JP4468304B2 - スクリーニング方法 - Google Patents
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Description
一方、リラキシン−3は脳内の橋と呼ばれる領域に存在することが報告されており(非特許文献6)、リラキシン−3が脳内ペプチドとして中枢性に何らかの機能を発揮している可能性は考えられていたが、これまでにリラキシン−3が摂食を調節するか否かについても、リラキシン−3が体重調節に関与するか否かについても報告されていなかった。また、リラキシン−3が肥満と関連するかについても知られていなかった。
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩を含有してなる摂食亢進剤。
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩を含有してなる体重増加剤。
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩を含有してなる脂肪量増加剤。
(4)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(5)次の工程;
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(6)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記(5)に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(7)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記(4)〜(6)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
(8)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記(7)に記載のスクリーニング方法。
(9)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニングキット。
(10)次の工程;
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニングキット。
(11)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記(10)に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニングキット。
(12)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記(9)〜(11)のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。
(13)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記(12)に記載のスクリーニングキット。
(14)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩を含有してなる体重増加を必要とする疾患の治療剤。
(15)疾患が拒食症または悪疫質である前記(14)に記載の治療剤。
(16)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(17)次の工程;
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(18)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記(17)に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(19)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記(16)〜(18)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
(20)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記(19)に記載のスクリーニング方法。
(21)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングキット。
(22)次の工程;
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニングキット。
(23)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記(22)に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニングキット。
(24)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記(21)〜(23)のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。
(25)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記(24)に記載のスクリーニングキット。
(26)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(27)次の工程;
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(28)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記(27)に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(29)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記(26)〜(28)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
(30)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記(29)に記載のスクリーニング方法。
(31)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニングキット。
(32)次の工程;
配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニングキット。
(33)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする前記(32)に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニングキット。
(34)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記(31)〜(33)のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。
(35)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記(34)に記載のスクリーニングキット。
(36)SALPR阻害作用を有する化合物を含有する摂食抑制剤。
(37)SALPR阻害作用を有する化合物が、前記(7)または(8)に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記(36)に記載の剤。
(38)SALPR阻害作用を有する化合物を含有する体重減少剤。
(39)SALPR阻害作用を有する化合物が、前記(19)または(20)に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記(38)に記載の剤。
(40)SALPR阻害作用を有する化合物を含有する脂肪量減少剤。
(41)SALPR阻害作用を有する化合物が、前記(29)または(30)に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記(40)に記載の剤。
(42)SALPR阻害作用を有する化合物を含有する肥満治療剤。
(43)SALPR阻害作用を有する化合物が、前記(19)、(20)、(29)または(30)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記(42)に記載の剤。
(44)SALPR阻害作用を有する化合物を含有する糖尿病治療剤。
(45)SALPR阻害作用を有する化合物が、前記(19)、(20)、(29)または(30)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記(44)に記載の剤。
(46)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記(36)〜(45)のいずれか一項に記載の剤。
(47)リラキシン−3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の摂食量を測定する工程を含むことを特徴とする、摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(48)リラキシン−3受容体に作用する化合物が、前記(4)〜(8)のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記(47)に記載の方法。
(49)リラキシン−3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の体重を測定する工程を含むことを特徴とする、体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(50)リラキシン−3受容体に作用する化合物が、前記(16)〜(20)のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記(49)に記載の方法。
(51)リラキシン−3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の肥満の指標を測定する工程を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。
(52)リラキシン−3受容体に作用する化合物が、前記(26)〜(30)のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記(51)に記載の方法。
などに関する。
本発明で使用する「リラキシン−3」とは、遺伝子配列のデータベースから新たに同定されたリラキシン−3(Relaxin−3)(INSL7(GenBankアクセッション番号NM_080864)とも称されている。)と称せられているポリペプチドであり(J. Biol. Chem. 277, 1148−1157(2002))、(i)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。また、リラキシン−3には、(ii)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、(iii)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる相同ポリペプチドが含まれる。本発明に使用するリラキシン−3としては、「配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。なお、前記ポリペプチドには、ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。
ここで、欠失、置換、挿入および/または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物[例えば非ヒト哺乳動物(例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]由来のリラキシン−3もしくはその変異体が含まれる。
本発明に使用するリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、DNAおよびRNAの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の(a)〜(e)からなる群より選択されるものが挙げられる。
(a)配列番号1で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド;
(b)「配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(c)「配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記のリラキシン−3と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(d)「配列番号2で表されるアミノ酸配列の1または複数個(好ましくは1または数個)の箇所において、1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のリラキシン−3と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;および
(e)「配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のリラキシン−3と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
本発明に使用するリラキシン−3は、摂食亢進剤として食欲不振や摂食量が低下した栄養障害などの治療、体重増加剤、脂肪量増加剤として体重増加を必要とする疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン−3またはリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドの異常等に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症もしくは各種疾患の治療(例えば術中、術後)に伴い減少した摂食(もしくは食欲)および/または体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記各種疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患(例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など)、免疫機能調節に係る疾患(例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など)、摂食障害、拒食症、AIDS、癌、または悪液質などが挙げられる。好ましくは、拒食症、悪液質が挙げられる。
本願明細書における「塩」とは、本発明に係る化合物と塩を形成し、かつ薬学的に許容され得る塩であれば特に限定されないが、好ましくはハロゲン化水素酸塩(例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など)、無機酸塩(例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など)有機カルボン酸塩(例えば酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など)、有機スルホン酸塩(例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など)、アミノ酸塩(例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など)、四級アミン塩、アルカリ金属塩(例えばナトリウム塩、カリウム塩など)、アルカリ土類金属塩(マグネシウム塩、カルシウム塩など)などが挙げられ、当該「薬学的に許容され得る塩」として、より好ましくは塩酸塩、シュウ酸塩、などである。
この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量%の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物[例えば非ヒト哺乳動物(例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口(例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のリラキシン−3を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
本発明に使用するリラキシン−3に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明に使用するリラキシン−3と結合活性を有し、リラキシン−3受容体発現細胞の細胞刺激活性(例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosおよびc−junの誘導活性、アラキドン酸遊離など)を有するものを使用することができる。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、DNAおよびRNAの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の(a)〜(e)からなる群より選択されるものが挙げられる。
(a)配列番号3で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド;
(b)「配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(c)「配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(d)「配列番号4で表されるアミノ酸配列の1または複数個(好ましくは1または数個)の箇所において、1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;および
(e)「配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているCREは、細胞内のcAMPの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群(cAMP誘導性遺伝子)の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤(例えばFSK)をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のcAMPの濃度が上昇し、その結果、CREの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
被験物質の投与回数は1日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は1日から数週間にわたってもよい。
本発明に使用するリラキシン−3に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明に使用するリラキシン−3と結合活性を有し、リラキシン−3受容体発現細胞の細胞刺激活性(例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosおよびc−junの誘導活性、アラキドン酸遊離など)を有するものを使用することができる。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、DNAおよびRNAの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の(a)〜(e)からなる群より選択されるものが挙げられる。
(a)配列番号3で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド;
(b)「配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(c)「配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(d)「配列番号4で表されるアミノ酸配列の1または複数個(好ましくは1または数個)の箇所において、1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;および
(e)「配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているCREは、細胞内のcAMPの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群(cAMP誘導性遺伝子)の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤(例えばFSK)をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のcAMPの濃度が上昇し、その結果、CREの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
被験物質の投与回数は1日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は1日から数週間にわたってもよい。
本発明に使用するリラキシン−3に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明に使用するリラキシン−3と結合活性を有し、リラキシン−3受容体発現細胞の細胞刺激活性(例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosおよびc−junの誘導活性、アラキドン酸遊離など)を有するものを使用することができる。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、DNAおよびRNAの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の(a)〜(e)からなる群より選択されるものが挙げられる。
(a)配列番号3で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド;
(b)「配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(c)「配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(d)「配列番号4で表されるアミノ酸配列の1または複数個(好ましくは1または数個)の箇所において、1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;および
(e)「配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているCREは、細胞内のcAMPの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群(cAMP誘導性遺伝子)の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤(例えばFSK)をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のcAMPの濃度が上昇し、その結果、CREの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
被験物質の投与回数は1日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は1日から数週間にわたってもよい。
本発明のスクリーニングキットは、リラキシン−3受容体、好ましくはSALPRもしくは前記細胞膜画分(すなわち、SALPRを含有する細胞膜画分)、または前記細胞(すなわち、SALPRを含有する細胞)を含む。前記スクリーニングキットは、所望により、種々の試薬、例えば標識したリラキシン−3、非標識のリラキシン−3、結合反応用緩衝液、および/または洗浄用緩衝液、説明書、器具をさらに含むことができる。
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、摂食を促進もしくは抑制する化合物、体重を増加もしくは減少させる化合物、または肥満を促進もしくは抑制する化合物である。当該化合物は塩を形成してもよく、薬学的に許容し得る塩が挙げられる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物またはその塩は、摂食(もしくは食欲)調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン−3またはリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症または各種疾患の治療(例えば術中、術後)に伴い増加もしくは減少した摂食(もしくは食欲)および/または体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患(例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など)、免疫機能調節に係る疾患(例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など)、エネルギー代謝に係る疾患(例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症など)、AIDS、癌、または悪液質などが挙げられる。
本発明によるスクリーニング方法によって、リラキシン−3受容体、好ましくはSALPRまたはその部分ポリペプチドを介した細胞刺激活性、より具体的には、SALPRまたはその部分ポリペプチドに天然リガンドが結合すると引き起こされる細胞刺激活性(例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosおよびc−junの誘導活性、アラキドン酸遊離など)の阻害作用(SALPR阻害作用)を有する化合物が提供される。このような化合物を含有する薬剤として、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などが挙げられる。
本発明に使用するリラキシン−3(すなわち、リラキシン−3、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド)の活性を阻害する物質によれば、摂食亢進作用、体重増加作用、肥満作用を抑制または阻害することができる。そこで、リラキシン−3の発現を阻害するものは、リラキシン−3のin vivo、ex vivoおよびin vitroにおける摂食制御および体重制御に伴う機能(例えばエネルギー代謝調節、成長など)、肥満を制限するのに利用できる可能性がある。
当該物質は塩を形成してもよく、薬学的に許容し得る塩が挙げられる。従って、リラキシン−3(すなわち、リラキシン−3、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド)の活性を阻害する物質またはその塩は、摂食(もしくは食欲)調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン−3またはリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、疾患の発症または疾患の治療(例えば術中、術後)に伴い増加した摂食(もしくは食欲)および/または体重の減少を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患(例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など)、免疫機能調節に係る疾患(例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など)、またはエネルギー代謝に係る疾患(例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害など)などが挙げられる。好ましくは、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などとして使用することができる。
または、予め体外で、細胞に、本発明のアンチセンス核酸、リボザイムおよびsiRNAを発現するように作成された構築物を有するベクターを導入してもよい。得られた細胞を、例えば筋肉注射、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射等により患者の組織に注入する(ex vivo法)。使用細胞は、患者の細胞と異種または同種であってよいが、好ましくは同種、より好ましくは患者から採取した細胞である。
これらの投与量は、患者の体重、年齢、症状、投与形態等により変動するが、当業者であれば、必要に応じて適当な投与量を選択することができる。
本発明に使用するモノクローナル抗体は、免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、リラキシン−3(すなわち、リラキシン−3、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド)またはそれらの部分断片を用いることを除いて、それ自体公知の手段により得ることができる。例えば前記免疫用抗原を用いてマウスを免疫し、そのマウスから取得した脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞とを、細胞融合法(Nature,256,495(1975))、または電気細胞融合法(J.Immunol.Method,100,181−189(1987))を用いて細胞融合し、前記スクリーニング用抗原を用いてスクリーニングすることにより、本発明に使用するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
(a)疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること;
(b)疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること;
(c)疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
SALPRをコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号3で表される核酸配列を基にして、以下のように行った。配列番号3では1857塩基対が示されており、SALPRをコードする領域は、361番目から1770番目(1410塩基対,470アミノ酸残基)とされている(GenBank アクセッション番号NM_016568)。PCR(polymerase chain reaction)により遺伝子を単離するために、配列番号5および配列番号6で表されるPCRプライマーを常法に従い作製した。
pBabe Puro(Morgenstern, J.P. and Land, H. Nucleic Acids Res. vol.18 3587−3596(1990))(配列番号7)からSalIおよびClaIで切断することによりSV40 promoter−puro(r)領域を除き、末端をKlenow fragmentにより平滑化した。ここへpIREShyg(Clontech社)からNsiIおよびXbaIで切断することによりIRES−hyg(r)領域を切り出し、T4ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しpBabeXIHを得た。
前記実施例2に記載のレトロウイルス発現用プラスミドpBabeCLXIHを制限酵素HpaIで切断した。ここへ前記実施例1で得たpCR2.1−SALPRからEcoRVで切断することによりSALPRをコードするポリヌクレオチドを切り出し、T4ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しpBabeCL(SALPR)IHを得た(図1)。
2×106個の293−EBNA細胞(Invitrogen社)を10cmコラーゲンコートディッシュ(IWAKI社)でDMEM(Sigma社)−10% fetal bovine serum (FCS)−ペニシリン(penicillin) 100units/ml ストレプトマイシン(streptomycin) 100μg/ml(PS)(以下、「EBNA培養液」と称する)10mlを用いて培養した。翌日、pV−gp(pVPack−GP(Stratagene社)からNsiIおよびXbaIで切断することによりIRES−hisDを除きT4ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの)、pVPack−VSV−G(Stratagene社)、および実施例3で得たSALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド(pBabeCL(SALPR)IH)それぞれ3.3μgをリポフェクション試薬であるTransIT(Panvera社)を用いて、前記293−EBNA細胞にトランスフェクションした。その6〜12時間後にEBNA培養液を交換し、37℃で培養を続けた。
その上清を0.45μmのフィルター(Millipore社)でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして、さらにウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。
超遠心用チューブ50 Ultra−Clear Tubes(Beckman社)を70%エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約35mlを入れた。これを超遠心ローターSW28(Beckman社)に入れ、超遠心装置XL−90(Beckman社)を使って19,500rpm 100分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。1時間後、チューブ壁面に残った培養液約100μl程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。
(1)サイクリックAMP応答配列を含むレポーターDNAの作成
公表された論文(Durocher et al. Anal Biochem 2000 284(2):316−26)を参考にcAMPに応じた転写がみられるunitを以下のように構築した。
cAMP responsive element(CRE)を含むunitの作成のために、CREx2hb用として配列番号8および配列番号9、CREx2bp用として配列番号10および配列番号11で表されるオリゴDNAを常法に従い作成した。
それぞれの組合せからなるオリゴDNAを95℃に熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖DNA(CREx2hb、CREx2bp)を形成させた。CREx2hbをHindIII,BamHI、CREx2bpをBamHI,PstIで消化するとともに、pBluescriptIISK(+)(Stratagene社)をHindIII,PstIで消化した。消化したDNAを電気泳動して両端に制限酵素消化部位をもつDNAを精製した後、これら3つのDNA(CREx2hb、CREx2bp、pBluescriptIISK(+))を一度に連結し(ligation)、得られたプラスミドの配列を解析して、CRE4/pBluescriptIISKを作成した。
Human genomic DNA(Roche Diagostics社)を鋳型とし、配列番号12および配列番号13の組合せからなるPCRプライマーと、recombinant Taq polymerase(Takara社)を用いて(94℃ 30秒−55℃ 30秒−72℃ 1分)を35回繰り返すことによりPCRしたところ、264塩基対のDNA(配列番号14)が得られた。この264塩基対のDNAをPstIで消化するとともにCRE4/pBluescriptIISK(+)のPstIサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認してCRE4VIP/pBluescriptIISK(+)を作成した(図2A)。得られたCRE4VIP/pBluescriptIISK(+)からHindIIIとSmaIで消化した後、得られたCRE4VIPプロモーター断片の末端平滑化を行なった。
サイクリックAMP応答配列によりレポーター遺伝子PLAPが誘導されるレトロウイルスベクタープラスミドpBabeCLcre4vPdNNを用い、実施例4に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターをHEK293細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローン化して、PLAP誘導の反応性が最も良かったクローン(以下、「SE302細胞」と称する)を以下の実験に供した。
前記の実施例4で調製したレトロウイルスベクターによる細胞へのSALPR遺伝子導入を以下のように行った。
前記実施例5で構築した3×103個のSE302細胞を96well plate(旭テクノガラス社)にDMEM(SIGMA社)−10% fetal bovine serum (FCS)−PS(以下、「培養液」と称する)100μlを用いて培養した。翌日、実施例4で調製したレトロウイルスベクターを適宜希釈し、その100μlを培養液で調製したpolybrene(最終濃度8μg/ml)(別名 hexadimethrine bromide Sigma社)とともにSE302細胞に加えた。その翌日、培養液を500μg/mlのハイグロマイシン(Hygromycin)(Invitrogen社)含有の培養液200μlと交換し培養した。この条件で増殖してきたSALPR遺伝子導入SE302細胞(以下、「SALPR−SE302細胞」と称する)を適時継代して実験に供した。
前記実施例6で構築したSALPR−SE302細胞を、転写活性測定用培地(DMEM−10%FBS(65℃にて30分非働化)を加えたもの)にて縣濁した後、96 well plate(Beckton Dickison社)に1穴あたり1×104細胞となるようにまいた。翌日、アッセイ用培地(DMEMに0.1%ウシ血清アルブミンを加えたもの)で希釈した各濃度のリラキシン−3(Relaxin−3)(Phoenix Pharamaceuticals社)またはインスリン(Invitrogen社)を添加し、その後フォルスコリン(Carbio Chem社)を最終濃度1μmol/Lとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清を15μl回収して化学発光測定用の96well plate(住友ベークライト社)に移し、アッセイ用緩衝液(280mmol/L Na2CO3−NaHCO3、8mmol/L MgSO4、pH10)を60μl、Lumiphos530(Lumigen社)70μlを添加して、室温にて1時間反応させた後、各wellの化学発光をFusionプレートリーダー(Perkin Elmer社)にて測定し転写活性量とした。フォルスコリン1μmol/Lを添加した細胞上清の転写活性を100%ととし、フォルスコリンを添加していない細胞の上清の活性を0%として各被験サンプルを加えた細胞上清中の活性を%で表示した(図3)。
実施例7で示した実験系を用いて、リラキシン−3の作用を拮抗する化合物のスクリーニングを実施し、拮抗作用を持つ化合物を見出した。
SALPR−SE302細胞を、転写活性測定用培地(DMEM−F12−10%FBS(65℃にて30分非働化)を加えたもの)にて縣濁した後、384 well plate(Greiner社)に1穴当たり5000細胞となるようにまいた。翌日、フォルスコリン(Fermentek社)溶液に被験化合物(1,2,5-oxadiazolo[3,4-a]1,2,5-oxadiazolo[3,4-e]1,2,5-oxadiazolo[3,4-i]1,2,5-oxadiazolo[3,4-m][16]annulene(化合物1))を溶解し、細胞上清に添加した(最終濃度:フォルスコリン3μmol/L、被験化合物20μg/mL,DMSO (dimethylsurfoxide)0.5%)。その後、アッセイ用培地(DMEM−F12に0.1%ウシ血清アルブミンを加えたもの)で希釈したリラキシン−3(株式会社ペプチド研究所)を最終濃度3nmol/Lとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清5μlを回収して化学発光測定用の384well plate(Corning社)に移し、アッセイ用緩衝液を20μL、Lumiphos530を25μL添加して、室温にて2時間反応させた後、各wellの化学発光をARVOsx3プレートリーダー(Perkin Elmer社)にて測定し転写活性量とした。SALPRを発現していないSE302細胞についても同様に操作し、被験物質の特異性を確認した。
(1)実験動物と脳室内投与のための前処置
Wistar雄性ラット(7週齢、日本チャールズリバー社)に実験動物用飼料MF(オリエンタル酵母社)を与えて馴化した。ラット(250〜300g)を麻酔下で、側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上飼育した後に投与実験を行った。
(2)リラキシン−3溶液の調製
60μgのリラキシン−3(Phoenix Pharmaceutical社)をDMSOにて溶解した後、最終濃度が200μmol/Lとなるように人工的脳脊髄液(artificial cerebrospinal fluid)を添加して調製した。析出した沈殿は遠心操作をして取り除き、上清をリラキシン−3投与液として用いた。ラットへの投与量(投与液中のリラキシン−3濃度)は実施例7に示された実験系にて、リラキシン−3による標準曲線を用いて算出したところ、約50pmol/ラットであった。
(3)リラキシン−3溶液の脳室内投与
ガイドカニューレを装着したラットを2群に分け(1群6匹)、リラキシン−3投与液もしくはvehicle(リラキシン−3を除いた前記(2)と同じ組成の溶液)を5μL/2分の速度でインフュージョンポンプを用いてラットに投与した。
(4)摂餌量の測定
投与液の脳室内投与後すぐに、ラットは予め重量を測定した餌を入れてあるケージに入れ自由摂食させた。2時間後に餌の減少量を測定することで摂餌量を算出した。各群の平均摂餌量と標準偏差を図5に示す。その結果、投与後2時間の摂餌量は、リラキシン−3を約50pmol投与したラットでは対照のvehicle投与のラットに比べて有意に増加していた(t−検定、p<0.01)。従って、リラキシン−3は摂食行動を増加させることが分かった。
血中レプチン濃度の測定
摂餌量測定後(投与後約3時間後)に前記ラットをネンブタールにて麻酔し、その腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を1,750×gで15分間遠心し、その上清を−80℃にて保存した。後日、上清中のレプチン量をラットレプチン定量ELISAキット(アマシャムバイオサイエンス社)により定量した。
その結果、単回のリラキシン−3投与ラットでは対照のvehicle投与のラットより血中のレプチン濃度が有意に上昇することが明らかとなった(t−検定、p<0.05、図6)。
(1)リラキシン−3溶液の調製
リラキシン−3(ペプチド研究所社)を生理食塩水にて100μmol/Lとなるように溶解し、vehicle(生理食塩水)またはリラキシン−3溶液を浸透圧ポンプ(alzet osmotic pump model1002(DURECT社) 投与量 6μL/日)とチューブ・投与用カニューレに注入しそれらを接続した。
(2)実験動物と脳室内投与のための処置
Wistar雄性ラット(6週齢、日本チャールズリバー社)に実験動物用飼料MF(オリエンタル酵母社)を与え、個別飼育で4日間馴化した。前記ラット(250〜270g)を麻酔下で、側脳室にガイドカニューレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。
(3)体重増加作用および摂餌量の測定
手術日を0日目として自由摂食下で飼育し、毎朝、体重と餌量を測定した。0日目からの体重の増加量を図7に示した。また、摂餌量は、手術前日から手術日までを0日目とし、一日当たりの餌の減少量を摂餌量として示した(図8)。
手術後1日目よりリラキシン−3投与ラット群では有意な体重の増加が確認された。また、リラキシン−3投与群の摂餌量も1日目より有意に増加した(t−検定、** p<0.01、* p<0.05)。
(4)脂肪量、血中レプチン量およびインスリン量の定量
実験終了日(14日目)に体重と餌量を測定した後、ラットをネンブタールにて麻酔し、精巣周囲の脂肪を取り出し両精巣周囲の脂肪重量を合わせて測定した(図9)。さらに、腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を1,750×gで15分間遠心し、その上清を−80℃にて保存した。後日、上清中のレプチン量をラットレプチン測定キット(L)(IBL社)により定量した(図10A)。また上清中のインスリン量を超高感度ラットインスリン測定キット(森永生化学研究所社)により定量した(図10B)。
その結果、精巣周囲脂肪量は対照のvehicle投与のラットに比較し、リラキシン−3持続投与群で有意に増加していた。また血中のレプチン濃度とインスリン濃度も、リラキシン−3を持続投与したラットで有意に上昇していることが明らかとなった(t−検定、** p<0.01、* p<0.05)。従って、リラキシン−3投与により脂肪蓄積を伴う肥満作用が亢進するとともに、インスリン量が増加することが明らかとなった。
(1)リラキシン−3溶液の調製
リラキシン−3(ペプチド研究所社)を生理食塩水にて100μmol/Lとなるように溶解し、vehicle(生理食塩水)またはリラキシン−3溶液を浸透圧ポンプ(alzet osmotic pump model1002(DURECT社) 投与量 6μL/日)とチューブ・投与用カニューレに注入しそれらを接続した。
(2)実験動物と脳室内投与のための処置
Wistar雄性ラット(5週齢、日本チャールズリバー社)に実験動物用飼料MF(オリエンタル酵母社)を与え、個別飼育で5日間馴化した。前記ラット(170〜200g)を麻酔下で、側脳室にガイドカニューレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。手術日を0日として運動量の測定日以外は自由摂食・飲水下で飼育し、毎朝体重を測定した(図11)。
前記実施例11と同様に、投与後1日後からリラキシン−3投与ラット群では有意な体重の増加が確認された(t−検定、** p<0.01、* p<0.05)。
(3)自発運動量の測定
前記(2)にて、リラキシン−3投与ラットの体重増加作用に有意な差が認められた日の明期および暗期の自発運動量を、Versamax(Accuscan社)を用いて測定した。明期(投与開始後2、7日後)、暗期(投与開始後3、8日後)のラットを実験開始の1時間以上前に個別飼育台から実験室へ移動して馴化した後、Versamaxケージ内にラットを入れ直後から90分間の行動量を記録した。90分間の全活動量を図12に示した。
いずれの日においても各群のラットで運動量には有意な変化は認められなかった。すなわち、リラキシン−3による体重増加作用は自発運動量の変化が作用しているのではないことが明らかとなった。
Claims (20)
- リラキシン−3またはその塩を含有してなる摂食亢進剤。
- リラキシン−3またはその塩を含有してなる体重増加剤。
- リラキシン−3またはその塩を含有してなる脂肪量増加剤。
- 次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - 次の工程;
リラキシン−3またはその塩、および被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - 次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする請求項5に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項4〜6のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項7に記載のスクリーニング方法。
- リラキシン−3またはその塩を含有してなる体重増加を必要とする疾患の治療剤。
- 疾患が拒食症または悪疫質である請求項9に記載の治療剤。
- 次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - 次の工程;
リラキシン−3またはその塩、および被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - 次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする請求項12に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項11〜13のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項14に記載のスクリーニング方法。
- 次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - 次の工程;
リラキシン−3またはその塩、および被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体、リラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - 次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする請求項17に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。 - リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項19に記載のスクリーニング方法。
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