WO2004053124A1 - 糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方法 - Google Patents

糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2004053124A1
WO2004053124A1 PCT/JP2003/015575 JP0315575W WO2004053124A1 WO 2004053124 A1 WO2004053124 A1 WO 2004053124A1 JP 0315575 W JP0315575 W JP 0315575W WO 2004053124 A1 WO2004053124 A1 WO 2004053124A1
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expression
receptor
nuclear
promoter
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Masatoshi Nakajima
Takeo Oshima
Satoshi Orita
Toru Yanagimoto
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Shionogi & Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a means for treating and preventing diabetes. More specifically, the present invention relates to a method for screening a therapeutic or preventive agent for diabetes, a kit used for the screening method, a pharmaceutical composition, and the like. Background art
  • Diabetes is a disease mainly associated with symptoms such as polydipsia, polyuria, and weight loss, and chronic hyperglycemia, and is generally associated with complications such as retinopathy, nephropathy, and peripheral neuropathy.
  • the diabetes may be primary diabetes [insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II diabetes)], secondary diabetes [knee diabetes mellitus, Teng extra-endocrine Z endocrine Diabetes, drug-induced diabetes).
  • the diabetes is known to be a factor in arteriosclerotic diseases such as myocardial infarction and cerebral infarction.
  • the ReV-erb family nuclear receptor is one of the orphan nuclear receptors [Miyajima, N. et al., Cell, Vol. 57, pp. 39 ( 1989)
  • R ev-erb A ⁇ is known to be a nuclear hormone receptor that is a target for therapeutic use of fertility.
  • An in vitro assay has been reported for identifying the module of nuclear hormone receptor function of ReV-erbA ⁇ [see WO99927365 (Table 1)].
  • the ReV-erb family is one of the negative regulators of transcription of the apolipoprotein C-III gene.
  • apolipoprotein C —III and serum triglycerides have been found to be used for screening substances useful for the treatment of lipid metabolism disorders associated with the apolipoprotein C-III [International Publication No. No. 99/67637 pamphlet (page 3, line 14-16 from the bottom, page 24, line 15-page 26, line 12, FIG. 1)].
  • One aspect of the present invention relates to diabetes, specifically type II diabetes, particularly in relation to the function of the Rev-erb family nuclear receptor or factors associated therewith, such as Rev-erbA.
  • a method for screening a therapeutic or preventive agent for diabetes which can perform at least one of the following.
  • Another aspect of the present invention relates to a screening method which can achieve at least one of the above-mentioned screening methods, which can be performed simply, rapidly, with a high throughput, and with high reliability.
  • a kit for use To provide a kit for use.
  • Still another aspect of the present invention relates to a nuclear receptor of the ReV-erb family or a factor related thereto, for example, an action based on the mechanism of action on the function of ReV-erbAa
  • the present invention relates to providing a pharmaceutical composition which exerts a therapeutic or preventive action against diabetes which develops in connection with the function of V-erb family nuclear receptor or a factor related thereto, for example, Rev-erb Aa.
  • Another aspect of the present invention relates to the function of diabetes, specifically, type II diabetes, in particular, the Rev_erb family nuclear receptor or a factor related thereto, for example, Rev-erbAo !.
  • An object of the present invention is to provide a method for diagnosing diabetes, which can perform at least one of a simple diagnosis and a rapid diagnosis of diabetes associated with the disease.
  • Another aspect of the present invention relates to providing a diagnostic kit capable of performing at least one of the above-mentioned diagnostic methods in a simple manner, in a rapid manner, and in a high throughput.
  • another aspect of the present invention relates to diabetes, specifically type II diabetes, in particular, the function of the ReV-erb family nuclear receptor or a factor related thereto, such as Rev-erbA ⁇ . Detection of a sample from an individual with diabetes that can achieve at least one of simple and rapid detection of a sample from an individual with diabetes associated with it. Related to providing a method.
  • another aspect of the present invention relates to providing a detection kit capable of at least one of performing the above-mentioned detection method simply, quickly, and with a high throughput.
  • another aspect of the present invention relates to a Re V-erb family mononuclear receptor or a factor related thereto, for example, an action based on the mechanism of action on the function of Re V-erbAa, a Re V-erb family.
  • Mononuclear receptors or factors related thereto for example, a method for suppressing the expression of Re ve rb family nuclear receptors, which is useful for application to treatment of diabetes that develops in connection with the function of Re ve rb A ⁇ .
  • ReV erb family, a nuclear receptor promoter
  • Nuclear factor promoter capable of functionally coupling the Rev-erb family nuclear receptor to the RNA polymerase complex
  • step (II) After the step (I), the binding between the factor and the test substance is detected, whereby the test substance that binds to the factor is selected as a candidate compound for a therapeutic or preventive agent for diabetes. Steps
  • the promoter is operably linked to the repo overnight gene downstream of and under the control of the responsive element, and the reporter downstream gene is operable downstream and under the control of the promoter.
  • step (c) expression of the reporter gene in the cells obtained in step (b). Detecting the presence or absence of the change in expression, and thereby selecting a test substance that results in the presence or increase of the expression of the repo allele gene as a candidate compound for a therapeutic or preventive agent for diabetes
  • step (B) measuring the variation in the expression of the Rev-erb family-1 nuclear receptor in the cells obtained in step (A), thereby producing a test that results in a decrease in the expression of the nuclear receptor; Step of selecting a substance as a candidate compound for a therapeutic or prophylactic agent for diabetes
  • step (c) expression of the reporter gene in the cells obtained in step (b). Detecting the presence or absence of the change in expression, and thereby selecting a test substance that results in the presence or decrease in the expression of the reporter gene as a candidate compound for a therapeutic or preventive agent for diabetes
  • step (b ′) the step (a ′) of introducing and expressing, into a cell, a nucleic acid construct in which the repo overnight gene is operably linked downstream and under the control of the promoter.
  • Nuclear factor promoter capable of functionally coupling the Rev—erb family receptor to the RNA polymerase complex
  • Kit for screening a compound or a salt thereof Comprising at least one factor selected from the group consisting of Kit for screening a compound or a salt thereof,
  • the promoter and the repo gene are operably linked, and the reporter gene is downstream and under the control of the promoter.
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that regulates the function of the factor
  • Kit for salt screening a compound that regulates the expression of a nuclear factor that comprises an antibody against a nuclear factor or a fragment thereof capable of functionally coupling a nuclear receptor of the Reverb family to an RNA polymerase complex, or a compound thereof.
  • ReV erb family mononuclear receptor
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that regulates expression of the factor comprising a cell endogenously expressing the factor.
  • a nucleic acid construct comprising the reporter gene operably linked downstream and under the control of the promoter.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that regulates the expression of the factor comprising:
  • ReV erb family, a nuclear receptor promoter
  • Nuclear factor promoter capable of functionally coupling the ReV-erb family mononuclear receptor to the RNA polymerase complex
  • [24] Includes a step of measuring the expression level of the ReV-erb family nuclear receptor gene in each of a test sample derived from the subject to be tested and a control sample derived from a normal subject, wherein the test sample If the expression level of the test sample is higher than the expression level of the control sample, the test sample is indicative of being a sample derived from an individual suspected of having the disease.
  • the expression level is measured using the amount of the mRNA transcript of the Rev-erb family mononuclear receptor gene as an index, the method according to (24),
  • [27] detection for performing the method of [24] or [25], comprising a nucleic acid capable of detecting a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, and 8; Kit, and
  • FIG. 1 is a diagram showing the expression analysis results of the Rev-erbA gene in Zuckerfat ttyrat skeletal muscle of each of the group administered with Piodari evening, the food restriction group, and the food restriction + exercise load group.
  • FIG. 2 is a view showing the results of expression analysis of the Rev-erbA gene in the Ztickerfatatttyrat adipose tissue of each of the pioglitazone-administered group, the food-restricted group, and the food-restricted + exercise-loaded group.
  • FIG. 3 is a view showing the results of expression analysis of ReV-erbA ⁇ gene in human tissues.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of Western blot of cells in which human ReV-erbA ⁇ is forcibly expressed.
  • FIG. 5 is a view showing the results of analyzing glucose uptake ability in cells in which ReV-erbA ⁇ is forcibly expressed.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of examining the expression of a reporter gene using a ReV-erbAK binding sequence.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of examining the expression of a reporter gene using the ReV-erbAa promoter.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of examining the expression level of Rev-erbA ⁇ in siRNA-expressing cells.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of analyzing the glucose uptake ability of ReV-erb Aa expression-suppressed cells.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention improved insulin resistance in insulin resistant model rats (Zuckerfattyrat) by applying dietary restriction or a combination of dietary restriction and exercise load.
  • the present inventors have found that the expression of Rev_erbAa is reduced as compared to before the improvement, and the glucose uptake ability is reduced by forcibly expressing the Rev-erbA ⁇ in cultured cells. Based on their surprising findings.
  • the following describes the preparation of the ReV-erbAa polynucleotide, the preparation of the ReV-erbAa polypeptide, the recombinant vector, the transformant, the method for producing the recombinant vector or the transformant, the antibody, and the quantification of the polypeptide.
  • Method or immunological detection method, mRNA quantification method, mRNA translation suppression method, binding substance, binding substance screening method, transcription regulatory activity modulator, transcription regulatory activity modulator screening method, expression regulator, expression regulator screening A method, a screening kit, a method for detecting diabetes, a gene detection kit, a pharmaceutical composition, and the like will be described.
  • gene recombination techniques techniques for producing recombinant proteins in animal cells, methods for separating and purifying expressed proteins, analytical methods, and immunological techniques, unless otherwise indicated. Is adopted.
  • the method for screening a therapeutic or prophylactic agent for diabetes of the present invention is based on such findings of the present inventors. Specifically, in the presence of a test substance, the following (1) to (5):
  • Nuclear factor promoter capable of functionally coupling the RNA polymerase complex with the ReV-erb family mononuclear receptor
  • One feature is to measure or detect the kinetics of at least one factor selected from the group consisting of:
  • the screening method of the present invention by using the kinetics of at least one of the above-mentioned factors (1) to (5) as an index, the effect of a test substance on diabetes mediated by the factor is evaluated. Alternatively, screening for a candidate compound for a prophylactic agent is performed.
  • a candidate compound for a therapeutic or prophylactic agent for diabetes effective for developing diabetes can be screened. That is, according to the screening method of the present invention, a therapeutic agent for diabetes based on a different mechanism of action from a thiazolidinedione compound for improving insulin resistance by activating peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) or Candidate compounds for prophylactic agents can be screened. Further, according to the screening method of the present invention, candidate compounds for therapeutic or prophylactic agents can be screened based on the mechanism of action on the function.
  • PPAR peroxisome proliferator-activated receptor
  • a candidate compound for a therapeutic or preventive agent for diabetes based on the mechanism of action can be screened simply and quickly.
  • the screening method of the present invention can be used for the pharmacological evaluation of candidate compounds as therapeutic or prophylactic agents for diabetes that develops in association with the function of the ReV-erb family nuclear receptor or a factor related thereto. it can.
  • the test substance includes a compound or a salt thereof.
  • the compound or a salt thereof includes a low-molecular compound, a high-molecular compound, a polypeptide or a derivative thereof, a nucleic acid or a derivative thereof, and the like.
  • Such a test substance may be a natural substance or a non-natural substance.
  • Derivatives of polypeptides include modified polypeptides obtained by adding a modifying group and amino acid residues by modifying The resulting variant polypeptide and the like can be mentioned.
  • the nucleic acid derivative include a modified nucleic acid obtained by adding a modifying group, a variant nucleic acid obtained by modifying a base, and a peptide nucleic acid.
  • the nucleic acid or its derivative also includes lipozyme, antisense nucleic acid (for example, antisense DNA), siRNA capable of inducing RNAi, and the like.
  • factor function examples include thyroid steroid hormone receptor superfamily (for example, thyroid hormone (T3) receptor, etc.), high-density lipoprotein metabolic protein (for example, apoprotein A-I, apoprotein A-II) ), Triglyceride-related proteins (eg, apoprotein C_III, lipoprotein lipase, etc.), circadian rhythm regulators (eg, Bma11, etc.) and R ev —er bAa itself, the transcriptional repression of each gene and protein C— III expression suppression.
  • T3 receptor thyroid hormone
  • high-density lipoprotein metabolic protein for example, apoprotein A-I, apoprotein A-II
  • Triglyceride-related proteins eg, apoprotein C_III, lipoprotein lipase, etc.
  • circadian rhythm regulators eg, Bma11, etc.
  • R ev er bAa itself
  • the functions include, for example, the thyroid nosteroid hormone receptor superfamily (eg, thyroid hormone (T3) receptor, etc.), high density lipoprotein metabolizing proteins (eg, apoprotein A_I, apoprotein A-II, etc.) ), Triglyceride-related proteins (eg, apoprotein C-III, lipoprotein lipase, etc.), circadian rhythm regulators (eg, Bma11, etc.) and Rev-erb ⁇ It can be determined by measuring with CR, Northern blotting, dot blotting, Western blotting, Imnoassesse, etc. The function can also be examined by measuring the binding activity between Rev-erb and the Rev-erb responsive element or the transcriptional control activity.
  • T3 receptor thyroid hormone
  • high density lipoprotein metabolizing proteins eg, apoprotein A_I, apoprotein A-II, etc.
  • Triglyceride-related proteins eg, apoprotein C-III, lipoprotein lipase, etc.
  • R e V-erb family nuclear receptor means a nuclear receptor belonging to Re v-erb family.
  • Rev-erb family mononuclear receptor include thyroid steroid hormone receptor super family (eg, thyroid hormone (T3) receptor etc.), high density rib protein Xe protein (eg, apoprotein AI, apoprotein A-II, etc.), triglyceride-related protein (eg, apoprotein C-III, lipoprotein lipase, etc.), rhythm control factor (eg, Bma11, etc.)
  • Rev-erbAa itself may have a function of controlling the transcription of each gene and the function of controlling the expression of protein C-III, and examples thereof include Rev-erb and R ⁇ R.
  • the “ReV-erb family mononuclear receptor” includes, for example, Rev-erbA, Rev-erbA / 3, R ⁇ Ra, R ⁇ R) 3, RORa and the like.
  • the “ReV-erb family nuclear receptor” may be a factor having a naturally-occurring amino acid sequence or a variant having the above function.
  • ReV-erbAa is characterized in that it is expressed in skeletal muscle, brown fat, liver, heart, brain, and kidney, and shows an expression pattern in skeletal muscle> brown fat> liver, heart, brain, and kidney.
  • a domain involved in transactivation for example, in the case of human-derived R eV-erb A ⁇ , a domain involved in transactivation, a D ⁇ binding domain, a domain involved in dimer formation, a transcription
  • nuclear receptors having domains and hormone (ligand) binding domains involved in suppression.
  • the “Re V-erb family mononuclear receptor responsive element” may be any element having a nucleic acid sequence that binds to the Re V-erb family nuclear receptor.
  • the “nuclear factor capable of functionally coupling the Rev_erb family nuclear receptor to the RNA polymerase complex” is a partner of the Rev_erb family nuclear receptor, A nuclear factor that can form a heteromultimer with a family nuclear receptor.
  • the “nuclear factor capable of functionally coupling an RNA polymerase complex with the ReV-erb family nuclear receptor” is a Rev-erb factor.
  • the thyroid / steroid hormone receptor superfamily eg, thyroid hormone (T3) receptor, etc.
  • high-density rib protein metabolic protein eg, apoprotein A-I , Apoprotein A-II, etc.
  • triglyceride-related proteins eg, apoprotein C_III, lipoprotein lipase, etc.
  • circadian rhythm regulators eg, Bma11, etc.
  • R ev — er bAa any substance having a function of controlling transcription and controlling the expression of protein C-III may be used.
  • the “Rev-erb family—a nuclear factor capable of functionally coupling a nuclear receptor and an RNA polymerase complex” may be a factor having a naturally-derived amino acid sequence, It may be a variant having a function.
  • Specific examples of the “nuclear factor capable of functionally coupling the ReV-erb family nuclear receptor and the RNA polymerase complex” include, but are not particularly limited to, N-CoRZR IP 13, SUN—CoR, Sin3, SMRT, RIP140 and the like.
  • the promoter of the Rev-erb family mononuclear receptor includes, for example, a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 60, and the like.
  • the promoter of the Re-erb family mononuclear receptor may be any one having a base sequence that functions as a promoter in the Re-erb family nuclear receptor. Just fine.
  • the promotion of the ReV—erb family nuclear receptor is, for example,
  • At least the sequence identity between the sequence of a region unrelated to the expression of the promoter function and the corresponding sequence is at least Is 60%, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and exhibits a function as a promoter in the ReV-erb family mononuclear receptor.
  • the function of the Re V-erb family nuclear receptor as a promoter is, for example,
  • rat-derived cell line L6 skeletal muscle-derived myoblast
  • mouse-derived cell line 3T3L1 adipocyte
  • mouse-derived cell line C2C12 myoblast Cells
  • the expression of the Re V- erb family nuclear receptor or the corresponding mRNA is preferable, preferably in the case of the wild type. Expression at the same or higher level is evaluated as an indicator that the nucleic acid to be evaluated exerts its function as a promoter at the nuclear receptor of the Rev-erb family. Can be.
  • Examples of the promoter of the nuclear factor that can functionally couple the ReV-erb family nuclear receptor with the RNA polymerase complex include the promoter of the nuclear factor described in (3) above. Specifically, for example, the promoter of RIP140 (SEQ ID NO: 61) and the like can be mentioned.
  • the promoter of a nuclear factor capable of functionally coupling the Rev-erb family mononuclear receptor to the RNA polymerase complex has a function as a promoter in the nuclear factor. What is necessary is just to have a base sequence which exhibits.
  • ReV-erb family nuclear receptor and RNA polymerase Promoters of nuclear factors capable of functionally coupling the complex include, for example,
  • the sequence identity between the sequence of a region unrelated to the expression of the promoter function and the corresponding sequence is at least 60%, preferably at least 80%, More preferably, the nucleic acid is 90% or more and exhibits a function as a promoter in the nuclear factor.
  • the function as a promoter of a nuclear factor capable of functionally coupling the Rev-erb family mononuclear receptor to the RNA polymerase complex is as a promoter in the Rev-erb family mononuclear receptor.
  • the expression of the nuclear factor or the corresponding mRNA is preferably carried out by expressing the nuclear factor or the corresponding mRNA at the same level or higher than that of the wild-type. Can be evaluated as an indicator of the functioning of the promotion as a function of the promotion.
  • the Rev-erb family mononuclear receptor preferably, the Rev-erb family mononuclear receptor, the ReV-erb family nucleus are used.
  • Function of internal receptors and RNA polymerase complex Nuclear factors that can be coupled to each other are desirable.
  • the Re e-V erb family nuclear receptor Among the v-erbs, human Rev-erbAa is preferable, and among the nuclear factors capable of functionally coupling the Rev-erb family nuclear receptor to the RNA polymerase complex.
  • human N-CoR and human Sun-CoR are preferred.
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence SEQ ID NO: 2 of the human ReV-erb @ ⁇ are disclosed in Gene Bank Accession No .: X72631.
  • the “factor kinetics” to be measured or detected may be a coordinated kinetics by all of the factors (1) to (5), and Coordinated kinetics by a combination of two types of factors arbitrarily selected from the factors may be used, and kinetics by each of the above factors (1) to (5) alone may be used.
  • the “kinetic of the factor” to be measured or detected includes, for example, the expression of the ReVerb family mononuclear receptor, specifically, the change in the expression level; e V—erb family mononuclear receptor and its ligand binding; ReV—erb family mononuclear receptor and nucleic acid to which the nuclear receptor specifically binds; Re Promote of V-erb family nuclear receptor.
  • the method includes a step of selecting a test substance that binds to the factor as a candidate compound for a therapeutic or preventive agent for diabetes. According to such a method, it is possible to select a substance that acts on the function of the factor through the binding to the factor, and thus the selected candidate compound directly binds to the factor to increase its function. It has the characteristic property of adjusting. Therefore, the selected candidate compound exerts an excellent effect that it can directly and specifically act on the factor.
  • the contact between the factor and the test substance is performed by mixing the factor and the test substance in a solution that does not hinder the original function of the factor, It can be carried out by maintaining the temperature, reaction time and the like.
  • a solution that does not hinder the original function of the factor examples include phosphate buffered saline (PBS), HE PES buffer 1, Tris buffer 1, and the like.
  • reaction conditions in step (I) are not particularly limited.
  • a solution of PBS, HEPES buffer 1, Tris buffer, or the like pH 6.0 to 10.0, preferably pH 7.0 to 9.0 0, more preferably pH 7.5 to 8.5, even more preferably pH 8.0, IO to 50, preferably 20: to 40 :, more preferably 25 to 37, even more preferably , 25, 1 minute to 1 hour, preferably 3 minutes to 30 minutes, more preferably 5 minutes to 20 minutes, more preferably 10 minutes, or 0t: to 20: preferably 2 110t :, more preferably 3: 8, more preferably 4, 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 40 minutes to 2 hours, even more preferably Is maintained for one hour.
  • step (II) the presence or absence of binding between the factor and the test substance is examined for the product obtained in step (I).
  • the binding between the factor and the test substance can be detected by, for example, surface plasmon analysis, binding to a carrier holding the test substance, or the like.
  • detection means eg optical detection (fluorescence, fluorescence polarization etc.), combined with mass spectrometer (matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometer: MA LDI-TOFMS, Electrospray T On mass spectrometer:
  • the binding can be measured by performing a method including In the measurement method using surface plasmon analysis, the binding between the above-described factor and the test substance may be caused by, for example, an optical sensorgram or a mass sensorgram fluctuating due to the introduction of the test substance by liquid sending.
  • the test substance can be selected as a candidate compound for a therapeutic or preventive agent for diabetes.
  • the promoter and the repo gene are operably linked downstream and under the responsive element, and the reporter gene is operated downstream and under the control of the promoter.
  • step (c) detecting the presence or absence of the expression of the reporter gene in the cells obtained in the step (b) or measuring a change in the expression, whereby a test substance which causes the presence or an increase in the expression of the reporter gene; Selecting as a candidate compound for a therapeutic or prophylactic agent for diabetes.
  • a method including: According to such a method, the presence or absence of the expression of a repo overnight gene downstream of the responsive element due to the interaction between the nuclear receptor of (1) and the responsive element to the nuclear receptor is used as an index.
  • Select a candidate compound a candidate compound. Therefore, the selected candidate compound is characterized by having the ability to inhibit the nuclear receptor of (1), particularly the ability to suppress the transcription of the nuclear receptor of (1). It has an excellent effect that the ability to regulate the transcription of the nuclear receptor or the ability to inhibit the DNA binding activity of (1) functions at the cell level.
  • operble is intended to mean a concept that includes the function of a promoter, the expression of the function of a downstream gene or various factors under the control of the promoter over and over, and the like.
  • the nucleic acid construct of I) used in the step (a) is a construct comprising a responsive element to a Rev_erb family nuclear receptor, a promoter, and a reporter gene.
  • the responsive element to the Re V-erb family nuclear receptor refers to a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence that acts by binding of the Reverb family nuclear receptor, for example, a Re V-erb family mononuclear. Nucleic acid consisting of a target sequence by the nuclear receptor itself, which is localized in the nucleic acid encoding the internal receptor, and hybridizes under stringent conditions to the antisense strand of the nucleic acid consisting of the target sequence.
  • nucleic acid molecule comprising a sequence capable of responding; having a mutation of at least one base in the nucleotide sequence of the nucleic acid comprising the target sequence, and binding to and / or responding to a ReV-erb family nuclear receptor.
  • nucleic acid molecules consisting of sequences capable of binding and Z or responding to internal receptors.
  • responsive element to the Rev-erb family nuclear receptor include SEQ ID NOs: 14, 15, 16 and the like.
  • the promoter may be appropriately selected depending on the cell used for introducing the nucleic acid construct, and may be any promoter as long as it can be expressed in the host.
  • the promoter e.g., trp promoter Isseki one (P lrp), 1 ac promoter - evening - (Pij, P L promoter, PR promoter, promoter evening one derived from Escherichia coli or phage, such as PSE promoter, S PO l promoter , S P02 Promote overnight, penP Promote overnight, Human cytomegalovirus (hCMV) (Promoter of DIE (Imme diate-early) gene, Early promoter of SV40, Moroni-I 'Mullin' Leukemia 'virus (Long Term Repetition Promoter); Long-Term Promote of Retrovirus, HSP Promoter , SRa promoter and meta-mouth thionine promoter, etc.
  • hCMV Human cytomegalovirus
  • a P trp X 2 promoter in which two P trps are connected in series, a tac promoter, a lac T7 promoter, 1 et Promoters designed and modified artificially, such as promoters, etc.
  • the promoter is operably linked downstream and under the control of the responsive element.
  • the reporter gene may be any gene whose product expression can be detected, and may be appropriately selected depending on the cell used to introduce the nucleic acid construct. Examples thereof include a luciferase gene, a 0-galactosidase gene, a chloramphenicolase acetyltransferase gene, an alkaline phosphatase gene, a Biotin gene, and a fluorescent protein.
  • the repo overnight gene is operably linked downstream and under the control of the promoter.
  • the one-time promotion may be the one-time promotion of the repo one-night gene.
  • the nucleic acid construct of the above I) may be carried on a conventional carrier for cell introduction, for example, a virus vector, a plasmid vector, metal fine particles or the like.
  • virus vector examples include a retrovirus vector, an adenovirus vector, and the like.
  • plasmid vector examples include p cDNA l.1, p cDNA l.1 aminop, pCDM8, pREP (manufactured by Invitrogen), pHM6, pHB6 (manufactured by Schdiagnostics), pKK223-3, pGEX (Amersham Biotech), pET-3, pET-11, pBluescriptll SK (10), pBluescriptll (registered trademark) SK (-) (Stratagene), pUC 19, pT r xFus ( Invitrogen), pUC118, pSTV28 (Yukara Bio), pMAL-c2X (New Zealand Biolab), pAGE107 CCy totec hnolgy, 3
  • the nucleic acid construct for expression of the above II) contains the nucleic acid encoding the nuclear receptor of the above (1).
  • nucleic acid encoding the nuclear receptor of the above (1) specifically, for example, i) SEQ ID NO: nucleic acid encoding amino acid sequence for 2,
  • the antisense strand of the nucleic acid of i) hybridizes under stringent conditions to the antisense strand, and the encoded polypeptide binds to a specific chromatin sequence, and regulates the transcription initiation efficiency of the target gene to be positive or negative.
  • a nucleic acid which exerts a function iii) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 which has at least one nucleotide mutation, and wherein the encoded polypeptide binds to a specific chromatin sequence
  • the function can be evaluated by the above-described function evaluation method.
  • the nucleic acid construct of the above I) and the nucleic acid construct for expression of the above II) are desirably those that can coexist with each other (have compatibility) in cells.
  • the nucleic acid construct of the above I) can be constructed by inserting the responsive element of the ReV-erb family nuclear receptor into a cloning site of a conventional reporter plasmid.
  • the reporter plasmid may be any vector as long as it is a vector capable of expressing and detecting the above-mentioned reporter gene.
  • Such vectors include pGL3, pRL, PCAT3 (promega), pEGFP, pECFP , PE YFP, pDs Red, pSEAP, pj3ga1 (Clontech), PGV-I CS, PGV-B, PGV-P, PGV-C2, PGV-P2, PGV-B2 ( Manufactured by Toyo Ink Co., Ltd.).
  • the expression nucleic acid construct of the above-mentioned II) is a conventional expression vector capable of expressing the nucleic acid encoding the nuclear receptor of the above-mentioned (1), for example, a virus vector, a plasmid vector -Can be constructed by inserting into a cloning site in such as.
  • the expression vector suitable for the expression of the nucleic acid encoding the nuclear receptor of the above (1) includes any vector that can incorporate the cDNA and express it in a suitable host cell, for example, an animal cell.
  • such vectors include pCR—Blunt II-T OPO, pcDNA l.1, pcDNA1.1 / Amp, pCDM8, pREP (manufactured by Invitrogen), pHM6, pHB6 ( Roche Diagnostics, PKK223-3, pGEX (Amersham Biotech), pET-13, pET-11, pBluescriptll (registered trademark) SK (+), pBluescriptll (registered trademark) SK ( —) (Stratagene), pUC19, pTr xFus (Invitrogen), pUC118, pST
  • V28 (Yukara Bio), pMAL-c2X (New England Biolab), PAGE 107 CCy totec hnology, 3 (2), 133-140 (1990); JP-A-3-22979) , PAGE 103 (Th eJournalof Bioch em istry, 101 (5), 1307-1310 (1987)), pAMo, pAMoA (TheJournalofBiologyc alChem istry, 268 ( 30), 2278 2-22787 (1993)], pAMoPRSA (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5-336963), pAS3-3 (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 2-227575), and the like.
  • the expression vector contains a constitutive promoter or an inducible promoter, a poly-A-added signal, an origin of replication, an antibiotic resistance gene, and the like.
  • the promoter may be any promoter as long as it can be expressed in a host.
  • the promoter of the IE (Immediate-early) gene of human cytomegalovirus (hCMV) the early promoter of SV40, Moroni-I. Roychemia 'Williles (Mo on ey Murine Leu 1 emia)
  • Virus long terminal repeat promoter
  • retrovirus promoter Yuichi Long Term Promoter
  • HSP promoter Long Term Promoter
  • SR ⁇ promoter metamouth thionein promoter
  • metamouth thionein promoter the enhancer of the I CM gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • animal cells specifically, human-derived cell lines HE K293 (human embryonic kidney cells, ATCC: CRL-1573) and He La (uterine cervical cancer cells, ATCC: CCL_2) HBT 5637 (leukemia cell, JP-A-63-299), BALL-1 (leukemia cell) and HCT-15 (colorectal cancer cell), mouse-derived cell line Sp2 / 0-Ag14 (mouse) Myeloid cells, ATCC: CRL-1 581), NSO (mouse myeloid cells), rat-derived cell line L6 (skeletal muscle-derived myoblasts), mouse-derived cell line 3T3L1 (adipocytes), mouse-derived cell line C2C12 (myoblasts), monkey-derived cell line COS-1 (African green monkey kidney cells (SV40 transformed cells), ATCC: CRL_1650) and COS-7 [African green monkey kidney cells (SV40 transformed cells) ), ATCC: CRL-1651), hamster-derived cell line CH ⁇
  • stringent conditions refers to conditions of high stringency, such as 1 XSSC / 0.2% SDS.
  • lower ionic strength for example, 0.5 XSSC, preferably 0.2 XSSC, more preferably, 0.1 XSSC and the like and / or higher temperature, for example, although it depends on the Tm value of the nucleic acid used, washing or the like may be performed under conditions of 50 or more, preferably 60 or more, more preferably 65 or more.
  • “Mutation” as used herein refers to substitution, deletion, addition and insertion of a base. Such a mutation may be a naturally occurring variation, or may be a mutation artificially introduced by a conventional site-specific mutation method or the like.
  • sequence identity refers to determining the number of matching sites by appropriately aligning at least two sequences to be compared and determining the same residue present in each sequence. Then, it refers to a value that can be calculated by dividing the number of matching sites by the total number of residues in the sequence region to be compared, and multiplying the obtained value by 100. Specifically, such sequence identity can be calculated, for example, by using the generally available BLAST algorithm or the like at the homepage address http: //www.ncbi.n1m.nih.govZBLASTZ.
  • sequence identity in the present specification refers to, in the BLAST algorithm, G (Costtoopengap5, E (Costtoextendga) 2, q (Penaltyfor nu cleotidemi sma tch) — 3> e (expected value) means a value calculated under the condition satisfying 10 and W (wordsize) 11.
  • step (a) the nucleic acid construct of I) and the nucleic acid construct for expression of II) are introduced into appropriate cells.
  • the cell may be any suitable cell or tissue corresponding to the expression vector, and examples include animal cells.
  • Animal cells used as hosts include, for example, rat-derived cell line L6 (skeletal muscle-derived myoblasts), human-derived cell line HEK293 (human fetal kidney cells, ATCC: CRL_1573), HeLa (uterus Classified cancer cells, ATCC: CCL-2) HBT5637 (leukemia cells, JP-A-63-299), BALL-1 (leukemia cells) and HCT-15 (colorectal cancer cells), mouse derived cell line S p20-Ag14 (mouse myeloid cells, ATCC: CRL-1581), NSO (mouse myeloid cells), C2C12 (mouse myoblasts) and 3T3-L1 (mouse fibroblasts, ATCC CL- 173), monkey-derived cell line COS-1 [African green monkey kidney cells (SV40 transformed cells), ATCC: CRL-1 650] and COS-7 [African green monkey kidney cells (SV
  • BHK-21 (C-13) (Sicilian hamster kidney cells, ATCC: CCL-10), rat cell line PC12 (adrenal pheochromocytoma, ATCC: CRL-1721) and YB2 0 ( Rat myeloid cells, ATCC: CRL — 1662) and the like.
  • the introduction of the nucleic acid construct and the expressed nucleic acid construct into the cell can be performed by a conventional gene transfer method.
  • the electroporation method [Cytotechnology, 3 (2), 133-140 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2-227075
  • the lipofection method etc.
  • Method ProceedingsoftheNationals of Science of Sciences USA, 84, 7413 (1987); Vi 1 ogy, 52, 456 (1973)]
  • DEAE dextran method, particle gun method, and virus It can be performed by the method described above.
  • Cells into which the nucleic acid construct and the expressed nucleic acid construct have been introduced may be cultured by a conventional method known and used in the art.
  • the culture can be performed using a medium suitable for the cells used, and a liquid medium is suitable as a medium used for the culture.
  • a MEM medium Science, 130, 432 (1959)
  • a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)]
  • an RPM 1 1640 medium [Th eJournaloftheAmerican M edica 1 As sociation, 199, 519 (1967)]
  • YT medium BEM medium and the like.
  • a culture medium for culturing a transformant in which the host is an animal cell for example, a medium obtained by adding an appropriate amount of fetal calf serum (FCS) to a MEM medium, a DMEM medium, an RPIM medium, or the like is used.
  • FCS fetal calf serum
  • the medium may contain a substance that promotes the transcription activity in order to increase the transcription activity of the promoter of the expression vector.
  • Substances that promote transcription activity include, for example, —Thio— / 3— D-galactopyranoside (I PTG) and the like.
  • the culture medium contains nutrients necessary for the growth of the transformant, such as glucose, amino acid, peptone, vitamins, hormones, and serum, preferably FCS, calcium chloride, and magnesium chloride.
  • nutrients necessary for the growth of the transformant such as glucose, amino acid, peptone, vitamins, hormones, and serum, preferably FCS, calcium chloride, and magnesium chloride.
  • FCS calcium chloride, and magnesium chloride.
  • a medium having any composition can be used as long as such a medium is used, and a commercially available medium can also be used.
  • the culture can be performed under aerobic conditions such as, for example, shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature, culture time, and pH of the culture solution are set in ranges suitable for various hosts.
  • the culture is usually 15 to 40: 5 hours to 7 days may be performed at pH3 0 ⁇ 9. 0, 5% C0 2 present conditions such as under..
  • the pH can be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium.
  • As a promoter when culturing a transformed microorganism in an expression vector carrying an inducible promoter, an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • a host transformed with an expression vector carrying the 1 ac promoter a host transformed with an expression vector carrying the trp promoter, such as isopropyl-1- / 3-D-thiogalactopyranoside, may be used.
  • trp promoter such as isopropyl-1- / 3-D-thiogalactopyranoside
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • step (a) when a stable cell line into which the nucleic acid construct and the expressed nucleic acid construct are introduced is used, step (a) may be omitted.
  • step (b) the cells obtained in step (a) are brought into contact with a test substance.
  • the step (b) includes, for example, culturing the cells obtained in the step (a) using a medium containing the test substance, and exposing the cells to a buffer solution such as PBS containing the test substance. This can be performed by exposing the cell extract to a test substance. Then, in step (c), the presence or absence of the expression of the reporter gene in the cells obtained in step (b) is measured.
  • a control cells containing the nucleic acid construct of the above-mentioned I) and the nucleic acid construct for expression of the above-mentioned II), and cultured in a medium not containing the test substance, and exposed to the test substance. Unexposed cells or cell extracts can be used.
  • the expression of the reporter gene is measured by examining the expression of the product, depending on the reporter gene used. For example, when the repo overnight gene is an enzyme gene such as a luciferase gene, the enzyme activity may be examined. Further, FI TC method for detecting the fluorescent label EL ISA method or chemiluminescence method, luminol or GFP (G reen F luorescence P rotein ) for detecting by enzymatic labels such as the West Wa rust pel O Kishida over peptidase, alkaline phosphatase, 125 The RIA method for detecting a radioisotope label such as I, the latex binding method to latex, the western blotting method, and the immunohistological staining are also exemplified.
  • the presence of the reporter gene in the cells contacted with the test substance indicates that the test substance is a candidate for a therapeutic or preventive agent for diabetes. It serves as an indicator of being a compound.
  • the expression level of the reporter gene is increased in the cells that have been brought into contact with the test substance as compared with the control cells. It is an indication that the test substance is a candidate compound for a therapeutic or prophylactic agent for diabetes.
  • the test substance is brought into contact with a cell in which the factor (1) or (3) is endogenously expressed, and the above-mentioned (1) or (3) )
  • the change in the expression of the factor is detected at the protein level or the nucleic acid level.
  • a method of selecting as a candidate compound is provided.
  • a candidate compound is selected using the change in the expression of the nuclear factor in (3) as an index. Therefore, the selected candidate compound exerts an excellent effect of acting on any of the factors constituting the transcription complex of the ReV-erb family.
  • Examples of the cells used in each of the steps (A) and ( ⁇ ′) include the same cells as those in the second embodiment.
  • contact between the cells and the test substance For example, culturing cells expressing the above-mentioned factor (1) or (3) endogenously using a medium containing the test substance, buffering the PBS containing the test substance, etc.
  • the exposure can be performed by exposing the cells to a liquid, exposing the cell extract to a test substance, and the like.
  • As a control cells that are endogenously expressing the factor (1) or (3) and cultured in a medium containing no test substance are used. Exposure of the cells to a buffer such as PBS containing the substance, exposure of the cell extract to the test substance, and the like can be used.
  • the change in the expression of each of the factors (1) and (3) in the cells obtained in each of (′) is at the protein level, for example, by the steps ( ⁇ ⁇ ) and
  • the expression level of each of the factors (1) and (3) in the cells obtained in each of ( ⁇ ') and the expression level of each of the factors (1) and (3) in the control cells were determined.
  • polyacrylamide gel electrophoresis Western blot analysis using the antibody against the nuclear receptor described in (1) or a fragment thereof or the fragment thereof and the antibody against the nuclear factor described in (3) or the fragment thereof, respectively.
  • Measurement can be performed by Imnoassay or the like using the antibody or a fragment thereof, and comparison can be made.
  • fluctuations in the expression of the factors (1) and (3) may be caused at the nucleic acid level, for example, by extracting a nucleic acid from a cell after contact with a test substance and obtaining the obtained nucleic acid by, for example, A nucleic acid capable of detecting each nucleic acid encoding the factor of (1) and (3), that is, an eighty-bridge using a nucleic acid that specifically binds to each nucleic acid encoding the factor of (1) and (3).
  • a nucleic acid encoding the factors (1) and (3) or a part thereof is subjected to PCR or the like using a primer pair capable of specifically amplifying the nucleic acid to form or to form a hybrid. Alternatively, it can be evaluated by measuring the appearance or amount of the amplification product and comparing the results.
  • the cells contacted with the test substance As compared with the control cells, the cells contacted with the test substance
  • the test substance It is an indicator that the compound is a candidate compound for a therapeutic or preventive agent for diabetes.
  • examples of the antibody for measuring or detecting the kinetics of a factor include an antibody against the factor (1) or (3), a fragment thereof, and the like.
  • the method for producing the antibody is described, for example, in 1992, by John Weily & Sons, Inc., edited by John E. Coligan, and edited by Current Protocols in Co., Ltd. It can be easily produced by immunizing a egret or mouse using all or a part of the factors of the above (1) or (3) by the method described in Immunology (Current Protocols in Immunology). .
  • Antibodies can also be produced by genetic engineering.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it has an ability to specifically bind to the factor (1) or (3).
  • the antibody may be, for example, an antibody capable of specifically binding to a specific partial fragment in the factor (1) or (3).
  • the antibody fragment is obtained by purifying the obtained antibody and treating it with peptidase or the like.
  • derivatives of the above-mentioned antibodies for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab fragments, single-chain antibodies, and antibodies modified by known techniques can also be used.
  • Such an antibody or a fragment thereof may be labeled with a conventional enzyme (for example, peroxidase or the like), a fluorescent dye, a radioactive substance, avidin or biotin, or the like.
  • Preparation of a polyclonal antibody that recognizes Re V-erb A ⁇ can be performed using mammals using the full length polypeptide of Re v-erb A ⁇ , its partial peptide or a polypeptide containing the partial peptide as an antigen. By administering the antibody, an antibody can be produced.
  • the antigen the polypeptide or the partial peptide may be used as it is.
  • Carriers such as perilla serum albumin (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), and pericaline (BTG) or the like may be used.
  • BSA perilla serum albumin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • BGT pericaline
  • CFA complete adjuvant
  • IFA incomplete An adjuvant
  • mammals used for immunization mouse, rat, porcupine, goat, hamster and the like can be used.
  • the polyclonal antibody can be obtained, for example, by the method of Lane et al. [Antibodies: ALaboratoryManual, Second Edition (19)
  • the immunized mammals can be obtained by administering 3 to 10 times every 1 to 2 weeks to obtain immunized mammals, and serum can be collected from those mammals and purified. .
  • the administration of the antigen is performed 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to 100 tg per animal per administration.
  • a peptide it is desirable to use the antigen covalently bound to an appropriate carrier as the antigen.
  • the peptide serving as the antigen can be synthesized by a genetic engineering technique or a peptide synthesizer. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the serum reacts with the antigen used for immunization. (1976); Antibodies: AL abo ratory
  • Blood is collected from the immunized mammal and the antibody titer is measured. Blood is collected at the time of immunization until a sufficient antibody titer is obtained, and a serum is prepared, whereby a polyclonal antibody can be obtained.
  • Methods for separating and purifying polyclonal antibodies include centrifugation, salting out with ammonium sulfate, and prillic acid precipitation [Antibodies: AL aboratory Manu al, Second Edition (198 9) (Cold Spring Harbor Laboratory Press) )] Or DE AE-sepharose column, anion exchange column, protein A column, G-force column or gel filtration column, etc., alone or in combination. it can.
  • Monoclonal antibodies that recognize the Rev-erb family mononuclear receptor are, for example, antibodies obtained from the spleen or lymph nodes of immunized mammals with sufficient antibody titers. It can be obtained by fusing the producer cells with myeloma (myeloma) cells to obtain a monoclonal antibody-producing hybridoma, and using the obtained hybridoma to produce the desired antibody by a conventional method.
  • myeloma myeloma
  • a Re V-erb family mononuclear receptor, a partial peptide or a polypeptide containing a partial peptide thereof is administered as an antigen, and the antigen is administered to a rat showing a sufficient antibody titer. Is given last. Then, on days 3 to 7, the spleen is removed from the rat. The obtained spleen is shredded in a MEM medium (for example, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with forceps, and centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes. The splenocytes in the precipitate fraction thus obtained are treated with Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.65) for 1 to 2 minutes to remove erythrocytes. Thereafter, the obtained spleen cells are washed three times with the MEM medium. The obtained splenocytes are used as antibody-producing cells.
  • MEM medium for example, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Myeloma cells include cell lines derived from mice or rats. Such myeloma cells include, for example, 8-azaguanine-resistant mice (derived from BALBZc) myeloma cells P3_X63Ag8-U1 strain (hereinafter abbreviated as P3-U1) [Current To pics Micro ob iolo gy cal cal I mm unology, 8 1, 1 (1978), Europi an Journal of I mmu no 1 ogy, 6, 51 1 (1976)], SP 2Z0—Agl 4 strain (hereinafter abbreviated as SP_2) [Nature, 276, 269 (1 978)], P 3 _X 63 _Ag 8653 strain (hereinafter abbreviated as 653) [Journal of Immunology, 123, 1548 (1979)], P 3 -X 63- Ag 8
  • Cell fusion can be performed in a known manner, for example, according to the method of Köhler and Milstein [; Nature, 256, 495-497 (1975)]. Specifically, the antibody-producing cells and the myeloma cells were added to a medium or? Wash with 8 S (per liter; 1.83 g disodium phosphate, 0.21 g monopotassium phosphate, 7.65 g NaC pH 7.2) and wash antibody-producing cells against the number of myeloma cells. Mix by ⁇ ⁇ ⁇ 10-fold and centrifuge at 1,200 rpm for 5 minutes to obtain a precipitate fraction.
  • polyethylene glycol solution [2 g Polyethylene glycol - 1000 (PEG- 1000), 2m 1 MEM culture areas, 0. 7 ml dimethyl sulfoxide (DMSO)] is added at 0.2 to 1 ml with stirring at 37, and 1 to 2 ml of MEM medium is added several times every 1 to 2 minutes. Adjust the total volume to 5 Om1 with MEM medium and centrifuge at 90 Orpm for 5 minutes to obtain a precipitate fraction.
  • HAT medium precipitation fraction normal medium, 1 0 one 4 M hypoxanthine, 1. including 5 X 10- 5 M thymidine and 4 X 10- 7 M Amino pterin
  • the resulting suspension was dispensed by 100 1 well to each well of a 96-well culture plate, 3 7, 5% C_ ⁇ 2 in the presence cultured for 7 to 14 days.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay [Antibodies: AL Absorbatory Manu al, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press)] Among them, select a hybridoma that produces an antibody that specifically reacts with the nuclear receptor of the ReV-erb family.
  • the antibody production by the hybridoma can be performed by a conventional method.
  • examples of the nucleic acid for measuring or detecting the kinetics of a factor include a nucleic acid that specifically binds to each nucleic acid encoding each factor of the above (1) or (3). .
  • nucleic acid that specifically binds to each nucleic acid encoding the factor of (1) or (3) include, for example, a nucleic acid encoding the nuclear receptor of (1) or a nucleic acid of an antisense strand thereof A nucleic acid encoding the nuclear factor of the above (3) or a nucleic acid of its antisense strand; a nucleic acid of a partial sequence characteristic of a nucleic acid encoding the nuclear receptor of the above (1) or its antisense strand; And a nucleic acid having a partial sequence characteristic of the nucleic acid encoding the nuclear factor of (3) or a nucleic acid of an antisense strand thereof.
  • Such a nucleic acid can be appropriately selected based on an appropriate Tm value, a secondary structure and the like in consideration of operability at the time of use. Specifically, for example, a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, and 8; a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41 to 51; their antisense strands And the like. Such a nucleic acid may be labeled with a conventional fluorescent dye, radioactive substance or the like.
  • Examples of the primer pair capable of specifically amplifying the nucleic acid encoding the factor (1) or (3) or a part thereof include the nucleic acid encoding the nuclear receptor of (1) and the nucleic acid (3).
  • a primer pair consisting of a primer corresponding to the 5 'end and a primer corresponding to the 3' end of each of the partial sequence and the partial sequence characteristic of the nucleic acid encoding the nuclear factor of (3), and the like, may be mentioned.
  • Such a pair of primers can be appropriately selected based on an appropriate Tm value, a secondary structure, and the like in consideration of operability at the time of use.
  • Specific examples include a primer pair capable of detecting a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, and 8 through nucleic acid amplification.
  • such a primer pair may be any as long as it can amplify the entire sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, or 8 or a specific partial sequence thereof.
  • SEQ ID NOS: 10, 12, 17, 17, 19, 21, 23, 2 A primer comprising a base sequence represented by one selected from the group consisting of 5, 27, 29, 31, 33, 35, 37 and 39; and SEQ ID NOS: 11, 13, 18, 20, 22, 24, And a primer pair consisting of a primer consisting of a nucleotide sequence represented by one selected from the group consisting of 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 and 40.
  • primer pair examples include, but are not particularly limited to, a primer pair of SEQ ID NOS: 10 and 11, a primer pair of SEQ ID NOs: 12 and 13, a primer pair of SEQ ID NOs: 17 and 18, a sequence No .: primer pair 19 and 20, SEQ ID NO: 21 and 22 primer pair, SEQ ID NO: 23 and 24 primer pair, SEQ ID NO: 25 and 26 primer pair, SEQ ID NO: 27 and 28 Primer pair with SEQ ID NO: 29 and 30, primer pair with SEQ ID NO: 31 and 32, primer pair with SEQ ID NO: 33 and 34, primer pair with SEQ ID NO: 35 and 36 And a primer pair of SEQ ID NOs: 37 and 38, a primer pair of SEQ ID NOs: 39 and 40, and the like.
  • Such a primer may be a primer labeled with a conventional fluorescent dye, a radioactive substance or the like.
  • the amplification product can be detected by conventional agarose gel electrophoresis or the like, by visualization with a bromide dye or a fluorescent dye, detection based on a labeled primer, or the like.
  • the “characteristic partial sequence (to nucleic acid)” refers to, for example, a base sequence of a sequence registered in the database excluding the factor (1) or (3). Refers to a partial sequence that is not found.
  • the sequence identity with the sequence registered in the database is 20% or less, preferably 10% or less, more preferably 5% or less, and particularly preferably 0% or less.
  • the Rev-erb family mononuclear receptor promoter (4) or the Rev-erb family nuclear receptor (5) and RNA polymerase Examples include a method of selecting a test substance that inhibits the function of a nuclear factor promoter capable of functionally coupling with a complex as a candidate compound for a therapeutic or preventive agent for diabetes.
  • the method of the fourth embodiment includes:
  • step (b,) a step of bringing the cells obtained in step (a ') into contact with a test substance
  • the function of the Rev-erb family nuclear receptor promoter is Inhibition of the function, ie, a substance that results in the presence or decrease of the expression of the reporter gene, can be selected. Therefore, the selected candidate compound is an inhibitor of the function of the Rev-erb family nuclear receptor promoter. Has the property of acting on the nuclear receptor of the family Rev-erb. Therefore, the selected candidate compound exerts an excellent effect of being able to directly and specifically act on the ReV-erb family nuclear receptor promoter.
  • the inhibition of the function of a nuclear factor promoter capable of functionally coupling the ReV-erb family nuclear receptor with the RNA polymerase complex ie, the expression of a reporter gene
  • the selected candidate compound Since the substance that causes the presence or decrease of the expression of the nuclear factor can be selected, the selected candidate compound has the property of acting on the nuclear factor through inhibition of the function of the promoter of the nuclear factor. Have. Therefore, the selected candidate compound should directly and specifically act on a promoter of a nuclear factor that can functionally couple the nuclear receptor of the ReV-erb family with the RNA polymerase complex. It has an excellent effect that it can be done.
  • the nucleic acid construct used in the step (a) or (a ′) contains the promoter of the above (4) or (5) and a reporter gene, and the reporter gene operates under and under the control of the promoter. Possibly linked constructs. Examples of such a reporter gene include those similar to the above-described repo overnight gene.
  • the cells used in the steps (a) and (a ') the same cells as the above-mentioned host cells can be used.
  • the introduction of the nucleic acid construct into cells can be performed by the above-described conventional gene transfer method.
  • a medium similar to the medium used in the method of Embodiment 2 can be used.
  • steps (a) and (a ′) may be omitted.
  • steps (b) and (b ') the cells obtained in steps (a) and (a') are brought into contact with a test substance, respectively.
  • the steps (b) and (b ') are, for example, culturing the cells obtained in the steps (a) and (a') using a medium containing the test substance, respectively.
  • the exposure can be performed by exposing the cells to a buffer solution such as PBS or the like, or exposing the cell extract to a test substance.
  • steps (c) and (c ′) the presence or absence or fluctuation of the expression of the reporter gene in the cells obtained in steps (b) and (b ′) are measured, respectively.
  • a control cells that retain the nucleic acid construct of the above I) and are cultured in a medium that does not contain the test substance, cells that are not exposed to the test substance, cell extracts, etc. Can be used.
  • Examples of the candidate compound for a therapeutic or preventive agent for diabetes obtained by the screening method of the present invention include a compound or a salt thereof that suppresses the expression of the factor (1) or (3); and (1) to (5). And compounds that inhibit the function of at least one factor selected from the group consisting of:
  • Examples of the compound or a salt thereof include a compound that inhibits at least one function of the factor by binding to at least one of the factors (1) to (5), for example, a low molecular compound, A polymer compound, an antibody against the factor (1) or (3), a nucleic acid such as an antisense strand of a nucleic acid encoding any of the factors (1) to (3), a peptide; 3) a nucleic acid that induces RNAi in response to a nucleic acid that encodes any of the factors, specifically, a siRNA; that corresponds to a nucleic acid that encodes any of the factors (1) to (3) Liposome and the like.
  • a compound that inhibits at least one function of the factor by binding to at least one of the factors (1) to (5) for example, a low molecular compound, A polymer compound, an antibody against the factor (1) or (3), a nucleic acid such as an antisense strand of a nucleic acid encoding any of the factors (1) to (3), a peptid
  • the sequence of the siRNA should avoid the 5 'and 3 untranslated regions having many regulatory protein binding sites and the region around the initiation codon. desirable.
  • the sequence of the siRNA is not particularly limited, for example, 1 From the start codon of the target sequence that inhibits the function, a region that is preferably at least 50 to 100 nucleotides downstream, more preferably at least 75 nucleotides downstream, is selected.
  • a sequence that does not cause cell death more preferably a sequence of AA—CN19 (any 19 nucleotide residues)] or AA-CN21 (any 21 nucleotide residue) Group)], more preferably, the sequence of AAG-CN18 (arbitrary 18 nucleotide residues)] or the sequence of AAC— [ ⁇ 18
  • the GC content is preferably 30% to 70%, more preferably about 40% to about 50%, and still more preferably about 50%.
  • siRNA design tool eg, an siRNA design tool manufactured by Dharmac Inc.
  • the siRNA having the designed sequence be stored in, for example, water treated with DE PEC (getyl pyrocarboxylic acid).
  • the siRNA specifically includes a siRNA corresponding to a nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 54 or 55, or a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 56 or 57
  • Examples include siRNA corresponding to nucleic acids.
  • siRNA When siRNA is used as the test substance in the screening method of the present invention, the designed siRNA is used in an appropriate annealing buffer, for example, composition: 50 mM Tris-HC1 (pH 7. 5), 100 mM NaC1 Buffer, composition: 30 mM HE PES-KOH (pH 7.4), 100 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg buffer, composition: 1 mM Tris-HCl (pH 7. 5) In a buffer of ImM EDTA, under a conventional annealing condition, for example, incubate at 90 to 95T: for 5 minutes, and gradually lower the temperature to around 25 at 25 to form double-stranded RNA. Can be used.
  • a buffer of ImM EDTA under a conventional annealing condition, for example, incubate at 90 to 95T: for 5 minutes, and gradually lower the temperature to around 25 at 25 to form double-stranded RNA. Can be used.
  • the screening method of the present invention comprises the step of (a) obtaining the cell or the cell obtained in step (a) of Embodiment 2 by a conventional method. Steps of Embodiment 3
  • RNAi The vector that can be used for RNAi is not particularly limited.
  • a method of synthesizing siRNA in in vitro 0 and introducing it into cells can be used, and such a method is not particularly limited.
  • trade name: BLOCK-IT Complete D icer RNA i Kit (manufactured by Invitrogen), trade name: Silencer, si RNA Construction Kit (manufactured by Ambion), trade name: CUGAR 7 invitrosi RNA Synthesis K it (manufactured by Futtsubon Gene) or the like can be used.
  • the effect of siRNA may be such that siRNA having the same base composition as the used siRNA is used as a negative control.
  • the liposome corresponding to the nucleic acid encoding any of the factors (1) to (3) is, for example, a tRNA-linked ribozyme.
  • RNA of the designed sequence is used as an index, for example, to correctly form the structure of tRNA, that the lipozyme structure is relatively stable, and that there is no formation of a stem structure in the target mRNA.
  • the designed lipozyme is converted into a vector suitable for expression, for example, trade name: pi GENE tRNA (Yukara Bio Inc.), trade name: pi GENE hU6 [Yukara Bio Inc.], trade name: pi GENEmU6 [Yukara Bio Inc.], etc., and the resulting vector can be introduced into an appropriate host cell and amplified in the host cell.
  • a vector suitable for expression for example, trade name: pi GENE tRNA (Yukara Bio Inc.), trade name: pi GENE hU6 [Yukara Bio Inc.], trade name: pi GENEmU6 [Yukara Bio Inc.], etc.
  • the screening method of the present invention uses the vector or virus for expressing the lipozyme in a conventional manner in the step (a) of the second embodiment. It can be carried out by, for example, introducing into the cells obtained or the cells obtained in step (A) of the third embodiment.
  • the factors (1) to (5) used in the screening method of the present invention are described in the present invention. It is also provided as a kit for performing the screening method. Therefore, such a screening kit is also included in the present invention.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof which contains at least one factor selected from the group consisting of the above (1) to (5) and binds to the factor;
  • Re V response element for erb family nuclear receptor, promoter
  • the promoter and the repo overnight gene are operably linked downstream and under the responsive element, and the reporter gene is operably linked downstream and under the control of the promoter.
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that regulates the expression of the factor comprising:
  • the antibody of the above (1) or (3) or a fragment thereof containing an antibody against the factor is provided.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that regulates expression of the factor comprising cells into which the nucleic acid encoding the factor of (1) or (3) has been introduced;
  • a nucleic acid construct comprising the promoter of (4) or (5) and a repo overnight gene, wherein the repo overnight gene is operably linked downstream and under the control of the promoter.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that regulates the expression of the factor comprising:
  • the screening kit of the present invention may further contain a detection reagent, a buffer, a standard substance, a standard curve, and the like.
  • the said screening method exhibits the outstanding effect that it can be performed simply, quickly, with a high throughput, and with high reliability.
  • the compound or a salt thereof obtained by the screening method of the present invention has an effect based on a mechanism of action on the function of each of the above-mentioned factors (1) to (5), and a function of each of the above-mentioned factors (1) to (5). It can exert a therapeutic or preventive effect on diabetes that develops in association with it. Therefore, the compound or salt thereof obtained by the screening method provides a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a disease associated with the function of each of the factors (1) to (5), particularly diabetes. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention is that the pharmaceutical composition or a salt thereof obtained by the screening method of the present invention is contained as an active ingredient. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is useful for inhibiting the function of each of the above-mentioned factors (1) to (5) for diseases associated with the functions of the above-mentioned factors and diseases which develop in connection with the functions. It has an excellent effect that it can work. Further, according to the pharmaceutical composition of the present invention, diabetes, specifically, type II diabetes, in particular, is associated with the function of each of the above-mentioned factors (1) to (5), for example, Rev-erbAa. Of type II diabetes The effect is excellent. Therefore, according to the pharmaceutical composition of the present invention, insulin resistance can be improved by a different mechanism of action from the thiazolidinedione compound based on activating the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR). It has an excellent effect.
  • PPAR peroxisome proliferator-activated receptor
  • the content of the compound or a salt thereof in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient, and may be a therapeutically effective amount.
  • a polymer compound for example, 0.0001 to 100 Omg, preferably 0.001 to 10 Omg, and in the case of a polypeptide or a derivative thereof, for example, 0.0001 to 1000 mg, preferably 0.001 to 100 mg
  • a nucleic acid or a derivative thereof for example, 0.000001 to 100 mg, preferably 0.000001 to: L Omg is desirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain various auxiliaries capable of stably retaining the compound or a salt thereof.
  • auxiliaries capable of stably retaining the compound or a salt thereof.
  • pharmaceutically acceptable auxiliaries, excipients, and binders exhibiting the property of inhibiting the active ingredient from decomposing before reaching the site to which the active ingredient is to be delivered.
  • Stabilizers, buffers, solubilizing agents, isotonic agents and the like are examples of sorbitol, sorbitol, and the like.
  • the administration form of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately selected depending on the type of the active ingredient; the individual, organ, local site, tissue to be administered; the age, weight, and the like of the individual to be administered.
  • Examples of the administration form include subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, topical administration and the like.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is also appropriately selected according to the type of the active ingredient; the individual, organ, local site, or tissue to be administered; the age and weight of the individual to be administered; The administration is not particularly limited.
  • the amount of the active ingredient is, for example, 0.0001 to 10 O OmgZkg body weight, preferably 0.0001 to 10 OmgZkg body weight, in the case of polypeptides or derivatives thereof, for example, 0.0001-100 OmgZkg body weight, Preferably, 0.001 to 10 OmgZkg body weight, in the case of a nucleic acid or a derivative thereof, for example, 0.000001 to 10 OmgZkg body weight, preferably, so as to give a single dose of 0.0001 to 1 OmgZkg body weight, It may be administered several times a day, for example, one to three times.
  • the pharmacological evaluation of the pharmaceutical composition of the present invention may be performed, for example, in the case of an insulin-resistant model animal, for example, Zuckerfattyra U, which is administered with the pharmaceutical composition of the present invention.
  • a method of evaluating when improvement is observed as an index; a glucose clamp test method or the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a nucleic acid capable of inducing RNAi corresponding to a nucleic acid encoding any of the above-mentioned factors (1) to (3), for example, siRNA or the siRNA.
  • a pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, a lipozyme corresponding to a ribozyme corresponding to a nucleic acid encoding any of the factors (3) is also included.
  • siRNA examples include, but are not particularly limited to, siRNA corresponding to a nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54 or 55, and si corresponding to a nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 56 or 57. RNA and the like.
  • RNA is extracted from an individual to be administered, preferably a tissue such as muscle, fat, liver or the like by a conventional method, and the target mRNA is extracted.
  • Pharmacological evaluation can also be performed using the degradation of the as an index.
  • ribozyme examples include a lipozyme having a recognition sequence of any one of base numbers: 691 to 701 and 578 to 599 in the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is a lipozyme
  • a factor of any of the above (1) to (3) based on cleavage of the recognition sequence or a decrease in the amount of a nucleic acid encoding the same is used as an index.
  • Pharmacological evaluation can also be performed.
  • an RNA or single-stranded DNA complementary to the nucleic acid encoding the above (1) is expressed in a cell. Or by introducing it, suppresses the expression of the gene for the nuclear receptor for the Rev-erb family.
  • the antisense nucleic acid has only to have a sequence complementary to mRNA transcribed from the gene of the target nuclear receptor of the ReV-erb family, and is, for example, at least 20 nucleotides in length, preferably at least 20 nucleotides in length. , 25 nucleotides or more, and more preferably, 28 nucleotides or more are chemically synthesized [for example, trade name: Mor ⁇ ho 1 ino antisense [Gene Tools]], trade name : Phosphorothioate oligo [see BioGnostic (BioGnostic)] and the like or enzymatic synthesis.
  • the antisense nucleic acid may have properties suitable for delivery to a target cancer tissue, and various modifications that can impart affinity to tissues or cells.
  • the antisense nucleic acid can be administered to an individual, for example, by topical administration to a tissue such as muscle or adipose tissue of the individual, parenteral administration, oral administration and the like.
  • the administration method include metal particles and ribosomes, for example, an encapsulating ribosome, a positively charged ribosome, an introduction method using HVJ (Sendai virus) —ribosome, a naked—direct introduction method of DNA, and an introduction method using a positively charged polymer.
  • HVJ Sendai virus
  • the dose and frequency of administration of the antisense nucleic acid can be appropriately set according to the purpose of administration, the age, body weight, condition of the individual, and the like, so as to be sufficient to exert the expression-suppressing effect.
  • the antisense nucleic acid is appropriately dissolved in an appropriate solution, for example, in a form in which the antisense nucleic acid is stably dissolved in a buffer solution or the like, depending on the purpose of use, use form, and the like. Can be used.
  • the antisense nucleic acid may be used as an agent containing a pharmacologically acceptable carrier, excipient, binder, stabilizer, buffer, solubilizing agent, isotonic agent, and the like.
  • a method for suppressing the expression of a ReV-erb family nuclear receptor using the lipozyme can be provided.
  • the means for administering the lipozyme is the same as the means for administering the antisense nucleic acid.
  • a vector suitable for introducing the lipozyme into an individual, particularly a tissue or a cell is not particularly limited.
  • the product name: pi GENEhU6 [Yukara Bio Inc.] the product name: pi GENEmU6 [Yukara Bio Inc. , Trade name: pi GE NE tRNA [Yukara Bio Inc.] and the like.
  • the expression suppression method uses an antisense nucleic acid, ribozyme, or the like corresponding to a nucleic acid encoding a ReV-erb family nuclear receptor, for example, the Rev_erb family nuclear receptor or a factor related thereto
  • a nucleic acid encoding a ReV-erb family nuclear receptor for example, the Rev_erb family nuclear receptor or a factor related thereto
  • an action based on the mechanism of action on the function of Rev_erbA ⁇ , a Renu-erb family mononuclear receptor or a factor related thereto eg, diabetes that develops in relation to the function of ReV_erbAa. It is useful for the application to the treatment etc.
  • the expression of R ev — er bAK is decreased as compared to before the improvement, and furthermore, the expression in cultured cells is reduced. Based on the finding that forced expression of R ev-erb A reduces glucose uptake, a method for diagnosing diabetes, particularly type II diabetes, is provided.
  • the method for diagnosing diabetes provides a method for diagnosing a Re V-erb family mononuclear receptor gene in a test sample derived from an individual to be tested and a control sample derived from a normal individual, that is, One feature is to measure the expression level of a nuclear receptor gene. Therefore, according to the diagnostic method of the present invention, diabetes, specifically, I Excellent effect of easily and rapidly diagnosing type I diabetes, especially diabetes that develops in association with the function of the Rev_erb family nuclear receptor, for example, Rev-erbAa Demonstrate. Further, according to the diagnosis method of the present invention, it is possible to make a diagnosis with high reliability.
  • an index indicating that the test subject is suspected of having diabetes is provided. Become.
  • Examples of the individual include human, mouse, rat, monkey and the like.
  • the nucleic acid-containing test sample can be prepared, for example, from an individual's tissue, cells, blood, etc. by a conventional method.
  • the expression level of the nuclear receptor gene of the above (1) is determined by the amount of the mRNA transcript of the nuclear receptor gene of the above (1) or the amount of the gene product of the nuclear receptor of the above (1). It can be measured as an indicator.
  • the nucleic acid-containing test sample derived from the individual to be tested and the nucleic acid-containing control sample derived from a normal individual can be used, for example, by the nuclear receptor of (1) above.
  • Hybridization using a nucleic acid capable of detecting the encoded nucleic acid ie, a nucleic acid that specifically binds to the nucleic acid encoding the nuclear receptor of (1), or the nuclear receptor of (1)
  • the encoded nucleic acid or a part thereof is subjected to PCR or the like using a primer pair capable of amplifying specifically, and the formation or amount of the hybrid or the appearance or amount of the amplification product is measured and evaluated by comparison. It can be done.
  • the nucleic acid used for the hybridization is characterized by the nucleic acid encoding the nuclear receptor of the above (1) or the nucleic acid of the antisense strand thereof, and the nucleic acid encoding the nuclear receptor of the above (1). Or a nucleic acid of an antisense strand thereof.
  • a nucleic acid can be appropriately selected based on an appropriate Tm value, a secondary structure and the like in consideration of operability at the time of use. Specifically, for example, SEQ ID NO: 1, 3, 4, Nucleic acids selected from the group consisting of 6 and 8; nucleic acids selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41 to 51; and nucleic acids of their antisense strands.
  • Such a nucleic acid may be labeled with a conventional fluorescent dye, radioactive substance, or the like.
  • the primer pair used for PCR includes a primer pair consisting of a primer corresponding to the 5 ′ end and a primer corresponding to the 3 ′ end of the nucleic acid encoding the nuclear receptor of (1); A primer pair consisting of a primer corresponding to the 5 ′ end and a primer corresponding to the 3 ′ end of the partial sequence characteristic of the nucleic acid encoding the nuclear receptor is exemplified.
  • Such a pair of primers can be appropriately selected based on an appropriate Tm value, a secondary structure and the like in consideration of operability at the time of use.
  • a primer pair that can detect a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, and 8 through nucleic acid amplification is exemplified. More specifically, for example, SEQ ID NO: 10, 12, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 and 39 A primer consisting of the base sequence shown in FIG. 1 and one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11, 13, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, and 40 And a primer pair consisting of a primer having the nucleotide sequence shown in the above.
  • a primer may be a primer labeled with a conventional fluorescent dye, radioactive substance or the like.
  • the amplification product can be detected by conventional agarose gel electrophoresis or the like by performing visualization with a bromide reagent or a fluorescent substance, detection based on a labeled primer, or the like.
  • each of a test sample derived from an individual to be tested and a control sample derived from a normal individual is subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, an antibody against the nuclear receptor of (1) or Western blot analysis using the fragment; subjecting to immunoassay or the like using the antibody or the fragment thereof, measuring the amount of the gene product, and comparing the results.
  • the result obtained by the above-mentioned diagnostic method is obtained via a medium, a telecommunication line, or the like. It can be provided to doctors, patients, etc.
  • a diagnostic kit containing the probe and the primer or the primer pair, or A diagnostic kit comprising an antibody against the nuclear receptor of (1) or a fragment thereof is provided.
  • the diagnostic kit of the present invention may further contain a detection reagent, a buffer, a control sample, and the like.
  • diabetes in particular, type II diabetes, in particular, in relation to the function of R ev — erb family nuclear receptors or factors related thereto, for example, R ev — erb
  • a method for detecting or selecting a sample from an individual suspected of having onset diabetes is also provided.
  • a sample derived from an individual suspected of suffering from diabetes can be detected simply, quickly, and with high reliability.
  • the detection or selection method of the present invention includes a step of measuring the expression level of the nuclear receptor gene of (1) in each of a test sample derived from an individual to be tested and a control sample derived from a normal individual,
  • a test sample derived from an individual to be tested
  • a control sample derived from a normal individual
  • the expression level in the test sample is higher than the expression level in the control sample, it is an indicator that the test sample is a sample derived from an individual suspected of having diabetes.
  • the expression level is determined by using the amount of the mRNA transcript of the nuclear receptor gene (1) or the amount of the gene product of the nuclear receptor (1) as an index. Can be measured.
  • the amount of the mRNA transcript or the amount of the gene product can be measured by using the probe and / or the primer pair, or the antibody against the nuclear receptor of (1) or a fragment thereof.
  • the probe or the primer pair is contained in order to carry out the detection or selection method of the present invention simply, quickly, with a high throughput, and with high reliability.
  • a detection kit containing an antibody against the nuclear receptor of the above (1) or a fragment thereof Therefore, according to such a detection kit, the detection method can be performed simply, quickly, with a high throughput, and with high reliability.
  • the detection kit may appropriately contain various reagents necessary for detection, for example, a labeling substance, a labeling reagent, an appropriate control, and the like.
  • Insulin resistance model animals 1 Administration of piodaritazone, an insulin sensitizer, [Pioglitazone administration group], 2 Dietary restriction [Dietary restriction group], or 3 Combination of dietary restriction and exercise load [Dietary restriction + exercise load] Group).
  • exercise load was exercised using a treadmill in addition to dietary restrictions. Exercise load conditions were 15 ml / min X 15 minutes warming-up, 2 Om 1 minute X 60 minutes exercise, 15 ml Z minute X I 5 minutes cool down. The period was 5 weeks.
  • Improvement in insulin resistance was performed by performing a glucose clamp test, and evaluating an increase in glucose injection as an indicator of improvement in insulin resistance.
  • TRIZOL reagent (trade name, manufactured by Invitrogen) was obtained from the brain, skeletal muscle, lung, and adipose tissue of the individual with improved insulin resistance and the control group.
  • Total RNA was prepared according to the attached manual to obtain 300 ag of total RNA. From all the obtained RNAs, po 1 y (A) + RNA was prepared using QuickPrep Micro mRNA Purification Kit (trade name, manufactured by Amersham Bioscience) according to the attached manual. . From this poly (A) + RNA, a cDNA fragment for cloning was prepared using Superscript Choice System (trade name, manufactured by Invitrogen).
  • a cDNA fragment of about 400 bp or more was recovered using Size Sep 400 Spun Collmns (trade name, manufactured by Amersham Bioscience).
  • the vector plasmid pSport1 (trade name, manufactured by Invitrogen) is treated with the restriction enzyme EcoRI (manufactured by Yukara Bio Inc.), and the 5 'end is phosphorylated using T4 polynucleotide kinase. Then, a cDNA fragment obtained using T4 DNA ligase was incorporated.
  • the obtained recombinant plasmid DNA was precipitated with ethanol, dissolved in 20 l of TE buffer (1 OmM Tris-HC1, pH 8.0, 1 mM EDTA), and electroporated by CNuc e eic Acid Reagent. search, 16, 6127 (1988)] to obtain a transformant by introducing it into ElectroMAX DH10B (trade name, manufactured by Impitrogen).
  • the transformant was cultured in 1 ml of SOC medium (manufactured by Invitrogen) at 37 for 1 hour, applied to an LB agar medium containing 100 gZml of ampicillin, and cultured at 37 overnight.
  • SOC medium manufactured by Invitrogen
  • LB agar medium containing 100 gZml of ampicillin
  • insertion rate 100 gZml of ampicillin
  • cDNA fragment was prepared by a PCR method.
  • the obtained cDNA fragment was prepared by using DYEnamic ETD Terminator Kit (MegaBACE) (trade name, manufactured by Amersham Bioscience) according to the attached manual.
  • the entire nucleotide sequence of the cDNA fragment was determined using a 1 ysis System (trade name, manufactured by Amersham Bioscience).
  • the sequence information of the cDNA is (Product name, manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), about 5,000 types of cDNA clones without duplication were selected. These clones were converted into a Type 7 slide glass (trade name, manufactured by Amersham Biosciences) using a DNA chip generation system, Microchip Array System Generation IIIS potter (trade name, manufactured by Molecular Dynamics). ) To produce a DNA chip.
  • Skeletal muscle was excised from ZuckerFatty rats that underwent 30% dietary restriction and exercise for 5 days per week. From the obtained skeletal muscle, total RNA was prepared using TRIZo1R eAnt (trade name, manufactured by Invitrogen) according to the attached manual. Poly (A) + RNA was purified from the obtained total RNA using QuickPrep Micro mRNA Purification Kit (trade name, manufactured by Amersham Bioscience) according to the attached manual. Probes were prepared using poly (A) + RNA. p o l y
  • Cy-3 dCTP or Cy-5 dCTP (manufactured by Amersham Bioscience) was incorporated using (registered trademark) II RT (manufactured by Invitrogen), and the cDNA was fluorescently labeled. Further, labeled cDNA was purified using GFX PCR DNA and Gel B and Purification Kit (trade name, manufactured by Amersham Bioscience) and used as a probe. As a probe, hybridization with a DNA chip was carried out using an Automated Slide Processor (trade name, manufactured by Amersham No. Science). Hybridization was carried out for 12 hours with the probe after pretreatment according to the protocol for Type 7 slides. Hvb ridiz for buffer at on Buffer Ver.
  • Rev-erbA has a high expression level in skeletal muscle. Therefore, for each of the treatment groups (1) to (3), the expression profile of the Rev-erbA ⁇ gene in the skeletal muscle of Zuckerfattyrat was examined by RT-PCR.
  • cDNA was prepared using RT-PCR Super Script (registered trademark) First—strand Synthesis System (trade name, manufactured by Invitrogen) according to the attached manual. Was synthesized.
  • a primer for real-time quantitative PCR was performed using the probe search software Primer Express (trade name, manufactured by ABI) based on the sequence of rat Rev-erbAa (GenBank accession number: M25804). I chose one. Primer requested synthesis from QIAGEN. Using this primer, real-time quantitative PCR using SYBR Green I was performed using the synthesized cDNA as type I, and the amount of mRNA was quantified.
  • reaction reagent using Qiagen brand name: Quantitect SYBR Green PCR kit, react for 15 minutes at 95, 30 seconds at 94, 30 seconds at 60, and 1 minute at 72 The reaction was performed for 40 cycles and quantified. The PCR and the fluorescence measurement were performed using ABI Company's ABI PR I SM 7000 Sequence Detection System (trade name). As a result, it was confirmed that when insulin resistance was improved by dietary restriction and exercise in diabetic rat skeletal muscle (Fig. 1) and adipose tissue (Fig. 2), the expression of Re-verbAa decreased. Was done. The graphs in FIG. 1 and FIG. 2 are shown as relative amounts, with the expression level in Zucker Lean rats as 1.
  • a primer for real-time quantitative PCR was designed and synthesized in the same manner as in Example 2.
  • real-time quantitative PCR using SYBR GreenI was performed using Human MTC Panel I (trade name, manufactured by Clontech) as a type II.
  • the reaction reagents and reaction conditions were the same as in Example 2, and after the reaction, it was confirmed by electrophoresis and a melting curve of the amplified product that only one target type was amplified.
  • GenBank accession number Based on the nucleotide sequence of X72631, PCR was performed on the full length human Rev_erbaA cDNA from Human Adipocyte Marathon-Ready cDNA (trade name, manufactured by Clonetech). And cloned into a PCR-B1untII-TOPO vector (trade name, Invitrogen).
  • the full-length cDNA was cut out with BamHI and XbaI, and the p3xFLAG-CMV-7.1 vector (trade name, manufactured by Sigma) was obtained.
  • the p3xFLAG-CMV-7.1 vector (trade name, manufactured by Sigma) was obtained.
  • an expression vector was obtained.
  • This expression vector was introduced into L6 cells to obtain cells that stably express Re-erb A ⁇ . Expression of human ReverbAa in cells into which the expression vector was introduced was detected by Western blotting using an anti-FLAG antibody (Fig. 4). After the whole cell extract was subjected to SDS-PAGE, it was transferred to Immonilon Transformer Membranes (trade name, manufactured by Millipore).
  • ⁇ -MEM For cell culture, ⁇ -MEM supplemented with 10% fetalbovineserum and lxAntiClOOxAntibiotic-Antimytic (trade name, manufactured by Invitrogen) was used as the medium, and 70-80% confluent was used. When the cells reached, the cells were collected using trypsin, diluted with 110-1Z20, and subcultured.
  • This reporter gene was introduced into L6 cells simultaneously with the ReV-erbAa expression vector shown in Example 4 above, and the transcriptional activity of the reporter gene was measured using the Pitka Gene Dual Sea Pansy Kit (manufactured by Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.). ) Was measured.
  • Fig. 6 shows the measurement results.
  • Example 2 suggested that it is possible to screen candidate compounds effective for the treatment or prevention of diabetes mellitus using the inhibition of the expression of ReV-erbAa as an index.
  • a reporter-assay system using the ReV-erbAa promoter was constructed. From the human genomic DNA, the promoter region of Rev-erbAa identified by Proc. Nat 1.Acad. Sci., 93, 3553-3558 (1996) (about 1. 7 kb) was PCR-cloned. The primers used are shown in SEQ ID NOs: 58 and 59.
  • the obtained fragment was inserted into the SmaI site of pGL3-Basicvecor [Promega (Promega)] to obtain a repo overnight gene.
  • This reporter gene was simultaneously introduced into L6 cells at the same time as the ReV—erbA expression vector—shown in Example 4 above, and the reporter activity was changed to a product name: Pitka Gene Du Luci Pansy Kit ( (Manufactured by Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.).
  • Rev-er bAa is known to bind to its own promoter region and suppress its transcription [Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3553-3558 (1996) )]. Therefore, the transcriptional activity of the reporter gene was also measured when dexamethasone [Endocri nology, 141, 3799-3806 (2000), which has the transcriptional repressing function of Rev-er bAa, was added to the medium at a concentration of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . did. Fig. 7 shows the measurement results.
  • a siRNA region for suppressing the expression of rat ReV-erbA ⁇ was selected.
  • Four oligonucleotides (SEQ ID NOs: 54 to 57) corresponding to the above regions were synthesized.
  • the synthesized oligonucleotides (pairs of SEQ ID NOS: 54 and 55, pairs of SEQ ID NOs: 56 and 57) were annealed, and the resulting double-stranded nucleic acid was trade name: pSi1encer 2. It was inserted into 1-U6 Hygrovector (Ambion) to obtain an expression vector.
  • the resulting expression vector was introduced into L6 cells to obtain cells that stably express siRNA against ReV-erbAo !.
  • the mRNA amount of Rev-erbA (3 ⁇ 4) was reduced to 1/3 as compared with the control cells.
  • the entire fragment of the promoter of RI140 shown in SEQ ID NO: 61 is inserted into the SmaI site of the product name: pGL3—Basicector (promega (Promega)) to obtain a plasmid.
  • the resulting plasmid is introduced into L6 cells, and Rev- is inhibited through the function inhibition of the promoter of a nuclear factor capable of functionally coupling the Reb family nuclear receptor and the RNA polymerase complex.
  • er bAo Obtain cells for use as a screening system for function inhibitors.
  • the obtained cells are cultured in a medium containing the test substance for a certain period of time, and the reporter activity is measured using a trade name: Pitka Gene Dual Sea Pansy Kit (manufactured by Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.).
  • the reporter activity is measured using a trade name: Pitka Gene Dual Sea Pansy Kit (manufactured by Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.).
  • the function inhibition of the promoter of a nuclear factor that can functionally couple the Rev-erb family nuclear receptor with the RNA polymerase complex is demonstrated. It is possible to screen candidate compounds for R e V-erb A function inhibitor through the mediated function.
  • SEQ ID NO: 10 shows the sequence of a forward primer for amplifying rat ReV-erb.
  • SEQ ID NO: 11 shows the sequence of a reverse primer for amplifying rat ReV—erb.
  • SEQ ID NO: 12 shows the sequence of forward primer for human ReV-erb amplification. Show.
  • SEQ ID NO: 13 shows the sequence of a reverse primer for amplifying human Rev-erb.
  • SEQ ID NO: 14 shows a sequence of a ReV—erb responsive element.
  • SEQ ID NO: 15 shows a sequence of a Rev-erb responsive element.
  • SEQ ID NO: 16 shows a sequence of a Rev-erb responsive element.
  • SEQ ID NO: 17 shows the sequence of PCR for-primed primer-11.
  • SEQ ID NO: 18 shows the sequence of PCR reverse primer 1.
  • SEQ ID NO: 19 shows the sequence of PCR for-primed primer-12.
  • SEQ ID NO: 20 shows the sequence of PCR reverse primer 2.
  • SEQ ID NO: 21 shows the sequence of PCR for primer 13.
  • SEQ ID NO: 22 shows the sequence of PCR reverse primer-13.
  • SEQ ID NO: 23 shows the sequence of PCR for primer 14.
  • SEQ ID NO: 24 shows the sequence of PCR River Primer 14
  • SEQ ID NO: 25 shows a sequence of PCR primer-doprimer-5.
  • SEQ ID NO: 26 shows the sequence of PCR reverse primer 5.
  • SEQ ID NO: 27 shows a sequence of PCR foreprimer-6.
  • SEQ ID NO: 28 shows the sequence of PCR River Primer 16.
  • SEQ ID NO: 29 shows a sequence of PCR for primer 17.
  • SEQ ID NO: 30 shows the sequence of PCR reverse primer 7.
  • SEQ ID NO: 31 shows the sequence of PCR for-primed primer-18.
  • SEQ ID NO: 32 shows the sequence of PCR reverse primer 8.
  • SEQ ID NO: 33 shows the sequence of PCR for primer 19.
  • SEQ ID NO: 34 shows the sequence of PCR reverse primer 9.
  • SEQ ID NO: 35 shows the sequence of PCR foreprimer-10.
  • SEQ ID NO: 36 shows a sequence of PCR reverse primer-10.
  • SEQ ID NO: 37 shows a sequence of RT-PCR positive primer 11.
  • SEQ ID NO: 38 shows a sequence of RT-PCR reverse primer-11.
  • SEQ ID NO: 39 shows the sequence of RT-PCR positive primer 12.
  • SEQ ID NO: 40 shows a sequence of RT-PCR reverse primer 12.
  • SEQ ID NO: 41 is a probe for detection of ReV-erb ⁇ (Bg1II—Bg
  • SEQ ID NO: 42 is a probe for detecting Rev-erbAa (XhoI-Sma
  • SEQ ID NO: 43 shows a sequence of a probe for detecting Rev-erbA ⁇ (EcoRI-stop codon region).
  • SEQ ID NO: 44 shows a sequence of a probe for detecting Rev-erbA ⁇ (783-position E_c_o_RI region).
  • SEQ ID NO: 45 shows a sequence of a probe for detecting ReV—erbaAa (full-length ⁇ RF).
  • SEQ ID NO: 46 shows a sequence of a probe (5 'non-coding region) for detection of Rev-erbA ⁇ .
  • SEQ ID NO: 47 shows the sequence of a probe for detecting ReV—erbAo; (start codon—EcoRI region).
  • SEQ ID NO: 48 shows a sequence of a probe for detecting Rev_erbA ⁇ (XhoI-SmaI region).
  • SEQ ID NO: 49 shows a sequence of a probe (PCR fragment) for detecting ReV—erbAa.
  • SEQ ID NO: 50 shows the sequence of a probe (PCR fragment) for detecting Rev_erb b ⁇ !.
  • SEQ ID NO: 51 shows a sequence of a probe (PCR fragment) for detecting ReV-erb ⁇ .
  • SEQ ID NO: 52 shows a sequence of a ReV-erbaAa binding sequence (forward).
  • SEQ ID NO: 53 shows a sequence of a ReV—erbAa binding sequence (reverse).
  • SEQ ID NO: 54 shows a sequence (forward) containing the siRNA target region.
  • SEQ ID NO: 55 shows a sequence (reverse) containing the siRNA target region.
  • SEQ ID NO: 56 shows a sequence (forward) containing the siRNA target region.
  • SEQ ID NO: 57 shows a sequence (reverse) containing the siRNA target region.
  • SEQ ID NO: 58 shows a sequence of a forward primer for amplifying promoter region.
  • SEQ ID NO: 59 shows a sequence of a reverse primer for amplifying one region of promoter.
  • diabetes specifically, type II diabetes, in particular, Rev-erb family nuclear receptor or a factor related thereto, such as Rev-erbA
  • Rev-erbA develops in connection with the function of A candidate compound for a therapeutic or prophylactic agent capable of exhibiting a therapeutic or preventive effect on diabetes based on the mechanism of action of the ReV-erb family nuclear receptor or a factor related thereto, for example, the function of Rev_erbAa.
  • the pharmacological evaluation of the therapeutic or prophylactic agent for the diabetes mellitus and the application to the means for treating or preventing diabetes are possible.

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Abstract

　糖尿病の治療、予防等への応用手段を提供すること。Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体等に基づく、糖尿病治療又は予防剤のスクリーニング方法及びそのキット、糖尿病に対する医薬組成物。

Description

明細書 糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 糖尿病の治療、 予防等のための手段に関する。 より詳しくは、 本発 明は、 糖尿病の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、 該スクリーニング方法 に用いるキット、 医薬組成物等に関する。 背景技術
糖尿病は、 多飲、 多尿、 体重減少等の症状、 慢性の高血糖を主徵とし、 一般的 に、 網膜症、 腎症、 末端神経障害等の合併症を伴う疾患である。 前記糖尿病は、 病因により、 原発性糖尿病 〔インスリン依存性糖尿病 （ I型糖尿病） 、 インスリ ン非依存性糖尿病 （ I I型糖尿病） 〕 、 二次性糖尿病 〔膝臓性糖尿病、 滕外性 Z 内分泌性糖尿病、 薬剤誘発性糖尿病〕 等に分類されている。 さらに、 前記糖尿病 は、 心筋梗塞、 脳梗塞等の動脈硬化性疾患の因子となることが知られている。 従来、 糖尿病の治療方法として、 例えば、 食事療法、 運動療法等による生活改 善をはじめ、 インスリン遺伝子、 インスリンレセプ夕一遺伝子、 ミトコンドリア D N A等における遺伝子異常に関連する糖代謝の制御； α—ダルコシダ一ゼ等の 糖吸収に関連する因子の機能の制御等を標的とする治療方法等が行なわれている。 しかしながら、 上述の糖尿病の治療方法を適用しても、 所望の効果が得られな い症例もある。
一方、 R e V— e r bファミリー核内受容体は、 ォーファン核内受容体の 1つ である 〔ミヤジマ（Miyaj ima, N. )ら、 セル（Ce l l) , 第 57 巻， 3卜 39 頁 （1989)
(図 1に記載） 、 ラザー（Lazar MA. ) ら、 ディーェヌエー セル バイオロジ — (DNA Ce l l B i o l. ) , 第 9巻， 77- 83頁 （1990) (図 1に記載） 、 及びァデルマ ント（Adelmant G)ら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 第 93 巻， 3553 - 3558 頁 (1996) (図 1に記載） 〕 。
前記 R e v— e r bフアミリー核内受容体のうち、 R e v— e r b A αは、 肥 満の治療用途の標的となる核ホルモン受容体であることが知られており、 かかる 治療用途の標的としての R e V— e r b A αの核ホルモン受容体機能のモジユレ 一夕一を同定するためのイン ' ビトロアツセィが報告されている 〔国際公開第 9 9 27365号パンフレット （表 1) を参照のこと〕 。
さらに、 前記 R e V - e r bフアミリーは、 アポリポタンパク質 C一 II I 遺 伝子の転写の負のレギユレ一夕一であること、 Re v— e r b A αを欠損させた マウスにおいては、 アポリポタンパク質 C—III の上昇及び血清トリグリセリド の上昇が見られること等が見出されており、 前記アポリポタンパク質 C一 III に関連する脂質代謝異常の治療に有用な物質のスクリーニングに用いられている 〔国際公開第 99/67637号パンフレツト （第 3頁下から 14〜16行、 第 24頁第 15行〜第 26頁第 12行、 図 1) 〕 。
また、 前記 R e v— e r bを活性化するリガンドをスクリーニングする方法が 報告されている 〔国際公開第 00/17334号パンフレット （請求項 3) を参 照のこと〕 。 発明の開示
本発明の 1つの側面は、 糖尿病、 具体的には、 I I型糖尿病、 特に、 Re v— e r bファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、 例えば、 Re v— e r b Aひの機能に関連して発症する糖尿病に対する治療剤又は予防剤をスクリーニン グすること；該 R e V— e r bファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、 例えば、 Re V— e r b A αの機能に対する作用機序に基づく治療剤又は予防剤 をスクリーニングすること；及び前記治療剤又は予防剤の候補化合物を薬理評価 すること、 簡便、 かつ迅速に、 糖尿病治療剤又は予防剤をスクリーニングするこ との少なくとも 1つを行ないうる、 糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方 法を提供することに関する。
さらに、 本発明の他の側面は、 前記スクリーニング方法を、 簡便に行なうこと、 迅速に行なうこと、 高処理量で行なうこと、 高い信頼性で行なうことの少なくと も 1つを達成しうる、 スクリーニング用キットを提供することにある。
また、 本発明のさらなる他の側面は、 R e V— e r bファミリ一核内受容体又 はそれに関連する因子、 例えば、 R e V— e r b A aの機能に対する作用機序に 基づく作用、 R e V— e r bファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、 例 えば、 R e v— e r b A aの機能に関連して発症する糖尿病に対する治療又は予 防作用を発揮する医薬組成物を提供することに関する。
さらに、 本発明の別の側面は、 糖尿病、 具体的には、 I I型糖尿病、 特に、 R e v _ e r bファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、 例えば、 R e v— e r b A o!の機能に関連して発症する糖尿病を、 簡便に診断すること、 迅速に診 断することの少なくとも 1つを行ないうる、 糖尿病の診断方法を提供することに 関する。
また、 本発明の他の側面は、 前記診断方法を、 簡便に行なうこと、 迅速に行な うこと、 高処理量で行なうことの少なくとも 1つを達成しうる診断用キットを提 供することに関する。
さらに、 本発明の他の側面は、 糖尿病、 具体的には、 I I型糖尿病、 特に、 R e V— e r bファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、 例えば、 R e v— e r b A αの機能に関連して発症する糖尿病に罹患している個体由来の試料を、 簡便に検出すること、 迅速に検出することの少なくとも 1つを達成しうる、 糖尿 病に罹患している個体由来の試料の検出方法を提供することに関する。
また、 本発明の他の側面は、 前記検出方法を、 簡便に行なうこと、 迅速に行な うこと、 高処理量で行なうことの少なくとも 1つを達成しうる検出用キットを提 供することに関する。 さらに、 本発明の他の側面は、 R e V— e r bファミリ一核内受容体又はそれ に関連する因子、 例えば、 Re V— e r bAaの機能に対する作用機序に基づく 作用、 Re V— e r bファミリ一核内受容体又はそれに関連する因子、 例えば、 Re v-e r b A αの機能に関連して発症する糖尿病の治療等への応用に有用な、 Re v-e r bファミリー核内受容体の発現抑制方法を提供することに関する。 即ち、 本発明は、
〔1〕 被検物質の存在下、 下記 （1) 〜 （5) ：
(1) Re v— e r bファミリ一核内受容体、
(2) R e V - e r bファミリ一核内受容体の応答性エレメント、
(3) Re v-e r bファミリー核内受容体と RN Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子、
(4) R e V— e r bファミリ一核内受容体のプロモータ一、 及び
(5) Re V— e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモー夕一
からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子の動態を測定又は検出して、 糖尿 病治療剤又は予防剤の候補化合物を得ることを特徴とする、 糖尿病治療剤又は予 防剤のスクリーニング方法、
〔 2〕 該糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物が、
(1) Re v— e r bファミリ一核内受容体、 又は
(3) Re v-e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子
の発現を抑制する化合物又はその塩である、 前記 〔1〕 記載の方法、
〔 3〕 該糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物が、
(1) Re v— e r bファミリ一核内受容体、
(2) R e V - e r bファミリ一核内受容体の応答性エレメント、 (3) Re v-e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子、
(4) R e V— e r bファミリー核内受容体のプロモーター、 及び
(5) Re v-e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子の機能を阻害する化合物又はその 塩である、 前記 〔1〕 記載の方法、
〔4〕 該 Re v— e r bが、 ヒト R e v— e r b A αである、 前記 〔1〕 記載 の方法、
〔5〕 ( I) 該因子と、 被検物質とを接触させるステップ、 及び
(II) 前記ステップ （ I ) の後、 該因子と被検物質との結合を検出し、 それに より、 該因子と結合する被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物とし て選択するステップ
を含む、 前記 〔1〕 記載の方法、
〔6〕 （a) I ) R e V— e r bファミリ一核内受容体に対する応答性エレメ ン卜と、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、 該応答性エレメントの下流及び支配下に、 該プロモーターと該レポ一夕 一遺伝子とが動作可能に連結し、 かつ該プロモーターの下流及び支配下に、 該レ ポー夕一遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物と、
II) 該 （1) の核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物と を、 細胞に導入して発現させるステップ、
(b) 前記ステップ （a) で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、 並びに
(c) 前記ステップ （b) で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の 有無を検出又は発現の変動を測定し、 それにより、 該レポ一夕一遺伝子の発現の 存在又は発現の増加をもたらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合 物として選択するステップ
を含む、 前記 〔1〕 記載の方法、
〔7〕 (A) 内在的に Re V— e r bファミリ一核内受容体を発現している細 胞と被検物質とを接触させるステップ、 及び
(B) 前記ステップ （A) で得られた細胞における該 R e v— e r bファミリ一 核内受容体の発現の変動を測定し、 それにより、 該核内受容体の発現の減少をも たらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステツ プ
を含む、 前記 〔1〕 記載の方法、
〔8〕 (Α' ) 内在的に R e V— e r bファミリー核内受容体と RNAポリメ ラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子を発現している細胞と被検物質 とを接触させるステップ、 及び
(Β' ) 前記ステップ （Α') で得られた細胞における該 R e V— e r bフアミ リー核内受容体と RN Aポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子 の発現の変動を検出し、 それにより、 該核内因子の発現の減少をもたらす被検物 質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、 前記 〔1〕 記載の方法、
〔9〕 （a) R e V— e r bファミリー核内受容体プロモーターと、 レポーター遺伝子と
を含み、 該プロモーターの下流及び支配下に、 該レポ一夕一遺伝子が動作可能に 連結したものである核酸構築物を、 細胞に導入して発現させるステップ、
(b) 前記ステップ （a) で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、 並びに
(c) 前記ステップ （b) で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の 有無を検出又は発現の変動を測定し、 それにより、 該レポーター遺伝子の発現の 存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合 物として選択するステップ
を含む、 前記 〔1〕 記載の方法、
〔1 0〕 （a' ) Re v— e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラーゼ 複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターと、
レポ一夕一遺伝子と
を含み、 該プロモーターの下流及び支配下に、 該レポ一夕一遺伝子が動作可能に 連結したものである核酸構築物を、 細胞に導入して発現させるステップ、 (b' ) 前記ステップ （a' ) で得られた細胞と被検物質とを接触させるステツ プ、 並びに
(c ' ) 前記ステップ （b' ) で得られた細胞における該レポ一ター遺伝子の発 現の有無を検出又は発現の変動を測定し、 それにより、 該レポ一夕一遺伝子の発 現の存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補 化合物として選択するステップ
を含む、 前記 〔1〕 記載の方法、
〔1 1〕 前記 〔5〕 記載の方法に用いるためのキットであり、 かつ下記 （1) 〜 （5) ：
(1) Re v— e r bファミリ一核内受容体、
(2) R e V— e r bファミリー核内受容体の応答性エレメント、
(3) Re v— e r bフアミリー核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子、
(4) R e V— e r bファミリー核内受容体のプロモータ一、 及び
(5) Re v— e r bフアミリー核内受容体と RN Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子を含有してなる、 該因子に結合す る化合物又はその塩のスクリーニング用キット、
〔12〕 前記 〔6〕 記載の方法に用いるためのキットであり、
I) Re v-e r bファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、 プ□モーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、 該応答性エレメントの下流及び支配下に、 該プロモー夕一と該レポ一夕 一遺伝子とが動作可能に連結し、 かつ該プロモーターの下流及び支配下に、 該レ ポー夕一遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物、 及び
ID Re v- e r bファミリ一核内受容体をコードする核酸を含有した発現用 核酸構築物
を含有してなる、 該因子の機能を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用 キット、
〔1 3〕 前記 〔7〕 又は 〔8〕 記載の方法に用いるためのキットであり、 (1) Re V— e r bファミリー核内受容体、 又は
(3) Re v-e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子に対する抗体又はその断片を含有してなる、 該因子 の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット、
〔14〕 前記 〔7〕 又は 〔8〕 記載の方法に用いるためのキットであり、
(1) R e V— e r bファミリ一核内受容体、 又は
(3) R e V - e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子
を内在的に発現している細胞を含有してなる、 該因子の発現を調節する化合物又 はその塩のスクリーニング用キット。
〔1 5〕 前記 〔9〕 又は 〔10〕 記載の方法のためのキットであり、
Re v— e r bフアミリー核内受容体プロモータ一、 又は R e v - e r bフアミ リー核内受容体と RN Aポリメラ一ゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子 のプロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、 該プロモーターの下流及び支配下に、 該レポーター遺伝子が動作可能に 連結したものである核酸構築物
を含有してなる、 該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用 キッ卜、
〔16〕 I) (1) Re V— e r bファミリ一核内受容体、 若しくは
(3) R e V - e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子
の発現を抑制する化合物又はその塩、 あるいは
II) (1) Re V— e r bファミリー核内受容体、
(2) Re v— e r bフアミリー核内受容体の応答性エレメント、
(3) R e V - e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子、
(4) R e V— e r bファミリ一核内受容体のプロモータ一、 及び
(5) R e V - e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子の機能を阻害する化合物又はその を有効成分として含有してなる、 糖尿病の治療又は予防に用いる医薬組成物、 〔17〕 該化合物が、 s i RNA又は該 s i RNAを発現するベクターである、 前記 〔16〕 記載の医薬組成物、
〔18〕 該 s i RNAが、 配列番号： 54〜 57のいずれかに示される塩基配 列に対応する核酸である、 前記 〔17〕 記載の医薬組成物、
〔19〕 被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれ における R e V - e r bファミリー核受容体遺伝子の発現レベルを測定するステ ップを含み、 ここで、 被検試料における発現レベルが、 対照試料における発現レ ベルよりも高くなる場合、 該被検対象の個体が、 糖尿病に罹患している疑いがあ ることの指標となる、 糖尿病の診断方法、
〔20〕 発現レベルが、 R e V— e r bファミリ一核受容体遺伝子の mRNA 転写物の量を指標として測定される、 前記 〔19〕 記載の方法、
〔2 1〕 発現レベルが、 Re v— e r bファミリ一核受容体遺伝子産物の量を 指標として測定される、 前記 〔20〕 記載の方法、
〔22〕 配列番号： 1、 3、 4、 6及び 8からなる群より選ばれた配列を検出 しうる核酸を含有してなる、 前記 〔19〕 又は 〔20〕 記載の方法を行なうため の診断用キット、
〔23〕 Re v— e r bファミリ一核受容体に対する抗体又はその断片を含有 してなる、 前記 〔19〕 又は 〔21〕 記載の方法を行なうための診断用キット、
〔24〕 被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれ における R e V - e r bファミリー核受容体遺伝子の発現レベルを測定するステ ップを含み、 ここで、 被検試料における発現レベルが、 対照試料における発現レ ベルよりも高くなる場合、 該被検試料が、 糖尿病に罹患している疑いがある個体 由来の試料であることの指標となる、 糖尿病に罹患している疑いがある個体由来 の試料の検出又は選別方法、
〔25〕 発現レベルが、 Re v— e r bファミリ一核受容体遺伝子の mRNA 転写物の量を指標として測定される、 前記 〔24〕 記載の方法、
〔26〕 発現レベルが、 R e V— e r bファミリー核受容体遺伝子産物の量を 指標として測定される、 前記 〔24〕 記載の方法、
〔27〕 配列番号： 1、 3、 4、 6及び 8からなる群より選ばれた配列を検出 しうる核酸を含有してなる、 前記 〔24〕 又は 〔25〕 記載の方法を行なうため の検出用キット、 並びに
〔28〕 Re v— e r bファミリ一核受容体に対する抗体又はその断片を含有 してなる、 前記 〔24〕 又は 〔26〕 記載の方法を行なうための検出用キット、 に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ピオダリ夕ゾン投与群、 食餌制限群及び食餌制限 +運動負荷群それ ぞれの Z u c k e r f a t t y r a t骨格筋における R e v— e r b Aひ遺 伝子の発現解析結果を示す図である。
第 2図は、 ピオグリタゾン投与群、 食餌制限群及び食餌制限 +運動負荷群それ ぞれの Z ti c k e r f a t t y r a t脂肪組織における R e v- e r b A 遺伝子の発現解析結果を示す図である。
第 3図は、 ヒト組織における R e V— e r b A α遺伝子の発現解析結果を示す 図である。
第 4図は、 ヒト R e V— e r b A α強制発現細胞のウエスタンブロットの結果 を示す図である。
第 5図は、 Re V— e r b A α強制発現細胞でのグルコース取り込み能の解析 結果を示す図である。
第 6図は、 Re V— e r b A K結合配列を用いた場合のレポーター遺伝子の発 現を調べた結果を示す図である。
第 7図は、 R e V— e r b A aプロモータ一を用いた場合のレポ一ター遺伝子 の発現を調べた結果を示す図である。
第 8図は、 s i RNA発現細胞における R e v— e r b A αの発現量を調べた 結果を示す図である。
第 9図は、 Re V— e r b A a発現抑制細胞でのグルコース取り込み能の解析 結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 本発明は、 インスリン抵抗性モデルラット （Zu c k e r f a t t y r a t) に対して、 食餌制限を適用すること、 又は食餌制限と運動負荷との組み合わ せを適用することにより、 該ラットにおけるィンスリン抵抗性を改善させた場合、 改善前よりも、 R e v_ e r bAaの発現が、 減少し、 さらに、 培養細胞におい て該 R e V - e r b A αを強制発現させることにより、 グルコース取り込み能が 低下するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
以下に、 Re V — e r bAaポリヌクレオチドの調製、 Re v— e r bAaポ リペプチドの調製、 組換えベクター、 形質転換体、 該組換えベクター又は形質転 換体の製造方法、 抗体、 該ポリペプチドの定量方法又は免疫学的検出方法、 mR NAの定量方法、 mRNAの翻訳抑制方法、 結合物質、 結合物質スクリーニング 方法、 転写制御活性調節物質、 転写制御活性調節物質スクリーニング方法、 発現 調節物質、 発現調節物質スクリーニング方法、 スクリーニング用キット、 糖尿病 の検出方法、 遺伝子検出用キット、 医薬組成物等について説明する。 本明細書に おいて、 特に指示のない限り、 当該分野で公知である遺伝子組換え技術、 動物細 胞での組換えタンパク質の生産技術、 発現タンパク質の分離精製法、 分析法及び 免疫学的手法が採用される。
本発明の糖尿病の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法は、 かかる本発明者 らの知見に基づくものであり、 具体的には、 被検物質の存在下、 下記 （1) 〜 (5) ：
(1) Re v— e r bファミリ一核内受容体、
(2) Re v— e r bフアミリー核内受容体の応答性エレメント、
(3) R e V - e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子、
(4) R e V— e r bファミリ一核内受容体のプロモーター、 及び
(5) R e V - e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモーター からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子の動態を測定又は検出することを 1つの特徵とする。
本発明のスクリーニング方法によれば、 前記 （1 ) 〜 （5 ) の少なくとも 1つ の因子の動態を指標として、 被検物質による該因子を介した糖尿病に対する作用 を評価することにより、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物のスクリ一二ング を行なう。
したがって、 本発明のスクリーニング方法によれば、 R e v— e r bファミリ —核内受容体 〔前記 （1 ) 等〕 又はそれに関連する因子 〔前記 （2 ) 〜 （5 ) 等〕 の機能に関連して発症する糖尿病に有効な糖尿病治療剤又は予防剤の候補化 合物をスクリーニングすることができる。 すなわち、 本発明のスクリーニング方 法によれば、 ペルォキシソーム増殖薬活性化受容体 （P P A R) を活性化させる ことにより、 インスリン抵抗性改善を図るチアゾリジンジオン化合物とは異なる 作用機序に基づく糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングできる。 また、 本発明のスクリーニング方法によれば、 前記機能に対する作用機序に基 づく治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
さらに、 本発明のかかるスクリーニング方法によれば、 前記作用機序に基づく 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物を、 簡便、 かつ迅速にスクリーニングする ことができる。
なお、 本発明のスクリーニング方法は、 R e V— e r bファミリー核内受容体 又はそれに関連する因子の機能に関連して発症する糖尿病に対する治療剤又は予 防剤の候補化合物の薬理評価に用いることができる。
前記被検物質としては、 化合物又はその塩が挙げられる。 なお、 本明細書にお いては、 前記化合物又はその塩は、 低分子化合物、 高分子化合物、 ポリペプチド 又はその誘導体、 核酸又はその誘導体等を含む。 かかる被検物質は、 天然物質で あってもよく、 非天然物質であってもよい。 ポリペプチドの誘導体としては、 修 飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、 ァミノ酸残基を改変することにより 得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。 また、 核酸の誘導体としては、 修飾基を付加して得られた修飾核酸、 塩基を改変することにより得られたバリァ ント核酸、 ペプチド核酸等が挙げられる。 なお、 本明細書において、 前記核酸又 はその誘導体には、 リポザィム、 アンチセンス核酸 （例えば、 アンチセンス DN A等） 、 RNA iを誘発しうる s i RNA等も含まれる。
前記 「因子の機能」 としては、 甲状腺 ステロイドホルモン受容体スーパーフ アミリー 〔例えば、 甲状腺ホルモン （T3) 受容体等〕 、 高密度リポタンパク質 代謝タンパク質 （例えば、 アポタンパク質 A— I、 アポタンパク質 A— I I等） 、 トリグリセリド関連タンパク質 （例えば、 アポタンパク質 C_ I I I、 リポプロ ティンリパーゼ等） 、 既日リズム制御因子 （例えば、 Bma 1 1等） 及び R e v —e r bAa自体それぞれの遺伝子の転写抑制及びタンパク質 C— I I Iの発現 抑制等が挙げられる。
前記機能は、 例えば、 甲状腺ノステロイドホルモン受容体スーパ一ファミリー 〔例えば、 甲状腺ホルモン （T3) 受容体等〕 、 高密度リポタンパク質代謝タン パク質 （例えば、 アポタンパク質 A_ I、 アポタンパク質 A— I I等） 、 トリグ リセリド関連タンパク質 （例えば、 アポタンパク質 C— I I I、 リポプロテイン リパーゼ等） 、 既日リズム制御因子 （例えば、 Bma 1 1等） 及び Re v— e r b Ααそれぞれの mRNA及びタンパク質の発現量を P CR、 ノーザンブロッテ イング、 ドットブロッテイング、 ウェスタンブロッテイング、 ィムノアツセィ等 の測定法により測定することにより調べられうる。 また、 前記機能は、 Re v— e r bと Re v— e r b応答性エレメントとの結合活性や転写制御活性を測定す ること等によっても調べられうる。
本明細書において、 「R e V— e r bファミリー核内受容体」 とは、 Re v— e r bフアミリーに属する核内受容体を意味する。 かかる 「Re v— e r bファ ミリ一核内受容体」 としては、 甲状腺 ステロイドホルモン受容体スーパーファ ミリ一 〔例えば、 甲状腺ホルモン （T3) 受容体等〕 、 高密度リブタンパク質代 謝タンパク質 〔例えば、 アポタンパク質 A— I、 アポタンパク質 A— I I等〕 、 トリグリセリド関連タンパク質 （例えば、 アポタンパク質 C一 I I I、 リポプロ ティンリパーゼ等） 、 既日リズム制御因子 （例えば、 Bma 1 1等） 及び R e v 一 e r bAa自体それぞれの遺伝子の転写制御及びタンパク質 C一 I I Iの発現 制御の機能を有するものであればよく、 例えば、 Re v— e r b、 R〇R等が挙 げられる。 より具体的には、 前記 「Re V— e r bファミリ一核内受容体」 とし ては、 例えば、 Re v— e r bAひ、 Re v— e r bA/3、 R〇Ra、 R〇R)3、 RORァ等が挙げられる。 なお、 前記 「Re V— e r bファミリー核内受容体」 は、 天然由来のアミノ酸配列を有する因子であってもよく、 前記機能を有するバ リアン卜であってもよい。
前記 Re V— e r bAaは、 骨格筋、 褐色脂肪、 肝臓、 心臓、 脳、 腎臓におい て発現が見られ、 骨格筋 >褐色脂肪 >肝臓、 心臓、 脳、 腎臓の発現パターンを示 すという特徴を有する。 また、 前記 R e V— e r b Ααは、 例えば、 ヒト由来の R e V— e r b A αの場合、 トランスァクチべーシヨンに関与するドメイン、 D Ν Α結合ドメイン、 二量体形成に関与するドメイン、 転写抑制に関与するドメイ ン、 ホルモン （リガンド） 結合ドメイン等を有する核内受容体の構造的特徴があ る。
前記 「Re V— e r bファミリ一核内受容体の応答性エレメント」 としては、 R e V - e r bファミリー核内受容体の結合する核酸配列を有するエレメントで あればよく、 例えば、 Re V— e r b応答性エレメント 〔WAWNTAGGTC A (W=A又は T) 、 配列番号： 14〕 等が挙げられる。
前記 「R e v_ e r bファミリー核内受容体と RNAポリメラ一ゼ複合体とを 機能的に共役させうる核内因子」 とは、 Re v_e r bファミリー核内受容体の パートナーであり、 Re V— e r bファミリー核内受容体とヘテロ多量体を構成 しうる核内因子をいう。 前記 「R e V— e r bファミリー核内受容体と RNAポ リメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子」 は、 Re v— e r bファ ミリ一核内受容体と協調して、 甲状腺/ステロイドホルモン受容体スーパ一ファ ミリ一 〔例えば、 甲状腺ホルモン （T3) 受容体等〕 、 高密度リブタンパク質代 謝タンパク質 （例えば、 アポタンパク質 A— I、 アポタンパク質 A— I I等） 、 トリグリセリド関連タンパク質 （例えば、 アポタンパク質 C_ I I I、 リポプロ ティンリパーゼ等） 、 既日リズム制御因子 （例えば、 Bma 1 1等） 及び R e v — e r bAa自体それぞれの遺伝子の転写制御及びタンパク質 C一 I I Iの発現 制御の機能を有するものであればよい。 ここで、 前記 「Re v— e r bファミリ —核内受容体と RN Aポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子」 は、 天然由来のアミノ酸配列を有する因子であってもよく、 前記機能を有するバ リアントであってもよい。 前記 「Re V— e r bフアミリー核内受容体と RN A ポリメラ一ゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子」 としては、 具体的には、 特に限定されないが、 例えば、 N— CoRZR I P 13、 SUN— CoR、 S i n 3、 SMRT、 R I P 140等が挙げられる。
前記 Re v- e r bファミリ一核内受容体のプロモーターとしては、 例えば、 配列番号： 60に示される塩基配列を有する核酸等が挙げられる。
なお、 本発明においては、 前記 Re v— e r bファミリ一核内受容体のプロモ 一夕一は、 Re v— e r bフアミリー核内受容体におけるプロモータ一としての 機能を発揮する塩基配列を有するものであればよい。
したがって、 前記 R e V— e r bファミリー核内受容体のプロモー夕一は、 例 えば、
- 前記配列番号： 60に示される塩基配列中のプロモーター機能の発現とは無 関係である領域において、 少なくとも 1塩基の変異を有する配列を有し、 かつ R e V - e r bファミリー核内受容体におけるプロモーターとしての機能を発揮す る核酸；
一 前記配列番号： 60に示される塩基配列において、 プロモーター機能の発現 とは無関係である領域の配列とそれに対応する配列との配列同一性が、 少なくと も 60%、 好ましくは、 80%以上、 より好ましくは、 90%以上であり、 かつ Re V— e r bファミリ一核内受容体におけるプロモーターとしての機能を発揮 する核酸
等が挙げられる。
前記 Re V - e r bファミリー核内受容体におけるプロモーターとしての機能 は、 例えば、
- R e V— e r bファミリ一核内受容体をコードする核酸 （野生型） における プロモー夕—部分を、 評価対象の核酸と置換し、
一 得られた核酸を、 適切な宿主 〔例えば、 ラット由来細胞株 L 6 (骨格筋由来 筋芽細胞） 、 マウス由来細胞株 3T3L 1 (脂肪細胞） 、 マウス由来細胞株 C 2 C 12 (筋芽細胞） 等〕 に導入し、
- Re v— e r bファミリー核内受容体又は対応する mR N Aを検出する ことにより、 該 Re V— e r bファミリー核内受容体又は対応する mR N Aが、 発現すること、 好ましくは、 野生型の場合と同程度若しくはそれ以上の程度で発 現することを、 該評価対象の核酸が、 Re v— e r bファミリ一核内受容体にお けるプロモーターとしての機能としての機能を発揮することの指標として評価さ れうる。
R e V - e r bファミリー核内受容体と RN Aポリメラーゼ複合体とを機能的 に共役させうる核内因子のプロモー夕一としては、 前記 （3) の核内因子のプロ モーターが挙げられ、 具体的には、 例えば、 R I P 140のプロモーター （配列 番号： 61) 等が挙げられる。
なお、 本発明においては、 前記 Re v— e r bファミリ一核内受容体と RNA ポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターは、 該核 内因子におけるプロモー夕一としての機能を発揮する塩基配列を有するものであ ればよい。
したがって、 前記 R e V - e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラーゼ 複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターは、 例えば、
一 前記配列番号： 61に示される塩基配列中のプロモーター機能の発現とは無 関係である領域において、 少なくとも 1塩基の変異を有する配列を有し、 かつ当 該核内因子におけるプロモータ一としての機能を発揮する核酸；
- 前記配列番号： 61に示される塩基配列において、 プロモーター機能の発現 とは無関係である領域の配列とそれに対応する配列との配列同一性が、 少なくと も 60%、 好ましくは、 80%以上、 より好ましくは、 90%以上であり、 かつ 当該核内因子におけるプロモータ一としての機能を発揮する核酸
等が挙げられる。
前記 Re v— e r bファミリ一核内受容体と RNAポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモータ一としての機能は、 前記 Re V— e r bファミリ一核内受容体におけるプロモーターとしての機能の評価と同様に、 例 えば、
- Re v-e r bファミリー核内受容体と RNAポリメラーゼ複合体とを機能 的に共役させうる核内因子をコードする核酸 （野生型） におけるプロモータ一部 分を、 評価対象の核酸と置換し、
- 得られた核酸を、 前記と同様の適切な宿主に導入し、
- Re v-e r bファミリー核内受容体と RNAポリメラ一ゼ複合体とを機能 的に共役させうる核内因子又は対応する mRN Aを検出する
ことにより、 該核内因子又は対応する mRN Aが、 発現すること、 好ましくは、 野生型の場合と同程度若しくはそれ以上の程度で発現することを、 該評価対象の 核酸が、 該核内因子におけるプロモー夕一としての機能としての機能を発揮する ことの指標として評価されうる。
本発明においては、 R e v_ e r b A aの機能を阻害若しくは発現を抑制する 観点から、 前記因子のなかでは、 好ましくは、 R e V— e r bファミリ一核受容 体、 R e V— e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを機能 的に共役させうる核内因子が望ましい。 具体的には、 ヒトの糖尿病に対してより 有効な治療剤又は予防剤の候補化合物を得る観点及びィンスリン抵抗性を改善す る観点から、 前記 R e V - e r bファミリー核受容体、 特に、 Re v— e r bの なかでは、 好ましくは、 ヒト Re v— e r bAaであり、 Re v— e r bフアミ リー核内受容体と RN Aポリメラ一ゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子 のなかでは、 好ましくは、 ヒト N— CoR、 ヒト Sun— CoRであることが望 ましい。
前記ヒト R e V— e r b Ααは、 ジーンバンク （Ge nB ank) ァクセッシ ヨン番号： X 7263 1に、 その塩基配列 （配列番号： 1) 及びアミノ酸配列 (配列番号： 2) が開示されている。
本発明のスクリーニング方法において、 測定又は検出対象の 「因子の動態」 は、 前記 （1) 〜 （5) の因子全てによる協調的な動態であってもよく、 前記 （1) 〜 （5) の因子から任意に選ばれた 2種の因子の組み合わせによる協調的な動態 であってもよく、 前記 （1) 〜 （5) の因子それぞれ単独による動態であっても よい。
本発明のスクリーニング方法において、 測定又は検出対象の 「因子の動態」 と しては、 例えば、 Re V— e r bファミリ一核内受容体の発現、 具体的には、 該 発現レベルの変動；該 R e V— e r bファミリ一核内受容体とそのリガンドとの 結合の有無；該 Re v— e r bファミリ一核内受容体と該核内受容体が特異的に 結合する核酸との結合の有無； Re V— e r bファミリー核内受容体のプロモー 夕一の機能の発現の有無等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法としては、 測定又は検出対象の 「因子の動態」 に 応じて、 大きく 4つの実施態様がある。
本発明のスクリーニング方法の第 1の実施態様としては、 （ I) 前記因子と、 被検物質とを接触させるステップ、 及び
(II) 前記ステップ （ I ) の後、 該因子と被検物質との結合を検出し、 それに より、 該因子と結合する被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物とし て選択するステップを含む方法が挙げられる。 かかる方法によれば、 前記因子へ の結合を介して当該因子の機能に作用する物質を選択することができるため、 選 択された候補化合物は、 直接的に前記因子に結合してその機能を調節するという 特徴的な性質を有する。 したがって、 選択された候補化合物は、 前記因子に直接 的かつ特異的に作用させることができるという優れた効果を発揮する。
前記ステップ （I) において、 前記因子と被検物質との接触は、 該因子の本来 の機能を妨げない溶液中において、 前記因子と被検物質とを混合し、 適切な反応 条件、 例えば、 反応温度、 反応時間等の下、 維持することにより行なわれうる。 前記 「因子の本来の機能を妨げない溶液」 としては、 例えば、 リン酸緩衝化生 理的食塩水 （PBS) 、 HE PESバッファ一、 T r i sバッファ一等が挙げら れる。
また、 ステップ （I) における反応条件としては、 特に限定されないが、 例え ば、 PBS、 HEPESバッファ一、 T r i sバッファー等の溶液中、 pH6. 0〜10. 0、 好ましくは、 pH7. 0〜9. 0、 より好ましくは、 pH7. 5 〜8. 5、 さらに好ましくは、 pH8. 0で、 I O から 50で、 好ましくは 2 0 ：〜 40 :、 より好ましくは、 25で〜 37 、 さらに好ましくは、 25で、 1分〜 1時間、 好ましくは、 3分〜 30分、 より好ましくは 5分〜 20分、 さら に好ましくは、 10分維持すること、 又は 0t：〜 20 ：、 好ましくは、 2 〜 1 0t：、 より好ましくは、 3 ：〜 8で、 さらに好ましくは、 4 で、 20分〜 24 時間、 好ましくは、 30分〜 12時間、 より好ましくは、 40分〜 2時間、 さら に好ましくは、 1時間維持すること等が挙げられる。 より具体的には、 10mM He p e s、 80 mM KC 1、 5 % グリセロール、 10mM DTT、 0. 1 m g / 1 p o l yd I dC、 50 n g /m 1 h e r r i n g s p e r m DNA、 lmg/m l BSA、 10% r e t i c u l o c y t e 1 y s a t e中、 前記条件下に維持することが挙げられる。 ついで、 ステップ （I I ) において、 前記ステップ （ I ) で得られた産物につ いて、 前記因子と被検物質との結合の有無を調べる。
前記因子と被検物質との結合の検出は、 例えば、 表面プラズモン解析、 被検物 質を保持した担体へのバインディングアツセィ等により行なわれうる。
表面プラズモン解析により、 前記因子と、 被検物質との間の結合を測定する場 合、 例えば、 下記ステップ：
一 前記因子を固定化したセンサーチップと、 被検物質を含有した溶液を一定の 流速で送液するステップ、 及び
- 適切な検出手段 〔例えば、 光学的検出 （蛍光度、 蛍光偏向度等） 、 質量分析 計との組み合わせ （マトリックス支援レーザー脱離イオン化一飛行時間型質量分 析計： MA L D I - T O F M S、 エレクトロスプレ Tオン化質量分析計：
E S I— M S等） 〕 により、 光学的変動又は質量の変動として、 前記因子と、 被 検物質との相互作用を検出するステップ；
を含む方法を行なうことにより、 該結合を測定することができる。 なお、 表面プ ラズモン解析を用いた測定方法においては、 前記因子と、 被検物質との間の結合 は、 例えば、 光学的センサーグラム又は質量センサーグラムが、 送液による被検 物質の導入により変動した場合、 当該被検物質が、 糖尿病治療剤又は予防剤の候 補化合物として選択されうる。
本発明のスクリーニング方法の第 2の実施態様としては、 （a ) I ) R e v— e r bファミリ一核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、 該応答性エレメントの下流及び支配下に、 該プロモータ一と該レポ一夕 —遺伝子とが動作可能に連結し、 かつ該プロモーターの下流及び支配下に、 該レ ポー夕一遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物と、
I I ) 前記 （1 ) の核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物と を、 細胞に導入して発現させるステップ、
(b) 前記ステップ （a) で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、 並びに
(c) 前記ステップ （b) で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の 有無を検出又は発現の変動を測定し、 それにより、 該レポーター遺伝子の発現の 存在又は発現の増加をもたらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合 物として選択するステップ、
を含む方法が挙げられる。 かかる方法によれば、 前記 （1) の核内受容体と該核 内受容体に対する応答性エレメントとの相互作用による該応答性エレメントの下 流のレポ一夕一遺伝子の発現の有無を指標として、 候補化合物を選択する。 した がって、 選択された候補化合物は、 前記 （1) の核内受容体に対する阻害能、 特 に、 前記 （1) の核内受容体の転写抑制能に対する阻害能を有するという特徴的 な性質を有し、 前記 （1) の核内受容体の転写制御能、 あるいは DNA結合活性 に対する阻害能が細胞レベルで機能するという優れた効果を発揮する。
なお、 本明細書において、 「動作可能」 とは、 プロモーターの機能、 該プロモ 一夕一制御下での下流遺伝子若しくは各種因子の機能発現等を包含する概念を意 図する。
前記ステップ （a) に用いられる I) の核酸構築物は、 Re v_e r bフアミ リー核内受容体に対する応答性エレメントと、 プロモーターと、 レポーター遺伝 子とを含む構築物である。
前記 Re V - e r bファミリー核内受容体に対する応答性エレメントとは、 R e v-e r bファミリー核内受容体が結合することにより作用する塩基配列から なる核酸をいい、 例えば、 Re V— e r bファミリ一核内受容体をコードする核 酸中に局在する Re v-e r bファミリ一核内受容体自身による標的配列からな る核酸、 前記標的配列からなる核酸のアンチセンス鎖にストリンジェントな条件 下にハイブリダィズし、 かつ R e V— e r bファミリ一核内受容体に結合及びノ 又は応答しうる配列からなる核酸分子；前記標的配列からなる核酸の塩基配列に おいて、 少なくとも 1塩基の変異を有し、 かつ R e V— e r bファミリー核内受 容体に結合及び/又は応答しうる配列からなる核酸分子；前記標的配列からなる 核酸の塩基配列と少なくとも 60 %、 好ましくは、 80%以上、 より好ましくは、 90 %以上の配列同一性を有し、 かつ Re V - e r bファミリー核内受容体に結 合及び Z又は応答しうる配列からなる核酸分子等も含まれる。
前記 Re v-e r bファミリー核内受容体に対する応答性エレメントとしては、 具体的には、 配列番号： 14、 1 5、 1 6等が挙げられる。
前記プロモー夕一としては、 核酸構築物を導入するために用いられる細胞によ り適宜選択されうるが、 宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい 。 プロモーターとしては、 例えば、 t r pプロモ一夕一 （Plrp) 、 1 a cプロモ —夕— （PiJ 、 PLプロモーター、 PRプロモーター、 P S Eプロモーター等 の大腸菌やファージに由来するプロモー夕一、 S PO lプロモーター、 S P02 プロモ一夕一、 p e nPプロモ一夕一、 ヒトサイトメガロウィルス （hCMV) (D I E ( I mme d i a t e— e a r l y) 遺伝子のプロモータ一、 S V40の 初期プロモーター、 モロニ一 'ミュリン 'ロイケミア 'ウィルス （Mo l o n e y Mu r i n e L e u 1 e m i a V i r u s) のロンク '夕ーミナレ · リ ピー卜 .フロモーター (； L o n g Te rm i n a l Re p e a t P r om o t e r) 、 レトロウイルスのプロモ一夕一、 HS Pプロモーター、 SRaプロ モーター及びメタ口チォネインのプロモータ一等が挙げられる。 また、 P t r p を 2つ直列させた P t r p X 2プロモ一夕一、 t a cプロモータ一、 l a c T7 プロモーター、 1 e tプロモー夕一のように人為的に設計改変されたプロモー夕 一、 等が挙げられる。 前記プロモーターは、 前記応答性エレメントの下流及び支 配下に動作可能に連結される。
前記レポーター遺伝子としては、 その産物の発現が検出可能である遺伝子であ ればよく、 核酸構築物を導入するために用いられる細胞により適宜選択されうる が、 例えば、 ルシフェラ一ゼ遺伝子、 0—ガラクトシダ一ゼ遺伝子、 クロラムフ ェニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、 アルカリフォスファタ一ゼ遺伝 子、 B i o t i n遺伝子、 蛍光タンパク質等が挙げられる。 前記レポ一夕一遺伝 子は、 前記プロモーターの下流及び支配下に動作可能に連結される。 なお、 前記 プロモ一夕一は、 前記レポ一夕一遺伝子本来のプロモ一夕一であってもよい。 前記 I) の核酸構築物は、 慣用の細胞導入用担体、 例えば、 ウィルスベクター、 プラスミドベクター、 金属微粒子等に担持させてもよい。 前記ウィルスベクター としては、 レトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一等が挙げられる。 前記プラスミドベクターとしては、 p cDNA l. 1、 p cDNA l. 1ノ Am p、 pCDM8、 pREP (インビトロジェン社製） 、 pHM6、 pHB 6 (口 シュダイァグノスティックス社製） 、 pKK223— 3、 pGEX (アマシャム バイオテク社製） 、 pET— 3、 p ET— 1 1、 pB l u e s c r i p t l l SK (十） 、 pB l u e s c r i p t l l (登録商標） SK (-) (ストラタ ジーン社製） 、 pUC 19、 pT r xFu s (インビトロジェン社製） 、 pUC 1 18、 p STV28 (夕カラバイオ社製） 、 pMAL— c 2X (ニュ Γング ランドバイオラボ社製） 、 pAGE 107 CCy t o t e c hn o l ogy, 3
(2) , 1 33 - 140 ( 1990) ；特開平 3— 22979号公報〕 、 p AG E 103 [Th e J ou r n a l o f B i o c h em i s t r y, 101
(5) ， 1 307 - 1 3 1 0 (1 987) 〕 、 pAMo、 p AMo A [Th e J o u r n a l o f B i o 1 o g y c a 1 Ch em i s t r y, 268
(30) ， 22782-22787 (1993) 〕 、 pAMoPRSA (特開平 5- 336963号公報） 、 p A S 3 _ 3 (特開平 2— 227075号公報） 等 が挙げられる。
前記 I I) の発現用核酸構築物は、 前記 （1) の核内受容体をコードする核酸 を含有する。
前記 （1) の核内受容体をコードする核酸としては、 具体的には、 例えば、 i ) 配列番号： 2のアミノ酸配列をコードする核酸、
ii) 前記 i ) の核酸のアンチセンス鎖に、 ストリンジェントな条件下にハイブ リダィズし、 かつコードされたポリペプチドが、 特定のクロマチン配列に結合し、 標的遺伝子の転写開始効率を正負に調節する機能を発揮するものである核酸、 iii)配列番号： 2のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、 少なくとも 1塩基の変異を有し、 かつコードされたポリペプチドが、 特定のクロマチン配列 に結合し、 標的遺伝子の転写開始効率を正負に調節する機能を発揮するものであ る核酸、
iv) 配列番号： 2のアミノ酸配列をコードする塩基配列と少なくとも 70 %、 好ましくは、 80%以上、 より好ましくは、 90 %以上の配列同一性を有し、 か つコードされたポリペプチドが、 特定のクロマチン配列に結合し、 標的遺伝子の 転写開始効率を正負に調節する機能を発揮するものである核酸、
等が挙げられる。 ここで、 前記機能は、 前述の機能の評価方法により評価されう る。
前記 I) の核酸構築物と、 前記 I I) の発現用核酸構築物とは、 好ましくは、 細胞内で互いに共存できるもの （和合性を有するもの） であることが望ましい。 前記 I ) の核酸構築物は R e V— e r bファミリー核内受容体の応答性エレメ ントを慣用のレポ一タープラスミドのクローニング部位に挿入することにより構 築されうる。 レポ一タープラスミドとしては前記レポ一夕一遺伝子の発現、 及び 検出ができるベクターであればいずれでもよく、 そのようなベクタ一として、 p GL 3、 pRL、 PCAT3 (プロメガ社製） 、 pEGFP、 pECFP、 pE YFP、 pD s Re d、 p SEAP、 p j3 g a 1 (クロンテック社製） 、 PGV 一 CS, PGV— B、 PGV - P、 PGV— C 2、 PGV— P 2、 P GV-B 2 (東洋インキ社製） 等が挙げられる。
前記 I I) の発現核酸構築物は、 前記 （1) の核内受容体をコードする核酸を 発現可能な慣用の発現べクタ一、 例えば、 ウィルスベクター、 プラスミドベクタ —等におけるクローニング部位に挿入することにより構築されうる。 前記 （1) の核内受容体をコードする核酸の発現に適した発現べクタ一としては、 該 c DN Aを組み込んで適切な宿主細胞、 例えば、 動物細胞で発現できるベクターであれ ばいずれでもよく、 そのようなベクターとしては、 pCR— B l un t I I -T OPO、 p cDNA l. 1、 p c DNA 1. 1 /Amp, p CDM 8 , pREP (インビトロジェン社製） 、 pHM6、 pHB 6 (ロシュダイァグノスティック ス社製） 、 PKK223— 3、 pGEX (アマシャムバイオテク社製） 、 pET 一 3、 pET— 1 1、 pB l u e s c r i p t l l (登録商標） SK ( + ) 、 pB l u e s c r i p t l l (登録商標） SK (—） （ストラタジーン社製） 、 pUC 1 9、 pT r xFu s (インビトロジェン社製） 、 pUC 1 18、 p ST
V 28 (夕カラバイオ社製） 、 pMAL— c 2X (ニューイングランドバイオラ ボ社製） 、 PAGE 107 CCy t o t e c hno l o gy, 3 (2) ， 133 - 140 (1990) ；特開平 3— 22979号公報〕 、 pAGE 103 〔Th e J ou r n a l o f B i o c h em i s t r y, 101 (5) ， 130 7 - 13 10 (1987) 〕 、 pAMo、 p AMo A [Th e J ou r n a l o f B i o l o gyc a l Ch em i s t r y, 268 (30) ， 2278 2 - 22787 ( 1 993) 〕 、 p AM o P R S A (特開平 5— 336963号 公報） 、 p AS 3— 3 (特開平 2— 227075号公報） 等が挙げられる。 発現 ベクタ一は、 構成的プロモーター又は誘導可能なプロモーター、 ポリ A付加シグ ナル、 複製開始起点、 抗生物質耐性遺伝子等が含まれていることが望ましい。 前記プロモーターとしては、 宿主中で発現できるものであればよく、 例えば、 ヒトサイトメガロウィルス （h CMV) の I E (Imme d i a t e -e a r l y) 遺伝子のプロモーター、 S V40の初期プロモーター、 モロニ一 . ミュリ ン ' ロイケミア 'ウイリレス （Mo l on e y Mu r i n e L e u 1 e m i a
V i r u s ) のロング ·ターミナル · リピート · プロモータ一 （Long T e rm i n a l Re p e a t P r omo t e r) , レトロウィルスのプロモ一 夕一、 HSPプロモーター、 S R αプロモーター及びメタ口チォネインのプロモ 一夕一等を挙げることができる。 また、 ヒト CMVの I Ε遺伝子のェンハンサー をプロモ一夕一と共に用いてもよい。
宿主に用いる宿主細胞としては、 動物細胞、 具体的には、 ヒト由来細胞株の HE K293 (ヒト胎児腎細胞、 ATCC : CRL— 1573) 、 He L a (子宮類部 癌細胞、 ATCC : CCL_2) HBT 5637 (白血病細胞、 特開昭 63— 29 9号公報） 、 BALL— 1 (白血病細胞） 及び HCT— 15 (大腸癌細胞） 、 マウ ス由来細胞株の S p 2/0— Ag 14 (マウス骨髄種細胞、 ATCC : CRL— 1 581) 、 NSO (マウス骨髄種細胞） 、 ラット由来細胞株 L 6 (骨格筋由来筋 芽細胞） 、 マウス由来細胞株 3T3L 1 (脂肪細胞） 、 マウス由来細胞株 C 2 C 12 (筋芽細胞） 、 サル由来細胞株の COS— 1 〔アフリカミドリザル腎細胞 （ SV40形質転換細胞） 、 ATCC : CRL_ 1650〕 及び COS— 7 〔ァフリ カミドリザル腎細胞 （S V40形質転換細胞） 、 ATCC： CRL- 1651) 、 ハムスター由来細胞株の CH〇— K1 (チャイニーズハムスター卵巣細胞、 ATC C： CCL— 61) 及び BHK— 21 (C—13) (シシリアンハムスター仔腎細 胞、 ATCC : CCL— 10) 、 ラット由来細胞株の PC 12 (副腎褐色細胞腫、 ATCC： CRL- 1721) 及び YB 2Z0 (ラット骨髄種細胞、 ATCC： C RL- 1662) 等を例示することができる。
本明細書に用いられる 「ストリンジェントな条件」 とは、 高ストリンジェンシ 一な条件、 例えば、 1 XS SC/0. 2 %SDSの条件等をいう。 ここで、 スト リンジエンシーを向上させるため、 より低イオン強度、 例えば、 0. 5 XS SC、 好ましくは、 0. 2 XS SC、 より好ましくは、 0. 1 XS SC等の条件及び 又はより高温、 例えば、 用いられる核酸の Tm値により異なるが、 50で以上、 好ましくは、 60 以上、 より好ましくは、 65 以上等の条件下で洗浄等を行 なってもよい。
本明細書に用いられる 「変異」 とは、 塩基の置換、 欠失、 付加及び挿入をいう。 かかる変異は、 天然に存在するバリエーションであってもよく、 慣用の部位特異 的変異方法等により人為的に導入された変異であってもよい。
本明細書に用いられる 「配列同一性」 とは、 比較対象の少なくとも 2つの配列 について、 適切に整列化させ、 それぞれの配列に存在する同一の残基を決定して、 適合部位の数を決定し、 ついで、 比較対象の配列領域内の残基の総数で、 前記適 合部位の数を割、 得られた数値に 100をかけることにより算出されうる値をい う。 かかる配列同一性は、 具体的には、 例えば、 ホームページアドレス h t t p ： //www. n c b i . n 1 m. n i h. g o v ZB L A S TZにおいて、 一般に利用可能である BLASTアルゴリズム等により算出されうる。 本明細書 における配列同一性とは、 より具体的には、 前記 BLASTアルゴリズムにおい て、 G (Co s t t o o p e n g a p 5 , E (Co s t t o e x t e nd g a ) 2, q (P e n a l t y f o r nu c l e o t i d e m i sma t c h) — 3> e (e xp e c t v a l u e) 1 0及び W (w o r d s i z e) 1 1を満たす条件により算出された値をいう。
ステップ （a) においては、 前記 I) の核酸構築物と、 前記 I I) の発現用核 酸構築物とを適切な細胞に導入する。
前記細胞としては、 発現ベクターに対応する適当な細胞又は組織を用いること が可能であればよく、 動物細胞等が挙げられる。 宿主に用いる動物細胞としては、 例えば、 ラット由来細胞株の L 6 〔骨格筋由来筋芽細胞〕 、 ヒト由来細胞株の H EK293 (ヒト胎児腎細胞、 ATCC : CRL_ 1573) 、 He L a (子宮類 部癌細胞、 ATCC : CCL— 2) HBT 5637 (白血病細胞、 特開昭 63— 2 99) 、 BALL- 1 (白血病細胞） 及び HCT— 15 (大腸癌細胞） 、 マウス由 来細胞株の S p 2 0— Ag 14 (マウス骨髄種細胞、 ATCC : CRL— 158 1) 、 NSO (マウス骨髄種細胞） 、 C2C 12 (マウス筋芽細胞） 及び 3T3— L 1 (マウス線維芽細胞、 ATCC CL— 173) 、 サル由来細胞株の COS— 1 〔アフリカミドリザル腎細胞 （SV40形質転換細胞） 、 ATCC : CRL— 1 650〕 及び COS - 7 〔アフリカミドリザル腎細胞 （SV40形質転換細胞） 、 ATCC : CRL— 1651〕 、 ハムス夕一由来細胞株の C HO— K 1 (チヤィニ —ズハムスター卵巣細胞、 ATCC : CCL_61) 及び BHK— 2 1 (C— 1 3) (シシリアンハムスター仔腎細胞、 ATCC : CCL— 10) 、 ラット由来細 胞株の PC 12 (副腎褐色細胞腫、 ATCC : CRL— 1721) 及び YB 2ノ 0 (ラット骨髄種細胞、 ATCC : CRL_ 1662) 等が挙げられる。
前記細胞への核酸構築物及び発現核酸構築物の導入は、 慣用の遺伝子導入法に より行なわれうる。 例えば、 宿主が動物細胞である場合、 エレクトロボレ一ショ ン法 〔Cy t o t e c h n o l o g y, 3 (2) , 1 33 - 140 ( 1 99 0) 〕 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2— 227075号公報） 、 リポフエクシ ョン法 [P r o c e e d i n g s o f t h e Na t i on a l Ac ad emy o f S c i e n c e s USA, 84, 7413 ( 1987) ； V i 1 o 1 o g y, 52, 456 (1973) 〕 、 DEAEデキストラン法、 パーテ ィクルガン法、 ウィルスを利用した方法等により行なわれうる。
前記核酸構築物及び発現核酸構築物が導入された細胞は、 当該分野において周 知慣用の常法により培養すればよい。 前記培養は、 用いられた細胞に適した培地 を用いて行うことができ、 培養に使用される培地としては液体培地が適当である 。 具体的には、 MEM培地 [S c i e n c e, 130, 432 (1959) 〕 、 DM EM培地 〔 V i r o l o gy, 8, 396 (1959) ] , RPM 1 164 0培地 [Th e J ou r n a l o f t h e Ame r i c an M e d i c a 1 As s o c i a t i on, 199， 519 (1967) 〕 、 YT培地、 B EM培地等が用いられる。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際の培 地としては、 例えば、 MEM培地、 DMEM培地、 R P I M培地等にゥシ胎児血 清 （FCS) を適量添加したもの等が用いられる。 培地には、 必要により発現べ クタ一のプロモーターの転写活性を高めるために、 転写活性を促進する物質を含 んでいてもよい。 転写活性を促進する物質としては、 例えば、 イソプロピル一 1 —チォ— /3— D—ガラクトピラノシド （I PTG) 等が挙げられる。
培地には、 形質転換体が生育するのに必要な栄養素、 例えば、 グルコース、 ァ ミノ酸、 ペプトン、 ビタミン類、 ホルモン類、 血清、 好ましくは、 FCS、 塩化 カルシウム、 塩化マグネシウム等が含有されており、 その様な培地であればどの ような組成の培地でも用いることができ、 市販されている培地も用いることがで さる。
培養は、 例えば、 振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件で行なうこと ができる。 培養温度、 培養時間及び培養液の pHは、 各種宿主に適した範囲に設 定される。 例えば、 培養は、 通常 15〜40 ：、 5時間〜 7日間、 pH3. 0〜 9. 0、 5 % C02存在下等の条件で行なわれうる。 pHの調整は、 無機酸又 は有機酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア等を用いて行なれ うる。 また、 必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培 地に添加してもよい。 プロモー夕一として、 誘導性のプロモーターを保持した発 現べクタ一で形質転換した微生物を培養するときには、 必要に応じてインデュー サーを培地に添加してもよい。 例えば、 1 a cプロモーターを保持した発現べク 夕一で形質転換した宿主を培養する場合、 イソプロピル一 /3— D—チォガラクト ピラノシド等を、 t r pプロモーターを保持した発現べクタ一で形質転換した宿 主を培養する場合、 ィンドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。
なお、 第 2の実施態様のスクリーニング方法においては、 前記核酸構築物と発 現核酸構築物とが導入された安定な細胞系を用いる場合、 ステップ （a) は、 省 略してもよい。
ついで、 ステップ （b) において、 前記ステップ （a) で得られた細胞と、 被 検物質とを接触させる。
ステップ （b) は、 例えば、 被検物質を含有した培地を用いて、 前記ステップ (a) で得られた細胞を培養すること、 被検物質の入った PBS等の緩衝液に細 胞をさらすこと、 細胞抽出液を被検物質にさらすこと等により行なわれうる。 その後、 ステップ （c) において、 ステップ （b) で得られた細胞における前 記レポ一ター遺伝子の発現の有無又は発現の変動を測定する。 なお、 対照として、 前記 I) の核酸構築物と前記 I I) の発現用核酸構築物とを保持した細胞であり、 かつ前記被検物質を含有しない培地を用いて培養された細胞、 被検物質にさらさ れていない細胞、 あるいは細胞抽出液等が用いられうる。
レポ一タ一遺伝子の発現は、 用いられたレポ一夕一遺伝子に応じて、 その産物 の発現を調べることにより測定される。 例えば、 前記レポ一夕一遺伝子がルシフ エラ一ゼ遺伝子等の酵素遺伝子である場合、 酵素活性を調べればよい。 また、 西 洋ヮサビペルォキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素標識により検出 する EL I S A法や化学発光法、 ルミノールや GFP (G r e e n F l u o r e s c e n c e P r o t e i n) 等の蛍光標識を検出する F I TC法、 125 I 等の放射性同位体標識を検出する R I A法、 ラテックスに結合したラテックス凝 集法、 ウェスタンブロット法及び免疫組織染色等も例示される。
ここで、 対照の細胞において、 レポーター遺伝子の発現が見られない場合は、 被検物質と接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現の存在が、 該被検物 質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物であることの指標となる。 また、 対照 の細胞において、 レポ一夕一遺伝子の発現が見られる場合は、 対照の細胞に比べ て、 被検物質と接触させた細胞において、 レポ一ター遺伝子の発現レベルが増加 した場合、 当該被検物質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物であることの指 標となる。
本発明のスクリーニング方法の第 3の実施態様としては、 被検物質と、 前記 (1) 又は （3) の因子が内在的に発現している細胞とを接触させ、 前記 （1) 又は （3) の因子の発現の変動をタンパク質レベル又は核酸レベルで検出し、 そ れにより、 前記 （1) 又は （3) の因子の発現の減少をもたらす被検物質を、 糖 尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択する方法が挙げられる。
前記 （1) の核内受容体の発現の変動を指標とする場合のスクリーニング方法 としては、
(A) 内在的に前記 （1) の核内受容体を発現している細胞と被検物質とを接触 させるステップ、 並びに
(B) 前記ステップ （A) で得られた細胞における前記 （1) の核内受容体の発 現の変動を測定し、 それにより、 前記 （1) の核内受容体の発現の減少をもたら す被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ を含む方法が挙げられる。 かかる方法によれば、 前記 （1) の核内受容体の発現 の変動を指標として、 候補化合物を選択する。 したがって、 選択された候補化合 物は、 細胞レベルにおいて前記 （1) の核内受容体の発現を転写レベルで抑制す るという特徴的な性質を有し、 核内受容体の機能を阻害することなく前記 （1) の核内受容体の発現を特異的に抑制することができるという優れた効果を発揮す る。
前記 （3) の核内因子の発現の変動を指標とする場合のスクリーニング方法と しては、
(Α') 内在的に前記 （3) の核内因子を発現している細胞と被検物質とを接触 させるステップ、 並びに
(Β') 前記ステップ （Α' ) で得られた細胞における前記 （3) の核内因子の 発現の変動を検出し、 それにより、 該核内因子の発現の減少をもたらす被検物質 を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法が挙げられる。 かかる方法によれば、 前記 （3) の核内因子の発現の 変動を指標として、 候補化合物を選択する。 したがって、 選択された候補化合物 は、 Re V— e r bファミリーの転写複合体を構成するいずれかの因子に作用す るという優れた効果を発揮する。
前記ステップ （A) 及び （Α' ) のそれぞれに用いられる細胞としては、 前記 実施態様 2の場合と同様の細胞が挙げられる。
前記ステップ （Α) 及び （Α' ) のそれぞれにおいて、 細胞と被検物質の接触 は、 例えば、 被検物質を含有した培地を用いて、 内在的に前記 （1) 又は （3) の因子を発現している細胞を培養すること、 被検物質の入った PB S等の緩衝液 に細胞をさらすこと、 細胞抽出液を被検物質にさらすこと等により行なわれうる。 なお、 対照として、 前記 （1) 又は （3) の因子を内在的に発現している細胞 であり、 かつ前記被検物質を含有しない培地を用いて培養された細胞を用いるこ と、 被検物質の入った PBS等の緩衝液に細胞をさらすこと、 細胞抽出液を被検 物質にさらすこと等を用いうる。
前記ステップ （B) 及び （Β' ) のそれぞれにおいて、 ステップ （Α) 及び
(Α' ) のそれぞれで得られた細胞における前記 （1) 及び （3) の因子それぞ れの発現の変動は、 タンパク質レベルでは、 例えば、 前記ステップ （Α) 及び
(Α' ) のそれぞれで得られた細胞における前記 （1) 及び （3) の因子それぞ れの発現レベルと、 対照の細胞における前記 （1) 及び （3) の因子それぞれの 発現レベルとを、 例えば、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動；前記 （1) の核内 受容体に対する抗体又はその断片又はその断片及び前記 （3) の核内因子に対す る抗体又はその断片のそれぞれを用いたウエスタンブロット解析；前記抗体又は その断片を用いたィムノアッセィ等により測定し、 比較することにより評価され うる。 また、 前記 （1) 及び （3) の因子の発現の変動は、 核酸レベルでは、 例 えば、 被検物質との接触後の細胞から、 核酸を抽出し、 得られた核酸を、 例えば、 前記 （1) 及び （3) の因子をコードした各核酸を検出しうる核酸、 すなわち、 前記 （1) 及び （3) の因子をコードした各核酸に特異的に結合する核酸を用い た八イブリダィゼーシヨン；前記 （1) 及び （3) の因子をコードした各核酸又 はその一部のそれぞれを特異的に増幅しうるプライマー対を用いた PC R等に供 し、 ハイブリッドの形成若しくは量又は増幅産物の出現若しくは量を測定し、 比 較することにより評価されうる。
ここで、 対照の細胞に比べて、 被検物質と接触させた細胞において、 前記
(1) 及び （3) それぞれの因子の発現レベルが減少した場合、 当該被検物質が 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物であることの指標となる。
なお、 本発明のスクリーニング方法において、 因子の動態を測定又は検出する ための抗体としては、 前記 （1) 又は （3) の因子に対する抗体、 その断片等が 挙げられる。 前記抗体の作製方法は、 例えば、 1992 年、 ジョン， ヮイリ一 &サ ンズ社 （John Weily & Sons, Inc) 発行、 ジョン · E · コリガン （John E. Coligan) 編集、 カレント · プロトコルズ ·イン · ィムノロジ一 （Current Protocols in Immunology ) に記載の方法により、 前記 （1) 又は （3) の因 子の全部又は一部を用いて、 ゥサギやマウス等を免疫することにより、 容易に作 製され得る。 また、 遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。 前記抗体は、 前記 （1) 又は （3) の因子に特異的に結合する能力を有するものであれば、 ポ リクローナル抗体であってもよく、 モノクローナル抗体であってもよい。 前記抗 体は、 例えば、 前記 （1) 又は （3) の因子中における特定の部分断片に特異的 に結合しうる抗体であってもよい。 また、 得られた抗体を精製後、 ぺプチダーゼ 等により処理することにより、 抗体の断片が得られる。 さらに、 前記抗体の誘導 体、 例えば、 キメラ抗体、 ヒト化抗体、 F a bフラグメント、 単鎖抗体等や公知 技術により修飾された抗体等を使用することもできる。 かかる抗体又はその断片 は、 慣用の酵素 （例えば、 ペルォキシダーゼ等） 、 蛍光色素、 放射性物質、 アビ ジン若しくはピオチン等で標識されていてもよい。
Re V - e r b A αを認識するポリクローナル抗体の作製は、 R e ν— e r b A αのポリべプチドの全長、 その部分べプチド若しくは該部分べプチドを含むポ リぺプチドを抗原として哺乳動物に投与することにより抗体を作製することがで きる。 抗原とは、 前記ポリペプチド又は部分ペプチドをそのまま用いてもよく、 担体、 例えば、 ゥシ血清アルブミン （BSA) 、 スカシガイのへモシァニン （k e yh o l e l imp e t h emo c y an i n ； KLH) やゥシチログ口 ブリン （BTG) 等に結合したものを用いてもよい。 また、 抗原による免疫反応 を高めるために、 例えば、 フロイントの完全アジュバント （CFA) 及び不完全 アジュバント （ I FA) を投与してもよい。 免疫に用いられる哺乳動物としては マウス、 ラット、 ゥサギ、 ャギ、 ハムスター等を用いることができる。
ポリクローナル抗体は、 例えば、 レーンらの方法 〔An t i bo d i e s ： A L a b o r a t o r y Manu a l , S e c ond Ed i t i on (19
89) (Cold Spring Harbor Laboratory Press)] 等に従って作製することが できる。
哺乳動物に抗原を 1回目の投与後、 1〜2週間毎に3〜10回投与することで 免疫された哺乳動物を得て、 それらの哺乳動物から血清を採取し、 精製すること で作製できる。
前記抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜10回行う。 該抗 原の投与量は 1回当たり動物 1匹に対し、 50〜 100 t gが好ましい。 ぺプチ ドを用いる場合は、 適当な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい 。 抗原とするペプチドは、 遺伝子工学的手法やペプチド合成機で合成することが できる。 各投与後、 3〜 7日目に眼底静脈叢より採血し、 該血清が免疫に用いた 抗原と反応することを酵素免疫測定法 〔 「酵素免疫測定法 （EL I SA法） 」 医学書院刊 （1976年） ； An t i b od i e s : A L abo r a t o r y
Ma nu a l , S e c ond Ed i t i on (1989) (Cold Spring Ha rbor Laboratory Press)] 等に記載の方法で確認することができる。
免疫された哺乳動物から採血し、 抗体価を測定する。 十分な抗体価が得られる までに免疫された時点で採血し、 血清を調製することによりポリクローナル抗体 を得ることができる。 ポリクローナル抗体の分離、 精製方法としては、 遠心分離 、 硫酸アンモニゥムによる塩析、 力プリル酸沈殿 〔An t i b od i e s ： A L a b o r a t o r y Manu a l , S e c ond Ed i t i on (198 9) (Cold Spring Harbor Laboratory Press)] 又は D E AE—セファロース カラム、 陰イオン交換カラム、 プロテイン Aカラム、 G—力ラムあるいはゲル濾 過カラム等の各種クロマトグラフィーを単独又は組み合わせることで行うことが できる。
R e v- e r bファミリ一核内受容体を認識するモノクローナル抗体は、 例え ば、 十分な抗体価が得られた免疫哺乳動物から、 脾臓又はリンパ節を採取し、 そ れらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫 （ミエローマ） 細胞と融合させて、 モノ クロ一ナル抗体産生ハイプリドーマを得、 得られたハイプリドーマを用いて慣用 の方法により目的の抗体を生産させることにより得られうる。
具体的には、 Re V— e r bファミリ一核内受容体、 その部分ペプチド若しく はその部分べプチドを含むポリぺプチドを抗原として投与して、 十分な抗体価を 示したラットに、 前記抗原を最終投与する。 その後、 3〜7日目に、 ラットから 、 脾臓を摘出する。 得られた脾臓を、 MEM培地 （例えば、 日水製薬社製） 中で 細断し、 ピンセットでほぐし、 1， 200 r pmで 5分間遠心分離する。 得られ た沈殿分画中の脾細胞を T r i s—塩化アンモニゥム緩衝液 （pH7. 65) で 1〜 2分間処理して、 赤血球を除去する。 その後、 得られた脾細胞を、 MEM培 地で 3回洗浄する。 得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
骨髄腫細胞としては、 マウス又はラットから由来の株化細胞が挙げられる。 か かる骨髄腫細胞としては、 例えば、 8—ァザグァニン耐性マウス （BALBZc 由来） 骨髄腫細胞 P 3_X63Ag 8— U1株 （以下、 P 3— U 1と略す） 〔C u r r e n t To p i c s M i c r ob i o l o gy c a l I mm u n o l o gy, 8 1, 1 (1978) 、 E u r o p i an J ou r n a l o f I mmu n o 1 o g y, 6, 51 1 (1976) 〕 、 SP 2Z0— Ag l 4株 （ 以下、 S P _ 2と略す） [Na t u r e, 276、 269 (1 978) 〕 、 P 3 _X 63 _Ag 8653株 （以下、 653と略す） [J ou r n a l o f I mmun o l o gy, 123, 1548 (1979) 〕 、 P 3 -X 63 -Ag 8
(以下、 X 63と略す） 〔Na t u r e， 256, 495 ( 1 975) ] 等が挙 げられる。 これらの細胞株は、 8—ァザグァニン培地 （15 gZm 1 8—ァ ザグァニンを含む正常培地 〔1. 5mM グルタミン、 5 X 10— 5M 2—メ ルカプトエタノール、 l O /x gZm l ジェン夕マイシン及び 10 % FCS ( CSL社製） を含む RPM I 1640培地） 〕 で継代し、 細胞融合を行なう 3〜 4曰前に正常培地で培養する。 細胞融合には、 そのようにして調製した細胞を 2 X 107個以上用いる。
細胞融合は、 既知の方法で行なわれ得、 例えば、 ケ一ラーとミルスタインの方 法 [； Na t u r e, 256, 495— 497 ( 1975) ] に従って行なわれう る。 具体的には、 前記抗体産生細胞と前記骨髄腫細胞とを、 £ 培地又は？8 S ( 1リットル当たり ； 1. 83 g リン酸ニナトリウム、 0. 21 g リン酸 一カリウム、 7. 65 g NaC pH7. 2) で洗浄し、 骨髄腫細胞の細胞 数に対し抗体産生細胞 5〜10倍になるよう混合し、 1， 200 r pmで 5分間 遠心分離した後、 沈殿分画を得る。 得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、 該 細胞群に対し抗体産生細胞 108個当たり、 ポリエチレングリコール溶液 〔2 g ポリエチレングリコール— 1000 (PEG— 1000) 、 2m 1 MEM培 地、 0. 7ml ジメチルスルホキシド （DMSO) 〕 を 0. 2〜： 1m lを 37 で攪拌しながら添加し、 更に 1〜 2分間毎に MEM培地 1〜 2m 1を数回添加 する。 MEM培地で全量を 5 Om 1になるように調製し、 90 O r pmで 5分間 遠心分離した後、 沈殿分画を得る。 沈殿分画に HAT培地 （正常培地、 1 0一4 M ヒポキサンチン、 1. 5 X 10— 5M チミジン及び 4 X 10— 7M ァミノ プテリンを含む） 100m lを添加し、 ゆるやかにほぐし、 懸濁する。
得られた懸濁液を 96穴培養用プレートの各穴に 100 1穴ずつ分注し、 3 7 、 5% C〇2存在下で 7〜14日間培養する。 酵素免疫測定法 〔An t i bo d i e s ： A L ab o r a t o r y Manu a l , S e c o nd Ed i t i o n ( 1 98 9 ) (Cold Spring Harbor Laboratory Press)] 等に記載 の方法で、 培養上清に産生された抗体のうち、 Re V— e r bファミリ一核内受 容体に特異的に反応する抗体を産生するハイプリドーマを選択する。
前記ハイプリドーマによる抗体の生産は、 慣用の方法により行なわれうる。 なお、 本発明のスクリーニング方法において、 因子の動態を測定又は検出する ための核酸としては、 前記 （1 ) 又は （3 ) の各因子をコードした各核酸に特異 的に結合する核酸等が挙げられる。 前記 （1 ) 又は （3 ) の各因子をコードした 各核酸に特異的に結合する核酸としては、 例えば、 前記 （1 ) の核内受容体をコ ードした核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、 前記 （3 ) の核内因子をコードし た核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、 前記 （1 ) の核内受容体をコードした核 酸に特徴的な部分配列の核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、 前記 （3 ) の核内 因子をコードした核酸に特徴的な部分配列の核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸 等が挙げられる。 かかる核酸は、 使用時における操作性を考慮し、 適切な Tm値、 二次構造等に基づき、 適宜選択されうる。 具体的には、 例えば、 配列番号： 1、 3、 4、 6及び 8からなる群より選ばれた核酸、 配列番号： 4 1〜 5 1からなる 群より選ばれた核酸、 それらのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。 かかる核 酸は、 慣用の蛍光色素、 放射性物質等で標識されていてもよい。
前記 （1 ) 又は （3 ) の因子をコードした核酸又はその一部のそれぞれを特異 的に増幅しうるプライマ一対としては、 前記 （1 ) の核内受容体をコードした核 酸及び前記 （3 ) の核内因子をコードした核酸それぞれの 5 ' 末端に対応するプ ライマーと 3 ' 末端に対応するプライマーとからなるプライマー対；前記 （1 ) の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分配列及び前記 （3 ) の核内因子を コードした核酸に特徴的な部分配列それぞれの 5 ' 末端に対応するプライマーと 3 ' 末端に対応するプライマーとからなるプライマ一対等が挙げられる。 かかる プライマ一対は、 使用時における操作性を考慮し、 適切な Tm値、 二次構造等に 基づき、 適宜選択されうる。 具体的には、 例えば、 配列番号： 1、 3、 4、 6及 び 8からなる群より選ばれた配列を、 核酸増幅を介して検出できるプライマー対 等が挙げられる。 なお、 かかるプライマー対は、 前記配列番号： 1、 3、 4、 6 又は 8の配列の全部又はその特徵的な部分配列を増幅可能なものであればよい。 より具体的には、 例えば、 配列番号： 1 0、 1 2、 1 7、 1 9、 2 1、 2 3、 2 5、 27、 29、 31、 33、 35、 37及び 39からなる群より選ばれた 1種 に示される塩基配列からなるプライマーと、 配列番号： 1 1、 13、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38及び 40からなる群よ り選ばれた 1種に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対 等が挙げられる。 プライマー対の具体例としては、 特に限定されないが、 配列番 号： 10と 1 1とのプライマ一対、 配列番号： 12と 13とのプライマー対、 配 列番号： 17と 18とのプライマ一対、 配列番号： 19と 20とのプライマ一対、 配列番号： 2 1と 22とのプライマー対、 配列番号： 23と 24とのプライマー 対、 配列番号： 25と 26とのプライマー対、 配列番号： 27と 28とのプライ マ一対、 配列番号： 29と 30とのプライマー対、 配列番号： 31と 32とのプ ライマー対、 配列番号： 33と 34とのプライマー対、 配列番号： 35と 36と のプライマ一対、 配列番号： 37と 38とのプライマー対、 配列番号： 39と 4 0とのプライマ一対等が挙げられる。 かかるプライマ一は、 慣用の蛍光色素、 放 射性物質等で標識されたプライマーであってもよい。 増幅産物の検出は、 慣用の ァガロースゲル電気泳動等において、 臭化工チジゥムゃ蛍光色素による可視化、 標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等により行なわれうる。
本明細書において、 「 （核酸に） 特徴的な部分配列」 とは、 例えば、 データべ ースに登録された配列のうち、 前記 （1) 又は （3) の因子を除くものの塩基配 列には、 見出されない部分配列をいい、 例えば、 データベースに登録された配列 との配列同一性が、 20 %以下、 好ましくは、 10 %以下、 より好ましくは、 5%以下、 特に好ましくは 0 %である配列をいう。
本発明のスクリーニング方法の第 4の実施態様としては、 前記 （4) の Re v - e r bファミリ一核内受容体プロモーター又は前記 （5) の Re v— e r bフ アミリー核内受容体と RN Aポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内 因子のプロモーターの機能を阻害する被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候 補化合物として選択する方法が挙げられる。 かかる第 4の実施態様の方法としては、
(a) R e V— e r bファミリー核内受容体プロモー夕一と、
レポ一夕一遺伝子と
を含み、 該プロモーターの下流及び支配下に、 該レポーター遺伝子が動作可能に 連結したものである核酸構築物を、 細胞に導入して発現させるステップ、
(b) 前記ステップ （a) で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、 並びに
(c) 前記ステップ （b) で得られた細胞における該レポ一夕一遺伝子の発現の 有無を検出又は発現の変動を測定し、 それにより、 該レポ一夕一遺伝子の発現の 存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合 物として選択するステップ
を含む方法 （方法 1) ；
(a' ) R e V - e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを 機能的に共役させうる核内因子のプロモーターと、
レポ一夕一遺伝子と
を含み、 該プロモーターの下流及び支配下に、 該レポーター遺伝子が動作可能に 連結したものである核酸構築物を、 細胞に導入して発現させるステップ、
(b， ) 前記ステップ （a' ) で得られた細胞と被検物質とを接触させるステツ プ、 並びに
(c ' ) 前記ステップ （b' ) で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発 現の有無を検出又は発現の変動を測定し、 それにより、 該レポーター遺伝子の発 現の存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補 化合物として選択するステップ
を含む方法 （方法 2)
が挙げられる。
前記方法 1によれば、 Re v— e r bフアミリー核内受容体プロモーターの機 能の阻害、 すなわち、 レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす 物質を選択することができるため、 選択された候補化合物は、 Re v— e r bフ アミリー核内受容体プロモータ一の機能の阻害を介して、 Re v— e r bフアミ リー核内受容体に作用するという性質を有する。 したがって、 選択された候補化 合物は、 R e V— e r bファミリー核内受容体プロモーターに直接的かつ特異的 に作用させることができるという優れた効果を発揮する。
また、 前記方法 2によれば、 R e V— e r bファミリー核内受容体と RNAポ リメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターの機能の阻 害、 すなわち、 レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす物質を 選択することができるため、 選択された候補化合物は、 当該核内因子のプロモ一 ターの機能の阻害を介して、 該核内因子に作用するという性質を有する。 したが つて、 選択された候補化合物は、 R e V— e r bファミリ一核内受容体と RNA ポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターに直接的 かつ特異的に作用させることができるという優れた効果を発揮する。
前記ステップ （a) 又は （a' ) に用いられる核酸構築物は、 前記 （4) 又は (5) のプロモーターと、 レポーター遺伝子とを含み、 該プロモーターの下流及 び支配下に、 該レポーター遺伝子が動作可能に連結した構築物である。 かかるレ ポーター遺伝子としては、 上述のレポ一夕一遺伝子と同様のものが挙げられる。 前記ステップ （a) 及び （a' ) に用いられる細胞としては、 上述の宿主細胞 と同様のものが用いられうる。
前記ステップ （a) 及び （a' ) において、 細胞への前記核酸構築物の導入は、 上述の慣用の遺伝子導入法により行なわれうる。 なお、 得られた細胞の培養には、 前記実施態様 2の方法に用いられる培地と同様の培地が用いられうる。
なお、 第 4の実施態様のスクリーニング方法においては、 前記核酸構築物が導 入された安定な細胞系を用いる場合、 ステップ （a) 及び （a' ) は、 省略して もよい。 ついで、 ステップ （b) 及び （b' ) において、 それぞれ、 前記ステップ (a) 及び （a' ) で得られた細胞と、 被検物質とを接触させる。
ステップ （b) 及び （b' ) は、 それぞれ、 例えば、 被検物質を含有した培地 を用いて、 前記ステップ （a) 及び （a' ) で得られた細胞を培養すること、 被 検物質の入った PB S等の緩衝液に細胞をさらすこと、 細胞抽出液を被検物質に さらすこと等により行なわれうる。
その後、 ステップ （c) 及び （c ' ) において、 それぞれ、 ステップ （b) 及 び （b' ) で得られた細胞における前記レポーター遺伝子の発現の有無又は発現 の変動を測定する。 なお、 対照として、 前記 I) の核酸構築物を保持した細胞で あり、 かつ前記被検物質を含有しない培地を用いて培養された細胞、 被検物質に さらされていない細胞、 あるいは細胞抽出液等が用いられうる。
本発明のスクリーニング方法により得られる糖尿病治療剤又は予防剤の候補化 合物としては、 前記 （1) 又は （3) の因子の発現を抑制する化合物又はその 塩；前記 （1) 〜 （5) からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子の機能を 阻害する化合物又はその塩等が挙げられる。
前記化合物又はその塩としては、 例えば、 前記 （1) 〜 （5) の因子の少なく とも 1つに結合することにより、 該因子の少なくとも 1つの機能を阻害する化合 物、 例えば、 低分子化合物、 高分子化合物、 該 （1) 又は （3) の因子に対する 抗体、 該 （1) 〜 （3) のいずれかの因子をコードする核酸のアンチセンス鎖等 の核酸、 ペプチド；該 （1) 〜 （3) のいずれかの因子をコードする核酸に対応 して RNA iを誘発する核酸、 具体的には、 s i RNA；該 （1) 〜 （3) のい ずれかの因子をコードする核酸に対応するリポザィム等が挙げられる。
なお、 前記 s i RNAの配列は、 RNA iに無関係な結合因子影響を減少させ る観点から、 調節タンパク質結合部位が多い 5' 及び 3， の非翻訳領域と開始コ ドン周辺の領域を避けることが望ましい。 前記 s i RNAの配列は、 特に限定さ れないが、 例えば、 ① 機能を阻害する標的となる配列の開始コドンから、 好ましくは、 50〜10 0ヌクレオチド以上下流、 より好ましくは、 少なくとも 75ヌクレオチド下流の 領域を選択し、
② 選択された領域から、 好ましくは、 細胞死を引き起こさない程度の長さ、 よ り好ましくは AA— CN 19 (任意の 19ヌクレオチド残基） 〕 の配列又は A A - CN2 1 (任意の 21ヌクレオチド残基） 〕 の配列、 さらに好ましくは、 A A G- CN 18 (任意の 1 8ヌクレオチド残基） 〕 の配列又は AAC— [Ν 1 8
(任意の 18ヌクレオチド残基） 〕 の配列を選択し、
③ 選択された配列について、
― GC含量が、 好ましくは、 30 %〜7 0 %、 より好ましくは、 4 0%前後〜 50%前後、 さらに好ましくは、 50%前後である
- 公知のデータベースを検索、 例えば、 ホームページアドレス h t t p ： /www. n c b i . n l m. n i h . g o v/BLASTzか ら利用可能な NCB Iデータベースの BLASTサーチにより、 標的と なる配列に対して特異的である
配列であることを確認する
ことによりデザインされうる。 かかるデザインには、 例えば、 慣用の s i RNA デザインツール 〔例えば、 Dh a r ma c 0 n社製の s i RNAデザインツール 等〕 を用いてもよい。 デザインされた配列の s i RNAについて、 例えば、 DE PEC (ジェチルピロカルボン酸） 処理水等中で保存されることが望ましい。 本発明においては、 前記 s i RNAとしては、 具体的には、 配列番号： 54又 は 55に示される塩基配列を有する核酸に対応する s i RNA, 配列番号： 56 又は 57に示される塩基配列を有する核酸に対応する s i RNAが挙げられる。 なお、 本発明のスクリーニング方法において、 被検物質として、 s i RNAを 用いる場合、 デザインされた s i RNAを、 適切なアニーリング用緩衝液、 例え ば、 組成： 50 mM T r i s— HC 1 (pH 7. 5) 、 100 mM N a C 1 の緩衝液、 組成： 30mM HE P E S -KOH (pH 7. 4) 、 1 00 mM CH3COOK、 2mM (CH3COO) 2M gの緩衝液、 組成： 1 mM T r i s—HC l (pH7. 5) 、 ImM E D T Aの緩衝液中、 慣用のアニーリング 条件下、 例えば、 90〜 95T:で 5分間インキュベーションし、 徐々に 25で前 後まで温度を下げることにより、 二本鎖 RN Aを形成させて用いられうる。
また、 本発明のスクリーニング方法において、 被検物質として、 s i RNAを 用いる場合、 本発明のスクリーニング方法は、 該 s i RNAを慣用の手法により、 前記実施態様 2のステップ （a) で得られる細胞又は前記実施態様 3のステップ
(A) で得られる細胞に導入すること等により行なわれうる。
また、 RNA iに際して用いられうるベクターとしては、 特に限定されないが、 例えば、 商品名： p S i l e n c e r. 1. 0— U6 〔アンビオン （Amb i o n) 社製〕 、 商品名： p S i l e n c e r. 2. 0— U6 〔アンビオン （Amb i o n) 社製〕 、 商品名： p S i l e n c e r. 3. 0— HI 〔アンビオン （A mb i o n) 社製〕 、 商品名 ： p S i l e n c e r. 2. 1— U6Hy g r o
〔アンビオン （Amb i o n) 社製〕 、 商品名： p S i 1 e n c e r . 3. 1— H 1 Hy g r o 〔アンビオン （Amb i o n) 社製〕 、 商品名 ： I MG— 700、 I MG- 800 〔ィムジェネックス （ I MGENEX) 社製〕 、 商品名： p GE - 1 〔ストラタジーン （STRATAGENE) 社製〕 、 商品名： p i GENE hU6 〔夕カラバイオ社製〕 、 商品名： p i GENEmU6 〔夕カラバイオ社 製〕 、 商品名 ： p s i RNA-hH 1 n e o 〔インビポジェン （ I NV I VOG EN) 社製〕 、 商品名： p s i RNA. hH 1 z e o 〔インビボジェン （ I NV
I VOGEN) 社製〕 等；アデノウイルスを用いた系として、 商品名： p S i 1 e n c e r. ad e no l. 0— CMVSy s t em 〔アンビ才ン (Amb i o n) 社製〕 、 商品名： Ge n e Su p p r e s s o r. A d e n o Con s t r u e t i o n k i t 〔ィムジェネックス （ I MGENEX) 社製〕 等； レト ロウィルスを用いた系として、 商品名： GENESUPRES SOR RETR OV I RAL SYSTEM 〔ィムジェネックス （I MGENEX) 社製〕 等が 挙げられる。
また、 i n V i t r 0で s i RNAを合成し、 それを細胞に導入する方法も 利用することができ、 かかる方法には、 特に限定されないが、 例えば、 商品名： BLOCK- i T Comp l e t e D i c e r RNA i K i t 〔インビ トロジェン （ I nv i t r og e n) 社製〕 、 商品名： S i l e n c e r, s i RNA C o n s t r u c t i o n K i t 〔アンビオン （Am b i o n) 社 製〕 、 商品名： CUGAR 7 i n v i t r o s i RNA Syn t h e s i s K i t 〔二ツボンジーン社製〕 等が用いられうる。
さらに、 本発明のスクリーニング方法において、 被検物質として、 s i RNA を用いる場合、 s i RNAの効果は、 用いられた s i RNAと同じ塩基組成を有 する s i RN Aを陰性対照として用いればよい。
また、 前記 （1) 〜 （3) のいずれかの因子をコードする核酸に対応するリポ ザィムは、 例えば、 t RNA連結型リボザィムの場合
① 機能を阻害する標的となる配列中におけるリポザィムにより切断可能な配列 を選択し、
② 選択された配列とその隣接の両側の 6〜 9ヌクレオチドとをリポザィムの認 識配列として、 該認識配列に相補的なリボザィムの配列を設計し、
③ 設計された配列の RNAが、 例えば、 t RNAの構造を正しく形成すること、 リポザィムの構造が比較的安定であること、 標的となる mRN Aにおけるステム 構造の形成がないこと等を指標として、 リポザィムと標的となる配列の評価を行 なうこと
により、 デザインされうる。
本発明のスクリーニング方法において、 被検物質として、 リポザィムを用いる 場合、 前記デザインされたリポザィムを、 発現に適したベクター、 例えば、 商品 名： p i GENE t RNA 〔夕カラバイオ社製〕 、 商品名： p i GENE hU6 〔夕カラバイオ社製〕 、 商品名： p i GENEmU6 〔夕カラバイオ社製〕 等に 組込み、 得られたベクターを適切な宿主細胞に導入して、 該宿主細胞内で増幅さ せることができる。
本発明のスクリーニング方法において、 被検物質として、 リボザィムを用いる 場合、 本発明のスクリーニング方法は、 該リポザィムを発現するためのベクター 又はウィルスを慣用の手法により、 前記実施態様 2のステップ （a) で得られる 細胞又は前記実施態様 3のステップ （A) で得られる細胞に導入すること等によ り行なわれうる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる前記 （1) 〜 （5) の各因子、 該 (1) 〜 （5) の各因子をコードする各核酸、 該核酸を保持した細胞等は、 本発 明のスクリーニング方法を行なうためのキッ卜としても提供される。 したがって、 このようなスクリーニング用キットも本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング用キットとしては、 具体的には、
前記 （1) 〜 （5) からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子を含有した、 かつ該因子に結合する化合物又はその塩のスクリーニング用キット ；
I ) Re V— e r bファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、 プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、 該応答性エレメントの下流及び支配下に、 該プロモーターと該レポ一夕 一遺伝子とが動作可能に連結し、 かつ該プロモーターの下流及び支配下に、 該レ ポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物、 及び
II) R e v— e r bフアミリー核内受容体をコードする核酸を含有した発現用 核酸構築物
を含有した、 該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キッ h；
前記 （1) 又は （3) の因子に対する抗体又はその断片を含有した、 該因子の発 現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット；
前記 （1 ) 又は （3 ) の因子をコードした核酸が導入された細胞を含有した、 該 因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キッ卜 ；
前記 （4 ) 又は （5 ) のプロモーターと、 レポ一夕一遺伝子とを含み、 該プロモ 一ターの下流及び支配下に、 該レポ一夕一遺伝子が動作可能に連結したものであ る核酸構築物を含有した、 該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリー ニング用キッ卜
等が挙げられる。
本発明のスクリーニング用キットは、 検出用試薬、 緩衝液、 標準物質、 標準曲 線等をさらに含有してもよい。
本発明のスクリーニング用キットによれば、 前記スクリーニング方法を、 簡便 に、 かつ迅速に、 高処理量で、 高い信頼性で行なうことができるという優れた効 果を発揮する。
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩は、 前記 （1 ) 〜 （5 ) の各因子の機能に対する作用機序に基づく作用、 前記 （1 ) 〜 （5 ) の 各因子の機能に関連して発症する糖尿病に対する治療又は予防作用を発揮しうる。 したがって、 前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、 前記 （1 ) 〜 （5 ) の各因子の機能に関連する疾患、 特に糖尿病の治療又は予防 に用いるための医薬組成物が提供される。
本発明の医薬組成物は、 本発明のスクリ一二ング方法により得られた化合物又 はその塩を有効成分として含有することに 1つの特徴がある。 したがって、 本発 明の医薬組成物は、 前記 （1 ) 〜 （5 ) の各因子の機能に関連する疾患、 該機能 に関連して発症する疾患に対して、 該因子の機能の阻害を介して作用しうるとい う優れた効果を発揮する。 また、 本発明の医薬組成物によれば、 糖尿病、 具体的 には、 I I型糖尿病、 特に、 前記 （1 ) 〜 （5 ) の各因子、 例えば、 R e v— e r b A aの機能に関連して発症する I I型糖尿病に対して、 該機能の阻害を介し て作用しうるという優れた効果を発揮する。 したがって、 本発明の医薬組成物に よれば、 ペルォキシソ一ム増殖薬活性化受容体 （PPAR) を活性化させること に基づくチアゾリジンジオン化合物とは異なる作用機序によりインスリン抵抗性 を改善することができるという優れた効果を発揮する。
本発明の医薬組成物中における前記化合物又はその塩の含有量は、 治療目的の 疾患、 患者の年齢、 体重等により適宜調節することができ、 治療上有効量であれ ばよく、 低分子化合物又は高分子化合物の場合、 例えば、 0. 0001〜 100 Omg、 好ましくは、 0. 001〜10 Omg、 ポリペプチド又はその誘導体の 場合、 例えば、 0. 0001〜1000mg、 好ましくは、 0. 001〜 100 mg、 核酸又はその誘導体の場合、 例えば、 0. 00001〜100mg、 好ま しくは、 0. 0001〜： L Omgであることが望ましい。
本発明の医薬組成物は、 前記化合物又はその塩を安定に保持しうる種々の助剤 をさらに含有してもよい。 具体的には、 有効成分の送達対象となる部位に到達す るまでの間に、 有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容さ れうる助剤、 賦形剤、 結合剤、 安定剤、 緩衝剤、 溶解補助剤、 等張剤等が挙げら れる。
本発明の医薬組成物の投与形態は、 有効成分の種類；投与対象となる個体、 器 官、 局所部位、 組織；投与対象となる個体の年齢、 体重等に応じて、 適宜選択さ れる。 前記投与形態としては、 皮下注射、 筋肉内注射、 静脈内注射、 局所投与等 が挙げられる。
また、 本発明の医薬組成物の投与量も、 有効成分の種類；投与対象となる個体、 器官、 局所部位、 組織；投与対象となる個体の年齢、 体重等に応じて、 適宜選択 される。 投与としては、 特に限定されないが、 有効成分が、 低分子化合物又は高 分子化合物である場合、 前記有効成分の量として、 例えば、 0. 0001〜10 O OmgZkg体重、 好ましくは、 0. 001〜 10 OmgZk g体重、 ポリべ プチド又はその誘導体の場合、 例えば、 0. 0001〜 100 OmgZk g体重、 好ましくは、 0. 001〜10 OmgZkg体重、 核酸又はその誘導体の場合、 例えば、 0. 00001〜 10 OmgZk g体重、 好ましくは、 0. 0001〜 1 OmgZk g体重の 1回投与量となるように、 1日につき、 複数回、 例えば、 1〜 3回投与すること等が挙げられる。
本発明の医薬組成物の薬理評価は、 例えば、 インスリン抵抗性モデル動物、 例 えば、 Z u c k e r f a t t y r a Uこ、 本発明の医薬組成物を投与し、 非 投与動物に比べ、 投与動物において、 インスリン抵抗性の改善が見られた場合を 指標として評価する方法；グルコースクランプ試験法等により行なわれうる。 なお、 本発明の医薬組成物には、 前記 （1) 〜 （3) のいずれかの因子をコー ドする核酸に対応して RNA iを誘発しうる核酸、 例えば、 s i RNA又は該 s i RNAを発現するベクターを有効成分として含有した医薬組成物、 該 （1) 〜
( 3 ) のいずれかの因子をコ一ドする核酸に対応するリボザィムに対応するリポ ザィムを有効成分として含有した医薬組成物も含まれる。
前記 s i RNAとしては、 特に限定されないが、 配列番号： 54又は 55に示 される塩基配列を有する核酸に対応する s i RNA, 配列番号： 56又は 57に 示される塩基配列を有する核酸に対応する s i RNA等が挙げられる。
本発明の医薬組成物の有効成分が、 s i RNAである場合、 投与対象となる個 体、 好ましくは、 筋肉、 脂肪、 肝臓等の組織から慣用の方法により全 RNAを抽 出し、 標的となる mRNAが分解されることを指標として、 薬理評価を行なうこ ともできる。
前記リボザィムとしては、 例えば、 配列番号： 1の塩基配列における塩基番 号： 69 1〜 70 1内、 578〜 599内のいずれかを認識配列とするリポザィ ムが挙げられる。
本発明の医薬組成物の有効成分が、 リポザィムである場合、 認識配列の切断に 基づく前記 （1) 〜 （3) のいずれかの因子又はそれをコードする核酸の量の減 少を指標として、 薬理評価を行なうこともできる。 また、 本発明によれば、 R e v_ e r bファミリー核内受容体をコードする核 酸 （センス核酸） のアンチセンス核酸を用いた Re v— e r bファミリ一核内受 容体の発現抑制方法も提供されうる。
かかるアンチセンス核酸を用いた R e V - e r bファミリ一核内受容体の発現 抑制方法においては、 前記 （1) をコードする核酸と相補的な RN A又は一本鎖 DNAを、 細胞内で発現させるか、 あるいは導入することにより、 Re v— e r bファミリ一核内受容体の遺伝子の発現を抑制する。
前記アンチセンス核酸は、 標的とする R e V— e r bファミリ一核内受容体の 遺伝子より転写される mRNAに相補的な配列を有するものであればよく、 例え ば、 少なくとも 20ヌクレオチド長、 好ましくは、 25ヌクレオチド長以上、 よ り好ましくは、 28ヌクレオチド長以上の核酸を化学的合成 〔例えば、 商品名： Mo r ρ h o 1 i n oアンチセンス [ジーンツールズ （Ge n e To o l s) 社製]、 商品名：ホスホロチォエートオリゴ [バイオグノスティック （B i oG NOST I C) 社製]等を参照のこと〕 又は酵素的合成により作製されうる。
前記アンチセンス核酸は、 標的とする癌組織へのデリバリーに適する性質、 組 織又は細胞に対する親和性を付与しうる種々の修飾を有していてもよい。
前記アンチセンス核酸は、 例えば、 個体の筋肉、 脂肪組織等の組織への局所投 与、 非経口投与、 経口投与等により個体に投与することができる。 投与手段とし ては、 金属粒子、 リボソーム、 例えば、 内包型リボソーム、 正電荷リボソーム、 HVJ (センダイウィルス） —リボソーム等による導入法、 n a k e d— DNA の直接導入法、 正電荷ポリマーによる導入法等が挙げられる。
また、 前記アンチセンス核酸の投与量及び投与回数は、 投与目的、 個体の年齢、 体重、 状態等に応じて、 発現抑制効果を発揮させるに十分な量となるように、 適 宜設定され得る。
なお、 アンチセンス核酸は、 使用目的、 使用形態等に応じて、 適宜、 適切な溶 液、 例えば、 アンチセンス核酸を安定に維持しうる緩衝液等に溶解させた形態で 用いられうる。 また、 アンチセンス核酸は、 薬理学的に許容されうる担体、 賦形 剤、 結合剤、 安定剤、 緩衝剤、 溶解補助剤、 等張剤などを含有した剤として用い てもよい。
また、 本発明によれば、 前記リポザィムを用いた R e V— e r bファミリー核 内受容体の発現抑制方法も提供されうる。
前記リポザィムの投与手段等は、 前記ァンチセンス核酸の投与手段等と同様で ある。
個体、 特に、 組織や細胞への前記リポザィムの導入に適したベクターとしては、 特に限定されないが、 例えば、 前記商品名： p i GENEhU6 〔夕カラバイオ 社製〕 、 商品名： p i GENEmU6 〔夕カラバイオ社製〕 、 商品名： p i GE NE t RNA 〔夕カラバイオ社製〕 等が挙げられる。
前記発現抑制方法は、 R e V— e r bファミリー核内受容体をコードする核酸 に対応する、 アンチセンス核酸、 リボザィム等が用いられるため、 例えば、 Re v_e r bファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、 例えば、 Re v_ e r b A αの機能に対する作用機序に基づく作用、 Re ν— e r bファミリ一核内 受容体又はそれに関連する因子、 例えば、 Re V— e r bAaの機能に関連して 発症する糖尿病の治療等への応用に有用である。
本発明によれば、 インスリン抵抗性モデルラット （Z u c k e r f a t t y r a t) において、 インスリン抵抗性を改善させた場合、 改善前よりも、 R e v — e r bA Kの発現が、 減少し、 さらに、 培養細胞において該 R e v— e r b A を強制発現させることにより、 グルコース取り込み能が低下するという知見に 基づき、 糖尿病、 特に I I型糖尿病の診断方法が提供される。
本発明の糖尿病の診断方法は、 被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由 来の対照試料それぞれにおける Re V - e r bファミリ一核内受容体遺伝子、 す なわち、 前記 （1) の核内受容体の遺伝子の発現レベルを測定することを 1つの 特徴とする。 したがって、 本発明の診断方法によれば、 糖尿病、 具体的には、 I I型糖尿病、 特に、 R e v _ e r bファミリー核内受容体、 例えば、 R e v— e r b A aの機能に関連して発症する糖尿病を、 簡便に、 迅速に、 診断することが できるという優れた効果を発揮する。 また、 本発明の診断方法によれば、 高い信 頼性で診断することを可能にする。
本発明の診断方法においては、 被検試料における発現レベルが、 対照試料にお ける発現レベルよりも高くなる場合、 該被検対象の個体が、 糖尿病に罹患してい る疑いがあることの指標となる。
前記個体としては、 ヒト、 マウス、 ラット、 サル等が挙げられる。
核酸含有被検試料は、 例えば、 個体の組織、 細胞、 血液等から慣用の手法によ り調製されうる。
前記 （1 ) の核内受容体の遺伝子の発現レベルは、 前記 （1 ) の核内受容体の 遺伝子の m R N A転写物の量又は前記 （1 ) の核内受容体の遺伝子産物の量を指 標として測定されうる。
mR N A転写物の量を指標とする場合、 被検対象の個体由来の核酸含有被検試 料及び正常個体由来の核酸含有対照試料のそれぞれを、 例えば、 前記 （1 ) の核 内受容体をコードした核酸を検出しうる核酸、 すなわち、 前記 （1 ) の核内受容 体をコードした核酸に特異的に結合する核酸を用いたハイブリダィゼーション、 あるいは前記 （1 ) の核内受容体をコードした核酸又はその一部のそれぞれを特 異的に増幅しうるプライマー対を用いた P C R等に供し、 ハイプリッドの形成若 しくは量又は増幅産物の出現若しくは量を測定し、 比較することにより評価され うる。
ハイブリダィゼーシヨンに用いられる核酸としては、 前記 （1 ) の核内受容体 をコードした核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、 前記 （1 ) の核内受容体をコ 一ドした核酸に特徴的な部分配列の核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸等が挙げ られる。 かかる核酸は、 使用時における操作性を考慮し、 適切な Tm値、 二次構 造等に基づき、 適宜選択されうる。 具体的には、 例えば、 配列番号： 1、 3、 4、 6及び 8からなる群より選ばれた核酸、 配列番号： 41〜51からなる群より選 ばれた核酸、 それらのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。 かかる核酸は、 慣 用の蛍光色素、 放射性物質等で標識されていてもよい。
P CRに用いられるプライマ一対としては、 前記 （1) の核内受容体をコード した核酸の 5 ' 末端に対応するプライマーと 3' 末端に対応するプライマーとか らなるプライマー対、 前記 （1) の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分 配列の 5 ' 末端に対応するプライマーと 3 ' 末端に対応するプライマーとからな るプライマ一対等が挙げられる。 かかるプライマ一対は、 使用時における操作性 を考慮し、 適切な Tm値、 二次構造等に基づき、 適宜選択されうる。 具体的には、 例えば、 配列番号： 1、 3、 4、 6及び 8からなる群より選ばれた配列を、 核酸 増幅を介して検出できるプライマー対等が挙げられる。 より具体的には、 例えば、 配列番号： 10、 12、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 3 3、 35、 37及び 39からなる群より選ばれた 1種に示される塩基配列からな るプライマ一と、 配列番号： 1 1、 13、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38及び 40からなる群より選ばれた 1種に示される 塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。 かかるプ ライマーは、 慣用の蛍光色素、 放射性物質等で標識されたプライマ一であっても よい。 増幅産物の検出は、 慣用のァガロースゲル電気泳動等において、 臭化工チ ジゥムや蛍光物質による可視化、 標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等 により行なわれうる。
遺伝子産物の量を指標とする場合、 被検対象の個体由来の被検試料及び正常個 体由来の対照試料のそれぞれを、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動、 前記 （1) の核内受容体に対する抗体又はその断片を用いたウエスタンブロット解析；前記 抗体又はその断片を用いたィムノアッセィ等に供し、 遺伝子産物量を測定し、 比 較することにより評価されうる。
なお、 前記診断方法により得られた結果は、 媒体、 電気通信回線等を介して、 医者、 受診者等に供給されうる。
また、 本発明によれば、 本発明の診断方法を、 簡便、 迅速に、 高処理量で、 高 い信頼性で行なうために、 前記プローブ及びノ又はプライマー対を含有した診断 用キット、 又は前記 （1 ) の核内受容体に対する抗体若しくはその断片を含有し た診断用キットが提供される。
本発明の診断用キットには、 検出用試薬、 緩衝液、 対照試料等をさらに含有し てもよい。
さらに、 本発明によれば、 糖尿病、 具体的には、 I I型糖尿病、 特に、 R e v — e r bファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、 例えば、 R e v _ e r b Aひの機能に関連して発症する糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試 料の検出又は選別方法も提供される。
本発明の検出又は選別方法によれば、 糖尿病に罹患している疑いがある個体由 来の試料を、 簡便、 迅速に、 高い信頼性で検出することができる。
本発明の検出又は選別方法は、 被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由 来の対照試料それぞれにおける前記 （1 ) の核内受容体の遺伝子の発現レベルを 測定するステップを含み、 ここで、 被検試料における発現レベルが、 対照試料に おける発現レベルよりも高くなる場合、 該被検試料が、 糖尿病に罹患している疑 いがある個体由来の試料であることの指標となる。
本発明の検出又は選別方法においては、 発現レベルは、 前記 （1 ) の核内受容 体の遺伝子の m R N A転写物の量又は前記 （1 ) の核内受容体の遺伝子産物の量 を指標として測定されうる。
m R N A転写物の量又は遺伝子産物の量の測定は、 前記プローブ及び 又はプ ライマ一対、 あるいは前記 （1 ) の核内受容体に対する抗体若しくはその断片を 用いることにより実施されうる。
また、 本発明によれば、 本発明の検出又は選別方法を、 簡便、 迅速に、 高処理 量で、 高い信頼性で行なうために前記プローブ及び 又はプライマー対を含有し た診断用キット、 又は前記 （1) の核内受容体に対する抗体若しくはその断片を 含有した検出用キットが提供される。 したがって、 かかる検出用キットによれば、 前記検出方法を、 簡便、 迅速に、 高処理量で、 高い信頼性で行なうことができる。 前記検出用キットには、 検出に必要な各種試薬、 例えば、 標識物質、 標識用試 薬、 適切な対照等を適宜含有してもよい。
本発明を、 下記実施例等により説明するが、 本発明は、 かかる実施例に限定さ れるものではない。 また、 以下の実施例において、 遺伝子操作的手法として、 特 に断らない限り、 Mo l e c u l a r C 1 o n i n g ： A Lab o r a t o r y Manu a l , S e c on d E d i t i on ( 1989) (C o l d S p r i ng Ha r b o r L a bo r a t o r y P r e s s) に記載され た方法を用いた。 実施例 1
(1) DNAチップを用いた糖尿病ラットの遺伝子発現解析
インスリン抵抗性モデル動物について、 ① インスリン抵抗性改善剤であるピ オダリタゾンの投与 〔ピオグリタゾン投与群〕 、 ② 食餌制限 〔食餌制限群〕 、 又は③ 食餌制限と運動負荷との組み合わせ 〔食餌制限 +運動負荷群〕 による処 理を行なった。
インスリン抵抗性モデル動物として、 Zu c k e r f a t t y r a t (塩 野義製薬株式会社 油日ラボラトリーズ AC部門育成供給、 10齢） を用いた。 対照として、 Zu c k e r l e an r a t (塩野義製薬株式会社 油日ラボ ラトリーズ AC部門育成供給、 10齢） を用いた。 飼育温度 24± I ：、 湿度 5 5 ± 5%、 照明期間 12時間 （8時から 20時） の飼育条件の下、 自由に摂餌飼 育した。 前記①のピオグリタゾン投与群については、 ピオダリ夕ゾン （武田薬品社製、 商品名：ァクトス） 1 OmgZk gラット体重を、 1日あたり、 1回投与した。 上記と同じの飼育条件の下、 3週間、 飼育した。
前記②の食餌制限群については、 Zu c k e r f a t t y r a tに、 一日 摂餌量の 70%相当量のみを摂餌させた。 期間は 5週間とした。 上記と同じ条件 の下、 飼育した。
前記③の食餌制限 +運動負荷群については、 食事制限に加えトレッドミルを用 いて運動負荷を行なった。 運動負荷条件は、 1 5m l /分 X 15分の warming - up, 2 Om 1 分 X 60分の運動、 1 5m l Z分 X I 5分の coo卜 down とした。 期間は、 5週間とした。
インスリン抵抗性の改善は、 グルコースクランプ試験を行ない、 グルコース注 入量の増加をインスリン抵抗性が改善したことの指標として評価した。
(2) インスリン抵抗性改善により発現が変動する遺伝子の検索
①〜③の各処理群においてィンスリン抵抗性が改善された個体及び対照群の個 体のそれぞれの脳、 骨格筋、 肺、 及び脂肪組織から、 TR I ZOL試薬 （商品名、 インビトロジェン社製） を用い、 添付のマニュアルに従って全 RNAを調製し、 全 RNA300 a gを得た。 得られた全 RN Aを、 Qu i c kP r e p M i c r o mRNA Pu r i f i c a t i on K i t (商品名、 アマシャムバイ ォサイエンス社製） を用い、 添付のマニュアルにしたがって p o 1 y (A) +R N Aを調製した。 この p o l y (A) +RNAから、 S u p e r s c r i p t Cho i c e Sy s t em (商品名、 インビトロジェン社製） を用いてクロー二 ング用 cDNA断片を調製した。
p o l y (A) +RNA 2〜5 gを用い、 O 1 i g o (dT) 12_18 p r i me rと Sup e r s c r i p t (登録商標） I I RTとを用いてファースト ストランド cDNAを合成し、 ついで、 E. c o l i DNAポリメラ一ゼと E. c o l i RNa s e Hとを用いてセカンドストランド c DNAを合成した。 得 られた cDNAを、 T4 DNAポリメラーゼで処理し、 平滑末端をもつ cDNA を生成した。 その後、 得られた cDNAに、 T4 DN Aリガ一ゼを用いて、 Ec oR I (No t I) アダプターを 5' 及び 3' 両末端に付加した。 アダプターを付 加した cDNAを、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、 5' 末端をリン酸化 した。 その後、 S i z e S e p 400 S pun Co l mn s (商品名、 ァ マシャムバイオサイエンス社製） で約 400 b p以上の c DNA断片を回収した。 ベクタープラスミド pSpo r t 1 (商品名、 インビトロジェン社製） を制限 酵素 Ec oR I (夕カラバイオ社製） で処理し、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを 用いて 5' 末端をリン酸化した後、 該ベクタ一プラスミドに、 T4 DNAリガ一 ゼを用いて得られた c DNA断片を組み込んだ。 得られた組換えプラスミド DNA をエタノール沈殿後、 TE緩衝液 （1 OmM Tr i s— HC 1， pH8. 0、 1 mM EDTA) 20 lに溶解し、 エレクトロポレーシヨン法 CNu c 1 e i c Ac i d Re s e a r c h, 16, 6127 (1988) 〕 により、 E l e c t r oMAX DH10B (商品名、 インピトロジェン社製） に導入して、 形質転換 体を作製した。
形質転換体を S. O. C. 培地 （インビトロジェン社製） 1ml中、 37でで 1時間培養し、 100 gZmlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布し、 3 7でで一晩培養した。 その結果、 cDNAライブラリ一として約 1000万個 （挿 入率 95%) のアンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。 得られた形質転換 体のコロニー約 20000個から、 PCR法により c DNA断片を調製した。 得ら れた c DNA断片は、 DYEn am i c ET Dy e Te rm i n a t o r K i t (Me g aBACE) (商品名、 アマシャムバイオサイエンス社製） を用 い、 添付のマニュアルに従って、 Me g a BACE 500 DNA An a 1 y s i s Sy s t em (商品名、 アマシャムバイオサイエンス社製） により cD NA断片の全塩基配列を決定した。 cDNAの配列情報を、 CH I PS p a c e (商品名、 日立ソフトウェアエンジニアリング社製） を用いて解析することによ り、 重複のない約 5000種類の c DNAクローンを選択した。 これらのクローン を DN Aチッフ作製システム M i c r 0 a r r a y Sy s t em Ge n e r a t i o n I I I S p o t t e r (商品名、 Mo l e c u l a r D y n a m i c s社製） を用いて， Typ e 7スライドグラス （商品名、 アマシャム バイ ォサイエンス社製） にスポットして DN Aチップを作製した。
この DNAチップを用いて、 糖尿病モデル Z u c k e r F a t t y ラット
〔J. He r e d, 52， 275 - 278 (1961) 〕 での遺伝子発現変動解析 を実施した。 30%食餌制限と週 5日間運動とを実施した Zu c ke r F a t t y ラットから、 骨格筋を摘出した。 得られた骨格筋から、 TR I z o 1 R e a e n t (商品名、 インビトロジェン社製） を用い、 添付のマニュアルに従つ て全 RNAを調製した。 得られた全 RNAを、 Qu i c kP r e p M i c r o mRNA Pu r i f i c a t i on K i t (商品名、 アマシャムバイオサイ エンス社製） を用い、 添付のマニュアルにしたがって、 p o l y (A) +RNA を精製し、 この p o l y (A) +RNAを用いてプローブを作製した。 p o l y
(A) +RNA 0. 5 gをサンプルとし用い、 R a n d om 9me r、 o 1 i g o (d T) p r i me rをァニールさせた後、 S u p e r S c r i p t
(登録商標） I I RT (インビトロジェン社製） を用いて Cy— 3 dCT P又は Cy— 5 dCTP (アマシャムバイオサイエンス社製） を取り込ませ c DNAを蛍光標識した。 さらに、 GFX PCR DNA a nd Ge l B and Pu r i f i c a t i on K i t (商品名、 アマシャムバイオサイエ ンス社製） を用いて標識 c DN Aを精製し、 プローブとして用いた。 プローブは、 Au t oma t e d S l i d e P r o c e s s o r (商品名、 アマシャム ノ ィォサイエンス社製） を用いて DN Aチップとのハイブリダィゼーシヨンを実施し た。 ハイブリダィゼーシヨンは、 Type 7スライドのプロトコールに従い、 前 処理の後にプローブと 48 で 12時間行った。 バッファーには Hvb r i d i z a t on Bu f f e r Ve r. 2 (商品名、 アマシャムバイオサインス社製） を用いた。 洗浄後、 M i c r o a r r ay S y s t em Ge n e r a t i o n I I I S c ann e r (商品名、 Mo l e c u l a r Dyn am i c s 社製） により読み取りを行ない、 解析コンピューターソフト 〔商品名： A r r a y V i s i o n (Mo l e c u l a r Dyn am i c s社製） 及び商品名： Ge n e S p r i n g (シリコンジエネテックス社製） 〕 を用いてデータ解析を 実施した。 その結果、 ラット骨格筋において、 コントロールと比較して食餌制限と 運動により発現量の減少が認められた遺伝子として Re V— e r bAaが見出され た。
その結果、 インスリン抵抗性糖尿病により、 ォ一ファン核内受容体である Re V— e r bAa遺伝子の発現が増加していることがわかった。 さらに、 ②の食餌 制限群及び③の食餌制限 +運動負荷群において、 ィンスリン抵抗性改善処置によ り、 改善前 （対照群） に比べ、 ォーファン核内受容体である R e V— e r b Αα 遺伝子の発現が約 1 10に減少することがわかった。 また、 インスリン抵抗性 改善薬物であるピオダリ夕ゾンによっては、 R e V— e r b Aひ遺伝子の発現に 変化は認められなかった。
以上の結果より、 Re V— e r bAaの発現を指標として、 糖尿病が診断でき ることが示唆される。 実施例 2 糖尿病モデルラットにおける Re V— e r bAa mRNAの発現
Re v— e r bAひは、 骨格筋における発現量が多いことが知られている。 し たがって、 前記①〜③の各処理群について、 RT— PCRにより、 Z uc k e r f a t t y r a tの骨格筋における R e v - e r b A α遺伝子の発現プロファ ィルを調べた。
なお、 RT— PCRには、 配列番号： 37と 38とのプライマー対、 配列番 号： 39と 40とのプライマー対を用いた。 対照として、 対照群の mRNA及び 未処理の骨格筋由来の mRNAを用いた。 具体的には、 30%食餌制限と週 5日 間運動を実施したラットの骨格筋、 及び脂肪組織より、 インビトロジェン社製の TR I z o 1試薬 （商品名） を用いて、 添付マニュアルに従い、 全 RNAを抽出 し、 50 gの全 RNAを得た。 この RNAをキアジェン （Q I AGEN) 社製 の商品名： RNe a s y mi n i k i tにて添付マニュアルに従い D N a s e I処理した後、 回収した。 得られた全 RNA 2 gより RT— PCR用 S u p e r S c r i p t (登録商標） F i r s t— s t r and Syn t h e s i s S y s t em (商品名、 インビトロジェン社製） を用いて添付マ二ユア ルに従い、 c DNAを合成した。 次に、 ラット Re v— e r bAa (Ge nB a n kァクセッション番号： M25804) の配列をもとにプローブ検索ソフト P r ime r Exp r e s s (商品名、 A B I社製） によりリアルタイム定量 P CR用プライマ一を選択した。 プライマ一は、 キアジェン （Q I AGEN) 社に 合成を依頼した。 このプライマーを用いて、 合成した c DNAを铸型として S Y BR Gr e e n Iによるリアルタイム定量 P C Rを行ない、 mR N A量を定 量した。
反応試薬としては、 キアジェン社の商品名： Qu an t i Te c t SYBR Gr e e n PCR k i tを使用し、 95でで 15分間反応した後、 94でで 30秒、 60 で 30秒、 72 で 1分の反応を 40サイクル行なって定量した。 P CR、 及び蛍光測定は、 AB I社の AB I PR I SM 7000 S e q u e n c e De t e c t i on Sy s t em (商品名） を用いてにて行なった。 その結果、 糖尿病ラット骨格筋 （第 1図） 、 及び脂肪組織 （第 2図） において、 食餌制限と運動によりインスリン抵抗性が改善されると Re V— e r bAaの発 現が減少することが確認された。 第 1図、 第 2図のグラフは、 Zu c k e r L e a n ラットにおける発現量を 1とした相対量で示している。 なお、 リアル夕 ィム定量 PC Rでは、 増幅産物の電気泳動と融解曲線を作製することにより目的 の一種類のみ増幅されていることを確認した。 その結果、 第 1図及び第 2図に示すように、 ②の食餌制限群及び③の食餌制限 +運動負荷群において、 インスリン抵抗性の改善により、 改善前 （対照群） に比 ベ、 ォーファン核内受容体である R e V - e r b A α遺伝子の発現が約 1 Z 10 に減少することがわかつた。
以上の結果より、 Re V— e r bAaの発現を指標として、 糖尿病が診断でき ることが示唆される。 実施例 3 ヒト正常組織における Re V— e r bAa mRNAの発現
ヒト Re v— e r bAa (Ge nB a n kァクセッション番号： X 72631) の配列をもとに、 実施例 2と同様の手法によりリアルタイム定量 PC R用プライマ 一を設計し、 合成した。 このプライマ一を用い、 Human MTC P ane l I (商品名、 クローンテック社製） を铸型として SYBR G r e e n Iによ るリアルタイム定量 PC Rを行なった。 反応試薬、 及び反応条件は実施例 2と同 様とし、 反応後、 増幅産物の電気泳動と融解曲線を作製することにより目的の一 種類のみ増幅されていることを確認した。 その結果、 R e V— e r b Ααの mR NAは、 発現量の大きい順に骨格筋、 滕臓、 脳、 心臓であることが観察された (第 3図） 。 第 3図のグラフは、 ヒト脳での発現を 1とした相対量で示している。 実施例 4 ヒト Re V— e r bAa発現細胞株の樹立
Ge nB an kァクセッション番号： X 72631の塩基配列に基づき、 Hu man Ad i p o c y t e Ma r a t hon— Re a dy cDNA (商品 名、 クローンテック社製） より、 ヒト Re v_e r bAひ cDNA全長を PCR により増幅し、 PCR— B 1 un t I I— TOPOベクター （商品名、 インビトロ ジェン社） へクローニングした。
前記クローンの塩基配列を確認した後、 BamH Iと Xb a Iとで cDNA全長 を切りだし、 p 3 xFLAG— CMV— 7. 1ベクター （商品名、 シグマ社製） の B 1 I Iと Xb a Iの制限酵素サイトへクローニングして、 発現べクタ一を得た。 この発現ベクターを L 6細胞に導入し、 Re V— e r b A αを安定的に発現する細 胞を取得した。 発現べクタ一を導入した細胞におけるヒト Re v— e r bAaの発 現は抗 FLAG抗体を用いたウェスタンプロット法により検出した （第 4図） 。 全 細胞抽出液を SDS—PAGEに供した後、 Immob i l on Tr an s f e r Memb r an e s (商品名、 ミリポア社製） に転写した。 このメンブランを 5%スキムミルク、 PBS中で室温、 1時間ブロッキング処理した後、 P e r ox i d a s e— c on j ug a t e d An t i—FLAG抗体 （シグマ社製） を加 え、 さらに 1時間室温でインキュベートした。 インキュベート後、 メンブランを 0. 1 % Twe e n— P B Sで洗浄し、 ECL + p l u s We s t e r n B i o t t i n g De t e c t i on S y s t e m 〔商品名、 アマシャムバイオサイ ェンシ一ズ （Ame r s h am B i o s c i e nc e s) 社製〕 を用いて発色さ せ、 Hyp e r f i lm ECL 〔商品名、 アマシャムバイオサイエンシーズ社 製〕 に露光した。 実施例 5 ヒト Re v— e r b A α発現細胞株におけるグルコース取りこみ活性 の測定
実施例 4により得られたヒト Re v_e r b Aひ発現細胞株を用いてグルコース 取りこみ活性の測定を行なった。 Cy t oS t a r— T p l a t e (商品名、 ァ マシャムバイオサイエンシーズ社製） に、 細胞を 2 X 104細胞ノウエルで捲いた 後、 C02インキュベータ一で 37 ：、 一晩培養した。 この細胞を 300 1の PBS (―) で 3 回洗浄した後、 80 1の HE PES— K r e b sバッファ — 〔組成： 1 19mM N a C 1 , 4. 75mM KC 1 , 5 mM N aHCO 3, 2. 54mM C a C 1 z · 2 H20, 1. 2mM Mg S 04, 20 mM H E P E S · 7H20(pH7. 4)〕 を添加した。 続いて 3 Mのインスリンを 1 0 1、 及び 2 -DEOXY-D- 〔U— I4C〕 G l u c o s e溶液 （アマシャ W ムバイオサイエンシーズ社製）を 10 1添加後、 軽く混和して、 co2インキュ ベータ一で 37で、 20分間インキュベートした。 インキュベート後、 100 Mの C y t o c h a 1 a s i n Bを 10 1添加し、 商品名： 1450 M I CRO BETA TR I LUX (商品名、 パーキンエルマ一社製） で測定した。 この結果、 R e V— e r b Αα強制発現細胞では、 コントロール細胞と比較して インスリン濃度非依存的にグルコース取りこみ能が低下していることが観察された。 アツセィに使用したサンプルは、 商品名： Cy QUANT C e l l P r o l i f e r a t i o n A s s ay K i t 〔モレキユラ一プローブ (Molecular Probes)社製〕 により測定した DNA量で補正し、 その結果を図に示した。
なお、 細胞の培養については、 10 % f e t a l b o v i n e s e r u mと l xAn t i Cl O O xAn t i b i o t i c -An t imy c o t i c (商品名） 、 インビトロジェン社製〕 を加えた α— MEMを培地として使用し、 70 - 80 %コンフルェントに達した時点でトリプシンを使用して細胞を回収し、 1 10— 1Z20希釈して、 継代する条件で行なった。
その結果、 第 5図に示すように、 R e V— e r b Aひの強制発現により、 グル コース取り込み能が低下することがわかった。 したがって、 Re v— e r bAa の発現の増加が、 糖尿病の病態に関連することが示唆された。 実施例 6
前記実施例の結果より、 R e V— e r bAo!の発現の阻害を指標として、 糖尿 病の治療又は予防に有効な候補化合物をスクリーニングできる可能性が示唆され た。 そこで、 R e V— e r b Ααレポーターアツセィ系を構築した。
R e V— e r b A α結合配列 〔P r o c . N a t l . Ac a d. S c に ， 93, 3553 - 3558 (1 996) 〕 を有するオリゴヌクレオチド (配列番号： 52及び 53) をァ二一リングさせた後、 商品名： pGL 3— P r omo t e r v e c t o r 〔プロメガ （P r ome g a) 社製〕 の B g 1 I I部位に挿入し、 レポーター遺伝子とした。
このレポーター遺伝子を、 前記実施例 4で示した Re V - e r bAa発現べク 夕一と同時に L 6細胞に導入し、 レポーター遺伝子の転写活性を、 ピツカジーン デュアルシーパンジーキット （東洋インキ製造株式会社製） を用いて測定した。 測定結果を第 6図に示す。
その結果、 第 6図に示されるように、 L 6細胞では R e V— e r b Ααの強制 発現によりレポーター遺伝子の転写活性が 1 / 8に低下した。
したがって、 上記のレポーター遺伝子の転写活性を指標にして Re V— e r b A a機能阻害剤をスクリーニングすることが可能である。 実施例 7 Re V— e r bAo!発現阻害剤のスクリーニング系
前記実施例 2の結果より、 R e V— e r bAaの発現の阻害を指標として、 糖 尿病の治療又は予防に有効な候補化合物をスクリーニングできる可能性が示唆さ れた。 そこで、 R e V— e r bAaプロモーターを利用したレポーターアツセィ 系を構築した。 Human g e n om i c DNAから、 P r o c. Na t 1. Ac ad. S c i . , 93, 35 53- 3558 (1 996) で同定さ れた R e v— e r b A aのプロモーター領域 （約 1. 7 k b) を PC Rクロ一二 ングした。 使用したプライマ一を配列番号： 58及び 59に示す。
得られた断片を商品名： pGL 3— B a s i c v e c t o r 〔プロメガ （P r ome g a) 社製〕 の Sma I部位に挿入し、 レポ一夕一遺伝子とした。 このレポ一ター遺伝子を前記実施例 4で示した R e V— e r b Aひ発現べクタ —と同時に L 6細胞に導入し、 レポ一ター活性を、 商品名： ピツカジーンデュア ルシ一パンジーキット （東洋インキ製造株式会社製） にて測定した。
Re v— e r bAaは、 自身のプロモーター領域に結合してその転写を抑制す ることが知られている 〔P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . ， 93: 3553 - 3558 ( 1996) 〕 。 そこで、 Re v— e r bAaの転写抑制機能を有するデキサメサゾン 〔End o c r i no l o gy, 141， 3799— 3806 (2000) を Ι Ο ηΜ の濃度で培地に添加した場合のレポーター遺伝子の転写活性も同時に測定した。 測定結果を第 7図に示す。
その結果、 第 7図に示されるように、 L 6細胞では、 1 6 ¥— 6 1" 13八ひの強 制発現によりレポ一夕一遺伝子の転写活性が 1 / 5に低下した。 またデキサメサ ゾンの添加では 1 / 2にレポ一夕一遺伝子の転写活性が低下した。 したがって、 このレポーター遺伝子の転写活性を指標にして R e v-e r bAa発現阻害剤を スクリーニングすることが可能である。 実施例 8 RNA iによる R e v- e r b A α発現抑制下でのグルコース取り込 み能の測定
G e n B a n kァクセッション番号： NM— 145775の塩基配列に基づき、 ラット R e V— e r b A αの発現を抑制するための s i RNA領域を選択した。 前記領域に相当する 4種のオリゴヌクレオチド （配列番号： 54〜57) を合成 した。 合成されたオリゴヌクレオチド （配列番号： 54と 5 5との対、 配列番 号： 56と 57との対） をアニーリングさせ、 得られた二本鎖核酸を商品名： p S i 1 e n c e r 2. 1 -U 6 Hyg r o v e c t o r 〔アンビオン （Am b i on) 社製〕 に挿入し、 発現べクタ一を得た。
得られた発現ベクターを、 L 6細胞に導入し、 R e V— e r bAo!に対する s i RNAを安定的に発現する細胞を取得した。
得られた細胞での R e v-e r bAaの発現量を実施例 2と同様の方法により測 定した。 結果を第 8図に示す。
その結果、 第 8図に示されるように、 対照の細胞と比較して、 Re v— e r b A(¾の mRNA量は、 1/3に低下していた。
また、 この細胞を用いて、 実施例 5と同様の方法にてグルコース取り込み量を 測定した。 結果を第 9図に示す。
その結果、 第 9図に示されるように、 R e V— e r bAaの発現を抑制すると インスリンによるグルコース取り込みの活性化がおよそ 2倍に上昇していた。 したがって、 R e V— e r bAaの発現の抑制が、 糖尿病の病態改善に関連す ることが示唆された。 実施例 9 R e V - e r b A α発現阻害剤のスクリーニング系
配列番号： 61に示される R I Ρ 140のプロモ一夕一の断片を商品名： pG L 3— B a s i c v e c t o r 〔プロメガ （P r ome g a) 社製〕 の Sma I部位に挿入し、 プラスミドを得る。 得られたプラスミドを L 6細胞に導入し、 R e V— e r bファミリー核内受容体と RNAポリメラーゼ複合体とを機能的に 共役させうる核内因子のプロモータ一の機能阻害を介した R e v— e r bAo;機 能阻害剤のスクリーニング系として用いるための細胞を得る。 得られた細胞を、 被検物質を含む培地で一定時間培養し、 レポーター活性を、 商品名： ピツカジー ンデュアルシーパンジーキット （東洋インキ製造株式会社製） にて測定する。 その結果、 レポ一夕一遺伝子の転写活性の減少を指標として、 Re v— e r b ファミリー核内受容体と RNAポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核 内因子のプロモー夕一の機能阻害を介した R e V— e r b Aひ機能阻害剤の候補 化合物をスクリーニングすることが可能である。 配列表フリーテキスト
配列番号： 10は、 ラット R e V - e r b増幅用フォワードプライマーの配列 を示す。
配列番号： 1 1は、 ラット R e V— e r b増幅用リバースプライマーの配列を 示す。
配列番号： 12は、 ヒト R e V— e r b増幅用フォワードプライマーの配列を 示す。
配列番号： 1 3は、 ヒト R e v— e r b増幅用リバースプライマーの配列を示 す。
配列番号： 1 4は、 R e V— e r b応答性ェレメントの配列を示す。
配列番号： 1 5は、 R e v— e r b応答性エレメントの配列を示す。
配列番号： 1 6は、 R e v— e r b応答性ェレメントの配列を示す。
配列番号： 1 7は、 P C Rフォヮ一ドプライマ一 1の配列を示す。
配列番号： 1 8は、 P C Rリバースプライマー 1の配列を示す。
配列番号： 1 9は、 P C Rフォヮ一ドプライマ一 2の配列を示す。
配列番号： 2 0は、 P C Rリバースプライマー 2の配列を示す。
配列番号： 2 1は、 P C Rフォヮ一ドプライマ一 3の配列を示す。
配列番号： 2 2は、 P C Rリバ一スプライマ一 3の配列を示す。
配列番号： 2 3は、 P C Rフォヮ一ドプライマ一 4の配列を示す。
配列番号： 2 4は、 P C Rリバ一スプライマ一 4の配列を示す。
配列番号： 2 5は、 P C Rフォヮ —ドプライマ —5の配列を示す。
配列番号： 2 6は、 P C Rリバースプライマー 5の配列を示す。
配列番号： 2 7は、 P C Rフォヮ一ドプライマ —6の配列を示す。
配列番号： 2 8は、 P C Rリバ一スプライマ一 6の配列を示す。
配列番号： 2 9は、 P C Rフォヮ一ドプライマ一 7の配列を示す。
配列番号： 3 0は、 P C Rリバ一スプライマー 7の配列を示す。
配列番号： 3 1は、 P C Rフォヮ一ドプライマ一 8の配列を示す。
配列番号： 3 2は、 P C Rリバ一スプライマー 8の配列を示す。
配列番号： 3 3は、 P C Rフォヮ一ドプライマ一 9の配列を示す。
配列番号： 3 4は、 P C Rリバースプライマー 9の配列を示す。
配列番号： 3 5は、 P C Rフォヮ一ドプライマ ― 1 0の配列を示す。
配列番号： 3 6は、 P C Rリバースプライマ— 1 0の配列を示す。 配列番号： 37は、 RT- P CRフォヮ一ドプライマ一 1の配列を示す。 配列番号： 38は、 RT- P CRリバースプライマ一 1の配列を示す。
配列番号： 39は、 RT- P CRフォヮ一ドプライマ一 2の配列を示す。 配列番号： 40は、 RT- P CRリバースプライマ一 2の配列を示す。
配列番号： 41は、 R e V ― e r b Ααの検出用プロ —ブ （B g 1 I I— B g
1 I I領域） の配列を示す。
配列番号： 42は、 Re v ― e r b A aの検出用プローブ （Xh o I - Sma
I領域） の配列を示す。
配列番号： 43は、 Re v— e r b A αの検出用プローブ （Ec oR I—終止 コドン領域） の配列を示す。
配列番号： 44は、 Re v— e r b A αの検出用プローブ （783位 _E c ο R I領域） の配列を示す。
配列番号： 45は、 R e V— e r bAaの検出用プローブ （全長〇RF) の配 列を示す。
配列番号： 46は、 R e v— e r b A αの検出用プローブ （5 ' 非コード領 域） の配列を示す。
配列番号： 47は、 R e V— e r b A o;の検出用プローブ （開始コドン— E c oR I領域） の配列を示す。
配列番号： 48は、 Re v_e r b A αの検出用プローブ （Xho I - Sm a I領域） の配列を示す。
配列番号： 49は、 R e V— e r bAaの検出用プローブ （PCR断片） の配 列を示す。
配列番号： 50は、 R e v_ e r b Αθ!の検出用プローブ （PCR断片） の配 列を示す。
配列番号： 51は、 R e V— e r b Ααの検出用プローブ （PCR断片） の配 列を示す。 配列番号： 52は、 R e V— e r bAa結合配列 （フォワード） の配列を示す。 配列番号： 5 3は、 R e V— e r bAa結合配列 （リバース） の配列を示す。 配列番号： 5 4は、 s i RNA標的領域を含有した配列 （フォワード） を示す。 配列番号： 5 5は、 s i RNA標的領域を含有した配列 （リバース） を示す。 配列番号： 5 6は、 s i RNA標的領域を含有した配列 （フォワード） を示す。 配列番号： 5 7は、 s i RNA標的領域を含有した配列 （リバース） を示す。 配列番号： 5 8は、 プロモーター領域を増幅するためのフォワードプライマー の配列を示す。
配列番号： 5 9は、 プロモータ一領域を増幅するためのリバースプライマーの 配列を示す。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 糖尿病、 具体的には、 I I型糖尿病、 特に、 Re v— e r b ファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、 例えば、 Re v— e r bAひの 機能に関連して発症する糖尿病に対して、 該 Re V— e r bファミリー核内受容 体又はそれに関連する因子、 例えば、 Re v_e r bAaの機能に対する作用機 序に基づく治療又は予防効果を呈しうる治療剤又は予防剤の候補化合物、 前記糖 尿病に対する治療又は予防剤の薬理評価及び糖尿病の治療又は予防手段への応用 が可能になる。

Claims

請求の範囲
1. 被検物質の存在下、 下記 （1) 〜 （5) ：
(1) Re v— e r bファミリ一核内受容体、
(2) R e V - e r bファミリー核内受容体の応答性エレメント、
(3) R e V - e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子、
(4) Re v_e r bファミリ一核内受容体のプロモータ一、 及び
(5) Re v— e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子の動態を測定又は検出して、 糖尿 病治療剤又は予防剤の候補化合物を得ることを特徵とする、 糖尿病治療剤又は予 防剤のスクリーニング方法。
2. 該糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物が、
(1) Re v— e r bファミリ一核内受容体、 又は
(3) Re v— e r bファミリ一核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子
の発現を抑制する化合物又はその塩である、 請求項 1記載の方法。
3. 該糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物が、
(1) Re v— e r bファミリ一核内受容体、
(2) Re v— e r bファミリー核内受容体の応答性エレメント、
(3) R e V - e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子、
(4) R e V— e r bファミリー核内受容体のプロモー夕一、 及び (5) Re v-e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子の機能を阻害する化合物又はその 塩である、 請求項 1記載の方法。
4. 該 Re v— e r bが、 ヒト R e v— e r b A αである、 請求項 1記載の方 法。
5. (I) 該因子と、 被検物質とを接触させるステップ、 及び
(II) 前記ステップ （ I ) の後、 該因子と被検物質との結合を検出し、 それに より、 該因子と結合する被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物とし て選択するステップ
を含む、 請求項 1記載の方法。
6. (a) I) Re v— e r bファミリー核内受容体に対する応答性エレメン 卜と、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、 該応答性エレメントの下流及び支配下に、 該プロモーターと該レポ一夕 —遺伝子とが動作可能に連結し、 かつ該プロモーターの下流及び支配下に、 該レ ポー夕一遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物と、
Π) 該 （1) の核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物と を、 細胞に導入して発現させるステップ、
(b) 前記ステップ （a) で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、 並びに
(c) 前記ステップ （b) で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の 有無を検出又は発現の変動を測定し、 それにより、 該レポーター遺伝子の発現の 存在又は発現の増加をもたらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合 物として選択するステップ
を含む、 請求項 1記載の方法。
7. (A) 内在的に Re V— e r bファミリー核内受容体を発現している細胞 と被検物質とを接触させるステップ、 及び
(B) 前記ステップ （A) で得られた細胞における該 R e V— e r bファミリー 核内受容体の発現の変動を測定し、 それにより、 該核内受容体の発現の減少をも たらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステツ プ
を含む、 請求項 1記載の方法。
8. (Α' ) 内在的に R e v_ e r bファミリー核内受容体と RNAポリメラ —ゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子を発現している細胞と被検物質と を接触させるステップ、 及び
(Β' ) 前記ステップ （Α' ) で得られた細胞における該 R e v— e r bフアミ リー核内受容体と RN Aポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子 の発現の変動を検出し、 それにより、 該核内因子の発現の減少をもたらす被検物 質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、 請求項 1記載の方法。
9. (a) R e V— e r bファミリー核内受容体プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、 該プロモーターの下流及び支配下に、 該レポーター遺伝子が動作可能に 連結したものである核酸構築物を、 細胞に導入して発現させるステップ、 (b) 前記ステップ （a) で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、 並びに
(c) 前記ステップ （b) で得られた細胞における該レポ一ター遺伝子の発現の 有無を検出又は発現の変動を測定し、 それにより、 該レポーター遺伝子の発現の 存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合 物として選択するステップ
を含む、 請求項 1記載の方法。
10. (a' ) Re v_e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラーゼ複 合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモー夕一と、
レポ一夕一遺伝子と
を含み、 該プロモーターの下流及び支配下に、 該レポ一ター遺伝子が動作可能に 連結したものである核酸構築物を、 細胞に導入して発現させるステップ、
(b' ) 前記ステップ （a' ) で得られた細胞と被検物質とを接触させるステツ プ、 並びに
(c ' ) 前記ステップ （b' ) で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発 現の有無を検出又は発現の変動を測定し、 それにより、 該レポーター遺伝子の発 現の存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、 糖尿病治療剤又は予防剤の候補 化合物として選択するステップ
を含む、 請求項 1記載の方法。
1 1. 請求項 5記載の方法に用いるためのキットであり、 かつ下記 （1) 〜 (5) ：
(1) Re v_e r bファミリ一核内受容体、
(2) R e V - e r bファミリ一核内受容体の応答性エレメント、
(3) Re v-e r bファミリー核内受容体と RN Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子、
(4) R e V— e r bファミリー核内受容体のプロモーター、 及び
(5) R e V - e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子を含有してなる、 該因子に結合す る化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
12. 請求項 6記載の方法に用いるためのキットであり、
I ) R e V - e r bファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、 プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、 該応答性エレメントの下流及び支配下に、 該プロモーターと該レポ一夕 —遺伝子とが動作可能に連結し、 かつ該プロモーターの下流及び支配下に、 該レ ポー夕一遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物、 及び
II) R e V - e r bファミリー核内受容体をコードする核酸を含有した発現用 核酸構築物
を含有してなる、 該因子の機能を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用 キッ卜。
13. 請求項 7又は 8記載の方法に用いるためのキットであり、
(1) Re v— e r bファミリ一核内受容体、 又は
(3) Re V— e r bファミリー核内受容体と RNAポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子に対する抗体又はその断片を含有してなる、 該因子 の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。 請求項 7又は 8記載の方法に用いるためのキットであり、 (1) Re v_e r bファミリ一核内受容体、 又は
(3) Re V— e r bファミリー核内受容体と R N Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子
を内在的に発現している細胞を含有してなる、 該因子の発現を調節する化合物又 はその塩のスクリーニング用キット。
1 5. 請求項 9又は 10記載の方法のためのキットであり、
R e V - e r bフアミリー核内受容体プロモータ一、 又は R e v— e r bフアミ リー核内受容体と RN Aポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子 のプロモーターと、
レポ一夕一遺伝子と
を含み、 該プロモーターの下流及び支配下に、 該レポーター遺伝子が動作可能に 連結したものである核酸構築物
を含有してなる、 該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用 キット。
16. I) (1) Re V— e r bファミリ一核内受容体、 若しくは
(3) R e V - e r bファミリ一核内受容体と RN Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子
の発現を抑制する化合物又はその塩、 あるいは
II) (1) R e V— e r bファミリー核内受容体、
(2) Re V— e r bファミリー核内受容体の応答性エレメント、
(3) Re V— e r bファミリー核内受容体と RN Aポリメラーゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子、
(4) Re v— e r bファミリー核内受容体のプロモ一夕一、 及び
(5) Re v— e r bファミリ一核内受容体と RN Aポリメラ一ゼ複合体とを機 能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも 1つの因子の機能を阻害する化合物又はその を有効成分として含有してなる、 糖尿病の治療又は予防に用いる医薬組成物。
17. 該化合物が、 s i RNA又は該 s i RNAを発現するべクタ一である、 請求項 16記載の医薬組成物。
18. 該 s i RNAが、 配列番号： 54〜57のいずれかに示される塩基配列 に対応する核酸である、 請求項 17記載の医薬組成物。
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