KR20080034877A - 비만 치료를 위한 약리학적 샤폐론 - Google Patents

Abstract

본 발명은 멜라노코르틴-4 수용체(melanocortin-4 receptor: MC4R)의 활성을 증가시키는 방법과, MC4R의 단백질 접힙(folding) 및/또는 프로세싱에 작용하는 돌연변이가 있는 MC4R의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 MC4R에 대한 약리학적 샤페론을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, MC4R의 활성을 세포 표면에서 증가시키는 것이 유익한 질병, 예컨대 비만이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 MC4R의 활성을 증가시키는 약리학적 샤페론을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포 표면에서의 MC4R 활성을 증가시키기 위하여, 소포체내에서 MC4R 접힘을 강화하는 약리학적 샤페론을 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

비만 치료를 위한 약리학적 샤폐론{PHARMACOLOGICAL CHAPERONES FOR TREATING OBESITY}

이건 출원은 2005년 6월 3일자 미국 특허 출원번호 60/687,648, 2006년 5월 12일자 미국 특허 출원번호 60/799,968 및 2006년 6월 2일자 출원에 대한 우선권을 주장하며, 이들 출원은 그 전문이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 멜라노코르틴-4 수용체(melanocortin-4 receptor;MC4R)의 활성을 증가시키는 방법과, MC4R의 접힘(folding) 및/또는 프로세싱에 작용하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 가진 MC4R의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 MC4R에 대한 약리학적 샤페론을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, MC4R의 활성을 세포 표면에서 증가시키는 것이 유익한, 비만과 같은 질병이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 MC4R의 활성을 증가시키는 약리학적 샤페론을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포 표면에서 MC4R 활성을 증가시키기 위하여, 소포체내에서 MC4R 접힘을 강화하는 약리학적 샤페론을 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다.

비만

가장 흔한 체중 장애로 알려져 있는 비만은, 서구에서 가장 중요한 영양장애 로, 중년 인구에서의 발병률은 30% 내지 50%로 추산되고 있다. 과체중 및 비만인 미국인의 숫자는 1960년 이래로 꾸준히 증가하고 있는 추세이며, 그 추세는 감소되지 않고 있다. 오늘날, 미국 성인의 64.5%(대략 1억 2700만명)가 과체중 또는 비만인 것으로 분류되고 있다. 매년 미국에서만도 적어도 300,000명 이상이 비만으로 사망하고 있으며, 비만 관련 건강 관리 비용으로 대략 1000억(미국 비만 협회) 달러가 지출되고 있다.

비만은 높은 혈압, 당뇨병(타입 II), 고지혈증, 심장병, 고혈압(hypertension), 발작, 담낭 질환, 유방암, 전립선암, 대장암과 같은 질병의 발병 위험성을 증가시킨다(Nishina, P. M. 등, Metab. 43: 554-558, 1994; Grundy, S. M. & Barnett, J. P., 1990, Dis. Mon. 36: 641-731). 미국에서, 코카서스 인종에 비해, 아프리카계 및 스페인계와 같은 소수 인종/민족 집단이 과체중 또는 비만이 되는 경우가 훨씬 많다. 소수 집단에서도 사회경제적 지위가 낮은 사람과 여성에서 특히 과체중 및 비만이 나타난다. 이러한 경향은 성인에게만 국한되는 것은 아니다. 어린이(6-11세)들 중 약 30.3%가 과체중이며, 15.3%가 비만이다. 청소년(12-19세)의 경우, 30.4%가 과체중이며, 15.5%가 비만으로 나타났다. 최근에는 당뇨병, 고혈압 및 그외 성인들에게서 흔한 비만 관련 만성 질환들이 어린이와 젊은 성인에게도 흔하게 나타나고 있다. 좋지 않은 식습관과 비활동성이 젊은층에서 비만이 증가하는 가장 큰 원인으로 보고되고 있다.

아울러, 소아 비만 발생 위험요소로는, 부모의 과체중, 자녀 체중에 대한 부모의 무관심, 과도한 음식량으로 인한 에너지 섭취량 증가, 좌식 생활의 증가, 이 동 관련 활동 감소(학교 또는 버스 정류장까지 보행), 극심한 노여움/좌절을 보이는 기질(이는 어린이의 화를 진정시키기 위해 부모가 아이에게 과도한 음식과 칼로리를 주게끔 할 수도 있음), 다운 증후군, 모체의 임신중 체중지수(Body Mass Index: BMI), 및 출생시 상태(비만율 증가)가 있다.

성인의 비만 진단에 사용되는 한가지 방법은 개인의 키에 대한 체중을 척도로 한 BMI를 측정하는 방법이다(Garrow and Webster, International Journal of Obesity, 1985; 9: 147-153). BMI 지수가 29.9에서 25이면, 과체중임을 의미하며, BMI가 30 이상이면 비만을 의미한다. 어린이의 경우, BMI는 성별 및 나이에 따라 특이적이다(Pietrobelli et al., Journal of Pediatrics 1998; 132: 204-210).

성인기에 비만이 발생할 위험 요소로는, 열악한 식이(고칼로리, 저영양), 육체적 활동 부족, 근무 교대 변동(working varied shift), 금연, 희귀 유전병과 같은 특별한 의학적 질환 상태, 호르몬 불균형(갑상선 기능저하증, 쿠싱병, 다낭성 난소 증후군), 특정 약물 복용(스테로이드 및 일부 항우울제들), 소수 인종 및 소수 민족(특히, 여성 소수집단), 사회경제적으로 낮은 위치, 나이(20-55세에 위험이 증가됨), 임신 및 (스케줄 변경으로 인한) 퇴직이 있다.

멜라노코르틴 -4 수용체 및 비만

멜라노코르틴-4 수용체(melanocortin-4 receptor: MC4R)는 체중 조절과 관련있다(Graham et al., Nat. Genetics, 17: 273-4; 1997). MC4R은 음식섭취에 영향을 미치는 시상하부를 포함한 뇌에서 발현된다. MC4R 활성에 영향을 주는 수많은 변이들이 발견되었으며, 이들 대다수는 조기 발병형(어린이) 비만을 포함한 비만과 관련성이 있다(Nijenhuis et al., J. Biol. Chem., 278: 22939-45; 2003, Branson et al., New Eng. J. Med., 348:1096-1103;2003, Gu et al., Diabetes., 48:635-39;1999, Farooqi et al., New Eng. J. Med., 348:1085-95;2003, Tao et al., Endocrinology, 144:4544-51;2003).

현 치료법

현재의 항-비만 약물은 제한된 효능과 여러가지 부작용을 가지고 있다(Crowley, V. E.,Yeo, G. S. and O'Rahilly, S., Nat. Rev. Drug Discov., 1, 276-86;2002). 전세계적으로 비만이 만연하고 있어, 이러한 분야에 맞는 치료제 개발이 절실한 실정이다. 최근들어, 식욕, 체열소비, 지방 축적의 조절에 관여하는 호르몬과 신경펩티드들이 항-비만 약물로 등장하고 있다(McMinn, J. E., Baskin, D. G. & Schwartz, M. W., Obes. Rev., 1 :37-46;2000, Drazen, D. L. & Woods, S. C., Curr. Opin Clin Nutr Metab Care, 6:621-629;2003). 그러나, 아직까지, 이러한 펩티드는 비경구 투여가 필수적이다. 비만을 조절을 위하여 장기간 매일 주사제를 사용하는 것은 권고할만하지 않으며, 이들 약들의 사용을 제한하고 있다.

분자 샤페론은 적절한 단백질 접힘을 안정화시킨다

단백질은 세포질에서 합성되고, 새롭게 합성된 단백질은 거의 접히지 않은 상태로 소포체의 루멘(Lumen)으로 분비된다. 일반적으로, 단백질 접힘은 자기-조립 원칙으로 이루어진다. 새롭게 합성된 폴리펩티드들은 그 아미노산 서열에 기초하여 본래의 구조로 접힌다(Anfinsen et al., Adv. Protein Chem., 29:20530;1975). 주위 온도와 고농도의 단백질이 조합되면 소수성 코어로 파묻혀진 아미노산들이 정상적으로는 이웃한 기와 비특이적으로 반응하는 응집 과정을 촉진시키기 때문에, 생체내에서의 단백질 접힘은 복잡하다. 이러한 문제를 피하기 위하여, 단백질이 본래의 구조로 다시 접히도록 접히지 않은 단백질에 결합함으로써 발현된 초기 폴리펩티드 체인이 응집되지 못하게 하는, 샤폐론이라고 하는 특별한 단백질 그룹에 의해, 단백질 접힘이 촉진된다(Hartl, Nature, 381:571-580;1996).

내인성 분자 사폐론들은 실제 모든 타입의 세포와 세포 구획에 존재하고 있다. 이들중 일부는 단백질 이동에 관여하며, 열충격 및 당고갈(glucose starvation)과 같은 스트레스하에서도 세포가 생존가능하게 한다(Gething et al., Nature, 355:33-45;1992, Caplan, Trends Cell. Biol., 9:262-268;1999, Lin et al., Mol. Biol. Cell., 4:109-1119;1993, Bergeron et al., Trends. Biochem. Sci., 19:124-128;1994). 내인성 샤폐론 중에서, BiP(immunoglobulin heavy-chain binding protein, Grp78)가 가장 잘 특정화된 ER 샤폐론이다(Haas, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 167:71-82;1991). 다른 샤폐론과 마찬가지로, BiP는 성숙기 동안에 ER내에서 수많은 분비성 단백질과 막 단백질과 상호 작용한다. 초기 단백질의 접힘이 순조롭게 진행될 때 이러한 상호작용은 통상 약하고 일시적이다. 단백질이 본래 구조를 취하게 되면, 분자 샤폐론은 더이상 단백질과 상호작용하지 않게 된다. 접힘, 조합 또는 적절하게 당화되지 못한 단백질에 BIP가 결합하면, 안정화되어, 통상 ER-조합성 분해 과정을 통해 단백질 분해를 이끈다. 이러한 과정 을 ER에서의 "품질 관리" 시스템(Quality control system)이라고 하며, 이는 적절하게 접혀지고 조합된 단백질만 추가적인 성숙을 위해 ER 외부로 이송시키고, 부적절하게 접힌 단백질은 이후 분해를 위해 보존된다(Hurtley et al., Annu. Rev. Cell. Biol., 5:277-307:1989). 비효율적인 열역학적인 단백질 접힘 프로세스와 ER의 품질 관리 시스템의 공동 작용으로 인해, 초기(돌연변이되지 않은) 단백질 분획만 기능적 구조로 접혀 ER에서 성공적으로 분비된다.

특이적인 효소 저해제로부터 유래된 약리학적 샤페론은 돌연변이 효소를 구제하고 야생형 효소를 강화시킨다

리소좀 축적증(lysosomal storage disorders: LSDs)과 관련있는 효소의 소형 분자 저해제는 돌연변이 효소의 접힘과 활성을 모두 구제할 수 있으며, 야생형 효소의 접힘과 활성을 강화시킬 수 있다(미국 특허 6,274,597; 6,583,158; 6,589,964; 6,599,919; 및 6,916,829, 이들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 특히, LSD와 관련있는 돌연변이 효소에 대한 특이적인 경쟁적 저해제인, 소형 글루코스 및 갈락토스 유도체의 투여가, 돌연변이 효소의 시험관내 및 생체내 안정성을 증가시키고, 돌연변이 효소의 활성을 강화시킨다는 사실을 확인하였다. 이러한 전략의 배후에 있는 원 이론은 다음과 같다: 돌연변이 효소 단백질은 ER에서 부적절하게 접히므로(Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 220: 812-815;1996), 효소 단백질은 정상적인 수송 경로(ER -> 골지체 -> 엔도좀 -> 리소좀)에서 지연되어, 빠르게 분해된다. 그러므로, 돌연변이 단백질의 올바른 접힘을 안정화시키는 화합물을 돌연변이 단백질에 대한 활성 부위-특이적인 샤페론으로서 제 공하여, 이것이 ER 품질 관리 시스템에서 순조롭게 배출되도록 할 것이다. 효소 저해제는 촉매 센터를 차지하여, 배양 및 동물에서 세포내 효소 구조를 안정화시킨다. 이러한 특이적인 샤페론은 효소의 활성 부위에 결합하기 때문에 "활성 부위-특이적인 샤폐론(ASSC)"이라고 한다.

ASSC는 돌연변이 효소를 구제할 뿐만 아니라 재조합 야생형 효소의 ER 분비와 활성을 증진시킨다. ASSC는, 효소의 과다 발현 및 과다 생산이 ER의 능력을 초과하여 ER의 품질 관리 시스템에서 지연되어, 단백질의 응집 및 분해로 유도되는, 과다 발현된 야생형 효소의 접힘을 촉진한다. 따라서, 접히는 동안에 효소의 안정적인 분자 구조를 유도하는 화합물은, ER에서 배출되기 위한 적절한 구조로 효소를 안정화시키는 "샤페론"으로서 제공된다. 전술한 효소에 대한 사항과 같이, 이러한 화합물이 효소의 경쟁적인 저해제인 것으로 놀랍게도 밝혀졌다.

샤폐론을 이용한 그외 단백질의 강화

현재 LSD 이외에도, 꽤 다양한 질병들이, 비-천연적인 단백질 구조를 채택함으로써 초래되는 "구조 질환"으로 인지되고 있으며, 이는 ER내 단백질 체류를 유도하여 결국 단백질 분해를 유도할 수 있다(Kuznetsov et al., N. Engl. J. Med., 339:1688-1695;1998, Thomas et al., Trends. Biochem. Sci., 20:456-459;1995, Bychkova et al., FEBS Lett., 359:6-8;1995, Brooks, FEBS Lett., 409:115-120;1997).

예를 들면, 종양 억제 단백질인 p53의 돌연변이 형태의 DNA 결합 도메인을 안정화시켜, 단백질의 활성형의 구조를 유지하도록 하는, 소형 합성 화합물이 발견 되었다(Foster et al., Science, 286:2507-10;1999). 리셉터의 합성은 소형 분자 리셉터 길항제 및 리간드에 의해 구제되는 것으로 입증되었다(Morello et al., J. Clin. Invest., 105:887-95;2000, Petaja-Repo et al., EMBO J. 21:1628-37;2002). 또한, 막 채널 단백질과 다른 혈장막 수송체의 약리학적 구제가 채널 차단 약물 또는 기질을 이용하여 입증되고 있다(Rajamani et al., Circulation Vol.105:2830-5;2002, Zhou et al., J. Bioi. Chem., 274:31123-26;1999, Loo et al., J. Biol. Chem., 272: 709-12;1997, Pedemonte et al., J. Clin. Inves., 115:2564-71;2005).

MC4R 돌연변이와 관련있는 MC4R 단백질 및 관련없는 MC4R 단백질의 기능 결핍에 대하여 해명이 요구가 여전히 남아있다.

발명의 요약

본 발명은 멜라노코르틴-4 리셉터(MC4R) 활성을 증가시키는, 예컨대 MC4R을 코딩하는 유전자에 대한 접힘 돌연변이가 있는 개체 또는 야생형 MC4R의 활성 증가가 유익한 개체에서 비만을 치료하기 위한, 방법을 제공한다.

일 예로, 본 발명은 유효량의 약리학적 샤페론을 MC4R 발현 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, MC4R 폴리펩티드의 기능적 구조로의 세포내 접힘을 강화시키는 방법을 제공한다. 예컨대 시상하부의 신경의 세포 표면상에서의 발현 증가를 초래하는 MC4R의 세포내 접힘 강화는, 식욕을 감소시키고, 따라서 폭식과 같은 과식 장애 치료에 유용하다.

일 예로, MC4R 폴리펩티드는 야생형 MC4R 폴리펩티드이며, 예컨대 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 개시된 서열을 갖는다.

다른 예로, MC4R 폴레펩티드는 돌연변이 MC4R 폴리펩티드이다. 이러한 예에서, 상기 돌연변이 폴리펩티드는 MC4R 폴리펩티드의 감소된 또는 부적절한 세포내 접힘을 초래하는 한가지 이상의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이의 예는 다음과 같다: P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, 코돈 211에 CTCT 및 코돈 244에 TGAT 삽입.

일 예로, 약리학적 샤폐론은 MC4R 길항제이다. 다른 예로, 약리학적 샤페론은 MC4R 작용제이다. 다른 예로, 약리학적 샤폐론은 MC4R 부분 작용제 또는 역 작용제(inverse agonist)이다.

또한, 본 발명은 MC4R 폴리펩티드의 세포 표면 발현을 증진시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 MC4R 발현 세포를 유효량의 약리학적 샤페론과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 야생형 MC4R 폴리펩티드 및 돌연변이 MC4R 폴리펩티드 둘 다와 관련있으며, 약리학적 샤페론은 MC4R 폴리펩티드의 세포내 접힘을 강화시키는 방법을 제시한다.

본 발명은 또한 테스트 화합물을 MC4R 폴리펩티드를 발현하는 세포를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키는 단계, 테스트 화합물의 존재하에 반응 혼합물내에서 MC4R 폴리펩티드의 안정성, 활성 및/또는 세포 표면 위치화를 검출하는 단계, 및 상기 테스트 화합물의 존재하의 MC4R 폴리펩티드의 안정성, 활성 및/또는 세포 표면 위치화를 상기 테스트 화합물의 부재시의 MC4R 폴리펩티드의 안정성, 활성 및/또는 세포 표면 위치화와 비교하는 단계를 포함하며, 테스트 화합물의 부재시에 비해 테스트 화합물의 존재시의 안정성, 활성 및/또는 세포 표면 위치화가 증가된 것으로 검출되면 상기 테스트 화합물이 MC4R 폴리펩티드에 대한 샤페론임을 의미하는 것을 특징으로 하는, MC4R 폴리펩티드에 대한 샤페론을 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다.

이러한 스크리닝 방법의 구체적인 예에서, MC4R 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

상기 스크리닝 방법의 다른 예로, MC4R 폴리펩티드는 MC4R 폴리펩티드의 잘못된 접힘과 관련있는 돌연변이를 포함한다. 구체적인 예로, 상기 잘못 접힌 돌연변이는 다음과 같은 한가지 이상의 변이이다: P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, 211번째 코돈에 CTCT 또는 244번째 코돈에 TGAT 삽입.

일 예로, 반응 혼합물은 세포를 주성분으로 한다. 다른 예로서, 반응 혼합물은 세포가 결핍된 것이다.

일 예로, 상기 스크리닝 방법은 예컨대 세포 표면에서의 MC4R 폴리펩티드의 활성을 검출하는 단계를 더 포함한다. 다른 예로, 상기 활성은 cAMP 활성화를 통해 측정된다.

본 발명은 상세한 설명 및 실시예를 들어 더욱 잘 이해될 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 MC4R 폴리펩티드의 야생형 및 돌연변이의 단백질 접힘 및 프로세싱을 구제하고 신경의 세포 표면에서 단백질 안정성을 강화시켜, 배고픔과 과식을 감소시킬 수 있는 소형 분자를 동정할 수 있다는 것에 관한 것이다. 약리학적 샤폐론은 MC4R 단백질에 특이적으로 결합하여 돌연변이형 또는 야생형 MC4R 단백질의 기능적 구조를 유도 또는 안정화시킨다. 따라서, 본 발명은 돌연변이 MC4R의 특이적인 구제 뿐만 아니라 세포 표면에서의 야생형 MC4R의 발현 강화를 허용한다. 따라서, MC4R에 대한 약리학적 샤폐론은 MC4R의 안정성 또는 활성을 구제 또는 증가시키는 것이 바람직한 질병, 예컨대 과체중 또는 비만인 상태를 치료하는데 사용할 수 있다.

본 발명은 부분적으로 인간에게 약리학적 샤폐론의 투여가 야생형 단백질의 활성 수준을 의미있는 수준으로 증가시킨다는 사실에 기초한 것이다. 이러한 사실은 올바른 단백질 이동성 및 현저한 단백질 활성 증가로 유도되는 약리학적 샤페론의 ER에서의 적절한 단백질 접힘을 촉매하는 능력에 대한 이해와 조합되어, 이롭게는 특히 인간의 질병, 질환 또는 증상을 반전 또는 완화시키는데 충분한 단백질 활성을 획득하는 능력을 제공한다. 이러한 현상은 "화학적 샤페론"이라고 하는 모든 단백질의 발현을 증가시키도록 일반적으로 운용되는 화합물을 이용하는 방법과는 대조적으로, 특정 약리학적 샤페론에 특이적으로 결합된 단백질에 특히 특이적이다.

특정 실험 결과는 본 발명을 뒷받침한다: 약리학적 샤폐론은 투여후 인간에서 내인성 야생형 단백질의 활성을 저투여량에서는 정상의 약 120, 130, 145%로 증가시키고, 고투여량에서는 정상의 150, 185%로 증가시킨다(실시예 7 및 도 12). 이러한 생체내 증가 정도는 약리학적 샤폐론에 노출된 상태로 있는 조직 배양에서의 세포 결과로부터는 예측할 수 없다. 예를 들면, 미국특허 제 6,274,597호는 약리학적 샤폐론인 데옥시갈락토노지리마이신(DGJ)을 첨가하여 시험관내에서 배양한 정상 림프아구에서 알파-갈락토시데이즈-A(α-Gal A)의 30% 증가를 언급하고 있다. 생리학적 제거과정이 생체에서 정상 단백질에 대한 약리 샤폐론들의 효과를 감소시킬 것이라고 예상되었지만, 약리학적 샤폐론이 야생형 단백질의 활성을 현저하게 증가시킬 것으로는 기대되지 않는다. 미국특허 제 6,274,597호의 실시예 10에는, 일주일간 약리학적 샤페론을 처리한 형질전환 마우스에서의 돌연변이 효소의 활성 증가가 기재되어 있다. 그러나, 이들 실험은 구제되는 단백질의 야생형이 아닌 돌연변이형으로 수행하고, 마우스를 대상으로 수행되었으므로, 그 결과는 인간에서 야생형 단백질에 대해 관찰되는 결과를 예측하거나 시사하지 않을 것이다.

약리학적 샤폐론이 생체에서 야생형 단백질의 활성 수준을 적어도 20-25%, 즉 적어도 1.2배 또는 정상의 120%, 또는 30%(1.3배, 정상의 130%), 40%(1.4배, 정상의 140%) 증가시킬 수 있으나, 특히 적어도 약 50%(1.5배, 정상의 150%)로는 증가시킬 수 있음을 예상할 수는, 없다. 본원에 예시된 바와 같이, 개체에게 DGJ를 투여하면 투여량 의존적인 α-Gal A 증가가 나타났다. 이러한 놀라운 효과는 개시된 활성 또는 야생형 단백질 증가를 획득하는 것으로, 단백질의 돌연변이 형태를 구제하기 위한 기존 기법에 따라 이미 입증된, 약리학적 샤폐론을 적정함으로써, 도출되었다. 따라서, 본 발명은 돌연변이 단백질의 활성을 구제하는 것으로 알려진 약리학적 샤페론의 투여량을 적정하여, 규정된 양에 의해 야생형 단백질의 활성 수준을 증가시키기 방법을 제공한다.

정의

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 명세서의 문맥 내에서, 그리고 각 용어가 사용된 특정 문맥에서, 당해 분야에서 통용되는 통상의 의미를 가진다. 본 발명의 조성물 및 방법과 이의 제조 및 사용 방법을 설명할 때 실무자에게 추가적인 지침을 제공하기 위하여, 특정 용어는 하기 또는 본 명세서의 도처에서 논의된다.

본원에서, 용어 "약리학적 샤페론," 또는 때때로 "특이적인 약리학적 샤페론"("SPC")은 MC4R에 특이적으로 결합하는 분자를 의미하며, 한가지 이상의 다음의 효과를 가진다: (i) 단백질의 안정적인 분자 구조 형성을 향상시키고; (ii) 단백질의 ER에서 다른 세포 위치, 바람직하게는 본래의 세포 위치로 적절한 이동을 유도하고, 즉 단백질의 ER-조합성 분해를 방지하고; (iii) 구조적으로 불안정한, 즉 잘못 접힌 단백질의 응집을 방지하고; (iv) 단백질의 야생형 기능, 안정성, 및/또는 활성을 일정 부분 복원시키거나 증진시키며; 및/또한 (v) MC4R를 함유하고 있는 세포의 표현형 또는 기능을 향상시킨다. 따라서, MC4R에 대한 약리학적 샤페론은 MC4R에 결합하여 MC4R의 적절한 접힘, 이동, 무응집 및 활성을 야기하는, 분자이다. 본원에서, 이러한 용어는 BiP와 같은 내인성 샤페론 또는 글리세롤, DMSO 또는 중수소수와 같은 다양한 단백질에 대하여 비특이적인 샤페론 활성이 입증된 비특이적인 제제, 즉 화학적 샤페론을 의미하는 것은 아니다(Welch et al., Cell Stress and Chaperones 1996; 1(2):109-115; Welch et al., Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997; 29(5):491-502; 미국 특허 5,900,360; 미국 특허 6,270,954; 및 미국 특허 6,541,195 참조). 이는 특이적인 결합 분자, 예컨대 특이적인 약리학적 샤페론(상기), 저해제 또는 길항제 및 작용제를 포함한다.

본원에서, 용어 "특이적으로 결합한다"는 MC4R과 약리학적 샤페론의 상호작용, 구체적으로는, 약리학적 샤페론과 접촉하는데 직접 참여하는 MC4R의 아미노산 잔기와의 상호작용을 말한다. 약리학적 샤페론은 표적 단백질, 예컨대 MC4R에 특이적으로 결합하여 MC4R에 대해 샤페론 효과를 나타내지만, 관련 또는 무관한 단백질의 일반 그룹에는 영향을 미치지 않는다. 소정의 MC4R 약리학적 샤페론과 상호작용하는 MC4R의 아미노산 잔기는 MC4R 리간드 결합 도메인, 즉 천연 리간드 MSH에 결합하는 도메인, 또는 MC4R의 "활성부위", 예컨대 G-단백질 결합 도메인내이거나 아닐 수 있다. 특이적 결합은 통상적인 결합 분석법 또는 구조 연구, 즉 동시-결정화, NMR 등을 통하여 평가할 수 있다. MC4R의 MSH 리간드 결합 도메인에서 아미노사의 예로 Phe284 및 Tyr268(서열번호 2를 기준 서열로 이용)이 있으나, 이로 한정되지 않는다.

비제한적인 예로, 약리학적 샤폐론은 MC4R의 저해제 또는 길항제이다. 다른 비제한적인 예로, 약리학적 샤페론은 MC4R의 작용제이다. 또다른 예로, 약리학적 샤페론은 작용제/길항제 혼성이다. 본원에서, "길항제"는 단백질에 결합하여 MC4R의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 저해, 감소 또는 무효화시키는 임의 분자를 의미한다. 용어 "작용제"는 단백질에 결합하여 MC4R의 활성을 일정 부분 증가, 증진, 복원 또는 모방하는 임의 분자이다. 하기에서와 같이, MC4R에 대한 이러한 분자는 공지되어 있다.

본원에서, 용어 "MC4R 구조 안정화를 강화한다" 또는 "MC4R 구조 안정성을 증가시킨다"는 MC4R에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉되지 않는 세포(바람직하기로는, 초기에, 동일한 세포 타입 또는 동일한 세포)에서의 MC4R에 비하여, MC4R에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉한 세포에서의 기능적 구조를 취하는, MC4R의 양 또는 비율 증가를 의미한다. 일 예로, 세포는 MC4R의 구조 돌연변이를 발현하지 않는다. 다른 예로, 세포는 폴리펩티드를 돌연변이 MC4R 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리펩티드, 예컨대 구조 돌연변이 MC4R을 발현한다.

본원에서, 용어 "MC4R 이동성을 강화한다" 또는 "MC4R 이동성을 증가시킨다"는 는 MC4R에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉되지 않는 세포(바람직하기로는, 초기에, 동일한 세포 타입 또는 동일한 세포)에서의 MC4R에 비하여, MC4R에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉한 세포에서의, MC4R의 형질막(plasma membrane)으로의 이동 효율 증가를 의미한다.

본원에서, 용어 "MC4R 활성을 증진시킨다" 또는 "MC4R 활성을 증가시킨다"는 는 MC4R에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉되지 않는 세포(바람직하기로는, 초기에, 동일한 세포 타입 또는 동일한 세포)에서의 MC4R에 비하여, MC4R에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉한 세포에서의, MC4R의 활성 증가를 의미한다.

본원에서, 용어 "MC4R 수준을 증진시킨다" 또는 "MC4R 수준을 증가시킨다"는 MC4R에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉되지 않는 세포(바람직하기로는, 초기에, 동일한 세포 타입 또는 동일한 세포)에서의 MC4R에 비하여, MC4R에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉한 세포에서의, MC4R의 수준 증가를 의미한다.

용어 "적절한 구조를 안정화시킨다"는 야생형 MC4R 단백질의 구조와 기능적으로 동일한 돌연변이 MC4R 단백질의 구조를 유도 또는 안정화시키는, MC4R 약리학적 샤페론의 능력을 의미한다. 용어 "기능적으로 동일한"은 구조에 일부 변이가 있을 수 있지만 구조적 유연성은 (1) 단백질 응집, (2) ER-조합성 분해 경로를 통한 제거, (3) 단백질 기능의 손상, 예컨대 리간드에 결합하여 및/또는 아데닐릴 사이클레이즈 활성을 활성화시키는 능력, 및/또는 (4) 야생형 단백질 보다 높은 또는 낮은 수준으로의 세포내 부적절한 이동, 예컨대 형질막에 위치화를 발생시키지 않는 것을 의미한다.

용어 "안정적인 분자 구조"는 약리학적 샤페론에 의해 유도되는, 세포에서 일정 부분이상 야생형 기능을 제공하는, 단백질, 즉 MC4R의 구조를 의미한다. 예를 들면, 돌연변이 MC4R의 안정적인 분자 구조는 MC4R이 잘못 접혀 분해되는 대신, 야생형 MC4R처럼 ER에서 MC4R이 배출되어 세포 막으로 이동되는 것일 수 있다. 아울러, 돌연변이된 MC4R의 안정적인 분자 구조는 동계 생리적 G 단백질을 통한 cAMP 생성 강화에 있어, 전체 또는 부분적인 MC4R 활성, 예컨대 아데닐릴 사이클레이즈 활성화 활성을 기질 수 있다. 그러나, 안정적인 분자 구조가 반드시 야생형 단백질의 모든 기능적인 속성을 가지는 것은 아니다.

용어 "MC4R 활성"은 세포에서 야생형 MC4R의 정상적인 생리 기능을 나타낸다. 예를 들면, 작용제에 의한 결합시, MC4R은 G 단백질, Gα_S와의 상호작용 및 아데닐레이트 사이클레이즈 활성화를 통해 신호 전달한다(VanLeeuwen et al., J. Biol. Chem., 18:15935-40;2003). 이는, 세포내 cAMP 축척과 단백질 카이네이즈 A(PKA)의 활성화를 초래한다. 이러한 기능성은 당업계에 알려진 방법으로 시험할 수 있다. 예를 들면, MC4R에 대한 α-, β-, 또는 γ-MSH 리간드 또는 ¹²⁵I-[Nle⁴, D-Phe⁷]α-MSH 작용제의 결합 분석 또는 아데닐릴 사이클레이즈 활성화 분석 또는 루시퍼레이즈 리포터 유전자 분석을 이용하여, 세포내 cAMP의 증가를 결정할 수 있다. cAMP 축척 분석은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다(VanLeeuwen et al., J. Biol. Chem., 18:15935-40;2003).

"MC4R"은 서열번호 1(human; GenBank Accession No. BC069172); 3(human; GenBank Accession No. NM_005912); 5(rat; GenBank Accession No. NM_013099); 또는 7(murine; GenBank Accession No. NM_016977) 중 어느 하나에 기재된 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코팅되는 폴리펩티드이다.

"MC4R 폴리펩티드"는 또한 서열번호 2(human; GenBank Accession No. AAIO1803); 4(human; GenBank Accession No. NM_005912); 6(rat; GenBank Accession No. NM_013099); 또는 8(murine; GenBank Accession No. AF201662)에 기재된 아미노산 서열과, 서열번호 2, 4, 6 또는 8 중 어느 하나와 동일한 기능 및 리간드 결합 친화성을 갖는 MC4R 폴리펩티드를 코딩하는 그외 다른 아미노산 서열이다.

용어 "야생형 MC4R"은 앞에서 언급된 뉴클레오티드(서열번호 1, 3, 5 및 7) 서열을 코딩하는 MC4R 및 전술한 뉴클레오티드 서열(human MC4R GenBank Accession AAI01803; human MC4R-GenBank Accession No. NM_005912; rat MC4R-GenBank Accession No. NM_013099; 및 mouse MC4R-GenBank Accession AF201662)에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열(서열번호 2, 4, 6 및 8) 서열, 및 ER에서 기능적 구조를 형성하는 능력, 세포내에서 알맞게 위치화하는 능력 및 야생형 활성(cAMP 축적의 MC4R 자극)을 나타내는 능력을 가진, 정상 개체에서 대립 유전자 변이체와 같이 (전술한 폴리펩티드 서열과 동일한 기능적 특성 및 결합 친화성을 가진) MC4R 폴리펩티드를 코딩하는 그외 다른 뉴클레오티드 서열이다.

본원에서, 용어 "돌연변이 MC4R"은 변이된 MC4R 아미노산 배열을 서열을 만드는 유전자 돌연변이가 있는 유전자로부터 번역된 MC4R 폴리펩티드를 의미한다. 일 예에서, 돌연변이는 야생형 MC4R과 비교하였을 때 ER에서 정상적으로 존재하는 조건하에서 본래의 구조를 취하지 않거나, 야생형 MC4R 단백질에 비해 안정성 또는 활성 감소를 보이는, MC4R 단백질을 만든다. 이러한 유형의 돌연변이를 본원에서 "구조 돌연변이"라고 하며, 이러한 돌연변이를 가진 단백질을 "구조 돌연변이체"라고 한다. 이러한 구조 형성에 실패하면, MC4R 단백질은 단백질 수송 시스템에서 정상 경로를 통해 세포내 본래 위치 또는 세포외 환경으로 수송되기 보다는 분해 또는 응집되게 된다. 일부 예에서, 돌연변이는 단백질의 발현 효율 감소, 예컨대 전사 효율, 스플라이싱 효율, mRNA 안정성 등에 작용하는 돌연변이를 형성하는, MC4R을 코딩하는 유전자의 비-코딩 부분에서 이루어질 수 있다. 야생형의 발현 수준 뿐만 아니라 MC4R의 구조 돌연변이 변이체의 발현 수준 강화에 의해, MC4R 약리학적 샤페론의 투여는 이러한 비효율적인 단백질 발현을 초래하는 결함을 완화시킬 수 있다.

예시적인 돌연변이(기준으로서 서열번호 2의 폴리펩티드의)로는 P78L, R165Q 및 R165W과 있다. 그외 MC4R 돌연변이체로는 I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, 211번 코돈에 CTCT, 및 244번 코돈에 TGAT의 삽입을 포함한다. 아울러, 그외 MC4R 돌연변이(기준으로서 서열번호 2를 이용하여)는 하기 표 1의 것을 포함한다.

특정 시험으로 생체내 실질적인 기능에 상응하거나 상응하지 않는 단백질의 속성을 평가할 수 있지만, 이는 단백질 기능성의 집합 대행자(aggregate surrogate)일 뿐이고 이러한 시험에서의 야생형 동태는 본 발명의 단백질 접힘 구제 또는 증진 기술에 대한 만족스러운 결과를 보여준다. 본 발명에 있어, 상기한 활성은 기능적 MC4R의 ER에서 세포막으로의 적절한 수송이다.

용어 "내인성 발현" 및 "내재적으로 발현된다"는 예컨대 그것의 발현, 활성 또는 안정성을 저해하는 것과 같이 변이시키는 MC4R 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 돌연변이와 같이, MC4R 결함, 우세한 네거티브 돌연변이 과다 발현 또는 그외 결함과 관련있는 질환 또는 질병, 예컨대 비만을 가지지 않은, 또는 가진것으로 추정되는 개체에서의, MC4R의 세포내 정상적인 생리적 발현을 의미한다. 또한, 상기 용어는 건강한 개체에서 정상적으로 발현되는 세포 또는 세포 타입에서의 MC4R 발현을 의미하며, 건강한 개체에서는 발현되지 않는 세포 또는 세포 타입, 예컨대 종양에서의 MC4R 발현은 해당되지 않는다.

본원에서, 용어 "수송 효율"은 돌연변이 단백질이 ER에서 세포내 본래 위치, 세포 막 또는 세포외 환경으로 수송되는 능력을 의미한다.

용어 "치료적 유효용량" 및 "유효량"은 (길항제의 경우) 적절한 세포 위치에서 이미 발현된 단백질을 저해하지 않으면서, 또는 (작용제의 경우) 단백질의 적절한 세포내 위치로의 리간드-매개 리포터 내재화를 유도하지 않으면서, ER(기능적 구조를 허용하는)에서의 단백질 프로세싱을 강화시키고, 타겟 단백질의 활성을 증진시켜, 개체에서 치료 반응을 형성하는데 충분한 양을 의미한다. 치료 반응이란, 사용자(예컨대, 임상의)가 증상 및 대용 임상 마커를 포함하여, 치료법에 대한 효과적인 반응으로서 인식하는, 모든 반응일 수 있다. 따라서, 치료 반응은 질환 또는 질병, 예컨대 비만 또는 폭식의 한가지 이상의 증상의 경감 또는 저해일 수 있다.

용어 "약제학적으로 허용가능한"은 인간에게 투여하였을때 부적절한 반응을 일으키지 않고 생리학적으로 허용가능한 분자단위 및 조성물에 대해 사용된다. 바람직하게는, 본원에서 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 공인된 약전에서 동물, 보다 특히 인간에서 사용되는 것으로 기재된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 화합물이 투여될 때 사용되는 희석제, 보강제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 약제학적 담체는 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 수성 식염수와 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 담체로서, 특히 주사제 용액으로 사용될 수 있다. 적절한 약제학적 담체는 "Remington's Pharmaceutical Sciences"(E. W. Martin, 18th Edition, or other editions)에 기재되어 있다.

용어 "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정확성의 측면에서 측정값에 대해 허용가능한 정도의 오차를 의미할 수 있다. 통상 예시적인 오차 범위는 주어진 값 또는 범위의 20 %, 바람직하게는 10%, 더욱 바람직하게는 5% 이내이다. 생물계에서 대안적이고 특이적으로, 용어 "약" 및 "대략"은 크기 순서에 따라, 바람직하게는 주어진 값의 5-배, 더욱 바람직하게는 2-배 이내의 값을 의미한다. 본 명세서에서 주어진 수치는 달리 언급하지 않는 한 대략적인 값이며, 이는 명백히 기재되지 않은 경우라도 용어 "약" 또는 "대략"이 추론될 수 있는 것을 의미한다.

본원에서, 용어 "분리된"은 언급하고 있는 물질이 정상적으로 발견되는 환경으로부터 분리되는 것을 의미한다. 따라서, 분리된 생물학적 물질은 세포 성분 즉, 물질이 발견 또는 생산되는 세포의 성분이 결핍되어 있을 수 있다. 핵산 분자의 경우, 분리된 핵산은 PCR 산물, 겔 상의 mRNA 밴드, cDNA 또는 제한 단편을 포함한다. 다른 예로, 분리된 핵산은 바람직하기로는 그것이 발견될 수 있는 염색체로부터 적출되며, 더 바람직하기로는 염색체에서 발견되었을때 분리된 핵산 분자에 포함된 유전자의 상류 또는 하류에 위치된 비-조절, 비-코딩 부위 또는 그외 유전자와 더 이상 연결되지 않는다. 또다른 예로, 분리된 핵산은 한개 이상의 인트론이 없다. 분리된 핵산 분자는 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체 등에 삽입되는 서열을 포함한다. 따라서, 구체적인 예에서, 재조합 핵산은 분리된 핵산이다. 분리된 단백질은 세포에 조합된, 또는 막-조합 단백질인 경우에 세포 막에 조합된, 그외 단백질이나 핵산 또는 이들 모두와 조합될 수 있다. 분리된 세포기관, 세포 또는 조직은 유기체에서 발견되는 해부학적 부위로부터 취한다. 분리된 물질은 필수적이진 않지만 정제될 수 있다.

용어 "정제된"은, 관련이 없는 물질, 즉, 오염원을 감소 또는 제거시킨 조건에서 분리한, MC4R 핵산 또는 폴리펩티드와 같은 물질에 대해서 사용된다. 예를 들어, 정제된 단백질은, 바람직하게는 세포내에서 조합된 다른 단백질 또는 핵산이 실질적으로 없는 것을 의미한다. 본원에서, 용어 "실질적으로 없는"은 물질의 분석 시험에서 사용된다. 바람직하게는, 오염원이 실질적으로 없는 정제된 물질은 적어도 50% 순도; 더 바람직하게는, 적어도 90% 순도, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 순도를 갖는다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역분석법, 조성 분석, 생물학적 분석법 및 당해 분야에 공지된 그외 방법에 의해 측정할 수 있다.

용어 "Me"는 메틸기를 의미하며, "Et"는 에틸기를, "Ac"는 아세틸기를 의미한다.

용어 "할로(halo)"는 별도로 지시되지 않는 한, 플루오르(fluoro), 염소(chloro), 브롬(bromo) 또는 요오드(Iodo)를 의미한다.

용어 "알킬"은, 별도로 지시되지 않는 한, (융합 및 브릿지된 바이사이클 및 스피로사이클 모이어티를 포함하여) 선형, 분지형 또는 사이클형 모이어티를 가진, 포화된 일가 탄화수소 라디칼, 또는 상기 모이어티의 조합을 의미한다. 사이클형 모이어티를 가지는 알킬기의 경우, 적어도 3개 이상의 탄소 원자를 가져야 한다.

용어 "사이클로알킬"은, 별도로 지시되지 않는 한, 상기와 같이 알킬이 정의된, 사이클형 알킬 모이어티이다. 용어 "사이클로알킬"의 사용은 용어 "알킬"을 비-사이클형 모이어티로 한정되는 것으로 해석되진 않는다.

용어 "알케닐"은 별도로 지시되지 않는 한, 상기와 같이 알킬이 정의된, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 가지 알킬 모이어티이며, 상기 알케닐 모이어티의 E 및 Z 이성체를 포함한다.

용어 "알키닐"은 별도로 지시되지 않는 한, 상기와 같이 알킬이 정의된, 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 가진 알킬 모이어티를 포함한다.

용어 "알콕시"는 별도로 지시되지 않는 한, 상기와 같이 알킬이 정의된, O-알킬기를 포함한다.

용어 "아릴"은 별도로 지시되지 않는 한, 페닐 또는 나프틸과 같이, 수소하나의 제거에 의해 방향족 탄화수소로부터 파생된 유기 라디칼이다.

용어 "4 내지 10원환 헤테로사이클"은 별도로 지시되지 않는 한, O, S 및 N 중에서 각각 선택된 하나 내지 4개의 헤테로원자를 포함하고 있는 방향족 및 비방향족 헤테로사이클기이며, 각 헤테로사이클기는 그것의 고리 시스템에 4 내지 10개의 원자를 가지며, 단 상기 기의 고리는 2개의 인접한 O 또는 S 원자를 포함하지 않는다. 비-방향족 헤테로사이클기로는, 그것의 고리 시스템에 단지 원자 4개를 가진 기를 포함하며, 방향족 헤테로사이클기는 그 고리 시스템에 5개 이상의 원자를 가져야 한다. 헤테로사이클기는 벤조-융합된 고리 시스템이다. 4원 헤테로사이클기의 예는 아제티디닐(아제티딘으로부터 유래된)이다. 5원 헤테로사이클기의 예는 티아졸릴이며, 10원 헤테로사이클기의 예는 퀴놀리닐이다. 비-방향족 헤ㅔㅌ로사이클기의 예로는, 피롤리디닐, 테트라하이드로퓨라닐, 디하이드로퓨라닐, 테트라하이드로티에닐, 테트라하이드로피라닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 피페리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 티옥사닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 호모피페리디닐, 옥세파닐, 티에파닐, 옥사제피닐, 디아제피닐, 티아제피닐, 1,2,3,6-테트라하이드로피리디닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 인돌리닐, 2H-피라닐, 4H-피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 피라졸리닐, 디티아닐, 디티올라닐, 디하이드로피라닐, 디하이드로티에닐, 디하이드로퓨라닐, 피라졸리디닐이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 3-아자바이사이클로[3.1.0]헥사닐, 3-아자바이사이클로[4.1.0]헵타닐, 아자바이사이클로[2.2.2]헥사닐, 3H-인돌릴 및 퀴놀리지닐이 있다. 방향적 헤테로사이클기의 예로는, 피리디닐, 이미다졸릴, 피리미디닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 퓨릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조퓨라닐, 시놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피라다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 퓨리닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 퓨라자닐, 벤조퓨라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤조옥사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐 및 퓨로피리디닐이 있다. 또한, 스피로 모이어티는 본 정의 범위에 속하며, 1-옥사-6-아자-스피로[2.5]옥트-6-일을 포함한다. 전술한 기들로부터 유래된 상기 기들은 가능한 C-부착 또는 N-부착될 수 있다. 예로, 피롤로부터 유래된 기는 피롤-1-일(N-부착된) 또는 피롤-3-일(N-부착)될 수 있다. 나아가, 이미다졸로부터 유래된 기는 이미다졸-1-일(N-부착) 또는 이미다졸-3-일(C-부착)될 수 있다.

용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 별도로 지시되지 않는 한, 본 발명의 방법에 사용되는 화합물에 존재될 수 있는, 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 자연적으로 염기성인 화합물은 다양한 무기 및 유기 산과 다양한 염을 형성할 수 있다. 그러한 염기성 화합물의 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염 제조에 이용할 수 있는 산은, 무독성의 산 부가 염, 예컨대 아세테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이카르보네이트, 바이설페이트, 바이타르트레이트, 보레이트, 브로마이드, 칼슘 에데테이트, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 칼라불라네이트, 시트레이트, 디하이드로클로라이드, 에데테이트, 디실리에이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 에틸숙시네이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴아르산닐레이트, 헥실레소르시네이트, 하이드라바민, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 아이오다이드, 이소티오ㅔ이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 말레이트, 말리트(maleate), 만델레이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 뮤케이트, 납실레이트, 니트레이트, 올레이트, 옥살레이트, 파모에이트(엠보네이트), 팔미테이트, 판토테네이트, 포스페이트/디포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 섭아세테이트, 숙시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에티오도드 및 발레레이트 염과 같은, 약제학적으로 허용가능한 음이온을 포함하는 염을 형성하는 것이다. 단일 화합물은 염기성 또는 산성 모이어티 2 이상을 포함할 수 있으므로, 상기 화합물은 단일 화합물내에 모노, 디 또는 트리-염을 포함할 수 있다.

멜라노코르틴 -4- 리셉터

멜라노코르틴(MC) 리셉터는 이차 메신저인 사이클 AMP(cAMP)의 생성을 활성화하는 4 트랜스막-도메인 G 단백질이 커플링된 리셉터 슈퍼패밀리에 속한다. 지금까지 5가지의 MC 리셉터가 분리되어 있다: MC1R, MC2R, MC3R, MC4R 및 MC5R. MC2R은 아드레노코르티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone, ACTH)이다. 인간 MC4R은 332개의 아미노산으로 이루어져 있다.

MC4R은 체중 조절에 관여한다(Graham et al., Nat. Genetics, 17: 273-4;1997). MC4R은 음식 섭취에 영향을 주는, 시상하부를 포함한 뇌에서 발현된다. MC4R 통한 신호 전달은 식욕부진 신경전달 경로를 자극한다. MC4R null 마우스에서는 추기 발병형의 고혈당 및 고인슐린 혈증을 동반한 비만이 발생한다. 하나의 MC4R 대립 유전자(이형접합체)가 없는 마우스는 야생형 및 동형접합성 null 마우스 중간의 체중을 갖는다. 인간의 경우, MC4R 결함은 비만의 가장 흔한 단일유전자로 인한 형태이다(Farooqi et al., New Engl. J. Med., 348:1085-95;2003). 내인성 MC4R 길항제, 아구티-관련 단백질(AgRP)를 과다 발현하는 형질전환 마우스는, 형질전환되지 않은 한배의 새끼(littermate)에 비해 체중 증가, 음식물 섭취 증가 및 신장 증가를 보인다(Ollman et al., Science 278:135-37;1997).

대부분의 비만인 개체에서 발견되는 수많은 돌연변이들이 인간 MC4R 유전자에서 동정되었으며, 그 예로는 프래임시프트(frameshift), 넌센스 및 미스센스 돌연변이가 있다(Nijenhuis et al., J. Biol. Chem., 278:22939-45;2003). 2그룹 이상의 연구 그룹들에서, 비만인의 5%에서 MC4R 유전자 돌연변이가 있는 것으로 확인하였다. 과식증 및 고인슐린 혈증으로 입증되는 MC4R 돌연변이 보유자는, 평균이상의 골밀도를 가지며, BMI에 있어 매치되는 대조군 개체보다 훨씬 빠른 선형 성장을 보인다. Farooqi 등은 또한 돌연변이 MC4R 수용체의 신호전달 특성이 비만의 경중과 관련되어 있다는 것을 밝혔다.

수많은 저자들이 이제 초기 발병형 비만에서 MC4R 유전학에 대한 최근 진척 내용을 논의하고 있다(Farooqi IS, O'Rahilly S, Int J Obes(Lond), 29(10):1149-52;2005, Govaerts, C. Srinivasan S, Shapiro A, Zhang S, Picard F, Clement K, Lubrano-Berthelier C, Vaisse C, Peptides, 2005 Oct, 26(10): 1909-19, Tao YX, Mol. Cell. Endocrinol., 2005 Jul 15, 239(1-2):114, Farooqi IS & O'Rahilly S, Annu. Rev. Med., 56:443-58;2005). 예를 들면, 초기 발병형의 중증 비만 환자의 경우, MC4R 돌연변이 유전의 상염색체 우성 모드가, 리셉터 이량화에 의해 초래된 우성-네거티브 효과 때문이라는 것이 밝혀졌다(Biebermann, H, Krude H, Elsner A, Chubanov V, Gudermann T, Gruters A, Diabetes, 52(12):2984-8;2003).

지금까지 동정된 돌연변이 대부분은 비-보존적인 아미노산 치환이기 때문에, 일부 돌연변이가 있는 MC4R에 대해 기능 상실이 예상된다. 이는 비만 개체에서 발견되는 여러가지 MC4R에서 입증되었다. 아울러, 수많은 돌연변이들은 세포 표면에서의 MC4R의 발현 감소와 관련되어 있다(Gu et al., Diabetes, 48:635-39;1999, Nijenhuis et al., supra). 예로, 비만 개체에서만 발견되며 MC4R의 N-말단부의 외부에 위치된(리간드 결합에는 관여하지 않음), 11가지의 MC4R 미스센스 돌연변이를 스크리닝함에 있어, 10가지에서 표지된 α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH)의 리간드 ¹²⁵I-[Nle⁴,D-Phe⁷]α-MSH에 대한 특이적인 세포 표면 결합이, 야생형 MC4R에 비해 낮았다(Nijenhuis et al., supra, at 22941). 돌연변이들에서 리간드에 대한 친화성은 하기 표 1(IC₅₀은 nM, +/- S.E.)에 개시된 바와 같이 야생형 리셉터와 거의 유사하기 때문에, 특이적인 결합 감소는 세포 표면 발현 감소를 반영하는 것으로 결정된다.

표 1:

Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 22939-22945, at 22941

높은 결합 친화성(L250Q 및 T112M)을 가진 2개의 돌연변이에서도 포화 결합 실험에서 세포 표면 발현이 낮은 것으로 입증되었다. 아울러, 돌연변이들 모두 α-MSH 결합시, 최대 반응(아데닐릴 사이클레이즈 분석을 이용하여 측정한 리셉터 활성화) 감소를 나타내었다. 특히, Nijenhuis 등은 P78L, R165Q 및 R165W 돌연변이들이 발현되어 세포내에 유지된다는 것을, 면역조직화학적 결과를 토대로 도출하였다.

다른 연구로 하기 MC4R 돌연변이를 동정하였다: I125K; C271Y; T11A (A434G); A175T; I316L; N97D; N62S; 및 C271R (Farooqi et al., New Eng. J. Med., 348:1085-95;2003). 이들 변이체들은, cAMP에 반응적인 루시퍼레이즈 리포터 유전자 분석을 이용한 시험관내 평가에서, 모두 활성 감소 또는 무활성을 보였다. 그러나, 이들 그룹에서, 3개의 변이체, V103I; I251L; 및 T112M은 MC4R 시그널링에 효과가 없는 것으로 확인되었다. 유아기, 즉 조기 발병형 비만과 관련있는 돌연변이는, 리간드 결합 감소(S58C, N62S, Y157S, C271Y) 또는 무결합(P78L, G98R)을 초래하는, S58C, N62S, Y157S, C271Y, P78L, G98R이며, 또한, 이들은 [Nle⁴,D-Phe⁷]α-MSH-자극성 cAMP 생성에 비례적인 손상을 보였다(Tao et al., Endocrinology, 144(10):4544-51;2003).

마지막 연구에서 MC4R에서 하기 돌연변이들이 동정되었다: I251L(AI144C); F51L(T544C); M200V(A991G); T5T(C408T)(Branson et al., New Eng J. Med., 348:1096-1103;2003).

비만이 외에도, MC4R은 과도한 음식 섭취와 관련있다. 진단 및 통계적 정신 질환 분석에 따르면(DSM-IV-TR™, Foruth Ed.), 폭식은 비정상적인 과량의 식품 섭취의 반복과 행동 조절 결핍감 경험을 포함한다. 백인 비만인 469명을 조사한 연구에서, 비만인 소수만 폭식으로 진단되었으며, MC4R 돌연변이가 있는 비만인은 모두 폭식으로 진단되었다(Branson et aI., supra).

MC4R 구조와 리간드 결합

내인성 멜라노코르틴 작용제는, 멜라노코르틴 리셉터 분자 인지 및 자극에 중요한, 서열 His-Phe-Arg-Trp를 포함한다. MC4R 리간드 결합의 분자 결정기가, 대규모의 리간드 어레이를 사용함으로써 한 연구에서 결정되었다(Nickolls et al., Pharmacol. Exp. Ther., 304(3):1217-27;2003). 리셉터의 분자 모델링을 사용하여, 리간드 상호작용의 잠재적 부위로서 트랜스멤브레인(TM) 도메인 7(TM7)에서 Phe284를 동정하였다. Phe284의 알라닌으로의 돌연변이는 결함 친화성을 감소시키고, L-Phe를 포함하는 펩티드의 효능을 70배까지 감소시켰지만, D-Phe를 포함하는 선형 펩티드의 결합에는 영향을 미치지 않았다. 이 결과는, α-MSH의 Phe7와 Phe284 간의 소수성 상호작용과 부합된다. 두 번째로, TM3에서의 자연적으로 이루어진 돌연변이의 효과를, 비만과 관련하여 조사하였다. 이러한 돌연변이는 친화성, 및 사이클형의 더이상 유연한 펩티드가 아닌 고정된 펩티드의 효과를 감소시켰으며, 이는 리셉터의 3차 구조에 대한 간접적인 돌연변이 효과와 일치된다. MC3R 보다 MC4R에 대한 리간드 선택성을 뒷받침하는 잔기를 또한 결정하였다. MC3R의 해당 잔기(페닐알라닌)에 MC4R의 Ile125(TM3) 돌연변이는 MC4R-선택 리가드의 친화성 및 효과를 선택적으로 감소시켰다. 이러한 효과는 상호 MC3R 돌연변이 F157I에 의해 반영된다. 이 효과는 이 위치가 가장 중요한 것은 아니라는 것을 나타낸다. 그러나, 이소루신/페닐알라닌 돌연변이는 리간드 결합 친화성의 주된 결정자로서 동정된 Asp122 배치에 영향을 미칠 수 있는 것으로 제시되었다.

그외로, Tyr268이 내인성 MC4R 길항제인 Agouti 단백질과의 선택적 상호작용 뿐만 아니라 다른 MC4R 작용제의 선택성에 필요한 것으로 결정되었다(Oosterom et aI., J. Biol. Chem. 2001;276(2):931-6). Agouti 단백질은 정상적으로는 필부에서 발현되며, 천연의 MC4R 길항제이다(Kiefer et al., Biochemistly, 36:2084-2090;1997).

MC4R 작용제 및 길항제

본 발명에서, MC4R 작용제 및 길항제는 도 1-8 및 10에 언급된 화합물을 포함하며, 하기 실시예 3 및 4에서 추가적으로 설명된다.

천연의 MC4R 작용제(리간드)로는 α-MSH, ACTH, β-MSH 및 γ-MSH(최상의 친화성 내지 최하의 친화성의)가 있다. 지금까지 개시된 작용제 및 길항제를 포함한 그외 MC4R 리간드는 거의 펩티드(미국 특허 6,060,589) 및 사이클형 펩티드 유사체(미국 특허 6,613,874, Mazur et al.)이다. MC4R 펩티드 작용제 시리즈도 제작되었다(Sun et al., Bioorg. Med. Chem. 12(10):2671-7;2004). 아울러, Nijenhuis 등은(Peptides, 24(2):271-80;2003) MC4R에 선택적인 멜라노코르틴 길항제 화합물의 개발 및 평가에 대해 개시하였다. Ac-Nle-Gly-Lys-D-Phe-Arg- Trp-Gly-NH(2)(서열번호 9)로 표시되는 화합물이 가장 선택적인 MC4R 화합물인 것으로 확인되었으며, MC3R 및 MC5R 각각에 비해 MC4R에 대한 선택성은 90배 및 110배이다. 후속적으로 변형시킨 화합물, Ac-Nle-Gly-Lys-D-Nal(2)-Arg-Trp-Gly-NH(2)(서열번호 10)은, 선택적인 MC4R 길항제이며, 34배의 MC4R/MC3R 및 109배의 MC4R/MC5R 선택성을 갖는다. 2종의 화합물은 생체내에서 활성형이며, 혈액-뇌 경계를 통과한다. 게다가, 미국 특허 제 6,054,556호와 제 5,731,408호에는 사이클 구조의 락탐 헵타펩티드인, MC4R 작용제 및 길항제 패밀리가 개시되어 있다.

그외 고친화성의 MC4R 길항제가 Grieco 등(J. Med. Chem., 24:5287-94;2002)에 개시되어 있다. 이들 사이클형 길항제는 공지된 고친화성 길항제인 SHU9119(Ac-Nle4-[Asp5-His6-DNal(2')7-Arg8-Trp9-Lys10]-NH(2))(서열번호 11)을 토대로 제작되었다. SHU9119 유사체는 비-통례적인 아미노산으로 6번 위치(His)가 변형되어 있다. 위치 6번에 Che 치환을 포함하고 있는 화합물은, MC3R 대비 100배의 선택성을 가진 고친화성의 MC4R 길항제(IC₅₀ = 0.48 nM)이다. 6번 위치에서 또한 Cpe 치환을 가지는 다른 화합물은 MC3R 대비 200배의 선택성을 지닌 고친화성 MC4R 길항제(IC₅₀ = 0.51 nM)이다. 분자 모델링을 사용하여, 6번 위치가 구조적으로 제한적인 아미노산으로 변형된, 사이클 펩티드의 구조 특성을 조사하였다. Grieco et al., Peptides 2006; 27(2):472-81을 참조한다.

Dyck 등의 미국 특허 공개공보 제 2003/0158209호 및 Briner 등의 미국 특허 공개공보 제 2004/082590호에, 수종의 비펩티드성 MC4R 리간드가 개시되어 있다. 또한, Renhowe 등의 미국 특허 제 6,638,927호에는, 특이적인 MC4R 작용제로서 저분자량의 소형 구아니도벤즈아미드가 개시되어 있다. Richardson 등은 MC4R 작용제인 신규한 아릴피페리진을 개시하였다(J. Med. Chem., 47(3):744-55;2004). Yu 등의 미국 특허 제 6,979,691호 및 Maguire의 미국 특허 제 6,699,873호에는, MC4R에 선택적으로 결합하는 비-펩티드성 화합물이 개시되어 있다.

Basu 등의 WO 99/55679에는, 이소퀴놀린유도체(isoquinoline derivatives)인 저분자 비-펩티드성 화합물이 개시되어 있으며, 이는 MC1R 및 MC4R에 대한 저(μmol) 친화성, 아라키돈산에 의해 유도된 진피 염증 감소 및 체중과 식품 섭취 감소를 보인다.

Nargund 등의 WO 99/64002에는, 스피로피페리딘 유도체(spiropiperidine derivatives)를 멜라노코르틴 리셉터 작용제로서 개시하고 있으며, 이는 비만, 당뇨병 및 성 기능 장애와 같은 질병 및 질환 치료에 유용하다.

그외의 비-펩티드성 MC4R 길항제가 개시되었다. Eisinger의 미국 특허 공개공보 제 2003/0176425호와 제 2003/0162819호에는, MC4R 길항제 또는 작용제로서 각각 신규한 1,2,4- 티아디아졸(1,2,4-thiadiazole) 및 1,2,4-티아디아졸륨(1,2,4-thiadiazolium) 유도체가 개시되어 있다. 또한, 이 출원들은 이들 화합물의 비만 치료 용도를 개시하고 있다.

수종의 멜라노코르틴 수용체 길항제가 경쟁적인 길항제, 즉 리가드와 결합에 대해 경쟁하는 것으로 확인되었다. 예로, 멜라노코르틴 길항제인 agouti 시그널링 단백질(ASIP)는, hMC1R에서 관찰되는 경쟁적인 길항력과 다른 수용체에서 관찰되는 보다 복잡한 행태와 부합되는 특징을 가지는 것으로 입증되었다(Yang et al., Mol. Endocrinology, 11(3):274-280;1997). 유사하게, MC2R에 대한 천연 리간드인 ACTH는 α-, β-, 또는 γ-MSH(Abdel-Malek et al., Cell. Mol. Life Sci., 48:434-41;2001)에 의한 결합에 경쟁할 수 없다.

그외 MC4R 결합성 화합물로는 다음이 있다: Bednarek 및 Fong의 Exp. Opn. Ther. Patents 14:327-36(2004); Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 15(18):4023-8(2005); WO 03/07949 (Merck); WO 03/61660 (Eli Lilly); WO 03/09847 (Amgen); WO 03/09850 (Amgen); WO 03/31410 (Neurocrine Biosciences); WO 03/94918 (Neurocrine Biosciences); WO 03/68738 (Neurocrine Biosciences); WO 03/92690 (Procter and Gamble); WO 03/93234 (Procter and Gamble); WO 03/72056 (Chiron); WO 03/66597 (Chiron); WO 03/66587 (Chiron); WO 03/66587 (Chiron); WO 02/67869 (Merck); WO 02/68387(Merck); WO 02/00259 (Taisho); WO 02/92566 (Taisho); Tran et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006 [epub ahead of print]; Pontillo et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15(23):5237-40(2005); Pontillo et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 15(10):2541-6(2005); Pontillo et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 14(22):5605-9(2004); Cheung et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 15(24):5504-8(2005); Yan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15(20): 4611-4(2004); Hsiung et al., Endocrinology, 146(12):5257-66(2005); 및 Todorovic et al., Peptides, 26(l0):2026-36(2005).

본원의 청구하고 있는 방법으로 사용가능한 특이적인 MC4R 비펩티드성 작용제 또는 길항제가, Sebhat et al., J. Med. Chem. 45:4589(2002)(화합물 1과 6); Richardson et al., J. Med. Chem., 47: 744(2004)(화합물 2); Arasasingham et al., J. Med. Chem., 46: 9(2003)(화합물 3); Millennium Pharmaceuticals의 WO 02/062766(화합물 4); Pedemonte et al., J. Clin. Inves., 115: 2564-71(2005)(화합물 5); Tran et al., Bioorg, Med, Chem. Lett., 15: 3434-38 (2005)(화합물 7); Xi et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004; 14: 377-81(화합물 8); Vos et al., J. Med. Chem., 47: 1602-04(2004)(화합물 9); Pan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 11: 185(2003)(화합물 10); Marsilje et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 14: 3721(2004)(화합물 11); Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 133: 4431(2003)(화합물 12); Nickolls et al., J. Pharmacol. Exp. Therap., 313: 1281-1288(2005)(화합물 13-17); Schioth et al., Biophys. Biochem. Res. Comm., 399-405(2003)(화합물 18); Benoit et al., et aI., J Neurosci. 2000; 20: 3442-48 화합물 19, 20); Vos et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15: 2302(2006)(화합물 21); Tucci et al., Bioorg Med Chem Lett 15: 4389(2005)(화합물 22); Pontillo et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15: 4615-18(2005)(화합물 23); Chaki et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 304: 818 (2003)(화합물 24); Chaki et al., Pharmacol. Biochem. Behav., 2005; 82: 621(화합물 25)에 개시되어 있다.

상기 화합물 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 13-17 및 19는 MC4R 작용제이며, 화합물 3, 4, 7, 9, 11, 18 및 20은 길항제이다.

현재 청구된 방법들에서 사용가능한 특이적인 MC4R 펩티드 길항제로는, Ac-Cys-Glu-His-D-(2')Nal-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH(2)(서열번호 12); Ac-Cys-Nle-Arg-His-D-(2')Nal-Arg-Trp-Gly(서열번호 13); Ac-Cys-Glu-His-D-Phe (3,4-di-CI)-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH(2)(서열번호 14), Ac-Nle-c[Asp-Che-DNal(2')-Arg-Trp-Lys-NH(2)(서열번호 15); Ac-Nle-c[Asp-Cpe-DNal(2')-Arg-Trp-Lys-NH(2)(서열번호 16); cyclo(1-6)-suc-His-DPhe-Arg-Trp-Lys-NH(2)(서열번호 17); 및 Ac-DArg[Cys-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Cys]-NH(2)(서열번호 18)가 있다.

비천연 측쇄가 있는 펩타드계 작용제 및 길항제와, 펩티드 모방체를 포함한다. 예로, 미국 특허 5,650,489, 미국 특허 6,090,9120 특히 섹션 5.5를 참조한다. 예컨대, 화합물 18-20의 측쇄 및 도 16에 개시된 화합물 클래스의 측쇄는 비천연적으로 형성될 수 있다.

MC4R은 리간드 매개성 리셉터 내재화를 겪는 것으로 입증되었다(Gao et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 307(3):870-7;2003). 내인성 MC4R를 발현하는 GT1-7 세포를 작용제 알파-메라노사이트-자극 호르몬(α-MSH)에 미리 노출하면, 이차 α-MSH 기회에 cAMP 형성 손상을 발생시킨다(Shinyama et al., Endocrinology, 144(4):1301-14;2003). 이러한 현상은 길항제 투여시에는 볼 수 없었다. 리간드-유발성 내재화는 C-말단 세그먼트와 3번째 세포내 루프 사이의 세린 또는 트레오닌 잔기의 인산화에 의해, G-단백질 커플링된 리셉터에서 촉발된다. 인산화는 리소좀에 의한 내재화 및 분해를 위해 리셉터를 표적으로 하는, 베타-어레스틴의 결합을 촉진시킨다. 최근 결과는, 어트랙션-유사 단백질(attractin-like protein: ALP)의 세포질 말단은 MC4R의 C-말단부에 결합하는 것으로 나타났다(Yeo et al., Biochem. J., 376;2003). 따라서, 세포 표면에서의 MC4R 안정성을 증가시키는 샤폐론은 표면에서의 리셉터의 짧은 반감기에 긍정적인 영향을 줄 수 있다.

ER에서 MC4R 폴리펩티드에 가역적으로 결합하는 작용제인 샤페론은 리셉터 내재화를 유도하진 않을 것으로 또한 예상된다. 이와 유사하게, 샤페론 화합물이 길항제인 경우, 이는 리셉터가 세포 표면에 위치하면 리셉터 활성을 저해하지 못할 것으로 예상된다.

치료 방법

또한, 본 발명은 MC4R 안정성 및/또는 활성을 증진시키기 위해, 치료가 필요한 개체에서 샤페론을 투여함에 의한, 비만과 같은 MC4R 안정성 감소과 관련있는 증상 또는 비만으로 발병될 위험 인자를 가진 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 치료될 개체는 MC4R 접힘 및 프로세싱에 작용하는 MC4R 돌연변이를 보이진 않지만, 예컨대 신경에서의 MC4R 안정성 증가가 유익한 개체일 수 있다. 치료될 개체는 MC4R 단백질의 접힘 또는 프로세싱에 작용하는 MC4R 돌연변이를 가질 수 있으며, 신경에서의 MC4R 안정성 감소를 보인다.

제형, 투여량 및 투여

MC4R에 대한 특이적인 약리학적 샤페론, 즉 MC4R 작용제 또는 길항제나 상기나 또는 전술한 바와 같이 본 발명의 스크리닝 방법을 통해 동정되는 바와 같은 그외 MC4R 결합성 화합물이, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 약학 조성물로 제형화되는 것이 유익하다. 샤페론은 MC4R 세포 표면 발현 감소 또는 세포 표면으로의 수송 감소가 관여하는 비만 또는 그외 질환의 치료에 있어, 활성 성분 또는 치료제로서 명시될 수 있다.

활성 성분(약리학적 샤페론)의 농도는 후술한 바와 같이 원하는 투여량 및 투여 요법에 따라 결정된다. 활성 성분의 투여 범위의 예는, 1일 당 약 0.01 mg/kg 내지 약 250 mg/kg(체중); 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg 내지 약 75 mg/kg이다.

치료에 유효한 화합물은 표준 제형으로 개체에 제공할 수 있으며, 부형제, 윤활제, 희석제, 향료, 착색제, 완충제 및 붕해제와 같은 약제학적으로 허용가능한 임의 첨가제를 포함할 수 있다. 표준 제형은 당업계에 잘 알려져 있다. 예로, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, Mack Publishing Company, 2000을 참조한다. 제형은 샤페론이 혈액-뇌 경계를 통과할 수 있게 허용하는 임의 경로에 의한 투여에 있어 사용가능한 투약 단위로 제조될 수 있다. 경로의 예로는, 경구, 비경구, 경점막, 비강내, 흡입 또는 경피 경로를 포함한다. 비경구 경로로는, 정맥내, 동맥내, 근육내, 진피내, 피하, 복막내, 실내, 강내 및 두개내를 포함한다.

일 예로, MC4R 약리학적 샤페론, 특히 도 1-8 및 10에 개시된 샤페론은 구형의 경루 투약 형태로 제형화된다. 경구 투여를 위해, 약학 조성물은 예컨대 소형 분자로, 결합제(예, 미리 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스), 충진제(예, 락토스, 미세결정 셀룰로스 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트); 윤활제(예, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카), 붕해제(예, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트), 또는 습윤제(예, 소듐 라우릴 설페이트)와 같이 약제학적으로 허용가능한 부형제를 이용하여 통상적인 방법에 의해 제조된 정제 또는 캡슐제 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 잘 알려져 있는 방법으로 코딩할 수 있다. 경구 투여용 액체 조제물은 예컨대, 용액, 시럽 또는 현탁액 형태를 취할 수 있으며, 또는 이는 사용하기 전에 물 또는 그외 적정 비히클로 구성하기 위한 건조 산물로서 존재할 수 있다. 이러한 액체 조제물은 현탁화제(예, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가된 식용 지방), 유화제(예, 렉시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분별화된 식물성 오일), 및 보존제(예, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)과 같은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 이용하여 통상적인 방법에 의해 제조할 수도 있다. 또한, 조제물은 완충제 염, 향료, 색소 및 감미제를 적절히 포함할 수 있다.

다른 예로, MC4R 샤페론은 비경구 투여용으로 제형화된다. 샤페론은 주사에 의해, 예컨대 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투약 형태, 예컨대 앰플 또는 다중-투여량 컨테이너에 첨가된 보존제와 함께 존재될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중에 현탁제, 용액 또는 에멀젼으로서 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형 제제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용전 적합한 비히클, 예컨대 멸균 발열원이 없는 물로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.

전술한 제형 이외에도, 샤페론은 또한 데포트(depot) 조제물로서 제형화될 수 있다. 이러한 장기간 작용하는 제형은 이식(예, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예컨대 화합물은 적정 폴리머 또는 소수성 물질(예, 허용가능한 오일중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지으로, 또는 난용성 유도체, 예컨대 난용성 염으로서, 제형화될 수 있다.

다른 예로, 샤페론은 비히클, 특히 리포좀 형태로 전달될 수 있다.

다른 예로, 샤페론은 방출 조절된 방식으로 전달될 수 있다. 예컨대, 치료제는 폴리-락트/글루탐산(PLGA)과 같은 폴리머 매트릭스 중에, 콜레스테롤과 활성 성분의 혼합물(SilasticR™; Dow Corning, Midland, MI; 미국 특허 제5,554,601호)을 함유하는 펠렛으로, 연속 펌프를 이용한 정맥내 주입을 이용하여, 피하 이식 또는 경피 패치에 의해 투여될 수 있다.

조합 요법. 또한, 약학 조성물은 후보 화합물과 함께 다른 생물학적 활성 물질을 포함할 수 있다. 그 예로는 시부트라민(sibutramine), 오르리스타트(orlistat)(Xenical^®), 렙틴, 뉴로펩티드 Y, 콜레사이스토키닌(cholecystokinin) 또는 GLP-1이 있으나, 이로 한정되지 않는다.

MC4R 약리학적 샤페론의 스크리닝 분석

본 발명은 MC4R 폴리펩티드의 안정성, 활성 및/또는 세포 표면으로의 위치화를 조절하는 샤페론 화합물 후보 물질을 동정하기 위한 방법을 제공한다. 일 예로, 본 발명은 표지 또는 비표지된 테스트 화합물을 MC4R 단백질 또는 그 단편과 접촉시키는 단계, 및 MC4R 단백질 또는 그 단편에 결합된 테스트 화합물의 양을 측정하는 단계를 포함하는, MC4R 단백질에 대한 샤페론을 동정하는 방법을 제공한다. 이는, 예컨대 하기와 같이 이룰 수 있다:

(a) 세포가 테스트 화합물과의 접촉에 반응하도록 충분한 기간동안 제1 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 단계;

(b) (a) 단계에서 접촉시킨 세포(또는 세포 표면)에서 MC4R 폴리펩티드(또는 리간드 결합 도메인을 포함하는 그 단편)의 구조 안정성, 호라성 및/또는 세포 표면 위치화를 결정하는 단계; 및

(c) (b) 단계에서 결정된 MC4R 폴리펩티드의 안정성, 활성 및/또는 세포 표면 위치화를 테스트 화합물과 접촉시키지 않은 대조군 세포에서의 MC4R 폴리펩티드와 비교하는 단계,

상기에서, 테스트 화합물과 접촉시키지 않은 대조군 세포에서의 MC4R 폴리펩티드의 안정성 수준과 비교하여, 테스트 화합물과 접촉에 대한 반응으로 제1 세포에서 MC4R 폴리펩티드의 안정성, 활성 및/또는 세포 표면 위치화에 대한 변화 검출은, 상기 테스트 화합물이 MC4R 폴리펩티드의 안정성을 조절하며 MC4R 안정성 또는 활성 감소와 관련있는 질병 치료용 후보 화합물임을 나타낸다.

세포는 비-내인성 야생형 MC4R, 돌연변이 MC4R, 또는 돌연변이 및 야생형 MC4R을 포함하여 내인적으로 MC4R을 발현하는 세포가 형질전환된 숙주 세포일 수 있다. 이러한 세포는 전술한 MacKenzie et al., Current Medicinal Chemistry - Immunology, Endocrine & Metabolic Agents, 4:113-117(2004)에 기술되어 있는 MC4R을 내인적으로 발현하는 GT1-7 세포와 같은 "비만 신경", 또는 Blondet et al., J. Biochem., 135:541-546;2004와 아래 실시예에 기술되어 있는 HER293 세포와 같은 정상 또는 돌연변이된 테깅된 MC4R을 발현하는 형질전환된 세포를 포함한다.

다른 예로, 본 발명은 표지된 테스트 화합물을 MC4R 단백질을 포함하는 세포 또는 세포 막 분획과 접촉시키는 단계, 및 상기 세포 또는 세포 막 분획에 결합된 상기 표지된 테스트 화합물의 양을 측정하는 단계를 포함하는, MC4R 단백질에 대한 샤페론을 동정하는 방법을 제공한다.

수많은 고성능 스크리닝(HTS) 방법을 이용하여 MC4R에 결합하는 테스트 화합물 다수(예, 수백, 수천 또는 수만개)를 한번에 스크리닝할 수 있다. 테스트 화합물은 소형 유기 또는 무기 분자(바람직함), 펩티드 또는 폴리펩티드(항체, 항체 단편 또는 그외 면역특이적 분자 포함), 올리고뉴클레오티드 분자(예, 아프타머), 폴리뉴클레오티드 분자 또는 키메라, 또는 그것의 유도체일 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. MC4R 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 후보 샤페론인 테스트 화합물은 세포를 이용한 분석 및/또는 세포 결핍성 분석으로 동정할 수 있다. 최근에 개방된 여러가지 자동 분석 방법은 단기간내에 수만개의 화합물을 스클리닝할 수 있다(미국 특허 제5,585,277호, 제5,679,582호 및 제6,020,141호). 예를 들면, 비펩티드성 G-단백질 커플링된 리셉터 편향 라이브러리의 반복적인 직접 스크리닝을 통해 하나의 아릴피페라진 MC4R 작용제를 동정한 것으로, 한 그룹에서 보고하였다(Richardson et al., J. Med. Chem., 47(3):744-55;2004). 이러한 HTS 방법은 특히 마이크로어레이로 이용가능하다.

스크리닝에서, 동정될 수 있는 정제된 화합물 클래스로는 소형 분자(즉, 분자량이 약 2 kD 미만, 더 바람직하기로는 1 kD 미만인 유기 또는 무기 분자)가 있으나, 이로 한정되지 않는다. 이들은 화합물 라이브러리의 구성 성분들이다.

본원에서, 용어 "선도 화합물(lead compound)"이란 MC4R 야생형 또는 돌연변이 단백질의 단백질 구조 안정화에 유효할 수 있는, 또는 추가적인 개발에 따라 변형되어 적절한 약학 화합물을 만들 수 있는, MC4R 길항제 또는 작용제의 일차 스크리닝으로부터 선택된 분자 물질이다.

화합물 라이브러리. 문서에 의해 충분히 입증된 약리학적 활성을 가진 고순도의 소형 유기 리간드 및 펩티드 작용제의 라이브러리를 시그마 알드리치사(LOPAC LIBRARY^TM and LIGAND-SETS^TM)로부터 구입가능하다. 또한, 식물 추출물 및 미생물 배양물 추출물을 포함하여 100,000 이상의 소형 화합물로 구성된 라이브러리인, Aldrich Library of Rare Chemicals을 시그마 알드리치사로부터 구입가능하다. 그외 이용가능한 화합물 라이브러리로는 Tripos(LeadQuest^®) 및 TimTech(카이네이즈 모듈레이터에 대해 표적화된 라이브러리 포함)이 있다.

본 발명에 따라 스크리닝하기에 적합한 타입의 화합물 라이브러리를 제공하거나 또는 제공한 그외 회사로는, 하기를 포함한다: 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc.; Advanced ChemTech; Abinitio PharmaSciences; Albany Molecular; Aramed Inc.; Annovis, Inc. (formerly Bearsden Bio, Inc.); ASINEX; AVANT Immunotherapeutics; AXYS Pharmaceuticals; Bachem; Bentley Pharmaceuticals; Bicoll Group; Biofor Inc.; BioProspect Australia Limited; Biosepra Inc.; Cadus Pharmaceutical Corp.; Cambridge Research Biochemicals; Cetek Corporation; Charybdis Technologies, Inc.; ChemBridge Corporation; ChemDiv, Inc.; ChemGenics Pharmaceuticals Inc.; ChemOvation Ltd.; ChemStar, Ltd.; Chrysalon; ComGenex, Inc.; Compugen Inc.; Cytokinetics; Dextra Laboratories Ltd.; Discovery Partners International Inc.; Discovery Technologies Ltd.; Diversa Corporation; Dovetail Technologies, Inc.; Drug Discovery Ltd.; ECM Pharma; Galilaeus Oy; Janssen Pharmaceutica; Jerini Bio Tools; J-Star Research; KOSAN Biosciences, Inc.; KP Pharmaceutical Technology, Inc.; Lexicon Genetics Inc.; Libris Discovery; MicroBotanica, Inc.; MicroChemistry Ltd.; MicroSource Discovery Systems, Inc.; Midwest Bio-tech Inc.; Molecular Design & Discovery; MorphoSys AG; Nanosyn, Inc.; Ontogen Corporation; Organix, Inc.; Pharmacopeia, Inc.; Pherin Pharmaceuticals; Phytera, Inc.; PTRL East, Inc.; REPLICor Inc.; RSP Amino Acid Analogues, Inc.; Sanofi-Synthelab (now Sanofi-Aventis) Pharmaceuticals; Sequitur, Inc.; Signature BioScience Inc.; Spectrum Info Ltd.; Talon Cheminformatics Inc.; Telik, Inc.; Tera Biotechnology Corporation; Tocris Cookson; Torrey Pines Institute for Molecular Studies; Trega Biosciences, Inc.; 및 WorldMolecules/MMD.

또한, 하버드 메디컬 스쿨의 Institute of Chemistry and Cell Biology(ICCB)에서는 스크리닝을 위한 천연 산물 라이브러리를 포함하여, 다음의 화합물 라이브러리를 제공한다: Chem Bridge DiverSet E (16,320 화합물); Bionet 1 (4,800 화합물); CEREP (4,800 화합물); Maybridge 1 (8,800 화합물); Maybridge 2 (704 화합물); Peakdale 1 (2,816 화합물); Peakdale 2 (352 화합물); ChemDiv Combilab and International (28,864 화합물); Mixed Commercial Plate 1 (352 화합물); Mixed Commercial Plate 2 (320 화합물); Mixed Commercial Plate 3 (251 화합물); Mixed Commercial Plate 4 (331 화합물); ChemBridge Microformat (50,000 화합물); Commercial Diversity Set 1 (5,056 화합물); NCI Collection: Structural Diversity Set, version 2 (1,900 화합물); Mechanistic Diversity Set (879 화합물); Open Collection 1 (90,000 화합물); Open Collection 2 (10,240 화합물); Known Bioactives Collection: NlNDS Custom Collection (1,040 화합물); ICCB Bioactives 1 (489 화합물); SpecPlus Collection (960 화합물); ICCB Discretes Collections. 하버드의 ICCB와 협력기관에서 화학자들이 개별적으로 수집한 ICCB 화합물은 다음과 같다: ICCB1 (190 화합물); ICCB2 (352 화합물); ICCB3 (352 화합물); ICCB4 (352 화합물). 천연 추출물: NCI Marine Extracts (352 wells); Organic fractions - NCI Plant and Fungal Extracts (1,408 wells); Philippines Plant Extracts 1 (200 wells); ICCB-ICG Diversity Oriented Synthesis (DOS) Collections; DDS 1 (DOS Diversity Set) (9600 wells).

대규모의 다양한 라이브러리 보다는 한층 집중된 화합물 라이브러르를 제조하기 위해 이용가능한 기법이 다수 있다. Chemical computing group, Inc.( Montreal)에서는 고성능 약물 디자인을 위한 새로운 접근법을 가진 소프트웨어를 개발하였다. 이 회사의 방법은 고성능 스크리닝(HTS) 실험 데이타를 이용하여 가능성이 있는 QSAR(Quantitative Structure Activity Relationship)을 만든 다음, 이를 이용하여 실제 조합 라이브러리에서 빌딩 블록을 선별하는 것이다. 이는 표준 회귀 분석이 아닌 통계 추정을 근간으로 한다.

아울러, ArQule, Inc(Woburn, MA)에서는 화합물의 고성능 자동 생산을 수행하고, 이들 공지된 구조 및 고순도의 화합물을 선도적인 최적화를 위한 충분한 양으로 전달하기 위한, 일체형 기법을 개발하였다. 이들 AMAP^TM(Automated Molecular Assembly Plant)은 화합물 발견의 각 단계에서 화합물의 고성능 합성을 수행한다.

유사하게, 화합물은 종종 화합물의 선택적인 "선별(cherry picking)"을 위해, 온라인 데이타베이즈 또는 CD-ROM으로 제공된다. 예로, AblInitio PharmaSciences; ActiMol; Aral Biosynthetics; ASDI Biosciences; Biotechnology Corporation of America; Chembridge; ChemDiv; Florida Center - Heterocyclic Compounds; Microsource /MSDI; NorthStar; Peakdale; Texas Retaining Group; Zelinsky Institute; Advanced ChemTech; Ambinter; AnalytiCon Discovery; Aurora Fine Chemicals; Biofocus; Bionet /Key; Comgenex; Key Organics; LaboTest; Polyphor; SPECS and Biospecs; 및 Bharavi Laboratories를 참조한다.

마이크로어레이

일 예로, MC4R 샤폐론의 HTS 스크리닝은 마이크로어레이를 사용한다.

단백질 어레이. 단백질 어레이는 예컨대 유리, 멤브레인, 마이크로타이터 웰, 질량 스펙트로미터 플레이트 및 비드 또는 다른 입자로부터 선택되는 다양한 표면상에서의, 고정된 단백질을 이용하는 고상 결합 분석 시스템이다. 이 어레이를 이용한 결합 분석은 매우 평행하며 흔히 소형화된다. 이것의 장점은 신속하게 자동화할 수 있으며 고감도이며, 시약 사용이 경제적이고 단일 실험으로부터 상당한 자료를 제공한다는 것이다.

자동화된 멀티-웰 형태가 가장 잘 개발된 HTS 시스템이다. 자동화된 96- 또는 384-웰 플레이트를 이용한 스크리닝 시스템이 가장 많이 사용된다. 플레이트를 이용한 스크리닝 시스템의 현재 경향은 반응 웰의 용적을 감소시키고 플레이트 당 웰의 밀도를 증가(플레이트당 96 웰 -> 384 웰 -> 1536웰)시키는 것이다. 이러한 경향은, 처리 성능 증가, 스크리닝한 화합물당 바이오시약의 현저한 단가 감소 및 자동화에 의해 관리하여야하는 플레이스 갯수를 감소시킨다. HTS에 사용될 수 있는 단백질 분석에 대한 설명으로, 예로 미국특허 제 6,475,809호; 제 6,406,921호; 제 6,197,599호; 및 국제특허 공개공보 제00/04389호 및 제00/07024호를 참조한다.

어레이 구축시, 야생형 또는 돌연변이형의 MC4R 또는 그 단편의 소스는 재조합 단백질의 세포 발현 시스템, 천연 소스에서의 정제, 세포 결핍성 번역 시스템에 의해 시험관내 생산, 및 MC4R 펩티드 제조를 위한 합성 방법을 포함할 수 있다. 캡쳐 어레이와 단백질 기능 분석시, MC4R 폴리펩티드는 올바르게 접히며 기능적인 경우가 흔하다. 이는, 예컨대, 변성 조건하에서 박테리아로부터 재조합 단백질이 추출되는 경우가 아니며, 다른 방법(천연 단백질의 분리, 세포 결핍성 합성)이 기능성을 일반적으로 유지한다. 그러나, 샤페론은 적절한 구조로 접히지 않는 돌연변이된 단백질에 결합할 것임에 틀림없으므로, 변성 단백질의 어레이는 샤페론 스크리닝에 여전히 사용가능하다.

바람직하게는, 사용되는 고정화 방법은, 고성능 및 자동화할 수 있으며, 일반적으로 샤페론-결합력 보유와 상용가능한, 여러가지 성질의 MC4R 폴리펩티드(야생형, 돌연변이, 전장, 부분 단편, 친수성, 소수성 등))에 적용가능하다. MC4R 단백질 고정화에 공유 또는 비공유 방법 둘다를 사용할 수 있다. 공유 결합을 위한 기질로는, 예컨대 아미노- 또는 알데하이드-함유성 실란 시약으로 코팅된 유리 슬라이드가 있다(Telechem). Versalinx™ system(Prolinx)에서, 가역적인 공유 커플링은 페닐디보론산으로 유도체화된 단백질과 지지체 표면에 고정된 살리실하이드로가믹산 사이의 상호작용에 의해 수행된다. 안정적인 연결을 제공하는 공유 결합 방법을 다양한 단백질에 적용할 수 있다. 비변형된 단백질의 비공유 결합은 3차 구주의 폴리아크릴아미드 젤을 주성분으로 하는 HydroGel™ (PerkinElmer)과 같은 다공성 구조에서 발생한다.

세포 매개 어레이. 세포 매개 어레이는, 세포 배양 기법을, 대상 샘플에서 테스트 화합물에 대한 세포 반응 측정, 배양된 세포에서 원하는 효과를 유도하는 분자를 동정하기 위한 샘플 스크리닝 및 신규한 원하는 특징을 가진 세포 집단의 선별 및 동정하기 위한, 유동성 디바이스의 사용과 조합한다. 고성능 스크리닝(HTS)은 형광 표지된 항체, 생물학적 리간드 또는 후보 샤페론 및/또는 핵산 혼성화 프로브를 이용하여 고정된 세포, 또는 다색 형광 인디케이터 및 바이오센서를 이용하여 살아있는 세포에 대해 수행될 수 있다. 고정된 세포 또는 살아있는 세포의 스크리닝 방법 선택은 필요한 특이적인 세포 매개 분석에 따라 결정된다.

당업계에 공지된 단일- 및 복수-세포 매개 어레이 기법이 다수개 있다. 최근에 개발된 기술, 예컨대 마이크로-패턴화된 어레이(국제특허 WO 97/45730호, WO 98/38490호) 및 마이크로유동성 어레이는 세포 매개 비교 분석에 유용한 툴을 제공한다. 형질감염된 세포 마이크로어레이는 어레이 구성이 규정된 cDNA를 과다 발현하는 세포 클러스터를 포함하는, 상보적인 기법이다. 발현 벡터에서 클로닝된 상보적인 DNA는 현미경 슬라이드상에 찍히며, 지질 형질감염 시약 및 유착성 포유류 세포를 첨가한 후 생명있는 어레이가 된다(Bailey et al., Drug Discov. Today, 7(18):S113-8;2002). 세포 매개 어레이는 예컨대 Beske, Drug Discov. Today, 7(18):S131-5;2002, Sundberg et al., Curr. Opin. Biotechnol., 11: 47-53;2000, Johnston et al., Drug Discov. Today, 7:353-63;2002, 미국특허 제6,406,840 호, 제6,103,479호, 제2002/0197656호에 상세하게 설명되어 있다. 리간드-관문의 이온 채널의 모듈레이터 검색에 특이적으로 사용되는 세포 매개 분석은, Mattheakis et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 1:124-34;2001 및 Baxter et al., J. Biomol. Screen. 7:79-85;2002를 참조한다.

검출가능한 표지. 스크리닝 분석을 이용하여 MC4R 샤페론 후보물질과 같은 분자의 검출시, 기능적 분석을 이용하여 본원에 기재된 비표지 분자를 추적할 수 있다. 대상 분자(예, 소형 분자, 항체 또는 폴리뉴클레오티드 프로브) 또는 이의 라이브러리는 원자(예, 방사핵), 검출가능한 분자(예, 플루오레세인) 또는 물리 또는 화학적 특성으로 인하여 대상 분자의 존재를 나타내는 복합체로 검출가능하게 표지될 수 있다. 또한, 분자는 검출가능한 산물을 만들도록 기질에 작용하는 "리포터" 분자(예, 효소와 같은 바이오분자)가 공유 결합되었을 때 검출가능하게 표지될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 검출가능한 표지물로는, 스펙트로스코피, 광화학적 수단, 생화학적 수단, 면역화학적 수단, 전기적 수단, 광학적 수단 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의 조성물을 포함하다. 본 발명에 이용가능한 표지물로는, 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘 접합체로 염색하기 위한 바이오틴, 자기 비드(Dynabeads™), 형광염료(예, 플루오레세인, 플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC), 텍사스 레드(Texas red), 로다민(rhodamine), 그린 형광단백질(green fluorescent protein), 강화된 그린 형광단백질(enhanced green fluorescent protein), 리사민(lissamine), 피이코에리트린(phycoerythrin), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX(Amersham), SyBR Green I & II(Molechlar Probe, 등), 방사선표지물(³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³²p), 효소(하이드롤레이즈, 알카라인 포스파테이즈, 에스테레이즈, 글라이코시데이즈, 옥시도리덕테이즈, 특히 양고추냉이 퍼옥시데이즈와 같은 퍼옥시데이즈, 등) 기질, 보조인자, 저해제, 생발광기, 발색제 및 콜로이달 골드 또는 유색 유리 또는 플라스틱(폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드와 같은 색도성 표지물이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 이러한 표지물의 이용을 언급하고 있는 특허로는, 미국특허 제3,817,837호; 미국특허 제3,850,752호; 미국특허 제3,939,350호; 미국특허 제3,996,345호; 미국특허 제4,277,437호; 미국특허 제4,275,149호; 그리고 미국특허 제4,366,241호가 있다.

이러한 표지물을 검출하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 방사선 표지물 및 생발광 표지물은 사진 촬영 필름 또는 신틸레이션 카운터를 이용하여 검출가능하며, 형광 마커는 광-검출기를 이용하여 방출된 광(예, 형광-활성화된 세포 분류, FACS)을 검출하여 검출할 수 있으며, 효소적 표지물은 기질을 이용한 효소 제공 및 기질에 대한 효소 작용에 의해 형성되는 예컨대 유색 반응 산물 검출에 의해, 검출될 수 있다.

안정성, 위치화 및 활성 분석

전술한 바와 같이, MC4R의 안정성 강화는 세포성 MC4R 폴리펩티드의 증가 측정에 의해, 세포 표면으로의 이동성 증가 결정에 의해, 예컨대 세포 표면 발현 증가에 의해 결정함으로써, 또는 MC4R 활성 증가 결정에 의해, 결정할 수 있다. 이들 각각에 대한 비제한적인 방법의 예는 하기에 언급되어 있다.

MC4R 의 세포내 안정성 결정. 세포내 MC4R 단백질 수준을 결정하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 방법으로는 웨스턴 블롯팅, 면역침강 및 웨스턴 블롯팅(IP Western), 또는 테깅된 MC4R 단백질을 이용한 면역형광이 있다.

MC4R 이동성 결정. 생합성 경로를 통한 단백질의 이동성 평가는, 예컨대 ³⁵S-표지된 수용체 단백질로의 펄스-체이스 실험을 글리코시다제와 함께 이용하거나, 또는 이동중에 단백질 변형을 결정하기 위한 간접 또는 직접 면역형광에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법과 그외 방법은 Current Protocols in Cell Biology 2001; John Wiley & Sons의 실시예에 기술되어 있다.

단백질의 이동 장애를 검출하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, 골치제에서이 N-및/또는 O-당화된 단백질의 경우, 글리코시데이즈 처리 및 면역침강과 조합하여 사용함으로써, 단백질이 골지에서 완전히 당화되는지, 또는 단백질이 이후 당화를 위해 골지로 이동되지 않고 ER에 체류되는지를 검출할 수 있다.

가시적으로 세포 위치화를 검출하는 민감한 방법으로는, 또한 형광 단백질 또는 형광 항체를 이용한 형광 현미경 방법이 있다. 예로, 대상 MC4R 단백질을 예컨대 그린 형광 단백질(GFP), 시안 형광 단백질, 옐로우 형광 단백질 및 레드 형광 단백질로 테깅한 다음, 다색 및 저속 현미경과 전자 현미경으로, 고정된 세포 및 살아있는 세포에서의 이들 단백질을 운명을 연구할 수 있다. 단백질 이동에 있어 형광 이미지화를 이용하는 것에 대해, Watson et al., Adv Drug Deliv Rev 2005; 57(1):43-61를 참조한다. 세포내 단백질의 공동-위치화에 대해 공초점 현미경을 사용하는 것에 대해서는, Miyashita et al., Methods Mol Bioi. 2004; 261:399-410을 참조한다.

형광 상관관계 분광기(Fluorescence correlation spectroscopy: FCS)는 단일 분자 및 실시간 분석가능한 비침습적이며 매우 민감도가 높은 검출 방법이다(Vukojevic et aI., Cell Mol. Life. Sci., 62(5): 535-50;2005). SPFI(single-particle fluorescence imaging)는 매우 민감한 형광물질을 이용하여, 소형 형광 입자로 선택적으로 표지된 개별 분자를 가시화한다(Cherry et al., Biochem. Soc. Trans., 31(Pt 5): 1028-31;2003). 지방 뗏목내 단백질 위치화는, Latif et al., Endocrinology 2003; 144(11): 4725-8을 참조한다. 살아있는 세포의 이미지화에 대해서는, Hariguchi, Cell Struct Funct 2002; 27(5):333-4를 참조한다.

형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer: FRET) 현미경을 또한 사용하여 생리 조건하에서 단백질의 구조와 위치화를 연구한다(Periasamy, J Biomed. Opt., 6(3):287-91;2001).

형질막에 있는 단백질의 경우, 덜 민감한 분석을 사용하여, 이들이 막상에 존재하는지를 검출할 수 있다. 이러한 방법으로는 고정된 세포의 면역조직화학법과 방사표지된 리간드(예, ¹²⁵I)를 이용한 전-세포 표지방법이 있다.

MC4R 의 세포 표면 발현 결정. 후보 화합물을 동정한 다음, 다음 단계는 후보 화합물이 세포 표면으로 이동된 MC4R의 양을 증가시키는지를 결정한다. 수많은 분석을 사용하여, 세포 표면의 리셉터 발현을 정량적으로 평가할 수 있다. 예로, ¹²⁵I-MSH를 이용한 방사능 리간드 결합 분석을 사용하여, MC4R을 발현하는 전체 세포 또는 세포막 분획에 대한 결합성을 결정할 수 있다. 미국 특허공보 제2003/0176425호; Chhajlani의 Peptides, 17(2):349-51;1996을 참조한다. 아울러, 표지된 항체 또는 표지된 MC4R(예, FLAG-테깅된 MC4R)을 이용한 면역형광 염색을 사용할 수도 있다. 그외 공지된 방법으로는 세포 표면 마커에 대한 표지된 항체를 이용하여 세포 집단을 분류 또는 구별하는 형광-활성화된 세포 분류(FACS)가 있다. 또한, Nijenhuis et al., supra를 참조한다.

MC4R 활성 증가 결정. MC4R 활성은 cAMP 활성/축척 분석방법(VanLeeuwen et al., J. Biol. Chem., 18:15935-40;2003)을 이용하여, 또는 cAMP에 의해 활성화된 하나이상의 유전자의 전사 증가를 측정하거나, 또는 cAMP 반응 인자에 대한 루시퍼레이즈와 같은 리포터 유전자를 작동가능하게 연결함으로써, 결정할 수 있다(Lee et al., Eur. J. Biochem., 268(3):582-91;2001). 또한, MC4R은 멜라노포어(melanophore)에서 TNF-α 분비를 자극하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 후보 화합물에 대한 반응으로 MC4R 활성은 TNF-α 분비 측정에 의해 평가할 수 있다(Ignar et al., Peptides 24(5):709-16;2003).

마지막으로, 멜라노포어는 멜라노코르틴 작용제 및 길항제에 대한 신속하고 민감한 바이오분석을 제공한다. 이러한 방법은 광학 밀도 변화에 의해 측정된 바와 같이, α-MSH에 의해 유도된 피그먼트 그래뉼 분산 측정을 토대로 한다(Quillan et al., PNAS U.S.A., 92: 2894(1995); Potenza et al., Pigment Cell Res., 5:372;1992).

분자생물학적 정의들

본 발명에서, 당업계의 영역에 포함되는 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법을 사용할 수 있다. 이러한 기법은 일반적으로 스크리닝 분석에 사용하기 위한 야생형 또는 돌연변이 MC4R을 발현하는 재조합 세포의 생산에 일반적으로 이용가능하다. 이러한 기법들은 문헌에 잘 설명되어 있다. 예로, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York("Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & SJ. Higgins, eds.(1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); 입수가능한 이후 버전을 참조한다.

용어 "숙주 세포"는 세포에 의한 원하는 물질 생산, 예컨대 세포에 의한 유전자, DNA 또는 RNA 서열, 단백질 또는 효소 발현에 있어, 임의 방법으로 선별, 변형, 형질전환, 배양, 사용 또는 조작된, 임의 유기체의 모든 세포이다. 본 발명에서, 숙주 세포는 돌연변이 또는 야생형 MC4R 핵산 및 폴리펩티드를 발현하도록 변형된다. 또한, 숙주 세포는 스크리닝 또는 그외 분석에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용가능한 숙주 세포의 예는 HEK293 세포, COS 세포 및 CHO 세포이다.

"재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다.

본원에서 MC4R 폴리뉴클레오티드는 천연적인 조절(발현 통제) 서열이 측면에 있을 수 있으며, 또는 프로모터, 내부 리보솜 도입부(IRES) 및 그외 리보좀 결합 부위 서열, 인핸서, 반응 인자, 억제자, 신호 서열, 폴리아데닐화 서열, 인트론, 5'- 및 3'-비코딩부 등을 포함하여, 이종 서열과 조합될 수 있다. 또한, 핵산은 당업계에 공지된 수많은 방법으로 변형시킬 수 있다. 이러한 변형 방법의 예로는, 메틸화, "caps", 자연적으로 발생되는 뉴클레오티드 하나 이상이 유사체로 치환, 및 예컨대 비하전된 연결기(예, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결기(예, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것과 같은 인터뉴클레오티드 변형체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대 단백질(예, 뉴클레이즈, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등), 인터칼레이터(예, 아크리딘, 프소랄렌(psoralen) 등), 킬레이터(예, 금속, 방사능 금속, 철, 산화 금속 등) 및 알킬화제와 같은 하나 이상의 부가적인 공유 결합 연결된 모이어티를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포르아미데이트 연결의 형성에 의해 유도체화될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 본원에서 간접 또는 직접적으로 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 표지물로 변형할 수 있다. 표지물의 예로는, 방사선 동위원소, 형광 분자, 바이오틴 등이 있다. 또한, 핵산은 분자의 사용과 조합된 분자 생물을 촉진시키기 위해, 예컨대 부위 특이적인 돌연변이 형성에 의해 하나 이상의 염기를 변형시킬 수 있다.

MC4R RNA 또는 폴리펩티드와 같은, "코딩 서열" 또는 발현 산물을 "코딩하는" 서열은, 발현되었을때 RNA 또는 폴리펩티드를 만드는 뉴클레오티드 서열이며, 예컨대 MC4R 뉴클레오티드 서열은 MC4R 폴리펩티드(단백질)에 대한 아미노산 서열을 코딩한다. 단백질에 대한 코딩서열은 개시 코돈(일반적으로 ATG) 및 정지 서열을 포함할 수 있다.

용어 "유전자"는 또한 "구조 유전자"라고도 하며, 하나 이상의 MC4R 단백질 전체 또는 일부분을 포함하며, MC4R 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 조절 DNA 서열을 포함 또는 포함하지 않을 수 있는, 특정 아미노산 서열을 코딩하는 해당 DNA 서열이다.

용어 "발현한다" 및 "발현"은, 핵산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 만드는 측면에서 사용되는 경우에, MC4R 유전자 또는 DNA 서열 정보가 예컨대 상응하는 MC4R 유전자 또는 DNA 서열의 전사 및 번역에 관여되는 세포 기능을 활성화시킴으로써 MC4R 단백질 생산이 명백하게 되도록 허용 또는 야기하는 것을 의미한다. DNA 서열은 MC4R 단백질과 같은 "발현 산물"을 만들기 위해 세포내에서 또는 세포에 의해 발현된다. 발현 산물 그 자체, 예컨대 제조되는 단백질은 또한 세포에서 "발현되는" 것으로 말할 수 있다. 발현 산물은 세포내, 세포외 또는 분비로 특징지어진다. 본원에서, MC4R은 신경의 세포 표면에서 발현된다.

용어 "세포내"는 세포 내부를 의미한다. 용어 "세포외"는 세포 외부를 의미한다. 세포 외부에서, 도처에서 또는 세포 내부에서의 현저한 관찰을 보인다면, 물질은 세포에서 "분비된다".

용어 "이종"은 자연적으로 조합하여 형성되지 않는 요소들의 조합을 의미한다. 예로, 이종 DNA는 세포 또는 세포의 염색체 부위에서는 자연적으로 위치되지 않는 DNA를 의미한다. 바람직하기로는, 이종 DNA는 세포에 대한 외부 유전자를 포함한다. 이종 발현 조절 요소는 본래 작동가능하게 조합된 것과 상이한 유전자가 작동가능하게 조합된 요소이다. 본 발명에서, 대상 단백질을 코딩하는 유전자는 클로닝 또는 발현을 위해 삽입된 벡터 DNA에 이종적이며, 이것이 발현되는 예컨대 E. coli 세포에서 상기 벡터를 포함하고 있는 숙주 세포에 이종적이다.

용어 "형질전환"은 DNA, 즉 MC4R 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 주변 배지에서 숙주 세포로 도입되는 과정이다.

용어 "형질도입"은 DNA, 즉 MC4R 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 원핵 숙주 세포, 예컨대 박테리아 바이러스 또는 박테리오파지를 통한 원핵 숙주 세포로의 도입을 의미한다. 도입되는 DNA 또는 RNA를 수용하여 발현하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포는 "형질전환" 또는 "형질도입"되며, 이는 "형질전환체" 또는 "클론"이다. 숙주 세포로 도입된 DNA 또는 RNA는 숙주 세포와 동일한 종 또는 속의 세포, 또는 다른 종 또는 속의 세포, 또는 합성 서열을 포함한, 임의 소스로부터 유래할 수 있다.

용어 "재조합 조작된 세포"는 형질감염, 형질전환 또는 형질도입을 포함한 임의의 적절한 방법에 의해 대상 핵산, 즉 MC4R 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현 또는 과다발현하도록 조작된 임의 원핵 또는 진핵 세포이다. 또한, 상기 용어는 유전자 산물을 정상적으로 발현하지 않는 세포 또는 유전자 산물을 준최적 수준으로 발현하는 세포에서의 핵산의 내인성 활성화를 포함한다.

용어 "형질감염"은 "외래"(즉, 외부 또는 세포외) 핵산의 세포 도입을 의미한다. "외래" 핵산은 숙주 세포가 DNA를 복제하여 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 물질, 전형적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 효소를 생산하는, 숙주 세포에 대한 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 포함한다. 도입된 유전자, 즉 MC4R 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 서열을 "클로닝된" 유전자 또는 서열이라고 칭할 수 있으며, 세포의 유전자 기계에 의해 사용된 개시, 정지, 프로모터, 신호, 분비 또는 그외 서열과 같은 조절 또는 통제 서열을 포함할 수 있다. 유전자 또는 서열은 비기능적 서열 또는 기능이 공지되지 않은 서열을 포함할 수 있다. DNA는 도입된 DNA 또는 RNA를 수용 및 발현하는 숙주 세포에, 염색체외 요소 또는 염색체 삽입으로서 도입할 수 있다.

사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환 또는 형질감염은 이러한 세포에 적합한 표준기법을 이용하여 행한다. Sambrook et al., 1989의 섹션 1.82에 개시된 바와 같이, 칼슘 클로라이드를 이용한 칼슘 처리가 실질적인 세포벽 경계를 포함하는 세균 세포에 이용된다. Chung and Miller(Nucleic Acids Res. 1988, 16:3580)에 개시된 바와 같이, 다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 또다른 예는 전기천공(electroporation)이라고하는 기법을 이용한다. 대안적으로, 바이러스 벡터를 이용하는 경우, 숙주 세포는 대상 유전자를 포함하는 바이러스로 감염시킬 수 있다.

용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주에 형질전환되어 도입된 서열의 발현(예, 전사 및 번역)을 조장하기 위해 DNA 또는 RNA 서열(예, MC4R 유전자)을 숙주 세포에 도입할 수 있는 비히클이다. 벡터로는 플라스미드, 파지, 바이러스 등이 있으며, 이는 하기에서 더욱 상세히 논의된다

"프로모터 서열"은 세포에서 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 코딩 서열의 하류(3' 방향)의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 한정하는 목적으로, 프로모터 서열은 전사 개시부에 의해 3' 말단이 한정되며, 백그라운드 이상의 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필수적인 염기 또는 요소를 최소로 포함하도록 상류(5' 방향)로 연장된다. 프로모터 서열내에서 전사 개시부위와 RNA 중합 효소가 결합하는 단백질 결합 도메인(보존적인 서열)이 발견될 것이다.

코딩 서열은 RNA 중합효소가 코딩 서열을 mRNA로 전사할때 세포에서 전사 및 번역 통제 서열의 "통제 하에" 또는 "작동가능하게 조합되어" 있으며, (만약 인트론이 함유되어 있다면) 트랜스-RNA가 스플라이싱되어 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역된다.

전술한 구성 성분들중 하나 이상을 포함하는 적합한 벡터의 구축에는 표준적인 연결 기법(standard ligation technique)을 사용한다. 분리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 원하는 플라스미드를 제조하기 위해 절단, 조작되고, 적합한 형태로 다시 연결된다.

구축된 플라스미드내 올바른 서열을 확인하기 위한 분석으로, 연결 혼합물을 사용하여 박테리아 균주를 형질전환시키고, 성공적인 형질전환체를 적합하다면 암피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 선별한다. 형질전환체의 플라스미드를 제조하고, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석하고 및/또는 Sanger et al.(Proc. Natl. Acad. ScL USA. 1977, 74:5463-5467) 또는 Messing et al.(Nucleic Acids Res. 1981, 9:309)의 방법이나, Maxam et al.(Methods in Enzymology 1980, 65:499)의 방법으로 서열분석한다. 숙주 세포는 전술한 발현 벡터로 형질전환시키고, 사용되는 프로모터에 적합하게 변형된 기존의 영양 배지에서 배양한다.

도 1. 랫 및 인간의 멜라노코르틴-4 수용체(Sebhat, J. Med. Chem., 45:4589-4593;2002, 화합물 1).

도 2. 인간 MC4R 작용제(Richardson, J. Med. Chem. 47:744-755;2004, 화합물 2).

도 3. 화합물 1의 합성 경로.

도 4. 화합물 2의 합성 경로.

도 5. MC4R의 길항제(Arasasingham, J. Med. Chem. 46:9-11;2003, 화합물 3).

도 6. MC4R의 길항제(화합물 4); 이 화합물의 생물학적 활성은 섬광 근접 시험을 이용한 WO 02/062766에 기재되어 있다.

도 7. 화합물 3의 합성 경로.

도 8. 화합물 4의 합성 경로.

도 9. 비스아미노티아졸(Bisaminothiazole) 화합물(Pedemonte et al., J. Clin. Inves., 115:2564-71;2005, 화합물 5).

도 10A-D. 화합물 6-25의 구조.

도 11. 리간드 처리 및 길항제 샤페론 처리/무처리한 MC4R 돌연변이에 대한 MC4R의 신호 전달 분석.

도 12. 50 mg의 1-데옥시갈락토노지리마이신(DGJ) b.i.d.(삼각형), 150 mg DGJ b.i.d(사각형) 또는 위약(원)을 복용시킨, 건강한 정상 지원자로부터 채혈한 백혈구 세포에서의 α-갈락토시데이즈 A의 평균 활성

도 13. 화합물 1, 2, 6, 7 및 12-17의 구조.

도 14. 화합물 3, 9, 10, 11 및 21의 구조.

도 15. 화합물 4, 8, 24 및 25의 구조.

도 16. 화합물 18-20의 구조.

본 발명은 하기 실시예로 추가적으로 설명한다. 이러한 실시예들은 단지 예 시에 불과하며 어떠한 방식으로도 본 발명 또는 예시된 것의 범위 및 의미를 한정하는 것은 아니다. 이와같이, 본 발명은 하기 바람직한 특정 예로 한정되지 않는다. 실제, 본 명세서에 따라 본 발명에 대한 수많은 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것이지만, 본 발명의 사상 및 범위에서 이탈되지 않는 범위로 행해질 수 있다. 본 발명은 따라서 청구항에 부여된 등가의 전체 범위로 첨부된 청구항 측면으로만 한정된다.

실시예 1: MC4R 접힙 돌연변이를 발현하는 세포주의 제조

몇몇 MC4R 돌연변이가 MC4R의 구조 결합을 초래하는지를 결정하기 위해, 다양한 돌연변이를 포함하고 있는 MC4R 핵산을 HEK-293T와 COS-7 세포에 형질감염시킨 다음 이의 세포 표면 발현과 활동을 평가하였다. 세포 표면 발현이 감소하거나 없는 것으로 관찰되는 세포주는, 세포내 존재 및/또는 MC4R 폴리펩티드의 위치화를 결정하기 위해, 더욱 조사하였다.

방법

MC4R 돌연변이의 제조. MC4R 야생형을 코딩하는 cDNA(예, 서열번호 1)를 당업계에 공지된 방법(예, PCR, 부위 특이적인 돌연변이 형성)을 이용하여, 예컨대 하기 MC4R 돌연변이 폴리펩티드들 중 하나를 만드는 뉴클레오티드에 변이가 있는 돌연변이 MC4R cDNA를 제조한다: P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, 211번째 코돈에 CTCT, 및/또는 244번째 코돈에 TGAT 삽입. 이러한 돌연변이들은 또한 GFP와 같은 형광 텍 또는 FLAG-테깅 또는 루시퍼레이즈와 같은 효소에 융합될 있다(Blondet et al., J Biochem(Tokyo) 135(4):541-6;2004, VanLeeuwen et al., J. Biol. Chem., 278: 15935-15940;2003).

세포배양과 형질감염. 이러한 돌연변이 MC4R 핵산을 제조사의 설명서에 따라 적절한 발현벡터, 예컨대 pCDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝한다. 세포의 형질감염은 리포펙타민(Invitrogen)을 이용하여 수행하고, 영구적으로 형질감염된 클론 세포주는 네오마이신 유사체인 G418 저항성으로 선별한다.

간략하게, HEK-293T 및 COS-7 세포는 10% 소태아 혈청, 100 units/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)이 첨가된, Dulbecco의 변형된 magle's 배지(글루타민 첨가됨; Invitrogen)에서 유지시킨다. 세포는 5% C0₂ 습윤한 조건하에서 37℃에서 배양한다. 세포는 일반적으로 형질감염한 그날에 70-80%의 컨플루언스가 된다.

GFP 가 달린 MC4R . 그린 형광단백질(GFP) cDNA는 BD Biosciences(San Jose, CA) 또는 Clontech(Palo Alto, CA)에서 구입가능하다. GFP를 제조사의 설명서에 따라 C-말단 종결 코돈이 제거된 인간 MC4R의 C 말단에 인프래임으로 융합시켰다. 키메라 MC4R-GFP 융합 단백질 구조체를 상기와 같이 형질감염시킨다. 루시퍼레이즈 구조체도 동일하게 사용한다.

MC4R 돌연변이의 위치화 검출. 세포 표면 위치화를 결정하기 위한 결합 실험을 기존에 개시된 조건으로 수행한다(Yang et al., J. Biol. Chem., 272:23000- 23010;1997). 간략하게는, ¹²⁵I-NDP-MSH(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)의 2 x 10⁵ cpm을, 비-방사선 표지된 리간드 NDP-MSH, AgRP 87-132, 또는 AgRP 110-117과 함께 사용한다. 결합 반응은 배지를 제거하고 0.2% 소 혈청 알부민이 첨가된 최소 필수 배지로 세포를 2번 세정하여, 종결짓는다. 이후, 세포는 0.2N 수산화나트륨으로 용혈시켜, 용혈물내 방사능을 분석-카운터로 정량한다. 비특이적 결합은 10^-6M의 비표지 리간드의 존재하에 결합된 ¹²⁵I 표지물의 양을 측정함으로써 결정된다. 아울러, FACS를 하기 실시예 4와 같이 사용할 수 있다. 특이 결합은 총 결합된 방사능에서 비특이적으로 결합된 방사능을 빼어, 계산한다. 최대 결합(Bmax)은 식 Bmax = [NDP-MSH 특이 결합]/([NDP-MSH]/(Kd + [NDP-MSH])로 계산할 수 있다. Ki = IC50/ 1 + 리간드 농도/Kd.

MC4R 돌연변이에 형광물질을 테깅하는 경우, 테깅된 MC4R의 세포내 이동성을 모니터하기 위해 공초점 현미경을 사용한다(Blondet et al., J. Biochem., 135:541-546;2004, Gao et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 307(3):870-7;2003). 간략하게는, 세포는 실험하기 전에 24-48시간동안 챔버 커버글라스에서 배양한다. 적절한 처리 후, 세포는 차가운 PBS로 세정하고, 포르말린으로 20분간 고정한 다음 LSM 510 META 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰한다(Carl Zeiss, Thornwood, NY). GFP의 형광은 488 nm 아르곤/크립톤 레이저를 사용하여 여기시키고, 500-550 nm의 밴드 패스 필터로 검출한다. 레드 신호는 543 nm에서 HeNe 레이저로 여기시켜, 565-615 밴드 패스 필터로 형광을 검출한다.

디지털로 획득한 이미지는 Scion Image Beta 4.02를 사용하여 정량화한다. 오리지날 그린 형광 공초점 이미지를 그레이스케일로 변환시키고, 미디언 필터링을 수행한다. 각각의 화소는 0(블랙)에서 255(백색)의 밀도치로 지정된다. 세포 표면과 전체 세포의 형광 세기는 해당 영역을 수동으로 지정한 후 측정한다. MC4R-GFP의 세포내 분포는 세포의 총 형광 세기에 대한 세포 표면의 형광 세피 비로서 나타낸다. 상기 비 감소는 리셉터의 내재화를 의미한다.

이러한 방법을 이용하여, MC4R의 접힘 돌연변이가 샤페론 매개 구제를 위하 후보물질인 것으로 확인한다.

실시예 2: MC4R 의 작용제와 길항제의 구조.

MC4R의 잠재적인 작용제 및 길항제는 공개된 특허 및 참고문헌을 토대로 선택하였다(특히, Bednarek and Fong, Exp. Opn. Therapeutic. Patents, 14(3):327-326;2004 및 국제 특허 공보 제02/062766호). 본원에 언급된 화합물 선별 기준은, 이용가능하다면 IC₅₀ 데이터, 동물의 생체 실험 데이터, 생체이용성 데이터(예, pharmacokinetics)이다.

a) 도 1의 작용제 합성(화합물 1)

THIQ라고 하는 이들 화합물의 선택은 하기 데이타를 토대로 한다.

명칭	MC4R 활성			PK	참조문헌
THIQ/화합물1	IC50(nM)	EC50(nM)	Emax(%)	%F 14 Vd 3.6 L/kg Cl 84 mLmin/kg t1 /2 0.6h	Van der Ploeg et al(2002) PNAS 99:11381. Sebhat et al(2002) J Med Chem 45:4589
	1.2	2.5	97

이 분자의 합성(11 단계)은 도 3에 기재된 도식을 토대로 수행하였다.

b) 도 2의 작용제 합성(화합물 2)

화합물 2라고 하는 공지된 화합물의 선택은 하기 데이타를 토대로 수행하였다:

명칭	MC4R 활성			PK	참조문헌
화합물2	Ki(nM)	EC50(nM)	Emax(%)	ND	Richardson et al (2004) J Med Chem 47:744
	24	39	ND

이 분자의 합성(11 단계)은 도 4에 기재된 도식을 토대로 수행하였다.

c) 도 5의 길항제 합성(화합물 3)

이 화합물은 Arasasingham (J. Med. Chem. 46:9-11;2003)에 의해 보고된 αMSH/MC4R 데이터를 근거로 선택하였다. 이 화합물은 도 7에 개괄된 방법에 따라 합성하였다.

d) 도 6의 길항제 합성(화합물 4)

이 화합물은 밀레니엄 파마슈티컬의 국제특허공보 제02/062766호에 기술된 데이타 및 합성 방법을 토대로 선택 및 합성하였고, 합성안은 도 8에 개괄되어 있다. 이 화합물의 생물학적 활성은 근접 섬광분석을 이용하여 국제특허공보 제02/062766에 보고되어 있다.

간략하게, 합성은 하기 방법으로 수행하였다: 1,3-디아미노프로판(Acros, 27.7 g, 0.374 mmol)을 1,2-디클로로벤젠(Acros, 200 ml) 중의 티오살리실산(Acros, 20 g, 0.130 mmol)에 첨가한다. 이 혼합물을 4시간 동안 170℃에서 가 열한다. 60℃로 냉각시킨 후, 메탄올(50 ml)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 철야 교반한 다음, 생성되는 노란색의 고체 결정체를 모아 에테르로 세정하여, 순수하 산물 9 g을 수득하였다.

2-메톡시-5-니트로벤질 브로마이드(Fluka, 1.86 g, 7.559 mmol)을 실온에서 메탄올(60 ml) 중의 2-(1,4,5,6-테트라하이드로피리미딘-2-yl)벤젠티올(1 g, 5.201 mmol)에 첨가하여, 12시간동안 농축시키고, 에테르(10 ml)을 첨가하여, 생성되는 연노란색 니들형태의 결정체를 모우고, 에테르로 세정하여, 1.28 g의 순수 산물을 수득하였다.

실시예 3: 저온 또는 화학적 샤페론을 이용한 잘못된 접힌 MC4R 의 구제

저온(열 구제) 및 DMSO와 같은 일반적인 화학적 샤폐론 둘다 돌연변이 단백질의 접힘을 복원시키는 것으로 알려져 있기에, 야생형 또는 다양한 MC4R 접힘 돌연변이의 세포 표면 발현을, WT 및 돌여변이 MC4R을 가진 세포와 1% DMSO가 첨가된 조건이나 30℃에서 배양한 세포에서, 각각 평가하였다.

방법

세포 및 형질감염. HEK 293 세포에 3HA 및 Venus(Enhanced Yellow Green Fluorescent Protein; EYFP)로 이중 표지된 야생형(WT) 또는 하기 hMC4R 돌연변이: S58C; N62S; R165W; R165Q 및 P299H를 일시적으로 형질감염시켰다.

저온 분석. WT 및 형질감염된 세포는 MC4R 세포 표면 발현을 평가하기 전에 12시간동안 30℃ 또는 37℃에서 배양하였다. 하기 식으로 Gain을 결정하였다: Gain = [(30℃에서의 표면 발현율% - 37℃에서의 표면 발현율%) / 37℃에서의 표면 발현율%] * 100.

화학 샤폐론 분석. WT 및 일시적으로 형질감염된 세포를 MC4R 세포 표면 발현을 평가하기 전에 12시간동안 1% DMSO가 첨가 또는 무첨가된 상태로 배양하였다.

FACS 분석. FACS 분석법은 세포를 1차 항-HA.11 항체(마우스; 1: 1000 희석)으로 형광 표지한 다음, Alexa 647(goat anti-mouse; 1:1000 희석)이 커플링된 이차 항체 희석물을 처리한 후, 수행하였다. 살아있는 세포(프로피듐 아이오다이드 음성)은 하기 2가지 해당 집단으로 분류하였다:

P4: 전체 YFP 양성 세포(총 MC4R 발현을 나타냄)

P5: YEP 및 Alexa 647에 양성인 세포의 백분율(Alexa 및 YFP 양성 세포) / (YFP 양성 세포 + Alexa 및 YFP 양성 세포) (세포 표면 발현을 나타냄).

결과

MC4R 의 세포 표면 발현. WT 세포 표면 발현의 기본 표면 발현은 90%에 달한다. 돌연변이들 중 어느 것도 ¹²⁵I-표지된 NDP-α-MSH의 결합에 의해 검출된 바와 같이 세포 표면에서 MC4R을 발현하지 않았다(데이타 미기재). FACS로 분석하였을때, 돌연변이 모두 WT MC4R로 형질감염된 세포에 비해 표면 발현의 현저한 감소를 보였다(데이타 미기재). WT 3HA-hMC4R-Venus 세포의 약 90%는 MC4R(P5) 표면 발현을 나타내었지만, 돌연변이들에서의 기본적인 표면 발현은 N62S, R165W, R165Q 및 P299H의 경우 12-18%였다. S58C는 약 40%의 표면 발현을 보였다.

열적 구제. 모두 5개의 돌연변이는 하기 표 2와 같이 MC4R(P5)의 세포 표면 발현 획득을 보였다:

표 2

유전자형	획득 %
WT	12
S585C	43
N62S	68
R165W	63
R165Q	93
P299H	107

화학 샤폐론: 1% DMSO 존재하에서는 세포 표면 발현에 대한 유의한 증가는 관찰되지 않았다.

실시예 4: MC4R 약리학적 샤폐론을 이용한 잘못 접힌 MC4R 의 구제

도 5(화합물 3) 및 도 6(HBr 염, 화합물 4)의 MC4R 길항제 화합물은 각각 다음 MC4R 돌연변이가 있는 세포에서의 샤페론 활성에 대해 평가하였다: S58C; N62S;R165Q;R165W 및 P299H.

방법

약리학적 샤폐론의 분석. 간략하게, 전술한 MC4R 돌연변이 각각을 가진 세포(실시예 3과 같이 형질감염된)를, 각 길항제 화합물 1.0 μM 및 10 μM의 농도하에 12시간 배양하고, 전술한 바와 같이 형광 활성화된 세포 분류 분석으로 MC4R의 세포 표면 발현을 평가한다. 세포 표면 발현 수준을 처리 및 기본 조건간에 비교한다. Gain%는 [Gain = [(처리시의 표면 발현율% - 무처리시의 표면 발현율%) / 무처리시의 표면 발현율 %] * 100으로 계산한다.

MC4R 활성 분석. MC4R 작용제 NDP-MSH(10-7M) 처리 반응으로, cAMP 축척을 Molecular Devices의 Catch Point cAMP 형광 분석 키트whole cell assay; Cat. No. R8044)를 이용하여 각 길항제의 존재 또는 부재하에, MC4R 돌연변이들인 S58C, N62S, R165W 및 P299H에서 평가하였다. 대조군은 무처리하거나 또는 NDP-MSH만 처리하였다.

결과

약리학적 샤폐론의 구제. 표 3에 나타낸 바와 같이, 2종의 길항제는 1.0 μM 과 10 μM 농도에서 MC4R 돌연변이인 R165W, S58C 및 R165Q의 세포 표면 발현을 농도 의존적으로 증가시킬 수 있었다. 전술한 바와 같이, 돌연변이들에서의 기본적인 표면 발현은, N62S, R165W, R165Q 및 P299H의 경우 12-18%였다. S58C는 40%의 표면 발현을 보였다. 기대와는 달리, 각 화합물을 10 μM으로 처리하면, 야생형 MC4R을 발현하는 세포와 동일한 수준으로 MC4R 165W의 세포 표면 발현을 복원시킬 수 있었다.

돌연변이 N62S의 경우, 돌연변이 MC4R의 세포 표면 발현에서 현저한 획득%이 10 μM 농도에서도 2종의 화합물 모두에서 관찰되었지만, 1.0 μM에서는 둘다 효과가 없었다. 도 5의 화합물은 보다 효과적이었으며, 즉, 도 6의 화합물 보다 세포 표면 발현이 높게 관찰되었다.

돌연변이 P299H의 경우, 도 6의 화합물은 1.0 μM 또는 10 μM 농도에서도 돌연변이 리셉터의 세포 표면 발현 복원에 효과가 없었으며, 도 5의 화합물은 10 μM 농도에서만 약한 효과가 관찰되었다.

표 3

화합물/농도	획득%
	S58C	N62S	R165W	R165Q	P299H
4/10μM	130	212.5	675	508	38.9
4/1μM	60	6.25	150	91.7	11.11
3/10μM	130	343.75	675	508	77.78
3/1μM	77.5	25	467	300	27.78

이러한 결과는, 세포 표면 발현을 복원시키는 것으로 약리학적 샤페론으로서 작용하는, 저농도의 MC4R 길항제와 접촉하였을때, MC4R 접힘 돌연변이가 "구제"될 수 있다는 것을 나타낸다.

마지막으로, Pedemonte et al., J. Clin. Inves., 115: 2564-71;2005(도 9)에 기재된 비스아미노티아졸 화합물은 돌연변이 R165W(28.95% 획득) 및 S58C(31.25% 획득) 에 약간의 효과를 보였다.

MC4R 활성. 도 11에서 나타낸 바와 같이, 2종의 길항제를 10μM로 처리한 후, S58C 및 R165W에 hMC4R WT와 동일한 수준으로의, MC4R을 통한 시그널링 회복이 관찰되었다. MC4R 돌연변이 N62S에서의 신호 전달 능력 역시 보다 낮은 수준으로 복원되었다. P299H 돌연변이는 G-단백질 커플링에 필수적인 도메인내이기 때문에, 예상된 바와 같이 신호 전달은 회복되지 않았다.

실시예 5: MC4R 돌연변이의 안정성 및 활성을 복원시키고, 야생형 MC4R 의 안정성 증가시키는, MC4R 샤폐론 스크리닝

본 실시예는 잘못 접힌 돌연변이 또는 야생형의 세포 표면 발현 및/또는 MC4R의 활성을 증진시키는, MC4R 샤페론 화합물을 스크리닝하는 방법을 설명한다.

방법

돌연변이 또는 야생형 MC4R 의 형질감염. MC4R 접힘/이동 돌연변이의 동정은 실시예 1에 개시된 바에 따라 수행된다. 이러한 접힘 돌연변이 및/또는 야생형 MC4R의 형질감염은 상기와 같이 수행하거나, 또는 ELISA 및 FACS 분석과 같은 면역분석을 포함한 단백질의 세포 표면 발현을 검출하기 위한 당업계에 공지된 임의 방법을 이용하여 달성된다.

샤폐론의 투여. MC4R 야생형 또는 접힘 돌연변이를 발현하는 세포의 배양물 또는 어레이에, 샤페론 테스트 화합물을 다양한 농도로 첨가한다. 이후 세포 표면으로 이동되는 MC4R의 활성 뿐만 아니라 MC4R의 세포 위치화를 결정한다. 예로, 하기에 기재된 바와 같이 피페라진-, 피페리딘-, 1,4-디아자판-, 구아니딘성 또는 그외 테스트 화합물을 스크리닝한다: Bednarek 와 Fong, Exp. Opn. Ther. Patents, 14: 327-36;2004, Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 13: 4431-4435;2003; W003/07949; W003/61660; W003/09847; W003/09850; W003/31410; W003/94918; W003/68738; W003/92690; W003/93234; W003/72056; W003/66597; W003/66587; W003/53927; W002/67869; W002/68387; W003/68738; W002/00259; W002/92566; W002/81443; W002/81430; 및 W002/80896.

MC4R 의 세포 표면으로의 이동 검출. 화합물 처리한 MC4R 발현 세포의 세포 및/또는 세포 표면 위치화를 무처리 세포와 비교하여 검출하는 것은 상기와 같이 수행한다.

cAMP 축척 측정에 의한 MC4R 활성 측정. 형질감염한 후 48시간째에, 세포를 PBS로 한번 세정한 다음 0.02% EDTA(Sigma)가 포함된 PBS로 플레이트에서 탈착시켰다. 탈착된 세포는 원심분리로 수거하고, 0.5 mM IBMX, 2 mM HEPES, pH 7.5(IBMX buffer)가 포함된 Hanks' balanced salt 용액에 재현탁한다. 15분간 37℃에서 배양하여 IBMX 흡수되게한 후, 세포 현탁액 0.4 ml(약 5 x 10⁵ cells/ml)을 다양한 농도로 작용제(예, [Nle4-D-Phe7]-MSH (NDP-MSH), α-MSH) 또는 다른 샤페론 후보물질 또는 10 μM 포르스콜린이 함유된 0.1 ml의 IBMX 완충액에 첨가하였다. 이후, 세포는 cAMP 축적을 위해 15분간 37℃에서 배양하였다. 활성은 0.5 ml의 5% 트리클로로아세트산을 첨가하여 중지시키고, 용혈된 세포에서 분비되는 cAMP를 cAMP ¹²⁵I 섬광 근접 분석 시스템(Amersham Biosciences)으로 분석하였다. EC₅₀은 95% 신뢰구간을 사용한 GraphPad Prism software(다양한 기울기의 시그모이달 조사량-반응 커브에 맞춘 비선형 회귀곡선 분석을 이용함)로 계산한다.

실시예 6: 안전성, 허용성, 약동태 및 α- 갈락토시데이즈 A 효소활성 효과를 평가하기 위한, DGJ 단회 투여량 투여

본 실시예는, 안전성, 허용성, 약동태 및 DGJ의 알파-갈락토시데이즈 A(알파-GalA)의 효소 활성 효과를 평가하기 위해, DGJ의 매일 2회 경구 투여량의 무작위, 이중 맹검, 플라시보 조절된 I상 실험을 언급한다.

실험 설계 및 기간. 본 실험은 먼저, 남자, 단일-센터, I상, 무작위, 이중 맹검, 1일 2회 투여량, 플라시보-조절된 실험으로, 경구 투여 이후의 안전성, 허용성, 약동태 및 DGJ의 알파-GalA의 효소 활성 효과를 펴가하였다. 실험은 매일 2번 DGJ 또는 플라시보를 50 또는 150 mg으로 7일 연속 경구 복용한 개체 8명(6명은 활성형이고 2명은 플라시보)으로 구성된 2 그룹을 테스트하였고, 7일까지 방문 추적하였다. 개체는 투약하기 14시간 전부터 투약 후 24시간 경과시까지 치료 시설에 거주시켰다. 스케줄에 따라 식사를 조절하였고, 약물 투여 후 4시간동안 보행(abulatory)시켰다.

약동태 매개변수를 1일 및 7일째에 혈장내 DGJ에 대해 계산하였다. 아울러, 뇨에서 배출되는 DGJ(투약 후 12시간)의 누적%를 계산하였다. α-Gal A 활성을 투약을 개시하기 전에 백혈구(WBC)에서 계산하였고, 실험 후 100시간, 150시간 그리고 336시간 후에 측정하였다.

연구 집단. 개체는 대규모 지역 구성원으로 이루어진 19 내지 50세(포괄적)의 건강하고, 비-수용성, 비흡연 남성이다.

안전성 및 허용성 평가. 안전성은 생명 사이, 실험 피라미터(혈청 화학, 혈액학 및 뇨 분석), ECG, 신체 검사 및 치료 기간동안 부작용 기록에 의해 결정하였다.

약동태 샘플링. 투약 전 및 투약 후 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 시간째에, EDTA에 있는 혈액 채집 투브에 혈액(각 10 ml)을 채혈하였다. 혈액을 얼음조에서 냉각시키고, 가능한 빨리 냉장하에서 원심분리하였다. 혈장 샘플은 2개의 분획으로 나누고, 분석하기 전까지 20 + 10℃에 보관하였다. 실험 끝에, 샘플 모두 MDS Pharma Services Analytical Laboratories (Lincoln)로 이송하여, 분석하였다. DGJ 분석을 위해 배출되는 뇨 전부를 각 개체 로부터 모아, 1일 및 7일째에 DGJ 투여한 후 처음 12시간동안 신장 소거를 결정하였다.

WBC α- GAL A 효소 활성 샘플링. 혈액(각 10 ml)을 EDTA가 함유된 혈액 채집 튜브에 모우고, 투약하기 전 및 이후 100, 150 및 336시간째에 WBC를 추출하였다. 샘플을 상기와 같이 처리하고, WBC α-Gal A 효소 활성을 결정하였다.

통계학적 분석. 실험 평가, 신체 검사, 부작용, ECG 모니터링 및 생명 사인 측정치를 포함한 안전성 데이타를, 치료군 및 채집 시간으로 개괄하였다. 기술 통계(산술평균, 표준편차, 중앙값, 최대값, 최소값)을, 양적 안전성 데이타 뿐만 아니라 베이스라인과의 차이점에 대해 계산하였다. 빈도수는 질적 안전성 데이타의 분류로 집계하였다.

부작용도 MedDRA version 7.0으로 암호화하고, 부작용을 보이는 개체 수 및 보고된 부작용 횟수에 대한 치료로 요약하였다. 약어(verbatim term), 암호 용어, 처리군, 중증도 및 치료 관련성을 포함하여 개체별 부작용 발생 데이타 리스트를 제공하였다. 처리군에서 병용 약물 및 병력을 기재하였다.

약동태 매개변수를 기술 통계(산술평균, 표준편차, 편차 계수, 샘플 크기, 최소값, 최대값 그리고 중앙값)로 종합하였다.

결과

플라시보 처리 개체에서는 부작용(AE)이 없었으며, DGJ를 하루에 2번 50 mg 또는 150 mg으로 복용한 개체에서는 AE가 없었다. DGJ는 하루에 2번 50 mg 또는 150 mg으로 투여시 안전적이며 건강한 남성 개체 군에 허용성이 높은 것으로 나타 났다.

투약 후 정상 범위에서 실험 오차가 있었지만, 임상적으로 유의한 것으로 판단되지 않았다. 실험 기간동안 조사한 모든 매개변수에서는 임상적으로 중요한 데이타로 바뀌지 않았다. 모든 생명 사인, ECG 또는 신체 검사 매개변수의 임상적인 이상은 나타나지 않았다.

약동태 평가. 하기 표는 실험하는 동안 수득한 약동태 데이타를 요약한 것이다.

표 4

	50 mg 2회		150 mg 2회
	1일	7일	1일	7일
Cmax(μM)	2.3 + 0.3	3.9 + 0.5	11.3 + 1.5	10.8 + 1.4
tmaxh)	2.9 + 0.4	2.5 + 0.4	3.1 + 0.4	2.9 + 0.4
t1/2(h)	2.5 + 0.1		2.4 + 0.05
Cmin(μM)		0.4 + 0.03		1.2 + 0.1
12시간 누적 신장 배출율(%)a	16 + 6	48 + 7	42 + 7	60 + 5

a: 투약 후 12시간동안에 배출된 DGJ의 누적%

DGJ의 약동태는 모든 개체와 모든 투약 농도에서 잘 특정화되었다. 평균적인 피크 농도는 모든 투약 농도에서 약 3시간째에 나타났다. 투여량을 50 mg에서 150 mg으로 증가시켰을때, DGJ의 C_max는 농도 비례적인 양상으로 증가하였다.

평균 소거 반감기(t_{1 /2})는 1일째에 50 및 150 mg의 투여량에서 유사하였다(2.5 대 2.4시간).

투여 기간 경과후 12시간에 걸쳐 배출된 DGJ의 평균%는 1일째에 각각 50mg 및 150 mg에서 16% 및 42%였고, 7일째에는 각각 48% 및 60%로 증가하였다.

α- 갈락토시데이즈 A(α- Gal A)의 효소 활성. 실험하는 동안 수득되는 α-Gal A의 효소 활성을 도 1에 나타낸다. 개체에서, DGJ는 50 mg b.i.d 또는 150 mg b.i.d 투여량에서는 WBC α-Gal A 효소 활성을 저해하지 않았다. 게다가, DGJ는 건강한 지원자에서 투여량 의존적인 WBC α-Gal A 활성 증가를 형성시켰다. α-Gal A의 효소 활성은 DGJ 50 mg b.i.d 또는 150 mg b.i.d, 플라시보 투여한 개체의 WBC에서 측정되었다. 플라시보는 WBC α-Gal A의 효소 활성에 효과가 없었다. 플라시보에 대한 반응으로 인한 효소 활성 변화는 임상적으로 유의하지 않았다. DGJ 50 mg b.i.d 또는 150 mg b.i.d 모두 표준화된 WBC α-Gal A의 효소 활성을 증가시켰다. 50 mg b.i.d. DGJ에 대한 반응으로, WBC α-Gal A의 효소 활성은 투약 후 100시간, 150시간 및 336시간 후에 각각 투약 전에 비해 120%, 130% 및 145%로 증가하였다. 150 mg b.i.d DGJ에 대한 반응으로, WBC α-Gal A의 효소 활성은 투약 후 100시간, 150시간 및 336시간 후에, 투약 전에 비해 각각 150%, 185% 및 185%로 증가하였다.

본 발명은 본원에 개시된 구체적인 예로 그 범위가 한정되는 것은 아니다. 실제, 당업자라면 본 명세서에 개시된 바 이외에도 전술한 상세한 설명 및 도면으로부터 본 발명에 대한 여러가지 변형이 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위내에 포함된다.

특허, 특허 출원, 공개공보, 제품 설명서 및 프로토콜이 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되어 있으며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Amicus Therapeutics Inc. <120> PHARMACOLOGICAL CHAPERONES FOR TREATING OBESITY <130> 077376.0346 <150> 60/687,648 <151> 2005-06-03 <150> 60/799,968 <151> 2006-05-12 <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1000 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggtgaact ccacccaccg tgggatgcac acttctctgc acctctggaa ccgcagcagt 60 tacagactgc acagcaatgc cagtgagtcc cttggaaaag gctactctga tggagggtgc 120 tacgagcaac tttttgtctc tcctgaggtg tttgtgactc tgggtgtcat cagcttgttg 180 gagaatatct tagtgattgt ggcaatagcc aagaacaaga atctgcattc acccatgtac 240 tttttcatct gcagcttggc tgtggctgat atgctggtga gcgtttcaaa tggatcagaa 300 accattgtca tcaccctatt aaacagtaca gatacggatg cacagagttt cacagtgaat 360 attgataatg tcattgactc ggtgatctgt agctccttgc ttgcatccat ttgcagcctg 420 ctttcaattg cagtggacag gtactttact atcttctatg ctctccagta ccataacatt 480 atgacagtta agcgggttgg gatcatcata agttgtatct gggcagcttg cacggtttca 540 ggcattttgt tcatcattta ctcagatagt agtgctgtca tcatctgcct catcaccatg 600 ttcttcacca tgctggctct catggcttct ctctatgtcc acatgttcct gatggccagg 660 cttcacatta agaggattgc tgtcctcccc ggcactggtg ccatccgcca aggtgccaat 720 atgaagggag cgattacctt gaccatcctg attggcgtct ttgttgtctg ctgggcccca 780 ttcttcctcc acttaatatt ctacatctct tgtcctcaga atccatattg tgtgtgcttc 840 atgtctcact ttaacttgta tctcatactg atcatgtgta attcaatcat cgatcctctg 900 atttatgcac tccggagtca agaactgagg aaaaccttca aagagatcat ctgttgctat 960 cccctgggag gcctttgtga cttgtctagc agatattaaa 1000 <210> 2 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Asn Ser Thr His Arg Gly Met His Thr Ser Leu His Leu Trp 1 5 10 15 Asn Arg Ser Ser Tyr Arg Leu His Ser Asn Ala Ser Glu Ser Leu Gly 20 25 30 Lys Gly Tyr Ser Asp Gly Gly Cys Tyr Glu Gln Leu Phe Val Ser Pro 35 40 45 Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Val Ile Ser Leu Leu Glu Asn Ile Leu 50 55 60 Val Ile Val Ala Ile Ala Lys Asn Lys Asn Leu His Ser Pro Met Tyr 65 70 75 80 Phe Phe Ile Cys Ser Leu Ala Val Ala Asp Met Leu Val Ser Val Ser 85 90 95 Asn Gly Ser Glu Thr Ile Val Ile Thr Leu Leu Asn Ser Thr Asp Thr 100 105 110 Asp Ala Gln Ser Phe Thr Val Asn Ile Asp Asn Val Ile Asp Ser Val 115 120 125 Ile Cys Ser Ser Leu Leu Ala Ser Ile Cys Ser Leu Leu Ser Ile Ala 130 135 140 Val Asp Arg Tyr Phe Thr Ile Phe Tyr Ala Leu Gln Tyr His Asn Ile 145 150 155 160 Met Thr Val Lys Arg Val Gly Ile Ile Ile Ser Cys Ile Trp Ala Ala 165 170 175 Cys Thr Val Ser Gly Ile Leu Phe Ile Ile Tyr Ser Asp Ser Ser Ala 180 185 190 Val Ile Ile Cys Leu Ile Thr Met Phe Phe Thr Met Leu Ala Leu Met 195 200 205 Ala Ser Leu Tyr Val His Met Phe Leu Met Ala Arg Leu His Ile Lys 210 215 220 Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr Gly Ala Ile Arg Gln Gly Ala Asn 225 230 235 240 Met Lys Gly Ala Ile Thr Leu Thr Ile Leu Ile Gly Val Phe Val Val 245 250 255 Cys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His Leu Ile Phe Tyr Ile Ser Cys Pro 260 265 270 Gln Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu 275 280 285 Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu 290 295 300 Arg Ser Gln Glu Leu Arg Lys Thr Phe Lys Glu Ile Ile Cys Cys Tyr 305 310 315 320 Pro Leu Gly Gly Leu Cys Asp Leu Ser Ser Arg Tyr 325 330 <210> 3 <211> 999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggtgaact ccacccaccg tgggatgcac acttctctgc acctctggaa ccgcagcagt 60 tacagactgc acagcaatgc cagtgagtcc cttggaaaag gctactctga tggagggtgc 120 tacgagcaac tttttgtctc tcctgaggtg tttgtgactc tgggtgtcat cagcttgttg 180 gagaatatct tagtgattgt ggcaatagcc aagaacaaga atctgcattc acccatgtac 240 tttttcatct gcagcttggc tgtggctgat atgctggtga gcgtttcaaa tggatcagaa 300 accattatca tcaccctatt aaacagtaca gatacggatg cacagagttt cacagtgaat 360 attgataatg tcattgactc ggtgatctgt agctccttgc ttgcatccat ttgcagcctg 420 ctttcaattg cagtggacag gtactttact atcttctatg ctctccagta ccataacatt 480 atgacagtta agcgggttgg gatcatcata agttgtatct gggcagcttg cacggtttca 540 ggcattttgt tcatcattta ctcagatagt agtgctgtca tcatctgcct catcaccatg 600 ttcttcacca tgctggctct catggcttct ctctatgtcc acatgttcct gatggccagg 660 cttcacatta agaggattgc tgtcctcccc ggcactggtg ccatccgcca aggtgccaat 720 atgaagggag cgattacctt gaccatcctg attggcgtct ttgttgtctg ctgggcccca 780 ttcttcctcc acttaatatt ctacatctct tgtcctcaga atccatattg tgtgtgcttc 840 atgtctcact ttaacttgta tctcatactg atcatgtgta attcaatcat cgatcctctg 900 atttatgcac tccggagtca agaactgagg aaaaccttca aagagatcat ctgttgctat 960 cccctgggag gcctttgtga cttgtctagc agatattaa 999 <210> 4 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Val Asn Ser Thr His Arg Gly Met His Thr Ser Leu His Leu Trp 1 5 10 15 Asn Arg Ser Ser Tyr Arg Leu His Ser Asn Ala Ser Glu Ser Leu Gly 20 25 30 Lys Gly Tyr Ser Asp Gly Gly Cys Tyr Glu Gln Leu Phe Val Ser Pro 35 40 45 Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Val Ile Ser Leu Leu Glu Asn Ile Leu 50 55 60 Val Ile Val Ala Ile Ala Lys Asn Lys Asn Leu His Ser Pro Met Tyr 65 70 75 80 Phe Phe Ile Cys Ser Leu Ala Val Ala Asp Met Leu Val Ser Val Ser 85 90 95 Asn Gly Ser Glu Thr Ile Ile Ile Thr Leu Leu Asn Ser Thr Asp Thr 100 105 110 Asp Ala Gln Ser Phe Thr Val Asn Ile Asp Asn Val Ile Asp Ser Val 115 120 125 Ile Cys Ser Ser Leu Leu Ala Ser Ile Cys Ser Leu Leu Ser Ile Ala 130 135 140 Val Asp Arg Tyr Phe Thr Ile Phe Tyr Ala Leu Gln Tyr His Asn Ile 145 150 155 160 Met Thr Val Lys Arg Val Gly Ile Ile Ile Ser Cys Ile Trp Ala Ala 165 170 175 Cys Thr Val Ser Gly Ile Leu Phe Ile Ile Tyr Ser Asp Ser Ser Ala 180 185 190 Val Ile Ile Cys Leu Ile Thr Met Phe Phe Thr Met Leu Ala Leu Met 195 200 205 Ala Ser Leu Tyr Val His Met Phe Leu Met Ala Arg Leu His Ile Lys 210 215 220 Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr Gly Ala Ile Arg Gln Gly Ala Asn 225 230 235 240 Met Lys Gly Ala Ile Thr Leu Thr Ile Leu Ile Gly Val Phe Val Val 245 250 255 Cys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His Leu Ile Phe Tyr Ile Ser Cys Pro 260 265 270 Gln Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu 275 280 285 Ile Leu Ile Met Cys Asn Ser Ile Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu 290 295 300 Arg Ser Gln Glu Leu Arg Lys Thr Phe Lys Glu Ile Ile Cys Cys Tyr 305 310 315 320 Pro Leu Gly Gly Leu Cys Asp Leu Ser Ser Arg Tyr 325 330 <210> 5 <211> 1888 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 5 atgctcggga agctcaactt ctgagaggct gcgctgtgag tgtgggcgcg cagatgcaga 60 ggcggctccc agctctccag cgactctcag gaaaaggact ctgaaaagac cccgagtgaa 120 tactacggct aaagggaaag ccacaaaaaa cgaactgcag actggtcagc cgagagtgag 180 ctttcagtag cgccagcttc taaagaaatg atgagcaaag ctgaacccag aagagaccaa 240 caactccttt gcaagctccg ctgcttctga ccctgttcac cgcaggcgcc aactgcagcc 300 ttccaacttc tacaggcaga caggctggga gaaaaaccac tcggggcttc cctgacctag 360 gaggttggac cacttcaagg aggattcgaa tccagctgct gcaggaagat gaactccacc 420 caccaccatg gcatgtatac ttccctccac ctctggaacc gcagcagcca cgggctgcac 480 ggcaatgcca gcgagtctct ggggaagggg cactcagacg gaggatgcta tgagcaactt 540 tttgtctccc ccgaggtgtt tgtgactctg ggtgtcataa gcctgttgga gaacattcta 600 gtgatcgtgg cgatagccaa gaacaagaac ctgcactcac ccatgtactt tttcatctgt 660 agtctggctg tggcggacat gctggtgagc gtttcgaacg ggtcagaaac catcgtcatc 720 accctgctaa acagtacgga cacggacgcc cagagcttca ccgtgaatat tgataatgtc 780 attgactctg tgatctgtag ctccttgctc gcatccattt gcagcctgct ttccattgca 840 gtggacaggt atttcactat cttttacgcg ctccagtacc ataacattat gacggttagg 900 cgggtcggga tcatcatcag ttgtatctgg gcagcttgca cagtatcggg cgttcttttt 960 atcatttact cggacagcag cgctgtcatc atctgcctca ttaccatgtt cttcaccatg 1020 ctggttctca tggcctctct ctatgtccac atgttcctga tggcgaggct tcacattaag 1080 aggatcgctg tcctcccggg cacgggtacc atccgacagg gtgccaacat gaagggcgca 1140 attaccttga ccattctgat tggagtgttt gttgtctgct gggccccgtt tttcctccat 1200 ttactgttct acatctcttg tcctcagaat ccatactgcg tgtgcttcat gtctcatttt 1260 aacttgtatc tcatactgat catgtgtaac gctgtcatcg accctctcat ttatgccctg 1320 cggagtcaag aactgaggaa aaccttcaaa gagatcatct gtttctaccc cctgggaggc 1380 atctgtgagt tacctggcag gtattaagtg gggacagagt gcatactagg tagagacctg 1440 cagaatttgt cactcaggca caacctgagc agtgtacttc ccaacagctg cctctactgt 1500 atagtgcttt ggttggaaaa tatctactgt ataaaatgta agtttatgac ttttgacgtg 1560 gggaaaaagt ctcaacgtgt tatgtttatt gaccttactt tttttgtgtg taaactgctt 1620 atttatgttc tacagcgtgg gcgctatgga gttccataaa agaaaaagac acccttatta 1680 aaactttgac agtgtttctt tccatgttat ttatcaagag tcaacccttg ttctttctgt 1740 ggtagcagaa atcagagcct tctgaaaagc tgtttccatt gcatcacccc cacagcacag 1800 cagaagcctg attccactgt ttatggggaa atatttaaac actggatgct cgatcattta 1860 atgagtcagc tctactcgtg aaatttca 1888 <210> 6 <211> 332 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Met Asn Ser Thr His His His Gly Met Tyr Thr Ser Leu His Leu Trp 1 5 10 15 Asn Arg Ser Ser His Gly Leu His Gly Asn Ala Ser Glu Ser Leu Gly 20 25 30 Lys Gly His Ser Asp Gly Gly Cys Tyr Glu Gln Leu Phe Val Ser Pro 35 40 45 Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Val Ile Ser Leu Leu Glu Asn Ile Leu 50 55 60 Val Ile Val Ala Ile Ala Lys Asn Lys Asn Leu His Ser Pro Met Tyr 65 70 75 80 Phe Phe Ile Cys Ser Leu Ala Val Ala Asp Met Leu Val Ser Val Ser 85 90 95 Asn Gly Ser Glu Thr Ile Val Ile Thr Leu Leu Asn Ser Thr Asp Thr 100 105 110 Asp Ala Gln Ser Phe Thr Val Asn Ile Asp Asn Val Ile Asp Ser Val 115 120 125 Ile Cys Ser Ser Leu Leu Ala Ser Ile Cys Ser Leu Leu Ser Ile Ala 130 135 140 Val Asp Arg Tyr Phe Thr Ile Phe Tyr Ala Leu Gln Tyr His Asn Ile 145 150 155 160 Met Thr Val Arg Arg Val Gly Ile Ile Ile Ser Cys Ile Trp Ala Ala 165 170 175 Cys Thr Val Ser Gly Val Leu Phe Ile Ile Tyr Ser Asp Ser Ser Ala 180 185 190 Val Ile Ile Cys Leu Ile Thr Met Phe Phe Thr Met Leu Val Leu Met 195 200 205 Ala Ser Leu Tyr Val His Met Phe Leu Met Ala Arg Leu His Ile Lys 210 215 220 Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr Gly Thr Ile Arg Gln Gly Ala Asn 225 230 235 240 Met Lys Gly Ala Ile Thr Leu Thr Ile Leu Ile Gly Val Phe Val Val 245 250 255 Cys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His Leu Leu Phe Tyr Ile Ser Cys Pro 260 265 270 Gln Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu 275 280 285 Ile Leu Ile Met Cys Asn Ala Val Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu 290 295 300 Arg Ser Gln Glu Leu Arg Lys Thr Phe Lys Glu Ile Ile Cys Phe Tyr 305 310 315 320 Pro Leu Gly Gly Ile Cys Glu Leu Pro Gly Arg Tyr 325 330 <210> 7 <211> 2769 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 gctggctcac aaagatgctc aggaagctga acttctgaga ggctgcggtg tgagtgtggg 60 cgcgcagatg cagacgcggc tcccagcagt acagcgagtc tcagggaaaa ggactctgaa 120 aagaccccga gtgaatacta aagtgaaagc cgcactgaga gagagagaaa aaaaagcaaa 180 cagcagactg gtcaaccgag aatgagcatt cagaagcacc agcttctaaa gagacgatga 240 tctgagccga acccagaaga gaccaacaac tcctttgcga gttccgctgc ttctgaccct 300 gctcctagca ggcgccaagc gcagcctccc aacttctaca ggcatacaga ctgggagaga 360 atcactcgga gcttccctga cccaggaggt tggatcagtt caaggaggac tcaaatccag 420 ctgctgcagg aagatgaact ccacccacca ccatggcatg tatacttccc tccacctctg 480 gaaccgcagc agctacgggc tgcacggcaa tgccagcgag tcgctgggga agggccaccc 540 ggacggagga tgctatgagc aactttttgt ttcccccgag gtgtttgtga ctctgggtgt 600 cataagcctg ttggagaaca ttctagtgat cgtggcgata gccaagaaca agaacctgca 660 ctcacccatg tactttttca tctgtagcct ggctgtggca gatatgctgg tgagcgtttc 720 gaatgggtcg gaaaccatcg tcattaccct gttaaacagt acggatacgg atgcccagag 780 cttcaccgtg aacattgata atgtcattga ctctgtgatc tgtagctcct tgctcgcatc 840 catttgcagc ctgctttcca ttgcggtgga caggtatttc actatctttt acgcgctcca 900 gtaccataac atcatgacgg ttaggcgggt cgggatcatc ataagttgta tctgggcagc 960 ttgcactgtg tcaggcgtcc tcttcatcat ttactcggac agcagcgctg tcatcatctg 1020 cctcatttcc atgttcttca ctatgctagt tctcatggcc tctctctatg tccacatgtt 1080 cctgatggcg aggcttcaca ttaagaggat tgctgtcctc ccaggcacag ggaccatccg 1140 ccagggtacc aacatgaagg gggcgattac cttgaccatc ctgattggag tctttgttgt 1200 ctgctgggcc ccgttctttc tccatttact gttctacatc tcttgccctc agaatccata 1260 ctgcgtgtgc ttcatgtctc attttaattt gtatctcata ctgatcatgt gtaacgccgt 1320 catcgaccct ctcatttatg ccctccggag tcaagaactg aggaaaactt tcaaagagat 1380 catctgtttc tatcctctgg gaggcatctg tgagttgtct agcaggtatt aagtggggga 1440 cagagtgcaa actaggtaga tacctgcaga ctttgtcact ctggcccgat ctgagcagtg 1500 tacttcccaa cagctgcctc ttctgtgtaa tgctttggtt gaaaatatct actgtataaa 1560 tgtaagtttg tgacttttga catggaaaaa aaagtctcaa cgtgttatgt ttattgacac 1620 gctatttttt ttgtttgtaa aatgcttatt tatgttctat atagtgtggg cgttatgaat 1680 tgacatgaaa gaaaaacaga cacccttatt aaaactttga cagtgtttct ttcctgttat 1740 ttatcaaggt tccacacttg ttctttctgt agtggccgaa atcagaacct tattaaacgt 1800 gttctcagct gttctcatgt attagcccca cagtactgca gaggcactga ccccactgtt 1860 tatggggaaa tatttaaaca ctacatgctt gatcattaaa atgagtcagc tctcttagtg 1920 aaatttcgag caatcgaata aaagcttgcc tattatcctt gctgtccaaa tacactgatg 1980 cttcttttta agtaaaggaa agagaaaggg ggaagaagca gctactgagg agaaagtgag 2040 atttctgtca catgcatttc tccaagaagg aatggttcat tgcccgagac tcagagttca 2100 cacaggcaag tcagctgtgg taggggaaat gcccacttaa tagattaaag atattataat 2160 agataataat agataaaata gattaataga taaaatagat accaatctta atagattaaa 2220 gtgtcctgtt aaatataaac tgtccacacc atgctgaaat ttcctatgcc aaatgatacc 2280 ccaccataac agaatgattt ctttctggct tcttaccagg gatctggttc ctacagaaag 2340 gtctagaaca gctccctctg cacttagagg tccagcgttc atttcatctt agagttaata 2400 gtgagttgtg ctatctttca tgtggcgggg gacttgttgt tcactttctg attacttttt 2460 gagctggaat ataagtgctg aagatcaagt gatttaattc ccaagccaaa tccacatcac 2520 aaaacatttt gggacagggt ttgtaaatat ctaaagtgtg gagccctgtg gtgcttgcac 2580 ataacgagat ggaaagagaa cacaaatggg gtcctggaag gtacagtaaa acaccctgct 2640 gttcttagtc atgtcttggg atggggaatg cttgttttct ccaaactaat accaaaggtg 2700 tggccactga gcaaccaaat ctatgctttc tagtctgtgt atactttgaa ataaaaggga 2760 taaaaacct 2769 <210> 8 <211> 332 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Asn Ser Thr His His His Gly Met Tyr Thr Ser Leu His Leu Trp 1 5 10 15 Asn Arg Ser Ser Tyr Gly Leu His Ser Asn Ala Ser Glu Ser Leu Gly 20 25 30 Lys Gly His Pro Asp Gly Gly Cys Tyr Glu Gln Leu Phe Val Ser Pro 35 40 45 Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Val Ile Ser Leu Leu Glu Asn Ile Leu 50 55 60 Val Ile Val Ala Ile Ala Lys Asn Lys Asn Leu His Ser Pro Met Tyr 65 70 75 80 Phe Phe Ile Cys Ser Leu Ala Val Ala Asp Met Leu Val Ser Val Ser 85 90 95 Asn Gly Ser Glu Thr Ile Val Ile Thr Leu Leu Asn Ser Thr Asp Thr 100 105 110 Asp Ala Gln Ser Phe Thr Val Asn Ile Asp Asn Val Ile Asp Ser Val 115 120 125 Ile Cys Ser Ser Leu Leu Ala Ser Ile Cys Ser Leu Leu Ser Ile Ala 130 135 140 Val Asp Arg Tyr Phe Thr Ile Phe Tyr Ala Leu Gln Tyr His Asn Ile 145 150 155 160 Met Thr Val Arg Arg Val Gly Ile Ile Ile Ser Cys Ile Trp Ala Ala 165 170 175 Cys Thr Val Ser Gly Val Leu Phe Ile Ile Tyr Ser Asp Ser Ser Ala 180 185 190 Val Ile Ile Cys Leu Ile Ser Met Phe Phe Thr Met Leu Val Leu Met 195 200 205 Ala Ser Leu Tyr Val His Met Phe Leu Met Ala Arg Leu His Ile Lys 210 215 220 Arg Ile Ala Val Leu Pro Gly Thr Gly Thr Ile Arg Gln Gly Thr Asn 225 230 235 240 Met Lys Gly Ala Ile Thr Leu Thr Ile Leu Ile Gly Val Phe Val Val 245 250 255 Cys Trp Ala Pro Phe Phe Leu His Leu Leu Phe Tyr Ile Ser Cys Pro 260 265 270 Gln Asn Pro Tyr Cys Val Cys Phe Met Ser His Phe Asn Leu Tyr Leu 275 280 285 Ile Leu Ile Met Cys Asn Ala Val Ile Asp Pro Leu Ile Tyr Ala Leu 290 295 300 Arg Ser Gln Glu Leu Arg Lys Thr Phe Lys Glu Ile Ile Cys Phe Tyr 305 310 315 320 Pro Leu Gly Gly Ile Cys Glu Leu Ser Ser Arg Tyr 325 330 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION, Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> D amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 9 Xaa Gly Lys Phe Arg Trp Gly 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION, Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> beta-naphthylalanine (2) <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> AMIDATION <400> 10 Xaa Gly Lys Xaa Arg Trp Gly 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide, cyclic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION, Nle <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(4) <223> Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> beta-naphthylalanine (2') <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> AMIDATION <400> 11 Xaa Xaa Xaa Xaa Asp His Xaa Arg Trp Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> D-(2') beta-naphthylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> AMIDATION <400> 12 Cys Glu His Xaa Arg Trp Gly Cys Pro Pro Lys Asp 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> D-(2') beta-naphthylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> AMIDATION <400> 13 Cys Xaa Arg His Xaa Arg Trp Gly Cys 1 5 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> D-Phe (3,4-di-Cl) <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> AMIDATION <400> 14 Cys Glu His Phe Arg Trp Gly Cys Pro Pro Lys Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide, cyclic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION, Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> c [Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Che <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> DNal(2') <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 15 Xaa Asp Xaa Xaa Arg Trp Lys 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION, Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> c[Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Cpe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> DNal (2') <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 16 Xaa Asp Xaa Xaa Arg Trp Lys 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic petide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> BLOCKED, cyclo (1,6) - suc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> D amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> AMIDATION <400> 17 His Phe Arg Trp Lys 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION, D amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> D amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> AMIDATION <400> 18 Arg Cys Glu His Phe Arg Trp Cys 1 5

Claims (43)

1. MC4R 발현 세포에 MC4R 폴리펩티드에 결합하는 약리학적 사페론을 MC4R 활성을 증가시키는데 유효한 양으로 접촉시키는 단계를 포함하는, MC4R 폴리펩티드의 활성을 증진시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 야생형 MC4R 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 MC4R 폴리펩티드 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드 돌연변이는 MC4R 폴리펩티드의 잘못된 접힘과 관련있는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드 돌연변이는 P78L, R165Q, R165W, 1125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X 및 P299H로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 4항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드 돌연변이는 R165Q, R165W, S58C, N62S 또는 P299H인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 MC4R 길항제인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 MC4R 길항제는 도 5 및 6에 표시된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 기능적 구조로 접히는 동안에 MC4R 폴리펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론에 의해 증가되는 활성은 아데닐릴 사이클레이즈의 활성화인 것을 특징으로 하는 방법.
12. MC4R 발현 세포에, MC4R 폴리펩티드에 결합하는 약리학적 사페론을 MC4R의 세포 표면 발현에 유효한 양으로 접촉시키는 단계를 포함하는, MC4R 폴리펩티드의 세포 표면 발현을 증진시키는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 약리학적 사페론은 기능적 구조로 접혀지면 MC4R 폴리펩티드로부터 해리되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 12항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 야생형 MC4R 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 12항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 12항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 MC4R 폴리펩티드 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드 돌연변이는 MC4R 폴리펩티드의 잘못된 접힘과 관련있는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 16항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드 돌연변이는 P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, TllA, A175T, I316L, I3168, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, 및 P299H로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 16항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드 돌연변이는 R165Q, R165W, S58C, N62S, 또는 P299H로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 12항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 MC4R 길항제인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 12항에 있어서, 상기 MC4R 길항제는 도 5 또는 도 6의 구조로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 개체에게 MC4R 폴리펩티드에 결합하는 약리학적 샤페론을 안정성 증가에 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, MC4R 폴리펩티드의 안정성 증가가 필요한 개체를 치료하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 도 5 또는 도 6의 구조로 표시되는 MC4R 길항제인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 22항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 MC4R 폴리펩티드의 세포막 이동 성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 22항에 있어서, 상기 개체는 비만이거나 비만이 될 위험이 있는 개체인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 22항에 있어서, 상기 개체는 비만과 관련있는 MC4R 유전자에 돌연변이가 있는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 22항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 약리학적으로 허용가능한 담체 중에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 22항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 야생형 MC4R 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 22항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 MC4R 폴리펩티드 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
30. MC4R에 대한 약리학적 샤폐론을 동정하는 방법으로서,

    상기 방법은

    (a) 테스트 화합물을 MC4R 폴리펩티드를 발현하는 세포 또는 세포 추출물을 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키는 단계로, 상기 반응 혼합물은 상기 테스트 화합물이 MC4R 폴리펩티드에 결합가능한 조건을 제공하며;

    (b) 테스트 화합물의 존재하에, 상기 반응 혼합물내에서 MC4R 폴리펩티드의 안정성, 활성 또는 세포 표면 위치화를 검출하는 단계; 및

    (c) 테스트 화합물의 부재시의 MC4R 폴리펩티드의 안정성, 활성 또는 세포 표면 위치화를, 테스트 화합물의 존재시의 MC4R 폴리펩티드의 안정성, 활성 또는 세포 표면 위치화와 비교하는 단계를 포함하며,

    테스트 화합물의 존재시의 안정성, 활성 또는 세포 표면 위치화가 테스트 화합물 부재시에 비해 증가된 것으로 검출되면, 이는 테스트 화합물이 MC4R에 대한 약리학적 샤페론임을 의미하는 것을 특징으로 하는, MC4R에 대한 약리학적 샤폐론을 동정하는 방법.
31. 제 30항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 야생형 MC4R 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 31항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 30항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드는 MC4R 폴리펩티드 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 33항에 있어서, 상기 MC4R 폴리펩티드 돌연변이는 MC4R 폴리펩티드의 잘못된 접힘과 관련있는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 34항에 있어서, 상기 MC4R의 잘못 접힌 돌연변이는 서열번호 2의 야생형 MC4R 폴리펩티드에 대한 P78L, R165Q, R165W, I125K, C271 Y, TllA, 30A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H 및 S58C로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 30항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 세포를 기본으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 30항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 세포가 결핍된 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 30항에 있어서, 세포 표면에 위치된 MC4R 폴리펩티드의 활성을 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 38항에 있어서, 상기 검출되는 활성은 cAMP의 활성화인 것을 특징으로 하 는 방법.
40. 제 1항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 도 13의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제 1항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 도 14의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 1항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 도 15의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 1항에 있어서, 상기 약리학적 샤페론은 도 16의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.

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