ES2676996T3 - Chaperonas farmacológicas para tratar obesidad - Google Patents

Abstract

Una chaperona farmacológica que es un antagonista del polipéptido de receptor de melanocortina 4 (MC4R) que tiene la siguiente estructura:**Fórmula** en la que la chaperona farmacológica se une a un polipéptido MC4R mutante, para su uso en el tratamiento de obesidad o trastorno por atracón, en la que la chaperona va a administrarse a un individuo que tiene una mutación en el gen MC4R asociado a obesidad, y en la que la mutación está seleccionada del grupo que consiste en T11A, S58C, P78L, N97D, G98R, I102S, I106P, Y157S, R165Q, R165W, A175T, L250Q, C271R, Y287X, I316L, I316S y I317T con respecto a la secuencia del polipéptido MC4R no mutante expuesta en SEQ ID NO: 2.

Description

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DESCRIPCION

Chaperonas farmacologicas para tratar obesidad CAMPO DE LA INVENClON

La invencion se refiere a metodos de potenciamiento de la actividad del receptor de melanocortina-4 (MC4R) normal, y a potenciar la actividad de un MC4R que tiene una mutacion o mutaciones que afectan el plegamiento y/o procesamiento de protemas del MC4R. La invencion proporciona un metodo de tratamiento de un individuo que tiene una afeccion en la que sena beneficiosa elevada actividad de un MC4R en la superficie celular, tal como en obesidad, administrando una cantidad eficaz de una chaperona farmacologica para el MC4R. La invencion proporciona chaperonas farmacologicas para MC4R que potencian la actividad de MC4R. La invencion proporciona ademas un metodo de cribado para identificar chaperonas farmacologicas que potencian el plegamiento de un MC4R en el retmulo endoplasmico (RE), con el fin de potenciar la actividad del MC4R en la superficie celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENClON

Obesidad

La obesidad representa el trastorno del peso corporal mas predominante, y es el trastorno nutricional mas importante en el mundo occidental, con estimaciones de su prevalencia que oscilan del 30 % al 50 % de la poblacion de edad media. El numero de estadounidenses con sobrepeso y obesos ha continuado aumentando desde 1960, una tendencia que no esta desacelerando. Hoy en dfa se cataloga que el 64,5 por ciento de los estadounidenses adultos (aproximadamente 127 millones) tienen sobrepeso o son obesos. Cada ano, la obesidad causa al menos 300.000 muertes en los EE.UU., y los costes sanitarios de los adultos estadounidenses con obesidad ascienden aproximadamente a 100 billones de dolares (Asociacion Americana de la Obesidad).

La obesidad aumenta el riesgo de un individuo de desarrollar afecciones tales como hipertension arterial, diabetes (tipo 2), hiperlipidemia, enfermedad cardfaca, hipertension, accidente cerebrovascular, enfermedad de la vesmula biliar y cancer de mama, prostata y colon (veanse, por ejemplo, Nishina, P. M. et al., 1994, Metab. 43: 554-558; Grundy, S. M. & Barnett, J. P., 1990, Dis. Mon. 36: 641-731). En los EE.UU., la incidencia de tener sobrepeso o ser obeso se produce a tasas mas altas en las poblaciones raciales/etnicas minoritarias tales como afroamericanos e hispanoamericanos, en comparacion con los caucaso-americanos. Mujeres y personas de bajo estatus socioeconomico dentro de las poblaciones minoritarias parecen ser particularmente afectadas por el exceso de peso y la obesidad. Esta tendencia no se limita a los adultos. Aproximadamente el 30,3 por ciento de los ninos (edades 6 a 11) tienen sobrepeso y el 15,3 por ciento son obesos. Para adolescentes (edad 12 a 19), el 30,4 por ciento tienen sobrepeso y el 15,5 por ciento son obesos. La diabetes, hipertension y otras enfermedades cronicas relacionadas con la obesidad que son predominantes entre los adultos han llegado ahora a ser mas comunes en ninos y adultos jovenes. Se informa que habitos alimenticios malos e inactividad contribuyen al aumento de la obesidad en la juventud.

Ademas, factores de riesgo para desarrollar obesidad infantil incluyen tener padres con sobrepeso, o padres no preocupados por el peso de sus hijos, elevado aporte calorico debido a tamanos de porciones grandes, elevado sedentarismo y reducida actividad relacionada con el transporte (caminar a la escuela o a la parada del autobus), tener un temperamento con altos niveles de indignacion/frustracion (que puede causar que los padres den a sus hijos comida y calonas adicionales para reducir los berrinches); tener smdrome de Down, mdice de masa corporal (IMC) durante el embarazo de la madre y estado de primogenito (elevada prevalencia de obesidad).

Una herramienta usada para diagnosticar la obesidad en adultos es calcular el IMC de un individuo, que es una medida del peso corporal para la altura (Garrow y Webster, International Journal of Obesity 1985; 9:147-153). Un IMC de 25 a 29,9 indica que un individuo tiene sobrepeso, mientras que un IMC de 30 o superior es indicativo de obesidad. Para ninos, el IMC es espedfico para el sexo y edad (Pietrobelli et al., Journal of Pediatrics 1998; 132:204-210).

Factores de riesgo para desarrollar obesidad en la adultez incluyen mala dieta (rica en calonas, baja en nutrientes); falta de actividad ffsica; trabajar en turnos variados; dejar de fumar, tener ciertas afecciones medicas tales como enfermedades hereditarias raras y desequilibrios hormonales (tales como hipotiroidismo, enfermedad de Cushing y smdrome del ovario poliquistico); ciertas medicaciones (esteroides y algunos antidepresivos); ser de una minona racial o etnica (especialmente una minona femenina); bajo estatus socioeconomico; edad (riesgo elevado a partir de 20-55), embarazo; y jubilacion (debido a programa alterado).

Receptor de melanocortina 4 y obesidad

El receptor de melanocortina 4 (MC4R) participa en la regulacion del peso corporal (Graham et al, Nat. Genetics 1997; 17: 273-4). MC4R se expresa en el cerebro, que incluye el hipotalamo, que influye en el consumo de alimentos. Se han encontrado numerosas mutaciones que afectan la actividad de MC4R y muchas estan asociadas a la obesidad que incluye obesidad de aparicion temprana (infancia) (Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003,

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278:22939-45; Branson et al., New Eng. J. Med. 2003, 348:1096-1103; Gu et al., Diabetes 1999, 48:635-39; Farooqi et al., New Eng. J. Med. 2003, 348:1085-95; Tao et al., Endocrinology 2003, 144:4544-51).

Actuales tratamientos

Los actuales farmacos contra la obesidad tienen eficacia limitada y numerosos efectos secundarios (Crowley, V. E., Yeo, G. S. & O'Rahilly, S., Nat. Rev. Drug Discov. 2002; 1, 276-86). Con la obesidad alcanzando proporciones epidemicas en el mundo, existe una necesidad urgente del desarrollo de agentes terapeuticos adecuados en esta area. En los ultimos anos, han aparecido hormonas y neuropeptidos implicados en la regulacion del apetito, gasto de energfa corporal y acumulacion de masa de grasa como posibles farmacos contra la obesidad (McMinn, J. E., Baskin, D. G. & Schwartz, M. W., Obes Rev 2000; 1:37-46; Drazen, D. L. & Woods, S. C., Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2003; 6:621-629). Actualmente, sin embargo, estos peptidos requieren administracion parenteral. La posibilidad de inyecciones diarias para controlar la obesidad durante periodos prolongados de tiempo (ya que la obesidad es una afeccion cronica) no es muy alentadora y limita el uso de estos farmacos.

Las chaperonas moleculares estabilizan el adecuado plegamiento de protemas

Las protemas son sintetizadas en el citoplasma, y las protemas recien sintetizadas son secretadas en la luz del retmulo endoplasmico (RE) en un estado ampliamente sin plegar. En general, el plegamiento de protemas esta gobernado por el principio de auto-ensamblaje. Los polipeptidos recien sintetizados se pliegan en su conformacion nativa basada en sus secuencias de aminoacidos (Anfinsen et al., Adv. Protein Chem. 1975; 29:205-300). In vivo, el plegamiento de protemas es complicado, debido a que la combinacion de temperatura ambiente y alta concentracion de protema estimula el proceso de agregacion, en el que aminoacidos normalmente enterrados en el nucleo hidrofobo interaccionan con sus vecinos no espedficamente. Para evitar este problema, el plegamiento de protemas es normalmente facilitado por un grupo de protemas especial llamado chaperonas, que previene que las cadenas de polipeptidos nacientes se agreguen uniendose a protema no plegada de forma que la protema se repliegue en la conformacion nativa (Hartl, Nature 1996; 381:571-580).

Chaperonas moleculares endogenas estan presentes en practicamente todos los tipos de celulas y en la mayona de los compartimentos celulares. Algunas participan en el transporte de protemas y permiten que las celulas sobrevivan bajo tensiones tales como choque termico y privacion de glucosa (Gething et al., Nature 1992; 355:33-45; Caplan, Trends Cell. Biol. 1999; 9:262-268; Lin et al., Mol. Biol. Cell. 1993; 4:109-1119; Bergeron et al., Trends Biochem. Sci. 1994; 19:124-128). Entre las chaperonas endogenas, BiP (protema de union de cadenas pesadas de inmunoglobulina, Grp78) es la chaperona mejor caracterizada del RE (Haas, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1991; 167:71-82). Al igual que otras chaperonas, BiP interacciona con muchas protemas secretoras y de membrana dentro del RE durante su maduracion. Cuando el plegamiento de protemas nacientes avanza suavemente, esta interaccion normalmente es debil y de corta vida. Una vez se logra la conformacion de protema nativa, la chaperona molecular ya no interacciona con la protema. La union de BiP a una protema que deja de plegarse, ensamblarse, o ser apropiadamente glucosilada, llega a ser estable, y normalmente conduce a degradacion de la protema mediante la via de degradacion asociada al RE. Este proceso sirve de sistema de "control de calidad" en el Re, que asegura que solo aquellas protemas apropiadamente plegadas y ensambladas seran transportadas fuera del RE para maduracion adicional, y protemas inapropiadamente plegadas son retenidas para la posterior degradacion (Hurtley et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 1989; 5:277-307). Debido a las acciones combinadas de la ineficiencia del proceso de plegamiento termodinamico de protemas y el sistema de control de calidad del RE, solo una fraccion de protemas nacientes (no mutadas) llegara a plegarse en una conformacion funcional y saldra satisfactoriamente del rE.

Chaperonas farmacologicas derivadas de inhibidores enzimaticos especificos rescatan enzimas mutantes y potencian enzimas no mutantes

Se ha mostrado previamente que los inhibidores de molecula pequena de enzimas asociadas a trastornos de almacenamiento lisosomal (LSD) pueden tanto rescatar el plegamiento como la actividad de la enzima mutante, y potenciar el plegamiento y la actividad de la enzima no mutante (veanse las patentes de EE.UU. N.° 6.274.597; 6.583.158; 6.589.964; 6.599.919; y 6.916.829). En particular, se descubrio que la administracion de derivados de molecula pequena de glucosa y galactosa, que eran inhibidores espedficos competitivos de enzimas mutantes asociadas a LSD, aumentaron eficazmente in vitro e in vivo la estabilidad de las enzimas mutantes y potenciaron la actividad enzimatica mutante. La teona original tras esta estrategia es la siguiente: como la protema enzimaticamente mutante se pliega inapropiadamente en el RE (Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815), la protema enzimatica es retrasada en la via de transporte normal (RE ^ aparato de Golgi ^ endosoma ^ lisosoma) y se degrada rapidamente. Por tanto, un compuesto que estabiliza el correcto plegamiento de una protema mutante servira de chaperona espedfica de sitio activo para que la protema mutante promueva su suave escape del sistema de control de calidad del RE. Los inhibidores enzimaticos ocupan el centro catalttico, produciendo la estabilizacion de la conformacion de enzima en celulas en cultivo y en animales. Estas chaperonas espedficas se designaron "chaperonas espedficas de sitio activo (ASSC)", ya que se unieron en el sitio activo de la enzima.

Ademas de rescatar las enzimas mutantes, las ASSC potencian la secrecion del RE y actividad de enzimas no mutantes recombinantes. Una ASSC facilita el plegamiento de enzima no mutante expresada en exceso, que es de

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otro modo retardada en el sistema de control de calidad del RE debido a que la expresion en exceso y la produccion en exceso de la enzima superan la capacidad del RE y conduce a agregacion y degradacion de protema. As^ un compuesto que induce una conformacion molecular estable de una enzima durante el plegamiento sirve de "chaperona" para estabilizar la enzima en una conformacion apropiada para la salida del Re. Como se observa anteriormente, para enzimas, un compuesto tal resulto ser inesperadamente un inhibidor competitivo de la enzima.

Potenciamiento de otras protemas con chaperonas

Ademas de LSD, ahora se reconocen un gran numero y variado de enfermedades como "enfermedades conformacionales", que son causadas por la adopcion de conformaciones distintas de protema nativa, que pueden conducir al retardo de la protema en el RE y la degradacion definitiva de las protemas (Kuznetsov et al., N. Engl. J. Med. 1998; 339:1688-1695; Thomas et al., Trends Biochem. Sci. 1995; 20:456-459; Bychkova et al., FEBS Lett. 1995; 359:6-8; Brooks, FEBS Lett. 1997; 409:115-120).

Por ejemplo, se encontro que compuestos sinteticos pequenos estabilizaban el dominio de union de ADN de formas mutantes de la protema supresora de tumor p53, permitiendo asf que la protema mantuviera una conformacion activa (Foster et al., Science 1999; 286:2507-10). Se ha mostrado que la smtesis de receptores es rescatada por antagonistas de receptores de molecula pequena y ligandos (Morello et al., J. Clin. Invest. 2000; 105: 887-95; Petaja- Repo et al., EMBO J. 2002; 21:1628-37). Incluso se ha demostrado el rescate farmacologico de protemas del canal de membrana y otros transportadores de membrana plasmatica usando farmacos bloqueadores de canales o sustratos (Rajamani et al., Circulation 2002; 105:2830-5; Zhou et al., J. Biol. Chem. 1999; 274:31123-26; Loo et al., J. Biol. Chem. 1997; 272: 709-12; Pedemonte et al., J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71).

Sigue existiendo en la materia una necesidad particular de tratar deficiencias en la funcion de protemas MC4R que esten tanto relacionadas como sin relacionar con mutacion de MC4R.

SUMARIO DE LA INVENCION

Como se ha descrito en el presente documento, la presente invencion proporciona una chaperona farmacologica para potenciar la actividad del receptor de melanocortina-4 (MC4R), por ejemplo, para el tratamiento de obesidad, en sujetos que tienen una mutacion de plegamiento en el gen que codifica MC4R, o en sujetos para los que sena beneficioso un aumento en la actividad de MC4R no mutante.

Segun un aspecto de la presente invencion, se proporciona una chaperona farmacologica como se define en la reivindicacion 1. El potenciar el plegamiento intracelular de MC4R, produciendo potenciada expresion sobre la superficie celular de, por ejemplo, neuronas del hipotalamo, reduce el deseo de comer, y, por tanto, es util en el tratamiento de trastornos de comer en exceso, tales como trastornos por atracon.

Preferentemente, la chaperona farmacologica se une al polipeptido MC4R mutante para aumentar la actividad de MC4R mutante; aumentar la expresion de la superficie celular de MC4R mutante; y/o aumentar la estabilidad.

Preferentemente, el polipeptido MC4R mutante comprende la mutacion R165Q, R165W o S58C en comparacion con SEQ ID NO: 2.

Preferentemente, la chaperona farmacologica se une al polipeptido MC4R mutante ya que esta plegado en una conformacion funcional.

Preferentemente, la actividad potenciada por la chaperona farmacologica es activacion de adenilil ciclasa.

Preferentemente, la actividad potenciada por la chaperona farmacologica es activacion de adenilil ciclasa.

Preferentemente, la chaperona farmacologica aumenta el trafico de polipeptido MC4R mutante a la membrana celular.

Preferentemente, la chaperona farmacologica va a administrarse en un vehmulo farmacologicamente aceptable. Preferentemente, la chaperona se administra en una cantidad de 1 a 100 mg/kg de peso corporal por dfa.

La presente invencion se entendera ademas por referencia a Descripcion detallada y Ejemplos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

FIG. 1. Un agonista de receptores de melanocortina-4 de rata y humanos, como se informa por Sebhat, 2002, J Med Chem, 45, 4589-4593 (compuesto 1).

FIG. 2. Un agonista de MC4R humano, como se informa por Richardson, 2004, J Med Chem 47, 744-755 (compuesto 2).

FIG. 3. Esquema sintetico para el compuesto 1.

FIG. 4. Esquema sintetico para el compuesto de 2.

FIG. 5. Un antagonista de MC4R, como se informa por Arasasingham, 2003, J Med Chem 46, 9-11 (compuesto 3).

FIG. 6. Un antagonista de MC4R (compuesto 4); la actividad biologica de este compuesto se informa en el documento WO 02/062766 usando un ensayo de proximidad de centelleo.

5 FIG. 7. Esquema sintetico para el compuesto 3.

FIG. 8. Esquema sintetico para el compuesto 4.

FIG. 9. Un compuesto de bisaminotiazol descrito en Pedemonte et al., J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71 (compuesto 5).

FIG. 10A-D. Compuestos 6-25 descritos abajo.

10 FIG 11. Ensayo de senalizacion de MC4R en mutantes de MC4R tratados con agonista de ligando y con y sin chaperonas antagonistas.

FIG. 12. Actividad media de a-galactosidasa A en globulos blancos de voluntarios sanos normales que recibieron 50 mg de 1-desoxigalactonojirimicina (DGJ) b.i.d. (triangulos), 150 mg de DGJ b.i.d. (cuadrados), o placebo (drculos blancos).

15 FIG. 13. Estructura de la clase de compuestos basada en los compuestos 1, 2, 6, 7 y 12-17.

FIG. 14. Estructura de la clase de compuestos basada en los compuestos 3, 9, 10, 11 y 21.

FIG. 15. Estructura de la clase de compuestos basada en los compuestos 4, 8, 24 y 25.

FIG. 16. Estructura de la clase de compuestos basada en los compuestos 18-20.

DESCRIPCION DETALLADA

20 La presente invencion se refiere al descubrimiento de que puede identificarse que moleculas pequenas rescatan el plegamiento y procesamiento de protemas de polipeptidos MC4R mutante y no mutantes y potencian la estabilidad de protemas sobre la superficie celular de neuronas, que a su vez, disminuye el hambre y el comer en exceso. Las chaperonas farmacologicas se unen espedficamente a la protema MC4R e inducen o estabilizan una conformacion funcional de MC4R mutante o no mutante. La invencion, por tanto, permite el rescate espedfico de MC4R mutante, 25 ademas de la potenciada expresion de MC4R no mutante en la superficie celular. Por consiguiente, pueden usarse chaperonas farmacologicas para MC4R para el tratamiento de trastornos donde se desee el rescate de, o elevada estabilidad o actividad de, MC4R, por ejemplo, la afeccion de tener sobrepeso o ser obeso.

La invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que la administracion de una chaperona farmacologica a un ser humano produjo un aumento significativo en el nivel de actividad de una protema natural. Este descubrimiento, 30 combinado con un entendimiento de la capacidad de una chaperona farmacologica para promover el apropiado plegamiento de protemas en el RE, que conduce al correcto trafico de protemas y aumento significativamente la actividad de protemas, proporciona ventajosamente la capacidad de lograr actividad de protemas suficiente para invertir o mejorar una enfermedad, trastorno, o afeccion, particularmente en un sujeto humano. Este fenomeno es altamente espedfico para la protema espedficamente unida por la chaperona farmacologica particular, a diferencia 35 de metodos que usan compuestos que operan generalmente para aumentar la expresion de todas las protemas, llamadas "chaperonas qdmicas".

Ciertos resultados experimentales subyacen a la presente invencion: chaperonas farmacologicas aumentaron la actividad de protema naturales endogenas en seres humanos a aproximadamente el 120 % de la normalidad, 130 % de la normalidad y 145 % de la normalidad a dosis mas bajas, y al 150 % y 185 % de la normalidad a una mayor 40 dosis despues de la administracion de una chaperona farmacologica (vease el Ejemplo 7 y la Figura 12). Este nivel de aumento in vivo no fue predecible de los resultados con celulas en cultivo de tejido que siguen expuestas a la chaperona farmacologica. Por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 6.274.597 describe un aumento del 30 % de la actividad de a-galactosidasa A (a-Gal A) en linfoblastos normales cultivados in vitro con desoxigalactonojirimicina (DGJ), una chaperona farmacologica. Dada la esperanza de que cupiera esperar que los procesos de fisiologica 45 redujeran los efectos de las chaperonas farmacologicas en protemas normales in vivo, no se espero que una chaperona farmacologica diera un aumento significativo en la actividad de protema natural. El Ejemplo 10 de la patente de EE.UU. N.° 6.274.597 describe un aumento en la actividad de una enzima mutante en ratones transgenicos tratados durante una semana con una chaperona farmacologica. Sin embargo, estos experimentos implicaron formas mutantes de la protema rescatada, no de tipo no mutante, y fueron conducidas en ratones, de 50 manera que los resultados no fueron predictivos o sugerentes de los resultados observados para protema natural en seres humanos.

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No hubo base para esperar que una chaperona farmacologica pudiera aumentar el nivel de actividad de una protema natural in vivo al menos el 20-25 %, es decir, al menos 1,2 veces o el 120 % de la normalidad, o el 30 % (1,3 veces, 130% de la normalidad), 40% (1,4 veces, 140% de la normalidad), y particularmente no al menos aproximadamente el 50 % (1,5 veces, 150% de la normalidad). Sin embargo, como se ejemplifica en el presente documento, la administracion de DGJ a sujetos produjo un aumento dependiente de la dosis en a-Gal A. Este extraordinario efecto resulta de valorar la chaperona farmacologica, que ya se ha demostrado segun tecnologfa existente que rescata una forma mutante de la protema, para lograr el aumento desvelado en la actividad o protema natural. Por consiguiente, la invencion proporciona valorar una dosis de una chaperona farmacologica que se ha encontrado que rescata la actividad de una protema mutante para aumentar el nivel de actividad de una protema natural una cantidad definida.

Definiciones

Los terminos usados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados habituales en la materia, dentro del contexto de la presente invencion y en el contexto espedfico donde ese usa cada termino. Ciertos terminos se tratan a continuacion, o en cualquier parte en la memoria descriptiva, para proporcionar orientacion adicional al medico en la descripcion de las composiciones y metodos de la invencion y como prepararlos y usarlos.

Como se usa en el presente documento, el termino "chaperona farmacologica", o algunas veces "chaperona farmacologica espedfica" ("SPC"), se refiere a una molecula que se une espedficamente a MC4R y tiene uno o mas de los siguiente efectos: (i) potenciar la formacion de una conformacion molecular estable de la protema; (ii) potencia el apropiado trafico de la protema desde el RE a otra localizacion celular, preferentemente una localizacion celular nativa, es decir, previene la degradacion asociada al RE de la protema; (iii) prevenir la agregacion de protemas conformacionalmente inestables, es decir, erroneamente plegadas; (iv) restaurar o potenciar al menos parcialmente la funcion de no mutante, estabilidad y/o actividad de la protema; y/o (v) mejorar el fenotipo o la funcion de la celula que aloja el MC4R. Asf, una chaperona farmacologica para MC4R es una molecula que se une a MC4R, produciendo el apropiado plegamiento, trafico, no agregacion y actividad de MC4R. Como se usa en el presente documento, este termino no se refiere a chaperonas endogenas, tales como BiP, o a agentes no espedficos que han demostrado actividad de chaperona no espedfica contra diversas protemas, tales como glicerol, DMSO o agua deuterada, es decir, chaperonas qmmicas (veanse Welch et al., Cell Stress and Chaperones 1996; 1(2):109-115; Welch et al., Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997; 29(5):491-502; patente de EE.UU. N.° 5.900.360; patente de EE.UU. N.° 6.270.954; y patente de EE.UU. N.° 6.541.195). Incluye moleculas de union espedfica, por ejemplo, chaperonas farmacologicas espedficas (tratadas anteriormente), inhibidores o antagonistas, y agonistas.

Como se usa en el presente documento, el termino "se une espedficamente a" se refiere a la interaccion de una chaperona farmacologica con MC4R, espedficamente, una interaccion con restos de aminoacidos de MC4R que participan directamente en el contacto de la chaperona farmacologica. Una chaperona farmacologica se une espedficamente a una protema diana, aqrn MC4R, para ejercer un efecto de chaperona sobre MC4R, y no sobre un grupo generico de protemas relacionadas o sin relacionar. Los restos de aminoacidos de MC4R que interaccionan con cualquier chaperona farmacologica de MC4R dada pueden o pueden no estar dentro del dominio de union de ligando de MC4R, es decir, el dominio que se une al ligando natural MSH, o cualquier otro "sitio activo" de MC4R, por ejemplo, el dominio de union de protema G. La union espedfica puede evaluarse mediante ensayos de union rutinarios o mediante estudios estructurales, por ejemplo, co-cristalizacion, RMN, y similares. Ejemplos de aminoacidos del dominio de union del ligando MSH de MC4R incluyen, pero no se limitan a, Phe284 y Tyr268 (usando, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 como secuencia de referencia).

En una realizacion no limitante, la chaperona farmacologica es un inhibidor o antagonista de MC4R. En otra realizacion no limitante, la chaperona farmacologica es un agonista de MC4R. En otra realizacion mas, la chaperona farmacologica es un agonista/antagonista mixto. Como se usa en el presente documento, el termino "antagonista" se refiere a cualquier molecula que se une a una protema y, ya sea parcialmente o completamente, bloquea, inhibe, reduce o neutraliza una actividad de MC4R. El termino "agonista" se refiere a cualquier molecula que se une a una protema y al menos aumenta, potencia, restaura o imita parcialmente una actividad de MC4R. Como se trata mas adelante, tales moleculas son conocidas para MC4R.

Como se usa en el presente documento, los terminos "potencian la estabilidad conformacional de MC4R" o "aumentan la estabilidad conformacional de MC4R" se refieren a aumentar la cantidad o proporcion de MC4R que adopta una conformacion funcional en una celula puesta en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para MC4R, con respecto a MC4R en una celula (preferentemente del mismo tipo de celula o la misma celula, por ejemplo, en un momento anterior) no puesta en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para MC4R. En una realizacion, las celulas no expresan una conformacion MC4R mutante. En otra realizacion, las celulas expresan un polinucleotido MC4R mutante que codifica un polipeptido, por ejemplo, un MC4R mutante conformacional.

Como se usa en el presente documento, los terminos "potencian el trafico de MC4R" o "aumentan el trafico de MC4R" se refieren a aumentar la eficiencia de transporte de MC4R a la membrana plasmatica en una celula puesta en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para MC4R, con respecto a la eficiencia de transporte de MC4R en una celula (preferentemente del mismo tipo de celula o la misma celula, por ejemplo, en un momento anterior) no puesta en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para MC4R.

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Como se usa en el presente documento, los terminos "potencian la actividad de MC4R" o "aumentan la actividad de MC4R" se refieren a aumentar la actividad de MC4R, como se describe en el presente documento, en una celula puesta en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para MC4R, con respecto a la actividad de MC4R en una celula (preferentemente del mismo tipo de celula o la misma celula, por ejemplo, en un momento anterior) no puesta en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para MC4R.

Como se usa en el presente documento, los terminos "potencian el nivel de MC4R" o "aumentan el nivel de MC4R" se refieren a aumentar el nivel de MC4R en una celula puesta en contacto con una chaperona farmacologica espedfica para MC4R, con respecto al nivel de MC4R en una celula (preferentemente del mismo tipo de celula o la misma celula, por ejemplo, en un momento anterior) no puesta en contacto con la chaperona farmacologica espedfica para MC4R.

El termino "estabilizar una conformacion apropiada" se refiere a la capacidad de una chaperona farmacologica para MC4R para inducir o estabilizar una conformacion de una protema MC4R mutada que es funcionalmente identica a la conformacion de la protema MC4R no mutante. El termino "funcionalmente identica" significa que aunque puede haber variaciones menores en la conformacion (casi todas las protemas presentan alguna flexibilidad conformacional en su estado fisiologico), la flexibilidad conformacional no produce (1) agregacion de protemas, (2) eliminacion mediante la via de degradacion asociada al retmulo endoplasmico, (3) alteracion de la funcion de protema, por ejemplo, la capacidad de unir ligando y/o activar actividad de adenilil ciclasa, y/o (4) transporte inapropiado dentro de la celula, por ejemplo, localizacion en la membrana plasmatica, a un mayor o menor grado que el de la protema natural.

El termino "conformacion molecular estable" se refiere a una conformacion de una protema, es decir, MC4R, inducida por una chaperona farmacologica, que proporciona funcion de no mutante al menos parcial en la celula. Por ejemplo, una conformacion molecular estable de un mutante MC4R sena una donde MC4R escapa del RE y es enviado a la membrana celular como para un MC4R no mutante, en lugar de plegarse erroneamente y ser degradado. Ademas, una conformacion molecular estable de un MC4R mutado tambien puede poseer actividad completa o parcial de MC4R, por ejemplo, actividad activadora de adenilil ciclasa para generacion potenciada de AMPc mediante su protema G fisiologica relacionada. Sin embargo, no es necesario que la conformacion molecular estable tenga todos los atributos funcionales de la protema natural.

El termino "actividad de MC4R" se refiere a la funcion fisiologica normal de un MC4R no mutante en una celula. Por ejemplo, tras la union por un agonista, senales de MC4R mediante interaccion con una protema G, Gas, y activacion de adenilato ciclasa (vease, por ejemplo, VanLeeuwen et al., J Biol. Chem. 2003; 18: 15935-40). Esto produce la acumulacion intracelular de AMPc y la activacion de protema cinasa A (PKA). Tal funcionalidad puede probarse por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, pueden usarse ensayos de union del ligando a-, p- o y-MSh, o agonista de 125I-[Nle4,D-Phe7]a-MSH a MC4R, o usando ensayos de activacion de adenilil ciclasa, o ensayos de gen indicador de luciferasa, para determinar aumentos en AMPc intracelular. Los ensayos de acumulacion de AMP dclico son muy conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, VanLeeuwen et al., J Biol. Chem. 2003; 18: 15935-40).

"MC4R" se refiere a un polipeptido codificado por una secuencia de nucleotidos que tiene la secuencia como se representa en uno cualquiera de: SEQ ID NO: 1 (humana; N° de acceso de GenBank BC069172); 3 (humana; N° de acceso de GenBank nM_005912); 5 (rata; N° de acceso de GenBank NM_013099); o 7 (murina; N° de acceso de GenBank NM_016977).

Un "polipeptido MC4R" tambien se refiere a una secuencia de aminoacidos como se representa en SEQ ID NO: 2 (humana; N° de acceso de GenBank AAI01803); 4 (humana; N° de acceso de GenBank Nm_005912); 6 (rata; N° de acceso de GenBank NM_013099); o 8 (murina; N° de acceso de GenBank AF201662), y cualquier otra secuencia de aminoacidos que codifica un polipeptido MC4R que tiene la misma funcion y afinidad de union de ligando que una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.

El termino "MC4R no mutante" se refiere al nucleotido (SEQ ID NO: 1, 3, 5 y 7) secuencias que codifican MC4R, y secuencias de polipeptidos (SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8) codificadas por las secuencias de nucleotidos anteriormente mencionadas (acceso de GenBank de MC4R humano AAI01803; N° de acceso de GenBank de MC4R humano NM_005912; N° de acceso de GenBank de MC4R de rata NM_013099; y N° de acceso de GenBank de MC4R de raton AF201662), y cualquier otra secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido MC4R (que tiene las mismas propiedades funcionales y afinidades de union que las secuencias de polipeptidos anteriormente mencionadas), tal como variantes alelicas en individuos normales, que tienen la capacidad de lograr una conformacion funcional en el RE, lograr localizacion apropiada dentro de la celula y presentar actividad no mutante (por ejemplo, estimulacion de MC4R de acumulacion de AMPc).

Como se usa en el presente documento, el termino "MC4R mutante" se refiere a un polipeptido MC4R traducido de un gen que contiene una mutacion genetica que produce una secuencia de aminoacidos de MC4R alterada. En una realizacion, la mutacion produce una protema MC4R que no logra una conformacion nativa en las condiciones normalmente presentes en el RE, cuando se compara con MC4R no mutante, o presenta estabilidad o actividad reducida en comparacion con MC4R no mutante. Este tipo de mutacion se denomina en el presente documento una "mutacion conformacional", y la protema que lleva una mutacion tal se denomina un "mutante conformacional". El

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dejar de lograr esta conformacion produce protema MC4R que se degrada o agrega, en vez de ser transportada a traves de una v^a normal en el sistema de transporte de protema a su localizacion nativa en la celula o en el entorno extracelular. En algunas realizaciones, puede producirse una mutacion en una parte no codificante del gen que codifica MC4R que produce expresion menos eficiente de la protema, por ejemplo, una mutacion que afecta la eficiencia de transcripcion, eficiencia de corte y empalme, estabilidad de ARNm, y similares. Potenciando el nivel de expresion de variantes no mutantes, ademas de mutantes conformacionales, de MC4R, la administracion de una chaperona farmacologica MC4R puede mejorar un deficit resultante de tal expresion ineficiente de protemas.

Mutaciones a modo de ejemplo (usando el polipeptido de SEQ ID NO: 2 como referencia) incluyen P78L, R165Q y R165W. Otros mutantes de MC4R incluyen I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, CTCT en el codon 211, e insercion de TGAT en el codon 244. Ademas, otras mutaciones de MC4R (otra vez usando SEQ ID NO: 2 como referencia) incluyen aquellas descritas en la Tabla 1, abajo.

Ciertas pruebas pueden evaluar atributos de una protema que puede o puede no corresponderse con su actividad real in vivo, pero, sin embargo, son sustitutos apropiados de funcionalidad de protema, y comportamiento de no mutante en tales pruebas demuestra evidencia para soportar las tecnicas de rescate o potenciamiento del plegamiento de protemas de la invencion. Una actividad tal segun la invencion es el transporte apropiado de un MC4R funcional desde el retmulo endoplasmico a la membrana celular.

Los terminos "expresion endogena" y "expresado endogenamente" se refieren a la expresion fisiologica normal de MC4R en celulas en un individuo que no tiene o que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno asociado a deficiencia de MC4R, expresion en exceso de un mutante negativo dominante, u otro defecto, por ejemplo, obesidad, tal como una mutacion en la secuencia de acidos nucleicos o de polipeptidos de MC4R que altera, por ejemplo, inhibe su expresion, actividad o estabilidad. Este termino tambien se refiere a la expresion de MC4R en celulas o tipos de celulas en las que normalmente se expresa en individuos sanos, y no incluye la expresion de MC4R en celulas o tipos de celulas, por ejemplo, celulas tumorales, en las que MC4R no se expresa en individuos sanos.

Como se usa en el presente documento, el termino "eficiencia de transporte" se refiere a la capacidad de una protema mutante para ser transportada fuera del retmulo endoplasmico a su localizacion nativa dentro de la celula, membrana celular, o en el entorno extracelular.

Los terminos "dosis terapeuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a una cantidad suficiente para potenciar el procesamiento de protemas en el RE (que permite una conformacion funcional), sin inhibir la protema ya expresada en la localizacion celular apropiada (en el caso de un antagonista), o sin inducir internalizacion por receptor mediada por ligando de protema de la localizacion celular apropiada (en el caso de un agonista), y potenciar la actividad de la protema diana, produciendo asf una respuesta terapeutica en un sujeto. Una respuesta terapeutica puede ser cualquier respuesta que un usuario (por ejemplo, un medico) reconocera como una respuesta eficaz a la terapia, que incluye los smtomas anteriores y marcadores clmicos sustitutos. Asf, una respuesta terapeutica generalmente sera una mejora o inhibicion de uno o mas smtomas de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, obesidad o trastorno por atracon.

La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiologicamente tolerables y no producen normalmente reacciones inapropiadas cuando se administran a un ser humano. Preferentemente, como se usa en el presente documento, el termino "farmaceuticamente aceptable" significa autorizado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino "vehmulo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehmulo con el que el compuesto se administra. Tales vehmulos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites. Agua o soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferentemente como vehmulos, particularmente para disoluciones inyectables. Vehmulos farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin, 18a Edicion, u otras ediciones.

El termino "aproximadamente" debe significar generalmente un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o precision de las mediciones. Grados tfpicos, a modo de ejemplo, de error estan dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10 %, y mas preferentemente dentro del 5 % de un valor o intervalo de valores dado. Alternativamente, y particularmente en sistemas biologicos, el termino "aproximadamente" puede significar valores que estan dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y mas preferentemente dentro de 2 veces de un valor dado. Cantidades numericas dadas en el presente documento son aproximadas, a menos que se establezca de otro modo, que significa que el termino "aproximadamente" puede deducirse cuando no se establezca expresamente.

Como se usa en el presente documento, el termino "aislado" significa que el material referenciado se elimina del entorno en el que normalmente se encuentra. Asf, un material biologico aislado puede estar libre de componentes celulares, es decir, componentes de las celulas en los que el material se encuentra o produce. En el caso de moleculas de acidos nucleicos, un acido nucleico aislado incluye un producto de PCR, una banda de ARNm sobre un gel, un ADNc, o un fragmento de restriccion. En otra realizacion, un acido nucleico aislado se corta

preferentemente del cromosoma en el que puede encontrarse, y mas preferentemente ya no se une a las regiones no codificantes no reguladoras, o a otros genes, localizados en la direccion 5' o en la direccion 3' del gen contenido por la molecula de acido nucleico aislada cuando se encuentra en el cromosoma. En otra realizacion mas, el acido nucleico aislado carece de uno o mas intrones. Los acidos nucleicos aislados incluyen secuencias insertadas en 5 plasmidos, cosmidos, cromosomas artificiales, y similares. As^ en una realizacion espedfica, un acido nucleico recombinante es un acido nucleico aislado. Una protema aislada puede asociarse a otras protemas o acidos nucleicos, o ambos, con los que esta asociado en la celula, o con membranas celulares si es una protema asociada a membrana. Un organulo aislado, celula, o tejido se extrae del sitio anatomico en el que se encuentra en un organismo. Un material aislado puede estar, pero no necesita estar, purificado.

10 El termino "purificado", como se usa en el presente documento, se refiere a material, tal como un acido nucleico o polipeptido MC4R, que ha sido aislado en condiciones que reducen o eliminan materiales no relacionados, es decir, contaminantes. Por ejemplo, una protema purificada esta preferentemente sustancialmente libre de otras protemas o acidos nucleicos con los que esta asociado en una celula. Como se usa en el presente documento, el termino "sustancialmente libre" se usa operacionalmente, en el contexto de las pruebas analtticas de material. 15 Preferentemente, el material purificado sustancialmente libre de contaminantes es al menos el 50% puro; mas preferentemente, al menos el 90 % puro, y mas preferentemente todavfa al menos el 99 % puro. La pureza puede evaluarse por medios convencionales, por ejemplo, cromatograffa, electroforesis en gel, inmunoensayo, analisis de composicion, ensayo biologico, y otros metodos conocidos en la tecnica.

El termino "Me" significa metilo, "Et" significa etilo y "Ac" significa acetilo.

20 El termino "halogeno", a menos que se indique lo contrario, significa fluor, cloro, bromo o yodo. Grupos halogeno preferidos son fluor, cloro y bromo.

El termino "alquilo", a menos que se indique lo contrario, incluye radicales de hidrocarburo monovalente saturado que tienen restos lineales, ramificados o dclicos (que incluyen restos bidclicos y espirodclicos fusionados y unidos por puente), o una combinacion de los restos anteriores. Para que un grupo alquilo tenga restos dclicos, el grupo 25 debe tener al menos tres atomos de carbono.

El termino "cicloalquilo", a menos que se indique lo contrario, incluye restos de alquilo dclicos en los que alquilo es como se ha definido anteriormente. El uso del termino "cicloalquilo" no debe considerarse como limitante del termino "alquilo" a restos no dclicos.

El termino "alquenilo", a menos que se indique lo contrario, incluye restos alquilo que tienen al menos un doble 30 enlace carbono-carbono en el que el alquilo es como se ha definido anteriormente y que incluye isomeros E y Z de dicho resto alquenilo.

El termino "alquinilo", a menos que se indique lo contrario, incluye restos alquilo que tienen al menos un triple enlace carbono-carbono en el que alquilo es como se ha definido anteriormente.

El termino "alcoxi", a menos que se indique lo contrario, incluye grupos O-alquilo en los que alquilo es como se ha 35 definido anteriormente.

El termino "arilo", a menos que se indique lo contrario, incluye un radical organico derivado de un hidrocarburo aromatico por eliminacion de un hidrogeno, tal como fenilo o naftilo.

El termino "heterodclico de 4 a 10 miembros", a menos que se indique lo contrario, incluye grupos heterodclicos aromaticos y no aromaticos que contienen uno a cuatro heteroatomos cada uno seleccionado de 0, S y N, en el que 40 cada grupo heterodclico tiene de 4 a 10 atomos en su sistema de anillos, y con la condicion de que el anillo de dicho grupo no contenga dos atomos de O o S adyacentes. Grupos heterodclicos no aromaticos incluyen grupos que tienen solo 4 atomos en su sistema de anillos, pero los grupos heterodclicos aromaticos deben tener al menos 5 atomos en su sistema de anillos. Los grupos heterodclicos incluyen sistemas de anillos benzo-condensados. Un ejemplo de un grupo heterodclico de 4 miembros es azetidinilo (derivado de azetidina). Un ejemplo de un grupo 45 heterodclico de 5 miembros es tiazolilo y un ejemplo de un grupo heterodclico de 10 miembros es quinolinilo.

Ejemplos de grupos heterodclicos no aromaticos son pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1,350 dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo[3.1.0]hexanilo, 3-azabiciclo[4.1.0]heptanilo, azabiciclo[2.2.2]hexanilo, 3H-indolilo y quinolizinilo. Ejemplos de grupos heterodclicos aromaticos son piridinilo, imidazolilo, pirimidinilo, pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, cinnolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, 55 pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo y furopiridinilo. Restos espiro tambien estan incluidos dentro del alcance de esta definicion que incluye 1-oxa-6-aza-espiro[2.5]oct-6-ilo. Los grupos anteriores, como derivaron de los grupos enumerados anteriormente, pueden estar unidos en C o unidos en N donde tal sea posible. Por ejemplo, un grupo

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derivado de pirrol puede ser pirrol-1-ilo (unido en N) o pirrol-3-ilo (unido en C). Ademas, un grupo derivado de imidazol puede ser imidazol-1-ilo (unido en N) o imidazol-3-ilo (unido en C).

La expresion "sal(es) farmaceuticamente aceptable(s)", a menos que se indique lo contrario, incluye sales de grupos acidos o basicos que pueden estar presentes en un compuesto usado en los metodos de la invencion. Compuestos que son basicos en la naturaleza son capaces de formar una amplia variedad de sales con diversos acidos inorganicos y organicos. Los acidos que pueden usarse para preparar sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables de tales compuestos basicos son aquellos que forman sales de adicion de acido no toxicas, es decir, sales que contienen aniones farmacologicamente aceptables, tales como las sales acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bisulfato, bitartrato, borato, bromuro, edetato de calcio, camsilato, carbonato, cloruro, clavulanato, citrato, diclorhidrato, edetato, disilato, estolato, esilato, etilsuccinato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromhidrato, clorhidrato, yoduro, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metilsulfato, mucato, napsilato, nitrato, oleato, oxalato, pamoato (embonato), palmitato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, tannato, tartrato, teoclato, tosilato, trietyoduro y valerato. Como un unico compuesto puede incluir mas de un resto acido o basico, un compuesto tal puede incluir mono, di o tri-sales en un unico compuesto.

Receptor de melanocortina 4

Los receptores de melanocortina (MC) son miembros de la superfamilia de receptores acoplados a protema G de siete dominios transmembranarios que activan la generacion del segundo mensajero AMP dclico (AMPc). Hasta la fecha se han aislado cinco receptores de MC: MC1R, MC2R, MC3R, MC4R y mC5R. MC2R es el receptor para la hormona adrenocorticotropica (ACTH). MC4R humano tiene 332 aminoacidos de longitud.

El receptor de melanocortina 4 (MC4R) participa en la regulacion del peso corporal (Graham et al, Nat. Genetics 1997; 17: 273-4). MC4R se expresa en el cerebro, que incluye el hipotalamo, que influye en el consumo de alimentos. La senalizacion mediante MC4R estimula las vfas neurales anorexigenicas. Ratones nulos en MC4R desarrollan obesidad de aparicion tardfa con hiperglucemia e hiperinsulinemia. Ratones que carecen de un alelo de MC4R (heterocigotos) tienen peso corporal intermedio entre ratones nulos no mutantes y homocigoticos. En seres humanos, la deficiencia de MC4R es la forma monogenica mas comun de obesidad (Farooqi et al., New Engl. J. Med. 2003; 348: 1085-95). Ratones transgenicos que expresan en exceso un antagonista de MC4R endogeno, protema relacionada con agouti (AgRP), presentaron elevado aumento de peso, consumo de alimentos y longitud del cuerpo en comparacion con companeros de camada no transgenicos (Ollman et al., Science 1997; 278: 135-37).

Se han identificado numerosas mutaciones, encontradas principalmente en individuos obesos, en el gen MC4R humano, que incluye mutaciones de desplazamiento del marco, finalizadoras y de aminoacido (Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 22939-45). Al menos dos grupos de investigadores han confirmado que MC4R esta mutado en aproximadamente el 5 % de los individuos obesos. Portadores de mutaciones de MC4R demostraron hiperfagia e hiperinsulinemia, tuvieron densidad mineral osea por encima del promedio y crecimiento lineal mas rapido que los sujetos de control del mismo IMC. Farooqi et al. tambien han encontrado que las propiedades de senalizacion de los receptores de MC4R mutante se correlacionaron con la gravedad de la obesidad.

Varios autores han revisado ahora los recientes avances a nuestro entendimiento de la genetica de MC4R en la obesidad de aparicion temprana (vease por ejemplo, Farooqi IS, O'Rahilly S, Int J Obes (Lond), 2005 Oct, 29(10), 1149-52; Govaerts C, Srinivasan S, Shapiro A, Zhang S, Picard F, Clement K, Lubrano-Berthelier C, Vaisse C, Peptides, 2005 Oct, 26(10), 1909-19; Tao YX, Mol Cell Endocrinol, 2005 Jul 15, 239(1-2), 1-14; Farooqi IS, O'Rahilly S, Annu Rev Med, 2005, 56, 443-58). Por ejemplo, en un paciente con obesidad de aparicion temprana grave, se ha encontrado que un modo autosomico-dominante de herencia de una mutacion de MC4R es debido a un efecto negativo dominante causado por la dimerizacion de receptor (Biebermann H, Krude H, Elsner A, Chubanov V, Gudermann T, Gruters A, Diabetes, 2003 Dec, 52(12), 2984-8).

Se espera perdida de funcion para MC4R con algunas mutaciones, ya que la mayona de las mutaciones identificadas hasta la fecha son sustituciones de aminoacidos no conservativas. Esto se ha demostrado para varios MC4R encontrados en individuos obesos. Ademas, varias mutaciones se han asociado a expresion reducida de MC4R en la superficie celular (Gu et al., Diabetes 1999, 48: 635-39; Nijenhuis et al., arribaj. Por ejemplo, en un cribado de once mutaciones de aminoacidos MC4R que fueron solo encontradas en individuos obesos, y que se localizaron fuera de la region del extremo N de MC4R (que no participa en la union de ligando), diez presentaron union espedfica mas baja en la superficie celular con respecto al ligando de la hormona estimulante de a- melanocitos marcada (a-MSH) 125I-[Nle4,D-Phe7]a-MSH, en comparacion con MC4R no mutante. Nijenhuis et al., arriba, en 22941. Se determino que la reducida union espedfica reflejaba una expresion de la superficie celular mas baja, ya que la afinidad por ligando entre los mutantes era en gran medida similar al receptor no mutante, como se representa en la Tabla 1 a continuacion (valores de CI50 en nM +/- E.E.):

5

10

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20

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30

35

40

Tabla 1:

Mutante

CI50 Mutante CI50

WT 55 ± 7,4 WT 9,1 ± 0,64 WT 55 ± 7,4 WT 9,1 ± 0,64

a-MSH 125I-[Nle4,D-Phe']a-MSH a-MSH 125I-[Nle4,D-Phe']a-MSH

T112M

28 ± 2,7 5,4 ± 0,64 I317T 38 ± 3,0 7,8 ± 0,44

V253I (A700G)

43 ± 2,0 8,1 ± 0,25 I301T 24 ± 4,8 5,8 ± 0,78

S30F/ G252S

67 ± 8,8 6,7 ± 0,30 R165W (C886T) 40 ± 13 8,7 ± 1,0

L250Q

5,8 ± 0,35 3,4 ± 0,69 R165Q (C886A) 40 ± 11 8,9 ± 1,2

I170V

59 ± 5,7 8,9 ± 1,7 P78L - -

Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 22939-22945, a 22942.

Incluso dos mutantes con afinidad de union mas alta (L250Q y T112M) demostraron expresion de la superficie celular mas baja segun experimentos de union de saturacion. Ademas, todos los mutantes demostraron respuesta maxima reducida (activacion de receptor como se mide usando un ensayo de adenilil ciclasa) tras la union de a- MSH. En particular, Nijenhuis et al. llegaron a la conclusion a partir de resultados de datos inmunocitoqmmicos que los mutantes P78L, R165Q y R165W se expresan, pero son retenidos intracelularmente.

Un estudio adicional identifico las siguientes mutaciones de MC4R: I125K; C271Y; T11A (A434G); A175T; I316L; N97D; N62S; y C271R (Farooqi et al., New Eng. J. Med. 2003; 348; 1085-95). De estas mutaciones, todas presentaron actividad reducida, o ninguna actividad, in vitro evaluada usando un ensayo de gen indicador de luciferasa sensible a AMPc. Sin embargo, este grupo encontro que tres variantes V103I; I251L; y T112M no tienen efecto sobre la senalizacion de MC4R. Mutaciones asociadas a la infancia, es decir, obesidad de aparicion temprana fueron S58C, N62S, Y157S, C271Y, P78L, G98R, que produjeron ya sea union de ligando reducida (S58C, N62S, Y157S, C271Y) o no (P78L, G98R), tambien demostraron alteraciones proporcionales en la produccion de AMPc estimulada por [Nle4,D-Phe7]a-MSH (Tao et al., Endocrinology 2003; 144(10):4544-51).

Un estudio final identifico los siguientes mutantes en MC4R; I251L (A1144C); F51L (T544C); M200V (A991G); T5T (C408T) (Branson et al., New Eng. J. Med. 2003; 348: 1096-1103).

Ademas de obesidad, MC4R participa en el trastorno por atracon. Segun el Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-Text Revision (DSM-IV-TR™, Cuarta Ed.), el trastorno por atracon implica episodios recurrentes de comer una cantidad anormalmente grande de comida y experimentar sentimientos de falta de control del comportamiento. En un estudio de 469 sujetos obesos blancos, se encontro que mientras que solo un pequeno porcentaje de sujetos obesos fueron diagnosticados con trastorno por atracon, todos los sujetos obesos con mutaciones de MC4R fueron diagnosticados con trastorno por atracon (Branson et al., arriba).

Estructura de MC4R y union de ligando

Agonistas de melanocortina endogenos contienen la secuencia His-Phe-Arg-Trp, que es importante para el reconocimiento y la estimulacion molecular de receptores de melanocortina. Se determinaron en un estudio los determinantes moleculares de la union de ligando de MC4R empleando una gran matriz de ligandos (Nickolls et al., Pharmacol Exp Ther 2003; 304(3):1217-27). Se uso modelado molecular del receptor para identificar Phe284, en el dominio 7 transmembranario (TM) (TM7), como un posible sitio de interaccion de ligando. La mutacion de Phe284 a alanina redujo la afinidad de union y potencia de peptidos que conteman L-Phe hasta 71 veces, pero no afecto la union de peptidos lineales que conteman D-Phe. Estos datos fueron coherentes con una interaccion hidrofoba entre Phe7 de a-MSH y Phe284. Segundo, se examino el efecto de una mutacion que existfa de forma natural en TM3 (I137T), que, como se describio anteriormente, esta asociada a obesidad. Esta mutacion disminuyo la afinidad y potencia de peptidos ngidos dclicos, pero no peptidos mas flexibles, coherente con un efecto indirecto de la mutacion sobre la estructura terciaria del receptor. Tambien se determinaron restos que respaldaban la selectividad por ligando para MC4R con respecto a MC3R. La mutacion de Ile125 (TM3) de MC4R al resto equivalente de MC3R (fenilalanina) disminuyo selectivamente la afinidad y potencia de ligandos selectivos de MC4R. Este efecto fue imitado por la mutacion de MC3R redproca F157I. La magnitud de este efecto indica que este locus no es de mayor importancia. Sin embargo, se propuso que una mutacion de isoleucina/ fenilalanina podfa afectar la orientacion de Asp122, que se ha identificado como un determinante mayor de afinidad de union de ligando.

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Otros han determinado que se requirio Tyr268 para la interaccion selectiva con el antagonista de MC4R endogeno la protema Agouti, ademas de para la selectividad de otro agonista de MC4R (Oosterom et al., J. Biol. Chem. 2001; 276(2):931-6). La protema Agouti normalmente se expresa en la piel y es un antagonista del MC4R natural (Kiefer et al., Biochemistry 1997; 36: 2084-2090).

Agonistas y antagonistas de MC4R

Segun la invencion, agonistas y antagonistas de MC4R incluyen los compuestos representados en las Figuras 1-8 y 10 en el presente documento y descritos ademas en los Ejemplos 3 y 4 a continuacion.

Agonistas naturales (ligandos) de MC4R incluyen a-MSH, ACTH, p-MSH y y-MSH (en orden de la afinidad mas alta a la mas baja). Otros ligandos de MC4R, que incluyen agonistas y antagonistas, que han sido descritos hasta la fecha son predominantemente peptidos (patente de EE.UU. 6.060.589) y analogos de peptidos dclicos (patente de EE.UU. 6.613.874 a Mazur et al.). Tambien se ha disenado una serie de agonistas del peptido MC4R (Sun et al., Bioorg Med Chem 2004; 12(10):2671-7). Ademas, Nijenhuis et al. (Peptides 2003; 24(2):271-80) describieron el desarrollo y la evaluacion de compuestos antagonistas de melanocortina que fueron selectivos para MC4R. Se encontro que un compuesto, designado Ac-Nle-Gly-Lys-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH(2) (SEQ ID NO:9), era el compuesto de MC4R mas selectivo, con una selectividad de 90 y 110 veces para MC4R en comparacion con MC3R y MC5R, respectivamente. La posterior modificacion dio el compuesto Ac-Nle-Gly-Lys-D-Nal(2)-Arg-Trp-Gly-NH(2) (SEQ ID NO: 10), un antagonista de MC4R selectivo con 34 veces de selectividad por MC4R/MC3R y 109 veces por MC4R/MC5R. Ambos compuestos fueron activos in vivo, y cruzaron la barrera hematoencefalica. Ademas, las patentes de EE.UU. N.° 6.054.556 y 5.731.408 describen familias de agonistas y antagonistas para MC4R que son heptapeptidos lactamicos que tienen una estructura dclica.

Otros antagonistas de MC4R de alta afinidad se describen en Grieco et al. (J Med Chem 2002; 24:5287-94). Estos antagonistas dclicos fueron disenados basandose en el conocido antagonista de alta afinidad SHU9119 (Ac-Nle4- [Asp5-His6-DNal(2')7-Arg8-Trp9-Lys10]-NH(2)) (SEQ ID NO: 11). Los analogos de SHU9119 se modificaron en la posicion 6 (His) con aminoacidos no convencionales. Un compuesto que contema una sustitucion Che en la posicion 6 es un antagonista de MC4R de alta afinidad (CI50 = 0,48 nM) con 100 veces de selectividad con respecto a MC3R. Otro compuesto con una sustitucion Cpe en la posicion 6 tambien era un antagonista de MC4R de alta afinidad (CI50 = 0,51 nM) con una selectividad de 200 veces con respecto a MC3R. Se uso modelado molecular para examinar las propiedades conformacionales de los peptidos dclicos modificados en la posicion 6 con aminoacidos conformacionalmente restringidos. Vease, por tanto, Grieco et al., Peptides 2006; 27(2):472-81.

Se han desvelado varios ligandos de MC4R no de peptido en las solicitudes de patente de EE.UU. publicadas 2003/0158209 a Dyck et al. y 2004/082590 a Briner et al. Por tanto, la patente de EE.UU. N.° 6.638.927 a Renhowe et al. describe guanidobenzamidas pequenas de bajo peso molecular como agonistas de MC4R espedficos. Richardson et al. han descrito novedosas arilpiperizinas que son agonistas de MC4R (J Med Chem 2004; 47(3):744- 55). Las patentes de EE.UU. N.° 6.979.691 a Yu et al. y 6.699.873 a Maguire tambien describen compuestos no de peptido que se unen selectivamente a MC4R.

El documento WO 99/55679 a Basu et al. desvela derivados de isoquinolina, compuestos de no peptido de molecula pequena, que muestran bajas afinidades (micromolares) por MC1r y MC4R, reduccion de inflamacion dermica inducida por acidos araquidonicos, y reducciones de peso corporal y consumo de alimentos.

El documento WO 99/64002 a Nargund et al. tambien desvela derivados de espiropiperidina como agonistas de receptores de melanocortina, utiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos tales como obesidad, diabetes y disfuncion sexual.

Se han descrito otros antagonistas de MC4R no de peptido. Asf, las solicitudes de patente de EE.UU. publicadas 2003/0176425 y 2003/0162819 a Eisinger desvelan novedosos derivados de 1,2,4-tiadiazol y 1,2,4-tiadiazolio, respectivamente, como antagonistas o agonistas de MC4R. Estas solicitudes tambien desvelan el uso de estos compuestos para tratar obesidad.

Varios antagonistas de receptores de melanocortina han demostrado que son antagonistas competitivos, es decir, que compiten por la union con un ligando. Por ejemplo, se mostro que el antagonista de melanocortina la protema de senalizacion agouti (ASIP) tiene caractensticas coherentes con el antagonismo competitivo observado en hMC1R, y se observo comportamiento mas complejo en los otros receptores (Yang et al., Mol. Endocrinology 1997; 11(3): 274280). Similarmente, ACTH, el ligando natural para MC2R, no puede ser mas competitivo para la union por a-, p- o y- MSH (Abdel-Malek et al., Cell. Mol. Life Sci. 2001; 48: 434-41.

Otros compuestos de union de MC4R se describen a continuacion: Bednarek y Fong, Exp Opn Ther Patents 2004; 14: 327-36; Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005;15(18):4023-8; documentos WO 03/07949 (Merck); WO 03/61660 (Eli Lilly); WO 03/09847 (Amgen); WO 03/09850 (Amgen); WO 03/31410 (Neurocrine Biosciences); WO 03/94918 (Neurocrine Biosciences); WO 03/68738 (Neurocrine Biosciences); WO 03/92690 (Procter and Gamble); WO 03/93234 (Procter and Gamble); WO 03/72056 (Chiron); WO 03/66597 (Chiron); WO 03/66587 (Chiron); WO 03/66587 (Chiron); WO 02/67869 (Merck); WO 02/68387 (Merck); WO 02/00259 (Taisho); WO 02/92566 (Taisho); Tran et al, Bioorg Med Chem Lett. 2006 [publicacion electronica antes de impresion]; Pontillo et al., Bioorg Med

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Chem Lett. 2005;15(23):5237-40; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005;15(10):2541-6; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004;14(22):5605-9; Cheung et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15(24):5504-8; Yan et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004; 15(20): 4611-4; Hsiung et al., Endocrinology. 2005 Dec;146(12):5257-66; y Todorovic et al., Peptides. 2005 Oct;26(10):2026-36.

Agonistas o antagonistas no de peptidos de MC4R espedficos contemplados para su uso en los metodos presentemente reivindicados se describen en Sebhat et al., J Med Chem 2002; 45: 4589 (compuestos 1 y 6); Richardson et al., J Med Chem. 2004; 47: 744 (compuesto 2); Arasasingham et al., J Med Chem. 2003; 46: 9 (compuesto 3); documento WO 02/062766 a Millennium Pharmaceuticals (compuesto 4); Pedemonte et al., J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71 (compuesto 5); Tran et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15: 3434-38 (compuesto 7); Xi et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004; 14: 377-81 (compuesto 8); Vos et al., J Med Chem. 2004; 47: 1602-04 (compuesto 9); Pan et al., Bioorg Med Chem Lett. 2003; 11: 185 (compuesto 10); Marsilje et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004. 14: 3721 (compuesto 11); Ujjainpareda et al., Bioorg Med Chem Lett. 2003; 133: 4431 (compuesto 12); Nickolls et al., J Pharmacol Exp Therap. 2005; 313: 1281-1288 (compuestos 13-17); Schioth et al., Biophys Biochem Res Comm. 2003; 399-405 (compuesto 18); Benoit et al., J. Neurosci. 2000; 20: 3442-48 (compuestos 19 y 20); Vos et al., Bioorg Med Chem Lett. 2006; 15: 2302 (compuesto 21); Tucci et al., Bioorg Med Chem Lett 2005; 15: 4389 (compuesto 22); Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15: 4615-18 (compuesto 23); Chaki et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 304: 818 (compuesto 24); Chaki et al., Pharmacol Biochem Behav. 2005; 82: 621 (compuesto 25).

Los compuestos 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 13-17 y 19 descritos anteriormente son agonistas de MC4R, mientras que los compuestos 3, 4, 7, 9, 11, 18 y 20 son antagonistas.

Antagonistas espedficos del peptido MC4R contemplados para su uso en los metodos presentemente reivindicados son Ac-Cys-Glu-His-D-(2')Nal-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH(2) (SEQ ID NO: 12); Ac-Cys-Nle-Arg-His-D- (2')Nal-Arg-Trp-Gly-Cys-NH(2) (SEQ ID NO: 13); Ac-Cys-Glu-His-D-Phe (3,4-di-Cl)-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys- Asp-NH(2) (SEQ ID NO: 14), Ac-Nle-c[Asp-Che-DNal(2')-Arg-Trp-Lys-NH(2) (SEQ ID NO: 15); Ac-Nle-c[Asp-Cpe- DNal(2')-Arg-Trp-Lys-NH(2) (SEQ ID NO: 16); ciclo(1-6)-suc-His-DPhe-Arg-Trp-Lys-NH(2) (SEQ ID NO: 17); y Ac- DArg[Cys-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Cys]-NH(2) (SEQ ID NO: 18).

Se contemplan agonistas y antagonistas basados en peptidos con cadenas laterales que no existen de forma natural y peptidomimeticos. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.650.489; vease, por tanto, la patente de EE.UU. N.° 6.090.912, especialmente en la Seccion 5.5. Por ejemplo, las cadenas laterales de los compuestos 18-20 y las cadenas laterales en la clase de compuestos representados en la Figura 16 pueden no existir de forma natural.

Se ha mostrado que MC4R experimenta internalizacion de receptor mediada por ligando (Gao et al., J Pharmacol Exp Ther 2003; 307(3):870-7). La exposicion previa de celulas GT1-7 que expresan MC4R endogeno al agonista la hormona estimulante de a-melanocitos (a-MSH) produjo formacion AMPc alterada a una segunda exposicion de a- MSH (Shinyama et al., Endocrinology 2003; 144(4):1301-14). Esto no se observo con la administracion de un antagonista. La internalizacion inducida por ligando es desencadenada en los receptores acoplados a protema G por fosforilacion de restos de serina o treonina entre el segmento del extremo C y el tercer bucle intracelular. La fosforilacion promueve la union de beta-arrestinas, que se dirigen a receptores para la internalizacion y degradacion por lisosomas. Datos recientes demostraron que la cola citosolica de una protema de tipo atractina (ALP) se urna al dominio del extremo C de MC4R (Yeo et al., Biochem. J. 2003; 376). Asf, una chaperona que aumenta la estabilidad de MC4R sobre la superficie celular sera especialmente beneficiosa dada la corta semivida del receptor sobre la superficie.

Se espera ademas que la chaperona, que es un agonista que se une reversiblemente a un polipeptido MC4R en el RE, no induzca internalizacion de receptor. Similarmente, donde el compuesto de chaperona es un antagonista, se espera que no inhiba la actividad de receptor una vez el receptor esta en la superficie celular.

Metodos de tratamiento

La presente invencion tambien proporciona un metodo de tratamiento de una afeccion asociada a estabilidad de MC4R reducida, tal como obesidad, o que tiene factores de riesgo para desarrollar obesidad, administrando a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una chaperona para potenciar la estabilidad y/o actividad de MC4R. El individuo que va a tratarse puede ser un individuo que no presenta una mutacion en MC4R que afecta el plegamiento y procesamiento de MC4R, pero que se beneficiana de la elevada estabilidad de MC4R, por ejemplo, en neuronas. El individuo que va a tratarse tambien puede tener una mutacion en MC4R que afecta el plegamiento y procesamiento de la protema MC4R, y presenta reducida estabilidad de MC4R en neuronas.

Formulacion, dosificacion y administracion

Una chaperona farmacologica espedfica para MC4R, es decir, un agonista o antagonista de MC4R u otro compuesto de union de MC4R como se describio anteriormente, o como se identifico mediante los metodos de cribado de la invencion como se exponen mas adelante, se formula ventajosamente en una composicion farmaceutica junto con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. La chaperona puede designarse un principio activo o agente terapeutico para el tratamiento de obesidad u otro trastorno que implique la expresion de la superficie celular de MC4R reducida o transporte a la superficie celular.

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La concentracion del principio activo (chaperona farmacologica) depende de la dosis y pauta de administracion deseada, como se trata mas adelante. Intervalos de dosis a modo de ejemplo del principio activo son de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal por dfa; de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por dfa; o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 75 mg/kg por dfa.

Pueden proporcionarse compuestos terapeuticamente eficaces a un sujeto en formulaciones estandar, y pueden incluir cualquier aditivo farmaceuticamente aceptable, tal como excipientes, lubricantes, diluyentes, aromatizantes, colorantes, tampones y disgregantes. Formulaciones estandar son muy conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edicion, Mack Publishing Company, 2000. La formulacion puede producirse en unidades de dosificacion utiles para administracion por cualquier via que permitira que la chaperona terapeutica cruce la barrera hematoencefalica. Vfas a modo de ejemplo incluyen vfas oral, parenteral, transmucosa, intranasal, inhalacion o transdermica. Vfas parenterales incluyen administracion intravenosa, intrarteriolar, intramuscular, intradermica, subcutanea, intraperitoneal, intraventricular, intratecal e intracraneal.

En una realizacion, una chaperona farmacologica para MC4R, particularmente aquellas representadas en las Figuras 1-8 y 10 en el presente documento, se formula en una forma de dosificacion oral solida. Para administracion por via oral, por ejemplo, para una molecula pequena, la composicion farmaceutica puede tomar la forma de un comprimido o capsula preparado por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como aglutinantes (por ejemplo, almidon de mafz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogeno fosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sflice); disgregantes (por ejemplo, almidon de patata o glicolato sodico de almidon); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden ser recubiertos por metodos muy conocidos en la tecnica. Preparaciones lfquidas para administracion por via oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para reconstitucion con agua u otro vehmulo adecuado antes de uso. Tales preparaciones lfquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arabiga); vehmulos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres aceitosos, alcohol etflico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o acido sorbico). Las preparaciones tambien pueden contener sales tampon, aromatizantes, colorantes y edulcorantes segun convenga.

En otra realizacion, se formula una chaperona para MC4R para administracion parenteral. La chaperona puede formularse para administracion parenteral mediante inyeccion, por ejemplo, mediante inyeccion en bolo o infusion continua. Formulaciones para inyeccion pueden presentarse en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multi-dosis, con un conservante anadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehmulos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para reconstitucion con un vehmulo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirogenos esteril, antes de uso.

Ademas de las formulaciones descritas previamente, la chaperona tambien puede formularse como una preparacion de liberacion lenta. Tales formulaciones de accion prolongada pueden administrarse por implantacion (por ejemplo por via subcutanea o por via intramuscular) o mediante inyeccion intramuscular. Asf, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo, como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble.

En otra realizacion, la chaperona puede ser administrada en una vesmula, particularmente un liposoma.

En otra realizacion, la chaperona puede ser administrada en un modo de liberacion controlada. Por ejemplo, un agente terapeutico puede administrarse usando infusion intravenosa con una bomba continua, en una matriz de polfmero tal como acido polilactico/glutamico (PLGA), en una pella que contiene una mezcla de colesterol y el principio activo (SilasticR™; Dow Corning, Midland, MI; vease la patente de EE.UU. N.° 5.554.601), por implantacion subcutanea, o por parche transdermico.

Terapia de combinacion. La composicion farmaceutica tambien puede incluir otras sustancias biologicamente activas en combinacion con el compuesto candidato. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, sibutramina, orlistat (Xenical®), leptina, neuropeptido Y, colecistoquinina, o GLP-1.

Ensayos de cribado para chaperonas farmacologicas para MC4R

La presente invencion proporciona ademas un metodo de identificacion de un compuesto de chaperona candidato que modula la estabilidad, actividad y/o localizacion de superficie celular de un polipeptido MC4R. En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo de identificacion de una chaperona para la protema MC4R, que comprende poner un compuesto de prueba marcado o sin marcar en contacto con la protema MC4R o un

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fragmento de la misma y medir la cantidad del compuesto de prueba unido a la protema MC4R o al fragmento de la misma. Esto puede lograrse, por ejemplo, del siguiente modo:

(a) poner en contacto una primera celula con un compuesto de prueba durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la celula responda a dicho contacto con el compuesto de prueba;

(b) determinar la estabilidad conformacional, actividad y/o localizacion de superficie celular de un polipeptido MC4R (o un fragmento del mismo que comprende un dominio de union de ligando) en la celula (o sobre la superficie celular) puesta en contacto en la etapa (a); y

(c) comparar la estabilidad, actividad y/o localizacion de superficie celular del polipeptido MC4R determinado en la etapa (b) con la de un polipeptido MC4R en una celula de control que no ha sido puesto en contacto con el compuesto de prueba;

en el que un cambio detectable en la estabilidad, actividad y/o localizacion de superficie celular del polipeptido MC4R en la primera celula en respuesta al contacto con el compuesto de prueba en comparacion con el nivel de estabilidad del polipeptido MC4R en la celula de control que no ha sido puesto en contacto con el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba modula la estabilidad del polipeptido MC4R y es un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno asociado a estabilidad o actividad de MC4R reducida.

La celula puede o bien ser una celula hospedadora transformada con un MC4R no mutante o mutante no endogeno, o una celula que expresa endogenamente MC4R, que incluye MC4R mutantes y no mutantes. Tales celulas incluyen las "neuronas de obesidad" tales como las celulas GT1-7, descritas anteriormente, aquellas descritas en MacKenzie et al., Current Medicinal Chemistry - Immunology, Endocrine & Metabolic Agents 2004; 4: 113-117, que expresan endogenamente MC4R, o celulas transformadas que expresan MC4R marcado normal o mutado tal como las celulas HEK293 descritas en Blondet et al., J Biochem 2004; 135: 541-546 y mas adelante en los ejemplos.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona un metodo de identificacion de una chaperona para la protema MC4R, que comprende poner un compuesto de prueba marcado en contacto con celulas o una fraccion de membrana celular que contiene la protema MC4R, y medir la cantidad del compuesto de prueba marcado unido a las celulas o la fraccion de membrana celular.

Pueden emplearse numerosos metodos de cribado de alto rendimiento (HTS) para cribar grandes numeros (por ejemplo, cientos, miles, decenas de miles) de compuestos de prueba simultaneamente para unirse a un MC4R. Un compuesto de prueba puede ser, sin limitacion, una molecula organica o inorganica pequena (preferida), un peptido o un polipeptido (incluyendo un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, u otra molecula inmunoespedfica), una molecula de oligonucleotido (tal como un aptamero), una molecula de polinucleotido, o una quimera o derivado de la misma. Los compuestos de prueba que son chaperonas candidatas que se unen espedficamente a un polipeptido MC4R pueden identificarse usando ensayos basados en celulas y/o libres de celulas. Varios metodos de ensayos automatizados que han sido desarrollados en los ultimos anos permiten el cribado de decenas de miles de compuestos en un corto periodo de tiempo (veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 5.585.277, 5.679.582 y 6.020.141). Por ejemplo, un grupo informo de la identificacion de un agonista de MC4R de arilpiperazina mediante cribado dirigido iterativo de bibliotecas sesgadas de receptores acoplados a protema G no de peptidilo (Richardson et al., J Med Chem 2004; 47(3):744-55). Tales metodos de HTS son particularmente utiles, por ejemplo, en micromatrices.

Para el cribado, clases purificadas de compuestos que pueden identificarse incluyen, pero no se limitan a, moleculas pequenas (es decir, moleculas organicas o inorganicas que son inferiores a aproximadamente 2 kilodaltons (kD) de peso molecular, y, mas preferentemente, inferiores a aproximadamente 1 kD de peso molecular). Estos son componentes de bibliotecas de compuestos.

Como se usa en el presente documento, el termino "compuesto de partida" se refiere a una entidad molecular seleccionada de un cribado primario de antagonistas o agonistas de MC4R que pueden ser eficaces por sf mismos en estabilizar la conformacion de protema de protema MC4R no mutante o mutante, o que pueden modificarse por desarrollo adicional para generar un compuesto farmaceutico apropiado.

Bibliotecas de compuestos. Bibliotecas de ligandos organicos pequenos de alta pureza y agonistas de peptido que tienen actividades farmacologicas bien documentadas estan disponibles de Sigma-Aldrich (LOPAC LIBRARY™ y LIGAND-SETS™). Tambien disponible de Sigma-Aldrich es Aldrich Library of Rare Chemicals, que es una biblioteca variadas de mas de 100.000 compuestos de molecula pequena, que incluyen extractos de plantas y extractos de cultivo microbiano. Otras bibliotecas de compuestos estan disponibles de Tripos (LeadQuest®) y TimTech (incluyendo bibliotecas dirigidas para moduladores de cinasa).

Otras empresas que suministran o han suministrado bibliotecas de compuestos del tipo adecuado para cribar segun la invencion incluyen las siguientes: 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc.; Advanced ChemTech; Abinitio PharmaSciences; Albany Molecular; Aramed Inc.; Annovis, Inc. (antiguamente Bearsden Bio, Inc.); ASINEX; AVANT Immunotherapeutics; AXYS Pharmaceuticals; Bachem; Bentley Pharmaceuticals; Bicoll Group; Biofor Inc.; BioProspect Australia Limited; Biosepra Inc.; Cadus Pharmaceutical Corp.; Cambridge Research Biochemicals;

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Cetek Corporation; Charybdis Technologies, Inc.; ChemBridge Corporation; ChemDiv, Inc.; ChemGenics Pharmaceuticals Inc.; ChemOvation Ltd.; ChemStar, Ltd.; Chrysalon; ComGenex, Inc.; Compugen Inc.; Cytokinetics; Dextra Laboratories Ltd.; Discovery Partners International Inc.; Discovery Technologies Ltd.; Diversa Corporation; Dovetail Technologies, Inc.; Drug Discovery Ltd.; ECM Pharma; Galilaeus Oy; Janssen Pharmaceutica; Jerini Bio Tools; J-Star Research; KOSAN Biosciences, Inc.; KP Pharmaceutical Technology, Inc.; Lexicon Genetics Inc.; Libris Discovery; MicroBotanica, Inc.; MicroChemistry Ltd.; MicroSource Discovery Systems, Inc.; Midwest Bio-tech Inc.; Molecular Design & Discovery; MorphoSys AG; Nanosyn, Inc.; Ontogen Corporation; Organix, Inc.; Pharmacopeia, Inc.; Pherin Pharmaceuticals; Phytera, Inc.; PTRL East, Inc.; REPLICor Inc.; RSP Amino Acid Analogues, Inc.; Sanofi-Synthelab (ahora Sanofi-Aventis) Pharmaceuticals; Sequitur, Inc.; Signature BioScience Inc.; Spectrum Info Ltd.; Talon Cheminformatics Inc.; Telik, Inc.; Tera Biotechnology Corporation; Tocris Cookson; Torrey Pines Institute for Molecular Studies; Trega Biosciences, Inc.; y WorldMolecules/MMD.

Ademas, el Instituto de Qmmica y Biologfa Molecular (ICCB), mantenido por la Escuela Medica de Harvard, proporciona las siguientes bibliotecas qmmicas, que incluyen bibliotecas de productos naturales, para cribar: Chem Bridge DiverSet E (16.320 compuestos); Bionet 1 (4.800 compuestos); CeReP (4.800 compuestos); Maybridge 1 (8.800 compuestos); Maybridge 2 (704 compuestos); Peakdale 1 (2.816 compuestos); Peakdale 2 (352 compuestos); ChemDiv Combilab and International (28.864 compuestos); Mixed Commercial Plate 1 (352 compuestos); Mixed Commercial Plate 2 (320 compuestos); Mixed Commercial Plate 3 (251 compuestos); Mixed Commercial Plate 4 (331 compuestos); ChemBridge Microformat (50.000 compuestos); Commercial Diversity Set 1 (5.056 compuestos); NCI Collections: Structural Diversity Set, version 2 (1.900 compuestos); Mechanistic Diversity Set (879 compuestos); Open Collection 1 (90.000 compuestos); Open Collection 2 (10.240 compuestos); Colecciones de bioactivos conocidas: NINDS Custom Collection (1.040 compuestos); ICCB Bioactives 1 (489 compuestos); SpecPlus Collection (960 compuestos); ICCB Discretes Collections. Los siguientes compuestos de ICCB fueron recogidos individualmente de qmmicos en ICCB, Harvard, y otras instituciones colaboradoras: ICCB1 (190 compuestos); ICCB2 (352 compuestos); ICCB3 (352 compuestos); ICCB4 (352 compuestos). Extractos de productos naturales: NCI Marine Extracts (352 pocillos); Organic fractions - NCI Plant and Fungal Extracts (1.408 pocillos); Philippines Plant Extracts 1 (200 pocillos); ICCB-ICG Diversity Oriented Synthesis (DOS) Collections; DDS1 (DOS Diversity Set) (9600 pocillos).

Existen numerosas tecnicas disponibles para crear bibliotecas de compuestos mas centradas en vez de grandes y diversas. Chemical Computing Group, Inc. (Montreal) ha desarrollado software con un nuevo enfoque para el diseno de farmacos de alto rendimiento. El metodo de la empresa usa datos experimentales de cribado de alto rendimiento (HTS) para crear un modelo de QSAR (Relacion Estructura-Actividad Cuantitativa) probabilfstico, que es posteriormente usado para seleccionar elementos estructurales en una biblioteca combinatoria virtual. Se basa en estimacion estadfstica en lugar del analisis de regresion estandar.

Ademas, ArQule, Inc. (Woburn, MA) tambien ha integrado tecnologfas para realizar la produccion automatizada de alto rendimiento de compuestos qmmicos y para suministrar estos compuestos de estructura conocida y alta pureza en cantidades suficientes para la optimizacion de cabezas de serie. Su AMAP™ (Planta de Ensamblaje Molecular Automatizada) realiza smtesis qmmicas de alto rendimiento para cada fase de descubrimiento de compuestos.

Similarmente, los compuestos son frecuentemente proporcionados en bases de datos en lmea o en CD-ROM para la "seleccion cuidadosa" selectiva de compuestos. Vease, por ejemplo, AbInitio PharmaSciences; ActiMol; Aral Biosynthetics; ASDI Biosciences; Biotechnology Corporation of America; Chembridge; ChemDiv; Florida Center - Heterocyclic Compounds; Microsource /MSDI; NorthStar; Peakdale; Texas Retaining Group; Zelinsky Institute; Advanced ChemTech; Ambinter; AnalytiCon Discovery; Aurora Fine Chemicals; Biofocus; Bionet /Key; Comgenex; Key Organics; LaboTest; Polyphor; SPECS y Biospecs; y Bharavi Laboratories.

Micromatrices

En una realizacion, el cribado de HTS para chaperonas para MC4R emplea micromatrices.

Matrices de prote^na. Las matrices de protema son sistemas de ensayos de union en fase solida que usan protemas inmovilizadas sobre diversas superficies que estan seleccionadas, por ejemplo, de vidrio, membranas, pocillos de microtitulacion, placas de espectrometro de masas, y perlas u otras partfculas. Los ensayos de union usando estas matrices son altamente paralelos y frecuentemente miniaturizados. Sus ventajas son que son rapidos, pueden ser automatizados, son capaces de alta sensibilidad, son economicos en su uso de reactivos, y proporcionan una abundancia de datos a partir de un unico experimento.

Los formatos multi-pocillo automatizados son los sistemas de HTS mejor desarrollados. Los sistemas de cribado automatizados basados en placas de 96 o 384 pocillos son los mas ampliamente usados. La tendencia actual en los sistemas de cribado basados en placa es reducir el volumen de los pocillos de reaccion incluso mas, y aumentar la densidad de los pocillos por placa (96 pocillos a 384 pocillos a 1.536 pocillos por placa). La tendencia produce elevada resolucion, costes de biorreactivos espectacularmente reducidos por compuesto cribado, y una disminucion en el numero de placas que necesitan ser gestionadas por automatizacion. Para una descripcion de matrices de protema que pueden usarse para HTS, veanse, por ejemplo: Las patentes de EE.UU. N.° 6.475.809; 6.406.921; y 6.197.599; y las publicaciones internacionales N.° WO 00/04389 y Wo 00/07024.

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Para la construccion de matrices, fuentes de MC4R o fragmentos de los mismos, tanto en forma no mutante como mutante, pueden incluir sistemas de expresion basados en celulas para protemas recombinantes, purificacion de fuentes naturales, produccion in vitro por sistemas de traduccion libres de celulas y metodos sinteticos para producir peptidos MC4R. Para matrices de captura y analisis de la funcion de protemas, es frecuente el caso que los polipeptidos MC4R sean correctamente plegados y funcionales. Esto no es siempre el caso, por ejemplo, donde se extraen protemas recombinantes de bacterias en condiciones desnaturalizantes; otros metodos (aislamiento de protemas naturales, smtesis libres de celula) generalmente retienen la funcionalidad. Sin embargo, matrices de protemas desnaturalizadas pueden todavfa ser utiles en el cribado de chaperonas, ya que la chaperona probablemente se unira a la protema mutada mientras que no este plegada en su conformacion apropiada.

El metodo de inmovilizacion usado es preferentemente aplicable a polipeptidos MC4R de diferentes propiedades (por ejemplo, fragmentos no mutantes, mutantes, de longitud completa, de longitud parcial, hidrofilos, hidrofobos, etc.), susceptibles a alto rendimiento y automatizacion, y generalmente compatibles con la retencion de capacidad de union a chaperonas. Pueden usarse tanto los metodos covalentes como no covalentes de inmovilizacion de protemas MC4R. Sustratos para la union covalente incluyen, por ejemplo, portaobjetos de vidrio recubiertos con reactivos de silano que contienen amino o aldehudo (Telechem). En el sistema Versalinx™ (Prolinx), se logra el acoplamiento covalente reversible por interaccion entre la protema derivatizada con acido fenildiboronico, y acido salicilhidroxamico inmovilizado sobre la superficie de soporte. Metodos de acoplamiento covalente que proporcionan un enlace estable pueden aplicarse a un intervalo de protemas. La union no covalente de protema no modificada se produce dentro de estructuras porosas tales como HydroGel™ (PerkinElmer), basado en un gel de poliacrilamida tridimensional.

Matrices basadas en celulas. Matrices basadas en celulas combinan la tecnica de cultivo celular en conjuncion con el uso de dispositivos flrndicos para la medicion de la respuesta celular a compuestos de prueba en una muestra de interes, cribado de muestras para identificar moleculas que inducen un efecto deseado en celulas cultivadas, y seleccion e identificacion de poblaciones de celulas con caractensticas novedosas y deseadas. El cribado de alto rendimiento (HTS) puede realizarse en celulas fijadas usando anticuerpos marcados fluorescentes, ligandos biologicos o chaperonas candidatas, y/o sondas de hibridacion de acido nucleico, o sobre celulas vivas usando indicadores y biosensores fluorescentes multicolores. La eleccion de cribados de celulas fijadas o vivas depende del ensayo basado en celulas espedficas requerido.

Se conocen en la tecnica numerosas tecnicas de matriz basadas en una sola celula y en multiples celulas conocidas. Tecnicas recientemente desarrolladas tales como matrices con micro-patrones (descritas, por ejemplo, en las publicaciones PCT internacionales WO 97/45730 y WO 98/38490) y matrices microflmdicas proporcionan valiosas herramientas para analisis basados en celulas comparativos. Las micromatrices de celulas transfectadas son una tecnica complementaria en la que caractensticas de matriz comprenden agrupaciones de celulas que expresan en exceso ADNc definidos. ADN complementarios clonados en vectores de expresion son impresos sobre portaobjetos de microscopio, que llegan a ser matrices vivas despues de la adicion de un reactivo de transfeccion de lfpidos y celulas de mairnfero adherentes (Bailey et al., Drug Discov. Today 2002; 7(18 Suppl): S113-8). Las matrices basadas en celulas se describen en detalle en, por ejemplo, Beske, Drug Discov. Today 2002; 7(18 Suppl): S131-5; Sundberg et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2000; 11: 47-53; Johnston et al., Drug Discov. Today 2002; 7: 353-63; las patentes de EE.UU. N.° 6.406.840 y 6.103.479, y la solicitud de patente publicada de EE.UU. N.° 2002/0197656. Para ensayos basados en celulas espedficamente usados para cribar moduladores de canales de iones seleccionados por ligando, vease Mattheakis et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2001; 1: 124-34; y Baxter et al., J. Biomol. Screen. 2002; 7: 79-85.

Marcas detectables. Para la deteccion de moleculas tales como chaperonas para MC4R candidatas usando ensayos de cribado, puede usarse un ensayo funcional para seguir moleculas no marcadas como se describe en cualquier parte en el presente documento. Una molecula de interes (por ejemplo, una molecula pequena, un anticuerpo, o una sonda de polinucleotidos) o una biblioteca de la misma tambien puede ser detectablemente marcada con un atomo (por ejemplo, un radionuclido), una molecula detectable (por ejemplo, fluorescema), o un complejo que, debido a una propiedad ffsica o qmmica, sirve para indicar la presencia de la molecula de interes. Una molecula tambien puede ser detectablemente marcada cuando se une covalentemente a una molecula "indicadora" (por ejemplo, una biomolecula tal como una enzima) que actua sobre un sustrato para producir un producto detectable. Marcas detectables adecuadas para su uso en la presente invencion incluyen cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqrnmicos, electricos, opticos o qmmicos. Marcas utiles en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, biotina para tincion con avidina marcada o conjugado de estreptavidina, perlas magneticas (por ejemplo, Dynabeads™), colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluorescema, fluorescema-isotiocianato (FITC), Texas red, rodamina, protema verde fluorescente, protema verde fluorescente potenciada, lisamina, ficoeritrina, Cy2, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5 Cy7, FluorX de Amersham, SyBR Green I & II de Molecular Probes, y similares), radiomarcas (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, hidrolasas, particularmente fosfatasas tales como fosfatasa alcalina, esterasas y glucosidasas, u oxidorreductasas, particularmente peroxidasas tales como peroxidasa de rabano picante, y similares), sustratos, cofactores, inhibidores, grupos quimioluminiscentes, agentes cromogenicos y marcas colorimetricas tales como oro coloidal o vidrio coloreado o plastico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, latex, etc.) perlas. Ejemplos de patentes que describen el uso de tales marcas incluyen las patentes de EE.UU. N.°: 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241.

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Medios de deteccion de tales marcas son conocidos para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, pueden detectarse radiomarcas y marcas quimioluminiscentes usando pelmula fotografica o contadores de centelleo; pueden detectarse marcadores fluorescentes usando un fotodetector para detectar luz emitida (por ejemplo, como en citometna de flujo activada por fluorescencia, FACS); y pueden detectarse marcas enzimaticas proporcionando la enzima con un sustrato y detectando, por ejemplo, un producto de reaccion coloreado producido por la accion de la enzima sobre el sustrato.

Ensayos de estabilidad, localizacion y de actividad

Como se indica previamente, puede determinarse la estabilidad potenciada de MC4R midiendo un aumento en el polipeptido MC4R celular, determinando un aumento en el trafico a la superficie celular, por ejemplo, como se determina por elevada expresion de la superficie celular, o determinando la elevada actividad de MC4R. Metodos no limitantes a modo de ejemplo para evaluar cada uno de los anteriores se describen a continuacion.

Determinacion de la estabilidad intracelular de MC4R. Son muy conocidos en la tecnica los metodos de determinacion de los niveles de protema MC4R intracelular. Tales metodos incluyen transferencia Western, inmunoprecipitacion seguido de transferencia Western (IP Western), o inmunofluorescencia usando una protema MC4R marcada.

Determinacion del trafico de MC4R. La evaluacion del trafico de protemas a traves de la via biosintetica puede lograrse, por ejemplo, usando experimentos de seguimiento de pulsos con protema de receptor marcada con 35S, en conjuncion con glucosidasas; o por inmunofluorescencia indirecta o directa para determinar la modificacion de protema durante el trafico. Estos y otros metodos se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Cell Biology 2001; John Wiley & Sons.

Son muy conocidos en la tecnica metodos de deteccion de trafico alterado de protemas. Por ejemplo, para protemas que estan N- y/o O-glucosiladas en el aparato de Golgi, puede usarse marcaje metabolico de seguimiento de pulsos usando protemas radiactivamente marcadas, combinado con tratamiento de glucosidasa e inmunoprecipitacion, para detectar si las protemas estan sometiendose a glucosilacion completa en el Golgi, o si estan siendo retenidas en el RE en lugar de pasar al Golgi para glucosilacion adicional.

Metodos sensibles para detectar visualmente la localizacion celular tambien incluyen microscopfa fluorescente usando protemas fluorescentes o anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, protemas MC4R de interes pueden ser marcadas con, por ejemplo, protema verde fluorescente (GFP), protema cian fluorescente, protema amarilla fluorescente y protema roja fluorescente, seguido de microscopfa multicolor y de lapso de tiempo y microscopfa electronica para estudiar el desenlace de estas protemas en celulas fijadas y en celulas vivas. Para una revision del uso de obtencion de imagenes fluorescentes en el trafico de protemas, vease Watson et al., Adv Drug Deliv Rev 2005; 57(1):43-61. Para una descripcion del uso de microscopfa confocal para la co-localizacion intracelular de protemas, vease Miyashita et al., Methods Mol Biol. 2004; 261:399-410.

La espectroscopfa de correlacion de fluorescencia (FCS) es un metodo ultrasensible y no invasivo de deteccion capaz de resolucion de una sola molecula y en tiempo real (Vukojevic et al., Cell Mol Life Sci 2005; 62(5): 535-50). SPFI (obtencion de imagenes de fluorescencia de una sola molecula) usa la alta sensibilidad de la fluorescencia para visualizar moleculas individuales que han sido selectivamente marcadas con partroulas fluorescentes pequenas (Cherry et al., Biochem Soc Trans 2003; 31(Pt 5): 1028-31). Para la localizacion de protemas dentro de balsas de lfpidos, vease Latif et al., Endocrinology 2003; 144(11): 4725-8). Para una revision de obtencion de imagenes de celulas vivas, vease Hariguchi, Cell Struct Funct 2002; 27(5):333-4).

Tambien se usa microscopfa de transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET) para estudiar la estructura y localizacion de protemas en condiciones fisiologicas (Periasamy, J Biomed Opt 2001; 6(3): 287-91).

Para protemas residentes en la membrana plasmatica, pueden usarse ensayos menos sensibles para detectar si estan presentes sobre la membrana. Tales metodos incluyen inmunohistoqmmica de celulas fijadas, o marcaje de celulas completas usando ligando radiomarcado (por ejemplo, 125I).

Determinacion de la expresion de la superficie celular de MC4R. Una vez se ha identificado un compuesto candidato, la siguiente etapa es determinar si el compuesto candidato puede potenciar la cantidad de MC4R enviada a la superficie celular. Pueden usarse numerosos ensayos para evaluar la expresion del receptor de la superficie celular cuantitativamente. Por ejemplo, pueden usarse ensayos de union de ligando radiactivos, usando por ejemplo,125I-MSH, para determinar la union a cualquier celula completa que expresa MC4R o a fracciones de la membrana celular. Vease la solicitud publicada de EE.UU. 2003/0176425 para una descripcion de un metodo a modo de ejemplo; vease tambien Chhajlani, Peptides. 1996;17(2):349-51. Ademas, tambien puede usarse tincion por inmunofluorescencia, usando cualquier anticuerpo marcado como MC4R marcado (por ejemplo, MC4R marcado con FLAG). Otro metodo muy conocido es la citometna de flujo activada por fluorescencia (FACS), que clasifica o distingue poblaciones de celulas usando anticuerpos marcados contra marcadores de la superficie celular. Vease, por tanto, Nijenhuis et al., arriba.

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Determinacion de un aumento en la actividad de MC4R. Puede determinarse la actividad de MC4R usando, por ejemplo, ensayos de activacion/acumulacion de AMPc (vease, por ejemplo, VanLeeuwen et al., J Biol Chem 2003; 18: 15935-40) o midiendo un aumento en la transcripcion de uno o mas genes activados por AMPc, o midiendo la expresion del gen indicador uniendo operativamente un gen indicador tal como luciferasa a un elemento de respuesta de AMPc (CRE) (vease por ejemplo, Lee et al., Eur J Biochem 2001; 268(3):582-91). Ademas, tambien se sabe que MC4R estimula la secrecion de TNF-a en melanoforos. Por tanto, la actividad de MC4R en respuesta a un compuesto candidato puede evaluarse midiendo la secrecion de TNF-a (vease, por ejemplo, Ignar et al., Peptides 2003 May;24(5):709-16).

Finalmente, los melanoforos proporcionan un bioensayo rapido y sensible para agonistas y antagonistas de melanocortina. Este metodo se basa en la medicion de la dispersion de granulos de pigmento inducida por a-MSH, como se determina por cambios en la densidad optica (Quillan et al., PNAS U.S.A. 1995; 92: 2894; y Potenza et al., Pigment Cell Res 1992; 5: 372).

Definiciones de biologia molecular

Segun la presente invencion, puede emplearse biologfa molecular convencional, microbiologfa y tecnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la materia. Estas tecnicas son generalmente utiles para la produccion de celulas recombinantes que expresan MC4R no mutante o mutante para su uso en ensayos de cribado. Tales tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (en el presente documento "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); y ediciones posteriores de cada uno, si estan disponibles.

El termino "celula hospedadora" significa cualquier celula de cualquier organismo que esta seleccionada, modificada, transformada, cultivada, usada o manipulada de algun modo, para la produccion de una sustancia deseada por la celula, por ejemplo la expresion por la celula de un gen, una secuencia de ADN o ARN, una protema, o una enzima. Segun la presente invencion, la celula hospedadora se modifica para expresar un acido nucleico y polipeptido MC4R mutante o no mutante. Las celulas hospedadoras pueden usarse ademas para cribado u otros ensayos. Celulas hospedadoras a modo de ejemplo para su uso en la presente invencion son celulas HEK293, celulas COS y celulas CHO.

Una "molecula de ADN recombinante" es una molecula de ADN que ha experimentado una manipulacion biologica molecular.

Los polinucleotidos MC4R en el presente documento pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras naturales (control de expresion), o pueden asociarse a secuencias heterologas, que incluyen promotores, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) y otras secuencias de sitios de union al ribosoma, potenciadores, elementos de respuesta, supresores, secuencias senal, secuencias de poliadenilacion, intrones, regiones no codificantes de 5' y 3', y similares. Los acidos nucleicos tambien pueden modificarse por muchos medios conocidos en la tecnica. Ejemplos no limitantes de tales modificaciones incluyen: metilacion, "capuchones", sustitucion de uno o mas de los nucleotidos que existen de forma natural con un analogo, y modificaciones internucleotfdicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los polinucleotidos pueden contener uno o mas restos covalentemente unidos adicionales, tales como, por ejemplo, protemas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, peptidos senal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, hierro, metales oxidantes, etc.) y alquilantes. Los polinucleotidos pueden ser derivatizados por la formacion de un enlace fosfotriester de metilo o etilo o un fosforamidato de alquilo. Ademas, los polinucleotidos en el presente documento tambien pueden modificarse con una marca capaz de proporcionar una senal detectable, ya sea directamente o indirectamente. Marcas a modo de ejemplo incluyen radioisotopos, moleculas fluorescentes, biotina, y similares. Los acidos nucleicos tambien pueden alterarse en una o mas bases por, por ejemplo, mutagenesis dirigida al sitio para facilitar la biologfa molecular asociada al uso de las moleculas.

Una "secuencia codificante" o una secuencia "que codifica" un producto de expresion, tal como un ARN o polipeptido de MC4R, es una secuencia de nucleotidos que, cuando se expresa, produce la produccion de ese ARN o polipeptido, por ejemplo, la secuencia de nucleotidos MC4R codifica una secuencia de aminoacidos para un polipeptido MC4R (protema). Una secuencia codificante para la protema puede incluir un codon de iniciacion (normalmente ATG) y un codon de parada.

El termino "gen", tambien llamado un "gen estructural", significa una secuencia de ADN que codifica o se corresponde con una secuencia de aminoacidos particular que comprende toda o parte de una o mas protemas

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MC4R, y puede o puede no incluir secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias promotoras, que determinan, por ejemplo, las condiciones en las que se expresa el gen MC4R.

Los terminos "expresar" y "expresion", cuando se usan en el contexto de producir una secuencia de aminoacidos a partir de una secuencia de acidos nucleicos, significan permitir o causar que la informacion en un gen MC4R o secuencia de ADN llegue a manifestarse, por ejemplo, produciendo un protema MC4R que activa las funciones celulares implicadas en la transcripcion y traduccion del gen MC4R correspondiente o secuencia de ADN. Una secuencia de ADN se expresa en o por una celula para formar un "producto de expresion" tal como una protema MC4R. Tambien puede decirse que el propio producto de expresion, por ejemplo, la protema resultante, se "expresa" por la celula. Un producto de expresion puede caracterizarse como intracelular, extracelular o secretado. Segun la presente invencion, MC4R se expresa en la superficie celular de neuronas.

El termino "intracelular" significa algo que esta dentro de una celula. El termino "extracelular" significa algo que esta fuera de una celula. Una sustancia es "secretada" por una celula si aparece en medidas significativas fuera de la celula, de algun lugar o dentro de la celula.

El termino "heterologo" se refiere a una combinacion de elementos que no existen de forma natural en combinacion. Por ejemplo, ADN heterologo se refiere a ADN no naturalmente localizado en la celula, o en un sitio cromosomico de la celula. Preferentemente, el ADN heterologo incluye un gen extrano a la celula. Un elemento de expresion heterologo o regulador es un elemento operativamente asociado a un gen diferente de aquel al que esta operativamente asociado en la naturaleza. En el contexto de la presente invencion, un gen que codifica una protema de interes es heterologo al ADN de vector en el que se inserta para clonacion o expresion, y es heterologo a una celula hospedadora que contiene un vector tal, en el que se expresa, por ejemplo, una celula de E. coli.

El termino "transformacion" se refiere al proceso por el que el ADN, es decir, un acido nucleico que codifica un polipeptido MC4R, se introduce desde el medio circundante en una celula hospedadora.

El termino "transduccion" se refiere a la introduccion de ADN, es decir, un acido nucleico que codifica un polipeptido MC4R, en una celula hospedadora procariota, por ejemplo, en una celula hospedadora procariota mediante un virus bacteriano, o bacteriofago. Una celula hospedadora procariota o eucariota que recibe y expresa ADN o ARN introducido ha sido "transformada" o "transducida" y es un "transformante" o un "clon". El aDn o ARN introducido en una celula hospedadora puede proceder de cualquier fuente, que incluye celulas del mismo genero o especie que la celula hospedadora, o celulas de un genero o especie diferente, o secuencias sinteticas.

El termino "celula recombinantemente manipulada" se refiere a cualquier celula procariota o eucariota que ha sido manipulada para expresar o expresar en exceso el acido nucleico de interes, es decir, un acido nucleico que codifica un polipeptido MC4R, por cualquier metodo apropiado, que incluye transfeccion, transformacion o transduccion. Este termino tambien incluye activacion endogena de un acido nucleico en una celula que normalmente no expresa ese producto genico o que expresa el producto genico a un nivel inferior al optimo.

El termino "transfeccion" significa la introduccion de un acido nucleico extrano (es decir, extrmseco o extracelular) en una celula. El acido nucleico "extrano" incluye un gen, secuencia de ADN o ARN para una celula hospedadora, de manera que la celula hospedadora replicara el ADN y expresara el gen introducido o secuencia para producir una sustancia deseada, normalmente una protema o enzima codificada por el gen introducido o secuencia. El gen introducido, es decir, un acido nucleico que codifica un polipeptido MC4R, o secuencia, tambien puede llamarse un gen o secuencia "clonado", puede incluir secuencias reguladoras o de control, tales como iniciacion, parada, promotor, senal, secrecion, u otras secuencias usadas por la maquinaria genetica de una celula. El gen o secuencia puede incluir secuencias no funcionales o secuencias con funcion desconocida, el ADN puede introducirse ya sea como un elemento extracromosomico o por integracion cromosomica o una celula hospedadora que recibe y expresa ADN o ARN introducido.

Dependiendo de la celula hospedadora usada, se hace transformacion o transfeccion usando tecnicas convencionales apropiadas para tales celulas. El tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, como se describe en la Seccion 1.82 de Sambrook et al., 1989 arriba, se usa generalmente para celulas bacterianas que contienen abundantes barreras de pared celular. Otro metodo para la transformacion emplea polietilenglicol/DMSO, como se describe en Chung y Miller (Nucleic Acids Res. 1988, 16:3580). Otro metodo mas es el uso de la tecnica llamada electroporacion. Alternativamente, donde se usa un vector viral, las celulas hospedadoras pueden infectarse por el virus que contiene el gen de interes.

Los terminos "vector", "vector de clonacion" y "vector de expresion" significan el vehmulo por el que una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen MC4R) puede introducirse en una celula hospedadora, de manera que transformen el hospedador y promuevan la expresion (por ejemplo, transcripcion y traduccion) de la secuencia introducida. Vectores incluyen plasmidos, fagos, virus, etc.; son muy conocidos en la tecnica.

Una "secuencia promotora" es una region reguladora de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa en una celula e iniciar la transcripcion de una secuencia codificante aguas abajo (direccion 3'). Para los fines de definir la presente invencion, la secuencia promotora esta limitada en su extremo 3' por el sitio de iniciacion de la transcripcion y se extiende aguas arriba (direccion 5') para incluir el numero mmimo de bases o elementos necesarios para iniciar la

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transcripcion a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrara un sitio de iniciacion de la transcripcion, ademas de dominios de union de protema (secuencias consenso) responsables de la union de ARN polimerasa.

Una secuencia codificante esta "bajo el control de" u "operativamente asociada a" secuencias de control transcripcionales y traduccionales en una celula cuando ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARNm, que entonces corta y empalma el ARN en tras (si contiene intrones) y se traduce en la protema codificada por la secuencia codificante.

La construccion de vectores adecuados que contienen uno o mas de los componentes anteriormente enumerados emplea tecnicas de ligacion estandar. Plasmido aislados o fragmentos de ADN son escindidos, adaptados y religados en la forma deseada para generar los plasmidos requeridos.

Para el analisis para confirmar secuencias correctas en plasmidos construidas, se usan las mezclas de ligacion para transformar cepas bacterianas, y se seleccionan transformantes satisfactorios por resistencia a ampicilina o tetraciclina cuando corresponda. Se preparan plasmidos de los transformantes, se analizan por digestion con endonucleasas de restriccion, y/o se secuencian por el metodo de Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74:5463-5467) o Messing et al. (Nucleic Acids Res. 1981, 9:309), o por el metodo de Maxam et al. (Methods in Enzymology 1980, 65:499). Se transforman celulas hospedadoras con los vectores de expresion anteriormente descritos de la presente invencion y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados segun convenga para el promotor utilizado.

EJEMPLOS

La presente invencion se describe ademas por medio de los ejemplos, presentados a continuacion. El uso de tales ejemplos es ilustrativo solo y de ninguna forma limita el alcance y significado de la invencion o de cualquier termino ejemplificado. Asimismo, la invencion no se limita a cualquier realizacion particular preferida descrita en el presente documento. De hecho, muchas modificaciones y variaciones de la invencion seran evidentes para aquellos expertos en la materia tras la lectura de esta memoria descriptiva y pueden hacerse sin apartarse de su alcance. La invencion debe, por tanto, limitarse solo por los terminos de las reivindicaciones adjuntas junto con el alcance completo de equivalentes a los que dan derecho las reivindicaciones.

EJEMPLO 1: Generacion de lrneas celulares que expresan mutantes de plegamiento de MC4R

Con el fin de determinar si algunos mutantes de MC4R producen defectos conformacionales de MC4R, se transfectan acidos nucleicos MC4R que contienen los diversos mutantes en celulas HEK-293T y COS-7 y se evalua su expresion de la superficie celular y actividad. Aquellas lrneas celulares en las que se observa expresion de la superficie celular reducida o ausente se evaluan adicionalmente para determinar la presencia intracelular y/o localizacion del polipeptido MC4R.

Metodos

Generacion de mutantes de MC4R. Se modifica un ADNc que codifica un MC4R no mutante (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) usando tecnicas conocidas en la materia (por ejemplo, PCR, mutagenesis dirigida al sitio) para generar ADNc de MC4R mutante que contienen alteraciones en los nucleotidos que producen, por ejemplo, uno de los siguientes polipeptidos mutantes de MC4R: P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, CTCT en el codon 211, y/o insercion de TGAT en el codon 244. Tales mutantes tambien pueden fusionarse con una marca fluorescente, tal como GFP, como se describe en Blondet et al. J Biochem (Tokyo) 2004; 135(4):541-6, o marcarse con FLAG, como se describe por VanLeeuwen et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 15935-15940, o marcarse con una enzima tal como luciferasa.

Cultivo y transfeccion de celulas. Se clonan tales acidos nucleicos MC4R mutantes en un vector de expresion apropiado, por ejemplo, pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), segun las instrucciones del fabricante. La transfeccion de celulas se lleva a cabo usando LipofectAMINE (Invitrogen), y se seleccionan lrneas celulares clonales permanentemente transfectadas por resistencia al analogo de neomicina G418.

Brevemente, se mantienen celulas HEK-293T y COS-7 en medio Eagle modificado por Dulbecco (con glutamina; Invitrogen) complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Las celulas se incuban a 37 °C en aire humidificado que contiene 5% de CO2. Las celulas estan generalmente al 70-80 % de confluencia el dfa de la transfeccion.

MC4R marcado con GFP. Esta disponible ADNc de protema verde fluorescente (GFP) de BD Biosciences (San Jose, CA) o Clontech (Palo Alto, CA). Se fusiona GFP en marco con el extremo C de MC4R humano con el codon de terminacion del extremo C eliminado, segun las instrucciones del fabricante. La construccion de protema de fusion MC4R-GFP quimerica se transfecta entonces como antes. Se emplea similarmente una construccion de luciferasa.

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Deteccion de la localizacion de mutantes de MC4R. Se realizan experimentos de union para determinar la localizacion de la superficie celular usando las condiciones descritas previamente (Yang et al., J Biol Chem 1997; 272: 23000-23010). Brevemente, se usan 2 x 105 cpm de 125I-NDP-mSh (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) en combinacion con ligandos no radiomarcados NDP-MSH, AgRP 87-132, o AgRP 110-117. Las reacciones de union se terminan eliminando los medios y lavando las celulas dos veces con medio esencial mmimo que contema 0,2 % de albumina de suero bovino. Las celulas se lisan entonces con NaOH 0,2 N, y se cuantifica la radiactividad

J 125

en el lisado en un contador analftico. Se determina la union no espedfica midiendo la cantidad de marca de I unida en presencia de ligando sin marcar 10-6 M. Puede usarse FACs adicional como se describe mas abajo en el Ejemplo 4. La union espedfica se calcula restando la radiactividad no espedficamente unida de la radiactividad unida total. La maxima union (Bmax) puede calcularse usando la ecuacion Bmax = [NDP-union espedfica de MSH]/([NDP-MSH]/(Kd + [NDP-MSH]). Ki = CI50/ 1 + concentracion de ligando / Kd.

Donde el mutante de MC4R esta fluorescentemente marcado, se usa microscopfa confocal para monitorizar el trafico intracelular de MC4R marcado (Blondet et al., J Biochem 2004; 135: 541-546; o Gao et al., J Pharmacol Exp Ther 2003; 307(3):870-7). Brevemente, se cultivan celulas en cubreobjetos con camara 24 a 48 h antes de los experimentos. Despues de tratamientos apropiados, las celulas se lavan con PBS fno y se fijan en formalina durante 20 minutos, y se observaron en un microscopio de laser de barrido LSM 510 META (Carl Zeiss, Thornwood, NY). La fluorescencia de GFP se excita usando un laser de argon/cripton de 488 nm, detectado con un filtro paso banda de 500 a 550 nm. La senal roja se excita con un laser de HeNe a 543 nm y la fluorescencia se detecta con un filtro paso banda de 565 a 615.

Se cuantifican las imagenes digitalmente adquiridas usando un Scion Image Beta 4.02. Las imagenes confocales de fluorescencia verde originales se convierten en la escala de grises y se realiza filtrado de la mediana. Cada pixel se asigna a un valor de intensidad que oscila de 0 (negro) a 255 (blanco). La superficie celular e intensidad celular total de fluorescencia se miden despues de seleccionar manualmente el area correspondiente. La distribucion subcelular de MC4R-GFP se expresa como una relacion de la intensidad de fluorescencia de la superficie celular con respecto a la intensidad de fluorescencia celular total. Una disminucion en la relacion indica internalizacion del receptor.

Usando estos metodos, se identifican mutantes de plegamiento de MC4R que senan candidatos para el rescate mediado por chaperona.

EJEMPLO 2: Estructuras de agonistas y antagonistas de MC4R

Se seleccionaron posibles agonistas y antagonistas de MC4R basandose en la revision de referencias de patentes publicadas y de bibliograffa (en particular, Bednarek y Fong, Exp. Opn. Therapeutic Patents 2004; 14(3): 327-326 y documento WO 02/062766). Los criterios usados en la seleccion de los compuestos descritos en el presente documento incluyeron datos de CI50 publicados, datos de animales in vivo y datos de biodisponibilidad (por ejemplo, farmacocinetica), si estan disponibles.

a) Smtesis del agonista de la Figura 1 (compuesto 1)

La seleccion de este compuesto, conocido como THIQ, se baso en los siguientes datos:

Nombre

Actividad de MC4R FC Referencia(s)

CI50 CE50 Emax

(nM) (nM) (%)

% de F 14 Van der Ploeg et al (2002) PNAS

THIQ/ compuesto

Vd 3,6 l/kg 99:11381.

1

1,2 2,5 97

Cl 84 mlmin/kg Sebhat et al (2002) J Med Chem

t1/2 0,6 h 45:4589.

La smtesis de esta molecula (11 etapas) se realizo basandose en el esquema representado en la Figura 3.

b) Smtesis del agonista de la Figura 2 (compuesto 2)

La seleccion de este compuesto conocido, denominado compuesto 2, se baso en los siguientes datos:

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Nombre

Actividad de MC4R FC Referencia(s)

Compuesto 2

Ki (Nm) 24 CE50 (nM) 39 Emax (%) ND ND Richardson et al (2004) J Med Chem 47:744.

La smtesis de esta molecula (11 etapas) se realizo basandose en el esquema representado en la Figura 4.

c) Smtesis del antagonista de la Figura 5 (compuesto 3)

Este compuesto se selecciono basandose en los datos de aMSH/MC4R informados por Arasasingham (J Med Chem 2003, 46: 9-11). La smtesis de este compuesto se realizo segun el metodo descrito alK, resumido en la Figura 7.

d) Smtesis del antagonista de la Figura 6 (compuesto 4)

Este compuesto se selecciono y sintetizo basandose en los datos y metodo sintetico descrito en la publicacion de patente internacional PCT WO 02/062766 a Millennium Pharmaceuticals; el esquema sintetico se resume en la Figura 8. La actividad biologica de este compuesto se informa en el documento Wo 02/062766 usando un ensayo de proximidad de centelleo.

Brevemente, se logro la smtesis usando el siguiente metodo:

Se anade 1,3-diaminopropano (Acros, 27,7 g, 0,374 mmoles) a acido tiosalidlico (Acros, 20 g, 0,130 mmoles) en 1,2- diclorobenceno (Acros, 200 ml), esta mezcla se calienta a 170 °C durante 4 horas. Tras enfriarse a 60 °C, se anade metanol (50 ml), la reaccion se agita a temperatura ambiente durante la noche y el solido cristalino amarillo resultante se recoge y se lava con eter dando 9 g de producto puro.

Se anade bromuro de 2-metoxi-5-nitrobencilo (Fluka, 1,86 g, 7,559 mmoles) a 2-(1,4,5,6-tetrahidropirimidin-2- il)bencenotiol (1 g, 5,201 mmoles) en metanol (60 ml) a temperatura ambiente, se mantiene durante 12 horas concentrado y se anade eter (10 ml), las agujas amarillas claras resultantes se recogen y se lavan con eter dando 1,28 g de producto puro.

EJEMPLO 3: Rescate de MC4R erroneamente plegado usando baja temperatura o chaperonas quimicas

Como tanto las bajas temperaturas (rescate termico) como las chaperonas qmmicas generales tales como DMSO son conocidas por restaurar el plegamiento de protemas mutantes, se evaluo la expresion de la superficie celular de no mutante y diversos mutantes de plegamiento de MC4R en celulas que alojan MC4R WT y mutante, y en aquellas celulas cultivadas a 30 °C o con 1 % de DMSO.

Metodos

Celulas y transfecciones. Se transfectaron transitoriamente celulas HEK 293 con no mutante (WT) o los siguientes mutantes de hMC4R doblemente marcados con 3HA y Venus (protema amarilla verde fluorescente potenciada; EYFP): S58C; N62S; R165W; R165Q y P299H.

Ensayo a baja temperatura. Se incubaron celulas WT y transfectadas a 30 °C o 37 °C durante 12 horas antes de la evaluacion de la expresion de la superficie celular de MC4R. La ganancia se determino usando lo siguiente: Ganancia = [(% de expresion superficial a 30 °C - % de expresion superficial a 37 °C) / % de expresion superficial a 37 °C] * 100.

Ensayo de chaperonas quimicas: Se incubaron celulas WT y transitoriamente transfectadas en presencia o ausencia de 1 % de DMSO durante 12 horas antes de la evaluacion de la expresion de la superficie celular de MC4R.

Analisis de FACS. Se realizo analisis FACS despues de marcar fluorescentemente con anticuerpo primario anti- HA.11 (raton; dilucion 1:1000) y anticuerpo secundario acoplado a Alexa 647 (cabra anti-raton; dilucion 1:1000). Se clasificaron celulas vivas (negativo para yoduro de propidio) en las dos siguientes poblaciones relevantes:

P4: Celulas positivas para YFP totales (representativo de expresion de MC4R total)

P5: Porcentaje de celulas positivas para tanto YFP como Alexa 647 (celulas positivas para Alexa y YFP) / (celulas positivas para YFP + celulas positivas para Alexa y YFP) (representativo de la expresion de la superficie celular)

Resultados

Expresion de la superficie celular de MC4R. La expresion superficial basal de la expresion de la superficie celular de WT alcanza el 90 %. Ninguno de los mutantes expreso MC4R sobre la superficie celular como se detecta uniendo

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NDP-a-MSH marcada con 125I (datos no mostrados). Cuando se analiza por FACS, todos los mutantes presentaron expresion superficial significativamente reducida cuando se compara con celulas transfectadas con MC4R WT (datos no mostrados). Aproximadamente el 90 % de las celulas 3HA-hMC4R-Venus WT presentaron expresion superficial de MC4R (P5), mientras que la expresion superficial basal en los mutantes fue entre el 12 % y el 18 % para N62S, R165W, R165Q y P299H. S58C presenta aproximadamente el 40 % de expresion superficial.

Rescate termico. Los cincos mutantes presentaron una ganancia en la expresion de la superficie celular de MC4R (P5) en la Tabla 2 del siguiente modo:

Tabla 2

Genotipo

% de ganancia

WT

12

S585C

43

N62S

68

R165W

63

R165Q

93

P299H

107

Chaperona quimica: No se detecto potenciamiento significativo de la expresion de la superficie celular en presencia de 1 % de DMSO.

EJEMPLO 4: Rescate de MC4R erroneamente plegado usando chaperonas farmacologicas para MC4R

Se evaluaron los compuestos antagonistas de MC4R representados en la Figura 5 (compuesto 3) y Figura 6 (sal de HBr; compuesto 4), respectivamente, para actividad de chaperona en celulas que alojan los siguientes mutantes de MC4R: S58C; N62S; R165Q; R165W; y P299H.

Metodos

Ensayo farmacologico de chaperonas. Brevemente, se cultivaron celulas que alojan cada uno de los mutantes de MC4R anteriormente referenciados (transfectadas como se describe en el Ejemplo 3) con cada uno de los compuestos antagonistas a concentraciones de 1,0 pM y 10 pM durante 12 h y se evaluaron para la expresion de la superficie celular de MC4R usando analisis de citometna de flujo activada por fluorescencia como se ha descrito anteriormente. Se comparan los niveles de expresion de la superficie celular entre condiciones de tratamiento y basales. Se determina el porcentaje de ganancia segun lo siguiente: [Ganancia = [(% de expresion superficial (con tratamiento) - % de expresion superficial (sin tratamiento)) / % de expresion superficial (sin tratamiento)] *100.

Ensayo de actividad de MC4R. Se evaluo la acumulacion de AMPc para mutantes de MC4R S58C, N62S, R165W y P299H en respuesta al tratamiento con agonista de MC4R NDP-MSH (10-7M) en presencia o ausencia de cada antagonista usando el kit de ensayo Catch Point cAMP Fluorescent de Molecular Devices (ensayo de celulas completas; Cat. N.° R8044). Los controles no se trataron o se trataron solo con NDP-MSH.

Resultados

Rescate de chaperonas farmacologicas. Como se muestra en la Tabla 3, a continuacion, ambos antagonistas fueron capaces de aumentar la expresion superficial de los mutantes de MC4R R165W, S58C y R165Q a concentraciones de tanto 1,0 pM como 10 pM, con un efecto dependiente de la dosis. Como se indica anteriormente, la expresion superficial basal sobre los mutantes estuvo entre el 12% y el 18% para N62S, R165W, R165Q y P299H. S58C presenta aproximadamente el 40 % de expresion superficial. Inesperadamente, el tratamiento con 10 pM de cada compuesto fue capaz de restaurar la expresion de la superficie celular de MC4R R165W a niveles identicos a celulas que expresan MC4R no mutante.

Para N62S mutante, no se observo efecto a 1,0 pM con ninguno de los compuestos, aunque se observo un significativo porcentaje de ganancia en la expresion de la superficie celular de MC4R mutante con ambos compuestos a la concentracion 10 pM. El compuesto representado en la Figura 5 fue mas potente, es decir, se observo mas expresion de la superficie celular que con el compuesto mostrado en la Figura 6.

Para P299H mutante, el compuesto mostrado en la Figura 6 no tuvo efecto sobre la restauracion de la expresion de la superficie celular del receptor mutante a ninguna de 1,0 pM o 10 pM, y solo se observo un pequeno efecto con el compuesto mostrado en la Figura 5 a 10 pM.

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Tabla 3

Compuesto/ concentracion

% de ganancia

S58C

N62S R165W R165Q P299H

4/10 pM

130 212,5 675 508 38,9

4 / 1 pM

60 6,25 150 91,7 11,11

3/10 pM

130 343,75 675 508 77,78

3 / 1 pM

77,5 25 467 300 27,78

Estos resultados demuestran que los mutantes de plegamiento de MC4R pueden ser "rescatados" cuando se ponen en contacto con bajas concentraciones de antagonistas de MC4R, que actuan de chaperonas farmacologicas para restaurar la expresion de la superficie celular.

Finalmente, un compuesto de bisaminotiazol descrito en Pedemonte et al., J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71 (Fig. 9) demostro un pequeno efecto sobre los mutantes S58C (31,25 % de ganancia) y R165W (28,95 % de ganancia).

Actividad de MC4R. Como se muestra en la Fig. 11, se observo recuperacion de la senalizacion mediante MC4R al mismo grado que hMC4R WT en S58C y R165W tras el tratamiento con ambos antagonistas a 10 pM. Tambien se restauro la capacidad de senalizacion en el mutante de MC4R N62S a un menor grado. No se restauro la senalizacion en P299H, como era de esperar, ya que este mutante ya que esta mutacion esta en un dominio necesario para el acoplamiento de protema G.

EJEMPLO 5: Cribado de chaperonas para MC4R que restauran la estabilidad y actividad de MC4R mutante o aumentan la estabilidad de MC4R no mutante

Este ejemplo describe un metodo de cribado de compuestos de chaperona para MC4R para potenciar la expresion de la superficie celular de mutantes o no mutantes erroneamente plegados y/o actividad de MC4R.

Metodos

Transfeccion de MC4R mutante o no mutante. Se logra la identificacion del plegamiento/trafico de mutantes de MC4R como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se logra la transfeccion de tales mutantes de plegamiento y/o MC4R no mutante como se ha descrito anteriormente, o usando cualquier metodo conocidos en la tecnica para detectar la expresion de la superficie celular de protemas, que incluyen inmunoensayos tales como ELISA, y analisis FACS.

Administracion de chaperonas. A cultivos o matrices de celulas que expresan no mutante de MC4R o que expresan mutantes de plegamiento se anaden diversas concentraciones de compuestos de prueba de chaperona. Entonces se determina la localizacion celular de MC4R, ademas de la actividad de MC4R que es enviada a la superficie celular. Por ejemplo, se criban compuestos basados en piperazina, piperidina 1,4-diazapano, guanidina, u otros compuestos de prueba como se describe, por ejemplo, a continuacion: Bednarek y Fong, Exp Opn Ther Patents 2004; 14: 327-36; Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003; 13: 4431-4435; WO03/07949; WO03/61660; WO03/09847; WO03/09850; WO03/31410; WO03/94918; WO03/68738; WO03/92690; WO03/93234; WO03/72056; WO03/66597; WO03/66587; WO03/53927; WO02/67869; WO02/68387; WO03/68738; WO02/00259; WO02/92566; WO02/81443; WO02/81430; y WO02/80896.

Deteccion del envte de MC4R a la superficie celular. Se logra la deteccion de la localizacion celular y/o de superficie celular de celulas que expresan MC4R tratadas con compuesto en comparacion con celulas sin tratar como se ha descrito anteriormente.

Deteccion de la actividad de MC4R midiendo la acumulacion de AMPc. 48 h despues de la transfeccion, las celulas se lavan una vez con PBS y luego se desprenden de la placa con PBS que contiene 0,02 % de EDTA (Sigma). Las celulas desprendidas se recogen por centrifugacion y se resuspenden en solucion salina equilibrada de Hanks (invitrogen) que contiene IBMX 0,5 mM, HEPES 2 mM, pH 7,5 (tampon IBMX). Despues de la incubacion a 37 °C durante 15 min para permitir la captacion de IBMX, se anaden 0,4 ml de suspension de celulas (aproximadamente 5 * 105 celulas/ml) a 0,1 ml de tampon IBMX que contiene diversas concentraciones de agonistas (por ejemplo, [Nle4-D-Phe7]-MSH (NDP-MSH), a-MSH), u otros candidates a chaperona o forskolina 10 pM. Las celulas se incuban posteriormente a 37 °C durante 15 min para permitir la acumulacion de AMPc. La actividad se termina anadiendo 0,5 ml de 5 % de acido tricloroacetico, y la AMPc liberada de las celulas lisadas se ensaya por el sistema de ensayo de proximidad de centelleo de AMPc-125I (Amersham Biosciences). Se calculan los valores de CE50 con un intervalo de confianza del 95 % usando el software GraphPad Prism (usando analisis de regresion no lineal ajustado con una curva de dosis-respuesta sigmoide con pendiente variable).

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EJEMPLO 6: Administracion de dosis unica de DGJ para evaluar la seguridad, tolerabilidad, farmacocinetica y efectos sobre la actividad enzimatica de a-galactosidasa A

Este ejemplo describe un estudio aleatorizado, de doble ciego, controlado por placebo, de fase I, de dosis oral de dos veces al dfa de DGJ para evaluar los efectos de seguridad, tolerabilidad, farmacocinetica y actividad enzimatica de a-galactosidasa A (a-Gal A) de DGJ en voluntarios sanos.

Diseno del estudio y duracion. Este estudio fue el primer estudio en seres humanos, monocentrico, de fase I, aleatorizado, de doble ciego, dosis de dos veces al dfa, controlado por placebo, para evaluar los efectos de seguridad, tolerabilidad, farmacocinetica y actividad enzimatica de a-Gal A de DGJ tras la administracion por via oral. El estudio probo dos grupos de 8 sujetos (6 activo y 2 placebo) que recibieron una dosis de dos veces al dfa de 50 o 150 mg de DGJ o placebo administrado por via oral durante siete dfas consecutivos, acompanada de una vista de seguimiento de siete dfas. Los sujetos se alojaron en la instalacion de tratamiento a partir de 14 horas antes de la dosis hasta 24 horas despues de la dosis. Las comidas fueron controladas por el programa y los sujetos siguieron siendo ambulatorios durante 4 horas despues de la administracion de farmaco.

Se calcularon parametros farmacocineticos para DGJ en plasma en el Dfa 1 y Dfa 7. Ademas, se calculo el porcentaje acumulado de DGJ secretado (12 horas despues de la dosis) en orina. Se calculo la actividad de a-Gal A en globulos blancos (WBC) antes de empezar la dosis, y otra vez 100 horas, 150 horas y 336 horas en el ensayo.

Poblacion de estudio. Los sujetos fueron voluntarios varones sanos, no institucionalizados, no fumadores, entre 19 y 50 anos de edad (ambos incluidos), que consisffan en miembros de la comunidad en general.

Evaluaciones de seguridad y tolerabilidad. Se determino la seguridad evaluando las constantes vitales, parametros de laboratorio (bioqmmica serica, hematologfa y analisis de orina), ECG, examen ffsico y por registro de acontecimientos adversos durante el periodo de tratamiento.

Muestreo farmacocinetico. Se recogieron muestras de sangre (10 ml cada una) en tubos de recogida de sangre que conteman EDTA antes de la dosis y en las siguientes veces a partir de aqrn: 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 horas. Se enfriaron las muestras de sangre en un bano de hielo y se centrifugaron con refrigeracion tan pronto como fue posible. Se dividieron las muestras de plasma en dos affcuotas y se guardaron a 20 ± 10 °C a la espera del ensayo. Al final del estudio, todas las muestras se transfirieron a MDS Pharma Services Analytical Laboratories (Lincoln) para analisis. Se recogio la produccion de orina completa de cada sujeto para analisis de DGJ para determinar la eliminacion renal durante las primeras 12 horas despues de la administracion de DGJ en los dfas 1 y 7.

Muestreo de la actividad enzimatica de a-GAL A de WBC. Se recogieron muestras de sangre (10 ml cada una) en tubos de recogida de sangre que conteman EDTA y se extrajeron WBC antes de la dosis y los momentos posteriores a partir de aqrn: 100 horas, 150 horas y 336 horas. Las muestras se trataron como se ha descrito, y se determinaron los niveles de actividad enzimatica de a-Gal A de WBC.

Analisis estad^stico. Se resumieron los datos de seguridad que incluyen evaluaciones de laboratorio, examenes ffsicos, acontecimientos adversos, monitorizacion de ECG y constantes vitales por grupo de tratamiento y momento de recogida. Se calculo la estadfstica descriptiva (media aritmetica, desviacion estandar, mediana, mmimo y maximo) para datos de seguridad cuantitativos, ademas de para la diferencia con respecto al nivel inicial. Se compilaron los numeros de frecuencia para la clasificacion de datos de seguridad cualitativa.

Se codificaron los acontecimientos adversos usando el diccionario MedDRA version 7.0 y se resumieron por tratamiento para el numero de sujetos que informan el acontecimiento adverso y el numero de acontecimientos adversos informados. Se proporciono un listado de datos de acontecimientos adversos por sujeto que incluyo termino literal, termino codificado, grupo de tratamiento, gravedad y relacion con el tratamiento. Se enumeraron medicaciones concomitantes y antecedentes personales por tratamiento.

Se resumieron los parametros farmacocineticos por grupo de tratamiento usando estadfstica descriptiva (medias aritmeticas, desviaciones estandar, coeficientes de variacion, tamano de muestra, mmimo, maximo y mediana).

Resultados

Ningun sujeto tratado con placebo tuvo un acontecimiento adverso (AE) y ningun sujeto presento AE despues de recibir 50 mg b.i.d. o 150 mg b.i.d. de DGJ, DGJ parecio ser seguro y bien tolerado por este grupo de sujetos varones sanos ya que las dosis se administraron a 50 mg b.i.d. y 150 mg b.i.d.

Ocurrieron desviaciones de laboratorio de los intervalos normales despues de la dosis, pero ninguno fue considerado clmicamente significativo. No hubo desplazamientos de datos medios clmicamente relevantes en ningun parametro investigado durante el transcurso del estudio. No ocurrieron anomaffas clmicamente relevantes en ningun vital signo, ECG, o parametro del examen ffsico.

Evaluacion farmacocinetica. La siguiente tabla resume los datos farmacocineticos obtenidos durante el estudio.

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Tabla 4.

dosis de 50 mg b.i.d. dosis de 150 mg b.i.d.

Dfa 1 Dfa 7 Dfa 1 Dfa 7

Cmax (|jM)

2,3 ± 0,3 3,9 ± 0,5 11,3 ± 1,5 10,8 ± 1,4

tmax (h)

2,9 ± 0,4 2,5 ± 0,4 3,1 ± 0,4 2,9 ± 0,4

t/ (h)

2,5 ± 0,1 2,4 ± 0,05

Cmm (jM)

0,4 ± 0,03 1,2 ± 0,1

Eliminacion renal acumulada de 12 h (%)a

16 ± 6 48 ± 7 42 ± 7 60 ± 5

aPorcentaje acumulado de DGJ eliminado durante el periodo de 12 horas despues de la dosis.

La farmacocinetica de DGJ fue bien caracterizada en todos los sujetos y a todos los niveles de dosis. En promedio, ocurrieron concentraciones pico a aproximadamente 3 horas para todos niveles de dosis. Cmax de DGJ aumento de una manera proporcional a la dosis cuando las dosis aumentaron de 50 mg a 150 mg.

Las semividas de eliminacion medias (ti/2) fueron comparables a los niveles de dosis de 50 y 150 mg en el Dfa 1 (2,5 frente a 2,4 horas).

El porcentaje medio de DGJ eliminado durante el periodo de 12 horas despues de la dosis fue del 16 % y 42 % a los niveles de dosis de 50 mg y 150 mg, respectivamente, en el Dfa 1, aumentando hasta el 48% y 60%, respectivamente, en el Dfa 7.

Actividad enzimatica de a-galactosidasa A (a-Gal A). Los datos de actividad enzimatica de a-Gal A obtenidos durante el estudio se muestran en la Figura 1. DGJ no inhibio la actividad enzimatica de a-Gal A de WBC en sujetos a dosis de 50 mg b.i.d. o 150 mg b.i.d. Ademas, DGJ produjo una tendencia dependiente de la dosis de elevada actividad enzimatica de a-Gal A de WBC en voluntarios sanos. La actividad enzimatica de a-Gal A se midio en WBC de sujetos administrados con placebo, 50 mg b.i.d., y 150 mg b.i.d. de DGJ. El placebo no tuvo efecto sobre la actividad enzimatica de a-Gal A de WBC. Variaciones en la actividad enzimatica en respuesta a placebo no fueron clmicamente significativas. Tanto 50 mg b.i.d. como 150 mg b.i.d. de DGJ aumentaron la actividad enzimatica de a- Gal A de WBC normalizada. En respuesta a 50 mg b.i.d. de DGJ, la actividad enzimatica de a-Gal A de WBC aumento a niveles del 120 %, 130 % y 145 % antes de la dosis 100 horas, 150 horas y 336 horas despues de la dosis, respectivamente. En respuesta a 150 mg b.i.d. de DGJ, la actividad enzimatica de a-Gal A de WBC aumento a niveles del 150%, 185% y 185% antes de la dosis 100 horas, 150 horas y 336 horas despues de la dosis, respectivamente.

La presente invencion no debe limitarse en alcance por las realizaciones espedficas descritas en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones de la invencion, ademas de aquellas descritas en el presente documento, seran evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de la descripcion anterior y las figuras adjuntas. Tales modificaciones pretenden entrar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Amicus Therapeutics Inc.

<120> CHAPERONAS FARMACOLOGICAS PARA TRATAR OBESIDAD

<130> 077376.0346

<150>60/687.648 <151>

<150>60/799.968

<151> <160> 18

5 <170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211>1000 <212> ADN

10 <213> Homo sapiens

<400> 1

atggtgaact

ccacccaccg tgggatgcac acttctctgc acctctggaa ccgcagcagt 60

tacagactgc

acagcaatgc cagtgagtcc cttggaaaag gctactctga tggagggtgc 120

tacgagcaac

tttttgtctc tcctgaggtg tttgtgactc tgggtgtcat cagcttgttg 180

gagaatatct

tagtgattgt ggcaatagcc aagaacaaga atctgcattc acccatgtac 240

tttttcatct

gcagcttggc tgtggctgat atgctggtga gcgtttcaaa tggatcagaa 300

accattgtca

tcaccctatt aaacagtaca gatacggatg cacagagttt cacagtgaat 360

attgataatg

tcattgactc ggtgatctgt agctccttgc ttgcatccat ttgcagcctg 420

ctttcaattg

cagtggacag gtactttact atcttctatg ctctccagta ccataacatt 480

atgacagtta

agcgggttgg gatcatcata agttgtatct gggcagcttg cacggtttca 540

ggcattttgt

tcatcattta ctcagatagt agtgctgtca tcatctgcct catcaccatg 600

ttcttcacca

tgctggctct catggcttct ctctatgtcc acatgttcct gatggccagg 660

cttcacatta

agaggattgc tgtcctcccc ggcactggtg ccatccgcca aggtgccaat 720

atgaagggag

cgattacctt gaccatcctg attggcgtct ttgttgtctg ctgggcccca 780

ttcttcctcc

acttaatatt ctacatctct tgtcctcaga atccatattg tgtgtgcttc 840

atgtctcact

ttaacttgta tctcatactg atcatgtgta attcaatcat cgatcctctg 900

atttatgcac

tccggagtca agaactgagg aaaaccttca aagagatcat ctgttgctat 960

cccctgggag

gcctttgtga cttgtctagc agatattaaa 1000

15

<210> 2 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Una chaperona farmacologica que es un antagonista del polipeptido de receptor de melanocortina 4 (MC4R) que tiene la siguiente estructura:

   imagen1

   en la que la chaperona farmacologica se une a un polipeptido MC4R mutante, para su uso en el tratamiento de obesidad o trastorno por atracon, en la que la chaperona va a administrate a un individuo que tiene una mutacion en el gen MC4R asociado a obesidad, y en la que la mutacion esta seleccionada del grupo que consiste en T11A, S58C, P78L, N97D, G98R, I102S, I106P, Y157S, R165Q, R165W, A175T, L250Q, C271R, Y287X, I316L, I316S y I317T con respecto a la secuencia del polipeptido MC4R no mutante expuesta en SEQ ID NO: 2.
2. 2. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 1, en la que la chaperona farmacologica se une al polipeptido MC4R mutante para

   1. aumentar la actividad de MC4R mutante;
3. 2. aumentar la expresion de la superficie celular de MC4R mutante; y/o
4. 3. aumentar la estabilidad.
5. 3. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 1, en la que el polipeptido MC4R mutante comprende la mutacion S58C, R165Q o R165W con respecto a la secuencia del polipeptido MC4R no mutante expuesta en SEQ ID NO: 2.
6. 4. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 1, en la que la chaperona farmacologica se une al polipeptido MC4R mutante ya que esta plegado en una conformacion funcional.
7. 5. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 2, en la que la actividad potenciada por la chaperona farmacologica es activacion de adenilil ciclasa.
8. 6. La chaperona para su uso segun la reivindicacion 2, en la que la chaperona farmacologica aumenta el trafico de polipeptido MC4R mutante a la membrana celular.
9. 7. La chaperona para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en la que la chaperona farmacologica va a administrarse en un vehfculo farmacologicamente aceptable.
10. 8. La chaperona para su uso segun cualquier reivindicacion precedente, en la que la chaperona se administra en una cantidad de 1 a 100 mg/kg de peso corporal por dfa.

    imagen2

    imagen3

    CTO

    FIG.2

    00

    imagen4

    OH H BocN

    J. Med. Chem., 2002, 45, 4589-4593, J. Med. Chem., 2004, 47, 744-755.

    FIG.3

    4^

    CD

    imagen5

    imagen6

    FIG.5

    imagen7

    FIG.6

    imagen8

    d. Med. Chem., 2003, 46, 9-11.

    imagen9

    imagen10

    imagen11

    FIG.10A

    imagen12

    FIG. 10B

    imagen13

    FIG. 10C

    imagen14

    aoroid

    Ui

    oo

    LU

    Q

    O <

    id

    8 w

    <g

    LL_

    | B < < LU O O Z LU

    "O LU

    O cc

    < CL

    0 % c p

    1 I I

    imagen15

    NINGUNA NINGUNA C0MPUEST0 4 C0MPUEST0 4 C0MPUEST0 3 C0MPUEST0 3

    ■ WT s S58C sN62S n R165W Q P299H

    FIG.11

    ACTIVIDAD ENZIMATICA NORMALIZADA

    ACTIVIDAD ENZIMATICA MEDIA DE WBC +/- EEM A/Nr.n„

    O PLACEBO

    a 50 mg

    imagen16

    0 50 100 150 200 250 300 350

    TIEMPO EN HORAS

    LOS VALORES SE NORMALIZARON A LOS VALORES DE PRE-DOSIS DE CADA GRUPO (n=6 PARA GRUPOS TRATADOS, n=4 PARA GRUPO DE PLACEBO)

    FIG.12

    imagen17

    FIG.13

    imagen18

    imagen19

    FIG. 13 continuacion

    Cl

    imagen20

    Ri es aminoalquilo sustituido o sin sustituir con el grupo alquilo tiene 1-3 carbonos, o un aromatico monociclico o biciclico que opcionalmente comprende un heteroatomo, preferentemente

    imagen21

    0

    imagen22

    Donde R4 y R5 son

    respectivamente e independientemente H, CH3, F.Cl.Brol

    imagen23

    donde Re es H 0 alquilo, alilo, alquinilo, alquenilo, alcoxi, alquilo heteroclclico 0 aminoalquilo sustituido 0 sin sustituir.

    R3 es H 0 alquilo, alquilo heterociclico 0 aminoalquilo sustituido 0 sin sustituir donde el grupo alquilo tiene 1-3 carbonos

    imagen24

    donde X e Y son respectivamente e independientemente H, F, Cl, Br, I o

    I\I02;

    M 3 o sin enlace;

    Aes

    B-F son respectivamente e independientemente C, N o S;

    Ri es un heterociclilo, alcoxi o carbamoilo sustituido;

    R2 es FI o -OCFI3; y

    R3 es amino sustituido

    Cuando R1 es heteroclclico, el heteroclclico incluye preferentemente incluye AV'

    F G.14

    imagen25

    particulares X es F en la posicion para

    Ri es alquilo, alquimlo, alquemlo, alilo, alcoxi

    heteroalquilo, etc.; en realizaciones particulares el

    (CH2)n-R2

    grupo alquilo tiene C1-6, mas preferentemente C1-3;

    R2 es arilo, heteroarilo 0 arilcarbomlalquilo sustituido 0

    sin sustituir

    n es 1-4

    FIG.15

    imagen26

    R2 es -S- 0 H

    R3 es H 0

    m

    0 r2

    R4 es aminoalquilo temendo el alquilo C1-5, en

    realizaciones particulares guamdinoalquilo temendo el

    alquilo C1-5, preferentemente C1-3

    R5 es un arilo 0 heteroarilo sustituido 0 sin

    sustituir; y

    R6 es H, CH3 0 alquilo C1-C3

    R7 es H 0 -S

    Rs es H, CH3 0 alquilo C1-3

    FIG.16