明 細 書
糖尿病治療剤スクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、糖尿病治療剤スクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 糖尿病は、持続的高血糖状態を伴う疾患であり、多くの環境因子と遺伝的因子とが 作用した結果生じると言われている。血糖の主要な調整因子はインスリンであり、高 血糖は、インスリン欠乏、あるいは、その作用を阻害する諸因子 (例えば、遺伝的素 因、運動不足、肥満、又はストレス等)が過剰となって生じることが知られている。
[0003] 糖尿病には主として 2つの種類があり、自己免疫疾患などによる膝インスリン分泌機 能の低下によって生じるインスリン依存性糖尿病(IDDM)と、持続的な高インスリン分 泌に伴う脾疲弊による膝インスリン分泌機能の低下が原因であるインスリン非依存性 糖尿病(NIDDM)とに分けられる。 日本人の糖尿病患者の 95%以上は、 NIDDMと言 われており、生活様式の変化に伴い、患者数の増加が問題となっている。
[0004] 糖尿病の治療は、軽症にお!、ては、食事療法、運動療法、及び肥満の改善等が主 として行われ、更に進行すると、経口糖尿病薬 (例えば、スルホ -ルゥレア剤等のイン スリン分泌促進剤)の投与が行われ、更に重症の場合は、インスリン製剤の投与が行 われている (非特許文献 1、 2)。
[0005] スルホニルゥレア剤は、脾 β細胞を刺激し、内因性インスリン分泌を促進する力 ィ ンスリン分泌のタイミング及び分泌量は、血糖値とは関係なぐ薬物の投与タイミング 及び投与量によって決まる。このため、副作用として薬剤の作用持続に起因する低 血糖を呈する場合がある。また、食欲不振等の消化器症状が現れる。更に、重症ケト 一シス又は肝若しくは腎機能障害のある患者には禁忌である (非特許文献 3)。 インスリン製剤は、確実に血糖を低下させるが、注射により投与しなければならない 上に、低血糖になるおそれもある (非特許文献 4)。
[0006] このように従来用いられて!/ヽるインスリン分泌促進剤及びインスリン製剤は、前記課 題を有していた。そこで、より高度な血糖管理が可能な薬剤、すなわち、単に血糖を
下げる薬剤ではなぐ正常範囲内に血糖をコントロールすることのできる薬剤が切望 されていた。
[0007] 一方分泌されたインスリンは肝臓や筋肉の細胞膜上にあるインスリン受容体を介し て、そのシグナルを伝え、最終的には細胞外からの糖の取り込みを促進する力 これ らインスリンシグナル伝達経路の詳細にっ 、ては精力的な研究がなされて 、る(非特 許文献 5〜7)が、未だその詳細な機構は解明されていない。
[0008] 最近、様々なサイト力インやホルモンによって発現が誘導される情報伝達因子とし て S〇C¾ ^suppressor
of cytokine signaling)ファミリーが同定された。 SOCSファミリ一は、 SH2 (Src homology 2)ドメインと、 SOCSボックス(SOCS
box)を有する点が共通しており、 SH2ドメインがリン酸ィ匕チ口シンを認識し、種々のサ イト力インレセプターのシグナルを抑制していると考えられている。 SOCSファミリ一間 での配列同一性は SH2ドメインと SOCSボックスに限定されており、その分子サイズは 579アミノ酸(S0CS-7)から 198アミノ酸(S0CS-2)とバラエティーに富んでおり、 SOCS- 1又は SOCS- 3のように KIR (kinase
inhibitory region)がある分子もあれば、それ以外の SOCSファミリー分子のように KIR を持たない分子もある(非特許文献 8)。 SOCSファミリー分子の生体内での機能は分 子により様々である。
[0009] 非特許文献 1 :阿部隆三及び春日雅人編集、 rEvidence- Based Medicineをめ ざす糖尿病治療」、南江堂、 1997年
非特許文献 2 :日本糖尿病学会編、「糖尿病治療ガイド 2000」、文光堂、 2000年 非特許文献 3:「ァナノレズ ·ォブ ·イマージェンシ^ ~ ·メデイシン(Annalsof Emergency Medicine)」、(米国)、 2001年、第 38卷、第 1号、 p.68-78
非特許文献 4:「ダイアビィテイス'メタボリズム(Diabetes &Metabolism)」、(米国)、 1994年、第 20卷、第 6号、 p.503-512
非特許文献 5:「ザ ·ジャーナル ·ォブ ·タリ-カル 'インべスティゲーシヨン(Thejournal of Clinical Investigation)」、(米国)、 2000年、第 106卷、第 2号、 p. 165-169 非特許文献 6 :「ザ'ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー(Thejournal of
Biological Chemistry)」、(米国)、 1999年、第 274卷、第 4号、 p. 1865-1868 非特許文献 7 :「ネイチヤー (Nature)」、(英国)、 2001年、第 410卷、第 6831号、 p.944-948
非特許文献 8:「プロシーディンダス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン ス'ォブ 'ザ'ュナイテイツド'ステート'ォブ 'アメリカ(Proceedings of the national academy of sciences of the United Statesof America)」、、未国.)、 1998年、弟 95卷、 p. 114-119
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] かかる状況下、本発明者らは、高グルコース濃度下特異的にインスリン分泌を促進 する新たな糖尿病治療剤のターゲットを探索し、鋭意研究を行った結果、高ダルコ一 ス濃度下で脾 j8細胞力ものインスリン分泌量は増加する力 SOCS-2を脾 |8細胞に 過剰発現させると、高グルコース濃度下でのインスリン分泌量が低下すること、一方、 低グルコース濃度下では、 SOCS-2を脾 |8細胞に過剰発現させてもインスリン分泌量 に変化がないとの知見を得た。つまり、高グルコース濃度下で促進されるべき脾 j8細 胞からのインスリン分泌を、 SOCS-2が抑制していることが判明した。以上より、 SOCS-2及び SOCS-2が過剰発現した脾 |8細胞は、正常範囲内に血糖をコントロー ル可能な糖尿病治療剤のスクリーニングツールとなることを見出し、高グルコース濃 度下で SOCS-2が過剰発現した脾 β細胞力ものインスリン分泌を増加させる物質をス クリーニングすることができる系を構築した。また、 SOCS- 2のプロモーターを取得し、 SOCS-2のプロモーター活性を低下させる物質をスクリーニングすることができる系を 構築した。これにより、正常範囲内に血糖をコントロール可能な糖尿病治療剤である インスリン分泌促進剤 (より好ましくは、高グルコース濃度下特異的インスリン分泌促 進剤)として有用な物質を得るための新規かつ簡便なスクリーニング方法を提供し、 本発明を完成した。
課題を解決するための手段
[0011] すなわち、本発明は、
[l] SOCS-2のアミノ酸配列、配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 1〜10個の
アミノ酸が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列、あるいは、配列番号 2で 表されるアミノ酸配列と 90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、 脾 β細胞にて強制発現させることにより高グルコース濃度下のインスリン分泌を抑制 する作用を示すポリペプチドからなる、糖尿病治療剤スクリーニング用ツール、
[2]SOCS- 2が、ヒト SOCS- 2又はマウス SOCS- 2である、 [1]に記載の糖尿病治療剤 スクリーニング用ツール、
[3] [1]又は [2]に記載のポリペプチドを過剰発現している細胞力もなる、糖尿病治 療剤スクリーニング用ツール、
[4] (1) [3]に記載の細胞と試験物質とを高グルコース濃度下で接触させる工程、及 び
(2)前記細胞カゝら分泌されるインスリン量を測定する工程
を含む、糖尿病治療剤のスクリーニング方法、
[5]糖尿病治療剤がインスリン分泌促進剤である、 [4]に記載のスクリーニング方法、 [6]配列番号 3で表される塩基配列又はその一部の配列、あるいは、配列番号 3で 表される塩基配列において 1〜10個の塩基の欠失、置換、及び Z若しくは付加され た塩基配列又はその一部の塩基配列を含み、且つ、ヒト SOCS-2プロモーター活性を 有する DNA断片である、糖尿病治療剤スクリ一ユング用ツール、
[7] (1) [6]に記載の DNA断片で形質転換した細胞と試験物質とを接触させる工程、
(2) SOCS2発現量を測定する工程、及び
(3) SOCS2発現量を抑制する物質を選択する工程
を含む、糖尿病治療剤のスクリーニング方法、並びに
[8]糖尿病治療剤がインスリン分泌促進剤である、 [7]に記載のスクリーニング方法 に関する。
[0012] 糖尿病治療剤 (好ましくはインスリン分泌促進剤、より好ましくは高血糖時特異的ィ ンスリン分泌促進剤)スクリーニングのための本発明のスクリーニングツールの使用も 、本発明に含まれる。
[0013] SOCS- 2は、例えば、アミノ酸配列の同一性 93%であるヒト SOCS- 2 (NCBI
Reference Sequences番号 NP_003868:配列番号 5)及びマウス SOCS- 2 (NCBI
Reference Sequences番号 NP_031732 :配列番号 2)が知られており、本発明のスクリー ユングツールとして 、ずれを用いることもできる。ヒト SOCS-2 (198アミノ酸残基)とそれ ぞれ 198アミノ酸残基中 189アミノ酸残基 (95%)、 191アミノ酸残基中 190アミノ酸残基( 99%)、 198アミノ酸残基中 198アミノ酸残基(100%)の同一性を有するアミノ酸配列をコ ードする塩基配列が特許文献(US5919661-A、 WO00/55174-Al、 WO03/039443) に開示されている。裏づけは伴わないがそれらに関連する疾患として多数記載され て ヽるが、高グルコース濃度下でのインスリン分泌促進を阻害する作用は記載されて おらず、それを示唆する記載もない。また、国際公開第 WO01/35732-A1号パンフレ ットには、 SOCS-2は成長ホルモン(GH)やインスリン様増殖因子—I (IGF-l)を含む ホルモンシグナルを調整し、家畜ゃヒトに対して、年を取っても活発でいられる可能 性や、代謝調節により肥満のコントロールに有用である可能性、慢性炎症の治療に 役立つ可能性、心筋梗塞や骨折、骨粗鬆症予防に使用できる可能性などが記載さ れて 、るが、高グルコース濃度下でのインスリン分泌促進を阻害する作用は記載され てない。本発明者らは、高血糖時の脾 )8細胞力ゝらのインスリン分泌促進を抑制する SOCS-2の作用を初めて見出し、 SOCS-2が糖尿病態における高血糖時のインスリン 分泌低下の原因であることを初めて明らかにした。
発明の効果
[0014] 本発明のスクリーニング用ツール又はスクリーニング方法によれば、正常範囲内に 血糖をコントロール可能な糖尿病治療剤 (好ましくはインスリン分泌促進剤、より好ま しくは、高グルコース濃度下特異的インスリン分泌促進剤)として有用な物質をスクリ 一-ングすることができる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]アデノウイルスを感染させた MIN6B1細胞に、 2.8 mmol/Lと 16.8mmol/Lのダルコ ースを添加後、 20分後の上清中のインスリン濃度 (ng/mL)を測定した結果を示すグ ラフである。記号「CTRL」はコントロールを意味し、「**」はコントロール群に対する有 意差が pく 0.01であることを意味して 、る。縦軸は「インスリン濃度 (ng/mL)」である。
[図 2]アデノウイルスを感染させたラット脾ランゲルハンス島に、 2.8mmol/Lと 16.8 mmol/Lのグルコースを添加後、 1.5時間後の上清中のインスリン濃度 (ng/mL)を測定
した結果を示すグラフである。記号「CTRL」はコントロールを意味し、「**」はコント口 ール群に対する有意差が pく 0.01であることを意味して 、る。縦軸は「インスリン濃度 ( ng/mL)」である。
[図 3]HepG2細胞に、 STAT1、 STAT3、 STAT5を誘導すると言われている IL-6を添カロ 又は無添カ卩し、 3時間培養後の SOCS-2メッセンジャー RNA量を定量 PCRを用いて測 定した結果を示すグラフである。縦軸には、 IL-6無添カ卩時 [IL6(-)]を 100とした RNA量 に対して、 IL-6添カ卩 [IL6(+)]の RNA量を相対値で示した。
[図 4]SOCS-2のプロモーターを用いたレポータープラスミドを HepG2にトランスフエク シヨンし、 IL-6刺激又は無刺激し、 3時間培養後のレポーター活性を測定し、同時に トランスフエクシヨンした βーガラタトダーゼ活性で標準化した結果を示すグラフである 。縦軸には無刺激時 [IL6(-)]を 100としたプロモーター活性に対して、 IL-6添カロ時 [ IL6(+)]の活性を相対値で示した。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下、本発明で使用される用語につき説明する。
「高グルコース濃度下」とは、例えば、血中、あるいは、細胞を取り巻く環境における グルコース濃度力 S、正常な状態におけるグルコース濃度範囲を越えた状態を意味し
、好ましくは 16.8 mmol/Lである。
また、「低グルコース濃度下」とは、例えば、前記グルコース濃度が、正常な状態に おけるグルコース濃度範囲より低い状態を意味し、好ましくは 2.8 mmol/Lである。
[0017] 「脾 β細胞」とは、インスリン分泌可能な細胞であり、分化又は再生後の成熟した脾 臓 j8細胞を示し、哺乳類由来の細胞又は株化された細胞が好ましい。具体的には、 ラット又はマウスの脾臓力も分離した膝ランゲルノ、ンス島、若しくは、脾 )8細胞の研究 に使用される RIN5細胞〔Pro Natl.Acad.Sci.USA (1977) 74, 628- 630〕、 HIT細胞〔 Proc.Natl.Acad.Sci.USA
(1981) 78, 4339- 4342〕、 MIN6細胞 [Endocrinol. (1990) 127, 126- 132〕、 MIN6B1細 胞 [Endocrinol.
(2003) 144, 1368-1379〕、 j8 TC細胞 [Endocrinol. (1990) 126, 2815-2822, Diabetes (1993)
42, 901- 907〕、 NIT1細胞 [Diabetes (1991) 40, 842- 849〕、 INS- 1細胞 [Endocrinol. (1992)
130, 167-178〕、 j8 HC細胞〔Mol.Cell.Biol. (1993) 13, 4223- 4232〕等が挙げられる。
[0018] 「スクリーニング」とは、多数の試験物質の中から目的の活性を有する物質を篩!、分 けること、及び、或る試験物質について、その物質が目的の性質を有する物質である か否かを検出すること (すなわち、篩 、分けること)の両方を含む。
[0019] 以下に本発明を詳細に説明する。
1.本発明のスクリーニングツール
本発明の糖尿病治療剤 (好ましくはインスリン分泌促進剤、より好ましくは高血糖時 特異的インスリン分泌促進剤)スクリーニングツールには、(1)ポリペプチド型スクリー ユングツール、(2)細胞型スクリーニングツール、及び(3)プロモーター型スクリー- ングツールが含まれる。
[0020] (1)ポリペプチド型スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとしては、 SOCS-2のアミノ酸配列、配 列番号 2で示されるアミノ酸配列において 1〜: L0個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z 又は付加されたアミノ酸配列、あるいは、配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 90% 以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、脾 |8細胞にて過剰発現させ ることにより高グルコース濃度下のインスリン分泌を抑制する作用を示すポリペプチド を利用することができる力 ヒト SOCS-2又はマウス SOCS-2を使用することがより好ま しい。
[0021] 或るポリペプチドが「脾 β細胞にて過剰発現させることにより高グルコース濃度下の インスリン分泌を抑制する作用」を示すか否かの判定方法は、特に限定されるもので はないが、例えば、実施例 1又は実施例 2に記載の方法によって確認することができ る。
具体的には、例えば、判定対象ポリペプチドを発現可能な DNAを挿入した発現べ クタ一と、コントロール用空ベクターとを用いて脾 j8細胞を形質転換し、脾 j8細胞に て前記ポリペプチドを発現させた状態にした試験用細胞と、コントロール細胞とを作 製し、所定期間(例えば、 12時間〜 2日間)が経過した後、高濃度又は低濃度のダル
コースを含有する緩衝液に置換して更に所定時間(例えば、数十分〜数時間)インキ ュペートし、前記緩衝液 (すなわち、培養上清)中のインスリン分泌量をそれぞれ測定 する。このとき、低濃度グルコース刺激時はコントロールと差がないが、高濃度ダルコ ース刺激時にのみ、インスリン分泌抑制作用が認められた場合、前記判定対象ポリ ペプチドは、「脾 j8細胞にて過剰発現させることにより高グルコース濃度下のインスリ ン分泌を抑制する作用」を示すと判定することができる。
[0022] ポリペプチドの機能を維持するために、置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と 似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グルー プに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。こ れらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能 は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリ ペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。 非極性アミノ酸: Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met, Phe、及び Trp
非荷電性アミノ酸: Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、及び Gin
酸性アミノ酸: Asp及び Glu
塩基性アミノ酸: Lys、 Arg、及び His
[0023] 本明細書における配列同一性は、 BLAST (Basic local
alignment search tool; Altschul'S.F.ら, J.Mol.BioL, 215, 403—410, 1990)により得ら れた値を意味し、アミノ酸配列の相同性は、 BLAST検索アルゴリズムを用いて決定す ることができる。具体的には、 BLASTパッケージ(sgi32bit版,バージョン 2.0.12 ; NCBI より入手)の bl2seqプログラム(Tatiana
A.Tatusova及び Thomas L.Madden, FEMS MicrobioLLett., 174, 247-250, 1999)を 用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ'ァラインメン ト 'パラメータ一として、プログラム名「blastp」を使用し、 Gap挿入 Cost値を「0」で、 Gap 伸長 Cost値を「0」で、 Query配列のフィルタ一とし「SEG」を、 Matrixとして「
BLOSUM62Jをそれぞれ使用する。
[0024] SOCS-2の発現には、ヒト SOCS-2の配列(配列番号 4及び配列番号 5)若しくはその マウスォーソログ配列 (配列番号 1及び配列番号 2)により開示された配列情報に基
づいて、一般的遺伝子工学的手法(「Molecular
し ioning」 [Sambrook, Jり, し old Spring Harbor Laboratory Press, 1989年]等)【こより 製造された SOCS-2をコードする DNA断片を適当なプロモーターの下流に連結するこ とで SOCS-2を細胞内で発現させることが容易にできる。
以下、 SOCS-2の発現のための SOCS-2をコードするポリヌクレオチドの取得方法、 SOCS-2発現ベクターの作成方法、 SOCS-2発現細胞の作製方法を具体的に説明す る。
[0025] SOCS-2をコードする DNA断片は、例えば次のように得ることができる力 この方法 に限らず他の公知の操作(「Molecular
し ioning」 [Sambrook, Jり, し old Spring Harbor Laboratory Press, 1989年]等)でもネ守 ることがでさる。
例えば、(l) PCRを用いた方法、(2)常法の遺伝子工学的手法 (すなわち cDNAライ ブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸配列を含む形質転換株を選 択する方法)を用いる方法、又は(3)化学合成法を用いた方法などを挙げることがで きる。各製造方法については、例えば、国際公開第 WO01/34785号パンフレットに記 載されて!ヽるのと同様に実施することができる。
より具体的には、例えば、実施例 1に記載の方法により SOCS-2を製造することがで きる。
[0026] (2)細胞型スクリーニングツール
本発明の細胞型スクリーニングツールとしては、本発明のポリペプチド型スクリー- ングツールとして利用することができるポリペプチドを、過剰発現して 、る細胞を利用 することができる。
SOCS-2をコードするポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再 び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換させることができ る。更に、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導 入することにより、それぞれの宿主細胞において SOCS-2を発現させることが可能で ある。宿主細胞は、インスリンを分泌する細胞であればよいが、脾 j8細胞が望ましい。
[0027] より、具体的には、 SOCS-2をコードする DNA断片を適当なプロモーター下に繋ぎ、
適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入することによ り、脾 j8細胞での SOCS-2の発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体 DNAに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもょ 、。実施例 1及び実施例 2に 記載の方法を、好まし 、具体例として挙げることができる。
宿主細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方法は、例えば、通常のリボフェクトアミ ン試薬を用いる方法がある。
[0028] (3)プロモーター型スクリーニングツール
本発明のプロモーター型スクリーニングツールとしては、配列番号 3で示される塩基 配列又はその一部の配列、あるいは、配列番号 3で示される塩基配列において 1〜1 0個の塩基の欠失、置換、及び Z若しくは付加された塩基配列又はその一部の塩基 配列を含み、且つ、ヒト SOCS-2プロモーター活性を有する DNA断片を利用すること ができる。
前記 DNA断片は、一般的遺伝子工学的手法により、取得することができ、例えば、 実施例 3に記載の方法で得ることができる。
[0029] 本明細書にお!、て「ヒト SOCS- 2プロモーター活性」とは、ヒト SOCS- 2遺伝子のプロ モーター活性を意味し、より具体的には、配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAの有するプロモーター活性を意味する。或る DNAが「ヒト SOCS- 2プロモーター 活性」を有する力否かの判定方法は、特に限定されるものではないが、既知の通常 の方法、例えば、前記 DNAの 3 '下流に適当なレポーター遺伝子 DNAを連結させ、こ れを有核細胞 (好ましくは動物細胞株)に導入して培養し、前記細胞内のレポーター 遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。より具体的には、例えば 、実施例 3に記載の方法で確認することができる。
[0030] 2.本発明のスクリーニング方法
SOCS-2遺伝子は、脾 |8細胞にて過剰発現を行うと、高グルコース濃度存在下にお いて脾 j8細胞からのインスリン分泌量抑制作用があることを見出した。従って、 SOCS-2過剰発現脾 |8細胞からのインスリン分泌量を指標とする、又は、 SOCS-2の 発現量変化を指標とする、又は、 SOCS-2が脾 |8細胞内でシグナルを伝える又はそ の機能を果たすために結合する分子に対する結合の量的若しくは質的変化を指標と
する、ことからなる糖尿病治療剤 (好ましくはインスリン分泌促進剤、より好ましくは高 血糖時特異的インスリン分泌促進剤)のスクリーニング方法を構築することができる。
[0031] 本発明のスクリーニング方法で使用する試験物質としては、特に限定されるもので はないが、例えば、市販の化合物(ペプチドを含む)、ケミカルファイルに登録されて V、る種々の公知化合物(ペプチドを含む)、コンビナトリアル ·ケミストリー技術 (N. Terrett et al., Drug Discov. Today, 4(1):41,1999)によって得られた化合物群、微生 物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本 発明のスクリーニング方法により選択されたィ匕合物 (ペプチドを含む)を化学的又は 生物学的に修飾したィ匕合物(ペプチドを含む)を挙げることができる。
[0032] 前記スクリーニングする方法として限定はされないが、具体的には例えば以下のス クリーニング方法が挙げられる。
( 1)分泌されるインスリン量の測定を利用したスクリーニング方法
SOCS-2を発現可能な DNAを用いて脾 β細胞を形質転換し、脾 β細胞にて SOCS-2を発現させた状態にした試験用細胞を作製し、所定期間 (例えば、 12時間 〜2日間)が経過した後、所定濃度のグルコースを含有する緩衝液に置換して更に 所定時間(例えば、数十分〜数時間)インキュベートし、前記緩衝液 (すなわち、培養 上清)中のインスリン分泌量をそれぞれ測定する。このときグルコースを含有する緩衝 液に試験物質を添加又は非添加することにより試験細胞を処理又は未処理する。こ の過程で試験用細胞力 培養上清中に分泌されたインスリンを測定する。このとき、 SOCS-2発現により引き起こされる脾 |8細胞でのインスリン分泌は有意に抑制されるこ とが望ましぐ試験物質処理によりインスリン分泌抑制が有意に標準状態まで回復又 は促進することが望ましい。標準状態とは、 SOCS-2を含まない空ベクターを発現させ たコントロール細胞を高グルコース濃度存在下にて培養しインスリン分泌抑制の無い 状態に分泌されるインスリン量のことを指す。またこのとき、低グルコース濃度下にて インスリン分泌量が試験物質の未処理と処理で変化がな 、ことが望ま 、。例えば、 実施例 1又は実施例 2の記載の方法で行うことが好ま ヽ。有意なインスリン分泌量 抑制又は回復とは、例えば、試験用細胞群から分泌されるインスリン量と比較対照細 胞群力 分泌されるインスリン量においてスチューデントの t検定で判定することがで
きる。試験細胞のインスリン分泌量とコントロール細胞に対する有意差が、 pく 0.05、好 ましくは pく 0.01である時、有意な変化があつたと判断する。
[0033] 以下、インスリン分泌量測定方法について、具体例を挙げて説明する。
本発明の細胞型スクリーニングツールとして利用できる細胞は、常法に従 、培養す ることができ、前記培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用 される各種のものを適宜選択することができる。例えば、前記 MIN6細胞であれば牛 胎児血清 (FBS)等の血清成分を 10%添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地 (DMEM)等の培地を使用することができる。
[0034] インスリン分泌量の測定は、 SOCS-2発現脾 β細胞を一度洗浄し、高グルコース濃 度存在下、又は、低グルコース濃度存在下にて数時間培養を行った間に培養上清 中に存在するインスリン濃度を測定することにより可能である。インスリン濃度の測定 には、例えば、実施例に挙げられるような一般的な市販のインスリン濃度測定キットを 用い、添付の説明書に従うことにより可能である。
[0035] (2) SOCS-2の発現抑制を指標とするスクリーニング方法
脾 j8細胞での SOCS-2の過剰発現は、高グルコース濃度下において、インスリンの 分泌を抑制するため、 SOCS-2の発現抑制を指標として糖尿病治療剤 (好ましくはィ ンスリン分泌促進剤、より好ましくは高グルコース濃度下特異的インスリン分泌促進剤 )のスクリーニングが実施可能となる。例えば、脾 |8細胞での内在性の SOCS-2の発 現量を分析すること、あるいは、 SOCS-2のプロモーター領域を、適当なレポーター遺 伝子 (例えば、ルシフェラーゼ遺伝子)の上流に連結した発現ベクターを作製し、この 発現ベクターで形質転換した細胞と、試験化合物とを接触させ、前記レポーター遺 伝子の発現の変化を分析することによりスクリーニングを実施し、糖尿病治療剤 (好ま しくはインスリン分泌促進剤、より好ましくは高グルコース濃度下特異的インスリン分 泌促進剤)を選択することができる。
[0036] 以下具体例を挙げて説明する。
まず試験物質で未処理又は処理した脾 β細胞力 通常用いられる方法により RNA を調製することができる。この RNA調製液力も公知の方法に従ってァガロースゲル電 気泳動により RNAを分離した後、ニトロセルロース膜に転写し、これを SOCS-2の部分
塩基配列を含むラベルした短鎖 DNAプローブを用いたノーザンブロット解析により、 試験物質による SOCS-2塩基配列を有する RNAの発現量の増減を検出することがで きる。これにより SOCS-2の発現量を抑制する物質を試験物質の母集団中からスクリ 一-ングすることができる。
[0037] あるいは、試験物質で未処理又は処理した脾 j8細胞力 通常用いられる方法によ りタンパク質を調製することができる。このタンパク質調製液力も公知の方法に従って タンパク質電気泳動によりタンパク質を分離した後、ポリフッ化ビ-リデン (PVDF)膜 に転写し、これを SOCS-2特異的抗体を用いたウェスタンプロット解析により、試験物 質による SOCS-2ポリペプチドの発現量の増減を検出することができる。これにより SOCS-2ポリペプチドの発現量を抑制する物質を試験物質の母集団中からスクリー二 ングすることができる。
[0038] あるいは、 SOCS-2の部分塩基配列を含む短鎖 DNAプライマーを用いたリアルタイ ム PCR法によっても、試験物質による SOCS-2塩基配列を有する RNAの発現量の増 減を定量的に検出することができる。リアルタイム PCRはより具体的には実施例 4の方 法に従って実施することができる。これにより SOCS-2の発現量を抑制する物質を試 験物質の母集団中からスクリーニングすることが可能である。
[0039] 又は、 SOCS-2のプロモーター領域を、適当なレポーター遺伝子(例えば、ルシフエ ラーゼ遺伝子)の上流に連結した発現ベクターを作製し、この発現ベクターで形質転 換した細胞と、試験化合物とを接触させ、前記レポーター遺伝子の発現の変化を分 析することによりスクリーニングを実施可能である。この方法により、プロモーター活性 を調節する物質が得られ、直接的、又は、間接的に SOCS-2の活性を調節する物質 が得られる。具体的なスクリーニング方法としては実施例 3の方法が好ま 、例として 挙げられ、プロモーター活性を抑制する物質としては、プロモーター活性化時の活性 と比較して有意にレポーター活性が抑制される能力を持つ物質を選択することが望 ましい。
[0040] 本発明のスクリーニング用ツール又はスクリーニング方法によれば、正常範囲内に 血糖をコントロール可能な糖尿病治療剤 (好ましくはインスリン分泌促進剤、より好ま しくは、高グルコース濃度下特異的インスリン分泌促進剤)として有用な物質をスクリ
一-ングすることができ、選択された物質は糖尿病治療効果 (好ましくはインスリン分 泌促進効果、より好ましくは、高グルコース濃度下特異的インスリン分泌促進効果)を 有する。選択された物質の糖尿病治療効果は、公知方法、例えば、糖尿病モデル動 物を用いる評価系により確認することができる。
[0041] 高グルコース濃度下特異的にインスリン分泌を促進することは、高グルコース濃度 下で、コントロール群に対して有意にインスリン分泌量が増加しており、かつ、コント口 ール群に対する試験化合物処理群の高ダルコース濃度下におけるインスリン分泌増 加量が、低グルコース濃度下におけるインスリン分泌増加量に比べ優位に (好ましく は、 1. 5倍以上、より好ましくは 3倍以上に)増加していることを試験することにより確 認することができる。コントロール群に対し試験化合物処理群で有意にインスリン分泌 量が増加している力否かは、例えば、下記実験を行ない、スチューデントの t検定で 判定することができる。試験化合物処理群でインスリン分泌量が増加しており、コント ロール群に対する有意差が、 p〈0.05、好ましくは pく 0.01である時、有意にインスリン分 泌量が増加して 、ると判断することができる。
[0042] マウス H¾ R細胞株 MTN6B1細胞 用いたインスリン分泌 験
24穴プレートに MIN6B1細胞(2xl05細胞)を播種し、 10%牛胎児血清(シグマ社)を 含む DMEM (ギブコ社) 0.5 mLで 24時間培養する。続いて、培地を吸引した後、 KRB-HEPES (140
mmol/L NaCl, 3.6 mmol/L KC1, 0.5 mmol/L NaH PO , 0.5 mmol/L
2 4
MgSO , 1.5 mmol/L CaCl , 10 mmol/L Hepes, 2 mmol/L NaHCO ,
4 2 3
0.1% BSA, pH 7.4)で洗い、 2.8 mmol/Lグルコース含有 KRB- HEPES (1 mL)を加え、 5% CO存在下、 37°Cで 30
2 〜60分間インキュベートする。
[0043] 前記バッファーを吸引除去した後、試験化合物を 2.8 mmol/L又は 16.8 mmol/Lグ ルコース含有 KRB-HEPESで希釈した試験化合物溶液 0.5 mLを加え、 5% CO存在下
2
、 37°Cで 20分間インキュベートする。この上清をインスリン分泌量測定に供する。 インスリン分泌量の測定は、市販のインスリン'ラジオィムノアッセィキット (ラットイン スリン [1251] RIAシステム;アマシャムバイオサイエンス社)により行うことができる。
[0044] その結果、試験化合物刺激により、 2.8 mmol/Lグルコース存在下ではインスリン分
泌量は増加しないが、 16.8 mmol/Lグルコース存在下ではインスリン分泌量が増加す る場合、試験化合物は、高濃度グルコース刺激時のみ、インスリン分泌促進作用を 示すことが確認することができる。
実施例
[0045] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力 これらは本発明の範囲を限 定するものではない。なお、特に断らない限り、公知の方法 (Maniatis,T.ら, "
Molecularし loning- A Laboratory Manual' , し old bpnng
Harbor Laboratory, NY, 1982等)に従って実施した。
[0046] 《実施例 1: SOCS-2高発現 MIN6B1細胞からの分泌インスリンの測定》
( 1)アデノウイルスベクターを利用した SOCS- 2高発現ウィルスの作製
マウス SOCS- 2をコードする遺伝子断片を NCBIリファレンス配列(Reference
Sequences)番号 NM_007706を参考に、両端にそれぞれ Kpnl及び Xhol切断サイトを 有する合成オリゴ DNA[5,- 及び 5' -
CCGCTCGAGTTATACCTGGAATTTATATTCTTCCAA -3,(配列番号 7) ]を用い て PCRを行 、、配列番号 2で表されるアミノ酸配列力もなるマウス SOCS-2をコードす る DNA断片(配列番号 1)を取得した。 PCRにはピロべスト(Pyrobest) DNAポリメラー ゼ(TAKARA社)を用い、 94°Cにて 1分処理後、 98°C5秒と 68°C1分とからなるサイクル を 5回、 98°C5秒と 65°C1分と力 なるサイクルを 5回、 98°C5秒と 60°C30秒と 72°C1分か らなるサイクルを 30回行い、最後に、 72°Cにて 1分処理を行った。得られた DNA断片 を、制限酵素 Kpnl及び Xholにて切断後、アデノウイルスベクター pAdTrack-CMV( Tong-Chuan
Heら, Proc.Natl.Acad.Sci, USA, vol. 95, pp. 2509-2514, 1998)のマルチクローニン グサイト Kpnl及び Xholに挿入し、 SOCS- 2/pAdTrack- CMVベクターを得た。
[0047] 以下、公知のプロトコール ["A Practical Guide for using
the AdEasy system (http://www.coloncancer.org/adeasy.htm
http://www.coloncancer.org/adeasy/protocol2.htm") ]に従い、 SOCS— 2 ^ §現する
高力価アデノウイルス液の調製を行った。コントロール用アデノウイルスは、 pAdTrack- CMVより調製した。
なお、ウィルス量は 260 nmにおける吸光度 (A260)を測定し、下記の計算式:
1 A260 = 1.1 X 1012ウィルス粒子 =
3.3 X 10 plu/mL
で換算した。
[0048] (2)マウス脾 β細胞株 MIN6B1細胞での SOCS- 2発現アデノウイルス添カ卩による
SOCS-2高発現脾 β細胞の作製
マウス脾 j8細胞株 MIN6B1細胞 [Endocrinol. (2003) 144,
1368-1379]に、先に作製した SOCS-2/pAdTrack-CMV又はコントロール用として pAdTrack-CMVを感染させ、 SOCS-2高発現脾 細胞を作製した。
先ず、 24穴プレートに MIN6B1細胞(2χ105細胞)を播種し、 10%牛胎児血清(シグマ 社)を含む最少必須培地 DMEM (ギブコ社) 0.5
mLで 24時間培養した。その後、 SOCS- 2/pAdTrack- CMV又はコントロール用として pAdTrack- CMVを 1穴あたり 4xl08
pfoの濃度で培地に添加した。
脾 β細胞へのアデノウイルスの感染は蛍光顕微鏡下で pAdTrack-CMVに含まれる uFP i^green
fluorescent protein)の蛍光を目視することにより行った。また、 SOCS-2の発現は、一 次抗体として SOCS-2を認識する市販の抗体(抗 SOCS-2抗体; ANASPEC
Incorporatedカタログ番号 28133)、二次抗体にはラビット IgG-HRP (horseradish peroxidase)融合抗体(バイオラッド社)を用いたウェスタンブロッテイングを行 、確認し た。
[0049] (3) SOCS-2高発現細胞におけるインスリン分泌の測定
脾 j8細胞へのアデノウイルスの感染 14時間後、培地を吸引し、 KRB-HEPES (140 mmol/L NaCl, 3.6 mmol/L KC1, 0.5 mmol/L NaH PO , 0.5
2 4
mmol/L MgSO , 1.5 mmol/L— CaCl , 10 mmol/L Hepes, 2 mmol/L
4 2
NaHCO , 0.1% BSA, pH 7.4)で 3回洗い、 2.8 mmol/Lグルコース含有 KRB— HEPES (1
mL)をカロえ、 5%
CO存在下、 37°Cで 1時間インキュベートした。
2
前記バッファーを吸引除去した後、 2.8 mmol/L又は 16.8 mmol/Lグルコース含有 KRB - HEPESを加え、 5%
CO存在下、 37°Cで 20分間インキュベートした。この上清をインスリン分泌量測定に
2
供した。
インスリン分泌量の測定は、市販のインスリン'ラジオィムノアッセィキット (ラットイン スリン [125I]RIAシステム;アマシャムバイオサイエンス社)により行なった。
[0050] その結果、図 1に示すように、 SOCS- 2の発現により、低濃度(2.8 mmol/L)ダルコ一 ス刺激時はコントロールと差がないが、高濃度(16.8
mmol/L)グルコース刺激時にのみ、インスリン分泌促進作用が有意に阻害された。 これにより SOCS-2は、その過剰発現により細胞へのインスリン分泌を妨げることによ つて糖尿病態の増悪因子として作用することがわ力つた。なお、図中の記号「**」はコ ントロール群に対する有意差が p〈0.01 (Studen' s
t-testによる)であることを意味して 、る。
[0051] 《実施例 2: SOCS- 2高発現ラット脾ランゲルノヽンス島を用いたインスリン分泌実験》
(1)ラット脾ランゲルノ、ンス島の単離
体重 350gから 450gの 6〜8週齢の雄ラット 4匹を麻酔し、開腹し、腹腔を露出させた。 肝臓の胆管側を糸で縛り、心臓より脱血させた。胆管より、翼状針を使って 0.02% リベラーゼ(Liberase;ロシュ'ダイァグノスティック社) -HBSS-HEPES (136.8 mmol/L
NaCl, 5.3 mmol/L KC1, 0.8
mmol/L MgSO , 1 mmol/L Na HPO , 0.44 mmol/L KH PO ,
4 2 4 2 4
4.1 mmol/L NaHCO , 10 mmol/L Hepes, 1 mmol/L CaCl , 2
3 2
mmol/Lグルコース, pH7.2)溶液 5 mLを注入した。脾臓を摘出し、 HBSS-HEPES 5mLの入ったチューブに入れ、 37°Cで 20分間インキュベートした。インキュベート後、 脾臓を撹拌してから、氷冷した HBSS-HEPES-0.35%
BSAを加え、遠心し(1500 rpm, 1分)、上清を除いた。これに、 HBSS- HEPES- 0.35% BSA 10 mLをカ卩え、組織を注射針で懸濁した(2回繰り返した)。遠心後、上清を除き
、 8.3%
フイコールーコンレイ(FicoU- Conray)溶液 10 mLを加え、懸濁後、更に、上から HBSS-HEPES-0.35% BSA 10 mLを加え、 20分間遠心した。遠心後、 2層に分かれた 液層の間にある、脾ランゲルハンス島を回収した。更に、回収した脾ランゲルノヽンス 島 ^HBSS-HEPES-0.35%
BSA 10 mLを加え、遠心後、 6穴プレートに 60細胞ずつになるよう播種し、 2 mLの 10% 牛胎児血清(シグマ社)を含む RPMI1640 (インビトロジェン社)で 1日間培養した。
[0052] (2)ラット脾ランゲルハンス島への SOCS- 2発現アデノウイルス添カ卩による SOCS- 2高 発現ラット脾ランゲルノ、ンス島の作製
SOCS- 2/pAdTrack- CMV又はコントロール用として pAdTrack- CMVを 1.2xl010 pfoの濃度で培地に添カ卩した。脾ランゲルノヽンス島へのアデノウイルスの感染及び
SOCS-2の発現は実施例 1 (2)の方法により確認した。
[0053] (3) SOCS-2高発現脾ランゲルノヽンス島におけるインスリン分泌の測定
単離した脾ランゲルノ、ンス島へアデノウイルスを添加して 42時間後、培地を吸引し
、 2.8
mmol/Lグルコース含有 KRB—HEPES—BSA( 140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KC1, 1.2 mmol/L KH PO ,
2 4
1.2 mmol/L MgSO , 1.7 mmol/L CaCl , 5.3 mmol/L NaHCO ,
4 2 3
10 mmol/L Hepes, 0.5% BSA, pH7.4)で 3回洗浄後、 1サンプルあたり 5個の脾ランゲ ルハンス島を 1.5 mLチューブに移した。このチューブに 500 ;z Lの 2.8
mmol/Lグルコース含有 KRB- HEPES- BSAを添カ卩し、 37。Cで 30分間インキュベートし た。
その後、グルコースの終濃度が 2.8 mmol/L又は 16.8 mmol/Lになるよう、グルコース 含有 KRB-HEPES-BSAを添カ卩し、 90分間インキュベートした。この上清をインスリン分 泌量測定に供した。
インスリン分泌量の測定は、市販のインスリン'ラジオィムノアッセィキット (ラットイン スリン [ 1251] RIAシステム;アマシャムバイオサイエンス社)により行なった。
[0054] その結果、図 2に示すとおり、 SOCS-2の発現により、低濃度(2.8 mmol/L)ダルコ一
ス刺激時はコントロールと差がないが、高濃度(16.8
mmol/L)グルコース刺激時にのみ、インスリン分泌促進作用が有意に阻害された。 これにより SOCS-2は、その過剰発現により細胞へのインスリン分泌を妨げることによ つて糖尿病態の増悪因子として作用することがわ力つた。なお、図中の記号「**」はコ ントロール群に対する有意差が p〈0.01 (Studen' s
t-testによる)であることを意味して 、る。
《実施例 3: SOCS-2プロモーターを用いたレポーター系による SOCS-2のプロモータ 一活性測定》
(1) SOCS- 2プロモーター領域のレポーターベクター構築
ヒト SOCS- 2の登録配列(NCBI Reference Sequences番号 NM— 003877)を参考に、本 配列が一致するゲノム配列を NCBI
GenBankァクセッション番号 NC_000012.5_93000001_94000000と特定した。次にヒト SOCS-2のプロモーター領域と思われる領域 NC— 000012.5— 93000001— 94000000の 893,596番目から 898,678番目に該当する配列、すなわち配列番号 3で表される塩基 配列からなる DNAを取得するために、それぞれ、 Nlulと Nhelの制限酵素サイトを含む 合成オリゴ DNA[5,- gtgACGCGTGCTCCCTCCAAGTGGTGGAAAAGTTGA -3,(配列番号 8)及び 5, - gtgGCTAGCGCGCTGCGGAAAATGCAAACCACCAAC -3,(配列番号 9) ]を用い て、 LATaq (TAKARA社;カタログ番号 RR002A)を使用し 1回目の PCRを行い、更に、 PCR産物を滅菌水にて 50倍希釈した液を铸型とし、合成オリゴ DNA[5,- gtgACGCGTGACCTGTATGGTCATTATCACTCATCA -3,(配列番号 10)及び 5, - gtgGCTAGCGCGCTCTTACCTCGACCTCGGCCGCG—3,(配列番号 11) ]を用い て、 LATaq (TAKARA社;カタログ番号 RR002A)を使用し 2回目の PCRを行った。それ ぞれ、 1回目の PCRの条件は、 94°Cにて 1分処理後、 98°C10秒と 72°C5分と力 なるサ イタルを 5回、 98°C10秒と 68°C5分とからなるサイクルを 5回であり、 2回目の PCRの条 件は、 98°C10秒と 68°C5分とからなるサイクルを 10回、 98°C10秒と 65°C5分とからなる サイクルを 25回行い、最後に、 72°Cにて 5分処理した。 2回の PCRの結果、約 5 kbの DNA断片を得、 DNAシーケンス試薬 BigDye3.1 (アプライドバイオシステムズ社)
を用い、添付の説明書に従い、 DNAシーケンサー(モデル PRISM3700 ;アプライドバ ィォシステムズ社)を用いて、 DNA配列を決定し、予測通り、 NCBI
GenBankァクセッション番号 NT_019546の SOCS-2のェキソンを含む上流配列である ことを確認した。この DNA断片中には SOCS-2が反応すると言われている STAT1、
STAT3、 STAT5が結合すると予測される STAT結合に特徴的な配列(TTCCCRKAA;
STATx, TRANSFACァクセッション番号 M00223)が複数個存在していた。この DNA断 片を、 PGVB- 2 (ピツカジーンベーシックベクター 2;東洋インキ社)の Mlul及び Nhelサ イトへ導入して SOCS- 2レポーターベクターを構築した。
[0056] (2) SOCS- 2プロモーター活性の測定
まず、内在性の SOCS-2プロモーター活性を測定した。脾 |8細胞にて SOCS-2のプ 口モーター活性を促進する刺激は不明なため、外部シグナルを伝えて最終的に
SOCS-2転写活性を促進すると考えられる STAT1、 STAT3、 STAT5の転写活性を上 げる刺激の代表である IL-6刺激による SOCS-2メッセンジャー RNA量を測定した。具 体的には IL-6反応性が確認されているヒト HepG2細胞にて、 IL-6刺激、又は、無刺激 状態の内在性 SOCS-2のメッセンジャー RNAの発現量を定量し、比較した。遺伝子発 現量は、同時に測定したダリセルアルデヒド 3-リン酸脱水素酵素〔Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH)〕遺伝子の発現量により補正した。測定系とし ては PRISM TM 7700シークェンスディテクシヨンシステム(Sequence
Detection System) (アプライドバイォシステムズ社)と SYBRグリーン PCRマスターミック ス(SYBR Green PCR Master Mix) (アプライドバイオシステムズ社)を用いた。本測定 系にお 、ては PCRで増幅された 2本鎖 DNAがとりこむ SYBRグリーン I色素の蛍光量を リアルタイムに検出 ·定量することにより、 目的とする遺伝子の発現量が決定される。
[0057] 具体的には、以下の手順により測定した。
先ず、 6穴プレートに HepG2細胞(ATCCァクセッション番号 HB-8065)を播種し、 10%牛胎児血清 (シグマ社)を含む最少必須培地 DMEM (ギブコ社) 2
mLで 1日間培養した HepG2を IL-6 (10 ng/mL;R&D Systems)存在下で 3時間培養し 、全 RNAを RNA抽出用試薬 (RNeasy;キアゲン社)を用いて説明書に従い、調製した 。次に全 RNAから 1本鎖 cDNAへの逆転写を、 0.25
μ gの RNAを用い、逆転写反応用キット(AdvantageTM RT- for- PCR Kit ;クロンテック 社)を用いて 20 しの系で行った。そして、 SOCS-2遺伝子に対しては合成オリゴ DNAの 5, - CCTTTATCTGACCAAACCGCTCTA-3 ' (配列番号 12)と 5, - TGTTAATGGTGAGCCTACAGAGATG-3 ' (配列番号 13)との組合せ、 G3PDH遺 伝子に対しては合成オリゴ DNAの 5, - CCTGACCTGCCGTCTAGAAAA-3 ' (配列 番号 14)と合成オリゴ DNAの 5, - CGCCTGCTTCACCACCTT-3 ' (配列番号 15)と の組み合わせを使用し、 PRISM
PCR増幅のリアルタイム測定を説明書に従って行った。各系において 1本鎖 cDNAは 5
μ L、 2xSYBRグリーン試薬を 12.5 μ L、各プライマーは 7.5 pmol使用した。なお、検 量線作成には、 1本鎖 cDNAに代えて 0.1 Hも / H Lのマウスゲノム DNA (クロンテック社 )を適当に希釈したものを 5
μ L用いた。 PCRは、 50°Cで 10分に続いて 95°Cで 10分の後、 95°Cで 15秒、 60°Cで 60 秒の 2ステップ力 なる工程を 45サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるマウス SOCS-2遺伝子の発現量は、下記式:
[SOCS-2補正発現量] = [SOCS-2遺伝子の発現量 (生データ)] Z[G3PDH遺伝子 の発現量 (生データ)]
に基づ!/ヽて G3PDH遺伝子の発現量で補正した。
その結果、図 3に示すとおり、内在性の SOCS-2遺伝子は IL-6刺激によって約 2倍 の発現上昇することが分力つた。
(3) SOCS- 2プロモーター活性のレポーターによる測定
HepG2細胞(ATCCァクセッション番号 HB-8065)へ、実施例 3 (1)にて作製した SOCS-2レポーターベクター又はコントロールベクターを遺伝子導入し、 IL-6刺激又 は無刺激における活性を測定した。具体的には、 HepG2細胞を 6穴プレートに播種し 、 10%牛胎児血清 (シグマ社)を含む最少必須培地 DMEM (ギブコ社) 2
mLで 1日間培養した。その後、前記プラスミド (0.2 μ g)及び βァクチンプロモーター によって調節される β—ガラタトシダーゼ遺伝子を含むプラスミド pCHl 10 (0.2
μ g)を、遺伝子導入効率を標準化するために併用し、 FuGENETM 6 (BOEHRINGER MANNHEIM, USA社; 1814 443)を用いて細胞に導入した。 8時間後に細胞を IL-6刺 激し、 3時間培養した後、細胞を細胞溶解液 LC |8 (東洋インキ社)で溶解し、そのル シフェラーゼ活性をピツカジーン発光キット (東洋インキ社; 309-04321)を用いて測定 した。
[0059] その結果を図 4に示す。それぞれのレポーター活性は /3 ガラクトシダーゼ活性に よって標準化し、 IL-6無添加の値を 100とした相対値で表した。 IL-6刺激に対して約 2 倍の SOCS-2遺伝子の発現が亢進した。
本実施例 3 (3)で得られた IL-6刺激に対するレポーター系の発現亢進が約 2倍で あった結果は、前記実施例 3 (2)で得られた内在性の SOCS-2遺伝子の発現亢進が 約 2倍であった結果と一致し、本実施例で取得した配列が SOCS-2遺伝子のプロモ 一ターであることを確認することができた。
産業上の利用可能性
[0060] 脾 j8細胞で発現している SOCS-2は、高グルコース濃度下において、脾 j8細胞のィ ンスリン分泌を阻害する活性を有する。従って、 SOCS-2を高発現している脾 |8細胞 を用い、正常範囲内に血糖をコントロール可能な糖尿病治療剤 (好ましくはインスリン 分泌促進剤、より好ましくは、高グルコース濃度下特異的インスリン分泌促進剤)とし て有用な物質を得るための簡便なスクリーニング系を構築することができる。また、プ 口モーター配列を用いた本発明のスクリーニング方法は SOCS-2の誘導を抑える糖尿 病治療剤を効率よくスクリーニングすることが可能となる。
本発明のスクリーニング方法により、正常範囲内に血糖をコントロール可能な糖尿 病治療用医薬組成物 (好ましくはインスリン分泌促進用医薬組成物、より好ましくは、 高グルコース濃度下特異的インスリン分泌促進用医薬組成物)を製造することができ る。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。
配列表フリーテキスト
[0061] 以下の配列表の数字見出し < 223 >には、「Artificial Sequence」の説明を記載す
る。配列番号 6〜 15の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー 配列である。