JP2008521419A - Ｇタンパク質共役型受容体 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体ＧＰＲ３９の機能性特性化およびＧＰＲ３９タンパク質活性を変性または調節する化合物に関する。具体的には、本発明は、胃腸の動態および／またはコレステロール代謝の調節が可能な化合物を同定するためのＧＰＲ３９のアゴニストまたはアンタゴニストのためのスクリーニングの方法、およびそれらの化合物の治療的使用に関する。本発明は、ＧＰＲ３９遺伝子内に変異を有するトランスジェニック動物にも関する。

Description

本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体ＧＰＲ３９の機能的特性化およびＧＰＲ３９タンパク質活性を変性または調節する化合物に関する。具体的には、本発明は、胃腸の動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）調節アゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのＧＰＲ３９のアゴニストまたはアンタゴニストのためのスクリーニングの方法およびそれらの化合物の治療的使用に関する。別の態様では、本発明は、代謝ホメオスタシス、具体的にはＧＰＲ３９ノックアウトマウス内で観察されるコレステロールレベルにおけるＧＰＲ３９の関与に関する。本発明は、ＧＰＲ３９遺伝子内に変異を有するトランスジェニック動物にも関する。

従来技術

ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、ホルモンのようなリガンドおよび他の化学的媒介物質のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）への結合と、細胞内エフェクターの活性化との間の媒介物として作用する。ＧＰＣＲへのリガンドの結合の際に、受容体の細胞質ドメインは、受容体とＧタンパク質との相互作用を可能とさせ、それは他方では細胞内中間体、例えばアデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣまたはイオンチャンネルの活性化を許す立体構造変化を受ける。ＧＰＣＲにおける単一リガンドの結合に応答して多数の第二メッセンジャーが産生できるので、このようなシステムは当初のシグナルの増幅を可能とする。この機構を介して、細胞はそれらの外部環境内の変化を感知しそして応答できる。

Ｇタンパク質共役型受容体は、内在型細胞膜タンパク質のスーパーファミリーを形成し、それぞれの受容体は、７個の疎水性膜貫通ドメインの共通特徴を共有し、そのそれぞれはアミノ酸２０〜３０個の長さでありそしてそれらは種々の長さの親水性アミノ酸配列により連結されている。受容体のアミノ末端は細胞外にあり、一方カルボキシル末端は細胞の細胞質内に見いだされる。

ＧＰＣＲは、広範囲の組織および細胞タイプ内に見いだされそして多数の異なる生理学的プロセスに関与する。それらは、広範囲のリガンド、例えばホルモン、例えば黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛膜刺激ホルモン、チロトロピン、副腎皮質刺激ホルモン、グルカゴンおよびバソプレッシン；神経伝達物質、例えば５−ＨＴ、アセチルコリン（ムスカリン性ＡｃｈＲ）、ヒスタミン、プロスタグランジン、カルシトニン、ロイコトリエンおよびＣａ^２＋により活性化される。ＧＰＣＲの広範囲の分布および広い役割は、ＧＰＣＲが各種の病理学的状態に重要な役割を有するであろうことを示す。実際に、ＧＰＣＲは、気管支収縮、高血圧、炎症、ホルモン失調、糖尿病、アポトーシス、侵害応答、神経伝達の促進および振せん障害に関連する疾患に関与することが見いだされている。

Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリー内で、それへの天然のリガンドが未知の推定ＧＰＣＲは、「オーファン（ｏｒｐｈａｎ）受容体」と呼ばれる。Ｇタンパク質共役型受容体は、価値のある薬剤標的であることが証明されており、それはそれらは市販薬剤の約５０％の標的だからである。従って、多数のオーファンＧＰＣＲが、新規の可能性がある標的を同定するために評価されている。

ＧＰＲ３９は、成長ホルモン分泌促進受容体（ＣＨＳ−Ｒ）およびニューロテンシン受容体１および２（ＮＴ−Ｒ１およひＮＴ−Ｒ２）との配列類似性に基づいて同定された（ＭｃＫｅｅ，ｅｔ ａｌ．、１９９７）。予測された４５３アミノ酸ＧＰＲ３９タンパク質は、ＧＰＣＲの特徴である７個の膜貫通ドメインを含む。他のＧＰＣＲとの配列比較により、ＭｃＫｅｅら（１９９７）は、ＧＰＲ３９のタンパク質配列がＧＳＨＲ、ＭＴＬＲ１（モチリン受容体）およびニューロテンシン受容体−１にそれぞれ２７％、２９％および３２％一致することを見いだした。ノーザンブロット分析は、ＧＰＲ３９が広範な組織分布を有することを明らかにした。１．８〜２ｋｂの単一ハイブリダイジングｍＲＮＡ転写物は、試験した殆どの脳領域内に検出された。しかし、この種に加えて、長さ３ｋｂの別の転写物が種々の末梢組織、例えば胃および小腸内および膵臓、甲状腺および結腸などの組織内に観察され、この３ｋｂ種は検出された唯一の転写体であった（ＭｃＫｅｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）。イン・シトゥ・ハイブリダイゼーションでの蛍光により、ＭｃＫｅｅら（１９９７）は、ＧＰＲ３９遺伝子を２ｑ２１−ｑ２２にマップ位置を決めた。構造的に異なるＧＨＳによるＧＨＳ−Ｒの結合および活性化に必須であるＴＭ３内の酸性残基がＧＰＲ３９内に保存されている。

これらの組織分布研究に基づいて、ＧＰＲ３９は、心血管疾患状態（特許文献１および特許文献２）、ガンおよび特には脳ガン、例えば膠芽腫（特許文献３および特許文献４）、炎症および神経疾患状態（特許文献５および特許文献６）および胃腸および肝臓疾患（特許文献６）に関与すると仮定されている。しかしながら、引用したどの文献でも、ＧＰＲ３９へのリガンド同定に基づく機能特性化は得られていない。かかる理由から、ＧＰＲ３９の現在の機能的解釈は推測的でありそしてＧＰＲ３９のリガンド結合および機能的性質を同定するためのさらなる研究を必要とする。

ＧＰＣＲの広範な組織分布および大一部分のＧタンパク質共役型受容体が各種の細胞および生理学的プロセス内で重要な役割を果たしていることを考慮して、本受容体の正常の生理学的役割の理解を得ることは興味があるであろう。
国際公開第２００１／０８１６３４号パンフレット 国際公開第２００４／００４２７９号パンフレット 国際公開第２００１／０３６６８５号パンフレット 国際公開第０１／０４２２８８号パンフレット 米国特許出願公開第２００３／２３２７６９号明細書 国際公開第２００４／００４２７９号パンフレット

発明の要旨
上記のように、本発明はＧＰＲ３９受容体の新規の機能の同定に関する。本明細書に後記の実施例に記載のように、哺乳動物内のＧＰＲ３９変異は胃の排出に影響しそしてＧＰＲ３９が胃腸系動態の調節において鍵となる要素として指定されている。ＧＰＲ３９遺伝子の下方制御が胃排出の増加に導くという事実を考慮すると、ＧＰＲ３９発現の増加が胃排出を減少させると期待される。この発見は、ＧＰＲ３９活性の調節を介する胃腸の動態の制御における新規の治療方法への進路を提供する。この発見は、胃腸の動態および胃腸の動態障害を含む疾患を研究するための新規のモデルシステムも提供し、それは、それらの疾患の防止または処置に有用な化合物を同定するための新規のスクリーニング方法も提供する。

上記に加えて、ＧＰＲ３９ノックアウトマウスの表現型決定は、コレステロール代謝に対するこの受容体の関与をさらに明らかにした。ＧＰＲ３９遺伝子の下方制御は、増加す
るコレステロールレベルに導く。従って、ＧＰＲ３９が、過剰コレステロールレベルに伴う疾患状態、例えば、肥満、糖尿病、肥満に関連する心血管疾患および緑内障を含む代謝性症候群に関与すると予測される。

従って、本発明の第一の態様は、胃腸の動態を調節するかまたは胃腸の動態障害と関連する病状を防止および／または処置するために有効な化合物を同定するための方法におけるＧＰＲ３９タンパク質の全てまたは一部分の使用を提供する。別の局面では、本発明はコレステロール形成を調節するかまたは過剰コレステロール形成に関連する病状を防止および／または処置するために有効な化合物を同定するための方法におけるＧＰＲ３９タンパク質の全てまたは一部分の使用を提供する。あるいは、本発明は、かかる方法中でＧＰＲ３９タンパク質の全てまたは一部分を発現する細胞の使用も提供する。特定の態様では、ＧＰＲ３９は配列番号２、配列番号４、上記配列を有するタンパク質のスプライスバリアント、および配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも５０％そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質である。

本明細書中でこれまで使用されたように、ＧＰＲ３９タンパク質の一部分とは、配列番号２または配列番号４のポリペプチドのフラグメントを含むことを意味し、かかるフラグメントは少なくとも１０個、例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００または１５０個またはそれ以上のアミノ酸の数である。かかるフラグメントは、配列番号２または配列番号４のそれぞれのＮ−末端から誘導されてもよい。Ｎ−末端領域を含むフラグメントは、受容体結合部位を提供するために受容体の細胞外一部分を再構築するために使用されてもよい。好ましくは、フラグメントはアデニンを結合する能力を保持する。

本発明は、胃腸の動態を調節する化合物を同定または胃腸の動態障害と関連する病状およびコレステロールの高レベルに関連する疾患状態、例えば糖尿病および心血管疾患を含む代謝性症候群を防止および／または処置するために有効な方法における配列番号２または配列番号４のポリペプチドの全てもしくは一部分をコードする単離された核酸配列の使用も提供する。本発明の方法に使用される場合の核酸配列は、配列番号１もしくは配列番号３からなる単離された核酸配列、および配列番号１もしくは配列番号３の核酸配列に少なくとも５０％、そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％配列同一性を有する核酸配列を含むと意図する。

本発明の核酸は、配列番号１もしくは配列番号３またはそれらの相補体の核酸配列に少なくとも５０％、そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％配列同一性を有する配列を含んでなる核酸をさらに含む。好ましくは、それらの配列は、非特異性結合を最小化するように制御された条件下で相当する核酸にハイブリダイズする。好ましくは、ストリンジェントないし中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい、適合する条件は、例えば、約８０〜９０％同一である配列の検出のために、一晩、４２℃、０．２５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中でハイブリダイゼーションし、最終洗浄を５５℃で０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で行うことを含む。約９０％以上同一である配列の検出のために適合する条件は、一晩、６５℃で、０．２５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中でハイブリダイゼーションし、最終洗浄を６０℃で０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１Ｘ ＳＤＳ中で行うことを含む。

かかる核酸は必ずしも「全長」ポリペプチドをコードする必要はなく、従って例えば、終止コドンをもたらす置換またはフレームシフト変異のいずれかによりコード配列が早すぎて終止されたＧＰＲ３９遺伝子の変異形態を示す核酸を含むであろうことは認められる
。それらも本発明の核酸である。

本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである核酸の使用も提供する。一つの局面では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその相補体をコードする配列の１５〜５０、例えば１５〜３５、１８〜３５、１５〜２４、１８〜３０、１８〜２１もしくは２１〜２４個のヌクレオチドから本質的に成る核酸プライマーを提供する。

本発明の核酸およびポリペプチドは、疾患を治療するために治療的に使用されてもよい。具体的には、それら疾患を治療するために使用されてもよく、その病状は、ＧＰＲ３９受容体における作用と関連する疾患に関連し、具体的には胃腸の動態障害に関連する病状および代謝性症候群のような上昇したコレステロールレベルに関連する疾患状態の防止および／または処置に関連するものである。

別の態様では、該核酸の配列を含んでなるベクター、具体的には本発明の核酸配列に操作可能に連結したプロモーターを含んでなる発現ベクターが提供される。該ベクターは、宿主細胞により運搬され、そして該細胞内で発現されてもよい。該発現に続いて、該細胞は本発明に従う方法に使用できる。

本明細書中で上記したように、本発明のポリペプチドに結合またはその活性を調節する化合物（以後薬剤とも呼ぶ）の同定のためのアッセイ方法を提供するのが、本発明の一つの目的である。具体的には、かかる化合物はいずれかの大きさの原子の有機もしくは無機の集合体であり、そして小さい分子（約２５００ダルトン未満）またはさらに大きい分子、例えばペプチド、ポリペプチド、全タンパク質およびポリヌクレオチドを含むことを意図し、ここで該化合物は上記のような処置の方法に使用されてもよい。

本発明者らは、胃腸の動態の調節における鍵となる要素としての受容体としてＧＰＲ３９を同定した最初なので、本発明は、ＧＰＲ３９自体および／またはこの受容体を作動または拮抗する化合物の治療用途への使用の可能性を開く。従って、本発明は、ヒトまたは動物身体の処置の方法にさらに拡張され、該方法はＧＰＲ３９アゴニストまたはアンタゴニストの使用を含んでなる。具体的には、疾患状態を処置する方法は、遅延した胃排出、例えば腸閉塞手術後軽症胃アトニー（ｇａｓｔｏｒｐａｒｅｓｉｓ）、糖尿病軽症胃アトニー、機能性消化不良、迷走神経切断後軽症胃アトニー、遅い移動性便秘、便秘性過敏性腸症候群、混合型過敏性腸症候群、および特発性間質性疑閉塞に関連する。かかる方法は、ヒトまたは動物に、ＧＰＲ３９受容体アンタゴニストの治療的に活性な投与量を投薬することを含んでなり、具体的には本発明の方法を用いて同定できるＧＰＲ３９アンタゴニストの使用を含んでなる。

上昇した胃腸排出、例えばダンピング症候群または増加した腸運動性例えば下痢、下痢性過敏性腸症候群および混合型過敏性腸症候群と関連する疾患状態を処置する方法を提供することも目的であり、該方法は、ＧＰＲ３９受容体アゴニストの治療系に有効な投与量をヒトまたは動物に投薬することを含んでなり、具体的には、本発明の方法を用いて同定できるＧＰＲ３９アゴニストの使用を含んでなる。

さらに、コレステロールホメオスタシスに対するＧＰＲ３９受容体の下方制御の観察された効果に基づいて、本発明のさらなる局面において、欠陥があるコレステロールホメオスタシスのための治療用途においてＧＰＲ３９自体および／またこの受容体を作動または拮抗する化合物を使用する可能性を開く。従って、本発明は、ヒトもしくは動物身体の処置の方法にも拡張され、該方法は欠陥コレステロールホメオスタシスに関係する疾患状態の措置におけＧＰＲ３９アゴニストまたはアンタゴニストの使用を含んでなる。具体的に
は、肥満、糖尿病、および心血管疾患、例えばコレステロールの高レベルに関連するアテローム性動脈硬化を含む代謝性症候群のような過剰コレステロール形成に関連する疾患状態の処置におけるＧＰＲ３９アゴニストの使用である。

それらおよびその他の本発明の態様は、以下にさらに詳細に説明される。

配列の説明
配列番号１は、マウスＧＰＲ３９のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、マウスＧＰＲ３９のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトＧＰＲ３９のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、ヒトＧＰＲ３９のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＧＰＲ３９フォアワードプライマーである。
配列番号６は、ＧＰＲ３９リバースプライマーである。
配列番号７は、ＧＰＲ３９プローブ配列である。
配列番号８は、ヒトオベスタチンである。
配列番号９は、サルオベスタチンである。
配列番号１０は、マウスオベスタチンである。
配列番号１１は、ラットオベスタチンである。
配列番号１２は、アレチネズミオベスタチンである。
配列番号１３は、ブタオベスタチンである。
配列番号１４は、ネコオベスタチンである。
配列番号１５は、イヌオベスタチンである。
配列番号１６は、ヤギオベスタチンである。
配列番号１７は、ヒツジオベスタチンである。
配列番号１８は、ウシオベスタチンである。
配列番号１９は、オベスタチンのコンセンサス配列である。

図面の説明
図１Ａは、野生型マウスから誘導された組織内のＧＰＲ３９の実時間定量逆転写ＰＣＲ
図２Ａは、野生型マウスおよびヘテロ接合およびホモ接合ＧＰＲ３９ノックアウトマウスから誘導された４種の異なる組織内のＧＰＲ３９の実時間定量逆転写ＰＣＲ
図２は、野生型マウスに対するＧＰＲ３９ノックアウトマウスにおける胃排出の半排出時間（ｔ_１／２）（Ａ）およびＴ_ｌａｇ（Ｂ）の比較
図３は、ＧＰＲ３９ノックアウトマウス（Ｂ）に対する野生型マウス（Ａ）における糞ペレットプロパルジョンの比較。ペレットの分布は、全結腸長さの１５％の区分として数えそして各区分から排出されたペレットの数は、２０分の時間間隔で数える。
図４は、若齢（１７週齢、ｎ＝６）および高齢マウス（５６週齢、ｎ＝６）の双方について、絶食（１９時間）マウス（Ｂ）に対する非絶食マウス（Ａ）の累積飼料摂取の比較。図５は、１１種の哺乳動物種からのプレプログレリン（ｐｒｅｐｒｏｇｈｒｅｌｉｎ）のアミノ酸配列をシグナルペプチド（イタリック体）、成熟グレリン（陰付き）、および隣接オベスタチン（下線付き）で示す。推定コンバーターゼ切断部位を表すコンセンサス塩基残基は、黒背景に白抜き文字で示す。コンセンサス配列中で、完全に保存される個別残基は、大文字で示される。個別のグレリン遺伝子のＧｅｎｅＢａｎｋ（ｇｉ）番号は、３７１８３２２４（ヒト）、３４５４１８９０（サル）、１９２２４６６４（マウス）、１１０６７３８７（ラット）、２７３５７９００（アレチネズミ）、４７５２３２３０（ブタ）、５２７８２８１３（ネコ）、５０９７８７０４（イヌ）、５２７８２８１４（ヤギ）、５７５２６２０２（ヒツジ）、および２７８０６６１３（ウシ）である。

発明の詳細な説明
核酸
本発明の方法中に使用される核酸は、ＤＮＡ（ゲノムおよびｃＤＮＡの双方を含む）およびＲＮＡを含む。本発明による核酸がＲＮＡを含む場合に、添付の表内に示される配列の引用は、ＵがＴを置換したＲＮＡの等価物も引用されると解釈するべきである。

本発明の核酸は、一本鎖での二本鎖でもよい。本発明の一本鎖核酸は、アンチセンス核酸を含む。従って、配列番号１または配列番号１を含んでなる配列またはそれらのフラグメントの引用は、文脈が明らかに反対でない限り、相補的配列も含むと理解されるべきである。同様のことは配列番号３にも当てはまる。

一般的に、本発明による核酸は、単離物、単離および／または精製された形態、または天然に同伴する物質を含まないかまたは本質的に含まないで、例えば、場合により発現のための１個もしくはそれ以上の調節配列を除き、ヒトゲノム内の遺伝子に隣接する核酸を含まないかまたは本質的に含まないで提供される。核酸は、全体または一部分的に合成されてもよくそしてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。

本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントである核酸も提供する。一つの局面では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその相補体をコードする配列の１５〜５０、例えば１５〜３５、１８〜３５、１５〜２４、１８〜３０、１８〜２１または２１〜２４ヌクレオチドから本質的に成る核酸プライマーを提供する。

「本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）の用語は、いかなる追加の５’または３’核酸配列も含まない核酸を本質的に指す。本発明のさらなる態様において、上記に定義した１５〜３０個のヌクレオチドから本質的になる本発明の核酸は、しかしながら、天然には連結されていない短い（例えば４〜１５、例えば４〜１０ヌクレオチド）別の配列に３’末端、しかし好ましくは５’末端で連結していてもよい。かかる別の配列は、好ましくは、本発明の核酸が例えばＰＣＲプライマーとして使用される場合に、クローニングを容易にするために制限酵素認識部位を含んでなるリンカーである。

本発明のプライマーは、望ましくは、本発明のポリペプチドをコードする核酸に選択的にハイブリダイズできる。「選択的」（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）とは、他のプリン受容体をコードする配列に関しそして具体的にはアデニン受容体以外の受容体に関して選択的であることを意味する。選択的にハイブリダイズする配列の能力は、実験または計算で決定されてもよい。

例えば、プライマーのＴｍを計算する一つの方法は、同類標的配列へのプライマーのＴｍを算出するための式を参照する方法である。この式は、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）−５である。これは３ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ（ここでＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である）の条件下でのＴｍを与える。この式は一般的に長さ約５０ヌクレオチドまでのプライマーに適合する。本発明では、この式は、本発明のポリペプチドをコードする配列から誘導された指定された配列に対するプライマーの見かけのＴｍを算出するためのアルゴリズムとして使用されてもよい。該Ｔｍは、それら他の配列のいずれかの一部分に対する一致の最大数に基づいて、ヒトおよびラットのＧＰＣＲ配列に対して算出れたＴｍと比較されてもよい。

標的配列にハイブリダイズするプライマーに適合する条件も、実験的に測定されてもよい。適合する実験条件は、本発明のポリペプチドをコードする核酸および他のアデニン受容体をコードする核酸の双方に対する候補プライマーを、低いストリンジェンシーのハイブリダイズ条件（例えば６ｘＳＳＣ５５℃）下で固体担体上でハイブリダイズし、還元ＳＳＣおよび／またはより高い温度、例えば０．２ｘＳＳＣ、４５℃において洗浄し、そし
てハイブリダイゼーション温度を段階的に上昇して、プライマーが本発明のポリペプチドをコードする核酸にはハイブリダイズするがしかし他のプリン受容体をコードする核酸にはハイブリダイズしないようにさせるハイブリダイゼーション条件を決定することを含んでなる。

本発明の核酸、殊にはプライマーは、顕示的な標識を有していてもよい。適当な標識は、放射性同位元素、例えば^３２Ｐまたは^３５Ｓ、蛍光標識、酵素標識、または他のタンパク質標識、例えばビオチンを含む。かかる標識は、本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーに加えられてもよくそして自体公知の技術を用いて検出されてもよい。

本発明のプライマーは、合成核酸、例えば細胞内の核酸の安定性を改善することを意図して修飾された骨格構造を有するものを含んでなってもよい。オリゴヌクレオチドへの修飾の多数の異なるタイプが当該技術分野では公知である。それらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、アクリジン、または分子の３’および／または５’末端でのポリリシン鎖の付加を含む。本発明の目的のために、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、当該技術分野で利用できるどの方法により修飾されてもよいと理解される。かかる修飾は、本発明のポリペプチドヌクレオチドのイン・ビボ活性または寿命を増大するために実施されてもよい。

さらに本発明内の範囲に含まれるのは、本明細書中に記載の核酸配列、好ましくはオリゴヌクレオチド、具体的には安定化されたオリゴヌクレオチド、またはリボザイムの形態に基づくアンチセンス配列である。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸、前ｍＲＮＡもしくは成熟ｍＲＮＡの相補的配列にハイブリダイズして、与えられた標的ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの産生に干渉して、その発現を低下もしくは全く防止するように設計されてもよい。リボザイムは、本発明の核酸配列をコードするＧＰＲ３９ ＧＰＣＲによりコードされるｍＲＮＡを、望ましくはＧＰＲ３９ＧＰＣＲに特異性の標的配列、すなわち他のＧＰＣＲ配列に共通でない配列で切断するように設計される。アンチセンス配列の構造およびその使用は、Ｐｅｙｍａｎ ａｎｄ Ｕｌｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）、Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｎ Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：３２９−３７６（１９９２）、およびＺａｍｅｃｎｉｋ ａｎｄ
Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，７５：２８０−２８４（１９７４）に記載されている。リボザイムの構造およびそれらの使用は、例えばＧｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｓｈｉｌｌｉｔｏｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（２）：１２５−１３７（１９９７）に記載されている。

一つの態様では、本発明のＲＮＡは、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１，１９９８）または短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：６０４７−５２，２００２）を用いるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の導入のために使用できる。「ＲＮＡｉ」は、ｄｓＲＮＡが相補ｍＲＮＡの同類依存性分解を誘導するプロセスである。一つの態様では、本発明の核酸分子は、本発明の「センス」リボ核酸との相補性塩基対形成によりハイブリダイズされて二本鎖ＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡアンチセンスおよびセンス核酸分子は、少なくとも約２０、２５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドまたはＧＰＲ３９コード鎖に、またはその一部分のみに相当するものを備える。別の態様では、ｓｉＲＮＡは長さが３０ヌクレオチドまたはそれ以下であり、そしてさらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドであり、特性的２〜３ヌクレオチド ３’オーバーハング末端を有し、それらはより長いｄｓＲＮＡからリボヌクレアーゼＩＩＩ切断により生成される。例えばＴｕｓｃｈｌ Ｔ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６−４８，２００２）参照。

小ＲＮＡ分子の細胞内転写は、ｓｉＲＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）転写単位内にクローンして達成でき、それは通常小さい核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮＡアーゼＰ ＲＮＡ Ｈ１をコードする。ｓｉＲＮＡを発現するために二つの方法が使用できる：一つの態様では、ｓｉＲＮＡデュプレックスを構成するセンスおよびアンチセンス鎖が、個別のプロモーターにより転写される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５，２００２）：別の態様では、ｓｉＲＮＡが細胞内プロセシングの後にｓｉＲＮＡを生成するステム−ループヘアピンＲＮＡ構造として発現される（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０−５５３，２００２）（引用することにより本明細書に編入される）。

ｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡは、生物体に送達される前にイン・ビトロでセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖をアニールして最も普通に投薬される。別の態様では、ＲＮＡｉは、投薬の前にアニールされることなく同じ溶液中の本発明のセンスおよびアンチセンス核酸を投薬することにより実施されてもよく、そして非常に近い時間範囲内に別のビヒクル内の核酸を投薬して実施されてもよい。ＧＰＲ３９またはＧＰＲ３９核酸配列に相補的なアンチセンス核酸のフラグメント、同族体、誘導体および類似体をコードする核酸分子が追加して提供される。

本発明のアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよびリボザイム配列は、カルチャー内の哺乳動物細胞系列内に導入されて、例えばこの遺伝子の下方制御を起こしそして表現型的効果、またはＧＰＲ３９ ＧＰＣＲと関連する本明細書中に記載のタンパク質の発現もしくは位置を観察することにより、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲの機能を研究してもよい。ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲの異常な発現が起きる細胞内で、かかるアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよびリボザイム配列は、遺伝子の発現を下方制御するために使用されてもよい。

本発明のＧＰＲのｃＤＮＡ配列は、標準ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いてクローンされてもよい。これは、配列番号１の反対鎖上の５’および３’末端にプライマーの対を作り、哺乳動物表層細胞から得られたｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡとプライマーを接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅されたフラグメントを単離（例えばアガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）し、そして増幅されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されＤＮＡが適当なクローニングベクター内にクローンできるように適当な制限酵素認識部位を含むように設計されてもよい。同様なことは配列番号３にも適用される。

配列番号１もしくは配列番号３に１００％は同一ではないが、しかし配列番号２もしくは配列番号４のいずれかまたはその他の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の方法で入手できる。

例えば、配列番号１または配列番号３の配列の部位指定変異誘発を行ってもよい。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞のコドン優先性を最適化するためにサイレントコドン変化が配列に要求される場合に有用である。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質もしくは機能を改変するために望まれるであろう。さらなる変化が、例えば保存的置換をもたらすために必要とされる特定のコーディング変化を表すために望ましいであろう。

本発明の核酸は、５’または３’末端に追加の配列を含んでなってもよい。例えば、合成または天然の５’リーダー配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸に富化され
てもよい。追加の配列は、本発明の核酸、具体的には宿主細胞の転写のために必要な５’または３’非翻訳領域を含んでもよい。

さらに、その他の動物、特定すると哺乳動物（例えばヒトまたはラビット）、さらに特定するとヒトを含む霊長類では、ＧＰＲ３９の同類が得られそそして本発明の方法中に使用されるであろう。かかる配列は、他の動物種からの分裂している細胞もしくは組織から作製されるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを作成または入手し、そして中程度ないし高いストリンジェンシーの条件（例えば、０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０^ＮＣ〜約６０^ＮＣ）下で配列番号１もしくは配列番号３の全てもしくは一部分を含んでなるプローブを用いてかかるライブラリーをプローブして得られてもよい。

本発明は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離されたＤＮＡ配列にさらに拡張されるが、しかしここでコード配列は２個もしくはそれ以上（好ましくは５個を越えず、例えば４個または３個）のエキソンに分割される。かかるエキソン配列は、天然そしてゲノムクローンから得られても、または合成でもよい。エキソン配列は、配列が１個もしくはそれ以上のエキソン配列により中断されている本発明のポリペプチドをコードする核酸を含んでなるミニ遺伝子配列の構築物中に使用されてもよい。

ミニ遺伝子は、あらゆる真核生物起源から誘導された異種エキソンを用いて構築されてもよい。

ポリペプチド
本発明の方法中に使用される単離されたポリペプチドは、単離された形態であり、それが細胞内に見いだされる他のポリペプチドなどの天然に連合した物質を含まないかまたは本質的に含まないと上記に定義されたものである。ポリペプチドは、当然ながら希釈剤もしくはアジュバントと一緒に調剤されそしてさらに実際的な目的で単離されてもよく、例えばポリペプチドは、免疫アッセイに使用するためにマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合にゼラチンまたは他の担体と一緒に通常混合される。ポリペプチドは、天然にもしくは異種真核生物細胞のシステムによるかのいずれかでグリコシル化されてもよく、またはそれらは非グリコシル化であってもよい（例えば原核生物細胞内の発現により産生された場合）。ポリペプチドはリン酸化および／またはアセチル化されてもよい。

本発明のポリペプチドは、本質的に精製された形態であってもよく、その場合にそれは製剤中のポリペプチドの９０％以上、例えば９５％、９８％もしくは９９％が本発明のポリペプチドである製剤中のポリペプチドを一般的に含んでなる。

本発明のポリペプチドは、例えばそれらの精製を支援するためのヒスチジン残基の添加によりまたは細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の添加により変性されてもよい。

配列番号２もしくは配列番号４に少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％配列同一性を有するポリペプチドは、それぞれ配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列変種、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体であるポリペプチドであってもよく、そしてまた本発明によって供給される。例えば、かかるポリペプチドは、１個もしくはそれ以上（例えば１〜２０個、例えば２、３、４、または５〜１０個）のアミノ酸の１個もしくはそれ以上の付加、置換、欠失および挿入により配列番号２もしくは配列番号４中に与えられたものとは異なるアミノ酸配列を有してもよい。

ポリペプチド配列の同一性百分率は、基準配列（例えば本発明の配列番号２または配列番号４）と質問（ｑｕｅｒｙ）配列とを比較する市場で入手できるアルゴリズムを用いて算出できる。同一性アッセイ方法のこれ以上の詳細は、以下に記載される。

質問配列が配列番号２または配列番号４のものと少なくとも５０％、そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の同一性を有し、該配列がＧＰＲ３９受容体活性を保持するポリペプチドのものであると決定された場合に、かかる配列は本発明の一部分を形成する。

本発明によるポリペプチドは、例えばコードする核酸からの発現により産生された後に単離および／または精製（例えば抗体を使用）されてもよい。単離および／または精製されたポリペプチドは組成物の調剤中に使用されてもよく、それは少なくとも１種の追加の成分、例えば製薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクルまたは担体を含む製薬学的組成物を含んでもよい。

本発明によるポリペプチドは、免疫原としてまたは特異性抗体を得るために使用されてもよい。抗体はポリペプチドの精製およびその他の操作、診断スクリーニングおよび治療の範囲内で有用である。

本発明によるポリペプチドは、それに結合しているかまたはその活性もくは機能を調節する分子のスクリーニングに使用されてもよい。かかる分子は、治療（可能ならば予防も含む）の範囲内で有用であってもよい。

本発明のポリペプチドもしくは標識されたポリペプチドまたはそのフラグメントは、固相、例えば免疫アッセイウエルもしくはディップスティックの表面に固定されてもよい。

かかる標識および／または不動化されたポリペプチドは、適当な試薬、対照体、説明書などと一緒に適当な容器中にキットとして包装されてもよい。

かかるポリペプチドおよびキットは、免疫アッセイにより試料またはそれらの活性一部分もしくはフラグメント中に存在するかかるポリペプチドへの抗体の検出の方法中に使用されてもよい。

免疫アッセイ法は当該技術分野では周知でありそして一般に、
（ａ）該タンパク質に対する抗体により結合可能なエピトープを含んでなるポリペプチドを提供し；
（ｂ）抗体−抗原複合体を形成させる条件下で該ポリペプチドと一緒に生物学的試料をインキュベーションし、そして
（ｃ）該ポリペプチドを含んでなる抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを決定する
ことを含んでなる。

配列同一性
核酸およびポリペプチドの配列の同一性百分率は、基準配列と質問配列を比較する市場で入手できるアルゴリズムを用いて算出できる。下記のプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより提供される）が、相同性／同一性を決定するために使用されてもよい：ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、ＢＬＳＴＩＮおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、これらはデフォールト・パラメーターを用いて使用されてもよい。

アルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，ＷＩ）は、一致の数を最大としそしてギャップの数を最小とする２個の完全配列を整列するニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）のアルゴリズムを使用する。一般に、ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝４のデフォールト・パラメーターが使用される。

核酸配列またはその一一部分と質問配列との間の最善の全体的一致を決定するための別の方法は、ブルトラグら（Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．，６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムの使用である。該プログラムは包括的配列整列を提供する。該包括的配列整列の結果は、同一性百分率である。同一性百分率を算出するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢサーチで使用される適当なパラメーターは下記である：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、およびＷｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００、またはヌクレオチド塩基で表した質問配列長さのいずれか短い方。アミノ酸整列の同一性百分率および類似性を算出するための適当なパラメーターは下記である：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ１５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、およびＷｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００、またはクレオチド塩基で表した質問配列長さのいずれか短い方。

ベクター
本発明の核酸配列は、ベクター、具体的には発現ベクター内に組み込まれてもよい。ベクターは、適合する宿主細胞内で核酸を複製するために使用されてもよい。従って、別の態様では、本発明は、複製可能なベクター内に本発明のポリヌクレオチドを導入し、適合する宿主細胞内にベクターを導入し、そしてベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖することによる本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収されてもよい。適合する宿主細胞は、発現ベクターと関連させて以下に記載する。

好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に操作可能に連結されており、すなわち、ベクターは発現ベクターである。

「操作可能に連結」の用語とは、記載された成分がそれらの意図された様式でそれらを機能させるような関係にある近位を指す。コード配列に「操作可能に連結」された制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような様式で結合されている。

適合するベクターは、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子およびその他の適当な配列を含む適当な調節配列を含むように選択または構築できる。ベクターは、適合するプラスミド、ウイルス、例えばファージ、ファジェミドもしくはバキュロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、またはＰＡＣなどであってもよい。ベクターは、遺伝子治療ベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えばＨＩＶもしくはＭＬＶ）またはアルファウイルスベクターに基づくベクターを含む。

ベクターは、複製起点、場合により該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に供給されてもよい。ベクターは、１種もしくはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターではネオマイシン耐性遺伝子を含んでもよい。ベクターは、イン・ビトロでは、例えばＲＮＡの産生のために使用されてもまたは宿主細胞をトランスフェクションもしくは形質転換するために使用されてもよい。ベクターは、イン・ビボでは、例えば遺伝子治療の方法において使用されるように適合されてもよい。種々の異なる宿主細胞内でポリペプチドのクローニングおよび発現の系は、周知である。適当な宿主細胞には、細菌、真核生物細胞、例えば哺乳動物および酵母、およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用できる哺乳動物細胞系統には、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、幼児ハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ細胞および多数のその他のものが含まれる。

プロモーターおよびその他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞と適合するように選択されてもよい。例えば、酵母プロモーターは、Ｓ．セレビシー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターを含む。哺乳動物プロモーターは、重金属、例えばカドミウムに応答して誘導できるメタロチオネイン・プロモーターを含む。ウイルス・プロモーター、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターを使用してもよい。すべてのこれらのプロモーターは、当該技術分野で容易に入手できる。

ベクターは、他の配列、例えば挿入された核酸の発現を駆動するプロモーターもしくはエンハンサー、ポリペプチドが融合体として産生されるような核酸配列および／または宿主細胞内で産生されるポリペプチドが細胞から分泌されるような分泌シグナルをコードする核酸を含んでもよい。

遺伝子治療に使用するための本発明のポリペプチドの産生のためのベクターは、本発明のミニ遺伝子配列を有するベクターを含む。従って、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲおよびその活性の低発現に関係する異常状態を処置するための方法を提供するのが本発明の一つの目的であり、該方法は、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドの使用を含んでなる。具体的には、上昇した胃排出、例えダンピング症候群または増加した腸運動性例えば下痢、下痢性過敏性腸症候群および混合型過敏性腸症候群を処置するための方法中である。遺伝子治療においては、本発明のポリヌクレオチドは、対象者内の関係する細胞によるＧＰＲ３９ ＧＰＣＲの内部産生に作用するように使用される。例えば、ＧＰＲ３９
ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドは、上記で提供される複製欠陥レトロウイルスベクター内で発現するように操作されてもよい。次いで、レトロウイルス発現構築物は、単離されそしてパッケージング細胞がここで関係する遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入されてパッケージング細胞内に導入されてもよい。それらのプロデューサー細胞は、イン・ビボでの細胞操作およびイン・ビボでのポリペプチドの発現のために対象者に投薬されてもよい。遺伝子治療の総説に関しては、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ、第２０章、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ．Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ．（１９９６）を参照されたい。

これ以上の詳細に関しては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。核酸の操作のための多数の公知の技術およびプロトコール、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、およびタンパク質の分析は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。

ベクターは、上記のようにして適当な宿主細胞内に形質転換して本発明のポリペプチドの発現をもたらしてもよい。従って、別の態様では、本発明はポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現をもたらす条件下で上記のような発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、そして発現されたポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明によるポリペプチドを調製する方法を提供する。ポリペプチドは、イン・ビトロ系、例えば網状赤血球溶解物中に発現されてもよい。

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドの複製および発現のためにベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。細胞は、該ベクターに適合性であるように選択されそして例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳動物性であってもよい。宿主細胞は、コードされたポリペプチドが産生されるような、遺伝子の発現のための条件下で培養されてもよい。ポリペプチドが適当なシグナルリーダーペプチドに結合して発現される場合には、それは細胞から培地内に分泌されてもよい。発現による産生に続いて、ポリペプチドは、該当する場合には宿主細胞および／または培地から単離および／または精製されてもよく、そして引き続いて希望に従って、例えば、１種もしくはそれ以上の追加の成分を含んでもよい組成物、例えば１種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクルもしくは担体を含む製薬学的組成物の調剤中に使用される。

本発明に従うポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの産生をもたらすためにアンチセンス方向で上記のベクター内に挿入されてもよい。

アッセイ
胃腸の動態およびコレステロールホメオスタシスを調節する化合物を同定するためのアッセイを提供することが本発明の一つの目的であり、該アッセイは、下記：本発明によりＧＰＲ３９受容体タンパク質のすべてまたは一部分を提供し、該タンパク質を推定される結合化合物と接触させ、そして該化合物が該タンパク質と相互作用できるかどうかについて決定することを含んでなる。

アッセイの一つの態様では、受容体または受容体のサブユニットが、結合アッセイに使用されてもよい。結合アッセイは競合的でも非競合的であってもよい。かかるアッセイは、存在する場合に、どの化合物がポリペプチドに結合できるかを決定するために多数の化合物の迅速なスクリーニングを処理できる。引き続いて、かかる化合物が本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかをさらに決定するために、さらに詳細なアッセイが、結合することが見いだされたそれらの化合物を用いて実行できる。

従って、胃腸の動態およびコレステロールホメオスタシスを調節する化合物を同定するための方法を提供することが本発明の一つの目的であり、該方法は、
（ｉ）本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質のすべてまたは一部分を発現する宿主細胞を、結合に適する条件下で該化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）該受容体タンパク質への化合物の結合を検出する
ことを含んでなる。

別の態様では、本発明は胃腸の動態を調節する化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、
（ｉ）本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質のすべてまたは一部分を発現する宿主細胞からの膜調製物を、結合に適する条件下で該化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）該受容体タンパク質への化合物の結合を検出する
ことを含んでなる。

さらに別の態様では、本発明は、胃腸の動態を調節する化合物を同定する方法を提供し、該方法は競合結合アッセイを含み、ここで
（ｉ）本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質のすべてまたは一部分を発現する宿主細胞を、試験される化合物の存在または非存在下の双方でＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合することが既知の化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合することが既知の該化合物の結合に対する該化合物の作用をアッセイする。

試験される化合物の存在下でＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合することが既知の化合物の結合の低下が、該化合物がＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合する指標である。ＧＰＲ３９受容体タンパク質への天然のリガンドであるオベスタチン（ｏｂｅｓｔａｔｉｎ）は、グレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）のような同じプロホルモンから誘導される別のペプチドとして最近同定された（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｖ．ｔ ａｌ．，２００４ Ｓｃｉｅｎｃｅ
第３１０巻、９９６−９９９）。特定の態様では、受容体に結合することが既知の化合物はオベスタチンから成り、さらに特定すると図５中に開示されたオベスタチン配列の一つから選択され、すなわち配列番号８〜１９、さらに特定すると配列番号８または配列番号１０から選択される。あるいは、本明細書中で使用されるオベスタチンは、配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有するペプチドを指す。

別の態様では、上記の競合的結合アッセイは、本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質のすべてまたは一部分を発現する宿主細胞の膜調製物に関して行われる。該宿主細胞調製およびかかる細胞から膜を調製する方法は、以下に記載される。

特定の態様では、上記の結合アッセイにおけるＧＰＲ３９受容体タンパク質は、配列番号２、配列番号４、上記の配列番号を有するタンパク質のスプライスバリアント、および配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも５０％、そして好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質である。

上記に使用されたＧＰＲ３９タンパク質の一部分は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドのフラグメントを含むと意図され、該フラグメントは、少なくとも１０個、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００もしくは１５０個またはそれ以上のアミノ酸の数である。かかるフラグメントは、配列番号２または配列番号４それぞれのＮ−末端領域から誘導されてもよい。Ｎ−末端領域を含むフラグメントは、受容体結合部位をもたらすために受容体の細胞外一部分を再構成するために使用されてもよい。好ましくは、フラグメントは、ＧＰＲ３９受容体タンパク質に結合することが既知の化合物を結合する能力を保持する。

膜調製物
本発明の受容体タンパク質を発現する細胞膜は、リガンド結合アッセイ、ＧＴＰ−γ−Ｓ結合アッセイなどを含みそれらに限定はされない一定の種類のアッセイに有用である。
かかる細胞膜を調製するための詳細は、一部の場合にはその後のアッセイの性質により決定されてもよいが、しかし、典型的には全細胞を採取しそして、例えば氷冷緩衝液（例えば２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、４℃において）中の音波処理により細胞を破壊することを含む。得られた粗細胞溶解物は、引き続いて、低速遠心分離、例えば４℃で５分間、２００ｘｇにより細胞残さを分離される。さらなる分離および膜濃縮は、高速遠心分離工程、例えば４℃で２０分間、４０，０００ｘｇを用いて最終的に行われ、そして得られた膜ペレットは氷冷緩衝液中に懸濁して洗浄されそして高速遠心分離工程を繰り返す。最終的に洗浄された膜ペレットをアッセイ緩衝液中に再懸濁する。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法により決定される。膜は、直ちに使用されるかまたは後の使用のために冷凍されてもよい。

放射能標識リガンド結合アッセイ
本発明の受容体を発現する細胞は、該受容体へのリガンドについてスクリーニングするために使用されてもよい。同じアッセイは、各種の治療目的に使用されてもよい受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために使用されてもよい。

放射性リガンドアッセイは、受容体を発現する解剖から調製した膜を適当な緩衝液、例えば、２．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）（０．００５ｍｇ／ｍｌ，Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびプロテアーゼ阻害剤としてのベスタチン（ｂｅｓｔａｔｉｎ）（０１．ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（０℃でｐＨ７．４）中で希釈して行われる。アッセイにおける最終タンパク質濃度は典型的には１２〜４０μｇ／ｍｌである。

次いで、膜は、２５０μｌ、９６ウエルマイクロタイタープレートの全体積中、６０分間、氷上で結合リガンドの存在または非存在のいずれかで放射性リガンドと一緒にインキュベーションされる。次いで結合したリガンドを、Ｔｏｍｔｅｃ（Ｗａｌｌａｃｅ）真空濾過装置を用いて０．５％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）中に予備含浸したＧＦ／Ｂフィルターを通す濾過により遊離リガンドから分離される。Ｒｅａｄｙ Ｓａｆｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ）シンチレーション液添加の後、結合放射能は、Ｔｒｉｌｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）シンチレーションカウンター（結合カウントの約４０％計数効率）を用いて定量される。あるいは、結合されたリガンドを捕集し次いで当該技術分野では周知の手順を用いて受容体からリガンドを分離すると好ましいであろう。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍを用いて非線型曲線にフィッティングされる。

この様式で、受容体に結合するアゴニストまたはアンタゴニスト化合物は、該受容体を発現する細胞の膜タンパク質への放射性標識リガンドの結合をそれらが阻害するとして同定されてもよい。非特異性結合は、使用された放射性リガンドに相当する非標識ペプチドの１００ｎＭの存在下で膜タンパク質のインキュベーションの後に残留した放射能の量として定義される。平衡飽和結合アッセイにおいて、受容体を用いてトランスフェクションされた膜調製物または不変の細胞を、標識化合物の上昇した濃度の存在下でインキュベーションして、標識リガンドの結合親和性を決定する。非標識化合物の結合親和性は、置換リガンドの変化する濃度の存在下で標識化合物の固定濃度を用いて、平衡競合結合アッセイで決定されてもよい。

特定の態様では、上記の放射性リガンド結合アッセイは、上記に定義された放射性標識オベスタチンを用いて行われる。オベスタチンの標識付けおよび受容体結合は、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第３１０巻；９９６−９９９）に記載されている。要約すると；
オベスタチンのヨード化は、イオドゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｕｐｌａｎ
ｄ，ＩＮ）方法を用いて行われた。ペプチド（２０μｇ）と１ｍＣｉ〔^１２５Ｉ〕ＮａＩの混合物を前被覆されたイオドゲン・バイアルに移しそして４分間インキュベーションした。^１２５Ｉ標識したペプチドをＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）に適用し次いで６０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡを用いて溶離した。放射性リガンド結合アッセイのために、ラット空腸またはその他の組織を緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０μＭアミジノフェニルメタンスルホニルフルオリド、５ｍｇ／Ｌロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて洗浄し、小片に切断し、そして電動ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジネートを１．０００ｇで５分間遠心分離し、そして上清を３００，０００ｇで１時間、２℃で遠心分離した。ペレット（粗膜画分）をＫＣｌを含まない緩衝液Ａに再懸濁し、液体窒素中で迅速に冷凍し、そして使用するまで−８０℃で保管した。組織ホモジネートを、１，０００倍過剰の非標識オベスタチンの存在または非存在において、種々の濃度の^１２５Ｉオベスタチンを用いて、０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝塩水１００μｌ中で、１８時間室温でインキュベーションした。インキュベーションの後、試験管を１０分間、１０．０００ｇで遠心分離しそしてペレットを氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し次いでγ−分光分析計を用いて放射能を定量した。特異性結合は、全結合から非特異性結合を差し引いて算出した。移動曲線のために、^１２５Ｉオベスタチンの固定濃度をオベスタチンもしくはその他のペプチドの増加する濃度の存在もしくは非存在でインキュベーションした。

上記の結合アッセイに加えて、化合物が本発明によるＧＰＲ３９受容体タンパク質の活性を調節すること特徴とする、胃腸の動態を調節する該化合物を同定するための機能アッセイを提供することも本発明の目的である。かかるアッセイは、
（ｉ）ＧＰＲ３９受容体タンパク質のすべてまたは一部分を試験される化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体タンパク質の活性を測定し、ここで、試験化合物の存在下でのＧＰＲ３９活性の変化は胃腸の動態を調節する化合物の能力の指標である、
工程を含んでなる。

ＧＰＲ３９活性に結合および／またはそれを調節する化合物を同定するためのすべての開示された態様において、コレステロールホメオスタシスにおけるＧＰＲ３９の観察された関与を考慮して、該アッセイは、ヒトおよび温血動物を含む対象者内のコレステロールホメオスタシスに影響するであろう化合物を同定するために使用できる。

本発明のポリペプチドの活性を「調節」する化合物とは、ポリペプチドが化合物の非存在の場合とは異なって、化合物の存在下で挙動するようにポリペプチドの活性を改変する化合物ｏを指す。調節に影響する化合物は、アゴニストおよびアンタゴニストを含む。アゴニストは、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ機能を活性化する化合物を包含する。あるいは、アンタゴニストは、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ機能を妨害する化合物を含む。典型的には、アンタゴニストの効果は、アゴニスト誘導の受容体活性化の遮断として観察されるが、しかし、最近構成的活性受容体として記述されているＧＰＲ３９の場合には、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ機能を妨害する化合物が、逆アゴニスト、すなわち該受容体に対してアゴニストと同じ受容体結合部位に結合するがしかし逆の薬理学的効果を及ぼす薬剤も含む。アンタゴニストは競合的ならびに非競合的アンタゴニストを含む。競合的アンタゴニスト（または競合的ブロッカー）は、アゴニスト結合に特異的な部位とまたはその近くで相互作用する。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニスト相互作用部位以外の部位と相互作用して、受容体の機能を不活性化する。従って、胃排出および／または結腸運動性を増加できる化合物を同定するための方法を提供するのが本発明の一つの目的であり、該方法は、
（ｉ）受容体タンパク質の活性化を許容する条件下で該ＧＰＲ３９受容体タンパク質のす
べてまたは一部分を発現する宿主細胞を試験される化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体活性におけるあらゆる増加を検出し、それにより胃排出および／または結腸運動性を増加できる化合物として試験化合物を同定する、
ことを含んでなる。

別の態様では、本発明は胃排出および／または結腸運動性を低下できる化合物を同定するための方法を提供し、該方法は、
（ｉ）受容体タンパク質の活性化を許容する条件下で該ＧＰＲ３９受容体タンパク質のすべてまたは一部分を発現する宿主細胞を試験される化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体活性におけるあらゆる低下を検出し、それにより胃排出および／または結腸運動性を低下できる化合物として試験化合物を同定する、
ことを含んでなる。

ふたたび、本明細書中の上記に記載の結合アッセイに関して、上記の活性アッセイは、コレステロール代謝を調節する化合物を同定するためにも使用できる。観察された表現型に基づいて、ＧＰＲ３９活性を増加する化合物はコレステロールレベルの低下をもたらすであろうし、そしてＧＰＲ３９活性を低下する化合物はコレステロールレベルの増加をもたらすであろうことが期待される。特定の態様において、本発明は、コレステロールレベルを低下できる化合物を同定する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）受容体タンパク質の活性化を許容する条件下で該ＧＰＲ３９受容体タンパク質のすべてまたは一部分を発現する宿主細胞を試験される化合物と接触させ、そして
（ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体活性におけるあらゆる増加を検出し、それによりコレステロールレベルを低下できる化合物として試験化合物を同定する、
ことを含んでなる。

ＧＰＲ３９活性に対する化合物の効果は、ＧＰＲ３９により媒介される細胞内第二メッセンジャー、例えば細胞内カルシウム、ｃＡＭＰまたはレポーター遺伝子産物の形成の増加または減少であってもよい。ＧＰＲ３９は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）として知られるタンパク質の種類に属する。ＧＰＣＲは、リガンドの結合の際に細胞膜を通過してシグナルを伝達する。リガンド結合ＧＰＣＲは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質により媒介される細胞内シグナル伝達イベントを活性化、例えばアデニル酸シクラーゼ経路の活性化またはホスホリパーゼＣ−β経路の活性化を行う。上記の細胞内シグナル伝達イベントの活性化を評価するアッセイは、当該技術分野では一般的に既知でありそしてなかでも、キメラリガンド誘導性転写因子を含んでなるシグナル伝達の細胞に基づくアッセイ、蛍光強度分布分析を用いるＧタンパク質共役型受容体の結合アッセイ、蛍光団に結合する環状ヌクレオチドもしくは多重応答素子を用いるＧタンパク質共役型受容体からの応答の測定を用いる細胞シグナル伝達アッセイまたはｃＡＭＰ応答因子−指令レポーターアッセイを含む。数種のかかるアッセイの記述は以下である。

本発明は、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ遺伝子の制御領域を調節する化合物を同定するためのバイオアッセイも提供する。かかるアッセイは、本発明のポリペプチド（好ましくは配列番号２または配列番号４）を発現できるラットまたはヒト細胞を利用して行われる。細胞は少なくとも１種の細胞と接触され、ここで制御領域を調節する該化合物の能力は既知である。その後、細胞は本発明の核酸の発現に関して測定される。あるいは、プロモーターが、レポーター遺伝子に連結されてもよい。使用してもよい適当なレポーター遺伝子は、例えばクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを含む。

当該技術分野の熟練者には理解されるように、本発明のポリペプチドのような受容体の活性を調節する化合物を同定するためのバイオアッセイ法は、一般に対照との比較を必要
とする。「対照」（ｃｏｎｔｒｏｌ）の一つのタイプは、化合物に暴露される試験細胞または試験培養物と本質的には同様に処理されるが、「対照」細胞または培養物が化合物に暴露されない点のみが相違する細胞または培養物である。使用できる「対照」細胞または培養物の他のタイプは、「対照」細胞または培養物が機能性ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲを発現しない点を除き、トランスフェクションされた細胞と同様の細胞または培養物である。従って、トランスフェクションされた細胞の応答は、同じ反応条件下で同じ化合物に対する「対照」細胞または培養物のものと比較できる。

アッセイの特に好ましいタイプは、結合アッセイおよび機能アッセイを含み、それらは以下のように行われる。

結合アッセイ
細胞系統（哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＳｆ９昆虫細胞を含む）内の本発明のポリペプチドをコードする核酸の過剰発現は、リガンド結合研究のための該ポリペプチド（便宜的に本節内ではＧＰＲ３９ ＧＰＣＲと呼ぶ）を有する膜調製物を産生するために使用されてもよい。それらの膜調製物は、慣用のフィルター結合アッセイ（例えばＢｒａｎｄｅｌフィルター・アッセイ装置を使用）または高処理量シンチレーション・プロキシミティー・タイプ結合アッセイ（ＳＰＡおよびＣｙｔｏｓｔａｒ−Ｔフラッシュプレート技術；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で、放射能標識リガンドの結合および結合部位に対する競合物によるかかる放射性リガンドの転置を検出するために使用できる。放射能は、９６−、３８４−、１５３６−マイクロタイタープレートフォーマットから迅速な測定が行えるＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、または同様の装置を用いて測定できる。ＳＰＡ／Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ技術は高処理量スクリーニングに特に適合し従ってこの技術は標準リガンドを転置できる化合物に対するスクリーンとしての使用に適する。

本来の状態に近似した環境内でＧＰＲ３９ ＧＰＣＲタンパク質へのリガンドの結合を研究する別の方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１９９９ 二月；２７（２）：３３５−４０）により開発された表面プラズモン共鳴効果を利用する。膜調製物または全細胞内のＧＰＲ３９ ＧＰＣＲはＢｉｏｃｏｒｅのバイオセンサーチップに取り付けられそして結合部位の競合物を同定するために、化合物の存在または非存在においてリガンドの結合を検査できる。

機能アッセイ
ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲは、通常ＧＩＲＫ（内向き選別カルシウムチャンネル）と相互作用するＧｉまたはＧｏ（阻害性Ｇタンパク質）を介して作用するので、カリウムイオンフラックスはそれらの受容体の活性化をもたらすであろう。このイオンのフラックスは、特定の化合物のアゴニスト的またはアンタゴニスト的効果を決定する各種の技術を使用して実時間で測定されてもよい。従って、細胞系統または、例えばアメリカツノガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内に発現された組換えＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ受容体は、全細胞および単一チャンネル電気生理学を用いて関係する化合物の作用の機構を決定して特性を知ることができる。ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲで活性な化合物に対する電気生理学スクリーニングは、慣用の電気生理学技術、そして利用できるようになれば、現在開発中の新規の高処理量方法を用いて行ってもよい。

蛍光−カルシウムおよびナトリウムフラックスは、フルオ（ｆｌｕｏ）−３、フルオ−４、フルオ−５Ｎ、フラ（ｆｕｒａ）レッド、ナトリウムグリーン、ＳＢＦＩおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓを含む供給者からのその他の同様のプローブを含み、数種のイオン感受性蛍光物質を用いて測定できる。従って、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲの結果としてのカルシウムおよびナトリウム流入は、イメージ分析アルゴリズムと組み合わせたレーザー共焦点法を使用または使用しない蛍光顕微鏡法を含む、蛍光測定および蛍光イメージング技術を用いて実時間で特性を知ることができる。

別の方法は、カルシウム遷移（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）に影響を及ぼすアゴニストまたはモジュレーターのいずれかとして活性の化合物に対する高処理量スクリーニングアッセイである。このアッセイは、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ^（Ｒ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる装置にほぼ基づく。その最も通常の構成では、それはフルオレセインに基づく色素により発光される蛍光を励起および測定する。それは蛍光団の４８８ｎｍにおける高出力励起を生成するアルゴンイオンレーザー、９６−／３８４−ウエルプレートの底部全体を迅速に走査する光学系および射出された蛍光を捕捉する高感度、冷却ＣＣＤカメラを用いる。それは９６−／３８４−ウエルプレートのウエル内へ試験薬剤の溶液を送達するための装置を可能とする９６−／３８４−ウエルピペティングヘッドも含む。ＦＬＩＰＲアッセイは、化合物の添加の前、その間およびその後において、実時間で、すべての９６−／３８４−ウエルから同時に細胞の集団からの蛍光シグナルを測定するように設計されている。ＦＬＩＰＲアッセイは、細胞系統内に発現される組換えＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ、例えばラットまたはヒトのＧＰＲ３９ ＧＰＣＲで機能的に活性の化合物をスクリーニングしそして特性を知るために使用されてもよい。以下に記載のように、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲを用いてトランスフェクションされた細胞内のカルシウム遷移体は、受容体の天然リガンドを決定するために種々の基質による受容体の活性化を測定するためにＦＬＩＰＲアッセイを用いて測定された。

環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ−環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成の受容体媒介促進または阻害は、受容体を発現する細胞内でアッセイされてもよい。ｃＡＭＰアッセイの例示的なプロトコールを以下に提示する。

このプロトコールにおいて、ＣＯＳ−７細胞は、ＤＥＡＥデキストラン法を用いて受容体遺伝子を用いて一時的にトランスフェクションされそして９６−ウエルにプレートされる。トランスフェクションの４８時間後に、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースおよび５ｍＭテオフィリンを補足したＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝塩水（ＦＥＳ）を用いて細胞を２回洗浄しそして同じ緩衝液中、２０分間、３７℃、５％ＣＯ_２中でインキュベーションする。試験化合物を加えそして細胞をさらに３７℃で１０分間インキュベーションする。次いで媒体を吸引除去しそして１００ｍＭ ＨＣｌを加えて反応を停止する。プレートは−２０℃で２〜５日間、ｃＡＭＰ測定のために保管する。プレートを解凍しそして各ウエル内のｃＡＭＰコンテンド（ｃｏｎｔｅｎｄ）をｃＡＭＰシンチレーション・プロキシミティーアッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により測定する。放射能は、マイクロベータＴｒｉｌｕｘカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いて定量される。

微量生理機能測定アッセイ−細胞代謝は広範囲の細胞イベント（多重メッセンジャー経路の受容体活性化を含む）に複雑に関与するので、細胞代謝の微量生理機能測定の使用は、受容体のシグナル伝達経路の特異性とは関係なく、あらゆるオーファン受容体の活性化から起きる細胞活性の包括的なアッセイを提供できる。

一時的受容体発現、細胞調製および微量生理機能測定記録の共通ガイドラインは、別の文献に記載されている（Ｓａｌｏｎ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｃｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ａ．１９９６）。典型的には、受容体を発現する細胞を採取しそして実験の２４時間前に完全培地内で微量生理機能測定用カプセルあたりに３ｘ１０^５個の細胞を接種する。寄せ集めで一定ではない血清因子による非特異性代謝刺激を最小にするために、記録の１６時間前に培地を血清を含まない培地と交換する。実験の日に、細胞カプセルを微量生理機能測定機器に移しそして記録媒体（低い緩衝液ＲＰＭＩ １６４０、炭酸水素塩を含まず、血清も含まない（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、脂肪酸を含まないＢＳＡ０．１〜１％を含む）内で平衡させ、その間に基礎代謝活性の基線測定が確定する。

標準記録プロトコールは、２分間の全ポンプサイクル（これは酸性化速度の測定が行われる３０秒間の中断を含む）を用いる１００μｌ／分の流量を規定している。リガンドチャレンジは試料への１分２０秒間の暴露を含み、直後に第一回のチャレンジ後速度測定が行われ、次いで全体で５分２０秒間、２回の追加のポンプサイクルが行われる。典型的には、一次スクリーン中の薬剤は、最終濃度１０μＭで細胞に提示される。

次いで、活性化合物の投与量依存性を検討するための補完実験は、閾値から最高レベルまでの範囲の応答を生成するために必要な量を越える薬剤濃度範囲を用いて細胞を段階的にチャレンジして行われる。次いで、リガンド試料を良く洗浄しそして報告された酸性化速度は、チャレンジの直前に観察された基線速度を起こすピーク応答の上昇百分率として表される。

本発明のポリペプチドの活性を調節することが見いだされた化合物は、ＧＰＲ３９が胃腸の動態および結腸ホメオスタシスの制御に関与するという知見に基づいて、多数の治療用途を有する。特定すると、それは、遅延胃排出に関連する疾病、例えば手術後閉塞による軽症胃アトニー、糖尿病に伴う軽症胃アトニー、機能性消化不良、迷走神経切断後軽症胃アトニー、および特発性腸擬性便秘を含む。さらにこれは上昇した胃排出に関連する疾病、例えばダンピング症候群または上昇した運動性、例えば下痢、下痢性過敏性腸症候群および混合型過敏性腸症候群を含む。さらにコレステロールホメオスタシスに対して観察された効果に基づいて、特には、上昇したコレステロールレベル、例えばアテローム性動脈硬化に関連する心血管疾患を伴う代謝性症候群を含む。要約すると、ＧＰＲ３９ ＧＰＣＲおよび関連受容体は、種々の治療分野における薬剤開発のための価値あるツールとして使用できる。

結合剤
従って、本発明は、本発明に従うアッセイにより得られた調節剤を含む新規の結合剤、およびかかる薬剤を含んでなる組成物をさらに提供する。受容体に結合しそしてアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するであろう薬剤は、その病理学がＧＰＲ３９ ＧＰＣＲ受容体を介する作用を特徴とする上記に列挙した特性の疾患を措置する方法に使用されてもよく、そしてかかる使用は本発明のさらなる局面を形成する。

かかる薬剤は、本発明の薬剤の有効量を投薬されてもよい。多数の上記の病状は慢性そしてしばしば治療不能なので、「処置」はある期間、例えば数時間、数日または数週間の間の症状の緩和を達成することを含み、そして疾患の経過の進行を遅延させることを意図すること含むと理解される。

かかる薬剤は、製薬学的に許容できる担体または希釈剤と一緒に薬剤を含んでなる組成物に調剤されてもよい。薬剤は、生理学的に機能性の誘導体、例えばエステルもしくは塩、例えば酸付加塩もしくは塩基性金属塩またはＮもしくはＳ酸化物の形態であってもよい。組成物は、投薬のいかなる適合する経路および手段のために調剤されてもよい。製薬学的に許容できる担体および希釈薬剤は、経口、経直腸、経鼻、吸入、局所（口中または舌下を含む）、経膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜を含む）投薬に適する調剤中に使用されるものを含む。担体または希釈剤の選択は、提出された投薬経路に依存することは勿論であるが、それは薬剤およびその治療目的に依存するであろう。調剤は、単位投与剤型として提供されると好都合であり、そして薬剤学の技術分野では周知のいずれの方法により調製されてもよい。かかる方法は、１種もしくはそれ以上の付加成分を構成する担体と有効成分を一緒にする工程を含む。一般に、調剤は、有効成分を液状担体もしくは微細に分割された固体担体または双方と一致かつ緊密に混合し次いで、必要な場合には製品に成形して調製される。

固体組成物のために、例えば、マンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬級を含む慣用の無毒性固体担体を使用してもよい。上記に定義された活性化合物は、例えばポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどを担体として用いる座薬として調剤されてもよい。液状の製薬学的に投薬できる組成物は、例えば上記に定義した活性化合物と場合により製薬学的アジュバントとを担体、例えば水、デキストロース塩水、グリセロール、エタノールなどの中に溶解、分散などしてそれにより溶液または分散液を形成して調製できる。所望の場合には、投薬される製薬学的組成物は、少量の無毒性助剤、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ナトリウム、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含んでもよい。かかる投与剤型を調製する実際の方法は、当該技術分野の熟練者には公知であるか、または明らかになるであろうし、例えば「レミントンの薬剤科学」（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，第１５版、１９７５）参照。

投薬されるべき組成物または調剤は、いかなる場合でも、処置される対象者の病状を軽減するために有効な量の活性化合物の量を含む。

０．２５〜９５％の範囲内の有効成分を無毒生担体から成る残部と共に含む投与剤型または組成物を調製してもよい。

経口投薬のために、製薬学的に許容できる無毒性組成物は、通常使用される賦形剤、例えばマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、クロスカルメロース（ｃｒｏｓｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬級のいずれかを組み込んで形成される。かかる組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、徐放調剤などの剤型をとる。かかる組成物は、有効成分１〜９５％、さらに好ましくは２〜５０％、最も好ましくは５〜８％を含んでもよい。

非経口投薬は、一般に皮下、筋肉内または静脈内のいずれかへの注入を特徴とする。注入用薬剤は、慣用の形、液状溶液もしくは懸濁液、注入の前に液体内の溶液もしくは懸濁液に適する固体形状、またはエマルションのいずれかで調製できる。適合する賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに、所望の場合には、投薬される製薬学的組成物は、少量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、酢酸トリエタノールアミンナトリウムなども含んでもよい。

かかる非経口組成物中に含まれる活性化合物の百分率は、その特定の性質、ならびに化合物の活性および対象者の必要性に大きく依存する。しかし、溶液中の０．１％〜１０％の有効成分の百分率が使用可能であり、そして組成物が上記の百分率にその後希釈される固体である場合には、さらに高い。好ましくは、組成物は溶液中に活性薬剤の０．２〜２％を含んでなる。

従って、遅延胃排出、遅延胃排出に関連する疾患、例えば手術後閉塞による軽症胃アトニー、糖尿病に伴う軽症胃アトニー、機能性消化不良、迷走神経切断後軽症胃アトニー、および特発性腸擬性便秘の処置のための製薬学的組成物を提供することが本発明の一つの目的であり、それらの組成物はＧＰＲ３９受容体アンタゴニストを含んでなる。

本発明の一つの別の目的は、上昇したコレステロールレベル、上昇した胃排出、上昇して胃排出に関係する疾患、例えばダンピング症候群または上昇した運動性、例えば下痢、下痢性過敏性腸症候群および混合型過敏性腸症候群の処置のための製薬学的組成物であり、それらの組成物はＧＰＲ３９アゴニストを含んでなる。

従って遅延胃排出に関連する疾患状態の処置のための薬剤の製造におけるＧＰＲ３９アンタゴニストの使用を提供するのが本発明の一つの目的である。具体的には、手術後閉塞による軽症胃アトニー、糖尿病に伴う軽症胃アトニー、機能性消化不良、迷走神経切断後軽症胃アトニー、および特発性腸擬性便秘の処置である。別の態様では、本発明は上昇した胃排出に関連する疾病状態の処置のための薬剤の製造におけるＧＰＲ３９アゴニストの使用を提供する。具体的には、ダンピング症候群、下痢、下痢性過敏性腸症候群および混合型過敏性腸症候群の処置である。

本発明は、下記の実験の詳細を参照してさらに良く理解できるであろうが、しかし当該技術分野の熟練者は、それらが以下の請求範囲中にさらに完全に記載される本発明の例示に過ぎないことを容易に認めるであろう。さらに、本出願中には種々の出版物が引用されている。それらの出版物の開示は、本発明が関係する技術分野の状態をさらに完全に記述するように、引用することにより本明細書に編入される。

実施例
以下の実施例は本発明を例示する。その他の態様は、これらの実施例を参考にして当該技術分野の熟練者により気づかれるであろう。

材料および方法
ＧＰＲ３９ノックアウトマウス
ＧＰＲ３９ノックアウトマウスは、Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃから入手した。ＧＰＲ３９のオープンリーディングフレームの破壊は、ＩＲＥＳ ＬａｃＺ／ＭＣｌ−Ｎｅｏレポーター遺伝子／選択カセットを用いてＧＰＲ３９遺伝子の第一コーディングエキソンのコード領域を置換して行った。動物は、動物管理のためのすべてのベルギーおよびヨーロッパの要求に適合するＳＰＦ施設内で養育した。マウスは、別途指示しないかぎり飼料および水を自由に摂取できる１２時間明暗サイクル（照明点灯７：００ ＥＳＴ）の空調動物コロニー内に群収容した。苦痛および不快を最小化するために適切な手段をとった。すべての実験は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅｓ（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って行いそして現地倫理委員会で承認された。

ＧＰＲ３９の実時間定量逆転写ＰＣＲ分析
ＧＰＲ３９の組織分布を研究しそしてＧＰＲ３９ノックアウトを確認するために、野生型（脳、肝臓、脊髄、胃、腎臓、脾臓、結腸、肺臓、心臓、食道、膵臓、回腸、空腸）およびＧＰＲ３９ノックアウト（肝臓、胃、空腸、結腸）マウスから切り取った種々の組織の全ＲＮＡを実時間定量逆転写ＰＣＲを用いて分析した。最初に、ストランドｃＤＮＡ合成をランダムヘキサマープライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１．０ｍｇ全ＲＮＡについて行った。定量ＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲキットを用いるＡＢＩＰｒｉｓｍ７０００サイクラー（ｃｙｃｌｅｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で行った。ｃＤＮＡの系統的希釈物を閾値サイクルに対するβ−アクチンの濃度の対数の標準曲線を描くために使用した。ＲＴＱ特異性プライマー対およびプローブを以下に表示する。

試料は、３系列で試験しそして結果は品質標準に適合する場合にのみ表示する。異なるマウス組織内の発現レベルは、マウスβアクチンに正規化した後の相対レベルとして表わされる。

ＧＰＲ３９ノックアウトマウス内のβ−ガラクトシダーゼ活性の染色
組織（膵臓、胃、回腸、空腸および結腸）を、固有マウスＧＰＲ３９プロモーターの調節制御下で細菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を発現するホモ接合ＧＰＲ３９ノックアウトマウスから切り取った。それらの組織のホウルマウント（ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｎｔ）染色を記載されたプロトコール（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ）に従って行い、次いで組織をパラフィンに埋め込みそして切片を作製した。

表現型分析
胃排出
野生型６匹およびホモ接合型雄ＧＰＲ３９ノックアウトマウス６匹の群を１４時間〜１０時間の明暗サイクルで２０〜２２℃でケージ内に収容した。標準的な市販のマウス飼料（４３５２ Ｍｕｒａｃｏｎ Ｇ，Ｎｕｔｒｅｃｏ Ｂｅｌｇｉｕｍ ＮＶ，Ｇｅｎｔ，ベルギー）（４．４％脂肪、４％セルロース、２１％タンパク質、１，４０４ｋｃａｌ／ｇ） を試験の前の晩まで自由に摂取させた。午後４時に飼料を取去りそして試験を次の日の午前１１時に開始した。絶食の間の食糞を避けるために、金網板をケージの底に挿入した。水道水は、試験の間を除いて常に自由に飲めた。

試験食
固体試験食餌は、０．０１μＣｉ^１４Ｃ−オクタン酸ナトリウム塩（ＡｍｅｒｉｃａｎＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）をドープしたベークしたスクランブル卵黄０．１ｇ、から成り、そして０．１ｇの標準マウス飼料と混合した。水道水を加えそして均質なペーストを形成するように混合した。実験開始の前に、絶食したマウス（１９時間）を毎週２回で２週間、放射性標識されていない試験食餌を自発的に食べる固定スケジュールで訓練した。この訓練の後では、大一部分の動物が試験食餌を６０秒内に摂取した。

呼吸試験手順：ＣＯ _２ 試料採取
６個の気密プラスチック管に入り口弁を取り付け、それを通して連続空気流（８０％Ｎ２、２０％Ｏ_２、３６０ｍｌ／分）を通し、流出する空気はＣＯ_２捕捉剤、水酸化テトラメチルアンモニウム（１．３ｍｍｏｌ）（Ａｃｒｏｓ，Ｇｅｅｌ，ベルギー）およびｐＨ指示薬チモールフタレイン（０．００６％）を入れたバイアルを通してバブルした。使用した試料採取時間では脱色は観察されず、それは試験の間に吐出されたすべてのＣＯ_２が捕捉されたことを示す。管の寸法（直径５０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）で、マウスに自由に運動させた。各マウスは気密管内に入れられそして試験飼料を与える前に基準呼気試料（
５分間）を採取した。管を明け、飼料をマウスに与えそして管を再度閉じた。試料採取は、最初の３０分間は５分毎、その後の４時間は１５分毎に行った。シンチレーション液を加え、そして試料をβ−カウンター内で計数した。

データ解析
最小二乗解析を使用して、呼気内に排出された^１４ＣＯ_２を二つの数式にフィッティングさせて最適適合曲線を導いた（Ｇｏｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｍａｅｓ ｅｔａｌ．，１９９４）：
式１：ｙ＝ｍｋβｅ^−ｋｔ（１−ｅ^−ｋｔ）^β−１
式２：ｙ＝ａｔ^ｂｅ^−ｃｔ
ｙは、１時間あたりの呼気内の^１４ＣＯ_２排出の百分率であり、
ｔは、時間で表した時間である；ｍ、ｋ、β、ａ，ｂおよびｃは回帰推定定数であり、ここでｍは時間が無限大で回収される^１４ＣＯ_２の全量である。

最適フィッティングから、下記のパラメーターが算出される：
−胃の半排出時間（ｔ_１／２）、^１４ＣＯ_２の全量の５０％が排出された時間。従って、ｔ_１／２値は、胃の半排出時間を含むだけでなく、胃以後の処置、例えば^１４Ｃオクタン酸の吸収および代謝および呼気中への^１４ＣＯ_２の排出のために必要な時間も含む。

式１：ｔ_１／２＝（−１／ｋ）^＊１ｎ（１−２^−１／β）
式２：ｔ_１／２＝６０^＊（ｂ／ｃ）
遅延相（ｔ_ｌａｇ）、食事を微粉に磨砕するために胃が必要とする時間による胃排出の遅延。

式１：ｔ_ｌａｇ＝１ｎ（β）／ｋ
式２：ｔ_ｌａｇ＝６０^＊ｇａｍｍａｉｎｖ（０．５；１＋ｂ；１／ｃ）
測定された^１４ＣＯ_２生成がフィッティングさせた数式曲線からあまり離れないようにするために、測定値を理論曲線に数学的にフィッティングされた値と相関させた。相関係数が０．９５以下（ｒ≦０．９５）の場合に、数学的フィッティングは許容でないと考えてデータを解析から除いた。

胃分泌
６匹の野生型（ＷＴ）および６匹のホモ接合ＧＰＲ３９ノックアウト（ＧＰＲ３９^−／−）雌マウスの群を胃分泌を研究するために使用した。イソフルランを用いてマウスを麻酔した。麻酔下で幽門を縫合糸（ｖｉｃｒｙｌ ４−０、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を用いて閉め次いで腹腔を縫合した。動物を個別にケージ中に再度４時間入れた。幽門閉止の４時間後にマウスを屠殺しそして食道を噴門の直上で閉めた。胃を腹腔から取り出した。胃を秤量しそして開けて胃分泌物を取り出した。胃分泌物を測定し次いで水（Ｗａｔｅｒ Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５ｍｌ中に希釈した。ｐＨ電極（ｐＨ５９７、Ｐｒｏｆｉ Ｌａｂ）を用いてｐＨを測定した。

データ解析
データは、平均±標準偏差として表した。マウスおよび胃の重量および胃分泌物は、非母数Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて野生型（ＷＴ）とＧＰＲ３９^−／−との間で比較した。水（５ｍｌ）のｐＨを最初に測定し、次いで胃分泌物中に加えそしてｐＨを再度測定した。水のｐＨと胃分泌物との溶液のｐＨとの間の差を算出し次いで溶液１ｍｌについて報告し、次いで非母数Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて双方の群の間で比較した。

糞ペレットプロパルジョン
６匹の野生型（ＷＴ）および６匹のホモ接合ＧＰＲ３９ノックアウト（ＧＰＲ３９^−／
−）雄マウスの群を胃ペレットプロパルジョン（ｐｒｏｐｕｌｓｉｏｎ）を研究するために使用した。

ＣＯ_２を用いてマウスを窒息させ次いで断頭した。結腸を盲腸から直腸にいたるまで切除し、そして付属組織を取り除いた。組織をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｓｓｅｌｅｉｔ溶液１００ｍｌを入れたガラスビーカーに移し、９５％Ｏ_２および５％ＣＯ_２の混合物を通気しそして３７℃に保持した。実験開始の前に、結腸の長さを測定した。結腸内のペレットを数えそして直腸までのその距離を測定した。次いで、各ペレットの排出までの時間を２０分間記録した。

データ解析
ｔ＝０から２０分までの結腸の全長にわたるペレットの分布を結腸の長さに対する各ペレットの位置を区分けして決定した（結腸全長の１５％の区分け：０〜１５％、＞１５〜３０％、＞３０〜４５％、＞６０〜７５％、＞７５〜９０％および＞９０〜１００％、ここで０％は直腸そして１００％は回盲（ＩＣ）弁位置を表す）。全結腸長さの１５％ずつの区分を考慮し、そして各区分内および各区分から排出されたペレットの数を２０分間数えた。両側符号検定を用いて統計的解析を行った。

マウス行動試験
１４匹の野生型および１４匹のホモ接合雄ＧＰＲ３９ノックアウトマウスおよび１２匹の野生型および１２匹のホモ接合ＧＰＲ３９雌ノックアウトマウスの群を２回の行動試験に使用した：オープン・フィールド試験（運動活動を評価するために当該技術分野では公知の方法）および高所ゼロ迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｚｅｒｏｍａｚｅ）（不安関連行動を評価するために当該技術分野では公知の方法）。

オープン・フィールド試験（ＯＦＴ）は、正常の明暗サイクルの明相の間に行った。各マウスは、自動化オープン・フィールド・システム内で３０分間試験セッションを課せられた。水平および垂直の面（ｐａｎｅ）内の運動を記録した。このセッションの間に、下記のパラメーターを記録した：動きの継続時間、動きの数、移動した全距離、中央部で移動した距離、縁部で移動した距離、中央部で移動した距離の比率、中央部で過ごした時間、縁部で過ごした時間、中央部で過ごした時間の比率、中央部で移動した距離と縁部で移動した距離との比率、中央部で過ごした時間と縁部で過ごした時間との比率、後退の数、および後退の時間。単一因子ＡＮＯＶＡを得られた結果の統計解析に使用した。

高所ゼロ迷路は、正常の明暗サイクルの明相の間に行った。各マウスは、高所ゼロ迷路内で５分間試験セッションを課せられた。そのセッションの間に、下記のパラメーターを記録した：行き止まりおよび開いた通路内の移動時間、行き詰まりおよび開いた通路内で過ごした時間の比率、移動した全距離、行き詰まりおよび開いた通路内の移動距離。単一因子ＡＮＯＶＡを得られた結果の統計解析に使用した。

呼吸速度
６匹の野生型および６匹のホモ接合雄ＧＰＲ３９ノックアウトマウスの群をＡＩＮ−９３Ｇげっ歯類精製食餌（Ｄｙｅｔｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）に慣らし、次いでそれらを代謝ケージ内に入れた。マウスは、測定の前少なくとも一週間、代謝ケージと同一の条件（以下参照）下でタイプ−２ケージ内で収容した。連続する２日間、すべてのマウスを制御された温度（２８．８℃）、湿度（５５〜６０％）および照明（１２：１２時間の明暗サイクル、照明開始０６：００時）で代謝ケージ内に個別に収容した。動物はげっ歯類飼料および水を自由に摂取できた。下記のパラメーターを測定し、平均として表した：呼吸商（ＰＥＲ）、ＶＯ２および熱発生。

血液分析
コレステロールおよびトリグリセリドの血漿レベルを、６月齢雄および雌ＧＰＲ３９^−／−マウスに対するＧＰＲ３９^＋／＋同腹子について、標準食餌の自由摂取の１２時間の絶食の後に決定した。コレステロールおよびトリグリセリドのレベルは、ＨｉｔａｃｈｉＭｏｄｕｌａｒランダムアクセス分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ、スイス）により、同じ供給者からの試薬および試験方法を用いて決定した。

飼料摂取
自由に給餌されそして絶食した若齢（１７週齢）および高齢（５６週齢）ＧＰＲ３９^−／−マウスおよびＧＰＲ３９^＋／＋同腹子（各群毎にｎ＝６）における６時間の累積飼料摂取解析を午前１０時から開始した。各マウスは、暗室（特に別途記載しない限り）内においた個別ケージ内に入れられ、そこで予め秤量した量の飼料を与えられた。累積飼料摂取は、３０分、１、２、３、４、５および６時間で未摂取飼料を差し引いて測定した。

結果
ＧＰＲ３９の実時間定量逆転写ＰＣＲ分析
野生型マウスから誘導した複数のマウス組織内のＧＰＲ３９の実時間定量逆転写ＰＣＲは、広い組織分布を示した（図１Ａ）。野生型マウスおよびヘテロ接合およびホモ接合ＧＰＲ３９ノックアウトマウスから誘導した４種の異なる組織（肝臓、胃、空腸、結腸）内のＧＰＲ３９の実時間定量逆転写ＰＣＲは、ＧＰＲ３９ノックアウトマウス内でのＧＰＲ３９転写物の不在を確認した。ヘテロ接合マウスでは中間的なレベルが得られた（図１Ｂ）。

ＧＰＲ３９ノックアウトマウス内のβガラクトシダーゼ活性の染色
ＧＰＲ３９の発現は、膵臓の外分泌（ランゲルハンス島）および内分泌一部分内、幽門内の粘液腺組織の上部に位置する壁細胞および胃の本体内の頸部粘液細胞内、小腸および結腸内の腸細胞ならびに腸の粘膜層を神経支配するニューロン内に検出された。

胃排出
ＧＰＲ３９ノックアウトマウスにおける固体食餌の胃排出は、野生型マウスと比較して著しく加速されている。実際に、ＧＰＲ３９ノックアウトマウス中の半排出時間（ｔ_１／２）（４８．５±２分、ｎ＝５）は、野生型マウス（８９．９±６分、ｎ＝６）と比較して著しく短い（図２Ａ）。Ｔ_ｌａｇもＧＰＲ３９ノックアウトマウスは野生型マウスに比べて著しく短く（２２．５±１．３分対３９．２±３．４分、ｎ＝６）、ＧＰＲ３９ノックアウトマウスにおける固体食餌の胃排出の加速を確認する（図２Ｂ）。それらの結果は、３日の間隔を置いた群あたりマウス６匹の３回の連続試験の平均である。

胃分泌
ＷＴとＧＰＲ３９^−／−マウスとの間にマウス体重の差異は観察されなかった（それぞれ３０．４±６．６ｇ対２６．９±４．０ｇ）。双方の群の間の胃重量の傾向を測定した。（ＷＴ：９７８±２６２ｍｇ対 ＧＰＲ３９^−／−：１３９５±３４３ｍｇ、Ｐ＝０．０５４７）。胃分泌（μＬ）は、ＧＰＲ３９^−／−マウスにおいて、ＷＴマウスと比較して著しく上昇した（それぞれ６３８±３３６μＬ対２２５±１７０μＬ、Ｐ＝０．０２４２）。ＧＰＲ３９^−／−中の水ｐＨと胃分泌液ｐＨの間のｐＨ低下はＷＴよりも著しく少なかった（それぞれ０．９±０．２対１．１±０．２、Ｐ＝０．０３７４）。それらのデータは、ＧＰＲ３９受容体の欠失が胃分泌の著しい上昇を誘導するが、しかしこの上昇は酸分泌の増加によるものではないことを示唆する。

糞ペレットプロパルジョン
結果は、実験の開始時の結腸内のペレットの分布がＧＰＲ３９^−／−とＷＴとの間で異
ならなかったことを示す（ｐ＝０．５６３７，両側記号検定による、青色棒）（図３）。直腸に最も近いペレット（全長の０〜３０％）は、ＷＴとＧＰＲ３９^−／−の双方で排出された。遠位に位置したペレット（長さの３０〜７５％）の大一部分は、ＧＰＲ３９^−／−動物の結腸から排出されたが、しかしＷＴ動物からはされなかった（ｐ＝０．０２５３、黄色棒）（図３）。それらの結果は、ＧＰＲ３９^−／−動物の結腸からの糞ペレットのより効果的な排出を示す。

マウス行動試験
胃排出で観察された差異はＧＰＲ３９ノックアウト動物の一般的な活動性または情緒的状態の差異によるかが混同され得るので、我々はオープン・フィールド試験（ＯＰＴ）およびゼロ迷路試験（０−ｍａｚｅ）に見られる神経医学的試験を行った。

オープン・フィールド試験
雌ＧＰＲ３９ノックアウトと野生型同腹子との間に運動活動性に差異は観察されなかった。従って、胃排出で観察された差異は、雌ＧＰＲ３９ノックアウトマウスにおける増加した一般的活動性による検査目的以外の変化（ａｒｔｅｆａｃｔ）ではない。動きの継続期間、動きの数、移動した全距離、移動した全時間、中央部で移動した距離、縁部で移動した距離、中央部で移動した距離の比率、中央部で過ごした時間、縁部で過ごした時間、中央部で過ごした時間の比率、中央部で移動した距離に対する縁部で移動した距離、中央部で過ごした時間に対する縁部で過ごした時間、速度、および後退の数、および後退の期間において顕著な差異は観察されなかった。雄ＧＰＲ３９ノックアウトと野生型同腹子とを比較すると、胃排出に観察された差異と混同の可能性がある一般的活動性の上昇は観察されなかった。もしあるとすれば、小さいが然し顕著な低下した一般活動性が、野生型対照と比較して、全運動時間および全移動距離から明らかな有意の低下で雄ＧＰＲ３９ノックアウトマウスで観察された（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．００１）。中央部での移動距離に加えて、中央部での移動距離の比率および中央部に対する縁部での距離が、野生型同腹子と比較してＧＰＲ３９ノックアウトマウスで有意に低かった。後者の差異は、低下した運動活動性によるかまたは、それではなくて、不安発生性表現型を反映するのであろう。従って、ゼロ迷路試験を行った。

ゼロ迷路試験
ゼロ迷路において、ＧＰＲ３９ノックアウトマウスは不安発生性も不安緩解性表現型も示さなかった。行き止まり通路に対する開いた通路内で過ごした時間比率ならびに行き止まり通路に対する開いた通路内での移動した距離のどちらも、ＧＰＲ３９ノックアウトマウスおよび野生型対照マウスで同様であった。従って、ＧＰＲ３９ノックアウトマウスにおける胃排出の速度増加は、不安誘導性条件への変化した応答によるものではない。

呼吸速度
記録した二日間で、雄ＧＰＲ３９ノックアウトと野生型同腹子との間で呼吸速度に差異は観察されなかった。従って、胃排出で観察された差異は、雌ＧＰＲ３９ノックアウトマウスにおける呼吸速度による検査目的以外の変化ではない。呼吸商は、野生型およびＧＰＲ３９ノックアウトマウスの双方でほぼ１．０のままであり、そして熱発生を含めたＶＯ２は、どちらの遺伝子型でも変化しなかった。

血液分析
血液化学データは、６月齢の雄および雌ＧＰＲ３９^−／−マウスに対してＧＰＲ３９^＋／＋同腹子について、標準飼料食餌の自由摂取の後に１２時間の飼料絶食後で採取した。コレステロールレベル（ｍｇ／ｄｌでの平均±標準偏差）は、ＧＰＲ３９^＋／＋雄（１０７．３±３７．８）および雌（８３．５±２４．２）同腹子と比較して、雄（１４２．２±２９．０）および雌（１１８．７±１６．２）ＧＰＲ３９^−／−マウスの双方で有意に上昇した（雄および雌に対してそれぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１）。トリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄｌでの平均±標準偏差）は、ＧＰＲ３９^＋／＋雄（１２３．９±２０．８）および雌（７１．４±１２．０）同腹子と比較して、雄（１６２．５±１４．７）および雌（８４．６±７．２）ＧＰＲ３９^−／−マウスの双方で上昇が認められたが、しかし差異は有意には達しなかった。

飼料摂取
試験の開始前に飼料を自由に摂取したマウス（１７週齢、ｎ＝６）における累積飼料摂取は、野生型マウスと比較してＧＰＲ３９ノックアウトマウスで有意な差異はなかった（ｐ＝０．４７）。同じ観察結果は、より高齢のマウス（５６週齢、ｎ＝６、ｐ＝０．７８）でも得られた。反対に、絶食マウス（１９時間）において累積飼料摂取は、野生型マウスと比較してＧＰＲ３９マウスでは有意（ｐ＜０．０００１）に低かった。この効果は、高齢のマウス（５６週齢）でさらに高かった。実際に、累積飼料摂取は、６時間後に、相当する週齢の野生型マウスで比較して、ＧＰＲ３９マウスの若齢で０．６２ｇ低く、高齢では１．２５ｇ低かった。

野生型マウスから誘導された組織内のＧＰＲ３９の実時間定量逆転写ＰＣＲ 野生型マウスおよびヘテロ接合およびホモ接合ＧＰＲ３９ノックアウトマウスから誘導された４種の異なる組織内のＧＰＲ３９の実時間定量逆転写ＰＣＲ 野生型マウスに対するＧＰＲ３９ノックアウトマウスにおける胃排出の半排出時間（ｔ１／２）（Ａ）およびＴｌａｇ（Ｂ）の比較 ＧＰＲ３９ノックアウトマウス（Ｂ）に対する野生型マウス（Ａ）における糞ペレットプロパルジョンの比較。ペレットの分布は、全結腸長さの１５％の区分として数えそして各区分から排出されたペレットの数は、２０分の時間間隔で数える。 若齢（１７週齢、ｎ＝６）および高齢マウス（５６週齢、ｎ＝６）の双方について、絶食（１９時間）マウス（Ｂ）に対する非絶食マウス（Ａ）の累積飼料摂取の比較。 １１種の哺乳動物種からのプレプログレリン（ｐｒｅｐｒｏｇｈｒｅｌｉｎ）のアミノ酸配列をシグナルペプチド（イタリック体）、成熟グレリン（陰付き）、および隣接オベスタチン（下線付き）で示す。推定コンバーターゼ切断部位を表すコンセンサス塩基残基は、黒背景に白抜き文字で示す。コンセンサス配列中で、完全に保存される個別残基は、大文字で示される。個別のグレリン遺伝子のＧｅｎｅＢａｎｋ（ｇｉ）番号は、３７１８３２２４（ヒト）、３４５４１８９０（サル）、１９２２４６６４（マウス）、１１０６７３８７（ラット）、２７３５７９００（アレチネズミ）、４７５２３２３０（ブタ）、５２７８２８１３（ネコ）、５０９７８７０４（イヌ）、５２７８２８１４（ヤギ）、５７５２６２０２（ヒツジ）、および２７８０６６１３（ウシ）である。

Claims (20)

1. ＧＰＲ３９受容体タンパク質のすべてまたは一部分の使用を含んでなる胃腸の動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）および／またはコレステロール代謝を調節する化合物の同定方法。
2. ＧＰＲ３９受容体タンパク質が、配列番号２、配列番号４、上記の配列番号を有するタンパク質のスプライスバリアント、および配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも５０％、そして好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項１に記載方法。
3. ＧＰＲ３９受容体タンパク質の一一部分が、配列番号２または配列番号４のポリペプチドの少なくとも１０個のアミノ酸のフラグメントから成る、請求項１に記載方法。
4. （ｉ）ＧＰＲ３９タンパク質のすべてまたは、一部分を発現する宿主細胞を該化合物と接触させ、そして
   （ｉｉ）該受容体タンパク質への化合物の結合を検出する
   ことを含んでなる、
   胃腸の動態および／またはコレステロール代謝を調節する化合物の同定方法。
5. （ｉ）ＧＰＲ３９タンパク質のすべてまたは一部分を発現する宿主細胞からの膜調製物を該化合物と接触させ、そして
   （ｉｉ）該受容体タンパク質への化合物の結合を検出する
   ことを含んでなる、
   胃腸の動態および／またはコレステロール代謝を調節する化合物の同定方法。
6. ＧＰＲ３９受容体タンパク質への化合物の結合が、試験される化合物に直接的もしくは間接的に連合した標識の手段によるかまたは標識した競合体との競合を伴うアッセイにおいて検出される、請求項４または５に記載の方法。
7. 標識された競合体が標識されたオベスタチンである、請求項６に記載方法。
8. （ｉ）ＧＰＲ３９タンパク質受容体のすべてまたは一部分を試験される化合物と接触させ、そして
   （ｉｉ）ＧＰＲ３９受容体タンパク質の活性を測定し、ここで化合物の存在下での活性の変化が、胃腸の動態を調節する化合物の能力の指標である、
   ことを含んでなる、
   胃腸の動態およびコレステロール代謝を調節する化合物の同定方法。
9. 段階ｉ）において、化合物が、請求項２および３において定義されたようなＧＰＲ３９タンパク質のすべてまたは、一部分を発現する宿主細胞と接触させられる、請求項８に記載方法。
10. ＧＰＲ３９受容体タンパク質の活性が、細胞内メッセンジャーの調節として測定される、請求項８または９に記載の方法。
11. 細胞内第二メッセンジャーがｃＡＭＰ、カルシウムまたはレポーター遺伝子産物である、請求項１０記載の方法。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法において、
    （ｉ）配列番号２もしくは配列番号４のポリペプチドのすべてまたは一部分をコードする
    核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号１もしくは配列番号３から成る核酸配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号１もしくは配列番号３の核酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列、
    からなる群から選択される単離された核酸配列の使用。
13. 請求項１、４、５、８または９のいずれか１項に記載の方法において、請求項１２に定義されたような核酸配列を含んでなるベクターの使用。
14. 請求項１、４、５、８または９のいずれか１項に記載の方法において、請求項１２に定義されたような核酸配列または請求項１３に定義されたベクターを含んでなる宿主細胞の使用。
15. ＧＰＲ３９受容体アンタゴニストを含んでなるヒトまたは動物内で遅延胃排出および遅延結腸運動性の処置のための製薬学的組成物
16. ＧＰＲ３９アゴニストを含んでなるヒトまたは動物内で上昇した胃排出および上昇した結腸運動性の処置のための製薬学的組成物
17. 遅延胃排出および遅延結腸運動性に関連する疾患状態の処置のための薬剤の製造におけるＧＰＲ３９アンタゴニストの使用。
18. 上昇した胃排出および上昇した結腸運動性に関連する疾患状態の処置のための薬剤の製造におけるＧＰＲ３９アゴニストの使用。
19. ＧＰＲ３９受容体アゴニストを含んでなるヒトまたは動物中の上昇したコレステロールレベルの処置のための製薬学的組成物。
20. 上昇したコレステロールレベルに関連する疾患条件の処置のための薬剤の製造におけるＧＰＲ３９アゴニストの使用。

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