KR20120011667A - 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

당뇨병 치료제의 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120011667A
KR20120011667A KR1020100073670A KR20100073670A KR20120011667A KR 20120011667 A KR20120011667 A KR 20120011667A KR 1020100073670 A KR1020100073670 A KR 1020100073670A KR 20100073670 A KR20100073670 A KR 20100073670A KR 20120011667 A KR20120011667 A KR 20120011667A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
insulin
cells
integer
nbdg
glucose
Prior art date
Application number
KR1020100073670A
Other languages
English (en)
Inventor
다런알윌리엄스
장영태
정다운
Original Assignee
광주과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 광주과학기술원 filed Critical 광주과학기술원
Priority to KR1020100073670A priority Critical patent/KR20120011667A/ko
Priority to EP11812778.6A priority patent/EP2600147B1/en
Priority to PCT/KR2011/005553 priority patent/WO2012015249A2/ko
Priority to US13/702,170 priority patent/US9254290B2/en
Publication of KR20120011667A publication Critical patent/KR20120011667A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/53—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with three nitrogens as the only ring hetero atoms, e.g. chlorazanil, melamine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 다음 단계를 포함하는 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 배지 내 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 배지에 시험물질을 처리하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 결과물에 대사되지 않는 글루코오스 유도체를 처리하는 단계; 및 (d) 상기 세포 내에 유입된 글루코오스 유도체를 측정하는 단계; 상기 시험물질이 상기 글루코오스 유도체의 세포 내 섭취(uptake)를 촉진시키면, 당뇨병 치료제로 판단된다. 본 발명의 방법에 따라 동정된 트리아진계 화합물은 세포 내 글루코오스 섭취를 촉진시키며 세포에서 아팝토시스를 유발시키지 않는다. 따라서, 상술한 트리아진계 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 당뇨병 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

당뇨병 치료제의 스크리닝 방법{Methods for Screening Diabetes Therapeutics}
본 발명은 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
인슐린은 제1형 당뇨병 또는 심각한 제2형 당뇨병의 치료를 위해 개발된 유일한 제제이다1,2. 많은 합성 작은 분자들(예컨대, zinc(II) 복합체 및 바나듐 화합물)은 세포 배양 및 당뇨병의 동물 모델에서 인슐린의 활성을 모방하는 것으로 보여졌다. 한편, 항생제(예: 아니소마이신), 곰팡이 대사산물(예: L-783,281), 식물 추출물[예: 열대지방 다년생 초본식물인 카타란투스 로세우스(Catharanthus roseus)로부터 추출된 잎의 알코올성 추출물] 및 동물 성분[예: 실크 벌레 봄빅스 바트리티카투스(Bombyx Batryticatus)의 건조된 번데기껍질(dried chrysalis)] 같은 많은 천연물들도 세포에서 글루코오스 섭취(glucose uptake)를 촉진시킨다3-6. 하지만, 상술한 화합물 또는 추출물 중 어떠한 것도 당뇨병 치료에서 인슐린을 대체할 수 없었다. 따라서, 인슐린 효과를 모방할 수 있는 신규한 항-당뇨병 제제에 대한 탐구가 필요한 실정이다. 또한, 신규한 인슐린 모방 약제(insulin mimetic agents)의 규명은 당뇨병 및 인슐린 저항성을 초래하는 생화학적 기작에 대한 이해를 증진시키는 새로운 약물 타겟의 발견을 촉진시킬 수 있다.
일반적으로 세포에서 글루코오스 섭취의 측정은 글루코오스 방사선 동위원소를 이용하여 실시되었다. 이들 동위원소들의 높은 시그널 대 잡음 비(high signal to noise ratio)는 글루코오스 이동의 속도론적 연구(kinetic studies)에 유용하다. 하지만, 방사선 폐기물 처분 및 청소와 관련된 불편함과 비용으로 인해, 이들의 이용이 글루코오스 섭취의 신규한 조절인자들을 동정하기 위한 대규모 스크리닝 프로그램에서 제외되는 경향이 있다.
글루코오스 항상성을 연구하기 위해 두 개의 형광물질-태깅된 글루코오스 유사체(analogues)가 유용하다. 글루코오스 트랜스포터 1(GLUT 1)를 연구하기 위해 6-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코오스(6-NBDG)가 1985년에 개발되었다7. 박테리아에서 글루코오스 섭취를 연구하기 위해 2-NBDG가 1996년에 개발되었다8. 2-NBDG 및 6-NBDG의 운명은 세포 내 섭취에 따라 달라진다. 2-NBDG는 당분해 경로에서 헥소키나제에 의해 인산화된 후 비-형광성 산물로 빠르게 분해된다8. 이와 대조적으로, 6-NBDG는 헥소키나제에 의해 인산화되지 않기 때문에 형광성 형태로 세포질에 축적된다.
NBDG 프로브의 특이성에 대한 연구들이 있어왔지만 글루코오스 트랜스포터가 NBDG와 어떻게 상호작용하는 지에 대해서는 상대적으로 거의 알려진 것이 없다. 예를 들어, 글루코오스는 6-NBDG 섭취의 경쟁자로서 기능하지 않기 때문에, 또 다른 세포 내 경로가 NBDG 섭취를 매개할 가능성이 고려되고 있다9. 하지만, 최근 연구는 6-NBDG가 글루코오스 보다 300배 높은 친화성으로 GLUT1과 결합한다는 것을 밝혔는데, 이는 NBDG의 이용과 관련된 속도론적 불일치가 단순히 허울뿐이라는 것을 나타낸다9.
글루코오스 섭취의 신규한 조절자의 스크리닝 및 동정용 NBDG 기반된 프로토콜을 확립하고자, 이전까지 두 가지의 접근방법들이 이용되어 왔다. 유동세포분석법에 기반한 첫 번째 접근방법은 상반된 결과들을 초래하였다. 한 연구 그룹은 인슐린-자극된 6-NBDG 섭취가 인간 단핵구 세포에서 일어났다고 보고하였다10. 이와 반대로, 두 번째 연구 그룹은 간세포주 또는 골격근육세포주에서 인슐린-자극된 6-NBDG 섭취를 검출할 수 없었다11. 형광물질-기반된 마이크로플레이트 판독기 분석에 기반한 두 번째 접근방법을 통해, 설사성 폐독(diarrhetic shellfish poison)인 오카다익산에 의해 유도된 세포독성-관련된 2-NBDG 섭취가 인간 폐 섬유아세포에서 발견되었다12. 하지만, 현재까지 글루코오스 섭취를 조절하는 신규한 화합물을 성공적으로 검출할 수 있는 스크리닝 시스템을 확립하기 위해 NBDG의 이용에 대해 공개된 데이터는 없었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 인슐린 모방 활성을 나타낼 수 있는 신규한 약물을 찾기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 지방전구세포에서 글루코오스 섭취(glucose uptake)를 촉진시키는 화합물을 대량 고속의 방식으로 스크리닝할 수 있는 NBDG-기반된 세포 스크리닝 시스템을 확립하였고, 이러한 스크리닝 시스템을 이용하여 576종의 트리아진계-태깅된 화합물 라이브러리로부터 당뇨병에 효과적인 트리아진계 화합물을 선별하여 이들의 인슐린 모방 활성을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 배지 내 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 배지에 시험물질을 처리하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 결과물에 대사되지 않는 글루코오스 유도체를 처리하는 단계; 및 (d) 상기 세포 내에 유입된 글루코오스 유도체를 측정하는 단계; 상기 시험물질이 상기 글루코오스 유도체의 세포 내 섭취(uptake)를 촉진시키면, 당뇨병 치료제로 판단된다.
본 발명자들은 인슐린 모방 활성을 나타낼 수 있는 신규한 약물을 찾기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 지방전구세포에서 글루코오스 섭취(glucose uptake)를 촉진시키는 화합물을 대량 고속의 방식으로 스크리닝할 수 있는 NBDG-기반된 세포 스크리닝 시스템을 확립하였고, 이러한 스크리닝 시스템을 이용하여 576종의 트리아진계-태깅된 화합물 라이브러리로부터 당뇨병에 효과적인 트리아진계 화합물을 선별하여 이들의 인슐린 모방 활성을 실험적으로 확인하였다.
본 발명은 글루코오스 유도체, 바람직하게는 대사되지 않는 글루코오스 유도체를 이용하여 세포 내 글루코오스 섭취를 측정하여 당뇨병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 화합물을 동정하는 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 배지 내에 세포를 준비한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 보다 바람직하게는 간세포, 근육세포 또는 지방세포이고, 보다 더 바람직하게는 간세포, 근육모세포 또는 지방전구세포이며, 가장 바람직하게는 지방전구세포이다. 본 발명에서 이용되는 지방전구세포는 배아 섬유아세포로, 마우스의 3T3-L1 배아 섬유아세포를 사용하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포는 인슐린의 처리에 의해 인슐린 저항성을 갖는 세포이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (a) 전에 세포를 지방세포로 분화시키는 단계(pre-a)를 추가적으로 포함한다. 상술한 세포를 증식 배지에서 배양시키면서 인슐린 처리에 의해 지방세포로 분화시킨다. 이후, 세포를 인슐린 처리 하에서 추가적인 배양을 실시한다. 본 발명에서 인슐린 처리에 의해 분화가 유도된 후 8일 된 마우스의 3T3-L1 지방세포를 이용하였다.
이어, 배양된 세포에 시험물질을 처리한다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명에서 이용되는 세포의 글루코오스 섭취에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 본 발명에서 이용되는 시험물질은 화합물 라이브러리, 천연물 라이브러리, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA 및 siRNA(small interference RNA)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 시험물질은 화합물 라이브러리를 포함하며, 가장 바람직하게는 태깅된 트리아진계 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리를 포함한다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 시험물질은 576종의 태깅된 트리아진(triazine)계 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리이다.
시험물질을 처리한 후, 배양 배지에 글루코오스 유도체를 처리하여 세포를 배양시킨다. 보다 바람직하게는, 상술한 글루코오스 유도체는 대사되지 않는 글루코오스 유도체이며, 가장 바람직하게는 2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-6-데옥시글루코오스(6-NBDG)다. 6-NBDG는 살아있는 세포에서 글루코오스 섭취 및 이동을 모니터하는 데 이용될 수 있는 형광성 글루코오스 유사체로 세포 내에서 가수분해되지 않는 다음과 같은 구조를 가지는 화합물(C12H14N4O8)이다.
Figure pat00001
6-NBDG는 환경에 민감할 지라도 약 465/540 nm에서 전형적인 여기/발광 스펙트라를 나타내기 때문에, 적절한 광학 필터를 이용하여 현미경 하에서 시각화할 수 있다.
마지막으로, 상술한 세포에서 상기 글루코오스 유도체를 검출한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 글루코오스 유도체의 검출은 형광 측정을 통해 용이하고 간편하게 실시될 수 있다. 이때, 처리된 시험물질에 의해 세포 내 글루코오스 유도체의 섭취가 촉진되면, 상기 시험물질은 당뇨병 치료제로 판단된다.
본 명세서의 용어 “촉진”은 세포 용해물에서 검출되는 형광 검출 시그널의 증가를 의미하며, 보다 바람직하게는 상기 시험물질의 처리에 의해 세포 내로 유입된 글루코오스 유도체로부터 방출되는 형광 시그널의 증가를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 스크리닝 하고자 하는 당뇨병 치료제는 인슐린 저항성에 의한 제2형 당뇨병 치료제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 트리아진계 화합물은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물을 포함한다:
화학식 I
Figure pat00002
상기 화학식에서, R1은 H 또는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이고; R2는 H, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올, -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-10의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬(상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올(상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다) 또는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다)이고; R3, R4, R5 및 R6는 각각 독립적으로, H, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬 알코올, C6-C10 아릴, C7-C16 아랄킬(aralkyl), C7-C16 알카릴(alkaryl), C3-C15 사이클로알킬, C4-C20 알킬사이클로알킬이고; 상기 아랄킬의 아릴기는 C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시 또는 할로겐으로 치환될 수 있고; 상기 알킬사이클로알킬의 고리 탄소는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬에 의해 치환될 수 있고; 그리고 R3 및 R4 또는 R5 및 R6는 서로 연결되어 환형태의 C3-C10 알킬을 이룰 수 있으며, 상기 환형태의 C3-C10 알킬에서 하나의 헤테로원자인 산소 또는 질소를 포함할 수 있고, 상기 헤테로원자는 C6-C10 아릴 또는 할로겐 또는 니트로 치환기를 가지는 C6-C10 아릴에 의해 치환될 수 있다.
본 발명의 유효성분인 트리아진(triazine)계 화합물은 576종의 태깅된 트리아진계 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리(tagged library)로부터 본 발명자들에 의해 확립된 스크리닝 시스템으로부터 인슐린 모방 화합물로서 동정된 화합물이다. 본 발명에서 사용된 트리아진 화합물 라이브러리의 합성방법 및 이의 용도에 대해서는 국제특허출원 공개공보 WO 03/032903 및 WO 03/050237에 설명되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명의 화학식 Ⅰ에서 용어 “C1-C10 알킬아민”은 메틸아민, 에틸아민, n-프로필아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, sec-부틸아민, tert-부틸아민, n-아밀(amyl), tert-아밀 등의 직쇄(straight chain) 또는 가지쇄(branched chain)의 알킬기를 갖는 아민을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “C1-C10 직쇄 또는 가지쇄 알킬”은 메틸아민, 에틸아민, n-프로필아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, sec-부틸아민, tert-부틸아민, n-아밀(amyl), tert-아밀, 헥실 등의 직쇄(straight chain) 또는 가지쇄(branched chain)의 알킬기를 의미한다. 본 명세서에서 화학식 Ⅰ에서 알킬 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 벤질 알코올, 페네틸 알코올 및 이의 유사체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “아릴(aryl)”은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미하며, 바람직하게는 모노아릴 또는 비아릴이다. 아릴기는 페닐기, 치환된 페닐기, 나프틸기, 치환된 나프틸기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 상술한 아릴기 치환(aryl group substituent)은 바람직하게는 적은 수의 알킬 또는 할로겐을 포함한다.
본 명세서의 용어 “아릴기 치환(aryl group substituent)”은 알킬, 사이클로알킬, 사이클로아릴, 아릴, 헤테로아릴을 포함하며, 선택적으로 할로, 할로알킬, 알킬, 아릴아킬, 헤테로아릴아킬, 1-2개의 이중 결합을 포함하는 알케닐, 1-2개의 삼중 결합을 포함하는 알키닐, 하이드록시, 폴리할로알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 포함하고, 바람직하게는 1-3의 치환기를 포함한다. 보다 바람직하게는 아릴기 치환은 C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시 또는 할로겐을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “C1-C5 알콕시(alkoxy)”는 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 “C7-C16 아랄킬(aralkyl)”은 임의의 위치에서 하나 또는 둘 이상의 페닐환으로 치환된 C1-C10 알킬을 의미하며, 예를 들어, 벤질(benzyl), 2-페닐에틸, 3-페닐(n-프로프(prop)-1-일(yl)), 4-페닐(헥(hex)-1-일(yl)), 3-페닐(n-아(am)-2-일(yl)), 3,3-디페닐프로필 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 “C3-C15 사이클로알킬”은 3-15개의 탄소원자로 이루어지는 단일환(mono ring) 또는 다중환(multi rings)의 포화탄화수소를 의미하며, 보다 바람직하게는 3-10개의 탄소원자로 이루어져 있으며, 보다 더 바람직하게는 3-6개의 탄소원자로 이루어져 있고, 예를 들어, 사이클로프로필환, 사이클로부틸환, 사이클로부틸환, 사이클로헥실환, 또는 사이클로헵틸환 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 “C4-C20 알킬사이클로알킬”은 상기 설명된 사이클로알킬에서 알킬로 치환된 4-20개의 탄소원자로 이루어지는 알킬을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “할로겐”은 F, Cl, Br 및 I를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 Ⅰ에서 R1은 H 또는 C1-C2 알킬을 포함하며, 보다 바람직하게는 H를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 Ⅰ에서 R2는 H, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올, -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-10의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬(상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올(상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다) 또는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다)를 포함하고, 보다 바람직하게는, H, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올, -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-5의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-5의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬(상기 q는 0-2의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올(상기 q는 0-2의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-5의 정수이고, 상기 q는 0-2의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-5의 정수이고, 상기 q는 0-2의 정수이다) 또는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-5의 정수이고, 상기 q는 0-2의 정수이다)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 Ⅰ에서 R3 및 R4는 각각 독립적으로, H, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬 알코올, C6-C10 아릴, C7-C16 아랄킬(aralkyl), C7-C16 알카릴(alkaryl), C3-C15 사이클로알킬, C4-C20 알킬사이클로알킬이고; 상기 아랄킬의 아릴기는 C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시 또는 할로겐으로 치환될 수 있고; 상기 알킬사이클로알킬의 고리 탄소는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬에 의해 치환될 수 있고; 그리고 R3 및 R4 또는 R5 및 R6는 서로 연결되어 환형태의 C3-C10 알킬을 이룰 수 있으며, 상기 환형태의 C3-C10 알킬에서 하나의 헤테로원자인 산소 또는 질소를 포함할 수 있고, 상기 헤테로원자는 C6-C10 아릴 또는 할로겐 또는 니트로 치환기를 가지는 C6-C10 아릴에 의해 치환될 수 있으며, 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 H, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬 알코올, C6-C10 아릴, C7-C16 아랄킬(aralkyl), C7-C16 알카릴(alkaryl), C5-C6 사이클로알킬, C7-C10 알킬사이클로알킬이고; 상기 아랄킬의 아릴기는 C1-C3 알킬 또는 할로겐으로 치환될 수 있고; 상기 알킬사이클로알킬의 고리 탄소는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬에 의해 치환될 수 있고; 그리고 R3 및 R4 또는 R5 및 R6는 서로 연결되어 환형태의 C4-C6 알킬을 이룰 수 있으며, 상기 환형태의 C4-C6 알킬에서 하나의 헤테로원자인 산소 또는 질소를 포함할 수 있고, 상기 헤테로원자는 C6-C10 아릴 또는 할로겐 또는 니트로 치환기를 가지는 C6-C10 아릴에 의해 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 트리아진계 화합물은 하기 화학식 1-12로 표시되는 화합물을 포함한다:
[화학식 1]
Figure pat00003
[화학식 2]
Figure pat00004
[화학식 3]
Figure pat00005
[화학식 4]
Figure pat00006
[화학식 5]
Figure pat00007
[화학식 6]
Figure pat00008
[화학식 7]
Figure pat00009
[화학식 8]
Figure pat00010
[화학식 9]
Figure pat00011
[화학식 10]
Figure pat00012
[화학식 11]
Figure pat00013
[화학식 12]
Figure pat00014
상기 화학식 1-12에서, R1은 H 또는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이고; R2는 H, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올, -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-10의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬(상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올(상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다) 또는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다)이다.
보다 바람직하게는, 상기 화학식 1-12로 표시되는 트리아진계 화합물은 하기 화학식 13-24로 표시되는 화합물을 포함한다:
[화학식 13]
[화학식 14]
Figure pat00016
[화학식 15]
Figure pat00017
[화학식 16]
Figure pat00018
[화학식 17]
Figure pat00019
[화학식 18]
Figure pat00020
[화학식 19]
[화학식 20]
Figure pat00022
[화학식 21]
Figure pat00023
[화학식 22]
Figure pat00024
[화학식 23]
Figure pat00025
[화학식 24]
Figure pat00026
가장 바람직하게는, 상기 화학식 1-12로 표시되는 트리아진계 화합물은 하기 화학식 13 또는 14로 표시되는 화합물을 포함한다:
[화학식 13]
Figure pat00027
[화학식 14]
Figure pat00028

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 본 발명의 트리아진계 화합물은 인슐린 모방 활성, 즉 세포 내 글루코오스 섭취(glucose intake)를 촉진시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 본 발명의 트리아진계 화합물은 세포독성 활성을 가지지 않아 세포에서 아팝토시스를 유발시키지 않으며, 항염증 활성을 가진다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 인슐린 모방 활성을 가지는 신규한 트리아진계 화합물에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 트리아진계 화합물은 세포 내 글루코오스 섭취를 촉진시키는 활성을 가진다.
(c) 또한, 본 발명의 트리아진계 화합물은 세포독성을 가지지 않으며 항염증 활성을 나타낸다.
(d) 따라서, 상술한 트리아진계 화합물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 당뇨병 예방 또는 치료 또는 염증성 질환 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1a는 주요한 인슐린 반응성 인체 조직으로부터 유래한 세포주에서 2-NBDG 섭취를 측정한 결과이다. 분화된 3T3-L1 지방세포가 Huh7 간세포, C2C12 근육모세포, C2C12 근관세포 및 3T3-L1 지방전구세포보다 인슐린 및/또는 로지글리타존-자극된 2-NBDG 섭취에 대한 가장 높은 반응성을 나타냈다. 세포를 검은색 96-웰 배양 플레이트에 104 세포/웰의 농도로 분주하였다. 24시간 후, 세포에 로지글리타존을 24시간 동안 처리하였다. 인슐린을 세포에 30분 동안 처리하기 전에, 세포를 혈청-부재 배양배지에서 3시간 동안 배양하였다. * = 3T3-L1 지방전구세포와 비교하여 P < 0.05. 오차 = 표준편차; 데이터 당 96-웰 플레이트 중 다섯 개의 웰. 도 1b는 100 nM 인슐린 또는 인슐린 모방 화합물인 아연 설페이트(250 μM)로 처리한 후 3T3-L1 지방세포에서 6-NBDG 섭취가 2-NBDG 섭취보다 더 크다는 것을 보여주는 결과이다. 오차 = 표준편차; 데이터 당 96-웰 플레이트 중 세 개의 웰. * = 2-NBDG 섭취 단독과 비교하여 P < 0.05; # = 6-NBDG 섭취 단독과 비교하여 P < 0.05. 도 1c는 지방세포에서 6-NBDG 섭취가 인슐린 및 인슐린-민감성 화합물인 로지글리타존에 민감하다는 것을 보여주는 결과이다. Ros = 1 μM 로지글리타존; Ins = 100 nM 인슐린, * = 프로브 없는 결과와 비교하여 P < 0.05; ** = 6-NBDG 단독과 비교하여 P < 0.05; # = 로지글리타존과 비교하여 P < 0.05; ## = 인슐린과 비교하여 P < 0.05. 오차 = 표준편차; 데이터 당 96-웰 플레이트 중 세 개의 웰. 도 1d는 지방세포에서 100 nM 인슐린-자극된 6-NBDG 섭취가 GLUT 억제제인 4,6-EDG 및 사이토칼라신 B(인슐린 자극 전에 3시간 동안 전처리)에 의해 억제된다는 것을 보여주는 결과이다. * = 비처리구와 비교하여 P < 0.05. 오차 = 표준편차; 데이터 당 96-웰 플레이트 중 세 개의 웰. 도 1a-1e의 데이터는 세 개의 독립적인 실험들 중에서 대표적인 결과를 나타낸다.
도 2a는 글루코오스 섭취의 신규한 유도인자(inducers)를 동정하기 위해 이용된 NBDG-기반된 스크리닝 시스템을 도식적으로 나타낸다. 스크리닝 프로토콜은 9 단계로 분할될 수 있다. 도 2b-2e는 576종의 화합물로 구성된 트리아진계-기반된 화합물 라이브러리를 스크리닝하여 동정된 열두 개의 화합물들 각각의 세포내로의 NBDG 섭취 유도 효과를 나타낸다. 도 2f-2i는 트리아진계-기반된 화합물인 AP-III-a4, AP-IV-e3, AP-IV-e4 및 AP-I-h7의 정제된 스톡을 이용하여 재-테스팅한 결과, 이들이 지방세포에서 NBDG 섭취를 촉진한다는 것을 보여준다. 화합물들은 250 μM부터 20 μM까지의 농도 범위에서 테스트되었으며, 인슐린 및 잘 알려진 인슐린 모방 화합물인 아연 설페이트의 효과와 비교되었다. 오차 = 표준편차; 데이터 당 96-웰 플레이트 중 세 개의 웰. * = 비처리구와 비교하여 P < 0.05. 도 2c-2f의 데이터는 세 개의 독립적인 실험들 중에서 대표적인 결과를 나타낸다.
도 3은 6-NBDG-기반된 스크리닝을 통해 동정된, GLUT의 외부표면(exofacial) 및 내부표면(endofacial) 억제제들에 민감한 네 개의 NBDG 섭취 유도인자를 나타낸다. 본 발명의 화합물인 AP-III-a4, AP-IV-e3, AP-IV-e4 및 AP-I-h7의 효과를 잘 알려진 인슐린 모방 화합물인 아연 설페이트와 비교하였다. 오차 = 표준편차; 데이터 당 96-웰 플레이트 중 세 개의 웰. * = 화합물 단독과 비교하여 P < 0.05; ** = 화합물 및 50 mM 4,6-EDG 처리와 비교하여 P < 0.05. 도 3의 데이터는 세 개의 독립적인 실험들 중에서 대표적인 결과를 나타낸다.
도 4a는 5 μM의 AP-IV-e3 또는 AP-IV-e4를 3T3-L1 지방세포에 24시간 동안의 처리하면 아팝토시스가 유도된다는 것을 보여주는 결과로, 이를 세포막 전위 및 인지질 스크램블링에서의 변화에 반응하는 Apo-TRACETM 형광 화합물로 검출하였다. 이와 대조적으로, 화합물 AP-III-a4 및 AP-I-h7은 아팝토시스를 유발하지 않았다. 스타우로스포린 처리(24시간 동안 500 nM 처리)를 아팝토시스 유도에 대한 양성 대조군으로 이용하였다. 도 4b는 3T3-L1 지방세포에서 화합물 AP-IV-e3 또는 AP-IV-e4의 처리(24시간 동안 처리)에 의한 아팝토시스 유도를 형광 마이크로플레이트 판독기로 정량한 결과를 나타낸다. 오차 = 표준편차; 데이터 당 96-웰 플레이트 중 세 개의 웰. * = 비처리구와 비교하여 P < 0.05. 도 4c는 화합물 AP-IV-e3 또는 AP-IV-e4의 24시간 동안 처리에 의해서 3T3-L1 지방세포에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 보여주는 결과이다. 스타우로스포린 처리(24시간 동안 500 nM 처리) 또는 트라이톤 X-100 처리(in PBS; 1시간 동안 0.1% 처리)를 양성 대조군으로 이용하였다. 오차 = 표준편차. * = 비처리구와 비교하여 P < 0.05; ** = 화합물 AP-IV-e3 또는 AP-IV-e4 처리와 비교하여 P < 0.05; # = 화합물 AP-III-a4 및 AP-I-h7 처리와 비교하여 P < 0.05. 도 4의 데이터는 세 개의 독립적인 실험들 중에서 대표적인 결과를 나타낸다.
도 5a는 6-NBDG-기반된 세포 내 스크리닝에 의해 동정된 본 발명의 화합물 AP-III-a4 and AP-I-h7가 인슐린 모방 화합물이라는 것을 나타내는 결과로, 지방세포로부터 10 μM 에피네프린-매개된 FFA 방출을 억제하는 능력을 보여줌으로써 이를 보였다. 잘 알려진 인슐린 모방 화합물로 250 μM의 아연 설페이트, 그리고 5 μM의 AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물을 사용하였다. 100 nM 인슐린을 양성 대조군으로 이용하였다. 오차 = 표준편차. * = 비처리구와 비교하여 P < 0.05; ** = 에피네프린 단독과 비교하여 P < 0.05. 도 5b는 AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물이 처리된 지방세포에서 NBDG 섭취가 인슐린 저항성의 유도에 민감하다는 것을 나타내는 결과이다. 인슐린 저항성 지방세포에서 NBDG 섭취의 감소는 인슐린 처리와 유사한 정도로 관찰되었다. 오차 = 표준편차. * = 동일한 처리구에서 3T3-L1 지방세포와 비교하여 P < 0.05. 도 5c는 10 μM의 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7의 처리한 후, 6-NBDG 섭취가 섬유아세포보다는 지방세포에서 더 많이 일어난다는 것을 보여주는 결과이다. 지방세포는 인슐린-민감성 세포 내 GLUT4를 발현하는 반면에, 공동-배양된 비분화된 3T3-L1 지방전구세포는 섬유아세포-유사 특징을 보여 인슐린에 대한 반응성이 낮다. 이러한 발견은 AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물이 신규한 인슐린 모방체라는 것을 다시 한번 확인시켜준다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험들 중에서 대표적인 결과를 나타낸다.
도 6은 인슐린 모방체 동정을 위해 본 발명의 신규한 6-NBDG-기반된 스크리닝 시스템이 Biovision Inc.(CA, USA)에 의해 제공되는 상업적 효소-기반된 글루코오스 어세이 방법보다 더 효율적으로 실시할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다. 트리아진계-기반된 화합물 라이브러리의 일부(인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7을 포함)를 세 번에 걸쳐서 상술한 효소-기반된 어세이(한번에 96개의 시료를 어세이할 수 있음)를 이용하여 다시 스크리닝하였다. 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7이 3T3-L1 지방세포에서 세포 내 글루코오스 함량 증가를 유도하였다. 오차 = 표준편차. 화합물 라이브러리의 다른 화합물들은 AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물과 동일한 정도로 세포 내 글루코오스 함량 증가를 유도할 수 없었다. 본 발명의 신규한 6-NBDG-기반된 스크리닝 시스템을 이용하여 얻어진 오차의 한도가 상업적 효소-기반된 글루코오스 어세이 방법을 이용하여 얻어진 오차의 한도와 비교한 결과, 더욱 우수하였다.
도 7은 본 발명에서 동정된 신규한 화합물의 활성에서 링커의 효과를 보여주는 결과이다. 본 발명의 트리아진계-기반된 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7의 링커 부위를 다양한 형태로 제작하였다: EM, EO, PR 및 Ph의 순으로 링커의 길이가 짧아진다. 한 화합물 당 총 다섯 가지 화합물의 효과가 비교되었다. 정도의 차이는 있을 지라도, 모든 종류의 화합물 처리에 의해 세포 내로의 글루코오스 유도체 유입이 증가되었다. 오차 = 표준편차.
도 8a는 인간 대동맥 내피세포(human aortic endothelial cells, HAEC)에 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 또는 AP-I-h7의 처리는 고혈당에 의해 유도되는 단핵구 부착을 감소시킨다는 결과를 나타낸다. HAEC를 고혈당(30 mM 글루코오스) 조건에서 5일 동안 배양한 후, THP-1 단핵구를 첨가하기 전에 5 μM의 AP-III-a4 또는 AP-I-h7, 또는 100 nM 인슐린으로 처리하였다. 도 8b는 고혈당 조건에서 HAEC에 대한 단핵구 결합 상에 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 또는 AP-I-h7의 억제 효과를 나타내는 결과로, 광학현미경을 이용한 세포수 카운팅을 통해 정량화하였다. 오차 = 표준편차. * = 정상혈당과 비교하여 P < 0.05; ** = 고혈당과 비교하여 P < 0.05. 도 8c 및 도 8d는 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 또는 AP-I-h7이 고혈당 하의 HAEC에서 VCAM-1의 발현을 감소시킨다는 것을 보여주는 결과이다. VCAM-1 발현의 억제 레벨이 당뇨병에 의한 이차 합병증에 유익한 이차 효능을 가진 것으로 잘 알려진 항-당뇨병 약제인 마그네슘 리토스퍼메이트 B와 비교되었다23. 데이터는 세 개의 독립적인 실험들 중에서 대표적인 결과를 나타낸다. 5 mM 글루코오스 = 정상혈당; 30 mM 글루코오스 = 고혈당(5일 동안 처리); AP-III-a4 = 고혈당(5일 동안 처리) 및 5 μM AP-III-a4로 24시간 동안 처리; AP-I-h7 = 고혈당(5일 동안 처리) 및 5 μM AP-I-h7로 24시간 동안 처리; MLB = 고혈당(5일 동안 처리) 및 50 μM 마그네슘 리토스퍼메이트 B로 48시간 동안 처리.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
시약
2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코오스(2-NBDG) 및 대사되지 않는 2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-6-데옥시글루코오스(6-NBDG)을 Invitrogen(OR, USA)으로부터 구입하였다. 소 췌장으로부터 유래한 인슐린, 아연 설페이트, 4,6-에틸리딘-D-글루코오스(4,6-EDG), 사이토칼라신 B, 에피네프린 및 스타우로스포린을 Sigma-Aldrich(SL, USA)로부터 구입하였다. 로지글리타진(Rosiglitazine)을 Cayman Chemicals(MI, USA)로부터 구입하였다. 인간 종양 괴사인자-알파(TNF-α)를 이주영 교수(School of Life Sciences, Gwangju Institute of Science and Technology)로부터 선물받았다. 글라이세르알데하이드 3 포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH; antibody code 6C5)에 대한 항체를 Abcam(MA, USA)로부터 구입하였다. 혈관세포 부착분자-1(VCAM-1; 항체 번호, sc-13160)에 대한 항체를 전창덕 교수(School of Life Sciences, Gwangju Institute of Science and Technology)로부터 선물받았다.
세포 배양
C2C12 마우스 골격 근육 전구세포(근육모세포), 3T3-L1 마우스 배아 섬유아세포 및 Huh7 인간 간세포 암종을 이현철 교수(Yonsei University College of Medicine, Seoul)로부터 선물받았다. 근육모세포는 10% 소태아혈청(FBS), 50 U/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Invitrogen, OR, USA) 배지로 이루어진 증식 배지에서 유지하였다. 근육모세포를 5% 말 혈청(Sigma-Aldrich, SL, USA), 50 U/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 8일 동안 배양시켜 골격 근육 근관(skeletal muscle myotubes)으로 분화시켰다. 분화 배지를 48시간 마다 신선한 배지로 교체해주었다.
3T3-L1 마우스 배아 섬유아세포는 10% FBS, 50 U/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지로 이루어진 증식 배지에서 유지하였다. 3T3-L1 섬유아세포를 지방세포(adipocytes)로 분화시키기 위해 다음의 단계를 실시하였다: 48시간된 포스트-컨플루언트 세포(0일째로 지정됨)를 10% FBS, 0.5 mM 3-이소뷰틸-1-메틸-크산틴, 2 ㎍/mL 덱사메타손(Sigma-Aldrich, SL, USA), 1 ㎍/mL 인슐린, 50 U/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 2일 동안 배양시켰다. 이후, 상기 세포를 10% FBS 및 1 ㎍/mL 인슐린이 보충된 신선한 DMEM으로 2일 마다 교체하여 배양하였다. 분화 유도 후 8일된 3T3-L1 지방세포를 실험에 사용하였다.
Huh7 인간 간세포는 10% FBS, 50 U/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지로 이루어진 증식 배지에서 유지하였다.
THP-1 인간 단핵구는 0.05 nM 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich, SL, USA), 10% FBS, 50 U/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640 배지(Invitrogen, OR, USA)로 이루어진 증식 배지에서 유지하였다.
인간 대동맥 내피세포는 Cambrex(NJ, USA)로부터 제공받아 EGM-2 성장 키트(EGM-2 bullet kit)가 첨가된 EBM-2 성장 배지에서 배양하였다. THP-1 인간 단핵구세포는 0.05 nM 2-머캅토에탄올, 10% FBS 및 항생제가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 세포를 정상혈당 조건인 5 mM 글루코오스 또는 고혈당 조건인 30 mM 글루코오스를 포함하는 성장 배지에서 배양시켰다.
NBDG 섭취에 기초한 세포-기반 스크리닝 시스템의 확립
NBDG가 신규한 인슐린 모방 화합물을 동정하기 위한 세포-기반된 스크리닝에 매우 적합한 96-웰 플레이트 세포배양 시스템에서 인슐린-자극된 글루코오스 섭취를 검출하는데 이용될 수 있는 지 여부를 테스트하기 위해 세 개의 세포주를 선택하였다. 선택된 세포주들은 각각 인슐린 활성에 민감한 주요 인체 조직형태인 간, 근육 및 지방을 대표하는 Huh7 간세포, C2C12 근육모세포 및 3T3-L1 지방전구세포들이다.
세포를 검은색 96-웰 조직배양 플레이트(BD Falcon, NJ, USA)에 104 세포/웰의 농도로 분주하였다. 증식세포 및 분화세포에서 NBDG 시그널을 비교하기 위해, C2C12 근육모세포 및 3T3-L1 지방전구세포가 각각 근관 및 지방세포로 분화를 거치도록 유도되었다. 10 nM 또는 100 nM 인슐린, 그리고 1 μM 또는 10 μM의 로지글리타존(인슐린-민감성 약제)로 처리된 후, 형광 마이크로플레이트 판독기(SpectraMAX GeminiXS and SoftMax Pro V5 software, Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 NBDG 섭취를 측정하였다. 인슐린을 세포에 처리하기 전에, 세포를 혈청-부재 저농도 글루코오스 배양배지에서 3시간 동안 배양하였다.
이를 바탕으로, 96-웰 배양 플레이트, 분화된 3T3-L1 지방세포 및 20 μM 6-NBDG 처리를 이용하는 본 발명의 스크리닝 프로토콜을 확립하기 위해 상술한 프로토콜을 변형시켰다(참조: 도 2a). 그 결과, 보다 비용-절감적이고 고속 스크리닝 적용에 적합한 스크리닝 프로토콜을 확립하였다.
본 발명의 NBDG-기반된 스크리닝 시스템을 테스트하기 위해, 576종의 트리아진계-기반된 작은 분자들로 이루어진 조합 화합물 라이브러리를 5 μM의 농도에서 스크리닝하였다. 상술한 조합 라이브러리는 장영태 교수(Department of Chemistry, National University of Singapore)로부터 제공받았다.
아팝토시스 또는 괴사의 검출
3T3-L1 지방전구세포를 24-웰 플레이트(BD Falcon, NJ, USA)에서 컨플루언스까지 배양시키고 지방세포로의 분화를 유도하였다. 변형된 세포막 포텐셜 및 인지질 스크램블링에 대해 반응하는 아팝토틱 세포의 지표인 형광 화합물을 이용하는 Apo-TRACETM 아팝토틱 세포 염색 키트(Sigma-Aldrich, SL, USA)를 이용하여 아팝토시스를 검출하였다. 아팝토틱 세포는 MetaMorph 7.5 이미지 캡쳐 소프트웨어(Molecular Devices, CA, USA)가 장착된 UV 조명 현미경(Olympus IX81, Japan)으로 시각화하였다. 이미지를 포토샵 CS4 소프트웨어(Adobe Systems Incorporated, CA, USA)로 얻었다. 세포 용해물의 형광 마이크로플레이트 판독기 분석을 통해 아팝토시스를 정량화하였다.
괴사는 트립판 블루 다이를 제거하는 세포 능력에 관찰하여 검출하였다. 3T3-L1 지방세포를 6-웰 플레이트에서 컨플루언스까지 배양시키고 약물(drugs)을 처리하였다. 이후, 지방세포를 트립신 처리를 통해 수득하여 1 mL PBS에 재현탁하였다. 50 ㎕ 분취액(aliquot)을 동일 용량의 0.4% 트립판 블루 용액(Sigma, SL, USA)으로 염색하였다. 다이를 제거할 수 없는 세포를 괴사세포로 분류하여 혈구 계산기(hemocytometer; Fisher Scientific, USA)로 정량화하였다.
유리 지방산 방출 어세이
이전에 기재된 바와 같이, 지방세포로부터 유리 지방산 방출을 유리 지방산 정량 키트(Biovision, CA, USA)를 이용하여 다음과 같이 측정하였다: 24-웰 플레이트에서 컨플루언스에 도달할 때까지 성장된 3T3-L1 지방전구세포를 혈청-부재 배양 배지에서 3시간 동안 배양시켰다. 이후, 지방세포에 염에 녹여진 10 μM 에피네프린을 처리하여 FFA 방출을 유도시켰다. 에피네프린을 처리하기 10분 전에 목적 약물을 첨가하였다. 세포 용해물을 수득하여 50 ㎕의 유상(organic phase)을 어세이에 이용하였다. 표준 곡선을 제작하기 위해 팔미트산을 이용하였다.
상업적인 글루코오스 함량 어세이
NBDG 섭취에 기초한 본 발명의 새로운 스크리닝 방법의 비교 및 유효성을 위해, 본 발명자들은 Biovision Inc.(CA, USA)에 의해 상업적으로 제공되는 효소-기반된 글루코오스 어세이 방법을 이용하였다. 3T3-L1 지방세포를 5×104 세포/웰의 농도로 96-웰 배양 플레이트에 분주하였다. 24시간 후, 배양 배지를 교체하고 약물 처리 전에 지방세포를 혈청-부재 저농도 글루코오스 DMEM에서 3시간 동안 배양시켰다. 세포를 100 ㎕ 세포 용해 M 용액(Sigma-Aldrich, SL, USA)으로 용해시키고 50 ㎕의 세포 용해물을 어세이에 사용하였다.
단핵구-내피세포 부착 어세이
내피세포 단일층으로 마우스 염증성 복막(IP) 삼출물 대식세포의 부착을 이전에 기술된 바와 같이 실시하였다14. 간략하게는, 내피세포를 6-웰 배양 플레이트에서 컨플루언스에 도달할 때까지 배양시킨 후 고농도 글루코오스(30 mM)를 포함하거나 포함하지 않는 배양 배지에서 약물을 처리하여 48시간 동안 배양시켰다. THP-1 인간 단핵구(2×104 세포/웰)을 단일층에 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 결합되지 않은 세포를 혈청-부재 RPMI-1640 배지로 세 번에 걸쳐서 세척한 후, 총 부착 세포의 수를 웰 당 임의적으로 선택된 네 개의 광학 필드[100× 배율; Olympus microscope CKX41, Japan; 현미경 이미지는 Digi Eye 330 디지털 카메라(Dewinter, India) 및 Biowizard 4.3 소프트웨어(Dewinter,India)로 캡쳐되었음]에서 카운팅하였다. 이미지를 포토샵 CS4 소프트웨어로 얻었다.
웨스턴 블롯 분석
단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하고 0.2 ㎛ 나이트로셀룰로오스 막(Bio-Rad, CA, USA)으로 옮겼다. TINA 2.10e 소프트웨어(Catholic University Medical College(GmBH), Germany)를 이용하여 밀도 계측법을 실시하였다.
데이터의 통계 분석
통계적 유의성을 결정하기 위해 Mann-Whitney U 테스트(TalkStats software; Jelsoft Enterprises Ltd., UK)를 이용하였다. 0.05 이하의 P 값을 유의한 것으로 간주하였다.
실험결과
NBDG는 지방세포에서 인슐린-자극된 글루코오스 섭취, 인슐린-민감성 화합물(insulin sensitizing compounds) 및 제4형 글루코오스 트랜스포터 억제제를 검출하는데 이용될 수 있다.
인슐린-자극된 글루코오스 섭취를 검출함에 있어 NBDG의 이용에 대한 이전 연구는 복합적인 결과들을 양산하였다10,11. 또한, NBDG는 세포-기반된 스크리닝에서 인슐린-민감성 화합물 또는 인슐린 모방 약제를 검출하는 데 아직까지 이용된 적이 없었다. 따라서, 본 발명자들의 첫 번째 실험은 NBDG가 96-웰 플레이트에서 배양된 세포에서 인슐린-자극된 글루코오스 섭취를 검출하는 데 이용될 수 있는 지 여부를 조사하는 것이었다(도 1a). 또한, 인슐린-민감성 화합물인 로지글리타존(rosiglitazone)의 효과도 테스트하였다. 이를 위해, 세 개의 세포주(Huh7 간세포, C2C12 근육모세포 및 3T3-L1 지방전구세포)가 선택되었는데, 이들은 인슐린 활성에 민감한 주요 인체 조직들(예컨대, 간, 근육 및 지방)을 대표한다. 인슐린 처리 후, 3T3-L1 지방세포주에서 2-NBDG 섭취가 매우 증가하였는데, 이는 인슐린이 처리된 Huh7 간세포, C2C12 근육모세포, C2C12 근관세포 및 3T3-L1 지방전구세포에서 보다 더욱 현저하게 증가하였다. 로지글리타존을 24시간 동안 처리한 결과, 3T3-L1 지방세포에서 인슐린-자극된 2-NBDG 섭취의 정도가 증가하였다.
6-NBDG는 2-NBDG의 대사되지 않는 유사체이다. 따라서, 본 발명자들은 3T3-L1 지방세포에서 이들 유사체들의 인슐린-자극된 섭취를 비교하였다(도 1b). 6-NBDG는 2-NBDG보다 더욱 뚜렷한 형광 시그널을 발생시킨다는 것을 확인하였다. 인슐린 모방체인 아연 설페이트(zinc sulfate)를 이용하였을 경우, 유사한 결과가 얻어졌다. 그러므로, 6-NBDG를 이후 연구에서 이용하였다. 또한, 2-NBDG를 이용하여 얻어진 결과와 유사하게도, 6-NBDG 섭취는 인슐린-민감성 화합물인 로지글리타존에 민감하였다(도 1c).
제4형 글루코오스 트랜스포터(GLUT4)는 지방 조직 및 가로무늬근(striated muscle)에서 인슐린-조절성 글루코오스 트랜스포터이다15. 6-NBDG 섭취가 GLUT4의 인슐린-자극된 활성화에 기인되는 지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 GLUT4의 두 개의 억제제인 사이토칼라신 B 및 4,6-에틸리딘-D-글루코오스(4,6-EDG)의 효과를 테스트하였다. GLUT4의 억제제들은 모두 6-NBDG의 인슐린-자극된 섭취를 감소시켰다(도 1d-1e).
신규한 인슐린 모방체(insulin mimetics)를 동정하기 위한 세포-기반된 스크리닝 시스템의 개발 및 이용
도 1a-1e의 결과들은 3T3-L1 지방세포에서 6-NBDG 섭취가 인슐린, 인슐린 모방체, 인슐린-민감성 화합물 및 제4형 글루코오스 트랜스포터 억제제들에 민감하다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 96-웰 플레이트에서 배양된 3T3-L1 지방세포에서 20 μM 6-NBDG의 섭취를 검출하는 마이크로플레이트 판독기를 이용하는 신규한 인슐린 모방체에 대한 새로운 스크리닝 프로토콜을 개발하였다(도 2a). 상술한 스크리닝 프로토콜이 신규한 인슐린 모방 화합물을 검출할 수 있는 지 여부를 테스트하기 위해, 576종의 트리아진계-기반된 작은 분자들의 조합 화합물 라이브러리(combinatorial chemical library)가 스크리닝되었다. 트리아진계 화합물이 생물학적 시스템에서 활성이 높은 퓨린 및 피리미딘과 구조적으로 유사하기 때문에, 트리아진계 화합물 라이브러리가 선택되었다(예를 들어, 트리아졸로피리미딘(8-아자퓨린)은 암 및 바이러스 화학치료법에 적용되고 있다16). 6-NBDG 섭취를 현저하게 증가(처리되지 않은 지방세포와 비교하여 25% 이상 증가)시키는 열두 개의 ‘히트’ 화합물이 발견되었다. 정제된 화합물의 추가적인 테스팅을 통해, ‘히트’ 화합물 중 네 가지(AP-III-a4, AP-IV-e3, AP-IV-e4 및 AP-I-h7으로 명명됨)가 지방세포에서 NBDG 섭취를 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다(도 2f-2i).
이들 히트 화합물이 지방세포에서 NBDG 섭취를 증가시킬 수 있는 지를 더욱 더 확증하기 위해, GLUT4 억제제들인 사이토칼라신 B 및 4,6-EDG의 효과를 테스트하였다. 두 GLUT4 억제제의 처리는 NBDG 섭취를 잘 알려진 인슐린 모방체인 아연 설페이트와 유사하게 감소시켰다(도 3).
NBDG-기반된 스크리닝에 의해 동정된 ‘히트’ 화합물이 진정한 인슐린 모방 약제인 지를 확인하기 위한 추가적인 분석
인슐린 모방 약제를 발견하기 위해 개발한 본 발명자들의 NBDG-기반된 스크리닝 시스템을 통해, 576종의 트리아진계-기반된 작은 분자들의 조합 화합물 라이브러리로부터 네 가지의 화합물을 동정하였다(도 2). 하지만, 많은 세포 내 기작들이 인슐린에 독립적으로 글루코오스 섭취를 유발할 수 있으며, 세포 스트레스 및 아팝토시스에 의해 유도되는 글루코오스 섭취가 한 예라 할 수 있다17. 따라서, 본 발명자들은 상술한 네 가지 ‘히트’ 화합물인 AP-III-a4, AP-IV-e3, AP-IV-e4 및 AP-I-h7을 지방세포에 처리한 후 세포독성을 조사하였다. 상술한 히트 화합물들 중 두 개(AP-IV-e3 및 AP-IV-e4)가 지방세포에서 아팝토시스를 유발한다는 것을 확인하였다(도 4a-4b). 또한, 트립판 블루 다이의 세포 내 제거를 통해 측정된 바와 같이, AP-IV-e3 및 AP-IV-e4 화합물이 세포 사멸(cell death)을 유도하였다(도 4c). 그러므로, AP-IV-e3 및 AP-IV-e4 화합물이 이후 연구에서 제외되었다.
인슐린 모방 화합물 후보를 입증하기 위한 전통적인 테스트 방법은 지방세포로부터 에피네프린-자극된 유리 지방산의 방출을 억제시키는 것이다2,18. 인슐린 모방 화합물 후보인 AP-III-a4 및 AP-I-h7은 3T3-L1 지방세포로부터 에피네프린-자극된 유리 지방산의 방출을 억제할 수 있었는데(도 5a), 이는 두 개의 트리아진계-기반된 작은 분자들이 인슐린 모방체의 신규한 화합물 클래스라는 것을 의미한다. 지중해 연안지방 허브인 개박하(white catnip; Teucrium cubense Jacq)로부터 추출한 수용성 추출물의 최근 연구19에서와 같이, 상술한 신규한 인슐린 모방체들의 추가적인 테스트로서 지방세포에서 인슐린 저항성에 대한 그들의 민감도를 조사하는 것은 흥미로운 일이다. TNF-α의 존재 하에서 장기간 배양함에 따라 인슐린 저항성이 부여된 지방세포20를 이용한 결과, AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물에 의해 유도된 NBDG 섭취는 인슐린 저항성에 민감한 것으로 보여졌다(도 5b). 이러한 결과는 AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물이 신규한 인슐린 모방체라는 것을 의미한다. 지방세포는 지방전구세포로부터 분화하는 동안 GLUT4의 발현을 증가시키기 때문에 인슐린-자극된 글루코오스 섭취에 민감하다21. AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물이 처리된 지방세포 및 지방전구세포의 혼합 배양에서 NBDG 섭취의 형광현미경 분석을 통해, NBDG가 지방세포에서 더욱 더 흡수된다는 것을 확인할 수 있었다(도 5c). 이러한 결과는 AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물이 인슐린과 유사한 생화학적 기작을 통해 글루코오스 섭취를 자극한다는 것을 나타내는 것이다.
상업화된 글루코오스 함량 어세이(glucose content assay)를 통한 6-NBDG-기반된 스크리닝 데이터의 비교
신규한 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7을 동정하는 데 이용된 신규한 NBDG 스크리닝 시스템의 유효성을 검증하기 위해, 글루코오스 함량의 상업적 효소-기반된 어세이(Biovision, CA, USA)를 이용하여 스크리닝 결과들을 비교하였다. 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7을 포함하는 트리아진계-기반된 조합 라이브러리의 일부를 상술한 효소-기반된 어세이를 이용하여 다시 스크리닝하였다(도 6). 지방세포에 인슐린 또는 본 발명의 신규한 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7의 처리는 세포 내 글루코오스 함량 증가를 유도하였다: 이 결과는 본 발명자들의 6-NBDG-기반된 스크리닝 프로토콜이 신규한 인슐린 모방체를 동정하는데 유효하다는 것을 나타낸다. 또한, 상응하는 6-NBDG-기반된 스크리닝 데이터는 효소-기반된 어세이 데이터보다 더욱 정확한 것으로 나타났다: 라이브러리 화합물들 간의 표준편차가 더 작았으며 ‘히트’ 화합물로부터 검출된 시그널이 현저하게 높았다.
한편, 신규한 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7의 효과를 나타내는 부위를 보다 더 자세하게 확인하기 위해, 각 화합물의 링커 부위를 네 개의 형태로 제조하여 지방세포에서 세포 내 글루코오스 함량의 변화를 측정하였다(도 7). 그 결과, 화학식 I로 표시되는 트리아진계 화합물 만으로도 세포 내 글루코오스 함량의 증가를 유도함을 확인할 수 있었다.
신규한 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7은 추가적인 항-염증 효과를 유도한다
당뇨병에 대한 새로운 치료법의 개발 분야에서의 현재 연구는 고혈당 환경에서 세포 기능 상 보조적이고 유익한 이차 효과를 발생시키는 제제에 초점이 맞추어져 있다22,23. 따라서, 본 발명자들은 동맥경화증과 같은 당뇨병의 이차 합병증의 발생에서 핵심적인 단계인 단핵구-내피세포 부착 상에 신규한 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7의 효과를 측정하였다24. 인간 대동맥 내피세포에 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7의 처리는 고혈당 조건에서 단핵구 부착을 감소시켰다(도 8a-8b). 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1)는 단핵구-내피세포 부착을 매개하는 핵심 세포 수용체이다25. 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7는 고혈당 조건에서 배양된 인간 대동맥 내피세포에서 VCAM-1의 상향조절(upregulation)을 감소시켰다(도 8c). 인슐린은 내피세포에서 부착 분자 발현을 억제하지 않았다26. 본 발명의 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7의 VCAM-1 발현 억제 효과는 매우 잘 알려진 유익한 이차 효능을 가진 항-당뇨병 약제로 자연 산물인 마그네슘 리토스퍼메이트 B(MLB)23의 효과와 비교하였다. 상술한 결과들은 본 발명의 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7이 강력한 항-당뇨병 치료제로서 향후 보다 폭넓은 연구를 위한 매우 흥미로운 후보라는 것을 제시한다.
추가논의사항
당뇨병으로 고통 받는 사람들의 수가 증가하고 있는 상황이기 때문에, 당뇨병 기작을 이해하기 위한 새로운 치료제 또는 프로브 개발에 이용될 수 있는 신규한 인슐린 모방체를 동정하기 위해 효율적이고 비용-절감적인(cost-effective) 안전한 스크리닝 프로토콜이 요구되고 있다. 처음에 2-NBDG 및 6-NBDG는 살아있는 세포에서 글루코오스 섭취를 모니터하기 위한 형광 프로브 및 GLUT1 수용체 카이네틱스의 연구를 위한 형광 프로브로서 각각 개발되었다7,8. 글루코오스 섭취를 모니터하기 위한 연구 커뮤니티에 의해 NBDG의 용도가 점차 증가하고 있다. PubMed 조사(U.S. National Library of Medicine National Institutes of Health)에 따르면, 1985년 이래로 NBDG에 대한 54개의 히트가 검색되었으며, 이중 10개의 히트는 2009/2010년에 검색되었다. 하지만, NBDG를 이용한 최근 연구들은 당뇨병-관련 연구보다는 암세포에서 해당과정의 모니터링에 더욱 더 집중되고 있다27,28.
본 연구 논문에서 제시된 본 발명자들의 데이터는 NBDG가 세포-기반된 스크리닝을 이용하여 신규한 인슐린 모방 화합물 후보를 빠르게 동정하는데 이용될 수 있다는 것을 보여준다. 상술한 목적으로 NBDG를 이용하고자 시도했던 이전 연구들은 복잡한 결과들을 보여줬으며, 현재까지 NBDG를 이용하여 발견된 신규한 인슐린 모방체에 대해 기술하고 있는 어떠한 공개된 보고도 없다. 비록 간 및 골격근육이 인체에서 인슐린의 주된 타겟일 지라도, 본 발명자들의 NBDG-기반된 새로운 스크리닝 시스템은 간세포 또는 분화된 근육 융합체(muscle syncytia)보다 인슐린-민감성 NBDG 섭취에 보다 민감한 것으로 알려진 3T3-L1 지방세포에 기초한다(도 1a). 비록 분화된 지방세포 및 분화된 골격 근육세포 모두에서 분화과정 동안 GLUT4의 발현이 증가할 지라도, 본 발명의 발견은 방사선-표지된 글루코오스의 섭취가 분화된 지방세포와 비교하여 분화된 골격 근육세포 배양에서 약 5배 더 낮다는 이전 보고29와 일치한다. 또한, 본 발명의 결과는, 비록 GLUT4의 발현 레벨이 지방세포보다 단핵구에서 낮을 지라도, NBDG가 단핵구에서 인슐린-자극된 글루코오스 섭취를 검출하기 위해 이용될 수 있다는 이전 보고10와 대비를 이룬다. 하지만, 세포유동분석법이 단핵구에서 글루코오스 섭취를 분석하는 데 이용된 반면에, 본 발명자들의 스크리닝 연구는 세포유동분석법과 비교하여 실험적용이성을 지닌 형광 마이크로플레이트 판독기로 실시하였다. 더 나아가, 세포유동분석법을 이용한 NBDG 섭취에 대한 다른 연구들은 간세포 또는 골격 근육세포 배양에서 인슐린-자극된 글루코오스 섭취를 검출하는 데 실패하였다11.
NBDG의 두 개의 유사체들인 2-NBDG 및 6-NBDG가 본 연구에서 비교되었으며, 본 발명자들의 스크리닝 프로토콜을 이용한 경우 6-NBDG가 보다 강력한 형광 시그널을 나타냈다(도 1b). 이러한 결과는 세포 내 섭취에 있어서 NBDG의 대사적 운명과 일치한다. 2-NBDG는 당분해 경로에 유입되어 형광성 c-6 포스포-유도체인 2-NBDG 6-포스페이트로 전환되어 비-형광성 산물로 분해된다8,12. 이와 대조적으로, 6-NBDG는 대사되지 않는(non-metabolizable) 형태로 이를 통해 본 발명자들의 스크리닝 프로토콜에서 더 강한 형광 시그널을 발생시키는 이유를 설명할 수 있다. 또한, 이러한 6-NBDG의 대사되지 않는 특징을 이용하여 본 발명자들은 스크리닝을 위해 필요한 처리농도를 100 μM(전형적으로 이용되는 농도)에서 20 μM로 감소시킬 수 있었으며, 이는 본 발명자들의 스크리닝 어세이 방법의 비용-절감성(cost-effectiveness)을 증가시킨다. 더욱이, 본 발명자들의 신규한 NBDG-기반된 어세이 방법은 통상적으로 처방되는 로지글리타존 같은 인슐린-민강성 약물 및 사이토칼라신 B 및 4,6-EDG 같은 알려진 GLUT4 억제제들에 민감하였는데(도 1c-1d), 이는 신규한 인슐린 모방체를 검출하기 위한 수단으로서 본 발명자들의 스크리닝 어세이 방법을 유효화시킨다. 매우 최근 연구들은 외부표면(exofacial) GLUT 억제제인 4,6-EDG가 NBDG 섭취를 억제하는 데 이용될 수 있다는 것을 다음과 같은 이유로 제시해주고 있다: NBDG 카이네틱 연구는 유리 글루코오스에 비해 GLUT에 대한 약 100배 높은 친화도를 나타내고, 또 한편으로 GLUT를 통한 NBDG의 패시지는 유리 글루코오스에 비해 감소된다는 것이 확인되었다9. 하지만, 본 발명자들의 스크리닝 시스템은 사이토칼라신 B[내부표면(endofacial) GLUT 억제제] 억제에 대한 민감성도 나타내는데, 이는 사이토칼라신 B가 본 발명자들의 어세이 방법의 시간경과(time-course)에 따라 세포로 유입되는 NBDG의 패시지를 효과적으로 억제할 수 있기 때문일 것이다. NBDG 섭취를 억제하기 위해 본 연구에서 이용된 4,6-EDG 및 사이토칼라신 B의 농도는 NBDG 카이네틱스 유효성에 대한 이전 보고와 일치한다9.
576종의 트리아진계-기반된 작은 분자들로 이루어진 조합 화합물 라이브러리의 스크리닝을 통해, 본 발명자들은 처리되지 않은 지방세포와 비교하여 6-NBDG 섭취가 25% 이상 증가시키는 열두 개의 ‘히트’ 화합물을 동정하였다. 이는 소수점 이하 세 자리까지인 2.083%의 히트 비에 해당한다. 가상적인 히트(putative hits)의 재-테스팅은 화합물 라이브러리로부터 네 개의 화합물이 NBDG 섭취를 유도할 수 있다는 것을 확인시켜 주었는데, 이는 0.694%의 화합물이 GLUT4 억제제에 반응하는 ‘히트’라는 것을 의미한다(도 2b-2f 및 도 3). 이러한 히트 비는 향후 연구에서 과도한 수의 거짓 양성(false positive) ‘히트’의 발생 없이 충분한 히트 화합물이 검출되는 범위에 해당하기 때문에 유용하다.
신규한 인슐린 모방체를 동정하기 위한 스크리닝 시스템에 존재하는 잠재적 문제점은 인슐린과 독립적으로 글루코오스 섭취를 유도할 수 있는 또 다른 세포 내 기작(예컨대, 세포 스트레스 및 아팝토시스)의 영향17으로 발생한다. 따라서, 본 발명자들은 히트 화합물이 아팝토시스 또는 괴사를 유도하지 않는다는 것을 확인하기 위한 추가적인 테스트를 실시하였다. 네 개의 히트 화합물 중 두 개가 아팝토시스를 유도하여 이후 연구에서 제외되었다. 그러므로, 본 발명자들은 히트 화합물의 분석에서 세포독성이 가장 먼저 조사되어야 한다고 추천한다. 또한, 세포독성 테스팅은 인슐린 모방 화합물 후보가 치료효능을 가지는 지 여부를 결정하는 데 매우 유익할 것이다.
이러한 신규한 NBDG-기반된 세포 내 스크리닝 시스템을 유효화하기 위해 이용된 화합물 라이브러리를 통해 본 발명자들은 트리아진계 분자 스캐폴드에 기반된 두 개의 신규한 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7을 발견하였다. 이들 화합물들(scaffold)은 생물학적 시스템에서 활성을 지니는 퓨린 및 피리미딘[예를 들어, 트리아졸로피리미딘(8-아자퓨린)은 암 및 바이러스 화학치료법에 적용되고 있다16]과 구조적으로 유사성을 가진다. 본 발명자들과 다른 연구 그룹들은 상술한 화합물 라이브러리의 스크리닝이 F1F0 ATPase의 억제제들 및 마이토콘드리아 샤페론인 프로히비틴 같은 다른 흥미로운 화합물들을 동정할 수 있다는 것을 보였다30,31. 상기 라이브러리로부터 동정된 AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물은 지방세포로부터 에피네프린-매개된 FFA 방출을 억제하는 능력을 보임으로써 진정한 인슐린 모방체라는 것을 나타냈다: 널리 연구된 인슐린 모방체인 아연 설페이트와 유사한 정도로 에피네프린-매개된 FFA 방출을 억제하는 능력을 나타낸다(도 5a). 이러한 테스트는 인슐린 모방 활성을 확인하는 표준 실험 방법2,18이고, 본 발명자들은 TNF-α-유도된 인슐린 저항성에 대한 AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물의 민감성을 테스트함으로써 이들이 진정한 인슐린 모방 약제라는 것을 추가적으로 확인하였다(도 5b). 본 발명자들의 결과는 지방세포에서 인슐린 모방 활성을 나타내는데 필요한 AP-III-a4 및 AP-I-h7 화합물의 농도가 널리 연구된 합성 인슐린 모방체인 아연(II) 복합체들 및 바나듐 화합물보다 현저하게 낮기(합성 인슐린 모방체의 농도가 250 μM-500 μM2,18의 범위이지만 본 발명의 화합물의 농도는 5 μM) 때문에 매우 바람직하다. 또한, 당뇨병을 치료하기 위한 잠재적인 신규 약제에 대한 현재의 연구의 초점은 세포 내 항산화 반응 경로의 활성화 또는 항-염증 효과 같은 고혈당에 민감한 세포에 유익한 이차 효과를 발생시킬 수 있는 약제의 동정으로 옮겨가고 있다23,32. 본 발명의 신규한 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7이 고혈당 조건에서 내피세포에 단핵구의 부착을 억제시키고 내피세포에서 고혈당-자극된 VCAM-1 발현의 상향조절을 억제시키는 능력을 가진다는 것을 보임으로써, 본 발명자들은 본 발명의 신규한 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7이 항-염증 활성을 가진다는 것을 보였다(도 8). 증가된 단핵구-내피세포 부착 및 VCAM-1 상향조절은 당뇨병-관련된 동맥경화증의 중요한 전구체(precursors)이다24,25. 이전 보고에 따르면, 인슐린 처리는 단핵구-내피세포 부착에 어떠한 억제 효과도 나타내지 않았다26. 따라서, 본 발명의 신규한 인슐린 모방 화합물인 AP-III-a4 및 AP-I-h7은 쇠약하게 만드는 당뇨병-관련된 합병증의 진행을 약화시킬 뿐 아니라 당뇨병에서 인슐린 결핍을 직접적으로 치료할 수 있는 약제로서 이후 연구에서 아주 매력적인 후보 화합물이다.
요약하면, 본 발명자들은 신규한 인슐린 모방 약제를 동정할 수 있는 NBDG 섭취에 기반된 새로운 스크리닝 시스템을 개발하였다. 본 발명의 스크리닝 시스템은 글루코오스 함량에 대한 상업적인 어세이 방법보다 더 정확하게 실시할 수 있을 뿐 아니라, 편리하고 비용-절감적이며 빠르게 실시할 수 있다(도 6). 본 발명자들은 576종의 트리아진계-기반된 작은 분자들로 이루어진 잘-알려진 화합물 라이브러리를 스크리닝하여 두 개의 신규한 인슐린 모방 화합물을 동정하였다. 상술한 결과들은 새로운 항-당뇨병 약제를 동정하기 위한 NBDG-기반된 스크리닝 시스템의 개발을 확인시켜 준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고문헌
1. G. E. Umpierrez, A. Palacio and D. Smiley, Am J Med, 2007, 120, 563-567.
2. M. Nishide, Y. Yoshikawa, E. U. Yoshikawa, K. Matsumoto, H. Sakurai and N. M. Kajiwara, Chem Pharm Bull (Tokyo), 2008, 56, 1181-1183.
3. B. Zhang, G. Salituro, D. Szalkowski, Z. Li, Y. Zhang, I. Royo, D. Vilella, M. T. Diez, F. Pelaez, C. Ruby, R. L. Kendall, X. Mao, P. Griffin, J. Calaycay, J. R. Zierath, J. V. Heck, R. G. Smith and D. E. Moller, Science, 1999, 284, 974-977.
4. W. L. Li, H. C. Zheng, J. Bukuru and N. De Kimpe, J Ethnopharmacol, 2004, 92, 1-21.
5. N. Malviya, S. Jain and S. Malviya, Acta Pol Pharm, 2010, 67, 113-118.
6. L. F. Barros, M. Young, J. Saklatvala and S. A. Baldwin, J Physiol, 1997, 504(Pt3), 517-525.
7. L. Speizer, R. Haugland and H. Kutchai, Biochim Biophys Acta, 1985, 815, 75-84.
8. K. Yoshioka, H. Takahashi, T. Homma, M. Saito, K. B. Oh, Y. Nemoto and H. Matsuoka, Biochim Biophys Acta, 1996, 1289, 5-9.
9. L. F. Barros, C. X. Bittner, A. Loaiza, I. Ruminot, V. Larenas, H. Moldenhauer, C. Oyarzun and M. Alvarez, J Neurochem, 2009, 109 Suppl1, 94-100.
10. G. Dimitriadis, E. Maratou, E. Boutati, K. Psarra, C. Papasteriades and S. A. Raptis, Cytometry A, 2005, 64, 27-33.
11. C. Zou, Y. Wang and Z. Shen, J Biochem Biophys Methods, 2005, 64, 207-215.
12. F. Leira, M. C. Louzao, J. M. Vieites, L. M. Botana and M. R. Vieytes, Toxicol In Vitro, 2002, 16, 267-273.
13. M. Nakai, F. Sekiguchi, M. Obata, C. Ohtsuki, Y. Adachi, H. Sakurai, C. Orvig, D. Rehder and S. Yano, J Inorg Biochem, 2005, 99, 1275-1282.
14. J. Kim, K. H. Nam, S. O. Kim, J. H. Choi, H. C. Kim, S. D. Yang, J. H. Kang, Y. H. Ryu, G. T. Oh and S. E. Yoo, FASEB J, 2004, 18, 714-716.
15. D. E. James, M. Strube and M. Mueckler, Nature, 1989, 338, 83-87.
16. W. B. Parker, J. A. Secrist, 3rd and W. R. Waud, Curr Opin Investig Drugs, 2004, 5, 592-596.
17. S. A. Baldwin, L. F. Barros, M. Griffiths, J. Ingram, E. C. Robbins, A. J. Streets and J. Saklatvala, Biochem Soc Trans, 1997, 25, 954-958.
18. K. Kawabe, Y. Yoshikawa, Y. Adachi and H. Sakurai, Life Sci, 2006, 78, 2860-2866.
19. A. J. Alonso-Castro, R. Zapata-Bustos, J. Romo-Yanez, P. Camarillo-Ledesma, M. Gomez-Sanchez and L. A. Salazar-Olivo, J Ethnopharmacol, 2010, 127, 1-6.
20. G. S. Hotamisligil, D. L. Murray, L. N. Choy and B. M. Spiegelman, Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91, 4854-4858.
21. A. Garcia de Herreros and M. J. Birnbaum, J Biol Chem, 1989, 264, 19994-19999.
22. G. E. Mann, B. Bonacasa, T. Ishii and R. C. Siow, Curr Opin Pharmacol, 2009, 9, 139-145.
23. S. H. Kim, M. Choi, Y. Lee, Y. O. Kim, D. S. Ahn, Y. H. Kim, E. S. Kang, E. J. Lee, M. Jung, J. W. Cho, D. R. Williams and H. C. Lee, Cardiovasc Res 2010, DOI 10.1093/cvr/cvq089.
24. R. J. Esper, J. O. Vilarino, R. A. Machado and A. Paragano, Adv Cardiol, 2008, 45, 17-43.
25. K. Yonekawa and J. M. Harlan, J Leukoc Biol, 2005, 77, 129-140.
26. G. Li, E. J. Barrett, S. H. Ko, W. Cao and Z. Liu, Endocrinology, 2009, 150, 3475-3482.
27. S. R. Millon, J. H. Ostrander, J. Q. Brown, A. Raheja, V. L. Seewaldt and N. Ramanujam, Breast Cancer Res Treat, 2010, DOI:10.1007/s10549-010-0884-1.
28. N. Nitin, A. L. Carlson, T. Muldoon, A. K. El-Naggar, A. Gillenwater and R. Richards-Kortum, Int J Cancer, 2009, 124, 2634-2642.
29. A. Ueyama, K. L. Yaworsky, Q. Wang, Y. Ebina and A. Klip, Am J Physiol, 1999, 277, E572-578.
30. D. Williams, D. W. Jung, S. M. Khersonsky, N. Heidary, Y. T. Chang and S. J. Orlow, Chem Biol, 2004, 11, 1251-1259.
31. J. R. Snyder, A. Hall, L. Ni-Komatsu, S. M. Khersonsky, Y. T. Chang and S. J. Orlow, Chem Biol, 2005, 12, 477-484.
32. R. Kleemann, L. Verschuren, B. J. de Rooij, J. Lindeman, M. M. de Maat, A. J. Szalai, H. M. Princen and T. Kooistra, Blood, 2004, 103, 4188-4194.

Claims (9)

  1. 다음 단계를 포함하는 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 배지 내 세포를 준비하는 단계;
    (b) 상기 배지에 시험물질을 처리하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 결과물에 대사되지 않는 글루코오스 유도체를 처리하는 단계; 및
    (d) 상기 세포 내에 유입된 글루코오스 유도체를 측정하는 단계; 상기 시험물질이 상기 글루코오스 유도체의 세포 내 섭취(uptake)를 촉진시키면, 당뇨병 치료제로 판단된다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 간 세포, 근육 세포 또는 지방세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 세포는 지방세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 세포는 인슐린의 처리에 의해 인슐린 저항성을 갖는 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 스크리닝 하고자 하는 당뇨병 치료제는 인슐린 저항성에 의한 제2형 당뇨병 치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 대사되지 않는 글루코오스 유도체는 2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-6-데옥시글루코오스(6-NBDG)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 측정은 형광 측정을 통해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 트리아진(triazine)계 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 트리아진계 화합물은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    화학식 I
    Figure pat00029

    상기 화학식에서, R1은 H 또는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이고; R2는 H, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올, -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-10의 정수이다), -[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬(상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-C1-5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올(상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-NH2(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다), -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-CH3(상기 m 및 n은 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다) 또는 -(CH2)q-(CONH)-[(CH2)m-O]n-(CH2)p-CH3(상기 m, n 및 p는 각각 1-10의 정수이고, 상기 q는 0-5의 정수이다)이고; R3, R4, R5 및 R6는 각각 독립적으로, H, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C1-C10 직쇄 또는 가지쇄의 알킬 알코올, C6-C10 아릴, C7-C16 아랄킬(aralkyl), C7-C16 알카릴(alkaryl), C3-C15 사이클로알킬, C4-C20 알킬사이클로알킬이고; 상기 아랄킬의 아릴기는 C1-C5 알킬, C1-C5 알콕시 또는 할로겐으로 치환될 수 있고; 상기 알킬사이클로알킬의 고리 탄소는 C1-C5 직쇄 또는 가지쇄의 알킬에 의해 치환될 수 있고; 그리고 R3 및 R4 또는 R5 및 R6는 서로 연결되어 환형태의 C3-C10 알킬을 이룰 수 있으며, 상기 환형태의 C3-C10 알킬에서 하나의 헤테로원자인 산소 또는 질소를 포함할 수 있고, 상기 헤테로원자는 C6-C10 아릴 또는 할로겐 또는 니트로 치환기를 가지는 C6-C10 아릴에 의해 치환될 수 있다.
KR1020100073670A 2010-07-29 2010-07-29 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법 KR20120011667A (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100073670A KR20120011667A (ko) 2010-07-29 2010-07-29 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법
EP11812778.6A EP2600147B1 (en) 2010-07-29 2011-07-28 Method for screening diabetes treating agent
PCT/KR2011/005553 WO2012015249A2 (ko) 2010-07-29 2011-07-28 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법
US13/702,170 US9254290B2 (en) 2010-07-29 2011-07-28 Method for screening diabetes treating agent

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100073670A KR20120011667A (ko) 2010-07-29 2010-07-29 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120142174A Division KR101271218B1 (ko) 2012-12-07 2012-12-07 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120011667A true KR20120011667A (ko) 2012-02-08

Family

ID=45530614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100073670A KR20120011667A (ko) 2010-07-29 2010-07-29 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9254290B2 (ko)
EP (1) EP2600147B1 (ko)
KR (1) KR20120011667A (ko)
WO (1) WO2012015249A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018147642A1 (ko) * 2017-02-07 2018-08-16 광주과학기술원 Enoblock을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101472083B1 (ko) * 2012-10-22 2014-12-16 광주과학기술원 ＥＮＯｂｌｏｃｋ을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
KR101472085B1 (ko) 2013-05-20 2014-12-16 광주과학기술원 당뇨병 치료제의 제브라피시-기반된 스크리닝 방법
JP2016041029A (ja) * 2014-08-15 2016-03-31 美佳子 斉藤 多層化筋管を用いた物質の取り込みを刺激する候補物質のスクリーニング方法
CN115364096B (zh) * 2021-05-19 2024-04-05 同济大学 一种改善Wolfram综合征中胰岛β细胞凋亡情况的药物

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006135A1 (en) * 1988-01-11 1989-07-13 Amylin Corporation Treatment of type 2 diabetes mellitus
US5266561A (en) 1988-01-11 1993-11-30 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of type 2 diabetes mellitus
US7173032B2 (en) * 2001-09-21 2007-02-06 Reddy Us Therapeutics, Inc. Methods and compositions of novel triazine compounds
EP1441683A4 (en) 2001-10-12 2005-10-26 Univ New York TRISUBSTITUTED TRIAZINE COMPOUNDS WITH ANTI-TUBULIN ACTIVITY, METHODS OF MAKING AND USING SAME
US20030166002A1 (en) 2001-12-12 2003-09-04 Young-Tae Chang Triazine library with linkers
JP2005312364A (ja) * 2004-04-28 2005-11-10 Mitsuo Itakura 糖尿病治療剤スクリーニング方法
US7592451B2 (en) * 2005-06-23 2009-09-22 New York University Treatment for diabetes and obesity as well as method of screening compounds useful for such treatments
FR2896159B1 (fr) 2006-01-13 2008-09-12 Merck Sante Soc Par Actions Si Combinaison de derives de triazine et d'agents sensibilisateurs a l'insuline.
KR100874761B1 (ko) * 2007-03-26 2008-12-19 재단법인서울대학교산학협력재단 형광염료로 표지된 글루코스 유사체, 이의 합성방법 및 그 용도
EP2197858B1 (en) * 2007-08-31 2014-07-02 HanAll Biopharma Co., Ltd. 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine compound or pharmaceutical acceptable salt thereof, and pharmaceutical composition comprising the same

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018147642A1 (ko) * 2017-02-07 2018-08-16 광주과학기술원 Enoblock을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012015249A2 (ko) 2012-02-02
EP2600147B1 (en) 2017-01-25
EP2600147A4 (en) 2014-01-15
US20130115642A1 (en) 2013-05-09
US9254290B2 (en) 2016-02-09
WO2012015249A3 (ko) 2012-05-10
EP2600147A2 (en) 2013-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jung et al. Novel use of fluorescent glucose analogues to identify a new class of triazine-based insulin mimetics possessing useful secondary effects
Jeong et al. Real-time monitoring of glutathione in living cells reveals that high glutathione levels are required to maintain stem cell function
Kaizuka et al. An autophagic flux probe that releases an internal control
Freeman et al. Inhibition of pannexin 1 reduces the tumorigenic properties of human melanoma cells
Zou et al. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement
Schildknecht et al. Requirement of a dopaminergic neuronal phenotype for toxicity of low concentrations of 1-methyl-4-phenylpyridinium to human cells
Beaumatin et al. mTORC1 activation requires DRAM-1 by facilitating lysosomal amino acid efflux
KR20120011667A (ko) 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법
Yang et al. The brominated flame retardant BDE 47 upregulates purine metabolism and mitochondrial respiration to promote adipocyte differentiation
KR101314869B1 (ko) 트리아진계 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
RU2536045C2 (ru) Способ измерения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуоресцентного красителя
JP2012510059A (ja) 肝細胞毒性分析
Basu et al. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection
Sun et al. Cell based-green fluorescent biosensor using cytotoxic pathway for bacterial lipopolysaccharide recognition
Jiang et al. Piezo1 channel activation stimulates ATP production through enhancing mitochondrial respiration and glycolysis in vascular endothelial cells
Sarkar et al. Chronic cholesterol depletion increases F-actin levels and induces cytoskeletal reorganization via a dual mechanism
Xu et al. Alizarin, a nature compound, inhibits the growth of pancreatic cancer cells by abrogating NF-κB activation
KR101271218B1 (ko) 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법
Nhieu et al. Targeting Cellular Retinoic Acid binding protein 1 with retinoic acid-like compounds to mitigate Motor Neuron Degeneration
Emamzadeh et al. Adherent state apoptosis assay (ASA): a fast and reliable method to detect apoptosis in adherent cells
Chen et al. Molecular mechanism of platelet-derived growth factor (PDGF)-BB-mediated protection against MPP+ toxicity in SH-SY5Y cells
Yang et al. Temperature tolerance electric cell-substrate impedance sensing for joint assessment of cell viability and vitality
Tortora et al. Effects of CB2 and TRPV1 stimulation on osteoclast Overactivity induced by iron in pediatric inflammatory bowel disease
CA3018125A1 (en) Subcellular localization of target analytes
Voorberg-van der Wel et al. Dual-Luciferase-Based Fast and Sensitive Detection of Malaria Hypnozoites for the Discovery of Anti-relapse Compounds

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E801 Decision on dismissal of amendment
A107 Divisional application of patent
J201 Request for trial against refusal decision
J801 Dismissal of trial

Free format text: REJECTION OF TRIAL FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20121207

Effective date: 20130322