JP4959880B2 - Ｇｐｒ８に対するリガンドおよびそのｄｎａ - Google Patents

Ｇｐｒ８に対するリガンドおよびそのｄｎａ Download PDF

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は脳由来の新規ポリペプチドおよびそれをコードするＤＮＡ、更には該新規ポリペプチドを用いた医薬のスクリーニング方法、好ましくは、本発明の新規ポリペプチドの受容体であるＧＰＲ８（O'Dowd, B.F. et al., Genomics, 28巻, 84-91, 1995年）と本発明の新規ポリペプチドの両者を用いた医薬（食欲（摂食）増進剤、抗肥満剤等）のスクリーニング、該スクリーニングによって得られる化合物などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの重要な機能調節は、様々なホルモンや神経伝達物質のような内在性因子あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこれらに対して生体が備えている細胞膜に存在する特異的な受容体を介して細胞が受容し、それに応じた反応をすることによって行われている。このような機能調節によるホルモンや神経伝達物質の受容体の多くはguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）と共役しており、このＧ蛋白質の活性化によって細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させることを特徴とする。また、これらの受容体蛋白質は共通して７個の膜貫通領域を有する。これらのことからこうした受容体はＧ蛋白質共役型受容体あるいは７回膜貫通型受容体と総称される。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質およびそれに対する受容体蛋白質が存在して相互作用し、重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対する受容体が存在するかどうかについてはいまだ不明なことが多い。
近年、ヒトゲノムＤＮＡあるいは各種ヒト組織由来のｃＤＮＡのランダムな配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともない、機能未知の蛋白をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになっている。Ｇ蛋白質共役型受容体は、７個の膜貫通領域を有するのみでなくその核酸あるいはアミノ酸に多くの共通配列が存在するためそのような蛋白の中から明確にＧ蛋白質共役型受容体として区分することができる。一方でこうした構造の類似性を利用したポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称する）法によってもこうしたＧ蛋白質共役型受容体遺伝子が得られている。このようにしてこれまでに得られたＧ蛋白共役型受容体のうちには既知の受容体との構造の相同性が高いサブタイプであって容易にそのリガンドを予測することが可能な場合もあるが、ほとんどの場合その内在性リガンドは予測不能であり、これらの受容体は対応するリガンドがほとんど見い出されていない。これより、これらの受容体はオーファン受容体と呼ばれている。このようなオーファン受容体の未同定の内在性リガンドは、リガンドが知られていなかったために十分な解析がなされていなかった生物現象に関与している可能性がある。そして、このようなリガンドが重要な生理作用や病態と関連している場合には、その受容体作動薬あるいは拮抗薬の開発が革新的な医薬品の創製に結びつくことが期待される（Stadel, J. et al.、TiPS、18巻、430-437頁、1997年、Marchese, A. et al．、TiPS、20巻、370-375頁、1999年、Civelli, O. et al.、Brain Res.、848巻、63-65頁、1999年）。しかし、これまで実際にオーファンＧ蛋白質共役型受容体のリガンドを同定した例はそれほど多くない。
最近、幾つかのグループによってこうしたオーファン受容体のリガンド探索の試みがなされ、新たな生理活性ペプチドであるリガンドの単離・構造決定が報告されている。ReinsheidらおよびMeunierらは独立に、動物細胞にオーファンＧ蛋白質共役型受容体ＬＣ１３２あるいはＯＲＬ１をコードするｃＤＮＡを導入して受容体を発現させ、その応答を指標としてorphanin FQあるいはnociceptinと名付けられた新規ペプチドをブタ脳あるいはラット脳の抽出物より単離し、配列を決定した（Reinsheid, R. K. et al.、Science、270巻、792-794頁、1995年、Meunier, J.-C. et al.、Nature、377巻、532-535頁、1995年）。このペプチドは痛覚に関与していることが報告されたが、さらに、受容体のノックアウトマウスの研究により記憶に関与していることが明らかにされた（Manabe, T. et al.、Nature、394巻、577-581頁、1998年）。
その後これまでにPrRP（prolactin releasing peptide）、orexin、apelin、ghrelinおよびGALP（galanin-like peptide）などの新規ペプチドがオーファンＧ蛋白質共役型受容体のリガンドとして単離された（Hinuma, S. et al.、Nature、393巻、272-276頁、1998年、Sakurai, T. et al.、Cell、92巻、573-585頁、1998年、Tatemoto, K. et al.、Bichem. Biophys. Res. Commun.、251巻、471-476頁、1998年、Kojima, M. et al.、Nature、402巻、656-660頁、1999年、Ohtaki, T. et al.、J. Biol. Chem.、274巻、37041-37045頁、1999年）。一方、これまで明らかでなかった生理活性ペプチドの受容体が解明された例もある。腸管収縮に関与するmotilinの受容体がＧＰＲ３８であることが明らかにされた（Feighner, S. D. et al.、Science、284巻、2184-2188頁、1999年）ほか、SLC-1がMCHの受容体として同定され（Chambers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999年、Saito, Y. et al.、Nature、400巻、265-269頁、1999年、Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、261巻、622-626頁、1999年、Lembo, P. M. C. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999年、Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524頁、1999年）、またＧＰＲ１４（ＳＥＮＲ）がurotensin IIの受容体であることが報告された（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年、Mori, M. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、265巻、123-129頁、1999年、Nothacker, H.P. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、383-385頁、1999年、Liu, Q. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、266巻、174-178頁、1999年）。ＭＣＨはそのノックアウトマウスが羸痩のphenotypeを示すことから肥満に関与することが示されていたが（Shimada, M. et al.、Nature、396巻、670-674頁、1998年）、その受容体が明らかにされたことにより抗肥満剤としての可能性を有する受容体拮抗薬の探索が可能となった。また、urotensin IIはサルに静脈内投与することによって心虚血を惹起することから心循環系に強力な作用を示すことも報告されている（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年）。
このように、オーファン受容体およびそのリガンドは新たな生理作用に関与する場合が多く、その解明は新たな医薬品開発に結びつくことが期待される。しかし、オーファン受容体のリガンド探索においては多くの困難さが伴うことが知られている。例えば、細胞に発現させたオーファン受容体がリガンドに応答した後にいかなる２次情報伝達系が作動するかは一般に不明であり、様々な応答系について検討する必要がある。また、リガンドの存在する組織は容易には予想されないため種々の組織抽出物を用意しなければならない。さらに、リガンドがペプチドである場合、受容体を刺激するのに必要なリガンド量はごく低濃度で十分であるためにこのようなリガンドの生体内の存在量は極微量であることが多いことに加え、ペプチドは蛋白分解酵素によって消化されて活性を失なったり、非特異的吸着によって精製過程において回収が悪かったりするために、生体より抽出して構造決定に必要な量を単離することは通常極めて困難である。これらの問題によって、これまでに数多くのオーファン受容体の存在が明らかにされながらそのリガンドが明らかにされた受容体はごく一部に過ぎない。
オーファンＧ蛋白質共役型受容体として報告されているものの一つにＧＰＲ８がある（O'Dowd, B. F. et al.、Genomics、28巻、84-91頁、1995年）。 ＧＰＲ８はソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ３）およびオピオイド受容体（δ、κおよびμ）と低いホモロジーがあるが、そのリガンドが何であるのかはこれまで不明であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、ＧＰＲ８の内因性リガンドを見出し、該リガンドを直接利用する、または該リガンド（好ましくはＧＰＲ８と組み合わせて）を用いた医薬のスクリーニング系を利用することによって今までにない全く新規な作用機序を有する医薬の開発が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者たちは上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ブタ視床下部抽出物より、ＧＰＲ８と結合する内因性リガンドを見出し、精製することに成功した。さらに該リガンドのヒト型ホモログのクローニングに成功し、該リガンドが食欲（摂食）増進作用を有すること、ＧＰＲ８アゴニストが食欲（摂食）増進剤、ＧＰＲ８アンタゴニストが肥満症の予防・治療剤（抗肥満薬・抗肥満剤）になること等を見出した。これらの知見に基づいて、発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（２）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（３）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を有する上記（２）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（４）実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：６、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９５、配列番号：９６、配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：１１２または配列番号：１１３で表されるアミノ酸配列である上記（２）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（５）配列番号：１５、配列番号：４２、配列番号：５５、配列番号：７２または配列番号：９０で表されるアミノ酸配列を含有する上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（６）上記（１）記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（７）配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配列番号：１２５で表される塩基配列を有する上記（６）記載のＤＮＡ、
（８）配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表される塩基配列を有する上記（６）記載のＤＮＡ、
（９）上記（６）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（１０）上記（９）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１１）上記（１０）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のポリペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の製造法、
（１２）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、
（１３）上記（６）記載のＤＮＡまたは上記（１２）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１４）上記（６）記載のＤＮＡに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンスＤＮＡ、
（１５）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる組成物（例、医薬、動物薬、農薬、食品等）、
（１６）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬、
（１７）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる食欲増進剤、
（１８）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなるプロラクチン産生促進剤、
（１９）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２０）標識した上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる上記（１９）記載のスクリーニング方法、
（２１）さらに、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその塩、または該蛋白質の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする上記（１９）記載のスクリーニング方法、
（２２）上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２３）さらに、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその塩、または該蛋白質の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる上記（２２）記載のスクリーニング用キット、
（２４）上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２５）上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２６）上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる抗肥満剤、
（２７）上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる食欲増進剤、
（２８）上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られるプロラクチン産生抑制剤、
（２９）哺乳動物に対し、上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の有効量を投与することを特徴とする食欲増進方法、
（３０）哺乳動物に対し、上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満の予防治療方法、
（３１）食欲増進剤を製造するための、上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の使用、
（３２）抗肥満剤を製造するための、上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用、
（３３）上記（６）記載のＤＮＡを用いることを特徴とするトランスジェニック動物、
（３４）上記（９）記載の組換えベクターにより動物に導入されることを特徴とする上記（３３）記載のトランスジェニック動物、
（３５）動物が非ヒト哺乳動物である上記（３３）記載のトランスジェニック動物、
（３６）上記（６）記載のＤＮＡが不活性化されたノックアウト動物、
（３７）上記（６）記載のＤＮＡが他の遺伝子の導入により不活性化された上記（３６）記載のノックアウト動物、
（３８）他の遺伝子がレポーター遺伝子である上記（３７）記載のノックアウト動物、
（３９）動物が非ヒト哺乳動物である上記（３６）記載のノックアウト動物、および
（４０）上記（３３）または上記（３６）記載の動物を用いることを特徴とする上記（６）記載のＤＮＡの欠損・損傷に起因する疾病に対して効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法などに関する。
【０００６】
さらには、本発明は、
（４１）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（４２）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、▲１▼配列番号：１６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、▲４▼配列番号：１６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲５▼それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記（１）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、および
（４３）配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などを提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の「配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩」としては、例えば、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合の解離定数が１ｎＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、さらに好ましくは１００ｐＭ以下、特に好ましくは８０ｐＭ以下、最も好ましくは５０ｐＭ以下であるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などが挙げられる。
本発明の配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであってもよい。
【０００８】
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【０００９】
本発明の配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性（例えば、後述の疾患の予防・治療活性、受容体との結合活性、受容体発現細胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等））などがあげられる。
実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：６、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９５、配列番号：９６、配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：１１２または配列番号：１１３で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
本発明のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：５７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１００で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号：１１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどのＧＰＲ８と特異的に結合する能力を有するポリペプチドがあげられる。
また、本発明のポリペプチドは、後述の本発明の受容体（ＧＰＲ８）との結合活性、本発明の受容体発現細胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等）等を有するポリペプチドのみならず、該結合活性または細胞刺激活性を有するポリペプチドの前駆体ポリペプチドをも包含する意味で用いられる。
該結合活性または細胞刺激活性を有するポリペプチドの前駆体ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチド等があげられる。
より、具体的には、
配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１〜１００個（好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：４２、配列番号：５５、配列番号：７２または配列番号：９０で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
上記前駆体ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号：９０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
【００１０】
本発明のポリペプチドに対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のポリペプチドと結合活性を有し、本発明のポリプチドにより該受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等）が観察されるものなどがあげられる。
具体的には、オーファンＧ蛋白質共役型受容体であるＧＰＲ８(O'Dowd, B. F. et al.、Genomics、28巻、84-91頁、1995年；配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質）、または、ＧＰＲ８と実質的に同一のアミノ酸配列、即ち、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質などがあげられる。
本発明の配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、本発明の受容体と称する場合がある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。
【００１１】
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号：４で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号：４で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(v) 上記(i)〜(iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
本発明のポリペプチドに対する受容体の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであっていてもよいが、好ましくは、本発明のポリペプチドに対する結合能を有する部分ペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等が用いられる。
具体的には、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中、１番目（Ｍｅｔ）〜１２３番目（Ｐｈｅ）、３０１番目（Ａｓｎ）〜３５８番目（Ｌｙｓ）、５４８番目（Ｔｙｒ）〜５９３番目（Ａｒｇ）および８４３番目（Ａｌａ）〜８９５番目（Ｉｌｅ）で表される部分アミノ酸配列から選択される１または２以上の部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチドなどがあげられる。
【００１２】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、本発明のポリペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００１３】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１４】
本発明のポリペプチド、受容体、その部分ペプチド、もしくはそれらの塩、またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、受容体、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル)カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt、HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１５】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
【００１６】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００１７】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１８】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは受容体の部分ペプチドについては、受容体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法があげられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００１９】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば▲１▼配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配列番号：１２５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、▲２▼配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配列番号：１２５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、▲３▼配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または▲４▼配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配列番号：１２５、または配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配列番号：１２５、または配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、
(i) 配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(ii) 配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(iii) 配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(iv) 配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(v) 配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(vi) 配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(vii) 配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(viii) 配列番号：２５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(ix) 配列番号：５６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(x) 配列番号：５７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xi) 配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xii) 配列番号：７４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xiii) 配列番号：９１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：９３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xiv) 配列番号：９２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：９４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xv) 配列番号：９５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xvi) 配列番号：９６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xvii) 配列番号：９７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xviii) 配列番号：９８で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xix) 配列番号：９９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xx) 配列番号：１００で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxi) 配列番号：１０１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxii) 配列番号：１０２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxiii) 配列番号：１０３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxiv) 配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxv) 配列番号：１０５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxvi) 配列番号：１０６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxvii) 配列番号：１０７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxviii) 配列番号：１０８で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxix) 配列番号：１０９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxx) 配列番号：１１０で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxxi) 配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxxii) 配列番号：１１１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxxiii) 配列番号：１１２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxxiv) 配列番号：１１３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２０】
本発明の受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明の受容体と実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：３２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：３２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００２１】
本発明の受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：３２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明の受容体と実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：３２で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００２２】
また、本発明の受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしてより具体的には、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中、１番目（Ｍｅｔ）〜１２３番目（Ｐｈｅ）、３０１番目（Ａｓｎ）〜３５８番目（Ｌｙｓ）、５４８番目（Ｔｙｒ）〜５９３番目（Ａｒｇ）および８４３番目（Ａｌａ）〜８９５番目（Ｉｌｅ）で表される部分アミノ酸配列から選択される１または２以上の部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、またはこれらとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどがあげられる。
【００２３】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチド（以下、これらポリペプチド等をコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらポリペプチド等を単に本発明のポリペプチドと略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２４】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２５】
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００２６】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００２７】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Vero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２８】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology, 6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００２９】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明のポリペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００３０】
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００３１】
本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００３２】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド（蛋白質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３３】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００３４】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ポリペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３５】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）としては、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のポリペプチドのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
以下に、▲１▼本発明のポリペプチド、▲２▼本発明のＤＮＡ、▲３▼本発明の抗体、および▲４▼アンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【００３６】
（１）本発明のポリペプチドが関与する各種疾病の治療・予防剤
本発明のポリペプチドは後述の実施例５〜８、２０〜２３、６４などに示すとおり、ＧＰＲ８（本発明の受容体）発現細胞の細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等）を有し、ＧＰＲ８（本発明の受容体）の内因性リガンドである。
従って本発明のポリペプチドまたは本発明のＤＮＡに異常があったり、欠損している場合、または本発明の受容体または該受容体をコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合には、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の種々の疾病が発症する可能性が高い。
従って、本発明のポリペプチド、本発明のＤＮＡは、例えば、上記の種々の疾病（特に拒食症）の治療・予防剤などの医薬（特に、食欲（摂食）増進剤等）として使用することができる。
【００３７】
本発明のポリペプチドおよび本発明のＤＮＡは、例えば、生体内において本発明のポリペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のポリペプチドを該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のポリペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のポリペプチドを上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のポリペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００３８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
【００３９】
本発明のポリペプチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、拒食症の治療目的で本発明のポリペプチドを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該ポリペプチドを約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ポリペプチドの１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、拒食症の治療目的で本発明のポリペプチドを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該ポリペプチドを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４０】
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のポリペプチドはＧＰＲ８のリガンドとしての機能などを有するため、本発明のポリペプチドの機能を促進する化合物またはその塩は、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病の治療・予防剤など（特に食欲（摂食）増進剤等）の医薬として使用できる。
一方、本発明のポリペプチドの機能を阻害する化合物またはその塩は、例えば肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
該スクリーニングは、本発明のポリペプチドを用いるか、または組換え型本発明のポリペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発明のポリペプチドとその受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすることができる。このような化合物には、本発明のポリペプチドの受容体を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性など）を有する化合物（即ち本発明のポリペプチドの受容体アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ち本発明のポリペプチドの受容体アンタゴニスト）などが含まれる。「リガンドとの結合性を変化させる」とは、リガンドとの結合を阻害する場合とリガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
【００４１】
すなわち、本発明は、
本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、具体的には、（ｉ）本発明の受容体またはその部分ペプチド（以下、これらを単に本発明の受容体と略称する場合がある）に、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ii）上記した本発明の受容体に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体の結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（i）上記した本発明の受容体に、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ii）上記した本発明の受容体に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば該本発明の受容体に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
▲１▼標識した本発明のポリペプチドを、上記した本発明の受容体に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識した本発明のポリペプチドを、本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識した本発明のポリペプチドを、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のポリペプチドの受容体に接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
【００４３】
▲４▼本発明の受容体を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチド）を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼本発明の受容体を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドなど）を本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合における、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法などである。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の受容体としては、本発明のポリペプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適している。
本発明の受容体を製造するには、前述の本発明のポリペプチドの製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うことができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、本発明の受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。また、本発明の受容体を発現した宿主細胞は、前述の本発明のポリペプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００４５】
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、適当な本発明の受容体画分と、標識した本発明のポリペプチドなどが用いられる。本発明の受容体画分としては、天然型の本発明の受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用することができる。このうち好ましくは、〔125Ｉ〕で標識されたリガンドである。
具体的には、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まず本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の受容体や本発明のポリペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のポリペプチドを添加し、同時に１０-10〜１０-7Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００４６】
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の受容体を発現した細胞が必要である。本発明の受容体を発現した細胞としては、前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００４７】
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の受容体またはその塩、本発明の受容体の部分ペプチドまたはその塩、本発明の受容体を含有する細胞、あるいは本発明の受容体を含有する細胞の膜画分、および本発明のポリペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識リガンド
〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識した本発明のポリペプチドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼リガンド標準液
本発明のポリペプチドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００４８】
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０-3Ｍの本発明のポリペプチドを５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のポリペプチドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ0 ：最大結合量
【００４９】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）であり、具体的には本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆる本発明の受容体アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆる本発明の受容体アンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記本発明の受容体アゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。
（ｉ）前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
（ii）(a)試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、上記本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストである。
(b) 本発明の受容体を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体アゴニストなど）を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
該本発明の受容体アゴニストは、本発明の受容体に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のポリペプチドと同様に安全で低毒性な医薬（例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進剤，下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕の予防・治療薬等）として有用である。
逆に、本発明の受容体アンタゴニストは、本発明の受容体に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、拒食症治療の目的で本発明のポリペプチドの機能を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、拒食症治療の目的で本発明のポリペプチドの機能を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、例えば、肥満症症治療の目的で本発明のポリペプチドの機能を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症治療の目的で本発明のポリペプチドの機能を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（３）本発明のポリペプチドの定量
本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
【００５２】
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００５３】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００５４】
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
【００５５】
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドの濃度を定量することによって、本発明のポリペプチドの濃度の減少が検出された場合、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のポリペプチドの濃度の増加が検出された場合には、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチドを検出するために使用することができる。また、本発明のポリペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチドの検出、被検細胞内における本発明のポリペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。
【００５６】
（４）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現低下が検出された場合は、 例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) 、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などである可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００５７】
（５）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) 、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬として使用することができる。
【００５８】
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００５９】
（６）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のポリペプチドを中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia) 、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬などの医薬として使用することができる。
【００６０】
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の肥満症患者の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００６１】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００６２】
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００６３】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００６４】
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００６５】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５´上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３´下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００６６】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００６７】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドによる正常ポリペプチドの機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のポリペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のポリペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６８】
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００６９】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００７０】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の細胞生物学的検討において有用である。
【００７１】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質のホモ発現不全個体を得ることができる。
【００７２】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００７３】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００７４】
例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定する。
【００７５】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血糖値が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上低下した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７６】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００７７】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を促進し、該ポリペプチドの機能を促進することができるので、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（II型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤（特に、食欲（摂食）増進剤）などの医薬として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、該ポリペプチドの機能を阻害することができるので、例えば肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）などの予防・治療剤、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００７８】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の肥満症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポータ遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のポリペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００７９】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｉ ：イノシン
Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしくはチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン
Ｇｌｙ又はＧ ：グリシン
Ａｌａ又はＡ ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ ：リジン
Ａｒｇ又はＲ ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ） ：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ ：Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｐｂｆ ： 2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
Ｃｌｔ ：２−クロロトリチル
Ｂｕt ：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ） ：メチオニンスルフォキシド
【００８０】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：1〕
ヒトＧＰＲ８蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：2〕
ヒトＧＰＲ８蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：3〕
5'側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、また3'側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されたヒトＧＰＲ８蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：4〕
ヒトＧＰＲ８蛋白の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：5〕
ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞株の各クローンにおけるＧＰＲ８受容体蛋白質ｍＲＮＡの発現量を測定するために使用したriboprobeの配列を示す。
〔配列番号：6〕
ブタ視床下部から精製されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのアミノ末端アミノ酸配列解析の結果から得られたアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：7〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：AW007531）を示す。
〔配列番号：8〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：AI500303）を示す。
〔配列番号：9〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：AI990964 ）を示す。〔配列番号：10〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：AA744804）を示す。
〔配列番号：11〕
ＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：H31598）を示す。
〔配列番号：12〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：13〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：14〕
ヒト脳由来ｃＤＮＡから増幅されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白の一部をコードするＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：15〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白の一部のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：16〕
配列番号：15から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：17〕
配列番号：15から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：18〕
配列番号：16で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：19〕
配列番号：17で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：20〕
後述の実施例14で合成されたヒトGPRリガンド（1-29）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：21〕
後述の実施例15で合成されたヒトGPRリガンド（1-28）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：22〕
後述の実施例16で合成されたヒトGPRリガンド（1-27）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：23〕
後述の実施例17で合成されたヒトGPRリガンド（1-26）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：24〕
後述の実施例18で合成されたヒトGPRリガンド（1-25）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：25〕
後述の実施例19で合成されたヒトGPRリガンド（1-24）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：26〕
配列番号：20で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：27〕
配列番号：21で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：28〕
配列番号：22で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：29〕
配列番号：23で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：30〕
配列番号：24で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：31〕
配列番号：25で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：32〕
配列番号：4で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：33〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：34〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：35〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：36〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：37〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：38〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：39〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：40〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：41〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：42〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：43〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：44〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：45〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：46〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：47〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：48〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：49〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：50〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
【００８１】
〔配列番号：51〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：52〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：53〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：54〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：55〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体蛋白のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：56〕
配列番号：55から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：57〕
配列番号：55から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：58〕
配列番号：56で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：59〕
配列番号：57で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：60〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：61〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：62〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：63〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：64〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：65〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：66〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：67〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：68〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：69〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：70〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：71〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：72〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体蛋白のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：73〕
配列番号：72から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：74〕
配列番号：72から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：75〕
配列番号：73で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：76〕
配列番号：74で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：77〕
ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白の一部をコードしていると推定されるマウスゲノム断片配列を示す。
〔配列番号：78〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：79〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：80〕
マウス精巣由来ｃＤＮＡから増幅されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体蛋白の一部をコードするＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：81〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：82〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：83〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：84〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：85〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：86〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流側ＤＮＡ配列を示す。
〔配列番号：87〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：88〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：89〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：90〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体蛋白のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：91〕
配列番号：90から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：92〕
配列番号：90から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：93〕
配列番号：91で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：94〕
配列番号：92で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：95〕
後述の実施例44で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(1-23)酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：96〕
後述の実施例45で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(1-22)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：97〕
後述の実施例46で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(1-21)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：98〕
後述の実施例47で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(1-20)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：99〕
後述の実施例48で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(1-19)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：100〕
後述の実施例49で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(1-18)のアミノ酸配列を示す。
【００８２】
〔配列番号：101〕
後述の実施例50で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(1-17)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：102〕
後述の実施例51で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(1-16)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：103〕
後述の実施例54で合成さブタＧＰＲ８リガンド(1-23)酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：104〕
後述の実施例55で合成されたラットあるいはマウスＧＰＲ８リガンド(1-23)酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：105〕
後述の実施例12で合成されたFmoc化ヒトＧＰＲ８リガンド(1-23)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：106〕
後述の実施例56で合成された[Nα-Acetyl-Trp1]-ヒトＧＰＲ８リガンド(1-23)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：107〕
後述の実施例57で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(2-23)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：108〕
後述の実施例58で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(4-23)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：109〕
後述の実施例59で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(9-23)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：110〕
後述の実施例60で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド(15-23)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：111〕
後述の実施例61で合成された[N-Acetyl-Tyr2]-ヒトＧＰＲ８リガンド(2-23)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：112〕
後述の実施例62で合成された[D-Trp1]-ヒトＧＰＲ８リガンド(1-23)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：113〕
後述の実施例63で合成された[N-3-Indolepropanoyl-Tyr2]-ヒトＧＰＲ８リガンド(2-23)のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：114〕
配列番号：96で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：115〕
配列番号：97で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：116〕
配列番号：98で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：117〕
配列番号：99で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：118〕
配列番号：100で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：119〕
配列番号：101で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：120〕
配列番号：102で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：121〕
配列番号：107で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：122〕
配列番号：108で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：123〕
配列番号：109で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：124〕
配列番号：110で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：125〕
配列番号：6で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
【００８３】
後述の実施例３で得られた形質転換体、Escherichia coli DH5α/pAKKO-GPR8は、大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ １６５６４として、茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５４０として、それぞれ寄託されている。
後述の実施例２８で得られた形質転換体、Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Human GPR8 Ligand Precursorは、大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ１６５６８として、茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５４４として、それぞれ寄託されている。
後述の実施例３２で得られた形質転換体、Escherichia Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Porcine GPR8 Ligand Precursorは、大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ １６５６５として、茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５４１として、それぞれ寄託されている。
後述の実施例３６で得られた形質転換体、Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Rat GPR8 Ligand Precursorは、大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ １６５６７、茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７５４３として、それぞれ寄託されている。
後述の実施例４１で得られた形質転換体、Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Mouse GPR8 Ligand Precursorは、大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ１６５６６として、茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５４２として、それぞれ寄託されている。
【００８４】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００８５】
実施例１ ヒト脳由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰＲ８ ｃＤＮＡの増幅
ヒト脳由来poly (A) +RNA（クローンテック）を鋳型として、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なった。逆転写は、タカラRNA PCR ver 2.1キット試薬を使用した。次にこの逆転写生成物を鋳型として用い、配列番号：１および配列番号：２で表される合成プライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行なった。合成プライマーは受容体蛋白に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の5'側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、3'側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されるように、5'側および3'側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、ｃＤＮＡ鋳型5μl，合成ＤＮＡプライマー各0.4μM、0.8mM dNTPs、pfuポリメラーゼ（ストラタジーン）0.5μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は50μlとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、94℃・60秒の加熱の後、94℃・60秒、65℃・60秒、72℃・150秒のサイクルを35回繰り返した。増幅産物の確認は、0.8％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【００８６】
実施例２ ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読による増幅ｃＤＮＡ配列の確認
実施例１で行なったＰＣＲ反応液を0.8％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行なってＤＮＡを回収した。PCR-ScriptTM Amp SK(+)クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)へサブクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) DH5αcompetent cell（東洋紡）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体E. coli DH5α/GPR8を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部に対して制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩによる切断を行ない、挿入されている受容体ｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit(PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：３）。図１にヒトＧＰＲ８受容体蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配列（配列番号：２３）およびそれから翻訳されるヒトＧＰＲ８受容体蛋白質の全アミノ酸配列（配列番号：４）を示した。
【００８７】
実施例３ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の作製
実施例２で配列が確認されたヒト脳由来のＧＰＲ８の全長アミノ酸配列をコードし5'側にＣｌａＩ認識配列を付加し、また3'側にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子が導入されたプラスミドによって形質転換されたE. coliのクローンからPlasmid Midi KIt（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで消化してインサートＤＮＡを切り出した。インサートＤＮＡは電気泳動後、アガロースゲルからカミソリで切り出し、次に細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作により回収された。このインサートＤＮＡをＣｌａＩおよびＳｐｅＩで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドpAKKO-111H（S. Hinuma et al.、Biochim. Biophys. Acta、1219巻、251-259頁、1994年、記載のpAKKO1.11Hと同一のベクタープラスミド）に加え、Ｔ４リガーゼ（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、蛋白発現用プラスミドpAKKO-GPR8を構築した。このプラスミドpAKKO-GPR8で形質転換した大腸菌をDH5α/pAKKO-GPR8（Escherichia coli DH5α/pAKKO-GPR8）と命名した。
pAKKO-GPR8で形質転換したE. coli DH5α（東洋紡）を培養後、Plasmid Midi Kit（キアゲン）を用いてpAKKO-GPR8プラスミドＤＮＡを調製した。これをCellPhect Transfection Kit（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコールに従ってCHO dhfr-細胞に導入した。4.5μｇのＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、２４時間前に5 x 105または1 x 106個のCHO dhfr-細胞を播種した直径6cmシャーレに添加した。10％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である10％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞である形質転換細胞のコロニー４７クローンを選択した。
【００８８】
実施例４ 全長ヒトＧＰＲ８蛋白質ｍＲＮＡの発現量の高いＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の選択
実施例３で樹立されたＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株４７クローンの全長ＧＰＲ８蛋白質ｍＲＮＡの発現量をCytostar T Plate（アマシャムファルマシアバイオテク）を用い、添付のプロトコールに従って以下のように測定した。ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の各クローンをCytostar T Plateに１well当たり2.5 x 104個ずつ播種して２４時間培養した後、10％ホルマリンによって細胞を固定した。各wellに0.25％ Triton X-100を添加して細胞の透過性をあげた後、35Sラベルした配列番号：５のriboprobeを加えてハイブリダイズさせた。20μg/mlのRNase Aを各wellに加えて遊離のriboprobeを消化し、プレートをよく洗浄した後、ハイブリダイズしたriboprobeの放射活性をTopcounterで測定した。放射活性の高い細胞株は、ｍＲＮＡ発現量が高い。ｍＲＮＡ発現量の高い３クローン（#17,41および46）を以下に実験に用いたが、特にクローン番号17を用いた。
【００８９】
実施例５ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定
実施例４で作製したＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞およびmock CHO細胞を２４穴プレートに5 x 104 cell/wellで播種し、４８時間培養した。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPSを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPSを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、試料と2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させた。100μlの20％過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃＡＭＰ量は、cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定した。
【００９０】
実施例６ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の膜画分を用いたＧＴＰγＳ結合活性の測定
ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する [35S]-Guanosine 5'-(γ-thio)triphosphateの結合促進活性を以下の方法により測定した。最初に膜画分の調整法を記載する。1 x 108個のＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に10mlのホモジネートバッファー（10mM NaHCO3, 5mM EDTA, 0.5mM PMSF, 1μg/ml pepstatin, 4μg/ml E64, 20μg/ml leupeptin)添加し、ポリトロン（12,000 rpm、1分間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（1,000 g, 15分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Beckman type 30ローター、30,000 rpm, 1時間）し、得られた沈殿物をＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。
ＧＴＰγＳ結合活性の測定は以下の通りである。ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を膜希釈緩衝液（50mMトリス塩酸緩衝液(pH 7.4), 5mM MgCl2, 150mM NaCl, 1μM GDP）で希釈して、蛋白質濃度30 mg/mlのアッセイ用細胞膜画分溶液を調製した。アッセイ用膜画分溶液200μlに、51.5nM濃度の[35S]-Guanosine 5'-(γ-thio)triphosphate（NEN社）を2μlと試料を添加し、この混合液を２５℃で一時間保温した。混合液をフィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液(pH 7.4), 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.1％ BSA）1.5mlで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００９１】
実施例７ ブタ視床下部抽出物に含まれ、ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株に対して特異的にｃＡＭＰ産生抑制およびＧＴＰγＳ結合促進を示す活性の検出
ブタ視床下部抽出物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）フラクションを以下に述べる方法で調製した。東京芝浦臓器（株）より購入した、処理当日に屠殺して摘出後は氷冷保存したブタ視床下部500 g（30頭分）を細かく切断し、直ぐに沸騰した蒸留水2.0 lに投じて10分間煮沸した。煮沸後、直ちに氷冷し、120 mlの酢酸を加えて終濃度1.0 Mとし、ポリトロン（20,000 rpm、6分間）を用いて破砕した。破砕液を遠心（8,000 rpm、30分）して上清を取り、沈殿には1.0 M酢酸2.0 lを加えて再度ポリトロンによって破砕し、一晩攪拌した後、遠心（8,000 rpm、30分）して上清を得た。上清に２倍量の冷アセトンを4℃でゆっくり滴下した後、１回目の遠心によって得た上清については一晩攪拌し、２回目の遠心によって得た上清については４時間攪拌した。アセトンを加えた抽出液は遠心（8,000 rpm、30分）して沈殿を除き、得られた上清からエバポレーターによって減圧下にアセトンを溜去した。アセトンを除いた抽出液に等量のジエチルエーテルを加え、分液ロートを使って脂質を含むエーテル層を分離して水層を回収した。エーテル脱脂した抽出液はエバポレーターによって減圧下に濃縮してエーテルを完全に除去した。濃縮液をガラス繊維濾紙（アドバンテック、DP70 (90 mmφ)）で濾過し、濾液をガラス製カラム（30φ x 240 mm）に充填したC18（ワイエムシー、YMCgel ODS-AM 120-S50）カラムに添加した。カラムを1.0 M酢酸400 mlで洗浄後、0.1％トリフルオロ酢酸を含む60％アセトニトリル500 mlで溶出した。溶出液を減圧下に濃縮して溶媒を溜去した後、濃縮液を凍結乾燥した。凍結乾燥品約0.5 gを30 mlの0.1％トリフルオロ酢酸を含む10％アセトニトリルに溶解し、10 mlずつをC18カラム（トーソー、TSKgel ODS-80TS (21.5φ x 300 mm)）を用いた10％から60％の0.1％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度勾配溶出法によるＨＰＬＣにかけた。ＨＰＬＣは3回行なった。溶出液は60分画に分取し、3回分の溶出液をまとめた。各分画を減圧下に濃縮・乾固し、残渣を0.5 mlのジメチルスルフオキシド（DMSO）で溶解した。
上記によって得られたＨＰＬＣフラクションのDMSO溶液を実施例５に示した方法によってＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に投与し、細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定を行なった結果、分画番号30に顕著なｃＡＭＰ産生抑制活性が認められた。また同様な試料についてＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞用いてＧＴＰγＳ結合促進活性を調べたところ、やはり分画番号３０付近に顕著な活性が確認された。これらの活性は他の受容体発現細胞では認められなかったことからブタ視床下部抽出物にＧＰＲ８特異的なリガンド活性物質が存在することが示された。
【００９２】
実施例８ ブタ視床下部抽出物中のＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して特異的に細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す活性物質のプロナーゼによる失活
実施例７でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示したＨＰＬＣ分画３０を蛋白分解酵素であるプロナーゼ（Sigma, protease Type XIV (P5147)）で処理し、活性物質が蛋白性であるかを調べた。
上記視床下部抽出物ＨＰＬＣ分画（#30）2 μlを0.2 M酢酸アンモニウム200 μlに加え、これにプロナーゼ3 μgを添加して37℃で2時間インキュベートした後、沸騰水中で10分間加熱してプロナーゼを失活させた。これにBSA 0.05mgおよびCHAPS 0.05 mgを含む蒸留水2 mlを加えてから凍結乾燥した。プロナーゼそのものあるいは加熱および凍結乾燥の影響を調べるため、プロナーゼのみ、ＨＰＬＣ分画のみおよびプロナーゼのみを加熱処理した後にＨＰＬＣ分画を加えたものについても同様に処理して凍結乾燥した。凍結乾燥した各試料を実施例５に示す方法によってＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に添加して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。ブタ視床下部抽出物中のＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す活性物質はプロナーゼによって完全に失活したことからこの物質が蛋白もしくはペプチドであることが示された。
【００９３】
実施例９ ブタ視床下部からのＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質の精製
ＧＰＲ８に特異的なリガンド活性を示す物質をＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を指標としてブタ視床下部から精製した代表例を以下に具体的に述べる。実施例７に述べた方法と全く同一の方法により、ブタ視床下部500 g（30頭分）を1.0 M酢酸で抽出し、アセトン沈殿およびエーテル脱脂をした後、C18（ワイエムシー、YMCgel ODS-AM 120-S50）カラムに吸着させ、0.1％トリフルオロ酢酸を含む60％アセトニトリルで溶出した。溶出液を濃縮し、凍結乾燥した後、C18カラム（トーソー、TSKgel ODS-80TS (21.5φ x 300 mm)）を用いたＨＰＬＣによって活性分画を得た。活性は分画番号30に回収された。これを以下の方法によってさらに精製した。
この分画を10％アセトニトリルを含む10 mMギ酸アンモニウム10 mlに溶解し、陽イオン交換カラム（トーソー、TSKgel SP-5PW (20 mmφ x 150 mm)）に添加した後、10％アセトニトリルを含む10 mMから2.0 Mのギ酸アンモニウムの濃度勾配によってカラムを溶出した。活性はギ酸アンモニウム0.8 M付近に回収された。活性分画を凍結乾燥し、0.1％トリフルオロ酢酸を含む10％アセトニトリル1.0 mlに溶解し、CNカラム（野村化学、Develosil CN-UG-5 (4.6 mmφx 250 mm)）に添加した後、0.1％トリフルオロ酢酸を含む21％から26％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出した。活性はアセトニトリル22.1％付近に出現した。活性分画を凍結乾燥し、0.1 mlのDMSOで溶解し、さらに0.4 mlの0.1％トリフルオロ酢酸を含む10％アセトニトリルを加えてODSカラム（和光純薬、Wakosil-II 3C18HG (2.0 mmφx 150 mm)）に添加した後、0.1％トリフルオ酢酸を含む22.5％から32.5％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出した。活性はアセトニトリル26.5％付近に単一ピークとして出現した（図２）。
【００９４】
実施例１０ ブタ視床下部から精製されたＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質のアミノ末端アミノ酸配列の解析およびＧＰＲ８リガンドのヒトおよびラットホモログペプチドの前駆体蛋白の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列
実施例９で精製されたＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質のアミノ末端アミノ酸配列解析を行なった。本活性物質は実施例８に示すように蛋白またはペプチドであることが推定されていたので、活性ピークを含む溶出液を用いてパーキンエルマー社Procise 494 Protein Sequencerによってアミノ末端アミノ酸配列分析を行なった。その結果、アミノ末端から１７残基までに配列番号：６に示す配列が得られた。この配列はリガンドペプチドの一部であると考えられた。
この配列に基づいて遺伝子データベースの検索を行なったところ、そのものもしくはその相補鎖がこのペプチドの前駆体蛋白の一部をコードしていると推定される幾つかのＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）配列が見出された。それらのアクセッション番号、ｃＤＮＡの由来、配列の長さおよび配列番号は次の通りである。AW007531 (anaplastic oligodendroglioma、438 base、配列番号：7)、AI500303 (anaplastic oligodendroglioma、 264 base、配列番号：8)、AI990964 (colonic mucosa from patient of Crohn's disease、424 base、配列番号：9)、AA744804 (germinal center B cell、375 base、配列番号：10)、H31598 (PC12 cells、260 base、配列番号：11)。初めの４つはヒト由来であり、最後の１つはラット由来である。これらのＥＳＴのＤＮＡ配列はブタ視床下部より単離した活性ペプチドの配列に相当するアミノ酸配列をコードする領域では極めてよく一致してしており、また翻訳されたアミノ酸配列はブタ視床下部より単離され明らかとなったペプチドの配列とは5残基目のＴｈｒがＶａｌであること以外はほぼ一致した。以上からこれらのＥＳＴはＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒトおよびラットホモログの前駆体蛋白の一部をコードしているものと推定した。
【００９５】
実施例１１ ＧＰＲ８リガンドペプチド前駆体の一部をコードするヒトｃＤＮＡの増幅と増幅ｃＤＮＡ配列の解読
実施例１０に述べたＧＰＲ８リガンドペプチドの前駆体蛋白の一部をコードすると推定されたＥＳＴ配列に基づいてプライマーを設計し、ヒト脳由来ｃＤＮＡよりＰＣＲによってＧＰＲ８リガンドペプチド前駆体の一部をコードするｃＤＮＡを増幅した。
ヒト脳由来poly (A) +RNA（クローンテック）を鋳型として、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なった。逆転写反応には、RNase H活性を欠失させたMMLV由来の逆転写酵素であるReverTra Ace（東洋紡）を使用した。続いて実施例１０に述べたＥＳＴ配列に基づいて設計した配列番号：１２および配列番号：１３の合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行なった。反応液の組成は、ｃＤＮＡ鋳型2μl、合成ＤＮＡプライマー各0.5μＭ、1.6mM dNTPs、LA Taq （宝酒造）0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は20μlとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを4回、96℃・30秒、70℃・45秒のサイクルを4回、96℃・30秒、68℃・45秒のサイクルを4回、96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを5回、96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを20回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅産物の確認は、3％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
ＰＣＲ反応液を３％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いてＤＮＡを回収した。TOPO TAクローニングキット（インビトロゲン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターpCR2.1-TOPOへサブクローニングした。これをEscherichia coli TOP10（インビトロゲン）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid KIt（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit(PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：１４に示すＤＮＡ配列を得た。このこの配列から翻訳されるＧＰＲ８リガンドぺプチド前駆体蛋白の一部（配列番号：１５）には予想どおりブタ視床下部より単離されて配列が明らかになった活性ペプチドに相当するペプチド配列が存在した。さらに、そのＣ末側には通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるＡｒｇ−Ａｒｇの配列（Seidah, N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998年）が2ヶ所存在した。このことから、ＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒトホモログのアミノ酸配列は配列番号：１６および１７のいずれかもしくは両方であると推定された。
【００９６】
実施例１２ Fmoc化ヒトGPR8 ligand (1-23)：Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０５）およびヒトGPR8 ligand (1-23)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１６）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Leu を導入したFmoc-Leu-O-Clt resin(0.76mmol/g) 0.25mmol を出発原料とし、ペプチド合成機ABI 433A を用い Fmoc/ DCC/ HOBt法により、Fmoc-Gly, Fmoc-Met, Fmoc-Leu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Val, Fmoc-Thr(But), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Tyr(But), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Pro, Fmoc-Ser(But), Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-His(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Tyr(But), Fmoc-Trp(Boc) の順に縮合を行い、Fmoc-Trp(Boc)-Tyr(But)-Lys(Boc)-His(Trt)-Val-Ala-Ser(But)-Pro-Arg(Pbf)-Tyr(But)-His(Trt)-Thr(But)-Val-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-O-Clt resin 830 mg を得た。 この樹脂150mgに TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5) 5 ml を加え、室温にて 2時間振盪した後樹脂をろ去し、溶媒を濃縮後エーテルを加え、粗 Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leuを沈殿として得た。これを YMC D-ODS-5-ST S-5 120A カラム(20 x 150mm)を用いた分取ＨＰＬＣで、A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルによるA/B: 72/28〜52/48への直線型濃度勾配溶出(60分)を行い、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末9.7mgを得た。
質量分析による(M+H)+ 2805.7 (計算値2805.4)
ＨＰＬＣ溶出時間 25.1 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分 得られた Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu 5 mg に 20％ diethylamine / DMF 1 mL を加え室温にて 2 時間撹拌した。溶媒を留去後 YMC D-ODS-5-ST S-5 120A カラム(20 x 150mm)を用いた分取ＨＰＬＣで、A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルによるA/B: 74/26〜64/36への直線型濃度勾配溶出(60分)を行い、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末1.2mgを得た。質量分析による(M+H)+ 2583.6 (計算値2583.4)
ＨＰＬＣ溶出時間 20.4 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分
【００９７】
実施例１３ ヒトGPR8 ligand (1-30)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu-Trp（配列番号：１７）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Trp(Boc) を導入したFmoc-Trp(Boc)-O-Clt resin(0.64mmol/g) 0.25mmol を出発原料として実施例１２と同様に配列順通りにアミノ酸を縮合、最後のTrpを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。 粗ペプチドを実施例１２と同様の方法で精製しTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu-Trpを得た。
質量分析による(M+H)+ 3543.4 (計算値3544.2)
ＨＰＬＣ溶出時間 21.5 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分
【００９８】
実施例１４ ヒトGPR8 ligand (1-29)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu（配列番号：２０）の製造
実施例１２の樹脂を用い実施例１３と同様に配列順にアミノ酸を縮合したのち樹脂からの切り出しと精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leuを得る。
【００９９】
実施例１５ ヒトGPR8 ligand (1-28)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr（配列番号：２１）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Tyr(But) を導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyrを得る。
【０１００】
実施例１６ ヒトGPR8 ligand (1-27)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro（配列番号：２２）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Proを導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Proを得る。
【０１０１】
実施例１７ ヒトGPR8 ligand (1-26)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser（配列番号：２３）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Ser(But)を導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Serを得る。
【０１０２】
実施例１８ ヒトGPR8 ligand (1-25)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg（配列番号：２４）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Arg(Pbf)を導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Argを得る。
【０１０３】
実施例１９ ヒトGPR8 ligand (1-24)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg（配列番号：２５）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g) にFmoc-Arg(Pbf)を導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Argを得る。
【０１０４】
実施例２０ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した23残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＧＴＰγＳ結合促進活性
実施例１２で合成した23残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ（以下、hGPR8L(1-23)と記載することがある）を種々の濃度で実施例６に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与してＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。結果を図３に示した。明らかにhGPR8L(1-23)は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。このことから配列番号：１６の構造を有するペプチドがＧＰＲ８に対するリガンドであることが明らかとなった。
【０１０５】
実施例２１ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した30残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＧＴＰγＳ結合促進活性
実施例１３で合成した30残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ（以下、hGPR8L(1-30)と記載することがある）を種々の濃度で実施例６に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与してＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。結果を図４に示した。明らかにhGPR8L(1-30)は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。このことから配列番号：１７の構造を有するペプチドがＧＰＲ８に対するリガンドであることが明らかとなった。
【０１０６】
実施例２２ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いて測定した23残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性
実施例１２で合成したhGPR8L(1-23)を種々の濃度で実施例５に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に接触させて細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。結果を図５に示した。明らかにhGPR8L(1-23)は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制した。図中、 ｃＡＭＰ合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を100％として、hGPR8L(1-23)を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を％として表わした。
【０１０７】
実施例２３ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いて測定した30残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性
実施例１３で合成したhGPR8L(1-30)を種々の濃度で実施例５に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に接触させて細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。結果を図７に示した。明らかにhGPR8L(1-30)は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制した。図７中、ｃＡＭＰ合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を100％として、hGPR8L(1-30)を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を％として表わした。
【０１０８】
実施例２４ GPR8 ligandの摂食行動に対する作用
Wistar雄性ラット（9週令）の側脳室（AP:8.1，L：1.8，H：7.1mm）にペントバルビタール麻酔下でガイドカニューレ（AG-8）を挿入した。その後、1週間以上回復させてから実験を行った。回復期間中、毎日ハンドリングを行い、脳室内投与時のストレスを軽減させた。
摂食実験は15:00から開始した。ラットに無麻酔、無拘束下でマイクロインジェクションカニューレを取り付け、PBSに溶解させた実施例１２で得たペプチド（配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）またはPBSのみを5μl/minで2分間投与した。投与終了後から１分後にマイクロインジェクションカニューレを取り外し、あらかじめ重量を計測しておいた餌（固形飼料 CE2：日本クレア）を自由に摂食させた。投与開始から時間を計測し、30、60、120分後に餌を計量して摂食量を求めた（図６）。
【０１０９】
実施例２５ ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流端のクローニング
実施例１１に記載したＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒトホモログ（以下、ヒトＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体蛋白の一部をコードするヒトｃＤＮＡ配列（配列番号：１４）を基に作製したプライマーでヒト視床下部ｃＤＮＡを鋳型とした5' RACE PCRを行ない、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を明らかにした。5'RACE PCR クローニングは、ヒト視床下部Marathon-Ready cＤＮＡ (CLONTECH)を鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：３３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：３４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はヒト視床下部ｃＤＮＡ 4μl、ＡＰ１プライマー0.5μM、配列番号：３３の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・240秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ反応液2μl、ＡＰ２プライマー0.5μM、配列番号：３４の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、70℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを１７回、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約1,200塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：３５に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１０】
実施例２６ ヒト脳ｃＤＮＡの作製
ヒト脳ｃＤＮＡは、Marathon TM cＤＮＡ Amplification Kit (CLONTECH)を用いてヒト脳poly A(+) RNA (CLONTECH)から作製した。RACE PCRに供されるｃＤＮＡは1st strand cＤＮＡ合成を除き、キットに添付のプロトコールに従って作製した。1st strand cＤＮＡは、キットに添付の逆転写酵素AMVの代わりに逆転写酵素MMLV (-RNAse H)（RevTraAce,東洋紡）を用いて、1μgのヒト脳poly A(+) RNAから合成した。
【０１１１】
実施例２７ ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流端のクローニング
実施例１１に記載のヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白の一部をコードするヒトｃＤＮＡ配列（配列番号：１４）を基に作製したプライマーでヒト脳ｃＤＮＡを鋳型とした3' RACE PCRを行ない、ヒトＧＰＲ８リガンドをコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を明らかにした。3'RACE PCR クローニングは、ヒト脳 ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：３６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：３７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はキットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したヒト脳ｃＤＮＡ 1μl、ＡＰ１プライマー0.5μM、配列番号：３６の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・240秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ反応液1μl、ＡＰ２プライマー0.5μM、配列番号：３７の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、70℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを１７回、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：３８に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１２】
実施例２８ ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒト視床下部ｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を基に作製したプライマーとヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ヒト視床下部Marathon-Ready cＤＮＡ (CLONTECH) 1μl、配列番号：３９の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：４０の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、2.5 mM MgCl2、5％ DMSO、LATaqポリメラーゼ(宝酒造)0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを３５回、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約700塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４１に示すＤＮＡ配列を得た。
この配列（配列番号：４１）はヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOヒトＧＰＲ８リガンド前駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Human GPR8 Ligand Precursor）と命名した。
配列番号：４１に示すＤＮＡ配列には、実施例１１に記載したヒトＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列をコードするようなフレームが存在するが、その5'上流側には蛋白翻訳の開始コドンであると予想されるATGが存在しない。しかし、これまでに幾つかの蛋白でATG以外のコドンを開始コドンとすることが予想されている例が報告されている（ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（H. Prats et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、1836-1840頁、1989年、R. Z. FlorkiewiczおよびA. Sommer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、3978-3981頁、1989年）、マウスレチノイン酸受容体β4（S. Nagpal et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、2718頁、1992年）、ヒトホスホリボシルピロリン酸合成酵素（M. Taira et al.、J. Biol. Chem.、265巻、16491-16497頁、1990年）、ショウジョウバエコリンアセチル転移酵素（H. Sugihara et al.、J. Biol. Chem.、265巻、21714-21719頁、1990年））。
これらの例ではATGに代わりLeuをコードするCTGが開始コドンとして仮定されていることが多い。ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白においても同様であると考え、後述のブタあるいはラットのＧＰＲ８リガンドホモログの前駆体蛋白との比較からこれらの前駆体蛋白における開始コドンと予想されるATGにほぼ対応する位置に存在するCTGコドンを開始コドンと仮定し、前駆体蛋白の配列を推定した。この仮想的ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白のアミノ酸配列を配列番号：４２に示した。また、仮想的ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図８に示した。
【０１１３】
実施例２９ ブタ脊髄ｃＤＮＡの作製
ブタ脊髄ｃＤＮＡは、Marathon TM cＤＮＡ Amplification Kit (CLONTECH)を用いてブタ脊髄poly A(+) RNAから作製した。ブタ脊髄poly A(+) RNAは、ブタ脊髄から以下のように調製した。ブタ脊髄を、ISOGEN（日本ジーン）中にてポリトロンホモゲナイザーで完全に破砕し、この破砕溶液からISOGEN溶液を用いたtotal RNA調製法に従ってブタ脊髄total RNAを得た。次に、ブタ脊髄total RNAからmRNA Purification Kit（Amersham Pharmacia Biotech）に添付のoligo dT celluloseカラムを用いた クロマトグラフィーを２回行なうことにより、7μgのブタ脊髄poly A(+) RNAを得た。RACE PCRに供したｃＤＮＡは1st strand cＤＮＡ合成を除き、キットに添付のプロトコールに従って作製した。1st strand cＤＮＡは、キットに添付の逆転写酵素AMVの代わりに逆転写酵素MMLV (-RNAse H)（RevTraAce，東洋紡）を用いて、1μgのブタ脊髄poly A(+) RNAから合成した。
【０１１４】
実施例３０ ブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流端のクローニング
１回目の5'RACE PCR クローニングと、そのＰＣＲ増幅 ＤＮＡの塩基配列を利用した２回目の5'RACE PCR クローニングにより、ＧＰＲ８のリガンドペプチドのブタホモログ（以下、ブタＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を明らかにした。
１回目の5'RACE PCR クローニングは、上記ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：４３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：４４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はキットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ 4μl、ＡＰ１プライマー0.5μM、配列番号：４３の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで１００倍希釈したＰＣＲ反応液1μl、ＡＰ２プライマー0.5μM、配列番号：４４の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを３回、次に96℃・30秒、70℃・180秒のサイクルを３回、次に96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを１５回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約300塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10F' competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４５に示すＤＮＡ配列を得た。
２回目の5'RACE PCR クローニングは、ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：４６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：４７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ 1μl、ＡＰ１プライマー0.5μM、配列番号：４６の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・180秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、70℃・180秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで１００倍希釈したＰＣＲ反応液1μl、ＡＰ２プライマー0.5μM、配列番号：４７の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを３１回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを2.0％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約200塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10F' competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４８に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１５】
実施例３１ ブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流端のクローニング
ブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流端の塩基配列を基に作製したプライマーを用いた3'RACE PCRクローニングにより、ブタＧＰＲ８リガンドペプチドの前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を明らかにした。3'RACE PCR クローニングは、ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：４９の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：５０の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ 1μl、ＡＰ１プライマー0.5μM、配列番号：４９の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、70℃・120秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで１００倍希釈したＰＣＲ反応液1μl、ＡＰ２プライマー0.5μM、配列番号：５０の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを３１回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを2.0％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約650塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10F' competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌ、ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：５１に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１６】
実施例３２ ブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡのクローニング
ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型として、ブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を基に作製したプライマーとブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ 1μl、配列番号：５２の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：５３の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、72℃・75秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、70℃・75秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、68℃・75秒のサイクルを４回、次に96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを５回、次に96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・45秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：５４に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：５４）はブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOブタＧＰＲ８リガンド前駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Porcine GPR8 Ligand Precursor）と命名した。
配列番号：５４のＤＮＡ配列がコードするブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白のアミノ酸配列を配列番号：５５に示した。この前駆体蛋白のアミノ酸配列には実施例１０に記載のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７残基までの配列が存在した。さらにその配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ前駆体蛋白の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるＡｒｇ−Ａｒｇの配列（Seidah, N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998年）が2ヶ所存在した。このことから、ＧＰＲ８リガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列は配列番号：５６および５７のいずれかもしくは両方であると推定された。ブタＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図９に示した。
【０１１７】
実施例３３ ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡ断片のクローニング
実施例１０に記載したように、ＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部から精製したペプチドのアミノ末端から１７アミノ酸配列（配列番号：６）に基づいてデータベース検索を行なったところ、配列番号：１１の塩基配列に合致するラットＥＳＴ塩基配列（アクセッション番号：H31598）が見出された。このＤＮＡ配列は１５アミノ酸の配列がブタ視床下部から精製したペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６）と同一となる翻訳枠を持っていた。このH31598は、ラットPC12細胞から作製したｃＤＮＡライブラリー由来のＥＳＴ 配列であり、未確定な７塩基を含む２６０塩基からなる。このH31598はＧＰＲ８リガンドのラットホモログペプチド（以下、ラットＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体蛋白の一部をコードしていると推定されたのでその正確な塩基配列を決定するため、H31598の5'塩基配列と3'塩基配列を基に作製したそれぞれのプライマーでラット脳Marathon-Ready cＤＮＡ (CLONTECH)を鋳型としたＰＣＲクローニングを行なった。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。ラット脳Marathon cＤＮＡ (CLONTECH) 2μl、配列番号：６０の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：６１の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、次に96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・60秒のサイクルを35回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを4.0％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約250塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：６２に示すＤＮＡ配列を得た。ＰＣＲクローニングしたＤＮＡの塩基配列（配列番号：６２）とH31598の塩基配列との比較により、１塩基欠失の読み誤りがH31598の塩基配列にあることが明らかになった。
【０１１８】
実施例３４ ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流端のクローニング
5'RACE ＰＣＲ クローニングによりラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を明らかにした。5'RACE PCR クローニングは、ラット脳Marathon-Ready cＤＮＡ (CLONTECH)を鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：６３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：６４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。 反応液はラット脳Marathon cＤＮＡ 2μl、ＡＰ１プライマー0.5μM、配列番号：６３の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・ 60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで２００倍希釈したＰＣＲ反応液2μl、ＡＰ２プライマー0.5μM、配列番号：６４の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.2μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを３１回、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：６５に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１９】
実施例３５ ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流端のクローニング
ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流端の塩基配列を基に作製したプライマーおよびラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡ断片配列を基に作製したプライマーを用いた3'RACE PCRクローニングにより、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を明らかにした。3'RACE PCR クローニングは、ラット脳Marathon-Ready cＤＮＡ (CLONTECH)を鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：６６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：６７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ラット脳Marathon-Ready cＤＮＡ 2μl、ＡＰ１プライマー0.5μM、配列番号：６６の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで２００倍希釈したＰＣＲ反応液2μl、ＡＰ２プライマー0.5μM、配列番号：６７の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・180秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：６８に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１２０】
実施例３６ ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡのクローニング
ラット脳ｃＤＮＡを鋳型として、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を基にしたプライマーとラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を基にしたプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ラット脳Marathon-Ready cＤＮＡ 1μl、配列番号：６９の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：７０の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、Advantage 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・60秒の加熱の後、、96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・60秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約750塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：７１に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：７１）は、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOラットＧＰＲ８リガンド前駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Rat GPR8 Ligand Precursor）と命名した。配列番号：７１のＤＮＡ配列がコードするラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白のアミノ酸配列を配列番号：７２に示した。この前駆体蛋白のアミノ酸配列には実施例１０に記載のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７残基までの配列と５残基目および１７残基目のアミノ酸のみが異なる類似した配列が存在した。さらにその配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトあるいはブタホモログ前駆体蛋白の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるＡｒｇ−Ａｒｇの配列（Seidah, N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998年）が2ヶ所存在した。これらのことから、ＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列は配列番号：７３および７４のいずれかもしくは両方であると推定された。ラットＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図１０に示した。
【０１２１】
実施例３７ マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白の一部をコードするｃＤＮＡ断片のクローニング
配列番号：５８の２３アミノ酸残基のブタＧＰＲ８リガンドペプチドをコードする塩基配列に基づいてデータベース検索を行なった。セレラ社マウスゲノムデータベースに対して検索を行なった結果、配列番号：５８の塩基配列に類似した塩基配列を含む配列番号：７７のマウスゲノム断片配列が見出された。この配列はＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログ（以下、マウスＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体蛋白の一部をコードするゲノム断片配列であることが予想された。
マウス精巣ｃＤＮＡを鋳型として、このマウスゲノム断片配列を基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行ない、増幅ＤＮＡの塩基配列を決定した。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。マウス精巣ｃＤＮＡ (CLONTECH) 1μl、配列番号：７８の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：７９の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを10回繰り返し、次に96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを25回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約350塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：８０）。ここに得られたＰＣＲクローニングしたｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：８０）は、配列番号：７８および配列番号：７９のプライマーに用いた２つの塩基配列に挟まれたマウスゲノム断片塩基配列に完全に一致した。
【０１２２】
実施例３８ マウス脳ｃＤＮＡの作製
マウス脳ｃＤＮＡは、SMARTTM RACE cＤＮＡ Amplification Kit (CLONTECH)を用いてマウス脳poly A(+) RNA (CLONTECH)から、キットに添付のプロトコールに従って作製した。合成した1st strand cＤＮＡ溶液を、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで１０倍に希釈し、この溶液をRACE PCR反応に供した。
【０１２３】
実施例３９ マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流端のクローニング
5'RACE PCR クローニングにより、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を明らかにした。5'RACE PCR クローニングは、マウス脳ｃＤＮＡを鋳型としてSMARTTM RACE cＤＮＡ Amplification Kitに添付のUniversal Primer Mixと配列番号：８１の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のNested Universal Primerと配列番号：８２の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。 反応液はマウス脳ｃＤＮＡ 1μl、Universal Primer Mix 2μl、配列番号：８１の合成ＤＮＡプライマー0.2μM、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ反応液0.5μl、Nested Universal Primer 0.5μM、配列番号：８２の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約300塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８３に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１２４】
実施例４０ マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流端のクローニング
3'RACE PCRクローニングにより、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を明らかにした。3'RACE PCR クローニングは、マウス脳ｃＤＮＡを鋳型としてSMARTTM RACE cＤＮＡ Amplification Kitに添付のUniversal Primer Mixと配列番号：８４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のNested Universal Primerと配列番号：８５の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、マウス脳ｃＤＮＡ 1μl、Universal Primer Mix 2μl、配列番号：８４の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ反応液0.5μl、Nested Universal Primer 0.5μM、配列番号：８５の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) 0.4μlおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約700塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８６に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１２５】
実施例４１ マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニング
マウス脳ｃＤＮＡを鋳型として、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの5'上流塩基配列を基にしたプライマーとマウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡの3'下流塩基配列を基にしたプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、マウス脳ｃＤＮＡ 0.5μl、配列番号：８７の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、配列番号：８８の合成ＤＮＡプライマー0.5μM、1.6 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）0.2μlおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を20μlとし、サーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、96℃・120秒の加熱の後、、96℃・30秒、64℃・30秒、72℃・120秒のサイクルを４０回繰り返し、最後に72℃で10分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約700塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８９に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：８９）は,マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白をコードするため、このＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOマウスＧＰＲ８リガンド前駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Mouse GPR8 Ligand Precursor）と命名した。
配列番号：８９に示すＤＮＡ配列には、実施例１０に記載のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７残基までの配列と５残基目および１７残基目のアミノ酸のみが異なる類似したアミノ酸配列をコードするようなフレームが存在する。しかし、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体の場合と同様に、その5'上流側には蛋白翻訳の開始コドンであると予想されるATGが存在しない。しかし、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白において推測されたように、ブタあるいはラットのＧＰＲ８リガンドホモログの前駆体蛋白との比較からこれらの前駆体蛋白における開始コドンと予想されるATGにほぼ対応する位置に存在するCTGコドンを開始コドンと仮定し、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白の配列を推定した。この仮想的マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白のアミノ酸配列を配列番号：９０に示した。マウスＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列と予想される配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リガンドペプチドのヒト、ブタあるいはラットホモログ前駆体蛋白の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるＡｒｇ−Ａｒｇの配列（Seidah, N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998年）が2ヶ所存在した。これらのことから、ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸配列は配列番号：９１および９２のいずれかもしくは両方であると推定された。なお、配列番号：９１の２３残基型マウスＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列は、２３残基型ラットＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列（配列番号：７３）と一致している。仮想的マウスＧＰＲ８リガンド前駆体蛋白のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図１１に示した。
【０１２６】
実施例４２ ラクトパーオキシダーゼ法を用いた [125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23) および[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)の作製
DMSO 5μlに溶かしたhGPR8L(1-23)（配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）1 nmolを0.1 M 塩化ニッケル5μl と混合し、 0.1 M HEPES (pH 7)に溶かした 0.001％ 過酸化水素水 10μl、0.1 M HEPES (pH 7)に溶かしたラクトパーオキシダーゼ (シグマ社) 10μg/ml を10μlおよび [125I] NaI 37 MBq (NENライフサイエンスプロダクツ社) 10μlを混合後、室温で６０分反応し、以下の条件でＨＰＬＣ分取した。
用いたカラムは、ODS-80TM (4.6 mm x 15 cm)(トーソー社)、溶出液Aとして10％ アセトニトリル/0.1％ TFA、溶出液Bとして60％ アセトニトリル/0.1％ TFA を用い、0-0 (2 min)、0-30 (3 min)、30-38 (5 min)、38-43 (55 min) ％B/A+Bのグラディエント溶出法を行なった。流速は1 mL/min、カラム温度は２５℃、検出は220nmの吸光度を用いて行った。
hGPR8L(1-23)には、チロシン残基が２つ存在するので、ヨード化によって、[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)および [125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)が生成する。このＨＰＬＣ条件では、hGPR8L(1-23)が24分、[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)が30分、[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)が32分付近に溶出した。
【０１２７】
実施例４３ [125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いた受容体結合実験
実施例４２に記載したように作製した[125I]-標識hGPR8L(1-23)および実施例６に記載した方法と同様にしてヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いて受容体結合実験を行なった。
ヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を、アッセイ用バッファー（25 mM Tris-HCl、5 mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、0.05％ CHAPS（３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパン硫酸）、0.1％ BSA（ウシ血清アルブミン）、0.25 mM PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオライド）、1μg/ml ペプスタチン、20μg/ml ロイペプチン、pH 7.4）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（Falcon 2053）に200μlずつ分注した。最大結合量（TB）を測定するために2μlのDMSOと7 nMの[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)または[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23) 2μlを膜画分溶液に添加した。また、非特異的結合（NSB）を測定するために100μM hGPR8L(1-23)のDMSO溶液2μlと7 nMの[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)または[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23) 2μlを膜画分溶液に添加した。25 ℃で60分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（GF-F）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ-カウンターを用いてろ紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引いて特異的結合量（SB）を見積もった。[125I-Tyr2]-hGPR8L(1-23)を用いた場合に比べて[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いた方が、特異的結合量が２倍多かったので実際の結合実験には[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いた。膜画分の濃度を変化させると膜画分の濃度に依存した[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)の特異的な結合が認められた。また、膜画分濃度を5μg/ｍｌに設定して阻害率（％） からhGPR8Ｌ(1-23)の50％阻害濃度（IC50値）を算出したところ、IC50値は0.25 nMであった。図１２に種々の濃度におけるhGPRL(1-23)の結合阻害を示す。
【０１２８】
実施例４４ ヒトGPR8 ligand (1-23)酸化体：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu（配列番号：９５）の製造
実施例１２の化合物0.45 mg を 50％ 酢酸水0.5 mlに溶解後、0.3％過酸化水素水0.05 mlを 加え、室温にて8時間放置した。減圧濃縮後SepPakにより精製し、白色粉末0.443 mgを得た。
質量分析による(M+H)+：2599.2 (計算値2599.4)
ＨＰＬＣ溶出時間：19.1 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１２９】
実施例４５ ヒトGPR8 ligand (1-22)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly（配列番号：９６）の製造
市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33 mmol/g) にFmoc-Gly を導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１３０】
実施例４６ ヒトGPR8 ligand (1-21)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met（配列番号：９７）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)にFmoc-Met を導入したのち実施例−１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１３１】
実施例４７ ヒトGPR8 ligand (1-20)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu（配列番号：９８）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Leuを導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析によるM+ :2282.8 (計算値2282.6)
ＨＰＬＣ溶出時間：17.2 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１３２】
実施例４８ ヒトGPR8 ligand (1-19)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu（配列番号：９９）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Leuを導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析によるM+ :2169.6 （計算値2169.5）
ＨＰＬＣ溶出時間：16.4 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１３３】
実施例４９ ヒトGPR8 ligand (1-18)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly（配列番号：１００）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Glyを導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析によるM+ :2056.8 （計算値2056.3）
ＨＰＬＣ溶出時間：14.2 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１３４】
実施例５０ ヒトGPR8 ligand (1-17)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala（配列番号：１０１）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Alaを導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１３５】
実施例５１ ヒトGPR8 ligand (1-16)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala（配列番号：１０２）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Alaを導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１３６】
実施例５２ ブタGPR8 ligand (1-23)：Trp-Tyr-Lys-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：５６）の製造
市販2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)にFmoc-Leuを導入したのち実施例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析による(M+H)+：2585.2 (計算値2585.4)
ＨＰＬＣ溶出時間：20.2 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１３７】
実施例５３ ラット／マウスGPR8 ligand (1-23)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ser-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leuの製造（配列番号：７３および配列番号：９１）
実施例５２と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得ることができる。
【０１３８】
実施例５４ ブタGPR8 ligand (1-23)酸化体：Trp-Tyr-Lys-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu（配列番号：１０３）の製造
実施例５２の化合物を用い実施例４４と同様に酸化して目的物を得た。
質量分析による(M+H)+：2601.3 (計算値2601.4)
ＨＰＬＣ溶出時間：18.9 分
溶出条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm)
溶離液：A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出(35分)
流速：1.0 ml/分
【０１３９】
実施例５５ ラット／マウスGPR8 ligand (1-23)酸化体：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ser-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu（配列番号：１０４）の製造
実施例５３の化合物を用い実施例４４と同様に酸化して目的物を得ることができる。
【０１４０】
実施例５６ [Nα-Acetyl-Trp1]-ヒトGPR8 ligand (1-23)：Ac-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０６）の製造
実施例１２で調製した樹脂のFmoc基を除去、無水酢酸でアセチル化した後、TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。 粗ペプチドを実施例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による (M+H)+ 2626.12625.8 (計算値2627.12626.1)
ＨＰＬＣ溶出時間 21.4 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分）
流速 1.0ml/分
【０１４１】
実施例５７ ヒトGPR8 ligand (2-23)： Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０７）の製造
実施例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のTyrを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを実施例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+ 2397.1 (計算値2397.3)
ＨＰＬＣ溶出時間 19.9 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分
【０１４２】
実施例５８ ヒトGPR8 ligand (4-23)： His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０８）の製造
実施例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のHisを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを実施例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+ 2106.0 (計算値2106.1)
ＨＰＬＣ溶出時間 20.0 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分
【０１４３】
実施例５９ ヒトGPR8 ligand (9-23)： Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０９）の製造
実施例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のArgを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを実施例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+ 1615.0 (計算値1614.9)
ＨＰＬＣ溶出時間 20.2 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分
【０１４４】
実施例６０ ヒトGPR8 ligand (15-23)： Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１０）の製造
実施例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のArgを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを実施例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+ 901.4 (計算値901.5)
ＨＰＬＣ溶出時間 20.2 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分
【０１４５】
実施例６１ [N-Acetyl-Tyr2]-ヒトGPR8 ligand (2-23)：Ac-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１１）の製造
実施例５７で調製した樹脂を無水酢酸でアセチル化した後、実施例５７と同様に処理、精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+ 2439.3 (計算値2439.3)
ＨＰＬＣ溶出時間 20.2 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分
【０１４６】
実施例６２ [D-Trp1]-ヒトGPR8 ligand (1-23)：D-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１２）の製造
実施例１２のFmoc-Trp(Boc)の代りにFmoc-D-Trp(Boc)を用い同様に目的物を得た。
質量分析による(M+H)+ 2583.4 (計算値2583.4)
ＨＰＬＣ溶出時間 20.6 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分
【０１４７】
実施例６３ [N-3-Indolepropanoyl-Tyr2]-ヒトGPR8 ligand (2-23)：3-Indolepropanoyl-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１３）の製造
実施例１２のFmoc-Trp(Boc)の代りに3-Indolepropionic acidを用い所望の樹脂を得、これをTFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを実施例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による(M+H)+ 2568.4 (計算値2568.4)
ＨＰＬＣ溶出時間 21.7 分
溶出条件
カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm)
溶離液 A液: 0.1％TFA-水、B液: 0.1％TFA含有アセトニトリルを用い、 A/B: 100 / 0 〜 30 / 70へ 直線型濃度勾配溶出(35分)
流速 1.0ml/分
【０１４８】
実施例６４ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のＧＴＰγＳ結合促進活性
本明細書に合成法を記載したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体を種々の濃度で実施例６に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与してＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。測定した誘導体の配列番号とＧＴＰγＳ結合促進活性を表１に示した。なお、活性は50％有効濃度（EC50値）で示した。また、実施例２０および２１に記載のhGPR8L(1-23)およびhGPR8L(1-30)のＧＴＰγＳ結合促進活性も合わせて記載した。
【０１４９】
実施例６５ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分および[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体の受容体結合活性
本明細書に合成法を記載したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体の受容体結合活性を実施例４３に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分および[125I-Tyr10]-hGPR8L(1-23)を用いて測定した。測定した誘導体の配列番号と受容体結合活性を表１に示した。なお、受容体結合活性は50％結合阻害濃度（IC50値）で示した。また、実施例４３に記載のhGPR8L(1-23)の受容体結合活性も合わせて記載した。
【０１５０】
【表１】
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【０１５１】
実施例６６ ＧＰＲ８リガンドペプチドのプロラクチン放出促進作用
Wistar雄性ラット（9週令）の第三脳室（AP:-7.1、L:0.0、H:2.0mm）にペントバルビタール麻酔下でガイドカニューレ（AG-12）を挿入した。その後、1週間以上回復させてから実験を行った。回復期間中、毎日ハンドリングを行い、脳室内投与時のストレスを軽減させた。
実験の前日に、ペントバルビタール麻酔下にて右頚静脈に採血用のカニューレを挿入した。実験は9：00-12：00に行った。ラットに無麻酔、無拘束下でマイクロインジェクションカニューレを取り付け、PBSに溶解させた実施例１２で得たヒトＧＰＲ８リガンドペプチド（配列番号：１６）（ｎ＝９）またはPBSのみ（ｎ＝１０）を5μl/minで2分間投与した。投与終了後から１分後にマイクロインジェクションカニューレを取り外し、自由に行動させた。ペプチド投与前および投与開始から5、10、20、30、60分後に300μlづつ採血を行った。体内の水分量を一定に保つために、血液を採取した後に同量の生理食塩水を頚静脈より投与した。血液にヘパリンを加えた後に遠心（5000rpm×10min，４℃）して血漿を分離した。血漿中プロラクチンレベルはラットプロラクチン[125I]アッセイシステム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を用いたラジオイムノアッセイにより測定した。
結果を図１３に示す。これより明らかに、ＧＰＲ８リガンドペプチドはラット脳室内投与によって血中プロラクチン量を増加させることがわかる。
【０１５２】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡまたは本発明のポリペプチドは、▲１▼本発明のポリペプチドの有する生理作用の探索、▲２▼合成オリゴヌクレオチドプローブあるいはＰＣＲのプライマーの作成、▲３▼ＧＰＲ８のリガンドや前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの入手、▲４▼組換え型レセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、▲５▼抗体および抗血清の入手、▲６▼ＤＮＡ、抗体を用いた診断薬の開発、▲７▼中枢神経機能調節剤などの医薬の開発、▲８▼遺伝子治療等に用いることができる。
【０１５３】
【配列表】
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【０１５４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＧＰＲ８受容体蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるヒトＧＰＲ８受容体蛋白質の全アミノ酸配列を示す。
【図２】 Wakosil-II 3C18HGカラムを用いたＧＰＲ８リガンドの最終段階の精製におけるＨＰＬＣのＵＶ吸収と各ピークのＧＴＰγＳ活性を示す。活性は矢印に示すピークに回収された。
【図３】 種々の濃度の２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す。
【図４】 種々の濃度の３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ/ＧＰＲ８細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す。
【図５】 種々の濃度の２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に対するｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。
【図６】 ＧＰＲ８リガンドペプチドの摂食量に対する作用を示す。各値は平均値±SEMを示す（ｎ＝１０）。
【図７】 種々の濃度の３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に対するｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。
【図８】 ＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ前駆体蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ前駆体受容体蛋白質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのヒトホモログペプチドの配列を四角で示す。
【図９】 ＧＰＲ８リガンドペプチドのブタホモログ前駆体蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのブタホモログ前駆体受容体蛋白質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのブタホモログペプチドの配列を四角で示す。
【図１０】 ＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログ前駆体蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログ前駆体受容体蛋白質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのラットホモログペプチドの配列を四角で示す。
【図１１】 ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログ前駆体蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログ前駆体受容体蛋白質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのマウスホモログペプチドの配列を四角で示す。
【図１２】 ヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いた、[125I]で標識した２３残基のヒトＧＰＲ８リガンドに対する２３残基のヒトＧＰＲ８リガンドの結合阻害活性を示す図を示す。
【図１３】 ラット脳室内投与したＧＰＲ８リガンドペプチドによる血中プロラクチン量増加を示す図を示す。各値は平均値±SEMを示す。

Claims (17)

  1. (i)配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９５、配列番号：９６、配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１１２、または配列番号：１１３で表されるアミノ酸配列、あるいは
    (ii)上記のいずれかの配列番号のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸がＣ末端に付加したアミノ酸配列
    からなるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
  2. 請求項１記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
  3. 配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：１１４、配列番号：１１５、または配列番号：１１６で表される塩基配列を有する請求項２記載のＤＮＡ。
  4. 請求項２記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
  5. 請求項４記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
  6. 請求項５記載の形質転換体を培養し、請求項１記載のポリペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の製造法。
  7. 請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
  8. 請求項２記載のＤＮＡに相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンスＤＮＡ。
  9. 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなるプロラクチン産生促進剤。
  10. 請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、及び配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその塩を用いることを特徴とする請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  11. 標識した請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項１０記載のスクリーニング方法。
  12. 請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、及び配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその塩を含有してなる請求項１記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  13. 請求項２記載のＤＮＡを用いることを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物。
  14. 請求項４記載の組換えベクターにより非ヒト動物に導入されることを特徴とする請求項１３記載のトランスジェニック動物。
  15. 請求項２記載のＤＮＡが不活性化された非ヒトノックアウト動物。
  16. 請求項２記載のＤＮＡが他の遺伝子の導入により不活性化された請求項１５記載の非ヒトノックアウト動物。
  17. 他の遺伝子がレポーター遺伝子である請求項１６記載の非ヒトノックアウト動物。
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