CN101535342A - 用于治疗肥胖的药理学陪伴分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及增强正常黑皮质素－4受体(MC4R)活性的方法，并涉及增强具有影响MC4R蛋白折叠和/或加工的突变的MC4R活性的方法。本发明提供了通过施用有效量的MC4R的药理学陪伴分子治疗患有病症的个体的方法，在所述病症中增强细胞表面MC4R的活性将有益的，例如肥胖症。本发明提供了增强MC4R活性的MC4R药理学陪伴分子。本发明进一步提供了筛选方法来鉴定增强内质网(ER)中MC4R折叠的药理学陪伴分子，以便增强细胞表面的MC4R的活性。

Description

用于治疗肥胖的药理学陪伴分子

相关优先权的引用

本申请要求2005年6月3日申请的美国专利申请号60/687,648、于2006年5月12日申请的60/799,968以及另一项于2006年6月2日申请的至今仍未指定申请号的申请的优先权，其中每项均在此被全部引用作为参考。

发明领域

本发明涉及增强正常黑皮质素-4受体(MC4R)活性的方法，并涉及增强具有影响MC4R蛋白折叠和/或加工的一个或多个突变的MC4R活性的方法。本发明提供了通过施用有效量的MC4R的药理学陪伴分子治疗患有病症的个体的方法，在所述病症中增强细胞表面MC4R的活性将有益的，例如肥胖症。本发明提供了增强MC4R活性的MC4R药理学陪伴分子。本发明进一步提供了筛选方法来鉴定增强内质网(ER)中MC4R折叠的药理学陪伴分子，以便增强细胞表面的MC4R的活性。

发明背景

肥胖

肥胖代表了最普遍的体重失调，且其为西方世界中最重要的营养失调，预计其患病率为30％至50％的中年人群。超重和肥胖的美国人已自1960年以来持续增加，并未有减缓的趋势。目前，64.5％的成年美国人(大约一亿两千七百万)被归为超重或肥胖一类。在美国，每年肥胖引起至少300,000人死亡，且患有肥胖的美国成年人的医疗保健成本达到大约1000亿美元(美国肥胖协会)。

肥胖增加了个体的发病危险，例如高血压、糖尿病(二型)、高脂血症、心脏病、高血压、中风、胆囊疾病及乳腺癌、前列腺癌、和结肠癌(见例如Nishina，P.M.等人，1994，Metab.43：554-558；Grundy，S.M.&Barnett，J.P.，1990，Dis.Mon.36：641-731)。在美国，与白种美国人相比，超重或肥胖的发病以更高的比率发生于种族/人种少数群体中，例如非洲裔美国人和西班牙裔美国人。少数民族群体中的女人和低社会经济状况的人尤其显示出受到超重和肥胖的影响。该趋势不限于成年人。大约30.3％的儿童(年龄6至11)超重，而15.3％的儿童肥胖。对于青少年(年龄12至19岁)，30.4％超重且15.5％肥胖。成年人中流行的糖尿病、高血压和其它肥胖相关的慢性疾病目前已在儿童和青年人中变得更加普遍。据报道不良的饮食习惯和不活动导致了年轻人中的肥胖增加。

另外，导致儿童肥胖的危险因素包括父母超重，或父母对其孩子的体重漠不关心，由于较大的食物分量大小而增加的能量摄入，增加的久坐的生活方式，以及减少的交通相关的活动(走路至学校或至公交车站)、具有高度愤怒/挫败的性情(其可导致父母给予其孩子额外的食物和卡路里来减少发怒)；具有唐氏综合征、母亲怀孕体重指数(BMI)、和头胎状态(增加的肥胖发病率)。

用于诊断成年人肥胖的一种工具是计算个体的BMI，其为体重对身高的测定(Garrow和Webster，International Journal of Obesity 1985；9：147-153)。25至29.9的BMI表明个体是超重的，当BMI是30或以上时是表明肥胖。对于儿童来说，BMI是性别和年龄特异的(Pietrobelli等人，Journal of Pediatrics 1998；132：204-210)。

成人期发生肥胖的危险因素包括不良饮食(高卡路里、低营养)；缺乏体力活动；工作的改变的轮班；戒烟、具有某些医学症状例如罕见的遗传疾病、以及激素失调(例如甲状腺机能减退、库兴病和多囊卵巢综合征)；某些药物治疗(类固醇和某些抗抑郁剂)；为人种或种族的少数群体(特别是女性少数民族)；低的社会经济状态；年龄(从20-55岁危险上升)，怀孕；和退休(由于改变的时间表)。

黑皮质素4受体和肥胖

已表明黑皮质素4受体(MC4R)参与体重的调节(Graham等人，Nat.Genetics 1997；17：273-4)。MC4R表达于脑中，包括下丘脑，影响食物摄入。已经发现了众多影响MC4R活性的突变并且许多与肥胖包括早发性(儿童)肥胖相关((Nijenhuis等人，J.Biol.Chem.2003，278：22939-45；Branson等人，New Eng.J.Med.2003，348：1096-1103；Gu等人，Diabetes1999，48：635-39；Farooqi等人，New Eng.J.Med 2003，348：1085-95；Tao等人，Endocrinology 2003，144：4544-51)。

当前的治疗

当前的抗肥胖药物具有有限的功效和众多的副作用(Crowley，V.E.，Yeo，G.S.& O′Rahilly，S.，Nat.Rev.Drug Discov.2002；1，276-86)。随着肥胖在世界范围内达到流行比例，在此领域内迫切需要开发足够的疗法。最近几年中，涉及调节食欲、身体能量消耗和脂肪量积累的激素和神经肽已显现作为潜在的抗肥胖药物(McMinn，J.E.，Baskin，D.G.& Schwartz，M.W.，Obes Rev 2000；1：37-46；Drazen，D.L.& Woods，S.C，Curr OpinClin Nutr Metab Care 2003；6：621-629)。然而，目前这些肽需要肠胃外给药。长期进行每日注射来控制肥胖的前景并不是非常鼓舞人心的(因为肥胖是慢性疾病)，且限制了这些药物的使用。

分子的陪伴分子稳定正确的蛋白质折叠

蛋白质合成于细胞质中，且新合成的蛋白质主要以未折叠的状态分泌至内质网(ER)的内腔。通常，蛋白质折叠受到自组装原则的控制。新合成的多肽基于它们的氨基酸序列而折叠成其天然构象(Anfinsen等人，Adv.Protein Chem.1975；29：205-300)。在体内，蛋白质折叠是复杂的，因为周围温度和高蛋白质浓度的组合刺激着聚合的过程，其中通常埋在疏水核心中的氨基酸与其相邻氨基酸非特异地相互作用。为避免此问题，通常通过称为陪伴分子的一组特定蛋白质来促进蛋白质折叠，所述陪伴分子防止初生肽链通过结合至未折叠的蛋白质而发生聚集，以便蛋白质再折叠成天然构象(Hartl，Nature 1996；381：571-580)。

内源性分子陪伴分子存在于实质上所有类型的细胞和大多数细胞区室中。一些涉及蛋白质的运输并允许细胞在胁迫例如热激和葡萄糖饥饿中存活(Gething等人，Nature 1992；355：33-45；Caplan，Trends Cell.Biol.1999；9：262-268；Lin等人，Mol.Biol.Cell.1993；4：109-1119；Bergeron等人，Trends Biochem.Sci.1994；19：124-128)。在内源性陪伴分子中，BiP(免疫球蛋白重链结合蛋白质，Grp78)是ER的最好表征的陪伴分子(Haas，Curr.Top.Microbiol.Immunol.1991；167：71-82)。像其它陪伴分子一样，贯穿于它们成熟的整个过程，BiP与许多分泌性和膜蛋白质在ER内部相互作用。当初生蛋白质折叠顺利进行时，此相互作用通常是弱而短暂的。一旦获得天然蛋白质构象，分子陪伴分子不再与蛋白质相互作用。结合至不能折叠、组装或正确糖基化的蛋白质上的BiP变得稳定，并通常通过ER相关的降解途径而导致蛋白质的降解。此过程作为ER中的“质量控制”系统，确保了只将那些正确折叠和组装的蛋白质运输出ER用于进一步成熟，而非正常折叠的蛋白质被保留进行随后的降解(Hurtley等人，Annu.Rev.Cell.Biol.1989；5：277-307)。由于热力学蛋白质折叠过程的无效率和ER质量控制系统的组合作用，仅有部分初生(非成熟)蛋白质折叠成功能构象并成功输出ER。

来源于特定酶抑制剂的药理学陪伴分子拯救突变型酶和增强野生型酶

以前曾有显示与溶酶体贮藏紊乱(LSDs)相关的酶的小分子抑制剂可拯救突变型酶的折叠和活性，并可增强野生型酶的折叠和活性(见美国专利号6,274,597；6,583,158；6,589,964；6,599,919；和6,916,829，所有均在此处被引用作为参考)。特别是，发现施用葡萄糖和半乳糖的小分子衍生物(其为与LSDs相关的突变型酶的特异竞争性抑制剂)在体外和体内有效增强了突变型酶的稳定性并增强了突变型酶的活性。在此策略之后的原始理论如下：由于突变型酶蛋白质在ER中不正确折叠(Ishii等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1996；220：812-815)，酶蛋白质在正常运输途径(ER→高尔基体→内体→溶酶体)中受到阻碍并迅速降解。因此，稳定突变型蛋白质正确折叠的化合物将用作突变型蛋白质的活性位点特异性陪伴分子，以促进其从ER质量控制系统中顺利逃脱。酶抑制剂占据催化中心，导致培养物和动物的细胞中的酶构象稳定化。将这些特异的陪伴分子称作“活性位点特异性陪伴分子(ASSCs)”，因为它们结合在酶的活性位点中。

除了拯救突变型酶，ASSCs增强了重组野生型酶的分泌和活性。ASSC促进了过表达野生型酶的折叠，所述酶否则会在ER质量控制系统中受到阻碍，因为酶的过表达和过量生产超出了ER的能力并导致蛋白质聚集和降解。因此，在折叠过程中诱导酶的稳定分子构象的化合物用作“陪伴分子”来将酶稳定于正确的构象以便离开ER。如上所述，对于酶而言，一种此类化合物出乎意料地变为酶的竞争性抑制剂。

陪伴分子增强其它蛋白质

除了LSDs，目前有大量不同的疾病被认为是“构象疾病”，其由采用非天然蛋白质构象引起，这可导致蛋白质在ER中的阻碍和蛋白质的最终降解(Kuznetsov等人，N.Engl.J.Med.1998；339：1688-1695；Thomas等人，Trends Biochem.Set 1995；20：456-459；Bychkova等人，FEBS Lett.1995；359：6-8；Brooks，FEBS Lett.1997；409：115-120)。

例如，发现小的合成化合物可稳定肿瘤抑制蛋白p53的突变形式的DNA结合结构域，因而允许蛋白质维持活性构象(Foster等人，Science 1999；286：2507-10)。已有显示，受体的合成受到小分子受体拮抗剂和配体的拯救(Morello等人，J Clin.Invest.2000；105：887-95；Petaja-Repo等人，EMBO J.2002；21：1628-37)。甚至膜通道蛋白和其它质膜运载体的药理学拯救已利用通道阻断性药物或底物而得以证实(Rajamani等人，Circulation 2002；105：2830-5；Zhou等人，J Biol.Chem.1999；274：31123-26；Loo等人，J.Biol.Chem.1997；272：709-12；Pedemonte等人，J.Clin.Inves.2005；115：2564-71)。

本领域中仍特别需要关注MC4R蛋白质功能中存在的与MC4R突变相关和不相关的缺陷。

发明概述

如此处所述，本发明提供了用于增强黑皮质素-4受体(MC4R)活性的方法，例如用于治疗受试者中的肥胖，所述受试者中编码MC4R的基因中含有折叠突变，或野生型MC4R活性的增强将是有益。

在一个实施方案中，本发明提供了一种通过将表达MC4R的细胞与有效量的药理学陪伴分子相接触用于增强胞内MC4R多肽折叠成功能构象的方法。增强MC4R的胞内折叠，导致例如下丘脑的神经元的细胞表面的增强表达，降低了食欲，并因此可用于治疗暴食紊乱例如狂食。

在一个实施方案中，MC4R多肽是野生型MC4R多肽，其例如具有如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：8所述的序列。

在另一个实施方案中，MC4R多肽是突变型MC4R多肽。在此实施方案中，突变型多肽含有一种或多种导致MC4R多肽降低的或错误的胞内折叠的突变。典型的突变如下：P78L、R165Q、R165W、I125K、C271Y、T11A、A175T、I316L、I316S、I317T、N97D、G98R、N62S、C271R、S58C、N62S、N97D、Y157S、I102S、L106P、L250Q、Y287X、P299H、S58C、密码子211位的CTCT，和密码子244位的TGAT插入。

在一个实施方案中，药理学陪伴分子是MC4R拮抗剂。在另一实施方案中，药理学陪伴分子是MC4R激动剂。在其它的实施方案中，药理学陪伴分子是MC4R部分激动剂和/或逆激动剂。

本发明还提供了用于增强MC4R多肽在细胞表面表达的方法。该方法包括将表达MC4R的细胞与有效量的药理学陪伴分子相接触。本发明的该实施方案涉及用于增强MC4R多肽胞内折叠的方法的野生型MC4R多肽和突变型MC4R多肽及上述药理学陪伴分子。

本发明还提供了用于鉴定MC4R多肽的陪伴分子的筛选方法，其包括将测试化合物与包含表达MC4R多肽的细胞的反应混合物相接触、检测在测试化合物存在下反应混合物中的MC4R多肽的稳定性、活性和/或细胞表面定位、并比较存在与不存在测试化合物情况下MC4R多肽的稳定性、活性和/或细胞表面定位的不同，其中测试化合物存在下相对于测试化合物不存在检测到增强的稳定性、活性和/或细胞表面定位，表明测试化合物是MC4R多肽的陪伴分子。

在此筛选方法的一个实施方案中，MC4R多肽包含选自SEQ ID NOs：2、4、6和8的氨基酸序列。

在此筛选方法的另一实施方案中，MC4R多肽包含与MC4R多肽的错折叠相关的突变。在特定的实施方案中，错折叠突变是下列改变中的一种或多种：P78L、R165Q或R165W、I125K、C271Y、T11A、A175T、I316L、I316S、I317T、N97D、G98R、N62S、C271R、S58C、N62S、N97D、Y157S、I102S、L106P、L250Q、Y287X、P299H、S58C、密码子211位的CTCT，或密码子244位的TGAT插入。

在一个实施方案中，反应混合物是基于细胞的。在另一实施方案中，反应混合物是无细胞的。

在一个实施方案中，筛选方法进一步包括检测例如在细胞表面上MC4R多肽的活性。在另一实施方案中，通过cAMP激活来检测活性。

通过参考详细描述和实施例将进一步理解本发明。

附图简述

图1.大鼠和人黑皮质素-4受体的激动剂，如Sebhat，2002，J MedChem，45，4589-4593所报道的(化合物1)。

图2.人MC4R的激动剂，如Richardson，2004，J Med Chem 47，744-755所报道的(化合物2)。

图3.化合物1的合成方案。

图4.化合物2的合成方案。

图5.MC4R的拮抗剂，如Arasasingham，2003，J Med Chem 46，9-11所报道的(化合物3)。

图6.MC4R的拮抗剂(化合物4)；WO 02/062766中利用闪烁迫近分析法报道了该化合物的生物活性。

图7.化合物3的合成方案。

图8.化合物4的合成方案。

图9.在Pedemonte等人，J.Clin.Inves.2005；115：2564-71中所述的二氨基噻唑化合物(化合物5)。

图10A-D.下文中所述的化合物6-25。

图11.用配体激动剂以及用和不用拮抗剂陪伴分子处理的MC4R突变体的MC4R信号测定法。

图12.来自正常健康志愿者的白细胞中的平均α-半乳糖苷酶A活性，所述志愿者接受50mg1-脱氧半乳糖基野尻霉素(deoxygalactonojirimycin)(DGJ)一日两次(三角形)、150mg DGJ一日两次(正方形)、安慰剂(空心圆形)。

图13.基于化合物1、2、6、7和12-17的化合物类的结构。

图14.基于化合物3、9、10、11和21的化合物类的结构。

图15.基于化合物4、8、24和25的化合物类的结构。

图16.基于化合物18-20的化合物类的结构。

发明详述

本发明涉及下述发现，即发现小分子可拯救突变型和野生型MC4R多肽的蛋白质折叠和加工，并增强神经元的细胞表面上蛋白质的稳定性，从而，降低饥饿和暴食。药理学陪伴分子特异结合至MC4R蛋白质上并诱导或者稳定突变型或野生型MC4R的功能构象。因此本发明允许突变型MC4R的特异拯救，以及野生型MC4R在细胞表面的增强表达。因此，MC4R的药理学陪伴分子可用于治疗紊乱例如超重或肥胖的状况，其中MC4R的拯救或增强的稳定或活性是所希望的。

本发明部分是基于下述发现，即对人施用药理学陪伴分子导致了野生型蛋白质的活性水平有意义的增强。该发现结合对药理学陪伴分子促进ER中正确的蛋白质折叠、导致正确的蛋白质运输和显著增加的蛋白质活性的能力的理解，有利地提供了能获得充分的蛋白质活性以逆转或改善尤其人受试者中疾病、紊乱或状况的能力。该现象对由特定的药理学陪伴分子特异结合的蛋白质是高度特异的，与利用称为“化学陪伴分子”的通常操控所有蛋白质表达增加的化合物的方法大不相同。

本发明依据某些实验结果：药理学陪伴分子在较低剂量下将人体内的内源性野生型蛋白质活性增加至大约正常活性的120％、正常活性的130％、和正常活性的145％，在较高剂量下施用药理学陪伴分子后增加至正常活性的150％和185％(见实施例7和图12)。体内此增加水平是不能从利用组织培养的细胞所获得的结果来预期的，所述细胞是暴露于药理学陪伴分子的。例如，美国专利号6,274,597描述了在体外用一种药理学陪伴分子脱氧半乳糖基野尻霉素(DGJ)培养的正常淋巴母细胞中α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)活性增加30％。假设期望的是，预期生理学清除过程将降低药理学陪伴分子对体内正常蛋白的影响，则药理学陪伴分子导致野生型蛋白质活性的显著增加是意料之外的。美国专利号6,274,597的实施例10描述了药理学陪伴分子处理一周的转基因小鼠中突变型酶的活性增加。然而，这些实验涉及所拯救蛋白质的突变形式而不是野生型，并是在小鼠中进行的，因此该结果对于人野生型蛋白质中所观察的结果并不是预见性或提示性的。

无任何基础可期望药理学陪伴分子能够将体内野生型蛋白质的活性水平增加至少20-25％，即，至少为正常的1.2倍或120％、或增加30％(正常的1.3倍、130％)、40％(正常的1.4倍、140％)，且尤其不能增加至少约50％(正常的1.5倍、150％)。然而，如此处所举例的，对受试者施用DGJ导致了α-Gal A的剂量依赖型增加。该特别结果来自于滴定药理学陪伴分子，其已经根据拯救蛋白质的突变形式、获得活性或野生型蛋白质公开的增加的现有技术而得以证实。因此，本发明提供了滴定药理学陪伴分子的剂量，所述分子被发现可以确定的量来拯救突变型蛋白质的活性以增加野生型蛋白质的活性水平。

定义

本说明书中所用的术语通常具有它们在本领域中的一般意义，在本发明的上下文内以及在每个术语所使用的特定上下文中。某些术语在下面进行讨论，或在说明书的其它地方，来在本发明的组合物和方法和如何制造和使用它们向实践者提供额外的指导。

如此处所用的，术语“药理学陪伴分子”或有时“特异药理学陪伴分子”(“SPC”)，指的是特异结合至MC4R并具有一种或多种下列效果的分子：(i)增强蛋白质的稳定分子构象的形成；(ii)增强蛋白质从ER至其它细胞位置、优选地天然细胞位置的正确运输，即阻止蛋白质的ER相关降解；(iii)阻止构象不稳定的、即错折叠蛋白质的聚集；(iv)恢复或增强蛋白质的至少部分野生型功能、稳定性和/或活性；和/或(v)改善包含MC4R的细胞的表型或功能。因此，MC4R的药理学陪伴分子是结合至MC4R上，导致MC4R的正确折叠、运输、非聚集和活性的分子。如此处所用的，此术语不是指内源性陪伴分子，例如BiP，或具有证实了针对多种蛋白的非特异陪伴分子活性的非特异性试剂例如甘油、DMSO或重水，即化学陪伴分子(见Welch等人，Cell Stress and Chaperones 1996；1(2)：109-115；Welch等人，Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997；29(5)：491-502；美国专利号5,900,360；美国专利号6,270,954；和美国专利号6,541,195)。其包括特异性结合分子，例如特异的药理学陪伴分子(上述的)、抑制剂或拮抗剂、和激动剂。

如此处所用的，术语“特异结合”指的是药理学陪伴分子与MC4R的相互作用，特别地，与MC4R的直接参与接触药理学陪伴分子的氨基酸残基相互作用。药理学陪伴分子特异地结合至靶蛋白质，此处为MC4R，来对MC4R而不是对相关或不相关蛋白质的一般群体发挥陪伴分子的作用。与任何给定MC4R药理学陪伴分子相互作用的MC4R氨基酸残基，可以是或可以不是在MC4R配体结合结构域，即结合天然配体MSH的结构域、或者任何其它MC4R“活性位点”例如G蛋白结合结构域的内部。可通过常规的结合试验或通过结构研究例如共结晶、NMR等来评估特异结合。MC4R的MSH配体结合结构域中氨基酸的例子包括但不限于Phe284和Tyr268(利用例如SEQ ID NO：2作为参考序列)。

在非限制性实施方案中，药理学陪伴分子是MC4R的抑制剂或拮抗剂。在另一非限制性实施方案中，药理学陪伴分子是MC4R的激动剂。在另一实施方案中，药理学陪伴分子是混合的激动剂/拮抗剂。如此处所用的，术语“拮抗剂”指结合至蛋白质并部分或全部阻断、抑制、降低或中和MC4R活性的任何分子。术语“激动剂”指的是结合至蛋白质并至少部分增加、增强、恢复或模仿MC4R活性的任何分子。如下所述，此类分子对于MC4R是熟知的。

如此处所述的，术语“增强MC4R构象稳定性”或“提高MC4R构象稳定性”指的是相对于未与MC4R特异的药理学陪伴分子相接触的细胞(优选地为同样的细胞类型或相同的细胞，例如在早期)中的MC4R而言，提高与MC4R特异的药理学陪伴分子相接触的细胞中采用功能构象的MC4R的量或比例。在一个实施方案中，细胞表达突变型MC4R多核苷酸，其编码例如构象突变型MC4R的多肽。

如此处所述的，术语“增强MC4R运输”或“提高MC4R运输”指的是相对于未与MC4R特异的药理学陪伴分子相接触的细胞(优选地为同样的细胞类型或相同的细胞，例如在早期)中的MC4R运输效率而言，提高与MC4R特异的药理学陪伴分子相接触的细胞中MC4R向质膜的运输效率。

如此处所述的，术语“增强MC4R活性”或“提高MC4R活性”指的是相对于未与MC4R特异的药理学陪伴分子相接触的细胞(优选地为同样的细胞类型或相同的细胞，例如在早期)中的MC4R活性而言，提高与MC4R特异的药理学陪伴分子相接触的细胞中如此处所述的MC4R活性。

如此处所述的，术语“增强MC4R水平”或“提高MC4R水平”指的是相对于未与MC4R特异的药理学陪伴分子相接触的细胞(优选地为同样的细胞类型或相同的细胞，例如在早期)中的MC4R水平而言，提高与MC4R特异的药理学陪伴分子相接触的细胞中MC4R水平。

术语“稳定正确的构象”指的是MC4R药理学陪伴分子诱导或稳定突变的MC4R蛋白质构象的能力，所述构象功能上与野生型MC4R蛋白质的构象相同。术语“功能上相同”意味着尽管构象中可能存在微小差异(几乎所有蛋白质在其生理状态下均呈现出一定的构象灵活性)，但是构象灵活性并不导致(1)蛋白质聚集，(2)通过内质网相关降解途径而消失，(3)蛋白质功能的损伤，例如结合配体和/或激活腺苷酸环化酶活性的能力，和/或(4)在细胞内部的不适当运输，例如向质膜的定位，达到比野生型蛋白质更高或更低的程度。

术语“稳定的分子构象”指的是由药理学分子诱导的蛋白质即MC4R的构象，其在细胞中提供了至少部分野生型功能。例如，突变型MC4R的稳定分子构象将为下述一种，其中MC4R如同野生型MC4R一样从ER中脱离并被运输至细胞膜，而不是被错折叠并被降解。另外，突变的MC4R的稳定分子构象也可拥有全部或部分MC4R活性，例如腺苷酸环化酶激活活性，其用于经其同源生理学G蛋白增强cAMP产生。然而，稳定分子构象具有野生型蛋白质的所有功能属性并非是必需的。

术语“MC4R活性”指的是细胞中野生型MC4R的正常生理学功能。例如，一旦被激动剂结合，MC4R通过与G-蛋白Gαs相互作用而发出信号并激活腺苷酸环化酶(见例如，VanLeeuwen等人，J Biol.Chem.2003；18：15935-40)。这导致cAMP的细胞内积累和蛋白激酶A(PKA)的激活。可以通过本领域已知的任一种方法测试此类功能性。例如，α-、β-、或γ-MSH配体、或者¹²⁵I-[Nle⁴，D-Phe⁷]α-MSH激动剂与MC4R的结合测定法，或使用腺苷酸环化酶激活测定法，或者萤光素酶报道基因测定法可以用于测定细胞内cAMP的增加。环AMP积累测定法是本领域公知的(见例如，VanLeeuwen等人，J Biol.Chem.2003；18：15935-40)。

“MC4R”指的是由具有如SEQ ID NO：1(人；GenBank检索号BC069172)；3(人；GenBank检索号NM_005912)；5(大鼠；GenBank检索号NM_013099)；或7(鼠；GenBank检索号NM_016977)中任意一种所描述的序列的核苷酸序列所编码的多肽。

“MC4R多肽”也指的是如SEQ ID NOs：2(人；GenBank检索号AAI01803)；4(人；GenBank检索号NM_005912)；6(大鼠；GenBank检索号NM__013099)；或8(鼠；GenBank检索号AF201662)中所描述的氨基酸序列，以及任何其它氨基酸序列，其编码具有与SEQ ID NOs：2、4、6或8的任意一种相同的功能和配体结合亲和性的MC4R多肽。

术语“野生型MC4R”指的是编码MC4R的核苷酸(SEQ ID NOs：1、3、5和7)序列，和由上述核苷酸序列(人MC4R-GenBank检索号AAI01803；人MC4R-GenBank检索号NM_005912；大鼠MC4R-GenBank检索号NM_013099；和小鼠MC4R-GenBank检索号AF201662)所编码的多肽序列(SEQ ID NOs：2、4、6和8)，和任何编码MC4R多肽的其它核苷酸序列(与上述多肽序列具有相同的功能特性和结合亲和力)，例如正常个体中的等位基因变体，其具有在ER中、实现功能构象、实现细胞内部正确的定位并呈现野生型活性的能力(例如，cAMP积聚的MC4R刺激)。

如此处所用的术语“突变型MC4R”指的是从含有遗传突变的基因翻译而来的MC4R多肽，所述突变导致改变的MC4R氨基酸序列。在一个实施方案中，突变导致当与野生型MC4R相比时MC4R蛋白质不能获得在通常存在于ER中的情况下的天然构象，或者与野生型MC4R相比显示出下降的稳定性或活性。此类型的突变在此称为“构象突变”，且将具有此种突变的蛋白质称为“构象突变体”。不能获得此构象则导致MC4R蛋白质降解或聚集，而不是通过蛋白质运输系统中的正常途径运输至其细胞中的天然位置或细胞外环境中。在一些实施方案中，突变可发生于编码MC4R的基因的非编码部分，其导致蛋白质较低效率的表达，例如影响转录效率、剪接效率、mRNA稳定性等的突变。通过提高MC4R野生型以及构象突变变体的表达水平，施用MC4R药理学陪伴分子可改善源于此种低效蛋白质表达的不足。

有代表性的突变(利用SEQ ID NO：2的多肽作为参考)包括P78L、R165Q和R165W。其它突变包括I125K、C271Y、T11A、A175T、I316L、I316S、I317T、N97D、G98R、N62S、C271R、S58C、N62S、N97D、Y157S、I102S、L106P、L250Q、Y287X、P299H、S58C，密码子211位的CTCT，和密码子244位的TGAT插入。另外，其它MC4R突变(再次用SEQ IDNO：2作参考)包括下文表1中所述的那些。

某些测试可评价蛋白质的特性，其能或不能与其实际的体内活性相对应，但仍然是蛋白质功能性的合适替代者，且此类测试中的野生型行为阐明了支持本发明的蛋白质折叠拯救或增强技术的证据。根据本发明的一种此类活性是功能MC4R从内质网至细胞膜的合适运输。

术语“内源性表达”和“内源地表达”指的是个体的细胞中MC4R的正常生理学表达，所述个体不具有或怀疑具有与MC4R缺失相关的疾病或紊乱、显性失活突变体的过表达、或其它缺陷例如肥胖，例如MC4R核酸或多肽序列的突变，其改变，例如抑制其表达、活性或稳定性。此术语还指细胞或细胞类型中MC4R的表达，其中它通常表达于健康个体中，且不包括细胞或细胞类型例如肿瘤细胞中的MC4R表达，其中MC4R不表达于健康个体中。

如此处所用的，术语“运输效率”指的是将突变型蛋白质运输出内质网至其细胞内的天然位置、细胞膜或细胞外环境的能力。

术语“治疗有效剂量”和“有效量”指的是这样的量，其足以增强蛋白质在ER中加工(允许功能构象)，并不抑制已经表达于适当细胞位置的蛋白质(在拮抗剂的情况下)，或者不诱导蛋白质从合适的细胞位置进行配体介导的受体内化(在激动剂的情况下)，并增强靶蛋白质的活性，因此导致受试者中的治疗反应。治疗反应可为使用者(如临床医生)将认为是对治疗的有效反应的任何反应，包括前述症状和替代的临床标志物。因此，治疗反应将通常为改善或抑制例如肥胖或狂食等疾病或紊乱的一种或多种症状。

术语“药学上可接受的”指的是分子实体和组合物，其为生理学上可耐受的并且当施用于人时通常不产生不利反应。优选地，如此处所述，术语“药学上可接受的”意味着用于动物且更特别用于人的经联邦或州政府的管理机构批准的或者列于美国药典或其它通常被认可的药典。术语“载体”指的是化合物与之一起施用的稀释剂、辅剂、赋形剂或赋形物。此类药物载体可为无菌液体例如水和油。水或盐水溶液和葡萄糖和甘油水溶液优选用作载体，特别用于注射溶液。合适的药物载体在E.W.Martin，第18版或其它版本的＂Remington′s Pharmaceutical Sciences＂有所描述。

术语“大约”和“近似”将通常指由于测量的性质或精确度，对于所测定量的可接受的误差程度。通常的典型的误差程度是在给定数值或数值范围的20％内，优选地10％内，且更优选地5％内。另外，特别是在生物系统中，术语“大约”和“近似”可意味着在在给定数值一个数量级内的数值，优选地5倍之内，且更优选地在2倍之内。除非另有说明，此处所给出的数字量是近似的，意味着当并未明确表达时术语“大约”或“近似”是可推断的。

如此处所用的，术语“分离的”意味着将参考材料从通常发现其的环境中取出。因此，分离的生物材料可为无细胞成分的，即发现或产生物质的细胞中的成分。在核酸分子的情况下，分离的核酸包括PCR产物，凝胶上的mRNA条带、cDNA、或限制性片段。在另一实施方案中，分离的核酸优选地从发现其的染色体中切离，且更优选地不再与非调节性的、非编码区域或其它基因相连接，所述基因当在染色体中发现时定位于该分离的核酸分子所包含的基因的上游或下游。在另一实施方案中，分离的核酸缺少一个或多个内含子。分离的核酸包括插入质粒、粘粒、人工染色体等的序列。因此，在特定的实施例中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白质可与其它蛋白质或核酸或者两者相结合，其与它们在细胞中结合，或与细胞膜结合(如果为膜相关蛋白质的话)。分离的细胞器、细胞或组织是从生物体中发现它们的解剖位点中分离的。分离的材料可为但不必需是纯化的。

此处所用的术语“纯化”涉及材料，例如MC4R核酸或多肽，其已在降低或消除了不相关材料即污染物的情况下得以分离。例如，纯化的蛋白质为优选地基本无其它在细胞中与结合的蛋白质或核酸。如此处所用的，术语“基本上无”是在材料的分析测试的上下文中可操作使用的。优选地，基本上无污染物的经纯化材料为至少50％纯；更优选地，至少90％纯，且更优选地至少99％纯。纯度可通过常规方法来评估，例如层析法、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定和其它本领域公知的方法。

术语“Me”指甲基，“Et”指乙基，“Ac”指乙酰基。

术语“卤素”，除另有说明外，指氟、氯、溴或碘。优选的卤素基团是氟、氯和溴。

术语“烷基”，除另有说明外，包括具有直链、支链或环状部分的饱和单价烃基(包括稠合的和桥接的二环以及螺环部分)，或前述部分的组合。对于具有环状部分的烷基而言，基团必须具有至少三个碳原子。

术语“环烷基”，除另有说明外，包括环状烷基部分，其中烷基如上所述。术语“环烷基”的使用将不能解释为将术语“烷基”限制至非环状部分。

术语“烯基”，除另有说明外，包括具有至少一个碳碳双键的烷基部分，其中烷基如上定义且包括所述烯基部分的E和Z异构体。

术语“炔基”，除另有说明外，包括具有至少一个碳碳三键的烷基部分，其中烷基如上定义。

术语“烷氧基”，除另有说明外，包括O-烷基，其中烷基如上定义。

术语“芳基”，除另有说明外，包括通过除去一个氢而来源于芳香烃的有机基，例如苯基或萘基。

术语“4至10元杂环”，除另有说明外，包括芳香的和非芳香杂环基，其含有一至四个杂原子，每个均选自O，S和N，其中每个杂环基团在其环系统中具有4至10个原子，条件是所述基团的环不含有两个相邻的O或S原子。非芳香杂环基包括在其环系统中仅具有4个原子的基团，但芳香杂环基必须在其环系统中具有至少5个原子。杂环基包括苯稠合的环系统。4元杂环基的例子是氮杂环丁烷基(衍生自氮杂环丁烷)。5元杂环基的例子是噻唑基，而10元杂环基的例子是喹啉基。非芳香杂环基的例子有吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、哌啶子基、吗啉代、硫代吗啉代、噻噁烷基、哌嗪基、高哌嗪基(homopiperazinyl)、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基(homopiperidinyl)、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、氧氮杂基、二氮杂基、硫氮杂基、1，2，3，6-四氢吡啶基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂环己烷基、1，3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂二环[3.1.0]己基、3-氮杂二环[4.1.0]庚基、氮杂二环[2.2.2]己基、3H-吲哚基和喹嗪基。芳香杂环基的例子有吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、2，3-二氮杂萘基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并苯硫基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、1，5-二氮杂萘基和呋喃并吡啶基。此定义的范围内还包括螺部分，包括1-氧杂-6-氮杂-螺[2.5]辛-6-基。前述基团，因衍生自上面所列的基团，在其可能的地方可为C连接的或N连接的。例如，衍生自吡咯的基团可为吡咯-1-基(N连接的)或吡咯-3-基(C连接的)。另外，衍生自咪唑的基团可为咪唑-1-基(N连接的)或咪唑-3-基(C连接的)。

短语“药学上可接受的盐”，除另有说明外，包括酸基或碱基的盐，其可存在于本发明方法所用的化合物中。本质为碱性的化合物能够与多种无机和有机酸形成很多种盐。能够用于制备此类碱性化合物的药学上可接受的酸加成盐的是那些形成非毒性酸加成盐的化合物，所述酸加成盐即含有药学上可接受的阴离子的盐，例如乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸钾、柠檬酸盐、二氢氯化物、乙二胺四乙酸盐、dislyate、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、乙基琥珀酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、羟乙酰基对氨苯基胂酸盐、hexylresorcinate、hydrabamine、氢溴酸盐、盐酸盐、碘化物、isothionate、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、扑姆酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱盐、甲苯磺酸盐、triethiodode和戊酸盐。由于单个化合物可能包括多于一个酸性或碱性部分，此化合物可在单一化合物中包括单、双或三盐。

黑皮质素4受体

黑皮质素(MC)受体是七次跨膜结构域G蛋白偶联受体超家族中的成员，其激活第二信使环AMP(cAMP)的产生。目前共分离了五种MC受体：MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R。MC2R是促肾上腺皮质激素(ACTH)的受体。人MC4R的长度为332个氨基酸。

已有暗示，黑皮质素4受体(MC4R)涉及体重的调节(Graham等人，Nat.Genetics 1997；17：273-4)。MC4R表达于脑中，包括下丘脑，其影响食物摄取。经MC4R的信号刺激减食欲的神经通路。MC4R无效小鼠发生了带有高血糖症和高胰岛素血症的迟发性肥胖。缺失一个MC4R等位基因(杂合体)的小鼠具有介于野生型和纯合无效小鼠之间的中等体重。在人类中，MC4R缺陷是肥胖最普遍的单基因形式(Farooqi等人，New Engl.J.Med.2003；348：1085-95)。过表达内源性MC4R拮抗剂——野灰蛋白相关蛋白质(AgRP)的转基因小鼠与非转基因同窝小鼠相比，显示出增加的体重增长、食物消耗和体长(Oilman等人，Science 1997；278：135-37)。

大多数发现于肥胖个体的大量突变已在人MC4R基因中得以鉴定，包括移码、无义和错义突变(Nijenhuis等人，J Biol.Chem.2003；278：22939-45)。至少两个小组的研究人员已经确认，MC4R在大约5％的肥胖个体中是突变的。证实具有饮食过量和高胰岛素血症的MC4R突变的载体，具有高出平均水平的骨矿物质密度，以及比与BMI匹配的对照受试者更快速的线性生长。Farooqi等人也已发现，突变型MC4R受体的信号特性与肥胖的严重性相关。

目前几位作者已综述了我们对MC4R在早发性肥胖中的遗传学的理解的最近进展(见例如Farooqi IS，O′Rahilly S，Int J Obes(Lond)，2005Oct，29(10)，1149-52；Govaerts C，Srinivasan S，Shapiro A，Zhang S，Picard F，Clement K，Lubrano-Berthelier C，Vaisse C，Peptides，2005 Oct，26(10)，1909-19；Tao YX，Mol Cell Endocrinol，2005 Jul 15，239(1-2)，1-14；Farooqi IS，O′Rahilly S，Annu Rev Med，2005，56，443-58)。例如，在患有严重早发性肥胖的一名病人中，发现MC4R突变的常染色体显性模式的遗传是由于受体二聚化作用引起的显性失活效应(Biebermann H，Krude H，Eisner A，Chubanov V，Gudermann T，Gruters A，Diabetes，2003 Dec，52(12)，2984-8)。

预期带有一些突变的MC4R会有功能的缺失，因为目前所鉴定的大多数突变是非保守氨基酸取代。这已在发现于肥胖个体中的几种MC4Rs中得以证实。另外，发现大量突变与MC4R在细胞表面的降低表达有关(Gu等人，Diabetes 1999，48：635-39；Nijenhuis等人，同上)。例如，在仅发现于肥胖个体的11个MC4R错义突变的筛选中，所述错义突变位于MC4R的N末端区域之外(其不涉及配体结合)，与野生型MC4R相比，十个显示出在细胞表面上与α-促黑素细胞激素(α-MSH)配体¹²⁵I-[Nle⁴，D-Phe⁷]α-MSH较低的特异结合。Nijenhuis等人，同上，22941页。确定降低的特异结合反映了较低的细胞表面表达，因为突变体中对于配体的亲和力大部分与野生型受体相似，如下面表1中所述的(以nM+/-S.E.表示IC₅₀值)。

表1

Nijenhuis等人，J.Biol.Chem.2003；278：22939-22945，22942页。

根据饱和结合实验，甚至两种具有更高结合亲和力的突变体(L250Q和T112M)证实了较低的细胞表面表达。另外，α-MSH结合时，所有突变体证实了降低的最大效应(如利用腺苷酸环化酶试验所测定的受体激活)。特别是，Nijenhuis等人从免疫细胞化学数据推断出P78L、R165Q和R165W突变体被表达但保留在细胞内。

另外的研究鉴定下列MC4R突变：I125K；C271Y；T11A(A434G)；A175T；I316L；N97D；N62S和C271R(Farooqi等人，New Eng.J.Med.2003；348；1085-95)。在这些突变中，所有均显示出降低的活性或无活性，在体外利用萤光素酶报告基因测定针对于cAMP的反应而得以评估。然而，此小组发现三种变体V103I；I251L和T112M对MC4R信号传递无影响。与儿童即早发性肥胖相关的突变是S58C、N62S、Y157S、C271Y、P78L、G98R，其导致降低的(S58C、N62S、Y157S、C271Y)或者无(P78L、G98R)配体结合，也证实了在[Nle⁴，D-Phe⁷]α-MSH-刺激的cAMP生产中成比例的受损(Tao等人，Endocrinology 2003；144(10)：4544-51)。

最终研究鉴定了MC4R中的下列突变：I251L(A1144C)；F51L(T544C)；M200V(A991G)；T5T(C408T)(Branson等人，New Eng.J.Med.2003；348：1096-1103)。

除了肥胖，MC4R还涉及狂食。根据Diagnostic and Statistical Manualof Mental Disorders-Text Revision(DSM-IV-TRTM，第四版)，狂食包括食用异常大量的食物并感受到对这种行为缺乏控制的重复发作事件。在一项对469名白人肥胖受试者的研究中，发现尽管只有小比例的肥胖患者被诊断为患有狂食，但所有带有MC4R突变的肥胖受试者均被诊断为患有狂食(Branson等人，同上)。

MC4R结构和配体结合

内源性黑皮质素激动剂含有序列His-Phe-Arg-Trp，其对于黑皮质素受体分子识别和刺激是重要的。在一项研究中通过使用大量的配体确定了MC4R配体结合的分子决定子(Nickolls等人，Pharmacol Exp Ther 2003；304(3)：1217-27)。利用受体的分子建模鉴定出跨膜(TM)结构域7(TM7)中的Phe284为配体相互作用的潜在位点。Phe284向丙氨酸的突变将含有L-Phe的肽的结合亲和力和潜能降低了71倍，但并未影响含有D-Phe的线性肽的结合。此数据与α-MSH的Phe7与Phe284之间的疏水相互作用是一致的。第二，检测了TM3中自然发生突变(I137T)的影响，其如上所述与肥胖相关。该突变降低了环状刚性肽而不是柔性肽的亲和力和潜能，与突变对受体三级结构的间接影响相一致。支持配体对MC4R而不是对MC3R的选择性的残基也得以确定。MC4R的Ile125(TM3)向MC3R(苯丙氨酸)的等效残基的突变选择性地降低了MC4R选择性配体的亲和力和潜能。通过互逆的MC3R突变F157I可反映出该效应。该效应的大小表明此基因座不是最重要的。然而，曾有建议，异亮氨酸/苯丙氨酸突变可影响Asp122的方向，这已被鉴定为配体结合亲和力的主要决定子。

其他人已确定，Tyr268是与内源性MC4R拮抗剂野灰蛋白选择性相互作用以及对另一MC4R激动剂的选择性所需的(Oosterom等人J Biol.Chem.2001；276(2)：931-6)。野灰蛋白通常表达于皮肤中，且为MC4R的天然拮抗剂(Kiefer等人，Biochemistry 1997；36：2084-2090)。

MC4R激动剂和拮抗剂

根据本发明，MC4R激动剂和拮抗剂包括如此处图1-8和10中所述的及下面实施例3和4中进一步描述的化合物。

MC4R的天然激动剂(配体)包括α-MSH、ACTH、β-MSH和γ-MSH(以亲和力从高到低的顺序)。其它MC4R配体，包括激动剂和拮抗剂，目前已有所描述的主要是肽(美国专利6,060,589)和环状肽类似物(美国专利6,613,874，Mazur等人)。也已设计了一系列MC4R肽激动剂(Sun等人，Bioorg Med Chem 2004；12(10)：2671-7)。另外，Nijenhuis等人.(Peptides 2003；24(2)：271-80)描述了对MC4R为选择性的黑皮质素拮抗剂化合物的开发与评估。发现一种称作Ac-Nle-Gly-Lys-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH(2)(SEQ ID NO：9)的化合物是最选择性的MC4R化合物，其对MC4R的选择性分别是对MC3R和MC5R的90和110倍。随后的修饰获得了化合物Ac-Nle-Gly-Lys-D-Nal(2)-Arg-Trp-Gly-NH(2)(SEQ ID NO：10)，一种具有34倍MC4R/MC3R和109倍MC4R/MC5R选择性的选择性MC4R拮抗剂。两种化合物在体内均为有活性的，且穿过血脑屏障。此外，美国专利号6,054,556和5,731,408描述了MC4R的激动剂和拮抗剂家族，其为具有环形结构的内酰胺七肽。

其它高亲和力MC4R拮抗剂在Grieco等人(J Med Chem 2002；24：5287-94)中有所描述。这些环形拮抗剂是基于已知的高亲和力拮抗剂SHU9119(Ac-Nle4-[Asp5-His6-DNal(2′)7-Arg8-Trp9-Lys10]-NH(2))(SEQID NO：11)来设计的。在第6位处(His)用非常规氨基酸对SHU9119类似物进行了修饰。在第6位处含有Che取代的一种化合物是高亲和力的MC4R拮抗剂(IC₅₀＝0.48nM)，具有超过MC3R 100倍的选择性。另一在第6位处含有Cpe取代的化合物也是一种高亲和力的MC4R拮抗剂(IC₅₀＝0.51nM)，具有超过MC3R 200倍的选择性。使用分子建模对在第6位用构象限制性氨基酸进行了修饰的环状肽检查了构象性质。另见，Peptides2006；27(2)：472-81。

Dyck等人的美国公布的专利申请2003/0158209和Briner等人的2004/082590已公开了几种非肽的MC4R配体。另外，Renhowe等人的美国专利号6,638,927描述了小的、低分子量胍基苯酰胺类作为特异的MC4R激动剂。Richardson等人已描述了新的芳基哌嗪，其为MC4R的激动剂(JMed Chem 2004；47(3)：744-55)。Yu等人的美国专利号6,979,691和Magurie的6,699,873也描述了选择性结合MC4R的非肽化合物。

Basu等人的WO 99/55679公开了异喹啉衍生物，小分子非肽化合物，其显示出对MC1R和MC4R的低(微摩尔)亲和力，降低由花生四烯酸引起的皮肤炎症、及减少体重和食物摄取。

Nargund等人的WO 99/64002还公开了螺哌啶衍生物作为黑皮质素受体激动剂，用于治疗疾病和紊乱例如肥胖、糖尿病和性功能障碍。

已描述了其它非肽MC4R拮抗剂。因此，Eisinger的美国公布的专利申请2003/0176425和2003/0162819分别公开了新的1，2，4-噻二唑和1，2，4-噻二唑鎓衍生物，作为MC4R拮抗剂或激动剂。这些申请还公开了这些化合物治疗肥胖的用途。

已经表明黑皮质素受体的一些拮抗剂是竞争性拮抗剂，即竞争结合配体。例如，黑皮质素拮抗剂黑灰信号蛋白(ASIP)表明具有与在hMCIR观察到的竞争性拮抗相一致的特征，和在其他受体观察到的更复杂的行为(Yang等人，Mol.Endocrinology 1997；11(3)：274-280)。类似地，MC2R的天然配体ACTH不能胜过α、β或γ-MSH的结合(Abdel-Malek等人，Cell.Mol.Life Sci.2001；48：434-41。

其它MC4R结合化合物在下列中有所描述：Bednarek和Fong，ExpOpn Ther Patents 2004；14：327-36；Ujjainwalla等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2005；15(18)：4023-8；WO 03/07949(Merck)；WO 03/61660(Eli Lilly)；WO 03/09847(Amgen)；WO 03/09850(Amgen)；WO 03/31410(NeurocrineBiosciences)；WO 03/94918(Neurocrine Biosciences)；WO 03/68738(Neurocrine Biosciences)；WO 03/92690(Procter and Gamble)；WO03/93234(Procter and Gamble)；WO 03/72056(Chiron)；WO 03/66597(Chiron)；WO 03/66587(Chiron)；WO 03/66587(Chiron)；WO 02/67869(Merck)；WO 02/68387(Merck)；WO 02/00259(Taisho)；WO 02/92566(Taisho)；Tran等人，Bioorg Med Chem Lett.2006[epub ahead of print]；Pontillo等人，Bioorg Med Chem Lett.2005；15(23)：5237-40；Pontillo等人，Bioorg Med Chem Lett.2005；15(10)：2541-6；Pontillo等人，Bioorg MedChem Lett.2004；14(22)：5605-9；Cheung等人，Bioorg Med Chem Lett.2005；15(24)：5504-8；Yan等人，Bioorg Med Chem Lett.2004；15(20)：4611-4；Hsiung等人，Endocrinology.2005 Dec；146(12)：5257-66；和Todorovic等人，Peptides.2005 Oct；26(10)：2026-36。

预期用于目前请求保护的方法中的特异的MC4R非肽激动剂或拮抗剂在下列中有所描述：Sebhat等人，J Med Chem 2002；45：4589(化合物1和6)；Richardson等人，J Med Chem.2004；47：744(化合物2)；Arasasingham等人，J Med Chem.2003；46：9(化合物3)；MillenniumPharmaceuticals的WO 02/062766(化合物4)；Pedemonte等人，J.Clin.Inves.2005；115：2564-71(化合物5)；Tran等人，Bioorg Med Chem Lett.2005；15：3434-38(化合物7)；Xi等人，Bioorg Med Chem Lett..2004；14：377-81(化合物8)；Vos等人，J Med Chem.2004；47：1602-04(化合物9)；Pan等人，Bioorg Med Chem Lett.2003；11：185(化合物10)；Marsilje等人，Bioorg Med Chem Lett.2004.14：3721(化合物11)；Ujjainwalla等人，Bioorg Med Chem Lett.2003；133：4431(化合物12)；Nickolls等人.，JPharmacol Exp Therap.2005；313：1281-1288(化合物13-17)；Schioth等人，Biophys Biochem Res Comm.2003；399-405(化合物18)；Benoit等人，J.Neurosci.2000；20：3442-48(化合物19和20)；Vos等人，Bioorg Med ChemLett.2006；15：2302(化合物21)；Tucci等人，Bioorg Med Chem Lett 2005；15：4389(化合物22)；Pontillo等人，Bioorg Med Chem Lett.2005；15：4615-18(化合物23)；Chaki等人，J Pharmacol Exp Ther.2003；304：818(化合物24)；Chaki等人，Pharmacol Biochem Behav.2005；82：621(化合物25)。

上述的化合物1、2、5、6、8、10、12、13-17和19是MC4R激动剂，而化合物3、4、7、9、11、18和20是拮抗剂。

预期用于目前要求保护的方法中的特异性MC4R肽拮抗剂是Ac-Cys-Glu-His-D-(2′)Nal-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH(2)(SEQ ID NO：12)；Ac-Cys-Nle-Arg-His-D-(2′)Nal-Arg-Trp-Gly-Cys-NH(2)(SEQ ID NO：13)；Ac-Cys-Glu-His-D-Phe(3，4-di-Cl)-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH(2)(SEQ ID NO：14)，Ac-Nle-c[Asp-Che-DNal(2′)-Arg-Trp-Lys-NH(2)(SEQ ID NO：15)；Ac-Nle-c[Asp-Cpe-DNal(2′)-Arg-Trp-Lys-NH(2)(SEQ ID NO：16)；环(1-6)-suc-His-DPhe-Arg-Trp-Lys-NH(2)(SEQ ID NO：17)；和Ac-DArg[Cys-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Cys]-NH(2)(SEQ ID NO：18)。

具有非天然存在的侧链的基于肽的激动剂和拮抗剂和肽模拟物是预期的。见例如美国专利号5,650,489，另见美国专利号6,090,912，特别在第5.5部分。例如，化合物18-20的侧链和图16中所述的化合物类中的侧链可为非天然存在的。

已显示出MC4R经历配体介导的受体内化(Gao等人，J PharmacolExp Ther 2003；307(3)：870-7)。将表达内源性MC4R的GT1-7细胞预先暴露于激动剂α-促黑素细胞刺激激素(α-MSH)，导致对于α-MSH的二次刺激的受损的cAMP形成(Shinyama等人，Endocrinology 2003；

144(4)：1301-14)。在施用拮抗剂时观察不到此结果。通过磷酸化C-末端区段和第三个胞内环之间的丝氨酸或苏氨酸残基，用G-蛋白偶联受体中触发配体诱导的内化。磷酸化促进了β-抑制蛋白的结合，其靶定受体用于内化和被溶酶体降解。最近数据证实引蛋白样蛋白(ALP)的胞质溶胶尾部结合至MC4R的C-末端结构域(Yeo等人，Biochem.J.2003；376)。因此，考虑到表面上MC4R的短的半衰期，增加细胞表面该受体的稳定性的陪伴分子将是特别有益的。

此外可预期到，如果陪伴分子是激动剂，将可逆地结合至内质网中的MC4R多肽，所述陪伴分子将不能诱导受体内化。类似地，当陪伴分子是拮抗剂时，可以预期一旦受体位于细胞表面，其将不抑制受体活性。

治疗方法

本发明还提供了用于治疗与MC4R降低的稳定性相关的状况的方法，所述状况例如肥胖、或具有发生肥胖的危险因素，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用陪伴分子以增强MC4R的稳定性和/活性。所要治疗的个体可为那些在MC4R中不显示将影响MC4R的折叠和加工的突变、但将受益于例如神经元上增加的MC4R稳定性的个体。所要治疗的个体还可在MC4R中具有影响MC4R蛋白质折叠和加工的突变，并显示出神经元上降低的MC4R稳定性。

制剂、剂量和施用

可方便地将MC4R的特异药理学陪伴分子即MC4R激动剂或拮抗剂、或者如上所述的或如通过下述的本发明的筛选方法所鉴定的其它MC4R结合化合物，与药学上可接受的载体一起配制成药物组合物。将陪伴分子指定为用于治疗肥胖或其它紊乱的活性成分或治疗剂，所述紊乱涉及降低的MC4R细胞表面表达或向细胞表面的运输。

活性成分(药理学陪伴分子)的浓度取决于所需剂量和给药方法，如下所述。活性成分的代表性的剂量范围为每天从大约0.01mg/kg至大约100mg/kg，每天从大约1mg/kg至大约100mg/kg；或每天从大约10mg/kg至大约75mg/kg。

治疗上有效的化合物可以标准制剂提供给受试者，并可包括任何药学上可接受的添加剂，例如赋形剂、润滑剂、稀释剂、调味剂、着色剂、缓冲剂和崩解剂。标准制剂是本领域中公知的。参见，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，第二十版，Mack Publishing Company，2000。可将制剂以有用的剂量单位形式来生产用于任何允许治疗陪伴分子穿过血脑屏障的途径施用。有代表性的途径包括口服、肠胃外、经粘膜(transmucosal)、鼻内的、吸入的或经皮肤的途径。肠胃外途径包括静脉内的、小动脉内的、肌内的、皮内的、皮下的、腹膜内的、心室内的、鞘内的、和颅内的施用。

在一个实施方案中，MC4R药理学陪伴分子，特别是在此处图1-8和10中所描述的那些是以固体口服剂型来制备的。对于口服施用，例如，对于小分子，药物组合物可采用通过通常方法制备的片剂或胶囊剂，所述方法使用药学上可接受的赋形剂例如黏合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或者淀粉羟乙酸钠)或者湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可通过本领域公知的方法来包衣。用于口服施用的液体制剂可采用例如溶液剂、糖浆剂或混悬剂的形式，或者可将其以干燥产品给出，在使用前用水或其它合适的载体重构。此类液体制剂可通过常规手段利用药物上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)、非水载体(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)、和防腐剂(例如甲基或丙基-对-羟基苯甲酸或山梨酸)来制备。该制剂还可适当地含有缓冲盐、调味剂、着色剂和增甜剂。

在另一实施方案中，MC4R陪伴分子是配制用于肠胃外施用的。可配制该陪伴分子用于通过注射例如快速浓注或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的制剂可呈现为单位剂型，例如在安瓿瓶或多剂量容器中，含有添加的防腐剂。组合物可采取例如油或水载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并可含有配制剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。另外，活性成分可为粉剂形式，用于用合适的载体例如无菌的无致热原水在使用前重构。

除了前述的制剂之外，陪伴分子还可制备为贮库制剂。此类长效制剂可通过植入(例如皮下地或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，可用合适的聚合或疏水材料(例如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂或保守地可溶性衍生物例如，作为保守地可溶性盐来配制化合物。

在另一实施方案中，陪伴分子可用载体特别是脂质体递送。

在另一实施方案中，陪伴分子可以控释的方式进行递送。例如，治疗剂可用连续泵利用静脉内输注、在聚合物基质例如聚-乳酸/谷氨酸(PLGA)中、在含有胆固醇和活性成分的混合物的丸剂中(SilasticR^TM；Dow Corning，Midland，MI；见美国专利号5,554,601)、通过皮下植入或通过经皮贴剂来施用。

组合治疗.药物组合物还可包括与候选化合物相组合的其它生物活性物质。实例包括但不限于西布曲明、奥利司他

、瘦素、神经肽Y、胆囊收缩素或GLP-1。

用于MC4R药理学陪伴分子的筛选试验

本发明进一步提供了用于鉴定候选陪伴分子化合物的方法，所述化合物调节MC4R多肽的稳定性、活性、和/或细胞表面定位。在一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定MC4R蛋白质的陪伴分子的方法，其包括将标记的或未标记的测试化合物与MC4R蛋白质或其片段相接触，并测定结合至MC4R蛋白质或其片段的测试化合物的量。这可以例如如下来完成：

(a)将第一细胞与测试化合物接触一段充足的时间以允许细胞对所述与测试化合物的接触应答；

(b)测定在步骤(a)中所接触的细胞中(或细胞表面上)MC4R多肽(或其包含配体结合结构域的片段)的构象稳定性、活性和/或细胞表面定位；并

(c)将步骤(b)中所测定的MC4R多肽与未与测试化合物相接触的对照细胞中的MC4R多肽的稳定性、活性、和/或细胞表面定位进行比较；

其中与未与测试化合物相接触的对照细胞中的MC4R多肽的稳定性水平相比，对与测试化合物的接触应答的第一细胞中MC4R多肽的稳定性、活性、和/或细胞表面定位的可检测的改变，表明测试化合物调节MC4R多肽的稳定性并为用于治疗与降低的MC4R稳定性或活性相关的紊乱的候选化合物。

细胞可为用非内源的野生型或突变型MC4R转化的宿主细胞，或内源MC4R表达细胞，包括突变型和野生型MC4Rs。此类细胞包括“肥胖神经元”例如上述的GT1-7细胞，在MacKenzie等人，Current MedicinalChemistry-Immunology，Endocrine & Metabolic Agents 2004；4：113-117中描述的那些内源性地表达MC4R的细胞，或表达正常或突变的、标记的MC4R的转化细胞例如Blondet等人JBiochem 2004；135：541-546中和下面实施例中所描述的HEK293细胞。

在另一实施方案中，本发明提供了用于鉴定MC4R蛋白质的陪伴分子的方法，其包括将标记的测试化合物与含有MC4R蛋白质的细胞或细胞膜级分相接触，并测定结合至细胞或细胞膜级分的标记的测试化合物的量。

许多高通量筛选(HTS)方法可用于同时筛选多种(例如，数百、数千、数万)结合至MC4R的测试化合物。测试化合物可以是但不限于，小的有机或无机分子(优选的)、肽或多肽(包括抗体、抗体片段、或其它免疫特异性分子)、寡核苷酸分子(例如适体)、多核苷酸分子、或嵌合体或其衍生物。特异结合至MC4R多肽的作为候选陪伴分子的测试化合物可利用基于细胞的和/或无细胞的测定法来鉴定。最近几年中开发的自动化测定的几种方法使得可以在短期内筛选数万化合物(见，例如美国专利号5,585,277、5,679,582和6,020,141)。例如，一个小组报道了通过对非肽基G-蛋白偶联受体有偏文库反复的定向筛选鉴定了一种芳基哌嗪MC4R激动剂(Richardson等人，J Med Chem 2004；47(3)：744-55)。此类HTS方法在例如微阵列中尤其有用。

为进行筛选，可被鉴定的化合物的纯化类别包括但不限于，小分子(即，有机或无机分子，其分子量小于2千道尔顿(kD)，且更优选地，分子量小于1kD)。这些是化合物文库的成分。

如此处所用的，术语“先导化合物”指的是选自MC4R拮抗剂或激动剂的初级筛选的分子实体，其可在稳定野生型或突变型MC4R蛋白质的蛋白质构象中独立地起作用，或其可通过进一步开发被修饰从而产生合适的药物化合物。

化合物文库.从Sigma-Aldrich(LOPAC LIBRARY^TM和LIGAND-SETS^TM)可获得具有详细记载的药理学活性的高纯度小分子有机配体和肽激动剂的文库。从Sigma-Aldrich还可获得稀有化学药品的Aldrich库(Aldrich Library of Rare Chemicals)，其为100000种以上小分子化合物的多样文库，包括植物提取物和微生物培养物提取物。其它化合物文库可从Tripos

和TimTech(包括激酶调节剂的靶文库)得到。

提供或已提供适用于根据本发明的筛选的化合物文库的其它公司包括下列：3-Dimensional Pharmaceuticals，Inc.；Advanced Chem Tech；Abinitio Pharma Sciences；Albany Molecular；Aramed Inc.；Annovis，Inc.(以前为Bearsden Bio，Inc.)；ASINEX；AVANT Immunotherapeutics；AXYS Pharmaceuticals；Bachem；Bentley Pharmaceuticals；Bicoll Group；Biofor Inc.；BioProspect Australia Limited；Biosepra Inc.；CadusPharmaceutical Corp.；Cambridge Research Biochemicals；CetekCorporation；Charybdis Technologies，Inc.；ChemBridge Corporation；ChemDiv，Inc.；ChemGenics Pharmaceuticals Inc.；ChemOvation Ltd.；ChemStar，Ltd.；Chrysalon；ComGenex，Inc.；Compugen Inc.；Cytokinetics；Dextra Laboratories Ltd.；Discovery Partners InternationalInc.；Discovery Technologies Ltd.；Diversa Corporation；DovetailTechnologies，Inc.；Drug Discovery Ltd.；ECM Pharma；Galilaeus Oy；Janssen Pharmaceutica；Jerini Bio Tools；J-Star Research；KOSANBiosciences，Inc.；KP Pharmaceutical Technology，Inc.；Lexicon GeneticsInc.；Libris Discovery；MicroBotanica，Inc.；MicroChemistry Ltd.；MicroSource Discovery Systems，Inc.；Midwest Bio-tech Inc.；MolecularDesign & Discovery；MorphoSys AG；Nanosyn，Inc.；Ontogen Corporation；Organix，Inc.；Pharmacopeia，Inc.；Pherin Pharmaceuticals；Phytera，Inc.；PTRL East，Inc.；REPLICor Inc.；RSP Amino Acid Analogues，Inc.；Sanofi-Synthelab(现在为Sanofi-Aventis)Pharmaceuticals；Sequitur，Inc.；Signature BioScience Inc.；Spectrum Info Ltd.；Talon CheminformaticsInc.；Telik，Inc.；Tera Biotechnology Corporation；Tocris Cookson；TorreyPines Institute for Molecular Studies；Trega Biosciences，Inc.；和WorldMolecules/MMD。

另外，由哈佛医学院维持的化学与细胞生物学研究所(ICCB)提供下列用于筛选的化学文库，包括天然产物文库：Chem Bridge DiverSet E(16,320种化合物)；Bionet 1(4,800种化合物)；CEREP(4,800种化合物)；Maybridge 1(8,800种化合物)；Maybridge 2(704种化合物)；Peakdale 1(2,816种化合物)；Peakdale 2(352种化合物)；ChemDiv Combilab andInternational(28,864种化合物)；Mixed Commercial Plate 1(352种化合物)；Mixed Commercial Plate 2(320种化合物)；Mixed Commercial Plate 3(251种化合物)；Mixed Commercial Plate 4(331种化合物)；ChemBridgeMicroformat(50,000种化合物)；Commercial Diversity Set 1(5,056种化合物)；NCI收集：Structural Diversity Set，版本2(1,900种化合物)；Mechanistic Diversity Set(879种化合物)；Open Collection 1(90,000种化合物)；Open Collection 2(10,240种化合物)；已知生物活性收集：NINDSCustom Collection(1,040种化合物)；ICCB Bioactives 1(489种化合物)；SpecPlus Collection(960种化合物)；ICCB Discretes Collections。下列ICCB化合物单独收集于ICCB、哈佛、和其它合作机构的化学家：ICCB1(190种化合物)；ICCB2(352种化合物)；ICCB3(352种化合物)；ICCB4(352种化合物)。天然产物提取物：NCI Marine Extracts(352孔)；Organicfractions-NCI Plant and Fungal Extracts(1,408孔)；Philippines PlantExtracts 1(200孔)；ICCB-ICG Diversity Oriented Synthesis(DOS)Collections；DDSl(DOS Diversity Set)(9600孔)。

有许多技术可用于产生更多集中的化合物文库而不是大的、分散的文库。Chemical Computing Group，Inc.(Montreal)已开发了软件，用新的方法进行高通量的药物设计。该公司的方法使用了高通量筛选(HTS)实验数据来产生概率QSAR(Quantitative Structure Activity Relationship)模型，其随后可被应用于在虚拟的组合文库中筛选构件。这是基于统计学判断而不是标准回归分析。

另外，ArQuIe，Inc.(Woburn，MA)也已整合了技术来进行化学化合物的高通量、自动化生产并递送这些已知结构和足以用于先导物优化量的高纯度的化合物。其AMAP^TM(Automated Molecular Assembly Plant)为化合物发现的每个阶段进行高通量的化学合成。

类似的化合物经常在在线数据库或CD-ROM上提供用于化合物的选择性“樱桃挑选”(cherry picking)。参见，例如，Ablnitio PharmaSciences；ActiMol；Aral Biosynthetics；ASDI Biosciences；BiotechnologyCorporation of America；Chembridge；ChemDiv；Florida Center-Heterocyclic Compounds；Microsource/MSDI；NorthStar；Peakdale；Texas Retaining Group；Zelinsky Institute；Advanced ChemTech；Ambinter；AnalytiCon Discovery；Aurora Fine Chemicals；Biofocus；Bionet/Key；Comgenex；Key Organics；LaboTest；Polyphor；SPECS andBiospecs；和Bharavi Laboratories。

微阵列

在一个实施方案中，用于MC4R陪伴分子的HTS筛选使用了微阵列。

蛋白质阵列.蛋白质阵列是利用多种表面上的固定化蛋白质的固相结合测定系统，所述表面选自例如玻璃、膜、微量滴定孔、质谱仪板、和珠子或其它颗粒。利用这些阵列的结合测定是高度平行的且常常是微型化的。其优点在于它们是快速的、可被自动化的、能够具有高灵敏度、在试剂的使用方面是经济的、并从单个实验中提供丰富数据。

自动化的多孔形式是最佳开发的HTS系统。自动化的基于96或384孔板的筛选系统是最广泛应用的。目前基于板的筛选系统中趋势是甚至更进一步降低反应孔的体积、并增加每板的孔的密度(每板96孔至384孔至1536孔)。该趋势导致增加的通量、每种所筛选化合物急剧降低的生物试剂成本、以及需要通过自动化处理的板的数量的降低。对可用于HTS的蛋白质阵列的描述，见例如美国专利号6,475,809；6,406,921；和6,197,599；以及国际公布号WO 00/04389和WO 00/07024。

为构建阵列，MC4Rs或其片段的来源，无论是野生型或突变型，可包括用于重组蛋白质的基于细胞的表达系统、从天然来源纯化、通过无细胞翻译系统的体外产生、以及用于制造MC4R肽的合成方法。对于捕获阵列和蛋白质功能分析，常常是这种情况，即MC4R多肽是正确折叠的和功能性的。并不总是这种情况，例如，当重组蛋白质是在变性条件下提取于细菌时，其它方法(天然蛋白质的分离、无细胞合成)通常维持功能性。然而，变性蛋白质的阵列在筛选陪伴分子中仍然是有用的，因为尽管突变蛋白不折叠成正确构象，但是陪伴分子仍可能结合至该突变蛋白。

所用的固定方法优选地适用于具有不同特性(例如，野生型、突变型、全长、部分长度片段、亲水的、疏水的等等)的MC4R多肽，顺应高通量和自动化，并通常与陪伴分子结合能力的维持相一致。可使用MC4R蛋白质固定的共价或非共价方法。共价连接的底物包括，例如，以含有氨基-或醛的甲硅烷试剂(Telechem)涂布的载玻片。在Versalinx^TM系统(Prolinx)中，可逆的共价偶联是通过利用苯基二硼酸(phenyldiboronic acid)衍生的蛋白质与固定于支持体表面的水杨酰基异羟肟酸之间的相互作用来实现的。提供稳定连接的共价偶联方法可用于一系列的蛋白质。基于三维聚丙烯酰胺凝胶，未修饰蛋白质的非共价结合发生在多孔结构例如HydroGel^TM(PerkinElmer)的内部。

基于细胞的阵列.基于细胞的阵列结合细胞培养技术与使用流控技术装置，用于测定细胞对目的样品中的测试化合物的反应，筛选样品用于鉴定引起培养细胞中的目的效应的分子，并选择和鉴定具有新的和所期望的特征的细胞群体。高通量筛选(HTS)可利用荧光标记的抗体、生物学配体或候选陪伴分子和/或核酸杂交探针在固定的细胞上进行，或者利用多色荧光指示剂和生物传感器在活细胞上完成。固定化或活细胞筛选的选择取决于所需的基于特定细胞的阵列。

本领域公知许多基于单和多细胞的阵列技术。最近发展起来的技术例如显微模式阵列(例如在国际PCT公布WO 97/45730和WO 98/38490中所描述的)和微流体阵列为比较性的基于细胞的分析提供了有价值的工具。转染的细胞微阵列是一种补充技术，其中阵列特征包含过表达确定的cDNAs的细胞群。将在表达载体中克隆的互补DNAs印至显微镜载玻片上，其在加入液体转染试剂和粘附的哺乳细胞之后变为活的阵列(Bailey等人，Drug Discov.Today 2002；7(18Suppl)：S13-8)。基于细胞的阵列在例如Beske，Drug Discov.Today 2002；7(18 Suppl)：S131-5；Sundberg等人，Curr.Opin.Biotechnol.2000；11：47-53；Johnston等人，Drug Discov.Today 2002；7：353-63；美国专利号6,406,840和6,103,479和美国公开的专利申请号2002/0197656中有详细描述。对于特异用于筛选配体-门控离子通道的调节子的基于细胞的阵列，见Mattheakis等人，Curr.Opin.DrugDiscov.Devel.2001；1：124-34；和Baxter等人，J.Biomol Screen.2002；7：79-85。

可检测的标记.为利用筛选试验检测分子例如候选MC4R陪伴分子，可如此处其它地方所述的用功能测定法跟踪未标记分子。目的分子(例如，小分子、抗体或多核苷酸探针)或相同的文库也可用原子(例如放射性核素)、可检测的分子(例如荧光素)或络合物可检测地标记，其因物理或化学特性可用于指示目的分子的存在。当其共价结合“报告”分子(例如，生物分子例如酶)上时，分子也可被检测地标记，所述报告分子用作底物以产生可检测的产物。适合用于本发明的可检测标记包括任何通过分光的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电的、光学的或化学的手段可检测的组合物。用于本发明的标记包括但不限于，用于用经标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白染色的生物素、磁珠(例如Dynabeads^TM)、荧光染料(例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、丽丝胺、藻红蛋白、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、来自Amersham的FluorX、来自Molecular Probes的SyBR Green I & II，等等)，放射性标记(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、或³²P)、酶(例如水解酶，特别是磷酸酶例如碱性磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化还原酶、特别是过氧化物酶例如辣根过氧化物酶，等等)、底物、辅因子、抑制剂、化学发光基团、生色试剂和比色标记例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠子。描述此类标记用途的专利的例子包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。

检测此类标记的手段是本领域技术人员所公知的。例如，放射标记和化学发光标记可利用照相胶片或闪烁计数器来检测；荧光标记可利用发光检测器检测发光来得以检测(例如，如在荧光激活细胞分选术中，FACS)；酶标记可通过为酶提供底物并检测例如通过酶作用于底物所产生的有色反应产物来检测。

稳定性、定位和活性测定

如前面所示的，增强的MC4R稳定性可通过检测细胞MC4R多肽的增加、通过测定向细胞表面的运输的增加，例如，如通过增强的细胞表面表达所测定的、或者通过测定增强的MC4R活性来确定。用于评价前述每种情况的非限制性的示例性方法在下面描述。

测定MC4R胞内稳定性.用于检测胞内MC4R蛋白质水平的方法是本领域所公知的。此类方法包括蛋白质印迹、免疫沉淀后的蛋白质印迹(IPWestern)、或利用标记的MC4R蛋白质的免疫荧光。

测定MC4R运输.对蛋白质通过生物合成途径的运输的评价可例如利用35S-标记的受体蛋白质的脉冲追踪实验与糖苷酶相结合来完成，或通过间接或直接的免疫荧光来测定在运输过程中的蛋白质修饰来完成。这些和其它方法例如在Current Protocols in Cell Biology 2001；John Wiley &Sons中描述。

用于检测蛋白质的受损的运输的方法是本领域中所公知的。例如，对于高尔基体中N-和/或O-糖基化的蛋白质而言，利用放射性标记蛋白质的脉冲追踪代谢标记结合糖苷酶处理和免疫沉淀，可用于检测蛋白质在高尔基体中是否经历了完全的糖基化，或者是否被保留在内质网中而不是运输至高尔基体进行进一步的糖基化。

用于在视觉上检测细胞定位的灵敏方法还包括利用荧光蛋白质或荧光抗体的荧光显微法。例如可用例如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白来标记目的MC4R蛋白质，随后通过多色和缩时显微术以及电子显微术来研究固定细胞和活细胞中这些蛋白质的命运。有关蛋白质运输的荧光成像的用途的综述，见Watson等人，Adv DrugDeliv Rev 2005；57(1)：43-61。对用于蛋白质的细胞内共定位的共焦显微术的使用的描述，见Miyashita等人，Methods Mol Biol.2004；261：399-410。

荧光相关光谱学(FCS)是能够进行单分子和实时分辨的超灵敏且非侵入性的检测方法(Vukojevic等人，Cell Mol Life Sci 2005；62(5)：535-50)。SPFI(单粒子荧光成像)使用高灵敏度的荧光来观察已用小的荧光颗粒进行选择性标记的个别分子(Cherry等人，Biochem Soc Trans2003；31(Pt5)：1028-31)。对于蛋白质在脂膜筏内部的定位，见Latif等人，Endocrinology 2003；144(11)：4725-8)。对于活细胞成像的综述，见Hariguchi，Cell Struct Funct 2002；27(5)：333-4)。

荧光共振能量转移(FRET)显微术也用于研究生理状态下蛋白质的结构和定位(Periasamy，J Biomed Opt 2001；6(3)：287-91)。

对于质膜固有蛋白质，可使用更低灵敏度的试验来检测它们是否存在于膜上。此类方法包括固定细胞的免疫组织化学、或利用放射性标记配体(例如¹²⁵I)的全细胞标记。

测定MC4R细胞表面表达.一旦鉴定出候选化合物，下一步骤是测定候选化合物能否提高运输至细胞表面的MC4R的量。许多测定法可用来定量地评估细胞表面受体表达。例如，利用例如¹²⁵I-MSH的放射性配体结合测定法，可用于测定对表达MC4R的全细胞或对于细胞膜级分的的结合。见美国公布的申请2003/0176425对一种有代表性的方法的描述，也可见Chhajlani，Peptides.1996；17(2)：349-51。另外，也可使用利用经标记抗体或经标记MC4R(例如FLAG标记的MC4R)的免疫荧光染色。另一公知的方法是荧光激活细胞分选术(FACS)，其利用针对细胞表面标志物的标记抗体来分选或区别细胞群体。另见，Nijenhuis等人，同前。

测定MC4R活性的增加.可利用例如cAMP激活/积累测定法(见例如VanLeeuwen等人，J Biol Chem 2003；18：15935-40)或通过测量由cAMP激活的一种或多种基因的转录的增加、或通过将报告基因例如荧光素酶有效连接到cAMP反应元件(CRE)上来测量报告基因表达(见，例如Lee等人，Eur J Biochem 2001；268(3)：582-91)来测定MC4R活性。另外，MC4R刺激载黑素细胞中的TNF-α分泌也是已知的。因此应答MC4R活性的候选化合物可通过测定TNF-α分泌来评价(见，例如Ignar等人，Peptides 2003 May；24(5)：709-16)。

最后，载黑素细胞为黑皮质素激动剂和拮抗剂提供了快速且灵敏的生物测定法。此方法是基于对由α-MSH引起的色素颗粒分散的检测，如通过对光密度改变的检测(Quillan等人，PNAS U.S.A.1995；92：2894；和Potenza等人，Pigment Cell Res 1992；5：372)。

分子生物学定义

根据本发明，可使用本领域内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术通常用于产生表达野生型或突变型MC4R的重组细胞，其用于筛选测定法。文献中对此类技术有充分的解释，见，例如Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(此处＂Sambrook等人，1989＂)；DNA Cloning：A PracticalApproach，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；OligonucleotideSynthesis(MJ.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames &S.J.Higgins eds.(1985))；Transcription And Translation(B.D.Hames &SJ.Higgins，eds.(1984))；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.(1986))；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，(1986))；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)；以及每本书以后的版本(可得到时)。

术语“宿主细胞”指以任何方式选择的、修饰的、转化的、培养的、使用的或操作的任何生物的任何细胞，用于通过该细胞进行目的物质的生产，例如通过细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶。根据本发明，修饰宿主细胞以表达突变型或野生型MC4R核酸和多肽。宿主细胞可进一步用于筛选或其它测定。用于本发明的有代表性的宿主细胞是HEK293细胞、COS细胞和CHO细胞。

“重组DNA分子”是已经历了分子生物学操作的DNA分子。

此处的MC4R多肽可在两侧有天然调节(表达控制)序列，或可与异源序列相结合，所述异源序列包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其它核糖体结合位点序列、增强子、应答元件、抑制子、信号序列、多聚腺苷酸化序列、内含子、5′-和3′-非编码区域等等。还可通过本领域已知的许多方式对核酸进行修饰。此类修饰的非限制性例子包括：甲基化，“帽”，类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代，以及核苷酸间的修饰例如，具有不带电的连接的修饰(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯，等)和具有带电连接的修饰(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等)。多核苷酸可含有一种或多种另外的共价连接部分，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如，金属、放射性金属、铁、氧化金属等)、和烷化剂。这些多核苷酸可通过甲基或乙基磷酸三酯或烷基亚磷酰胺连接的形成得到。而且，此处的多核苷酸还可用能够直接或间接提供可检测信号的标记来修饰。有代表性的标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等等。核酸还可在一个或多个碱基上通过例如定点诱变来进行改变，以促进与分子的用途相关的分子生物学。

“编码序列”或“编码”表达产物例如MC4R RNA或多肽的序列，是当其表达时导致产生RNA或多肽的核苷酸序列，例如，MC4R核苷酸序列编码MC4R多肽(蛋白质)的氨基酸序列。蛋白质的编码序列可包括起始密码子(通常是ATG)和终止密码子。

术语“基因”，也称为“结构基因”指编码或相应于特定的氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列包含一种或多种MC4R蛋白质的全部或部分，并且可以包括或不包括调节DNA序列，例如启动子序列，其决定例如MC4R基因得以表达的条件。

术语“表达”当用于从核酸序列生产氨基酸序列的上下文中时，指允许或引起MC4R基因或DNA序列中的信息变得明了，例如通过激活涉及相应MC4R基因或DNA序列的转录和翻译的细胞功能来产生MC4R蛋白质。细胞中或通过细胞表达的DNA序列形成“表达产物”例如MC4R蛋白质。表达产物本身，例如，所获得的蛋白质，还可称为被细胞“表达”。表达产物可表征为胞内的、胞外的或分泌的。根据本发明，MC4R表达于神经元的细胞表面。

术语“细胞内”指在细胞内部的某物。术语“细胞外”指细胞外部的某物。如果物质从细胞上或细胞内部的某处大量出现在细胞外部，那么物质被细胞“分泌”。

术语“异源的”指的是天然不以组合存在的元件的组合。例如，异源DNA指的是不天然定位于细胞或细胞的染色体位置的DNA。优选地，异源DNA包括对于细胞外来的基因。异源表达调节元件是有效地与不同基因相结合的元件，而不是有效地与自然状态的基因相结合的元件。在本发明的上下文中，编码目的蛋白质的基因对载体DNA是异源的，该基因插入载体进行克隆或表达，且其对于含有此类载体的宿主细胞是异源的，基因在所述宿主例如大肠杆菌细胞中表达。

术语“转化”指的是将DNA如编码MC4R多肽的核酸从周围培养基引入宿主细胞的方法。

术语“转导“指的是将DNA如编码MC4R多肽的核酸引入原核宿主细胞，例如经细菌病毒或噬菌体引入原核宿主细胞。接受和表达引入的DNA或RNA的原核或真核宿主细胞已经被“转化”或“转导”，且是“转化体”或“克隆”。引入宿主细胞的DNA或RNA可来自任何来源，包括与宿主细胞相同属或种的细胞，或不同种或属的细胞，或合成序列。

术语“重组工程细胞”指的是任何已通过任何合适的方法，包括转染、转化或转导经过操作来表达或过表达目的核酸如编码MC4R多肽的核酸的原核或真核细胞。该术语还包括细胞中通常不表达基因产物或以次优水平表达基因产物的核酸的内源性激活。

术语“转染”指将外源(即外来的或细胞外的)核酸引入细胞中。“外源”核酸对宿主细胞而言包括基因、DNA或RNA序列，因此宿主细胞将复制所述DNA并表达引入的基因或序列来产生目的物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。引入的基因，如编码MC4R多肽的核酸，或序列也可称为“克隆的”基因或序列，可包括调节或控制序列，例如由细胞遗传机器所使用的起始、终止、启动子、信号、分泌或其它序列。该基因或序列可包括非功能性序列或无已知功能的序列。可将DNA引入作为染色体外的元件或通过染色体整合到接受和表达引入的DNA或RNA的宿主细胞。

取决于所用的宿主细胞，利用适合此类细胞的标准技术来完成转化或转染。使用氯化钙的钙处理，如Sambrook等人，1989同上的第1.82部分所述的，通常用于含有坚固的细胞壁屏障的细菌细胞。用于转化的另一方法使用聚乙二醇/DMSO，如Chung和Miller(Nucleic Acids Res.1988，16：3580)中所述的。而另一方法是使用称为电穿孔的技术。备选地，当使用病毒载体时，可通过含有目的基因的病毒来感染宿主细胞。

术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”指DNA或RNA序列(例如MC4R基因)借以被引入宿主细胞，以便转化宿主并启动引入序列的表达(例如转录和翻译)的载体。载体包括质粒、噬菌体、病毒等；它们在是本领域所公知的。

“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并起始编码序列下游(3’方向)的转录的DNA调节区域。为限定本发明，启动子序列通过转录起始位点结合至其3’末端并延伸上游(5’方向)至包括最低数量的碱基或元件，所述数量是以高于背景的可检测水平起始转录所必需的。在启动子序列内部将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。

当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列在细胞中处于转录和翻译控制序列的“控制下”或“与其有效结合”，mRNA然后被反式RNA剪接(如果其含有内含子)并翻译成编码序列所编码的蛋白质。

含有一种或多种上述成分的合适载体的构建使用标准的连接技术。分离的质粒或DNA片段经剪切、剪裁、并再连接成所期望的形式以产生所需质粒。

为分析以确认所构建质粒中正确的序列，用连接混合物来转化细菌菌株，并在适当的时候将成功的转化体通过氨苄青霉素或四环素抗性筛选出来。从转化体制备质粒，通过限制性内切酶消化、和/或通过Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1977，74：5463-5467)、或Messing等人(NucleicAcids Res.1981，9：309)的方法，或Maxam等人(Methods in Enzymology1980，65：499)的方法进行测序来进行分析。用本发明的上述表达载体转化宿主细胞并在经改良适用于所用的启动子的常规培养基中进行培养。

实施例

通过实施例对本发明进行了进一步描述，如下所示。此类实施例的使用仅仅是说明性的，绝非限制本发明或其中示例的任何术语的范围和意义。同样，本发明并不限于此处所述的任何特定的优选实施方案。实际上，对本领域的技术人员而言，一旦阅读了本说明书，本发明的许多修饰和变型将是显而易见的，并能够在不违背其精神和范围的情况下做出。因此本发明仅仅受到所附的的权利要求以及与权利要求等同的完整范围的限制。

实施例1：表达MC4R折叠突变体的细胞系的产生

为了测定一些MC4R突变体是否导致MC4R的构象缺陷，将含有多种突变的MC4R核酸转染进HEK-293T和COS-7细胞，并评估其细胞表面表达和活性。对在其中观察导降低的或缺失的细胞表面表达的那些细胞系进行进一步评估来确定MC4R多肽的细胞内存在和/或位置。

方法

MC4R突变体的产生.利用本领域的已知技术(例如PCR、定点诱变)修饰编码野生型MC4R的cDNA(例如，SEQ ID NO：1)来产生含有核苷酸改变的突变MC4R cDNAs，所述改变导致例如，下列MC4R突变多肽之一：P78L、R165Q、R165W、I125K、C271Y、T11A、A175T、I316L、1316S、I317T、N97D、G98R、N62S、C271R、S58C、N62S、N97D、Y157S、I102S、L106P、L250Q、Y287X、P299H、S58C、密码子211位的CTCT，和/或密码子244位的TGAT插入。所述突变体还可与荧光标记例如GFP(如Blondet等人JBiochem(Tokyo)2004；135(4)：541-6中所述)、FLAG标记(如VanLeeuwen等人，J Biol.Chem.2003；278：15935-15940所述)相融合或用酶例如萤光素酶标记。

细胞培养和转染.根据厂商的说明书，将此类突变体MC4R核酸克隆进合适的表达载体，例如pCDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)。利用LipofectAMINE(Invitrogen)完成细胞的转染，并通过对新霉素类似物G418的抗性将永久转染的克隆细胞系筛选出来。

简要地，将HEK-293T和COS-7细胞维持在Dulbecco改良的Eagle培养基(含有谷胺酰胺，Invitrogen)中，培养基中补充有10％的胎牛血清、100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素(Invitrogen)。将细胞培养在37℃下含有5％ CO₂的湿润空气中。在转染的当天细胞通常达到70-80％汇合。

GFP标记的MC4R.绿色荧光蛋白(GFP)cDNA从BD Biosciences(San Jose，CA)或Clontech(Palo Alto，CA)获得。根据厂商的说明书，将GFP融合至除去了C末端终止密码子的人MC4R的C末端框内。然后将嵌合的MC4R-GFP融合蛋白质构建体如上述进行转染。类似地使用了萤光素酶构建体。

MC4R突变体的定位的检测.利用前面所述的条件进行结合实验来测定细胞表面定位(Yang等人，J Biol Chem 1997；272：23000-23010)。简要地，将2 x 10⁵cpm的¹²⁵I-NDP-MSH(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)与非放射标记的配体NDP-MSH、AgRP 87-132或AgRP 110-117组合使用。通过除去培养基并用含有0.2％牛血清白蛋白的最低基本培养基洗涤细胞两次来终止结合反应。然后用0.2N NaOH裂解细胞，并在分析计数器中对裂解物的放射性进行定量。通过检测10^-6M未标记配体存在下所结合的¹²⁵I标记的量来测定非特异性结合。另外，可如下面在实施例4中所述使用FACS。通过从总的结合放射性中减去非特异结合的放射性来计算特异结合。利用等式Bmax＝[NDP-MSH特异结合]/([NDP-MSH]/(Kd+[NDP-MSH])可计算出最大结合(Bmax)。Ki＝IC50/1+配体浓度/Kd。

当MC4R突变体经荧光标记时，使用共焦显微术来检测经标记的MC4R在细胞内的运输(Blondet等人，J Biochem 2004；135：541-546；或Gao等人，J Pharmacol Exp Ther 2003；307(3)：870-7)。简要地，实验之前将细胞培养在腔室盖玻片(chamber coverglasses)24至48小时。在适当的处理后，用冷的PBS洗涤细胞并在福尔马林中固定20分钟，并在LSM510 META激光扫描显微镜(Carl Zeiss，Thornwood，NY)上进行观察。利用488nm的氩/氪激光激发GFP的荧光，用500至550nm的带通滤波器检测。用HeNe激光在543nm激发红色信号，并用565至615的带通滤波器对荧光进行检测。

利用Scion Image Beta 4.02对数字获取的图像进行定量。将原始的绿色荧光共焦图像转换成灰度并进行中值过滤。对每个像素指定一个从0(黑色)至255(白色)的强度值。在手工选择相应的区域之后测定细胞表面和整个细胞的荧光强度。将MC4R-GFP的亚细胞分布表达为细胞表面荧光强度与整个细胞荧光强度的比率。该比率的降低表明受体内化。

利用这些方法，MC4R的折叠突变体得以鉴定，其将是陪伴分子介导的拯救的候选者。

实施例2：MC4R的激动剂和拮抗剂的结构

基于公开的专利和参考文献的综述(特别是，Bednarek和Fong，Exp.Opn.Therapeutic Patents 2004；14(3)：327-326和WO 02/062766)对MC4R的激动剂和拮抗剂进行选择。用于选择此处所述化合物的标准包括公布的IC₅₀数据、体内动物数据、和生物利用度数据(例如，药物动力学)(可得到时)。

a)图1的激动剂(化合物1)的合成

此称作THIQ的化合物的选择是以下列数据为基础的：

此分子的合成(11步)是基于图3所描述的方案来完成的。

b)图2的激动剂(化合物2)的合成

此称为化合物2的已知化合物的选择是基于下列数据：

此分子的合成(11步)是基于图4所描述的方案完成的。

c)图5的拮抗剂(化合物3)的合成

此化合物的选择是基于Arasasingham(J Med Chem 2003，46：9-11)所报道的αMSH/MC4R数据。此化合物的合成是根据其中所述的方法完成的，在图7中进行了概述。

d)图6的拮抗剂(化合物4)的合成

以Millennium Pharmaceuticals的PCT国际专利公布WO 02/062766中所述的数据和合成方法选择和合成化合物；图8中概括了合成方案。WO02/062766中报告了利用闪烁迫近测定法测定的此化合物的生物学活性。

简要地，利用下列方法完成合成：

将1，3-二氨基丙烷(Acros，27.7g，0.374mmol)加入在二氯苯中的硫代水杨酸(Acros，20g，0.130mmol)中，将该混合物加热至170℃ 4小时。冷却至60℃，加入甲醇(50ml)，在室温搅拌反应物过夜并收集所获得的黄色晶状固体，并用醚洗涤从而产生9g纯产物。

在室温下将2-甲氧基-硝基苄基溴(Fluka，1.86g，7.559mmol)加入在甲醇(60ml)中的2-(1，4，5，6-四氢嘧啶-2-基)苯硫醇(1g，5.201mmol)，维持12小时，浓缩并加入醚(10ml)，收集所获得的浅黄色针状结晶，并用醚洗涤从而得到1.28g纯产物。

实施例3：利用低温或化学陪伴分子拯救错折叠的MC4R

由于低温(热拯救)和一般的化学陪伴分子例如DMSO均已知可恢复突变型蛋白质的折叠，在含有WT和突变型MC4R的细胞和那些培养在30℃或用1％DMSO培养的细胞中，对野生型和多种MC4R折叠突变体的细胞表面表达进行评估。

方法

细胞和转染。用野生型(WT)或下列用3HA和Venus(增强的黄绿色荧光蛋白，EYFP)双重标记的hMC4R突变体：S58C；N62S；R165W；R165Q，和P299H对HEK293细胞进行瞬时转染。

低温测定.在对MC4R细胞表面表达进行评估之前，将WT和转染细胞在30℃或37℃温育12小时。利用下列来确定所得增加：所得增加＝[(30℃下的％表面表达-37℃下的％表面表达)/37℃下的％表面表达]＊100。

化学陪伴分子测定：在评价MC4R细胞表面表达之前，将WT和瞬时转染的细胞在存在或不存在1％DMSO的情况下温育12小时。

FACS分析.在用一级抗HA.11抗体(小鼠；1:1000稀释度)和偶联至Alexa647的二级抗体(山羊抗小鼠；1:1000稀释度)荧光标记细胞之后进行FACS分析。将活细胞(碘化丙锭阴性)分选到下列两个相关群体：

P4：全部YFP阳性细胞(代表总的MC4R表达)

P5：YFP和Alexa 647阳性细胞百分比(Alexa和YFP阳性细胞)/(YFP阳性细胞+Alexa和YFP阳性细胞)(代表细胞表面表达)

结果

MC4R细胞表面表达.WT细胞表面表达的基础表面表达达90％。如通过¹²⁵I-标记的NDP-α-MSH的结合所检测的，没有突变体在细胞表面表达MC4R(数据未显示)。当通过FACS分析时，与经WT MC4R转染的细胞相比较，突变体均显示出显著降低的表面表达(数据未显示)。大约90％的WT 3HA-hMC4R-Venus细胞显示出MC4R(P5)的表面表达，而对于N62S、R165W、R165Q和P299H，突变体上基础表面表达在12％和18％之间。S58C显示出大约40％的表面表达。

热拯救.如下在表2中，所有五种突变体均显示出在MC4R(P5)细胞表面表达中的增加：

表2

 

基因型	％增加
		WT	12
S585C	43
		N62S	68
R165W	63
		R165Q	93
P299H	107

化学陪伴分子：当1％的DMSO存在时，未检测到细胞表面表达的显著增强。

实施例4：利用MC4R药理学陪伴分子对错折叠MC4R的拯救

将图5(化合物3)和图6(HBr盐，化合物4)中所述的MC4R拮抗剂化合物分别用于评价细胞中的陪伴分子活性，所述细胞含有下列MC4R突变体：S58C；N62S；R165Q；R165W；和P299H。

方法

药理学陪伴分子测定.简要地，将含有每种上述MC4R突变体的细胞(如实施例3中所述的进行转染)用浓度为1.0μM和10μM的每种拮抗剂化合物培养12小时，并利用如上述的荧光激活细胞分选分析对MC4R的细胞表面表达进行评估。比较处理和基础条件下的细胞表面表达水平。根据下列来测定增加百分比：[增加＝[(表面表达的％(经处理)-表面表达的％(w/o治疗))/表面表达的％(w/o治疗)]＊100。

MC4R活性测定.在存在或不存在每种拮抗剂的情况下，利用来自Molecular Devices(全细胞测定；目录号R8044)的Catch Point cAMP荧光测定试剂盒，评估MC4R突变体S58C，N62S，R165W和P299H响应于MC4R激动剂NDP-MSH(10-7M)处理而产生的cAMP积累。对照不经处理或只用NDP-MSH处理。

结果

药理学陪伴分子拯救。如下面表3中所示，在1.0μM和10μM浓度下，两种拮抗剂均能够增强MC4R突变体R165W、S58C和R165Q的表面表达，具有剂量依赖性效应。如上所示，对于N62S，R165W，R165Q和P299H，突变体上基础表面表达在12％和18％之间。S58C显示大约40％的表面表达。出乎意料地，用10μM每种化合物能够将MC4R R165W的细胞表面表达恢复至与表达野生型MC4R的细胞相同的水平。

对于突变的N26S，在1.0μM下用任一种化合物均未发现效果，尽管两种化合物在10μM浓度下均可观察到突变型MC4R的细胞表面表达的显著增加百分比。图5中所描绘的化合物是更有效的，即比用图6中所示的化合物观察到更多的细胞表面表达。

对于突变体P299H，图6中所示的化合物在1.0μM或10μM下对恢复突变型受体的细胞表面表达无作用，且用10μM的图5所示的化合物仅观察到了微小的作用。

表3

这些结果表明当与低浓度的MC4R拮抗剂接触时，MC4R折叠突变体可得以“拯救”，所述拮抗剂用作恢复细胞表面表达的药理学陪伴分子。

最后，Pedemonte等人，J Clin.Inves.2005；115：2564-71中所述的二氨基噻唑化合物显示出对突变体S58C(31.25％增加)和R165W(28.95％增加)的微小作用。

MC4R活性.如图11中所示，在S58C和R165W中用10μM的两种拮抗剂处理后，均观察到通过MC4R的信号恢复至与hMC4R WT相同的水平。MC4R突变体N62S中的信号能力也有了较低程度的恢复。如所期望的，P299H中无信号恢复，因为此突变是在G蛋白偶联所必需的结构域中。

实施例5：筛选恢复突变体MC4R的稳定性和活性或增强野生型MC4R稳定性的MC4R陪伴分子

此实施例描述了用于筛选MC4R陪伴分子化合物的方法，所述化合物用于增强MC4R的错折叠突变体或野生型细胞表面表达和/或活性。

方法

突变体或野生型MC4R的转染。如实施例1中所述来进行折叠/运输MC4R突变体的鉴定。如上所述来进行此类折叠突变体和/或野生型MC4R的转染，或通过利用本领域任何已知的用于检测蛋白质的细胞表面表达的方法，包括免疫测定例如ELISA和FACS分析。

陪伴分子施用.向表达MC4R野生型或表达折叠突变体的细胞培养物或阵列中加入多种浓度的陪伴分子测试化合物。然后测定MC4R的细胞定位，以及被运输至细胞表面的MC4R的活性。例如，筛选基于哌嗪-、哌啶-、1，4-二氮杂

-、胍的，或其它如下述的测试化合物：Bednarek和Fong，Exp Opn Ther Patents 2004；14：327-36；Ujjainwalla等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2003；13：4431-4435；WO03/07949；WO03/61660；WO03/09847；WO03/09850；WO03/31410；WO03/94918；WO03/68738；WO03/92690；WO03/93234；WO03/72056；WO03/66597；WO03/66587；WO03/53927；WO02/67869；WO02/68387；WO03/68738；WO02/00259；WO02/92566；WO02/81443；WO02/81430；和WO02/80896。

MC4R向细胞表面运输的检测.与未处理细胞相比较，对化合物处理的MC4R表达细胞的细胞和/或表面定位的检测是如上所述来完成的。

通过测定cAMP积累来检测MC4R活性。转染后48小时，将细胞用PBS洗涤一次，然后用含有0.02％ EDTA(Sigma)的PBS将细胞从平板脱离。通过离心收获脱离的细胞并重悬于含有0.5mM IBMX，2mM HEPES，pH 7.5(IBMX缓冲液)的Hanks’平衡盐溶液(Invitrogen)中。在37℃温育15分钟后允许IBMX摄取，将0.4ml细胞悬液(大约5×10⁵细胞/ml)加入到0.1ml的含有多种浓度的激动剂(例如，[Nle4-D-Phe7]-MSH(NDP-MSH)，α-MSH)或其它陪伴分子候选物或10μM毛喉素的IBMX缓冲液中。随后在37℃将细胞温育15分钟，以允许cAMP积累。通过加入0.5ml的5％三氯乙酸来终止反应性，并通过cAMP¹²⁵I闪烁迫近分析法系统(Amersham Biosciences)来测定从裂解细胞中释放的cAMP。利用GraphPad Prism软件用95％的置信区间来计算EC₅₀值(利用非线性回归分析，用具有可变斜率的S形剂量反应曲线拟合)。

实施例6：施用单剂量DGJ来评价安全性、耐受性、药物代谢动力学和对α-半乳糖苷酶A酶活性的影响

此实施例描述了对每日两次口服剂量的DGJ进行随机、双盲、安慰剂对照的I期研究，从而评估DGJ在健康志愿者体内的安全性、耐受性、药物动力学、和对α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)酶活性的影响。

研究设计和持续时间.该研究是首次在人体内、单中心、I期、随机、双盲、每日两次剂量、安慰剂对照的研究来评估口服给药之后DGJ的安全性、耐受性、药物动力学、和对α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)酶活性的影响。该研究测试了两组的8位受试者(6位活性的和2位安慰剂)，其接受了每日两次剂量的50或150mg DGJ或安慰剂，所述DGJ或安慰剂是连续七天口服施用的，伴有七天的随访。在给药之前的14小时直至给药之后的24小时均让受试者处于治疗设施中。按时间表控制进餐，且药物施用后受试者保持走动4小时。

在第1天和第7天计算血浆中DGJ的药物代谢动力学参数。另外，计算尿液中所排泄的累积百分比(给药后12小时)。在给药开始前、并另外在进入试验100小时、150小时和336小时时，计算白细胞(WBC)中的α-Gal A活性。

研究群体.受试者是健康的、非专门机构的、不吸烟的19至50岁(包括19和50岁)的男性志愿者，多数由社会成员组成。

安全和耐受性评价.通过评估生命指征、实验室参数(血清化学、血液学和尿分析)、ECGs、身体检查并通过记录治疗时期过程中的不利事件来确定安全性。

药物代谢动力学抽样.在给药前，并在其后的下列时间：0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12小时，将血液样品(每人10mL)收集在含有EDTA的血液收集管中。将血液样品在冰浴中冷却并在冷却后尽快离心。将血浆样品分成两等份并储存在20±10℃直至测试。在研究结束时，将所有样品转移至MDS Pharma Services AnalyticalLaboratories(Lincoln)进行分析。在施用DGJ后第1和第7天，从每位受试者收集完全的尿液排出用于分析DGJ从而确定前12个小时的肾清除率。

WBCα-GAL A酶活性抽样.将血液样品(每人10ml)收集在含有EDTA的血液收集管中，并在给药前和其后的下列时间：100小时、150小时和336小时提取WBC。如上述处理样品，并测定WBCα-Gal A酶活性。

统计分析.通过治疗组和收集的时间点来总结包括实验室评估、体检、不利事件、ECG监测和生命指征评价在内的安全性数据。描述统计学(算术平均、标准差、中值、最小值和最大值)用于计算定量安全性数据以及与基线的偏差。编辑频率计数用于定性安全数据的分类。

利用MedDRA 7.0版词典编码不利事件，并通过处理报告有不利事件的受试者数目和所报告的不利事件数目来进行总结。提供了按受试者计的不利事件数据列表，其包括字母名称(verbatim term)、编码名称(codedterm)、治疗组、严重性和与治疗的关系。伴随的药物治疗和医疗史按照治疗列出。

利用描述统计学(算术平均、标准差、变异系数、样品尺寸、最小值、最大值和中值)按照治疗组来概述药物代谢动力学参数。

结果

安慰剂处理的受试者均不具有不利事件(AE)，且在接受50mg一日两次或150mg一日两次DGJ之后，无受试者表现出AEs。当施用50mg一日两次和150mg一日两次的剂量时，DGJ显示为安全的并对于这组健康男性受试者是良好耐受的。

给药后发生了与正常范围的实验室偏差，但没有偏差被判断为临床显著性的。在研究过程中所调查的任何参数中，无任何临床上相关的平均数据变化。任何生命指征、ECG或身体检查参数中均未发生任何临床相关异常。

药物代谢动力学评估.下列表概述了研究中所获得的药物代谢动力学数据。

表4

^a在给药后的12小时中所排泄的DGJ的积累百分比。

所有受试者中和在所有剂量水平下DGJ的药物代谢动力学均得以良好表征。平均起来，对于所有剂量水平峰浓度均出现在大约3小时时。当将剂量从50mg增加至150mg时，DGJ的C_max以剂量成比例的方式增加。

第1天在50和150mg的剂量水平下平均清除半衰期(t₁/₂)是相当的(2.5对2.4小时)。

第1天，在50mg和150mg的剂量水平下在给药时期后的12小时中所排泄DGJ的平均百分比分别是16％和42％，在第7天分别增加至48％和60％。

α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)酶活性.研究中所获得的α-Gal A酶活性数据显示于图1中。在50mg一日两次或150mg一日两次的剂量下，DGJ不抑制受试者中的WBC α-Gal A酶活性。而且，在健康志愿者体内DGJ产生了增加的WBC α-Gal A活性的剂量依赖性趋势。检测了施用安慰剂50mg一日两次和150mg一日两次DGJ的受试者白细胞中α-Gal A酶活性。安慰剂对WBC α-Gal A酶活性无影响。响应安慰剂而产生的酶活性变化不是临床上显著的。50mg一日两次和150mg一日两次的DGJ增加了归一化的WBC α-Gal A酶活性。响应50mg一日两次的DGJ，在给药后100小时、150小时和336小时，WBC α-Gal A酶活性分别增加至120％、130％和145％剂量前水平。响应150mg一日两次的DGJ，在给药后100小时、150小时和336小时，WBC α-Gal A酶活性分别增加至150％、185％和185％剂量前水平。

本发明并不限于由此处所述的特定实施例所限定的范围。实际上，从前面的描述和附图中，除此处所述的那些之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员而言将变得显而易见。此类修饰意在落入所附权利要求的范围内。

本申请全文中引用专利、专利申请、出版物、产品说明和方案，其公开将以其全部内容为所有目的而在此处被引用作为参考。

序列表

<110>阿米库斯治疗学公司

<120>用于治疗肥胖的药理学陪伴分子

<130>077376.0346

<150>60/687,648

<151>2005-06-03

<150>60/799,968

<151>2006-05-12

<160>18

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>1000

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>332

<212>PRT

<213>人

<400>2

<210>3

<211>999

<212>DNA

<213>人

<400>3

<210>4

<211>332

<212>PRT

<213>人

<400>4

<210>5

<211>1888

<212>DNA

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>5

<210>6

<211>332

<212>PRT

<213>大鼠

<400>6

<210>7

<211>2769

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>7

<210>8

<211>332

<212>PRT

<213>小鼠

<400>8

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化，Nle

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>D氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)..(7)

<223>酰胺化

<400>9

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化，Nle

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>β-萘基丙氨酸(2)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)..(4)

<223>酰胺化

<400>10

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽，环状

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化，Nle

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)..(4)

<223>Nle

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>β-萘基丙氨酸(2’)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(10)..(10)

<223>酰胺化

<400>11

<210>12

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>D-(2’)β-萘基丙氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)..(12)

<223>酰胺化

<400>12

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)..(2)

<223>Nle

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>D-(2’)β-萘基丙氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(9)..(9)

<223>酰胺化

<400>13

<210>14

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>D-Phe(3，4-di-C1)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)..(12)

<223>酰胺化

<400>14

<210>15

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽，环状

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化，Nle

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>c[Asp

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Che

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>DNal(2’)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)..(7)

<223>酰胺化

<400>15

<210>16

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化，N1e

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>c[Asp

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Cpe

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>DNal(2’)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)..(7)

<223>酰胺化

<400>16

<210>17

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>BLOCKED，环(1，6)-suc

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>D氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)..(5)

<223>酰胺化

<400>17

<210>18

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化，D氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>D氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>18

Claims (43)

1.用于增强MC4R多肽活性的方法，该方法包括将表达MC4R的细胞与结合MC4R多肽的药理学陪伴分子相接触，所述药理学陪伴分子的量有效增加MC4R活性。

2.权利要求1的方法，其中所述MC4R多肽是野生型MC4R多肽。

3.权利要求2的方法，其中所述MC4R多肽具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的序列。

4.权利要求1的方法，其中所述MC4R多肽是突变型MC4R多肽。

5.权利要求4的方法，其中所述突变型MC4R多肽包含与MC4R多肽错折叠相关的突变。

6.权利要求4的方法，其中所述突变型MC4R多肽包含选自P78L、R165Q、R165W、I125K、C271Y、T11A、A175T、I316L、I316S、I317T、N97D、G98R、N62S、C271R、S58C、N62S、N97D、Y157S、I102S、L106P、L250Q、Y287X和P299H的突变。

7.权利要求4的方法，其中所述突变型MC4R多肽是R165Q、R165W、S58C、N62S或P299H。

8.权利要求1的方法，其中所述药理学陪伴分子是MC4R拮抗剂。

9.权利要求8的方法，其中所述MC4R拮抗剂具有图5或图6中给出的结构。

10.权利要求1的方法，其中当MC4R多肽正在被折叠成功能构象时，所述药理学陪伴分子结合至该MC4R多肽上。

11.权利要求1的方法，其中受所述药理学陪伴分子增强的活性是腺苷酸环化酶激活。

12.增强MC4R多肽的细胞表面表达的方法，该方法包括将表达MC4R的细胞与结合MC4R多肽的药理学陪伴分子相接触，所述陪伴分子的量有效增加MC4R细胞表面表达。

13.权利要求12的方法，其中当MC4R多肽折叠成功能构象时，所述药理学陪伴分子从MC4R多肽上解离下来。

14.权利要求12的方法，其中所述MC4R多肽是野生型MC4R多肽。

15.权利要求12的方法，其中所述MC4R多肽具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的序列。

16.权利要求12的方法，其中所述MC4R多肽是突变型MC4R多肽。

17.权利要求16的方法，其中所述突变型MC4R多肽包含与MC4R多肽错折叠相关的突变。

18.权利要求16的方法，其中所述突变型MC4R多肽包含选自P78L、R165Q、R165W、I125K、C271Y、T11A、A175T、I316L、I316S、I317T、N97D、G98R、N62S、C271R、S58C、N62S、N97D、Y157S、I102S、L106P、L250Q、Y287X和P299H的突变。

19.权利要求16的方法，其中所述突变型MC4R多肽是R165Q、R165W、S58C、N62S或P299H。

20.权利要求12的方法，其中所述药理学陪伴分子是MC4R拮抗剂。

21.权利要求20的方法，其中所述MC4R拮抗剂具有图5或图6中给出的结构。

22.治疗需要MC4R多肽稳定性增加的个体的方法，该方法包括对所述个体施用结合MC4R多肽的药理学陪伴分子，该药理学陪伴分子的量有效增加稳定性。

23.权利要求22的方法，其中所述药理学陪伴分子是具有如图5或图6中给出的结构的MC4R拮抗剂。

24.权利要求22的方法，其中所述药理学陪伴分子增加MC4R多肽向细胞膜的运输。

25.权利要求22的方法，其中所述个体是肥胖的的或具有发胖的危险。

26.权利要求22的方法，其中所述个体包含MC4R基因中的突变，该突变与肥胖相关。

27.权利要求22的方法，其中将所述药理学陪伴分子用药学上可接受的载体施用。

28.权利要求22的方法，其中所述MC4R多肽是野生型MC4R多肽。

29.权利要求22的方法，其中所述MC4R多肽是突变型MC4R多肽。

30.用于鉴定MC4R的药理学陪伴分子的方法，该方法包括：

(a)将测试化合物与包含表达MC4R多肽的细胞或细胞提取物的反应混合物相接触，其中反应混合物条件允许测试化合物与MC4R多肽结合；

(b)在所述测试化合物存在下检测反应混合物中MC4R多肽的稳定性、活性、或细胞表面定位；和

(c)将所述测试化合物存在下MC4R多肽的稳定性、活性、或细胞表面定位与不存在所述测试化合物时MC4R多肽的稳定性、活性、或细胞表面定位相比较，

其中检测到所述测试化合物存在时比所述测试化合物不存在时增强的稳定性、活性、或细胞表面定位表明所述测试化合物是MC4R的药理学陪伴分子。

31.权利要求30的方法，其中所述MC4R多肽是野生型MC4R多肽。

32.权利要求31的方法，其中所述MC4R多肽包含SEQ ID NO：2中给出的氨基酸序列。

33.权利要求30的方法，其中所述MC4R多肽是突变型MC4R多肽。

34.权利要求33的方法，其中所述MC4R多肽包含与MC4R多肽错折叠相关的突变。

35.权利要求34的方法，其中相对于SEQ ID NO：2中给出的野生型MC4R多肽序列，所述MC4R错折叠突变选自P78L、R165Q、R165W、I125K、C271Y、T11A、A175T、I316L、I316S、I317T、N97D、G98R、N62S、C271R、S58C、N62S、N97D、Y157S、I102S、L106P、L250Q、Y287X、P299H、和S58C。

36.权利要求30的方法，其中所述反应混合物是基于细胞的。

37.权利要求30的方法，其中所述反应混合物是无细胞的。

38.权利要求30的方法，其还包括检测定位于细胞表面的MC4R多肽的活性。

39.权利要求38的方法，其中所述所检测的活性是cAMP激活。

40.权利要求1的方法，其中所述药理学陪伴分子具有图13中描绘的结构。

41.权利要求1的方法，其中所述药理学陪伴分子具有图14中描绘的结构。

42.权利要求1的方法，其中所述药理学陪伴分子具有图15中描绘的结构。

43.权利要求1的方法，其中所述药理学陪伴分子具有图16中描绘的结构。

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