JP2002345468A - 新規インスリン/igf/リラキシンファミリーポリペプチドおよびそのdna - Google Patents

新規インスリン/igf/リラキシンファミリーポリペプチドおよびそのdna

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Nobuhiro Suzuki
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】新規な分泌性生体機能調節タンパク質およびそ
のDNAの提供。 【解決手段】1.特定の配列で示されるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポ
リペプチド(A鎖)、2.特定の配列で示されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するポリペプチド(B鎖)、3.A鎖およびB鎖がジ
スルフィド結合で結合しているポリペプチドまたはその
塩(2本鎖)、4.それらをコードするDNAなど。 【効果】本発明のポリペプチドおよびそれをコードする
DNAは、例えば、炭水化物などのエネルギー源の代謝
調節(糖代謝、脂質代謝等)異常(例えば糖尿病など)
等の疾病の診断、治療、予防等に使用することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な分泌性生体
機能調節タンパク質およびそのDNAなどに関する。詳
しくは、新規なインスリン/IGF/リラキシンファミリ
ータンパク質及びそのDNAなどに関する。
【0002】
【従来の技術】生体は、細胞間または組織間で、互いに
情報伝達をすることにより、発生、分化、増殖、恒常性
の維持などの統合の取れた調節を行っている。多くの場
合、タンパク性因子がそれらの仲立ちをしている。例え
ば、免疫系、造血系に関与する分泌性因子(液性因子)
が数多く見いだされていて、それらはサイトカインと呼
ばれている。リンホカイン、モノカイン、インターフェ
ロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子などがこれらに
含まれる。これらについて、疾病との関係や医薬として
の利用方法について盛んに研究されている。また、内分
泌組織から生産されるペプチドホルモンや増殖因子など
の液性因子も、恒常性の維持や成長に大変重要な機能を
担っており、これらについても医薬への応用が精力的に
研究されている。インスリン(insulin)、インスリン
様成長因子−I(IGF-I)、インスリン様成長因子−I
I(IGF-II)、リラキシンH1(relaxin H1)、リラキシ
ンH2(relaxin H2)は、その構造的特徴から一群のファ
ミリーを形成する液性因子と考えられていて、生体にお
いて炭水化物の代謝調節、組織の成長促進、生殖機能の
調節など幅広い生理的役割を担っている[BioScience用
語ライブラリー サイトカイン・増殖因子、羊土社、10
8−109頁、1995年;ホルモンの分子生物学6 発生と成
長因子・ホルモン、学会出版センター、1−23頁、1996
年]。また、同じファミリーに属する新しい分子種も見
つかりつつある[モレキュラー エンドクリノロジー(M
olecular Endocrinology)、第13巻、2163−2174頁、199
9年]。これらの前駆体タンパク質の構造的特徴は、シ
グナル配列−Bドメイン−Cドメイン−Aドメイン構造
を有していることで、成熟型分子となるBドメインとA
ドメインは2つのジスルフィド結合でつながっている。
更に、Aドメイン内にある1つのジスルフィド結合は立
体構造の維持や活性の発現に重要である。インスリン、
インスリン様成長因子、リラキシンは多くの生理活性を
有し、生体にとって重要な情報伝達因子である。インス
リンは膵臓のβ細胞から分泌され、肝臓,筋肉,脂肪組
織での糖の取り込みの促進、脂肪酸合成の促進、グリコ
ーゲン合成の促進などのエネルギー代謝の調節に重要で
あるほか、細胞増殖作用を有する。IGF-Iは主に肝臓で
合成され、骨由来細胞をはじめとする多くの細胞に対し
て増殖や分化を促進する。IGF-IIはIGF-Iと同様に細胞
増殖促進作用、インスリン様作用を有する。これらの因
子は、特異的な受容体に結合し、その受容体の自己リン
酸化を引き起こすことが、その後の一連の作用の引き金
となる。一方リラキシンは、産道の弛緩、コラーゲンの
再構築による結合組織の軟化、乳腺の増殖分化促進など
の主に生殖機能に関連する作用を始め幅広いを生理作用
を有することが近年明らかになってきている。例えば、
子宮,乳腺,肺,心臓などに分布する血管の拡張促進、心
臓の拍動に対する作用、肥満細胞からのヒスタミンの放
出阻害、血小板の凝集阻害、下垂体ホルモンの分泌調
節、体液バランスの調節、培養系における乳ガン細胞の
増殖や分化の調節等である[ジェネラル ファーマコロ
ジー (Gen Pharmacol)、第28巻、13−22頁、1997年]。
生体にとって重要なこれらのタンパク性及びペプチド性
因子は、従来、その固有の生物活性を指標にして発見さ
れてきた。また、既知の生理活性タンパク質に対するホ
モロジーを手がかりにしたクローニング技術により、相
同性の高い類似遺伝子が追随的に発見されてきている。
しかし、高等生物、とりわけ、哺乳類動物が健康体を維
持し続けるために、公知の遺伝子群以外にも既存の手法
で未だ同定されずにその存在が知られていない液性機能
分子が重要な生理的役割を果たしている可能性は極めて
高いと考えられる。そこで、最近ではコンピュータを使
った情報処理技術の助けを借り、DNAの配列情報から
見出されてきた新規な遺伝子産物を、生物学、医学、獣
医学などに役立てようとする試み、すなわち、バイオイ
ンフォマティクス(bioinformatics)からの各種研究が行
われつつある[トレンズ・イン・バイオテクノロジー(T
rends in Biotechnology)、第14巻、294−298
頁、1996年]。近年、cDNAライブラリーの大規
模シーケンシングが可能になったことで、EST(expre
sssed sequence tag)情報の蓄積などにより、膨大な数
の新規遺伝子、あるいはその候補が見つかってきつつあ
るが、未だ配列情報が断片的で不正確なことも多く、ま
た、現実問題として、現存するcDNA関連の各種公開
データベースが各生物の全発現遺伝子を完全に網羅でき
ていないのが現状である。したがって、これらの中から
さらに全く新しい有用遺伝子産物を探索することは必ず
しも容易ではない。他方、現在、一つの生物のもつ全D
NA、つまりゲノムの構造解析が、細菌類、真菌類(酵
母など)、昆虫、植物では既にそのいくつかの種で終了
し、ヒトのそれもあと数年で完成の見通しが立ってい
る。確かにこれまで数多くの分泌タンパク質あるいは分
泌ペプチドをコードする遺伝子が単離されてきているも
のの、その数は全ゲノムからみればとてもそのすべてを
網羅したとはいえない。そして、インスリン/IGF/リ
ラキシンファミリーに属する新規物質については上述の
ように医療への応用が高く期待できることからその登場
が強く望まれていた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生物
学、医学、獣医学などに利用可能なインスリン/IGF/
リラキシンファミリーに属する新規タンパク、およびそ
の前駆体タンパク質、それらのフラグメント、ならびに
それらをコードするポリヌクレオチドを提供することで
ある。本発明の他の目的は、かかるポリヌクレオチドを
含有する組み換えベクター、該ベクターを含有する形質
転換宿主細胞、かかるポリヌクレオチドを含む遺伝子を
導入されたトランスジェニック動物も提供することであ
る。また、かかるタンパク質またはポリペプチドの製造
方法、かかるタンパク質またはポリペプチドに対する抗
体、アゴニストまたはアンタゴニスト、受容体ならびに
それらの同定方法も提供する。さらに本発明は、かかる
タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アンタ
ゴニスト、抗体、受容体を含有する医薬組成物、疾病の
治療方法および予防方法等を提供することも目的とす
る。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト生体内
で発現している新規な遺伝子を発見することに成功し、
それにコードされるタンパク質がインスリン/IGF/リ
ラキシンファミリーに属する新しい分泌性生体機能調節
タンパク質であることを見出した。更に本発明者らは、
鋭意研究を重ねた結果、新規ヒト型分泌性生体機能調節
タンパク質に続いて、新規ラット型、該ラット型バリア
ント、マウス型およびブタ型分泌性生体機能調節タンパ
ク質を見出した。本発明者らは、これらの知見に基づい
て、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至っ
た。
【0005】すなわち、本発明は、(1)配列番号:7
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミド、も
しくはそのエステルまたはその塩、(2)実質的に同一
のアミノ酸配列が配列番号:19または配列番号:47
で表されるアミノ酸配列である上記(1)記載のポリペ
プチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその
塩、(3)配列番号:8で表されるアミノ酸配列と同一
もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその
塩、(4)実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号:2
1または配列番号:49で表されるアミノ酸配列である
上記(3)記載のポリペプチド、そのアミド、もしくは
そのエステルまたはその塩、(5)配列番号:7で表さ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列および配列番号:8で表されるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記
(1)または上記(3)記載のポリペプチド、そのアミ
ド、もしくはそのエステルまたはその塩、(6)配列番
号:7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミ
ドまたはそのエステルおよび配列番号:8で表されるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するポリペプチド、そのアミドまたはそのエステ
ルがジスルフィド結合で結合しているポリペプチド、そ
のアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
【0006】(7)配列番号:7で表されるアミノ酸配
列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列が配列番
号:19または配列番号:47で表されるアミノ酸配列
であり、配列番号:8で表されるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号:21ま
たは配列番号:49で表されるアミノ酸配列である上記
(5)または上記(6)記載のポリペプチド、そのアミ
ド、もしくはそのエステルまたはその塩、(8)上記
(1)または上記(3)記載のポリペプチドをコードす
るDNAを含有するDNA、(9)配列番号:3で表さ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含有する上記(1)または上記(3)記載のポ
リペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたは
その塩、(10)実質的に同一のアミノ酸配列が配列番
号:17、配列番号:23、配列番号:45または配列
番号:51で表されるアミノ酸配列である上記(9)記
載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステル
またはその塩、(11)上記(9)記載のポリペプチド
をコードするDNAを含有する上記(8)記載のDN
A、(12)配列番号:12、配列番号:18、配列番
号:24、配列番号:46または配列番号:52で表さ
れる塩基配列を有する上記(10)記載のDNA、(1
3)上記(8)記載のDNAを含有する組換えベクタ
ー、(14)上記(13)記載の組換えベクターで形質
転換された形質転換体、(15)上記(14)記載の形
質転換体を培養し、上記(1)、上記(3)または上記
(6)記載のポリペプチドを生成せしめることを特徴と
する上記(1)、上記(3)または上記(6)記載のポ
リペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたは
その塩の製造法、(16)上記(1)、上記(3)また
は上記(6)記載のポリペプチド、そのアミド、もしく
はそのエステルまたはその塩に対する抗体、(17)上
記(1)、上記(3)または上記(6)記載のポリペプ
チド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩
を用いることを特徴とする上記(1)、上記(3)また
は上記(6)記載のポリペプチド、そのアミド、もしく
はそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害す
る化合物またはその塩のスクリーニング方法、(18)
上記(1)、上記(3)または上記(6)記載のポリペ
プチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその
塩を含有してなる上記(1)、上記(3)または上記
(6)記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはその
エステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合
物またはその塩のスクリーニング用キット、
【0007】(19)上記(17)記載のスクリーニン
グ方法または上記(18)記載のスクリーニング用キッ
トを用いて得られる、上記(1)、上記(3)または上
記(6)記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそ
のエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化
合物またはその塩、(20)上記(17)記載のスクリ
ーニング方法または上記(18)記載のスクリーニング
用キットを用いて得られる上記(1)、上記(3)また
は上記(6)記載のポリペプチド、そのアミド、もしく
はそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害す
る化合物またはその塩を含有してなる医薬、(21)上
記(1)、上記(3)または上記(6)記載のポリペプ
チド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩
を含有してなる医薬、(22)上記(16)記載の抗体
を含有してなる医薬、(23)上記(1)、上記
(3)または上記(6)記載のポリペプチド、そのアミ
ド、もしくはそのエステルまたはその塩、上記(1
9)記載の化合物またはその塩、または上記(16)
記載の抗体を含有してなる代謝調節異常、組織の成長・
増殖・分化阻害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成
異常、組織の線維化、循環器障害、内分泌障害、体液バ
ランス異常、中枢性疾患、免疫系疾患、血管新生障害の
予防・治療剤、(24)肝硬変・肺線維症、強皮症、腎
線維症または末梢動脈疾患の予防・治療剤である上記
(23)記載の剤、(25)上記(16)記載の抗体を
含有してなる診断剤、(26)代謝調節異常、組織の成
長・増殖・分化阻害、生殖機能の機能低下、結合組織の
形成異常、組織の線維化、循環器障害、内分泌障害、体
液バランス異常、中枢性疾患、免疫系疾患、血管新生障
害の予防・治療作用を有する医薬を製造するための上
記(1)、上記(3)または上記(6)記載のポリペプ
チド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその
塩、上記(17)記載のスクリーニング方法または上
記(18)記載のスクリーニング用キットを用いて得ら
れる上記(1)、上記(3)または上記(6)記載のポ
リペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたは
その塩の活性を促進または阻害する化合物またはその
塩、または上記(16)記載の抗体の使用、および
(27)上記(1)、上記(3)または上記(6)記
載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステル
またはその塩、上記(17)記載のスクリーニング方
法または上記(18)記載のスクリーニング用キットを
用いて得られる上記(1)、上記(3)または上記
(6)記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはその
エステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合
物またはその塩、または上記(16)記載の抗体を哺
乳動物に投与することを特徴とする代謝調節異常、組織
の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機能低下、結合組
織の形成異常、組織の線維化、循環器障害、内分泌障
害、体液バランス異常、中枢性疾患、免疫系疾患、血管
新生障害の予防・治療方法などを提供するものである。
さらに本発明のDNA、およびポリペプチド、そのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩等は、分子量マー
カー、組織マーカー、染色体マッピング、遺伝病の同
定、プライマー、プローブの設計等の基礎研究に利用で
きる。
【0008】
【発明の実施の形態】本発明の配列番号:7または配列
番号:8で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドは(以下、
配列番号:7または配列番号:8で表されるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
ポリペプチドを総称して本発明のポリペプチドと称する
こともある)、ヒトや温血動物(例えば、モルモット、
ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サル等)の細胞(例えば、肝細胞、脾細胞、神経細
胞、内分泌細胞、神経内分泌細胞、グリア細胞、膵臓β
細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細
胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維
細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファー
ジ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細
胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞)、巨
核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細
胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の
前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等)もしくはそれら
の細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部
位(例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床
下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵
臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血
管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸
(精巣)、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋
等に由来するポリペプチドであってもよく、組換えポリ
ペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであっても
よい。また、本発明のポリペプチドがシグナルペプチド
を有している場合は、ポリペプチドを効率よく細胞外に
分泌させることができる。配列番号:7または配列番
号:8で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列としては、配列番号:7または配列番号:8で表
されるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60
%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましく
は約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好
ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列等
が挙げられる。配列番号:3で表されるアミノ酸配列
は、配列番号:7で表されるアミノ酸配列および配列番
号:8で表されるアミノ酸配列の両方を含有する。配列
番号:3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列としては、配列番号:3で表されるアミノ酸配
列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好
ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、
特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%
以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
【0009】本発明の配列番号:7または配列番号:8
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列
番号:7または配列番号:8で表されるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:7ま
たは配列番号:8で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチド
等が好ましい。配列番号:7で表されるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列として、より具体的には、
例えば配列番号:19または配列番号:47で表される
アミノ酸配列などがあげられる。また、配列番号:8で
表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と
して、より具体的には、例えば配列番号:21または配
列番号:49で表されるアミノ酸配列などがあげられ
る。また、配列番号:3で表されるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとして
は、例えば、前記の配列番号:3で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:
3で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実
質的に同質の性質を有するポリペプチド等が好ましい。
配列番号:3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列として、より具体的には、例えば配列番
号:17、配列番号:23、配列番号:45または配列
番号:51で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
実質的に同質の性質としては、例えば、抗原性や、分泌
され液性因子として作用すること、細胞内サイクリック
AMP産生促進作用等が挙げられる。実質的に同質とは、
それらの性質が定性的に同質であることを示す。したが
って、分泌作用や溶解度等や生理作用の性質が同等
(例、約0.1〜100倍、好ましくは約0.5〜10
倍、より好ましくは0.5〜2倍)であることが好まし
いが、これらの性質の程度、ポリペプチドの分子量等の
量的要素は異なっていてもよい。また、配列番号:7、
配列番号:8または配列番号:3で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドとしてより具体的には、例えば、配列番号:7、配
列番号:8または配列番号:3で表されるアミノ酸配列
中の1または2個以上(好ましくは、1〜30個程度、
好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜
5)個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号:7、配列番号:8または配列番号:3で表されるア
ミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、1〜30
個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは
数(1〜5)個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号:7、配列番号:8または配列番号:3で表
されるアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、
1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好
ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が挿入されたアミ
ノ酸配列、配列番号:7、配列番号:8または配列番
号:3で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上
(好ましくは、1〜30個程度、好ましくは1〜10個
程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれ
らを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチド
等のいわゆるムテインも含まれる。
【0010】上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失ま
たは置換されている場合、その挿入、欠失または置換の
位置としては、特に限定されないが、配列番号:7、配
列番号:8または配列番号:3のそれぞれの配列番号で
表されるアミノ酸配列の中のシステイン残基以外のアミ
ノ酸残基が挙げられる。配列番号:7で表されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列およ
び配列番号:8で表されるアミノ酸配列と同一もしくは
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド
は、配列番号:7で表されるアミノ酸配列および配列番
号:8で表されるアミノ酸配列の両方を含有する一本鎖
ポリペプチドに加えて、配列番号:7で表されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するポリペプチド(以下、本明細書において、A鎖と
略称する場合がある)と配列番号:8で表されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するポリペプチド(以下、本明細書において、B鎖と
略称する場合がある)の2本のポリペプチド鎖からなる
ポリペプチド(以下、本明細書において、2本鎖ポリペ
プチドと略称する場合がある)を含む。2本鎖ポリペプ
チドとして、より具体的には、配列番号:7で表される
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列および配列番号:8で表されるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列がジスルフィド結合
で結合しているポリペプチドのことを意味し、A鎖及び
B鎖内のシステイン残基が分子間及び分子内でジスルフ
ィド結合を形成しているポリペプチドを示す。システイ
ン残基同士の結合の組み合わせとしては、例えば特にA
鎖のCys11(A鎖のCys11とは、配列番号:7、配列番
号:19または配列番号:47で表されるアミノ酸配列
のN末端から第11番目のシステイン残基を示す。以下
同様)とB鎖のCys10(B鎖のCys10とは、配列番号:
8、配列番号:21または配列番号:49で表されるア
ミノ酸配列のN末端から第10番目のシステイン残基を
示す。以下同様)が結合し、かつA鎖のCys24とB鎖のC
ys22が結合し、さらにA鎖のCys10とA鎖のCys15が結合
していることが望ましい。配列番号:3で表されるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するポリペプチド(以下、単に前駆体タンパク質と
称する場合がある)として好ましいものは、 配列番
号:3の場合、N末端から第26番目(Arg)〜第5
2番目(Trp)に配列番号:8で表されるアミノ酸配
列(即ち、B鎖をコードするアミノ酸配列)を含有し、
配列番号:3のN末端から第119番目(Asp)〜第
142番目(Cys)に配列番号:7で表されるアミノ
酸配列(即ち、A鎖をコードするアミノ酸配列)を含有
しており、 配列番号:17の場合、N末端から第25番目(A
rg)〜第51番目(Trp)に配列番号:21で表さ
れるアミノ酸配列(即ち、B鎖をコードするアミノ酸配
列)を含有し、配列番号:17のN末端から第118番
目(Asp)〜第141番目(Cys)に配列番号:1
9で表されるアミノ酸配列(即ち、A鎖をコードするア
ミノ酸配列)を含有しており、 配列番号:23の場合、N末端から第24番目(A
rg)〜第50番目(Trp)に配列番号:21で表さ
れるアミノ酸配列(即ち、B鎖をコードするアミノ酸配
列)を含有し、配列番号:23のN末端から第117番
目(Asp)〜第140番目(Cys)に配列番号:1
9で表されるアミノ酸配列(即ち、A鎖をコードするア
ミノ酸配列)を含有しており、 配列番号:45の場合、N末端から第27番目(A
rg)〜第53番目(Trp)に配列番号:49で表さ
れるアミノ酸配列(即ち、B鎖をコードするアミノ酸配
列)を含有し、配列番号:45のN末端から第117番
目(Asp)〜第140番目(Cys)に配列番号:4
7で表されるアミノ酸配列(即ち、A鎖をコードするア
ミノ酸配列)を含有しており、 配列番号:51の場合、N末端から第24番目(A
rg)〜第50番目(Trp)に配列番号:21で表さ
れるアミノ酸配列(即ち、B鎖をコードするアミノ酸配
列)を含有し、配列番号:51のN末端から第151番
目(Asp)〜第174番目(Cys)に配列番号:1
9で表されるアミノ酸配列(即ち、A鎖をコードするア
ミノ酸配列)を含有しており、A鎖、B鎖、2本鎖ポリ
ペプチドの前駆体としての性質を有する。
【0011】本発明のポリペプチド(以下、A鎖、B
鎖、2本鎖ポリペプチド、前駆体タンパク質を総称して
「本発明のポリペプチド」と称する場合がある)は、ペ
プチド標記の慣例に従って左端がN末端(アミノ末
端)、右端がC末端(カルボキシル末端)である。配列
番号:3、配列番号:7および配列番号:8で表される
アミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、
本発明のポリペプチドは、C末端が通常カルボキシル基
(−COOH)またはカルボキシレート(−COO-)で
あるが、C末端がアミド(−CONH2)またはエステ
ル(−COOR)であってもよい。ここでエステルにお
けるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピ
ル、イソプロピルもしくはn−ブチル等のC1-6アルキ
ル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のC
3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチ
ル等のC6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチ
ル等のフェニル−C 1-2アルキル基もしくはα−ナフチ
ルメチル等のα−ナフチル−C1-2アルキル基等のC
7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用さ
れるピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明
のポリペプチドがC末端以外にカルボキシル基(または
カルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基
がアミド化またはエステル化されているものも本発明の
ポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとして
は、例えば上記したC末端のエステル等が用いられる。
さらに、本発明のポリペプチドには、N末端のアミノ酸
残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基(例え
ば、ホルミル基、アセチル基等のC1-6アルカノイル等
のC1-6アシル基等)で保護されているもの、生体内で
切断されて生成するN末端のグルタミン残基がピログル
タミン酸化したもの、C末端のアミノ酸残基がホモセリ
ンやホモセリンラクトンであるものや、分子内のアミノ
酸の側鎖上の置換基(例えば−OH、−SH、アミノ
基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等)
が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基等の
1- 6アルカノイル基等のC1-6アシル基等)で保護され
ているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ポリペ
プチド等の複合ポリペプチド等も含まれる。また、本発
明のポリペプチドは一量体であってもよく、例えば、二
量体、四量体、六量体、八量体などの多量体であっても
よい。本発明のポリペプチドまたはその塩としては、生
理学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸)や塩基
(例、アルカリ金属塩)等との塩が用いられ、とりわけ
生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩
としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭
化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢
酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハ
ク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、
メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩等が用
いられる。
【0012】本発明のポリペプチドまたはその塩として
は、生理学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸)や
塩基(例、アルカリ金属塩)等との塩が用いられ、とり
わけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様
な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例え
ば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安
息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との
塩等が用いられる。本発明のポリペプチドまたはその塩
は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体
公知のポリペプチド(タンパク質)の精製方法によって
製造することもできるし、後述するポリペプチドをコー
ドするDNAを含有する形質転換体を培養することによ
っても製造することができる。また、後述のペプチド合
成法に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の
組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組
織または細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行
い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせ
ることにより精製単離することができる。本発明のポリ
ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成に
は、通常市販のポリペプチド(タンパク質)合成用樹脂
を用いることができる。そのような樹脂としては、例え
ば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズ
ヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4−ベンジル
オキシベンジルアルコール樹脂、4−メチルベンズヒド
リルアミン樹脂、PAM樹脂、4−ヒドロキシメチルメチ
ルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミ
ド樹脂、4−(2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシ
メチル)フェノキシ樹脂、4−(2',4'-ジメトキシフェ
ニル−Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂等を挙げるこ
とができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側
鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリ
ペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従
い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペ
プチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに
高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施
し、目的のポリペプチドまたはそれらのアミド体を取得
する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペ
プチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることが
できるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイ
ミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイ
ミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル)カル
ボジイミド等が用いられる。これらによる活性化にはラ
セミ化抑制添加剤(例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護
アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物
またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあら
かじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加
することができる。保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮
合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド(タンパク
質)縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から
適宜選択されうる。例えば、N,N−ジメチルホルムア
ミド,N,N−ジメチルアセトアミド,N−メチルピロ
リドン等の酸アミド類、塩化メチレン,クロロホルム等
のハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノール等の
アルコール類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド
類、ピリジン,ジオキサン,テトラヒドロフラン等のエ
ーテル類、アセトニトリル,プロピオニトリル等のニト
リル類、酢酸メチル,酢酸エチル等のエステル類あるい
はこれらの適宜の混合物等が用いられる。反応温度はポ
リペプチド(タンパク質)結合形成反応に使用され得る
ことが知られている範囲から適宜選択され、通常約−2
0〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたア
ミノ酸誘導体は通常1.5〜4倍過剰で用いられる。ニ
ンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な
場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返
すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰
り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸
またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸を
アセチル化することによって、後の反応に影響を与えな
いようにすることができる。原料のアミノ基の保護基と
しては、例えば、Z、Boc、t−ペンチルオキシカルボ
ニル、イソボルニルオキシカルボニル、4−メトキシベ
ンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオ
キシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、
ホルミル、2−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニ
ルホスフィノチオイル、Fmoc等が用いられる。カルボキ
シル基は、例えば、アルキルエステル化(例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、t−ブチル、シクロペ
ンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオク
チル、2−アダマンチル等の直鎖状、分枝状もしくは環
状アルキルエステル化)、アラルキルエステル化(例え
ば、ベンジルエステル、4−ニトロベンジルエステル、
4−メトキシベンジルエステル、4−クロロベンジルエ
ステル、ベンズヒドリルエステル化)、フェナシルエス
テル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、t−
ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド
化等によって保護することができる。セリンの水酸基
は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護
することができる。このエステル化に適する基として
は、例えば、アセチル基等の低級(C1-6)アルカノイ
ル基、ベンゾイル基等のアロイル基、ベンジルオキシカ
ルボニル基、エトキシカルボニル基等の炭酸から誘導さ
れる基等が用いられる。また、エーテル化に適する基と
しては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル
基、t-ブチル基等である。チロシンのフェノール性水酸
基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、2−ニト
ロベンジル、Br-Z、t−ブチル等が用いられる。ヒスチ
ジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、
4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DN
P、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmoc等が用
いられる。
【0013】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール(例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt)とのエステル〕等が用いられる。原料
のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応
するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去(脱離)
方法としては、例えば、Pd−黒あるいはPd-炭素等
の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、
無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタ
ンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合
液等による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、ト
リエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン等による塩基
処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元等も
用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−
20〜40℃の温度で行われるが、酸処理においては、
例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メ
タクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、
1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオール等のよう
なカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジ
ンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロ
フェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリ
プトファンのインドール保護基として用いられるホルミ
ル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオ
ール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化
ナトリウム溶液、希アンモニア等によるアルカリ処理に
よっても除去される。原料の反応に関与すべきでない官
能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、
反応に関与する官能基の活性化等は公知の基または公知
の手段から適宜選択しうる。ポリペプチドのアミド体を
得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端
アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した
後、アミノ基側にペプチド(ポリペプチド)鎖を所望の
鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα−アミ
ノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとC末端のカル
ボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製
造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中
で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様で
ある。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した
後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗
ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチド
は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍
結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得る
ことができる。ポリペプチドのエステル体を得るには、
例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基
を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした
後、ポリペプチドのアミド体と同様にして、所望のポリ
ペプチドのエステル体を得ることができる。本発明のポ
リペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成
法に従って製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明の部分ペプチドを構成し
得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合
させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離する
ことにより目的のペプチドを製造することができる。公
知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の
〜に記載された方法が挙げられる。
【0014】M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペ
プチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscien
ce Publishers, New York (1966年); SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年); 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
(1975年); 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年); 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合
成、広川書店。 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶等を組み合わせて本発明のポリペプチドポリペ
プチドを精製単離することができる。上記方法で得られ
るポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって適当な塩に変換すること
ができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変
換することができる。本発明のポリペプチドをコードす
るDNAとしては、前述した本発明のポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するものであれ
ばいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、
前記した細胞・組織由来のcDNA、合成DNAのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
等いずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よ
りtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用
いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Rea
ction(以下、RT-PCR法と略称する)によって増幅
することもできる。本発明のポリペプチドをコードする
DNAとしては、例えば、配列番号:12、配列番号:
15、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:2
0、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:2
5、配列番号:26、配列番号:46、配列番号:4
8、配列番号:50または配列番号:52で表される塩
基配列を含有するDNA、または配列番号:12、配列
番号:15、配列番号:16、配列番号:18、配列番
号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番
号:25、配列番号:26、配列番号:46、配列番
号:48、配列番号:50または配列番号:52で表さ
れる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと
実質的に同質の性質(例、生物活性、免疫原性、分泌さ
れ液性因子として作用すること、細胞内サイクリックAM
P産生促進作用等)を有するポリペプチドをコードする
DNA等を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質
の性質を有するポリペプチドをコードするDNAであれ
ば何れのものでもよい。配列番号:12、配列番号:1
5、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:2
0、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:2
5、配列番号:26、配列番号:46、配列番号:4
8、配列番号:50または配列番号:52で表される塩
基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズできるDNAとしては、例えば、配列番号:12、配
列番号:15、配列番号:16、配列番号:18、配列
番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番
号:25、配列番号:26、配列番号:46、配列番
号:48、配列番号:50または配列番号:52で表さ
れる塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以
上、さらに好ましくは約80%以上の相同性を有する塩
基配列を含有するDNA等が用いられる。また、配列番
号:12、配列番号:15、配列番号:16、配列番
号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番
号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番
号:46、配列番号:48、配列番号:50または配列
番号:52で表される塩基配列とハイストリンジェント
な条件下でハイブリダイズできるDNAとして、本発明
のポリペプチドと実質的に同質の性質(例、生物活性、
免疫原性、分泌され液性因子として作用すること、細胞
内サイクリックAMP産生促進作用等)有するポリペプチ
ドをコードするDNA等を有し、本発明のポリペプチド
と実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードす
るDNA等があげられる。ハイブリダイゼーションは、
自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モ
レキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd
(J. Sambrook etal., Cold Spring Harbor Lab. Pres
s, 1989)に記載の方法等に従って行うことができる。
また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用
説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好
ましくはハイストリンジェントな条件に従って行うこと
ができる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、
ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19
〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約6
0〜65℃の条件を示す。本発明のポリペプチドをコー
ドするDNAとしては、配列番号:12、配列番号:1
5、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:2
0、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:2
5、配列番号:26、配列番号:46、配列番号:4
8、配列番号:50または配列番号:52で表される塩
基配列を有するDNA等が用いられる。
【0015】より具体的には、(I) A鎖(ヒト型;配
列番号:7で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チド)をコードするDNAとしては、例えば、配列番
号:15で表される塩基配列を有するDNAを含有する
DNAなどが、(II) A鎖(ラット型;配列番号:19
で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド)をコ
ードするDNAとしては、例えば、配列番号:20で表
される塩基配列を有するDNAを含有するDNAなど
が、(III) A鎖(マウス型;配列番号:19で表され
るアミノ酸配列を含有するポリペプチド)をコードする
DNAとしては、例えば、配列番号:25で表される塩
基配列を有するDNAを含有するDNAなどが、(IV)
A鎖(ブタ型;配列番号:47で表されるアミノ酸配列
を含有するポリペプチド)をコードするDNAとして
は、例えば、配列番号:48で表される塩基配列を有す
るDNAを含有するDNAなどが、(V) B鎖(ヒト
型;配列番号:8で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチド)をコードするDNAとしては、例えば、配
列番号:16で表される塩基配列を有するDNAを含有
するDNAなどが、(VI) B鎖(ラット型;配列番号:
21で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド)
をコードするDNAとしては、例えば、配列番号:22
で表される塩基配列を有するDNAを含有するDNAな
どが、(VII) B鎖(マウス型;配列番号:21で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチド)をコードす
るDNAとしては、例えば、配列番号:26で表される
塩基配列を有するDNAを含有するDNAなどが、(VII
I) B鎖(ブタ型;配列番号:49で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチド)をコードするDNAとし
ては、例えば、配列番号:50で表される塩基配列を有
するDNAを含有するDNAなどが、(IX) 2本鎖ポリ
ペプチド(ヒト型)および、前駆体タンパク質(ヒト
型;配列番号:3で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチド)をコードするDNAとしては、例えば、配
列番号:12で表される塩基配列を有するDNAを含有
するDNAなどが、(X) 2本鎖ポリペプチド(ラット
型)および、前駆体タンパク質(ラット型;配列番号:
17または配列番号:51で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチド)をコードするDNAとしては、例
えば、配列番号:18または配列番号:52で表される
塩基配列を有するDNAを含有するDNAなどが、(XI)
2本鎖ポリペプチド(マウス型)および、前駆体タン
パク質(マウス型;配列番号:23で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチド)をコードするDNAとし
ては、例えば、配列番号:24で表される塩基配列を有
するDNAを含有するDNAなどが、(XII) 2本鎖ポ
リペプチド(ブタ型)および、前駆体タンパク質(ブタ
型;配列番号:45で表されるアミノ酸配列を含有する
ポリペプチド)をコードするDNAとしては、例えば、
配列番号:46で表される塩基配列を有するDNAを含
有するDNAなどがあげられる。
【0016】本発明のポリペプチドを完全にコードする
DNAのクローニングの手段としては、本発明のポリペ
プチドの部分塩基配列を有する合成DNAプライマーを
用いてPCR法によって増幅するか、または適当なベク
ターに組み込んだDNAを本発明のポリペプチドの一部
あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成D
NAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーション
によって選別することができる。ハイブリダイゼーショ
ンの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング(Mo
lecular Cloning)2nd(J. Sambrook et al., Cold Sp
ring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法等に従っ
て行うことができる。また、市販のライブラリーを使用
する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う
ことができる。DNAの塩基配列の変換は、PCRや公
知のキット、例えば、Mutan(登録商標)-super Expres
s Km(宝酒造(株))、Mutan(登録商標)-K(宝酒造
(株))等を用いて、ODA-LA PCR法やGupped duplex法
やKunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる
方法に従って行うことができる。クローン化されたポリ
ペプチドをコードするDNAは目的によりそのまま、ま
たは所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加
したりして使用することができる。該DNAはその5’
末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また
3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGA
またはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コ
ドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプター
を用いて付加することもできる。本発明のポリペプチド
の発現ベクターは、例えば、(イ)本発明のポリペプチ
ドをコードするDNAから目的とするDNA断片を切り
出し、(ロ)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプ
ロモーターの下流、もしくは適当な保護ペプチドをコー
ドする塩基配列の下流に連結することにより製造するこ
とができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド(例、pBR322,pBR325,pUC12,p
UC13)、枯草菌由来のプラスミド(例、pUB11
0,pTP5,pC194)、酵母由来プラスミド
(例、pSH19,pSH15)、λファージ等のバク
テリオファージ、レトロウイルス,ワクシニアウイル
ス,バキュロウイルス等の動物ウイルス等の他、pA1
−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、
pcDNAI/Neo、pET−1、pET−2、pE
T−3、pET−4、pET−5、pET−11等が用
いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、
遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を
宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、SV4
0プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモー
ター、HSV-TKプロモーター、β-アクチンプロモー
ター等が挙げられる。これらのうち、CMV(サイトメ
ガロウイルス)プロモーター、SRαプロモーター、β
-アクチンプロモーター等を用いるのが好ましい。宿主
がエシェリヒア属菌である場合は、trpプロモータ
ー、lacプロモーター、recAプロモーター、λP
Lプロモーター、lppプロモーター、T7プロモータ
ー等が、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プ
ロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモー
ター等、宿主が酵母である場合は、PHO5プロモータ
ー、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH
プロモーター等が好ましい。宿主が昆虫細胞である場合
は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター等
が好ましい。T7プロモーターの発現系を用いる場合に
はT7プロモーターとしてはT7DNA上で見出されて
いる17種のプロモーター[J. L. Oakleyら, Proc. Nat
l.Acad. Sci, U. S. A, 74: 4266-4270(1977), M. D. R
osa, Cell 16: 815-825 (1979), N. Panayotatosら, Na
ture, 280:35 (1979), J. J. Dunnら, J. Mol. Biol.,
166:477-535 (1983) ]のいずれでもよいがφ10プロモ
ーター[A. H. Rosenbergら, Gene, 56: 125-135 (198
7)]が好ましい。ベクターは上記ベクターにT7プロモ
ーター、T7ターミネーターを組み込んで構築されるの
が好ましく、このようなベクターとしては、pET−
1、pET−2、pET−3、pET−4、pET−
5、pET−11 [A. H. Rosenberg,Gene 56: 125-135
(1987)]などをあげることができる。発現ベクターに
は、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシ
ングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、S
V40複製オリジン(以下、SV40oriと略称する
場合がある)等を含有しているものを用いることができ
る。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元
酵素(以下、dhfrと略称する場合がある)遺伝子
〔メソトレキセート(MTX)耐性〕、アンピシリン耐
性遺伝子(以下、Amprと略称する場合がある)、ネ
オマイシン耐性遺伝子(以下、Neorと略称する場合
がある、Geneticin耐性)等が挙げられる。特に、dh
fr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてd
hfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、組換
え体細胞をチミジンを含まない培地によっても選択でき
る。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列
を、本発明のポリペプチドのN末端側に付加する。宿主
がエシェリヒア属菌である場合は、PhoA・シグナル配
列、OmpA・シグナル配列等が、宿主がバチルス属菌で
ある場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリ
シン・シグナル配列等が、宿主が酵母である場合は、M
Fα・シグナル配列、SUC2・シグナル配列等、宿主
が動物細胞である場合には、インスリン・シグナル配
列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・
シグナル配列等がそれぞれ利用できる。
【0017】このようにして構築された本発明のポリペ
プチドをコードするDNAを含有するベクターを用い
て、形質転換体を製造することができる。宿主として
は、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、
昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒ
ア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ
(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA),60巻,160(1968)〕,JM
103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ,(Nuclei
c Acids Research),9巻,309(1981)〕,JA
221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー(Journal of Molecular Biology)〕,120巻,5
17(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー,41巻,459(196
9)〕,C600〔ジェネティックス(Genetics),3
9巻,440(1954)〕等が用いられる。T7プロモ
ーターの発現系を用いる場合には、その形質転換体の宿
主としては、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子 [F. W. S
tudierら, J. Mol. Biol. 189: 113-130 (1986)]]を組
み込んだ大腸菌株、例えば、MM294、DH−1,C
600,JM109,BL21,あるいはT7 RNA
ポリメラーゼ遺伝子を他のプラスミドと共に組み込んだ
大腸菌株などが用いられる。好ましくはT7 RNAポ
リメラーゼ遺伝子を組み込んだλファージが溶原化した
MM294株、BL21株、およびBL21(DE3)
株等が用いられる。この場合、T7 RNAポリメラーゼ
遺伝子のプロモーターとしては、イソプロピル−1−チ
オ−β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)で発現が誘
導されるlacプロモーターが用いられる。バチルス属菌
としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus s
ubtilis)MI114〔ジーン,24巻,255(198
3)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー(Journal of Biochemistry),95巻,87
(1984)〕等が用いられる。酵母としては、例えば、
サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevi
siae)AH22,AH22R-,NA87−11A,D
KD−5D,20B−12、シゾサッカロマイセス ポ
ンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC191
3,NCYC2036、ピキア パストリス(Pichia p
astoris)KM71等が用いられる。昆虫細胞として
は、例えば、ウイルスがAcNPVの場合は、夜盗蛾の
幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf
細胞)、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Tri
choplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra br
assicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞等
が用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来
株化細胞(Bombyx mori N 細胞;BmN細胞)等が用い
られる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(AT
CC CRL1711)、Sf21細胞(以上、Vaughn, J.L.ら、
イン・ヴィボ(In Vivo),13, 213-217,(1977))等が用
いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用
いられる〔前田ら、ネイチャー(Nature),315巻,
592(1985)〕。動物細胞としては、例えば、サル
細胞COS−7,Vero,チャイニーズハムスター細胞
CHO(以下、CHO細胞と略記),dhfr遺伝子欠
損チャイニーズハムスター細胞CHO(以下、CHO
(dhfr-)細胞と略記),マウスL細胞,マウスA
tT20,マウスミエローマ細胞,ラットGH3,ヒト
FL細胞等が用いられる。
【0018】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),69巻,21
10(1972)やジーン(Gene),17巻,107(1
982)等に記載の方法に従って行うことができる。バ
チルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular
& General Genetics),168巻,111(1979)
等に記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質
転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロ
ジー(Methods in Enzymology),194巻,182−
187(1991)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci.USA),
75巻,1929(1978)等に記載の方法に従って
行うことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換する
には、例えば、バイオ/テクノロジー(Bio/Technolog
y),6, 47-55(1988))等に記載の方法に従って行うこと
ができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞
工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール.263−2
67(1995)(秀潤社発行)、ヴィロロジー(Viro
logy),52巻,456(1973)に記載の方法に従っ
て行うことができる。このようにして、ポリペプチドを
コードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換さ
れた形質転換体を得ることができる。宿主がエシェリヒ
ア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、
培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、
その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素
源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源として
は、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、
ショ糖等、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カ
ゼイン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液等の無機または有機物質、無機物としては、例え
ば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マ
グネシウム等が挙げられる。また、酵母エキス、ビタミ
ン類、生長促進因子等を添加してもよい。培地のpHは
約5〜8が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の
培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含む
M9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エク
スペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス
(Journal of Experiments in Molecular Genetics),
431−433,Cold Spring Harbor Laboratory, New
York1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモ
ーターを効率よく働かせるために、例えば、3β−イン
ドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜4
3℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を
加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養
は通常約30〜40℃で約6〜24時間行い、必要によ
り通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である
形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バー
クホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77巻, 4
505 (1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するS
D培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA),81巻,5330(1984)〕が挙げられ
る。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培
養は通常約20〜35℃で約24〜72時間行い、必要
に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆
虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grac
e's Insect Medium(Grace, T.C.C.,ネイチャー(Natur
e),195,788(1962))に非動化した10%ウシ血清等の
添加物を適宜加えたもの等が用いられる。培地のpHは
約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常
約27℃で約3〜5日間行い、必要に応じて通気や撹拌
を加える。
【0019】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば、約5〜20%の胎児牛血
清を含むMEM培地〔サイエンス(Science),122
巻,501(1952)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー
(Virology),8巻,396(1959)〕,RPMI
1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション(The Journal of the Ame
rican Medical Association)199巻,519(196
7)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
(Proceeding ofthe Society for the Biological Medi
cine),73巻,1(1950)〕等が用いられる。pH
は約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30〜4
0℃で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌
を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細
胞膜または細胞外に本発明のポリペプチドを生成せしめ
ることができる。上記培養物から本発明のポリペプチド
を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うこ
とができる。本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは
細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌
体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、
超音波、リゾチームおよび/または凍結融解等によって
菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によ
りポリペプチドの粗抽出液を得る方法等が適宜用いられ
る。組換え体が産生するポリペプチドが菌体中で封入体
を形成する場合には、遠心分離により集菌した後、超音
波等で菌体を破砕して得られた封入体を変性剤(2−8
M 塩酸グアニジン、5−9M 尿素等)を用いて可溶化
することによってポリペプチドを抽出することができ
る。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培
養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上
清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた
培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの
精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて
行うことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析
法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利
用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマ
トグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電
気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が用いられ
る。かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた
場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に
よって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合
には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、
遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組
換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後
に適当な蛋白修飾酵素または蛋白分解酵素等を作用させ
ること、または化学反応により、任意に修飾を加えた
り、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。こ
れらの酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプ
シン、アルギニルエンドペプチダーゼ、フリン、プロホ
ルモンコンベルターゼ1(PC1)、プロホルモンコンベ
ルターゼ2(PC2)カルボキシぺプチダーゼB、プロテイ
ンキナーゼ、グリコシダーゼ等が用いられる。 化学反
応としては、例えば臭化シアン(CNBr)を用いた切断反
応などがあげられる。抽出した目的蛋白質または分離精
製した目的蛋白質は必要により蛋白質のリフォールディ
ングに付される。リフォールディングは、例えば「蛋白
質のフォールディング」(R.H.Pain編、245-279 (199
5)、シュプリンガーフェアラーク東京)に記載された公
知の方法あるいはそれに準じる方法により実施すること
が可能である。抽出剤(例えば、グアニジン塩酸塩、尿
素のようなカオトロピック可溶化剤、n-ラウリルメチ
ルグリシン、SDSのような界面活性剤など)を含まな
い、もしくは低濃度の抽出剤を含む緩衝液で1段階もし
くは多段階での希釈や半透膜を用いた透析、ゲル濾過を
用いた緩衝液の置換等により行うことができる。この場
合、目的蛋白質のアグリゲーションを防止するために、
アルギニン、ポリエチレングリコール、中性界面活性剤
等を添加することができる。蛋白質のジスルフィド結合
を形成させるために空気酸化したり、酸化還元緩衝液系
等を添加することができる。酸化還元緩衝液にはグルタ
チオン、システイン、ジチオスレイトール、2−メルカ
プトエタノール、またはシステアミンをベースとしたも
のがあげられる。
【0020】また、本発明のポリペプチドであるA鎖及
びB鎖を別々に生産した後、両者をジスルフィド結合で
連結させることができる。例えば、A鎖とB鎖をコード
するDNA断片をそれぞれlacZ(β-ガラクトシダー
ゼ)遺伝子に繋げ、大腸菌を宿主に用いてβ-ガラクト
シダーゼ+A鎖と、β-ガラクトシダーゼ+B鎖の融合
タンパク質を作製した後、臭化シアン処理や酵素処理で
A鎖とB鎖を融合タンパク質から切り出すことができ
る。切り出されたA鎖とB鎖を還元状態で混合し、徐々
に酸化させることによってA鎖とB鎖がジスルフィド結
合で連結したタンパクに変換させることができる。A鎖
とB鎖の連結状態は、例えばA鎖のCys11とB鎖のCys10
が結合し、かつA鎖のCys24とB鎖のCys22が結合し、さ
らにA鎖のCys10とA鎖のCys15が結合していることが望
ましい。このときの変換条件としては、例えば、インス
リン分子の製造法〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ
・ユーエスエー(Proc. Natl.Acad. Sci. USA),7
6巻,106(1979)〕に準じて行うことができる。
かくして生成する本発明のポリペプチドまたはその塩の
存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイや
ウエスタンブロット解析等で測定することができる。本
発明のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステ
ルまたはその塩(以下、単に本発明のポリペプチドと称
する場合がある)に対する抗体は、本発明のポリペプチ
ドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体の何れであってもよい。
【0021】本発明のポリペプチドに対する抗体は、本
発明のポリペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体
または抗血清の製造法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕(a)モノクロナール抗
体産生細胞の作製 本発明のポリペプチドは、温血動物に対して投与により
抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤
とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高める
ため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイント
アジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎
に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温
血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモ
ット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げ
られるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で
免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種
または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製すること
ができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の
標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体
に結合した標識剤の活性を測定することにより行うこと
ができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーと
ミルスタインの方法〔ネイチャー(Nature)、256、495
(1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤とし
ては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)やセ
ンダイウィルス等が挙げられるが、好ましくはPEGが
用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、NS−1、
P3U1、SP2/0、AP−1等の温血動物の骨髄腫
細胞が挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。
用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数
との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PE
G(好ましくはPEG1000〜PEG6000)が1
0〜80%程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好
ましくは約30〜37℃で約1〜10分間インキュベー
トすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングに
は種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド抗
原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相(例、マ
イクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添加し、
次に放射性物質や酵素等で標識した抗免疫グロブリン抗
体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウ
ス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテイン
Aを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出す
る方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸
着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射
性物質や酵素等で標識したポリペプチドを加え、固相に
結合したモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げら
れる。
【0022】モノクローナル抗体の選別は、自体公知あ
るいはそれに準じる方法に従って行うことができる。通
常HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン)を添加した動物細胞用培地で行うことができる。選
別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育で
きるものならばどのような培地を用いても良い。例え
ば、約1〜20%、好ましくは約10〜20%の牛胎児
血清を含むRPMI 1640培地、約1〜10%の牛
胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業(株))ある
いはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−10
1、日水製薬(株))等を用いることができる。培養温
度は、通常約20〜40℃、好ましくは約37℃であ
る。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間
〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行うこ
とができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記
の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 (b)モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインAあるいはプロ
テインG等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合
を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行うこ
とができる。 〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル
抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従っ
て製造することができる。例えば、免疫抗原(本発明の
ポリペプチド抗原)自体、あるいはそれとキャリアー蛋
白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の
製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から
本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、
抗体の分離精製を行うことにより製造することができ
る。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキ
ャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の
種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリ
アーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率
良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させ
てもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイロ
グロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対
し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプ
ルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリア
ーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができ
るが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミ
ド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有
する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、
温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あ
るいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して
抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバント
や不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投
与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程
度行われる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫
された温血動物の血液、腹水等、好ましくは血液から採
取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価
の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして
測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記の
モノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリン
の分離精製法に従って行うことができる。また、本発明
のポリぺプチドを用いて、Nat. Biotechnol,14,845‐
851.(1996)、Nat Genet.15,146‐156.(1997)、PN
AS,97(2),722−727 (2000)等に記載の方法に準じて
ヒト化抗体を作製することも可能である。本発明のポリ
ペプチドをコードするDNA(以下、本発明のDNAと
称することもある)に相補的な、または実質的に相補的
な塩基配列を有するアンチセンスDNAとしては、本発
明のDNAに相補的な、または実質的に相補的な塩基配
列を有し、該DNAの発現を抑制し得る作用を有するも
のであれば、いずれのアンチセンスDNAであってもよ
い。
【0023】本発明のDNAに実質的に相補的な塩基配
列とは、例えば、本発明のDNAに相補的な塩基配列
(すなわち、本発明のDNAの相補鎖)の全塩基配列あ
るいは部分塩基配列と約70%以上、好ましくは約80
%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは
約95%以上の相同性を有する塩基配列等が挙げられ
る。特に、本発明のDNAの相補鎖の全塩基配列うち、
本発明のポリペプチドのN末端部位をコードする部分の
塩基配列(例えば、開始コドン付近の塩基配列等)の相
補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好
ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の
相同性を有するアンチセンスDNAが好適である。これ
らのアンチセンスDNAは、公知のDNA合成装置等を
用いて製造することができる。本発明のポリペプチドが
シグナルペプチドを有する場合は、細胞外に効率よく分
泌され、液性因子として、生体機能調節などの重要な生
物活性を発揮する。以下に、本発明のポリペプチド、本
発明のDNA、本発明のポリペプチドまたはその塩に対
する抗体(以下、本発明の抗体と略記する場合があ
る)、およびアンチセンスDNAの用途を説明する。 (1)本発明のポリペプチドは、組織特異的に発現して
いるため、組織マーカーとして使用することができる。
すなわち組織の分化、病態、癌の転移等の検出のための
マーカーとして有用である。また、対応する受容体、結
合ポリペプチド等の分取にも利用できる。さらに、自体
公知のハイスループットスクリーニングのためのパネル
にして、生物活性を調べるのに利用できる。 (2)本発明のポリペプチドが関与する各種疾病の治療
・予防剤 本発明のポリペプチドは、生体内で液性因子として存在
し、後述の実施例に記載のとおり、MMP−1(マトリ
ックスメタロプロテイナーゼ−1)やVEGF(血管内
皮細胞増殖因子)の発現促進作用を有するため、本発明
のポリペプチド、または本発明のDNA等に異常があっ
たり、欠損している場合あるいは発現量が異常に減少ま
たは亢進している場合、例えば、炭水化物などのエネル
ギー源の代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例え
ば糖尿病、肥満症など)、組織の成長・増殖・分化阻
害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成異常(例えば
強皮症など)、組織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維
症、強皮症または腎線維症など)、循環器障害(末梢動
脈疾患、心筋梗塞または心不全など)、動脈硬化、内分
泌障害、体液バランス異常、中枢性疾患、免疫系疾患
(例えばアレルギー、炎症、自己免疫疾患等)、血管新
生障害等の種々の疾病が発症する。したがって、本発明
のポリペプチドおよび本発明のDNAは、例えば、炭水
化物などのエネルギー源の代謝調節(糖代謝、脂質代謝
など)異常(例えば糖尿病、肥満症など)、組織の成長
・増殖・分化阻害、生殖機能の機能低下、結合組織の形
成異常(例えば強皮症など)、組織の線維化(例えば、
肝硬変・肺線維症、強皮症または腎線維症など)、循環
器障害(末梢動脈疾患、心筋梗塞または心不全など)、
動脈硬化、内分泌障害、体液バランス異常、中枢性疾
患、免疫系疾患(例えばアレルギー、炎症、自己免疫疾
患等)、血管新生障害等の種々の疾病の治療・予防剤等
の医薬として使用することができる。また、本発明のポ
リペプチドは、他のインスリン/IGF/リラキシンファ
ミリーポリペプチドとファミリーを形成するため、他の
ファミリーのポリペプチド、またはそのDNA等に異常
があったり、欠損している場合あるいは発現量が異常に
減少または亢進している場合においても、他のファミリ
ーと相補的に作用することにより、さらには、特に発現
量に異常が認められない場合においても、本発明のポリ
ペプチド単独の薬理作用により、炭水化物などのエネル
ギー源の代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例え
ば糖尿病、肥満症など)、組織の成長・増殖・分化阻
害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成異常(例えば
強皮症など)、組織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維
症、強皮症または腎線維症など)、循環器障害(末梢動
脈疾患、心筋梗塞または心不全など)、内分泌障害、体
液バランス異常、中枢性疾患、アレルギーなどの免疫系
疾患、血管新生障害等の種々の疾病の治療・予防剤等の
医薬として使用することができる。さらに、本発明のポ
リペプチドは、上述のとおり、1組のA鎖内ジスルフィ
ド結合と2組のA鎖とB鎖間ジスルフィド結合より形成さ
れるものが好ましいが、2組のジスルフィド結合を有す
るA鎖単独あるいは1組のジスルフィド結合を有するB鎖
単独の分子種も存在し得る。後者のA鎖あるいはB鎖単独
の分子種も代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例
えば糖尿病、肥満症など)、組織の成長・増殖・分化阻
害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成異常(例えば
強皮症など)、組織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維
症、強皮症または腎線維症など)、循環器障害(末梢動
脈疾患、心筋梗塞または心不全など)、動脈硬化、内分
泌障害、体液バランス異常、中枢性疾患、免疫系疾患
(例えばアレルギー、炎症、自己免疫疾患等)、血管新
生障害等の種々の疾病の治療・予防剤等の医薬として使
用することができる。例えば、生体内において本発明の
ポリペプチドが減少あるいは欠損しているために、細胞
における情報伝達が十分に、あるいは正常に発揮されな
い患者がいる場合に、(イ)本発明のDNAを該患者に
投与し、生体内で本発明のポリペプチドを発現させるこ
とによって、(ロ)細胞に本発明のDNAを挿入し、本
発明のポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に
移植することによって、または(ハ)本発明のポリペプ
チドを該患者に投与すること等によって、該患者におけ
る本発明のポリペプチドの役割を十分に、あるいは正常
に発揮させることができる。本発明のDNAを上記の治
療・予防剤として使用する場合は、該DNAを単独ある
いはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター
等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、
ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明の
DNAは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助
剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺
伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルに
よって投与できる。本発明のポリペプチドを上記の治療
・予防剤として使用する場合は、少なくとも90%、好
ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さら
に好ましくは99%以上に精製されたものを使用するの
が好ましい。本発明のポリペプチドは、例えば、必要に
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤等として経口的に、あるいは水もし
くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、
または懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用でき
る。例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に認めら
れる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定
剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求
される単位用量形態で混和することによって製造するこ
とができる。これら製剤における有効成分量は指示され
た範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤とし
ては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガン
ト、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースの
ような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸
等のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような
潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味
剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような
香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである
場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状
担体を含有することができる。注射のための無菌組成物
は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰
子油等のような天然産出植物油等を溶解または懸濁させ
る等の通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ
糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビ
トール、D−マンニトール、塩化ナトリウム等)等が挙
げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール(例え
ば、エタノール等)、ポリアルコール(例えば、プロピ
レングリコール、ポリエチレングリコール等)、非イオ
ン性界面活性剤(例えば、ポリソルベート80TM、HCO
−50等)等と併用してもよい。油性液としては、例え
ば、オリーブ油、ゴマ油、大豆油、ラッカセイ油、綿実
油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール等が
挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジ
ルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤(例え
ば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等)、無痛
化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン
等)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコール等)、保存剤(例えば、ベンジルアルコ
ール、フェノール等)、酸化防止剤等と配合してもよ
い。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填
される。
【0024】本発明のDNAが挿入されたベクターも上
記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるの
で、例えば、温血動物(例えば、ヒト、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル等)に対して投与することがで
きる。本発明のポリペプチドの投与量は、対象疾患、投
与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、代
謝調節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例えば糖尿病、
肥満症など)、組織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能
の機能低下、結合組織の形成異常(例えば強皮症な
ど)、組織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮
症または腎線維症など)、循環器障害(末梢動脈疾患、
心筋梗塞または心不全など)、動脈硬化、内分泌障害、
体液バランス異常、中枢性疾患、免疫系疾患(例えばア
レルギー、炎症、自己免疫疾患等)、血管新生障害等の
種々の疾病の治療目的で本発明のポリペプチドを経口投
与する場合、一般的に成人(60kgとして)において
は、一日につき本発明のポリペプチドを約0.01mg
〜1000mg、好ましくは約1mg〜1000mg、
さらに好ましくは約10〜500mg、より好ましくは
約10〜200mg投与する。非経口的に投与する場合
は、本発明のポリペプチドの1回投与量は投与対象、対
象疾患等によっても異なるが、例えば、代謝調節(糖代
謝、脂質代謝など)異常(例えば糖尿病、肥満症な
ど)、組織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機能低
下、結合組織の形成異常(例えば強皮症など)、組織の
線維化(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮症または腎線
維症など)、循環器障害(末梢動脈疾患、心筋梗塞また
は心不全など)、動脈硬化、内分泌障害、体液バランス
異常、中枢性疾患、免疫系疾患(例えばアレルギー、炎
症、自己免疫疾患等)、血管新生障害等の種々の疾病の
治療目的で本発明のポリペプチドを注射剤の形で成人
(体重60kgとして)に投与する場合、一日につき該ポ
リペプチドを約0.001〜500mg程度、好ましく
は0.01〜500mg程度、さらに好ましくは約0.
1〜200mg程度、より好ましくは約0.1〜100
mg程度を患部にあるいは全身性に注射することにより
投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60k
g当たりに換算した量を投与することができる。 (2)疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング 本発明のポリペプチドは生体内で液性因子として存在す
るため、本発明のポリペプチドの機能(活性)を促進す
る化合物またはその塩は、例えば、炭水化物などのエネ
ルギー源の代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例
えば糖尿病、肥満症など)、組織の成長・増殖・分化阻
害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成異常(例えば
強皮症など)、組織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維
症、強皮症または腎線維症など)、循環器障害(末梢動
脈疾患、心筋梗塞または心不全など)、動脈硬化、内分
泌障害、体液バランス異常、中枢性疾患、免疫系疾患
(例えばアレルギー、炎症、自己免疫疾患等)、血管新
生障害等の種々の疾病の治療・予防剤等の医薬として使
用できる。一方、本発明のポリペプチドの機能(活性)
を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチ
ドの産生過剰に起因する疾患の治療・予防剤等の医薬と
して使用できる。したがって、本発明のポリペプチド
は、本発明のポリペプチドの機能(活性)を促進または
阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための
試薬として有用である。
【0025】すなわち、本発明は、 (1)本発明のポリペプチドまたはその塩を用いること
を特徴とする本発明のポリペプチドまたはその塩の機能
(活性)を促進する化合物もしくはその塩(以下、促進
剤と略記する場合がある)、または本発明のポリペプチ
ドまたはその塩の機能(活性)を阻害する化合物(以
下、阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方
法を提供する。本発明のスクリーニング用キットは、本
発明のポリペプチドまたはその塩を含有するものであ
る。本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本
発明のポリペプチドの機能(活性)を促進または阻害す
る化合物またはその塩のスクリーニング方法として、具
体的には、(i)本発明のポリペプチドが結合する組
織、細胞、またはそれらの膜画分に、本発明のポリペプ
チドを接触させた場合と(ii)本発明のポリペプチドが
結合する組織、細胞、またはそれらの膜画分に、本発明
のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との
比較を行うことを特徴とする本発明のポリペプチドと組
織、細胞、またはそれらの膜画分の結合性を変化させる
化合物(本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害
する化合物)またはその塩のスクリーニング方法などが
あげられる。本発明のスクリーニング方法においては、
(i)上記した本発明のポリペプチドが結合する組織、
細胞、またはそれらの膜画分に、本発明のポリペプチド
を接触させた場合と(ii)本発明のポリペプチドが結合
する組織、細胞、またはそれらの膜画分に、本発明のポ
リペプチドおよび試験化合物を接触させた場合におけ
る、例えば本発明のポリペプチドが結合する組織、細
胞、またはそれらの膜画分に対するリガンドの結合量、
細胞刺激活性、組織反応性などを測定して、比較する。
本発明のスクリーニング方法は具体的には、 標識した本発明のポリペプチドを、本発明のポリペプ
チドが結合する組織、細胞、またはそれらの膜画分に接
触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび
試験化合物を本発明のポリペプチドが結合する組織、細
胞、またはそれらの膜画分に接触させた場合における、
標識した本発明のポリペプチドの本発明のポリペプチド
が結合する組織、細胞、またはそれらの膜画分に対する
結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポ
リペプチドと本発明のポリペプチドが結合する組織、細
胞、またはそれらの膜画分との結合性を変化させる化合
物(本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する
化合物)またはその塩のスクリーニング方法、 標識した本発明のポリペプチドを、本発明のポリペプ
チドに対する受容体を含有する細胞または該細胞の膜画
分に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチド
および試験化合物を本発明のポリペプチドに対する受容
体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場
合における、標識した本発明のポリペプチドの該細胞ま
たは該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを
特徴とする本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチ
ドに対する受容体との結合性を変化させる化合物(本発
明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物)
またはその塩のスクリーニング方法、 標識した本発明のポリペプチドを、本発明のポリペプ
チドに対する受容体をコードするDNAを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発
明のポリペプチドに対する受容体に接触させた場合と、
標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発
明のポリペプチドに対する受容体をコードするDNAを
含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に
発現した本発明のポリペプチドに対する受容体に接触さ
せた場合における、標識した本発明のポリペプチドの本
発明のポリペプチドに対する受容体への結合量を測定
し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと
本発明のポリペプチドに対する受容体との結合性を変化
させる化合物(本発明のポリペプチドの活性を促進また
は阻害する化合物)またはその塩のスクリーニング方
法、 本発明のポリペプチドに対する受容体を活性化する化
合物(例えば、本発明のポリペプチド)を本発明のポリ
ペプチドに対する受容体を含有する細胞に接触させた場
合と、本発明のポリペプチドに対する受容体を活性化す
る化合物および試験化合物を本発明のポリペプチドに対
する受容体を含有する細胞に接触させた場合における、
本発明のポリペプチドに対する受容体を介した細胞刺激
活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ca2+の遊離、細胞内cAMP生成、細胞内
cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、c−fosの活性化、細
胞外液のpHの低下、NO産生、該細胞が特有に産生して
いる生理活性物質の産生などを促進する活性または抑制
する活性など)を測定し、比較することを特徴とする本
発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドに対する受
容体との結合性を変化させる化合物(本発明のポリペプ
チドの活性を促進または阻害する化合物)またはその塩
のスクリーニング方法、および 本発明のポリペプチドに対する受容体を活性化する化
合物(例えば、本発明のポリペプチドなど)を本発明の
ポリペプチドに対する受容体をコードするDNAを含有
する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現
した本発明のポリペプチドに対する受容体に接触させた
場合と、本発明のポリペプチドに対する受容体を活性化
する化合物および試験化合物を、本発明のポリペプチド
に対する受容体をコードするDNAを含有する形質転換
体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の
ポリペプチドに対する受容体に接触させた場合におけ
る、本発明のポリペプチドに対する受容体を介する細胞
刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ca2+の遊離、細胞内cAMP生成、細胞
内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位
変動、細胞内蛋白質のリン酸化、c−fosの活性化、
細胞外液のpHの低下、NO産生、該細胞が特有に産生し
ている生理活性物質の産生などを促進する活性または抑
制する活性など)を測定し、比較することを特徴とする
本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドに対する
受容体との結合性を変化させる化合物(本発明のポリペ
プチドの活性を促進または阻害する化合物)またはその
塩のスクリーニング方法などである。 本発明のポリペプチドに対する受容体をコードするD
NAは、以下のような方法で取得することができる。本
発明のポリペプチドを125Iなどのラジオアイソトープ
やフルオレセインなどの蛍光物質、またはビオチン等で
標識し、該標識体が特異的に結合する細胞株、組織、器
官などを見出す。次に公知の方法でそこからmRNAを
抽出し、cDNAを合成した後、動物細胞用の発現ベク
ターにクローニングする。これをCOS7細胞などに導
入し、該形質転換細胞に上記の標識体が結合するかどう
かを指標にして、本発明のポリペプチドに対する受容体
をコードするDNAが組み込まれた形質転換細胞を選び
出すことができる(発現クローニング)。 また、インスリン受容体ファミリーに共通の構造的特
徴(例えば、チロシンキナーゼドメインなどのアミノ酸
配列)に対する混合プライマーを作製し、RT−PCR
を行うことにより、インスリン受容体ファミリーに属す
る新規受容体cDNA断片を取得することができる。続
いて得られたDNA配列を基に5’-RACEおよび3’-RACE
PCRを行って、全長のcDNAを取得する。これを
上述の動物細胞用発現ベクターに挿入し、CHO細胞や
COS7細胞などの適当な動物培養細胞で発現させ、本
発明のポリペプチドが特異的に結合することを確認する
ことにより、本発明のポリペプチドに対する受容体をコ
ードするDNAであることが確認できる。
【0026】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に
用いる本発明のポリペプチドが結合する組織、細胞、ま
たはそれらの膜画分など、すなわち本発明のポリペプチ
ドに対する受容体としては、本発明のポリペプチドを特
異的に結合するものであれば何れのものであってもよい
が、ヒトや温血動物の臓器、培養細胞、またはそれらの
膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器
は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用い
られるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた
ヒトの組換え受容体などが適している。本発明のポリペ
プチドに対する受容体を製造するには、前述の本発明の
ポリペプチドの製造方法などが用いられる。本発明のス
クリーニング方法において、本発明のポリペプチドに対
する受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを
用いる場合、後述の調製法に従えばよい。本発明のポリ
ペプチドに対する受容体を含有する細胞を用いる場合、
該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化
してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って
行うことができる。本発明のポリペプチドに対する受容
体を含有する細胞としては、本発明のポリペプチドに対
する受容体を発現した細胞株をいうが、大腸菌、枯草
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などを宿主細胞とする形
質転換細胞であってもよい。また、本発明のポリペプチ
ドに対する受容体を発現した宿主細胞の取得方法として
は、前述の本発明のポリペプチドを含有する発現ベクタ
ーで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方法
などがあげられる。膜画分としては、細胞を破砕した
後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれ
る画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter
−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワ
ーリングブレンダーやポリトロン(Kinematica社製)に
よる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加
圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる
破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分
離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が
主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速(50
0rpm〜3000rpm)で短時間(通常、約1分〜
10分)遠心し、上清をさらに高速(15000rpm
〜30000rpm)で通常30分〜2時間遠心し、得
られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した
本発明のポリペプチドに対する受容体と細胞由来のリン
脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該本発明
のポリペプチドに対する受容体を含有する細胞や膜画分
中の本発明のポリペプチドに対する受容体の量は、1細
胞当たり103〜108分子であるのが好ましく、105
〜107分子であるのが好適である。なお、発現量が多
いほど膜画分当たりのリガンド結合活性(比活性)が高
くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になる
ばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるよ
うになる。本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチ
ドに対する受容体との結合性を変化させる化合物(本発
明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物)
をスクリーニングする前記の〜を実施するために
は、適当な本発明のポリペプチドに対する受容体画分
と、標識した本発明のポリペプチドなどが用いられる。
本発明のポリペプチドに対する受容体画分としては、本
発明のポリペプチドに対する天然の組織や細胞の受容体
画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型の受
容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同
等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドと
しては、標識した本発明のポリペプチドなどが用いられ
る。例えば〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕、
蛍光色素、ビオチン、βガラクトシダーゼやパーオキシ
ダーゼなどの酵素などで標識された本発明のポリペプチ
ドを利用することができる。
【0027】具体的には、本発明のポリペプチドと本発
明のポリペプチドに対する受容体との結合性を変化させ
る化合物のスクリーニングを行うには、まず本発明のポ
リペプチドに対する受容体を含有する細胞または細胞の
膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁す
ることにより受容体標品を調製する。バッファーには、
pH4〜10(望ましくはpH6〜8)のリン酸バッフ
ァー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドと受容体
との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよ
い。また、非特異的結合を低減させる目的で、CHAP
S、Tween−80TM(花王−アトラス社)、ジギト
ニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファー
に加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる受
容体や本発明のポリペプチドの分解を抑える目的でPM
SF、ロイペプチン、E−64(ペプチド研究所製)、
ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加すること
もできる。0.01ml〜10mlの該受容体溶液に、
一定量(5000cpm〜500000cpm)の標識
した本発明のポリペプチドを添加し、同時に10-1 0
10-6Mの試験化合物を共存させる。非特異的結合量
(NSB)を知るために大過剰の未標識の本発明のポリ
ペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は0℃
から50℃、望ましくは4℃から37℃で20分から2
4時間、望ましくは30分から3時間行う。反応後、ガ
ラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチ
レーションカウンターまたはγ−カウンターで計測す
る。拮抗する物質がない場合のカウント(B0))から非特
異的結合量(NSB)を引いたカウント(B0−NS
B)を100%とした時、特異的結合量(B−NSB)
が例えば50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力の
ある候補物質として選択することができる。本発明のポ
リペプチドと本発明のポリペプチドに対する受容体との
結合性を変化させる化合物(本発明のポリペプチドの活
性を促進または阻害する化合物)をスクリーニングする
前記の〜の方法を実施するためには、本発明のポリ
ペプチドに対する受容体を介する細胞刺激活性(例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内C
2+の遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生
成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
蛋白質のリン酸化、c−fosの活性化、細胞外液のp
Hの低下、NO産生、該細胞が特有に産生している生理活
性物質の産生などを促進する活性または抑制する活性な
ど)を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測
定することができる。具体的には、まず、本発明のポリ
ペプチドに対する受容体を含有する細胞をマルチウェル
プレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっ
ては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない
適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して
一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上
清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従っ
て定量する。細胞刺激活性の指標とする物質(例えば、
アラキドン酸など)の生成が、細胞が含有する分解酵素
によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤
を添加してアッセイを行なってもよい。また、cAMP
産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで
細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産
生抑制作用として検出することができる。また、細胞外
液のpHの低下については、マイクロフィジオメーター
(CytosensorTM等)を用いてその酸性化率の変化を測定で
きる。
【0028】細胞刺激活性を測定してスクリーニングを
行うには、適当な本発明のポリペプチドに対する受容体
を発現した細胞が必要である。本発明のポリペプチドに
対する受容体を発現した細胞としては、天然の細胞株や
前述の本発明のポリペプチドに対する受容体発現細胞株
などが望ましい。試験化合物としては、例えばペプチ
ド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵
生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など
が挙げられる。本発明のポリペプチドと本発明のポリペ
プチドに対する受容体との結合性を変化させる化合物
(本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化
合物)またはその塩のスクリーニング用キットは、本発
明のポリペプチド、および本発明のポリペプチドが結合
する対象(本発明のポリペプチドに対する受容体、本発
明のポリペプチドに対する受容体を含有する細胞、ある
いは本発明のポリペプチドの受容体を含有する細胞の膜
画分など)を含有するものである。本発明のスクリーニ
ング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ
る化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドと本発
明のポリペプチドに対する受容体との結合を変化させる
(結合を阻害あるいは促進する)化合物(本発明のポリ
ペプチドの活性を促進または阻害する化合物)であり、
具体的には本発明のポリペプチドに対する受容体を介し
て細胞刺激活性を有する化合物またはその塩(いわゆる
本発明のポリペプチドに対する受容体のアゴニスト)、
あるいは該刺激活性を有しない化合物(いわゆる本発明
のポリペプチドに対する受容体のアンタゴニスト)であ
る。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチ
ド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、
これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の
化合物であってもよい。上記本発明のポリペプチドに対
する受容体のアゴニストであるかアンタゴニストである
かの具体的な評価方法は以下の(i)または(ii)に従
えばよい。 (i)本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドに
対する受容体との結合性を変化させる(特に、結合を阻
害する)化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の
ポリペプチドに対する受容体を介する細胞刺激活性を有
しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合
物またはその塩は本発明のポリペプチドに対する受容体
のアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはそ
の塩は本発明のポリペプチドに対する受容体のアンタゴ
ニストである。 (ii)(a)試験化合物を本発明のポリペプチドに対する
受容体を含有する細胞に接触させ、上記本発明のポリペ
プチドに対する受容体を介した細胞刺激活性を測定す
る。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明
のポリペプチドに対する受容体のアゴニストである。 (b) 本発明のポリペプチドに対する受容体を活性化する
化合物(例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の
ポリペプチドに対する受容体アゴニストなど)を本発明
のポリペプチドに対する受容体を含有する細胞に接触さ
せた場合と、本発明のポリペプチドに対する受容体を活
性化する化合物および試験化合物を本発明のポリペプチ
ドに対する受容体を含有する細胞に接触させた場合にお
ける、本発明のポリペプチドに対する受容体を介した細
胞刺激活性を測定し、比較する。本発明のポリペプチド
に対する受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性
を減少させ得る化合物またはその塩は本発明のポリペプ
チドに対する受容体のアンタゴニストである。
【0029】該本発明のポリペプチドに対する受容体ア
ゴニストは、本発明のポリペプチドに対する受容体に対
する本発明のポリペプチドが有する生理活性と同様の作
用を有しているので、本発明のポリペプチドと同様に安
全で低毒性な医薬として有用である。逆に、本発明のポ
リペプチドに対する受容体アンタゴニストは、本発明の
ポリペプチドに対する受容体に対する本発明のポリペプ
チドが有する生理活性を抑制することができるので、本
発明のポリペプチドが過剰な場合の活性を抑制する安全
で低毒性な医薬として有用である。本発明のスクリーニ
ング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ
る化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等から選
ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの機能を促
進または阻害する化合物である。該化合物の塩として
は、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが
用いられる。本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療
・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施す
ることができる。例えば、前記した本発明のポリペプチ
ドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エ
リキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液
剤等とすることができる。このようにして得られる製剤
は安全で低毒性であるので、例えば、温血動物(例え
ば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル等)に対して投与す
ることができる。該化合物またはその塩の投与量は、そ
の作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異
はあるが、例えば、代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)
異常(例えば糖尿病、肥満症など)、組織の成長・増殖
・分化阻害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成異常
(例えば強皮症など)、組織の線維化(例えば、肝硬変
・肺線維症、強皮症、腎線維症など)、循環器障害(末
梢動脈疾患、心筋梗塞または心不全など)、動脈硬化、
内分泌障害、体液バランス異常、中枢性疾患、免疫系疾
患(例えばアレルギー、炎症、自己免疫疾患等)、血管
新生障害等の種々の疾病の治療目的で本発明のポリペプ
チドの機能を促進する化合物を経口投与する場合、一般
的に成人(体重60kgとして)においては、一日につ
き該化合物を約0.01〜1000mg、好ましくは約
0.1〜1000mg、さらに好ましくは約1.0〜2
00mg、より好ましくは約1.0〜50mg投与す
る。非経口的に投与する場合は、該化合物の1回投与量
は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、
代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例えば糖尿
病、肥満症など)、組織の成長・増殖・分化阻害、生殖
機能の機能低下、結合組織の形成異常(例えば強皮症な
ど)、組織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮
症、腎線維症など)、循環器障害(末梢動脈疾患、心筋
梗塞または心不全など)、動脈硬化、内分泌障害、体液
バランス異常、中枢性疾患、免疫系疾患(例えばアレル
ギー、炎症、自己免疫疾患等)、血管新生障害等治療の
目的で本発明のポリペプチドの機能を促進する化合物を
注射剤の形で通常成人(60kgとして)に投与する場
合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程度、
好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約
0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算
した量を投与することができる。一方、本発明のポリペ
プチドの機能を阻害する化合物を経口投与する場合、一
般的に成人(体重60kgとして)においては、一日に
つき該化合物を約0.01〜1000mg、好ましくは
約0.1〜1000mg、さらに好ましくは約1.0〜
200mg、より好ましくは約1.0〜50mg投与す
る。非経口的に投与する場合は、該化合物の1回投与量
は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、本発明の
ポリペプチドの機能を阻害する化合物を注射剤の形で通
常成人(60kgとして)に投与する場合、一日につき
該化合物を約0.01〜30mg程度、好ましくは約
0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10
mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。
他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与す
ることができる。
【0030】(3)本発明のポリペプチドまたはその塩
の定量 本発明のポリペプチドに対する抗体(以下、本発明の抗
体と略記する場合がある)は、本発明のポリペプチドを
特異的に認識することができるので、被検液中の本発明
のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法に
よる定量等に使用することができる。すなわち、本発明
は、(i)本発明の抗体と、被検液および標識化された
本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に
結合した標識化された本発明のポリペプチドの割合を測
定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチ
ドの定量法、および(ii)被検液と担体上に不溶化した
本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを
同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の
標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本
発明のポリペプチドの定量法を提供する。また、本発明
のポリペプチドに対するモノクローナル抗体(以下、本
発明のモノクローナル抗体と称する場合がある)を用い
て本発明のポリペプチドの定量を行なえるほか、組織染
色等による検出を行うこともできる。これらの目的に
は、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子
のF(ab')2、Fab'、あるいはFab画分を用いて
もよい。本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの
定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液
中の抗原量(例えば、本発明のポリペプチド量)に対応
した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的
または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を
含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定
法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、
ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサ
ンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点
で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好まし
い。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤として
は、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物
質等が用いられる。放射性同位元素としては、例えば、
125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕等が用いら
れる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが
好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコ
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が用いられる。蛍光物質とし
ては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソ
チオシアネート等が用いられる。発光物質としては、例
えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、
ルシゲニン等が用いられる。さらに、抗体あるいは抗原
と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いること
もできる。抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物
理吸着を用いてもよく、また通常ポリペプチドあるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキ
ストラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ある
いはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては
不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応
させ(1次反応)、さらに標識化した別の本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ(2次反応)たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のポリペプチド量を定量することができる。1次
反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行
なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化
剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることがで
きる。また、サンドイッチ法による免疫測定法におい
て、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は
必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させ
る等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよ
い。本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチ
ドの測定法においては、1次反応と2次反応に用いられ
る本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチ
ドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられ
る。すなわち、1次反応および2次反応に用いられる抗
体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、本発明の
ポリペプチドのC端部を認識する場合、1次反応で用い
られる抗体は、好ましくはC端部以外、例えばN端部を
認識する抗体が用いられる。本発明のモノクローナル抗
体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合
法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリー等に用
いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識
抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応
の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原(B)と
を分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測
定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗
体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレン
グリコール、前記抗体に対する第2抗体等を用いる液相
法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あ
るいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として
固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメ
トリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定
量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を
分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識
化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標
識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離す
る。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗
原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あ
るいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降
物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少
量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利
用するレーザーネフロメトリー等が好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用
するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要と
されない。それぞれの方法における通常の条件、操作法
に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプ
チドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術
手段の詳細については、総説、成書等を参照することが
できる。
【0031】例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセ
イ〕(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジ
オイムノアッセイ〕(講談社、昭和54年発行)、石川
栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発
行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医
学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「Me
thods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Techniq
ues(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniq
ues(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniq
ues(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniq
ues(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92
(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antib
odies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vo
l. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma
Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカ
デミックプレス社発行)等を参照することができる。以
上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、
本発明のポリペプチドを感度良く定量することができ
る。さらには、本発明の抗体を用いて本発明のポリペプ
チドの濃度を定量することによって、本発明のポリペプ
チドの濃度の増多または減少が検出された場合、例え
ば、炭水化物などのエネルギー源の代謝調節(糖代謝、
脂質代謝など)異常(例えば糖尿病、肥満症など)、組
織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機能低下、結合
組織の形成異常(例えば強皮症など)、組織の線維化
(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮症または腎線維症な
ど)、循環器障害(末梢動脈疾患、心筋梗塞または心不
全など)、動脈硬化、内分泌障害、体液バランス異常、
中枢性疾患、免疫系疾患(例えばアレルギー、炎症、自
己免疫疾患等)、血管新生障害等の種々の疾病である可
能性、または将来罹患する可能性が高いと診断すること
ができる。また、本発明の抗体は、体液や組織等の被検
体中に存在する本発明のポリペプチドを検出するために
使用することができる。また、本発明のポリペプチドを
精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各
分画中の本発明のポリペプチドの検出、被検細胞内にお
ける本発明のポリペプチドの挙動の分析等のために使用
することができる。
【0032】(4)遺伝子診断剤 本発明のDNAは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、温血動物(例えば、ヒト、ラット、マウス、
モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウ
マ、ネコ、イヌ、サル等)における本発明のポリペプチ
ドをコードするDNAまたはmRNAの異常(遺伝子異
常)を検出することができるので、例えば、該DNAま
たはmRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該
DNAまたはmRNAの増加あるいは発現過多等の遺伝
子診断剤として有用である。また、染色体マッピングを
行い、遺伝病の研究にも利用できる。本発明のDNAを
用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザ
ンハイブリダイゼーションやPCR−SSCP法(ゲノ
ミックス(Genomics),第5巻,874〜879頁(1
989年)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエス
エー(Proceedings ofthe National Academy of Scienc
es of the United States of America),第86巻,2
766〜2770頁(1989年))、DNAマイクロ
アレイ(サイエンス(Science),第270巻,467
〜470頁(1995年))等により実施することがで
きる。例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、DN
Aマイクロアレイにより発現低下が検出された場合やP
CR−SSCP法、DNAマイクロアレイによりDNA
の突然変異が検出された場合は、例えば、炭水化物など
のエネルギー源の代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)異
常(例えば糖尿病、肥満症など)、組織の成長・増殖・
分化阻害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成異常
(例えば強皮症など)、組織の線維化(例えば、肝硬変
・肺線維症、強皮症または腎線維症など)、循環器障害
(末梢動脈疾患、心筋梗塞または心不全など)、動脈硬
化、内分泌障害、体液バランス異常、中枢性疾患、免疫
系疾患(例えばアレルギー、炎症、自己免疫疾患等)、
血管新生障害等の種々の疾病等である可能性が高いと診
断することができる。
【0033】(5)アンチセンスDNAを含有する医薬 本発明のDNAに相補的に結合し、該DNAの発現を抑
制することができるアンチセンスDNAは、生体内にお
ける本発明のポリペプチドまたは本発明のDNAの機能
を抑制することができるので、例えば、本発明のポリペ
プチドの発現過多に起因する疾患の治療・予防剤として
使用することができる。上記アンチセンスDNAを上記
の治療・予防剤として、前記した本発明のDNAを含有
する各種疾病の治療・予防剤と同様に使用することがで
きる。例えば、該アンチセンスDNAを単独あるいはレ
トロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデ
ノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当
なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与するこ
とができる。該アンチセンスDNAは、そのままで、あ
るいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められ
る担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテ
ーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるい
は、エアロゾル化して吸入剤として気管内に投与するこ
ともできる。該アンチセンスDNAの投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例
えば、本発明のアンチセンスDNAを吸入剤として気管
内に局所投与する場合、一般的に成人(体重60kg)
においては、一日につき該アンチセンスDNAを約0.
1〜100mg投与する。さらに、該アンチセンスDN
Aは、組織や細胞における本発明のDNAの存在やその
発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ
ーブとして使用することもできる。
【0034】(6)本発明の抗体を含有する医薬 本発明のポリペプチドの活性を中和する作用を有する本
発明の抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの発現過
多に起因する疾患の治療・予防剤等の医薬として使用す
ることができる。本発明の抗体を含有する上記疾患の治
療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型
の医薬組成物として、哺乳動物(例、ヒト、ラット、ウ
サギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等)に対
して経口的または非経口的に投与することができる。投
与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によ
っても異なるが、例えば、本発明の抗体を1回量とし
て、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましく
は0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは
0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、
好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与する
のが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場
合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特
に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。本
発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として
投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成
物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担
体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる
組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提
供される。すなわち、例えば、経口投与のための組成物
としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤(糖
衣錠、フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆粒
剤、散剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤を含む)、シ
ロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物
は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において
通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有する
ものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、
乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が
用いられる。非経口投与のための組成物としては、例え
ば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、
皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の
剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従
って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用
いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または
乳化することによって調製する。注射用の水性液として
は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を
含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、
アルコール(例、エタノール)、ポリアルコール(例、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非
イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−
50(polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogen
ated castor oil)〕等と併用してもよい。油性液とし
ては、例えば、オリーブ油、ゴマ油、大豆油、ラッカセ
イ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピ レング
リコール等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製さ
れた注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直
腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通
常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。上
記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投
与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されること
が好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠
剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプル)、坐剤等が
例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常5〜50
0mg程度、とりわけ注射剤では5〜100mg程度、
その他の剤形では10〜250mg程度の上記抗体が含
有されていることが好ましい。なお前記した各組成物
は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生
じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【0035】(7)DNA転移動物 本発明は、外来性の本発明のポリペプチドをコードする
DNA(以下、本発明の外来性DNAと略記する)また
はその変異DNA(本発明の外来性変異DNAと略記す
る場合がある)を有する非ヒト哺乳動物を提供する。す
なわち、本発明は、(1)本発明の外来性DNAまたは
その変異DNAを有する非ヒト哺乳動物、(2)非ヒト
哺乳動物がゲッ歯動物である第(1)記載の動物、(3)
ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第(2)記載の
動物、および(4)本発明の外来性DNAまたはその変
異DNAを含有し、哺乳動物において発現しうる組換え
ベクターを提供するものである。本発明の外来性DNA
またはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物(以下、
本発明のDNA転移動物と略記する)は、未受精卵、受
精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞等に対し
て、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生
の段階(さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の
段階でかつ一般に8細胞期以前)に、リン酸カルシウム
法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイ
クロインジェクション法、パーティクルガン法、DEA
E−デキストラン法等により目的とするDNAを転移す
ることによって作出することができる。また、該DNA
転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞等に目
的とする本発明の外来性DNAを転移し、細胞培養、組
織培養等に利用することもでき、さらに、これら細胞を
上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させ
ることにより本発明のDNA転移動物を作出することも
できる。非ヒト哺乳動物としては、例えば、サル、ウ
シ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモ
ット、ハムスター、マウス、ラット等が用いられる。な
かでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生およ
び生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ
歯動物、とりわけマウス(例えば、純系として、C57
BL/6系統,DBA2系統等、交雑系として、B6C
3F1系統,BDF1系統,B6D2F1系統,BALB
/c系統,ICR系統等)またはラット(例えば、Wi
star,SD等)等が好ましい。哺乳動物において発
現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」として
は、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒト等が挙げられる。
本発明の外来性DNAとは、非ヒト哺乳動物が本来有し
ている本発明のDNAではなく、いったん哺乳動物から
単離・抽出された本発明のDNAをいう。本発明の変異
DNAとしては、元の本発明のDNAの塩基配列に変異
(例えば、突然変異等)が生じたもの、具体的には、塩
基の付加、欠損、他の塩基への置換等が生じたDNA等
が用いられ、また、異常DNAも含まれる。該異常DN
Aとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させる
DNAを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチド
の機能を抑制するポリペプチドを発現させるDNA等が
用いられる。本発明の外来性DNAは、対象とする動物
と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであ
ってもよい。本発明のDNAを対象動物に転移させるに
あたっては、該DNAを動物細胞で発現させうるプロモ
ーターの下流に結合したDNAコンストラクトとして用
いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトDN
Aを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のDN
Aを有する各種哺乳動物(例えば、ウサギ、イヌ、ネ
コ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等)由来
のDNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、本
発明のヒトDNAを結合したDNAコンストラクト
(例、ベクター等)を対象哺乳動物の受精卵、例えば、
マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによ
って本発明のDNAを高発現するDNA転移哺乳動物を
作出することができる。本発明のポリペプチドの発現ベ
クターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来
のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージ等の
バクテリオファージ、モロニー白血病ウィルス等のレト
ロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィル
ス等の動物ウイルス等が用いられる。なかでも、大腸菌
由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母
由来のプラスミド等が好ましく用いられる。上記のDN
A発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、ウ
イルス(例、シミアンウイルス、サイトメガロウイル
ス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイ
ルス、ポリオウイルス等)に由来するDNAのプロモー
ター、各種哺乳動物(ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モ
ルモット、ハムスター、ラット、マウス等)由来のプロ
モーター、例えば、アルブミン、インスリンII、ウロ
プラキンII、エラスターゼ、エリスロポエチン、エン
ドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タ
ンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、血小
板由来成長因子β、ケラチンK1,K10およびK1
4、コラーゲンI型およびII型、サイクリックAMP
依存タンパク質キナーゼβIサブユニット、ジストロフ
ィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナ
トリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ
(一般にTie2と略される)、ナトリウムカリウムア
デノシン3リン酸化酵素(Na,K−ATPase)、
ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインIおよび
IIA、メタロプロティナーゼ1組織インヒビター、M
HCクラスI抗原(H−2L)、H−ras、レニン、
ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ
(TPO)、ポリペプチド鎖延長因子1α(EF−1
α)、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン
軽鎖1および2、ミエリン基礎タンパク質、チログロブ
リン、Thy−1、免疫グロブリン、H鎖可変部(VN
P)、血清アミロイドPコンポーネント、ミオグロビ
ン、トロポニンC、平滑筋αアクチン、プレプロエンケ
ファリンA、バソプレシン等のプロモーター等が用いら
れる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイト
メガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長
因子1α(EF−1α)のプロモーター、ヒトおよびニ
ワトリβアクチンプロモーター等が好適である。上記ベ
クターは、DNA転移哺乳動物において目的とするメッ
センジャーRNAの転写を終結する配列(一般にターミ
ネーターと呼ばれる)を有していることが好ましく、例
えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各DNA
の配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィ
ルスのSV40ターミネーター等が用いられる。その
他、目的とする外来性DNAをさらに高発現させる目的
で各DNAのスプライシングシグナル、エンハンサー領
域、真核DNAのイントロンの一部等をプロモーター領
域の5´上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは
翻訳領域の3´下流に連結することも目的により可能で
ある。該翻訳領域は転移動物において発現しうるDNA
コンストラクトとして、前記のプロモーターの下流およ
び所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のD
NA工学的手法により作製することができる。受精卵細
胞段階における本発明の外来性DNAの転移は、対象哺
乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するよう
に確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞にお
いて、本発明の外来性DNAが存在することは、作出動
物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべて
に本発明の外来性DNAを保持することを意味する。本
発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は
その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性D
NAを有する。本発明の外来性正常DNAを転移させた
非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保
持することを確認して、該DNA保有動物として通常の
飼育環境で継代飼育することが出来る。
【0036】受精卵細胞段階における本発明の外来性D
NAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の
全てに過剰に存在するように確保される。DNA転移後
の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性DNAが
過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽
細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰
に有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け
継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞
の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有する。導入D
NAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取
得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子
孫が該DNAを過剰に有するように繁殖継代することが
できる。本発明の正常DNAを有する非ヒト哺乳動物
は、本発明の正常DNAが高発現させられており、内在
性の正常DNAの機能を促進することにより最終的に本
発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあ
り、その病態モデル動物として利用することができる。
例えば、本発明の正常DNA転移動物を用いて、本発明
のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチド
が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の
治療方法の検討を行うことが可能である。また、本発明
の外来性正常DNAを転移させた哺乳動物は、遊離した
本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本
発明のポリペプチドに関連する疾患に対する治療薬のス
クリーニング試験にも利用可能である。一方、本発明の
外来性異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配によ
り外来性DNAを安定に保持することを確認して該DN
A保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが
出来る。さらに、目的とする外来DNAを前述のプラス
ミドに組み込んで原科として用いることができる。プロ
モーターとのDNAコンストラク卜は、通常のDNA工
学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段
階における本発明の異常DNAの転移は、対象哺乳動物
の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保さ
れる。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発
明の異常DNAが存在することは、作出動物の子孫が全
てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DN
Aを有することを意味する。本発明の外来性DNAを受
け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体
細胞の全てに本発明の異常DNAを有する。導入DNA
を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得
し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫
が該DNAを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明
の異常DNAが高発現させられており、内在性の正常D
NAの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリ
ペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その
病態モデル動物として利用することができる。例えば、
本発明の異常DNA転移動物を用いて、本発明のポリペ
プチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこ
の疾患を治療方法の検討を行うことが可能である。ま
た、具体的な利用可能性としては、本発明の異常DNA
高発現動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不
応症における本発明の異常ポリペプチドによる正常ポリ
ペプチドの機能阻害(dominant negative作用)を解明
するモデルとなる。また、本発明の外来異常DNAを転
移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドの
増加症状を有することから、本発明のポリペプチドの機
能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験に
も利用可能である。
【0037】また、上記2種類の本発明のDNA転移動
物のその他の利用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のDNA転移動物の組織中のDNAもしくはR
NAを直接分析するか、またはDNAにより発現された
ポリペプチド組織を分析することによる、本発明のポリ
ペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリペ
プチドとの関連性についての解析、 DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 本発明の変異ポリペプチドの単離精製およびその抗体
作製等が考えられる。 さらに、本発明のDNA転移動物を用いて、本発明のポ
リペプチドの機能不活性型不応症等を含む、本発明のポ
リペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることがで
き、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデル
の各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新
しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾
患の研究および治療に貢献することができる。また、本
発明のDNA転移動物から各臓器を取り出し、細切後、
トリプシン等のポリペプチド(タンパク質)分解酵素に
より、遊離したDNA転移細胞の取得、その培養または
その培養細胞の系統化を行うことが可能である。さら
に、本発明のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトー
シス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにお
けるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べるこ
と等ができ、本発明のポリペプチドおよびその作用解明
のための有効な研究材料となる。さらに、本発明のDN
A転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活
性型不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾
患の治療薬の開発を行うために、上述の検査法および定
量法等を用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリー
ニング法を提供することが可能となる。また、本発明の
DNA転移動物または本発明の外来性DNA発現ベクタ
ーを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のD
NA治療法を検討、開発することが可能である。
【0038】(8)ノックアウト動物 本発明は、本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、(1)本発明の
DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2)該DNAがレポーター遺伝子(例、大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子)を導入することにより不
活性化された第(1)項記載の胚幹細胞、(3)ネオマ
イシン耐性である第(1)項記載の胚幹細胞、(4)非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第(1)項記載の胚幹
細胞、(5)ゲッ歯動物がマウスである第(4)項記載
の胚幹細胞、(6)本発明のDNAが不活性化された該
DNA発現不全非ヒト哺乳動物、(7)該DNAがレポ
ーター遺伝子(例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子)を導入することにより不活性化され、該レポー
ター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制
御下で発現しうる第(6)項記載の非ヒト哺乳動物、
(8)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第(6)項記
載の非ヒト哺乳動物、(9)ゲッ歯動物がマウスである
第(8)項記載の非ヒト哺乳動物、および(10)第
(7)項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポータ
ー遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のD
NAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本
発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞
とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のDNAに人為
的に変異を加えることにより、該DNAの発現能を抑制
するか、もしくは該DNAがコードしている本発明のポ
リペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、D
NAが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さな
い(以下、本発明のノックアウトDNAと称することが
ある)非ヒト哺乳動物の胚幹細胞(以下、ES細胞と略
記する)をいう。非ヒト哺乳動物としては、前記と同様
のものが用いられる。本発明のDNAに人為的に変異を
加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により
該DNA配列の一部または全部の削除、他DNAを挿入
または置換させることによって行うことができる。これ
らの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらし
たり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊する
ことにより本発明のノックアウトDNAを作製すればよ
い。本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚
幹細胞(以下、本発明のDNA不活性化ES細胞または
本発明のノックアウトES細胞と略記する)の具体例と
しては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本
発明のDNAを単離し、そのエキソン部分にネオマイシ
ン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とす
る薬剤耐性遺伝子、あるいはlacZ(β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子)、cat(クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子)を代表とするレポーター
遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊す
るか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の
転写を終結させるDNA配列(例えば、polyA付加シグ
ナル等)を挿入し、完全なメッセンジャーRNAを合成
できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊する
ように構築したDNA配列を有するDNA鎖(以下、タ
ーゲッティングベクターと略記する)を、例えば相同組
換え法により該動物細胞の染色体に導入し、得られたE
S細胞について本発明のDNA上あるいはその近傍のD
NA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーショ
ン解析あるいはターゲッティングベクター上のDNA配
列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明の
DNA以外の近傍領域のDNA配列をプライマーとした
PCR法により解析し、本発明のノックアウトES細胞
を選別することにより得ることができる。また、相同組
換え法等により本発明のDNAを不活化させる元のES
細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたも
のを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準
じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのE
S細胞の場合、現在、一般的には129系のES細胞が
使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていない
ので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明ら
かなES細胞を取得する等の目的で例えば、C57BL
/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA
/2との交雑により改善したBDF1マウス(C57B
L/6とDBA/2とのF1)を用いて樹立したもの等
も良好に用いうる。BDF1マウスは、採卵数が多く、
かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL
/6マウスを背景に持つので、これを用いて得られたE
S細胞は病態モデルマウスを作出したとき、C57BL
/6マウスと戻し交配(バッククロス)することでその
遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能
である点で有利に用い得る。
【0039】また、ES細胞を樹立する場合、一般には
受精後3.5日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に8
細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより
効率よく多数の初期胚を取得することができる。また、
雌雄いずれのES細胞を用いてもよいが、通常雄のES
細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。
また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ
早く雌雄の判別を行うことが望ましい。ES細胞の雌雄
の判定方法としては、例えば、PCR法によりY染色体
上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その
1例として挙げることができる。この方法を使用すれ
ば、従来、核型分析をするのに約106個の細胞数を要
していたのに対して、1コロニー程度のES細胞数(約
50個)で済むので、培養初期におけるES細胞の第一
次セレクションを雌雄の判別で行うことが可能であり、
早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の
手間は大幅に削減できる。また、第二次セレクションと
しては、例えば、G−バンディング法による染色体数の
確認等により行うことができる。得られるES細胞の染
色体数は正常数の100%が望ましいが、樹立の際の物
理的操作等の関係上困難な場合は、ES細胞の遺伝子を
ノックアウトした後、正常細胞(例えば、マウスでは染
色体数が2n=40である細胞)に再びクローニングす
ることが望ましい。このようにして得られた胚幹細胞株
は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力
を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要で
ある。例えば、STO線維芽細胞のような適当なフィー
ダー細胞上でLIF(1−10000U/ml)存在下に炭
酸ガス培養器内(好ましくは、約5%炭酸ガス、約95
%空気または約5%酸素、約5%炭酸ガス、約90%空
気)で約37℃で培養する等の方法で培養し、継代時に
は、例えば、トリプシン/EDTA溶液(通常約0.0
01−0.5%トリプシン/約0.1−5mM EDT
A、好ましくは約0.1%トリプシン/約1mM EDT
A)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー
細胞上に播種する方法等がとられる。このような継代
は、通常1−3日毎に行うが、この際に細胞の観察を行
い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養
細胞は放棄することが望まれる。ES細胞は、適当な条
件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細
胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂
筋、内臓筋、心筋等の種々のタイプの細胞に分化させる
ことが可能であり〔M. J. EvansおよびM. H. Kaufman,
ネイチャー(Nature)第292巻、154頁、1981年;G. R.
Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー(Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A.)第78巻、7634頁、1981年;T.
C. Doetschmanら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジ
ー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第
87巻、27頁、1985年〕、本発明のES細胞を分化させて
得られる本発明のDNA発現不全細胞は、インビトロに
おける本発明のポリペプチドの細胞生物学的検討におい
て有用である。本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物
は、該動物のmRNA量を公知方法を用いて測定して間
接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区
別することが可能である。該非ヒト哺乳動物としては、
前記と同様のものが用いられる。本発明のDNA発現不
全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製し
たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマ
ウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベク
ターの本発明のDNAが不活性化されたDNA配列が遺
伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵
細胞の染色体上の本発明のDNAと入れ換わる相同組換
えをさせることにより、本発明のDNAをノックアウト
させることができる。本発明のDNAがノックアウトさ
れた細胞は、本発明のDNA上またはその近傍のDNA
配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解
析またはターゲッティングベクター上のDNA配列と、
ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発
明のDNA以外の近傍領域のDNA配列とをプライマー
としたPCR法による解析で判定することができる。非
ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換
えにより、本発明のDNAが不活性化された細胞株をク
ローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、8細胞
期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製した
キメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植
する。作出された動物は正常な本発明のDNA座をもつ
細胞と人為的に変異した本発明のDNA座をもつ細胞と
の両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物
の生殖細胞の一部が変異した本発明のDNA座をもつ場
合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することに
より得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を
加えた本発明のDNA座をもつ細胞で構成された個体
を、例えば、コートカラーの判定等により選別すること
により得られる。このようにして得られた個体は、通
常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であ
り、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体同志を
交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドのホモ
発現不全個体を得ることができる。
【0040】卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞
核内にマイクロインジェクション法でDNA溶液を注入
することによりターゲッティングベクターを染色体内に
導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ること
ができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に
比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のDNA座に変
異のあるものを選択することにより得られる。このよう
にして本発明のDNAがノックアウトされている個体
は、交配により得られた動物個体も該DNAがノックア
ウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継
代を行うことができる。さらに、生殖系列の取得および
保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化
DNAの保有する雌雄の動物を交配することにより、該
不活化DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート
動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母
親動物に対して、正常個体1,ホモザイゴート複数にな
るような状態で飼育することにより効率的に得ることが
できる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することに
より、該不活化DNAを有するホモザイゴートおよびヘ
テロザイゴート動物を繁殖継代する。本発明のDNAが
不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のD
NA発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有
用である。また、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動
物は、本発明のポリペプチドにより誘導され得る種々の
生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドの生物
活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るの
で、これらの疾病の原因究明および治療法の検討に有用
である。 (8a)本発明のDNAの欠損や損傷等に起因する疾病
に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニン
グ方法本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発
明のDNAの欠損や損傷等に起因する疾病(炭水化物な
どのエネルギー源の代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)
異常(例えば糖尿病、肥満症など)、組織の成長・増殖
・分化阻害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成異常
(例えば強皮症など)、組織の線維化(例えば、肝硬変
・肺線維症、強皮症または腎線維症など)、循環器障害
(末梢動脈疾患、心筋梗塞または心不全など)、動脈硬
化、内分泌障害、体液バランス異常、中枢性疾患、免疫
系疾患(例えばアレルギー、炎症、自己免疫疾患等)、
血管新生障害等)に対して治療・予防効果を有する化合
物のスクリーニングに用いることができる。すなわち、
本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に試
験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定すること
を特徴とする、本発明のDNAの欠損や損傷等に起因す
る疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニン
グ方法において用いられる本発明のDNA発現不全非ヒ
ト哺乳動物としては、前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非
ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等が挙げられ、
これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の
化合物であってもよい。具体的には、本発明のDNA発
現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理
の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症
状等の変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を
試験することができる。試験動物を試験化合物で処理す
る方法としては、例えば、経口投与、静脈注射等が用い
られ、試験動物の症状、試験化合物の性質等にあわせて
適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量
は、投与方法、試験化合物の性質等にあわせて適宜選択
することができる。例えば、膵臓機能障害に対して治療
・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を
行い、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与
し、該動物の血糖値および体重変化等を経時的に測定す
る。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合
物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、
本発明のポリペプチドの欠損や損傷等によって引き起こ
される疾患(炭水化物などのエネルギー源の代謝調節
(糖代謝、脂質代謝など)異常(例えば糖尿病、肥満症
など)、組織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機能
低下、結合組織の形成異常(例えば強皮症など)、組織
の線維化(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮症または腎
線維症など)、循環器障害(末梢動脈疾患、心筋梗塞ま
たは心不全など)、動脈硬化、内分泌障害、体液バラン
ス異常、中枢性疾患、免疫系疾患(例えばアレルギー、
炎症、自己免疫疾患等)、血管新生障害等)に対して治
療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒
性な治療・予防剤等の医薬として使用することができ
る。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から
誘導される化合物も同様に用いることができる。
【0041】該スクリーニング方法で得られた化合物は
塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理
学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸)や塩基(例
アルカリ金属)等との塩が用いられ、とりわけ生理学的
に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩として
は、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素
酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩等が用いられ
る。該スクリーニング方法で得られた化合物またはその
塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドを
含有する医薬と同様にして製造することができる。この
ようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、
例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、ラット、マウス、モ
ルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、
イヌ、サル等)に対して投与することができる。該化合
物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与
ルート等により差異はあるが、例えば、例えば、代謝調
節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例えば糖尿病、肥満
症など)、組織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機
能低下、結合組織の形成異常(例えば強皮症など)、組
織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮症または
腎線維症など)、循環器障害(末梢動脈疾患、心筋梗塞
または心不全など)、動脈硬化、内分泌障害、体液バラ
ンス異常、中枢性疾患、免疫系疾患(例えばアレルギ
ー、炎症、自己免疫疾患等)、血管新生障害等の治療目
的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重
60kgとして)においては、一日につき該化合物を約
0.01〜1000mg、好ましくは約0.1〜1000
mg、さらに好ましくは約1.0〜200mg、より好
ましくは約1.0〜50mg投与する。非経口的に投与
する場合は、該化合物の1回投与量は投与対象、対象疾
患等によっても異なるが、例えば、代謝調節(糖代謝、
脂質代謝など)異常(例えば糖尿病、肥満症など)、組
織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機能低下、結合
組織の形成異常(例えば強皮症など)、組織の線維化
(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮症または腎線維症な
ど)、循環器障害(末梢動脈疾患、心筋梗塞または心不
全など)、動脈硬化、内分泌障害、体液バランス異常、
中枢性疾患、免疫系疾患(例えばアレルギー、炎症、自
己免疫疾患等)、血管新生障害等の治療目的で該化合物
を注射剤の形で通常成人(60kgとして)に投与する
場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程
度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましく
は約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに
換算した量を投与することができる。
【0042】(8b)本発明のDNAに対するプロモー
ターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニン
グ方法本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動
物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を
検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロ
モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング方法を提供する。上記スクリーニン
グ方法において、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動
物としては、前記した本発明のDNA発現不全非ヒト哺
乳動物の中でも、本発明のDNAがレポーター遺伝子を
導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子
が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現
しうるものが用いられる。試験化合物としては、前記と
同様のものが挙げられる。レポーター遺伝子としては、
前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺
伝子(lacZ)、可溶性アルカリフォスファターゼ遺
伝子またはルシフェラーゼ遺伝子等が好適である。本発
明のDNAをレポーター遺伝子で置換された本発明のD
NA発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が
本発明のDNAに対するプロモーターの支配下に存在す
るので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をト
レースすることにより、プロモーターの活性を検出する
ことができる。例えば、本発明のポリペプチドをコード
するDNA領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子(lacZ)で置換している場合、本来、本
発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペ
プチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従
って、例えば、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリ
ル−β−D−ガラクトピラノシド(X−gal)のよう
なβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色
することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生
体内における発現状態を観察することができる。具体的
には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織
切片をグルタルアルデヒド等で固定し、リン酸緩衝生理
食塩液(PBS)で洗浄後、X−galを含む染色液
で、室温または37℃付近で、約30分ないし1時間反
応させた後、組織標本を1mM EDTA/PBS溶液
で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を
停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、
lacZをコードするmRNAを検出してもよい。上記
スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその
塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、
本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または
阻害する化合物である。該スクリーニング方法で得られ
た化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩とし
ては、生理学的に許容される酸(例、無機酸)や塩基
(例、有機酸)等との塩が用いられ、とりわけ生理学的
に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩として
は、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素
酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩等が用いられ
る。本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進す
る化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現
を促進し、該ポリペプチドの機能を促進することができ
るので、例えば、炭水化物などのエネルギー源の代謝調
節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例えば糖尿病、肥満
症など)、組織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機
能低下、結合組織の形成異常(例えば強皮症など)、組
織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮症または
腎線維症など)、循環器障害(末梢動脈疾患、心筋梗塞
または心不全など)、動脈硬化、内分泌障害、体液バラ
ンス異常、中枢性疾患、免疫系疾患(例えばアレルギ
ー、炎症、自己免疫疾患等)、血管新生障害等の種々の
疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤等の医薬とし
て有用である。さらに、上記スクリーニングで得られた
化合物から誘導される化合物も同様に用いることができ
る。該スクリーニング方法で得られた化合物またはその
塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドま
たはその塩を含有する医薬と同様にして製造することが
できる。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性
であるので、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、ラッ
ト、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等)に対して投与すること
ができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例え
ば、代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例えば糖
尿病、肥満症など)、組織の成長・増殖・分化阻害、生
殖機能の機能低下、結合組織の形成異常(例えば強皮症
など)、組織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維症、強
皮症または腎線維症など)、循環器障害(末梢動脈疾
患、心筋梗塞または心不全など)、動脈硬化、内分泌障
害、体液バランス異常、中枢性疾患、免疫系疾患(例え
ばアレルギー、炎症、自己免疫疾患等)、血管新生障害
等の治療目的で本発明のDNAに対するプロモーター活
性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人
(体重60kgとして)においては、一日につき該化合
物を約0.01〜1000mg、好ましくは約0.1〜1
000mg、さらに好ましくは約1.0〜200mg、
より好ましくは約1.0〜50mg投与する。非経口的
に投与する場合は、該化合物の1回投与量は投与対象、
対象疾患等によっても異なるが、例えば、代謝調節(糖
代謝、脂質代謝など)異常(例えば糖尿病、肥満症な
ど)、組織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機能低
下、結合組織の形成異常(例えば強皮症など)、組織の
線維化(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮症または腎線
維症など)、循環器障害(末梢動脈疾患、心筋梗塞また
は心不全など)、動脈硬化、内分泌障害、体液バランス
異常、中枢性疾患、免疫系疾患(例えばアレルギー、炎
症、自己免疫疾患等)、血管新生障害等の治療目的で本
発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合
物を注射剤の形で通常成人(60kgとして)に投与す
る場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程
度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましく
は約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに
換算した量を投与することができる。一方、例えば、本
発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合
物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgと
して)においては、一日につき該化合物を約0.1〜1
000mg、好ましくは約1.0〜200mg、より好
ましくは約1.0〜50mg投与する。非経口的に投与
する場合は、該化合物の1回投与量は投与対象、対象疾
患等によっても異なるが、本発明のDNAに対するプロ
モーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人
(60kgとして)に投与する場合、一日につき該化合
物を約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜
20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、60kg当たりに換算した量を投与すること
ができる。
【0043】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸等を略号で表示する場合、IUPAC−IUB Co
mmission on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとす
る。 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA :相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA :メッセンジャーリボ核酸 dATP :デオキシアデノシン三リン酸 dTTP :デオキシチミジン三リン酸 dGTP :デオキシグアノシン三リン酸 dCTP :デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA :エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム Gly又はG :グリシン Ala又はA :アラニン Val又はV :バリン Leu又はL :ロイシン Ile又はI :イソロイシン Ser又はS :セリン Thr又はT :スレオニン Cys又はC :システイン Met又はM :メチオニン Glu又はE :グルタミン酸 Asp又はD :アスパラギン酸 Lys又はK :リジン Arg又はR :アルギニン His又はH :ヒスチジン Phe又はF :フェニルアラニン Tyr又はY :チロシン Trp又はW :トリプトファン Pro又はP :プロリン Asn又はN :アスパラギン Gln又はQ :グルタミン pGlu :ピログルタミン酸 Hse :ホモセリン
【0044】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Me :メチル基 Et :エチル基 Bu :ブチル基 Ph :フェニル基 TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキサミド基 Tos :p−トルエンスルフォニル CHO :ホルミル Bzl :ベンジル Cl2−Bzl :2,6−ジクロロベンジル Bom :ベンジルオキシメチル Z :ベンジルオキシカルボニル Cl−Z :2−クロロベンジルオキシカルボニル Br−Z :2−ブロモベンジルオキシカルボニル Boc :t−ブトキシカルボニル DNP :ジニトロフェニル Trt :トリチル Bum :t−ブトキシメチル Fmoc :N−9−フルオレニルメトキシカルボニル HOBt :1−ヒドロキシベンズトリアゾール HOOBt :3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ− 1,2,3−ベンゾトリアジン HONB :1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド DCC :N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【0045】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 [配列番号:1]実施例1で用いられたプライマーの塩
基配列を示す。 [配列番号:2]実施例1及び実施例3で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 [配列番号:3]本発明の新規タンパク質前駆体(ヒト
型)のアミノ酸配列を示す。 [配列番号:4]実施例1及び実施例2で判明した本発
明の新規タンパク質前駆体(ヒト型)をコードするcD
NA断片の塩基配列を示す。 [配列番号:5]実施例2及び実施例4で用いられたプ
ライマーの塩基配列を示す。 [配列番号:6]実施例4で用いられたプライマーの塩
基配列を示す。 [配列番号:7]新規ポリペプチドのA鎖(ヒト型)の
アミノ酸配列を示す [配列番号:8]新規ポリペプチドのB鎖(ヒト型)の
アミノ酸配列を示す [配列番号:9]実施例2で用いられたプライマーの塩
基配列を示す。 [配列番号:10]実施例2で用いられたプライマーの
塩基配列を示す。 [配列番号:11]実施例2で用いられたプライマーの
塩基配列を示す。 [配列番号:12]実施例3で得られた本発明の新規タ
ンパク質前駆体(ヒト型)をコードするcDNA断片の
中のオープンリーディングフレーム(ORF)の塩基配
列を示す。 [配列番号:13]実施例3で用いられたプライマーの
塩基配列を示す。 [配列番号:14]実施例3で用いられたプライマーの
塩基配列を示す。 [配列番号:15]A鎖(ヒト型)をコードするDNA
の塩基配列を示す。 [配列番号:16]B鎖(ヒト型)をコードするDNA
の塩基配列を示す。 [配列番号:17]本発明の新規タンパク質前駆体(ラ
ット型)のアミノ酸配列を示す。 [配列番号:18]配列番号:17で表されるアミノ酸
配列をコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:19]A鎖(ラット型・マウス型)のアミ
ノ酸配列を示す。 [配列番号:20]A鎖(ラット型)のアミノ酸配列を
コードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:21]B鎖(ラット型・マウス型)のアミ
ノ酸配列を示す。 [配列番号:22]B鎖(ラット型)のアミノ酸配列を
コードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:23]本発明の新規タンパク質前駆体(マ
ウス型)のアミノ酸配列を示す。 [配列番号:24]配列番号:23で表されるアミノ酸
配列をコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:25]A鎖(マウス型)のアミノ酸配列を
コードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:26]B鎖(マウス型)のアミノ酸配列を
コードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:27]後述の実施例5で用いられたプライ
マーR1の塩基配列を示す。 [配列番号:28]後述の実施例5で用いられたプライ
マーR2の塩基配列を示す。 [配列番号:29]後述の実施例5で用いられたプライ
マーL1の塩基配列を示す。 [配列番号:30]後述の実施例5で用いられたプライ
マーR8の塩基配列を示す。
【0046】[配列番号:31]後述の実施例5で用い
られたプライマーR9の塩基配列を示す。 [配列番号:32]後述の実施例5で用いられたプライ
マーR6の塩基配列を示す。 [配列番号:33]後述の実施例5で用いられたプライ
マーR7の塩基配列を示す。 [配列番号:34]後述の実施例5で用いられたプライ
マーU1の塩基配列を示す。 [配列番号:35]後述の実施例5で用いられたプライ
マーU2の塩基配列を示す。 [配列番号:36]後述の実施例6、実施例7で用いら
れたプライマーUPの塩基配列を示す。 [配列番号:37]後述の実施例6で用いられたプライ
マーRLの塩基配列を示す。 [配列番号:38]後述の実施例7で用いられたプライ
マーMLの塩基配列を示す。 [配列番号:39]後述の実施例6で得られたラットO
RFを含むDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:40]後述の実施例7で得られたマウスO
RFを含むDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:41]後述の実施例5で明らかになったラ
ット型前駆体をコードするDNAのうち第1エクソン領
域の塩基配列を示す。 [配列番号:42]後述の実施例5で明らかになったラ
ット型前駆体をコードするDNAのうち第2エクソン領
域の塩基配列を示す。 [配列番号:43]後述の実施例5で明らかになったマ
ウス型前駆体をコードするDNAのうち第1エクソン領
域の塩基配列を示す。 [配列番号:44]後述の実施例5で明らかになったマ
ウス型前駆体をコードするDNAのうち第2エクソン領
域の塩基配列を示す。 [配列番号:45]本発明の新規タンパク質前駆体(ブ
タ型)のアミノ酸配列を示す。 [配列番号:46]配列番号:45で表されるアミノ酸
配列をコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:47]A鎖(ブタ型)のアミノ酸配列を示
す。 [配列番号:48]A鎖(ブタ型)のアミノ酸配列をコ
ードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:49]B鎖(ブタ型)のアミノ酸配列を示
す。 [配列番号:50]B鎖(ブタ型)のアミノ酸配列をコ
ードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:51]本発明の新規タンパク質前駆体(ラ
ット型バリアント)のアミノ酸配列を示す。 [配列番号:52]配列番号:51で表されるアミノ酸
配列をコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:53]後述の実施例8で用いられたセンス
鎖プライマーex1F1の塩基配列を示す。 [配列番号:54]後述の実施例8で用いられたアンチ
センス鎖プライマーex1R1の塩基配列を示す。 [配列番号:55]後述の実施例8で得られたブタ型前
駆体タンパク質のN末端からシグナルペプチドを経てB
鎖ペプチドまでをコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:56]後述の実施例8で得られたPCR産
物の塩基配列を示す。 [配列番号:57]後述の実施例8で用いられたオリゴ
DNA(PORex1F1)の塩基配列を示す。 [配列番号:58]後述の実施例8で用いられたオリゴ
DNA(PORex1F2)の塩基配列を示す。 [配列番号:59]後述の実施例8で明らかになったブ
タ型前駆体をコードするDNAのうち第1エクソン領域
の塩基配列を示す。 [配列番号:60]後述の実施例8で明らかになったブ
タ型前駆体をコードするDNAのうち第2エクソン領域
の塩基配列を示す。 [配列番号:61]後述の実施例9で明らかになったラ
ット型前駆体バリアントをコードするオープンリーディ
ングフレーム(ORF)を含むDNAのの塩基配列を示
す。 [配列番号:62]後述の実施例9で明らかになったラ
ット型前駆体バリアントの一部をコードするDNAの塩
基配列を示す。 [配列番号:63]後述の実施例9で明らかになった配
列番号:62で表されるDNA塩基配列でコードされる
アミノ酸配列を示す。 [配列番号:64]後述の実施例19で用いられたセン
ス鎖プライマーの塩基配列を示す。 [配列番号:65]後述の実施例19で用いられたアン
チセンス鎖プライマ−の塩基配列を示す。 [配列番号:66]後述の実施例19で用いられたセン
ス鎖プライマーの塩基配列を示す。 [配列番号:67]後述の実施例19で用いられたアン
チセンス鎖プライマ−の塩基配列を示す。 [配列番号:68]後述の実施例19で得られた融合蛋
白質をコードするDNAの塩基配列を示す。 [配列番号:69]後述の実施例19で得られた融合蛋
白質のアミノ酸配列を示す。 [配列番号:70]後述の実施例23で用いられたセン
ス鎖プライマーの塩基配列を示す。 [配列番号:71]後述の実施例23で用いられたアン
チセンス鎖プライマ−の塩基配列を示す。 [配列番号:72]後述の実施例23で用いられたTaqM
anプローブのオリゴDNA部分の塩基配列を示す。 [配列番号:73]後述の実施例23で用いられたセン
ス鎖プライマ−の塩基配列を示す。 [配列番号:74]後述の実施例23で用いられたアン
チセンス鎖プライマ−の塩基配列を示す。 [配列番号:75]後述の実施例23で用いられたTaqM
anプローブのオリゴDNA部分の塩基配列を示す。 [配列番号:76]後述の実施例23で用いられたセン
ス鎖プライマ−の塩基配列を示す。 [配列番号:77]後述の実施例23で用いられたアン
チセンス鎖プライマ−の塩基配列を示す。 [配列番号:78]後述の実施例23で用いられたTaqM
anプローブのオリゴDNA部分の塩基配列を示す。 [配列番号:79]後述の実施例29で用いられた合成
DNAの塩基配列を示す。 [配列番号:80]後述の実施例29で用いられた合成
DNAの塩基配列を示す。 [配列番号:81]後述の実施例29で用いられた合成
DNAの塩基配列を示す。 [配列番号:82]後述の実施例29で用いられた合成
DNAの塩基配列を示す。 [配列番号:83]後述の実施例29で用いられた合成
DNAの塩基配列を示す。 [配列番号:84]後述の実施例30で用いられた合成
DNAの塩基配列を示す。 [配列番号:85]後述の実施例30で用いられた合成
DNAの塩基配列を示す。 [配列番号:86]後述の実施例30で用いられた合成
DNAの塩基配列を示す。
【0047】後述の実施例1で得られた形質転換体エシ
ェリヒア コリ(Escherichia coli)INVαF’/pVH7U
5Lhは、2000年4月12日から日本国茨城県つくば
市東1−1−3、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所(NIBH)に寄託番号FERM BP−71
30として寄託されており、2000年4月18日から
日本国大阪府大阪市十三本町2−17−85、財団法人
・発酵研究所(IFO)に寄託番号IFO 16423
として寄託されている。後述の実施例3で得られた形質
転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)INVα
F’/pVHNC5Lhは、2000年4月18日から日本国茨
城県つくば市東1−1−3、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所(NIBH)に寄託番号FERM
BP−7139として寄託されており、2000年4月
18日から日本国大阪府大阪市十三本町2−17−8
5、財団法人・発酵研究所(IFO)に寄託番号IFO
16424として寄託されている。後述の実施例6で
得られたプラスミド pVHUPTrは、2000年7月3日か
ら日本国茨城県つくば市東1−1−3、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所(NIBH)に寄託番号
FERM BP−7204として寄託されている。後述
の実施例6で得られた形質転換体エシェリヒアコリ(Es
cherichia coli)TOP10/pVHUPTrは、2000年7月1
7日から日本国大阪府大阪市十三本町2−17−85、
財団法人・発酵研究所(IFO)に寄託番号IFO 1
6455として寄託されている。後述の実施例7で得ら
れたプラスミド pVHUPTmは、2000年7月3日から日
本国茨城県つくば市東1−1−3、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所(NIBH)に寄託番号FE
RM BP−7205として寄託されている。後述の実
施例7で得られた形質転換体エシェリヒア コリ(Esch
erichia coli)TOP10/pVHUPTmは、2000年7月17
日から日本国大阪府大阪市十三本町2−17−85、財
団法人・発酵研究所(IFO)に寄託番号IFO 16
454として寄託されている。後述の実施例9で得られ
た形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli)
TOP10/pVHABDrは、2000年8月10日から日本国茨
城県つくば市東1−1−3、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所(NIBH)に寄託番号FERM
BP−7268として寄託されており、2000年8月
3日から日本国大阪府大阪市十三本町2−17−85、
財団法人・発酵研究所(IFO)に寄託番号IFO16
461として寄託されている。後述の実施例19で得ら
れた形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia col
i)BL21-Gold (DE3)/pETVHMMhは、2001年2月1日
から日本国大阪府大阪市十三本町2−17−85、財団
法人・発酵研究所(IFO)に寄託番号IFO 165
31として寄託されている。後述の実施例14で得られ
たハイブリドーマ HK4-144-10は、2001年3月26
日から茨城県つくば市東1−1−3、日本国経済産業省
産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所(NIB
H)に寄託番号FERM BP−7520として寄託さ
れている。
【0048】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・
クローニング(Molecular cloning)に記載されている
方法に従った。
【0049】実施例1 新規ポリペプチドをコードするcDNAのクローニング 本発明の新規ポリペプチドをコードするcDNAは以下
のようなPCR法により取得した。配列番号:1で表さ
れるオリゴDNA(CTGGCGGTATGGGTGC
TGAC)をセンス鎖プライマーとして、配列番号:2
で表されるオリゴDNA(ACTGGGGCATTGG
TCCTGGTG)をアンチセンス鎖プライマーとして
各々5pmol、100mM トリス・塩酸緩衝液(pH
9.0)5μl、500mM 塩化カリウム溶液 5μ
l、25mM 塩化マグネシウム溶液 3μl、2.5m
M デオキシリボヌクレオチド溶液 4μl、 鋳型DN
AとしてHuman Testis polyA+ RN
A (クロンテック(株))より調製したcDNA溶液
1μl、およびTaKaRa TaqTM 0.5μlを含
む混合液50μlを調製し、TaKaRa PCR Th
ermal CyclerMP(宝酒造(株))を用いて
最初に95℃で1分間置いた後、95℃で30秒、 6
5℃で1分、72℃で1分を1サイクルとして35サイ
クル各反応を繰り返し、さらに72℃、10分間反応さ
せるプログラムでPCR反応を行った。反応終了液を
1.0%アガロースゲルを用いて電気泳動後エチジウム
ブロマイド染色し、分子量マーカー換算で0.45kb付
近の位置にPCR反応で増幅されたDNAに対応するバ
ンドを確認した。次にGENE CLEAN SPIN
KIT(BIO101社)を用いて該DNA断片を回収
し、塩基配列を決定する為にpCR(登録商標)2.1
(インビトロジェン社)を用いてTAクローニング
し、該プラスミドを大腸菌INVαF’株のコンピテン
トセルに導入した。アンピシリン含有LB寒天培地上で
出現するアンピシリン耐性形質転換株のコロニーの中か
ら外来DNA断片が挿入されていたプラスミドを保持し
ていたクローンを選択し、該プラスミドDNA、pVH
7U5Lhを調製した。挿入DNAの塩基配列を決定す
るため、pVH7U5Lhを鋳型DNA、上記の配列番
号:1で表されるオリゴDNAと上記の配列番号:2で
表されるオリゴDNAをシーケンスプライマーとし、A
BI PRISMTM BigDye Terminato
r Cycle Sequencing FS Ready
Reaction Kit(パーキンエルマー社)を用
いたシーケンス反応を添付資料の条件にしたがって、T
aKaRa PCR Thermal Cycler MP
(宝酒造(株))で行った後、該反応試料をDNAシーケ
ンサーABI PRISMTM 377(パーキンエルマー
社)で分析した。その結果、pVH7U5Lhには、配
列番号:4で示される49番目から494番目に相当す
る塩基配列、すなわち配列番号:3で表される142個
のアミノ酸からなる新規ポリペプチドのうち、N末端の
9アミノ酸残基を除くC末端側の133残基のアミノ酸
配列に相当する領域をコードしていることが判明した。
該当部分のアミノ酸配列には、インスリン/IGF/リラ
キシンファミリーに特徴的な一次構造(N末端の疎水性
領域、塩基性アミノ酸残基で挟まれ、かつCys残基を
有するA鎖(配列番号:7)及びB鎖(配列番号:
8))が見られた。こうして得られたプラスミドpVH
7U5Lhを大腸菌INVαF’に導入し、形質転換体
Escherichia coli INVαF’/ p
VH7U5Lhを得た。
【0050】実施例2 新規ポリペプチドをコードする
cDNA の5' RACE及び3' RACE解析 以下の要領で5' RACE (Rapid Amplification of cDN
A End)PCR及び3'RACEPCRを行うことにより、新
規ポリペプチドをコードする完全長cDNAの解析を行
った。RACE PCRの鋳型DNAには、MarathonTM-Read
y cDNA Human Testis(クロンテック社)を用い
た。実施例1で得られたpVH7U5Lhの挿入DNA
配列を基に、5' RACEPCRの一次PCR反応では、配
列番号:9で示されるオリゴDNAをアンチセンス鎖プ
ライマーとして、MarathonTM-Ready cDNA Human Te
stis添付のAP1をセンス鎖プライマーとして使用し
た。続くnested PCRでは、配列番号:10で示され
るオリゴDNAをアンチセンス鎖プライマーとして、Ma
rathonTM-Ready cDNA Human Testis添付のAP2を
センス鎖プライマーとして使用した。反応条件は、キッ
トに付属の使用説明書に従って行い、PCRのサイクル
は1回目が35回、続くnested PCRは20回で行っ
た。増幅されたPCR断片を2.0%アガロースゲルを
用いて分離し、電気泳動溶出で回収した後、配列番号:
10で表される合成DNAをシークエンス用プライマー
に用いて、直接該PCR断片の塩基配列を決定した。そ
の結果、配列番号:4で示される1番目から48番目に
相当する塩基配列、及び配列番号:3で示される1番目
から9番目に相当するアミノ酸配列が新たに明らかにな
った。次に実施例1で得られたpVH7U5Lhの挿入
DNA配列を基に3'RACE PCRを以下の要領で行っ
た。一次PCR反応では、センス鎖プライマーとして配
列番号:5で表されるオリゴDNAを、またアンチセン
ス鎖プライマーとしてはMarathonTM-Ready cDNA Hu
man Testis添付のAP1を用い、続くnested PCRで
は、センス鎖プライマーとして配列番号:11で表され
るオリゴDNAを、またアンチセンス鎖プライマーとし
てはMarathonTM-Ready cDNA Human Testis添付のA
P2を用いて反応を行った。反応終了液を2.0%アガ
ロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド
染色したところ、0.7kbの位置にRACE PCR産物
としてバンドが検出された。そこで、該DNA断片をキ
アクィックゲルエキストラクションキット(キアゲン
社)を用いて回収、精製し、塩基配列を決定する為にpC
R(登録商標)2.1-TOPO(インビトロジェン社)を用い
てTAクローニングし、該プラスミドを大腸菌DH5α株
のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有LB寒
天培地上で出現してきたアンピシリン耐性形質転換株の
コロニーの中から外来DNA断片が挿入されていたプラ
スミドを保持していたクローン4株を選択し、各プラス
ミドDNAを調製後、挿入DNA断片の塩基配列を決定した。
その結果、全てのクローンのプラスミドに、配列番号:
11で表されるnested primerを起点とする配列番号:
4で示される413番目から1061番目に相当する塩
基配列に続きさらにその3’側にポリA配列が付加した
DNA断片が挿入されていることがわかった。以上の結果
から、配列番号:4のオープンリーディングフレームが
明らかとなり、該オープンリーディングフレームにコー
ドされている配列番号:3で表されるタンパク質の特徴
(シグナル配列、塩基性アミノ酸残基で挟まれ、かつC
ys残基を有するA鎖(配列番号:7)及びB鎖(配列
番号:8))から、本発明の新規タンパク質は、インス
リン/IGF/リラキシンファミリーに属する新しい分泌
性生体機能調節タンパク質の前駆体であることが判明し
た(図1)。
【0051】実施例3 新規ポリペプチド(前駆体ポリ
ペプチド)をコードする 全長cDNAのクローニング 本発明の新規ポリペプチド(前駆体ポリペプチド)をコ
ードする全長cDNAは以下のような5'-RACE法により
取得した。5'-RACE System(GIBCO BRL社)を用
いて、実施例1で得られたpVH7U5Lhの挿入DN
A配列を基に作製した配列番号:13で表されるオリゴ
DNA(GGGCAGGGGTCTCTGTGT)をプ
ライマーとし、鋳型としてHuman Testis p
olyA+ RNA (クロンテック(株))を用いた逆
転写反応によりcDNA溶液を調製した。このcDNA
を鋳型とし、センス鎖プライマーとして5'-RACE System
添付のAAPを、アンチセンス鎖プライマーとして上記
の配列番号:13で表されるオリゴDNAを用いて一次
PCR反応を行った。次にセンス鎖プライマーとして、
実施例1で得られたpVH7U5Lhの挿入DNA配列
を基に作製した配列番号:14で表されるオリゴDNA
(TTCAAAGCATCTCCGTCCAGC)を、
アンチセンス鎖プライマーとして前記の配列番号:2で
表されるオリゴDNA(ACTGGGGCATTGGT
CCTGGTG)を用いてnested PCRを行っ
た。この反応終了液を1.0%アガロースゲルを用いて
電気泳動し、エチジウムブロマイド染色したところ、
0.5kbの位置にバンドが検出された。次に該DNA断
片をGENE CLEAN SPIN KIT(BIO1
01社)を用いて回収し、塩基配列を決定するためにp
CR(登録商標)2.1(インビトロジェン社)を用い
てTAクローニングし、該プラスミドを大腸菌INVα
F’株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含
有LB寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株
のコロニーの中から外来DNA断片が挿入されていたプ
ラスミドを保持していたクローンを選択し、該プラスミ
ドDNA、pVHNC5Lhを調製した。挿入DNAの
塩基配列を決定するため、 pVHNC5Lhを鋳型D
NA、配列番号:14で表されるオリゴDNA(TTC
AAAGCATCTCCGTCCAGC)と配列番号:
2で表されるオリゴDNA(ACTGGGGCATTG
GTCCTGGTG)をシーケンスプライマーとし、A
BI PRISMTM BigDye Terminato
r Cycle Sequencing FS Ready
Reaction Kit(パーキンエルマー社)を
用いたシーケンス反応を添付資料の条件にしたがって、
TaKaRa PCR Thermal Cycler M
P(宝酒造(株))で行った後、該反応試料をDNAシー
ケンサーABI PRISMTM377(パーキンエルマ
ー社)で分析した。その結果、pVHNC5Lhには、
配列番号:4で示される1番目から494番目に相当す
る塩基配列、すなわち配列番号:3で表される全142
個のアミノ酸からなる新規ポリペプチドをコードするオ
ープンリーディングフレーム(ORF)が含まれること
が判明した。(図1)。こうして得られたプラスミドp
VHNC5Lhを大腸菌INVαF’に導入し、形質転
換体Escherichia coli INVαF’
/ pVHNC5Lhを得た。
【0052】実施例4 新規ポリペプチドの組織発現分
布の解析 以下に示すPCR法によって新規ポリペプチドの発現組
織を調べた。まず、配列番号:5で表されるオリゴDN
A(CCGGATGCAGATGCTGATGAA)を
センス鎖プライマーとして、配列番号:6で表されるオ
リゴDNA(TGGTCAAAGGGCAGGGTTG
G)をアンチセンス鎖プライマーとして各々2.5pm
ol、100mM トリス・塩酸緩衝液(pH9.0)
2.5μl、500mM 塩化カリウム溶液 2.5μ
l、25mM 塩化マグネシウム溶液 1.5μl、2.
5mM デオキシリボヌクレオチド溶液 2μl、 鋳型
DNAとしてHuman multiple tissu
e cDNA(MTCTM) panels(クロンテック
(株))の各組織別cDNA溶液 1μl、およびTaK
aRa TaqTM 0.25μlを含む混合液25μlを
調製し、TaKaRaPCR Thermal Cycl
er MP(宝酒造(株))を用いて最初に95℃で1分
間置いた後、95℃で30秒、66℃で1分、72℃で
1分を1サイクルとして35サイクル各反応を繰り返す
プログラムでPCR反応を行った。反応終了液を1.5
%アガロースゲルを用いて電気泳動後、アガロースゲル
をエチジウムブロマイド染色し増幅産物の有無を調べ
た。その結果、新規ポリペプチドをコードするDNAに
由来する0.45kbのDNA断片が主に胎盤、肺、精
巣、下垂体などの反応液から検出されたことから、本新
規ポリペプチドがこれらの生体組織で発現していること
が判った(図2)。
【0053】実施例5 新規ポリペプチド(前駆体ポリ
ペプチド)のラットカウンターパートおよびマウスカウ
ンターパートをコードする染色体遺伝子およびcDNAの配
列解析 実施例3で得られたヒト由来新規ポリペプチド(前駆体
ポリペプチド)のラットカウンターパート及びマウスカ
ウンターパートをコードするcDNAをクローニングするた
め、まず両動物種における染色体遺伝子の構造を下記の
ようなgenome walking法で解析した。被検材料として
は、ラット染色体DNAについてはRat GenomeWalkerTM Ki
t(クロンテック社)を、またマウス染色体DNAについて
はMouse GenomeWalkerTM Kit(クロンテック社)を用い
た。方法はPCR反応用の酵素としてTaKaRa Ex TaqTM
(宝酒造)を用いた点を除いては各キットの添付資料に
従った。1回目の5’上流方向へのgenome walkingを行
うにあたって、まず、配列番号:12で表されるヒト新
規ポリペプチド(前駆体ポリペプチド)をコードするcD
NAの塩基配列をクエリー(query)にしてpublic EST (E
xpressed Sequence Tag)データベースから見出された、
該ポリペプチドのラットカウンターパートをコードする
cDNAの 3'側の一部の領域を含むと考えられるEST、AW52
3625およびAW521175の塩基配列を基に、これらの塩基配
列の一部に相補的な配列の3種のオリゴDNA(R1(配列
番号:27)、R2(配列番号:28)、L1(配列番号:
29))を化学合成し、gene specific primerとした。
その結果、ラット染色体DNAに関しては、1st PCRではL
1、続くnested PCRでR2を用いた反応系で、またマウ
ス染色体DNAに関しては1st PCRではR1、続くnested P
CRでR2を用いた反応系でそれぞれ特異的な増幅DNA断
片を得た。これらのDNA断片について、アダプタープラ
イマー(AP2)配列を末端とする側の各ゲノム由来の塩基
配列を既述の実施例の方法に準拠して決定し、その配列
を基に、さらに2回目の5’上流方向へのgenome walkin
gを進めるために新たなgene specific primerを設計し
た。すなわち、ラット染色体DNAに関しては、1st PCR用
にR8(配列番号:30)、nested PCR用にR9(配列番
号:31)、またマウス染色体DNAに関しては、1st PCR
用にR6(配列番号:32)、nested PCR用にR7(配列
番号:33)の計4種のオリゴDNAである。これらのプラ
イマーを用いて上述のRat GenomeWalkerTM Kit 、Mouse
GenomeWalkerTM Kitの各DNAサンプルに対して再度同様
な条件でPCR反応を行ったところ、マウス、ラット各々
について特異的な増幅DNA断片が新たに得られた。そこ
で、先の1回目のgenome walkingで得られたDNA断片共
々、各増幅DNA断片の塩基配列を決定し、実施例3で得
られた本発明ヒト新規ポリペプチド(前駆体ポリペプチ
ド)をコードするcDNAの塩基配列との相同性を比較しな
がら構造解析した。その結果、新規ポリペプチド(前駆
体ポリペプチド)のラットカウンターパートは、以上の
実験で判明したゲノムの塩基配列と上述のパブリックES
T配列(AW523625及びAW521175)から、配列番号:18
で示される420塩基のDNAでコードされる配列番号:17
で示される140個のアミノ酸残基からなるポリペプチド
であること、また該遺伝子はラット染色体上で1つの介
在配列を挟んで2つのエクソン(exon)から構成され、42
0塩基のうち、第1エクソンには配列番号:41で示さ
れる184塩基が、第2エクソンには配列番号:42で示
される236塩基がコードされていることが明らかとなっ
た。該ポリペプチドにはヒト新規ポリペプチド(前駆体
ポリペプチド)同様にインスリン/IGF/リラキシンフ
ァミリーに特徴的な配列、即ちシグナル配列、塩基性ア
ミノ酸残基で挟まれ、かつCys残基を有するA鎖(配列
番号:19)およびB鎖(配列番号:21)が含まれて
いた。また、該ラット新規ポリペプチドのヒト新規ポリ
ペプチドとの相同性は75.0%であった。また、マウスに
ついても、上記実験で本件新規ポリペプチドカウンター
パート遺伝子の5’側の領域と考えられる配列が得られ
たことから、次に残る3’側の配列とmRNAとしての発現
を併せて調べるための3’ RACE PCRを行った。RACE PCR
の鋳型DNAにはMarathonTM-Ready cDNA Mouse Testis
(クロンテック社)を用い、gene specific primerと
して、1回目のgenome walkingで得られた第2エクソン
相当領域の配列から、2種のオリゴDNA (U1(配列番
号:34)、U2(配列番号:35))を設計して各々化学
合成した。、1st PCR反応においては、U1をセンス鎖
プライマーとして、 またMarathonTM-Ready cDNA Mouse
Testis添付のAP1をアンチセンス鎖プライマーとして用
い、続くnested PCR反応においてはU2をセンス鎖プラ
イマーとして、またMarathonTM-Ready cDNA Mouse Test
is添付のAP2をアンチセンス鎖プライマーとして用い
た。これらのPCR反応の結果、単一のDNA断片が最終増幅
産物として得られ、既述の方法に準じて塩基配列を決定
したところ、該DNA断片にはU2を起点としてマウス第
2エクソン相当領域の塩基配列が終止コドンまで含ま
れ、さらにその3’側の非翻訳領域末端にはポリA付加シ
グナル配列とポリA配列が存在していた。このcDNA部分
配列と本実施例で得たマウス染色体DNA断片の一次構造
から、新規ポリペプチド(前駆体ポリペプチド)のマウ
スカウンターパートは配列番号:24で示される423塩
基のDNAでコードされる配列番号:23で示される141個
のアミノ酸残基からなるポリペプチドであること、また
該遺伝子はラット同様、染色体上で1つの介在配列を挟
んで2つのエクソン(exon)から構成され、423塩基のう
ち、第1エクソンには配列番号:43で示される187塩
基が、第2エクソンには配列番号:44で示される236
塩基がコードされていることが明らかとなった。該ポリ
ペプチドにはヒト新規ポリペプチド、また上記ラット新
規ポリペプチド同様にインスリン/IGF/リラキシンフ
ァミリーに特徴的な配列、即ちシグナル配列、塩基性ア
ミノ酸残基で挟まれ、かつCys残基を有するA鎖(配列
番号:19)およびB鎖(配列番号:21)が含まれて
いた。また、該マウス新規ポリペプチドのヒト新規ポリ
ペプチド、ラット新規ポリペプチドとの相同性はそれぞ
れ77.3%、92.1%であり、A鎖及びB鎖のアミノ酸配列
は上述したラット由来のそれと完全に一致していた。
【0054】実施例6 新規ポリペプチド(前駆体ポリ
ペプチド)のラットカウンターパートをコードする完全
長cDNAのクローニング 本発明の新規ポリペプチドラットカウンターパートをコ
ードする完全長cDNAは以下の要領でPCRを行うこ
とにより取得した。まず、センス鎖プライマーとして、
実施例5で得られた新規ポリペプチドマウスカウンター
パート遺伝子の5’側非翻訳領域塩基配列を基に化学合
成したオリゴDNA(UP(配列番号:36))を、ま
たアンチセンス鎖プライマーとして、実施例5記載のpu
blic EST、AW523625およびAW521175の塩基配列を基に化
学合成したオリゴDNA(RL(配列番号:37))を
各々5pmol、100mMトリス・塩酸緩衝液(pH
8.3) 5μl、500mM 塩化カリウム溶液 5μ
l、25mM 塩化マグネシウム溶液 3μl、2.5m
M デオキシリボヌクレオチド溶液 4μl、 鋳型DN
AとしてSDラット(9週齢)精巣由来total R
NAより調製したcDNA溶液 4μl、およびTaK
aRa TaqTM(宝酒造(株))0.5μlを含む混
合液50μlを調製した。次に該混合液に対して、Ta
KaRa PCR Thermal Cycler MP
(宝酒造(株))を用いて、最初に95℃で1分間置いた
後、95℃で30秒、 67℃で1分、72℃で1分を
1サイクルとして40サイクル各反応を繰り返し、さら
に72℃で10分間反応させるプログラムでPCR反応
を行った。反応終了液を1.0%アガロースゲルを用い
て電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、分子量マ
ーカー換算で0.45kb付近の位置にPCR反応で増
幅されたDNAに対応するバンドを確認した。次にGE
NE CLEAN SPIN KIT(BIO101社)
を用いて該DNA断片を回収し、塩基配列を決定する為
にpCR(登録商標)2.1−TOPO (インビトロ
ジェン社)にTAクローニングし、該プラスミドを大腸
菌TOP10株のコンピテントセル(インビトロジェン
社)に導入した。アンピシリン含有LB寒天平板培地上
の培養で出現してきたアンピシリン耐性形質転換株のコ
ロニーの中から外来DNA断片が挿入されていたプラス
ミドを保持していたクローンを選択し、該クローンより
プラスミドDNA、pVHUPTrを調製し、挿入DN
A断片の塩基配列を決定した。その結果、pVHUPT
rには、配列番号:17で示される140個のアミノ酸
からなる新規ポリペプチド前駆体のラットカウンターパ
ートをコードする配列番号:18で示される420塩基
からなるオープンリーディングフレーム(ORF)を含
む配列番号:39で示される470塩基対のDNA断片
が含まれることが判明した。こうして得られたラット新
規ポリペプチド(前駆体タンパク質)をコードするDN
Aを保持するプラスミドpVHUPTrを大腸菌( E
scherichia coli) TOP10に導入
し、形質転換体Escherichia coli T
OP10/pVHUPTrを得た。
【0055】実施例7 新規ポリペプチド(前駆体タン
パク質)のマウスカウンターパートをコードする完全長
cDNAのクローニング 本発明の新規ポリペプチドマウスカウンターパートをコ
ードする完全長cDNAは以下の要領でPCRを行うこ
とにより取得した。まず、センス鎖プライマーとして、
実施例5で得られた新規ポリペプチドマウスカウンター
パート遺伝子の5’側非翻訳領域塩基配列を基に化学合
成したオリゴDNA(UP(配列番号:36))を、ま
たアンチセンス鎖プライマーとして、実施例5で得られ
たマウスcDNA部分配列を基に化学合成したオリゴD
NA(ML(配列番号:38))を各々5pmol、1
00mM トリス・塩酸緩衝液(pH8.3) 5μl、
500mM 塩化カリウム溶液 5μl、25mM 塩化
マグネシウム溶液 3μl、2.5mM デオキシリボヌ
クレオチド溶液 4μl、 鋳型DNAとしてMarathonTM
-Ready cDNA Mouse Testis (クロンテック社)4
μl、およびTaKaRa TaqTM(宝酒造(株))
0.5μlを含む混合液50μlを調製した。次に該混
合液に対して、TaKaRa PCR Thermal
Cycler MP(宝酒造(株))を用いて、最初に9
5℃で1分間置いた後、95℃で30秒、 67℃で1
分、72℃で1分を1サイクルとして40サイクル各反
応を繰り返し、さらに72℃で10分間反応させるプロ
グラムでPCR反応を行った。反応終了液を1.0%ア
ガロースゲルを用いて電気泳動後、エチジウムブロマイ
ド染色し、分子量マーカー換算で0.45kb付近の位
置にPCR反応で増幅されたDNAに対応するバンドを
確認した。次にGENECLEAN SPIN KIT
(BIO101社)を用いて該DNA断片を回収し、塩
基配列を決定する為にpCR(登録商標)2.1−TO
PO(インビトロジェン社)にTAクローニングし、該
プラスミドを大腸菌TOP10株のコンピテントセル
(インビトロジェン社)に導入した。アンピシリン含有
LB寒天平板培地上の培養で出現してきたアンピシリン
耐性形質転換株のコロニーの中から外来DNA断片が挿
入されていたプラスミドを保持していたクローンを選択
し、該クローンよりプラスミドDNA、pVHUPTm
を調製し、挿入DNA断片の塩基配列を決定した。その
結果、pVHUPTmには、 配列番号:23で示され
る141個のアミノ酸からなる新規ポリペプチド前駆体
のマウスカウンターパートをコードする配列番号:24
で示される423塩基からなるオープンリーディングフ
レーム(ORF)を含む配列番号:40で示される47
5塩基対のDNA断片が含まれることが判明した。こう
して得られたマウス新規ポリペプチド(前駆体タンパク
質)をコードするDNAを保持するプラスミドpVHU
PTmを大腸菌( Escherichia coli
) TOP10に導入し、形質転換体Escheri
chiacoli TOP10/pVHUPTmを得
た。
【0056】実施例8 新規ポリペプチド(前駆体タン
パク質)ブタカウンターパートをコードする染色体遺伝
子の解析 まずブタ型新規ポリペプチド(前駆体タンパク質)の一
部をコードするDNA断片を以下のようなPCR法により取得
した。即ち、配列番号:53(ex1F1)で示されるオリゴD
NAをセンス鎖プライマーとして、配列番号:54(ex1R
1)で示されるオリゴDNAをアンチセンス鎖プライマーと
して各々20pmol含み、さらにPremix TaqT M (Ex TaqTM V
ersion)(宝酒造(株))20μl、鋳型DNAとしてブタgen
omic DNA(クロンテック社、#6651−1)1μlを含
む混合液40μlを調製し、サーマルサイクラー(GeneAmp
TM PCR system model 9700(PEバイオシステムズ社))
を用いて、94℃、2分、続いて94℃、10秒→55
℃、10秒→72℃、30秒を30サイクル繰り返し、
さらに72℃、1分30秒で伸長反応させるプログラム
でPCR反応を行った。反応終了液を2%アガロースゲル
で電気泳動後、そのゲルをエチジウムブロマイド染色し
たところ、PCR反応で増幅されたDNAが単一バンドとして
確認された。キアクィックゲルエキストラクションキッ
ト(キアゲン社)を用いて該DNA断片を回収し、塩基配
列を決定するためにpCRTM2.1-Topo(インビトロジェン
社)を用いてTAクローニングし、該プラスミドを大腸菌
(Escherichia coli)DH5αコンピテントセル(東洋紡績
(株))に導入した。アンピシリン含有LB寒天培地上で
出現してきたアンピシリン耐性形質転換株のコロニーの
中から、外来DNA断片が挿入されていたプラスミドを
保持していたクローンを選択し、挿入DNAの塩基配列
を決定するため、アンピシリン存在下で再培養したクロ
ーン菌体から調製した該プラスミドを鋳型DNA、市販
プライマーDNA(PRM-007, PRM-008(東洋紡績
(株)))をシーケンスプライマーとし、ABI PRISMTM
BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reacti
on Kit(PEバイオシステムズ社)を用いたシーケンス反
応を添付資料の条件に準拠してサーマルサイクラー(Ge
neAmpTM PCR system model 9700(PEバイオシステム
ズ社))で行った後、該反応試料をDNAシーケンサー
ABI PRISM 377(PEバイオシステムズ社)で分析した。
その結果、該PCR産物は、上記プライマー配列を両末
端に有し、かつその内側にはブタ型前駆体タンパク質の
N末端からシグナルペプチドを経てB鎖ペプチドまでを
コードする配列番号:55で示される塩基配列を含む配
列番号:56で示される239塩基対のDNAを含むD
NA断片であることが判明した。そこで、次にブタ型前
駆体タンパク質をコードする染色体遺伝子について、さ
らに下流(3’)側の構造を調べるために、genome walkin
gを行った。被検材料としては、上述のブタgenomic DNA
に対しUniversal GenomeWalkerTM Kit(クロンテック
社)で加工したGenomeWalkerライブラリーDNAを用
い、方法は実施例5におけるRat GenomeWalkerTM Kit及
びMouse GenomeWalkerTM Kit(クロンテック社)適用の
際のそれに準拠した。まずgene specific primerとし
て、配列番号:56で示される塩基配列の一部にあたる
2種のオリゴDNA (PORex1F1(配列番号:57)、 PORex
1F2(配列番号:58))をそれぞれ化学合成し、PORex1F
1を1st PCR反応時に、PORex1F2をnested PCR反応時にそ
れぞれ用いた。nested PCR反応後に得られた増幅DNA断
片について、上述の方法に準じて塩基配列を決定し、PO
Rex1F2プライマー配列部位を起点としてヒト、マウス及
びラットの前駆体タンパク質をコードするcDNAの塩基配
列との相同性を比較しながらその塩基配列を解析した。
その結果、判明したゲノムの一次構造から、新規ポリペ
プチド(前駆体タンパク質)のブタカウンターパートは
配列番号:46で示される420塩基のDNAでコードさ
れる配列番号:45で示される140個のアミノ酸残基
からなるポリペプチドであること、また該遺伝子はブタ
染色体上で1つの介在配列を挟んで2つのエクソン(exo
n)から構成され、420塩基のうち、第1エクソンには
配列番号:59で示される193塩基が、第2エクソン
には配列番号:60で示される227塩基がコードされ
ていることが明らかとなった。該ポリペプチドにはヒト
新規ポリペプチド(前駆体タンパク質)同様にインスリ
ン/IGF/リラキシンファミリーに特徴的な配列、即ち
シグナル配列、塩基性アミノ酸残基で挟まれ、かつCys
残基を有するA鎖(配列番号:47)およびB鎖(配列
番号:49)が含まれていた。また、該ブタ新規ポリペ
プチドのヒト前駆体タンパク質、マウス前駆体タンパク
質及びラット前駆体タンパク質とのアミノ酸レベルでの
相同性は それぞれ77.1%、70.0%、67.1%であった。
【0057】実施例9 ラット腸間膜脂肪組織由来新規
ポリペプチド(前駆体ポリペプチド)バリアントをコー
ドする全長cDNAのクローニング ラット腸間膜脂肪組織由来新規ポリペプチド(前駆体ポ
リペプチド)バリアントをコードする全長cDNAは以
下のようなPCR法により取得した。まず、実施例6で
用いたオリゴDNAのうち、UP(配列番号:36)を
センス鎖プライマーとして、またRL(配列番号:3
7)をアンチセンス鎖プライマーとして各々5pmo
l、100mM トリス・塩酸緩衝液(pH8.3) 5
μl、500mM 塩化カリウム溶液 5μl、25mM
塩化マグネシウム溶液 3μl、2.5mM デオキシ
リボヌクレオチド溶液4μl、鋳型DNAとしてラット
腸間膜脂肪組織由来total RNAより調製したc
DNA溶液 1μl、およびTaKaRa TaqTM (宝
酒造(株))0.5μlを含む混合液50μlを調製し
た。次にTaKaRa PCR Thermal Cyc
ler MP(宝酒造(株))を用いて、最初に95℃で1
分間置いた後、95℃で30秒、 67℃で1分、72
℃で1分を1サイクルとして35サイクル各反応を繰り
返し、さらに72℃、10分間反応させるプログラムで
PCR反応を行った。反応終了液を1.0%アガロース
ゲルを用いて電気泳動後エチジウムブロマイド染色し、
分子量マーカー換算で0.6kb付近の位置にPCR反応
で増幅されたDNAに対応するバンドを検出した。次に
GENE CLEAN SPIN KIT(BIO101
社)を用いて該DNA断片を回収し、塩基配列を決定す
る為にpCRTM2.1-TOPO(インビトロジェン
社)を用いてTAクローニングし、該プラスミドを大腸
菌TOP10株のコンピテントセルに導入した。アンピ
シリン含有LB寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形
質転換株のコロニーの中から外来DNA断片が挿入され
ていたプラスミドを保持していたクローンを選択し、該
プラスミドDNA、pVHABDrを調製した。挿入D
NAの塩基配列を決定するため、pVHABDrを鋳型
DNA、市販プライマーDNA(PRM-007, PRM008(東
洋紡績(株))をシーケンスプライマーとし、ABI
PRISMTM BigDyeTerminator Cy
cle Sequencing FS Ready Rea
ction Kit(PEバイオシステムズ社)を用い
たシーケンス反応を添付資料の条件にしたがって、 サ
ーマルサイクラー(GeneAmpTM PCRsyst
em model 9700( PEバイオシステムズ
社))で行った後、該反応試料をDNAシーケンサーA
BI PRISM 377( PEバイオシステムズ社)
で分析した。その結果、pVHABDrには、配列番
号:52で示される522塩基からなるDNAでコード
される配列番号:51で示される174個のアミノ酸残
基からなる新規ポリペプチド(前駆体ポリペプチド)バ
リアントをコードするオープンリーディングフレーム
(ORF)を含む配列番号:61で示される572塩基
対のDNA断片が挿入されていることが判明した。該ポ
リペプチドバリアントには、インスリン/IGF/リラキ
シンファミリーに特徴的な配列、すなわち実施例5及び
実施例6記載の新規ポリペプチド(前駆体ポリペプチ
ド)ラット型カウンターパートと全く同一のシグナル配
列と、塩基性アミノ酸で挟まれ、かつCys残基を有する
A鎖(配列番号:19)およびB鎖(配列番号:21)
を有しており、かつ実施例5記載の新規ポリペプチド
(前駆体ポリペプチド)ラット型カウンターパートの第
1エキソンと第2エキソン間に1ヶ所存在する介在配列
の一部に由来する配列番号:62で示される102塩基
からなるDNAでコードされる配列番号:63で示され
る34アミノ酸残基からなるポリペプチドが挿入された
構造を有することが判明した。こうして得られたプラス
ミドpVHABDrを大腸菌TOP10に導入し、形質
転換体Escherichia coli TOP10/
pVHABDrを得た。
【0058】実施例10 ヒト新規ポリペプチド遺伝子
発現AtT20細胞株の作製 実施例3で得られた新規ポリペプチドをコードするDNA
断片が挿入されたプラスミドであるpVHNC5Lhを制限酵素
EcoRIで消化した後、反応終了液を1.5% アガロースゲル
を用いて電気泳動し、0.15kbと0.35kbに相当する2本の
バンドをゲルから回収した。哺乳動物細胞発現ベクター
であるpcDNA3.1 (-) (Invitrogen)をEcoRI消化し、Calf
intestine alkaline phosphatase (宝酒造)を用いて脱
リン酸化処理を施した後の反応終了液を1.5% アガロー
スゲルを用いて電気泳動し、約5.5kbに相当するバンド
をゲルから回収した。DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒
造)を用いてこれらのDNA断片を連結させた後、その反応
液をE. coli JM109 CompetentCells (宝酒造)に加え、形
質転換させた。得られたアンピシリン耐性コロニーの中
からベクター挿入部位のCMVプロモーター側に0.15kb Ec
o RI断片、ポリAシグナル側に0.35kb EcoRI断片のトー
タル0.5kbのDNA断片が挿入されたプラスミドを保持した
クローンを選択し、再培養した菌体から該プラスミドをP
lasmid Maxi Kit (QIAGEN)を用いて大量調製した。こう
して得られたプラスミドをLipofectin (GIBCO-BRL)を用
い、添付プロトコール記載の方法にしたがってマウス脳
下垂体腫瘍細胞株AtT20(大日本製薬)に導入した。10%FC
S、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(1
00μg/ml)および500μg/mlのG418 (和光純薬)を含むD
MEM中で生育可能なコロニーを選択することにより、ヒ
ト新規ポリペプチド遺伝子発現AtT20細胞株を取得し
た。
【0059】実施例11 新規ポリペプチド(ヒト型)
A鎖N端ペプチドを含む免疫原の作製および免疫 上記実施例3で得られた新規ポリペプチド(ヒト型)の
A鎖N端ペプチド、AspValLeuAlaGlyLeuSerSerSerCys(配
列番号:7のN端(1-10)部分配列:公知手法に準じて
合成した)とヘモシアニン(KLH)との複合体を作製し
免疫原とした。すなわち、KLH 20mgを、0.1Mリン酸緩衝
液(pH6.7) 2.0 mlに溶解させ、N-(γ-マレイミドブ
チリロキシ)サクシニミド(GMBS)2.8 mgを含むDMSO溶
液200μlと混合し、室温で30分反応させた。2 mM EDTA
を含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.5)で平衡化したセファ
デックスG−25カラムで過剰のGMBS試薬を除去した後、
マレイミド基の導入されたKLH 5 mgと0.1 mlのDMSOに溶
解させたA鎖N端ペプチド0.84 mgとを混合し、4℃で1夜
反応させた。反応後、生理食塩水に対し、4℃で2日間透
析した。8週齢のBALB/C雌マウスに、上記、A鎖N端ペプ
チド-KLH複合体、約0.1mg/匹を完全フロインドアジュバ
ントとともに皮下免疫した。3週間後同量の免疫原を不
完全フロインドアジュバントとともに追加免疫し、その
1週間後に採血した。
【0060】実施例12 西洋ワサビパーオキシダーゼ
(HRP)標識化A鎖N端ペプチドの作製 上記、A鎖N端ペプチドとHRP(酵素免疫測定法用、ベー
リンガーマンハイム社製)とを架橋し、酵素免疫測定法
(EIA)の標識体とした。すなわち、HRP 23 mgを2.3 ml
の0.1 Mリン酸緩衝液、pH6.7に溶解させ、GMBS 1.6 mg
を含むDMF溶液0.23 m1と混合し、室温で30分間反応させ
たのち、2 mM EDTAを含む0.1 Mリン酸緩衝液、pH6.5
で平衡化させたセファデックスG-25カラムで分画した。
このようにして作製したマレイミド基の導入されたHRP
2.3 mgとA鎖N端ペプチド1 mgとを混合し、4℃で1日反応
させた。反応後、0.1 Mリン酸緩衝液、pH6.5で平衡化さ
せたウルトロゲルAcA54(ファルマシア社製)カラムで
分画し、HRP標識化A鎖N端ペプチドを得た。
【0061】実施例13 A鎖N端ペプチドを免疫したマ
ウスの抗血清中の抗体価の測定 マウス抗血清中の抗体価を以下の方法により測定した。
抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを
作製するため、まずヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体
(IgG画分、カッペル社製)を0.1 mg/ml含む0.1 M炭酸
緩衝液、pH9.6溶液を96ウェルマイクロプレートに0.1m1
ずつ分注し、4℃で24時間放置した。次に、プレートを
リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)で洗浄したのち、
ウェルの余剰の結合部位をふさぐため25%ブロックエー
ス(雪印乳業社製)および0.05%NaN3を含むPBS、pH7.2
を0.3m1ずつ分注し、4℃で少なくとも24時間処理した。
上記、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレ
ートの各ウエルにバッファーEC [0.2% BSA、0.4 M NaC
l、0.4%ブロックエース、0.05% CHAPS〔3−〔(コラミ
ドプロピル)ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン
酸〕、2 mM EDTAおよび0.05% NaN3を含む0.02 Mリン酸
緩衝液、pH7.0]で希釈したマウス抗血清0.14mlを加え4
℃で16時間反応させた。次に、該プレートをPBS、pH7.4
で洗浄したのち、バッファーC[1% BSA、0.4 M NaCl、お
よび2 mM EDTAを含む0.02 Mリン酸緩衝液、PH7.0]で10
00倍に希釈した上記実施例12で作製したHRP標識A鎖N
端ペプチド0.1mlを加え4℃で1日反応させた。次に、該
プレートをPBS、pH7.4で洗浄したのち、固相上の酵素活
性をTMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム
(KIRKEGAARD&PERRY LAB. フナコシ薬品取り扱い)0.1
mlを加え室温で5分間反応させることにより測定した。
反応を1Mリン酸0.1mlを加え停止させたのち、450nmの吸
光度(Abs.450)をプレートリーダー(MTP-120、コロナ
社製またはMultiskan Ascent、Labsystems社製)で測
定した。結果を図4に示す。免疫した8匹のマウス全て
にA鎖N端ペプチドに対する抗体価の上昇が認められた。
【0062】実施例14 抗A鎖N端ペプチドモノクロー
ナル抗体の作製 実施例13において比較的高い抗体価を示したマウスN
o.1およびNo.7に対してKLHとして0.08-0.1mgのA鎖N端ペ
プチド-KLHを静脈内に投与することにより最終免疫を行
なった。最終免疫3日後のマウスから脾臓を摘出し、ス
テンレスメッシュで圧迫ろ過し、イーグルズ・ミニマム
・エッセンシヤル・メデイウム(MEM)に浮遊させ、脾
臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、BA
LB/Cマウス由来ミエローマ細胞P3−X63.Ag 8.U1(P3
U1)を用いた〔カレント・トピックス・イン・マイクロ
バイオロジー・アンド・イムノロジー、81、1(197
8)〕。細胞融合は、原法〔ネイチャー、256、495(197
5)〕に準じて行なった。すなわち、脾臓細胞およびP3U
1をそれぞれ血清を含有しないMEMで3度洗浄し、脾臓紬
砲とP3U1数の比率を6.6:1になるよう混合して、750回
転で15分間遠心を行なって細胞を沈澱させた。上清を充
分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、45%ポリエチレン
・グリコール(PEG)6000(コッホライト社製)を0.3m
1加え、37℃温水槽中で7分間静置して融合を行なった。
融合後細胞に徐々にMEMを添加し、合計15 mlのMEMを加
えた後750回転15分間遠心して上清を除去した。この細
胞沈殿物を10%牛胎児血清を含有するGITメデイウム
(和光純薬)(GIT−10%FCS)にP3U1が1m 1当リ2×105
個になるように浮遊し、24穴マルチディッシュ(リンブ
ロ社製)に1ウェル1 mlずつ168ウェルに播種した。播種
後、細胞を37℃で5%炭酸ガスインキュベーター中で培
養した。24時間後HAT(ヒポキサンチン1×10-4 M、アミ
ノプテリン4×10-7 M、チミジン1.6×10-3 M)を含ん
だGIT−10%FCS培地(HAT培地)を1ウェル当リ1 mlずつ
添加することにより、HAT選択培養を開始した。HAT選択
培養は、培養開始5、8日後に旧液を1 ml捨てたあと、1
mlのHAT培地を添加することにより継続し、細胞融合後9
日目に上清を採取した。培養上清中の抗体価は、実施例
13に記載の方法に準じて実施した。すなわち、抗マウス
イムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエル
に培養上清0.07mlおよびバッファーEC0.07mlを加え4℃
で1夜反応させた後、バッファーCで1000倍に希釈したHR
P標識化A鎖N端ペプチド0.1mlを非標識A鎖N端ペプチド0.
002mMの存在下あるいは非存在下室温で7時間反応させ
た。該プレートをPBSで洗浄したのち、実施例13に記
載の方法に従い固相上の酵素活性を測定した。その結
果、168ウェルの中から特異的な抗体価の認められた31
ウェルを選択し、ハイブリドーマを凍結保存した。さら
に5ウェルのハイブリドーマ、No.14、 No.43、No.144、
No.146、 およびNo.149については、希釈法によるクロ
ーニングに付した。クローニングに際しては、フィーダ
ー細胞としてBALB/Cマウスの胸腺細胞をウェル当リ5×
105個になるように加えた。クローニング後、 培養上清
中の抗体価を同様の方法に従って測定した。陽性クロー
ンは、No.14からは33ウェル中2ウェルに、No.43からは2
8ウェル中1ウェルに、No.144からは25ウェル中23ウェル
に、No.149から58ウェル中15ウェルに、 No.146からは2
88ウェル中7ウェルに検出された。これらのクローンの
中から、抗A鎖N端ペプチドモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマとしてNo.144-10(ハイブリドーマ HK4-144-
10)を選択した。
【0063】実施例15 ハイブリドーマのマウス腹水
化およびモノクローナル抗体の精製 ハイブリドーマ、No.144-10のマウス腹水化を実施し
た。あらかじめミネラルオイル0.5 mlを腹腔内投与され
たマウス(BALB/C、雌)に1〜3×106セル/匹の上記ハ
イブリドーマを腹腔内投与したのち、6〜20日後に抗体
含有腹水を採取した。モノクローナル抗体は得られた腹
水よリプロテイン−Aカラムにより精製した。即ち、腹
水約25 mlを等量の結合緩衝液(3.5 M NaCl、0.05% NaN
3を含む1.5Mグリシン、pH9.0)で希釈したのち、あらか
じめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテイン
−A−アガロース(Repligen社製)カラムに供し、特異
抗体を溶離緩衝液(0.05% NaN3を含む0.1 Mクエン酸緩
衝液、pH3.0)で溶出した。溶出液はPBS、pH7.4に対し
て4℃、2日間透析したのち、0.22μmのフィルター(ミ
リポア社製)により除菌濾過し4℃あるいは-80℃で保存
した。得られたモノクローナル抗体をHK4-144-10と命名
した。
【0064】実施例16 AtT20培養上清からの新規ポ
リペプチド(ヒト型)の精製 10%FCSを含むDMEMあるいは5%FCSを含むOPTI-MEMに0.5mg
/mlのG418を添加した培地で実施例10記載の新規ポリ
ペプチド(ヒト型)前駆体発現AtT20を培養した。培養
上清2L分をHK4-144-10結合トレシルトヨパール固相3.2
mlに通し、PBS、pH7.4で洗浄した後、10mlの0.1%TFA
(トリフルオロ酢酸)を含む60%アセトニトリルで溶出
した。HK4-144-10結合トレシルトヨパール固相は125mg
のHK4-144-10抗体を5gのAF-Tresyl Toyopearl(TOSOH社
製)に添付指針書に従い結合させた。溶出液を凍結乾燥
後、0.5mlの0.1%TFAを含む40%アセトニトリルに溶解
し、0.1%TFAを含む40%アセトニトリルで平衡化したTSK
G3000PWカラム(7.8 x 300mm、TOSOH社製)を用いるゲ
ルろ過で分離した。流速は0.25ml/minとし、2分間を1フ
ラクションとして集めた。各フラクションの免疫活性を
上記実施例15記載のモノクローナル抗体、HK4-144-10
および実施例12記載のHRP標識化A鎖N端ペプチドを用
いる競合法-EIAにより調べた。即ち、抗マウスイムノグ
ロブリン抗体結合マイクロプレートに、0.05%CHAPSを含
むバッファーC(バッファーCC)で3ng/mlに希釈したHK4
-144-10、0.05ml、バッファーCCで段階的(0, 0.016,
0.08, 0.4, 2, 10 ng/ml)に希釈されたA鎖N端ペプチド
あるいはバッファーCCで250倍希釈された上記ゲルろ過
画分、0.05ml、およびHRP標識化A鎖N端ペプチド(バッ
ファーCCで6000倍希釈)を0.05ml加え、4℃で1日反応さ
せた。反応後、PBS、pH7.4で洗浄したのち固相上の酵素
活性を上記実施例13記載の方法により測定した。その
結果、フラクションNo.19-21にA鎖N端ペプチドの標準曲
線からの計算値として約1.8nmolの新規ポリペプチド
(ヒト型)の免疫活性が検出された。同様の操作によ
り、新規ポリペプチド前駆体(ヒト型)発現AtT20の他
の培養上清1Lからも約0.8nmolの新規ポリペプチド(ヒ
ト型)の免疫活性がフラクションNo.19-21に検出され
た。次に、合計3Lの培養上清から部分精製された新規
ポリペプチド(ヒト型)(免疫活性として約2.6nmol)
をTSK ODS-80TSカラム(4.6 x 250mm、TOSOH)で分離し
た。溶離液のアセトニトリル濃度は17%-38%の直線勾配
(0.05%TFAを含む)とし40分間で上昇させた。流速1ml/
minで0.5分間を1フラクションとして集め、UVピークは2
15nmの吸光度で、また免疫活性は上記競合法EIAで検出
した。結果を図5に示す。主要なUVピーク、No.1、No.2
およびNo.3は、それぞれ免疫活性フラクションNo.56、N
o.64およびNo.65に一致した。これらのフラクションに
ついて質量分析(LCQduo、ThermoQuest社製)ならびに
アミノ酸配列分析(491cLC、Applied Biosystems社
製)を実施した。その結果、フラクションNo.56の質量
分析からは分子量2459.9の値が、また、アミノ酸分析か
らはA鎖N端配列、AspValLeuAlaGlyLeuSerSerSer (配列
番号:7のN端(1-10)部分配列)が得られた。この分子
量はA鎖の還元型での分子量2463.8よりも約4小さいこと
から、フラクションNo.56には酸化型A鎖が単独で溶出さ
れていることが分かった。一方、フラクションNo.64の
質量分析からは分子量5500.5の値が得られ、アミノ酸配
列分析からはB鎖N端配列、ArgAlaAlaProTyrGlyValArgLe
u(配列番号:8のN端(1-9)部分配列)およびA鎖N端配
列、AspValLeuAlaGlyLeuSerSerSer(配列番号:7のN端
(1-9)部分配列)の混合配列が得られた。この分子量は
配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するA鎖と配列
番号:8で表されるアミノ酸配列を有するB鎖からなる新
規ポリペプチド(ヒト型)の分子量5500.4にほぼ一致す
ることから、フラクションNo.64には当該新規ポリペプ
チド(ヒト型)そのものが溶出されていることが分かっ
た。さらに、フラクションNo.65の質量分析からは、少
なくとも2種類の成分が検出され、主成分の分子量は534
3.7、副成分の分子量は5272.8であった。新規ポリペプ
チド(ヒト型)のB鎖のN端アミノ酸Argが欠損したも
の、およびさらにAlaが欠損したものの分子量はそれぞ
れ5344.2および5273.1であり、観測された分子量にほぼ
一致することから、主成分はB鎖のN端アミノ酸Argが欠
損したもの、副成分はさらにAlaも欠損したものと推定
された。以上の結果から、新規ポリペプチド前駆体(ヒ
ト型)から、AtT20細胞において、実際に配列番号:7で
表されるアミノ酸配列を有するA鎖と配列番号:8で表さ
れるアミノ酸配列を有するB鎖からなる新規ポリペプチ
ドが分泌・産生されることが確認された。また、酸化型
A鎖が単独で分泌・産生され得ることも明らかとなっ
た。
【0065】実施例17 ヒト新規ポリペプチド精製標
品のヒト単球系細胞株THP-1細胞(大日本製薬)に対す
る細胞内環状アデノシン-1リン酸(cAMP)産生促進作
用 新規ポリペプチド前駆体(ヒト型)発現AtT20細胞の別
ロットの培養上清3.5Lより上記実施例16に記載した方
法にしたがって別途精製された新規ポリペプチド(ヒト
型)を含むフラクションを凍結乾燥し、200μlの緩衝液
A (PBS、1%BSA、0.05%CHAPS)を加えて溶解したもの
(濃度3.8μM)をヒト新規ポリペプチド精製標品とし
て以下の実験に使用した。ヒト単球系細胞株THP-1細胞
を106 cells/mlになるように培地A(DMEM/F12 (1:1)、1
0mM HEPES (pH7.5)、0.1%BSA、0.1mM3-イソブチル-1-
メチルキサンチン(IBMX))に懸濁し、その細胞懸濁液を
1.5ml容マイクロチューブに200μlずつ分注し37℃で1
時間プレインキュベートした。さらに緩衝液Aで反応液
当たりの希釈倍数が102、103、104、105、106、107、10
8になるように希釈されたヒト新規ポリペプチド精製標
品溶液25μlずつを上記細胞懸濁液に添加し、さらに培
地Aに溶解したフォルスコリン(和光純薬)溶液(終濃
度1μM)25μlずつを上記細胞懸濁液に添加した後、37
℃で30分間インキュベートした。3,000rpm、5分間、4℃
で遠心することにより細胞を沈澱させ、上清を捨てた後、
培地Aを1ml加え、細胞を懸濁した。遠心分離(3,000rp
m、5分間、4℃)し上清を捨てた後、250μlの培地Aに細
胞を懸濁した。この懸濁液に20%過塩素酸溶液50μlを
加えた後、4℃で20分間静置した。遠心分離(15,000rp
m、10分間、4℃)した後、上清250μlを別の1.5ml容マイ
クロチューブに移し、60mM HEPES、1.5M KOH溶液を加
え、中和したものをcAMPアッセイ用サンプルとした。細
胞内cAMP量は、cAMP EIA System (アマシャムファルマ
シア)を用い、キット添付のプロトコールに準じて測定
した。その結果、ヒト新規ポリペプチド精製標品はTHP-1
細胞に対して濃度依存的に細胞内cAMP産生量を増加させ
る活性を示した。(図6)。
【0066】実施例18 マイクロフィジオメーターに
よるヒト新規ポリペプチド精製標品のTHP-1細胞株に対
する細胞刺激作用の解析 ヒト新規ポリペプチド精製標品のTHP-1細胞株に対する
細胞刺激作用を、以下のようなマイクロフィジオメータ
ーを用いた細胞外酸性化率(Acidification Rate)の測
定で調べた。まず、予め10%FCS含有RPMI 1640培地
中で浮遊培養させた増殖状態のTHP-1細胞を、測定培地
(low buffered RPMI(モレキュラーデバイス社))で1
×108cells/mlに懸濁し、さらにアガロースセルエント
ラップメディウム(モレキュラーデバイス社)と3対1
の割合で混合した液を7μlずつ各カプセルカップ(モレ
キュラーデバイス社)の中心に分注した。アガロースは
固化後、測定培地で浸し、その状態でカップ上にスぺー
サー、カプセルインサートを順に入れ、最後に測定培地
でインサートを完全に沈めることで測定用カプセルを完
成した。該カプセルは直ちにセンサーチャンバーに移
し、サイトセンサー・マイクロフィジオメーター(Cyto
sensorTM Microphysiometer、モレキュラーデバイス
社)本体に装着した。チャンバー内の酸性化率測定なら
びにデータ解析は該装置付属のアプリケーションプログ
ラムであるCytosoftにて行った。ポンプスピードは測定
培地の流速がポンプ作動中100μl/minになるように設
定し、酸性化率の測定は2分30秒の各ポンプサイクル
中の40秒間のインターバル毎に行った。被検試料として
は実施例16で得られたヒト新規ポリペプチド精製標品
を実施例17記載の緩衝液A (PBS、1%BSA、0.05%CHAP
S)に溶解後、測定培地で500倍希釈したものを用いた。
該希釈液をサイトセンサーの2系統ある流路の一方にセ
ットし、バルブの切り換えによってヒト新規ポリペプチ
ド溶液を一定時間(7分間)細胞に暴露した。酸性化率
の変化の比較は、細胞に試料を暴露する前の酸性化率の
値を基準に各時点の酸性化率を百分率に換算して行っ
た。その結果、図9に示すように、ヒト新規ポリペプチ
ド精製標品暴露に伴う酸性化率の一過性の上昇が観察さ
れ、該ペプチドの細胞刺激活性が検出された。
【0067】実施例19 ヒト新規ポリペプチド融合蛋
白質発現組換え大腸菌株の作製 実施例3で得られたヒト新規ポリペプチドをコードする
DNA断片を含むプラスミドであるpVHNC5Lhを鋳型とし、
配列番号:64で示されるオリゴDNA(CCGGATCCATGCGGG
CAGCGCCTTA)をセンス鎖プライマーとして、配列番号:
65で示されるオリゴDNA(ATCTCGACTGCCCCGAAGAACC)
をアンチセンス鎖プライマーとして、ならびに、配列番
号:66で示されるオリゴDNA(CAGTCGAATGGATGTCCTGGC
TGGC)をセンス鎖プライマーとして、配列番号:67で
示されるオリゴDNA (CCGGATCCTAGCAAAGGCTACTGATTTC
A)をアンチセンス鎖プライマーとして、各々LA-Taq ポ
リメラーゼ(宝酒造)を用いてPCR反応を行った。反応
終了液を1.5%アガロースゲルを用いて電気泳動し、それ
ぞれの反応により生じた0.3kbならびに0.1kbのDNA断片
をゲルから回収した。これらのDNA断片を制限酵素BamHI
およびTaqIで消化することにより、末端にBamHIサイトお
よびTaqIサイトを形成させた。pET-11a(STRATAGENE)
発現ベクターをBamHIで消化し、Calf intestine phosph
atase (宝酒造)を用いて脱リン酸化処理した後、反応
終了液を1%アガロースゲルを用いて電気泳動し、5.5kb
のDNA断片をゲルから回収した。DNA Ligation Kit ver.
2 (宝酒造)を用いてこれら3本のDNA断片を連結させた
後、その反応液をE. coli JM109 Competent Cells (宝酒
造)に加え、形質転換させた。得られたアンピシリン耐性
コロニーの中から上記0.1kb断片と0.3kb断片が直列につ
ながった0.4kbのDNA断片が挿入されたプラスミド(pETV
HMMh)を保持したクローンを選択した。該プラスミドの
構築過程を図7に示す。挿入DNA断片の塩基配列を確認
した後、該プラスミドをEpicurian Coli BL21-Gold (DE
3) Competent Cells (STRATAGENE)に導入することによ
り、ヒト新規ポリペプチド融合蛋白質発現のための組換
え大腸菌株Escherichia coli BL21-Gold (DE3)/pETVHMM
hを得た。該融合蛋白質は配列番号:68に示す全39
9個の塩基配列によりコードされ、14アミノ酸から成
るリーダーペプチド配列−Met−B鎖−プロセシングプ
ロテアーゼ認識配列(Arg-Trp-Arg-Arg)−C鎖−Met−
A鎖の順に連結された配列番号:69に示す133個の
アミノ酸残基で構成される。
【0068】実施例20 ヒト新規ポリペプチド融合蛋
白質発現組換え大腸菌株による融合蛋白質の発現 実施例19で取得した大腸菌株Escherichia coli BL21-
Gold (DE3)/pETVHMMhを50μg/mlアンピシリンを含むLB
培地中で37℃でOD600が0.5になるまで培養した後、終濃
度1mM になるようにイソプロピル-β-D-チオガラクトピ
ラノシド(IPTG)を添加してさらに3時間培養した。培
養終了液を遠心分離して集菌し、全菌体蛋白質を抽出し
た後、SDS-PAGEにより分析した。その結果、図8に示す
ように、ヒト新規ポリペプチド融合蛋白質にあたる17KD
aの蛋白質のバンドがIPTG誘導下で認められた。本実施
例に基づき培養された大腸菌株菌体から該融合蛋白質を
封入体として回収し、変性、巻き戻しにより正しい組合
わせでS-S結合を形成させた後、Met残基C末側の臭化シ
アン(CNBr)による化学的切断、Arg-Trp-Arg-Arg配列C
末側の限定分解とそれにより生じた2個のArgの切断を酵
素反応により行うことでヒト新規ポリペプチド成熟体を
得ることが出来る。
【0069】実施例21 ヒト新規ポリペプチド融合蛋
白質発現組換え大腸菌株からのヒト新規ポリペプチドお
よびその誘導体の調製 実施例19で取得した大腸菌株Escherichia coli BL21-
Gold (DE3)/pETVHMMhを実施例20記載の方法で培養し
て得た菌体を破砕用緩衝液(50mM Tris.HCl (pH6.8)、
5mM EDTA)に懸濁し、超音波処理(1分間×3回)を行
った後、遠心分離(15,000rpm、20分間、4℃)した。
沈澱物を洗浄用緩衝液(50mM Tris.HCl (pH6.8)、 5mM
EDTA、4% Triton X-100)に懸濁し、遠心分離(15,000
rpm、20分間、4℃)した後、沈澱物を再度、洗浄用緩
衝液に懸濁し、同様に遠心分離した。沈澱物を蒸留水に
懸濁し、同様に遠心分離する操作を2回行った。このよ
うにして得た沈澱物、すなわちヒト新規ポリペプチド融
合蛋白質を含む封入体を可溶化用緩衝液(50mM Tris.HC
l (pH6.8)、4M 塩酸グアニジン、5mM 2-メルカプトエ
タノール)に溶解し、この可溶化液を再生用緩衝液(50
mM Tris.HCl (pH8.0)、5mM EDTA、5mM 還元型グルタチ
オン、0.5mM 酸化型グルタチオン、0.8M アルギニン塩
酸塩)で20倍に希釈した後、4℃で一晩攪拌した。この
溶液を遠心分離(15,000rpm、15分間、4℃)して得ら
れた上清をセップパックC-18(ウォーターズ社)を用い
て濃縮後、凍結乾燥した。このヒト新規ポリペプチド融
合蛋白質を含む凍結乾燥物より実施例16に記載された
方法に準じてTSKgel ODS-80Tsカラムを用いて分画され
た主ピークのフラクションについて、実施例16記載の
方法に準じて質量分析を行った結果、得られた測定分子
量の値が、配列番号:69に示す133個のアミノ酸で
構成されるポリペプチドのうちN末端の1アミノ酸(Me
t)を欠失したポリペプチドである(2-133)の理論分子
量の値と一致した(質量分析値:実測値:14156.9、理
論値:14157.0)。次に前記ポリペプチド(2-133)を0.
1N 塩酸と5%臭化シアン(CNBr)の存在下で室温、
暗所にて一晩インキュベートさせることにより化学的に
分解させた。この分解反応産物より実施例16に記載さ
れた方法に準じてTSKgel ODS-80Tsカラムを用いて分画
された主分解産物のフラクションについて実施例16記
載の方法に準じて質量分析を行った結果、このときの測
定分子量の値が配列番号:8で表されるアミノ酸配列を
有するB鎖のC末に11アミノ酸(ArgArgSerAspIleLeuAla
HisGluAlaHse)が付加したペプチドと配列番号:7で表
されるアミノ酸配列を有するA鎖とで構成されるポリペ
プチド((16-53)/(110-133))の理論分子量の値と
一致した(質量分析値:実測値:6732.9、理論値:673
2.8)。前記ポリペプチド(16-53)/(110-133)を基質
としてトリプシン(ベーリンガーマンハイム社)とカル
ボキシペプチダーゼB(CPB)(ベーリンガーマンハイム
社)の存在下(各々酵素/基質(重量比)=1/1000)、0.
1M Tris.HCl(pH 8.5)を含む反応液中で、37℃、4
5分間インキュベートした後の反応生成物を実施例16
に記載された方法に準じてTSKgel ODS-80Tsカラムを用
いて分画した(図10)。31.681分に溶出されたフラク
ションについて実施例16記載の方法に準じて質量分析
を行ったところ、測定分子量の値が配列番号:8で表さ
れるアミノ酸配列を有するB鎖と配列番号:7で表される
アミノ酸配列を有するA鎖とで構成されるポリペプチド
である((16-42)/(110-133))、すなわちヒト新規
ポリペプチドの理論分子量の値と一致した(質量分析
値:実測値:5500.3、理論値:5500.4)。このフラクシ
ョンについてさらにアミノ酸配列分析および還元後に生
じた2本のペプチドの質量分析を行った。その結果、こ
のフラクションのアミノ酸配列分析によりB鎖N端配列、
ArgAlaAlaProTyr(配列番号:8のN端(1-5)部分配列)と
A鎖N端配列、AspValLeuAlaGly(配列番号:7のN端(1-
5)部分配列)の混合配列が得られた。またこのフラクシ
ョンの還元後に生じた2本のペプチドの質量分析により
得られた測定分子量の値が配列番号:8で表されるアミ
ノ酸配列を有するB鎖の理論分子量の値(質量分析値:
実測値:3043.1、理論値:3042.6)と配列番号:7で表
されるアミノ酸配列を有するA鎖の理論分子量の値(質
量分析値:実測値:2463.1、理論値:2463.8)と一致し
た。以上の結果から、(16-53)/(110-133)をトリプ
シンとCPBで処理することにより、配列番号:8で表され
るアミノ酸配列を有するB鎖と配列番号:7で表されるア
ミノ酸配列を有するA鎖とで構成されるポリペプチド
((16-42)/(110-133))、すなわちヒト新規ポリペ
プチドが得られることが明らかとなった。また、後述の
実施例22で用いる配列番号:8で表されるアミノ酸配
列を有するB鎖のC末から1アミノ酸(Trp)を欠失した
ペプチドと配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有す
るA鎖とで構成されるポリペプチド(16-41)/(110-133)も
上記の過程で副産物として得られた。
【0070】実施例22 ヒト新規ポリペプチド融合蛋
白質発現組換え大腸菌株から調製したヒト新規ポリペプ
チドおよびその誘導体のTHP-1細胞に対する細胞内cAMP
産生促進作用 実施例17記載の方法に準じて、ヒト新規ポリペプチド
融合蛋白質発現組換え大腸菌株から調製したヒト新規ポ
リペプチドおよびその誘導体のTHP-1細胞株に対する細
胞内cAMP産生への効果を調べた。誘導体は(16-53)/(110
-133)の他、ポリペプチド(16-41)/(110-133)について調
べた。その結果、ヒト新規ポリペプチド〔ポリペプチド
((16-42)/(110-133))〕(図11)およびその誘
導体(図12)はいずれも濃度依存的に細胞内cAMP産生
量を増加させる活性を示した。また、ヒト新規ポリペプ
チドとB鎖C末配列の異なるヒト新規ポリペプチド誘導体
とで活性の強さを比較すると、(16-53)/(110-133)>(16
-42)/(110-133)(ヒト新規ポリペプチド)>(16-41)/(1
10-133)の順に強かった。この結果から、B鎖C末の配列
が活性に重要であることが明らかとなった。
【0071】実施例23 ヒト新規ポリペプチドによる
正常ヒト肺線維芽細胞株CCD-19Lu(ATCC CCL-210)にお
けるマトリックスメタロプロテイナーゼ-1(MMP-1)お
よび血管内皮細胞増殖因子(VEGF)遺伝子の発現促進作
用 正常ヒト肺線維芽細胞株CCD-19Luを106 cells/mlになる
ように培地B(MinimumEssential Medium with Earle’s
Salts(GIBCO-BRL社)、100μM MEM Non-Essential Am
ino Acids(GIBCO-BRL社)、10% FCS、100U/ml ペニシ
リン、100μg/ml ストレプトマイシン)に懸濁し、その
細胞懸濁液を6-ウェルプレートの1ウェル当り2mlずつ
分注し、37℃で5%炭酸ガスインキュベーター中で培養
した。細胞がコンフルエント(confluent)に達したとこ
ろで2mlの培地C(Minimum Essential Medium with Ear
le’s Salts(GIBCO-BRL社)、100μM MEM Non-Essenti
alAmino Acids(GIBCO-BRL社)、100U/ml ペニシリン、
100μg/ml ストレプトマイシン、0.025% CHAPS、0.2%B
SA)で細胞を2回洗った後、培地Cを2mlずつ入れ、37
℃で5%炭酸ガスインキュベーター中でさらに24時間培
養した。培地を吸引除去し、培地Cを1mlずつ添加した
後、培地Cでウェル当りの終濃度の2倍濃度に調製され
たヒト新規ポリペプチド溶液を1mlずつ添加し、37℃で
5%炭酸ガスインキュベーター中で24時間培養した。こ
のように処理された細胞よりトリゾル試薬(GIBCO BRL
社)を用いて、メーカー推奨のプロトコールに準じて、
全RNAを抽出した後、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.2.
1(宝酒造)を用いて、キット添付のプロトコールに準
じて逆転写反応を行うことによりcDNAを合成した。CCD-
19Lu細胞株におけるMMP-1、VEGF、およびハウスキーピ
ング遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素
酵素(G3PDH)遺伝子発現量の測定は、いずれもこの逆
転写反応液を鋳型DNAとして用い、TaqMan PCR Core Rea
gents Kit with AmpliTaq Gold (Applied Biosystems
社)を用いてキット添付のプロトコールに従い、ABIPRIS
M 7700( Applied Biosystems 社)を用いるTaqMan PCR
法により行った。その際、ヒトMMP-1の遺伝子発現量の
測定には、配列番号:70で表されるオリゴDNAをセ
ンス鎖プライマーとして、配列番号:71で表されるオ
リゴDNAをアンチセンス鎖プライマーとして、そして
配列番号:72で表されるオリゴDNAの5’末端にリ
ポーター色素としてFamを、3’末端にクエンチャー色素
としてTamraを結合したものをTaqMan プローブとして用
いた。ヒトVEGFの遺伝子発現量の測定には、配列番号:
73で表されるオリゴDNAをセンス鎖プライマーとし
て、配列番号:74で表されるオリゴDNAをアンチセ
ンス鎖プライマーとして、そして配列番号:75で表さ
れるオリゴDNAの5’末端にリポーター色素としてFam
を、3’末端にクエンチャー色素としてTamraを結合した
ものをTaqManプローブとして用いた。ヒトG3PDHの遺伝
子発現量の測定には、配列番号:76で表されるオリゴ
DNAをセンス鎖プライマーとして、配列番号:77で
表されるオリゴDNAをアンチセンス鎖プライマーとし
て、そして配列番号:78で表されるオリゴDNAの
5’末端にリポーター色素としてFamを、3’末端にクエ
ンチャー色素としてTamraを結合したものをTaqMan プロ
ーブとして用いた。PCR反応は、最初に50℃で2分間保
温した後、続いて95℃で15秒および 60℃で1分を1サ
イクルとして40サイクル各反応を繰り返すプログラムで
行った。その結果、ヒト新規ポリペプチド精製標品はMM
P-1およびVEGFの遺伝子発現量のG3PDHのそれに対する相
対比を増加させた(図13)。このことから、正常ヒト
肺線維芽細胞株CCD-19Luにおいてヒト新規ポリペプチド
精製標品がMMP-1およびVEGF遺伝子発現を促進させる作
用を有することが明らかとなった。
【0072】実施例24 ヒト新規ポリペプチド精製標
品のTHP-1細胞に対する血管内皮細胞成長因子(VEGF)
遺伝子の発現促進作用 ヒト新規ポリペプチド精製標品のTHP-1細胞に対する血
管内皮細胞成長因子(VEGF)遺伝子の発現への影響を以
下の要領で調べた。まず増殖期にあるTHP-1細胞を5 X 1
04 cells/mlになるように10% FCS含有RPMI-1640培地に
懸濁し、0.4 mlずつ24穴培養プレートへ分注した。次に
同培地で所定の濃度に希釈したヒト新規ポリペプチド精
製標品(実施例21と同一ロット)を各ウエルに0.1 ml
ずつ添加、混和した後、同培養プレート中で該細胞を37
℃、24時間培養した。このように処理された各細胞から
RNeasy Mini Kit (キアゲン社)を用いて直ちにtotal RN
Aを回収した後、THERMOSCRIPTTM RT-PCR System(ライ
フテックオリエンタル社)を用いて逆転写反応を行い、
まずcDNAを合成した。遺伝子発現の定量は、実施例23
の方法に準じて該cDNAを鋳型DNAとしたTaqManT M PCR
(アプライドバイオシステムズ社)を行い、生成するター
ゲット特異的シグナルをABI PRISMTM 7700 Sequence De
tection Systems (アプライドバイオシステムズ社)で
検出することで行った。その結果図16に示すように、
ヒト新規ポリペプチド精製標品はG3PDH遺伝子発現量に
対するVEGF遺伝子発現量の相対比を昂進させ、VEGF遺伝
子の発現を促進する活性を有していた。
【0073】実施例25 ヒト新規ポリペプチド精製標
品のヒト正常皮膚線維芽細胞株NHDF細胞に対するcAMP産
生促進作用 ヒト正常皮膚線維芽細胞株NHDF細胞(BioWhittaker社)を
105 cells/mlになるように培地D(線維芽細胞培地キッ
ト(BioWhittaker社))に懸濁し、その細胞懸濁液を1ml
ずつ24-ウェルプレートに分注し、37℃で5%炭酸ガスイ
ンキュベーター中で2日間培養した。実施例17記載の
培地Aの1mlで細胞を2回洗浄し、0.4 mlの培地Aを加え
た後、37℃で5%炭酸ガスインキュベーター中で1時間
インキュベートした。実施例17記載の緩衝液Aで反応
時の終濃度の10倍濃度になるように調製されたヒト新規
ポリペプチド精製標品溶液50μl、および培地Aに溶解し
た10μM フォルスコリン(和光純薬)溶液50μlを上記
細胞懸濁液に添加し、37℃で5%炭酸ガスインキュベー
ター中で30分間インキュベートした。培地Aの1mlで細
胞を2回洗浄し、0.5 mlの培地Aを加えた後、100μlの2
0%過塩素酸溶液を加え、4℃で20分間静置した。この細
胞抽出液を1.5ml容マイクロチューブに移し、遠心分離
(15,000rpm、10分間、4℃)した。上清500μlを別の1.
5ml容マイクロチューブに移し、60mM HEPES、1.5M KOH
溶液を加えて中和したものをcAMPアッセイ用サンプルと
した。細胞内cAMP量は、cAMP EIA System (アマシャム
ファルマシア)を用い、キット添付のプロトコールに準
じて測定した。その結果、ヒト新規ポリペプチド精製標
品はNHDF細胞に対して濃度依存的に細胞内cAMP量を増加
させる活性を示した(図14)。
【0074】実施例26 ヒト新規ポリペプチド精製標
品のラット下垂体前葉初代培養細胞に対するcAMP産生促
進作用 ウィスターラット(8週齢、雄性)32匹を無麻酔下に
断頭し、摘出した下垂体前葉を緩衝液B(137 mM 塩化
ナトリウム、5 mM 塩化カリウム、0.7 mM リン酸水素二
ナトリウム、25 mM HEPES(pH 7.3)、50μg/ml 硫酸ゲ
ンタマイシン)の入ったシャーレに入れ、緩衝液Bで1
回洗浄した。これをはさみで4分割し、さらに2回洗浄
した後、下垂体片を30 mlの酵素液I(0.4% コラゲナ
ーゼA(ベーリンガーマンハイム社)、0.4% ウシ血清
アルブミン、10μg/ml デオキシリボヌクレアーゼ I
(シグマ社)、0.2% グルコースを含む緩衝液B)中で
振とうしながら37℃で1時間インキュベートした。組
織片を駒込ピペットで分散させ、遠心分離(480×g、6
分間)し、上清を除去した。沈澱を30 mlの酵素液II
(0.25% パンクレアチン(シグマ社)を含む緩衝液B)
に懸濁し、振とうしながら37℃で8分間インキュベー
トした。2mlのウシ胎仔血清を添加し、再び遠心分離
(480×g、6分間)した後、上清を除去した。沈澱に10
mlの培地D(10% ウシ胎仔血清、20mM HEPES (pH 7.
3)、50U/ml ペニシリンG、50μg/ml ストレプトマイシ
ンを含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM))を加え
懸濁し、ナイロンメッシュを用いて濾過した。10mlの
培地Dでさらに2回洗浄した後、細胞数を測定し、細胞
を1.8×105cells/mlになるように培地Dに浮遊させた。
細胞浮遊液を1mlずつ24-ウェルプレートの各穴に分
注し、37℃で5%炭酸ガスインキュベーター中で3日間
培養した。培地E(実施例17記載の培地Aのうち、IBMX
濃度を1mMにしたもの)の1mlで細胞を2回洗浄し、0.
45 mlの培地Eを加えた後、37℃で5%炭酸ガスインキュ
ベーター中で1時間インキュベートした。実施例17記
載の緩衝液Aで反応時の終濃度の10倍濃度になるように
調製されたヒト新規ポリペプチド精製標品溶液50μlを
上記細胞懸濁液に添加し、37℃で5%炭酸ガスインキュ
ベーター中で30分間インキュベートした。培地Eの1ml
で細胞を2回洗浄し、0.5 mlの培地Eを加えた後、100μ
lの20%過塩素酸溶液を加え、4℃で20分間静置した。こ
の細胞抽出液を1.5ml容マイクロチューブに移し、遠心
分離(15,000rpm、10分間、4℃)した。上清500μlを別
の1.5ml容マイクロチューブに移し、60mM HEPES、1.5M
KOH溶液を加えて中和したものをcAMPアッセイ用サンプ
ルとした。細胞内cAMP量は、cAMP EIA System (アマシ
ャムファルマシア)を用い、キット添付のプロトコール
に準じて測定した。その結果、ヒト新規ポリペプチド精
製標品はラット下垂体前葉初代培養細胞に対して濃度依
存的に細胞内cAMP量を増加させる活性を示した(図1
5)。
【0075】実施例27 ヒト新規ポリペプチド精製標
品のマウス肺胞マクロファージに対するcAMP産生促進作
用 マウス肺胞マクロファージはネンブタール(大日本製
薬)投与の麻酔下BALB/Cマウス(雌8週齢)よりハンク
ス液(ライフテックオリエンタル社)を用いた肺胞洗浄
液を公知の方法で回収することで取得した。該肺胞マク
ロファージ細胞は5 X 104個ずつ24穴培養プレートへ播
種し、10% FCS含有RPMI-1640培地中で37℃、2時間静置
培養し、細胞を培養プレート底面へ付着させた。次に10
% FCSと50μM IBMXを含有するRPMI-1640培地へ培地交換
し、そこへヒト新規ポリペプチド精製標品(新規ポリペ
プチド前駆体(ヒト型)発現AtT20細胞より上記実施例
16に記載した方法に従って別途精製され、実施例17
記載の緩衝液Aで濃度5.0μMに溶解したもの)を最終濃
度100nMになるように添加後、細胞をさらに37℃、45分
間静置培養した。このように処理された細胞の細胞内cA
MP量はcAMP EIA System (アマシャムファルマシア)を
用いて該キットのプロトコールに準じて測定した。その
結果、ヒト新規ポリペプチド精製標品を添加されたマウ
ス肺胞マクロファージでは未添加の対照群に比較して約
1.4倍の細胞内cAMP量の昂進が認められた。
【0076】実施例28 マウスモノクローナル抗体、
HK4-144-10のクラス・サブクラスの決定 前記実施例15記載マウスモノクローナル抗体、HK4-14
4-10のクラス・サブクラスは、市販の抗血清(Bio-Rad
社製)を用いるEIAにより、IgG1、κと決定された。
【0077】実施例29 ヒト新規ポリペプチド遺伝子
の動物細胞発現ベクターの構築 ヒト新規ポリペプチド遺伝子をCOS-7細胞中で発現させ
るための発現ベクターの構築を行った。COS-7細胞はポ
リペプチド前駆体のプロセッシングに必要なプロセシン
グ酵素PC1を発現していないため、ポリペプチド前駆体A
鎖の前のPC1プロセッシング認識配列(Arg-Xaa-Xaa-Arg)
を、プロセシング酵素furinによって認識プロセッシン
グされる配列 (Arg-Xaa-Arg-Xaa-Arg-Arg)に置換し、さ
らにヒトfurinを同時に発現する発現プラスミドを構築
した。その際、furin発現産物を分泌タンパク質として
得ることができるように、C末端部分の膜貫通領域に相
当する部分を除去し、さらに検出を容易にするために、
そのC末端側に6アミノ酸残基からなるHis-tag配列を導
入した。ヒトfurincDNAはヒト膵臓 cDNA (Clontech 社)
を鋳型にして、ヒトfurinタンパク質の翻訳開始部分に
相当する合成 DNA(配列番号:79)と、furin タンパ
ク質の595Ala までのアミノ酸配列に続いて His-His-Hi
s-His-His-His 配列、終始コドンがくるように設計した
合成 DNA(配列番号:80)、Pfu DNA polymerase (St
ratagene 社)を用いてPCR (反応条件:94℃ 1分→ (98℃
10秒 →68℃ 3分30秒)×25回→72℃ 10分 → 4℃)を行
いDNA断片を得た。このDNA断片を制限酵素 BlnI(宝
酒造)で消化した後、pCAN618の BlnI部位に導入
し、まず分泌型 furin/His-tag 発現プラスミドを構築
した。次に、ヒト新規ポリペプチド遺伝子をコ-ドして
いる cDNA 断片を鋳型にして、翻訳開始コドンのATGの
直前に MfeI制限酵素部位がくるように設計した合
成DNA(配列番号:81)とヒト新規ポリペプチド遺伝
子のC末側をコードする配列、続いて終止コドンがくる
ように設計した合成DNA(配列番号:82)、PfuDNA po
lymerase (Stratagene社)を用いてPCR(反応条件:95℃ 1
分→(98℃ 10秒→68℃ 35秒)×25回→72℃ 5分→4℃)を
行い、ヒト新規ポリペプチド遺伝子のORFを含み、か
113Val→113Arg、117Ser→117Argのアミノ酸置換を伴
ったDNA断片を得た。このDNA断片を制限酵素MfeI(N
ew England Biolabs)で消化した後、上記で得た分泌型f
urin/His-tag 発現プラスミドの EcoRI、平滑末端
化したNotI部位に導入し、A鎖の前にfurinによって
認識プロセッシングされる配列(Arg-Leu-Arg-Gly-Arg-A
rg)を持つ、ヒト新規ポリペプチド前駆体/furin-His-ta
g共発現ベクターpCAN618/hVH1,3を得た。同時に、コン
トロ−ルとしてアミノ酸置換を行っていないそのままの
ヒト新規ポリペプチド前駆体タンパク質/furin-His-tag
共発現ベクターを同様にして構築した。ヒト新規ポリペ
プチド遺伝子をコ-ドしているcDNA断片を鋳型にして、
翻訳開始コドンの ATG の直前にMfeI制限酵素部位
がくるように設計した合成DNA(配列番号:81)とヒ
ト新規ポリペプチド遺伝子のC末側をコードする配列、
続いて終止コドンNotI制限酵素部位がくるように設
計した合成DNA(配列番号:83)、PfuDNA polymerase
(Stratagene社)を用いてPCR(反応条件:95℃ 1分→(98
℃ 10秒→68℃ 35秒)×25回→72℃ 5分→4℃)を行い、
ヒトポリペプチド前駆体のORFを含むDNA断片を得
た。このDNA断片を制限酵素MfeI(New England Biol
abs)、NotI(New England Biolabs)で二重消化した
後、上記で得た分泌型furin/His-tag 発現プラスミドの
EcoRI、NotI部位に導入し、ヒトポリペプチド
前駆体/ furin-His-tag 共発現ベクター pCAN618/hVH1,
4を得た。
【0078】実施例30 マウス新規ポリペプチド遺伝
子の動物細胞発現ベクターの構築 マウス新規ポリペプチド遺伝子をCOS-7細胞中で発現さ
せるための発現ベクターの構築を上記実施例29と同様
の手法を用いて行った。まず、マウス新規ポリペプチド
遺伝子をコ-ドしているcDNA断片を鋳型にして、翻訳開
始コドンのATGの直前にEcoRI制限酵素部位がくる
ように設計した合成DNA(配列番号:84)とマウス新
規ポリペプチド遺伝子のC末側をコードする配列、続い
て終止コドン NotI制限酵素部位がくる様に設計し
た合成DNA(配列番号:85)、Pfu DNA polymerase(St
ratagene社)を用いて PCR(反応条件: 95℃ 1分 → (98
℃ 10 秒 →68℃ 35秒)×25回→72℃ 5分→4℃)を行
い、マウスポリペプチド前駆体のORFを含み、かつ
112Val→112Arg、116Ser→116Argのアミノ酸置換を伴っ
たDNA断片を得た。このDNA断片を制限酵素 EcoR
I、NotI(New England Biolabs)で二重消化した
後、上記実施例29で得た分泌型 furin/His-tag 発現
プラスミドのEcoRI、NotI部位に導入し、A鎖
の前にfurinによって認識プロセッシングされる配列(RV
RGRR)を持つマウスポリペプチド前駆体/furin-His-tag
共発現ベクター pCAN618/mVH1,3を得た。同時に、コン
トロ−ルとしてアミノ酸置換を行っていないそのままの
マウスポリペプチド前駆体/furin-His-tag共発現ベクタ
ーを同様にして構築した。マウス新規ポリペプチド遺伝
子をコ-ドしているcDNA 断片を鋳型にして、翻訳開始コ
ドンの ATG の直前にEcoRI制限酵素部位がくるよ
うに設計した合成DNA(配列番号:84)とマウス新規
ポリペプチド遺伝子のC末側をコードする配列、続いて
終止コドン NotI制限酵素部位がくるように設計し
た合成DNA(配列番号:86)、Pfu DNA polymerase(St
ratagene社)を用いて PCR (反応条件:95℃ 1分→(98℃
10秒 →68℃ 35秒)×25回→72℃ 5分→4℃)を行い、ポ
リペプチド前駆体のORFを含む DNA 断片を得た。こ
の DNA 断片を制限酵素 EcoRI、NotI(New Eng
land Biolabs )で二重消化した後、上記実施例29で得
た分泌型 furin/His-tag 発現プラスミドの EcoR
I、NotI部位に導入し、マウスポリペプチド前駆体
/furin-His-tag共発現ベクター pCAN618/mVH1,2 を得
た。
【0079】実施例31 新規ポリペプチド成熟体のCO
S-7培養上清中への分泌発現 新規ポリペプチド成熟体が培養上清中への分泌発現して
いることを確認するために、COS-7 細胞に上記実施例2
9および実施例30で作製したヒトポリペプチド前駆体
現ベクターを導入し、培養上清中の成熟ペプチドをEIA
によって測定した。上記実施例29で作製した発現ベク
タ-をトランスフェクションする前日に4×105 cell/wel
lとなるように6-wellプレートにまき10% FBS (Hyclone)
を含むDMEM培地 ( Gibco-BRL )で24時間 CO2 incubator
中で培養した。上記実施例29で作製した発現ベクタ-
およびpCAN618とFuGENE6 ( Roche Diagnostics ) を用
いてトランスフェクションを行った後、24時間後に1ml
の 0.1mM 4-(2-aminoethylbenzen sulfonyl fluolide
(pABSF)(和光純薬)と0.05% CHAPS(同仁化学)を含むDMEM
(Phenol Red)培地 (Gibco-BRL)に培地交換を行ない、さ
らに48時間培養を続けた。培養上清は eppendorf サン
プルチューブに移して遠心し、浮いている細胞を除去し
た後、この原液をそのままEIA のアッセイに用い
た。EIAは実施例16記載の競合法に準じて行った
(図17)。その結果、A鎖の前にfurinによって認識プロ
セッシングされる配列(RLRGRR)を持つヒトポリペプチド
前駆体/furin-His-tag 共発現ベクターpCAN618/hVH1,3
を導入したCOS-7細胞培養上清中には約35nMの免疫反応
性のポリペプチドが、マウスポリペプチド前駆体/furin
-His-tag共発現ベクターpCAN618/mVH1,3を導入したCOS-
7細胞培養上清中には約41nMの免疫反応性 ポリペプチド
が存在することが判明した。
【0080】実施例32 COS-7 培養上清中に存在する
新規ポリペプチドのTHP-1細胞に対する細胞内cAMP産生
促進作用 実施例31において免疫反応性ヒトポリペプチドがCOS-
7細胞培養上清中へ分泌発現されることが確認されたの
で、この生物活性を確認するために、培養上清原液を用
いて実施例17に示した方法でTHP-1 細胞に対する細胞
内cAMP産生促進作用を見た(図18)。その結果、A鎖の
前にfurinによって認識プロセッシングされる配列(RLRG
RR)を持つヒトポリペプチド前駆体/furin-His-tag 共発
現ベクターpCAN618/hVH1,3を導入した COS-7 細胞培養
上清を加えた場合、コントロールに比べて約1.8倍の、
マウスポリペプチド前駆体/furin-His-tag 共発現ベク
ターpCAN618/mVH1,3を導入した COS-7 細胞培養上清を
加えた場合は約1.6倍の THP-1細胞に対する細胞内cAMP
産生促進作用があることが判明し、生物活性を持つ新規
ポリペプチドが産生されていることが明らかとなった。
【0081】
【発明の効果】本発明のポリペプチドおよびそれをコー
ドするDNAは、例えば、炭水化物などのエネルギー源
の代謝調節(糖代謝、脂質代謝など)異常(例えば糖尿
病など)、組織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機
能低下、結合組織の形成異常(例えば強皮症など)、組
織の線維化(例えば、肝硬変・肺線維症、強皮症または
腎線維症など)、循環器障害(末梢動脈疾患、心筋梗塞
または心不全など)、内分泌障害、体液バランス異常、
中枢性疾患およびアレルギーなどの免疫系疾患、血管新
生障害等の種々の疾病の診断、治療、予防に使用するこ
とができる。また、本発明のポリペプチドは、本発明の
ポリペプチドの活性を促進もしくは阻害する化合物また
はその塩のスクリーニングのための試薬として有用であ
る。さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、本
発明のポリペプチドを特異的に認識することができるの
で、被検液中の本発明のポリペプチドの検出、定量、中
和等に使用することができる。
【0082】
【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Insulin/IGF/Relaxin Family Polypeptide and Its DNA <130> B01153 <150> JP 12-126340 <151> 2000-04-21 <150> JP 12-205587 <151> 2000-07-03 <150> JP 12-247962 <151> 2000-08-10 <150> JP 12-395050 <151> 2000-12-22 <160> 78 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ctggcggtat gggtgctgac 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 actggggcat tggtcctggt g 21 <210> 3 <211> 142 <212> PRT <213> Human <400> 3 Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr 1 5 10 15 Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val 20 25 30 Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly 35 40 45 Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly 50 55 60 Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu 65 70 75 80 Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser 85 90 95 Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly 100 105 110 Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys 115 120 125 Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys 130 135 140 142 <210> 4 <211> 1061 <212> DNA <213> Human <400> 4 ttcaaagcat ctccgtccag catggccagg tacatgctgc tgctgctcct ggcggtatgg 60 gtgctgaccg gggagctgtg gccgggagct gaggcccggg cagcgcctta cggggtcagg 120 ctttgcggcc gagaattcat ccgagcagtc atcttcacct gcgggggctc ccggtggaga 180 cgatcagaca tcctggccca cgaggctatg ggagatacct tcccggatgc agatgctgat 240 gaagacagtc tggcaggcga gctggatgag gccatggggt ccagcgagtg gctggccctg 300 accaagtcac cccaggcctt ttacaggggg cgacccagct ggcaaggaac ccctggggtt 360 cttcggggca gccgagatgt cctggctggc ctttccagca gctgctgcaa gtgggggtgt 420 agcaaaagtg aaatcagtag cctttgctag tttgagggct gggcagccgt gggcaccagg 480 accaatgccc cagtcctgcc atccactcaa ctagtgtctg gctgggcacc tgtctttcga 540 gcctcacaca ttcattcatt catctacaag tcacagaggc actgtgggct caggcacagt 600 ctcccgacac cacctatcca accctgccct ttgaccagcc tatcatgacc ctggccccta 660 aggaagctgt gcccctgcct ggtcaagtgg ggaccccccc atcctgaccc ctgacctctc 720 cccagcccta accatgcgtt tgcctggcct acacactcca ctgccacaac tgggtcccta 780 ctctacctag gctggccaca cagagacccc tgcccccttc ccagtccaaa ctgtggccat 840 tgtcccctga ccagctaaaa tcaagcctct gtctcagtcc agcctttgca cgcacgcttc 900 ctttgccctg ctttccatcc cctctccctc caactcccct gccagagttc caaggctgtg 960 gaccccagag aaggtggcag gtggcccccc taggagagct ctgggcacat tcgaatcttc 1020 ccaaactcca ataataaaaa ttcgaagact ttggcagaga g 1061 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccggatgcag atgctgatga a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tggtcaaagg gcagggttgg 20 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Human <400> 7 Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Lys Trp Gly Cys Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys 20 24 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Human <400> 8 Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp 20 25 27 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ggtgaagatg actgctcgga tga 23 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ccgcaaagcc tgaccccgta ag 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gggggtgtag caaaagtgaa a 21 <210> 12 <211> 426 <212> DNA <213> Human <400> 12 atggccaggt acatgctgct gctgctcctg gcggtatggg tgctgaccgg ggagctgtgg 60 ccgggagctg aggcccgggc agcgccttac ggggtcaggc tttgcggccg agaattcatc 120 cgagcagtca tcttcacctg cgggggctcc cggtggagac gatcagacat cctggcccac 180 gaggctatgg gagatacctt cccggatgca gatgctgatg aagacagtct ggcaggcgag 240 ctggatgagg ccatggggtc cagcgagtgg ctggccctga ccaagtcacc ccaggccttt 300 tacagggggc gacccagctg gcaaggaacc cctggggttc ttcggggcag ccgagatgtc 360 ctggctggcc tttccagcag ctgctgcaag tgggggtgta gcaaaagtga aatcagtagc 420 ctttgc 426 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 gggcaggggt ctctgtgt 18 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ttcaaagcat ctccgtccag c 21 <210> 15 <211> 72 <212> DNA <213> Human <400> 15 gatgtcctgg ctggcctttc cagcagctgc tgcaagtggg ggtgtagcaa aagtgaaatc 60 agtagccttt gc 72 <210> 16 <211> 81 <212> DNA <213> Human <400> 16 cgggcagcgc cttacggggt caggctttgc ggccgagaat tcatccgagc agtcatcttc 60 acctgcgggg gctcccggtg g 81 <210> 17 <211> 140 <212> PRT <213> Rat <400> 17 Met Ala Thr Arg Gly Leu Leu Leu Ala Ser Trp Ala Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Leu Gln Ala Glu Ala Arg Pro Ala Pro Tyr Gly Val Lys Leu 20 25 30 Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser 35 40 45 Arg Trp Arg Arg Ala Asp Ile Leu Ala His Asp Pro Leu Gly Glu Phe 50 55 60 Phe Ala Asp Gly Glu Ala Asn Thr Asp His Leu Ala Ser Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Val Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser Pro Gln 85 90 95 Val Phe Tyr Gly Gly Arg Ser Ser Trp Gln Gly Ser Pro Gly Val Val 100 105 110 Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Glu 115 120 125 Trp Gly Cys Ser Lys Ser Gln Ile Ser Ser Leu Cys 130 135 140 <210> 18 <211> 420 <212> DNA <213> Rat <400> 18 atggcaactc gggggctgct gctggcttcc tgggctctcc tcggggctct ggtgctgcag 60 gccgaggcga ggcccgcgcc ctatggggtg aagctctgcg gtcgggagtt catccgcgcg 120 gtcatcttca cctgcggggg ctcacgatgg cgccgggcgg acatcttggc ccacgaccct 180 ctgggggaat tcttcgctga tggagaagcc aatacagacc acctggccag cgaactggac 240 gaagctgtgg gctccagcga gtggctggcc ctgaccaaat ccccccaggt cttctatggg 300 ggtcgatcca gctggcaagg gtctcccgga gtggttcggg gcagcagaga tgtgctggct 360 ggcctttcca gcagctgttg cgagtggggc tgtagtaaga gccaaattag cagcttgtgc 420 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Rat, Mouse <400> 19 Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Glu Trp Gly Cys Ser 1 5 10 15 Lys Ser Gln Ile Ser Ser Leu Cys 20 24 <210> 20 <211> 72 <212> DNA <213> Rat <400> 20 gagtgctgg ctggcctttc cagcagctgt tgcgagtggg gctgtagtaa gagccaaatt 60 agcagcttgt gc 72 <210> 21 <211> 27 <212> PRT <213> 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cccgtccag 29 <210> 59 <211> 193 <212> DNA <213> Porcine <400> 59 atggccaaac gtccactgct gctgctgctg ctggccgtat gggtgctggc tggggagctg 60 tggctgagga ctgaggcccg ggcgtcaccc tatggagtga agctttgcgg ccgtgaattc 120 atccgagcgg tcatctttac ctgcgggggc tcccggtgga gacggtcgga catgctggcc 180 catgaagctc tgg 193 <210> 60 <211> 227 <212> DNA <213> Porcine <400> 60 gggatgtctt ctcagacaca gattccaacg cagacagcga gttggacgag gcaatggcct 60 ccagcgaatg gctggccctg accaagtccc ctgagacctt ctatggggtt caaccaggct 120 ggcagagaac ccctggggct cttaggggca gtcgtgatgt cctggctggc ctctccagca 180 actgctgcaa gtgggggtgc agcaagagtg aaatcagcag cctctgc 227 <210> 61 <211> 572 <212> DNA <213> Rat <400> 61 ggtcgcaggc atctcagctg atcatggcaa ctcgggggct gctgctggct tcctgggctc 60 tcctcggggc tctggtgctg caggccgagg cgaggcccgc gccctatggg gtgaagctct 120 gcggtcggga gttcatccgc gcggtcatct tcacctgcgg gggctcacga tggcgccggg 180 cggacatctt ggcccacgac cctctgggtg agtgcggagg gaaagcaatg gacctggaac 240 aggtgtcctt gatcctccag accagagatg tagccggatt cagccctgtt catccacttt 300 cttttgcagg ggaattcttc gctgatggag aagccaatac agaccacctg gccagcgaac 360 tggacgaagc tgtgggctcc agcgagtggc tggccctgac caaatccccc caggtcttct 420 atgggggtcg atccagctgg caagggtctc ccggagtggt tcggggcagc agagatgtgc 480 tggctggcct ttccagcagc tgttgcgagt ggggctgtag taagagccaa attagcagct 540 tgtgctagga tctgggctga gcgattggga ag 572 <210> 62 <211> 102 <212> DNA <213> Rat <400> 62 gtgagtgcgg agggaaagca atggacctgg aacaggtgtc cttgatcctc cagaccagag 60 atgtagccgg attcagccct gttcatccac tttcttttgc ag 102 <210> 63 <211> 34 <212> PRT <213> Rat <400> 63 Gly Glu Cys Gly Gly Lys Ala Met Asp Leu Glu Gln Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Leu Gln Thr Arg Asp Val Ala Gly Phe Ser Pro Val His Pro Leu Ser 20 25 30 Phe Ala 34 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 64 ccggatccat gcgggcagcg cctta 25 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 65 atctcgactg ccccgaagaa cc 22 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 cagtcgaatg gatgtcctgg ctggc 25 <210> 67 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 67 ccggatccta gcaaaggcta ctgatttca 29 <210> 68 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 68 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatgcgggc agcgccttac 60 ggggtcaggc tttgcggccg agaattcatc cgagcagtca tcttcacctg cgggggctcc 120 cggtggagac gatcagacat cctggcccac gaggctatgg gagatacctt cccggatgca 180 gatgctgatg aagacagtct ggcaggcgag ctggatgagg ccatggggtc cagcgagtgg 240 ctggccctga ccaagtcacc ccaggccttt tacagggggc gacccagctg gcaaggaacc 300 cctggggttc ttcggggcag ccgaatggat gtcctggctg gcctttccag cagctgctgc 360 aagtgggggt gtagcaaaag tgaaatcagt agcctttgc 399 <210> 69 <211> 133 <212> PRN <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 69 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Arg 5 10 15 Ala Ala Pro Tyr Gly Val Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala 20 25 30 Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu 35 40 45 Ala His Glu Ala Met Gly Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu 50 55 60 Asp Ser Leu Ala Gly Glu Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp 65 70 75 80 Leu Ala Leu Thr Lys Ser Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser 85 90 95 Trp Gln Gly Thr Pro Gly Val Leu Arg Gly Ser Arg Met Asp Val Leu 100 105 110 Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu 115 120 125 Ile Ser Ser Leu Cys 130 133 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 70 acggataccc caaggacatc t 21 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 71 ctcagaaaga gcagcatcga tatg 24 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 72 cagctccttt ggcttcccta gaactgtga 29 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 73 ccagcacata ggagagatga gc 22 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 74 ggaacattta cacgtctgcg g 21 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 75 agcaagacaa gaaaatccct gtggg 25 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 76 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 77 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 78 caagcttccc gttctcagcc 20 <210> 79 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 79 ctccagccta ggcttttgca aaaaccacca tggagctgag gccctggttg ctat 54 <210> 80 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 80 ttatttccta gggaattcat caatggtgat ggtgatgatg ggcctgactg gacgtgaggg 60 tcttgc 66 <210> 81 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 81 aacagtcaat tgccaccatg gcaagataca tgctgctgct gctcctggcg gtatgggtgc 60 <210> 82 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 82 tcagcaaagg ctactgattt cacttttgct gcacccccac ttgcaacagg agctgctaag 60 gccagccagg acatcgcggc ggccccgaag cctcccaggg gttccttgcc aggagggtcg 120 <210> 83 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 83 tttattagcg gccgctcagc aaaggctact gatttcactt ttgctacacc cccacttgc 60 <210> 84 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 84 aggcatgaat tcccaccatg gcaatgctcg ggctgctgct gctggcttcc tgggctctcc 60 tcggggctct 70 <210> 85 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 85 caacgcggcc gctagcacaa gctgctaatt tggctcttgc tacagcccca ctcgcagcaa 60 ctgctggaaa ggccagccaa cacatctctc ctgccccgaa cccttccagg tgacccttgc 120 <210> 86 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 86 tcaacgcggc cgctagcaca agctgctaat ttggctcttg ctacagcccc actcgcagca 60 ac 62
【0083】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の新規タンパク質(前駆体タンパク質)
のオープンリーディングフレームおよびコードされるア
ミノ酸配列を示す。
【図2】実施例4において本発明のヒト型ポリペプチド
の発現組織をRT−PCRで調べた結果を示す。図中、
レーン1はheart(心臓)、レーン2はbrain(脳)、レ
ーン3はplacenta(胎盤)、レーン4はlung(肺)、レー
ン5はliver(肝臓)、レーン6はskeletal muscle(骨
格筋)、レーン7はkidney(腎臓)、レーン8はpancre
as(膵臓)、レーン9はspleen(脾臓)、レーン10は
thymus(胸腺)、レーン11はprostate(前立腺)、レ
ーン12はtestis(精巣)、レーン13はovary(卵
巣)、レーン14はsmall intestine(小腸)、レーン
15はcolon(結腸)、レーン16はperipheral blood
leukocyte(末梢血白血球)、レーン17はhypothalamu
s(視床下部)、レーン18はhippocampus(海馬)、レ
ーン19はpituitary(下垂体)、レーン20はadipocy
te(脂肪細胞)、レーン21はfetal brain(胎児
脳)、レーン22はfetal lung(胎児肺)、レーン23
はfetal liver(胎児肝臓)、レーン24はfetal kidne
y(胎児腎臓)、レーン25はfetal heart(胎児心臓)、
レーン26はfetal spleen(胎児脾臓)、レーン27は
fetal thymus(胎児胸腺)、レーン28はfetal skelet
al muscle(胎児骨格筋)、レーン29はgenomic DNA
(ゲノムDNA)を示す。
【図3】本発明のヒト型・マウス型・ラット型・ブタ型
新規タンパク質(前駆体タンパク質)の各アミノ酸配列
のアライメントを示す。
【図4】本発明の新規ポリペプチドA鎖N端ペプチドに対
するマウス抗血清の抗体価を示す。
【図5】本発明の新規ポリペプチド遺伝子導入AtT20細
胞株培養上清から新規ポリペプチドを逆相-HPLCにより
精製した時の吸光度215nmおよび免疫活性による検出結
果を示す。
【図6】ヒト新規ポリペプチド精製標品のTHP-1細胞株
における細胞内cAMP産生促進作用を示す。
【図7】ヒト新規ポリペプチド融合蛋白質大腸菌発現用
プラスミドの構築図を示す。図中、「T7/lacO promote
r」はT7プロモーターおよびlac オペレーター領域を、
「Amp」はアンピシリン耐性領域を、「ColE1 ori」はプ
ラスミド複製開始点を、「lac Iq」はlac レプレッサー
領域を、「B鎖」は配列番号:16で表される塩基配列
を、「A鎖」は配列番号:15で表される塩基配列を、
「C鎖」は配列番号:4で表される塩基配列の184番目
から375番目の塩基配列を示す。
【図8】ヒト新規ポリペプチド融合蛋白質発現組換え大
腸菌から調製した全菌体蛋白質のSDS-PAGEの結果を示
す。
【図9】ヒト新規ポリペプチド精製標品のTHP-1細胞株
における細胞刺激作用を示す。
【図10】(16-53)/(110-133)をトリプシンとCPBで
処理した後の反応生成物をTSKgel ODS-80Tsカラムを用
いるHPLCで分離したときのパターンを示す。
【図11】大腸菌から調製したヒト新規ポリペプチドの
THP-1細胞株における細胞内cAMP産生促進作用を示す。
【図12】大腸菌から調製したヒト新規ポリペプチド誘
導体のTHP-1細胞株における細胞内cAMP産生促進作用を
示す。図中、−●−はヒト新規ポリペプチド(16-42)/
(110-133)を示し、−□−は(16-53)/(110-133)、
−△−は(16-41)/(110-133)を示す。
【図13】ヒト新規ポリペプチド(16-42)/(110-13
3)精製標品による正常ヒト肺線維芽細胞株CCD-19Luに
おけるMMP-1およびVEGF遺伝子の発現促進作用の結果図
を示す。
【図14】ヒト新規ポリペプチド(16-42)/(110-13
3)精製標品の正常ヒト皮膚線維芽細胞株NHDFにおける
細胞内cAMP産生促進作用を示す。
【図15】ヒト新規ポリペプチド(16-42)/(110-13
3)精製標品のラット下垂体前葉初代培養細胞における
細胞内cAMP産生促進作用を示す。
【図16】ヒト新規ポリペプチド(16-42)/(110-13
3)精製標品のTHP-1細胞に対するVEGF遺伝子の発現促進
作用を示す。
【図17】種々の新規ポリペプチド発現ベクタ-を導入
した COS-7 細胞培養上清中の新規ポリペプチドの免疫
活性を示す。Control はもとの親プラスミド pCAN618
を導入した COS-7 細胞培養上清中の、blank は COS-7
細胞の培養上清中の免疫活性を示す。
【図18】新規ポリペプチド発現ベクタ-を導入したCOS
-7細胞培養上清中のTHP-1細胞に対する細胞内 cAMP産生
促進活性を示す。Controlはもとの親プラスミドpCAN618
を導入したCOS-7細胞の培養上清を、100nM新規ポリペプ
チドは新規ポリペプチ精製標品100nMを加えたときのTHP
-1細胞に対する細胞内cAMP産生促進活性を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 38/28 A61P 1/16 4C085 39/395 3/00 4C086 5/00 4H045 45/00 9/00 48/00 11/00 A61P 1/16 13/12 3/00 15/00 5/00 17/00 9/00 25/00 11/00 37/00 13/12 43/00 105 15/00 C07K 14/62 17/00 14/64 25/00 14/65 37/00 16/26 43/00 105 C12N 1/15 C07K 14/62 1/19 14/64 1/21 14/65 C12P 21/02 E 16/26 G01N 33/15 Z C12N 1/15 33/50 Z 1/19 33/53 D 1/21 33/566 5/10 C12N 15/00 ZNAA C12P 21/02 5/00 A G01N 33/15 A61K 37/02 33/50 37/26 33/53 37/36 33/566 37/24 (31)優先権主張番号 特願2000−395050(P2000−395050) (32)優先日 平成12年12月22日(2000.12.22) (33)優先権主張国 日本(JP) (72)発明者 鈴木 伸宏 茨城県つくば市大字谷田部1077番地50 (72)発明者 西 一紀 茨城県つくば市並木4丁目16番地1号 ガ ーデンヒルズ並木402号 (72)発明者 木澤 秀樹 茨城県つくば市春日1丁目7番地9 武田 春日ハイツ1103号 (72)発明者 原田 征隆 茨城県つくば市東2丁目14番地5 仕黒マ ンション201 (72)発明者 大儀 和宏 茨城県つくば市梅園2丁目16番地1 ル ン・ビーニ梅園206号 Fターム(参考) 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA02 CA04 DA02 DA06 DA12 EA04 FA02 GA11 HA15 4B064 AG16 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA15X AA57X AA72X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA19 CA53 CA56 DB01 DB34 DB58 NA14 ZA022 ZA362 ZA592 ZA752 ZA812 ZA892 ZB072 ZB212 ZC032 ZC102 ZC112 ZC212 4C085 AA13 AA14 BB07 BB11 DD21 DD62 DD63 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA36 ZA59 ZA75 ZA81 ZA89 ZB07 ZB21 ZC03 ZC10 ZC11 ZC21 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA37 DA38 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】配列番号:7で表されるアミノ酸配列と同
    一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはそ
    の塩。
  2. 【請求項2】実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号:
    19または配列番号:47で表されるアミノ酸配列であ
    る請求項1記載のポリペプチド、そのアミド、もしくは
    そのエステルまたはその塩。
  3. 【請求項3】配列番号:8で表されるアミノ酸配列と同
    一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはそ
    の塩。
  4. 【請求項4】実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号:
    21または配列番号:49で表されるアミノ酸配列であ
    る請求項3記載のポリペプチド、そのアミド、もしくは
    そのエステルまたはその塩。
  5. 【請求項5】配列番号:7で表されるアミノ酸配列と同
    一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列および配列番
    号:8で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
    同一のアミノ酸配列を含有する請求項1または請求項3
    記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステ
    ルまたはその塩。
  6. 【請求項6】配列番号:7で表されるアミノ酸配列と同
    一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチド、そのアミドまたはそのエステルおよび配列番
    号:8で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
    同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミ
    ドまたはそのエステルがジスルフィド結合で結合してい
    るポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルま
    たはその塩。
  7. 【請求項7】配列番号:7で表されるアミノ酸配列と同
    一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号:1
    9または配列番号:47で表されるアミノ酸配列であ
    り、配列番号:8で表されるアミノ酸配列と同一もしく
    は実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号:21または
    配列番号:49で表されるアミノ酸配列である請求項5
    または請求項6記載のポリペプチド、そのアミド、もし
    くはそのエステルまたはその塩。
  8. 【請求項8】請求項1または請求項3記載のポリペプチ
    ドをコードするDNAを含有するDNA。
  9. 【請求項9】配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同
    一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する請求
    項1または請求項3記載のポリペプチド、そのアミド、
    もしくはそのエステルまたはその塩。
  10. 【請求項10】実質的に同一のアミノ酸配列が配列番
    号:17、配列番号:23、配列番号:45または配列
    番号:51で表されるアミノ酸配列である請求項9記載
    のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルま
    たはその塩。
  11. 【請求項11】請求項9記載のポリペプチドをコードす
    るDNAを含有する請求項8記載のDNA。
  12. 【請求項12】配列番号:12、配列番号:18、配列
    番号:24、配列番号:46または配列番号:52で表
    される塩基配列を有する請求項10記載のDNA。
  13. 【請求項13】請求項8記載のDNAを含有する組換え
    ベクター。
  14. 【請求項14】請求項13記載の組換えベクターで形質
    転換された形質転換体。
  15. 【請求項15】請求項14記載の形質転換体を培養し、
    請求項1、請求項3または請求項6記載のポリペプチド
    を生成せしめることを特徴とする請求項1、請求項3ま
    たは請求項6記載のポリペプチド、そのアミド、もしく
    はそのエステルまたはその塩の製造法。
  16. 【請求項16】請求項1、請求項3または請求項6記載
    のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルま
    たはその塩に対する抗体。
  17. 【請求項17】請求項1、請求項3または請求項6記載
    のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルま
    たはその塩を用いることを特徴とする請求項1、請求項
    3または請求項6記載のポリペプチド、そのアミド、も
    しくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻
    害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  18. 【請求項18】請求項1、請求項3または請求項6記載
    のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルま
    たはその塩を含有してなる請求項1、請求項3または請
    求項6記載のポリペプチド、そのアミド、もしくはその
    エステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合
    物またはその塩のスクリーニング用キット。
  19. 【請求項19】請求項17記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項18記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる、請求項1、請求項3または請求項6記載のポ
    リペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたは
    その塩の活性を促進または阻害する化合物またはその
    塩。
  20. 【請求項20】請求項17記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項18記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られる請求項1、請求項3または請求項6記載のポリ
    ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはそ
    の塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩を
    含有してなる医薬。
  21. 【請求項21】請求項1、請求項3または請求項6記載
    のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルま
    たはその塩を含有してなる医薬。
  22. 【請求項22】請求項16記載の抗体を含有してなる医
    薬。
  23. 【請求項23】請求項1、請求項3または請求項6記
    載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステル
    またはその塩、請求項19記載の化合物またはその
    塩、または請求項16記載の抗体を含有してなる代謝
    調節異常、組織の成長・増殖・分化阻害、生殖機能の機
    能低下、結合組織の形成異常、組織の線維化、循環器障
    害、内分泌障害、体液バランス異常、中枢性疾患、免疫
    系疾患、血管新生障害の予防・治療剤。
  24. 【請求項24】肝硬変・肺線維症、強皮症、腎線維症ま
    たは末梢動脈疾患の予防・治療剤である請求項23記載
    の剤。
  25. 【請求項25】請求項16記載の抗体を含有してなる診
    断剤。
  26. 【請求項26】代謝調節異常、組織の成長・増殖・分化
    阻害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成異常、組織
    の線維化、循環器障害、内分泌障害、体液バランス異
    常、中枢性疾患、免疫系疾患、血管新生障害の予防・治
    療作用を有する医薬を製造するための請求項1、請求
    項3または請求項6記載のポリペプチド、そのアミド、
    もしくはそのエステルまたはその塩、請求項17記載
    のスクリーニング方法または請求項18記載のスクリー
    ニング用キットを用いて得られる請求項1、請求項3ま
    たは請求項6記載のポリペプチド、そのアミド、もしく
    はそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害す
    る化合物またはその塩、または請求項16記載の抗体
    の使用。
  27. 【請求項27】請求項1、請求項3または請求項6記
    載のポリペプチド、そのアミド、もしくはそのエステル
    またはその塩、請求項17記載のスクリーニング方法
    または請求項18記載のスクリーニング用キットを用い
    て得られる請求項1、請求項3または請求項6記載のポ
    リペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたは
    その塩の活性を促進または阻害する化合物またはその
    塩、または請求項16記載の抗体を哺乳動物に投与す
    ることを特徴とする代謝調節異常、組織の成長・増殖・
    分化阻害、生殖機能の機能低下、結合組織の形成異常、
    組織の線維化、循環器障害、内分泌障害、体液バランス
    異常、中枢性疾患、免疫系疾患、血管新生障害の予防・
    治療方法。
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