JP2001340094A - 新規蛋白質、そのｄｎａおよびその製造法 - Google Patents
新規蛋白質、そのｄｎａおよびその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリ
ガンド活性を有するペプチドを含む新規蛋白質及びその
ペプチドのアミドもしくはそのエステル又はその塩等、
並びにそれを含有する医薬品の提供。 【解決手段】 それぞれマウス由来又はラット由来の特
定のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する蛋白質又はその塩。
ガンド活性を有するペプチドを含む新規蛋白質及びその
ペプチドのアミドもしくはそのエステル又はその塩等、
並びにそれを含有する医薬品の提供。 【解決手段】 それぞれマウス由来又はラット由来の特
定のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する蛋白質又はその塩。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラット脳幹周辺部
およびヒト脳由来の新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質に対するリガンド活性を有するペプチドを含む蛋白質
およびそのペプチドのアミドもしくはそのエステルまた
はその塩などに関する。
およびヒト脳由来の新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質に対するリガンド活性を有するペプチドを含む蛋白質
およびそのペプチドのアミドもしくはそのエステルまた
はその塩などに関する。
【０００２】
【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質などの生
理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋
白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセ
プター蛋白質のうち多くは共役しているguanine nucleo
tide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合
がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行な
い、また７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっ
ていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ある
いは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称
される。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞
や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の
機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝達物質お
よび生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を
担っている。レセプターは生理活性物質との結合を介し
てシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞
の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。各種生
体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、そ
の特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体
の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連
した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとな
る。
理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋
白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセ
プター蛋白質のうち多くは共役しているguanine nucleo
tide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合
がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行な
い、また７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっ
ていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ある
いは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称
される。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞
や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の
機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝達物質お
よび生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を
担っている。レセプターは生理活性物質との結合を介し
てシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞
の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。各種生
体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、そ
の特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体
の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連
した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとな
る。
【０００３】例えば、生体の種々の器官では、多くのホ
ルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活
性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわ
れている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に
存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通して
その生理機能の調節を行っている。生体内には未だ未知
のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多
く、それらのレセプター蛋白質の構造に関しても、これ
まで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセ
プター蛋白質にいてもサブタイプが存在するかどうかに
ついても分かっていないものが多い。生体における複雑
な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質
との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重
要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴ
ニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、
医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセ
プター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な
発現系で発現させることが必要であった。近年、生体内
で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡ
の配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれてお
り、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がExpr
essed Sequence Tag（ＥＳＴ）としてデータベースに登
録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列
情報のみであり、その機能を推定することは困難であ
る。
ルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活
性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわ
れている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に
存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通して
その生理機能の調節を行っている。生体内には未だ未知
のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多
く、それらのレセプター蛋白質の構造に関しても、これ
まで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセ
プター蛋白質にいてもサブタイプが存在するかどうかに
ついても分かっていないものが多い。生体における複雑
な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質
との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重
要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴ
ニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、
医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセ
プター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な
発現系で発現させることが必要であった。近年、生体内
で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡ
の配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれてお
り、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がExpr
essed Sequence Tag（ＥＳＴ）としてデータベースに登
録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列
情報のみであり、その機能を推定することは困難であ
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来、Ｇ蛋白質共役型
レセプターと生理活性物質（即ち、リガンド）との結合
を阻害する物質や、結合して生理活性物質（即ち、リガ
ンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これ
らレセプターの特異的なアンタゴニストまたはアゴニス
トとして、生体機能を調節する医薬品として活用されて
きた。従って、このように生体内での生理発現において
重要であるばかりでなく、医薬品開発の標的ともなりう
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を新規に見出し、そ
の新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガン
ドを見出すことは、アゴニスト、アンタゴニストを見出
す際に、非常に重要な手段となる。さらにその際、レセ
プターの生理機構を明らかにするため、ヒトレセプター
遺伝子あるいはリガンド遺伝子に対する例えば齧歯類
（ラット、マウスなど）やチンパンジー、サル等のカウ
ンターパート遺伝子を取得し、その遺伝子産物の蛋白化
学的諸性質、生物学的諸活性を検索し、また動物体内で
の質的、量的動態や生理機構を詳細に調べて、ヒトにお
ける機能を推定することは、有効な医薬を創製する上で
も重要な事柄である。さらに候補となるアゴニスト、ア
ンタゴニストを選択する際に、種差の有無を認識しなが
ら、候補化合物を選定、決定することは、医薬品の創製
上欠くべからざる項目となっている。本発明は、上記の
ように、有用なヒト新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質に対する特異的なヒト由来のリガンドの、ラットおよ
びマウスホモログリガンド（以下、「本発明のリガンド
蛋白質」と称する場合がある）を提供するものである。
レセプターと生理活性物質（即ち、リガンド）との結合
を阻害する物質や、結合して生理活性物質（即ち、リガ
ンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これ
らレセプターの特異的なアンタゴニストまたはアゴニス
トとして、生体機能を調節する医薬品として活用されて
きた。従って、このように生体内での生理発現において
重要であるばかりでなく、医薬品開発の標的ともなりう
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を新規に見出し、そ
の新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガン
ドを見出すことは、アゴニスト、アンタゴニストを見出
す際に、非常に重要な手段となる。さらにその際、レセ
プターの生理機構を明らかにするため、ヒトレセプター
遺伝子あるいはリガンド遺伝子に対する例えば齧歯類
（ラット、マウスなど）やチンパンジー、サル等のカウ
ンターパート遺伝子を取得し、その遺伝子産物の蛋白化
学的諸性質、生物学的諸活性を検索し、また動物体内で
の質的、量的動態や生理機構を詳細に調べて、ヒトにお
ける機能を推定することは、有効な医薬を創製する上で
も重要な事柄である。さらに候補となるアゴニスト、ア
ンタゴニストを選択する際に、種差の有無を認識しなが
ら、候補化合物を選定、決定することは、医薬品の創製
上欠くべからざる項目となっている。本発明は、上記の
ように、有用なヒト新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質に対する特異的なヒト由来のリガンドの、ラットおよ
びマウスホモログリガンド（以下、「本発明のリガンド
蛋白質」と称する場合がある）を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これまで
にラット脳幹周辺部およびヒト脳由来のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質に対する細胞内Ｃａイオン濃度上昇活
性を有するペプチドを探索した。その結果、ガン転移抑
制遺伝子ＫｉＳＳ−１（Genomics, 54巻, 145頁-148頁,
1998年）にコードされる蛋白質のＣ端ペプチドが本レ
セプターを活性化する作用を有することを明らかにし、
ＫｉＳＳ−１中のアミノ酸５４残基からなるペプチド配
列さらにそのＣ端部分ペプチドにリガンド活性を有する
ことを確認した（特開２０００−３１２５９０号）。
にラット脳幹周辺部およびヒト脳由来のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質に対する細胞内Ｃａイオン濃度上昇活
性を有するペプチドを探索した。その結果、ガン転移抑
制遺伝子ＫｉＳＳ−１（Genomics, 54巻, 145頁-148頁,
1998年）にコードされる蛋白質のＣ端ペプチドが本レ
セプターを活性化する作用を有することを明らかにし、
ＫｉＳＳ−１中のアミノ酸５４残基からなるペプチド配
列さらにそのＣ端部分ペプチドにリガンド活性を有する
ことを確認した（特開２０００−３１２５９０号）。
【０００６】ＫｉＳＳ−１遺伝子産物から切り出されて
生成するペプチドには、その遺伝子がガン転移抑制遺伝
子であることから、ガン転移抑制活性を有することが期
待される。それ以外にも、本遺伝子が胎盤に多量に発現
されていることや該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
ヒト型レセプターであるｈＯＴ７Ｔ１７５（ｈはヒト由
来であることを示す）が胎盤に多量に発現されているこ
とを鑑み、該ペプチドが胎盤で重要な機能を担っている
ことも予想される。また、ヒトでは膵臓にもレセプター
の発現が比較的高く、膵臓においても本ペプチドは何ら
かの生理機能を現しているものと期待される。また、ラ
ットリガンド、ラット型レセプターであるｒＯＴ７Ｔ１
７５（ｒはラット由来であることを示す）はともに盲
腸、大腸に高い発現量があり、このような臓器において
も本ペプチドは何らかの生理機能を現しているものと期
待される。本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト
型ＫｉＳＳ−１遺伝子配列を基に作成したＰＣＲプライ
マーを用いて、ラット肝臓ｃＤＮＡよりヒト型Ｋｉｓｓ
−１遺伝子に相同性の高い配列をコードするｃＤＮＡを
単離し、その全塩基配列を解析することに成功した。そ
して、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、
ヒト型ＫｉＳＳ−１アミノ酸配列と有意に高い相同性を
有する蛋白質をコードすることを確認した。一方、マウ
ス胚ｃＤＮＡより同様にヒト型ＫｉＳＳ−１遺伝子に相
同性の高い配列をコードするｃＤＮＡを単離し、その配
列がヒトおよびラット型ＫｉＳＳ−１アミノ酸配列と有
意に高い相同性を有する蛋白質をコードする配列である
ことを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づい
て、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至っ
た。
生成するペプチドには、その遺伝子がガン転移抑制遺伝
子であることから、ガン転移抑制活性を有することが期
待される。それ以外にも、本遺伝子が胎盤に多量に発現
されていることや該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
ヒト型レセプターであるｈＯＴ７Ｔ１７５（ｈはヒト由
来であることを示す）が胎盤に多量に発現されているこ
とを鑑み、該ペプチドが胎盤で重要な機能を担っている
ことも予想される。また、ヒトでは膵臓にもレセプター
の発現が比較的高く、膵臓においても本ペプチドは何ら
かの生理機能を現しているものと期待される。また、ラ
ットリガンド、ラット型レセプターであるｒＯＴ７Ｔ１
７５（ｒはラット由来であることを示す）はともに盲
腸、大腸に高い発現量があり、このような臓器において
も本ペプチドは何らかの生理機能を現しているものと期
待される。本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト
型ＫｉＳＳ−１遺伝子配列を基に作成したＰＣＲプライ
マーを用いて、ラット肝臓ｃＤＮＡよりヒト型Ｋｉｓｓ
−１遺伝子に相同性の高い配列をコードするｃＤＮＡを
単離し、その全塩基配列を解析することに成功した。そ
して、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、
ヒト型ＫｉＳＳ−１アミノ酸配列と有意に高い相同性を
有する蛋白質をコードすることを確認した。一方、マウ
ス胚ｃＤＮＡより同様にヒト型ＫｉＳＳ−１遺伝子に相
同性の高い配列をコードするｃＤＮＡを単離し、その配
列がヒトおよびラット型ＫｉＳＳ−１アミノ酸配列と有
意に高い相同性を有する蛋白質をコードする配列である
ことを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づい
て、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至っ
た。
【０００７】すなわち、本発明は、（１） 配列番号：
１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴
とする蛋白質またはその塩、（２） 該実質的に同一の
アミノ酸配列が配列番号：２で表されるアミノ酸配列で
ある上記（１）記載の蛋白質またはその塩、（３） 配
列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３２
から１４１番目のアミノ酸配列を含有することを特徴と
する上記（１）記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩、（４） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ
末端から１２７から１４１番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記（３）
記載の部分ペプチドまたはその塩、（５） 配列番号：
１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９０から１４１
番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を有する上記（３）記載の部分ペプチドまたはそ
の塩、（６） 配列番号：２で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から９４から１４５番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する上記（１）記
載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、（７） 配列
番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１０か
ら１１９番目のアミノ酸配列を含有することを特徴とす
る上記（１）記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩、（８） 配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ
末端から１０５から１１９番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記（７）
記載の部分ペプチドまたはその塩、（９） 配列番号：
３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６８から１１９
番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を有する上記（７）記載の部分ペプチドまたはそ
の塩、（１０） 上記（１）記載の蛋白質をコードする
ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（１
１） 上記（３）、（６）または（７）記載の部分ペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク
レオチド、（１２） ＤＮＡである上記（１０）または
（１１）記載のポリヌクレオチド、（１３） 配列番
号：４、配列番号：５または配列番号：６で表される塩
基配列を有する上記（１０）記載のポリヌクレオチド、
（１４） 上記（１０）または（１１）記載のポリヌク
レオチドを含有する組換えベクター、（１５） 上記
（１４）記載の組換えベクターで形質転換された形質転
換体、（１６） 上記（１５）記載の形質転換体を培養
し、上記（１）記載の蛋白質または上記（３）、（６）
もしくは（７）記載の部分ペプチドを生成・蓄積せしめ
ることを特徴とする上記（１）記載の蛋白質もしくはそ
の塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部
分ペプチドまたはその塩の製造方法、（１７） 上記
（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、
（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩
に対する抗体、（１８） 上記（１）記載の蛋白質また
は上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチ
ドのシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記
（１７）記載の抗体、（１９） 上記（１）記載の蛋白
質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは
（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを
特徴とする、レセプターと上記（１）記載の蛋白質もし
くはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記
載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる
化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２０）
上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記
（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまた
はその塩を含有することを特徴とする、レセプターと上
記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記
（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまた
はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の
スクリーニング用キット、（２１） レセプターが配列
番号：７、配列番号：８または配列番号：２４で表され
るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配
列を有することを特徴とする蛋白質またはその塩である
上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２
０）記載のスクリーニング用キット、（２２） 上記
（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２０）
記載のスクリーニング用キットを用いて得ることのでき
る、レセプターと上記（１）または上記（３）ないし
（５）のいずれか１項記載の蛋白質またはその塩との結
合性を変化させる化合物またはその塩、（２３） アゴ
ニストである上記（２２）記載の化合物またはその塩、
（２４） 上記（１９）記載のスクリーニング方法また
は上記（２０）記載のスクリーニング用キットを用いて
得ることのできる、レセプターと上記（１）記載の蛋白
質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは
（７）記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変
化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬組成
物、（２５） 癌転移抑制剤である上記（２４）記載の
医薬組成物、（２６） 上記（１７）記載の抗体を用い
ることを特徴とする、上記（１）記載の蛋白質または上
記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドの
定量方法、（２７） 上記（１）記載の蛋白質もしくは
その塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の
部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬組成物、
（２８） 癌転移抑制剤である上記（２７）記載の医薬
組成物などに関する。
１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴
とする蛋白質またはその塩、（２） 該実質的に同一の
アミノ酸配列が配列番号：２で表されるアミノ酸配列で
ある上記（１）記載の蛋白質またはその塩、（３） 配
列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３２
から１４１番目のアミノ酸配列を含有することを特徴と
する上記（１）記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩、（４） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ
末端から１２７から１４１番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記（３）
記載の部分ペプチドまたはその塩、（５） 配列番号：
１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９０から１４１
番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を有する上記（３）記載の部分ペプチドまたはそ
の塩、（６） 配列番号：２で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から９４から１４５番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する上記（１）記
載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、（７） 配列
番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１０か
ら１１９番目のアミノ酸配列を含有することを特徴とす
る上記（１）記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩、（８） 配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ
末端から１０５から１１９番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記（７）
記載の部分ペプチドまたはその塩、（９） 配列番号：
３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６８から１１９
番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を有する上記（７）記載の部分ペプチドまたはそ
の塩、（１０） 上記（１）記載の蛋白質をコードする
ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（１
１） 上記（３）、（６）または（７）記載の部分ペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク
レオチド、（１２） ＤＮＡである上記（１０）または
（１１）記載のポリヌクレオチド、（１３） 配列番
号：４、配列番号：５または配列番号：６で表される塩
基配列を有する上記（１０）記載のポリヌクレオチド、
（１４） 上記（１０）または（１１）記載のポリヌク
レオチドを含有する組換えベクター、（１５） 上記
（１４）記載の組換えベクターで形質転換された形質転
換体、（１６） 上記（１５）記載の形質転換体を培養
し、上記（１）記載の蛋白質または上記（３）、（６）
もしくは（７）記載の部分ペプチドを生成・蓄積せしめ
ることを特徴とする上記（１）記載の蛋白質もしくはそ
の塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部
分ペプチドまたはその塩の製造方法、（１７） 上記
（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、
（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩
に対する抗体、（１８） 上記（１）記載の蛋白質また
は上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチ
ドのシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記
（１７）記載の抗体、（１９） 上記（１）記載の蛋白
質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは
（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを
特徴とする、レセプターと上記（１）記載の蛋白質もし
くはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記
載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる
化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２０）
上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記
（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまた
はその塩を含有することを特徴とする、レセプターと上
記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記
（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまた
はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の
スクリーニング用キット、（２１） レセプターが配列
番号：７、配列番号：８または配列番号：２４で表され
るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配
列を有することを特徴とする蛋白質またはその塩である
上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２
０）記載のスクリーニング用キット、（２２） 上記
（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２０）
記載のスクリーニング用キットを用いて得ることのでき
る、レセプターと上記（１）または上記（３）ないし
（５）のいずれか１項記載の蛋白質またはその塩との結
合性を変化させる化合物またはその塩、（２３） アゴ
ニストである上記（２２）記載の化合物またはその塩、
（２４） 上記（１９）記載のスクリーニング方法また
は上記（２０）記載のスクリーニング用キットを用いて
得ることのできる、レセプターと上記（１）記載の蛋白
質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは
（７）記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変
化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬組成
物、（２５） 癌転移抑制剤である上記（２４）記載の
医薬組成物、（２６） 上記（１７）記載の抗体を用い
ることを特徴とする、上記（１）記載の蛋白質または上
記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドの
定量方法、（２７） 上記（１）記載の蛋白質もしくは
その塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の
部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬組成物、
（２８） 癌転移抑制剤である上記（２７）記載の医薬
組成物などに関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の蛋白質は、上記のヒト新
規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ｈＯＴ７Ｔ１７
５）に対する特異的なヒト由来のリガンドの、ラットお
よびマウスのホモログ、ならびにそれらの成熟形態であ
る。これらの蛋白質は、例えば、ヒトや哺乳動物（例え
ば、サル、ラット、マウス、 モルモット、ウサギ、ブ
タ、ヒツジ、ウシ、サル等）のあらゆる細胞（例えば、
脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細
胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそ
れらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の
各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、
視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、
前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、
下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆の
う、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、
小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末
梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、
関節、骨格筋など（特に、脳や脳の各部位）に由来する
蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよ
い。
規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ｈＯＴ７Ｔ１７
５）に対する特異的なヒト由来のリガンドの、ラットお
よびマウスのホモログ、ならびにそれらの成熟形態であ
る。これらの蛋白質は、例えば、ヒトや哺乳動物（例え
ば、サル、ラット、マウス、 モルモット、ウサギ、ブ
タ、ヒツジ、ウシ、サル等）のあらゆる細胞（例えば、
脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細
胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそ
れらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の
各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、
視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、
前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、
下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆の
う、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、
小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末
梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、
関節、骨格筋など（特に、脳や脳の各部位）に由来する
蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよ
い。
【０００９】本発明の蛋白質は、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質に特異的に結合する性質を有する。Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質としては、ヒト由来のＯＴ７Ｔ
１７５、ラット由来のＯＴ７Ｔ１７５、またはサル、マ
ウス等の哺乳動物のＯＴ７Ｔ１７５ホモログ等が挙げら
れる。本発明の蛋白質は、具体的には、マウス型１およ
びマウス型２と称されるマウス由来の蛋白質（それぞれ
配列番号：１および配列番号：２に示すアミノ酸配列を
含有）、ならびにラット型の蛋白質（配列番号：３に示
すアミノ酸配列を含有）、さらにそれらの蛋白質の成熟
体ポリペプチドを包含する。マウス型１の成熟体ポリペ
プチドは配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端
から９０から１４１番目のアミノ酸配列を有する蛋白質
であり、マウス型２の成熟体ポリペプチドは配列番号：
２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９４から１４５
番目のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、ラット型の
成熟体ポリペプチドは配列番号：３で表されるアミノ酸
配列のＮ末端から６８から１１９番目のアミノ酸配列を
有する蛋白質である。
ター蛋白質に特異的に結合する性質を有する。Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質としては、ヒト由来のＯＴ７Ｔ
１７５、ラット由来のＯＴ７Ｔ１７５、またはサル、マ
ウス等の哺乳動物のＯＴ７Ｔ１７５ホモログ等が挙げら
れる。本発明の蛋白質は、具体的には、マウス型１およ
びマウス型２と称されるマウス由来の蛋白質（それぞれ
配列番号：１および配列番号：２に示すアミノ酸配列を
含有）、ならびにラット型の蛋白質（配列番号：３に示
すアミノ酸配列を含有）、さらにそれらの蛋白質の成熟
体ポリペプチドを包含する。マウス型１の成熟体ポリペ
プチドは配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端
から９０から１４１番目のアミノ酸配列を有する蛋白質
であり、マウス型２の成熟体ポリペプチドは配列番号：
２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９４から１４５
番目のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、ラット型の
成熟体ポリペプチドは配列番号：３で表されるアミノ酸
配列のＮ末端から６８から１１９番目のアミノ酸配列を
有する蛋白質である。
【００１０】本明細書において、「実質的に同一のアミ
ノ酸配列」とは、（１）対照となるアミノ酸配列中の１
または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好
ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１個
または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（２）対照となるアミノ酸配列に１または２個以上（好
ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個
程度、さらに好ましくは数個（１個または２個）のアミ
ノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）対照となるアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個（１個または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸
で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み
合わせたアミノ酸配列を意味する。具体的には、例え
ば、配列番号：１または３で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としてはは、配列番号：１ま
たは３で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好まし
くは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最
も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配
列等が挙げられる。
ノ酸配列」とは、（１）対照となるアミノ酸配列中の１
または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好
ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１個
または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（２）対照となるアミノ酸配列に１または２個以上（好
ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個
程度、さらに好ましくは数個（１個または２個）のアミ
ノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）対照となるアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個（１個または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸
で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み
合わせたアミノ酸配列を意味する。具体的には、例え
ば、配列番号：１または３で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としてはは、配列番号：１ま
たは３で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好まし
くは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最
も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配
列等が挙げられる。
【００１１】本発明の蛋白質と実質的に同一のアミノ酸
配列を含有する蛋白質、および実質的に同一のアミノ酸
配列を有する蛋白質は、本発明の蛋白質と実質的に同質
の性質を有している。すなわち、これらの蛋白質はＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質に特異的に結合する性質を
有する。好ましいレセプターとしては、ヒト由来のＯＴ
７Ｔ１７５（配列番号：７に示す）、ラット由来のＯＴ
７Ｔ１７５（配列番号：８に示す）およびマウス由来の
ＯＴ７Ｔ１７５（配列番号：２４に示す）がある。詳細
には、かかる性質はＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質へ
の結合活性、シグナル情報伝達作用（活性）等が挙げら
れ、それらの性質または活性が同等（例えば、約０．０
１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ま
しくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これ
らの活性の程度や蛋白質の分子量等の量的要素は異なっ
ていてもよい。これらの活性の測定は、自体公知の方法
に準じて行うことができるが、例えば、後述するスクリ
ーニング法に従って測定することもできる。本発明の蛋
白質と実質的に同質の性質を有する蛋白質もまた、本発
明の蛋白質に包含される。
配列を含有する蛋白質、および実質的に同一のアミノ酸
配列を有する蛋白質は、本発明の蛋白質と実質的に同質
の性質を有している。すなわち、これらの蛋白質はＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質に特異的に結合する性質を
有する。好ましいレセプターとしては、ヒト由来のＯＴ
７Ｔ１７５（配列番号：７に示す）、ラット由来のＯＴ
７Ｔ１７５（配列番号：８に示す）およびマウス由来の
ＯＴ７Ｔ１７５（配列番号：２４に示す）がある。詳細
には、かかる性質はＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質へ
の結合活性、シグナル情報伝達作用（活性）等が挙げら
れ、それらの性質または活性が同等（例えば、約０．０
１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ま
しくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これ
らの活性の程度や蛋白質の分子量等の量的要素は異なっ
ていてもよい。これらの活性の測定は、自体公知の方法
に準じて行うことができるが、例えば、後述するスクリ
ーニング法に従って測定することもできる。本発明の蛋
白質と実質的に同質の性質を有する蛋白質もまた、本発
明の蛋白質に包含される。
【００１２】本明細書において本発明の蛋白質を記載す
る場合、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（ア
ミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）であ
る。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する
リガンド蛋白質をはじめとする、本発明のリガンド蛋白
質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）また
はカルボキシレート(−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端が
アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）
であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、
例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル
もしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例え
ば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シ
クロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなど
のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチ
ルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナ
フチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基
などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステル
として汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用い
られる。本発明のリガンド蛋白質がＣ末端以外にカルボ
キシル基（またはカルボキシレート）を有している場
合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されて
いるものも本発明のリガンド蛋白質に含まれる。この場
合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステ
ルなどが用いられる。さらに、本発明のリガンド蛋白質
には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残
基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル
などのＣ２− ６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基
など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断さ
れ生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したも
の、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−Ｏ
Ｈ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、アミノ基、イミダゾール基、
インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例
えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイ
ル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているも
の、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複
合蛋白質なども含まれる。本発明のリガンド蛋白質の具
体例としては、例えば、配列番号：１および２で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するマウス由来のリガンド蛋白
質（それぞれマウス型１およびマウス型２）または配列
番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するラット由
来のリガンド蛋白質（ラット型）などがある。
る場合、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（ア
ミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）であ
る。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する
リガンド蛋白質をはじめとする、本発明のリガンド蛋白
質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）また
はカルボキシレート(−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端が
アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）
であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、
例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル
もしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例え
ば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シ
クロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなど
のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチ
ルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナ
フチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基
などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステル
として汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用い
られる。本発明のリガンド蛋白質がＣ末端以外にカルボ
キシル基（またはカルボキシレート）を有している場
合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されて
いるものも本発明のリガンド蛋白質に含まれる。この場
合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステ
ルなどが用いられる。さらに、本発明のリガンド蛋白質
には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残
基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル
などのＣ２− ６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基
など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断さ
れ生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したも
の、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−Ｏ
Ｈ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、アミノ基、イミダゾール基、
インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例
えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイ
ル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているも
の、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複
合蛋白質なども含まれる。本発明のリガンド蛋白質の具
体例としては、例えば、配列番号：１および２で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するマウス由来のリガンド蛋白
質（それぞれマウス型１およびマウス型２）または配列
番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するラット由
来のリガンド蛋白質（ラット型）などがある。
【００１３】本発明のリガンド蛋白質の部分ペプチド
（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）も本発明
に包含され、本発明のリガンド蛋白質の部分ペプチドで
あれば何れのものであってもよいが、上記した性質を有
するものであることが必須である。具体的には、配列番
号：１、２または３で表わされるアミノ酸配列を有する
蛋白質の部分ペプチドとしては、上記したこれらの成熟
体が典型例である。さらにそれらの成熟体の部分ペプチ
ドも、上記した性質を有しているかぎり、本発明に包含
されることはいうまでもない。すなわち、配列番号：
１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
の部分ペプチドとして具体的には、（a）配列番号：１
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９０から１４１番
目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩、（b）配列番
号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３４から
１４１番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５２個の
アミノ酸残基からなるポリペプチドもしくはそのアミド
もしくはそのエステルまたはその塩、（c）配列番号：
２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９４から１４５
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその
アミドもしくはそのエステルまたはその塩、（d）配列
番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３８か
ら１４５番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５２個
のアミノ酸残基からなるポリペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩、（e）配列番
号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６８から１
１９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは
そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（f）
配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１
２から１１９番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５
２個のアミノ酸残基からなるポリペプチドもしくはその
アミドもしくはそのエステルまたはその塩、（g）配列
番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３２か
ら１４１番目のアミノ酸配列を含有するポリペプチドも
しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（h）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端か
ら１２７から１４１番目のアミノ酸配列と同一または実
質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもし
くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（i）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端か
ら１１０から１１９番目のアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた
はその塩、（j）配列番号：３で表されるアミノ酸配列
のＮ末端から１０５から１１９番目のアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
その塩などが挙げられる。上記（a）〜（j）に記載のポ
リペプチドはそのＣ末端がアミド体であるものが好まし
い。実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらのアミノ
酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さら
に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以
上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。このうち、好
ましくは上記（a）〜（j）に記載のポリペプチドもしく
はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩であ
り、さらに好ましくは、 i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から
１３２から１４１番目のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩、 ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から
１２７から１４１番目のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩、 iii）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端か
ら１１０から１１９番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
その塩、 iv）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から
１０５から１１９番目のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩である。これらのポリペプチドはそのＣ末端がアミ
ド体であるものが好ましい。
（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）も本発明
に包含され、本発明のリガンド蛋白質の部分ペプチドで
あれば何れのものであってもよいが、上記した性質を有
するものであることが必須である。具体的には、配列番
号：１、２または３で表わされるアミノ酸配列を有する
蛋白質の部分ペプチドとしては、上記したこれらの成熟
体が典型例である。さらにそれらの成熟体の部分ペプチ
ドも、上記した性質を有しているかぎり、本発明に包含
されることはいうまでもない。すなわち、配列番号：
１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
の部分ペプチドとして具体的には、（a）配列番号：１
で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９０から１４１番
目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩、（b）配列番
号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３４から
１４１番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５２個の
アミノ酸残基からなるポリペプチドもしくはそのアミド
もしくはそのエステルまたはその塩、（c）配列番号：
２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９４から１４５
番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその
アミドもしくはそのエステルまたはその塩、（d）配列
番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３８か
ら１４５番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５２個
のアミノ酸残基からなるポリペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩、（e）配列番
号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６８から１
１９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは
そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（f）
配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１
２から１１９番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５
２個のアミノ酸残基からなるポリペプチドもしくはその
アミドもしくはそのエステルまたはその塩、（g）配列
番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３２か
ら１４１番目のアミノ酸配列を含有するポリペプチドも
しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（h）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端か
ら１２７から１４１番目のアミノ酸配列と同一または実
質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもし
くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（i）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端か
ら１１０から１１９番目のアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた
はその塩、（j）配列番号：３で表されるアミノ酸配列
のＮ末端から１０５から１１９番目のアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
その塩などが挙げられる。上記（a）〜（j）に記載のポ
リペプチドはそのＣ末端がアミド体であるものが好まし
い。実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらのアミノ
酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さら
に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以
上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。このうち、好
ましくは上記（a）〜（j）に記載のポリペプチドもしく
はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩であ
り、さらに好ましくは、 i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から
１３２から１４１番目のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩、 ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から
１２７から１４１番目のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩、 iii）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端か
ら１１０から１１９番目のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
その塩、 iv）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から
１０５から１１９番目のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩である。これらのポリペプチドはそのＣ末端がアミ
ド体であるものが好ましい。
【００１４】また、本発明の部分ペプチドは、上記アミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０
個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のア
ミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または
２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２
個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、
より好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他
のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発明の部
分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯ
Ｈ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、
前記した本発明のリガンド蛋白質のごとく、Ｃ末端がア
ミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）
（Ｒは上記と同意義を示す）であってもよい。さらに、
本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のリガンド
蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が
保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断さ
れ生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護さ
れているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプ
チドなどの複合ペプチドなども含まれる。本発明のリガ
ンド蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、生理
学的に許容される塩基もしくは酸との塩が用いられ、と
りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この
様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例え
ば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安
息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との
塩などが用いられる。
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０
個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のア
ミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または
２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２
個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、
より好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他
のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発明の部
分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯ
Ｈ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、
前記した本発明のリガンド蛋白質のごとく、Ｃ末端がア
ミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）
（Ｒは上記と同意義を示す）であってもよい。さらに、
本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のリガンド
蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が
保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断さ
れ生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護さ
れているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプ
チドなどの複合ペプチドなども含まれる。本発明のリガ
ンド蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、生理
学的に許容される塩基もしくは酸との塩が用いられ、と
りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この
様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例え
ば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安
息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との
塩などが用いられる。
【００１５】本発明のリガンド蛋白質またはその塩は、
前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知
のリガンド蛋白質の精製方法によって製造することもで
きるし、後述する本発明のリガンド蛋白質をコードする
ＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても
製造することができる。また、後述の蛋白質合成法また
はこれに準じた方法により製造することもできる。ヒト
や哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや
哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸な
どで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラ
フィーを組み合わせることにより精製単離することがで
きる。
前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知
のリガンド蛋白質の精製方法によって製造することもで
きるし、後述する本発明のリガンド蛋白質をコードする
ＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても
製造することができる。また、後述の蛋白質合成法また
はこれに準じた方法により製造することもできる。ヒト
や哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや
哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸な
どで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラ
フィーを組み合わせることにより精製単離することがで
きる。
【００１６】本発明のリガンド蛋白質、その部分ペプチ
ドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成に
は、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセト
アミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列
通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合
させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時
に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジ
スルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質または
それらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の
縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試
薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類が
よい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプ
ロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミ
ノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これら
による活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt,
HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかま
たは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBt
エステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行な
った後に樹脂に添加することができる。
ドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成に
は、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセト
アミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列
通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合
させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時
に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジ
スルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質または
それらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の
縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試
薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類が
よい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプ
ロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミ
ノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これら
による活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt,
HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかま
たは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBt
エステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行な
った後に樹脂に添加することができる。
【００１７】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうるこ
とが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩
化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素
類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメ
チルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジ
オキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセ
トニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸
メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの
適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合
形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適
宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選
択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜
４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテス
トの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行う
ことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行
なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得
られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾー
ルを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによっ
て、後の反応に影響を与えないようにすることができ
る。
いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうるこ
とが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩
化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素
類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメ
チルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジ
オキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセ
トニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸
メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの
適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合
形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適
宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選
択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜
４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテス
トの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行う
ことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行
なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得
られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾー
ルを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによっ
て、後の反応に影響を与えないようにすることができ
る。
【００１８】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキ
シル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、
シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シ
クロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状
もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステ
ル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジル
エステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロ
ベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェ
ナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジ
ド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、
トリチルヒドラジド化などによって保護することができ
る。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエー
テル化によって保護することができる。このエステル化
に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンのフ
ェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl
２-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチ
ルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護
基としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメ
チルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチ
ル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
ば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキ
シル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、
シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シ
クロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状
もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステ
ル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジル
エステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロ
ベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェ
ナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジ
ド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、
トリチルヒドラジド化などによって保護することができ
る。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエー
テル化によって保護することができる。このエステル化
に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンのフ
ェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl
２-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチ
ルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護
基としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメ
チルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチ
ル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
【００１９】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭
素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、
また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオ
ロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれら
の混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルア
ミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなど
による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによ
る還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応
は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、
酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、
チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジ
メチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタン
ジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効で
ある。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用
いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理
により除去され、トリプトファンのインドール保護基と
して用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭
素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、
また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオ
ロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれら
の混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルア
ミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなど
による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによ
る還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応
は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、
酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、
チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジ
メチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタン
ジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効で
ある。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用
いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理
により除去され、トリプトファンのインドール保護基と
して用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。
【００２０】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。蛋白質のアミド体を得る別の方法
としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα
−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基
側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした
後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみ
を除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみ
を除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記した
ような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細につい
ては上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質
を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去
し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質
は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍
結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることが
できる。蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カル
ボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアル
コール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質の
アミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得
ることができる。
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。蛋白質のアミド体を得る別の方法
としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα
−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基
側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした
後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみ
を除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみ
を除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記した
ような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細につい
ては上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質
を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去
し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質
は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍
結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることが
できる。蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カル
ボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアル
コール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質の
アミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得
ることができる。
【００２１】本発明のリガンド蛋白質の部分ペプチド
は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本
発明のリガンド蛋白質を適当なペプチダーゼで切断する
ことによって製造することができる。ペプチドの合成法
としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれに
よっても良い。すなわち、本発明のリガンド蛋白質を構
成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを
縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離
することにより目的のペプチドを製造することができ
る。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、
以下の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。
は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本
発明のリガンド蛋白質を適当なペプチダーゼで切断する
ことによって製造することができる。ペプチドの合成法
としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれに
よっても良い。すなわち、本発明のリガンド蛋白質を構
成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを
縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離
することにより目的のペプチドを製造することができ
る。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、
以下の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。
【００２２】本発明のリガンド蛋白質をコードするポリ
ヌクレオチドとしては、前述した本発明のリガンド蛋白
質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好まし
くはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであ
ってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のリ
ガンド蛋白質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ
であり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二
本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハ
イブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即
ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非
コード鎖）であってもよい。本発明のリガンド蛋白質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の
実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載
の方法またはそれに準じた方法により、本発明のリガン
ド蛋白質のｍＲＮＡを定量することができる。本発明の
リガンド蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織
由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡラ
イブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリ
ーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラス
ミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよ
い。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたは
ｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Tran
scriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−
ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮ
Ａとしては、例えば、配列番号：４〜６の何れかで表わ
される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４
〜６の何れかで表わされる塩基配列とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本
発明のリガンド蛋白質と実質的に同質の活性（例、リガ
ンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋
白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４〜６の何れかで表わされる塩基配列とハイ
ブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
４〜６の何れかで表わされる塩基配列と約７０％以上、
好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ヌクレオチドとしては、前述した本発明のリガンド蛋白
質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好まし
くはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであ
ってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のリ
ガンド蛋白質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ
であり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二
本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハ
イブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即
ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非
コード鎖）であってもよい。本発明のリガンド蛋白質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の
実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載
の方法またはそれに準じた方法により、本発明のリガン
ド蛋白質のｍＲＮＡを定量することができる。本発明の
リガンド蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織
由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡラ
イブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリ
ーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラス
ミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよ
い。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたは
ｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Tran
scriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−
ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮ
Ａとしては、例えば、配列番号：４〜６の何れかで表わ
される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４
〜６の何れかで表わされる塩基配列とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本
発明のリガンド蛋白質と実質的に同質の活性（例、リガ
ンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋
白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４〜６の何れかで表わされる塩基配列とハイ
ブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
４〜６の何れかで表わされる塩基配列と約７０％以上、
好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２３】ハイブリダイゼーションは、自体公知の方
法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook
etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記
載の方法などに従って行なうことができる。また、市販
のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記
載の方法に従って行なうことができる。より好ましく
は、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことが
できる。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、
ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９
〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６
０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１
９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具
体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含
有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：
４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。また、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含
有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：
５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。さらに配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含
有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：
６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡの塩基
配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部
を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の
部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではな
く、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。本発明に従
えば、本発明のリガンド蛋白質遺伝子の複製又は発現を
阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド
（核酸）を、クローン化したあるいは決定された蛋白質
をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合
成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、蛋白
質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該
ＲＮＡの合成又は機能を阻害することができるか、ある
いはリガンド蛋白質関連ＲＮＡとの相互作用を介してリ
ガンド蛋白質遺伝子の発現を調節・制御することができ
る。リガンド蛋白質関連ＲＮＡの選択された配列に相補
的なポリヌクレオチド、及びリガンド蛋白質関連ＲＮＡ
と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレ
オチドは、生体内及び生体外でリガンド蛋白質遺伝子の
発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの
治療又は診断に有用である。用語「対応する」とは、遺
伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列又は核酸の特定の
配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味
する。ヌクレオチド、塩基配列又は核酸とペプチド（蛋
白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核
酸）の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペ
プチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。リガン
ド蛋白質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベ
ースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド
翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コ
ドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、
及び３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選
択しうるが、リガンド蛋白質遺伝子内の如何なる領域も
対象として選択しうる。
法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook
etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記
載の方法などに従って行なうことができる。また、市販
のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記
載の方法に従って行なうことができる。より好ましく
は、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことが
できる。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、
ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９
〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６
０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１
９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具
体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含
有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：
４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。また、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含
有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：
５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。さらに配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含
有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：
６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡの塩基
配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部
を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の
部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではな
く、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。本発明に従
えば、本発明のリガンド蛋白質遺伝子の複製又は発現を
阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド
（核酸）を、クローン化したあるいは決定された蛋白質
をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合
成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、蛋白
質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該
ＲＮＡの合成又は機能を阻害することができるか、ある
いはリガンド蛋白質関連ＲＮＡとの相互作用を介してリ
ガンド蛋白質遺伝子の発現を調節・制御することができ
る。リガンド蛋白質関連ＲＮＡの選択された配列に相補
的なポリヌクレオチド、及びリガンド蛋白質関連ＲＮＡ
と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレ
オチドは、生体内及び生体外でリガンド蛋白質遺伝子の
発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの
治療又は診断に有用である。用語「対応する」とは、遺
伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列又は核酸の特定の
配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味
する。ヌクレオチド、塩基配列又は核酸とペプチド（蛋
白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核
酸）の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペ
プチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。リガン
ド蛋白質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベ
ースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド
翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コ
ドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、
及び３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選
択しうるが、リガンド蛋白質遺伝子内の如何なる領域も
対象として選択しうる。
【００２４】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブ
リダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係
は、「アンチセンス」であるということができる。アン
チセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リ
ボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−
リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、プ
リン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他
のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド
骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質
核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）又は特殊な結
合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤ
ＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや
塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有す
る）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本
鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブ
リッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチ
ド（又は非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の
修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識
のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたも
の、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換した
もの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非
荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエ
ステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持
つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持
つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・
インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポ
リ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライド
など）などの側鎖基を有しているもの、インターカレン
ト化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持
つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をも
つ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、
アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つも
の（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよ
い。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」及び
「核酸」とは、プリン及びピリミジン塩基を含有するの
みでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつよう
なものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル
化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン
及びピリミジン、あるいはその他の複素環を含むもので
あってよい。修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌ
クレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば
１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換
されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基
に変換されていてよい。
相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブ
リダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係
は、「アンチセンス」であるということができる。アン
チセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リ
ボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−
リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、プ
リン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他
のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド
骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質
核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）又は特殊な結
合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤ
ＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや
塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有す
る）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本
鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブ
リッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチ
ド（又は非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の
修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識
のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたも
の、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換した
もの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非
荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエ
ステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持
つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持
つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・
インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポ
リ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライド
など）などの側鎖基を有しているもの、インターカレン
ト化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持
つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をも
つ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、
アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つも
の（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよ
い。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」及び
「核酸」とは、プリン及びピリミジン塩基を含有するの
みでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつよう
なものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル
化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン
及びピリミジン、あるいはその他の複素環を含むもので
あってよい。修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌ
クレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば
１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換
されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基
に変換されていてよい。
【００２５】本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド
（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸
（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうして修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 などに開示がある。本発明のアン
チセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、
塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロス
フェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療
により適用されたり、付加された形態で与えられること
ができる。こうして付加形態で用いられるものとして
は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ
ンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高め
たり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例え
ば、ホスホリピッド、コレステロールなど）といった粗
水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質とし
ては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステ
リルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。
こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着さ
せることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を
介して付着させることができうる。その他の基として
は、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置された
キャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅな
どのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙
げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチ
レングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリ
コールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護
基が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、
本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発
明のリガンド蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて
調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法
で細胞に適用できる。
（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸
（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうして修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 などに開示がある。本発明のアン
チセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、
塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロス
フェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療
により適用されたり、付加された形態で与えられること
ができる。こうして付加形態で用いられるものとして
は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ
ンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高め
たり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例え
ば、ホスホリピッド、コレステロールなど）といった粗
水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質とし
ては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステ
リルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。
こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着さ
せることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を
介して付着させることができうる。その他の基として
は、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置された
キャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅな
どのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙
げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチ
レングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリ
コールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護
基が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、
本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発
明のリガンド蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて
調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法
で細胞に適用できる。
【００２６】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ
−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもでき
る。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：４〜６で表わ
される塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有する
ＤＮＡ、または（２）配列番号：４〜６で表わされる塩
基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする塩基配列を有し、本発明のリガンド蛋白質と実質
的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報
伝達作用など）を有するリガンド蛋白質をコードするＤ
ＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４〜６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
の部分塩基配列を有するＤＮＡの典型例としては、本発
明のリガンド蛋白質の成熟体をコードするＤＮＡ等が挙
げられる。配列番号：４〜６で表わされる塩基配列ハイ
ブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
４〜６で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましく
は約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好
ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有
するＤＮＡなどが用いられる。
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ
−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもでき
る。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：４〜６で表わ
される塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有する
ＤＮＡ、または（２）配列番号：４〜６で表わされる塩
基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする塩基配列を有し、本発明のリガンド蛋白質と実質
的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報
伝達作用など）を有するリガンド蛋白質をコードするＤ
ＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４〜６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
の部分塩基配列を有するＤＮＡの典型例としては、本発
明のリガンド蛋白質の成熟体をコードするＤＮＡ等が挙
げられる。配列番号：４〜６で表わされる塩基配列ハイ
ブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
４〜６で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましく
は約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好
ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有
するＤＮＡなどが用いられる。
【００２７】本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペ
プチド（以下、本発明のリガンド蛋白質と略記する場合
がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手
段としては、本発明のリガンド蛋白質の部分塩基配列を
有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって
増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡ
を本発明のリガンド蛋白質の一部あるいは全領域をコー
ドするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識した
ものとのハイブリダイゼーションによって選別すること
ができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、
モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２n
d（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Pre
ss, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができ
る。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の
使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
プチド（以下、本発明のリガンド蛋白質と略記する場合
がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手
段としては、本発明のリガンド蛋白質の部分塩基配列を
有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって
増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡ
を本発明のリガンド蛋白質の一部あるいは全領域をコー
ドするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識した
ものとのハイブリダイゼーションによって選別すること
ができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、
モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２n
d（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Pre
ss, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができ
る。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の
使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２８】ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−
Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ
法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等
の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って
行なうことができる。クローン化された本発明のリガン
ド蛋白質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、ま
たは所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加
したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’
末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また
３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ
またはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コ
ドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプター
を用いて付加することもできる。本発明のリガンド蛋白
質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のリガンド
蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を
切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中
のプロモーターの下流に連結することにより製造するこ
とができる。
のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−
Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ
法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等
の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って
行なうことができる。クローン化された本発明のリガン
ド蛋白質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、ま
たは所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加
したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’
末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また
３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ
またはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コ
ドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプター
を用いて付加することもできる。本発明のリガンド蛋白
質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のリガンド
蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を
切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中
のプロモーターの下流に連結することにより製造するこ
とができる。
【００２９】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好
ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐ
プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモー
ター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなど
が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモ
ーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター
など、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
プロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場
合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター
などが好ましい。
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好
ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐ
プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモー
ター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなど
が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモ
ーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター
など、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
プロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場
合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター
などが好ましい。
【００３０】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）
等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用
いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場
合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選
択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル
配列を、本発明のリガンド蛋白質のＮ端末側に付加す
る。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シ
グナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチ
ルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配
列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母で
ある場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナ
ル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュ
リン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル
配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用でき
る。このようにして構築された本発明のリガンド蛋白質
をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質
転換体を製造することができる。
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）
等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用
いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場
合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選
択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル
配列を、本発明のリガンド蛋白質のＮ端末側に付加す
る。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シ
グナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチ
ルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配
列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母で
ある場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナ
ル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュ
リン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル
配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用でき
る。このようにして構築された本発明のリガンド蛋白質
をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質
転換体を製造することができる。
【００３１】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。
【００３２】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveＴＭ 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞ま
たはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウ
イルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx
mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveＴＭ 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞ま
たはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウ
イルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx
mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。
【００３３】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４
巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載
の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆
虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー
（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方
法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換す
るには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロト
コール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、
ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)
に記載の方法に従って行なうことができる。このように
して、本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを含
有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得ら
れる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形
質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては
液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育
に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめら
れる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキスト
リン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例え
ば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リ
カー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイ
ショ抽出液などの無機または有機物質、無機物として
は、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エ
キス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよ
い。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４
巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載
の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆
虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー
（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方
法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換す
るには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロト
コール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、
ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)
に記載の方法に従って行なうことができる。このように
して、本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを含
有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得ら
れる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形
質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては
液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育
に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめら
れる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキスト
リン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例え
ば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リ
カー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイ
ショ抽出液などの無機または有機物質、無機物として
は、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エ
キス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよ
い。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３４】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で
約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通
常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により
通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形
質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バーク
ホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ
培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、
必要に応じて通気や撹拌を加える。
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で
約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通
常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により
通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形
質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バーク
ホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ
培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、
必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３５】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞膜に本発明の
リガンド蛋白質またはその部分ペプチドを生成せしめる
ことができる。
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞膜に本発明の
リガンド蛋白質またはその部分ペプチドを生成せしめる
ことができる。
【００３６】上記培養物から本発明のリガンド蛋白質ま
たはその部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下
記の方法により行なうことができる。本発明のリガンド
蛋白質またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞
から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あ
るいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドの粗抽
出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿
素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ
−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプ
チドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知
の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集
める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出
液中に含まれる本発明のリガンド蛋白質またはその部分
ペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組
み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、
精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用
する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主とし
て分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラ
フィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティー
クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差
を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を
利用する方法などが用いられる。
たはその部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下
記の方法により行なうことができる。本発明のリガンド
蛋白質またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞
から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あ
るいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドの粗抽
出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿
素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ
−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプ
チドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知
の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集
める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出
液中に含まれる本発明のリガンド蛋白質またはその部分
ペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組
み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、
精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用
する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主とし
て分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラ
フィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティー
クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差
を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を
利用する方法などが用いられる。
【００３７】かくして得られる本発明のリガンド蛋白質
またはその部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、
自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に
変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公
知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体また
は他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産
生する本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチド
を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用さ
せることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチド
を部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素として
は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニル
エンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダ
ーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明のリガ
ンド蛋白質またはその塩、本発明の部分ペプチドもしく
はそのエステルもしくはそのアミドまたはその塩の活性
は、標識したレセプターとの結合実験および特異抗体を
用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定するこ
とができる。
またはその部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、
自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に
変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公
知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体また
は他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産
生する本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチド
を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用さ
せることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチド
を部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素として
は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニル
エンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダ
ーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明のリガ
ンド蛋白質またはその塩、本発明の部分ペプチドもしく
はそのエステルもしくはそのアミドまたはその塩の活性
は、標識したレセプターとの結合実験および特異抗体を
用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定するこ
とができる。
【００３８】本発明のリガンド蛋白質またはその塩、そ
の部分ペプチドもしくはそのエステルもしくはそのアミ
ドまたはその塩（以下、本発明のリガンド蛋白質と略記
する場合がある）に対する抗体は、本発明のリガンド蛋
白質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のリ
ガンド蛋白質に対する抗体は、本発明のリガンド蛋白質
を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造
法に従って製造することができる。
の部分ペプチドもしくはそのエステルもしくはそのアミ
ドまたはその塩（以下、本発明のリガンド蛋白質と略記
する場合がある）に対する抗体は、本発明のリガンド蛋
白質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のリ
ガンド蛋白質に対する抗体は、本発明のリガンド蛋白質
を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造
法に従って製造することができる。
【００３９】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のリガンド蛋白質に対するレセプター（以下「レ
セプタ−」という場合もある）は、哺乳動物に対して投
与することにより抗体産生が可能な部位にそれ自体ある
いは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗
体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや
不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与
は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわ
れる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウ
サギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤ
ギなどがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく
用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
された本発明のリガンド蛋白質とを反応させたのち、抗
体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なう
ことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラ
ーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、２５
６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することが
できる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられ
るが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞とし
ては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが
挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いら
れる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好
ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好
ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜
８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好まし
くは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートす
ることにより効率よく細胞融合を実施できる。
セプタ−」という場合もある）は、哺乳動物に対して投
与することにより抗体産生が可能な部位にそれ自体ある
いは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗
体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや
不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与
は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわ
れる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウ
サギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤ
ギなどがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく
用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
された本発明のリガンド蛋白質とを反応させたのち、抗
体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なう
ことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラ
ーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、２５
６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することが
できる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられ
るが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞とし
ては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが
挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いら
れる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好
ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好
ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜
８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好まし
くは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートす
ることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４０】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、本発明のリガンド蛋白質抗原を直接あるいは担体と
ともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素な
どで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いら
れる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体
が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合
したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブ
リン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブ
リドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標
識した本発明のリガンド蛋白質を加え、固相に結合した
モノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに
準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡ
Ｔ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添
加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別
および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を
含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリ
ドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、本発明のリガンド蛋白質抗原を直接あるいは担体と
ともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素な
どで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いら
れる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体
が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合
したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブ
リン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブ
リドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標
識した本発明のリガンド蛋白質を加え、固相に結合した
モノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに
準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡ
Ｔ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添
加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別
および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を
含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリ
ドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４１】（ｂ）モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。
【００４２】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法にしたがって製造することができる。例えば、免
疫抗原（リガンド蛋白質抗原）とキャリアー蛋白質との
複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と
同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明
のリガンド蛋白質またはレセプター蛋白質に対する抗体
含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより
製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫
抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー
蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比
は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して
抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率
で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、
ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモ
シアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２
０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用
いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングに
は、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルア
ルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、
チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル
試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対し
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２
〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法にしたがって製造することができる。例えば、免
疫抗原（リガンド蛋白質抗原）とキャリアー蛋白質との
複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と
同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明
のリガンド蛋白質またはレセプター蛋白質に対する抗体
含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより
製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫
抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー
蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比
は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して
抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率
で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、
ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモ
シアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２
０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用
いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングに
は、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルア
ルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、
チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル
試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対し
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２
〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。
【００４３】本発明のリガンド蛋白質またはその塩、そ
の部分ペプチドもしくはそのエステルもしくはそのアミ
ドまたはその塩、およびそれをコードするＤＮＡは、
（１）本発明のリガンド蛋白質の機能不全に関連する疾
患の予防および／または治療剤、（２）遺伝子診断剤、
（３）本発明のリガンド蛋白質に対するレセプターの定
量、（４）本発明のリガンド蛋白質とレセプターとの結
合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト
など）のスクリーニング、（５）本発明のリガンド蛋白
質とレセプターとの結合性を変化させる化合物（アゴニ
スト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病の予防およ
び／または治療剤、（６）本発明のリガンド蛋白質の定
量、（７）本発明のリガンド蛋白質に対する抗体による
中和、（８）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮ
Ａを有する非ヒト動物の作製などに用いることができ
る。特に、本発明の組換え型リガンド蛋白質の発現系を
用いた、後述のレセプターとの結合アッセイ系を用いる
ことによって、ヒトや哺乳動物に特異的な本発明のリガ
ンド蛋白質に対するレセプターの結合性を変化させる化
合物（例、アゴニスト、アンタゴニストなど）をスクリ
ーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴ
ニストを後述の各種疾病の予防・治療剤などとして使用
することができる。本発明のリガンド蛋白質、およびそ
れをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記す
る場合がある）および本発明のリガンド蛋白質に対する
抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）等の
用途について、以下に具体的に説明する。
の部分ペプチドもしくはそのエステルもしくはそのアミ
ドまたはその塩、およびそれをコードするＤＮＡは、
（１）本発明のリガンド蛋白質の機能不全に関連する疾
患の予防および／または治療剤、（２）遺伝子診断剤、
（３）本発明のリガンド蛋白質に対するレセプターの定
量、（４）本発明のリガンド蛋白質とレセプターとの結
合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト
など）のスクリーニング、（５）本発明のリガンド蛋白
質とレセプターとの結合性を変化させる化合物（アゴニ
スト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病の予防およ
び／または治療剤、（６）本発明のリガンド蛋白質の定
量、（７）本発明のリガンド蛋白質に対する抗体による
中和、（８）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮ
Ａを有する非ヒト動物の作製などに用いることができ
る。特に、本発明の組換え型リガンド蛋白質の発現系を
用いた、後述のレセプターとの結合アッセイ系を用いる
ことによって、ヒトや哺乳動物に特異的な本発明のリガ
ンド蛋白質に対するレセプターの結合性を変化させる化
合物（例、アゴニスト、アンタゴニストなど）をスクリ
ーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴ
ニストを後述の各種疾病の予防・治療剤などとして使用
することができる。本発明のリガンド蛋白質、およびそ
れをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記す
る場合がある）および本発明のリガンド蛋白質に対する
抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）等の
用途について、以下に具体的に説明する。
【００４４】（１）本発明のリガンド蛋白質の機能不全
に関連する疾患の予防および／または治療剤 本発明のリガンド蛋白質または該リガンド蛋白質をコー
ドするＤＮＡを、本発明のリガンド蛋白質の機能不全に
関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬と
して使用することができる。例えば、生体内において本
発明のリガンド蛋白質が減少しているためにレセプター
の生理作用が期待できない（該リガンド蛋白質の欠乏
症）患者がいる場合に、本発明のリガンド蛋白質を該
患者に投与し該リガンド蛋白質の量を補充したり、
（イ）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを該
患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）
対象となる細胞に本発明のリガンド蛋白質をコードする
ＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植
することなどによって、患者の体内における本発明のリ
ガンド蛋白質の量を増加させ、それに対するレセプター
の作用を充分に発揮させることができる。したがって、
本発明のリガンド蛋白質および本発明のリガンド蛋白質
をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な本発明のリガン
ド蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および／また
は治療剤などの医薬として有用である。本発明のリガン
ド蛋白質よび本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮ
Ａは、癌転移抑制活性を有するため、あらゆる癌（例え
ば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸
癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防また
は治療薬に有用である。また、レセプター蛋白質に対す
るアゴニストは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛
癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代
謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療
薬に有用である。本発明のリガンド蛋白質を上記予防・
治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化
することができる。一方、本発明のリガンド蛋白質をコ
ードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合
がある）を上記予防・治療剤として使用する場合は、本
発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、
アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテ
ッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した
後、常套手段に従って実施することができる。本発明の
ＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助
剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよう
なカテーテルによって投与できる。例えば、本発明の
リガンド蛋白質または該リガンド蛋白質をコードする
ＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、本発明のリガンド
蛋白質または該リガンド蛋白質をコードするＤＮＡを
生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベ
ヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認
められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和する
ことによって製造することができる。これら製剤におけ
る有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られる
ようにするものである。
に関連する疾患の予防および／または治療剤 本発明のリガンド蛋白質または該リガンド蛋白質をコー
ドするＤＮＡを、本発明のリガンド蛋白質の機能不全に
関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬と
して使用することができる。例えば、生体内において本
発明のリガンド蛋白質が減少しているためにレセプター
の生理作用が期待できない（該リガンド蛋白質の欠乏
症）患者がいる場合に、本発明のリガンド蛋白質を該
患者に投与し該リガンド蛋白質の量を補充したり、
（イ）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを該
患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）
対象となる細胞に本発明のリガンド蛋白質をコードする
ＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植
することなどによって、患者の体内における本発明のリ
ガンド蛋白質の量を増加させ、それに対するレセプター
の作用を充分に発揮させることができる。したがって、
本発明のリガンド蛋白質および本発明のリガンド蛋白質
をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な本発明のリガン
ド蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および／また
は治療剤などの医薬として有用である。本発明のリガン
ド蛋白質よび本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮ
Ａは、癌転移抑制活性を有するため、あらゆる癌（例え
ば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸
癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防また
は治療薬に有用である。また、レセプター蛋白質に対す
るアゴニストは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛
癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代
謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療
薬に有用である。本発明のリガンド蛋白質を上記予防・
治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化
することができる。一方、本発明のリガンド蛋白質をコ
ードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合
がある）を上記予防・治療剤として使用する場合は、本
発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、
アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテ
ッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した
後、常套手段に従って実施することができる。本発明の
ＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助
剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよう
なカテーテルによって投与できる。例えば、本発明の
リガンド蛋白質または該リガンド蛋白質をコードする
ＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、本発明のリガンド
蛋白質または該リガンド蛋白質をコードするＤＮＡを
生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベ
ヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認
められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和する
ことによって製造することができる。これら製剤におけ
る有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られる
ようにするものである。
【００４５】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。
【００４６】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例
えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。本発明のリガンド蛋白質の投与量は、投与対象、対
象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口
投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、
その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日に
つき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜
２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与すること
ができる。本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡ
の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法など
により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例え
ば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき
約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０
ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経
口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対
象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例
えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。本発明のリガンド蛋白質の投与量は、投与対象、対
象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口
投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、
その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日に
つき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜
２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与すること
ができる。本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡ
の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法など
により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例え
ば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき
約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０
ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経
口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対
象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。
【００４７】（２）遺伝子診断剤 本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡまたはレセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡは、プローブとして使
用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）における本発明のリガンド蛋白質をコー
ドするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検
出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡま
たはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断
剤として有用である。本発明のリガンド蛋白質をコード
するＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体
公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳ
ＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜
８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Acad
emy of Sciences of the United States of Americ
a），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９
年））などにより実施することができる。
プター蛋白質をコードするＤＮＡは、プローブとして使
用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）における本発明のリガンド蛋白質をコー
ドするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検
出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡま
たはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断
剤として有用である。本発明のリガンド蛋白質をコード
するＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体
公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳ
ＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜
８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Acad
emy of Sciences of the United States of Americ
a），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９
年））などにより実施することができる。
【００４８】（３）本発明のリガンド蛋白質に対するレ
セプターの定量法 レセプター蛋白質は、本発明のリガンド蛋白質に対して
結合性を有しているので、生体内におけるレセプター濃
度を感度良く定量することができる。本発明の定量法
は、例えば、競合法と組み合わせることによって用いる
ことができる。すなわち、被検体を本発明のリガンド蛋
白質と接触させることによって被検体中のレセプター濃
度を測定することができる。具体的には、例えば、以下
のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる方
法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）
セプターの定量法 レセプター蛋白質は、本発明のリガンド蛋白質に対して
結合性を有しているので、生体内におけるレセプター濃
度を感度良く定量することができる。本発明の定量法
は、例えば、競合法と組み合わせることによって用いる
ことができる。すなわち、被検体を本発明のリガンド蛋
白質と接触させることによって被検体中のレセプター濃
度を測定することができる。具体的には、例えば、以下
のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる方
法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）
【００４９】（４）本発明のリガンド蛋白質またはその
塩とレセプターとの結合性を変化させる化合物（アゴニ
スト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法 本発明のリガンド蛋白質に対するレセプター蛋白質また
はその塩を用いるか、または組換え型レセプター蛋白質
の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合ア
ッセイ系を用いることによって、本発明のリガンド蛋白
質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物
（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくス
クリーニングすることができる。ここで使用するレセプ
ターとしては、性質等が十分に知られているもの、例え
ばＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、特にヒト、マウス
またはラットのＯＴ７Ｔ１７５等が好ましい。このよう
な化合物には、（イ）例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ーを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、
アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡ
ＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑
制する活性など）を有する化合物（いわゆる、レセプタ
ー蛋白質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性
を有しない化合物（いわゆる、レセプター蛋白質に対す
るアンタゴニスト）、あるいは（ハ）本発明のリガンド
蛋白質とレセプター蛋白質との結合力を減少させる化合
物などが含まれる。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明
のリガンド蛋白質と本発明のレセプター蛋白質とを接触
させた場合と（ii）本発明のリガンド蛋白質および試験
化合物とレセプター蛋白質とを接触させた場合との比較
を行なうことを特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレ
セプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリ
ーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合におけ
る、例えば、本発明のリガンド蛋白質に対するレセプタ
ーの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較するこ
とを特徴とする。
塩とレセプターとの結合性を変化させる化合物（アゴニ
スト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法 本発明のリガンド蛋白質に対するレセプター蛋白質また
はその塩を用いるか、または組換え型レセプター蛋白質
の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合ア
ッセイ系を用いることによって、本発明のリガンド蛋白
質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物
（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくス
クリーニングすることができる。ここで使用するレセプ
ターとしては、性質等が十分に知られているもの、例え
ばＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、特にヒト、マウス
またはラットのＯＴ７Ｔ１７５等が好ましい。このよう
な化合物には、（イ）例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ーを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、
アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡ
ＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑
制する活性など）を有する化合物（いわゆる、レセプタ
ー蛋白質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性
を有しない化合物（いわゆる、レセプター蛋白質に対す
るアンタゴニスト）、あるいは（ハ）本発明のリガンド
蛋白質とレセプター蛋白質との結合力を減少させる化合
物などが含まれる。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明
のリガンド蛋白質と本発明のレセプター蛋白質とを接触
させた場合と（ii）本発明のリガンド蛋白質および試験
化合物とレセプター蛋白質とを接触させた場合との比較
を行なうことを特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレ
セプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリ
ーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合におけ
る、例えば、本発明のリガンド蛋白質に対するレセプタ
ーの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較するこ
とを特徴とする。
【００５０】より具体的には、本発明は、 標識した本発明のリガンド蛋白質を、レセプター蛋白
質に接触させた場合と、標識した本発明のリガンド蛋白
質および試験化合物をレセプター蛋白質に接触させた場
合における、標識した本発明のリガンド蛋白質の該レセ
プター蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを
特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質
との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー
ニング方法（この場合、リガンドではなくレセプターを
標識してもよい）、 標識した本発明のリガンド蛋白質を、レセプター蛋白
質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場
合と、標識した本発明のリガンド蛋白質および試験化合
物をレセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜
画分に接触させた場合における、標識した本発明のリガ
ンド蛋白質の該細胞または該膜画分に対する結合量を測
定し、比較することを特徴とする本発明のリガンド蛋白
質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法、 標識した本発明のリガンド蛋白質を、本発明のＤＮＡ
を含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上
に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合と、標識
した本発明のリガンド蛋白質および試験化合物を本発明
のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合
における、標識した本発明のリガンド蛋白質の該レセプ
ター蛋白質等に対する結合量を測定し、比較することを
特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質
との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー
ニング方法、
質に接触させた場合と、標識した本発明のリガンド蛋白
質および試験化合物をレセプター蛋白質に接触させた場
合における、標識した本発明のリガンド蛋白質の該レセ
プター蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを
特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質
との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー
ニング方法（この場合、リガンドではなくレセプターを
標識してもよい）、 標識した本発明のリガンド蛋白質を、レセプター蛋白
質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場
合と、標識した本発明のリガンド蛋白質および試験化合
物をレセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜
画分に接触させた場合における、標識した本発明のリガ
ンド蛋白質の該細胞または該膜画分に対する結合量を測
定し、比較することを特徴とする本発明のリガンド蛋白
質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法、 標識した本発明のリガンド蛋白質を、本発明のＤＮＡ
を含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上
に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合と、標識
した本発明のリガンド蛋白質および試験化合物を本発明
のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合
における、標識した本発明のリガンド蛋白質の該レセプ
ター蛋白質等に対する結合量を測定し、比較することを
特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質
との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー
ニング方法、
【００５１】本発明のリガンド蛋白質をレセプター蛋
白質を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のリガ
ンド蛋白質をおよび試験化合物をレセプター蛋白質を含
有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介
した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチ
ルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する
活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明
のリガンド蛋白質と本発明のレセプター蛋白質との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、および 本発明のリガンド蛋白質をレセプターＤＮＡを含有す
る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し
たレセプター蛋白質に接触させた場合と、本発明のリガ
ンド蛋白質および試験化合物をレセプターＤＮＡを含有
する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現
したレセプター蛋白質に接触させた場合における、レセ
プターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内
ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン
酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ
−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性また
は抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴と
する本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結
合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング
方法などを提供する。
白質を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のリガ
ンド蛋白質をおよび試験化合物をレセプター蛋白質を含
有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介
した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチ
ルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する
活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明
のリガンド蛋白質と本発明のレセプター蛋白質との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、および 本発明のリガンド蛋白質をレセプターＤＮＡを含有す
る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し
たレセプター蛋白質に接触させた場合と、本発明のリガ
ンド蛋白質および試験化合物をレセプターＤＮＡを含有
する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現
したレセプター蛋白質に接触させた場合における、レセ
プターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内
ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン
酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ
−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性また
は抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴と
する本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結
合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング
方法などを提供する。
【００５２】上記〜いずれかの方法を用いることに
よって、リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質と
の結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングする
ことができる。さらに、スクリーニングされた化合物が
アゴニストかアンタゴニストかを簡便に評価することが
できる。本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を
以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に用い
るレセプター蛋白質としては、前記したレセプター蛋白
質を含有するものであれば何れのものであってもよい
が、レセプター蛋白質を含有する哺乳動物の臓器の細胞
膜画分が好適である。しかし、スクリーニングに用いる
大量のレセプター蛋白質を得るには、組換え体を用いて
大量発現させたレセプター蛋白質などが適している。
よって、リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質と
の結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングする
ことができる。さらに、スクリーニングされた化合物が
アゴニストかアンタゴニストかを簡便に評価することが
できる。本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を
以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に用い
るレセプター蛋白質としては、前記したレセプター蛋白
質を含有するものであれば何れのものであってもよい
が、レセプター蛋白質を含有する哺乳動物の臓器の細胞
膜画分が好適である。しかし、スクリーニングに用いる
大量のレセプター蛋白質を得るには、組換え体を用いて
大量発現させたレセプター蛋白質などが適している。
【００５３】レセプター蛋白質を製造するには、前述の
方法が用いられるが、そのＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞
で発現することにより行なうことが好ましい。目的とす
る蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが
用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではな
い。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細
胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該
ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属す
る核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；
ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来の
プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロ
チオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモー
ター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロ
モーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現した
レセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行う
ことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Bio
l. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方
法に従って行なうことができる。したがって、本発明の
スクリーニング方法において、レセプター蛋白質を含有
するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製し
たレセプター蛋白質であってもよいし、該レセプター蛋
白質を含有する細胞を用いてもよく、また該レセプター
蛋白質を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
方法が用いられるが、そのＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞
で発現することにより行なうことが好ましい。目的とす
る蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが
用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではな
い。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細
胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該
ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属す
る核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；
ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来の
プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロ
チオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモー
ター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロ
モーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現した
レセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行う
ことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Bio
l. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方
法に従って行なうことができる。したがって、本発明の
スクリーニング方法において、レセプター蛋白質を含有
するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製し
たレセプター蛋白質であってもよいし、該レセプター蛋
白質を含有する細胞を用いてもよく、また該レセプター
蛋白質を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００５４】本発明のスクリーニング方法において、レ
セプター蛋白質を含有する細胞を用いる場合、該細胞を
グルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよ
い。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうこ
とができる。レセプター蛋白質を含有する細胞として
は、該レセプター蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、
該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細
胞、動物細胞などが好ましい。細胞膜画分としては、細
胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜
が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法とし
ては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し
潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinema
tica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプ
レスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させ
ることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画に
は、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力
による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕
液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間
（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速
（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分
〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画
分中には、発現したレセプター蛋白質と細胞由来のリン
脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該レセプ
ター蛋白質を含有する細胞や膜画分中のレセプター蛋白
質の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが
好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。
なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活
性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の
構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試
料を測定できるようになる。
セプター蛋白質を含有する細胞を用いる場合、該細胞を
グルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよ
い。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうこ
とができる。レセプター蛋白質を含有する細胞として
は、該レセプター蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、
該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細
胞、動物細胞などが好ましい。細胞膜画分としては、細
胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜
が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法とし
ては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し
潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinema
tica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプ
レスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させ
ることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画に
は、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力
による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕
液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間
（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速
（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分
〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画
分中には、発現したレセプター蛋白質と細胞由来のリン
脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該レセプ
ター蛋白質を含有する細胞や膜画分中のレセプター蛋白
質の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが
好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。
なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活
性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の
構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試
料を測定できるようになる。
【００５５】本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白
質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする
前記の〜を実施するためには、例えば、適当なレセ
プター蛋白質画分と、標識したリガンドが必要である。
レセプター蛋白質画分としては、天然型のレセプター蛋
白質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型
レセプター蛋白質画分などが望ましい。ここで、同等の
活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達
作用などを示す。標識したリガンドとしては、標識した
リガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用い
られる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、
〔３５Ｓ〕などで標識されたリガンド（本発明のリガン
ド蛋白質）などが用いられる。具体的には、本発明のリ
ガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させ
る化合物のスクリーニングを行なうには、まずレセプタ
ー蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリ
ーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセ
プター蛋白質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４
〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、
トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプター蛋
白質との結合を阻害しないバッファーであればいずれで
もよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨ
ＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、
ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッ
ファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼに
よるレセプターや本発明のリガンド蛋白質の分解を抑え
る目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド
研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を
添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レ
セプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５００００
０ｃｐｍ）の標識した本発明のリガンド蛋白質を添加
し、同時に１０ −４Ｍ〜１０−１０Ｍの試験化合物を共
存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過
剰の未標識の本発明のリガンド蛋白質を加えた反応チュ
ーブも用意する。反応は約０℃から５０℃、望ましくは
約４℃から３７℃で、約２０分から２４時間、望ましく
は約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等
で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊
維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウ
ンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質
がない場合のカウント(Ｂ０）から非特異的結合量（Ｎ
ＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％と
した時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０
％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質
として選択することができる。
質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする
前記の〜を実施するためには、例えば、適当なレセ
プター蛋白質画分と、標識したリガンドが必要である。
レセプター蛋白質画分としては、天然型のレセプター蛋
白質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型
レセプター蛋白質画分などが望ましい。ここで、同等の
活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達
作用などを示す。標識したリガンドとしては、標識した
リガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用い
られる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、
〔３５Ｓ〕などで標識されたリガンド（本発明のリガン
ド蛋白質）などが用いられる。具体的には、本発明のリ
ガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させ
る化合物のスクリーニングを行なうには、まずレセプタ
ー蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリ
ーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセ
プター蛋白質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４
〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、
トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプター蛋
白質との結合を阻害しないバッファーであればいずれで
もよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨ
ＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、
ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッ
ファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼに
よるレセプターや本発明のリガンド蛋白質の分解を抑え
る目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド
研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を
添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レ
セプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５００００
０ｃｐｍ）の標識した本発明のリガンド蛋白質を添加
し、同時に１０ −４Ｍ〜１０−１０Ｍの試験化合物を共
存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過
剰の未標識の本発明のリガンド蛋白質を加えた反応チュ
ーブも用意する。反応は約０℃から５０℃、望ましくは
約４℃から３７℃で、約２０分から２４時間、望ましく
は約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等
で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊
維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウ
ンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質
がない場合のカウント(Ｂ０）から非特異的結合量（Ｎ
ＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％と
した時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０
％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質
として選択することができる。
【００５６】本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白
質との結合性を変化させる化合物スクリーニングする前
記の〜の方法を実施するためには、例えば、レセプ
ター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊離、細胞内
ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン
酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ
−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性また
は抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用
キットを用いて測定することができる。具体的には、ま
ず、レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプ
レート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっ
ては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない
適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して
一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上
清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従っ
て定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、
アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素
によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤
を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ
産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで
細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産
生抑制作用として検出することができる。細胞刺激活性
を測定してスクリーニングを行なうには、適当なレセプ
ター蛋白質を発現した細胞が必要である。レセプター蛋
白質を発現した細胞としては、天然型のレセプター蛋白
質を有する細胞株、前述の組換え型レセプター蛋白質を
発現した細胞株などが望ましい。試験化合物としては、
例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物
組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合
物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
質との結合性を変化させる化合物スクリーニングする前
記の〜の方法を実施するためには、例えば、レセプ
ター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊離、細胞内
ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン
酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ
−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性また
は抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用
キットを用いて測定することができる。具体的には、ま
ず、レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプ
レート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっ
ては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない
適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して
一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上
清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従っ
て定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、
アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素
によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤
を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ
産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで
細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産
生抑制作用として検出することができる。細胞刺激活性
を測定してスクリーニングを行なうには、適当なレセプ
ター蛋白質を発現した細胞が必要である。レセプター蛋
白質を発現した細胞としては、天然型のレセプター蛋白
質を有する細胞株、前述の組換え型レセプター蛋白質を
発現した細胞株などが望ましい。試験化合物としては、
例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物
組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合
物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００５７】本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白
質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング用キットは、レセプター蛋白質、レセプター蛋
白質を含有する細胞、またはレセプター蛋白質を含有す
る細胞の膜画分を含有するものなどである。本発明のス
クリーニング用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇ蛋白質共役型レセプター標品 レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プ
レートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ
２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 標識リガンド 市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、
〔３５Ｓ〕などで標識した本発明のリガンド蛋白質水溶
液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用
時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。 リガンド標準液 本発明のリガンド蛋白質を０.１％ウシ血清アルブミン
（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解
し、−２０℃で保存する。
質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング用キットは、レセプター蛋白質、レセプター蛋
白質を含有する細胞、またはレセプター蛋白質を含有す
る細胞の膜画分を含有するものなどである。本発明のス
クリーニング用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇ蛋白質共役型レセプター標品 レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プ
レートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ
２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 標識リガンド 市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、
〔３５Ｓ〕などで標識した本発明のリガンド蛋白質水溶
液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用
時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。 リガンド標準液 本発明のリガンド蛋白質を０.１％ウシ血清アルブミン
（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解
し、−２０℃で保存する。
【００５８】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したレセプター蛋
白質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄
した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。 １０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加
えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反
応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の
代わりに１０−３Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
白質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄
した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。 １０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加
えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反
応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の
代わりに１０−３Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
【００５９】〔数１〕 ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１０
０ ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ０ ：最大結合量
０ ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ０ ：最大結合量
【００６０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその
塩は、本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との
結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的
には、（イ）Ｇ蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下などを促進する活性または抑制する活性など）
を有する化合物（いわゆる、レセプター蛋白質に対する
アゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物
（いわゆる、レセプター蛋白質に対するアンタゴニス
ト）、あるいは（ハ）本発明のリガンド蛋白質とレセプ
ター蛋白質との結合力を減少させる化合物である。該化
合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化
合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物で
あってもよい。レセプター蛋白質に対するアゴニスト
は、レセプター蛋白質に対する本発明のリガンド蛋白質
が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該リ
ガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用であ
る。具体的には、レセプター蛋白質に対するアゴニスト
は癌転移抑制活性を有するため、あらゆる癌（例えば、
肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前
立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防または治療
薬に有用である。また、レセプター蛋白質に対するアゴ
ニストは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞
状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異
常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬に
有用である。レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト
は、レセプター蛋白質に対する本発明のリガンド蛋白質
が有する生理活性を抑制することができるので、該リガ
ンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用であ
る。本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結
合力を減少させる化合物は、レセプター蛋白質に対する
本発明のリガンド蛋白質が有する生理活性を減少させる
ための安全で低毒性な医薬として有用である。
ーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその
塩は、本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との
結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的
には、（イ）Ｇ蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下などを促進する活性または抑制する活性など）
を有する化合物（いわゆる、レセプター蛋白質に対する
アゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物
（いわゆる、レセプター蛋白質に対するアンタゴニス
ト）、あるいは（ハ）本発明のリガンド蛋白質とレセプ
ター蛋白質との結合力を減少させる化合物である。該化
合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化
合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物で
あってもよい。レセプター蛋白質に対するアゴニスト
は、レセプター蛋白質に対する本発明のリガンド蛋白質
が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該リ
ガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用であ
る。具体的には、レセプター蛋白質に対するアゴニスト
は癌転移抑制活性を有するため、あらゆる癌（例えば、
肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前
立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防または治療
薬に有用である。また、レセプター蛋白質に対するアゴ
ニストは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞
状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異
常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬に
有用である。レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト
は、レセプター蛋白質に対する本発明のリガンド蛋白質
が有する生理活性を抑制することができるので、該リガ
ンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用であ
る。本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結
合力を減少させる化合物は、レセプター蛋白質に対する
本発明のリガンド蛋白質が有する生理活性を減少させる
ための安全で低毒性な医薬として有用である。
【００６１】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその
塩を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に
従って実施することができる。例えば、前記した本発明
のＤＮＡを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、
懸濁液剤などとすることができる。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺
乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩（アゴニストの場
合）の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例
えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につ
き約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口
的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。
ーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその
塩を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に
従って実施することができる。例えば、前記した本発明
のＤＮＡを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、
懸濁液剤などとすることができる。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺
乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩（アゴニストの場
合）の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例
えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につ
き約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口
的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。
【００６２】（５）本発明のリガンド蛋白質とレセプタ
ーとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタ
ゴニスト）を含有する各種疾病の予防および／または治
療剤 本発明のリガンド蛋白質は前述のとおり、癌転移抑制活
性を有するため、あらゆる癌（例えば、肺癌、胃癌、肝
癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣
癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防または治療薬に有用であ
る。また、レセプター蛋白質に対するアゴニストは、胎
盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入
奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異
常または分娩誘発の予防または治療薬に有用である。従
って、本発明のリガンド蛋白質とレセプターとの結合性
を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）
は、本発明のリガンド蛋白質の機能不全または不足もし
くは過剰に関連する疾患の予防および／または治療剤と
して用いることができる。該化合物を本発明のリガンド
蛋白質の機能不全または不足もしくは過剰に関連する疾
患の予防および／または治療剤として使用する場合は、
常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該
化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的
に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、
防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた
製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによ
って製造することができる。これら製剤における有効成
分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにす
るものである。
ーとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタ
ゴニスト）を含有する各種疾病の予防および／または治
療剤 本発明のリガンド蛋白質は前述のとおり、癌転移抑制活
性を有するため、あらゆる癌（例えば、肺癌、胃癌、肝
癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣
癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防または治療薬に有用であ
る。また、レセプター蛋白質に対するアゴニストは、胎
盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入
奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異
常または分娩誘発の予防または治療薬に有用である。従
って、本発明のリガンド蛋白質とレセプターとの結合性
を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）
は、本発明のリガンド蛋白質の機能不全または不足もし
くは過剰に関連する疾患の予防および／または治療剤と
して用いることができる。該化合物を本発明のリガンド
蛋白質の機能不全または不足もしくは過剰に関連する疾
患の予防および／または治療剤として使用する場合は、
常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該
化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的
に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、
防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた
製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによ
って製造することができる。これら製剤における有効成
分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにす
るものである。
【００６３】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。
【００６４】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例
えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）
においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好まし
くは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２
０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投
与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっ
ても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌
患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．
０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例
えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）
においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好まし
くは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２
０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投
与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっ
ても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌
患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．
０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６５】（６）本発明のリガンド蛋白質の定量 本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体
は、本発明のリガンド蛋白質またはレセプターを特異的
に認識することができるので、被検液中の本発明のリガ
ンド蛋白質またはレセプターの定量、特にサンドイッチ
免疫測定法による定量などに使用することができる。す
なわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明のリガンド蛋
白質またはレセプターに対する抗体と、被検液および標
識化リガンド蛋白質またはレセプターとを競合的に反応
させ、該抗体に結合した標識化リガンド蛋白質またはレ
セプターの割合を測定することを特徴とする被検液中の
本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの定量法、
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明のリガンド蛋
白質またはレセプターに対する抗体および標識化された
本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体
とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体
上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中
の本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの定量法を
提供する。上記（ii）においては、一方の抗体が本発明
のリガンド蛋白質またはレセプターのＮ端部を認識する
抗体で、他方の抗体が本発明のリガンド蛋白質またはレ
セプターＣ端部に反応する抗体であることが好ましい。
は、本発明のリガンド蛋白質またはレセプターを特異的
に認識することができるので、被検液中の本発明のリガ
ンド蛋白質またはレセプターの定量、特にサンドイッチ
免疫測定法による定量などに使用することができる。す
なわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明のリガンド蛋
白質またはレセプターに対する抗体と、被検液および標
識化リガンド蛋白質またはレセプターとを競合的に反応
させ、該抗体に結合した標識化リガンド蛋白質またはレ
セプターの割合を測定することを特徴とする被検液中の
本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの定量法、
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明のリガンド蛋
白質またはレセプターに対する抗体および標識化された
本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体
とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体
上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中
の本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの定量法を
提供する。上記（ii）においては、一方の抗体が本発明
のリガンド蛋白質またはレセプターのＮ端部を認識する
抗体で、他方の抗体が本発明のリガンド蛋白質またはレ
セプターＣ端部に反応する抗体であることが好ましい。
【００６６】本発明のリガンド蛋白質またはレセプター
に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクロ
ーナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のリガ
ンド蛋白質またはレセプターの測定を行なえるほか、組
織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目
的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体
分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用
いてもよい。本発明のリガンド蛋白質またはレセプター
に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきも
のではなく、被測定液中の抗原量（例えば、リガンド蛋
白質量またはレセプター）に対応した抗体、抗原もしく
は抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段によ
り検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作
製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの
測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合
法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に
用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイ
ッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測
定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位
元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放
射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔
１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。
上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好まし
く、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リ
ンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質として
は、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチ
オシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例
えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、
ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗
原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いるこ
ともできる。
に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクロ
ーナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のリガ
ンド蛋白質またはレセプターの測定を行なえるほか、組
織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目
的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体
分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用
いてもよい。本発明のリガンド蛋白質またはレセプター
に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきも
のではなく、被測定液中の抗原量（例えば、リガンド蛋
白質量またはレセプター）に対応した抗体、抗原もしく
は抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段によ
り検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作
製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの
測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合
法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に
用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイ
ッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測
定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位
元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放
射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔
１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。
上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好まし
く、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リ
ンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質として
は、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチ
オシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例
えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、
ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗
原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いるこ
ともできる。
【００６７】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるいは酵素
等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用い
る方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、
デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリス
チレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、
あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法におい
ては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を
反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のリガンド蛋白質量またはレセプターを定量する
ことができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっ
ても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行
なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそ
れらに準じることができる。また、サンドイッチ法によ
る免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体
に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、
測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混
合物を用いてもよい。本発明のサンドイッチ法によるリ
ガンド蛋白質またはレセプターの測定法においては、１
次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル
抗体はリガンド蛋白質の結合する部位が相異なる抗体が
好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に
用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体
が、リガンド蛋白質のＣ端部を認識する場合、１次反応
で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ
端部を認識する抗体が用いられる。
理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるいは酵素
等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用い
る方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、
デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリス
チレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、
あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法におい
ては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を
反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のリガンド蛋白質量またはレセプターを定量する
ことができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっ
ても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行
なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそ
れらに準じることができる。また、サンドイッチ法によ
る免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体
に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、
測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混
合物を用いてもよい。本発明のサンドイッチ法によるリ
ガンド蛋白質またはレセプターの測定法においては、１
次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル
抗体はリガンド蛋白質の結合する部位が相異なる抗体が
好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に
用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体
が、リガンド蛋白質のＣ端部を認識する場合、１次反応
で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ
端部を認識する抗体が用いられる。
【００６８】本発明のリガンド蛋白質またはレセプター
に対するモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測
定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法ある
いはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法
では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合
的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗体
と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、
Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を
定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用
い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に
対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体
として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可
溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固
相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、被検
液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対し
て競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるい
は、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応さ
せ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に
結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれ
かの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗
原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定す
る。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか
得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザー
ネフロメトリーなどが好適に用いられる。
に対するモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測
定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法ある
いはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法
では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合
的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗体
と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、
Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を
定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用
い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に
対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体
として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可
溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固
相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、被検
液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対し
て競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるい
は、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応さ
せ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に
結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれ
かの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗
原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定す
る。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか
得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザー
ネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００６９】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のリガンド蛋白質またはレセプターの測定系を構築す
ればよい。これらの一般的な技術手段の詳細について
は、総説、成書などを参照することができる〔例えば、
入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４
９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕
（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫
測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年
発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）
（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エ
ンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Imm
unochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Imm
unochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Imm
unochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Imm
unochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassay
s))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodiesand General Immunoassay Met
hods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(P
art I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodi
es))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。以
上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発
明のリガンド蛋白質またはレセプターを感度良く定量す
ることができる。さらに、本発明の抗体を用いて、生体
内での本発明のリガンド蛋白質またはレセプターを定量
することによって、本発明のリガンド蛋白質の機能不全
に関連する各種疾患の診断をすることができる。また、
本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体
は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のリガ
ンド蛋白質またはレセプターを特異的に検出するために
使用することができる。また、本発明のリガンド蛋白質
またはレセプターを精製するために使用する抗体カラム
の作製、精製時の各分画中の本発明のリガンド蛋白質の
検出、被検細胞内における本発明のリガンド蛋白質また
はレセプターの挙動の分析などのために使用することが
できる。
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のリガンド蛋白質またはレセプターの測定系を構築す
ればよい。これらの一般的な技術手段の詳細について
は、総説、成書などを参照することができる〔例えば、
入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４
９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕
（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫
測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年
発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）
（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エ
ンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Imm
unochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Imm
unochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Imm
unochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Imm
unochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassay
s))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodiesand General Immunoassay Met
hods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(P
art I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodi
es))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。以
上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発
明のリガンド蛋白質またはレセプターを感度良く定量す
ることができる。さらに、本発明の抗体を用いて、生体
内での本発明のリガンド蛋白質またはレセプターを定量
することによって、本発明のリガンド蛋白質の機能不全
に関連する各種疾患の診断をすることができる。また、
本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体
は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のリガ
ンド蛋白質またはレセプターを特異的に検出するために
使用することができる。また、本発明のリガンド蛋白質
またはレセプターを精製するために使用する抗体カラム
の作製、精製時の各分画中の本発明のリガンド蛋白質の
検出、被検細胞内における本発明のリガンド蛋白質また
はレセプターの挙動の分析などのために使用することが
できる。
【００７０】（７）本発明のリガンド蛋白質に対する抗
体による中和 本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体
の、それらリガンド蛋白質または該レセプターに対する
中和活性とは、即ち、該リガンド蛋白質または該レセプ
ターの関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を
意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、
該リガンド蛋白質または該レセプターの関与するシグナ
ル伝達、例えば、該リガンド蛋白質を介する細胞刺激活
性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、
細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧ
ＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、
細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの
低下などを促進する活性または抑制する活性など）を不
活性化することができる。従って、該リガンド蛋白質ま
たは該レセプターの過剰発現などに起因する疾患の予防
および／または治療に用いることができる。 （８）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを有
する動物の作製 本発明のＤＮＡを用いて、本発明のリガンド蛋白質を発
現するトランスジェニック動物を作製することができ
る。動物としては、哺乳動物（例えば、ラット、マウ
ス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど）などが挙げられるが、特に、マウス、ウサギなどが
好適である。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるに
あたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモ
ーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用
いるのが一般に有利である。例えば、マウス由来の本発
明のＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い動物
由来の本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プ
ロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、
例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションする
ことによって本発明のレセプター蛋白質を高産生するＤ
ＮＡ転移動物を作出できる。このプロモーターとして
は、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネ
イン等のユビキアスな発現プロモーターも使用しうる
が、好ましくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子プロ
モーターやエノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いら
れる。
体による中和 本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体
の、それらリガンド蛋白質または該レセプターに対する
中和活性とは、即ち、該リガンド蛋白質または該レセプ
ターの関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を
意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、
該リガンド蛋白質または該レセプターの関与するシグナ
ル伝達、例えば、該リガンド蛋白質を介する細胞刺激活
性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、
細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧ
ＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、
細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの
低下などを促進する活性または抑制する活性など）を不
活性化することができる。従って、該リガンド蛋白質ま
たは該レセプターの過剰発現などに起因する疾患の予防
および／または治療に用いることができる。 （８）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを有
する動物の作製 本発明のＤＮＡを用いて、本発明のリガンド蛋白質を発
現するトランスジェニック動物を作製することができ
る。動物としては、哺乳動物（例えば、ラット、マウ
ス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど）などが挙げられるが、特に、マウス、ウサギなどが
好適である。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるに
あたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモ
ーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用
いるのが一般に有利である。例えば、マウス由来の本発
明のＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い動物
由来の本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プ
ロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、
例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションする
ことによって本発明のレセプター蛋白質を高産生するＤ
ＮＡ転移動物を作出できる。このプロモーターとして
は、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネ
イン等のユビキアスな発現プロモーターも使用しうる
が、好ましくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子プロ
モーターやエノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いら
れる。
【００７１】受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの
転移は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽
細胞において本発明のリガンド蛋白質が存在すること
は、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全
てに本発明のリガンド蛋白質を有することを意味する。
遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞
および体細胞の全てに本発明のリガンド蛋白質を有す
る。本発明のＤＮＡ転移動物は、交配により遺伝子を安
定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として
通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。さら
に、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物を交配することに
より、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴ
ート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによ
りすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代する
ことができる。本発明のＤＮＡが転移された動物は、本
発明のリガンド蛋白質が高発現させられているので、本
発明のリガンド蛋白質に対するアゴニストまたはアンタ
ゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用であ
る。本発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養のための細胞
源として使用することもできる。例えば、本発明のＤＮ
Ａ転移マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分
析するか、あるいは遺伝子により発現された本発明のリ
ガンド蛋白質が存在する組織を分析することにより、本
発明のリガンド蛋白質について分析することができる。
本発明のリガンド蛋白質を有する組織の細胞を標準組織
培養技術により培養し、これらを使用して、例えば、脳
や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細
胞の機能を研究することができる。また、その細胞を用
いることにより、例えば、各種組織の機能を高めるよう
な医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があれ
ば、そこから、本発明のリガンド蛋白質を単離精製する
ことも可能である。
転移は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽
細胞において本発明のリガンド蛋白質が存在すること
は、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全
てに本発明のリガンド蛋白質を有することを意味する。
遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞
および体細胞の全てに本発明のリガンド蛋白質を有す
る。本発明のＤＮＡ転移動物は、交配により遺伝子を安
定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として
通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。さら
に、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物を交配することに
より、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴ
ート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによ
りすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代する
ことができる。本発明のＤＮＡが転移された動物は、本
発明のリガンド蛋白質が高発現させられているので、本
発明のリガンド蛋白質に対するアゴニストまたはアンタ
ゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用であ
る。本発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養のための細胞
源として使用することもできる。例えば、本発明のＤＮ
Ａ転移マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分
析するか、あるいは遺伝子により発現された本発明のリ
ガンド蛋白質が存在する組織を分析することにより、本
発明のリガンド蛋白質について分析することができる。
本発明のリガンド蛋白質を有する組織の細胞を標準組織
培養技術により培養し、これらを使用して、例えば、脳
や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細
胞の機能を研究することができる。また、その細胞を用
いることにより、例えば、各種組織の機能を高めるよう
な医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があれ
ば、そこから、本発明のリガンド蛋白質を単離精製する
ことも可能である。
【００７２】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００７３】 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【００７４】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl２Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＢＨＡ ：ベンツヒドリルアミン ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル ＯｃＨｅｘ ：シクロヘキシルエステル ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl２Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＢＨＡ ：ベンツヒドリルアミン ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル ＯｃＨｅｘ ：シクロヘキシルエステル ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
【００７５】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（マウス型１）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（マウス型２）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３〕本発明のラット由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（ラット型）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（マウス型１）をコードするｃＤＮＡの塩基配
列を示す。 〔配列番号：５〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（マウス型２）をコードするｃＤＮＡの塩基配
列を示す。 〔配列番号：６〕本発明のラット由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（ラット型）をコードするｃＤＮＡの塩基配列
を示す。 〔配列番号：７〕ヒト由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質ｈＯＴ７Ｔ１７５のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：８〕ラット由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質ｒＯＴ７Ｔ１７５のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：９〕本発明のマウス由来KiSS-1をクローニ
ングするために使用したプローブＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０〕本発明のマウス由来KiSS-1をクロー
ニングするために使用したプライマーＢの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１１〕本発明のマウス由来KiSS-1をクロー
ニングするために使用したプライマーＣの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１２〕本発明のマウス由来KiSS-1をクロー
ニングするために使用したプライマーＤの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１３〕本発明のマウス由来KiSS-1をクロー
ニングするために使用したプライマーＥの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１４〕本発明のラット型リガンド（１−５
４）［ラットKiSS-1］をコードするｃＤＮＡをクローニ
ングするために使用したデジェネレートプライマー13-3
F38の塩基配列を示す。 〔配列番号：１５〕本発明のラット型リガンド（１−５
４）［ラットKiSS-1］をコードするｃＤＮＡをクローニ
ングするために使用したデジェネレートプライマーKiSS
357Rの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６〕ラットKiSS-1の部分ペプチドをコー
ドする配列を有するＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：１７〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-41Fの塩基
配列を示す。 〔配列番号：１８〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-10Fの塩基
配列を示す。 〔配列番号：１９〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-254Rの塩基
配列を示す。 〔配列番号：２０〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-44Rの塩基
配列を示す。 〔配列番号：２１〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマーrKiSS364Fの塩
基配列を示す。 〔配列番号：２２〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマーrKiSS859Rの塩
基配列を示す。 〔配列番号：２３〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
する３９３塩基対のＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：２４〕マウス由来新規Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質ｍＯＴ７Ｔ１７５のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２５〕マウス由来新規Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質ｍＯＴ７Ｔ１７５をコードするＤＮＡの塩
基配列を示す。 〔配列番号：２６〕後述の実施例３で用いられたプライ
マー１の塩基配列を示す。 〔配列番号：２７〕後述の実施例３で用いられたプライ
マー２の塩基配列を示す。
列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（マウス型１）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（マウス型２）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３〕本発明のラット由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（ラット型）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（マウス型１）をコードするｃＤＮＡの塩基配
列を示す。 〔配列番号：５〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（マウス型２）をコードするｃＤＮＡの塩基配
列を示す。 〔配列番号：６〕本発明のラット由来新規リガンド蛋白
質KiSS-1（ラット型）をコードするｃＤＮＡの塩基配列
を示す。 〔配列番号：７〕ヒト由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質ｈＯＴ７Ｔ１７５のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：８〕ラット由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質ｒＯＴ７Ｔ１７５のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：９〕本発明のマウス由来KiSS-1をクローニ
ングするために使用したプローブＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０〕本発明のマウス由来KiSS-1をクロー
ニングするために使用したプライマーＢの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１１〕本発明のマウス由来KiSS-1をクロー
ニングするために使用したプライマーＣの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１２〕本発明のマウス由来KiSS-1をクロー
ニングするために使用したプライマーＤの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１３〕本発明のマウス由来KiSS-1をクロー
ニングするために使用したプライマーＥの塩基配列を示
す。 〔配列番号：１４〕本発明のラット型リガンド（１−５
４）［ラットKiSS-1］をコードするｃＤＮＡをクローニ
ングするために使用したデジェネレートプライマー13-3
F38の塩基配列を示す。 〔配列番号：１５〕本発明のラット型リガンド（１−５
４）［ラットKiSS-1］をコードするｃＤＮＡをクローニ
ングするために使用したデジェネレートプライマーKiSS
357Rの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６〕ラットKiSS-1の部分ペプチドをコー
ドする配列を有するＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：１７〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-41Fの塩基
配列を示す。 〔配列番号：１８〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-10Fの塩基
配列を示す。 〔配列番号：１９〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-254Rの塩基
配列を示す。 〔配列番号：２０〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-44Rの塩基
配列を示す。 〔配列番号：２１〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマーrKiSS364Fの塩
基配列を示す。 〔配列番号：２２〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を得るためのプライマーrKiSS859Rの塩
基配列を示す。 〔配列番号：２３〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコード
する３９３塩基対のＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：２４〕マウス由来新規Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質ｍＯＴ７Ｔ１７５のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２５〕マウス由来新規Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質ｍＯＴ７Ｔ１７５をコードするＤＮＡの塩
基配列を示す。 〔配列番号：２６〕後述の実施例３で用いられたプライ
マー１の塩基配列を示す。 〔配列番号：２７〕後述の実施例３で用いられたプライ
マー２の塩基配列を示す。
【００７６】後述の実施例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＣ
ＭＶ−ｍＫｉＳＳ−１は、平成１２（２０００）年１月
２４日から茨城県つくば市東１−１−３の通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００３として、平成１１（１９９
９）年１２月１６日から大阪府大阪市淀川区十三本町２
−１７−８５の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託
番号ＩＦＯ １６３４８として寄託されている。後述の
実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Es
cherichia coli)ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＫｉＳＳ
−１．４Ａは、平成１２年３月６日から通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号
ＦＥＲＭＢＰ−７０７３として、平成１２年２月１６日
から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１６３６０として寄託されている。後述の実施例２で
得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）ＴＯＰ１０／ｐＲＫＩＳＳ４は、平成１２年３月
１６日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７０９３と
して、平成１２年２月２日から財団法人・発酵研究所
（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６３６２として寄託さ
れている。後述の実施例３で得られた大腸菌（Escheric
hia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＯＴ
７Ｔ１７５は、２００１年１月１１日から茨城県つくば
市東１−１−３の経済産業省産業技術総合研究所生命工
学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７４２８として、２０００年１２月２２日から大阪
府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５の財団法人・発
酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６５２３とし
て寄託されている。
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＣ
ＭＶ−ｍＫｉＳＳ−１は、平成１２（２０００）年１月
２４日から茨城県つくば市東１−１−３の通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００３として、平成１１（１９９
９）年１２月１６日から大阪府大阪市淀川区十三本町２
−１７−８５の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託
番号ＩＦＯ １６３４８として寄託されている。後述の
実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Es
cherichia coli)ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＫｉＳＳ
−１．４Ａは、平成１２年３月６日から通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号
ＦＥＲＭＢＰ−７０７３として、平成１２年２月１６日
から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１６３６０として寄託されている。後述の実施例２で
得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）ＴＯＰ１０／ｐＲＫＩＳＳ４は、平成１２年３月
１６日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７０９３と
して、平成１２年２月２日から財団法人・発酵研究所
（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６３６２として寄託さ
れている。後述の実施例３で得られた大腸菌（Escheric
hia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＯＴ
７Ｔ１７５は、２００１年１月１１日から茨城県つくば
市東１−１−３の経済産業省産業技術総合研究所生命工
学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７４２８として、２０００年１２月２２日から大阪
府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５の財団法人・発
酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６５２３とし
て寄託されている。
【００７７】
【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載さ
れている方法に従った。
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載さ
れている方法に従った。
【００７８】実施例１ マウス型KiSS−１の取得 ｃDNAのクローニングは、GENE TRAPPER （ Life Techno
logies社 ）の処方に従って行った。プローブA（ 配列
番号：９）をビオチン化したのち、一本鎖にしたマウス
胚cDNAライブラリー（ スーパースクリプトcDNAライブ
ラリー、 Life Technologies社 ）とハイブリダイゼー
ションさせ、得られた一本鎖遺伝子を、プライマーB（
配列番号：１０）を用いて二本鎖とした。この遺伝子を
大腸菌DH10Bにエレクトロポレーションし、アンピシリ
ン耐性を指標として形質転換体を得た。エレクトロポレ
ーションは、E coli Pulser （ BIO RAD社 ）を用い、
電圧1.8kVで行った。得られた形質転換体を、プライマ
ー B（ 配列番号：１０）とプライマーC（ 配列番号：
１１）を用いたコロニーPCRによって選択、形質転換
体：大腸菌（ Escherichia coli ）DH10B / pCMV-mKiSS
-1を得た。このcDNAクローンの塩基配列よりＯＲＦ（op
en reading frame）を推定（配列番号：４）、導き出さ
れるアミノ酸配列（ 配列番号：１）を有する新規分泌
性蛋白をmKiSS-1（マウス型１）と命名した。コロニーP
CRは、Advantage2 cDNA polymerase Mix（ CLONTECH社
）1/50量、プライマーB（ 配列番号：１０）及びプラ
イマーC（ 配列番号：１１）を各0.2μM、dNTPs 200μ
M、DMSO 1/25量及び酵素に添付のバッファーを加え、10
μlの液量とした。PCR反応は、94℃・10分の後、94
℃・10秒、60℃・10秒、68℃・1分のサイクルを25回繰
り返し行った。さらに、上記の pCMV-mKiSS-１にコード
された塩基配列より、ORFの外側にプライマーD（ 配列
番号：１２）およびプライマー E（配列番号：１３）を
作製、mouse embryo Marathon Ready cDNA （ CLONTE
CH社 ）を鋳型にPCRを行った。PCRは、 Advantage2 cDN
A polymerase Mix（ CLONTECH社 ）1/50量、プライマー
D（ 配列番号：１２）及びプライマーE（ 配列番号：１
３）を各0.2μM、dNTPs 200μM、DMSO 1/25量及び酵素
に添付のバッファーを加え、25μｌの液量で、94℃・
2分の後、94℃・10秒、68℃・1分30秒 のサイクルを3
回、94℃・10秒、64℃・10秒、68℃・1分のサイクル
を3回、94℃・10秒、60℃・10秒、68℃・1分のサイク
ルを30回繰り返し、最後に68℃、8分の伸長反応を行
った。該PCR反応後の反応産物を、TOPO-TA cloning Kit
（ Invirtogen社 ）の処方に従いプラスミドベクターpC
R2.1-TOPO（ Invitrogen社 ）へサブクローニングし
た。これを大腸菌DH5αに導入し、cDNAを持つクローン
を、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々
のクローンの配列を解析したところ、上記mKiSS-1の
塩基配列（配列番号：４）と完全一致するものの他に、
上記mKiSS-1の塩基配列（配列番号：４）の途中に12
塩基の挿入、および、ORFから402番目に一塩基変異（ア
ミノ酸不変）があるもの（配列番号：５）、の2種類が
得られた。についても、12塩基の挿入は4アミノ酸に
翻訳でき、また、ヒト、ラット型KiSS-1ではともにこの
4アミノ酸に相当するアミノ酸配列が存在することか
ら、マウスには2通りのmKiSS-1が存在するとみなし、新
たに得られた塩基配列（核酸配列番号：５より推定され
るアミノ酸配列（ 配列番号：２）を有する新規分泌性
蛋白をmKiSS-1・4A（マウス型２）とした。この塩基配
列を有するクローンを大腸菌に導入して形質転換体：大
腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍ
ＫｉＳＳ−１．４Ａを得た。得られた核酸配列から推定
されたマウス型１およびマウス型２のＫｉＳＳ−１蛋白
質のアミノ酸配列（それぞれ配列番号：４および５）は
既知のヒトホモログに対して高い相同性を有していた
（図１参照）。 プローブA 5'−tat ggg gag ccg ctg gca aaa gtg−3' プライマーB 5'−tag acc tgc ccc ttc ctc cca ga−3' プライマーC 5'−ctg ctg gcc tgt gga tcc agg ctt−3' プライマーD 5'−tgc agg aga gtg aag att aaa tcc cca−3' プライマーE５’−gag gac ctg tcc cat ctc gca gga g
tc a−3'
logies社 ）の処方に従って行った。プローブA（ 配列
番号：９）をビオチン化したのち、一本鎖にしたマウス
胚cDNAライブラリー（ スーパースクリプトcDNAライブ
ラリー、 Life Technologies社 ）とハイブリダイゼー
ションさせ、得られた一本鎖遺伝子を、プライマーB（
配列番号：１０）を用いて二本鎖とした。この遺伝子を
大腸菌DH10Bにエレクトロポレーションし、アンピシリ
ン耐性を指標として形質転換体を得た。エレクトロポレ
ーションは、E coli Pulser （ BIO RAD社 ）を用い、
電圧1.8kVで行った。得られた形質転換体を、プライマ
ー B（ 配列番号：１０）とプライマーC（ 配列番号：
１１）を用いたコロニーPCRによって選択、形質転換
体：大腸菌（ Escherichia coli ）DH10B / pCMV-mKiSS
-1を得た。このcDNAクローンの塩基配列よりＯＲＦ（op
en reading frame）を推定（配列番号：４）、導き出さ
れるアミノ酸配列（ 配列番号：１）を有する新規分泌
性蛋白をmKiSS-1（マウス型１）と命名した。コロニーP
CRは、Advantage2 cDNA polymerase Mix（ CLONTECH社
）1/50量、プライマーB（ 配列番号：１０）及びプラ
イマーC（ 配列番号：１１）を各0.2μM、dNTPs 200μ
M、DMSO 1/25量及び酵素に添付のバッファーを加え、10
μlの液量とした。PCR反応は、94℃・10分の後、94
℃・10秒、60℃・10秒、68℃・1分のサイクルを25回繰
り返し行った。さらに、上記の pCMV-mKiSS-１にコード
された塩基配列より、ORFの外側にプライマーD（ 配列
番号：１２）およびプライマー E（配列番号：１３）を
作製、mouse embryo Marathon Ready cDNA （ CLONTE
CH社 ）を鋳型にPCRを行った。PCRは、 Advantage2 cDN
A polymerase Mix（ CLONTECH社 ）1/50量、プライマー
D（ 配列番号：１２）及びプライマーE（ 配列番号：１
３）を各0.2μM、dNTPs 200μM、DMSO 1/25量及び酵素
に添付のバッファーを加え、25μｌの液量で、94℃・
2分の後、94℃・10秒、68℃・1分30秒 のサイクルを3
回、94℃・10秒、64℃・10秒、68℃・1分のサイクル
を3回、94℃・10秒、60℃・10秒、68℃・1分のサイク
ルを30回繰り返し、最後に68℃、8分の伸長反応を行
った。該PCR反応後の反応産物を、TOPO-TA cloning Kit
（ Invirtogen社 ）の処方に従いプラスミドベクターpC
R2.1-TOPO（ Invitrogen社 ）へサブクローニングし
た。これを大腸菌DH5αに導入し、cDNAを持つクローン
を、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々
のクローンの配列を解析したところ、上記mKiSS-1の
塩基配列（配列番号：４）と完全一致するものの他に、
上記mKiSS-1の塩基配列（配列番号：４）の途中に12
塩基の挿入、および、ORFから402番目に一塩基変異（ア
ミノ酸不変）があるもの（配列番号：５）、の2種類が
得られた。についても、12塩基の挿入は4アミノ酸に
翻訳でき、また、ヒト、ラット型KiSS-1ではともにこの
4アミノ酸に相当するアミノ酸配列が存在することか
ら、マウスには2通りのmKiSS-1が存在するとみなし、新
たに得られた塩基配列（核酸配列番号：５より推定され
るアミノ酸配列（ 配列番号：２）を有する新規分泌性
蛋白をmKiSS-1・4A（マウス型２）とした。この塩基配
列を有するクローンを大腸菌に導入して形質転換体：大
腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍ
ＫｉＳＳ−１．４Ａを得た。得られた核酸配列から推定
されたマウス型１およびマウス型２のＫｉＳＳ−１蛋白
質のアミノ酸配列（それぞれ配列番号：４および５）は
既知のヒトホモログに対して高い相同性を有していた
（図１参照）。 プローブA 5'−tat ggg gag ccg ctg gca aaa gtg−3' プライマーB 5'−tag acc tgc ccc ttc ctc cca ga−3' プライマーC 5'−ctg ctg gcc tgt gga tcc agg ctt−3' プライマーD 5'−tgc agg aga gtg aag att aaa tcc cca−3' プライマーE５’−gag gac ctg tcc cat ctc gca gga g
tc a−3'
【００７９】実施例２ ラット型リガンド（１−５４）[ラットKiSS-1]をコード
するcDNAのクローニング ラット胎盤からTRIZOL reagent（Gibco BRL社）を用
い、添付されたマニュアルに記載された方法に従ってto
tal RNAを抽出した。次いでオリゴdTセルロースカラム
（MessageMaker reagent assembly, Gibco BRL社）を用
い、添付されたマニュアルに記載された方法に従って該
total RNAからpoly(A)+ RNAを調製した。さらに、Super
Script Preamplification System for First Strand cD
NA Synthesis(Gibco BRL社)を用い、添付されたマニュ
アルに記載された方法に従って、該Poly (A)+ RNAから
first strand cDNA を合成した。また、マウスKiSS-1配
列を基にデザインした次のデジェネレートプライマー(d
egenerate primer)を合成した。 13-3F38: 5'-TTCTTGGCAGCTRCTGCTTYTCCTCTGTG-3' （配列番号：１４） KiSS357R: 5'-GAAGCGCAGGCCGAAGGAGTTCCA-3' （配列番号：１５） 前述の first strand cDNA を鋳型として用い、13-3F38
およびKiSS357Rをプライマーとして用いてデジェネレー
トPCR（Degenerative PCR）反応を実施した。該PCR反応
における反応液は、Taq polymerase（宝酒造社）を1 μ
l、それぞれ添付の10x PCR buffer(500 mM KCl-100 mM
Tris・HCl, pH 8.3)を10 μl、25 mM MgCl2を6 μl、2.
5 mM dNTP mixtureを8 μl、25 % DMSO溶液を4 μl、プ
ライマー13-3F38およびプライマーKiSS357R（ともに20
μM）を各2 μl、および該鋳型cDNA（前述の first str
and cDNA）を2 μl、蒸留水を65 μlを混合して作製し
た。該PCRとして、１）初期変性（94℃・5分間）、２）
サイクル反応（94℃・20秒間-72℃・50秒間）３）サイク
ル反応（94℃・20秒間-71.5℃・20秒間-72℃・30秒間）
４）サイクル反応（94℃・20秒間-71℃・20秒間-72℃・30
秒間）、５）サイクル反応（94℃・20秒間-70.5℃・20秒
間-72℃・30秒間）、６）サイクル反応（94℃・20秒間-70
℃・20秒間-72℃・30秒間）、７）サイクル反応（94℃・20
秒間-69.5℃・20秒間-72℃・30秒間）、８）サイクル反応
（94℃・20秒間-69℃・20秒間-72℃・30秒間）、９）サイ
クル反応（94℃・20秒間-68.5℃・20秒間-72℃・30秒
間）、１０）サイクル反応（94℃・20秒間-68℃・20秒間-
72℃・30秒間）、１１）30回のサイクル反応（94℃・20秒
間-61.8℃・20秒間-72℃・30秒間）の後１２）最終伸長反
応（72℃・7分間）を行いPCR産物を得た。さらにPCR 産
物を1.5 %アガロースゲル電気泳動を行い、サイバーグ
リーン染色される約300 bpのバンドを含むゲル片を剃刀
で切り出した。該ゲル片より Gene Clean DNA 抽出キッ
ト（BIO 101社）を用いてPCR 産物であるDNA断片を回収
した。該DNA断片の塩基配列決定のための反応は、Dye T
erminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystem
s、パーキンエルマー社）を用いて行い、蛍光式自動シ
ークエンサー（DNA sequencer Prism 377：Applied Bio
systems、パーキンエルマー社）を用いてPCR 産物の塩
基配列を解読した。その結果、ラットKiSS-1の部分ペプ
チドをコードする配列を有するDNA断片を得ることがで
きた。以下にデジェネレートプライマー部分を含まない
288 bpの塩基配列（配列番号：１６）pCR288bpを示す。 pCR288bp： TGGCCTCTTT TGGGGAGCCA CTGGCAAAAA TGGCACCTGT GGTGAACCCT GAACCCACAG 60 GCCAACAGTC CGGACCCCAG GAACTCGTTA ATGCCTGGCA AAAGGGCCCG CGGTATGCAG 120 AGAGCAAGCC TGGGGCTGCA GGACTGCGCG CTCGCCGAAC ATCGCCATGC CCGCCGGTGG 180 AGAACCCCAC GGGGCACCAG CGGCCCCCGT GTGCCACCCG CAGTCGCCTG ATCCCTGCGC 240 CCCGCGGATC GGTGCTGGTG CAGCGCGAGA AGGACATGTC AGCCTACA 288 （配列番号：１６） 得られた配列よりプライマー 288-41F（配列番号：１
７）、288-10F（配列番号：１８）、288-254R（配列番
号：１９）、288-44R（配列番号：２０）を作成し、以
下に記した5'-RACE及び3'-RACE実験に用いた。 288-41F: 5'-GGTGAACCCTGAACCCACAGGCCAACAG-3' （配列番号：１７） 288-10F: 5'-TTGGGGAGCCACTGGCAAAAATGGCACC-3' （配列番号：１８） 288-254R: 5'-TGACATGTCCTTCTCGCGCTGCACCAGC-3' （配列番号：１９） 288-44R: 5'-GGACTGTTGGCCTGTGGGTTCAGGGTTC-3' （配列番号：２０） ラット肝臓cDNAを鋳型として5'-RACE及び3'-RACE反応を
実施した。5'-RACE及び3'-RACEのPCR反応液はTaq polym
erase(宝酒造社)を0.5 μl、添付の10x PCR buffer(500
mM KCl-25 mM MgCl2-100 mM Tris・HCl, pH 8.3)を5
μl、2.5 mM dNTP mixtureを4 μl、25 mM MgCl2 を3
μl、25 % DMSO溶液を2 μl(3'-RACEの場合)、10 μMプ
ライマー288-10F(3'-RACEの場合)あるいは10 μMプライ
マー288-254R(5'-RACEの場合)を 1 μl、10 μMプライ
マーAP1（プライマーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready
cDNA Kitに添付のもの）を1 μl、鋳型ラット肝臓cDNA
（CLONTECH社、Marathon-Ready cDNA Kit、rat liver）
を5 μl、及び蒸留水を28.5μl(3'-RACEの場合)あるい
は30.5μl(5'-RACEの場合)を混合して作製した。反応条
件は94℃・60秒の初期変性後、94℃・30秒-72℃・120秒の
サイクル反応を5回、94℃・30秒-70℃・120秒のサイクル
反応を5回、94℃・20秒-68℃・120秒のサイクル反応を25
回、および68℃・10分の最終伸長反応とした。続いて、
該PCR反応の反応液を鋳型としてnested PCRを実施し
た。反応液はTaqpolymerase(宝酒造社)を0.5 μl、添付
の10x PCR buffer(500 mM KCl-25 mM MgCl2-100 mM Tri
s・HCl, pH 8.3)を5 μl、2.5 mM dNTP mixtureを4 μ
l、25 mMMgCl2 を3 μl、25 % DMSO溶液を2 μl(3'-RAC
Eの場合)、10 μMプライマー288-41F(3'-RACEの場合)あ
るいは10 μMプライマー288-44R(5'-RACEの場合)を 1
μl、10 μMプライマーAP2（プライマーAP2はCLONTECH
社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付のもの）を1 μl、
鋳型DNA（該PCR反応液50倍希釈液）を5 μl、及び蒸留
水を28.5 μl(3'-RACEの場合)あるいは30.5μl(5'-RACE
の場合)を混合して作製した。反応条件は94℃・60秒の初
期変性後、94℃・30秒-72℃・120秒のサイクル反応を5
回、94℃・30秒-70℃・120秒のサイクル反応を5回、94℃・
20秒-68℃・120秒のサイクル反応を25回、および68℃・10
分の最終伸長反応とした。さらにnested PCR 産物から
前述の方法によりDNA断片を回収した。該DNA断片をTOPO
-TA Cloning Kit (Invitrogen社）を用いて、添付のマ
ニュアルに記載された方法に従ってプラスミドベクター
pCR2.1に連結し、大腸菌TOP10をトランスフォームさせ
た。単一コロニーより大腸菌をピックアップし、LB培地
中にて液体培養終了後、集菌してプラスミド精製キット
（QIAGEN社、QIAwell 8 Ultra plasmid purification k
it）を用いてプラスミドを精製した。該プラスミド中の
PCR産物の塩基配列を前述の方法により解読し、5'端、
3'端の配列情報を得た。この配列情報よりプライマーrK
iSS364F、rKiSS859Rを作成した。 rKiSS364F: 5'-CGTCTCAGCCTCTGGACACCCTGTGGATCTGCC-3' (配列番号 ：２１) rKiSS859R: 5'-TGGCGACAGCATTGCTTTTATTGCACAAGTCTA-3' (配列番号 ：２２) ラット肝臓cDNAを鋳型としてプライマーrKiSS364FとrKi
SS859Rを用いてPCRを実施した。PCR反応液はPfu DNA po
lymerase(Stratagene社)を1 μl、添付の10xPCR buffer
(500 mM KCl-25 mM MgCl2-100 mM Tris・HCl, pH 8.3)
を5 μl、2.5mM dNTP mixtureを4 μl、25 % DMSO溶液
を2 μl、10 μMプライマーrKiSS364F及びrKiSS859Rを
各1 μl 、鋳型ラット肝臓cDNA（CLONTECH社、Marathon
-ReadycDNA Kit、rat liver）を5 μl、及び蒸留水を31
μlを混合して作製した。反応条件は94℃・60秒の初期
変性後、94℃・20秒-72℃・120秒のサイクル反応を3回、9
4℃・20秒-70℃・120秒のサイクル反応を3回、94℃・20秒-
68℃・120秒のサイクル反応を3回、94℃・20秒-63℃・30秒
-68℃・120秒のサイクル反応を30回、および68℃・10分の
最終伸長反応とした。得られたDNA断片をpPCR-BluntII-
TOPO vector (Stratagene社)を用いて添付のマニュアル
に記載された方法に従ってクローニングした。クローニ
ングされたDNA配列を前述の方法により解読し、ラットK
iSS-1全長ペプチドをコードする393 bpのDNA断片(配列
番号２５)を有するpRKISS4を得ることができた。該プラ
スミドによりトランスフォームさせた大腸菌TOP10を、T
OP10/pRKISS4と命名した。得られた核酸配列から推定さ
れたラット型ＫｉＳＳ−１蛋白質のアミノ酸配列（配列
番号：６）は既知のヒトホモログに対して高い相同性を
有していた（図１参照）。 pRKISS4(393bp)： ATGACCTCGC TGGCTTCTTG GCAGCTGCTG CTTCTCCTCT GTGTGGCCTC TTTTGGGGAG 60 CCACTGGCAA AAATGGCACC TGTGGTGAAC CCTGAACCCA CAGGCCAACA GTCCGGACCC 120 CAGGAACTCG TTAATGCCTG GCAAAAGGGC CCGCGGTATG CAGAGAGCAA GCCTGGGGCT 180 GCAGGACTGC GCGCTCGCCG AACATCGCCA TGCCCGCCGG TGGAGAACCC CACGGGGCAC 240 CAGCGGCCCC CGTGTGCCAC CCGCAGTCGC CTGATCCCTG CGCCCCGCGG ATCGGTGCTG 300 GTGCAGCGCG AGAAGGACAT GTCAGCCTAC AACTGGAACT CCTTTGGCCT GCGCTACGGC 360 AGGAGGCAGG TGGCGCGGGC GGCACGGGGC TGA 393 （配列番号：２３）
するcDNAのクローニング ラット胎盤からTRIZOL reagent（Gibco BRL社）を用
い、添付されたマニュアルに記載された方法に従ってto
tal RNAを抽出した。次いでオリゴdTセルロースカラム
（MessageMaker reagent assembly, Gibco BRL社）を用
い、添付されたマニュアルに記載された方法に従って該
total RNAからpoly(A)+ RNAを調製した。さらに、Super
Script Preamplification System for First Strand cD
NA Synthesis(Gibco BRL社)を用い、添付されたマニュ
アルに記載された方法に従って、該Poly (A)+ RNAから
first strand cDNA を合成した。また、マウスKiSS-1配
列を基にデザインした次のデジェネレートプライマー(d
egenerate primer)を合成した。 13-3F38: 5'-TTCTTGGCAGCTRCTGCTTYTCCTCTGTG-3' （配列番号：１４） KiSS357R: 5'-GAAGCGCAGGCCGAAGGAGTTCCA-3' （配列番号：１５） 前述の first strand cDNA を鋳型として用い、13-3F38
およびKiSS357Rをプライマーとして用いてデジェネレー
トPCR（Degenerative PCR）反応を実施した。該PCR反応
における反応液は、Taq polymerase（宝酒造社）を1 μ
l、それぞれ添付の10x PCR buffer(500 mM KCl-100 mM
Tris・HCl, pH 8.3)を10 μl、25 mM MgCl2を6 μl、2.
5 mM dNTP mixtureを8 μl、25 % DMSO溶液を4 μl、プ
ライマー13-3F38およびプライマーKiSS357R（ともに20
μM）を各2 μl、および該鋳型cDNA（前述の first str
and cDNA）を2 μl、蒸留水を65 μlを混合して作製し
た。該PCRとして、１）初期変性（94℃・5分間）、２）
サイクル反応（94℃・20秒間-72℃・50秒間）３）サイク
ル反応（94℃・20秒間-71.5℃・20秒間-72℃・30秒間）
４）サイクル反応（94℃・20秒間-71℃・20秒間-72℃・30
秒間）、５）サイクル反応（94℃・20秒間-70.5℃・20秒
間-72℃・30秒間）、６）サイクル反応（94℃・20秒間-70
℃・20秒間-72℃・30秒間）、７）サイクル反応（94℃・20
秒間-69.5℃・20秒間-72℃・30秒間）、８）サイクル反応
（94℃・20秒間-69℃・20秒間-72℃・30秒間）、９）サイ
クル反応（94℃・20秒間-68.5℃・20秒間-72℃・30秒
間）、１０）サイクル反応（94℃・20秒間-68℃・20秒間-
72℃・30秒間）、１１）30回のサイクル反応（94℃・20秒
間-61.8℃・20秒間-72℃・30秒間）の後１２）最終伸長反
応（72℃・7分間）を行いPCR産物を得た。さらにPCR 産
物を1.5 %アガロースゲル電気泳動を行い、サイバーグ
リーン染色される約300 bpのバンドを含むゲル片を剃刀
で切り出した。該ゲル片より Gene Clean DNA 抽出キッ
ト（BIO 101社）を用いてPCR 産物であるDNA断片を回収
した。該DNA断片の塩基配列決定のための反応は、Dye T
erminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystem
s、パーキンエルマー社）を用いて行い、蛍光式自動シ
ークエンサー（DNA sequencer Prism 377：Applied Bio
systems、パーキンエルマー社）を用いてPCR 産物の塩
基配列を解読した。その結果、ラットKiSS-1の部分ペプ
チドをコードする配列を有するDNA断片を得ることがで
きた。以下にデジェネレートプライマー部分を含まない
288 bpの塩基配列（配列番号：１６）pCR288bpを示す。 pCR288bp： TGGCCTCTTT TGGGGAGCCA CTGGCAAAAA TGGCACCTGT GGTGAACCCT GAACCCACAG 60 GCCAACAGTC CGGACCCCAG GAACTCGTTA ATGCCTGGCA AAAGGGCCCG CGGTATGCAG 120 AGAGCAAGCC TGGGGCTGCA GGACTGCGCG CTCGCCGAAC ATCGCCATGC CCGCCGGTGG 180 AGAACCCCAC GGGGCACCAG CGGCCCCCGT GTGCCACCCG CAGTCGCCTG ATCCCTGCGC 240 CCCGCGGATC GGTGCTGGTG CAGCGCGAGA AGGACATGTC AGCCTACA 288 （配列番号：１６） 得られた配列よりプライマー 288-41F（配列番号：１
７）、288-10F（配列番号：１８）、288-254R（配列番
号：１９）、288-44R（配列番号：２０）を作成し、以
下に記した5'-RACE及び3'-RACE実験に用いた。 288-41F: 5'-GGTGAACCCTGAACCCACAGGCCAACAG-3' （配列番号：１７） 288-10F: 5'-TTGGGGAGCCACTGGCAAAAATGGCACC-3' （配列番号：１８） 288-254R: 5'-TGACATGTCCTTCTCGCGCTGCACCAGC-3' （配列番号：１９） 288-44R: 5'-GGACTGTTGGCCTGTGGGTTCAGGGTTC-3' （配列番号：２０） ラット肝臓cDNAを鋳型として5'-RACE及び3'-RACE反応を
実施した。5'-RACE及び3'-RACEのPCR反応液はTaq polym
erase(宝酒造社)を0.5 μl、添付の10x PCR buffer(500
mM KCl-25 mM MgCl2-100 mM Tris・HCl, pH 8.3)を5
μl、2.5 mM dNTP mixtureを4 μl、25 mM MgCl2 を3
μl、25 % DMSO溶液を2 μl(3'-RACEの場合)、10 μMプ
ライマー288-10F(3'-RACEの場合)あるいは10 μMプライ
マー288-254R(5'-RACEの場合)を 1 μl、10 μMプライ
マーAP1（プライマーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready
cDNA Kitに添付のもの）を1 μl、鋳型ラット肝臓cDNA
（CLONTECH社、Marathon-Ready cDNA Kit、rat liver）
を5 μl、及び蒸留水を28.5μl(3'-RACEの場合)あるい
は30.5μl(5'-RACEの場合)を混合して作製した。反応条
件は94℃・60秒の初期変性後、94℃・30秒-72℃・120秒の
サイクル反応を5回、94℃・30秒-70℃・120秒のサイクル
反応を5回、94℃・20秒-68℃・120秒のサイクル反応を25
回、および68℃・10分の最終伸長反応とした。続いて、
該PCR反応の反応液を鋳型としてnested PCRを実施し
た。反応液はTaqpolymerase(宝酒造社)を0.5 μl、添付
の10x PCR buffer(500 mM KCl-25 mM MgCl2-100 mM Tri
s・HCl, pH 8.3)を5 μl、2.5 mM dNTP mixtureを4 μ
l、25 mMMgCl2 を3 μl、25 % DMSO溶液を2 μl(3'-RAC
Eの場合)、10 μMプライマー288-41F(3'-RACEの場合)あ
るいは10 μMプライマー288-44R(5'-RACEの場合)を 1
μl、10 μMプライマーAP2（プライマーAP2はCLONTECH
社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付のもの）を1 μl、
鋳型DNA（該PCR反応液50倍希釈液）を5 μl、及び蒸留
水を28.5 μl(3'-RACEの場合)あるいは30.5μl(5'-RACE
の場合)を混合して作製した。反応条件は94℃・60秒の初
期変性後、94℃・30秒-72℃・120秒のサイクル反応を5
回、94℃・30秒-70℃・120秒のサイクル反応を5回、94℃・
20秒-68℃・120秒のサイクル反応を25回、および68℃・10
分の最終伸長反応とした。さらにnested PCR 産物から
前述の方法によりDNA断片を回収した。該DNA断片をTOPO
-TA Cloning Kit (Invitrogen社）を用いて、添付のマ
ニュアルに記載された方法に従ってプラスミドベクター
pCR2.1に連結し、大腸菌TOP10をトランスフォームさせ
た。単一コロニーより大腸菌をピックアップし、LB培地
中にて液体培養終了後、集菌してプラスミド精製キット
（QIAGEN社、QIAwell 8 Ultra plasmid purification k
it）を用いてプラスミドを精製した。該プラスミド中の
PCR産物の塩基配列を前述の方法により解読し、5'端、
3'端の配列情報を得た。この配列情報よりプライマーrK
iSS364F、rKiSS859Rを作成した。 rKiSS364F: 5'-CGTCTCAGCCTCTGGACACCCTGTGGATCTGCC-3' (配列番号 ：２１) rKiSS859R: 5'-TGGCGACAGCATTGCTTTTATTGCACAAGTCTA-3' (配列番号 ：２２) ラット肝臓cDNAを鋳型としてプライマーrKiSS364FとrKi
SS859Rを用いてPCRを実施した。PCR反応液はPfu DNA po
lymerase(Stratagene社)を1 μl、添付の10xPCR buffer
(500 mM KCl-25 mM MgCl2-100 mM Tris・HCl, pH 8.3)
を5 μl、2.5mM dNTP mixtureを4 μl、25 % DMSO溶液
を2 μl、10 μMプライマーrKiSS364F及びrKiSS859Rを
各1 μl 、鋳型ラット肝臓cDNA（CLONTECH社、Marathon
-ReadycDNA Kit、rat liver）を5 μl、及び蒸留水を31
μlを混合して作製した。反応条件は94℃・60秒の初期
変性後、94℃・20秒-72℃・120秒のサイクル反応を3回、9
4℃・20秒-70℃・120秒のサイクル反応を3回、94℃・20秒-
68℃・120秒のサイクル反応を3回、94℃・20秒-63℃・30秒
-68℃・120秒のサイクル反応を30回、および68℃・10分の
最終伸長反応とした。得られたDNA断片をpPCR-BluntII-
TOPO vector (Stratagene社)を用いて添付のマニュアル
に記載された方法に従ってクローニングした。クローニ
ングされたDNA配列を前述の方法により解読し、ラットK
iSS-1全長ペプチドをコードする393 bpのDNA断片(配列
番号２５)を有するpRKISS4を得ることができた。該プラ
スミドによりトランスフォームさせた大腸菌TOP10を、T
OP10/pRKISS4と命名した。得られた核酸配列から推定さ
れたラット型ＫｉＳＳ−１蛋白質のアミノ酸配列（配列
番号：６）は既知のヒトホモログに対して高い相同性を
有していた（図１参照）。 pRKISS4(393bp)： ATGACCTCGC TGGCTTCTTG GCAGCTGCTG CTTCTCCTCT GTGTGGCCTC TTTTGGGGAG 60 CCACTGGCAA AAATGGCACC TGTGGTGAAC CCTGAACCCA CAGGCCAACA GTCCGGACCC 120 CAGGAACTCG TTAATGCCTG GCAAAAGGGC CCGCGGTATG CAGAGAGCAA GCCTGGGGCT 180 GCAGGACTGC GCGCTCGCCG AACATCGCCA TGCCCGCCGG TGGAGAACCC CACGGGGCAC 240 CAGCGGCCCC CGTGTGCCAC CCGCAGTCGC CTGATCCCTG CGCCCCGCGG ATCGGTGCTG 300 GTGCAGCGCG AGAAGGACAT GTCAGCCTAC AACTGGAACT CCTTTGGCCT GCGCTACGGC 360 AGGAGGCAGG TGGCGCGGGC GGCACGGGGC TGA 393 （配列番号：２３）
【００８０】実施例３ マウス全脳由来 新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするcDNAのクローニングと塩基配列の決定 マウス全脳cDNA（CLONTECH社）を鋳型とし、２個のプラ
イマー、プライマー１（配列番号:２６）およびプライ
マー2（配列番号：２７）を用いてPCR反応を行った。該
反応における反応液の組成は、上記cDNAを10分の１量鋳
型として使用し、Pfu Turbo DNA Polymerase（STRATAGE
NE社）1/50量、プライマー１およびプライマー2を各0.2
μM、dNTPs 200μM、および酵素に添付のバッファーを
加え、25μｌの液量とした。PCR反応は、94℃・2分の
後、94℃・20秒、72℃・2分のサイクルを3回、94℃・
20秒、68℃・2分のサイクルを3回、94℃・20秒、62℃・
20秒、68℃・1分30秒のサイクルを38回繰り返し、最後に
68℃・7分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応
産物を、Zero−blunt TOPO TA Cloning Kit（Invitroge
n社）の処方に従い、プラスミドベクターpCR−Blunt II
−TOPO（Invitrogen社）へサブクローニングした。これ
を大腸菌DH5αに導入し、cDNAを持つクローンを、カナ
マイシンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクロー
ンの配列を解析した結果、新規G蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするcDNAの塩基配列（配列番号：２
５）を得た。この塩基配列より導き出される396残基か
らなるアミノ酸配列（配列番号：２４）は、既知Ｇ蛋白
質共役型レセプターであるrOT7T175（GPR54）との間
に、94.4％ともっとも高い相同性がみられた。また、そ
のヒト型カウンターパートであるhOT7T175（ＷＯ ００
／２４８９０）との間にも82.4％の相同性が見られたこ
とから、これらのマウス型カウンターパートであると考
えられた。そこで、このアミノ酸配列を含有する新規G
蛋白質共役型レセプター蛋白質をmOT7T175と命名した。
またmOT7T175配列を有する上記の形質転換体を、大腸菌
(Escherichia coli)DH5α / pCR−Blunt II−mOT7T175
と命名した。
をコードするcDNAのクローニングと塩基配列の決定 マウス全脳cDNA（CLONTECH社）を鋳型とし、２個のプラ
イマー、プライマー１（配列番号:２６）およびプライ
マー2（配列番号：２７）を用いてPCR反応を行った。該
反応における反応液の組成は、上記cDNAを10分の１量鋳
型として使用し、Pfu Turbo DNA Polymerase（STRATAGE
NE社）1/50量、プライマー１およびプライマー2を各0.2
μM、dNTPs 200μM、および酵素に添付のバッファーを
加え、25μｌの液量とした。PCR反応は、94℃・2分の
後、94℃・20秒、72℃・2分のサイクルを3回、94℃・
20秒、68℃・2分のサイクルを3回、94℃・20秒、62℃・
20秒、68℃・1分30秒のサイクルを38回繰り返し、最後に
68℃・7分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応
産物を、Zero−blunt TOPO TA Cloning Kit（Invitroge
n社）の処方に従い、プラスミドベクターpCR−Blunt II
−TOPO（Invitrogen社）へサブクローニングした。これ
を大腸菌DH5αに導入し、cDNAを持つクローンを、カナ
マイシンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクロー
ンの配列を解析した結果、新規G蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするcDNAの塩基配列（配列番号：２
５）を得た。この塩基配列より導き出される396残基か
らなるアミノ酸配列（配列番号：２４）は、既知Ｇ蛋白
質共役型レセプターであるrOT7T175（GPR54）との間
に、94.4％ともっとも高い相同性がみられた。また、そ
のヒト型カウンターパートであるhOT7T175（ＷＯ ００
／２４８９０）との間にも82.4％の相同性が見られたこ
とから、これらのマウス型カウンターパートであると考
えられた。そこで、このアミノ酸配列を含有する新規G
蛋白質共役型レセプター蛋白質をmOT7T175と命名した。
またmOT7T175配列を有する上記の形質転換体を、大腸菌
(Escherichia coli)DH5α / pCR−Blunt II−mOT7T175
と命名した。
【００８１】
【発明の効果】ラットおよびマウス由来の新規リガンド
蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、およびそ
れらをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、
ＲＮＡおよびそれらの誘導体）が提供される。該ポリヌ
クレオチドを含んでなるベクター、それを用いた該リガ
ンド蛋白質の製造方法も提供される。該蛋白質等に対す
る抗体、アンタゴニスト、これらのスクリーニング方法
およびキットも提供される。該蛋白質等、該ポリヌクレ
オチド、またはそれらに対する抗体、またはアンタゴニ
スト等を含有する医薬等も提供される。
蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、およびそ
れらをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、
ＲＮＡおよびそれらの誘導体）が提供される。該ポリヌ
クレオチドを含んでなるベクター、それを用いた該リガ
ンド蛋白質の製造方法も提供される。該蛋白質等に対す
る抗体、アンタゴニスト、これらのスクリーニング方法
およびキットも提供される。該蛋白質等、該ポリヌクレ
オチド、またはそれらに対する抗体、またはアンタゴニ
スト等を含有する医薬等も提供される。
【００８２】
SEQ ID NO. 9 Designed oligonucleotide probe to amplify mouse Ki
SS-1 cDNA. SEQ ID NO. 10 Designed oligonucleotide primer to amplify mouse K
iSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 11 Designed oligonucleotide primer to amplify mouse K
iSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 12 Designed oligonucleotide primer to amplify mouse K
iSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 13 Designed oligonucleotide primer to amplify mouse K
iSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 14 Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiS
S-1 cDNA. y represents t or c. SEQ ID NO. 15 Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiS
S-1 cDNA. SEQ ID NO. 17 Designed oligonucleotide primer for 3'-RACE to amp
lify rat KiSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 18 Designed oligonucleotide primer for 3'-RACE to amp
lify rat KiSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 19 Designed oligonucleotide primer for 5'-RACE to am
plify rat KiSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 20 Designed oligonucleotide primer for 5'-RACE to amp
lify rat KiSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 21 Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiS
S-1 cDNA. SEQ ID NO. 22 Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiS
S-1 cDNA. SEQ ID NO. 26 Designed oligonucleotide primer to amplify mOT7T17
5 cDNA. SEQ ID NO. 27 Designed oligonucleotide primer to amplify mOT7T17
5 cDNA.
SS-1 cDNA. SEQ ID NO. 10 Designed oligonucleotide primer to amplify mouse K
iSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 11 Designed oligonucleotide primer to amplify mouse K
iSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 12 Designed oligonucleotide primer to amplify mouse K
iSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 13 Designed oligonucleotide primer to amplify mouse K
iSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 14 Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiS
S-1 cDNA. y represents t or c. SEQ ID NO. 15 Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiS
S-1 cDNA. SEQ ID NO. 17 Designed oligonucleotide primer for 3'-RACE to amp
lify rat KiSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 18 Designed oligonucleotide primer for 3'-RACE to amp
lify rat KiSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 19 Designed oligonucleotide primer for 5'-RACE to am
plify rat KiSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 20 Designed oligonucleotide primer for 5'-RACE to amp
lify rat KiSS-1 cDNA. SEQ ID NO. 21 Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiS
S-1 cDNA. SEQ ID NO. 22 Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiS
S-1 cDNA. SEQ ID NO. 26 Designed oligonucleotide primer to amplify mOT7T17
5 cDNA. SEQ ID NO. 27 Designed oligonucleotide primer to amplify mOT7T17
5 cDNA.
【００８３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel protein, DNA encoding the same, and process for preparation thereof <130> 176997 <150> JP 2000-093575 <151> 2000-03-30 <160> 27 <210> 1 <211> 152 <212> PRT <213> Mouse <400> 1 Met Tyr Leu Arg Phe Gly Val Asp Val Cys Ser Leu Ser Pro Trp Lys 5 10 15 Glu Thr Val Asp Leu Pro Leu Pro Pro Arg Met Ile Ser Met Ala Ser 20 25 30 Trp Gln Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala Thr Tyr Gly Glu Pro Leu 35 40 45 Ala Lys Val Ala Pro Gly Ser Thr Gly Gln Gln Ser Gly Pro Gln Glu 50 55 60 Leu Val Asn Ala Trp Glu Lys Glu Ser Arg Tyr Ala Glu Ser Lys Pro 65 70 75 80 Gly Ser Ala Gly Leu Arg Ala Arg Arg Ser Ser Pro Cys Pro Pro Val 85 90 95 Glu Gly Pro Ala Gly Arg Gln Arg Pro Leu Cys Ala Ser Arg Ser Arg 100 105 110 Leu Ile Pro Ala Pro Arg Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp 115 120 125 Leu Ser Thr Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Tyr Gly Arg Arg 130 135 140 Gln Ala Ala Arg Ala Ala Arg Gly 145 150 <210> 2 <211> 156 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Met Tyr Leu Arg Phe Gly Val Asp Val Cys Ser Leu Ser Pro Trp Lys 5 10 15 Glu Thr Val Asp Leu Pro Leu Pro Pro Arg Met Ile Ser Met Ala Ser 20 25 30 Trp Gln Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala Thr Tyr Gly Glu Pro Leu 35 40 45 Ala Lys Val Ala Pro Leu Val Lys Pro Gly Ser Thr Gly Gln Gln Ser 50 55 60 Gly Pro Gln Glu Leu Val Asn Ala Trp Glu Lys Glu Ser Arg Tyr Ala 65 70 75 80 Glu Ser Lys Pro Gly Ser Ala Gly Leu Arg Ala Arg Arg Ser Ser Pro 85 90 95 Cys Pro Pro Val Glu Gly Pro Ala Gly Arg Gln Arg Pro Leu Cys Ala 100 105 110 Ser Arg Ser Arg Leu Ile Pro Ala Pro Arg Gly Ala Val Leu Val Gln 115 120 125 Arg Glu Lys Asp Leu Ser Thr Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg 130 135 140 Tyr Gly Arg Arg Gln Ala Ala Arg Ala Ala Arg Gly 145 150 155 <210> 3 <211> 130 <212> PRT <213> Rat <400> 3 Met Thr Ser Leu Ala Ser Trp Gln Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala 5 10 15 Ser Phe Gly Glu Pro Leu Ala Lys Met Ala Pro Val Val Asn Pro Glu 20 25 30 Pro Thr Gly Gln Gln Ser Gly Pro Gln Glu Leu Val Asn Ala Trp Gln 35 40 45 Lys Gly Pro Arg Tyr Ala Glu Ser Lys Pro Gly Ala Ala Gly Leu Arg 50 55 60 Ala Arg Arg Thr Ser Pro Cys Pro Pro Val Glu Asn Pro Thr Gly His 65 70 75 80 Gln Arg Pro Pro Cys Ala Thr Arg Ser Arg Leu Ile Pro Ala Pro Arg 85 90 95 Gly Ser Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Met Ser Ala Tyr Asn Trp 100 105 110 Asn Ser Phe Gly Leu Arg Tyr Gly Arg Arg Gln Val Ala Arg Ala Ala 115 120 125 Arg Gly 130 <210> 4 <211> 449 <212> DNA <213> Mouse <400> 4 atgtatctga gatttggcgt tgatgtctgc agcctgagtc cctggaagga gactgtagac 60 ctgccccttc ctcccagaat tctcaatggc ttcttggcag ctgctgcttc tcctctgtgt 120 cgccacctat ggggagccgc tggcaaaagt gaagcctgga cacaggccag cagtccggac 180 cccaggaact cgttaatgcc tgggaaaagg aatcgcggta tgcagagagc aagcctgggt 240 gcagggctgc gcgctcgtag gtcgtcgcca tgcccgccgg ttgagggccc cgcggggcgc 300 cagcggcccc tgtgtgcctc gcagtcgcct gatccctgcg ccccgcggag cggtgctggt 360 gcagcgggag aaggacctgt ccacctacaa ctggaactcc cggcctgcgc tacggcagga 420 ggcaggcggc gcgggcagca cggggctga <210> 5 <211> 458 <212> DNA <213> Mouse <400> 5 atgtatctga gatttggcgt tgatgtctgc agcctgagtc cctggaagga gactgtagac 60 ctgccccttc ctcccagaat tctcaatggc ttcttggcag ctgctgcttc tcctctgtgt 120 cgccacctat ggggagccgc tggcaaaagt ggcacctttg gaagcctgga tccacaggcc 180 agcagtccgg accccaggaa ctcgttaatg cctgggaaaa ggaatcgcgg tatgcagaga 240 aagcctgggt ctgcagggct gcgcgctcgt aggtcgtcgc catgcccgcc ggttgagggc 300 cccgcggggc gccagcggcc tgtgtgcctc ccgcagtcgc ctgatccctg cgccccgcgg 360 agcggtgctg gtgcagcggg agaaggacct gtcgacctac ctggaactcc ttcggcctgc 420 gctacggcag gaggcaggcg gcgcgggcag cacggggc <210> 6 <211> 390 <212> DNA <213> Rat <400> 6 atgacctcgc tggcttcttg gcagctgctg cttctcctct gtgtggcctc ttttggggag 60 ccactggcaa aaatggcacc tgtggtgaac cctgaaccca caggccaaca gtccggaccc 120 caggaactcg ttaatgcctg gcaaaagggc ccgcggtatg cagagagcaa gcctggggct 180 gcaggactgc gcgctcgccg aacatcgcca tgcccgccgg tggagaaccc cacggggcac 240 cagcggcccc cgtgtgccac ccgcagtcgc ctgatccctg cgccccgcgg atcggtgctg 300 gtgcagcgcg agaaggacat gtcagcctac aactggaact cctttggcct gcgctacggc 360 aggaggcagg tggcgcgggc ggcacggggc <210> 7 <211> 398 <212> PRT <213> Human <400> 7 Met His Thr Val Ala Thr Ser Gly Pro Asn Ala Ser Trp Gly Ala Pro 5 10 15 Ala Asn Ala Ser Gly Cys Pro Gly Cys Gly Ala Asn Ala Ser Asp Gly 20 25 30 Pro Val Pro Ser Pro Arg Ala Val Asp Ala Trp Leu Val Pro Leu Phe 35 40 45 Phe Ala Ala Leu Met Leu Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Val Ile 50 55 60 Tyr Val Ile Cys Arg His Lys Pro Met Arg Thr Val Thr Asn Phe Tyr 65 70 75 80 Ile Ala Asn Leu Ala Ala Thr Asp Val Thr Phe Leu Leu Cys Cys Val 85 90 95 Pro Phe Thr Ala Leu Leu Tyr Pro Leu Pro Gly Trp Val Leu Gly Asp 100 105 110 Phe Met Cys Lys Phe Val Asn Tyr Ile Gln Gln Val Ser Val Gln Ala 115 120 125 Thr Cys Ala Thr Leu Thr Ala Met Ser Val Asp Arg Trp Tyr Val Thr 130 135 140 Val Phe Pro Leu Arg Ala Leu His Arg Arg Thr Pro Arg Leu Ala Leu 145 150 155 160 Ala Val Ser Leu Ser Ile Trp Val Gly Ser Ala Ala Val Ser Ala Pro 165 170 175 Val Leu Ala Leu His Arg Leu Ser Pro Gly Pro Arg Ala Tyr Cys Ser 180 185 190 Glu Ala Phe Pro Ser Arg Ala Leu Glu Arg Ala Phe Ala Leu Tyr Asn 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ala Thr Cys Ala Cys Tyr 210 215 220 Ala Ala Met Leu Arg His Leu Gly Arg Val Ala Val Arg Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ala Asp Ser Ala Leu Gln Gly Gln Val Leu Ala Glu Arg Ala Gly Ala 245 250 255 Val Arg Ala Lys Val Ser Arg Leu Val Ala Ala Val Val Leu Leu Phe 260 265 270 Ala Ala Cys Trp Gly Pro Ile Gln Leu Phe Leu Val Leu Gln Ala Leu 275 280 285 Gly Pro Ala Gly Ser Trp His Pro Arg Ser Tyr Ala Ala Tyr Ala Leu 290 295 300 Lys Thr Trp Ala His Cys Met Ser Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Asn Pro 305 310 315 320 Leu Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ser His Phe Arg Gln Ala Phe Arg Arg 325 330 335 Val Cys Pro Cys Ala Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Gly 340 345 350 Pro Ser Asp Pro Ala Ala Pro His Ala Glu Leu His Arg Leu Gly Ser 355 360 365 His Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gln Lys Pro Gly Ser Ser Gly Leu Ala 370 375 380 Ala Arg Gly Leu Cys Val Leu Gly Glu Asp Asn Ala Pro Leu 385 390 395 <210> 8 <211> 396 <212> PRT <213> Rat <400> 8 Met Ala Ala Glu Ala Thr Leu Gly Pro Asn Val Ser Trp Trp Ala Pro 5 10 15 Ser Asn Ala Ser Gly Cys Pro Gly Cys Gly Val Asn Ala Ser Asp Gly 20 25 30 Pro Gly Ser Ala Pro Arg Pro Leu Asp Ala Trp Leu Val Pro Leu Phe 35 40 45 Phe Ala Ala Leu Met Leu Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Val Ile 50 55 60 Phe Val Ile Cys Arg His Lys His Met Gln Thr Val Thr Asn Phe Tyr 65 70 75 80 Ile Ala Asn Leu Ala Ala Thr Asp Val Thr Phe Leu Leu Cys Cys Val 85 90 95 Pro Phe Thr Ala Leu Leu Tyr Pro Leu Pro Thr Trp Val Leu Gly Asp 100 105 110 Phe Met Cys Lys Phe Val Asn Tyr Ile Gln Gln Val Ser Val Gln Ala 115 120 125 Thr Cys Ala Thr Leu Thr Ala Met Ser Val Asp Arg Trp Tyr Val Thr 130 135 140 Val Phe Pro Leu Arg Ala Leu His Arg Arg Thr Pro Arg Leu Ala Leu 145 150 155 160 Thr Val Ser Leu Ser Ile Trp Val Gly Ser Ala Ala Val Ser Ala Pro 165 170 175 Val Leu Ala Leu His Arg Leu Ser Pro Gly Pro His Thr Tyr Cys Ser 180 185 190 Glu Ala Phe Pro Ser Arg Ala Leu Glu Arg Ala Phe Ala Leu Tyr Asn 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ala Thr Cys Ala Cys Tyr 210 215 220 Gly Ala Met Leu Arg His Leu Gly Arg Ala Ala Val Arg Pro Ala Pro 225 230 235 240 Thr Asp Gly Ala Leu Gln Gly Gln Leu Leu Ala Gln Arg Ala Gly Ala 245 250 255 Val Arg Thr Lys Val Ser Arg Leu Val Ala Ala Val Val Leu Leu Phe 260 265 270 Ala Ala Cys Trp Gly Pro Ile Gln Leu Phe Leu Val Leu Gln Ala Leu 275 280 285 Gly Pro Ser Gly Ala Trp His Pro Arg Ser Tyr Ala Ala Tyr Ala Leu 290 295 300 Lys Ile Trp Ala His Cys Met Ser Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Asn Pro 305 310 315 320 Leu Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ser His Phe Arg Gln Ala Phe Cys Arg 325 330 335 Val Cys Pro Cys Gly Pro Gln Arg Gln Arg Arg Pro His Ala Ser Ala 340 345 350 His Ser Asp Arg Ala Ala Pro His Ser Val Pro His Ser Arg Ala Ala 355 360 365 His Pro Val Arg Val Arg Thr Pro Glu Pro Gly Asn Pro Val Val Arg 370 375 380 Ser Pro Ser Val Gln Asp Glu His Thr Ala Pro Leu 385 390 395 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide probe to amplify mouse KiSS-1 cDNA. <400> 9 tatggggagc cgctggcaaa agtg 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify mouse KiSS-1 cDNA. <400> 10 tagacctgcc ccttcctccc aga 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify mouse KiSS-1 cDNA. <400> 11 ctgctggcct gtggatccag gctt 24 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify mouse KiSS-1 cDNA. <400> 12 tgcaggagag tgaagattaa atcccca 27 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify mouse KiSS-1 cDNA. <400> 13 gaggacctgt cccatctcgc aggagtca 28 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiSS-1 cDNA. <400> 14 ttcttggcag ctrctgctty tcctctgtg 29 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiSS-1 cDNA. <400> 15 gaagcgcagg ccgaaggagt tcca 24 <210> 16 <211> 288 <212> DNA <213> Rat <400> 16 tggcctcttt tggggagcca ctggcaaaaa tggcacctgt ggtgaaccct gaacccacag 60 gccaacagtc cggaccccag gaactcgtta atgcctggca aaagggcccg cggtatgcag 120 agagcaagcc tggggctgca ggactgcgcg ctcgccgaac atcgccatgc ccgccggtgg 180 agaaccccac ggggcaccag cggcccccgt gtgccacccg cagtcgcctg atccctgcgc 240 cccgcggatc ggtgctggtg cagcgcgaga aggacatgtc agcctaca 288 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for 3'-RACE to amplify rat KiSS-1 cDNA. <400> 17 ggtgaaccct gaacccacag gccaacag 28 <210> 18 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiSS-1 cDNA. <400> 18 ttggggagcc actggcaaaa atggcacc 28 <210> 19 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiSS-1 cDNA. <400> 19 tgacatgtcc ttctcgcgct gcaccagc 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for 5'-RACE to amplify rat KiSS-1 cDNA. <400> 20 ggactgttgg cctgtgggtt cagggttc 28 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiSS-1 cDNA. <400> 21 cgtctcagcc tctggacacc ctgtggatct gcc 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify rat KiSS-1 cDNA. <400> 22 tggcgacagc attgctttta ttgcacaagt cta 33 <210> 23 <211> 393 <212> DNA <213> Rat <400> 23 atgacctcgc tggcttcttg gcagctgctg cttctcctct gtgtggcctc ttttggggag 60 ccactggcaa aaatggcacc tgtggtgaac cctgaaccca caggccaaca gtccggaccc 120 caggaactcg ttaatgcctg gcaaaagggc ccgcggtatg cagagagcaa gcctggggct 180 gcaggactgc gcgctcgccg aacatcgcca tgcccgccgg tggagaaccc cacggggcac 240 cagcggcccc cgtgtgccac ccgcagtcgc ctgatccctg cgccccgcgg atcggtgctg 300 gtgcagcgcg agaaggacat gtcagcctac aactggaact cctttggcct gcgctacggc 360 aggaggcagg tggcgcgggc ggcacggggc tga 393 <210> 24 <211> 396 <212> PRT <213> Mouse <400> 24 Met Ala Thr Glu Ala Thr Leu Ala Pro Asn Val Thr Trp Trp Ala Pro 1 5 10 15 Ser Asn Ala Ser Gly Cys Pro Gly Cys Gly Val Asn Ala Ser Asp Asp 20 25 30 Pro Gly Ser Ala Pro Arg Pro Leu Asp Ala Trp Leu Val Pro Leu Phe 35 40 45 Phe Ala Thr Leu Met Leu Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Val Ile 50 55 60 Tyr Val Ile Cys Arg His Lys His Met Gln Thr Val Thr Asn Phe Tyr 65 70 75 80 Ile Ala Asn Leu Ala Ala Thr Asp Val Thr Phe Leu Leu Cys Cys Val 85 90 95 Pro Phe Thr Ala Leu Leu Tyr Pro Leu Pro Ala Trp Val Leu Gly Asp 100 105 110 Phe Met Cys Lys Phe Val Asn Tyr Ile Gln Gln Val Ser Val Gln Ala 115 120 125 Thr Cys Ala Thr Leu Thr Ala Met Ser Val Asp Arg Trp Tyr Val Thr 130 135 140 Val Phe Pro Leu Arg Ala Leu His Arg Arg Thr Pro Arg Leu Ala Leu 145 150 155 160 Ala Val Ser Leu Ser Ile Trp Val Gly Ser Ala Ala Val Ser Ala Pro 165 170 175 Val Leu Ala Leu His Arg Leu Ser Pro Gly Pro Arg Thr Tyr Cys Ser 180 185 190 Glu Ala Phe Pro Ser Arg Ala Leu Glu Arg Ala Phe Ala Leu Tyr Asn 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ala Thr Cys Ala Cys Tyr 210 215 220 Gly Ala Met Leu Arg His Leu Gly Arg Ala Ala Val Arg Pro Ala Pro 225 230 235 240 Thr Asp Gly Ala Leu Gln Gly Gln Leu Leu Ala Gln Arg Ala Gly Ala 245 250 255 Val Arg Thr Lys Val Ser Arg Leu Val Ala Ala Val Val Leu Leu Phe 260 265 270 Ala Ala Cys Trp Gly Pro Ile Gln Leu Phe Leu Val Leu Gln Ala Leu 275 280 285 Gly Pro Ser Gly Ala Trp His Pro Arg Ser Tyr Ala Ala Tyr Ala Val 290 295 300 Lys Ile Trp Ala His Cys Met Ser Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Asn Pro 305 310 315 320 Leu Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ser His Phe Arg Gln Ala Phe Cys Arg 325 330 335 Val Cys Pro Cys Cys Arg Gln Arg Gln Arg Arg Pro His Thr Ser Ala 340 345 350 His Ser Asp Arg Ala Ala Thr His Thr Val Pro His Ser Arg Ala Ala 355 360 365 His Pro Val Arg Ile Arg Ser Pro Glu Pro Gly Asn Pro Val Val Arg 370 375 380 Ser Pro Cys Ala Gln Ser Glu Arg Thr Ala Ser Leu 385 390 395 396 <210> 25 <211> 1188 <212> DNA <213> Mouse <400> 25 atggccaccg aggcgacatt ggctcccaat gtgacctggt gggctccgtc caacgcttca 60 ggatgcccag gctgcggtgt caacgcctcg gatgacccag gctctgcgcc aaggcccctg 120 gatgcctggc tggttcccct gtttttcgct acactcatgt tgcttgggct ggtcggaaac 180 tcattggtca tctacgttat ctgccgccac aagcacatgc agacagttac caacttctac 240 atcgctaacc tggctgccac agacgtcact ttcctactgt gctgcgtgcc cttcaccgca 300 ctcctctacc cgctgcccgc ctgggtgctg ggagacttca tgtgcaaatt cgtcaactac 360 atccagcagg tctcggtgca agccacatgt gccactctga cggccatgag tgtggaccgc 420 tggtatgtga ctgtgttccc gctgcgtgca cttcaccgcc gcactccgcg cctggccctg 480 gctgtcagcc tcagcatctg ggtggggtca gcagctgtgt ccgccccggt gctggccctg 540 caccgcctgt cgccagggcc tcgcacctac tgcagcgagg cgtttcccag ccgcgccctg 600 gagcgcgcct tcgcgctcta caacctgctg gctctatatc tgctgccgct gctcgccacc 660 tgcgcctgct acggcgccat gctgcgccac ctgggccgtg cggctgtacg ccccgcaccc 720 actgacggcg ccctgcaggg acagctgcta gcacagcgcg ccggagcagt gcgcaccaag 780 gtctcccggc tggtggccgc tgtcgtcctg ctcttcgccg cctgctgggg cccgatccag 840 ctgttcctgg tgcttcaagc cctgggcccc tcgggggcct ggcaccctcg aagctatgcc 900 gcctacgcgg tcaagatctg ggctcactgc atgtcctaca gcaactcggc gctcaatccg 960 ctgctctatg ccttcctggg ttcacacttc agacaggcct tctgccgcgt gtgcccctgc 1020 tgccggcaac gccagcgccg gccccacacg tcagcgcact cggaccgagc tgcaactcac 1080 actgtgccgc acagccgtgc tgcgcaccct gtgcggatca ggagcccgga gcctgggaac 1140 cctgtggtgc gctcgccctg cgctcagagt gaacgcactg cctcactc 1188 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 tccccacagt cccaggacac aatcct 26 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 caccagcgca agcagcctgg gatgct 26
【００８４】
【図１】 ヒト型、マウス型１、マウス型２およびラッ
ト型のＫｉＳＳ−１蛋白質のアミノ酸配列を比較した図
である。これら４種のホモログすべてにおいて同一のア
ミノ酸を＊で示す。アミノ酸は慣用的な１文字標記で表
す。
ト型のＫｉＳＳ−１蛋白質のアミノ酸配列を比較した図
である。これら４種のホモログすべてにおいて同一のア
ミノ酸を＊で示す。アミノ酸は慣用的な１文字標記で表
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/21 33/50 Ｚ 5/10 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 寺尾 寧子 茨城県つくば市小野崎985番地 ＲＯＹＡ Ｌ ＺＯＡ中山307号 (72)発明者 熊野 聡 茨城県つくば市松代３丁目12番地１ 武田 松代レジデンス504号
Claims (28)
- 【請求項１】 配列番号：１または配列番号：３で表さ
れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩。 - 【請求項２】 該実質的に同一のアミノ酸配列が配列番
号：２で表されるアミノ酸配列である請求項１記載の蛋
白質またはその塩。 - 【請求項３】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から１３２から１４１番目のアミノ酸配列を含有
することを特徴とする請求項１記載の蛋白質の部分ペプ
チドまたはその塩。 - 【請求項４】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から１２７から１４１番目のアミノ酸配列と同一
または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する請求項３
記載の部分ペプチドまたはその塩。 - 【請求項５】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から９０から１４１番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項３記載
の部分ペプチドまたはその塩。 - 【請求項６】 配列番号：２で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から９４から１４５番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項１記載
の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。 - 【請求項７】 配列番号：３で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から１１０から１１９番目のアミノ酸配列を含有
することを特徴とする請求項１記載の蛋白質の部分ペプ
チドまたはその塩。 - 【請求項８】 配列番号：３で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から１０５から１１９番目のアミノ酸配列と同一
または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する請求項７
記載の部分ペプチドまたはその塩。 - 【請求項９】 配列番号：３で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端から６８から１１９番目のアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項７記載
の部分ペプチドまたはその塩。 - 【請求項１０】 請求項１記載の蛋白質をコードするポ
リヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 【請求項１１】 請求項３、６または７記載の部分ペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク
レオチド。 - 【請求項１２】 ＤＮＡである請求項１０または１１記
載のポリヌクレオチド。 - 【請求項１３】 配列番号：４、配列番号：５または配
列番号：６で表される塩基配列を有する請求項１０記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１４】 請求項１０または１１記載のポリヌク
レオチドを含有する組換えベクター。 - 【請求項１５】 請求項１４記載の組換えベクターで形
質転換された形質転換体。 - 【請求項１６】 請求項１５記載の形質転換体を培養
し、請求項１記載の蛋白質または請求項３、６もしくは
７記載の部分ペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴
とする請求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求
項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩の
製造方法。 - 【請求項１７】 請求項１記載の蛋白質もしくはその塩
または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまた
はその塩に対する抗体。 - 【請求項１８】 請求項１記載の蛋白質または請求項
３、６もしくは７記載の部分ペプチドのシグナル伝達を
不活性化する中和抗体である請求項１７記載の抗体。 - 【請求項１９】 請求項１記載の蛋白質もしくはその塩
または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまた
はその塩を用いることを特徴とする、レセプターと請求
項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６も
しくは７記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を
変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - 【請求項２０】 請求項１記載の蛋白質もしくはその塩
または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまた
はその塩を含有することを特徴とする、レセプターと請
求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６
もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性
を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キ
ット。 - 【請求項２１】 レセプターが配列番号：７、配列番
号：８または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有することを
特徴とする蛋白質またはその塩である請求項１９記載の
スクリーニング方法または請求項２０記載のスクリーニ
ング用キット。 - 【請求項２２】 請求項１９記載のスクリーニング方法
または請求項２０記載のスクリーニング用キットを用い
て得ることのできる、レセプターと請求項１または請求
項３ないし５のいずれか１項記載の蛋白質またはその塩
との結合性を変化させる化合物またはその塩。 - 【請求項２３】 アゴニストである請求項２２記載の化
合物またはその塩。 - 【請求項２４】 請求項１９記載のスクリーニング方法
または請求項２０記載のスクリーニング用キットを用い
て得ることのできる、レセプターと請求項１記載の蛋白
質もしくはその塩または請求項３、６もしくは７記載の
部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合
物またはその塩を含有してなる医薬組成物。 - 【請求項２５】 癌転移抑制剤である請求項２４記載の
医薬組成物。 - 【請求項２６】 請求項１７記載の抗体を用いることを
特徴とする、請求項１記載の蛋白質または請求項３、６
もしくは７記載の部分ペプチドの定量方法。 - 【請求項２７】 請求項１記載の蛋白質もしくはその塩
または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまた
はその塩を含有してなる医薬組成物。 - 【請求項２８】 癌転移抑制剤である請求項２７記載の
医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001095115A JP2001340094A (ja) | 2000-03-30 | 2001-03-29 | 新規蛋白質、そのｄｎａおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-93575 | 2000-03-30 | ||
| JP2000093575 | 2000-03-30 | ||
| JP2001095115A JP2001340094A (ja) | 2000-03-30 | 2001-03-29 | 新規蛋白質、そのｄｎａおよびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001340094A true JP2001340094A (ja) | 2001-12-11 |
Family
ID=26588847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001095115A Withdrawn JP2001340094A (ja) | 2000-03-30 | 2001-03-29 | 新規蛋白質、そのｄｎａおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001340094A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1363655A2 (en) * | 2000-12-18 | 2003-11-26 | Merck & Co., Inc. | Isolated nucleic acid molecules encoding a human and mouse g protein-coupled receptor - gpr54; encoded proteins, cells transformed therewith and uses thereof |
| JP2005097237A (ja) * | 2003-03-12 | 2005-04-14 | Takeda Chem Ind Ltd | 性腺機能改善剤 |
-
2001
- 2001-03-29 JP JP2001095115A patent/JP2001340094A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1363655A2 (en) * | 2000-12-18 | 2003-11-26 | Merck & Co., Inc. | Isolated nucleic acid molecules encoding a human and mouse g protein-coupled receptor - gpr54; encoded proteins, cells transformed therewith and uses thereof |
| EP1363655A4 (en) * | 2000-12-18 | 2005-04-06 | Merck & Co Inc | ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING A HUMAN G-GPR54 PROTEIN-COUPLED RECEPTOR AND MURINE, ENCODED PROTEINS, CELLS TRANSFORMED THEREFROM, AND USES THEREOF |
| JP2005097237A (ja) * | 2003-03-12 | 2005-04-14 | Takeda Chem Ind Ltd | 性腺機能改善剤 |
| JP4639052B2 (ja) * | 2003-03-12 | 2011-02-23 | 武田薬品工業株式会社 | 性腺機能改善剤 |
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