Thr 290 295 300 Ile Val Arg Asp Phe Phe Pro Thr Val Phe Val Lys Glu Lys His Tyr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Phe Tyr Ile Val Glu Cys Ile Ala Met Ser Asn Ser Met 325 330 335 Ile Asn Thr Leu Cys Phe Val Thr Val Lys Asn Asp Thr Val Lys Tyr 340 345 350 Phe Lys Lys Ile Met Leu Leu His Trp Lys Ala Ser Tyr Asn Gly Gly 355 360 365 Lys Ser Ser Ala Asp Leu Asp Leu Lys Thr Ile Gly Met Pro Ala Thr 370 375 380 Glu Glu Val Asp Cys Ile Arg Leu Lys 385 390 <210> 2 <211> 1179 <212> DNA <213> Human <400> 2 atggagacca ccatggggtt catggatgac aatgccacca acacttccac cagcttcctt 60 tctgtgctca accctcatgg agcccatgcc acttccttcc cattcaactt cagctacagc 120 gactatgata tgcctttgga tgaagatgag gatgtgacca attccaggac gttctttgct 180 gccaagattg tcattgggat ggccctggtg ggcatcatgc tggtctgcgg cattggaaac 240 ttcatcttta tcgctgccct ggtccgctac aagaaactgc gcaacctcac caacctgctc 300 atcgccaacc tggccatctc tgacttcctg gtggccattg tctgctgccc ctttgagatg 360 gactactatg tggtgcgcca gctctcctgg gagcacggcc acgtcctgtg cacctctgtc 420 aactacctgc gcactgtctc tctctatgtc tccaccaatg ccctgctggc catcgccatt 480 gacaggtatc tggctattgt ccatccgctg agaccacgga tgaagtgcca aacagccact 540 ggcctgattg ccttggtgtg gacggtgtcc atcctgatcg ccatcccttc cgcctacttc 600 accaccgaga cggtcctcgt cattgtcaag agccaggaaa agatcttctg cggccagatc 660 tggcctgtgg accagcagct ctactacaag tcctacttcc tctttatctt tggcatagaa 720 ttcgtgggcc ccgtggtcac catgaccctg tgctatgcca ggatctcccg ggagctctgg 780 ttcaaggcgg tccctggatt ccagacagag cagatccgca agaggctgcg ctgccgcagg 840 aagacggtcc tggtgctcat gtgcatcctc accgcctacg tgctatgctg ggcgcccttc 900 tacggcttca ccatcgtgcg cgacttcttc cccaccgtgt tcgtgaagga gaagcactac 960 ctcactgcct tctacatcgt cgagtgcatc gccatgagca acagcatgat caacactctg 1020 tgcttcgtga ccgtcaagaa cgacaccgtc aagtacttca aaaagatcat gttgctccac 1080 tggaaggctt cttacaatgg cggtaagtcc agtgcagacc tggacctcaa gacaattggg 1140 atgcctgcca ccgaagaggt ggactgcatc agactaaaa 1179 <210> 3 <211> 1179 <212> DNA <213> Human <400> 3 atggagacca ccatggggtt catggatgac aatgccacca acacttccac cagcttcctt 60 tctgtgctca accctcatgg agcccatgcc acttccttcc cattcaactt cagctacagc 120 gactatgata tgcctttgga tgaagatgag gatgtgacca attccaggac gttctttgct 180 gccaagattg tcattgggat ggccctggtg ggcatcatgc tggtctgcgg cattggaaac 240 ttcatcttta tcgctgccct ggtccgctac aagaaactgc gcaacctcac caacctgctc 300 atcgccaacc tggccatctc tgacttcctg gtggccattg tctgctgccc ctttgagatg 360 gactactatg tggtgcgcca gctctcctgg gagcacggcc acgtcctgtg cacctctgtc 420 aactacctgc gcactgtctc tctctatgtc tccaccaatg ccctgctggc catcgccatt 480 gacaggtatc tggctattgt ccatccgctg agaccacgga tgaagtgcca aacagccact 540 ggcctgattg ccttggtgtg gacggtgtcc atcctgatcg ccatcccttc cgcctacttc 600 accaccgaga cggtcctcgt cattgtcaag agccaggaaa agatcttctg cggccagatc 660 tggcctgtgg accagcagct ctactacaag tcctacttcc tctttatctt tggcatagaa 720 ttcgtgggcc ccgtggtcac catgaccctg tgctatgcca ggatctcccg ggagctctgg 780 ttcaaggcgg tccctggatt ccagacagag cagatccgca agaggctgcg ctgccgcagg 840 aagacggtcc tggtgctcat gtgcatcctc accgcctacg tgctatgctg ggcgcccttc 900 tacggcttca ccatcgtgcg cgacttcttc cccaccgtgt ttgtgaagga gaagcactac 960 ctcactgcct tctacatcgt cgagtgcatc gccatgagca acagcatgat caacactctg 1020 tgcttcgtga ccgtcaagaa cgacaccgtc aagtacttca aaaagatcat gttgctccac 1080 tggaaggctt cttacaatgg cggtaagtcc agtgcagacc tggacctcaa gacaattggg 1140 atgcctgcca ccgaagaggt ggactgcatc agactaaaa 1179 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 4 gtcgacatgg agaccaccat ggggttcatg g 31 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 5 actagtttat tttagtctga tgcagtccac ctcttc 36 <210> 6 <211> 1152 <212> DNA <213> Human <400> 6 atggcagccc agaatggaaa caccagtttc acacccaact ttaatccacc ccaagaccat 60 gcctcctccc tctcctttaa cttcagttat ggtgattatg acctccctat ggatgaggat 120 gaggacatga ccaagacccg gaccttcttc gcagccaaga tcgtcattgg cattgcactg 180 gcaggcatca tgctggtctg cggcatcggt aactttgtct ttatcgctgc cctcacccgc 240 tataagaagt tgcgcaacct caccaatctg ctcattgcca acctggccat ctccgacttc 300 ctggtggcca tcatctgctg ccccttcgag atggactact acgtggtacg gcagctctcc 360 tgggagcatg gccacgtgct ctgtgcctcc gtcaactacc tgcgcaccgt ctccctctac 420 gtctccacca atgccttgct ggccattgcc attgacagat atctcgccat cgttcacccc 480 ttgaaaccac ggatgaatta tcaaacggcc tccttcctga tcgccttggt ctggatggtg 540 tccattctca ttgccatccc atcggcttac tttgcaacag aaaccgtcct ctttattgtc 600 aagagccagg agaagatctt ctgtggccag atctggcctg tggatcagca gctctactac 660 aagtcctact tcctcttcat ctttggtgtc gagttcgtgg gccctgtggt caccatgacc 720 ctgtgctatg ccaggatctc ccgggagctc tggttcaagg cagtccctgg gttccagacg 780 gagcagattc gcaagcggct gcgctgccgc aggaagacgg tcctggtgct catgtgcatt 840 ctcacggcct atgtgctgtg ctgggcaccc ttctacggtt tcaccatcgt tcgtgacttc 900 ttccccactg tgttcgtgaa ggaaaagcac tacctcactg ccttctacgt ggtcgagtgc 960 atcgccatga gcaacagcat gatcaacacc gtgtgcttcg tgacggtcaa gaacaacacc 1020 atgaagtact tcaagaagat gatgctgctg cactggcgtc cctcccagcg ggggagcaag 1080 tccagtgctg accttgacct cagaaccaac ggggtgccca ccacagaaga agtggactgt 1140 atcaggctga ag 1152 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 7 ctacttctgc tgctgccgct gctgtt 26 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 8 ttggaaagtt gaggaagcaa gagcattt 28 <210> 9 <211> 359 <212> DNA <213> Human <400> 9 cacgccccgc gctggggacg ccgccgtgat caccggggct tgtgacaagg actcccaatg 60 tggtggaggc atgtgctgtg ctgtcagtat ctgggtcaag agcataagga tttgcacacc 120 tatgggcaaa ctgggagaca gctgccatcc actgactcgt aaagttccat tttttgggcg 180 gaggatgcat cacacttgcc catgtctgcc aggcttggcc tgtttacgga cttcatttaa 240 ccgatttatt tgtttagccc aaaagtaatc gctctggagt agaaaccaaa tgtgaatagc 300 cacatcttac ctgtaaagtc ttacttgtga ttgtgccaaa caaaaaatgt gccagaaag 359 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 10 tgtctcccag tttgcccata ggtgtgc 27 <210> 11 <211> 184 <212> DNA <213> Human <400> 11 cccgagggcg ccatgaggag cctgtgctgc gccccactcc tgctcctctt gctgctgccg 60 ccgctgctgc tcacgccccg cgctggggac gccgccgtga tcaccggggc ttgtgacaag 120 gactcccaat gtggtggagg catgtgctgt gctgtcagta tctgggtcaa gagcataagg 180 attt 184 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 12 ccatgaggag cctgtgctgc gcc 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 13 ctattcacat ttggtttcta ctc 23 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 14 gtcgaccacc atgaggagcc tgtgctgcg 29 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 15 actagtcgat tacttttggg ctaaac 26 <210> 16 <211> 346 <212> DNA <213> Human <400> 16 gtcgaccacc atgaggagcc tgtgctgcgc cccactcctg ctcctcttgc tgctgccgcc 60 gctgctgctc acgccccgcg ctggggacgc cgccgtgatc accggggctt gtgacaagga 120 ctcccaatgt ggtggaggca tgtgctgtgc tgtcagtatc tgggtcaaga gcataaggat 180 ttgcacacct atgggcaaac tgggagacag ctgccatcca ctgactcgta aagttccatt 240 ttttgggcgg aggatgcatc acacttgccc atgtctgcca ggcttggcct gtttacggac 300 ttcatttaac cgatttattt gtttagccca aaagtaatcg actagt 346 <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> Human <400> 17 Met Arg Ser Leu Cys Cys Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro 5 10 15 Pro Leu Leu Leu Thr Pro Arg Ala Gly Asp Ala Ala Val Ile Thr Gly 20 25 30 Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gln Cys Gly Gly Gly Met Cys Cys Ala Val 35 40 45 Ser Ile Trp Val Lys Ser Ile Arg Ile Cys Thr Pro Met Gly Lys Leu 50 55 60 Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val Pro Phe Phe Gly Arg 65 70 75 80 Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg 85 90 95 Thr Ser Phe Asn Arg Phe Ile Cys Leu Ala Gln Lys 100 105 <210> 18 <211> 324 <212> DNA <213> Human <400> 18 atgaggagcc tgtgctgcgc cccactcctg ctcctcttgc tgctgccgcc gctgctgctc 60 acgccccgcg ctggggacgc cgccgtgatc accggggctt gtgacaagga ctcccaatgt 120 ggtggaggca tgtgctgtgc tgtcagtatc tgggtcaaga gcataaggat ttgcacacct 180 atgggcaaac tgggagacag ctgccatcca ctgactcgta aagttccatt ttttgggcgg 240 aggatgcatc acacttgccc atgtctgcca ggcttggcct gtttacggac ttcatttaac 300 cgatttattt gtttagccca aaag 324 <210> 19 <211> 81 <212> PRT <213> Human <400> 19 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gln Cys Gly Gly Gly 5 10 15 Met Cys Cys Ala Val Ser Ile Trp Val Lys Ser Ile Arg Ile Cys Thr 20 25 30 Pro Met Gly Lys Leu Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val 35 40 45 Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly 50 55 60 Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe Ile Cys Leu Ala Gln 65 70 75 80 Lys <210> 20 <211> 243 <212> DNA <213> Human <400> 20 gccgtgatca ccggggcttg tgacaaggac tcccaatgtg gtggaggcat gtgctgtgct 60 gtcagtatct gggtcaagag cataaggatt tgcacaccta tgggcaaact gggagacagc 120 tgccatccac tgactcgtaa agttccattt tttgggcgga ggatgcatca cacttgccca 180 tgtctgccag gcttggcctg tttacggact tcatttaacc gatttatttg tttagcccaa 240 aag 243 <210> 21 <211> 80 <212> PRT <213> Dendroaspip polylepis <400> 21 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Leu Gln Cys Gly Lys Gly 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Val Ser Leu Trp Ile Lys Ser Val Arg Val Cys Thr 20 25 30 Pro Val Gly Thr Ser Gly Glu Asp Cys His Pro Ala Ser His Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Ser Gly Gln Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Ala Pro Asn 50 55 60 Leu Ala Cys Val Gln Thr Ser Pro Lys Lys Phe Lys Cys Leu Ser Lys 65 70 75 80 <210> 22 <211> 80 <212> PRT <213> Human <400> 22 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gln Cys Gly Gly Gly 5 10 15 Met Cys Cys Ala Val Ser Ile Trp Val Lys Ser Ile Arg Ile Cys Thr 20 25 30 Pro Met Gly Lys Leu Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val 35 40 45 Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly 50 55 60 Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe Ile Cys Leu Ala Gln 65 70 75 80 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 23 gcttgygaca aggactcyca 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 24 gttyctacty cagagygat 19 <210> 25 <211> 210 <212> DNA <213> Human <400> 25 gtgtggagga ggaatgtgct gcgctgtcag tatctgggtt aagagcataa ggatctgcac 60 acctatgggc caagtgggag acagctgcca ccccctgact cggaaagttc cattttgggg 120 gcggaggatg caccacactt gtccctgcct gccaggtttg gcatgtttaa ggacttcttt 180 caaccgtttt atttgtttgg cccggaagtg 210 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 26 gtgcatcctc cgcccccaaa atggaa 26 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 27 gacagcgcag cacattcctc ctccacac 28 <210> 28 <211> 148 <212> DNA <213> Human <400> 28 cgcgtcccta accgccaccg cctcctcggg acgccatgga ggacccgcgc tgtgccccgc 60 tactgctact tttgctgcta ccgctgctgc tcacaccgcc cgccggggat gccgcggtca 120 tcaccggggc ttgcgacaag gactctca 148 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 29 gagacagctg ccaccccctg actcggaa 28 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 30 ggcggaggat gcaccacact tgtccctg 28 <210> 31 <211> 150 <212> DNA <213> Rat <400> 31 cctgcctgcc aggtttggca tgtttaagga cttctttcaa ccgttttatt tgtttggccc 60 ggaagtgatc actctgaagc aggagctgga aatgtgaacc tctactcact gaacaatgtc 120 tgtcaagtct cgcttgtaat tgtgtcaaag 150 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 32 taaccgccac cgcctcct 18 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 33 gggacgccat ggaggac 17 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 34 cgagacttga cagacattgt tcagtg 26 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 35 tttccagctc ctgcttcaga 20 <210> 36 <211> 356 <212> DNA <213> Rat <400> 36 gggacgccat ggaggacccg cgctgtgccc cgctactgct acttttgctg ctaccgctgc 60 tgctcacacc gcccgccggg gatgccgcgg tcatcaccgg ggcttgcgac aaggactctc 120 agtgtggagg aggaatgtgc tgcgctgtca gtatctgggt taagagcata aggatctgca 180 cacctatggg ccaagtggga gacagctgcc accccctgac tcggaaagtt ccattttggg 240 ggcggaggat gcaccacact tgtccctgcc tgccaggttt ggcatgttta aggacttctt 300 tcaaccgttt tatttgtttg gcccggaagt gatcactctg aagcaggagc tggaaa 356 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Rat <400> 37 Met Glu Asp Pro Arg Cys Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro 5 10 15 Leu Leu Leu Thr Pro Pro Ala Gly Asp Ala Ala Val Ile Thr Gly Ala 20 25 30 Cys Asp Lys Asp Ser Gln Cys Gly Gly Gly Met Cys Cys Ala Val Ser 35 40 45 Ile Trp Val Lys Ser Ile Arg Ile Cys Thr Pro Met Gly Gln Val Gly 50 55 60 Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val Pro Phe Trp Gly Arg Arg 65 70 75 80 Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg Thr 85 90 95 Ser Phe Asn Arg Phe Ile Cys Leu Ala Arg Lys 100 105 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> Rat <400> 38 atggaggacc cgcgctgtgc cccgctactg ctacttttgc tgctaccgct gctgctcaca 60 ccgcccgccg gggatgccgc ggtcatcacc ggggcttgcg acaaggactc tcagtgtgga 120 ggaggaatgt gctgcgctgt cagtatctgg gttaagagca taaggatctg cacacctatg 180 ggccaagtgg gagacagctg ccaccccctg actcggaaag ttccattttg ggggcggagg 240 atgcaccaca cttgtccctg cctgccaggt ttggcatgtt taaggacttc tttcaaccgt 300 tttatttgtt tggcccggaa g 321 <210> 39 <211> 81 <212> PRT <213> Rat or Mouse <400> 39 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gln Cys Gly Gly Gly 5 10 15 Met Cys Cys Ala Val Ser Ile Trp Val Lys Ser Ile Arg Ile Cys Thr 20 25 30 Pro Met Gly Gln Val Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val 35 40 45 Pro Phe Trp Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly 50 55 60 Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe Ile Cys Leu Ala Arg 65 70 75 80 Lys <210> 40 <211> 243 <212> DNA <213> Rat <400> 40 gcggtcatca ccggggcttg cgacaaggac tctcagtgtg gaggaggaat gtgctgcgct 60 gtcagtatct gggttaagag cataaggatc tgcacaccta tgggccaagt gggagacagc 120 tgccaccccc tgactcggaa agttccattt tgggggcgga ggatgcacca cacttgtccc 180 tgcctgccag gtttggcatg tttaaggact tctttcaacc gttttatttg tttggcccgg 240 aag 243 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 41 gtcgacatgg agaccactgt ggggaccctg 30 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 42 actagtttat ttcagtcgga tgcagtccac 30 <210> 43 <211> 1179 <212> DNA <213> Rat <400> 43 atggagacca ctgtggggac cctgggcgag aataccacaa acactttcac cgacttcttt 60 tctgcacgtg atggcagtgg agccgaaacc tcccccttgc cattcacttt cagctatggt 120 gactatgaca tgccctcgga tgaagaggag gatgtgacca actctcggac tttctttgct 180 gccaagattg tcattggcat ggctttggtg ggcatcatgc tggtgtgtgg catcggcaac 240 ttcatcttca tcactgcgct ggcccgctac aaaaagcttc gcaacctcac caacctgctt 300 atcgccaacc tggccatttc ggacttcctg gtagccatcg tgtgctgccc ctttgagatg 360 gactactatg tggtacgcca gctctcctgg gagcacggcc atgtcctgtg cgcctccgtc 420 aactacttgc gcaccgtctc cctctacgtg tccactaacg ccctactggc cattgccatt 480 gacaggtatc tggccattgt gcacccgctg agaccgcgga tgaagtgtca aacggctgca 540 ggcctgatct tcctggtgtg gtctgtgtcc atcctcatcg ccatcccagc cgcctacttc 600 accactgaga cggtgttggt catcgtggaa agccaggaga agatcttctg cggccagatc 660 tggccggtgg atcagcagtt ctactacagg tcctatttcc ttttggtctt cggcctcgag 720 ttcgtgggtc ctgtaatcgc catgaccctg tgctatgcca gggtgtcccg agagctctgg 780 ttcaaggcgg tgcccggctt ccagacagag cagatccgcc ggaggctgcg ctgtcgccga 840 cggacggtac tggggctcgt gtgcgtcctt tccgcctatg tgctgtgctg ggctcccttc 900 tatggcttca ccatcgtgcg tgacttcttc ccctccgtgt ttgtgaaaga gaagcactac 960 ctcaccgcct tttatgtggt ggagtgcatc gccatgagca acagtatgat caatacgctg 1020 tgctttgtga ctgtcaggaa taacaccagt aagtacctca agaggatcct gcggctccag 1080 tggagggcct ctcctagcgg gagcaaggcc agcgctgacc tcgacctcag gaccacgggg 1140 attcctgcca cggaggaggt ggactgcatc cgactgaaa 1179 <210> 44 <211> 393 <212> PRT <213> Rat <400> 44 Met Glu Thr Thr Val Gly Thr Leu Gly Glu Asn Thr Thr Asn Thr Phe 5 10 15 Thr Asp Phe Phe Ser Ala Arg Asp Gly Ser Gly Ala Glu Thr Ser Pro 20 25 30 Leu Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Gly Asp Tyr Asp Met Pro Ser Asp Glu 35 40 45 Glu Glu Asp Val Thr Asn Ser Arg Thr Phe Phe Ala Ala Lys Ile Val 50 55 60 Ile Gly Met Ala Leu Val Gly Ile Met Leu Val Cys Gly Ile Gly Asn 65 70 75 80 Phe Ile Phe Ile Thr Ala Leu Ala Arg Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Thr Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Ala Ile Ser Asp Phe Leu Val Ala 100 105 110 Ile Val Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp Tyr Tyr Val Val Arg Gln Leu 115 120 125 Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys Ala Ser Val Asn Tyr Leu Arg 130 135 140 Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn Ala Leu Leu Ala Ile Ala Ile 145 150 155 160 Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Pro Leu Arg Pro Arg Met Lys Cys 165 170 175 Gln Thr Ala Ala Gly Leu Ile Phe Leu Val Trp Ser Val Ser Ile Leu 180 185 190 Ile Ala Ile Pro Ala Ala Tyr Phe Thr Thr Glu Thr Val Leu Val Ile 195 200 205 Val Glu Ser Gln Glu Lys Ile Phe Cys Gly Gln Ile Trp Pro Val Asp 210 215 220 Gln Gln Phe Tyr Tyr Arg Ser Tyr Phe Leu Leu Val Phe Gly Leu Glu 225 230 235 240 Phe Val Gly Pro Val Ile Ala Met Thr Leu Cys Tyr Ala Arg Val Ser 245 250 255 Arg Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro Gly Phe Gln Thr Glu Gln Ile 260 265 270 Arg Arg Arg Leu Arg Cys Arg Arg Arg Thr Val Leu Gly Leu Val Cys 275 280 285 Val Leu Ser Ala Tyr Val Leu Cys Trp Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Thr 290 295 300 Ile Val Arg Asp Phe Phe Pro Ser Val Phe Val Lys Glu Lys His Tyr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Phe Tyr Val Val Glu Cys Ile Ala Met Ser Asn Ser Met 325 330 335 Ile Asn Thr Leu Cys Phe Val Thr Val Arg Asn Asn Thr Ser Lys Tyr 340 345 350 Leu Lys Arg Ile Leu Arg Leu Gln Trp Arg Ala Ser Pro Ser Gly Ser 355 360 365 Lys Ala Ser Ala Asp Leu Asp Leu Arg Thr Thr Gly Ile Pro Ala Thr 370 375 380 Glu Glu Val Asp Cys Ile Arg Leu Lys 385 390 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 45 cctcaccaay ctgctyatyg ccaacctggc c 31 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 46 gtggtrcgsc agctctcctg ggagca 26 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 47 tcccgggagc tctggttcaa ggc 23 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 48 gagtgcatcg ccatgagcaa cagcatg 27 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 49 ggcttgaacc agagctcccg gga 23 <210> 50 <211> 1263 <212> DNA <213> Rat <400> 50 atggtatcag ttctgtccaa cagggacctc cacacactgg ccccagctga agtgctgaac 60 tccacgtggg cctatctccc tgacacatac cagcctacct gccacatcat caacatggga 120 gaccagaacg gaaacacaag ctttgcacca gacttgaacc caccccaaga ccacgtctcc 180 ttgctcccct taaactacag ttatggagat tatgacatcc ccctggatga cgatgaggat 240 gtgaccaaga cacagacctt ctttgcagcc aaaatcgtca ttggcgtagc cctggcaggc 300 atcatgctag tctgcggcgt tggcaacttt gtcttcattg ctgccctcgc ccgctacaag 360 aagctgcgca accttaccaa cctcctcatc gctaacctgg ccatctctga cttcctggtg 420 gcgatcgtct gctgcccctt tgagatggac tactacgtag tacgtcagct ttcctgggag 480 catggtcacg tgctttgtgc ctccgtcaac taccttcgta cagtctccct gtacgtctcc 540 accaatgctc tgctggccat cgctattgac agatatctcg ctattgtcca ccccttaaaa 600 cggatgaatt accagaccgc ctccttcctg atcgctttgg tctggatggt ctccatcctc 660 atcgccatcc catctgccta cttcaccaca gaaaccatcc ttgttatcgt caagaatcag 720 gaaaagctct tctgtggtca gatctggccc gtggaccagc agctctacta caaatcctac 780 ttcctcttcg tcttcgggct tgagttcgtg ggtcccgtgg tcactatgac cctgtgctat 840 gccaggatct cccaggagct ctggttcaag gctgtacctg gtttccagac ggagcagatc 900 cgcaagcgac tgcgctgccg ccgaaagaca gtgctattgc tcatgggtat cctcacagcc 960 tacgtgctgt gctgggcgcc tttctatggc tttaccatag tgcgagactt cttccccacg 1020 ctggttgtga aggagaagca ctacctcacc gccttctatg tcgtcgagtg catcgccatg 1080 agcaacagca tgatcaatac tatatgcttc gtgacggtca agaacaacac catgaaatac 1140 ttcaagaaga tgctgctgct gcactggcgg ccctctcact acgggagtaa gtccagcgcg 1200 gacctcgacc tcaaaaccag tggggttcct gccaccgaag aggtggactg tatcaggcta 1260 aag 1263 <210> 51 <211> 421 <212> PRT <213> Rat <400> 51 Met Val Ser Val Leu Ser Asn Arg Asp Leu His Thr Leu Ala Pro Ala 5 10 15 Glu Val Leu Asn Ser Thr Trp Ala Tyr Leu Pro Asp Thr Tyr Gln Pro 20 25 30 Thr Cys His Ile Ile Asn Met Gly Asp Gln Asn Gly Asn Thr Ser Phe 35 40 45 Ala Pro Asp Leu Asn Pro Pro Gln Asp His Val Ser Leu Leu Pro Leu 50 55 60 Asn Tyr Ser Tyr Gly Asp Tyr Asp Ile Pro Leu Asp Asp Asp Glu Asp 65 70 75 80 Val Thr Lys Thr Gln Thr Phe Phe Ala Ala Lys Ile Val Ile Gly Val 85 90 95 Ala Leu Ala Gly Ile Met Leu Val Cys Gly Val Gly Asn Phe Val Phe 100 105 110 Ile Ala Ala Leu Ala Arg Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu Thr Asn Leu 115 120 125 Leu Ile Ala Asn Leu Ala Ile Ser Asp Phe Leu Val Ala Ile Val Cys 130 135 140 Cys Pro Phe Glu Met Asp Tyr Tyr Val Val Arg Gln Leu Ser Trp Glu 145 150 155 160 His Gly His Val Leu Cys Ala Ser Val Asn Tyr Leu Arg Thr Val Ser 165 170 175 Leu Tyr Val Ser Thr Asn Ala Leu Leu Ala Ile Ala Ile Asp Arg Tyr 180 185 190 Leu Ala Ile Val His Pro Leu Lys Arg Met Asn Tyr Gln Thr Ala Ser 195 200 205 Phe Leu Ile Ala Leu Val Trp Met Val Ser Ile Leu Ile Ala Ile Pro 210 215 220 Ser Ala Tyr Phe Thr Thr Glu Thr Ile Leu Val Ile Val Lys Asn Gln 225 230 235 240 Glu Lys Leu Phe Cys Gly Gln Ile Trp Pro Val Asp Gln Gln Leu Tyr 245 250 255 Tyr Lys Ser Tyr Phe Leu Phe Val Phe Gly Leu Glu Phe Val Gly Pro 260 265 270 Val Val Thr Met Thr Leu Cys Tyr Ala Arg Ile Ser Gln Glu Leu Trp 275 280 285 Phe Lys Ala Val Pro Gly Phe Gln Thr Glu Gln Ile Arg Lys Arg Leu 290 295 300 Arg Cys Arg Arg Lys Thr Val Leu Leu Leu Met Gly Ile Leu Thr Ala 305 310 315 320 Tyr Val Leu Cys Trp Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Thr Ile Val Arg Asp 325 330 335 Phe Phe Pro Thr Leu Val Val Lys Glu Lys His Tyr Leu Thr Ala Phe 340 345 350 Tyr Val Val Glu Cys Ile Ala Met Ser Asn Ser Met Ile Asn Thr Ile 355 360 365 Cys Phe Val Thr Val Lys Asn Asn Thr Met Lys Tyr Phe Lys Lys Met 370 375 380 Leu Leu Leu His Trp Arg Pro Ser His Tyr Gly Ser Lys Ser Ser Ala 385 390 395 400 Asp Leu Asp Leu Lys Thr Ser Gly Val Pro Ala Thr Glu Glu Val Asp 405 410 415 Cys Ile Arg Leu Lys 420 <210> 52 <211> 384 <212> PRT <213> Human <400> 52 Met Ala Ala Gln Asn Gly Asn Thr Ser Phe Thr Pro Asn Phe Asn Pro 5 10 15 Pro Gln Asp His Ala Ser Ser Leu Ser Phe Asn Phe Ser Tyr Gly Asp 20 25 30 Tyr Asp Leu Pro Met Asp Glu Asp Glu Asp Met Thr Lys Thr Arg Thr 35 40 45 Phe Phe Ala Ala Lys Ile Val Ile Gly Ile Ala Leu Ala Gly Ile Met 50 55 60 Leu Val Cys Gly Ile Gly Asn Phe Val Phe Ile Ala Ala Leu Thr Arg 65 70 75 80 Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu Thr Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Ala 85 90 95 Ile Ser Asp Phe Leu Val Ala Ile Ile Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp 100 105 110 Tyr Tyr Val Val Arg Gln Leu Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys 115 120 125 Ala Ser Val Asn Tyr Leu Arg Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn 130 135 140 Ala Leu Leu Ala Ile Ala Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Pro 145 150 155 160 Leu Lys Pro Arg Met Asn Tyr Gln Thr Ala Ser Phe Leu Ile Ala Leu 165 170 175 Val Trp Met Val Ser Ile Leu Ile Ala Ile Pro Ser Ala Tyr Phe Ala 180 185 190 Thr Glu Thr Val Leu Phe Ile Val Lys Ser Gln Glu Lys Ile Phe Cys 195 200 205 Gly Gln Ile Trp Pro Val Asp Gln Gln Leu Tyr Tyr Lys Ser Tyr Phe 210 215 220 Leu Phe Ile Phe Gly Val Glu Phe Val Gly Pro Val Val Thr Met Thr 225 230 235 240 Leu Cys Tyr Ala Arg Ile Ser Arg Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro 245 250 255 Gly Phe Gln Thr Glu Gln Ile Arg Lys Arg Leu Arg Cys Arg Arg Lys 260 265 270 Thr Val Leu Val Leu Met Cys Ile Leu Thr Ala Tyr Val Leu Cys Trp 275 280 285 Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Thr Ile Val Arg Asp Phe Phe Pro Thr Val 290 295 300 Phe Val Lys Glu Lys His Tyr Leu Thr Ala Phe Tyr Val Val Glu Cys 305 310 315 320 Ile Ala Met Ser Asn Ser Met Ile Asn Thr Val Cys Phe Val Thr Val 325 330 335 Lys Asn Asn Thr Met Lys Tyr Phe Lys Lys Met Met Leu Leu His Trp 340 345 350 Arg Pro Ser Gln Arg Gly Ser Lys Ser Ser Ala Asp Leu Asp Leu Arg 355 360 365 Thr Asn Gly Val Pro Thr Thr Glu Glu Val Asp Cys Ile Arg Leu Lys 370 375 380 384 <210> 53 <211> 393 <212> PRT <213> Mouse <400> 53 Met Glu Thr Thr Val Gly Ala Leu Gly Glu Asn Thr Thr Asp Thr Phe 5 10 15 Thr Asp Phe Phe Ser Ala Leu Asp Gly His Glu Ala Gln Thr Gly Ser 20 25 30 Leu Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Gly Asp Tyr Asp Met Pro Leu Asp Glu 35 40 45 Glu Glu Asp Val Thr Asn Ser Arg Thr Phe Phe Ala Ala Lys Ile Val 50 55 60 Ile Gly Met Ala Leu Val Gly Ile Met Leu Val Cys Gly Ile Gly Asn 65 70 75 80 Phe Ile Phe Ile Thr Ala Leu Ala Arg Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Thr Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Ala Ile Ser Asp Phe Leu Val Ala 100 105 110 Ile Val Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp Tyr Tyr Val Val Arg Gln Leu 115 120 125 Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys Ala Ser Val Asn Tyr Leu Arg 130 135 140 Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn Ala Leu Leu Ala Ile Ala Ile 145 150 155 160 Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Pro Leu Arg Pro Arg Met Lys Cys 165 170 175 Gln Thr Ala Ala Gly Leu Ile Phe Leu Val Trp Ser Val Ser Ile Leu 180 185 190 Ile Ala Ile Pro Ala Ala Tyr Phe Thr Thr Glu Thr Val Leu Val Ile 195 200 205 Val Glu Arg Gln Glu Lys Ile Phe Cys Gly Gln Ile Trp Pro Val Asp 210 215 220 Gln Gln Phe Tyr Tyr Arg Ser Tyr Phe Leu Leu Val Phe Gly Leu Glu 225 230 235 240 Phe Val Gly Pro Val Val Ala Met Thr Leu Cys Tyr Ala Arg Val Ser 245 250 255 Arg Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro Gly Phe Gln Thr Glu Gln Ile 260 265 270 Arg Arg Thr Val Arg Cys Arg Arg Arg Thr Val Leu Gly Leu Val Cys 275 280 285 Val Leu Ser Ala Tyr Val Leu Cys Trp Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Thr 290 295 300 Ile Val Arg Asp Phe Phe Pro Ser Val Phe Val Lys Glu Lys His Tyr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Phe Tyr Val Val Glu Cys Ile Ala Met Ser Asn Ser Met 325 330 335 Ile Asn Thr Leu Cys Phe Val Thr Val Arg Asn Asn Thr Ser Lys Tyr 340 345 350 Leu Lys Arg Ile Leu Arg Leu Gln Trp Arg Ala Ser Pro Ser Gly Ser 355 360 365 Lys Ala Ser Ala Asp Leu Asp Leu Arg Thr Thr Gly Ile Pro Ala Thr 370 375 380 Glu Glu Val Asp Cys Ile Arg Leu Lys 385 390 393 <210> 54 <211> 381 <212> PRT <213> Mouse <400> 54 Met Gly Pro Gln Asn Arg Asn Thr Ser Phe Ala Pro Asp Leu Asn Pro 5 10 15 Pro Gln Asp His Val Ser Leu Asn Tyr Ser Tyr Gly Asp Tyr Asp Leu 20 25 30 Pro Leu Gly Glu Asp Glu Asp Val Thr Lys Thr Gln Thr Phe Phe Ala 35 40 45 Ala Lys Ile Val Ile Gly Val Ala Leu Ala Gly Ile Met Leu Val Cys 50 55 60 Gly Ile Gly Asn Phe Val Phe Ile Ala Ala Leu Ala Arg Tyr Lys Lys 65 70 75 80 Leu Arg Asn Leu Thr Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Ala Ile Ser Asp 85 90 95 Phe Leu Val Ala Ile Val Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp Tyr Tyr Val 100 105 110 Val Arg Gln Leu Ser Trp Ala His Gly His Val Leu Cys Ala Ser Val 115 120 125 Asn Tyr Leu Arg Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn Ala Leu Leu 130 135 140 Ala Ile Ala Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Pro Leu Lys Pro 145 150 155 160 Arg Met Asn Tyr Gln Thr Ala Ser Phe Leu Ile Ala Leu Val Trp Met 165 170 175 Val Ser Ile Leu Ile Ala Val Pro Ser Ala Tyr Phe Thr Thr Glu Thr 180 185 190 Ile Leu Val Ile Val Lys Asn Gln Glu Lys Ile Phe Cys Gly Gln Ile 195 200 205 Trp Ser Val Asp Gln Gln Leu Tyr Tyr Lys Ser Tyr Phe Leu Phe Val 210 215 220 Phe Gly Leu Glu Phe Val Gly Pro Val Val Thr Met Thr Leu Cys Tyr 225 230 235 240 Ala Arg Ile Ser Gln Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro Gly Phe Gln 245 250 255 Thr Glu Gln Ile Arg Lys Arg Leu Arg Cys Arg Arg Lys Thr Val Leu 260 265 270 Leu Leu Met Gly Ile Leu Thr Ala Tyr Val Leu Cys Trp Ala Pro Phe 275 280 285 Tyr Gly Phe Thr Ile Val Arg Asp Phe Phe Pro Thr Val Val Val Lys 290 295 300 Glu Lys His Tyr Leu Thr Ala Phe Tyr Val Val Glu Cys Ile Ala Met 305 310 315 320 Ser Asn Ser Met Ile Asn Thr Ile Cys Phe Val Thr Val Lys Asn Asn 325 330 335 Thr Met Lys Tyr Phe Lys Lys Met Leu Arg Leu His Trp Arg Pro Ser 340 345 350 His Tyr Gly Ser Lys Ser Ser Ala Asp Leu Asp Leu Lys Thr Ser Gly 355 360 365 Val Pro Ala Thr Glu Glu Val Asp Cys Ile Arg Leu Lys 370 375 380 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> Mouse <400> 55 Met Gly Asp Pro Arg Cys Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro 5 10 15 Leu Leu Phe Thr Pro Pro Ala Gly Asp Ala Ala Val Ile Thr Gly Ala 20 25 30 Cys Asp Lys Asp Ser Gln Cys Gly Gly Gly Met Cys Cys Ala Val Ser 35 40 45 Ile Trp Val Lys Ser Ile Arg Ile Cys Thr Pro Met Gly Gln Val Gly 50 55 60 Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val Pro Phe Trp Gly Arg Arg 65 70 75 80 Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg Thr 85 90 95 Ser Phe Asn Arg Phe Ile Cys Leu Ala Arg Lys 100 105 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Mouse <400> 56 atgggggacc cgcgctgtgc cccgctactg ctacttctgc tgctaccgct gctgttcaca 60 ccgcccgccg gggatgccgc ggtcatcacc ggggcttgcg acaaggactc tcagtgcgga 120 ggaggcatgt gctgtgctgt cagtatctgg gttaagagca taaggatctg cacacctatg 180 ggccaagtgg gcgacagctg ccaccccctg actcggaaag ttccattttg ggggcggagg 240 atgcaccaca cctgcccctg cctgccaggc ttggcgtgtt taaggacttc tttcaaccgg 300 tttatttgct tggcccggaa a 321 <210> 57 <211> 243 <212> DNA <213> Mouse <400> 57 gcggtcatca ccggggcttg cgacaaggac tctcagtgcg gaggaggcat gtgctgtgct 60 gtcagtatct gggttaagag cataaggatc tgcacaccta tgggccaagt gggcgacagc 120 tgccaccccc tgactcggaa agttccattt tgggggcgga ggatgcacca cacctgcccc 180 tgcctgccag gcttggcgtg tttaaggact tctttcaacc ggtttatttg cttggcccgg 240 aaa 243 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 58 tcatgttgct ccactggaag g 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 59 ccaattgtct tgaggtccag g 21 <210> 60 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 60 ttcttacaat ggcggtaagt ccagtgcag 29 <210> 61 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 61 gtcgacatgg agaccaccat ggggttcatg g 31 <210> 62 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 62 actagtttat tttagtctga tgcagtccac ctcttc 36 <210> 63 <211> 1179 <212> DNA <213> Mouse <400> 63 atggagacca ctgtcggggc tctgggtgag aataccacag acaccttcac cgacttcttt 60 tctgcactcg atggccatga agcccaaacc ggctcgttac cattcacttt cagctacggt 120 gactatgaca tgcccctgga tgaagaggaa gatgtgacca attctcggac tttctttgct 180 gccaagattg tcattggcat ggctttggtg ggtatcatgc tagtgtgtgg catcggcaac 240 ttcatcttta tcactgccct ggcccgctac aaaaagctcc gcaacctcac caacctgctt 300 atcgccaacc tggccatttc agacttcctc gtggccatcg tgtgctgccc ctttgagatg 360 gactactatg tggtgcgcca gctctcctgg gagcatggtc atgtcctgtg cgcctctgtc 420 aactacttgc gtaccgtctc cctctacgtc tccactaacg ccctactggc cattgccatt 480 gacaggtatc tggccattgt gcacccgctg agaccgcgga tgaagtgtca aacagccgcc 540 ggcctgatct tcctggtgtg gtcagtatcc atcctcatcg ccattccagc tgcctacttc 600 accactgaga ccgtgctggt catcgtggag agacaggaga agatcttctg tggtcagatc 660 tggccggtgg atcagcagtt ctactacagg tcctatttcc ttttggtttt cggcctcgag 720 ttcgtgggcc ccgtagtcgc catgaccttg tgctatgcca gggtgtcccg ggagctctgg 780 ttcaaggcgg tgccaggctt ccagacagag cagatccgcc ggacggtgcg ctgccgccgc 840 aggacggtgc tggggctcgt gtgcgtcctc tctgcctatg tgctgtgctg ggctcccttc 900 tatggcttca ctatcgtgcg tgacttcttc ccctccgtgt ttgtgaagga gaagcactac 960 ctcaccgcct tctatgtggt ggagtgcatc gccatgagca acagcatgat caatacgctc 1020 tgctttgtga ctgtcaggaa taacaccagt aagtacctca agaggatcct gcggcttcag 1080 tggagggcct ctcccagcgg gagcaaggcc agcgctgacc tcgacctcag gaccacggga 1140 atacctgcca ccgaggaggt ggactgcatc cgactgaaa 1179 <210> 64 <211> 1143 <212> DNA <213> Mouse <400> 64 atgggacccc agaacagaaa cactagcttt gcaccagact tgaatccacc ccaagaccat 60 gtctccttaa actacagtta tggtgattat gacctccccc tgggtgagga tgaggatgtg 120 accaagacac agaccttctt tgcagccaaa attgtcattg gcgtggcact ggcaggcatc 180 atgctggtct gcggcattgg caactttgtc ttcattgctg ccctcgcccg ctacaagaag 240 ctgcgcaacc ttaccaacct cctcattgct aacctggcca tctctgactt cctggtggcg 300 atcgtctgct gcccctttga gatggactat tatgtagtac ggcagctttc ctgggcgcat 360 ggtcacgtgc tttgtgcctc cgtcaactac cttcgtacgg tctccctgta cgtctccacc 420 aacgctctgc tggccatcgc tattgacaga tacctcgcta ttgtccaccc tttgaaacca 480 cggatgaatt atcagaccgc ttccttcctg atcgctttgg tctggatggt ctccatcctc 540 atcgctgtcc catctgccta cttcaccaca gaaaccatcc tcgttatcgt caagaatcaa 600 gaaaaaatct tctgtggtca gatctggtcg gtggaccagc agctctacta caaatcctac 660 ttcctcttcg tcttcgggct tgagttcgtg ggtcccgtgg tcactatgac cctgtgctat 720 gccaggatct cccaagagct ctggttcaag gctgtacctg gcttccagac ggagcaaatc 780 cgcaagcggc tgcgttgccg ccgcaagaca gtgctactgc tcatgggcat cctcacagcc 840 tacgtgctgt gctgggcgcc gttctatggc tttaccatag tgcgagactt cttccccacg 900 gtagttgtga aggagaagca ctacctcacc gccttctacg tcgtggagtg cattgccatg 960 agcaacagca tgatcaatac tatatgcttc gtgacggtca agaacaacac catgaaatac 1020 ttcaagaaga tgctgcggct ccactggcgg ccctctcact acgggagtaa gtccagcgct 1080 gacctcgacc tcaaaaccag cggggtgcct gccactgaag aggtggattg tatcagacta 1140 aag 1143 <210> 65 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 65 tatggcggtg attaccggtg cgtgcgataa agatagccag tgcggtggcg gtatgtgctg 60 tgcggtgagc atttgggtga aa 82 <210> 66 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 agcattcgta tttgcacccc gatgggcaaa ctgggcgata gctgccatcc gctgacccgt 60 aaagtgccgt tttttggccg cc 82 <210> 67 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 67 gtatgcatca tacctgcccg tgcctgccgg gcctggcgtg cctgcgcacc agctttaacc 60 gctttatttg cctggcgcag aaatagg 87 <210> 68 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 68 cgaatgcttt tcacccaaat gctcaccgca cagcacatac cgccaccgca ctggctatct 60 ttatcgcacg caccggtaat caccgcca 88 <210> 69 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 69 atgatgcata cggcggccaa aaaacggcac tttacgggtc agcggatggc agctatcgcc 60 cagtttgccc atcggggtgc aaata 85 <210> 70 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 70 gatccctatt tctgcgccag gcaaataaag cggttaaagc tggtgcgcag gcacgccagg 60 cccggcaggc acgggcaggt 80 <210> 71 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 71 gcggtgatta ccggtgcgtg cgataaagat agccagtgcg gtggcggtat gtgctgtgcg 60 gtgagcattt gggtgaaaag cattcgtatt tgcaccccga tgggcaaact gggcgatagc 120 tgccatccgc tgacccgtaa agtgccgttt tttggccgcc gtatgcatca tacctgcccg 180 tgcctgccgg gcctggcgtg cctgcgcacc agctttaacc gctttatttg cctggcgcag 240 aaa 243 <210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Bovine <400> 72 Ala Val Ile Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp Val Gln Xaa Arg Ala Gly 5 10 15 <210> 73 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 73 ggtgccacgc gagtctcaat catgctcc 28 <210> 74 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 74 ggggcctgtg agcgggatgt ccagtgtg 28 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 75 cttcttcagg aaacgcaagc accacacc 28 <210> 76 <211> 409 <212> DNA <213> Human <400> 76 cttcttcagg aaacgcaagc accacacctg tccttgcttg cccaacctgc tgtgctccag 60 gttcccggac ggcaggtacc gctgctccat ggacttgaag aacatcaatt tttaggcgct 120 tgcctggtct caggataccc accatccttt tcctgagcac agcctggatt tttatttctg 180 ccatgaaacc cagctcccat gactctccca gtccctacac tgactaccct gatctctctt 240 gtctagtacg cacatatgca cacaggcaga catacctccc atcatgacat ggtccccagg 300 ctggcctgag gatgtcacag cttgaggctg tggtgtgaaa ggtggccagc ctggttctct 360 tccctgctca ggctgccaga gaggtggtaa atggcagaaa ggacattcc 409 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 77 ccaccatgag aggtgccacg 20 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 78 ctcgagctca ggaaaaggat ggtg 24 <210> 79 <211> 371 <212> DNA <213> Human <400> 79 ccaccatgag aggtgccacg cgagtctcaa tcatgctcct cctagtaact gtgtctgact 60 gtgctgtgat cacaggggcc tgtgagcggg atgtccagtg tggggcaggc acctgctgtg 120 ccatcagcct gtggcttcga gggctgcgga tgtgcacccc gctggggcgg gaaggcgagg 180 agtgccaccc cggcagccac aagatcccct tcttcaggaa acgcaagcac cacacctgtc 240 cttgcttgcc caacctgctg tgctccaggt tcccggacgg caggtaccgc tgctccatgg 300 acttgaagaa catcaatttt taggcgcttg cctggtctca ggatacccac catccttttc 360 ctgagctcga g 371 <210> 80 <211> 371 <212> DNA <213> Human <400> 80 ccaccatgag aggtgccacg cgagtctcaa tcatgctcct cctagtaact gtgtctgact 60 gtgctgtgat cacaggggcc tgtgagcggg atgtccagtg tggggcaggc acctgctgtg 120 ccatcagcct gtggcttcga gggctgcgga tgtgcacccc gctggggcgg gaaggcgagg 180 agtgccaccc cggcagccac aaggtcccct tcttcaggaa acgcaagcac cacacctgtc 240 cttgcttgcc caacctgctg tgctccaggt tcccggacgg caggtaccgc tgctccatgg 300 acttgaagaa catcaatttt taggcgcttg cctggtctca ggatacccac catccttttc 360 ctgagctcga g 371 <210> 81 <211> 86 <212> PRT <213> Human <400> 81 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ile Asn Phe 85 <210> 82 <211> 86 <212> PRT <213> Human <400> 82 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Met Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Val 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Asn 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Met Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ile Asn Phe 85 <210> 83 <211> 105 <212> PRT <213> Human <400> 83 Met Arg Gly Ala Thr Arg Val Ser Ile Met Leu Leu Leu Val Thr Val 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 His Lys Ile Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Ser Met Asp Leu Lys Asn Ile Asn Phe 100 105 <210> 84 <211> 105 <212> PRT <213> Human <400> 84 Met Arg Gly Ala Thr Arg Val Ser Ile Met Leu Leu Leu Val Thr Val 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Met Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 His Lys Val Pro Phe Phe Arg Lys Arg Lys His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Ser Met Asp Leu Lys Asn Ile Asn Phe 100 105 <210> 85 <211> 678 <212> DNA <213> Human <400> 85 aaggctgagc gggaggaagc gagaggcatc taagcaggca gtgttttgcc ttcaccccaa 60 gtgaccatga gaggtgccac gcgagtctca atcatgctcc tcctagtaac tgtgtctgac 120 tgtgctgtga tcacaggggc ctgtgagcgg gatgtccagt gtggggcagg cacctgctgt 180 gccatcagcc tgtggcttcg agggctgcgg atgtgcaccc cgctggggcg ggaaggcgag 240 gagtgccacc ccggcagcca caagatcccc ttcttcagga aacgcaagca ccacacctgt 300 ccttgcttgc ccaacctgct gtgctccagg ttcccggacg gcaggtaccg ctgctccatg 360 gacttgaaga acatcaattt ttaggcgctt gcctggtctc aggataccca ccatcctttt 420 cctgagcaca gcctggattt ttatttctgc catgaaaccc agctcccatg actctcccag 480 tccctacact gactaccctg atctctcttg tctagtacgc acatatgcac acaggcagac 540 atacctccca tcatgacatg gtccccaggc tggcctgagg atgtcacagc ttgaggctgt 600 ggtgtgaaag gtggccagcc tggttctctt ccctgctcag gctgccagag aggtggtaaa 660 tggcagaaag gacattcc 678 <210> 86 <211> 678 <212> DNA <213> Human <400> 86 aaggctgagc gggaggaagc gagaggcatc taagcaggca gtgttttgcc ttcaccccaa 60 gtgaccatga gaggtgccac gcgagtctca atcatgctcc tcctagtaac tgtgtctgac 120 tgtgctgtga tcacaggggc ctgtgagcgg gatgtccagt gtggggcagg cacctgctgt 180 gccatcagcc tgtggcttcg agggctgcgg atgtgcaccc cgctggggcg ggaaggcgag 240 gagtgccacc ccggcagcca caaggtcccc ttcttcagga aacgcaagca ccacacctgt 300 ccttgcttgc ccaacctgct gtgctccagg ttcccggacg gcaggtaccg ctgctccatg 360 gacttgaaga acatcaattt ttaggcgctt gcctggtctc aggataccca ccatcctttt 420 cctgagcaca gcctggattt ttatttctgc catgaaaccc agctcccatg actctcccag 480 tccctacact gactaccctg atctctcttg tctagtacgc acatatgcac acaggcagac 540 atacctccca tcatgacatg gtccccaggc tggcctgagg atgtcacagc ttgaggctgt 600 ggtgtgaaag gtggccagcc tggttctctt ccctgctcag gctgccagag aggtggtaaa 660 tggcagaaag gacattcc 678 <210> 87 <211> 258 <212> DNA <213> Human <400> 87 gctgtgatca caggggcctg tgagcgggat gtccagtgtg gggcaggcac ctgctgtgcc 60 atcagcctgt ggcttcgagg gctgcggatg tgcaccccgc tggggcggga aggcgaggag 120 tgccaccccg gcagccacaa gatccccttc ttcaggaaac gcaagcacca cacctgtcct 180 tgcttgccca acctgctgtg ctccaggttc ccggacggca ggtaccgctg ctccatggac 240 ttgaagaaca tcaatttt 258 <210> 88 <211> 258 <212> DNA <213> Human <400> 88 gctgtgatca caggggcctg tgagcgggat gtccagtgtg gggcaggcac ctgctgtgcc 60 atcagcctgt ggcttcgagg gctgcggatg tgcaccccgc tggggcggga aggcgaggag 120 tgccaccccg gcagccacaa ggtccccttc ttcaggaaac gcaagcacca cacctgtcct 180 tgcttgccca acctgctgtg ctccaggttc ccggacggca ggtaccgctg ctccatggac 240 ttgaagaaca tcaatttt 258 <210> 89 <211> 315 <212> DNA <213> Human <400> 89 atgagaggtg ccacgcgagt ctcaatcatg ctcctcctag taactgtgtc tgactgtgct 60 gtgatcacag gggcctgtga gcgggatgtc cagtgtgggg caggcacctg ctgtgccatc 120 agcctgtggc ttcgagggct gcggatgtgc accccgctgg ggcgggaagg cgaggagtgc 180 caccccggca gccacaagat ccccttcttc aggaaacgca agcaccacac ctgtccttgc 240 ttgcccaacc tgctgtgctc caggttcccg gacggcaggt accgctgctc catggacttg 300 aagaacatca atttt 315 <210> 90 <211> 315 <212> DNA <213> Human <400> 90 atgagaggtg ccacgcgagt ctcaatcatg ctcctcctag taactgtgtc tgactgtgct 60 gtgatcacag gggcctgtga gcgggatgtc cagtgtgggg caggcacctg ctgtgccatc 120 agcctgtggc ttcgagggct gcggatgtgc accccgctgg ggcgggaagg cgaggagtgc 180 caccccggca gccacaaggt ccccttcttc aggaaacgca agcaccacac ctgtccttgc 240 ttgcccaacc tgctgtgctc caggttcccg gacggcaggt accgctgctc catggacttg 300 aagaacatca atttt 315 <210> 91 <211> 382 <212> DNA <213> Human <400> 91 gaattcgccc ttccaccatg agaggtgcca cgcgagtctc aatcatgctc ctcctagtaa 60 ctgtgtctga ctgtgctgtg atcacagggg cctgtgagcg ggatgtccag tgtggggcag 120 gcacctgctg tgccatcagc ctgtggcttc gagggctgcg gatgtgcacc ccgctggggc 180 gggaaggcga ggagtgccac cccggcagcc acaaggtccc cttcttcagg aaacgcaagc 240 accacacctg tccttgcttg cccaacctgc tgtgctccag gttcccggac ggcaggtacc 300 gctgctccat ggacttgaag aacatcaatt tttaggcgct tgcctggtct caggataccc 360 accatccttt cctgagctcg ag 382 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 92 Ala Val Ile Thr Gly Ala Xaa Glu Arg Asp 5 10 <210> 93 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 93 gtcgaccacc atgagaggtg ccacgc 26 <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 94 actagtcgca gaactggtag gtatgg 26 <210> 95 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 95 tatggcggtg attaccggtg cgtgcgaacg tgatgtgcag tgcggtgcgg gtacctgctg 60 cgcgattagc ctgtggctgc gtggtctg 88 <210> 96 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 96 cgtatgtgca ccccgctggg tcgtgaaggt gaagaatgcc atccgggtag ccataaagtg 60 ccgttcttcc gtaaacgtaa acatcatacc tg 92 <210> 97 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 97 cccgtgcctg ccgaacctgc tgtgcagccg tttcccggat ggtcgttatc gttgcagcat 60 ggatctgaaa aacattaact tttagg 86 <210> 98 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 98 cacatacgca gaccacgcag ccacaggcta atcgcgcagc aggtacccgc accgcactgc 60 acatcacgtt cgcacgcacc ggtaatcacc gcca 94 <210> 99 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 99 aggcacgggc aggtatgatg tttacgttta cggaagaacg gcactttatg gctacccgga 60 tggcattctt caccttcacg acccagcggg gtg 93 <210> 100 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 100 gatccctaaa agttaatgtt tttcagatcc atgctgcaac gataacgacc atccgggaaa 60 cggctgcaca gcaggttcgg c 81 <210> 101 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 101 gcggtgatta ccggtgcgtg cgaacgtgat gtgcagtgcg gtgcgggtac ctgctgcgcg 60 attagcctgt ggctgcgtgg tctgcgtatg tgcaccccgc tgggtcgtga aggtgaagaa 120 tgccatccgg gtagccataa agtgccgttc ttccgtaaac gtaaacatca tacctgcccg 180 tgcctgccga acctgctgtg cagccgtttc ccggatggtc gttatcgttg cagcatggat 240 ctgaaaaaca ttaacttt 258 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 102 cttggccttc tcggcttgtc tag 23 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 103 ggtgtaaagc aagaggtcac ccagt 25 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 104 acaaggcagc gcagaaggaa gt 22 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 105 ggctccagta cagagtccag acaa 24 <210> 106 <211> 410 <212> DNA <213> Mouse <400> 106 acaaggcagc gcagaaggaa gtgaggggta ccaaagtaga ctgtgtttgt cgtcacctca 60 agtgatcatg agaggcgctg tgcatatctt catcatgctc cttctagcaa cggcgtccga 120 ctgtgcggtc atcacagggg cctgtgaacg agatatccag tgtggggccg gcacctgctg 180 cgctatcagt ctgtggctgc ggggcctgcg gttgtgtacc ccactggggc gtgaaggaga 240 ggagtgccac ccaggaagcc acaagatccc cttcttgagg aaacgccaac accatacctg 300 tccctgctca cccagcctgc tgtgctccag gttcccggac ggcaggtacc gctgcttccg 360 ggacttgaag aatgccaact tttagtttgt ctggactctg tactggagcc 410 <210> 107 <211> 105 <212> PRT <213> Mouse <400> 107 Met Arg Gly Ala Val His Ile Phe Ile Met Leu Leu Leu Ala Thr Ala 1 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Ile Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Leu Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 His Lys Ile Pro Phe Leu Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Phe Arg Asp Leu Lys Asn Ala Asn Phe 100 105 <210> 108 <211> 315 <212> DNA <213> Mouse <400> 108 atgagaggcg ctgtgcatat cttcatcatg ctccttctag caacggcgtc cgactgtgcg 60 gtcatcacag gggcctgtga acgagatatc cagtgtgggg ccggcacctg ctgcgctatc 120 agtctgtggc tgcggggcct gcggttgtgt accccactgg ggcgtgaagg agaggagtgc 180 cacccaggaa gccacaagat ccccttcttg aggaaacgcc aacaccatac ctgtccctgc 240 tcacccagcc tgctgtgctc caggttcccg gacggcaggt accgctgctt ccgggacttg 300 aagaatgcca acttt 315 <210> 109 <211> 86 <212> PRT <213> Mouse <400> 109 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Ile Gln Cys Gly Ala Gly 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Leu Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Leu Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Phe Arg Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ala Asn Phe 85 <210> 110 <211> 258 <212> DNA <213> Mouse <400> 110 gcggtcatca caggggcctg tgaacgagat atccagtgtg gggccggcac ctgctgcgct 60 atcagtctgt ggctgcgggg cctgcggttg tgtaccccac tggggcgtga aggagaggag 120 tgccacccag gaagccacaa gatccccttc ttgaggaaac gccaacacca tacctgtccc 180 tgctcaccca gcctgctgtg ctccaggttc ccggacggca ggtaccgctg cttccgggac 240 ttgaagaatg ccaacttt 258 <210> 111 <211> 364 <212> DNA <213> Mouse <400> 111 gaggggtacc aaagtagact gtgtttgtcg tcacctcaag tgatcatgag aggcgctgtg 60 catatcttca tcatgctcct tctagcaacg gcgtccgact gtgcggtcat cacaggggcc 120 tgtgaacgag atatccagtg tggggccggc acctgctgcg ctatcagtct gtggctgcgg 180 ggcctgcggt tgtgtacccc actggggcgt gaaggagagg agtgccaccc aggaagccac 240 aagatcccct tcttgaggaa acgccaacac catacctgtc cctgctcacc cagcctgctg 300 tgctccaggt tcccggacgg caggtaccgc tgcttccggg acttgaagaa tgccaacttt 360 tagt 364 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 112 tcaccycaag tgaycatgag agg 23 <210> 113 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 113 ctaaaarttg ryrttcttca agtcc 25 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 114 atcacagggg cctgtgarcg 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 115 agcagcggta cctgccgtcc 20 <210> 116 <211> 186 <212> DNA <213> Rat <400> 116 agatgtccag tgtggggctg gcacctgctg tgctatcagc ctgtggctgc ggggcctgag 60 gctgtgtacc cctctggggc gggaaggaga ggagtgccac cctggaagcc acaagatccc 120 tttctttagg aaacgccaac accatacctg tccctgttca cccagcctgc tgtgctccag 180 gttccc 186 <210> 117 <211> 186 <212> DNA <213> Rat <400> 117 agatgtccag tgtggggctg gcacctgctg tgctatcagc ctgtggctgc ggggcctgag 60 gctgtgcacc cctctggggc gggaaggaga ggagtgccac cctggaagcc acaagatccc 120 tttctttagg aaacgccaac accatacctg tccctgttca cccagcctgc tgtgctccag 180 gttccc 186 <210> 118 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 118 gtggcactcc tctccttccc gccccaga 28 <210> 119 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 119 caggccccgc agccacaggc tgatagca 28 <210> 120 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 120 agcaggtgcc agccccacac tggacatc 28 <210> 121 <211> 244 <212> DNA <213> Rat <400> 121 agagagatga ggcatttaga ggcagccctg gatccgacta tataaatctg aaggaggtaa 60 ggtaggacag cttggccttc ttagcttgtc tagtgcaagg cagtgcagaa ggaagtgagg 120 gattccagag tggacagtgt ttgccttcac cccaagtgat catgagaggt gctgtgcaag 180 tcttcatcat gctccttcta gcaactgtct ctgactgtgc ggtgatcaca ggggcctgtg 240 aacg 244 <210> 122 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 122 ggaaggagag gagtgccacc ctggaag 27 <210> 123 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 123 accatacctg tccctgttca cccagcct 28 <210> 124 <211> 464 <212> DNA <213> Rat <400> 124 ctgttcaccc agcctgctgt gctccaggtt cccagatggc aggtaccgct gctcccagga 60 cttgaagaat gtcaactttt agtttatctg gactctgtct gggtccctac tgggtgacct 120 cttgtgttac atctgtgtga cttagttccg tgcaacttct ccactcccca ccctgtccgt 180 gtgtgtgcag acaagcatat cttccactac ggaacagtcc agcagcgtgc agagaggagt 240 ttgcagcctt gagaagtggg ccagcctggc cttcctggcc agaccgcctg aagttgtgac 300 actgggacct cctcaattgt ctgcccttcc tgcatgtgcc cttctcccta aaccacacct 360 cccaggccct ggcctgtggg tgcgtcacta agtcacgggg tctatggggg gaagatcaac 420 attctcctca ttttctttca ttggctagct ccttgtttta ggag 464 <210> 125 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 125 attccagagt ggacagtgtt tgccttcacc 30 <210> 126 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 126 gatcatgaga ggtgctgtgc aagtcttc 28 <210> 127 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 127 ctctctgcac gctgctggac tgttcc 26 <210> 128 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 128 cagatgtaac acaagaggtc acccagtagg 30 <210> 129 <211> 375 <212> DNA <213> Rat <400> 129 gatcatgaga ggtgctgtgc aagtcttcat catgctcctt ctagcaactg tctctgactg 60 tgcggtgatc acaggggcct gtgaacgaga tgtccagtgt ggggctggca cctgctgtgc 120 tatcagcctg tggctgcggg gcctgaggct gtgtacccct ctggggcggg aaggagagga 180 gtgccaccct ggaagccaca agatcccttt ctttaggaaa cgccaacacc atacctgtcc 240 ctgttcaccc agcctgctgt gctccaggtt cccagatggc aggtaccgct gctcccagga 300 cttgaagaat gtcaactttt agtttatctg gactctgtct gggtccctac tgggtgacct 360 cttgtgttac atctg 375 <210> 130 <211> 375 <212> DNA <213> Rat <400> 130 gatcatgaga ggtgctgtgc aagtcttcat catgctcctt ctagcaactg tctctgactg 60 tgcggtgatc acaggggcct gtgaacgaga tgtccagtgt ggggctggca cctgctgtgc 120 tatcagcctg tggctgcggg gcctgaggct gtgtacccct ctggggcggg aaggagagga 180 gtgccaccct ggaagctaca agatcccttt ctttaggaaa cgccaacacc atacctgtcc 240 ctgttcaccc agcctgctgt gctccaggtt cccagatggc aggtaccgct gctcccagga 300 cttgaagaat gtcaactttt agtttatctg gactctgtct gggtccctac tgggtgacct 360 cttgtgttac atctg 375 <210> 131 <211> 375 <212> DNA <213> Rat <400> 131 gatcatgaga ggtgctgtgc aagtcttcat catgctcctt ctagcaactg tctctgactg 60 tgcggtgatc acaggggcct gtgaacgaga tgtccagtgt ggggctggca cctgctgtgc 120 tatcagcctg tggctgcggg gcctgaggct gtgtacccct ctggggcagg aaggagagga 180 gtgccaccct ggaagccaca agatcccttt ctttaggaaa cgccaacacc atacctgtcc 240 ctgttcaccc agcctgctgt gctccaggtt cccagatggc aggtaccgct gctcccagga 300 cttgaagaat gtcaactttt agtttatctg gactctgtct gggtccctac tgggtgacct 360 cttgtgttac atctg 375 <210> 132 <211> 105 <212> PRT <213> Rat <400> 132 Met Arg Gly Ala Val Gln Val Phe Ile Met Leu Leu Leu Ala Thr Val 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Leu Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 His Lys Ile Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Ser Gln Asp Leu Lys Asn Val Asn Phe 100 105 <210> 133 <211> 315 <212> DNA <213> Rat <400> 133 atgagaggtg ctgtgcaagt cttcatcatg ctccttctag caactgtctc tgactgtgcg 60 gtgatcacag gggcctgtga acgagatgtc cagtgtgggg ctggcacctg ctgtgctatc 120 agcctgtggc tgcggggcct gaggctgtgt acccctctgg ggcgggaagg agaggagtgc 180 caccctggaa gccacaagat ccctttcttt aggaaacgcc aacaccatac ctgtccctgt 240 tcacccagcc tgctgtgctc caggttccca gatggcaggt accgctgctc ccaggacttg 300 aagaatgtca acttt 315 <210> 134 <211> 105 <212> PRT <213> Rat <400> 134 Met Arg Gly Ala Val Gln Val Phe Ile Met Leu Leu Leu Ala Thr Val 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Leu Cys Thr Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 Tyr Lys Ile Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Ser Gln Asp Leu Lys Asn Val Asn Phe 100 105 <210> 135 <211> 315 <212> DNA <213> Rat <400> 135 atgagaggtg ctgtgcaagt cttcatcatg ctccttctag caactgtctc tgactgtgcg 60 gtgatcacag gggcctgtga acgagatgtc cagtgtgggg ctggcacctg ctgtgctatc 120 agcctgtggc tgcggggcct gaggctgtgt acccctctgg ggcgggaagg agaggagtgc 180 caccctggaa gctacaagat ccctttcttt aggaaacgcc aacaccatac ctgtccctgt 240 tcacccagcc tgctgtgctc caggttccca gatggcaggt accgctgctc ccaggacttg 300 aagaatgtca acttt 315 <210> 136 <211> 105 <212> PRT <213> Rat <400> 136 Met Arg Gly Ala Val Gln Val Phe Ile Met Leu Leu Leu Ala Thr Val 5 10 15 Ser Asp Cys Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys 20 25 30 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg 35 40 45 Leu Cys Thr Pro Leu Gly Gln Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser 50 55 60 His Lys Ile Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys 85 90 95 Ser Gln Asp Leu Lys Asn Val Asn Phe 100 105 <210> 137 <211> 315 <212> DNA <213> Rat <400> 137 atgagaggtg ctgtgcaagt cttcatcatg ctccttctag caactgtctc tgactgtgcg 60 gtgatcacag gggcctgtga acgagatgtc cagtgtgggg ctggcacctg ctgtgctatc 120 agcctgtggc tgcggggcct gaggctgtgt acccctctgg ggcaggaagg agaggagtgc 180 caccctggaa gccacaagat ccctttcttt aggaaacgcc aacaccatac ctgtccctgt 240 tcacccagcc tgctgtgctc caggttccca gatggcaggt accgctgctc ccaggacttg 300 aagaatgtca acttt 315 <210> 138 <211> 86 <212> PRT <213> Rat <400> 138 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Leu Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Gln Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Val Asn Phe 85 <210> 139 <211> 258 <212> DNA <213> Rat <400> 139 gcggtgatca caggggcctg tgaacgagat gtccagtgtg gggctggcac ctgctgtgct 60 atcagcctgt ggctgcgggg cctgaggctg tgtacccctc tggggcggga aggagaggag 120 tgccaccctg gaagccacaa gatccctttc tttaggaaac gccaacacca tacctgtccc 180 tgttcaccca gcctgctgtg ctccaggttc ccagatggca ggtaccgctg ctcccaggac 240 ttgaagaatg tcaacttt 258 <210> 140 <211> 86 <212> PRT <213> Rat <400> 140 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Leu Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Arg Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser Tyr Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Gln Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Val Asn Phe 85 <210> 141 <211> 258 <212> DNA <213> Rat <400> 141 gcggtgatca caggggcctg tgaacgagat gtccagtgtg gggctggcac ctgctgtgct 60 atcagcctgt ggctgcgggg cctgaggctg tgtacccctc tggggcggga aggagaggag 120 tgccaccctg gaagctacaa gatccctttc tttaggaaac gccaacacca tacctgtccc 180 tgttcaccca gcctgctgtg ctccaggttc ccagatggca ggtaccgctg ctcccaggac 240 ttgaagaatg tcaacttt 258 <210> 142 <211> 86 <212> PRT <213> Rat <400> 142 Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Glu Arg Asp Val Gln Cys Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Cys Cys Ala Ile Ser Leu Trp Leu Arg Gly Leu Arg Leu Cys Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Gln Glu Gly Glu Glu Cys His Pro Gly Ser His Lys Ile 35 40 45 Pro Phe Phe Arg Lys Arg Gln His His Thr Cys Pro Cys Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Leu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Gln Asp 65 70 75 80 Leu Lys Asn Val Asn Phe 85 <210> 143 <211> 258 <212> DNA <213> Rat <400> 143 gcggtgatca caggggcctg tgaacgagat gtccagtgtg gggctggcac ctgctgtgct 60 atcagcctgt ggctgcgggg cctgaggctg tgtacccctc tggggcagga aggagaggag 120 tgccaccctg gaagccacaa gatccctttc tttaggaaac gccaacacca tacctgtccc 180 tgttcaccca gcctgctgtg ctccaggttc ccagatggca ggtaccgctg ctcccaggac 240 ttgaagaatg tcaacttt 258 <210> 144 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 144 atygtstgct gccccttyga gatg 24 <210> 145 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 145 tagtagagct gctgrtccac bgrcc 25 <210> 146 <211> 301 <212> DNA <213> Bovine <400> 146 gactactacg tggtgcgcca gctctcctgg gagcacggcc acgtgctgtg cgcctctgtc 60 aactacctgc gcacggtctc tctctacgtc tccaccaacg ccctgctggc catcgccatc 120 gacagatatc tggccattgy ccacccgctg agaccccgga tgaagtacca aacagccacg 180 ggcttgattg ccttggtgtg ggtggtgtcc attcttgttg ccataccgtc agcctacttc 240 accactgaaa cggtcctcgt cattgtcaag agccaggaga agattttctg tggccagatc 300 t 301 <210> 147 <211> 301 <212> DNA <213> Bovine <400> 147 gactactatg tggtgcatca gctctcctgg gagcatggcc atgtgctctg tgcctgtatc 60 aactacctgc gtaccgtctc actctacgtc tccaccaatg ccctgctggc cattgctatt 120 gacagatatc tcgctatcgt tcaccccttg aaaccacgaa tgaattatca aacagcctcc 180 ttcctgatcg ctctggtctg gatggtatcc attctcatct ccatcccatc agcctacttc 240 acaaaggaaa ccgtcctctt cattgtcaaa aaccagaaaa agatcttctg cggccaggtc 300 t 301 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 148 ggccagcagg gcgttggtgg aga 23 <210> 149 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 149 gtgcgcaggt agttgacaga ggcgcaca 28 <210> 150 <211> 767 <212> DNA <213> Bovine <400> 150 ctaacagcgg ggtcaaaggg ctgaaatgaa gctgaccccc gcgtccagtc gggcttgccc 60 gggggagcga cgtttgagtc gctcccagtg tgtcctgcga gggcggtgtg ggtagaaggg 120 aaggctcctc ccggttcttt gaaatctcgc cggctcatca gcccgaccgc ccactctggc 180 ggtggctcca gggcagacca ggcttaggat gaagcttgga ttctggacgc catggatgtt 240 tgcagggaca cactgactca tgaaggaaaa gctgagtttc agcagaaaag ggagacctca 300 gcctagcaac atcaccccag aggaattccc aagagtgtgg ctcaaggctt caaccagcca 360 gatggagatc accatggggg tcatggatga gaatgccacc aatacgtcaa ccaactattt 420 ccctctgctt gaccccctcg gagcccaagc tgcttctttc cccttcaact tcagctacgg 480 tgactatgat atgcccttgg atgaagatga ggatatgacc aattcccgga ccttctttgc 540 cgccaagatt gtcattggca tggcgctggt gggtattatg ctggtctgtg gtatcggcaa 600 cttcatcttc atcgctgccc tggcccgcta caagaagcta cgcaacctca ccaatctgct 660 catcgccaac ctggccatct ctgatttcct ggtggccatt gtctgctgcc ccttcgagat 720 ggactactac gtggtgcgcc agctctcctg ggagcacggc cacgtgc 767 <210> 151 <211> 720 <212> DNA <213> Bovine <400> 151 gagagcaact cctgcagagc ccagccagga gaaagccccg agcggggacc gtgctcttcc 60 tgcgggcttc tgggagcagt ggctcgtgcc ctccgacccg ggctaaagag cccaggacct 120 cgtctgcctg gctggggact ccgggatgaa tcaggcttag gatgaagctt ggattctgga 180 cgccatggat gtttgcaggg acacactgac tcatgaagga aaagctgagt ttcagcagaa 240 aagggagacc tcagcctagc aacatcaccc cagaggaatt cccaagagtg tggctcaagg 300 cttcaaccag ccagatggag atcaccatgg gggtcatgga tgagaatgcc accaatacgt 360 caaccaacta tttccctctg cttgaccccc tcggagccca agctgcttct ttccccttca 420 acttcagcta cggtgactat gatatgccct tggatgaaga tgaggatatg accaattccc 480 ggaccttctt tgccgccaag attgtcattg gcatggcgct ggtgggtatt atgctggtct 540 gtggtatcgg caacttcatc ttcatcgctg ccctggcccg ctacaagaag ctacgcaacc 600 tcaccaatct gctcatcgcc aacctggcca tctctgattt cctggtggcc attgtctgct 660 gccccttcga gatggactac tacgtggtgc gccagctctc ctgggagcac ggccacgtgc 720 <210> 152 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 152 tcatcagccc gaccgcccac tctggc 26 <210> 153 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 153 taggatgaag cttggattct ggacgcca 28 <210> 154 <211> 2051 <212> DNA <213> Bovine <400> 154 tggatgtttg cagggacaca ctgactcatg aaggaaaagc tgagtttcag cagaaaaggg 60 agacctcagc ctagcaacat caccccagag gaattcccaa gagtgtggct caaggcttca 120 accagccaga tggagatcac catgggggtc atggatgaga atgccaccaa tacgtcaacc 180 aactatttcc ctctgcttga ccccctcgga gcccaagctg cttctttccc cttcaacttc 240 agctacggtg actatgatat gcccttggat gaagatgagg atatgaccaa ttcccggacc 300 ttctttgccg ccaagattgt cattggcatg gcgctggtgg gtattatgct ggtctgtggt 360 atcggcaact tcatcttcat cgctgccctg gcccgctaca agaagctacg caacctcacc 420 aatctgctca tcgccaacct ggccatctct gatttcctgg tggccattgt ctgctgcccc 480 ttcgagatgg actactacgt ggtgcgccag ctctcctggg agcacggcca cgtgctgtgc 540 gcctctgtca actacctgcg cacggtctct ctctacgtct ccaccaacgc cctgctggcc 600 atcgccatcg acagatatct ggccattgtc cacccgctga gaccccggat gaagtaccaa 660 acagccacgg gcttgattgc cttggtgtgg gtggtgtcca ttcttgttgc cataccgtca 720 gcctacttca ccactgaaac ggtcctcgtc attgtcaaga gccaggagaa gattttctgt 780 ggccagatct ggccagtaga ccagcagatc tactacaagt cctacttcct cttcatcttt 840 ggcatcgagt tcgtgggccc agtggtcacc atgaccctat gctatgccag gatctcccga 900 gagctctggt tcaaggccgt ccctggtttc cagacggagc agatccggaa gcgactgcgc 960 tgtcgccgga agaccgtcct ggtgctcatg tgcatcctca cggcgtacgt gctgtgctgg 1020 gcgcccttct acggcttcgc catcgtgcgg gacttcttcc ccacagtgtt tgtgaaggag 1080 aaacactatc tcacggcctt ctacgtggtc gagtgcattg ccatgagcaa cagcatgatc 1140 aacaccgtgt gcttcgtgac tgtcaagaat aacaccatca agtacttcaa gaagattatg 1200 ctgctccact ggaaggcttc ttacaatggc agcaagtcca gtggggacct tgacctcaaa 1260 accacggggg tgcctgccac tgaagaggtg gactgcatcg ggctgaaata actccagaac 1320 aggacctttg ggcccctgac aatgtgctta agcccacact atcaaccaag aactctaggt 1380 ttgccacata gggcaaaaga aatggacaaa tatgtcagtg ctgtgttcag ggagctcaga 1440 atctctaaaa ctggtgtgac cacaccatca ccagtggccg acattcaatg aacatctaat 1500 ttgtgcaaag tgtaggcact ggtgatatct gtatctgttg atgatatttg attggcagaa 1560 agaaataggg attaaacaaa cacaaaaaaa tgatgggaca tagtgtggaa tgatgggttt 1620 tccagaaggg agcctgagta gtcacctaaa actgtggtct atatgtttgt agggtgaagt 1680 tctctctgga tcatctcagc tactcatcag acactgagat aacctgtctc tgggattgtt 1740 cttaggcttg agttcactcc taacacttgc tggcctgggg caagaataca aagcaggttc 1800 ctggctcttt ctgcaatctt cccttctatc cctggttctg actctcaccc tgggcaccca 1860 ggaaagaaag aaacatacaa ataggcggtg gggggtgggg gttggcacca gtgagattca 1920 gagactacag gcttattgag ggccttttta atccacctcc tttgtttggt tttttgaatt 1980 tggaaatttg gaaccagaag atacgaccca gccttggatc tatcacctgt atgggcctgg 2040 gtaaggcctc t 2051 <210> 155 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 155 tttgagtcgc tcccagtgtg tcct 24 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 156 gctcctcccg gttctttgaa atc 23 <210> 157 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 157 tgtagtctct gaatctcact ggtgcc 26 <210> 158 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 158 ggtggattaa aaaggccctc aataagcc 28 <210> 159 <211> 2038 <212> DNA <213> Bovine <400> 159 gctcctcccg gttctttgaa atctcgccgg ctcatcagcc cgaccgccca ctctggcggt 60 ggctccaggg cagaccaggc ttaggatgaa gcttggattc tggacgccat ggatgtttgc 120 agggacacac tgactcatga aggaaaagct gagtttcagc agaaaaggga gacctcagcc 180 tagcaacatc accccagagg aattcccaag agtgtggctc aaggcttcaa ccagccagat 240 ggagatcacc atgggggtca tggatgagaa tgccaccaat acgtcaacca actatttccc 300 tctgcttgac cccctcggag cccaagctgc ttctttcccc ttcaacttca gctacggtga 360 ctatgatatg cccttggatg aagatgagga tatgaccaat tcccggacct tctttgccgc 420 caagattgtc attggcatgg cgctggtggg tattatgctg gtctgtggta tcggcaactt 480 catcttcatc gctgccctgg cccgctacaa gaagctacgc aacctcacca atctgctcat 540 cgccaacctg gccatctctg atttcctggt ggccattgtc tgctgcccct tcgagatgga 600 ctactacgtg gtgcgccagc tctcctggga gcacggccac gtgctgtgcg cctctgtcaa 660 ctacctgcgc acggtctctc tctacgtctc caccaacgcc ctgctggcca tcgccatcga 720 cagatatctg gccattgtcc acccgctgag accccggatg aagtaccaaa cagccacggg 780 cttgattgcc ttggtgtggg tggtgtccat tcttgttgcc ataccgtcag cctacttcac 840 cactgaaacg gtcctcgtca ttgtcaagag ccaggagaag attttctgtg gccagatctg 900 gccagtagac cagcagatct actacaagtc ctacttcctc ttcatctttg gcatcgagtt 960 cgtgggccca gtggtcacca tgaccctatg ctatgccagg atctcccgag agctctggtt 1020 caaggccgtc cctggtttcc agacggagca gatccggaag cgactgcgct gtcgccggaa 1080 gaccgtcctg gtgctcatgt gcatcctcac ggcgtacgtg ctgtgctggg cgcccttcta 1140 cggcttcgcc atcgtgcggg acttcttccc cacagtgttt gtgaaggaga aacactatct 1200 cacggccttc tacgtggtcg agtgcattgc catgagcaac agcatgatca acaccgtgtg 1260 cttcgtgact gtcaagaata acaccatcaa gtacttcaag aagattatgc tgctccactg 1320 gaaggcttct tacaatggca gcaagtccag tggggacctt gacctcaaaa ccacgggggt 1380 gcctgccact gaagaggtgg actgcatcgg gctgaaataa ctccagaaca ggacctttgg 1440 gcccctgaca atgtgcttaa gcccacacta tcaaccaaga actctaggtt tgccacatag 1500 ggcaaaagaa atggacaaat atgtcagtgc tgtgttcagg gagctcagaa tctctaaaac 1560 tggtgtgacc acaccatcac cagtggccga cattcaatga acatctaatt tgtgcaaagt 1620 gtaggcactg gtgatatctg tatctgttga tgatatttga ttggcagaaa gaaataggga 1680 ttaaacaaac acaaaaaaat gatgggacat agtgtggaat gatgggtttt ccagaaggga 1740 gcctgagtag tcacctaaaa ctgtggtcta tatgtttgta gggtgaagtt ctctctggat 1800 catctcagct actcatcaga cactgagata acctgtctct gggattgttc ttaggcttga 1860 gttcactcct aacacttgct ggcctggggc aagaatacaa agcaggttcc tggctctttc 1920 tgcaatcttc ccttctatcc ctggttctga ctctcaccct gggcacccag gaaagaaaga 1980 aacatacaaa taggcggtgg ggggtggggg ttggcaccag tgagattcag agactaca 2038 <210> 160 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 160 gtaggctgat gggatggaga tgagaatgga 30 <210> 161 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 161 gcaggtagtt gatacaggca cagagcacat 30 <210> 162 <211> 368 <212> DNA <213> Bovine <400> 162 ccatcctaat acgactcact atagggctcg agcggccgcc cgggcaggtg ggaagggcgc 60 tgggtgagaa ggaataggga cacctccttc gaagcgcaag tccgggttcc cgggaccgct 120 ggtggggaga gcgcggaagc cggatcgagg atggcctgtt gactccccaa ggatgtgggc 180 agggtgctag gatctntgac ctcatgagag caggaggtct ggaccctanc tcanagtctg 240 cggaccctgg aatctcccac acaccgctca ctggaaagct tcaccatggc agtccanaat 300 ggaaatgcta gttttccagc caacttcagt ataccccaag aacatgcctn ctccctcccc 360 ttcaactt 368 <210> 163 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 163 agcctccttc ctgatcgctc tggtctg 27 <210> 164 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 164 cccatcagcc tacttcacaa aggaaaccg 29 <210> 165 <211> 911 <212> DNA <213> Bovine <400> 165 tcctcttcat tgtcaaaaac cagaaaaaga tcttctgcgg ccaggtctgg ccagtggacc 60 agcarctcta ctataaatcc tacttcctct ttgtctttgg catcgagttc ctgggccccg 120 tgttcwccat gaccctgtgc tatgccagga tctcccgaga gctctggttc aaagcggtcc 180 cgggtttcca gactgagcaa atccggaaga ggctgcgctg ccgccggaag acggtactgg 240 tactcatgtg tatcctcacg gcctatgttc tgtgctgggc gcccttctat ggcctcacaa 300 tcgtgcgcga cttcttcccc actgtgttcg tgaaggaaaa acattacctc acagcctttt 360 atgttgtgga gtgcatcgcc atgagcaaca gcatgatcaa caccgtgtgc ttcgtgacag 420 tgaagaacag yaccatgaag tacttcaaga agatgctgct gctccattgg cggccctctc 480 accacgggag taagtccagt gccgacctcg acctcaaaac cagccgcctg ycagccacgg 540 aggaggtgga ttgtatcagg ctgaagtgac ccactggtac ttcacaatgg aaaacccaaa 600 agccagtact tggcgcacag tttatcaata accaagttca caggctgcat ggggaaaggg 660 caacagtttt cacacttcgc tgctgtcaag gagctggatg cttctgcagt cataaatgca 720 gtgtgacttg acacaaacca cagcagccaa catttactga tacgtgctcr acgtactgtg 780 cacaacacca ccagcgagat taaagagcaa caggagctga catttactga ttacctactg 840 tgtgtaaaaa tatttaaata gcaaaatgaa ttggcacctg cccgggcggc cgctcgagcc 900 ctatagtgag t 911 <210> 166 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 166 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 167 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 167 gctgggtgag aaggaatagg ga 22 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 168 gcaggtgcca attcattttg c 21 <210> 169 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 169 tgctctttaa tctcgctggt ggt 23 <210> 170 <211> 1623 <212> DNA <213> Bovine <400> 170 gctgggtgag aaggaatagg gacacctcct tcgaagcgca agtccgggtt cccgagaccg 60 ctggtgggga gagcgcggaa gccggatcga ggatggcctg ttgactcccc aaggatgtgg 120 gcagggtgct aggatctctg acctcatgag agcagaaggt ctggacccta gctcagagtc 180 tgcagaccct ggaatctccc acacaccgct cactggaaag cttcaccatg gcagcccaga 240 atggaaatgc tagttttcca gccaacttca gtatacccca agaacatgcc tcctccctcc 300 ccttcaactt cagttatgat gattatgacc tccctctgga tgaggatgag gatatgacca 360 agactcagac cttctttgca gccaagattg ttatcggggt ggcacttgtg ggtatcatgc 420 tgacttgtgg tattggcaac tttgtcttta tcactgccct cacccgctat aaaaagctgc 480 gcaacctcac caacctgctc attgctaacc tggccatctc cgacttcctg gtagccatca 540 tctgctgccc ctttgagatg gactactatg tggtgcatca gctctcctgg gagcatggcc 600 atgtgctctg tgcctgtatc aactacctgc gtaccgtctc actctacgtc tccaccaatg 660 ccctgctggc cattgctatt gacagatatc tcgctatcgt tcaccccttg aaaccacgaa 720 tgaattatca aacagcctcc ttcctgatcg ctctggtctg gatggtatcc attctcatct 780 ccatcccatc agcctacttc acaaaggaaa ccgtcctctt cattgtcaaa aaccagaaaa 840 agatcttctg cggccaggtc tggccagtgg accagcagct ctactataaa tcctacttcc 900 tctttgtctt tggcatcgag ttcctgggcc ccgtgttcac catgaccctg tgctatgcca 960 ggatctcccg agagctctgg ttcaaagcgg tcccgggttt ccagactgag caaatccgga 1020 agaggctgcg ctgccgccgg aagacggtac tggtactcat gtgtatcctc acggcctatg 1080 ttctgtgctg ggcgcccttc tatggcttca caatcgtgcg cgacttcttc cccactgtgt 1140 tcgtgaagga aaaacattac ctcacagcct tttatgttgt ggagtgcatc gccatgagca 1200 acagcatgat caacaccgtg tgcttcgtga cagtgaagaa cagcaccatg aagtacttca 1260 agaagatgct gctgctccat tggcggccct ctcaccacgg gagtaagtcc agtgctgacc 1320 tcgacctcaa aaccagccgc ctgccagcca cggaggaggt ggattgtatc aggctgaagt 1380 gacccactgg tacttcacaa tggaaaaccc aaaagccagt acttggcgca cagtttatca 1440 ataaccaagt tcacaggctg catggggaaa gggcaacagt tttcacactt cgctgctgtc 1500 aaggagctgg atgcttctgc agtcataaaa tgcagtgtga cttgacacaa accacagcag 1560 ctaacattta ctgatacgtg ctcaacgtac tgtgcacaac accaccagcg agattaaaga 1620 gca 1623 <210> 171 <211> 393 <212> PRT <213> Bovine <400> 171 Met Glu Ile Thr Met Gly Val Met Asp Glu Asn Ala Thr Asn Thr Ser 5 10 15 Thr Asn Tyr Phe Pro Leu Leu Asp Pro Leu Gly Ala Gln Ala Ala Ser 20 25 30 Phe Pro Phe Asn Phe Ser Tyr Gly Asp Tyr Asp Met Pro Leu Asp Glu 35 40 45 Asp Glu Asp Met Thr Asn Ser Arg Thr Phe Phe Ala Ala Lys Ile Val 50 55 60 Ile Gly Met Ala Leu Val Gly Ile Met Leu Val Cys Gly Ile Gly Asn 65 70 75 80 Phe Ile Phe Ile Ala Ala Leu Ala Arg Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu 85 90 95 Thr Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Ala Ile Ser Asp Phe Leu Val Ala 100 105 110 Ile Val Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp Tyr Tyr Val Val Arg Gln Leu 115 120 125 Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys Ala Ser Val Asn Tyr Leu Arg 130 135 140 Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn Ala Leu Leu Ala Ile Ala Ile 145 150 155 160 Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Pro Leu Arg Pro Arg Met Lys Tyr 165 170 175 Gln Thr Ala Thr Gly Leu Ile Ala Leu Val Trp Val Val Ser Ile Leu 180 185 190 Val Ala Ile Pro Ser Ala Tyr Phe Thr Thr Glu Thr Val Leu Val Ile 195 200 205 Val Lys Ser Gln Glu Lys Ile Phe Cys Gly Gln Ile Trp Pro Val Asp 210 215 220 Gln Gln Ile Tyr Tyr Lys Ser Tyr Phe Leu Phe Ile Phe Gly Ile Glu 225 230 235 240 Phe Val Gly Pro Val Val Thr Met Thr Leu Cys Tyr Ala Arg Ile Ser 245 250 255 Arg Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro Gly Phe Gln Thr Glu Gln Ile 260 265 270 Arg Lys Arg Leu Arg Cys Arg Arg Lys Thr Val Leu Val Leu Met Cys 275 280 285 Ile Leu Thr Ala Tyr Val Leu Cys Trp Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Ala 290 295 300 Ile Val Arg Asp Phe Phe Pro Thr Val Phe Val Lys Glu Lys His Tyr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Phe Tyr Val Val Glu Cys Ile Ala Met Ser Asn Ser Met 325 330 335 Ile Asn Thr Val Cys Phe Val Thr Val Lys Asn Asn Thr Ile Lys Tyr 340 345 350 Phe Lys Lys Ile Met Leu Leu His Trp Lys Ala Ser Tyr Asn Gly Ser 355 360 365 Lys Ser Ser Gly Asp Leu Asp Leu Lys Thr Thr Gly Val Pro Ala Thr 370 375 380 Glu Glu Val Asp Cys Ile Gly Leu Lys 385 390 <210> 172 <211> 1179 <212> PRT <213> Bovine <400> 172 atggagatca ccatgggggt catggatgag aatgccacca atacgtcaac caactatttc 60 cctctgcttg accccctcgg agcccaagct gcttctttcc ccttcaactt cagctacggt 120 gactatgata tgcccttgga tgaagatgag gatatgacca attcccggac cttctttgcc 180 gccaagattg tcattggcat ggcgctggtg ggtattatgc tggtctgtgg tatcggcaac 240 ttcatcttca tcgctgccct ggcccgctac aagaagctac gcaacctcac caatctgctc 300 atcgccaacc tggccatctc tgatttcctg gtggccattg tctgctgccc cttcgagatg 360 gactactacg tggtgcgcca gctctcctgg gagcacggcc acgtgctgtg cgcctctgtc 420 aactacctgc gcacggtctc tctctacgtc tccaccaacg ccctgctggc catcgccatc 480 gacagatatc tggccattgt ccacccgctg agaccccgga tgaagtacca aacagccacg 540 ggcttgattg ccttggtgtg ggtggtgtcc attcttgttg ccataccgtc agcctacttc 600 accactgaaa cggtcctcgt cattgtcaag agccaggaga agattttctg tggccagatc 660 tggccagtag accagcagat ctactacaag tcctacttcc tcttcatctt tggcatcgag 720 ttcgtgggcc cagtggtcac catgacccta tgctatgcca ggatctcccg agagctctgg 780 ttcaaggccg tccctggttt ccagacggag cagatccgga agcgactgcg ctgtcgccgg 840 aagaccgtcc tggtgctcat gtgcatcctc acggcgtacg tgctgtgctg ggcgcccttc 900 tacggcttcg ccatcgtgcg ggacttcttc cccacagtgt ttgtgaagga gaaacactat 960 ctcacggcct tctacgtggt cgagtgcatt gccatgagca acagcatgat caacaccgtg 1020 tgcttcgtga ctgtcaagaa taacaccatc aagtacttca agaagattat gctgctccac 1080 tggaaggctt cttacaatgg cagcaagtcc agtggggacc ttgacctcaa aaccacgggg 1140 gtgcctgcca ctgaagaggt ggactgcatc gggctgaaa 1179 <210> 173 <211> 384 <212> PRT <213> Bovine <400> 173 Met Ala Ala Gln Asn Gly Asn Ala Ser Phe Pro Ala Asn Phe Ser Ile 5 10 15 Pro Gln Glu His Ala Ser Ser Leu Pro Phe Asn Phe Ser Tyr Asp Asp 20 25 30 Tyr Asp Leu Pro Leu Asp Glu Asp Glu Asp Met Thr Lys Thr Gln Thr 35 40 45 Phe Phe Ala Ala Lys Ile Val Ile Gly Val Ala Leu Val Gly Ile Met 50 55 60 Leu Thr Cys Gly Ile Gly Asn Phe Val Phe Ile Thr Ala Leu Thr Arg 65 70 75 80 Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu Thr Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Ala 85 90 95 Ile Ser Asp Phe Leu Val Ala Ile Ile Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp 100 105 110 Tyr Tyr Val Val His Gln Leu Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys 115 120 125 Ala Cys Ile Asn Tyr Leu Arg Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn 130 135 140 Ala Leu Leu Ala Ile Ala Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Pro 145 150 155 160 Leu Lys Pro Arg Met Asn Tyr Gln Thr Ala Ser Phe Leu Ile Ala Leu 165 170 175 Val Trp Met Val Ser Ile Leu Ile Ser Ile Pro Ser Ala Tyr Phe Thr 180 185 190 Lys Glu Thr Val Leu Phe Ile Val Lys Asn Gln Lys Lys Ile Phe Cys 195 200 205 Gly Gln Val Trp Pro Val Asp Gln Gln Leu Tyr Tyr Lys Ser Tyr Phe 210 215 220 Leu Phe Val Phe Gly Ile Glu Phe Leu Gly Pro Val Phe Thr Met Thr 225 230 235 240 Leu Cys Tyr Ala Arg Ile Ser Arg Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro 245 250 255 Gly Phe Gln Thr Glu Gln Ile Arg Lys Arg Leu Arg Cys Arg Arg Lys 260 265 270 Thr Val Leu Val Leu Met Cys Ile Leu Thr Ala Tyr Val Leu Cys Trp 275 280 285 Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Thr Ile Val Arg Asp Phe Phe Pro Thr Val 290 295 300 Phe Val Lys Glu Lys His Tyr Leu Thr Ala Phe Tyr Val Val Glu Cys 305 310 315 320 Ile Ala Met Ser Asn Ser Met Ile Asn Thr Val Cys Phe Val Thr Val 325 330 335 Lys Asn Ser Thr Met Lys Tyr Phe Lys Lys Met Leu Leu Leu His Trp 340 345 350 Arg Pro Ser His His Gly Ser Lys Ser Ser Ala Asp Leu Asp Leu Lys 355 360 365 Thr Ser Arg Leu Pro Ala Thr Glu Glu Val Asp Cys Ile Arg Leu Lys 370 375 380 <210> 174 <211> 1152 <212> DNA <213> Bovine <400> 174 atggcagccc agaatggaaa tgctagtttt ccagccaact tcagtatacc ccaagaacat 60 gcctcctccc tccccttcaa cttcagttat gatgattatg acctccctct ggatgaggat 120 gaggatatga ccaagactca gaccttcttt gcagccaaga ttgttatcgg ggtggcactt 180 gtgggtatca tgctgacttg tggtattggc aactttgtct ttatcactgc cctcacccgc 240 tataaaaagc tgcgcaacct caccaacctg ctcattgcta acctggccat ctccgacttc 300 ctggtagcca tcatctgctg cccctttgag atggactact atgtggtgca tcagctctcc 360 tgggagcatg gccatgtgct ctgtgcctgt atcaactacc tgcgtaccgt ctcactctac 420 gtctccacca atgccctgct ggccattgct attgacagat atctcgctat cgttcacccc 480 ttgaaaccac gaatgaatta tcaaacagcc tccttcctga tcgctctggt ctggatggta 540 tccattctca tctccatccc atcagcctac ttcacaaagg aaaccgtcct cttcattgtc 600 aaaaaccaga aaaagatctt ctgcggccag gtctggccag tggaccagca gctctactat 660 aaatcctact tcctctttgt ctttggcatc gagttcctgg gccccgtgtt caccatgacc 720 ctgtgctatg ccaggatctc ccgagagctc tggttcaaag cggtcccggg tttccagact 780 gagcaaatcc ggaagaggct gcgctgccgc cggaagacgg tactggtact catgtgtatc 840 ctcacggcct atgttctgtg ctgggcgccc ttctatggct tcacaatcgt gcgcgacttc 900 ttccccactg tgttcgtgaa ggaaaaacat tacctcacag ccttttatgt tgtggagtgc 960 atcgccatga gcaacagcat gatcaacacc gtgtgcttcg tgacagtgaa gaacagcacc 1020 atgaagtact tcaagaagat gctgctgctc cattggcggc cctctcacca cgggagtaag 1080 tccagtgctg acctcgacct caaaaccagc cgcctgccag ccacggagga ggtggattgt 1140 atcaggctga ag 1152 <210> 175 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 175 gctcctcccg gttctttgaa atc 23 <210> 176 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 176 tggtgaggtt gcgtagcttc ttg 23 <210> 177 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 177 aaccaactat ttccctctgc ttgac 25 <210> 178 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 178 tcaccgtagc tgaagttgaa gg 22 <210> 179 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 179 cctcggagcc caagctgctt cttt 24 <210> 180 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 180 gctgggtgag aaggaatagg ga 22 <210> 181 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 181 ggagagctga tgcaccacat agtag 25 <210> 182 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 182 tcatgagagc agaaggtctg ga 22 <210> 183 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 183 tggctggaaa actagcattt cc 22 <210> 184 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 184 cacacaccgc tcactggaaa gcttca 26

【図面の簡単な説明】

【図１】 参考例４で行われたヒト型Bv8ペプチドおよ
びMIT1のZAQ受容体活性化作用の測定結果を示す。図
中、−○−はヒト型Bv8ペプチドを、−●−はMIT1を示
す。

【図２】 参考例４で行われたヒト型Bv8ペプチドおよ
びMIT1のI5E受容体活性化作用の測定結果を示す。図
中、−○−はヒト型Bv8ペプチドを、−●−はMIT1を示
す。

【図３】 参考例１１（３）で行われた、精製ZAQリガ
ンドペプチドのZAQ活性化作用の測定結果を示す。

【図４】 参考例１３（３）で行われたヒト型ZAQリガ
ンドペプチドおよびMIT1のZAQ受容体活性化作用の測定
結果を示す。図中、−○−はヒト型ZAQリガンドペプチ
ドを、−●−はＭＩＴ１を示す。

【図５】 参考例１３（３）で行われたヒト型ZAQリガ
ンドペプチドおよびMIT1のI5E受容体活性化作用の測定
結果を示す。図中、−○−はヒト型ZAQリガンドペプチ
ドを、−●−はMIT1を示す。

【図６】 実施例２で行われたウシ副腎毛細血管内皮細
胞（BACE）およびウシ大動脈血管内皮細胞（BAE）にお
けるウシ型ZAQおよびウシ型I5E mRNAのTaqMan PCR法に
よる定量結果を示す。図中、□はtotal RNA １ ngあた
りのウシ型ZAQ mRNAのコピー数を、また、■は同様にウ
シ型I5E mRNAのコピー数を示す。

【図７】 実施例３で行われたBACEを用いたFLIPRによ
る細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性の測定の結果を
示す。図中、−●−は、ヒト型ZAQリガンドペプチド
を、−▲−はヒト型Bv8ペプチドを、−■−はMIT1を示
す。

【図８】 実施例３で行われたBACEにおけるp42 MAPキ
ナーゼおよびp44 MAPキナーゼの活性化に及ぼすZAQ関連
ペプチドの用量反応性の結果を示す。図中、Cはリガン
ド（溶液）を投与しないコントロールを、MはMIT1を、L
1はヒト型ZAQリガンドペプチドを、L2はヒト型Bv8ペプ
チドをそれぞれ図中に示した濃度で添加したことを示
す。また、p44 MAPK-Pはリン酸化されたp44 MAPキナー
ゼのバンドを、またp42 MAPK-Pはリン酸化されたp42 MA
Pキナーゼのバンドを示す。

【図９】 実施例３で行われたBACEにおけるp38 MAPキ
ナーゼの活性化に及ぼすZAQ関連ペプチドの用量反応性
の結果を示す。図中、Cはリガンド（溶液）を投与しな
いコントロールを、MはMIT1を、L1はヒト型ZAQリガンド
ペプチドを、L2はヒト型Bv8ペプチドをそれぞれ図中に
示した濃度で添加したことを示す。また、p38MAPK-Pは
リン酸化されたp38 MAPキナーゼのバンドを示す。

【図１０】 BACEにおける[³H]チミジン取り込みに及ぼ
すペプチドの用量反応性の結果を示す。図中、−●−
は、ヒト型ZAQリガンドペプチドを、−▲−はヒト型Bv8
ペプチドを、−■−はMIT1を示す。

【図１１】 BACEの増殖に及ぼすヒト型ZAQリガンドペ
プチドおよびヒト型Bv8ペプチドの影響を示す。縦軸
は、１ウエルあたりのBACEの細胞数を示す。横軸のZAQL
-1は、ヒト型ZAQリガンドペプチドを、ZAQL-2は、ヒト
型Bv8ペプチドを示す。＊は Student's t test 検定か
ら得られたp値が0.05より小さいことを、＊＊は同様
に、p値が0.001より小さいことを示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/10 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 9/10 15/00 ４Ｃ０８５ 15/00 27/02 ４Ｃ０８６ 27/02 29/00 ４Ｈ０４５ 29/00 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/50 5/00 Ａ (72)発明者 高津 吉広 茨城県つくば市竹園１丁目６番地２ つく ば・さくら団地905−505 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB03 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA37 DA77 FB02 FB04 FB05 FB06 4B024 AA01 AA11 BA43 BA80 CA01 GA11 HA12 4B063 QA18 QA20 QQ79 QQ91 QQ96 QR48 QS33 QX01 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA60 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA20 BA21 BA22 BA23 MA01 NA14 ZA332 ZA402 ZA812 ZB112 ZB212 ZB262 4C085 AA13 AA14 CC32 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA33 ZA40 ZA81 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA28 EA51 FA74

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：８１、配列番号：８２、配列
   番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：１９もし
   くは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列と同一ま
   たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドま
   たはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有
   してなる血管新生阻害剤。
2. 【請求項２】 配列番号：１、配列番号：４４、配列番
   号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
   号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３
   で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の
   アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻
   害する化合物またはその塩を含有してなる血管新生阻害
   剤。
3. 【請求項３】 （a）配列番号：２１、配列番号：８
   １、配列番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：１
   ３８、配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わさ
   れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
   配列を含有するペプチドまたはその塩と（b）配列番
   号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：
   ５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１
   ７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配
   列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
   蛋白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはそ
   の塩を含有してなる血管新生阻害剤。
4. 【請求項４】 配列番号：２１、配列番号：８１、配列
   番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、配
   列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わされるアミ
   ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
   有するペプチドまたはその塩の、配列番号：１、配列番
   号：４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番
   号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしくは
   配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一また
   は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質または
   その塩の活性化作用を阻害する化合物またはその塩を含
   有してなる血管新生阻害剤。
5. 【請求項５】 配列番号：８１、配列番号：８２、配列
   番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：１９もし
   くは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列と同一ま
   たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドま
   たはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に
   相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一
   部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有してなる
   血管新生阻害剤。
6. 【請求項６】 配列番号：８１、配列番号：８２、配列
   番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：１９もし
   くは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列と同一ま
   たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドま
   たはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有
   してなる血管新生阻害剤。
7. 【請求項７】 配列番号：１、配列番号：４４、配列番
   号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
   号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３
   で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の
   アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチド
   をコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的
   に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセ
   ンスヌクレオチドを含有してなる血管新生阻害剤。
8. 【請求項８】 配列番号：１、配列番号：４４、配列番
   号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
   号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３
   で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の
   アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチド
   またはその塩に対する抗体を含有してなる血管新生阻害
   剤。
9. 【請求項９】 癌、多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過剰
   刺激症候群の予防・治療剤である請求項１〜８記載のい
   ずれかの血管新生阻害剤。
10. 【請求項１０】 （a）配列番号：８１、配列番号：８
    ２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：
    １９もしくは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列
    と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペ
    プチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、ま
    たは（b）配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：
    ５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５
    ４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わ
    されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
    酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリ
    ヌクレオチドを含有してなる癌、多嚢胞性卵巣症候群ま
    たは卵巣過剰刺激症候群の診断薬。
11. 【請求項１１】 内皮細胞を用いることを特徴とする、
    配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列
    番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番
    号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミ
    ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
    有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物また
    はその塩のスクリーニング方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載のスクリーニング方法
    で得られる化合物またはその塩を含有してなる血管新生
    阻害剤。
13. 【請求項１３】 （a）配列番号：２１、配列番号：８
    １、配列番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：１
    ３８、配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わさ
    れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
    配列を含有するペプチドまたはその塩、および（また
    は）（b）配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：
    ５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５
    ４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わ
    されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
    酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特
    徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング方法。
14. 【請求項１４】 （a）配列番号：２１、配列番号：８
    １、配列番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：１
    ３８、配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わさ
    れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
    配列を含有するペプチドまたはその塩、および（また
    は）（b）配列番号：１、配列番号：４４、配列番号：
    ５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５
    ４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わ
    されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
    酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを
    特徴とする血管新生阻害剤のスクリーニング用キット。
15. 【請求項１５】 （a）配列番号：８１、配列番号：８
    ２、配列番号：１０９、配列番号：１３８、配列番号：
    １９もしくは配列番号：３９で表わされるアミノ酸配列
    と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペ
    プチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、お
    よび（または）（b）配列番号：１、配列番号：４４、
    配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配
    列番号：５４、配列番号：１７１もしくは配列番号：１
    ７３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同
    一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコー
    ドするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする血管
    新生阻害剤のスクリーニング方法。
16. 【請求項１６】 （a）配列番号：２１、配列番号：８
    １、配列番号：８２、配列番号：１０９、配列番号：１
    ３８、配列番号：１９もしくは配列番号：３９で表わさ
    れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
    配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドまたは
    その塩に対する抗体、および（または）（b）配列番
    号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：
    ５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１
    ７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配
    列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗
    体を用いることを特徴とする血管新生阻害剤のスクリー
    ニング方法。
17. 【請求項１７】 請求項１３、１５もしくは１６記載の
    スクリーニング方法または請求項１４記載のスクリーニ
    ング用キットを用いて得られる血管新生阻害剤。
18. 【請求項１８】 内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物
    またはその塩を含有してなる血管新生阻害剤。
19. 【請求項１９】 配列番号：１７１もしくは配列番号：
    １３７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に
    同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質
    またはその塩。
20. 【請求項２０】 配列番号：１７１で表わされるアミノ
    酸配列からなる蛋白質またはその塩。
21. 【請求項２１】 配列番号：１３７で表わされるアミノ
    酸配列からなる蛋白質またはその塩。
22. 【請求項２２】 請求項１９記載の蛋白質の部分ペプチ
    ドまたはその塩。
23. 【請求項２３】 請求項１９記載の蛋白質をコードする
    ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
24. 【請求項２４】 ＤＮＡである請求項２３記載のポリヌ
    クレオチド。
25. 【請求項２５】 配列番号：１７２または配列番号：１
    ７４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
26. 【請求項２６】 請求項２４記載のポリヌクレオチドを
    含有する組換えベクター。
27. 【請求項２７】 請求項２６記載の組換えベクターで形
    質転換された形質転換体。
28. 【請求項２８】 請求項２７記載の形質転換体を培養
    し、請求項１９記載の蛋白質を生成・蓄積せしめること
    を特徴とする請求項１９記載の蛋白質またはその塩の製
    造法。
29. 【請求項２９】 請求項１９記載の蛋白質もしくはその
    部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
30. 【請求項３０】 請求項２９記載の抗体を含有してなる
    医薬。
31. 【請求項３１】 請求項２９記載の抗体を含有してなる
    診断薬。
32. 【請求項３２】 請求項１９記載の蛋白質もしくはその
    部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、
    請求項１９記載の蛋白質またはその塩の活性を促進また
    は阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
33. 【請求項３３】 請求項１９記載の蛋白質もしくはその
    部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とす
    る、請求項１９記載の蛋白質またはその塩の活性を促進
    または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用
    キット。
34. 【請求項３４】 請求項３２記載のスクリーニング方法
    または請求項３３記載のスクリーニング用キットを用い
    て得られる、請求項１９記載の蛋白質またはその塩の活
    性を促進または阻害する化合物またはその塩。
35. 【請求項３５】 請求項３４記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
36. 【請求項３６】 哺乳動物に対して、配列番号：１、配
    列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列
    番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしく
    は配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一ま
    たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質また
    はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量
    を投与することを特徴とする血管新生阻害方法。
37. 【請求項３７】 血管新生阻害剤を製造するための、配
    列番号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番
    号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番
    号：１７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミ
    ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
    有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物また
    はその塩の使用。
38. 【請求項３８】 哺乳動物に対して、配列番号：１、配
    列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：５２、配列
    番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１７１もしく
    は配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配列と同一ま
    たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質また
    はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量
    を投与することを特徴とする癌、多嚢胞性卵巣症候群ま
    たは卵巣過剰刺激症候群の予防・治療方法。
39. 【請求項３９】 癌、多嚢胞性卵巣症候群または卵巣過
    剰刺激症候群の予防・治療剤を製造するための、配列番
    号：１、配列番号：４４、配列番号：５１、配列番号：
    ５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：１
    ７１もしくは配列番号：１７３で表わされるアミノ酸配
    列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその
    塩の使用。