KR20070086003A - Ｇ 단백질 커플된 수용체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 G 단백질 커플된 수용체 GPR39의 기능적 특성 및 GPR39 단백질 활성을 변형하거나 조절하는 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 위장의 운동을 조절하는 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist)를 확인하기 위한 GPR39의 작용제 또는 길항제용 스크리닝 방법과 이러한 화합물의 치료적 용도에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 대사 항상성, 특히, GPR39 낙아웃(knockout) 마우스에서 관찰된 콜레스테롤 레벨에서 GPR39의 관여에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GPR39 유전자에 돌연변이를 갖는 트랜스제닉(transgenic) 동물에 관한 것이다.

Description

Ｇ 단백질 커플된 수용체{G PROTEIN COUPLED RECEPTOR}

본 발명은 G 단백질 커플된 수용체 GPR39의 기능적 특성 및 GPR39 단백질 활성을 변형하거나 조절하는 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 위장의 운동을 조절하는 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist)를 확인하기 위해 GPR39의 작용제 또는 길항제를 스크리닝하는 방법과 이러한 화합물의 치료적 용도에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 대사 항상성, 특히, GPR39 낙아웃(knockout) 마우스에서 관찰된 콜레스테롤 레벨에서 GPR39의 관여에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GPR39 유전자에 돌연변이를 갖는 트랜스제닉(transgenic) 동물에 관한 것이다.

GTP-결합 단백질(G-단백질)은 호르몬 및 세포내 효과제의 활성화와 G 단백질 커플된 수용체(GPCR)에 다른 화학적 매개체와 같은 리간드의 결합 사이의 중개자로써, 행동한다. GPCR에 리간드가 결합한 경우, 수용체의 세포질 부위는 입체 형태 변화를 겪고, G 단백질과 수용체의 상호작용이 가능하게 되며, 이에 따라, 아데닐레이트 사이클라제(adenylate cyclase), 포스포리파제 C(phospholipase C), 이온 채널(ion channel)과 같은 세포내 중개자의 활성화를 가능하게 한다. 이러한 시스템은 GPCR에 단일 리간드의 결합에 반응하여 생산될 수 있는 많은 이차전령물질(second messenger)로써, 원래 신호의 증폭을 허용한다. 이러한 기전을 통하여, 세포들은 그들의 외측 환경에서의 변형을 감지 및 반응할 수 있다.

G 단백질 커플된 수용체는 통합 플라스마 막단백질의 상과(superfamily)를 형성하며, 각 수용체는 다양한 길이의 친수성 아미노산 서열에 의하여 링크되는 각각이 20-30 아미노산 길이인 일곱개 소수성 막횡단단백질 부위의 공통 부분을 공유한다. 수용체의 아미노 말단은 세포의 세포질에서 발견되는 카르복시 말단과 함께, 세포외에 있다.

GPCR은 넓은 범위의 조직 및 세포 타입에서 발견되며 많은 다른 생리적 과정에 함유된다. 그들은 광대한 범위의 리간드, 예를 들면, 황체형성 호르몬(luteinizing hormone), 난포자극 호르몬(follicle stimulating hormone), 융모성 성선자극호르몬(chorionic gonadotrophin), 갑상샘자극 호르몬(thyrotropin), 부신피질자극 호르몬(adrenocorticotrophin), 글루카곤(glucagon) 및 바소프레신(vasopressin)과 같은 호르몬; 5-HT, 아세틸콜린(acetylcholine)(무스카린성 AchR), 히스타민(histamine), 프로스타글란딘(prostaglandins), 칼시토닌(calcitonin), 류코트리엔(leukotrienes) 및 Ca^{2 +}과 같은 신경전달물질(neurotransmitter)에 의하여 활성화된다. GPCR 역할의 광대한 분포 및 넓은 다양성은 GPCR이 다양한 병리 증상에서 중요한 역할을 수행함을 나타낸다. 실제로, GPCR은 기관지수축(bronchoconstriction), 고혈압(hypertension), 염증(inflammation), 호르몬 장애(hormonal disturbance), 당뇨병(diabetes), 세포 자멸(apoptosis), 통각(nociception), 신경전달의 소통(facilitation of neurotransmission) 및 떨림 장애(tremor disorder)에 관련된 질환에 관여된다고 밝혀졌다.

G-단백질-커플된 수용체 상과 내에서, 자연적인 리간드가 알려지지 않은 추정의 GPCR은 "추정 수용체"라고 불린다. 그것들이 판매 약물의 약 50%의 표적이기 때문에, G 단백질-커플된 수용체는 귀중한 약 표적으로 입증되었다. 게다가, 많은 추정 GPCR은 새로운 잠재적 표적을 확인하기 위하여 평가된다.

GPR39는 성장 호르몬 분비촉진 수용체(GHS-R) 및 뉴로텐신 수용체 1 및 2(NT-Rl 및 NT-R2)와의 서열 상동성을 바탕으로 확인되었다(McKee et al . , 1997). 예측되는 453-아미노산 GRP39 단백질은 GPCR들 특성의 7 막횡단(transmembrane) 부위를 함유한다. 다른 GPCR과의 서열 비교에 의하여, McKee et al. (1997)는 GPR39의 단백질 서열이 GSHR, MTLRl(모틸린 수용체) 및 뉴로텐신 수용체-1, 각각의 그것에 27%, 29% 및 32% 동일한 것을 발견하였다. 노던 블롯 분석은 GPR39가 넓은 조직 분포를 갖는 것을 보여준다. 1.8-2kb의 mRNA 전사체에 단일 혼성화가 시험한 대부분의 뇌 영역에서 탐지되었다. 그러나 이러한 종에 덧붙여, 3-kb 길이의 대신하는 전사체는 위 및 소장과 같은 몇몇 말초 조직, 그리고, 췌장, 갑상선 및 결장과 같은 조직에서 발견되었고, 이러한 3-kb 종은 탐지된 유일한 전사체였다(McKee et al., 1997). 형광 제자리부합법(in situ hybridization)에 의하여, McKee et al. (1997)은 2q21-q22에 GPR39 유전자를 지도화하였다. 구조적으로 차이가 있는 GHS들에 의한, GHS-R의 결합 및 활성화에 필수적인 TM3에서의 산성 잔기는, GPR39에 보존된다.

이러한 조직 분포 연구에 근거를 두어, GPR39가 심장혈관 질환 증상(WO2001/081634 & WO2004/004279), 암 및 특히 교모세포종(glioblastoma)과 같은 뇌암(WO2001/036685 & WO01042288), 염증 및 신경계 질환 증상(US 2003/ 232769 & WO2004/004279) 그리고, 위장 및 간 질환(WO2004/004279)에 관여될 것으로 가정된다. 그럼에도 불구하고, 인용된 참조에서, GPR39를 위한 리간드 확인에 근거를 둔 기능적 특성화가 제공되지 않았다. 상기의 이유로, 현재 GPR39의 기능적 주석이 확실하지 않으며, GPR39의 기능적 특성 및 리간드-결합을 확인하기 위하여 연구가 더욱 필요하다.

주어진, GPR39의 넓은 조직 분포 및 대부분의 G 단백질 커플된 수용체가 세포 및 생리 과정의 넓은 다양성에서 중요한 역할을 수행한다는 사실은 이러한 수용체의 통상적인 생리 역할의 이해를 얻는 데, 주의를 끌 것이다.

[발명의 요약]

상기에서 기술된 바와 같이, 본 발명은 GPR39 수용체의 새로운 기능의 확인에 관한 것이다. 이하 실시예에서 나타낸 바, 포유동물에서 GPR39 돌연변이는 위 배출(gastric emptying)에 영향을 미치며, 위장 운동의 조절에서 중요한 요소로써 GPR39를 나타낸다. GPR39 유전자의 하향 조절이 위 배출 증가에 이르게 한다는 주어진 사실은, GPR39 발현의 증가가 위 배출을 줄일 것이라고 기대되게 한다. 이러한 발견은 GPR39 활성의 조절을 통한 위장 운동의 조절에서, 새로운 치료적 접근을 위한 통로를 제공한다. 이러한 발견은 또한, 위장 운동 및 위장 운동 장애에 관여 하는 질환을 연구하기 위한 새로운 모델 시스템을 제공하고, 그것은 또한 이러한 질환들의 예방 또는 치료에 유용한 화합물을 확인하기 위한 새로운 스크리닝 방법을 제공한다.

상기한 것에 덧붙여, GPR39 낙아웃(knockout) 마우스의 표현형은 콜레스테롤 대사에 이러한 수용체의 관여을 나타낸다. GPR39 유전자의 하향 조절이 증가된 콜레스테롤 레벨에 이르게 한다. 따라서, GPR39는 비만, 당뇨병, 비만 관련 심혈관 질환 및 녹내장(glaucoma)을 포함하는 대사 증후군과 같은 과도한 콜레스테롤 수치와 함께 나타나는 질환 증상에 관여할 것이라고 기대된다.

게다가, 본 발명의 첫번째 국면은 위장 운동을 조절하거나, 위장 운동 장애와 관련된 병리들을 예방 및/또는 치료하기 위하여 효율적인 화합물들을 확인하기 위한 방법에서, GPR39 단백질의 전부 또는 부분의 용도를 제공한다. 다른 일면에서, 본 발명은 콜레스테롤 형성을 조절하거나, 과도한 콜레스테롤 형성과 관련된 병리들을 예방 및/또는 치료하기 위하여 효율적인 화합물을 확인하기 위한 방법에서, GPR39 단백질의 전부 또는 부분의 용도를 제공한다. 대신하여, 본 발명은 그러한 방법에서 GPR39 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 세포의 용도를 제공한다. 특정 구체예에서, GPR39는 서열번호 2, 서열번호 4, 상기 언급된 서열번호를 갖는 단백질들의 스플라이스 변형체(splice variant), 및 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열에 적어도 50%, 및 바람직하게 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질이다.

본 발명에서 이용되는 바, GPR39 단백질의 부분은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 폴리펩티드 단편들을 함유하는 것을 의미하며, 상기 단편은 크기로 적어도 10, 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50, 75, 100 또는 150 또는 그 이상의 아미노산이다. 그러한 단편들은 서열번호 2 또는 서열번호 4 각각의 N-말단 영역으로부터 얻을 수 있다. N-말단 영역을 함유하는 단편은 수용체 결합 부위를 제공하기 위하여 수용체의 세포외 부분을 재구성하는 데 이용될 수 있다. 바람직하게, 단편들은 아데닌에 결합하는 능력을 유지할 것이다.

본 발명은 또한, 위장 운동을 조절하거나, 위장 운동 장애에 관련된 병리 및 당뇨병 및 심혈관질환을 포함하는 대사 증후군과 같이, 높은 레벨의 콜레스테롤과 관련된 질환 증상을 예방 및/또는 치료하기 위하여 효과적인 화합물을 확인하는 방법에서, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 분리된 핵산 서열의 용도를 추가로 제공한다. 본 발명의 방법에서 이용되는 바, 핵산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 구성된, 분리된 핵산 서열, 및 서열번호 1 또는 서열번호 3에 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 함유하는 것을 의미한다.

본 발명의 핵산은 또한 서열번호 1 또는 서열번호 3 또는 그들의 보체(complement)의 핵산 서열에 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산을 함유한다. 바람직하게, 이러한 서열은 비-특이적 결합을 최소화하도록 조절된 환경 하에서, 상응하는 핵산에 혼성화할 것이다. 바람직하게는, 가혹한 환경부터 알맞게 가혹한 혼성화 환경이 바람직하다. 적합한 환경은 예를 들면, 약 80-90% 동일성이 있는 서열의 탐지를 위하여, 0.25M Na₂HPO₄, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트, 42℃에서 오버나이트 혼성화, 및 0.1X SSC, 0.1% SDS, 55℃에서의 최종 세척을 함유한다. 약 90% 보다 더 동일한 서열의 탐지를 위하여, 적합한 환경은 0.25M Na₂HPO₄, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트, 65℃에서 오버나이트 혼성화, 및 0.1X SSC, 0.1% SDS, 60℃에서의 최종 세척을 함유한다.

그러한 핵산이 필수적으로 "전장" 폴리펩티드를 암호화하지 않는 것이 이해될 것이며, 따라서, 예를 들어, 정지 코돈으로 결과되는 치환 또는 틀이동(frameshift) 돌연변이 둘 중 하나에 의하여 성급하게 종결된 코딩 서열이 있는 GPR39 유전자의 돌연변이 형태를 나타내는 핵산을 함유할 것이다. 이들은 또한 본 발명의 핵산이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 단편인 핵산의 용도를 제공한다. 일면에서, 본 발명은 15 내지 50, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열 또는 그것의 보체의 15 내지 35, 18 내지 35, 15 내지 24, 18 내지 30, 18 내지 21 또는 21 내지 24 뉴클레오티드로 필수적으로 구성된 핵산 프라이머(primer)를 제공한다.

본 발명의 핵산 및 폴리펩티드는 질환을 치료하기 위하여 치료적으로 이용될 수 있다. 특히, 그들은 병리가 GPR39 수용체에서의 작용과 관련된 질환을 치료하기 위하여, 특히, 대사 증후군과 같은 증가된 콜레스테롤 레벨에 관련된 질환 증상 및 위장 운동 장애과 관련된 병리의 예방 및/또는 치료용과 연관된 것으로 이용될 수 있다.

다른 일면에서, 상기 핵산의 서열을 포함하는 벡터, 특히, 본 발명의 핵산 서열에 사용가능하게 링크된 프로모터를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 벡터는 숙주 세포에 의하여 운반될 수 있으며, 상기 세포 내에서 발현된다. 상기 발현 후, 상기 세포는 본 발명에 따른 방법에서 이용될 수 있다.

상기에서 언급한 바, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 조절하거나 결합하는 화합물(이하 제제라고도 언급)의 확인을 위한 분석 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 특히, 그러한 화합물들이 임의의 크기 원자의 유기 또는 무기 어셈블리(assembly)이며, 작은 분자들(약 2500 달톤 미만) 또는 펩티드, 폴리펩티드, 전체 단백질 및 폴리뉴클레오티드와 같이 더 큰 분자들을 함유하며, 여기서 상기 화합물은 상기 개시된 바, 치료의 방법에 이용될 수 있다고 예상된다.

본 발명자들이 위장 운동의 조절에 중요한 요소인 수용체로써 GPR39를 첫번째로 확인했기 때문에, 본 발명은 치료 적용에서 GPR39 자체 및/또는 이러한 수용체를 작용시키거나, 길항시키는 화합물 이용의 가능성을 연다. 더욱이, 본 발명은 GPR39 작용제 또는 길항제의 이용을 포함하는 인간 또는 동물 신체의 치료 방법으로 더욱 확장된다. 특히 질환 증상을 치료하는 방법은 예를 들어, 장폐쇄증 수술-후 위마비(gastroparesis post-operative ileus), 당뇨병에서 위마비(gastroparesis in diabetic), 기능성 소화불량(functional dyspepsia), 미주신경절제술-후 위마비(post-vagotomy gastroparesis), 저속 이행 변비(slow transition constipation), 변비-IBS(constipation-IBS), 혼합-IBS(mixed-IBS) 및 특발성 장 가성-막힘(idiopathic intestinal pseudo- obstruction)과 같은 지연 위 배출과 관련된다. 상기 방법은 GPR39 수용체 길항제의 치료적 유효량을 인간 또는 동물에게 투여하는 것, 특히, 본 발명의 방법을 이용하여 확인가능한 GPR39 길항제의 용도를 포함한다.

예를 들어, 덤핑 증후군(dumping syndrome)과 같은 위 배출 증가 또는 설사(diarrhoea), 설사-IBS(diarrhoea-IBS) 및 혼합 IBS와 같은 장 운동성 증가와 관련된 질환 증상을 치료하는 방법을 제공하는 것도 목적이며, 상기 방법은 특히, 본 발명의 방법을 이용하여 확인가능한 GPR39 수용체 작용제의 이용을 포함하여 GPR39 수용체 작용제의 치료적 유효량을 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함한다.

덧붙여, 콜레스테롤 항상성에서, GPR39 수용체의 하향 조절에 대하여 관찰된 효과에 근거하여, 다른 일면에서 본 발명은 결함이 있는 콜레스테롤 항상성의 치료적 적용에서 이러한 수용체를 작용시키거나, 길항시키는 GPR39 자체 및/또는 화합물의 이용 가능성을 연다. 따라서 본 발명은 또한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법으로도 확장되며, 상기 방법은 결함이 있는 콜레스테롤 항상성과 관련된 질환 증상을 치료하는 것에서 GPR39 작용제 또는 길항제의 용도를 포함한다. 특히, 질환 증상의 치료에서, GPR39 작용제의 용도는 비만, 당뇨병 및 높은 레벨의 콜레스테롤에 관련된 죽상동맥경화증과 같은 심혈관질환을 포함하는 대사 증후군과 같이 과도한 코르티졸(cortisol) 형성과 연관된다.

본 발명의 이러한 및 다른 일면은 여기서 더욱 자세하게 기술된다.

[서열의 설명]

서열번호 l은 마우스 GPR39의 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 2는 마우스 GPR39의 아미노산 서열이다.

서열번호 3은 인간 GPR39의 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 4는 인간 GPR39의 아미노산 서열이다.

서열번호 5는 GPR39 전방 프라이머(forward primer)이다.

서열번호 6는 GPR39 후방 프라이머(reverse primer)이다.

서열번호 7은 GPR39 프로브 서열이다.

서열번호 8은 인간 오베스타틴(obestatin)이다.

서열번호 9는 원숭이 오베스타틴이다.

서열번호 10은 마우스 오베스타틴이다.

서열번호 11은 랫 오베스타틴이다.

서열번호 12는 저빌쥐(gerbil) 오베스타틴이다.

서열번호 13은 돼지 오베스타틴이다.

서열번호 14는 고양이 오베스타틴이다.

서열번호 15는 개 오베스타틴이다.

서열번호 16은 염소 오베스타틴이다.

서열번호 17은 양 오베스타틴이다.

서열번호 18은 소(Cattle) 오베스타틴이다.

서열번호 19는 오베스타틴 공통 서열(consensus sequence)이다.

도 1A : 야생형 마우스로부터 유래된 조직에서 GPR39의 실시간 정량적 역전사 PCR(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR).

도 1B : 야생형 마우스와 GPR39 낙아웃(knock-out) 마우스의 이형접합체 및 동형접합체로부터 유래된 네가지 다른 조직에서 GPR39의 실시간 정량적 역전사 PCR.

도 2 : 야생형 마우스에 비하여 GPCR39 낙아웃 마우스에서 위 배출을 위한 절반 배출 시간(t1/2) 및 T_lag(B)의 비교.

도 3 : GPCR39 낙아웃 마우스(B)에 대하여, 야생형 마우스(A)에서 분변의 펠렛(pellet) 추진 비교. 펠렛의 분포는 전체 결장의 15%의 저장소에서 계산되며, 각 저장소로부터 나온 펠렛의 수는 20분 시간의 간격동안 계산된다.

도 4 : 어린(17주, n=6) 및 더 나이든 마우스(56주, n=6) 둘 다에서, 공복의(19시간) 마우스에 대하여 공복이 아닌 마우스의 누적 음식물 섭취의 비교.

도 5 : 신호 펩티드(이탤릭체로 쓰인) , 성숙 그렐린 (어둡게) , 및 프랭킨 오베스타틴 (밑줄쳐진)과 함께, 포유동물 11종으로부터의 프리프로그렐린(preproghrelin) 아미노산 서열. 잠재적 전환효소(convertase) 절단 부위를 나타내는 공통 염기성 잔기는 검은 배경에 하얀 글자로 나타냈다. 공통 서열에서, 완전 한 보존이 있는 개개의 잔기는 위의 경우에 나타냈다. 개개의 그렐린 유전자의 GenBank(gi) 번호는 37183224 (인간), 34541890 (원숭이), 19224664 (마우스), 11067387 (랫), 27357900 (저빌쥐), 47523230 (돼지), 52782813 (고양이), 50978704 (개), 52782814 (염소), 57526202 (양), 및 27806613 (소)이다.

핵산

본 발명의 방법에서 이용된 바, 핵산은 DNA(게놈 및 cDNA 둘다 포함) 및 RNA를 함유한다. 본 발명에 따른 핵산이 RNA를 포함할 때, 첨부되는 목록에 나타낸 서열에 대한 언급은 T를 U로 치환한 RNA 동등체에 대한 언급으로 간주되어야 한다.

본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 사슬일 수 있다. 본 발명의 단일 사슬 핵산은 안티-센스 핵산을 포함한다. 따라서, 서열 번호 1 또는, 서열 번호 1을 포함하는 서열 또는 그의 단편에 대한 언급은 상황이 명확하게 반대가 아니라면 상보적인 서열을 포함한다고 이해될 것이다. 서열 번호 3에 대해서도 동일하게 적용된다.

일반적으로, 본 발명에 따른 핵산은 분리체로서, 분리되고/거나 정제된 형태, 또는 가능한 하나 이상의 발현용 조절 서열(들)을 제외하고 인간 게놈에서의 유전자를 프랭킹하는 핵산이 없거나 실질적으로 없는 것과 같은, 자연적으로 관련된 물질이 없거나 실질적으로 없는 것으로 제공된다. 핵산은 완전히 또는 부분적으로 합성일 수 있고 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 단편인 핵산을 제공한다. 일면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열이나 그것의 상보체의 15 내지 50, 예를 들어 15 내지 35, 18 내지 35, 15 내지 24, 18 내지 30, 18 내지 21 또는 21 내지 24 뉴클레오티드를 필수성분으로 하여 구성되는 핵산 프라이머를 제공한다.

용어, 필수성분으로 하여 구성되는

은 임의의 추가적인 5' 또는 3' 핵산 서열을 포함하지 않는 핵산을 언급한다. 하지만 본 발명의 다른 면에서, 상기에서 정의된 바와 같이 15 내지 30 누클레오티드를 필수성분으로 하여 구성되는 본 발명의 핵산은 3'에서 하지만 바람직하게는 5' 말단에서 자연적으로 링크되지 않는 짧은(예를 들어 4 내지 10과 같은 4 내지 15 뉴클레오티드) 추가적인 서열까지 링크될 수 있다. 이런 추가적인 서열은 바람직하게는 본 발명의 핵산이 예를 들어 PCR 프라이머로서 사용되는 경우 클로닝을 촉진하는 제한 효소 인식 부위를 포함하는 링커이다.

본 발명의 프라이머는 바람직하게 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 선택적으로 혼성화될 수 있다. 선택적인

은, 다른 퓨린 수용체를 코딩하는 서열에 관하여 그리고 특히 아데닌 수용체 외의 수용체에 관하여 선택적인 것을 의미한다. 선택적으로 혼성화하는 서열의 능력은 실험이나 계산에 의해 결정될 수 있다.

예를 들어, 프라이머의 Tm을 계산하는 한 방법은 상응하는 표적 서열에 대한 프라이머의 Tm을 계산하기 위한 공식의 참조에 의한다. 공식은 Tm(℃)=2(A+T) + 4(G+C) - 5이다. 이것은 3×SSC 및 0.1% SDS(여기서 SSC는 0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트, pH7)의 환경 하에서의 Tm을 제공할 것이다. 이 공식은 일반적으로 길이가 약 50 뉴클레오티드까지의 프라이머에 적절하다. 본 발명에서, 이 공식은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열로부터 유래된 특이적인 서열에 대한 프라이머의 명목상 Tm을 계산하는 알고리즘으로서 사용될 수 있다. Tm은 이들 다른 서열의 임의의 부분에 대한 정합의 최대수에 기초하여, 인간과 랫의 GPCR 서열에 대한 계산된 Tm과 비교될 수 있다.

표적 서열에 혼성화하는 프라이머에 대한 적절한 환경은 또한 실험적으로 측정될 수 있다. 적절한 실험 환경은 낮은 엄격성의 혼성화 환경 (예를 들어 55℃에서 6×SSC) 하에서 후보 프라이머를 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 고체 지지상의 다른 아데닌 수용체를 코딩하는 핵산을 혼성화하고, 환원된 SSC 및/또는 높은 온도에서, 예를 들어 45℃의 0.2×SSC에서 세척하고, 프라이머가 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 혼성화하지만 핵산을 암호화하는 다른 퓨린 수용체에는 하지 않게 하는 혼성화 환경을 결정하기 위해 점차 혼성화 온도를 증가시키는 것을 포함한다.

본 발명의 핵산, 특히 프라이머는 가시적인 표지를 수반할 수 있다. 적절한 표지는 ³²P 또는 ³⁵S와 같은 방사성 동위원소, 형광 표지, 효소 표지 또는 비오틴과 같은 다른 단백질 표지를 함유한다. 이런 표지는 본 발명의 폴리뉴클레오티드나 프라이머에 첨가될 수 있고 그 자체가 알려진 기술에 의하여 이용하여 검출될 수 있다.

본 발명의 프라이머는 세포 내에서 핵산의 안정성을 향상시키도록 의도되는 변형된 백본(backbone) 구조를 갖는 것과 같은, 합성된 핵산으로 구성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 많은 다른 변형의 형태가 본 분야에 알려져 있다. 이것들은 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서 아크리딘이나 폴리라이신 사슬의 첨가, 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본을 함유한다. 본 발명의 목적을 위하여, 본 명세서에서 기술되는 폴리뉴클레오티드는 본 분야에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있음이 이해되어야 한다. 이런 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성이나 수명을 증가시키기 위하여 수행될 수 있다.

본 명세서에서 기술되는 핵산 서열, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드, 특히 안정화된 올리고뉴오티드 또는 리보자임의 형태에 기초한 안티센스 서열이 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 주어진 표적 DNA 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생성을 방해하도록, 핵산, 전-mRNA 또는 성숙 mRNA의 상보적인 서열에 혼성화하도록 디자인될 수 있고, 따라서 그것의 발현은 감소되거나 전부 정지된다. 리보자임은 바람직하게는 GPR39 GPCR에 특이적인 표적 서열, 즉 다른 GPCR 서열에 공통되지 않는 서열에서, 본 발명의 핵산 서열을 암호화하는 GPR39 GPCR에 의해 암호화되는 mRNA를 자르도록 디자인될 것이다. 안티센스 서열의 구성과 그것의 용도는 Peyman and Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376, (1992), 및 Zamecnik and Stephenson, P.N.A.S, 75:280-284, (1974)에 기술되어 있다. 리보자임의 구성과 그들의 용도는 예를 들어 Gibson and Shillitoe, Molecular Biotechnology 7(2): 125-137, (1997)에 기술되어 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 RNA는 이중 나선(dsRNA)(Fire et al. , Nature 391: 806-811. 1998) 또는 짧은-간섭 RNA(siRNA) 서열(Yu et al. , Proc Natl Acad Sci USA. 99:6047-52. 2002)을 이용하여, RNA 간섭의 유도에 이용될 수 있다. "RNAi"는 dsRNA가 상보적인 mRNA의 상동성-의존적 분해를 유도하는 것에 의한 과정이다. 일구체예에서, 이중 나선 RNA를 형성하기 위하여, 본 발명의 "센스(sense)" 리보핵산과 본 발명의 핵산 분자는 상보적 염기 짝지움에 의하여 혼성화된다. GPR39 코딩 서열 또는 적어도 약 20, 25, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오티드 또는 이들의 오직 일부분에 상응하는 dsRNA 안티센스(antisense) 및 센스 핵산 분자가 제공된다. 대신하는 구체예에서, siRNA는 30 뉴클레오티드 또는 그 미만의 길이 및 더욱 바람직하게, 보다 긴 dsRNA로부터 리보핵산분해효소 Ⅲ 절단에 의하여 생성되는, 3'-오버행(overhanging) 말단에 독특한 2- 내지 3-뉴클레오티드를 갖는 21- 내지 23-뉴클레오티드이다. 예를 들어, Tuschl T.(Nat Biotechnol. 20:446-48. 2002)를 참조.

작은 RNA 분자의 세포내 전사는 siRNA 주형(template)을 RNA 중합효소 Ⅲ(Pol Ⅲ) 전사 유니트에 클로닝하여 성취될 수 있고, 이는 인간 RNA 분해 효소 P RNA Hl 또는 핵내 저분자 RNA(snRNA) U6를 정상적으로 암호화한다. 두가지 접근은 siRNA를 발현하는 데 이용될 수 있다: 일구체예에서, siRNA 두가닥을 구성하는 센스 및 안티센스 사슬은 개개의 프로모터에 의하여 전사되고(Lee, et al . Nat. Biotechnol . 20, 500-505. 2002); 대신하는 구체예에서, siRNA는 세포내 과정 후에 siRNA로 되는 스템-루프(stem-loop) 헤어핀 RNA 구조로써 발현된다(Brummelkamp et al. Science 296:550-553. 2002) (여기에 참조에 의하여 삽입된다) .

dsRNA/siRNA는 일반적으로, 유기체로 운반 전에 실험상에서 센스 및 안티센스 RNA 가닥의 결합에 의하여 도입된다. 대신하는 구체예에서, RNAi는 도입 전에 결합없이, 같은 용액 내에서 본 발명의 센스 및 안티센스 핵산을 도입하는 것에 의하여 수행되고, 심지어, 매우 근접한 시간의 틀 내에 다른 운송 수단 내에서 핵산의 도입에 의하여 수행될 수 있다. GPR39의 단편, 호모로그, 변형체 및 유사체를 암호화하는 핵산 분자 또는 GPR39 핵산 서열에 상보적인 안티센스 핵산이 추가적으로 제공된다.

본 발명의 안티센스, siRNA 및 리보자임 서열은 예를 들어 이 유전자의 하향-조절을 유발하고 표현형 효과를 관찰함으로써, GPR39 GPCR의 기능을 연구하거나 GPR39 GPCR과 관련된 본 명세서에서 기술하는 단백질의 발현이나 위치를 연구하기 위한 배양에서 포유류 세포주로 도입시킬 수 있다. GPR39 GPCR의 비정상적인 발현이 발생하는 세포에서, 이런 안티센스, siRNA 및 리보자임 서열은 유전자의 발현을 하향-조절하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 GPCR의 cDNA 서열은 표준 PCR (중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 사용하여 클로닝될 수 있다. 이것은 서열 번호 1의 반대쪽 사슬 상에서 5' 및 3' 말단에 대한 한 쌍의 프라이머를 제작하고, 이 프라이머를 포유류 피질 세포로부터 얻은 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키도록 가져오고, 원하는 영역의 증폭을 야기하는 환경 하에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하고, (예를 들어 반응 혼합물을 아가로스 겔 상에서 정제함으로써) 증폭된 단편을 분리하고, 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함한다. 프라이머는 적절한 제한 효소식 부위를 포함하도록 디자인될 수 있고 따라서 증폭된 DNA는 적절한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다. 서열 번호 3에도 동일하게 적용한다.

서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 서열에 100% 상동이지는 않지만 서열 번호 2나 서열 번호 4 또는 본 발명의 다른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 여러 방법으로 얻을 수 있다.

예를 들어, 서열 번호 1 또는 서열 번호 3 서열의 위치 지시된 돌연변이유발(site directed mutagenesis)이 수행될 수 있다. 이것은 예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대한 코돈 선호를 최적화하는 서열에 대해 필요한 침묵 코돈 변화에 유용하다. 다른 서열 변화를 제한 효소 인식 부위를 도입하기 위하여 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 특성이나 기능을 변경시키기 위하여 원할 수 있다. 추가의 변화는 예를 들어, 보존성 치환을 제공하는데 필요한 특정 코딩 변화를 나타내기 위하여 바람직할 수 있다.

본 발명의 핵산은 5' 또는 3' 말단에서의 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 또는 자연 5' 리더 서열(leader sequence)은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 부찰될 수 있다. 추가적인 서열은 특정 숙주 세포에서 본 발명의 핵산의 전사에 필요한 5' 또는 3'의 번역되지 않은 영역을 또한 함유할 수 있다.

또한, 다른 동물 특히 포유류(예를 들어 인간이나 토끼), 보다 특히 인간을 포함하는 영장류에서 GPR39 상동체가 수득되고, 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 이런 서열은 세포나 조직을 분리하여 제조되는 cDNA 라이브러리 또는 다른 동물 종으로부터의 조직 또는 게놈 DNA 라이브러리를 제조하거나 획득하고, 중간 내지 고도로 엄격한 환경 하에서 (예를 들어 약 50℃ 내지 약 60℃에서 0.03M 염화나트륨 및 0.03M 시트르산염 나트륨) 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 전부 또는 부분을 포함하는 프로브로 이런 라이브러리를 프로빙하여 얻어진다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 DNA 서열로 연장되지만 암호화하는 서열은 둘 이상의 (바람직하게는 5개 이하, 예를 들어 4 또는 3) 엑손으로 나뉜다. 이런 엑손 서열은 자연적이고 게놈 클론으로부터 얻거나 합성될 수 있다. 엑손 서열은 서열이 하나 이상의 엑손 서열에 의해 방해되는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 미니-유전자 서열의 제조에서 사용될 수 있다.

미니-유전자는 또한 임의의 진핵 소스로부터 유도되는, 헤테로 엑손을 이용하여 제조될 수 있다.

폴리펩티드

본 발명의 방법에서 이용된 분리된 폴리펩티드는 분리형으로 상기에서 정의된 바일 것이고, 세포에서 발견되는 다른 폴리펩티드와 같이 자연적으로 관련된 물질이 없거나 실질적으로 없다: 폴리펩티드는 물론 희석제나 애쥬번트와 함께 제형화될 수 있고 또한 실용적 목적을 위하여 분리될 수 있고-예를 들어 폴리펩티드는 면역분석에서 사용하기 위해 마이크로티터 플레이트를 코팅하는데 사용된다면 젤라틴이나 다른 담체와 함께 보통 혼합된다. 폴리펩티드는 자연적으로 또는 이종 진핵 세포 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 그것들은 (예를 들어 원핵 세포에서 발현에 의해 생성된다면) 비글리코실화될 수 있다. 폴리펩티드는 인산화 및/또는 아세틸화될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 실질적으로 정제형일 수 있고, 이 경우 그것은 일반적으로 제조에서 90% 초과, 예를 들어 95%, 98% 또는 99%의 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드 제조에서의 폴리펩티드를 포함할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 그것의 정제를 돕기 위한 히스티딘 잔기의 첨가에 의해 또는 세포로부터의 그들의 분비를 촉진시키기 위한 신호 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다.

서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 대해 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열 변형체, 대립유전자, 유도체 또는 돌연변형체인 폴리펩티드일 수 있고 또한 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어 이런 폴리펩티드는 하나 이상의 (1 내지 20, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5 내지 10과 같은) 아미노산의 하나 이상의 첨가, 치환, 결실 및 삽입에 의해 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에서 주어진 것과 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

폴리펩티드 서열의 퍼센트 동일성은 참조 서열(예를 들어 본 발명의 서열 번호 2 또는 서열 번호 4)를 의문 서열과 비교하는 상업적으로 이용가능한 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다. 동일성을 평가하는 다른 상세는 하기에 기술되어 있다.

의문 서열이 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 그것에 대해 GPR39 수용체 활성을 보유하는 폴리펩티드의 그것인 적어도 50% 및 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 상기 서열의 동일성을 갖는지를 결정하는데 있어서, 이런 서열은 본 발명의 부분을 형성한다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들어 암호화하는 핵산으로부터 발현에 의한 생성 후에 분리되고/거나 정제(예를 들어, 항체를 이용하여)될 수 있다. 분리되고/거나 정제된 폴리펩티드는 조성물의 제형화에 사용될 수 있고, 이것은 적어도 하나의 추가 구성성분, 예를 들어 약제학적으로 허용가능한 부형제, 운반체나 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 면역원으로서 또는 다르게는 특이적인 항체를 얻는데 사용될 수 있다. 항체는 정제와 다른 폴리펩티드의 조작, 진단 스크리닝과 치료학적 내용에서 유용하다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 그것에 결합하거나 그것의 작용이나 기능을 조절하는 분자를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이런 분자는 치료학적(가능하게는 예방적을 포함) 내용에 유용하다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 표지된 폴리펩티드 또는 그의 단편은 또한 고체상, 예를 들어 면역 분석 웰이나 딥스틱의 표면에 고정될 수 있다.

이러한 표지되고/거나 고정된 폴리펩티드는 적절한 시약, 대조군, 지시 등과 함께 적절한 용기내의 키트로 포장될 수 있다.

이러한 폴리펩티드와 키트는 면역 분석에 의한 샘플에 존재하는 이런 폴리펩티드 또는 활성 부분 또는 이의 단편에 대한 항체의 검출 방법에서 사용될 수 있다.

면역분석 방법은 본 분야에서 주지이고 일반적으로:

(a) 상기 단백질에 대한 항체에 의해 결합가능한 항원결정기(epitope)를 포함하는 폴리펩티드를 제공하고;

(b) 항체-항원 복합체의 형성을 허용하는 환경 하에서 생물학적 샘플을 상기 폴리펩티드와 배양하고;

(c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 항원-항체 복합체가 형성되는지 여부를 결정하는 것을 포함한다.

서열 동일성

핵산 및 폴리펩티드 서열의 퍼센트 동일성은 참조 서열을 의문 서열과 비교하는 상업적으로 이용가능한 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다. 하기 프로그램(National Center for Biotechnology Information에 의해 제공됨)은 상동성/동일성을 결정하기 위하여 사용될 수 있다: BLAST, gapped BLAST, BLASTN 및 PSI-BLAST, 이것은 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있다.

알고리즘 GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI)은 정합의 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화하는 2개의 완전한 서열을 정렬하는 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용한다. 일반적으로, 갭 생성 패널티 = 12 및 갭 연장 패널티 = 4를 갖는, 디폴트 파라미터가 사용된다.

핵산 서열이나 그의 부위와 의문 서열 간의 최고의 전체 정합을 결정하기 위한 다른 방법은 Brutlag et al (Comp. App. Biosci., 6; 237-245 (1990))의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램의 용도이다. 프로그램은 전체적 서열 정열을제공한다. 상기 전체 서열 정열의 결과는 퍼센트 동일성 내이다. 퍼센트 동일성을 계산하기 위한 DNA 서열의 FASTDB 조사에서 사용되는 적절한 파라미터는:Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch penalty=1, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, 및 Window Size=500 또는 더 짧을지라도 뉴클레오티드 염기 상의 의문 서열 길이. 아미노산 정렬의 퍼센트 동일성 및 상동성을 계산하기 위한 적합한 파라미터는:Matrix=PAM 150, k-tuple=2, Mismatch Penalty=l, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=l, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, 및 Window Size=500 또는 더 짧을지라도 뉴클레오티드 염기 상의 의문 서열 길이.

벡터

본 발명의 핵산 서열은 벡터, 특히 발현 벡터로 도입될 수 있다. 벡터는 호환성 숙주 세포내의 핵산을 복제하는데 사용될 수 있다. 따라서 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 벡터에 도입하고, 벡터를 호환 숙주 세포에 도입하고, 벡터의 복제를 가능케 하는 환경 하에서 숙주 세포를 성장시켜 본 발명의 제조 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 발현 벡터와 관련하여 하기에서 기술한다.

바람직하게는, 벡터내의 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 의해 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 컨트롤 서열에 작용 가능하게 링크되고, 즉 벡터는 발현 벡터이다.

용어 "작용 가능하게 링크된"은 기술된 성분이 그들의 의도된 방법으로 기능하게 하는 관계에 있는 것을 말한다. 코딩 서열에 "작용 가능하게 링크된" 컨트롤 서열은 컨트롤 서열과 호환하는 환경 하에서 코딩 서열의 발현이 달성되는 방법으로 연결된다.

적절한 벡터는 프로모터 서열, 종결 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 표지 유전자 및 다른 적절한 서열을 포함하는, 적절한 조절 서열을 포함하여 선택되거나 구성될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 예를 들어 파지, 파지미드 또는 배큘로바이러스, 코스미드 YACs, BACs, 또는 적절한 PACs일 수 있다. 벡터는 유전자 치료 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 레트로바이러스(예를 들어 HIV 또는 MLV) 또는 알파 바이러스 벡터에 기초한 벡터를 포함한다.

벡터는 복제 기원, 임의로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절자와 함께 제공될 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택가능한 표지 유전자, 예를 들어 포유류 벡터를 위한 네오마이신 내성 유전자 또는 박테리아 플라스미드의 경우, 앰피실린 저항성 유전자를 포함한다. 벡터는 예를 들어 RNA의 생성을 위하여 시험관 내에서 사용될 수 있거나, 숙주 세포를 형질감염하거나 형질전환하는데 사용될 수 있다. 벡터는 예를 들어 유전자 치료 방법에서, 생체내에서 사용하는데 또한 적용될 수 있다. 매우 다양한 다른 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝과 발현을 위한 시스템은 주지이다. 적절한 숙주 세포는 박테리아, 포유류와 효모와 같은 진핵 세포 및 배큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종유래 폴리펩티드의 발현을 위한 본 분야에서 이용가능한 포유류 세포주는 Chinese hamster ovary 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, COS 세포 및 많은 다른 것들을 포함한다.

프로모터 및 다른 발현 조절 신호는 발현 벡터가 디자인되는 숙주 세포와 호환가능하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 효모 프로모터는 S. cerevisiae GAL4 및 ADH 프로모터, S. pombe nmt1 및 adh 프로모터를 함유한다. 포유류 프로모터는 카드뮴과 같은 중금속에 반응하여 유도될 수 있는 메탈로티오네인 프로모터를 함유한다. SV40 대형 T 항원 프로모터 또는 아데노바이러스 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 또한 사용될 수 있다. 이런 모든 프로모터는 본 분야에서 쉽게 이용가능하다.

벡터는 삽입된 핵산의 발현을 하게 하는 프로모터나 인핸서와 같은 다른 서열, 숙주 세포에서 생성된 폴리펩티드가 세포로부터 분비되도록 하기 위한 분비 신호를 암호화하는 핵산 및/또는 융합으로써, 폴리펩티드를 생성하도록 하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.

유전자 치료에서의 사용을 위한 본 발명의 폴리펩티드의 생성용 벡터는 본 발명의 미니-유전자를 운반하는 벡터를 포함한다. 따라서, 본 발명의 목적은 GPR39 GPCR 및 그의 활성의 불충분한 발현에 관련된 비정상적 증상을 치료하는 방법을 제공하는 것이고, 상기 방법은 GPR39 GPCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 포함한다. 특히, 예를 들어, 덤핑 증후군과 같은 위 배출 증가, 또는, 설사, 설사-IBS 및 혼합-IBS와 같은 장 운동성 증가을 치료하기 위한 방법이다. 유전자 치료에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 대상에서 관련된 세포에 의한 GPR39 GPCR의 내부 생산에 영향을 미치는 데 이용된다. 예를 들어, GPR39 GPCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현을 위하여 상기에서 제공된 바, 복제 결함 레트로바이러스의 벡터에 엔지니어링될 수 있다. 레트로바이러스의 발현 컨스트럭트는 그 다음 분리되고, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 플라스미드 벡터로 형질 도입된 패키징 세포에 도입될 수 있고, 패키징 세포는 이제 대상 유전자를 함유하는 전염성의 바이러스 파티클을 생산한다. 이러한 생산자 세포들은 생체내에서 폴리펩티드의 발현과 생체 내에서 세포의 엔지니어링을 위하여 대상에 도입될 수 있다. 유전자 치료에 대한 리뷰는 Chapter20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, in Human Molecular Genetics, T. Strachan and A.P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd.(1996) 참고.

다른 자세한 것을 위하여, 예를 들어, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조. 예를 들어 핵산 구성의 제조, 돌연변이유발, 시퀀싱, DNA를 세포에 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에서 핵산의 조작을 위한 많은 공지의 기술과 프로토콜은 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. des., John Wiley & Sons, 1992에 상세하게 설명되어 있다.

벡터는 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 상기의 적절한 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 따라서 다른 면에서 본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 서열의 벡터에 의한 발현을 제공하는 환경 하에서 상기의 발현 벡터로 형질전환이나 형질감염된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제조하는 과정을 제공한다. 폴리펩티드는 또한 망상적혈구 용해질과 같은, 시험관내 시스템에서 발현된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 복제와 발현을 위한 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 벡터와 호환가능한 것으로 선택될 것이고 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충이나 포유류일 수 있다. 숙주 세포는 유전자의 발현을 위한 환경 하에서 배양될 수 있고, 따라서 암호화된 폴리펩티드가 생성된다. 만약 폴리펩티드가 적절한 신호 리더 펩티드와 커플되어 발현된다면 그것은 세포로부터 배양 배지로 분비될 것이다. 발현에 의한 제조 후에, 폴리펩티드는 경우에 따라, 숙주 세포 및/또는 배양액으로부터 분리 및/또는 정제될 수 있으며, 그리고 그 뒤에, 바람직하게 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 약제학적 수용가능한 부형제(excipient), 매개제(vehicle), 담체를 함유하는 약제학적 조성물과 같은 하나 또는 그 이상의 추가적인 성분을 함유하는 조성물의 제형화에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한 안티센스 RNA나 리보자임의 생성을 제공하기 위하여 안티센스 기원으로 상기 기재된 상기의 벡터로 삽입될 수 있다.

분석

본 발명의 목적은 위장 운동 및 콜레스테롤 항상성을 조절하는 화합물을 확인하는 분석을 제공하는 것이고, 이 분석은: 본 발명에 따른 GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 제공하는 것, 상기 단백질과 잠재적인 결합화합물을 접촉시키고, 상기 화합물이 상기 화합물과 상호작용할 수 있는지 결정하는 것을 포함한다.

분석의 한 구체예에서, 수용체 또는 수용체의 서브유닛은 결합 분석에 사용될 수 있다. 결합 분석은 경쟁성 또는 비경쟁성일수 있다. 이런 분석은 어떤 화합물이 폴리펩티드에 결합할 수 있는지를 결정하는 매우 많은 화합물의 신속한 스크리닝을 제공할 수 있다. 이어서, 보다 상세한 분석은 이런 화합물이 본 발명의 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제로서 작용하는지 여부를 추가로 결정하기 위하여, 결합하는 것으로 밝혀진 그 화합물로 수행될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 위장 운동 및 콜레스테롤 항상성을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는 것이고, 방법은:

(i) 본 발명에 따라 GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주 세포와 상기 화합물을 결합에 적합한 환경 하에서 접촉시키고,

(ii) 상기 수용체 단백질에 화합물의 결합을 검출하는 것을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 위장 운동을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하고, 방법은:

(i) 본 발명에 따라 GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주 세포로부터의 막 제제와, 상기 화합물을 결합에 적합한 환경 하에서 접촉시키고,

(ii) 상기 수용체 단백질에 화합물의 결합을 검출하는 것을 포함한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 위장 운동을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하고, 방법은:

(i) 본 발명에 따라 GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주 세포를 시험할 화합물의 존재 및 부재 하 둘다에서, GPR39 수용체 단백질에 결합한다고 알려진 화합물과 접촉시키고,

(ii) GPR39 GPCR 수용체 단백질에 결합한다고 알려진 화합물의 결합에 상기 화합물의 영향을 측정하는 경쟁적 결합 어세이를 포함한다.

시험할 화합물의 존재하에서, GPR39 수용체 단백질에 결합한다고 알려진 화합물 결합의 감소는 상기 화합물이 GPR39 수용체 단백질에 결합한다는 것을 나타낸다. GPR39 수용체 단백질의 자연적 리간드인 오베스타틴은 그렐린과 같은 프로 호르몬으로부터 유래된 다른 펩티드로써, 최근 확인되었다(Zhang, J.V. et al. , 2004 Science VoI.310,-996- 999). 다른 구체예에서, 수용체에 결합한다고 알려진 화합물은 오베스타틴으로 구성되고, 더욱 구체적으로 도 5에 개시된 오베스타틴 서열의 하나로부터 선택되고, 예를 들어, 서열 번호 8 내지 19, 보다 상세하게, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10으로부터 선택된다. 대신으로 본 발명에서 사용된 바 오베스타틴은 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열에 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 펩티드를 언급한다.

대신하는 구체예에서, 상기 언급된 경쟁적 결합 분석은 본 발명에 따라 GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주 세포의 막 제제에 수행된다. 상기 숙주 세포를 준비하고 그러한 세포들로부터 막 제제를 준비하는 방법은 이하 기술된다.

특정 구체예에서, 상기 언급된 결합 분석에서 GPR39 수용체 단백질은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 상기 언급된 서열번호를 갖는 단백질의 스플라이스 변형체 및 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 바람직하게 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질이다.

여기서 이용된 바, GPR39 단백질의 부분은 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 폴리펩티드의 단편을 포함하는 것을 의미하며, 상기 단편은 적어도 10, 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50, 75, 100 또는 150 또는 그 이상의 아미노산 크기이다. 그러한 단편들은 서열 번호 2 또는 서열 번호 4 각각의 N-말단 영역으로부터 유래될 수 있다. N-말단 영역을 함유하는 단편은 수용체 결합 부위를 제공하는 수용체의 세포외 부분을 재구성하는 데 이용될 수 있다. 바람직하게, 단편은 GPR39 수용체 단백질에 결합한다고 알려진 화합물에 결합할 능력을 보유할 것이다.

막 제제

본 발명의 수용체 단백질을 발현하는 세포 막은 리간드 결합 분석, GTP-γ-S결합 분석 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정한 타입의 분석에 유용하다. 준비된 상기 세포 막의 특성은 다음의 분석의 원리에 의하여 결정되는 몇몇 경우에 있을 수 있으나, 전형적으로 전체 세포를 거두는 것과 예를 들어, 얼음처럼 차가운 완충액(예를 들어, 20 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4, 4℃)에서의 소니케이션(sonication)에 의하여 세포를 분쇄하는 것을 함유한다. 그 뒤에, 예를 들어, 4℃, 200xg에서 5분동안의 저속 원심분리를 하여, 결과적인 정제되지 않은 세포 용해물의 세포 파편을 제거한다. 예를 들어, 4℃, 40,000xg에서 20분 동안과 같은, 고속의 원심분리 단계를 이용하여, 한층 더한 제거 및 막 농축(enrichment)을 수행하며, 결과적인 막 펠렛(pellet)을 얼음처럼 차가운 완충액에 현탁시키는 것과 고속 원심분리 단계를 반복하는 것에 의하여 세척시킨다. 최종적으로 세척된 막 펠렛을 분석 완충액에 재현탁시킨다. 기준대로 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 이용한 브래드포드(Bradford (1976))의 방법에 의하여 단백질 농도를 측정한다. 막을 즉시 이용하거나, 다음 이용을 위하여 얼릴 수 있다.

방사성 표지된 리간드 결합 분석

본 발명의 수용체를 발현하는 세포는 상기 수용체를 위한 리간드의 스크리닝에 이용될 수 있다. 동일한 분석은 다양한 치료적 목적용으로 이용될 수 있는 수용체의 작용제 또는 길항제를 확인하는 데 이용될 수 있다.

방사성리간드 결합 분석은 예를 들어, 2.1% 소 혈청 알부민(Sigma), 아프로티닌(aprotinin)(0.005 mg/ml, Boehringer Mannheim) 및 단백질분해효소 저해제로서 베스타틴(bestatin)(01. mM, Sigma)를 포함하는 50 mM Tris buffer (pH = 7.4 at 0℃) 와 같은 적절한 완충액 내에서 수용체를 발현하는 세포로부터 준비된 막을 희석함으로써, 수행한다. 분석에서 최종 단백질 농도는 전형적으로 12-40 ㎍/㎖내에 있다.

그 다음, 경쟁 리간드의 존재 또는 부재 하에서, 막을 방사성표지된 리간드와 함께, 96웰 마이크로리터 플레이트 250㎕의 전체 부피에서, 얼음에 60분동안 인큐베이션 시켰다. 그 다음, Tomtec (Wallac) 진공 필터 장치를 이용한, 0.5% 폴리에틸렌이민(PEI)에 미리 담궈둔 GF/B 필터를 통한 필터를 하여, 결합된 리간드를 자유 리간드로부터 분리시켰다. Ready Safe (Beckman) 신틸레이션(scintillation) 유체의 첨가 후에, 결합된 방사성활성을 Trilux (Wallac) scintillation counter (결합 수의 거의 40% 카운팅 효율성)를 이용하여 정량화하였다. 대신하여, 결합된 리간드를 수집하고, 그 다음, 본 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 수용체로부터 리간드를 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 데이터는 GraphPad prism을 이용한 비-직선 커브에 맞춘다.

이러한 방식으로, 수용체에 결합하는 작용제 또는 길항제 화합물은 그들이 상기 수용체를 발현하는 세포의 막 단백질에 방사성표지된 리간드의 결합을 방해하기 때문에, 확인할 수 있다. 비-특이적 결합은 이용된 방사성리간드에 상응하는 비표지된 펩티드의 100nM의 존재하에서, 막 제제의 인큐베이션 후에, 남아있는 방사성활성의 양으로써, 정의된다. 평형 포화 결합 분석에서, 수용체로 형질감염된 완전한 세포들 또는 막 제제를 표지된 화합물의 증가된 농도의 존재하에서, 인큐베이션시켜, 표지된 리간드의 결합 친화도를 결정하였다. 치환된 리간드의 다양한 농도의 존재하에서, 표지된 화합물의 고정된 농도를 이용한, 평형 경쟁 결합 분석으로 표지되지 않은 화합물의 결합 친화도를 결정할 수 있다.

특정 구체예에서, 방사성표지된, 상기에서 정의된 오베스타틴을 이용하여 상기 언급한 방사성리간드 결합 분석을 수행한다. 오베스타틴의 표지화 및 수용체 결합은 Zhang, J.V. et al . (2004 Science Vol.310;996-999)에 개시된다. 간단하게;

Iodogen (Pierce, Upland, IN) 과정을 이용하여 오베스타틴의 아이오딘화를 수행하였다. 펩티드(20㎍) 및 1mCi[¹²⁵I] NaI의 혼합물을 미리 코팅한 Iodogen 바이얼에 옮기고, 4분 동안 인큐베이션시켰다. ¹²⁵I-표지된 펩티드를 60% 아세토니트릴/0.1%TFA로 용리하기 전에 Sep-Pak C18 cartridge (Waters)에 적용시켰다. 방사성리간드 결합 분석을 위하여, 랫 빈창자 또는 다른 조직들을 완충액 A(20 mM Hepes, 5 mM EDTA, 1 mM 디티오트레이톨(DTT), 10 μM 아미디노페닐메탄술포닐 플루오라이드, 5 mg/L 류펩틴, 100 mM KCl, pH 7.5)로 세척하고, 작은 조각으로 자르고, 동력화 균질기를 이용하여 균질화시켰다. 균질액을 1,000g에서 5분 동안 원심분리시키고, 상층액을 300,000g, 2℃에서 1시간 동안 원심분리시켰다. 펠렛(조 막 단편)을 KCl을 제외한 완충액 A에 재현탁시키고, 액상 질소 하에서 빠르게 동결시켰으며, 이용할 때까지 -80℃에 보관하였다. 1,000-배 초과의 표지되지 않은 오베스타틴의 존재 또는 부재하에서, ¹²⁵I-오베스타틴의 다양한 농도로, 조직 균질액을 0.1%의 소 혈청 알부민을 함유하는 100㎕의 인산 완충 식염수 내에서, 실온에서 18시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 튜브를 10,000g에서 10분 동안 원심분리시키고, γ-분광광도계로 방사성활성을 정량화하기 전에, 펠렛을 얼음처럼 차가운 PBS로 두번 세척하였다. 전체 결합으로부터 비특이적 결합을 제외하는 것에 의하여 특이적 결합을 계산하였다. 치환 곡선을 위하여, ¹²⁵I-오베스타틴의 고정된 농도를 오베스타틴 또는 다른 펩티드의 증가된 농도와 함께 또는 없이, 인큐베이션시켰다.

상기 언급한 결합 분석에 덧붙여, 위장 운동을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 기능적 분석을 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이며, 상기 화합물은 본 발명에 따른 GPR39 수용체 단백질의 활성을 조절하는 것으로 특성화된다. 상기 분석은;

(i) 시험할 화합물과 GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 접촉시키는 단계, 및

(ii) GPR39 수용체 단백질의 활성을 측정하는, 여기서, 시료 화합물의 존재 하에서, GPR39 활성의 변화는 위장 운동을 조절할 수 있는 화합물을 지시하는 것인 단계을 포함한다.

결합하고/거나 GPR39 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 개시된 구체예의 전부에서, 주어진 콜레스테롤 항상성에서 관찰된 GPR39의 관여는 상기 분석이 인간 및 온혈 동물을 포함하는 대상에서 콜레스테롤 항상성에 영향을 미칠 수 있는 화합물을 확인하는 데 이용할 수 있음을 말한다.

본 발명의 폴리펩티드의 활성을 조절하는

화합물은 폴리펩티드의 활성을 변형시켜, 화합물의 부재하에서 보다, 화합물의 존재하에서 다르게 행동하는 화합물을 언급한다. 조절에 영향을 미치는 화합물은 작용제 및 길항제를 함유한다. 작용제는 GPR39 GPCR 기능을 활성화시키는 화합물을 포함한다. 대신하여, 길항제는 GPR39 GPCR 기능을 방해하는 화합물을 포함한다. 전형적으로, 길항제의 영향은 작용제-유발된 수용체 활성화의 차단으로써, 관찰되며, 그러나, 구조적으로 활성이 있는 수용체로서, 최근 개시된 GPR39의 경우에, GPR39 GPCR 기능을 방해하는 화합물은 또한, 역 작용제, 예를 들어, 수용체에 대한 작용제로써 같은 수용체 결합-부위에 결합하나 반대 약리학적 영향을 가하는 제제를 포함한다. 길항제는 비-경쟁적 길항제 뿐만 아니라, 경쟁적을 포함한다. 경쟁적 길항제(또는 경쟁적 차단제)는 작용제 결합을 위하여 특이적 부위와 또는 근처와 상호작용한다. 비-경쟁적 길항제 또는 차단제는 작용제 상호작용 부위를 제외한 부위와 상호작용함으로써, 수용체의 기능을 비활성화시킨다.

따라서, 본 발명의 목적은 위 배출 및/또는 결장 운동성을 증가시킬 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는 것이고, 상기 방법은;

(i) GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주세포와, 시험할 화합물을 상기 수용체 단백질의 활성화를 허용하는 환경 하에서 접촉시키고, (ⅱ) GPR39 수용체 활성에서 얼마간의 증가를 감지하고, 이에 따라 위 배출 및/또는 결장 운동을 증가시킬 수 있는 화합물로써, 시료 화합물을 확인하는 것을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 위 배출 및/또는 결장 운동을 감소시킬 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은;

(i) GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주세포와, 시험할 화합물을 상기 수용체 단백질의 활성화를 허용하는 환경 하에서 접촉시키고, (ⅱ) GPR39 수용체 활성에서 얼마간의 증가를 감지하고, 이에 따라 위 배출 및/또는 결장 운동을 증가시킬 수 있는 화합물로써, 시료 화합물을 확인하는 것을 포함한다.

다시, 상기 언급한 결합 분석용으로써, 상기 언급된 활성 분석은 또한 콜레스테롤 대사작용을 조절하는 화합물을 확인하는 데 이용될 수 있다. 관찰된 표현형에 기초하여, GPR39 활성을 증가시키는 화합물이 콜레스테롤 수치를 낮추게 되고, GPR39 활성을 감소시키는 화합물은 콜레스테롤 수치를 높이게 되는 것으로 기대된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 콜레스테롤 수치를 낮출 수 있는 화합물을 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은;

(i) GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주세포와, 시험할 화합물을 상기 수용체 단백질의 활성화를 허용하는 환경 하에서 접촉시키고, (ⅱ) GPR39 수용체 활성에서 얼마간의 증가를 감지하고, 이에 따라 콜레스테롤 수치를 낮출 수 있는 화합물로써, 시료 화합물을 확인하는 것을 포함한다.

GPR39 활성에서 화합물의 영향은 세포내 칼슘, cAMP 또는 리포터 유전자 산물과 같은 GPR39에 의하여 매개되는 세포내 2차 전령 형성의 증가 또는 감소일 수 있다. GPR39는 G-단백질 커플된 수용체(GPCRs)로 알려진 단백질의 분류에 속한다. GPCR은 리간드의 결합에 따라 세포 막을 가로질러 신호를 전달한다. 리간드-결합 GPCR은 아데닐산 고리화효소 경로 또는 포스포리파제 C-β 경로와 같은 헤테로삼량체 G 단백질에 의하여 매개되는 세포내 신호 사건을 활성화한다. 상기 언급된 세포내 신호 사건의 활성화를 측정하기 위한 분석은 일반적으로 본 분야에 알려져 있으며, cAMP 반응 요소-규제된 리포터 분석 또는 다중 반응 요소를 이용한 G 단백질 커플된 수용체로부터 반응의 측정 또는 발광단에 커플된 고리-뉴클레오티드를 이용한 세포-신호 분석, 형광 세기 분포 분석을 이용한 G 단백질 커플된 수용체용 결합 분석, 키메라 리간드-유도가능한 전사 요소를 포함하는 신호 전달용 세포에 기초한 분석을 함유한다. 이러한 몇몇 분석에 대한 기술은 뒤에 온다.

본 발명은 또한, GPR39 GPCR 유전자의 조정 영역을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 생물학적 분석을 제공한다. 이러한 분석은 본 발명의 폴리펩티드(바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4)를 발현할 수 있는 인간 또는 랫 세포들을 이용하여 실시한다. 세포는 조정 영역을 조절하기 위한 능력이 알려져 있는, 적어도 하나의 화합물과 접촉시킨다. 그 후, 본 발명의 핵산의 발현을 위하여 세포를 감시한다. 대신하여, 프로모터는 리포터 유전자에 링크될 수 있다. 채용될 수 있는 적합한 리포터 유전자는 예를 들어, 클로람페니콜 아세틸전이효소 유전자, 루시퍼라제 유전자 등을 함유한다.

본 분야의 숙련자에 의하여 이해된 바, 본 발명의 폴리펩티드와 같이 수용체의 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 생물학적 분석 방법은 일반적으로 대조군과의 비교가 필요하다. 대조군

의 일 형태는 대조군

세포 또는 배양이 화합물에 노출되지 않은 차이점을 갖고, 화합물에 노출되는 시험 세포 또는 시험 배양과 동일하게 실질적으로 처리된 세포 또는 배양이다. 채용될 수 있는 대조군

세포 또는 배양의 다른 형태는 대조군

세포 또는 배양이 기능적 GPR39 GPCR을 발현하지 않는 것을 제외하고, 형질 감염된 세포와 동일하다. 따라서, 같은 반응 환경 하에서 같은 화합물에 대한 형질 감염된 세포의 반응은 , 대조군

세포 또는 배양의 그것과 비교될 수 있다.

분석의 특히 바람직한 형태는 결합 분석 및 기능적 분석을 함유하며, 이는 다음과 같이 수행될 수 있다:

결합 분석

세포주(포유동물 HEK 293 세포, CHO 세포 및 Sf9 곤충 세포 포함)에서 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 과-발현은 리간드 결합 연구를 위하여 상기 폴리펩티드(편의를 위하여 이 섹션에서 GPR39 GPCR으로써 언급함)를 함유하는 막 제제를 생산하는 데 이용될 수 있다. 이러한 막 제제는 방사성-표지된 리간드의 결합 및 결합 부위의 경쟁자에 의한 상기 방사성-리간드의 치환을 감지하기 위하여, 전통적인 필터-결합 분석(예를 들어 Brandel 필터 분석 장비를 이용하여) 또는 고 효율 신틸레이션 근접 타입 결합 분석(SPA 및 Cytostar-T flashplate technology; Amersham Pharmacia Biotech)에 이용될 수 있다. 방사성활성은 96-, 384-, 1536- 마이크로타이터 웰 형식으로부터 급속 측정을 수행할 수 있는 Packard Topcount 또는 유사 기기로 측정될 수 있다. SPA/Cytostar-T 기술은 특히 고효율 스크리닝을 분석할 수 있고, 이에 따라, 이러한 기술은 표준 리간드를 치환할 수 있는 화합물의 스크리닝으로써의 용도에 적합하다.

본래의 위치에 근접한 환경에서 GPR39 GPCR 단백질에 리간드의 결합을 연구하기 위한 다른 접근은 Biacore 기기(Malmqvist M. , Biochem Soc Trans. 1999 Feb;27 (2) :335-40)에 의하여 행해지는 표면 플라스몬 공진 영향을 이용한다. 막 제제 또는 전체 세포에서 GPR39 GPCR은 Biacore의 바이오센터 칩에 부착될 수 있으며, 리간드의 결합은 화합물의 존재 및 부재 하에서 시험하여, 결합 부위의 경쟁자를 확인할 수 있다.

기능적 분석

GPR39 GPCR이 일반적으로 GIRK(내측으로 정류하는 칼륨 채널)와 상호작용하는 Gi 또는 Go(억제적 G 단백질)를 통하여 행동하기 때문에, 칼륨 이온 유동은 이러한 수용체들의 활성화를 초래하여야 한다. 이러한 이온의 유동은 특정 화합물의 작용제 또는 길항제 효과를 결정하기 위한 다양한 기술을 이용하여 실시간으로 측정될 수 있다. 따라서, 세포주 또는 예를 들어 개구리 난자(Xenopus oocytes)에서 발현되는 재조합 GPR39 GPCR 수용체는 단일 채널 전기생리학 및 전체 세포를 이용하여 특성화되어, 관심있는 화합물의 활동 메카니즘을 결정할 수 있다. GPR39 GPCR에서 활성있는 화합물을 위한 전기생리학적 스크리닝은 전통적인 전기생리학적 기술과, 그들이 유용하게 될 때, 현재 개발 중에 있는 새로운 고효율 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

형광성 칼슘 및 나트륨 유동은 fluo-3, fluo-4, fluo-5N, fura red, 소듐 그린, SBFI 및 Molecular Probes를 포함하는 공급자로부터의 다른 유사 프로브를 함유하는 몇몇 이온-과민 형광 색소를 이용하여 측정가능하다. GPR39 GPCR의 결과로써, 칼슘 및 나트륨 유동은 이미지 분석 알고리즘과 연결된 레이져 컨포컬 방법과 함께 또는 없는 형광 현미경을 함유한 형광 분석(fluorometric) 및 형광 이미지 기술을 이용하여 실시간으로 특성화될 수 있다.

다른 분석은 칼슘 일과성에 영향을 미치는 작용제 또는 조절자 둘 중 하나로써 활성있는 화합물을 위한 고효율 스크리닝 분석이다. 이러한 분석은 FLuorescence Imaging Plate Reader ((FLIPR®), Molecular Devices Corporation)라 불리는 기기에 기초한다. 그것의 가장 공통적인 구성에서, 그것은 플루오레세인-기초의 색소에 의하여 방사되는 형광성을 자극시키고, 측정한다. 방사된 형광성을 잡기 위한 민감하고 정확한 CCD 카메라 및 96-/384-웰 플레이트의 바닥을 신속하게 스캔하기 위한 광학 시스템은 488㎚의 형광단에서 큰 힘의 자극을 생산하는 데 아르곤-이온 레이져를 이용한다. 그것은 또한 96-/384-웰 플레이트의 웰에 시료 제제의 용액을 운반하기 위한 기기를 허용하는 96-/384-웰 피펫팅 헤드를 함유한다. FLIPR 분석은 화합물의 첨가 전, 동안 및 후에, 모든 96-/384-웰로부터 동시에 실시간으로 세포 집단으로부터의 형광성 신호를 측정하기 위하여 설계된다. FLIPR 분석은 세포 주에서 발현되는 재조합 GPR39 GPCR, 예를 들면 랫 또는 인간 GPR39 GPCR에서 기능적으로 활성 있는 화합물을 스크린하고 특성화하는 데 이용될 수 있다. 아래에서 기술한 대로, GPR39 GPCR로 형질감염된 세포에서 칼슘 일과성을 FLIPR 분석을 이용하여 측정하여, 수용체의 자연적 리간드를 결정하기 위한, 다양한 기질에 의한 수용체의 활성을 측정할 수 있다.

고리 AMP( cAMP ) 분석 - 고리 AMP(cAMP) 형성의 수용체-매개 자극 또는 억제는 수용체를 발현하는 세포 내에서 분석될 수 있다. cAMP 분석을 위한 바람직한 프로토콜은 이하에서 제공된다.

이러한 프로토콜에서 COS-7 세포를 DEAE-덱스트란 방법을 이용하여 리포터 유전자와 함께 일시적으로 형질감염시키며, 96-웰 공간에 플레이팅시킨다. 형질감염 48시간 후에, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코오스 및 5 mM 테오필린으로 보충되는 Dulbecco's 인산 완충 식염수(FES)로 세포를 두번 세척하고, 같은 완충액 내에서 5% CO₂, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시킨다. 시료 화합물을 첨가하고, 37℃에서 추가적으로 10분 동안 인큐베이션시킨다. 그 다음, 배지를 빨아들이고, 100mM HCl을 첨가하여 반응을 중지시킨다. cAMP 측정을 위하여 플레이트를 20℃에서 2-5일 동안 저장한 다음, 플레이트를 용해시키고, 각 웰 내의 cAMP 함량을 cAMP Scintillation Proximity Assay (Amersham Pharmacia Biotech)로 측정한다. microbeta Trilux counter (Wallac)을 이용하여 방사성 활성을 정량화한다.

마이크로물리계측 분석( Microphysiometric assay) - 세포 대사는 넓은 범위의 세포적 사건(다중 전령 경로의 수용체 활성화 포함)에 복잡하게 관계되기 때문에, 수용체의 신호 경로의 특성에 관계없이 임의의 추정 수용체의 활성화로부터 발생하는 세포 활성의 일반적 분석을 제공하는 것이 세포 대사의 마이크로물리계측 분석의 용도일 수 있다.

일과성 수용체 발현을 위한 일반적인 지침, 세포 제제 및 마이크로물리계측 기록은 다른 곳에서 기술된다(Salon, J. A. and Cwicki, J. A., 1996). 전형적으로 수용체를 발현하는 세포를 수집하고, 실험 24시간 전에, 완전한 배지에서 마이크로물리미터 캡슐 당 3 x 10⁵세포를 시드한다. 기록 16시간 전에, 배지를 세럼이 없는 배지로 바꿔 분류되고 불분명한 세럼 요소에 의한 비-특이적 대사 자극을 최소화한다. 실험의 첫째 날, 세포 캡슐을 마이크로물리미터로 이동시키고, 기저 대사 활성의 베이스라인 측정이 확립되는 동안, 기록 배지(바이카르보네이트가 없고, 세럼이 없고, 0.1-1% 지방산이 없는 BSA를 함유하는 low buffer RPMI 1640(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA))에 평형화되도록 허용한다.

표준 기록 프로토콜은 산성화 희귀 측정이 수행되는 동안, 30초 흐름 방해를 포함하는 2분의 전체 펌프 사이클과 함께 100㎕/분 유동비로 특성화된다. 리간드 시험은 첫번째 시험후 비율 측정이 수행되기 바로 전에 샘플에 1분 20초의 노출, 이어서, 전체 5분 20초 동안 샘플 노출의 추가적인 펌프 사이클을 포함한다. 전형적으로 최초 스크린에서 약물은 세포에서, 10 μM 최종 농도를 나타낸다.

활성 화합물의 복용량-의존성을 시험하기 위한 다음 실험은 그 다음, 역치에서부터 최대 레벨까지의 반응을 생성하기 위하여 필요한 양을 초과하는 약물 농도 범위로, 순차적으로 시험되는 세포에 의하여 수행된다. 그 다음, 리간드 샘플을 세척하며, 기록된 산성화 비율은 시험 바로 전에 관찰된 베이스라인 비율에 대한, 피크 반응의 증가 퍼센트로써 나타난다.

본 발명의 폴리펩티드의 활성을 조절하는 것으로 밝혀진 화합물은 GPR39가 위장 운동 및 콜레스테롤 항상성의 조절에 속한다는 발견에 기초하여 수많은 치료적 용도를 갖는다. 특히, 이는 예를 들어, 장폐쇄증 수술-후 위마비, 당뇨병에서 위마비, 기능성 소화불량, 미주신경절제술-후 위마비 및 특발성 장 가성-막힘과 같은 위 배출 지연에 관련된 질환을 함유한다. 더욱이, 이는 예를 들어, 덤핑 증후군 또는 설사, 설사-IBS 및 혼합-IBS와 같은 위 배출 증가에 관련된 질환을 함유한다. 더욱이, 콜레스테롤 항상성에서 관찰된 영향에 기초하여, 이는 또한 죽상동맥경화증과 같은 증가된 콜레스테롤 레벨과 관련된 특정 심혈관 질환과 함께 대사 증후군을 함유한다. 요약하여, GPR39 GPCR 및 관련된 수용체는 다양한 치료적 분야에서 약 개발을 위한 중요한 도구로써, 이용될 수 있다.

결합 약제

따라서 본 발명은 본 발명에 따른 분석에 의해 얻어지는 조절제 및 이 약제를 포함하는 조성물을 포함하는 신규의 결합제를 또한 제공한다. 수용체에 결합하고 작용제 또는 길항제 활성을 가질 수 있는 약제는 병리가 GPR39 GPCR 수용체를 통한 작용으로 특성화되는 상기에서 특성화된 질환을 치료하는 방법에서 사용될 수 있고 이런 용도 형태는 본 발명의 다른 면을 형성한다.

약제는 본 발명 약제의 유효량으로 투여될 수 있다. 많은 상기-언급된 증상이 만성이거나 종종 불치이기 때문에, "치료" 는 몇 시간, 몇일, 또는 몇주와 같은 시간의 기간동안 증상이 감소되는 것을 포함하고 질병 진행을 감소시키는 것을 포함하는 것으로 의도된다고 이해될 것이다.

이 약제는 약제학적으로 허용가능한 담체나 희석제와 함께 약제를 포함하는 조성물로 제형화될 수 있다. 약제는 에스테르 또는 산 부가 염이나 염기 금속 염과 같은 염 또는 N 또는 S 산화물과 같은, 생리학적으로 기능적인 유도체의 형태일 수 있다. 조성물은 모든 적절한 경로와 투여 방법으로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체와 희석제는 경구, 직장, 비강, 흡입, 국소(입과 혀아래 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 내피, 포막내 및 경막외를 포함) 투여에 적합한 제제에서 사용되는 것을 포함한다. 담체나 희석제의 선택은 물론 약제와 그것의 치료학적 목적에 의존할 수 있는, 제안된 투여 경로에 따를 것이다. 제제는 편리하게 단위 복용 형태로 제시될 수 있고 약학 분야에서 주지인 모든 방법에 의해 제조될 수 있다. 이런 방법은 활성 성분을 하나 이상의 보조 성분으로 구성되는 담체와 결합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 제제는 활성 성분을 액체 담체나 정교하게 분리된 고체 담체나 양쪽 전부와 일정하고 밀접하게 결합시키고 다음 필요한 경우 생성물의 모양을 만들어서 제조된다.

고체 조성물에 대하여, 통상적인 비독성 고체 담체는 예를 들어 약제학적 등급의 마니톨, 락토스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈컴, 글루코스, 수크로스, 마그네슘 카보네이트 등이 사용될 수 있다. 상기에서 정의된 활성 화합물은 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 아세틸화 트리글리세리드 등을 담체로 사용하는 좌약으로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 투여가능한 액체 조성물은 예를 들어, 물, 식염수 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 담체에서의 부수적인 약제학적 애쥬번트와 활성 화합물의, 상기에서 정의된 용해, 분산 등에 의해 제조할 수 있고, 따라서 용액이나 현탁액을 형성할 수 있다. 원하는 경우, 투여되는 약제학적 조성물은 또한 습윤제 또는 에멀전화제, pH 완충제 등, 예를 들어 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등과 같은 소량의 비독성 보조 물질을 포함할 수 있다. 이런 복용 형태를 제조하는 실제적인 방법은 본 분야의 당업자에게 공지이거나 명백할 것이다; 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, Mack Published Company, Easton, Pennsylvania, 15th Edition, 1975 참조.

투여되는 조성물 또는 제제는 임의의 경우에서, 치료하는 대상의 증상을 완화시키기 위한 유효량으로 활성 화합물의 양을 함유할 것이다.

비독성 담체로부터 구성되는 균형을 갖는 0.25 내지 95% 범위에서 활성 성분을 함유하는 복용 형태나 조성물이 제조될 수 있다.

경구 투여를 위하여, 약제학적으로 허용가능한 비독성 조성물이 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 수준의 마니톨, 락토스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 소듐 크로스카멜로스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈컴, 글루코스, 수크로스, 마그네슘, 카보네이트 등과 같은 보통 사용되는 부형제의 임의의 것을 병합하여 형성된다. 이런 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제제 등의 형태를 취한다. 이런 조성물은 1% 내지 95%의 활성 성분, 보다 바람직하게는 2 내지 50%, 가장 바람직하게는 5 내지 8%를 함유할 수 있다.

비경구적 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사로 특성화된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체 또는 용액이나 현탁액으로 적합한 고체 형태, 또는 에멀전으로 통상적인 형태로 준비될 수 있다. 적절한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 원하는 경우, 투여되는 약제학적 조성물은 예를 들어 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 트리에탄아민 소듐 아세테이트 등과 같은 습윤제 또는 에멀젼제, pH 완충제 등과 같은 소량의 비독성 보조 물질을 함유할 수 있다. 이런 모체 조성물에 함유되어 있는 활성 화합물의 퍼센트는 그의 특이적인 본질과 화합물의 활성과 대상의 필요에 크게 따른다. 하지만, 용액 중의 0.1% 내지 10%의 활성 성분의 퍼센티지는 사용가능하고, 조성물이 상기 퍼센트에 이어서 희석될 고체라면 더 높을 것이다. 바람직하게는, 조성물은 용액 중에 0.2 내지 2%의 활성제를 포함할 것이다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 위 배출 지연, 예를 들어, 장폐쇄증 수술-후 위마비, 당뇨병에서 위마비, 기능성 소화불량 및 미주신경절제술-후 위마비 및 특발성 장-가상 막힘과 같은 위 배출 지연에 관련된 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이며, 상기 조성물은 GPR39 수용체 길항제를 포함한다.

본 발명의 다른 목적은 콜레스테롤 레벨 증가, 위 배출 증가, 예를 들어, 담핑 증후군과 같은 위 배출 증가와 관련된 질환 또는 설사, 설사-IBS 및 혼합-IBX와 같은 대장 운동성 증가의 치료를 위한 약제학적 조성물이며, 상기 조성물은 GPR39 작용제를 포함한다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 위 배출 지연과 관련된 질환 증상의 치료를 위한 약제의 제조에서, GPR39 길항제의 용도를 제공하는 것이다. 특히, 장폐쇄증 수술-후 위마비, 당뇨병에서 위마비, 기능성 소화불량 및 미주신경절제술-후 위마비 및 특발성 장-가상 막힘의 치료이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 위 배출 증가와 관련된 질환 증상 치료하기 위한 약제의 제조에서, GPR39 작용제의 용도를 제공한다. 특히, 덤핑 증후군, 설사, 설사-IBS 및 혼합-IBS의 치료이다.

본 발명은 하기 실험 설명을 참고로 하여 더욱 이해될 것이며, 본 분야의 기술자는 하기 청구범위에서 더욱 전체적으로 기술된 바, 이는 단지 본 발명의 일례라는 것을 이해할 것이다. 추가로, 본 명세서에서 다양한 공개문헌을 인용하다. 공개문헌은 본 발명이 포함하는 본 분야의 상태를 더욱 전체적으로 설명하기 위하여 본 명세서에 참고문헌으로서 인용된다.

실시예

다음 실시예는 본 발명을 설명한다. 다른 구체예들은 본 실시예의 관점 내에서 본 분야의 숙련자에게 발생할 것이다.

재료 및 방법

GPR39 낙-아웃 마우스

GPR39 낙-아웃 마우스는 Lexicon Genetics Inc.로부터 수득하였다. IRES LacZ/MCl-Neo 리포터 유전자/선택 카세트와 함께 GPR39 유전자의 첫번째 코딩 영역의 코딩 영역을 치환함으로써, GPR39해독 프레임의 붕괴를 수행하였다. 동물 관리를 위한 벨기에 및 유럽의 모든 요구사항을 만족하는 SPF 설비 내에 동물을 유지시켰다. 다르게 지시되어 있지 않으면, 음식물 및 물을 자유롭게 허용하였고, 12시간 암-명 주기(7:00 EST에 명)와 함께 기후-조절된 동물 군락내에 마우스를 그룹-수용하였다. 고통 또는 불편을 최소화하기 위하여 적절한 조치를 수행하였다. European Communities Council Directives (86/609/EEC)에 따라 모든 실험을 수행하였으며, 지역 윤리 위원회에 의하여 승인을 받았다.

GPR39 의 실시간 정량 역전사 PCR 분석

야생형(뇌, 간, 척수, 위, 간, 비장, 결장, 폐, 심장, 식도, 이자, 회장, 공장) 및 GPR39 낙-아웃 마우스(간, 위, 공장, 결장)로부터 절개한 다른 조직들의 전체 RNA를 실시간 정량적 역전사 PCR을 통하여 분석하여, GPR 낙-아웃을 확인하고 GPR39의 조직 분포를 연구하였다. Superscript II RT (Invitrogen Life Technologies) 및 랜덤 헥사머 프라이머를 이용하여, 전체 RNA 1.0㎎에 첫번째 가닥 cDNA 합성을 수행하였다. Taqman PCR 키트를 이용하여, ABIPrism 7000 cycler (Applied Biosystems)에서 정량 PCR을 수행하였다. 연속적인 cDNA 희석을 β-actin 농도의 로그에 대하여, 역치 사이클의 표준 곡선을 생성하는 데 이용하였다. RTQ 특이 프라이머 쌍 및 프로브는 아래에 삽입하였다.

RTQ 프라이머 및 프로브의 마우스 IMPA2 선택:

샘플을 세번 수행하였으며, 표준 수치에 따를 때만 결과를 나타내었다. 다른 마우스 조직에서 발현 레벨을 마우스 β-actin에 표준화한 후, 상대적 레벨로써 나타내었다.

GPR39 낙 아웃 마우스에서 β- 갈락토시다제 활성을 위한 염색

마우스 내부 GPR39 프로모터의 조절 관리하에서, 박테리아 β-갈락토시다아제를 발현하는 동형 접합 GPR39 낙-아웃 마우스로부터 조직(이자, 위, 회장, 공장, 결장)을 절개하였다. 개시된 프로토콜(InvitroGen)에 따라 이러한 조직에 홀-마운트(Whole-mount) 염색을 수행하였고, 그 다음 조직을 파라핀에 묻고 섹션하였다.

표현형 분석

위배출

선정된 야생형 6 및 동형 접합 수컷 GPR39 낙아웃 마우스 6을 14시간-10시간의 명-암 주기로, 20-22℃에서 케이지에 수용하였다. 표준 통상의 마우스 식이(4352 Muracon G, Nutreco Belgium NV, Gent, Belgium) (4.5% 지방, 4% 셀룰로오즈, 21% 단백질, 1.404 kcal/g)를 시험 전 저녁까지 자유롭게 급식하였다. 오후 4시에 음식물을 치우고, 다음날 오전 11시에 테스트를 시작하였다. 와이어-체 플레이트를 케이지의 바닥에 삽입하여, 공복의 기간동안 식분증(coprophagia)을 방지하였다. 테스트 동안을 제외하고, 항상 수돗물을 자유롭게 급식하였다.

테스트 식이

고형 테스트 식이는 0.1g 표준 마우스 식이에, 구워진 스크램블된 달걀 노른자 1 g으로 구성되며, 0.01 μCi ¹⁴C-옥탄산 나트륨 염(American Radiolabeled chemicals Inc, St Louis, MO, USA)을 첨가한다. 수돗물을 첨가하고 혼합하여, 균질한 페이스트를 형성시켰다. 실험 시작 전에, 공복의 마우스(19시간)를 2주동안, 일주에 2번씩 정해진 시간 스케쥴대로 훈련시켜, 방사성 활성있는 마커없이, 테스트 식이를 자발적으로 섭취하도록 하였다. 이러한 훈련 후에, 대부분의 동물은 테스트 식이를 60초 안에 섭취한다.

호흡 테스트 과정: CO ₂ 샘플링

6개의 밀폐된 플라스틱 튜브는 CO₂ 구속기(trapper), 테트라메틸암모늄히드록시드(1.3mmol) (Acros, Geel, Belgium), 및 PH 지시기 티모프탈레인(thymolphtaleine)(0.006%)를 함유하는 바이얼을 통과하여, 공기 유출이 기포를 내며 흐르는 동안, 연속적인 공기 흐름(80% N2, 20% O2, 360 ml/min)이 지나가는 입구 밸브로 적용시켰다. 실험하는 동안 모든 CO₂가 소진되었음을 나타내는, 관찰된 탈색을 이용하지 않는 샘플링 시간을 획득하였다. 튜브의 면적(직경 50㎜, 길이 150㎜)은 마우스의 자유로운 움직임을 허용한다. 테스트 식이를 주기 전에, 각 마우스를 밀폐된 튜브내에 위치시키고, 호흡 샘플(5분)의 베이스라인을 취하였다. 튜브를 열고, 음식물을 마우스에 주고, 튜브를 다시 닫았다. 첫번째 반시간 동안은 매 5분, 다음 4시간 동안은 매 15분마다 샘플링을 하였다. 신틸레이션 용액을 첨가하고, β-counter로 샘플을 측정하였다.

데이터 분석

최소자승법(least-square analysis)을 이용하여, 호흡에서 배출된 ¹⁴CO₂를 두개의 수학적 공식에 적용하여, 최적 일치(best-fit)의 커브를 얻었다.(Ghoos et al. , 1993 ; Maes et al . , 1994) :

수학식 1: y = mkβe^-kt(l-e^-kt)^β-1

수학식 2: y = at^be^-ct

y는 시간당 호흡에서 ¹⁴CO₂ 배출 퍼센트, t는 시간; m, k, β, a, b 및 c는 추정 회귀 정수(regression estimated constant)이며, m은 시간이 무한할 때, 회수되는 ¹⁴CO₂의 전체 양이다. 최적 일치

최적 일치로부터 다음 파라미터를 계산하였다:

-위 절반 배출 시간(t_{1 /2}) , ¹⁴CO₂ 전체량의 50%가 배출되는 시간이다. 따라서, t_{1 /2}-수치는 위 절반 배출 시간을 포함할 뿐만 아니라, 호흡에서 ¹⁴CO₂의 배출 및 ¹⁴C 옥탄산의 흡수 및 대사와 같은 위 다음 처리에 필요한 시간을 함유한다.

수학식 1: t_{1 /2} = (-1/k) *ln(l-2^-1/β)

수학식 2: t_{1 /2} = 60*(b/c)

-지체기(t_lag) ,위가 미세한 입자로 음식물을 파쇄하는 데 필요한 시간때문에, 위 배출 지연.

수학식 1: t_lag=ln(β)/k

수학식 2: t_lag = 60*gammainv(0.5;1+b;1/c)

측정된 ¹⁴CO₂ 생산량이 일치되는 수학적 커브로부터 너무 많이 벗어나지 않도록 하기 위하여, 측정된 수치를 이론적인 커브에 수학적으로 일치하는 수치에 상관시킨다. 만약 상관 계수가 0.95보다 적으면(r≤0.95), 수학적 일치는 인정할 만한 것으로 판단되지 않으며, 데이터는 분석으로부터 거절된다.

위 배출

선택된 야생형(WT) 6과 동형 접합 GPR39 낙아웃(GPR39^-/-) 암컷 마우스 6을 이용하여, 위 배출을 연구하였다. 아이소플루란을 이용하여 마우스를 마취시켰다. 마취 하에서, 봉합(vicryl 4-0, Ethicon)의 수단으로 유문을 닫고, 그 다음 복강을 봉합하였다. 동물들 각각 케이지에 4시간 동안 가져다 두었다. 4시간 경과 후에, 유문이 닫힌 마우스를 희생시키고, 심장 바로 위의 식도를 닫았다. 복강으로부터 위를 빼냈다. 위의 무게를 재고, 열어 위 배출을 취하였다. 위 배출을 측정한 다음, 5㎖의 물에 희석시켰다(Water Molecular Biology Grade, Eppendorf). pH 전극(pH 597, Profi Lab)을 이용하여 pH를 측정하였다.

데이터 분석

데이터를 평균±SD.로 나타내었다. 비모수 윌콕슨 테스트(non parametric Wilcoxon test)를 이용하여 야생형(WT)와 GPR39^-/-의 마우스 및 위 무게 그리고 위 배출을 비교하였다. 물(5㎖)의 pH를 처음 측정한 다음, 위 배출에 첨가하였고, pH를 다시 측정하였다. 물의 pH와 위 배출 용액의 pH 사이의 차이를 측정한 다음, 용액 1㎖에 기록하고, 그 다음, 비모수 윌콕슨 테스트(non parametric Wilcoxon test)를 이용하여 두 군을 비교하였다.

배설물 펠렛 추진

선택된 야생형(WT) 6과 동형 접합 GPR39 낙아웃(GPR39^-/-) 암컷 마우스 6을 이용하여, 배설물 펠렛 추진을 연구하였다. 마우스를 CO₂로 질식시킨 다음 단두시켰다. 부착된 조직으로부터 자유롭게, 맹장으로부터 직장까지 결장을 잘라냈다.Krebs-Henseleit 용액 100㎖을 함유하고, 37℃를 유지하고 95% O₂ 및 5% CO₂의 혼합물로 채워진 유리 비커에 조직을 옮겼다. 실험 시작 전에, 결장의 길이를 측정하였다. 결장에서 펠렛을 측정하고, 직장에서 그들의 거리를 측정하였다. 그 다음, 각 펠렛의 배출하기 위한 시간을 20분동안 기록하였다.

데이터 분석

t=0 및 20분에, 직장의 길이에 걸쳐서, 결장의 길이에 상대적인 각 펠렛의 위치를 저장소에 넣음으로써, 팰렛의 분포를 측정하였다(결장 길이의 15% 저장소: 0%-15%, >15%-30%, >30%-45%, >60%-75%, >75%-90% 및 >90%-100%, 여기서 0%는 직장, 100%는 IC-밸브를 나타낸다). 전체 결장의 15% 저장소를 고려하였고, 각 저장소 및 각 저장소로부터 방출되는 펠렛의 수를 20분 동안 측정하였다. 2-면 사인 테스트(2-sided Sign Test)를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다.

마우스 행동 테스트

선택된 야생형(WT) 14와 동형 접합 GPR39 낙아웃(GPR39^-/-) 수컷 마우스 14 및 야생형 12와 동형 접합 암컷 GPR39 낙-아웃 마우스 12를 두가지 행동 테스트에 투입하였다: Open Field Test(이동체의 활동을 측정하기 위하여 종래에 알려진 방법) 및 Elevated Zero Maze(불안-관련 행동을 측정하기 위하여 종래에 알려진 방법). 정상적임 명/암 주기의 명 상태동안 Open Field Test (OFT)를 수행하였다. 각 마우스를 Open Field 시스템 내의 30분-테스트 기간에 투입하였다. 수평의, 그리고 수직의 판유리 내에서 운동을 기록하였다. 기간 동안 다음 파라미터가 기록되었다: 움직임의 지속 기간, 움직임의 수, 이동한 전체 길이, 중심에서 이동한 길이, 가장자리에서 이동한 길이, 중심에서 이동한 상대적 길이, 중심에서 소비한 시간, 가장자리에서 소비한 시간, 중심에서 상대적으로 소비한 시간, 가장자리에서 이동한 거리에 대하여 중심에서 이동한 거리, 가장자리에서 소비한 시간에 대하여 중심에서 소비한 시간, 사육 수, 사육 기간. 단일 요소 ANOVA를 얻어진 결과의 통계적 분석에 이용하였다.

정상적인 명/암 주기의 명 기간 동안 Elevated Zero Maze (0-maze)를 수행하였다. 각 마우스를 elevated zero maze의 5-분 테스트 기간에 투입하였다. 이 기간동안, 다음 파라미터를 기록하였다: 닫힌 그리고 열린 팔에서 이동한 시간, 닫힌 그리고 열린 팔에서 소비한 상대적 시간, 이동한 전체 길이, 닫힌 그리고 열린 팔에서 이동한 길이. 단일 요소 ANOVA를 얻어진 결과의 통계적 분석에 이용하였다.

호흡률

선택된 야생형(WT) 6과 동형 접합 GPR39 낙아웃(GPR39^-/-) 수컷 마우스 6를 대사 케이지에 넣기 전에, AIN-93G Rodent Purified Diet (Dyets, Inc., USA)에 길들였다. 마우스를 측정 전 최소 1주일 동안 대사 케이지(아래 참조)로써, 동일한 환경 하에서, 각각 2형 케이지에 구속하였다. 연속적인 2일 동안, 각각 조절된 온도(28.8℃), 습도(55-60%) 및 빛(12:12시간 명/암 주기, 06:00시 점등) 하에서의 대사 케이지에 모든 마우스를 구속시켰다. 동물들을 설치류 식이 및 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 다음 파라미터를 측정하고, 평균으로써 나타내었다: 호흡 지수(RER), VO2 및 열 생산

혈액 분석

GPR39^+/+ 한배 새끼에 대하여, 6달된 수컷 및 암컷 GPR39^-/-마우스 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 혈장 레벨을, 자유롭게 허용한 일반적인 식이 후, 12시간 음식을 주지 않은 다음, 결정하였다. 시약을 이용한 Hitachi Modular random access analyzer (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)와 동일한 공급자로부터의 테스트 방법의 수단에 의하여 콜레스테롤 및 트리글리세리드 레벨을 결정하였다.

음식물 섭취

6시간 동안 자유롭게 급식된, 그리고 공복의, 어리고(17주) 나이 든(56주) GPR39^-/- 마우스 및 GPR39^+/+ 한배 새끼의 누적 음식물 섭취 분석은 오전 10시에 시작하였다. 각 마우스를 각각의 케이지 내에 두고, 미리-무게를 잰 양의 음식물이 주어진 어두운 방에 위치시켰다(다른 언급이 없다면). 30분, 1, 2, 3, 4, 5 및 6시간에 먹지 않은 음식물을 제외하고, 누적 음식물 섭취를 측정하였다.

결과

GPR39 의 실시간 정량적 역전사 PCR 분석

야생형 마우스로부터 유래된 다중 마우스 조직에서 GPR39의 실시간 정량적 역전사 PCR 분석은 넓은 조직 분포를 나타낸다(도 1A).

야생형 마우스 및 이형접합 그리고 동형접합 GPR39 낙-아웃 마우스로부터 유래된 네가지 다른 조직(간, 위, 공장, 결장)에서 GPR39의 정량적 역전사 PCR 분석은 GPR39 낙-아웃 마우스에서 GPR39 전사체의 부재를 확실하게 한다. 이형접합 마우스에서 중간 레벨을 얻었다(도 1B).

GPR39 낙-아웃 마우스에서 β- 갈락토시다아제 활성을 위한 염색

GPR39의 발현은 장의 근육층의 신경이 통하게 하는 뉴런에서 뿐만 아니라, 소장 및 결장에서 엔테로사이트, 위의 몸통 내의 점막 목 세포에서와, 유문 내의 점막의 샘조직의 상부 영역에 위치한 두정 세포, 이자의 외분비 및 내분비 부분에서 검출되었다.

위 배출

GPCR39 낙-아웃마우스에서 고형 식이의 위 배출은 야생형 마우스와 비교하여 유의성있게 가속된다. 실제로, GPCR 39 낙-아웃 마우스에서 절반 비움 시간(t%)은(48.5 ±2 분, n=6) 야생형 마우스와 비교하여(89.9±6 분, n=6), 유의성있게 감소한다(도 2A). T_lag는 또한, 야생형 마우스에 대하여 GPR39 낙-아웃 마우스(39.2±3.4 분에 대하여 22.5±1.3 분, n=6)에서 유의성있게 감소하며, GPR39 낙-아웃 마우스에서 고형 식이의 위 배출의 가속화를 확실하게 한다(도 2B). 결과는 3일 간격으로 그룹당 6마리의 마우스에서 일련의 테스트 3의 평균이ㄷ.

위 분비

야생형 및 GPR39^-/-마우스 사이에서 무게의 차이점이 관찰되지 않았다. (30.4±6.6g 대 26.9±4.0g, 각각). 두 그룹 사이의 위 무게에서의 경향을 측정하였다(야생형: 978±262mg 대. GPR39^-/-: 1395±343mg; P=O.0547). 야생형 마우스와 비교하여 GPR39^-/-마우스에서 위 배출(㎕)은 유의적으로 증가하였다(638±336㎕ 대 225±170㎕, 각각; P=O.0242). 야생형과 비교하여 GPR39^-/-에서 유의성있게 더 작은, 물 pH 와 위 배출 용액 pH 사이의 pH 감소를 관찰하였다(0.9±0.2 대 l.l±0.2, 각각; P=O.0374). 이러한 데이터는 GPR39 수용체의 결실이 산 분비의 증가 때문이 아닌, 위 분비의 유의적 증가를 유도하는 것을 제안한다.

분변 펠렛 추진

결과는 실험 시작시에 결장에 걸쳐 펠렛의 분포가 GPR39^-/- 및 야생형 사이에 차이가 없음(2-면 사인 테스트에 의하여 p=0.5637; 파란 바)을 나타낸다(도 3). 직장(전체 길이의 0-30%)에 가장 근접한 펠렛은 야생형 및 GPR39^-/- 전부에서 배출된다; 멀리 위치한 펠렛(길이의 30-75%)의 대부분은 GPR39^-/- 동물의 결장으로부터 배출되나, 야생형으로부터는 그러하지 않다(p=0.0253; 노란 바) (도 3). 이러한 결과는 GPR39^-/-동물의 결장으로부터 분변 펠렛의 더욱 효과적인 추진을 지시한다.

마우스 행동 테스트

위 배출에서 관찰되는 차이가 GPR39 낙-아웃 마우스의 일반적 활성 또는 정신적 증상에서 차이에 의하여 혼동될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 open field test (OFT) 및 zero maze test (0-maze)의 신경적인 시험 수행하였다.

Open Field test

암컷 GPR39 낙-아웃 마우스 및 야생형 한배 새끼에서, 운동 신경 활성에서 차이를 발견하지 못했다. 게다가, 위 배출에서 발견된 차이는 암컷 GPR39 낙-아웃 마우스에서 증가된 일반적 활성에 기인하는 인위 결과가 아니다. 움직임의 지속 기간, 움직임의 수, 이동한 전체 길이, 이동한 전체 시간, 중심에서 이동한 길이, 가장자리에서 이동한 길이, 중심에서 이동한 상대적 길이, 중심에서 소비한 시간, 가장자리에서 소비한 시간, 중심에서 상대적으로 소비한 시간, 가장자리에서 이동한 거리에 대하여 중심에서 이동한 거리, 가장자리에서 소비한 시간에 대하여 중심에서 소비한 시간, 속도, 사육 수 및 사육 기간에서 차이를 발견하지 못했다. 수컷 GPR39 낙-아웃 및 야생형 한배 새끼를 비교할 때, 일반적 활성에서 증가가 없는 것은 관찰된 위 배출에서 관찰된 차이를 혼동할 수 있다. 야생형 대조군과 비교하여, 수컷 GPR39 낙-아웃 마우스에서 전체 이동 시간 및 전체 이동 거리(ANOVA, p<0.001)에서의 유의적인 감소로부터 분명하게 수컷 GPR39 낙-아웃 마우스에서 작지만 유의적으로 감소된 일반적 활성이 관찰되었다. 덧붙여, 중심에서 이동한 거리, 중심에서 이동한 상대적 거리 및 중심 대 가장자리 거리는 야생형 한배 새끼와 비교하여, GPR39 낙-아웃 마우스에서 유의적으로 더 낮았다. 후의 차이점은 감소된 이동 때문일 수 있으며, 또는 대신하여, 불안 표현형에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 0-maze test를 수행하였다.

Zero maze test

O-maze에서 GPR39 낙-아웃 마우스는 불안성 또는 불안 완화 표현형을 나타내지 않는다. 닫힌 팔에 대한 열린 팔에서 이동한 상대적 거리, 뿐만 아니라, 열린 팔에 대한 닫힌 팔에서 소비한 상대적 시간 둘다는 GPR39 낙-아웃 및 야생형 대조군 마우스에서 비슷하다. 이에 따라, GPR39 낙-아웃 마우스에서 위 배출의 증가된 비율은 불안 유도 환경에 변화된 반응 때문이 아니다.

호흡률

두 기록일 동안, 야생형 한배 새끼와 수컷 GPR39 낙-아웃 사이에 호흡률 차이를 관찰하지 못했다. 이에 따라, 위 배출에서 관찰된 차이는 암컷 GPR39 낙-아웃 마우스에서 호흡률 때문인 인공 결과이다. 야생형 및 GPR39 낙-아웃 마우스에서 호흡 지수는 1.0 근처로 남아있고, 열 생산과 함께 VO2는 유전형으로 변하지 않는다.

혈액 분석

일반적인 음식 식이의 자유로운 허용 후에, 12시간 동안 음식을 배제하고, GPR39^-/- 한배 새끼에 대하여 6달된 수컷 및 암컷 GPR39^-/- 마우스에서 학적 데이터를 수집하였다. 콜레스테롤 레벨(mg/dl ± SD로 평균)은 GPR39^+/+ 수컷(107.3 ± 37.8) 및 암컷(83.5 ± 24.2) 한배 새끼(수컷 및 암컷 각각 p<0.05 및 p<0.001)와 비교하여, 수컷(142.2 ± 29.0) 및 암컷(118.7 ± 16.2) GPR39^-/-마우스 둘다에서, 유의적으로 증가하였다. 트리글리세리드 레벨(mg/dl ± SD로 평균)은 GPR39^+/+ 수컷(123.9 ± 20.8) 및 암컷(71.4 ± 12.0) 한배 새끼와 비교하여 수컷(162.5 ± 14.7) 및 암컷(84.6 ± 7.2) GPR39^-/- 마우스에서 증가를 관찰하였으나, 이러한 차이는 유의성에 도달하지 않는다.

음식물 섭취

실험 시작 전에, 음식물에 자유롭게 접근하도록 한 마우스(17 주, n=6)에서 누적 음식물 섭취는 야생형 마우스와 비교하여 GPR39 낙-아웃 마우스에서 유의적인(P=0.47) 차이가 없었다. 더 나이든 마우스(56주, n=6, p=0.78)에서도 같은 관찰을 수행하였다. 반대로, 공복의 마우스(19시간)에서 누적 음식물 섭취는 야생형 마우스와 비교하여 GPR39 마우스에서 유의적으로((P<0.0001) 낮았다. 이러한 영향은 더 나이든 마우스(56주)에서 더욱 두드러진다. 실제로, 6시간 후에, 누적 음식물 섭취는 나이 매치된 야생형 마우스와 비교하여 나이든 GPR39 마우스에서 1.25g, 어린 것에서 0.62g 더 낮았다.

[참조]

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceutica N.V. <120> G protein coupled receptor <130> PRD2394 <150> EP04106220.9 <151> 2004-12-01 <160> 19 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1421 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (50)..(1417) <223> <400> 1 aggtcagtgg agacatttgg ggacctggtg gtctgggtct ctcttcctc atg gct tca 58 Met Ala Ser 1 tcc agt ggc tcc aac cac atc tgc tcc cgt gtc atc gat cac agc cat 106 Ser Ser Gly Ser Asn His Ile Cys Ser Arg Val Ile Asp His Ser His 5 10 15 gtt cct gaa ttt gag gtg gcc act tgg atc aaa atc acc ctc atc ttg 154 Val Pro Glu Phe Glu Val Ala Thr Trp Ile Lys Ile Thr Leu Ile Leu 20 25 30 35 gtg tac ctg atc atc ttt gtg gta ggc atc ttg ggc aac agc gtc acc 202 Val Tyr Leu Ile Ile Phe Val Val Gly Ile Leu Gly Asn Ser Val Thr 40 45 50 atc agg gtt acg cag gta ttg cag aag aag ggc tat ttg cag aag gag 250 Ile Arg Val Thr Gln Val Leu Gln Lys Lys Gly Tyr Leu Gln Lys Glu 55 60 65 gtg aca gat cac atg gtc agt ttg gct tgt tca gat atc ttg gtc ttt 298 Val Thr Asp His Met Val Ser Leu Ala Cys Ser Asp Ile Leu Val Phe 70 75 80 ttg att ggc atg ccc atg gag ttc tac agc atc att tgg aac ccc ctg 346 Leu Ile Gly Met Pro Met Glu Phe Tyr Ser Ile Ile Trp Asn Pro Leu 85 90 95 acc aca ccc agc tat gct ctg tcc tgt aag ctc cac acg ttc ctc ttt 394 Thr Thr Pro Ser Tyr Ala Leu Ser Cys Lys Leu His Thr Phe Leu Phe 100 105 110 115 gag acg tgc agc tac gcc aca ctg ctg cac gtg ctg acc ctc agc ttt 442 Glu Thr Cys Ser Tyr Ala Thr Leu Leu His Val Leu Thr Leu Ser Phe 120 125 130 gag cgc tac att gcc att tgt cat ccc ttc aag tat aaa gca gtg tct 490 Glu Arg Tyr Ile Ala Ile Cys His Pro Phe Lys Tyr Lys Ala Val Ser 135 140 145 gga cct cgc cag gtg aaa ctg ctg att ggc ttt gta tgg gtc acc tcc 538 Gly Pro Arg Gln Val Lys Leu Leu Ile Gly Phe Val Trp Val Thr Ser 150 155 160 gcc ctg gtg gca ctg cct ttg ctc ttt gcc atg ggt atc gag tac cct 586 Ala Leu Val Ala Leu Pro Leu Leu Phe Ala Met Gly Ile Glu Tyr Pro 165 170 175 ctg gta aac gta ccc act cac aag gga ctc aac tgc aac ctc tct cgc 634 Leu Val Asn Val Pro Thr His Lys Gly Leu Asn Cys Asn Leu Ser Arg 180 185 190 195 acc cgc cac cac gat gaa cct gga aac tcc aat atg tcc atc tgc acg 682 Thr Arg His His Asp Glu Pro Gly Asn Ser Asn Met Ser Ile Cys Thr 200 205 210 aac ctc tcc aac cgt tgg gag gtc ttc cag tcc agc atc ttt ggg gcc 730 Asn Leu Ser Asn Arg Trp Glu Val Phe Gln Ser Ser Ile Phe Gly Ala 215 220 225 ttt gct gtt tac ctg gtg gtc ctg gcg tct gtg gct ttc atg tgt tgg 778 Phe Ala Val Tyr Leu Val Val Leu Ala Ser Val Ala Phe Met Cys Trp 230 235 240 aat atg atg aaa gtg cta atg aag agc aag cag ggc act ctt gca ggg 826 Asn Met Met Lys Val Leu Met Lys Ser Lys Gln Gly Thr Leu Ala Gly 245 250 255 acc ggg cca cag ctc cag ctg agg aag tca gag agt gag gag agc cgg 874 Thr Gly Pro Gln Leu Gln Leu Arg Lys Ser Glu Ser Glu Glu Ser Arg 260 265 270 275 aca gca aga aga cag acc atc ata ttc ctg aga ctg att gtg gtg acg 922 Thr Ala Arg Arg Gln Thr Ile Ile Phe Leu Arg Leu Ile Val Val Thr 280 285 290 ttg gcc gtg tgt tgg atg ccc aat cag atc cga cgg atc atg gct gca 970 Leu Ala Val Cys Trp Met Pro Asn Gln Ile Arg Arg Ile Met Ala Ala 295 300 305 gca aaa ccc aaa cat gac tgg acc aga acg tac ttc agg gca tac atg 1018 Ala Lys Pro Lys His Asp Trp Thr Arg Thr Tyr Phe Arg Ala Tyr Met 310 315 320 atc ctc ctg ccc ttc tct gat acc ttc ttc tac ctc agc tct gtg gtc 1066 Ile Leu Leu Pro Phe Ser Asp Thr Phe Phe Tyr Leu Ser Ser Val Val 325 330 335 aac cct ctc ctc tac aac gtg tcc tct cag cag ttc cgg aag gtg ttc 1114 Asn Pro Leu Leu Tyr Asn Val Ser Ser Gln Gln Phe Arg Lys Val Phe 340 345 350 355 tgg cag gtg ctc tgc tgc cgc ctg act ctg cag cat gcc aac caa gag 1162 Trp Gln Val Leu Cys Cys Arg Leu Thr Leu Gln His Ala Asn Gln Glu 360 365 370 aaa cgc cag cgt gcc cgc ttc atc tcc acc aag gac agc acc agc tca 1210 Lys Arg Gln Arg Ala Arg Phe Ile Ser Thr Lys Asp Ser Thr Ser Ser 375 380 385 gcc cgc agc ccc ctc atc ttc cta gcc tcc cgg cgc agt aac tct tcc 1258 Ala Arg Ser Pro Leu Ile Phe Leu Ala Ser Arg Arg Ser Asn Ser Ser 390 395 400 tcc agg aga act aac aag gtt ttc tta agc act ttt cag act gag gcc 1306 Ser Arg Arg Thr Asn Lys Val Phe Leu Ser Thr Phe Gln Thr Glu Ala 405 410 415 aag cct gga gag gct aag ccc cag ccc ttg agt cct gag tca cca cag 1354 Lys Pro Gly Glu Ala Lys Pro Gln Pro Leu Ser Pro Glu Ser Pro Gln 420 425 430 435 act ggc tca gag acc aaa cca gct ggg tcc acc cca gaa aat agt tta 1402 Thr Gly Ser Glu Thr Lys Pro Ala Gly Ser Thr Pro Glu Asn Ser Leu 440 445 450 cag gag cag gaa gta tgaa 1421 Gln Glu Gln Glu Val 455 <210> 2 <211> 456 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Ser Ser Ser Gly Ser Asn His Ile Cys Ser Arg Val Ile Asp 1 5 10 15 His Ser His Val Pro Glu Phe Glu Val Ala Thr Trp Ile Lys Ile Thr 20 25 30 Leu Ile Leu Val Tyr Leu Ile Ile Phe Val Val Gly Ile Leu Gly Asn 35 40 45 Ser Val Thr Ile Arg Val Thr Gln Val Leu Gln Lys Lys Gly Tyr Leu 50 55 60 Gln Lys Glu Val Thr Asp His Met Val Ser Leu Ala Cys Ser Asp Ile 65 70 75 80 Leu Val Phe Leu Ile Gly Met Pro Met Glu Phe Tyr Ser Ile Ile Trp 85 90 95 Asn Pro Leu Thr Thr Pro Ser Tyr Ala Leu Ser Cys Lys Leu His Thr 100 105 110 Phe Leu Phe Glu Thr Cys Ser Tyr Ala Thr Leu Leu His Val Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Phe Glu Arg Tyr Ile Ala Ile Cys His Pro Phe Lys Tyr Lys 130 135 140 Ala Val Ser Gly Pro Arg Gln Val Lys Leu Leu Ile Gly Phe Val Trp 145 150 155 160 Val Thr Ser Ala Leu Val Ala Leu Pro Leu Leu Phe Ala Met Gly Ile 165 170 175 Glu Tyr Pro Leu Val Asn Val Pro Thr His Lys Gly Leu Asn Cys Asn 180 185 190 Leu Ser Arg Thr Arg His His Asp Glu Pro Gly Asn Ser Asn Met Ser 195 200 205 Ile Cys Thr Asn Leu Ser Asn Arg Trp Glu Val Phe Gln Ser Ser Ile 210 215 220 Phe Gly Ala Phe Ala Val Tyr Leu Val Val Leu Ala Ser Val Ala Phe 225 230 235 240 Met Cys Trp Asn Met Met Lys Val Leu Met Lys Ser Lys Gln Gly Thr 245 250 255 Leu Ala Gly Thr Gly Pro Gln Leu Gln Leu Arg Lys Ser Glu Ser Glu 260 265 270 Glu Ser Arg Thr Ala Arg Arg Gln Thr Ile Ile Phe Leu Arg Leu Ile 275 280 285 Val Val Thr Leu Ala Val Cys Trp Met Pro Asn Gln Ile Arg Arg Ile 290 295 300 Met Ala Ala Ala Lys Pro Lys His Asp Trp Thr Arg Thr Tyr Phe Arg 305 310 315 320 Ala Tyr Met Ile Leu Leu Pro Phe Ser Asp Thr Phe Phe Tyr Leu Ser 325 330 335 Ser Val Val Asn Pro Leu Leu Tyr Asn Val Ser Ser Gln Gln Phe Arg 340 345 350 Lys Val Phe Trp Gln Val Leu Cys Cys Arg Leu Thr Leu Gln His Ala 355 360 365 Asn Gln Glu Lys Arg Gln Arg Ala Arg Phe Ile Ser Thr Lys Asp Ser 370 375 380 Thr Ser Ser Ala Arg Ser Pro Leu Ile Phe Leu Ala Ser Arg Arg Ser 385 390 395 400 Asn Ser Ser Ser Arg Arg Thr Asn Lys Val Phe Leu Ser Thr Phe Gln 405 410 415 Thr Glu Ala Lys Pro Gly Glu Ala Lys Pro Gln Pro Leu Ser Pro Glu 420 425 430 Ser Pro Gln Thr Gly Ser Glu Thr Lys Pro Ala Gly Ser Thr Pro Glu 435 440 445 Asn Ser Leu Gln Glu Gln Glu Val 450 455 <210> 3 <211> 1362 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1362) <223> <400> 3 atg gct tca ccc agc ctc ccg ggc agt gac tgc tcc caa atc att gat 48 Met Ala Ser Pro Ser Leu Pro Gly Ser Asp Cys Ser Gln Ile Ile Asp 1 5 10 15 cac agt cat gtc ccc gag ttt gag gtg gcc acc tgg atc aaa atc acc 96 His Ser His Val Pro Glu Phe Glu Val Ala Thr Trp Ile Lys Ile Thr 20 25 30 ctt att ctg gtg tac ctg atc atc ttc gtg atg ggc ctt ctg ggg aac 144 Leu Ile Leu Val Tyr Leu Ile Ile Phe Val Met Gly Leu Leu Gly Asn 35 40 45 agc gcc acc att cgg gtc acc cag gtg ctg cag aag aaa gga tac ttg 192 Ser Ala Thr Ile Arg Val Thr Gln Val Leu Gln Lys Lys Gly Tyr Leu 50 55 60 cag aag gag gtg aca gac cac atg gtg agt ttg gct tgc tcg gac atc 240 Gln Lys Glu Val Thr Asp His Met Val Ser Leu Ala Cys Ser Asp Ile 65 70 75 80 ttg gtg ttc ctc atc ggc atg ccc atg gag ttc tac agc atc atc tgg 288 Leu Val Phe Leu Ile Gly Met Pro Met Glu Phe Tyr Ser Ile Ile Trp 85 90 95 aat ccc ctg acc acg tcc agc tac acc ctg tcc tgc aag ctg cac act 336 Asn Pro Leu Thr Thr Ser Ser Tyr Thr Leu Ser Cys Lys Leu His Thr 100 105 110 ttc ctc ttc gag gcc tgc agc tac gct acg ctg ctg cac gtg ctg aca 384 Phe Leu Phe Glu Ala Cys Ser Tyr Ala Thr Leu Leu His Val Leu Thr 115 120 125 ctc agc ttt gag cgc tac atc gcc atc tgt cac ccc ttc agg tac aag 432 Leu Ser Phe Glu Arg Tyr Ile Ala Ile Cys His Pro Phe Arg Tyr Lys 130 135 140 gct gtg tcg gga cct tgc cag gtg aag ctg ctg att ggc ttc gtc tgg 480 Ala Val Ser Gly Pro Cys Gln Val Lys Leu Leu Ile Gly Phe Val Trp 145 150 155 160 gtc acc tcc gcc ctg gtg gca ctg ccc ttg ctg ttt gcc atg ggt act 528 Val Thr Ser Ala Leu Val Ala Leu Pro Leu Leu Phe Ala Met Gly Thr 165 170 175 gag tac ccc ctg gtg aac gtg ccc agc cac cgg ggt ctc act tgc aac 576 Glu Tyr Pro Leu Val Asn Val Pro Ser His Arg Gly Leu Thr Cys Asn 180 185 190 cgc tcc agc acc cgc cac cac gag cag ccc gag acc tcc aat atg tcc 624 Arg Ser Ser Thr Arg His His Glu Gln Pro Glu Thr Ser Asn Met Ser 195 200 205 atc tgt acc aac ctc tcc agc cgc tgg acc gtg ttc cag tcc agc atc 672 Ile Cys Thr Asn Leu Ser Ser Arg Trp Thr Val Phe Gln Ser Ser Ile 210 215 220 ttc ggc gcc ttc gtg gtc tac ctc gtg gtc ctg ctc tcc gta gcc ttc 720 Phe Gly Ala Phe Val Val Tyr Leu Val Val Leu Leu Ser Val Ala Phe 225 230 235 240 atg tgc tgg aac atg atg cag gtg ctc atg aaa agc cag aag ggc tcg 768 Met Cys Trp Asn Met Met Gln Val Leu Met Lys Ser Gln Lys Gly Ser 245 250 255 ctg gcc ggg ggc acg cgg cct ccg cag ctg agg aag tcc gag agc gaa 816 Leu Ala Gly Gly Thr Arg Pro Pro Gln Leu Arg Lys Ser Glu Ser Glu 260 265 270 gag agc agg acc gcc agg agg cag acc atc atc ttc ctg agg ctg att 864 Glu Ser Arg Thr Ala Arg Arg Gln Thr Ile Ile Phe Leu Arg Leu Ile 275 280 285 gtt gtg aca ttg gcc gta tgc tgg atg ccc aac cag att cgg agg atc 912 Val Val Thr Leu Ala Val Cys Trp Met Pro Asn Gln Ile Arg Arg Ile 290 295 300 atg gct gcg gcc aaa ccc aag cac gac tgg acg agg tcc tac ttc cgg 960 Met Ala Ala Ala Lys Pro Lys His Asp Trp Thr Arg Ser Tyr Phe Arg 305 310 315 320 gcg tac atg atc ctc ctc ccc ttc tcg gag acg ttt ttc tac ctc agc 1008 Ala Tyr Met Ile Leu Leu Pro Phe Ser Glu Thr Phe Phe Tyr Leu Ser 325 330 335 tcg gtc atc aac ccg ctc ctg tac acg gtg tcc tcg cag cag ttt cgg 1056 Ser Val Ile Asn Pro Leu Leu Tyr Thr Val Ser Ser Gln Gln Phe Arg 340 345 350 cgg gtg ttc gtg cag gtg ctg tgc tgc cgc ctg tcg ctg cag cac gcc 1104 Arg Val Phe Val Gln Val Leu Cys Cys Arg Leu Ser Leu Gln His Ala 355 360 365 aac cac gag aag cgc ctg cgc gta cat gcg cac tcc acc acc gac agc 1152 Asn His Glu Lys Arg Leu Arg Val His Ala His Ser Thr Thr Asp Ser 370 375 380 gcc cgc ttt gtg cag cgc ccg ttg ctc ttc gcg tcc cgg cgc cag tcc 1200 Ala Arg Phe Val Gln Arg Pro Leu Leu Phe Ala Ser Arg Arg Gln Ser 385 390 395 400 tct gca agg aga act gag aag att ttc tta agc act ttt cag agc gag 1248 Ser Ala Arg Arg Thr Glu Lys Ile Phe Leu Ser Thr Phe Gln Ser Glu 405 410 415 gcc gag ccc cag tct aag tcc cag tca ttg agt ctc gag tca cta gag 1296 Ala Glu Pro Gln Ser Lys Ser Gln Ser Leu Ser Leu Glu Ser Leu Glu 420 425 430 ccc aac tca ggc gcg aaa cca gcc aat tct gct gca gag aat ggt ttt 1344 Pro Asn Ser Gly Ala Lys Pro Ala Asn Ser Ala Ala Glu Asn Gly Phe 435 440 445 cag gag cat gaa gtt tga 1362 Gln Glu His Glu Val 450 <210> 4 <211> 453 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Met Ala Ser Pro Ser Leu Pro Gly Ser Asp Cys Ser Gln Ile Ile Asp 1 5 10 15 His Ser His Val Pro Glu Phe Glu Val Ala Thr Trp Ile Lys Ile Thr 20 25 30 Leu Ile Leu Val Tyr Leu Ile Ile Phe Val Met Gly Leu Leu Gly Asn 35 40 45 Ser Ala Thr Ile Arg Val Thr Gln Val Leu Gln Lys Lys Gly Tyr Leu 50 55 60 Gln Lys Glu Val Thr Asp His Met Val Ser Leu Ala Cys Ser Asp Ile 65 70 75 80 Leu Val Phe Leu Ile Gly Met Pro Met Glu Phe Tyr Ser Ile Ile Trp 85 90 95 Asn Pro Leu Thr Thr Ser Ser Tyr Thr Leu Ser Cys Lys Leu His Thr 100 105 110 Phe Leu Phe Glu Ala Cys Ser Tyr Ala Thr Leu Leu His Val Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Phe Glu Arg Tyr Ile Ala Ile Cys His Pro Phe Arg Tyr Lys 130 135 140 Ala Val Ser Gly Pro Cys Gln Val Lys Leu Leu Ile Gly Phe Val Trp 145 150 155 160 Val Thr Ser Ala Leu Val Ala Leu Pro Leu Leu Phe Ala Met Gly Thr 165 170 175 Glu Tyr Pro Leu Val Asn Val Pro Ser His Arg Gly Leu Thr Cys Asn 180 185 190 Arg Ser Ser Thr Arg His His Glu Gln Pro Glu Thr Ser Asn Met Ser 195 200 205 Ile Cys Thr Asn Leu Ser Ser Arg Trp Thr Val Phe Gln Ser Ser Ile 210 215 220 Phe Gly Ala Phe Val Val Tyr Leu Val Val Leu Leu Ser Val Ala Phe 225 230 235 240 Met Cys Trp Asn Met Met Gln Val Leu Met Lys Ser Gln Lys Gly Ser 245 250 255 Leu Ala Gly Gly Thr Arg Pro Pro Gln Leu Arg Lys Ser Glu Ser Glu 260 265 270 Glu Ser Arg Thr Ala Arg Arg Gln Thr Ile Ile Phe Leu Arg Leu Ile 275 280 285 Val Val Thr Leu Ala Val Cys Trp Met Pro Asn Gln Ile Arg Arg Ile 290 295 300 Met Ala Ala Ala Lys Pro Lys His Asp Trp Thr Arg Ser Tyr Phe Arg 305 310 315 320 Ala Tyr Met Ile Leu Leu Pro Phe Ser Glu Thr Phe Phe Tyr Leu Ser 325 330 335 Ser Val Ile Asn Pro Leu Leu Tyr Thr Val Ser Ser Gln Gln Phe Arg 340 345 350 Arg Val Phe Val Gln Val Leu Cys Cys Arg Leu Ser Leu Gln His Ala 355 360 365 Asn His Glu Lys Arg Leu Arg Val His Ala His Ser Thr Thr Asp Ser 370 375 380 Ala Arg Phe Val Gln Arg Pro Leu Leu Phe Ala Ser Arg Arg Gln Ser 385 390 395 400 Ser Ala Arg Arg Thr Glu Lys Ile Phe Leu Ser Thr Phe Gln Ser Glu 405 410 415 Ala Glu Pro Gln Ser Lys Ser Gln Ser Leu Ser Leu Glu Ser Leu Glu 420 425 430 Pro Asn Ser Gly Ala Lys Pro Ala Asn Ser Ala Ala Glu Asn Gly Phe 435 440 445 Gln Glu His Glu Val 450 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> GPR39 Forward primer <400> 5 ccactcacaa gggactcaac tg 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> GPR39 reverse primer <400> 6 tggagtttcc aggttcatcg t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> GPR39 Probe <400> 7 aacctctctc gcacccgcca 20 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr 1 5 10 15 Gln Gln His Ser Gln Ala Leu Gly 20 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 9 Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr 1 5 10 15 Gln Gln His Ser Gln Ala Leu Gly 20 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Gln Gln His Gly Arg Ala Leu Gly 20 <210> 11 <211> 24 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 11 Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Gln Gln His Gly Arg Ala Leu Gly 20 <210> 12 <211> 24 <212> PRT <213> Meriones unguiculatus <400> 12 Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Gln Gln His Gly Arg Ala Leu Gly 20 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 13 Phe Asn Ala Pro Cys Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Ser 1 5 10 15 Asp Gln His Gly Gln Pro Leu Gly 20 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Felis catus <400> 14 Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr 1 5 10 15 His Gln His Gly Gln Ala Leu Gly 20 <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 15 Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Pro Gln Tyr 1 5 10 15 His Gln His Gly Gln Ala Leu Gly 20 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Capra hircus <400> 16 Phe Asn Ala Pro Phe Asn Ile Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Ser 1 5 10 15 Leu Gln His Gly Gln Thr Leu Gly 20 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 17 Phe Asn Ala Pro Phe Asn Ile Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Ser 1 5 10 15 Leu Gln His Gly Gln Thr Leu Gly 20 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 18 Phe Asn Ala Pro Phe Asn Ile Gly Ile Lys Leu Ala Gly Ala Gln Ser 1 5 10 15 Leu Gln His Gly Gln Thr Leu Gly 20 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Obestatin consensus sequence <400> 19 Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Gln Gln His Gly Gln Ala Leu Gly 20

Claims (20)

1. GPR39 수용체 단백질의 전부 또는 부분을 이용하는 것을 포함하여, 위장 운동 및/또는 콜레스테롤 대사를 조절하는 화합물을 확인하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, GPR39 수용체 단백질이 서열번호 2, 서열번호 4, 상기 언급된 서열번호를 갖는 단백질의 스플라이스 변형체, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열에 적어도 50%, 바람직하게 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
3. 제 1항에 있어서,

   GPR39 수용체 단백질의 부분이 서열번호 2 또는 서열번호 4 폴리펩티드의 적어도 10 개의 아미노산 단편으로 구성되는 방법.
4. (i) GPR39 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주 세포와 화합물을 접촉시키고,

   (ii) 상기 수용체 단백질에 화합물의 결합을 검출하는 것을 포함하여, 위장 운동 및/또는 콜레스테롤 대사를 조절하는 화합물을 확인하는 방법.
5. (i) GPR39 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주 세포로부터의 막 제제 를 화합물과 접촉시키고,

   (ii) 상기 수용체 단백질에 화합물의 결합을 검출하는 것을 포함하여, 위장 운동 및/또는 콜레스테롤 대사를 조절하는 화합물을 확인하는 방법.
6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, GPR39 수용체 단백질에 화합물의 결합이 시험할 화합물과 직접 또는 간접적으로 관련된 표지 수단에 의하여 또는 표지된 경쟁자와의 경쟁을 포함하는 분석으로 검출되는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 표지된 경쟁자가 표지된 오베스타틴(obestatin)인 방법.
8. (i) GPR39 단백질 수용체의 전부 또는 부분을 시험할 화합물과 접촉시키고,

   (ii) GPR39 수용체 단백질의 활성을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 화합물의 존재 하에서, 활성의 변화는 위장 운동을 조절할 수 있는 화합물임을 나타내는 것인 위장 운동 및 콜레스테롤 대사를 조절하는 화합물의 확인 방법.
9. 제 8항에 있어서, 단계 i)에서, 화합물이 제 2항 및 제 3항에 정의된 바와 같은 GPR39 단백질의 전부 또는 부분을 발현하는 숙주 세포와 접촉되는 방법.
10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, GPR39 수용체 단백질의 활성이 세포내 전령의 조절로써 측정되는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 세포내 이차 전령이 cAMP, 칼슘 또는 리포터 유전자 산물인 방법.
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서,

    (i) 서열번호:2 또는 서열번호:4의 폴리펩티드 전부 또는 부분을 암호화하는 핵산 서열,

    (ii) 서열번호:1 또는 서열번호:3으로 구성된 핵산 서열, 또는

    (iii) 서열번호:1 또는 서열번호:3의 핵산 서열에 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 분리된 핵산 서열의 용도.
13. 제 1항, 제 4항, 제 5항, 제 8항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서, 제 12항에 정의된 바와 같은, 핵산 서열을 포함하는 벡터의 용도.
14. 제 1항, 제 4항, 제 5항, 제 8항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서, 제 12항에 정의된 바와 같은, 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포의 용도.
15. GPR39 수용체 길항제를 포함하는, 인간 또는 동물에서 위 배출 지연 및 결장 운동성 지연 치료용 약제학적 조성물.
16. GPR39 작용제를 포함하는, 인간 또는 동물에서 위 배출 증가 및 결장 운동성 증가의 치료용 약제학적 조성물.
17. 위 배출 지연 및 결장 운동성 지연에 관련된 질환 증상 치료용 약제를 제조하기 위한 GPR39 길항제의 용도.
18. 위 배출 증가 및 결장 운동성 증가와 관련된 질환 증상 치료용 약제를 제조하기 위한 GPR39 작용제의 용도.
19. GPR39 수용체 작용제를 포함하는, 인간 또는 동물에서 콜레스테롤 레벨 증가 치료용 약제학적 조성물.
20. 콜레스테롤 레벨 증가에 관련된 질환 증상 치료용 약제를 제조하기 위한GPR39 작용제의 용도.

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