WO2006109855A1

WO2006109855A1 - 摂食亢進作用を有するペプチドおよびスクリーニング方法

Info

Publication number: WO2006109855A1
Application number: PCT/JP2006/307863
Authority: WO
Inventors: Takayuki Hida; Toru Arai; Takashi Seiki; Tomoko Sekiya; Eiki Takahashi; Toru Sawai; Kokichi Harada; Michiko Kosasa
Original assignee: Eisai R & D Management Co., Ltd.
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2006-04-13
Publication date: 2006-10-19
Also published as: JP2006290826A

Abstract

　本発明は、摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する治療剤、当該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、当該スクリーニング用キット、および当該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などを提供することを目的とする。本発明によれば、リラキシン－３を含有してなる、摂食亢進剤、体重増加剤、および脂肪量増加剤が提供される。

Description

摂食亢進作用を有するペプチドおよびスクリーニング方法

発明の分野

[0001] 本発明は、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリぺプチド、当該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、当該ポリペプチドの受容体の賦活ィ匕、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、当該スクリーニング用キット、および当該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などに関する。

背景技術

[0002] 摂食は動物が生きて、くために欠力せな、行動である。肥満は飽食時代の現代社会にあって、摂食量とエネルギー消費の調節'バランスが崩れた結果として生じたものであると考えられている。肥満は生活習慣病を始めとする各種疾病の危険因子でもあるため、社会的な関心が高まってきている。食事療法や運動療法など、摂食量とエネルギー消費のバランスを改善する基本的な治療法はあるものの、現状では肥満患者 ·その予備群は増加している。最近では末梢組織での栄養吸収を抑制する薬剤や中枢性に作用し摂食量を減少させる薬剤も開発されているが、肥満治療剤として摂食量を抑制する有効かつ安全な薬剤の開発は望まれている。

[0003] 摂食行動は脳中枢神経からの指令と、末梢組織からのフィードバックによって中枢神経がさらに指令を送る循環で制御されていることがわ力りつつあり、その主体である脳での摂食制御機構に焦点を当てた研究が盛んに行なわれている。脳の特定領域を破壊した動物の研究や、神経ペプチドや神経伝達物質を用いた機能解析により、視床下部領域が摂食行動に重要な役割を果たしていることが分力つてきている。また、視床下部には多くの神経伝達物質や神経ペプチドおよびそれらに対する受容体 (レセプター）が発現しており、これらと摂食行動との関連が示されている。例えば摂食の亢進には視床下部弓状核に存在する-ユーロペプチド Ύゃァグーチ関連ぺプチドなどが関わること、さらに摂食の抑制には同所に存在するメラノコルチンや視床下部室傍核力ゝら放出されるコルチコトロピン放出ホルモンやサイロトロピン放出ホルモンが関わっていることが報告されている（Spiegelman et al.， Cell, 104, p.541-543, 200 D oし力しながら、摂食を制御する複雑な神経ネットワークには未だ不明な部分が多ぐ未だなお新規な神経伝達因子やその局在についての新たな知見が得られつつある状況である。

[0004] 神経伝達物質や神経ペプチドなどの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して機能を発揮する。これらのレセプターの中で細胞膜を 7回貫通する構造を有し、細胞内で 3量体 Gタンパク質と共役するレセプターは特に Gタンパク質共役型受容体 (GPCR)と分類されている。 GPCRは特異的なリガンドが結合した時に細胞内にシグナルを伝達し、細胞の賦活化や抑制化をすることで、各種臓器 · 器官での機能発現に重要な役割を担って、る。それ故に GPCRを賦活ィ匕するァゴ- ストや抑制するアンタゴニストと呼ばれる物質は、医薬品として使用されている。 GPC Rに分類されるレセプターの中でもその特異的なリガンドが未同定のものが数多く知られており、それらはォーファン GPCRと呼ばれている。ォーファン GPCRは新たな治療薬のターゲットとしての可能性を秘めており、生体内のリガンド同定や機能を賦活もしくは抑制する物質の研究が進められている。このようにして同定されたリガンドや物質を生体に投与してレセプターとそのリガンドの機能を解明することは、医薬品の開発を提供する上できわめて重要である。

[0005] 近年の遺伝子配列情報の充実により、既知のタンパク質 ·ペプチドの配列を元にその相同性や法則性を導きだし、未知のペプチドやタンパク質を予測して、 GPCRの新たなリガンドとして同定する方法も可能となった。インスリン'リラキシン (Insulin'Re laxin)ファミリーに属するリラキシンは、黄体や胎盤から産生される分泌ペプチドであり、妊娠の維持と出産に関わる作用をもつことが以前力知られていた。それ以外の作用としては、例えばリラキシン— 2のラット静脈内投与による摂水量の亢進という報告はなされているが（Sinnayah et al.， Endocrinology, 140, p.5082- 5086, 1999)、リラキシンの摂食行動との関連につ!ヽては知られて!/ヽな、。リラキシンをコードする DNA の塩基配列を元に遺伝子配列データベース力新たに同定された DNAのコードするタンパク質が、リラキシン一 3 (Relaxin— 3) (または INSL7とも称される。）と名づけられたポリペプチドである（国際公開第 01/68862号パンフレット)。成熟型または活性型のリラキシン 3は、リラキシンー3のプレプロプロティン ^ 1：0 1：0 6^ から切断された B鎖および A鎖カゝら構成され、当該 B鎖および当該 A鎖がジスルフイド結合により結合されているポリペプチドである。リラキシン—3 (relaxin—3)は、免疫細胞系である THP— 1の細胞内サイクリック AMP (cAMP)の上昇をともなって細胞を賦活ィ匕することが報告された（国際公開第 01Z81562号パンフレット、 Bathgate et a 1., J. Biol. Chem., 277, p.1148-1157, 2002) ₀その後、リラキシン一 3はリラキシン一 2 と共に、 GPCRである LGR7に結合するリガンドの一つであることが示されるとともに、リラキシン一 3による cAMPの上昇には LGR7が関与して!/、ることが示された (Sudo et al., J. Biol. Chem., 278, p.7855-7862, 2003)。 LGR7は脳と末梢組織に発現しており、これまでには生殖器官の発達や妊娠 '出産に関わることが示唆されているが、摂食との関連にっヽては良く分力つてヽな、。

[0006] 最近、生体内のリガンドが未同定の GPCRであった、 SALPR(GPCR135)と名づけられているレセプターや、 GPR100 (hGPCRl l、 GPCR142)と呼ばれるレセプタ一のリガンドがリラキシン一 3であることが報告された（Takeda et al., FEBS Letter, 52 0, p.97-101, 2002、 Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003、国際公開第 2004Z82598号パンフレット）。また、リラキシン一 3による cAMPの低下には SA LPR (Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003)や GPR100 (Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003)が関与していることが報告された。さらに、国際公開第 00Z24891号パンフレット、国際公開第 01Z48189号パンフレット、国際公開第 02Z31111号パンフレット、国際公開第 02Z61087号パンフレットにもこれらのレセプターに関連する記載がある。 SALPRは脳に局在することが知られており（Matsumoto et al., Gene, 248, p.183- 189, 2000)、特に視床下部の室傍核と視索上核に存在することが報告された（国際公開第 2004Z82598号パンフレット、 Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003)。一方、 GPR100は全身性に発現しているレセプターであることが報告されている（Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p. 50765-50770, 2003、 Boels et al" Br. J. PharamacoL, 140, p.932- 938, 2003)が、その機能については不明なままである。

[0007] 一方、リラキシン 3は脳内の特定の領域に存在することが報告されており（Liu et al.， J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003)、リラキシン 3が脳内ペプチドとして中枢性に何らかの機能を発揮して、る可能性は考えられて、たが、これまでにリラキシン 3が摂食を調節する力否かについても、リラキシン 3が体重調節に関与するか否かについても報告されていな力た。また、リラキシン一 3が肥満と関連するかにつ！、ても知られて、なかった。

発明の概要

[0008] 本発明は、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリぺプチド、当該ポリペプチドを含有する治療剤、当該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、当該スクリーニング用キット、および当該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などを提供することを目的とする。

[0009] 本発明者は、リラキシンー3をラット脳室内に投与し、投与後の摂食量を観察することにより、リラキシン一 3が摂食亢進作用を有することを見出した。また、ラットにリラキシンー3を単回投与した後に、当該ラットから採取した血液を測定した結果、体脂肪増加の指標として知られるレブチン濃度が血液中で上昇していることを見出した。さらに、ラット脳室内へリラキシン— 3の持続投与を行なったところ、リラキシン— 3投与群では対照の vehicle投与群に比べて有意な摂餌量の増加と体重増加作用が認められた。リラキシン一 3の持続投与によって両群において運動量に差はな力つた。これらのことから、リラキシン 3は摂食亢進作用と共に体重増加作用も有することが初めて明らかとなった。さらに、リラキシン 3を投与し体重が増加したラットにおいては脂肪量の増加および、体脂肪含量と相関する血中レブチン濃度が上昇していた。また、糖尿病と関連するインスリン濃度も上昇していた。以上より、リラキシン 3は摂食亢進作用、体重増加作用、肥満作用を有するポリペプチドであると考えられる。本発明はこれらの知見に基づ、て完成されたものである。

[0010] すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。

(1)リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン一 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物を含有してなる摂食亢進剤。

(2)リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン一 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物を含有してなる体重増加剤。

(3)リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン一 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物を含有してなる脂肪量増加剤。

(4)次の工程;被験物質を、

(A)リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、

(B)リラキシン 3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、

を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(5)次の工程；

リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリべプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B 鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物および被験物質を、

を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリー- ング方法。

(6)次の工程； (B)リラキシン 3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、

をさらに含むことを特徴とする前記（5)に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(7)リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記 (4)〜（6)の、ずれか一項に記載のスクリーニング方法。

(8) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（7)に記載のスクリーニング方法。

(9)リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリー二ング用キット。

(10)リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力も得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン一 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖からなるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、前記（9)に記載のスクリー- ング用キット。

(11)リラキシン 3が標識されている、前記（10)に記載のスクリーニング用キット。

(12)リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（9)〜（11)の、ずれか一項に記載のスクリーニング用キット。

(13) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（12)に記載のスクリーニング用キット。

(14)リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力も得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン一 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖からなるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物を含有してなる体重増加を必要とする疾患の治療剤。

(15)疾患が拒食症または悪液質である前記（14)に記載の治療剤。 (16)次の工程;被験物質を、

を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(17)次の工程；

を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーユング方法。

(18)次の工程；

をさらに含むことを特徴とする前記（17)に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(19)リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（16)〜（18)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

(20) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（19)に記載のスクリーニング方法。

(21)リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。

(22)リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力も得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン一 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖からなるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、前記（21)に記載のスクリーユング用キット。

(23)リラキシン 3が標識されている、前記（22)に記載のスクリーニング用キット。

(24)リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（21)〜（23)の、ずれか一項に記載のスクリーニング用キット。

(25) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（24)に記載のスクリーニング用キット。

(26)次の工程;被験物質を、

を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(27)次の工程；

(28)次の工程；

をさらに含むことを特徴とする前記（27)に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。 (29)リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（26)〜（28)の、ずれか一項に記載のスクリーニング方法。

(30) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（29)に記載のスクリーニング方法。

(31)リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリー- ング用キット。

(32)リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力も得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン一 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖からなるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、前記（31)に記載のスクリーユング用キット。

(33)リラキシン 3が標識されている、前記（32)に記載のスクリーニング用キット。

(34)リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（31)〜（33)のヽずれか一項に記載のスクリーニング用キット。

(35) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（34)に記載のスクリーニング用キット。

(36) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する摂食抑制剤。

(37) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（7)または（8)に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（36)に記載の剤。

(38) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する体重減少剤。

(39) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（19)または（20)に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（38)に記載の剤。

(40) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する脂肪量減少剤。

(41) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（29)または（30)に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記 (40)に記載の剤。

(42) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する肥満治療剤。 (43) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（19)、（20)、（29)または（30)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記 (42)に記載の剤。

(44) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する糖尿病治療剤。

(45) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（19)、（20)、（29)または（30)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記 (44)に記載の剤。

(46) SALPR力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（36)〜 (45)の、ずれか一項に記載の剤。

(47)リラキシン— 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の摂食量を測定する工程を含むことを特徴とする、摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(48)リラキシン 3受容体に作用する化合物が、前記 (4)〜（8)の、ずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記 (47)に記載の方法。

(49)リラキシン— 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の体重を測定する工程を含むことを特徴とする、体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(50)リラキシン 3受容体に作用する化合物力前記（16)〜（20)の、ずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記 (49)に記載の方法。

(51)リラキシン— 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の肥満の指標を測定する工程を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(52)リラキシン 3受容体に作用する化合物力前記（26)〜（30)の、ずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（51)に記載の方法。

図面の簡単な説明

[図 l]pBabeCL (SALPR) IHの構築図を示す。

[図 2A]CRE4VIPZpBluescriptIISK ( + )の構築図を示す。

[図 2B]pBabeCLXの構築図を示す。 [図 2C]pBabeCLcre4vPdNNの構築図を示す。

[図 3]SALPRを発現させた SE302細胞におけるフォルスコリン添カ卩によって上昇した転写活性のヒト型リラキシンー3による特異的な用量依存的抑制を示す。黒四角はヒト型リラキシン一 3を添加した場合を示す。白四角はインスリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの最終濃度 (nmolZL)を示す。縦軸はフオルスコリン 1 μ mol/Lを添カ卩した細胞上清のアルカリフォスファターゼの活性を 100、フオルスコリンを添加して、な、細胞上清の活性を 0として算出した各活性の割合を示す。各点は平均値 (N = 3)と標準偏差を示す。

[図4]SALPR—SE302細胞を用ぃたリラキシンー3拮抗化合物の評価(スクリー-ング）を示す図である。（A)は、 SALPR— SE302細胞を使用し、（B)は、 SE302細胞を使用した。図中、 FK (—）はフオルスコリン無処置群、 FK ( + )は 3 μ Μフオルスコリン処置群、 FK( + )&RLX—3はフオルスコリンと 3ηΜ ヒト型リラキシン 3の処置群、 FK ( + ) &RLX- 3 &化合物 1はフオルスコリンとヒト型リラキシン 3と化合物 1を共存させた処置群を示す。縦軸はアルカリフォスファターゼの活性 (PLAT活性)を示す。

圆 5]正常ラット脳室内へのヒト型リラキシン— 3の単回投与による摂餌量への作用を示す。白いバーは vehicle投与群 (対照）を、斜線のバーはヒト型リラキシン— 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの摂餌量 (g)の平均値と標準誤差を示す。圆 6]正常ラット脳室内へのヒト型リラキシン— 3の単回投与による血中レブチン濃度への作用を示す。白いバーは vehicle投与群 (対照）を、斜線のバーはヒト型リラキシンー 3投与群を示す。縦軸は各群の血中のレブチン濃度 (ngZmL)の平均値と標準偏差を示す。

圆 7]正常ラットの脳室内に持続投与したヒト型リラキシン— 3による体重増加量への作用を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はヒト型リラキシン— 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹当たりの体重増加量 (g)の平均値と標準偏差を示す。圆 8]正常ラットの脳室内に持続投与したヒト型リラキシン— 3による摂餌量への作用を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はヒト型リラキシン— 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの摂餌量 (g)の平均値と標準偏差を示す。 [図 9]正常ラットの脳室内に持続投与したヒト型リラキシン— 3による精巣周囲脂肪重量への作用を示す。白いバーは vehicle投与群 (対照）を、斜線のバーはヒト型リラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの脂肪量 (g)の平均値と標準偏差を示す。

[図 10]正常ラットの脳室内に持続投与したヒト型リラキシン一 3による血中ホルモンの変動を示す。（A)は血中レブチン濃度への作用を示す。白いバーは vehicle投与群 (対照）を、斜線のバーはヒト型リラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの血中レブチン濃度 (ngZmL)の平均値と標準偏差を示す。 (B)は血中インスリン濃度への作用を示す。白いバーは vehicle投与群を、斜線のバーはヒト型リラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの血中インスリン濃度 (ngZmL)の平均値と標準偏差を示す。

[図 11]脳室内にヒト型リラキシン— 3を持続投与した後、自発運動量を測定しながら飼育したラットの体重増加量の変化を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はヒト型リラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹当たりの体重増加量 (g) の平均値と標準偏差を示す。図中の白三角は、明期の運動量測定日、黒三角は暗期の運動量測定日を示す。

[図 12]脳室内にヒト型リラキシン— 3を持続投与したラットの自発運動量に対する作用を示す。白いバーは vehicle投与群 (対照）を、斜線のバーはヒト型リラキシン— 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの全活動量 (カウント)の平均値と標準偏差を示す。

発明の具体的説明

[0012] リラキシン 3

本発明のリラキシン一 3は、リラキシン一 3 (または INSL7とも称される。）と名づけられたポリペプチドであり、成熟型または活性型のリラキシン 3を意味する。

[0013] 具体的には、本発明のリラキシンー3は、配列番号 2の N末端から第 26番目（Arg) 〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド (以下、単に「B鎖」と略記する場合がある。）と配列番号 2の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力なるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド (以下、単に「A鎖」と略記する場合がある。）が、 B鎖および A鎖のシスティン残基がジスルフィド結合により結合されて、ることを特徴とするポリペプチドを意味する。ジスルフイド結合は、 B鎖および A鎖のシスティン残基力分子間および分子内で結合していることが望ましい。

より具体的には、本発明のリラキシン— 3は、配列番号 2の N末端力も第 26番目（A rg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）と配列番号 2 の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力もなるポリぺプチド (ヒト型 A鎖）がジスルフイド結合により結合されて、ることを特徴とするポリべプチドを意味し、 B鎖および A鎖のシスティン残基が分子間および分子内でジスルフイド結合を形成しているポリペプチドである。当該ジスルフイド結合は、配列番号 2の N末端から第 35番目の B鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端力第 129番目の A 鎖のシスティンが結合し、配列番号 2の N末端から第 47番目の B鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端から第 142番目の A鎖のシスティンが結合し、並びに配列番号 2の N末端力も第 128番目の A鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端力も第 1 33番目の A鎖のシスティンが結合して、ることが望まし、。

本発明のリラキシン 3としては、下記のものが挙げられる。（数字はジスルフイド結合するシスティン残基を示し、同じ数字同士のシスティン残基がジスルフイド結合する。）

[ヒト型リラキシン 3]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： DVLAGLSSSCCKWGCSKSEISSLC (配列番号 6)

31 3 2

B鎖および A鎖のアミノ酸配列は、本発明のリラキシン 3のプレプロプロテインのァミノ酸配列に含まれる。本発明のリラキシン 3のプレブ口プロテインは、配列番号 2 で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン） (GenBank ァクセッション番号 NM— 080864)または当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド（以下、単に「プレブ口プロティン」と略記する場合もある。）が挙げられる。本発明のリラキシン— 3は、前記プレプロプロテイン力切断された B鎖および A鎖力 B鎖および A鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを含む。

[0014] 本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖およびプレプロプロテインは、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に由来する天然由来のポリペプチドであつても良ぐ組換えポリペプチド、合成ポリペプチドであっても良い。本発明のリラキシン 3には、本発明のリラキシン 3の塩が含まれ、さらには本発明のリラキシン 3またはその塩は糖鎖を有しな、ものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。塩につ!、ては、後述の塩の記載を参照するとよい。また、本発明のリラキシン— 3、 B鎖、 A鎖およびプレブ口プロテインには、 N末端環状グルタミン化、 C末端アミドィ匕など、分泌タンパクのプロセッシングを受けた形のポリペプチドを含む。

[0015] 上述の機能的に等価な改変ポリペプチドとは、配列番号 2の N末端から第 26番目（ Arg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）、配列番号 2の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力もなるポリべプチド (ヒト型 A鎖)または配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド (ヒト型プレブ口プロテイン）において、 1または複数個（好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列であって、しかも B鎖および A鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン 3と実質的に同じ活性 [例えばリラキシン 3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、アデ二ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、ィノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c fosおよび c junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など）、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用]を有するのであれば、上述の生物由来のポリべプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドのいずれであってもよい。配列番号 2の N末端力も第 26番目（Arg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）、配列番号 2の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 A鎖)または配列番号 2で表されるアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型プレブ口プロテイン)のアミノ酸配列が欠失、置換および Zまたは挿入される場合は、その位置は、特に限定されないが、前記のアミノ酸配列中のシスティン残基以外のアミノ酸残基が挙げられる。

[0016] 本明細書において「置換」は、好ましくは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換える保存的置換を意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行なうことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性 (疎水性)アミノ酸としては、ァラニン、パリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フ -ルァラニン、メチォニンなどが挙げられる。極性（中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオ-ン、チロシン、グルタミン、ァスパラギン、システィンなどが挙げられる。陽電荷をもつ (塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性)アミノ酸としては、ァスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

[0017] 前記の欠失、置換、挿入および Zまたは付加されてもょ、アミノ酸残基の数は、例えば 1〜30個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5 個、特に好ましくは 1〜2個である。

[0018] 上述の相同ポリペプチドとは、配列番号 2の N末端から第 26番目（Arg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）、配列番号 2の N末端から第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 A 鎖)または配列番号 2で表されるアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型プレブロブ口ティン)のアミノ酸配列に関して 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列力もなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、しかも B 鎖および A鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン 3と実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3 受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用）を有するのであれば、上述の生物由来のポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドのいずれであってもよい。

[0019] 本明細書において、「同一性」（「相同性」ということがある）の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよぐ例えば全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI)の相同性アルゴリズム BLAST (Basic 1 ocal alignment searcn tool) http： / / www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLA¾

TZにおいてデフォルト (初期設定)のパラメーターを用いることにより、算出することができる。

[0020] 上述の機能的に等価な改変ポリペプチドまたは相同ポリペプチドの B鎖、 A鎖、リラキシン 3またはプレプロプロテインの好ましい例としては、例えば、それ自体公知のマウス型、ラット型またはブタ型の B鎖、 A鎖、リラキシン 3またはそのプレプロプロテイン（国際公開第 01/81562号パンフレット）や、リラキシン一 1、リラキシン一 2、またはインスリン様ペプチド 3 (INSL— 3)のプレブ口プロテインまたは B鎖（国際公開第 2 006Z026355号パンフレット）などが挙げられる。

[0021] 「リラキシン 3またはリラキシン 3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン一 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド」は、好ましくは、本発明のリラキシン— 3と実質的に同じ活性 (例えばリラキシン— 3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用）を有する下記（1)または（2)のポリペプチドである：

(1)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 6のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 A鎖)またはそのアミノ酸配列にぉ、て、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端力ゝら第 11番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端から第 24 番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 6の N末端力も第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；および

(2)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90 %以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 6 のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 A鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上（好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型 A鎖とからなるポリペプチドであつて、配列番号 5の N末端力も第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端から第 11番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B 鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 6の N末端力も第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端力第 15番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド。

また、「リラキシン— 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリべプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシステイン残基がジスルフイド結合により結合されているポリペプチド」の例としては、国際公開第 2006/026355号パンフレットや Changlu Liu et al, Mol Pharmacol. 67(1):231 -40(2005)に開示されたリラキシンー3のキメラペプチドが挙げられる。

リラキシン一 3のキメラペプチドは、好ましくは、本発明のリラキシン一 3と実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用）を有する以下 (3)〜（10 )のポリペプチドである：

(3)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 7のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型リラキシン— 1の A鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、

1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付カロされた改変ヒト型リラキシン一 1の A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 11番目の A 鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 7 の N末端から第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合して、るポリペプチド；

(4)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90 %以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 7 のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型リラキシン一 1の A鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型リラキシン一 1の A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端力第 11番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 7の N末端力も第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；

(5)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 8のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型リラキシン 2の A鎖)またはそのアミノ酸配列にぉ、て、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、

1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付カロされた改変ヒト型リラキシン 2の A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 11番目の A 鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 8 の N末端から第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合して、るポリペプチド；

(6)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90 %以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 8 のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型リラキシン一 2の A鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型リラキシン一 2の A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端力第 11番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 8の N末端力も第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；

(7)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 9のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型インスリン様ペプチド 3の改変 A鎖)またはそのアミノ酸配列にお!ヽて、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド 3の A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端力も第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端から第 9番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端から第 22番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 9の N末端力ゝら第 8番目の A鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端力も第 13番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；

(8)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90 %以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 9 のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型インスリン様ペプチド 3の改変 A鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型インスリン様ペプチド 3の A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端力も第 1 0番目の B鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端から第 9番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 9の N 末端から第 22番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 9の N末端力第 8番目の A鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端から第 13番目の A鎖のシスティンとが結合して、るポリペプチド；

(9)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 10のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型インスリン様ペプチド 6の改変 A鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド 6の A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 10の N 末端から第 7番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 10の N末端から第 20番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 10の N末端力も第 6番目の A鎖のシスティンと、配列番号 10の N末端から第 11番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；および

(10)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 10のアミノ酸配列力もなるポリペプチド（ヒト型インスリン様ペプチド 6の改変 A鎖）またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型ィンスリン様ペプチド 6の A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 10の N末端から第 7番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 10 の N末端から第 20番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 10の N末端から第 6番目の A鎖のシスティンと、配列番号 10の N末端から第 11番目の A鎖のシスティンとが結合して、るポリペプチド。

リラキシン 3のキメラペプチドは、より好ましくは、下記のものが挙げられる。（数字はジスルフイド結合するシスティン残基を示し、同じ数字同士のシスティン残基がジスルフイド結合する。）これらのキメラペプチドは、 SALPR (GPCR135)、 GPR100 (G PCR142)、および LGR7に対するリガンド活性が確認されている（国際公開第 200 6Z026355号パンフレットおよび Changlu Liu et al., Mol Pharmacol. 67(1):231- 40(2 005))。

[ヒト型 B鎖とヒト型リラキシン 1の A鎖とのキメラペプチド]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： RPYVALFEKCCLIGCTKRSLAKYC (配列番号 7)

31 3 2

[ヒト型 B鎖とヒト型リラキシン 2の A鎖とのキメラペプチド]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： QLYSALANKCQHVG£TKRSLARF£ (配列番号 8)

31 3 2

[ヒト型 B鎖とヒト型インスリン様ペプチド 3の改変 A鎖とのキメラペプチド]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： ATNPARY££LSG£TQQDLLTL£ (配列番号 9)

31 3 2

[ヒト型 B鎖とヒト型インスリン様ペプチド 6の改変 A鎖とのキメラペプチド]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： GYSEKCCLTGCTKEELSIAC (配列番号 10)

31 3 2

本発明において用いられるリラキシン一 3は、また、リラキシン一 3と実質的に同じ活性を有するのであれば、 B鎖および A鎖の分子内あるいは分子間で、ジスルフイド結合あるいはそれ以外の結合形式により、結合していてもよい。このようなペプチドの例は、国際公開第 2004Z113381号パンフレット、 Halls et al, J. Pharmacol. Exp. Th er.， Vol.313:677- 687(2005)、 Rosengren et al., J. Biol. Chem. Vol.281:5845- 5851(2 006)、 Bathgate et al., Biochemistry Vol.45:1043- 1053(2006)などに記載されている。

[0023] 本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレプロプロテインは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体力発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物力所望のポリペプチドを分離および精製することによつて調製することができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。

[0024] リラキシン 3をコードするポリヌクレオチド

本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレォチド (以下、単に「本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチド」と略記する場合もある。 )は、本発明のリラキシン一 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、 DNAおよび RNAの両方を意味する。

本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号 1 の 5'末端力も第 76番目（c)〜第 156番目（g)の塩基配列力もなるポリヌクレオチド (ヒト型 B鎖をコードするポリヌクレオチド)、配列番号 1の 5'末端力も第 355番目（g)〜第 426番目（c)の塩基配列力もなるポリヌクレオチド (ヒト型 A鎖をコードするポリヌクレオチド）、配列番号 1で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド (ヒト型プレブ口プロテインをコードするポリヌクレオチド）とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする塩基配列を有し、本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインと実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。 [0025] 本明細書にぉ、て、ストリンジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチドとは、具体的には、 FASTA、： BLAST、 Smith— Waterman〔Meth. Enzym. , 16 4, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のノラメーターを用いて計算したときに、配列番号 1の 5'末端力も第 76番目（c)〜第 15

6番目（g)の塩基配列力もなるポリヌクレオチド、配列番号 1の 5'末端力も第 355番目 (g)〜第 426番目（c)の塩基配列力なるポリヌクレオチドまたは配列番号 1で表される塩基配列と少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダィゼーシヨン緩衝液中で、温度が 40°C〜70°C、好ましくは 60°C〜65°Cなどで反応を行い、塩濃度力 Sl5〜300mmolZL、好ましくは 15〜60mmolZLなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。

[0026] 本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明のリラキシン一 3をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたは cDNAライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインの部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当な DNAプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。

[0027] B鎖 (配列番号 2の N末端から第 26番目（Arg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号 1の 5'末端から第 76番目（c)〜第 156番目（g)の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる

A鎖 (配列番号 2の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号 1の 5'末端から第 355番目（g)〜第 426番目（c)の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。

プレプロプロテイン (配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号 1で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。

[0028] プラスミド

前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。また、分離および精製の操作を容易にするために、必要に応じて本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロティンを切り出す融合タンパク質として発現することのできるプラスミドであってもよ、。

[0029] 形龍

また、前記形質転換体も、上記のような本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明のリラキシン 3を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。また、別の態様によれば、前記形質転換体は、 B鎖、 A鎖が切り出される切断部位に作用するプロテアーゼを発現するプラスミドを同時に含んで、てもよ、。

[0030] 前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えば Escherichia coli JM109株）または酵母（例えば Saccharomyces cerevisi ae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えば CHO細胞、 H EK— 293細胞、または COS細胞）または昆虫細胞（例えば BmN4細胞）を挙げることがでさる。

[0031] また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、 pUC、 pTV、 p GEX、 pKK、または pTrcHisを；酵母に対しては、 pEMBLYまたは pYES2を； CH O細胞、 HEK— 293細胞および COS細胞に対しては、 pcDNA3、 pMAMneoまたは pBabe Puroを； BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウィルス（BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば PBK283)を挙げることができる。

[0032] 前記形質転換体を、本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、本発明のリラキシン一 3、 B鎖、 A鎖またはプレプロプロテインをコードする RN Aを注入し、本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。

[0033] 本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインを、前記形質転換体の培養物から取得する場合は、培養後に、菌体、細胞または培養液を集め、分離および精製の公知の方法を組合せ、リラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロティンの生化学的性質または物理的性質などを利用しながら行なうことができる。例えば、限外濾過、液体クロマトグラフィー（例えば、ァフィ-ティクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー (HPLC)など）、透析法などの技術を利用することができる

[0034] 本発明のリラキシン一 3の B鎖および A鎖をそれぞれ独立に調製した場合、または融合タンパク質力も B鎖または A鎖を切り出して調製する場合は、生産されたまたは切り出された B鎖および A鎖を、常法に従い、単離精製し、それぞれ同士をジスルフイド結合で結合させることもできる。

[0035] リラキシン 3を含有する医蓉組成物

本発明のリラキシン 3は、摂食亢進作用、体重増加作用、肥満作用を有するため、摂食亢進剤として食欲不振や摂食量が低下した栄養障害などの治療、体重増加剤、脂肪量増加剤として体重増加を必要とする疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、および本発明のリラキシン 3または本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドの異常などに起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症もしくは各種疾患の治療 (例えば術中、術後）に伴、減少した摂食 (もしくは食欲)および Zまたは体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記各種疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患 (例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検查時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など)、免疫機能調節に係る疾患 (例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など）、摂食障害、拒食症、 AIDS、癌、または悪液質などが挙げられる。好ましくは、拒食症、悪液質が挙げられる。

[0036] 前記疾患の治療の医薬として使用するにあたり、本発明のリラキシン 3または本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドは塩を形成していてもよぐさらにそれらは水和物を形成していてもよぐ本発明に含まれる。前記疾患の治療の医薬として使用するにあたり、本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドは、単独または適当なベクターに挿入して、あるいは、シグナル配列、ポリペプチド安定ィ匕配列などの配列を付カ卩して用いることができる。前記ベクターとしては、例えば、アデノウィルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウィルスベクター、プラスミド、ファージミド、コスミドなどの公知のものを使用することができる。本発明のリラキシン 3または本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドもしくはその塩またはそれらの水和物は単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。

[0037] 本願明細書における前記の「塩」とは、本発明のリラキシン 3または本発明のリラキシン一 3をコードするポリヌクレオチドと塩を形成し、かつ薬学的に許容され得る塩であれば特に限定されないが、好ましくはハロゲンィ匕水素酸塩 (例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩 (例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など)有機カルボン酸塩 (例えば酢酸塩、トリフルォロ酢酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クェン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩 (例えばァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級ァミン塩、アルカリ金属塩 (例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩 (マグネシウム塩、カルシウム塩など)などが挙げられ、当該「薬学的に許容され得る塩」として、より好ましくはトリフルォロ酢酸塩、塩酸塩、シユウ酸塩などである。

[0038] この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従つて、本発明のリラキシン 3またはリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定ィ匕剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添カロ剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシゥム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クェン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

[0039] それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のリラキシン— 3または本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドの選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。適当な投与量は患者の体重 lkgあたり例えば約 0. 1〜500 g、好ましくは約 0. 1〜： LOO g、より好ましくは 1〜50 g程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。

[0040] リラキシン— 3^容体を用いた摂食調節に係る化合物のスクリーニング方法リラキシン一 3 容体

本発明のリラキシン一 3に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のリラキシン— 3と結合活性を有し、リラキシン— 3受容体発現細胞の細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、アデ二ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変ィ匕、細胞内タンパク質のリン酸化、 c— fosおよび c一 junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]のリラキシン一 3受容体を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、リラキシン一 3受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば本発明のリラキシン一 3に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。この場合、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、リラキシン一 3受容体のアミノ酸数の 90%、 80%、 70%、 60%、 50%、 40%、 30%、 20%、 10%または 5%である。

[0041] 具体的には、リラキシン一 3受容体として、報告されている公知の受容体、例えば L GR7 (GenBankァクセッション番号 NM— 021634)、 SALPR (GenBankァクセッシヨン番号 NM_016568) (GPCR135とも称されている。）または GPR100 (GenB ankァクセッション番号 AB一 083593) (hGPCRl l、 GPCR142とも称されている。）などを使用することが可能である。

[0042] SALPRを用いた摂食調節に係る化合物のスクリーニング方法

以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、 SALPRを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、 SALPR またはその部分ポリペプチドに結合し、摂食調節 (摂食を促進または抑制する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に摂食を促進または抑制する作用を有するか否かを決定することができる。 [0043] ここで、本発明の SALPRまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチド（GenBankァクセッション番号 NM— 016568)を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ

、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、 SALPRの部分ポリペプチドは、 SALPRを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。別の態様によれば、 SALPRの部分ポリペプチドは、結合活性部位を有する部分ポリペプチドを調製するのが好まし、。

[0044] 本発明の SALPRをコードするポリペプチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号 4で表されるアミノ酸配列に関して、 70%以上の同一性、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99% 以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0045] ここで、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリべプチドにおいて 1または複数個（好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0046] さらに、 SALPRの部分ポリペプチドも、 SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有する限り、使用することができる。 SALPRの部分ポリペプチドには、リラキシン— 3との結合活性部位を有する部分ポリペプチドを使用することができる。

[0047] 以下、遺伝子工学的手法について、より具体的には SALPRを使用する場合について詳述する力その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されな、。

[0048] SALPRの調製方法

SALPRをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物力所望のポリペプチドを分離および精製すること〖こより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン A結合多糖類を用いる親和性力ラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。

[0049] SALPRをコードするポリヌクレオチド

本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。

なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、 DNAおよび RNAの両方が含まれる。本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドには、具体的には下記の（a )〜 (e)力らなる群より選択されるものが挙げられる。

(a)配列番号 3で表される塩基配列力もなる、ポリヌクレオチド；

(b)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；

(c)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；

(d)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および

(e)「配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリべプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。 [0050] 本発明の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、配列番号 3で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチドである。配列番号 3で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力なる SALPRをコードする。

[0051] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および/または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば 1〜30個、好ましくは 1 〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1〜2個である。

[0052] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリぺプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、し力も、前記 SAL PRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。

[0053] プラスミド

前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。

[0054] 形皙転龍

また、前記形質転換体も、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、 SALPR を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換すること〖こより得ることができる。

[0055] 前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えば Escherichia coli JM109株）または酵母（例えば Saccharomyces cerevisi ae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えば CHO細胞、 H EK— 293細胞、または COS細胞）または昆虫細胞（例えば BmN4細胞）を挙げることがでさる。

[0056] また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、 pUC、 pTV、 p GEX、 pKK、または pTrcHisを；酵母に対しては、 pEMBLYまたは pYES2を； CH O細胞、 HEK— 293細胞および COS細胞に対しては、 pcDNA3、 pMAMneoまたは pBabe Puroを； BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウィルス（BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば PBK283)を挙げることができる。

[0057] SALPRを含有する細胞は、 SALPRを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなぐ例えば前記形質転換体 (すなわち、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞)を、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、 SALPRをコードする RNAを注入し、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることちでさる。

[0058] 細朐麵分

また、 SALPRを含有する本発明の細胞膜画分は、例えば本発明による SALPRを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えば Potter— Elvehi em型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリンダブレンダーまたはポリトロン (Kinematica社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどでカロ圧しながら細いノズル力も細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。

[0059] SALPRを介する、本発明による摂食を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、 SALPRまたは前記細胞 (すなわち、 SALPRを含有する細胞)もしくは前記細胞膜画分 (すなわち、 SALPRを含有する細胞膜画分)を用いることができる。

[0060] また、本発明によるスクリーニング方法においては、第一の態様として被験物質が S ALPRに特異的に結合するか否かを調べる方法と、第二の態様として SALPRに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、ァデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変化、細胞内タンパク質のリン酸ィ匕、 c— fosおよび c junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。

[0061] 本発明によるスクリーニング方法の第一の態様では、例えば SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質とを接触させ、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質が結合するか否力を分析することにより、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。

[0062] 具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下にお!/、て、 SA LPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識した本発明のリラキシン 3とを接触させ、前記条件下における SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン 3の特異的結合量を比較することにより、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下における SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン 3の特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。

[0063] 本発明によるスクリーニング方法にぉ、て、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する本発明のリラキシン 3の特異的結合量を比較する場合には、当該リラキシン一 3として、標識した当該リラキシン一 3を用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 [ ]、 [¹⁴C]、 [¹²⁵I]、 [³⁵S]などを用いることができる。前記酵素としては、例えば j8—ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、バーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルォレセイソチォシァネート、 BODIPYなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、本発明のリラキシン一 3と標識物質を結合させるためにピオチン一アビジンの系を用いることもできる。

[0064] このように、本発明によるスクリーニング方法にぉ、て、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと本発明のリラキシン— 3との結合を阻害する化合物を、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずにスクリ一-ングすることができる。

[0065] 本発明によるスクリーニング方法における第二の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した本発明のリラキシンー 3とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する当該リラキシン 3の特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における当該リラキシン 3の特定の細胞刺激活性を比較することにより、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。

[0066] 前記態様にお!、ては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、 SALPRを介する摂食を促進する化合物として選択することができる。

[0067] 一方、前記態様において、前記細胞と当該リラキシン 3との結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、 SALPRを介する摂食を抑制する化合物として選択することができる。

[0068] 本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデ二ル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。

[0069] この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕によって細胞内に生成する cAMPを公知の手法で測定すればよぐ SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、 SALPRに本発明のリラキシン一 3が結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、 SALPRの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、 SALPRに当該リラキシン— 3が結合すると、 SALPRに共役して!/、る Gタンパク質ファミリーの一つである Giフアミリーが、アデ-ル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリック AMP (cA MP：アデ二ル酸シクラーゼにより ATP力も生成される）量を減少させることによる。

[0070] 例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)した哺乳動物由来細胞 (例えば HEK— 293細胞もしくは CHO細胞）にアデ-ル酸シクラーゼの活性化剤 [例えばフオルスコリン (FSK) ]を添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇する。

[0071] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン一 3を加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン一 3が本発明による SALPRに作用して生じるアデ- ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性ィ匕剤を単独投与した場合に比べて、 cAMPの生成量が減少する。従って、摂食を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で SA LPRを介する当該リラキシン 3に代わり、被験物質を単独で接触させて c AMPの生成量を減少させる（すなわち当該リラキシン— 3と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0072] 摂食を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン— 3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン 3の作用で cAMPの生成量が減少するが、被験物質が当該リラキシン— 3の作用に拮抗する場合には、 cAMP生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は摂食抑制作用を有する化合物として選択できる。

[0073] 細胞内 cAMP量を測定する方法としては、例えばィムノアッセィなどがある力例えば市販の cAMP定量キットを使用することもできる。

[0074] 別の態様のスクリーニング方法にぉ、ては、例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)し、しかも、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファタ一ゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、または GFP (Green Fluorescent Protein)などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いること〖こより、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述の cAMPの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。

[0075] 以下、前記態様による、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。

[0076] すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREは、細胞内の cAMP の濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群 (cAMP誘導性遺伝子)の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕剤（例えば FSK)をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇し、その結果、 CREの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。

[0077] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン一 3を加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン一 3が本発明による SALPRに作用して生じるアデ- ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性ィ匕剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従つて、摂食を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーユング系で、 SALPRを介する当該リラキシン 3に代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち当該リラキシン 3と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0078] 摂食を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン— 3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン 3の作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少する力被験物質が当該リラキシンー3の作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は摂食抑制作用を有する化合物として選択でさる。

[0079] 被験物質による作用が、 SALPRに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞 (すなわち、 SALPRを細胞膜上に発現し、し力も、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用、た前記試験と並行して、コントロール用細胞 (例えば CREが 5 '上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、 SALPRを細胞膜上に発現してヽな、細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、 SALPR に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、 SALPRに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。

[0080] また、別の態様として、被験物質、好ましくは上記のスクリーニング方法により選択された被験物質 (以下、単に「被験物質」と略記する場合がある。）を被験動物、例えばヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に投与し、投与後の摂食量や血中パラメーターの変動などの指標を解析することにより摂食調節に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルである obZobマウス、 dbZdbマウス、 Zucker fattvラットなど）や遺伝子改変動物でもよい。

具体的には、本発明のリラキシンー3を投与することにより摂食を促進させる場合は、以下の工程により行なうことができる。

工程 A：被験動物に所定量の被験物質を投与する。

工程 B:被験動物に所定量のリラキシンー3を投与する。なお、リラキシンー3の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。

工程 C：被験動物を摂食の有無 (程度)を解析および評価する環境下に置く。工程 D：試験結果に基づ、て被験動物の摂食の有無 (程度）につ!/、て解析および評価し、被験物質が摂食調節作用を有するものである力否かを判断および選択するまたは、

工程 A:被験動物に所定量のリラキシンー3を投与する。なお、リラキシンー3の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。

工程 B：被験動物に所定量の被験物質を投与する。

工程 A:被験動物に所定量の被験物質および所定量のリラキシン 3を同時に投与する。なお、リラキシン— 3の投与は、一般的には、脳室内への投与が好ましい。また、同時に投与するとは、被験物質およびリラキシン 3の両方を混合した状態で投与することには限定されず、実質的に同時と考えられる範囲内であれば、例えば、両方の投与に多少の時間差があってもよいし、また各々投与経路が異なっていてもよく、投与形態は適宜設定できる。

工程 B:被験動物を摂食の有無 (程度)を解析および評価する環境下に置く。

工程 C：試験結果に基づ、て被験動物の摂食の有無 (程度）につ!/、て解析および評価し、被験物質が摂食調節作用を有するものである力否かを判断および選択する [0082] 被験物質の投与形態としては、経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。被験物質の被験動物の脳室内への投与方法は、薬物などを脳室内の所定の位置へ投与する際の常法に従えばよぐ限定はされない。例えば、まず被験動物を麻酔した上で、ガイド力-ユーレを所定の位置に固定する手術を施しておき、適当な回復期間（例えば 7日間〜 14日間、好ましくは少なくとも 1週間程度）の経過後、ガイド力-ユーレにインジェクション-一ドルを挿し込み、還流ポンプを接続したマイクロシリンジを用い、上記-一ドルを介して被験物質を投与することが好ましい。被験物質の投与量は、限定はされず、適宜設定できる。被験物質は、一般的には人工的脳脊髄液 (artificial cerebrospinal fluid)または生理食塩水などを用いて所望の濃度の溶液として調製しておく。人工的脳脊髄液としては、公知の常用されているものを用いればよぐ限定はされないが、例えば、 aCSF (glucose 10mM、 KC1 2mM、 NaCl 115mM、 CaCl 2. 5m

2

M、 MgSO 1. 2mM、 NaHCO 25mM、 KH PO 2. 2mM ;pH7. 4)などが

4 3 2 4

好ましい。被験物質の投与回数は 1日あたり一回でも数回に分けても良ぐ被験物質を投与する期間や観察する期間は 1日から数週間にわたつてもよい。

[0083] リラキシン 3の被験動物への投与方法などは、前記の被験物質の場合と同様の方法が好ましい。また、リラキシン— 3の被験動物の脳室内への投与方法も、前記の被験物質と同様に、一般的には人工的脳脊髄液を用いて所望の濃度の溶液となるよう調製しておくことが好ま、。

[0084] スクリーニングのための指標としては摂食量のほかにも、例えば体重、運動量、エネルギ一代謝量、血中の糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量などを測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食などの条件を課すこともできる。

[0085] リラキシン 3受容体を用いた体重調節に係る化合物のスクリーニング方法

リラキシン 3 容体

本発明のリラキシン 3に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のリラキシン— 3と結合活性を有し、リラキシン— 3受容体発現細胞の細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、アデ二ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変ィ匕、細胞内タンパク質のリン酸化、 c— fosおよび c一 junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]のリラキシン一 3受容体を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、リラキシン一 3受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば本発明のリラキシン一 3に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。この場合、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、リラキシン一 3受容体のアミノ酸数の 90%、 80%、 70%、 60%、 50%、 40%、 30%、 20%、 10%または 5%である。

[0086] 具体的には、リラキシン一 3受容体として、報告されている公知の受容体、例えば L GR7 (GenBankァクセッション番号 NM— 021634)、 SALPR (GenBankァクセッシヨン番号 NM_016568) (GPCR135とも称されている。）または GPR100 (GenB ankァクセッション番号 AB一 083593) (hGPCRl l、 GPCR142とも称されている。）などを使用することが可能である。

[0087] SALPRを用いた体重調節に係る化合物のスクリーニング方法

以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、 SALPRを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、 SALPR またはその部分ポリペプチドに結合し、体重調節（体重を増加または減少する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に体重を増加または減少する作用を有する力否かを決定することができる。

[0088] ここで、本発明の SALPRまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチド（GenBankァクセッション番号 NM— 016568)を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ

[0089] 本発明の SALPRをコードするポリペプチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号 4で表されるアミノ酸配列に関して、 70%以上の同一性、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99% 以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0090] ここで、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリべプチドにおいて 1または複数個（好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0091] さらに、 SALPRの部分ポリペプチドも、 SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有する限り、使用することができる。 SALPRの部分ポリペプチドには、リラキシン— 3との結合活性部位を有する部分ポリペプチドを使用することができる。

[0092] 以下、遺伝子工学的手法について、より具体的には SALPRを使用する場合について詳述する力その部分ポリペプチドについても後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されな、。 [0093] SALPRの調製方法

[0094] SALPRをコードするポリヌクレオチド

(e)「配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリべプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。

[0095] 本発明の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、配列番号 3で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチドである。配列番号 3で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力なる SALPRをコードする。

[0096] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および/または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば 1〜30個、好ましくは 1 〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1〜2個である。

[0097] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリぺプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、し力も、前記 SAL PRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。

[0098] プラスミド

[0099] 形皙転龍

[0100] 前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えば Escherichia coli JM109株）または酵母（例えば Saccharomyces cerevisi ae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えば CHO細胞、 H EK— 293細胞、または COS細胞）または昆虫細胞（例えば BmN4細胞）を挙げることがでさる。

[0101] また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、 pUC、 pTV、 p GEX、 pKK、または pTrcHisを；酵母に対しては、 pEMBLYまたは pYES2を； CH O細胞、 HEK— 293細胞および COS細胞に対しては、 pcDNA3、 pMAMneoまたは pBabe Puroを； BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウィルス（BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば PBK283)を挙げることができる。

[0102] SALPRを含有する細胞は、 SALPRを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなぐ例えば前記形質転換体 (すなわち、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞)を、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、 SALPRをコードする RNAを注入し、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることちでさる。

[0103] 細麟画分

[0104] SALPRを介する、本発明による体重を増加または減少する化合物のスクリーニング方法では、 SALPRまたは前記細胞 (すなわち、 SALPRを含有する細胞)もしくは前記細胞膜画分 (すなわち、 SALPRを含有する細胞膜画分)を用いることができる。

[0105] また、本発明によるスクリーニング方法においては、第一の態様として被験物質が S ALPRに特異的に結合するか否かを調べる方法と、第二の態様として SALPRに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、ァデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変化、細胞内タンパク質のリン酸ィ匕、 c— fosおよび c junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。

[0106] 本発明によるスクリーニング方法における第一の態様では、例えば SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質とを接触させ、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、 SA LPRを介する体重を増加または減少する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。

[0107] 具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、 SA LPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識した本発明のリラキシン 3とを接触させ、前記条件下における SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン 3の特異的結合量を比較することにより、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を有する場合には、被験物質非存在下における SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン 3の特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。

[0108] 本発明によるスクリーニング方法にぉ、て、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する本発明のリラキシン 3の特異的結合量を比較する場合には、当該リラキシン一 3として、標識した当該リラキシン一 3を用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 [ ]、 [¹⁴C]、 [¹²⁵I]、 [³⁵S]などを用いることができる。前記酵素としては、例えば j8—ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、バーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルォレセイソチォシァネート、 BODIPYなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、本発明のリラキシン一 3と標識物質を結合させるためにピオチン一アビジンの系を用いることもできる。

[0109] このように、本発明によるスクリーニング方法において、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと本発明のリラキシン— 3との結合を阻害する化合物を、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別せずにスクリ一-ングすることができる。

[0110] 本発明によるスクリーニング方法における第二の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した本発明のリラキシンー 3とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する当該リラキシン 3の特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における当該リラキシン 3の特定の細胞刺激活性を比較することにより、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。

[0111] 前記態様においては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、 SALPRを介する体重を増加する化合物として選択することができる。

[0112] 一方、前記態様において、前記細胞と当該リラキシン 3との結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、 SALPRを介する体重を減少する化合物として選択することができる。

[0113] 本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデ二ル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。

[0114] この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕によって細胞内に生成する cAMPを公知の手法で測定すればよぐ SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、 SALPRに本発明のリラキシン一 3が結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、 SALPRの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、 SALPRに当該リラキシン— 3が結合すると、 SALPRに共役して!/、る Gタンパク質ファミリーの一つである Giフアミリーが、アデ-ル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリック AMP (cA MP：アデ二ル酸シクラーゼにより ATP力も生成される）量を減少させることによる。

[0115] 例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)した哺乳動物由来細胞 (例えば HEK— 293細胞もしくは CHO細胞）にアデ-ル酸シクラーゼの活性化剤 [例えばフオルスコリン (FSK) ]を添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇する。

[0116] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン一 3を加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン一 3が本発明による SALPRに作用して生じるアデ- ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性ィ匕剤を単独投与した場合に比べて、 cAMPの生成量が減少する。従って、体重を増加する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で SA LPRを介する当該リラキシン 3に代わり、被験物質を単独で接触させて c AMPの生成量を減少させる（すなわち当該リラキシン— 3と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0117] 体重を減少する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン— 3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン 3の作用で cAMPの生成量が減少するが、被験物質が当該リラキシン— 3の作用に拮抗する場合には、 cAMP生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は体重減少作用を有する化合物として選択できる。

[0118] 細胞内 cAMP量を測定する方法としては、例えばィムノアッセィなどがある力例えば市販の cAMP定量キットを使用することもできる。

[0119] 別の態様のスクリーニング方法においては、例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)し、しかも、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファタ一ゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、または GFP (Green Fluorescent Protein)などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述の cAMPの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。

[0120] 以下、前記態様による、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。

すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREは、細胞内の cAMP の濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群 (cAMP誘導性遺伝子)の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕剤（例えば FSK)をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇し、その結果、 CREの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。

[0121] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン一 3を加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン一 3が本発明による SALPRに作用して生じるアデ- ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性ィ匕剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従つて、体重を増加する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーユング系で、 SALPRを介する当該リラキシン 3に代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち当該リラキシン 3と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。 [0122] 体重を減少する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン— 3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン 3の作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少する力被験物質が当該リラキシンー3の作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は体重減少作用を有する化合物として選択でさる。

[0123] 被験物質による作用が、 SALPRに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞 (すなわち、 SALPRを細胞膜上に発現し、し力も、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用、た前記試験と並行して、コントロール用細胞 (例えば CREが 5 '上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、 SALPRを細胞膜上に発現してヽな、細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、 SALPR に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、 SALPRに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。

[0124] また、別の態様として、被験物質、好ましくは上記のスクリーニング方法により選択された被験物質 (以下、単に「被験物質」と略記する場合がある。）をヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスタ一、ブタ、ィヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に投与し、投与後の摂食量、体重、肥満の指標 (例えば体脂肪率、 BMI (体格指数)、肥満度、体型、身体年齢、インピーダンス、体脂肪量、除脂肪量、体水分量、蛋白質量、筋肉量、無機質量、細胞量、部位別筋肉量、部位別水分量、 BMR (基礎代謝量)、エネルギー所要量、腹部肥満率 (VSR)、内臓脂肪量、皮下脂肪量、内臓脂肪量レベル、臓器重量、血中パラメーターの変動、血中のレプチン、糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量など)を測定することにより体重調節に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルである obZobマウス、 dbZdbマウス、 Zucker fattyラットなど）や遺伝子改変動物でもよ!/ヽ。

具体的には、本発明のリラキシンー3を投与することにより体重を増加させる場合は、以下の工程により行なうことができる。

工程 A：被験動物に所定量の被験物質を投与する。

工程 C :被験動物を体重の増減を解析および評価する環境下に置く。

工程 D：試験結果に基づいて被験動物の体重の増減について解析および評価し、被験物質が体重調節作用を有するものである力否かを判断および選択する。

または、

工程 B：被験動物に所定量の被験物質を投与する。

または、

工程 B:被験動物を体重の増減を解析および評価する環境下に置く。

工程 C：試験結果に基づ、て被験動物の体重の増減につ!、て解析および評価し、被験物質が体重調節作用を有するものである力否かを判断および選択する。 [0126] 被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。被験物質の被験動物の脳室内への投与方法は、薬物などを脳室内の所定の位置へ投与する際の常法に従えばよぐ限定はされない。例えば、まず被験動物を麻酔した上で、ガイド力-ユーレを所定の位置に固定する手術を施しておき、適当な回復期間（例えば 7日間〜 14日間、好ましくは少なくとも 1週間程度）の経過後、ガイド力-ユーレにインジェクション-一ドルを挿し込み、還流ポンプを接続したマイクロシリンジを用い、上記-一ドルを介して被験物質を投与することが好ましい。被験物質の投与量は、限定はされず、適宜設定できる。被験物質は、一般的には人工的脳脊髄液 (artificial cerebrospinal fluid)または生理食塩水などを用いて所望の濃度の溶液として調製しておく。人工的脳脊髄液としては、公知の常用されているものを用いればよぐ限定はされないが、例えば、 aCSF (glucose 10mM、 KC1 2mM、 NaCl 115mM、 CaCl 2. 5m

2

M、MgSO 1. 2mM、NaHCO 25mM、 KH PO 2. 2mM ;

4 3 2 4

pH7. 4)などが好ましい。被験物質の投与回数は 1日あたり一回でも数回に分けても良ぐ被験物質を投与する期間や観察する期間は 1日から数週間にわたってもよい。

[0127] リラキシン 3の被験動物への投与方法などは、前記の被験物質の場合と同様の方法が好ましい。また、リラキシン— 3の被験動物の脳室内への投与方法も、前記の被験物質と同様に、一般的には人工的脳脊髄液を用いて所望の濃度の溶液となるよう調製しておくことが好ま、。

[0128] スクリーニングのための指標としては、体重の測定が挙げられ、さらに摂食量および肥満の指標を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食などの条件を課すこともできる。

[0129] リラキシン— 3^容体を用いた肥満調節に係る化合物のスクリーニング方法

リラキシン 3 容体

[0130] 具体的には、リラキシン一 3受容体として、報告されている公知の受容体、例えば L GR7 (GenBankァクセッション番号 NM— 021634)、 SALPR (GenBankァクセッシヨン番号 NM_016568) (GPCR135とも称されている。）または GPR100 (GenB ankァクセッション番号 AB一 083593) (hGPCRl l、 GPCR142とも称されている。）などを使用することが可能である。

[0131] SALPR 用いた满言周铺に係る化合物のスクリーユング法

以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、 SALPRを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、 SALPR またはその部分ポリペプチドに結合し、肥満調節 (肥満を促進または抑制する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に肥満を促進または抑制する作用を有する力否かを決定することができる。

[0132] ここで、本発明の SALPRまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチド（GenBankァクセッション番号 NM— 016568)を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、 SALPRの部分ポリペプチドは、 SALPRを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。別の態様によれば、 SALPRの部分ポリペプチドは、結合活性部位を有する部分ポリペプチドを調製するのが好まし、。

[0133] 本発明の SALPRをコードするポリペプチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号 4で表されるアミノ酸配列に関して、 70%以上の同一性、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99% 以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0134] ここで、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリべプチドにおいて 1または複数個（好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0135] さらに、 SALPRの部分ポリペプチドも、 SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有する限り、使用することができる。 SALPRの部分ポリペプチドには、リラキシン— 3との結合活性部位を有する部分ポリペプチドを使用することができる。

[0136] 以下、遺伝子工学的手法について、より具体的には SALPRを使用する場合について詳述する力その部分ポリペプチドについても後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されな、。

[0137] SALPRの調製方法

SALPRをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いら

れる方法により、その培養物力所望のポリペプチドを分離および精製することにより調

製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換

セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩力

ラムクロマトグラフィー、プロテイン A結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。

SALPRをコードするポリヌクレオチド

(e)「配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリべプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。 [0139] 本発明の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、配列番号 3で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチドである。配列番号 3で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力なる SALPRをコードする。

[0140] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および/または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば 1〜30個、好ましくは 1 〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1〜2個である。

[0141] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリぺプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、し力も、前記 SAL PRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。

[0142] プラスミド

[0143] 形皙転龍

[0144] 前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えば Escherichia coli JM109株）または酵母（例えば Saccharomyces cerevisi ae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えば CHO細胞、 H EK— 293細胞、または COS細胞）または昆虫細胞（例えば BmN4細胞）を挙げることがでさる。

[0145] また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、 pUC、 pTV、 p GEX、 pKK、または pTrcHisを；酵母に対しては、 pEMBLYまたは pYES2を； CH O細胞、 HEK— 293細胞および COS細胞に対しては、 pcDNA3、 pMAMneoまたは pBabe Puroを； BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウィルス（BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば PBK283)を挙げることができる。

[0146] SALPRを含有する細胞は、 SALPRを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなぐ例えば前記形質転換体 (すなわち、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞)を、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、 SALPRをコードする RNAを注入し、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることちでさる。

[0147] 細朐麵分

[0148] SALPRを介する、本発明による肥満を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、 SALPRまたは前記細胞 (すなわち、 SALPRを含有する細胞)もしくは前記細胞膜画分 (すなわち、 SALPRを含有する細胞膜画分)を用いることができる。

[0149] また、本発明によるスクリーニング方法においては、第一の態様として被験物質が S ALPRに特異的に結合するか否かを調べる方法と、第二の態様として SALPRに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、ァデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変化、細胞内タンパク質のリン酸ィ匕、 c— fosおよび c junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。

[0150] 本発明によるスクリーニング方法における第一の態様では、例えば SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質とを接触させ、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、 SA LPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。

[0151] 具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、 SA LPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識した本発明のリラキシン 3とを接触させ、前記条件下における SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン 3の特異的結合量を比較することにより、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下における SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する当該リラキシン 3の特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。

[0152] 本発明によるスクリーニング方法にぉ、て、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する本発明のリラキシン 3の特異的結合量を比較する場合には、当該リラキシン一 3として、標識した当該リラキシン一 3を用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 [ ]、 [¹⁴C]、 [¹²⁵I]、 [³⁵S]などを用いることができる。前記酵素としては、例えば j8—ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、バーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルォレセイソチォシァネート、 BODIPYなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、本発明のリラキシン一 3と標識物質を結合させるためにピオチン一アビジンの系を用いることもできる。

[0153] このように、本発明によるスクリーニング方法において、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと本発明のリラキシン— 3との結合を阻害する化合物を、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずにスクリ一-ングすることができる。

[0154] 本発明によるスクリーニング方法における第二の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した本発明のリラキシンー 3とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する当該リラキシン 3の特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における当該リラキシン 3の特定の細胞刺激活性を比較することにより、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。

[0155] 前記態様にお!、ては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、 SALPRを介する肥満を促進する化合物として選択することができる。

[0156] 一方、前記態様において、前記細胞と当該リラキシン 3との結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、 SALPRを介する肥満を抑制する化合物として選択することができる。

[0157] 本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデ二ル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。

[0158] この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕によって細胞内に生成する cAMPを公知の手法で測定すればよぐ SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、 SALPRに当該リラキシン 3が結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、 SALPRの細胞刺激活性の一つであるアデ二ル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、 SALPRに当該リラキシン 3が結合すると、 SALPRに共役して!/、る Gタンパク質ファミリーの一つである Giファミリーが、アデ-ル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリック AMP (cAMP :ァデュル酸シクラーゼにより ATPから生成される）量を減少させることによる。

[0159] 例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)した哺乳動物由来細胞 (例えば HEK— 293細胞もしくは CHO細胞）にアデ-ル酸シクラーゼの活性化剤 [例えばフオルスコリン (FSK) ]を添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇する。

[0160] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン一 3を加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン一 3が本発明による SALPRに作用して生じるアデ- ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性ィ匕剤を単独投与した場合に比べて、 cAMPの生成量が減少する。従って、肥満を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で SA LPRを介する当該リラキシン 3に代わり、被験物質を単独で接触させて c AMPの生成量を減少させる（すなわち当該リラキシン— 3と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0161] 肥満を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン— 3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン 3の作用で cAMPの生成量が減少するが、被験物質が当該リラキシン— 3の作用に拮抗する場合には、 cAMP生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は肥満抑制作用を有する化合物として選択できる。

[0162] 細胞内 cAMP量を測定する方法としては、例えばィムノアッセィなどがある力例えば市販の cAMP定量キットを使用することもできる。

[0163] 別の態様のスクリーニング方法にぉ、ては、例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)し、しかも、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファタ一ゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、または GFP (Green Fluorescent Protein)などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述の cAMPの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。

[0164] 以下、前記態様による、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。

[0165] すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREは、細胞内の cAMP の濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群 (cAMP誘導性遺伝子)の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕剤（例えば FSK)をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇し、その結果、 CREの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。

[0166] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン一 3を加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン一 3が本発明による SALPRに作用して生じるアデ- ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性ィ匕剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従つて、肥満を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーユング系で、 SALPRを介する本発明のリラキシン 3に代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち当該リラキシン 3 と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0167] 肥満を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン— 3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン 3の作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少する力被験物質が当該リラキシンー3の作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は肥満抑制作用を有する化合物として選択でさる。

[0168] 被験物質による作用が、 SALPRに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞 (すなわち、 SALPRを細胞膜上に発現し、し力も、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用、た前記試験と並行して、コントロール用細胞 (例えば CREが 5 '上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、 SALPRを細胞膜上に発現してヽな、細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、 SALPR に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、 SALPRに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。

[0169] また、別の態様として、上記のスクリーニング方法により選択された被験物質をヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ィヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に投与し、投与後の摂食量、体重、肥満の指標 (例えば体脂肪率、 BMI (体格指数)、肥満度、体型、身体年齢、インピーダンス、体脂肪量、除脂肪量、体水分量、蛋白質量、筋肉量、無機質量、細胞量、部位別筋肉量、部位別水分量、 BMR (基礎代謝量)、エネルギー所要量、腹部肥満率 (VSR)、内臓脂肪量、皮下脂肪量、内臓脂肪量レベル、臓器重量、血中パラメーターの変動、血中のレプチン、糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量など）を測定することにより肥満作用に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルである obZobマウス、 db Zdbマウス、 Zucker fattyラットなど）や遺伝子改変動物でもよい。

具体的には、本発明のリラキシンー3を投与することにより肥満を促進させる場合は、以下の工程により行なうことができる。

工程 A：被験動物に所定量の被験物質を投与する。

工程 C :被験動物を肥満の程度を解析および評価する環境下に置く。

工程 D：試験結果に基づ、て被験動物の肥満の程度につ!、て解析および評価し、被験物質が肥満調節作用を有するものである力否かを判断および選択する。

または、

工程 B：被験動物に所定量の被験物質を投与する。

または、

工程 B:被験動物を肥満の程度を解析および評価する環境下に置く。

工程 C：試験結果に基づ、て被験動物の肥満の程度にっ、て解析および評価し、被験物質が肥満調節作用を有するものである力否かを判断および選択する。

[0171] 被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。被験物質の被験動物の脳室内への投与方法は、薬物などを脳室内の所定の位置へ投与する際の常法に従えばよぐ限定はされない。例えば、まず被験動物を麻酔した上で、ガイド力-ユーレを所定の位置に固定する手術を施しておき、適当な回復期間（例えば 7日間〜 14日間、好ましくは少なくとも 1週間程度）の経過後、ガイド力-ユーレにインジェクション-一ドルを挿し込み、還流ポンプを接続したマイクロシリンジを用い、上記-一ドルを介して被験物質を投与することが好ましい。被験物質の投与量は、限定はされず、適宜設定できる。被験物質は、一般的には人工的脳脊髄液 (artificial cerebrospinal fluid)または生理食塩水などを用いて所望の濃度の溶液として調製しておく。人工的脳脊髄液としては、公知の常用されているものを用いればよぐ限定はされないが、例えば、 aCSF (glucose 10mM、 KC1 2mM、 NaCl 115mM、 CaCl 2. 5m

2

M、 MgSO 1. 2mM、 NaHCO 25mM、 KH PO 2. 2mM ;pH7. 4)などが

4 3 2 4

[0172] リラキシン 3の被験動物への投与方法などは、前記の被験物質の場合と同様の方法が好ましい。また、リラキシン— 3の被験動物の脳室内への投与方法も、前記の被験物質と同様に、一般的には人工的脳脊髄液を用いて所望の濃度の溶液となるよう調製しておくことが好ま、。

[0173] スクリーニングのための指標としては、肥満の指標を測定することが挙げられ、さらに摂食量および体重を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食などの条件を課すこともできる。

[0174] 被験物皙

ここで、上述の被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸 (オリゴ DNA、オリゴ RNA) 、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞 (微生物、植物細胞、動物細胞)抽出液、細胞 (微生物、植物細胞、動物細胞)培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物など由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよぐこれらは本発明の被験物質に含まれる。

[0175] 本願明細書において被験化合物の「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されな、。具体的には、例えば好ましくはハロゲンィ匕水素酸塩 (例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩 (例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩 (例えば酢酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クェン酸塩など）、有機スルホン酸塩 (例えばメタンスルホン酸塩、トリフルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級ァミン塩、アルカリ金属塩 (例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など)などが挙げられる。

[0176] スクリーニング用キット

本発明のスクリーニング用キットは、リラキシン 3受容体または前記細胞 (すなわち、リラキシン 3受容体を含有する細胞)もしくは前記細胞膜画分 (すなわち、リラキシン— 3受容体を含有する細胞膜画分)と場合によってはリラキシン— 3とを少なくとも含有する。当該リラキシン— 3は、標識した当該リラキシン— 3であってもよい。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および Zまたは器具などをさらに含むことができる。ここで、リラキシン 3受容体の好適な例は、 SALPRである。

[0177] 本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、本発明のリラキシン 3、およびリラキシン 3受容体を細胞膜上に発現 (好ましくは、リラキシン 3受容体を含む発現べクタ一を導入して過剰に発現)し、し力も、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）を含有する細胞とを少なくとも含有する。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばレポーター遺伝子産物（例えば、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼなど）の基質、アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤（例えば F SK)、結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および Zまたは器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、リラキシン 3受容体を細胞膜上に発現してヽない細胞を含んでいてもよい。ここで、リラキシン 3受容体の好適な例は、 SALPR である。

[0178] 本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医

本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、摂食を促進もしくは抑制する化合物、体重を増加もしくは減少させる化合物、または肥満を促進もしくは抑制する化合物である。当該化合物は塩を形成してもよぐさらに当該化合物およびその塩は水和物を形成して、てもよ、。

[0179] 従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、摂食 (もしくは食欲)調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン 3またはリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症または各種疾患の治療 (例えば術中、術後）に伴い増加もしくは減少した摂食 (もしくは食欲)および Zまたは体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患 (例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など)、免疫機能調節に係る疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など )、エネルギー代謝に係る疾患 (例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症など)、 AIDS、癌、または悪液質などが挙げられる。

[0180] 本発明によるスクリーニング方法によって、リラキシン一 3受容体、好ましくは SALP Rまたはその部分ポリペプチドを介した細胞刺激活性、より具体的には、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに本発明のリラキシンー3が結合すると引き起こされる細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、アデ二ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 c AMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c— fosおよび c junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)の阻害作用（SALPR阻害作用）を有する化合物が提供される。このような化合物を含有する薬剤として、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などが挙げられる。

[0181] 得られたィ匕合物もしくはその塩またはそれらの水和物を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クェン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。 [0182] それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重 lkgあたり例えば約 1. 0〜1, 500 g、好ましくは約 10〜50 0 g程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。

[0183] リラキシン 3の活件阳.害する物皙およびその使用

本発明のリラキシン 3の活性を阻害する物質によれば、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用を抑制または阻害することができる。そこで、当該リラキシン 3 の発現を阻害するものは、当該リラキシン 3の in vivo, ex vivoおよび in vitro における摂食制御および体重制御に伴う機能 (例えばエネルギー代謝調節、成長など)や肥満を制限することに利用できる。

[0184] 本発明のリラキシン 3の活性を阻害する物質には、当該活性を有する限り特に制限はな!/、が、例えば当該リラキシン 3をコードする塩基配列のアンチセンス配列を有する DNAや、当該リラキシン 3をコードする塩基配列を有する 2本鎖 RNA (sma 11 interfering RNA; siRNA)、リボザィムなど当該リラキシン 3の発現を阻害するもの、あるいは当該リラキシン一 3の抗体や糖タンパク質、さらには上記スクリーニング方法により得られる化合物などの当該リラキシンー3もしくはリラキシンー3受容体（好ましくは、 SALPR)と相互作用して当該リラキシンー3が有する活性を阻害する物質などが挙げられる。

[0185] 当該物質は塩を形成してもよぐ薬学的に許容し得る塩が挙げられる。従って、本発明のリラキシン 3の活性を阻害する物質もしくはその塩またはそれらの水和物は、摂食 (もしくは食欲)調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン 3またはリラキシン 3をコードするポリヌクレォチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、疾患の発症または疾患の治療 (例えば術中、術後）に伴い増加した摂食 (もしくは食欲)および Zまたは体重の減少を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患 (例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など)、免疫機能調節に係る疾患 (例えば慢性関節リウマチ、全身性ェリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リゥマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など)、またはエネルギー代謝に係る疾患（例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害など)などが挙げられる。好ましくは、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などとして使用することができる

[0186] アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する機構としては、 (1) 3重鎖形成による転写開始阻害、（2) RNAポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部位とのハイブリッド形成による転写抑制、（3)合成中の RNAとのノ、イブリツド形成による転写阻害、（4)イントロンーェキソン接合点におけるノ、イブリツド形成によるスプライシング抑制、（5)スプライソソーム形成部位とのノ、イブリツド形成によるスプライシング抑制、（6) mRNAとのハイブリッド形成による、 mRNAの細胞質への移行抑制、（7 )キヤッビング部位またはポリ A付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（8)翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、（9)リボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、（10) mRNA翻訳領域またはポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長抑制、並びに（11)核酸と蛋白質の相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制が挙げられる（平島および井上『新生化学実験講座 2 核酸 IV 遺伝子の複製と発現』日本生化学会編、東京化学同人、 pp. 319— 347 (1993) )。

[0187] 本発明のリラキシン 3のアンチセンス核酸は、上述の（1)〜（11)のどの機構により遺伝子発現を抑制する核酸であってもよい。すなわち、発現を阻害する目的の遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列に対するアンチセンス配列を含むものであってもよい。アンチセンス核酸をコードする DNAは、その発現を可能とする適当な制御配列下に連結して使用され得る。アンチセンス核酸は、標的とする遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に対して完全に相補的である必要はなぐ効果的に当該遺伝子の発現を阻害するものであればよい。このようなアンチセンス核酸は、少なくとも 15bp以上、好ましくは lOObp以上、さらに好ましくは 500bp以上であり、通常 3000bp以内、好ましくは 2000bp以内、より好ましくは lOOObp以内の鎖長を有し、標的遺伝子の転写産物の相補鎖に対して好ましくは 90%以上、より好ましくは 95% 以上同一である。このようなアンチセンス核酸は、本発明のリラキシン 3の配列情報を基に、ホスホロチォネート法（Stein (1988) Nucleic Acids Res. 16 : 32 09— 21)などにより調製することができる。

リボザィムとは、 RNAを構成成分とする触媒の総称であり、大きくラージリボザィム (1 arge ribozyme)およびスモールリボザィム（small liboyme)に分類される。ラージリボザィムは、核酸のリン酸エステル結合を切断し、反応後に 5'—リン酸と 3'—ヒドロキシル基を反応部位に残す酵素である。ラージリボザィムは、さらに（1)グアノシンによる 5，ースプライス部位でのトランスエステル化反応を行なうグループ Iイントロン RN A、（2)ラリアット構造を経る二段階反応により自己スプライシングを行なうグループ II イントロン RNA、および（3)加水分解反応による tRNA前駆体を 5，側で切断するリボヌクレアーゼ Pの RNA成分に分類される。それに対して、スモールリボザィムは、比較的小さな構造単位 (40bp程度）であり、 RNAを切断して、 5'—ヒドロキシル基と 2' —3，環状リン酸を生じさせる。スモールリボザィムには、ハンマーヘッド型（Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228 : 225)、ヘアピン型（Buzayan (1986) Nature 323 : 349 ; Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acids Res . 19 : 6751 ; 菊地洋（1992)化学と生物 30 : 112)などのリボザィムが含まれる。リボザィムは、改変および合成が容易なため多様な改良方法が公知であり、例えばリボザィムの基質結合部を標的部位近くの RNA配列と相補的となるように設計することにより、標的 RNA中の塩基配列 UC、 UUまたは UAを認識して切断するハンマーヘッド型リボザィムを作ることができる（Koizumi et al. (1988) FEBS Le tt. 228 : 225 ; 小泉誠および大塚栄子（1990) 蛋白質核酸酵素 35 : 2191 ； Koizumi et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17 : 7059)。ヘアピン型のリボザィムについても、公知の方法に従って設計、製造が可能である (Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19 : 6751 ; 菊地洋（1992) 化学と生物 30 : 112)。

1998年に、線虫において RNA同士が邪魔し合い働きを失う現象 (RNA干渉）が観察された（Fire et al. (1998) Nature 391 : 806— 11)。 RNA干渉とは、二本鎖の人工 RNAを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有する RNAが分解される現象である。その後の研究により、 RNA干渉などの RNAサイレンシングの現象は、欠陥を持つ mRNAの排除、並びにトランスポゾン、ウィルスなどの寄生体に対する防御のための細胞機構であることが示唆されている。現在では、多くの遺伝子の発現を抑制するためのツールとして、二本鎖 RNA (small interfering RNA; siRNA)が利用されており、病気の原因遺伝子などの発現抑制を、 siRNAを用いて行なうことにより病気を治療 ·予防する方法も検討されている。本発明の siRNAは、本発明のリラキシン 3の mRNAの転写を阻害する限り、特に限定されない。通常、 siRNAは、標的 mRNAの配列に対するセンス鎖およびアンチセンス鎖の組合せであり、少なくとも 10個力も標的 mRNAと同じ個数までのヌクレオチド長を有する。好ましくは、 15〜75個、より好ましくは 18〜50個、さらに好ましくは 20〜25個のヌクレオチド長である。本発明のリラキシン— 3の発現を抑制するために、 siRNAは公知の方法により細胞に導入することができる。例えば siRNAを構成する二本の RNA鎖を、一本鎖上にコードする DNAを設計し、当該 DNAを発現ベクターに組み込み、細胞を当該発現ベクターで形質転換し、 siRNAを、ヘアピン構造を有する二本鎖 RNAとして細胞内で発現させることができる。トランスフエクシヨンにより持続的に siRNAを産生するプラスミド発現ベクターも設計されて!、る（例えば RNAi— Ready pSIREN Vector, RNAi- Ready pSIREN— RetroQ Vector (BD Biosciences Clon tech社））。 siRNAの塩基配列は、例えば Ambion website (http： ///www. a mbion. com/techlib/misc/siRNA finder, html)のコンピュータープログラムを用いて設計することができる。機能的 siRNAをスクリーニングするためのキット（例えば BD Knockout RNAi System (BD Biosciences Clontech社））なども市販されており利用可能である。

[0190] 患者の細胞内における遺伝子の発現を制御するための遺伝子治療において、本発明のアンチセンス核酸、リボザィムおよび siRNAを、直接組織に投与してもよぐまたはこれらを発現するように作成された構築物を有する任意のベクター（例えば、レトロウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルスなどのウィルス由来のベクター、リポソームなどを利用した非ウィルスベクター）を、直接組織に投与してもよ!/、 (in vivo法）。これらは、例えば筋肉注射、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射などによって、組織部位へ注入することができる。

[0191] または、予め体外で、細胞に、本発明のアンチセンス核酸、リボザィムおよび siRN Aを発現するように作成された構築物を有するベクターを導入してもよ!/ヽ。得られた細胞を、例えば筋肉注射、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射などにより患者の組織に注入する（ex vivo法)。使用細胞は、患者の細胞と異種または同種であってよいが、好ましくは同種、より好ましくは患者力採取した細胞である。

[0192] 本発明のアンチセンス核酸、リボザィムおよび siRNA、またはこれらを発現するように作成された任意のベクターは、単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合されて、医薬品組成物 (例えば摂食抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤）として使用され得る。例えば、注射剤の形態で投与する場合には、医薬品組成物は、蒸留水、塩ィ匕ナトリウムまたは塩ィ匕ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マン-トール、ラタトース、デキストラン、グルコースなどの糖溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液または塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などを含んでもよい。

これらの投与量は、患者の体重、年齢、症状、投与形態などにより変動するが、当業者であれば、必要に応じて適当な投与量を選択することができる。

[0193] 本発明の抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体フラグメントが含まれる。

本発明のモノクローナル抗体は、免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、本発明のリラキシン一 3またはそれらの部分断片を用いることを除、て、それ自体公知の手段により得ることができる。例えば前記免疫用抗原を用いてマウスを免疫し、そのマウス力も取得した脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞とを、細胞融合法 (Nature, 256, 495 (1975) )、または電気細胞融合法 (J. Immunol. Method, 100, 181— 189 (1987) )を用いて細胞融合し、前記スクリーニング用抗原を用いてスクリーニングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを得ることができる。

[0194] 前記ノ、イブリドーマを培養する培地としては、ハイプリドーマの培養に適した培地であればよぐ好ましくはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Dulbecco's mo dified Eeagle s minimum essential medium;にゥシ月台 ¾血清、 L—クノレタン、 L—ピルビン酸および抗生物質（ペニシリン Gおよびストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。前記ハイプリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、 5%CO

2濃度、

37°Cの条件下で約 3日間行なうことができる。また、マウスの腹腔内で培養する場合には、約 14日間で行なうことができる。

[0195] このようにして得られた培養液またはマウスの腹水から、タンパク質の分離および精製常法に従って、前記モノクローナル抗体を分離および精製することが可能である。このような方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン A結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析または凍結乾燥などを挙げることができる。

[0196] また、本発明のポリクローナル抗体も、免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、本発明のリラキシン一 3またはそれらの部分断片を用いることを除いて、それ自体公知の方法、例えば以下に示す方法により調製することができる。すなわち、抗原を含む生理食塩水を等量のフロイント氏完全アジュバンドもしくは不完全アジュバンド、またはその等価物、例えば Hunter's TiterMax™ (フナコシ社）と乳化混合して、哺乳動物 (特にはゥサギまたはャギなど)の皮下、腹腔内または筋肉内などのいずれかに投与する（初回免疫)。以後、 2〜4週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から 1〜2週間後に哺乳動物の頸動脈または心臓から血液を採取して血清を硫酸アンモ-ゥムによって塩析することにより調製することができる。

[0197] 本発明の抗体フラグメントは、前記抗体 (モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む)の部分断片であって、しかも、元の抗体と同じ反応特異性を有する限り、特に限定されるものではない。本発明による抗体フラグメントとしては、例えば Fab、 Fab'、 F (ab') または Fvを挙げることができる。本発明の抗体フラグメントは、例えば

2

前記によって得られることができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素 (例えばトリプシンなど）によって消化し、続いて、タンパク質の分離および精製の常法に従って得ることができる。

[0198] また別の態様によれば、本発明の抗体は、国際公開第 01Z068862号パンフレツト、特開 2002— 345468号明細書に記載の方法により得ることができる。また。公知となった抗リラキシン- 3抗体を使用することができ、例えば特開 2002— 345468号明細書の実施例に記載された抗体 (モノクローナル抗体: HK4— 144 10)を挙げることがでさる。

[0199] 本発明の抗体は、医薬品組成物として用いることもでき、例えば摂食 (もしくは食欲 )抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤として使用することができる。本発明の抗体は、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることができる。この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。また、か力る薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明の抗体を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クェン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

[0200] それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、抗体の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重 lkgあたり例えば約 0. 01〜30mg、好ましくは約 0. 1〜10 mg程度を投与するのが好ま、範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レべルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。

[0201] 本発明のリラキシン 3もしくはリラキシン 3受容体 (好ましくは SALPR)と相互作用し、本発明のリラキシン一 3の活性を阻害する物質は、本発明のスクリーニング法によって得ることができる。前記スクリーニング方法によって得られる化合物の好適例として、後述する実施例に記載された 1, 2, 5 -oxadiazolo [3, 4— a] l, 2, 5— oxa diazoio [3, 4— e」l, 2, 5― oxadiazolo [ 3 , 4— 1」1, 2, 5― oxadiazolo [ 3 , 4— m ] [16] _annulene (以下、「ィ匕合物 1」と称する場合もある。）を挙げることができる。当該化合物の投与形態は、前記本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬に関する記載を参照すればよい。

[0202] 本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および Zまたは症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒と!/、う点では治療的である。本明細書にぉ、て「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a)〜(c)の治療を含む：

(a)疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持って!/、ると診断されて、な、患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；

(b)疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；

(c)疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。

[0203] なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0204] 以下、実施例により本発明についてより詳細に説明する力本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。

[0205] 「実施例 11 SALPRをコードするポリヌクレオチドの調製

SALPRをコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号 3で表される塩基配列を基にして、以下のように行った。配列番号 3では 1410塩基対が示されており、 SALP Rをコードする領域は、 1番目から 1407番目（1410塩基対， 469アミノ酸残基）とされている（GenBank ァクセッション番号 NM— 016568)。 PCR (polymerase cha in reaction)により遺伝子を単離するために、配列番号 11および配列番号 12で表される PCRプライマーを常法に従ヽ作製した。

[0206] human genomic DNA (Roche Diagostics社）を铸型として、配列番号 11および配列番号 12の組合せからなる PCRプライマーと、 Expand High Fidelity P CR System (Roche Diagnostics社）を用い、 (98°C 1分— 57。C 1分— 72。C 3分)を添付の操作方法に従い、 30回繰り返すことにより PCRを行った。その結果、約 1, 400塩基対の DNA断片を得た。

[0207] この DNA断片を、 pCR2. 1 (Invitrogen社）に挿入し、 ABI prism DNA sequ encing kit (Perkin- Elmer Applied Biosystems社）により配列を確認した。その結果、配列番号 11および 12からなるプライマーの組合せによって得られた pCR2 . 1— SALPRに挿入された 1410塩基対の配列は、配列番号 3における 361番目力ら 1770番目と長さは同一であった力配列中には 1つの変異が見られた。この変異は、該当部位の核酸配列力翻訳されるアミノ酸には影響を与えないことは明らかであつたので、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを得ることができた。

[0208] 「実施例 2Ίレトロウイルスベクタープラスミドの調製

pBaoe Puro (Morgenstern, J. P. and Land, H. Nucleic Acids Re s. vol. 18 3587— 3596 (1990) ) (配列番号 13)力も Sailおよび Clalで切断することにより SV40 promoter— puro (r)領域を除き、末端を Klenow fragmentにより平滑化した。ここへ pIREShyg (Clontech社）カゝら Nsilおよび Xbalで切断することにより IRES— hyg (r)領域を切り出し、 T4ポリメラーゼにより末端を平滑ィ匕したものを挿入し pBabeXIHを得た。

[0209] pBabeXIHから Ssplおよび BamHIで切断することにより 5，一 LTR— packaging signalを除、た。ここへ pCLXSN (IMGENEX社）から Ssplおよび BamHIで切断することにより切り出した 5，LTR—CMV promoter - packaging signalを挿入し pB abeCLXIHを得た。

[0210] 「実施例 31 SALPR遣伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製

前記実施例 2に記載のレトロウイルス発現用プラスミド pBabeCLXIHを制限酵素 H palで切断した。ここへ前記実施例 1で得た pCR2. 1— SALPRから EcoRVで切断することにより SALPRをコードするポリヌクレオチドを切り出し、 T4ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入し pBabeCL (SALPR) IHを得た（図 1)。

[0211] 「実施例 41 SALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製

2 X 10⁶個の 293— EBNA細胞（Invitrogen社）を 10cmコラーゲンコートディッシュ（IWAKI社）で DMEM (Sigma社）ー10% fetal bovine serum (FCS)—ぺ -シリン（penicillin) lOOunits/ml ストレプトマイシン（streptomycin) 100 ^ g/ml (PS) (以下、「EBNA培養液」と称する） 10mlを用いて培養した。翌日、 pV— gp (pVPack-GP (Stratagene社）から Nsilおよび Xbalで切断することにより IRES — hisDを除き T4ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの）、 pVPack— VSV —G (Stratagene社）、および実施例 3で得た SALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド（pBabeCL (SALPR) IH)それぞれ 3. 3 μ gをリポフエクシヨン試薬である TransIT(Panvera社）を用いて、前記 293— EBNA細胞にトランスフエクシヨンした。その 6〜 12時間後に EBNA培養液を交換し、 37°Cで培養を続けた。

[0212] トランスフエクシヨン 2日後に培養液を回収し、 1, 200 X gで 10分間遠心した。その上清を 0. 45 μ mのフィルター（Millipore社）でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして、さらにウィルスベクターの濃縮を以下のように行った。

[0213] 超遠心用チューブ 50 Ultra -Clear Tubes (Beckman社）を 70%エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウィルスベクター約 35mLを入れた。これを超遠心ローター SW28 (Beckman社）に入れ、超遠心装置 XL— 90 (Beckman社）を使って 19, 500rpm 100分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。 1時間後、チューブ壁面に残った培養液約 100 /z L程度の濃縮ウィルスベクター溶液が得られた。

[0214] 「実施例 5Ίサイクリック AMP応答配列を含むレポーター系導入細朐 SE302の構築

(1)サイクリック AMP応答配列を含むレポーター DNAの作成

公表された論文（Durocher et al. Anal Biochem 2000 284 (2) : 316— 26)を参考に cAMPに応じた転写がみられる unitを以下のように構築した。

cAMP responsive element (CRE)を含む unitの作成のために、 CREx2hb用として配列番号 14および配列番号 15、 CREx2bp用として配列番号 16および配列番号 17で表されるオリゴ DNAを常法に従、作成した。それぞれの組合せ力もなるォリゴ DNAを 95°Cに熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖 DNA ( CREx2hb、 CREx2bp)を形成させた。 CREx2hbを Hindlll, BamHI、 CREx2bp を BamHI, Pstlで消化するとともに、 pBluescriptIISK( + ) (Stratagene社）を Hin dill, Pstlで消化した。消化した DNAを電気泳動して両端に制限酵素消化部位をもつ DNAを精製した後、これら 3つの DNA (CREx2hb、 CREx2bp、 pBluescriptll SK( + ) )を一度に連結し (ligation)、得られたプラスミドの配列を解析して、 CRE4 ZpBluescriptllSKを作成した。

[0215] 次に VIP (vasoactive intestinal peptide)プロモーターを含む DNAを得るために配列番号 18および配列番号 19で表される PCRプライマーを常法に従、作成した。

[0216] Human genomic DNA (Roche Diagostics社）を铸型とし、配列番号 18および配列番号 19の組合せからなる PCRプライマーと、 recombinant Taq polymer ase (Takara社）を用いて（94°C 30秒 55°C 30秒 72°C 1分）を 35回繰り返すことにより PCRしたところ、 264塩基対の DNA (配列番号 20)が得られた。この 26 4塩基対の DNAを Pstlで消化するとともに CRE4ZpBluescriptIISK ( + )の Pstlサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認して CRE4VIPZpBluescriptIISK ( + )を作成した（図 2A)。得られた CRE4VIPZpBluescriptIISK( + )から Hindlllと Smalで消化した後、得られた CRE4VIPプロモーター断片の末端平滑ィ匕を行なった

[0217] 前述の発現用ウィルスベクタープラスミド pBabeCLXIHより IRES〜hygro (r)領域を除去した pBabeCLXを作成した（図 2B)。 pBabeCLXよりレトロウイルス本来のェンハンサー活性 (LTR)中の NheI〜NarI領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、 CREと VIPプロモーターを含む配列と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ (PLAP) ( Gotoら， Molecular Pharmacology, 49, p. 860— 873, 1996)を導入し、 pBabeCLcre4vPdNNを得た（図 2C)。

[0218] (2)サイクリック AMP)^^:西 R歹 II 含すレポーター人糸田 H qSE302の榭

サイクリック AMP応答配列によりレポーター遺伝子 PLAPが誘導されるレトロウィルスベクタープラスミド pBabeCLcre4vPdNNを用い、実施例 4に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターを HEK293細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローンィ匕して、 PLAP誘導の反応性が最も良かつたクローン (以下、「SE302細胞」と称する）を以下の実験に供した。

[0219] 「実施例 61 SALPR遣伝子導入用レトロウイルスベクターによる SALPR発現細胞の謹

前記の実施例 4で調製したレトロウイルスベクターによる細胞への SALPR遺伝子導入を以下のように行った。

前記実施例 5で構築した 3 X 10³個の SE302細胞を 96well plate (旭テクノガラス社）に DMEM (SIGMA社）ー10% fetal bovine serum (FCS)—PS (以下、「培養液」と称する） 100 μ Lを用いて培養した。翌日、実施例 4で調製したレトロウィルスベクターを適宜希釈し、その 100 Lを培養液で調製した polybrene (最終濃度 8 /z gZmL) (別名 hexadimethrine bromide Sigma社）とともに SE302細胞にカロえた。その翌日、培養液を 500 μ gZmLのハイグロマイシン（Hygromycin) (Invi trogen社)含有の培養液 200 Lと交換し培養した。この条件で増殖してきた SALP R遺伝子導入 SE302細胞（以下、「SALPR—SE302細胞」と称する）を適時継代して実験に供した。

[0220] 「実施例 71 SALPR— SE302細朐におけるフォルスコリン添加によって増加させた転写活件のリラキシン— 3による抑制

前記実施例 6で構築した SALPR— SE302細胞を、転写活性測定用培地 (DME M— 10%FBS (65°Cにて 30分非働ィ匕）をカ卩えたもの）にて縣濁した後、 96 well p late (Beckton Dickison社）に 1穴あたり 1 X 10⁴細胞となるようにまいた。翌日、ァッセィ用培地 (DMEMに 0. 1%ゥシ血清アルブミンをカ卩えたもの）で希釈した各濃度のヒト型リラキシン一 3 (Phoenix Pharamaceuticals社）またはインスリン（Invitrog en社）を添加し、その後フォルスコリン（Carbio Chem社）を最終濃度 1 μ molZLとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清を 15 L回収して化学発光測定用の 96well plate (住友ベークライト社）に移し、アツセィ用緩衝液（280mmolZL

Na CO -NaHCO、 8mmol/L MgSO、 pH10)を 60 μ L、 Lumiphos530 (L

2 3 3 4

umigen社） 70 /z Lを添カ卩して、室温にて 1時間反応させた後、各 wellの化学発光を Fusionプレートリーダー（Perkin Elmer社）にて測定し転写活性量とした。フォルスコリン 1 μ molZLを添加した細胞上清の転写活性を 100%とし、フオルスコリンを添カロして、な、細胞の上清の活性を 0%として各被験サンプルを加えた細胞上清中の活性を％で表示した (図 3)。

[0221] その結果、フオルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン 3は SALPRの活性化を介して抑制することが分力つた。この転写活性の上昇は関連ペプチドであるインスリンでは影響がな力つたので、リラキシン一 3特異的な反応であることが分力つた。すなわちこの実験系を用いることで、リラキシン 3による SALPRの活性化に影響を与える化合物、物質を判別できることが示された。

[0222] 「実施例 8Ί SALPR— SE302細朐を用いたリラキシン一 3拮抗物質のスクリーニング

実施例 7で示した実験系を用いて、リラキシン 3の作用を拮抗する化合物のスクリ一-ングを実施し、拮抗作用を持つ化合物を見出した。

リラキシン 3は、株式会社ペプチド研究所にて合成されたヒト型リラキシン 3 (以下、単に「ヒト型リラキシン— 3 (ペプチド研究所社製)」と略記する場合もある。）を用いて実験を行った。ヒト型リラキシン— 3は、配列番号 2の N末端力も第 26番目（Arg) 〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）と配列番号 2の N 末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 A鎖）が、配列番号 2の N末端から第 35番目の B鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端力も第 129番目の A鎖のシスティンが結合し、配列番号 2の N末端から第 47番目の B鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端力も第 142番目の A鎖のシスティンが結合し、並びに配列番号 2の N末端力ゝら第 128番目の A鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端から第 133番目の A鎖のシスティンが結合しているポリぺプチドである。

[0223] SALPR— SE302細胞を、転写活性測定用培地（DMEM— F12— 10%FBS (6 5°Cにて 30分非働ィ匕）をカ卩えたもの）にて縣濁した後、 384 well plate (Greiner社 )に 1穴当たり 5000細胞となるようにまいた。翌日、フオルスコリン（Fermentek社)溶液に被験化合物（1, 2, 5-oxadiazolo[3, 4 a] l, 2, 5— oxadiazolo [3, 4— e] 1 , 2, 5― oxadiazolo [ 3 , 4— 1」1 , 2, 5― oxadiazolo [ 3 , 4— m」 [l6]annulene、化合物 1) )を溶解し、細胞上清に添加した (最終濃度:フオルスコリン 3 molZL、被験化合物 20 gZmL, DMSO (dimethylsurf oxide) 0. 5%)。その後、アツセィ用培地（DMEM— F12に 0. 1%ゥシ血清アルブミンをカ卩えたもの）で希釈したヒト型リラキシン一 3 (ペプチド研究所社製)を最終濃度 3nmolZLとなるように添加した。

[0224] さらに一日培養後、細胞上清 5 μ Lを回収して化学発光測定用の 384well plate ( Corning社）に移し、アツセィ用緩衝液を 20 μ L、 Lumiphos530を 25 μ L添カロして、室温にて 2時間反応させた後、各 wellの化学発光を ARVOsx3プレートリーダー（ Perkin Elmer社）にて測定し転写活性量とした。 SALPRを発現していない SE30 2細胞にっ、ても同様に操作し、被験物質の特異性を確認した。

[0225] その結果、 SALPR— SE302細胞におけるフォルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン— 3が抑制し、被験物質である化合物 1がリラキシン— 3による転写活性の抑制に拮抗した（図 4 (A) )。また、 SALPRを発現していない SE302細胞における検討では、化合物 1は、転写活性を上昇させることはな力つた（図 4 (B) )。したがって被験物質による作用が、 SALPRのリラキシン一 3による活性ィ匕を特異的に抑制するィ匕合物であることが確認できた。 [0226] 「実施例 9Ίリラキシン 3脳室内投与による摂食量亢進作用

(1)撒験ラット脳内投与のための前処置

Wistar雄性ラット（7週齢、日本チャールズリバ一社）に実験動物用飼料 MF (オリェンタル酵母社)を与えて馴化した。ラット（250〜300g)を麻酔下で、側脳室に力- ユーレを挿入した。その後一週間以上、前記ラットを飼育した後にリラキシンー3の投与実験を行った。

(2)リラキシン— 3溶液の調製

60 μ gのヒト型リラキシン一 3 (Phoenix Pharmaceutical社）を DMSOにて溶解した後、最終濃度が 200 molZLとなるように人工的脳脊髄液を添加して調製した。析出した沈殿は遠心操作をして取り除き、上清をヒト型リラキシン— 3投与液として用いた。ラットへの投与量 (投与液中のリラキシン 3濃度）は実施例 7に示された実験系にて、リラキシン一 3による標準曲線を用いて算出したところ、約 50pmol/ラットであった。

(3)リラキシン 3溶液の脳室内

ガイド力-ユーレを装着した被験ラットを 2群に分け（1群 6匹）、ヒト型リラキシン— 3 投与液もしくは vehicle (ヒト型リラキシン 3を除、た前記（2)と同じ組成の溶液)を 5 μ LZ2分の速度でインフュージョンポンプを用いて被験ラットに投与した。

H の沏 I

投与液の脳室内投与後すぐに、被験ラットは予め重量を測定した餌を入れてあるケージに入れ自由摂食させた。 2時間後に餌の減少量を測定することで摂餌量を算出した。各群の平均摂餌量と標準偏差を図 5に示す。その結果、投与後 2時間の摂餌量は、ヒト型リラキシン— 3を約 50pmol投与したラットでは対照の vehicle投与のラットに比べて有意に増加していた (t—検定、 pく 0. 01)。従って、リラキシン 3は摂食行動を増加させることが分力つた。

[0227] 「実施例 10Ίリラキシン 3の単回脳室内投与時の血中レブチン濃度上昇

血中レブチン濃度の測定

摂餌量測定後 (投与後約 3時間後）に前記ラットをネンブタールにて麻酔し、その腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を 1, 750 X gで 15分間遠心し、その上清を— 80°Cにて保存した。後日、上清中のレブチン量をラットレプチン定量 ELISA キット（アマシャムバイオサイエンス社）により定量した。

その結果、単回のヒト型リラキシン— 3投与ラットでは対照の vehicle投与のラットより血中のレブチン濃度が有意に上昇することが明ら力となった (t—検定、 pく 0. 05、図 6)。

[0228] 「実施例 11Ίリラキシン 3持続投与による体重增カ Π ·肥満作用の亢進

( 1)リラキシン— 3溶液の調製

ヒト型リラキシン 3 (ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて 100 μ molZLとなるように溶解し、 vehicle (生理食塩水）またはヒト型リラキシン— 3 (ペプチド研究所社製 )溶液を浸透圧ポンプ（alzet osmotic pump modell002 (DURECT社）投与量 6 LZ日）とチューブ '投与用力-ユーレに注入しそれらを接続した。

(2) ,験 ^ のための

Wistar雄性ラット（6週齢、日本チャールズリバ一社）に実験動物用飼料 MF (オリェンタル酵母社)を与え、個別飼育で 4日間馴化した。前記ラット（250〜270g)を麻酔下で、側脳室にガイド力-ユーレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。

(3) ：力 tH乍 ffl fcよび接 H の沏 I

手術日を 0日目として自由摂食下で飼育し、毎朝、体重と餌量を測定した。 0日目力もの体重の増加量を図 7に示した。また、摂餌量は、手術前日から手術日までを 0 日目とし、一日当たりの餌の減少量を摂餌量として示した（図 8)。

[0229] 手術後 1日目よりヒト型リラキシン 3 (ペプチド研究所社製)投与ラット群では有意な体重の増加が確認された。また、ヒト型リラキシン— 3 (ペプチド研究所社製)投与群の摂餌量も 1日目より有意に増加した（t 検定、 * * p〈0. 01、 * p〈0. 05)。

(4)脂肪量、血中レプチン量およびインスリン量の定量

実験終了日（14日目）に体重と餌量を測定した後、ラットをネンブタールにて麻酔し、精巣周囲の脂肪を取り出し両精巣周囲の脂肪量を合わせて測定した (図 9)。さらに、腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を 1 , 750 X gで 15分間遠心し、その上清を— 80°Cにて保存した。後日、上清中のレブチン量をラットレプチン測定キット (L) (IBL社）により定量した（図 10 (A) )。また上清中のインスリン量を超高感度ラットインスリン測定キット (森永生化学研究所社）により定量した（図 10 (B) )。

その結果、精巣周囲脂肪量は対照の vehicle投与のラットに比較し、ヒト型リラキシン— 3 (ペプチド研究所社製)持続投与群で有意に増力！]していた。また、血中のレブチン濃度とインスリン濃度も、ヒト型リラキシン— 3 (ペプチド研究所社製)を持続投与したラットで有意に上昇していることが明ら力となった (t—検定、 * * pく 0. 01、 * pく 0. 05)。従って、リラキシン— 3投与により脂肪蓄積を伴う肥満作用が亢進するとともに、インスリン量が増加することが明ら力となった。

「実施例 12Ίリラキシン 3持続投与による体重增カロ、運動量への作用

( 1)リラキシン— 3溶液の調製

(2) ,験 ^ のための

Wistar雄性ラット（5週齢、日本チャールズリバ一社）に実験動物用飼料 MF (オリェンタル酵母社)を与え、個別飼育で 5日間馴化した。前記ラット（170〜200g)を麻酔下で、側脳室にガイド力-ユーレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。手術日を 0日として運動量の測定日以外は自由摂食 ·飲水下で飼育し、毎朝体重を測定した（図 1 1)。

前記実施例 1 1と同様に、投与後 1日後からヒト型リラキシンー3 (ペプチド研究所社製)投与ラット群では有意な体重の増加が確認された (t 検定、 * * pく 0. 01、 * pく 0. 05)。

(3)自； ί軍 ¾ の沏 I

前記 (2)にて、ヒト型リラキシン— 3 (ペプチド研究所社製)投与ラットの体重増加作用に有意な差が認められた日の明期および暗期の自発運動量を、 Versamax (Acc uscan社)を用いて測定した。明期 (投与開始後 2、 7日後）、暗期 (投与開始後 3、 8 日後）のラットを実験開始の 1時間以上前に個別飼育台から実験室へ移動して馴化した後、 Versamaxケージ内にラットを入れ直後から 90分間の行動量を記録した。 9 0分間の全活動量を図 12に示した。

いずれの日においても各群のラットで運動量には有意な変化は認められな力つた。すなわち、リラキシン 3による体重増加作用は自発運動量の変化が作用しているのではないことが明ら力となった。

産業上の利用可能性

本発明により、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、当該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、当該スクリーニング用キット、ある、は当該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などが提供される。

Claims

請求の範囲

[1] リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物を含有してなる摂食亢進剤。

[2] リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物を含有してなる体重増加剤。

[3] リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物を含有してなる脂肪量増加剤。

[4] 次の工程;被験物質を、

(A)リラキシン— 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、

[5] 次の工程；

[6] 次の工程；

をさらに含むことを特徴とする請求項 5に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

[7] リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 4〜6のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

[8] SALPR力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 7に記載のスクリーニング方法。

[9] リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。

[10] リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物を、さらに含んでなる、請求項 9に記載のスクリーニング用キット。

[11] リラキシン 3が標識されている、請求項 10のスクリーニング用キット。

[12] リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 9〜： L 1のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。

[13] SALPR力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 12に記載のスクリーニング用キット。

[14] リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物を含有してなる、体重増加を必要とする疾患の治療剤

[15] 疾患が拒食症または悪液質である請求項 14に記載の治療剤。

[16] 次の工程;被験物質を、

[17] 次の工程；

[18] 次の工程；

をさらに含むことを特徴とする請求項 17に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。

[19] リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 16〜18のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

[20] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 19に記載のスクリーニング方法。

[21] リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリ一ユング用キット。

[22] リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、請求項 21に記載のスクリーニング用キット。

[23] リラキシン一 3が標識されている、請求項 22に記載のスクリーニング用キット。

[24] リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 21〜23のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。

[25] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 24に記載のスクリーニング用キット。

[26] 次の工程;被験物質を、

[27] 次の工程；

[28] 次の工程；

をさらに含むことを特徴とする請求項 27に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

[29] リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 26〜28のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

[30] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 29に記載のスクリーニング方法。

[31] リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。

[32] リラキシン 3またはリラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチド、これらの塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、請求項 31に記載のスクリーニング用キット。

[33] リラキシン一 3が標識されている、請求項 32に記載のスクリーニング用キット。

[34] リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 31〜33のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。

[35] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 34に記載のスクリーニング用キット。

[36] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する摂食抑制剤。

[37] SALPR阻害作用を有する化合物が、請求項 7または 8に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 36に記載の剤。

[38] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する体重減少剤。

[39] SALPR阻害作用を有する化合物力請求項 19または 20に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 38に記載の剤。

[40] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する脂肪量減少剤。

[41] SALPR阻害作用を有する化合物力請求項 29または 30に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 40に記載の剤。

[42] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する肥満治療剤。

[43] SALPR阻害作用を有する化合物力請求項 19、 20、 29または 30のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 4

2に記載の剤。

[44] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する糖尿病治療剤。

[45] SALPR阻害作用を有する化合物力請求項 19、 20、 29または 30のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 4

4に記載の剤。

[46] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 36〜45のいずれか一項に記載の剤。

[47] リラキシン— 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の摂食量を測定する工程を含むことを特徴とする、摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

[48] リラキシン 3受容体に作用する化合物力請求項 4〜8のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項 47に記載の方法。

[49] リラキシン— 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の体重を測定する工程を含むことを特徴とする、体重を増加または減少させるィ匕合物またはその塩のスクリーニング方法。

[50] リラキシン— 3受容体に作用する化合物力請求項 16〜20のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項 49に記載の方法。

[51] リラキシン— 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の肥満の指標を測定する工程を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

[52] リラキシン— 3受容体に作用する化合物力請求項 26〜30のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項 51に記載の方法。