WO2006118131A1

WO2006118131A1 - 抗不安作用を有するペプチドおよびスクリーニング方法

Info

Publication number: WO2006118131A1
Application number: PCT/JP2006/308701
Authority: WO
Inventors: Takayuki Hida; Toru Arai; Tomoko Sekiya; Eiki Takahashi; Kodo Shikata
Original assignee: Eisai R & D Management Co., Ltd.
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2006-11-09
Also published as: JPWO2006118131A1; AU2006241928B2; US20090311185A1; EP1880728A4; CA2606162A1; CN101189019A; AU2006241928A1; KR20080010441A; EP1880728A1

Abstract

　本発明は、抗不安作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する治療剤、当該ポリペプチドを用いる不安の治療方法、当該ポリペプチドの受容体の賦活化もしくは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットなどを提供することを目的とする。本発明によれば、リラキシン－３を含有してなる、抗不安剤が提供される。

Description

明細書

抗不安作用を有するペプチドおよびスクリーニング方法

発明の分野

[0001] 本発明は、抗不安作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを用いる不安の治療方法、当該ポリペプチドの受容体の賦活化もしくは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットなどに関する。背景技術

[0002] 脳腸管ホルモン、ケモカイン、神経ペプチドや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して機能を発揮する。これらのレセプターの中で細胞膜を 7回貫通する構造を有し、細胞内で 3量体 Gタンパク質と共役するレセプターは特に Gタンパク質共役型受容体 (GPCR)と分類されている。 GPCR は特異的なリガンドが結合した時に細胞内にシグナルを伝達し、細胞の賦活化や抑制化をすることで、各種臓器'器官での機能発現に重要な役割を担っている。それ故に GPCRを賦活ィ匕するァゴ-ストや抑制するアンタゴ-ストと呼ばれる物質は、医薬品として使用されている。 GPCRに分類されるレセプターの中でもその特異的なリガンドが未同定のものが数多く知られており、それらはォーファン GPCRと呼ばれている。ォーファン GPCRは新たな治療薬のターゲットとしての可能性を秘めており、生体内のリガンド同定や機能を賦活もしくは抑制する物質の研究が進められている。このようにして同定されたリガンドゃ物質を生体に投与してレセプターとそのリガンドの機能を解明することは、医薬品の開発を提供する上できわめて重要である。

[0003] 近年の遺伝子配列情報の充実により、既知のタンパク質 ·ペプチドの配列を元にその相同性や法則性を導きだし、未知のペプチドやタンパク質を予測して、 GPCRの新たなリガンドとして同定する方法も可能となった。インスリン'リラキシン (Insulin'Re laxin)ファミリーに属するリラキシンは、黄体や胎盤から産生される分泌ペプチドであり、妊娠の維持と出産に関わる作用をもつことが以前力も知られていた。リラキシンをコードする DNAの塩基配列を元に遺伝子配列データベース力新たに同定された DNAをコードするタンパク質力リラキシン一 3 (Relaxin— 3) (または INSL7とも称される。）と名づけられたポリペプチドである（国際公開第 01Z068862号パンフレツト)。成熟型または活性型のリラキシン 3は、リラキシン 3のプレブ口プロテイン (pr eproprotein)力切断された B鎖および A鎖から構成され、当該 B鎖および当該 A 鎖がジスルフイド結合により結合されているポリペプチドである。リラキシン— 3は、免疫細胞系である THP— 1の細胞内サイクリック AMP (cAMP)の上昇をともなって細胞を賦活ィ匕することが報告された（国際公開第 01Z81562号パンフレット、 Bathgate et al" J. Biol. Chem., 277, p.1148-1157, 2002) ₀その後、リラキシン一 3はリラキシン 2とともに、 GPCRである LGR7に結合するリガンドの一つであることが示されるとともに、リラキシン 3による cAMPの上昇には LGR7が関与して!/、ることが示された (S udo et al., J. Biol. Chem., 278, p.7855-7862, 2003)。 LGR7は脳と末梢組織に発現しており、これまでには生殖器官の発達や妊娠 ·出産に関わることが示唆されている力精神症状との関連にっヽては良く分力つて、な!/、。

最近、生体内のリガンドが未同定の GPCRであった、 SALPR(GPCR135)と名づけられているレセプターや、 GPR100 (hGPCRl l、 GPCR142)と呼ばれるレセプタ一のリガンドがリラキシン一 3であることが報告された（Takeda et al., FEBS Letter, 52 0, p.97-101, 2002、 Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003、 Liu et al" J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003、国際公開第 2004/082598号パンフレット）。また、リラキシン一 3による cAMPの低下には SALPR (Liu et al., J. Biol. Ch em" 278, p.50754-50764, 2003)や GPR100 (Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.5076 5-50770, 2003)が関与していることが報告された。さらに、国際公開第 00/24891 号パンフレット、国際公開第 01Z48189号パンフレット、国際公開第 02Z31111号パンフレット、および国際公開第 02Z61087号パンフレットにもこれらのレセプターに関連する記載がある。 SALPRは脳に局在することが知られており（Matsumoto et a 1., Gene, 248, p.183-189, 2000)、特に視床下部の室傍核と視索上核に存在することが報告された（国際公開第 2004Z082598号パンフレット、 Liu et al., J. Biol. Chem ., 278, p.50754-50764, 2003)。さらに、 SALPRへの選択的な結合を示すリラキシン 3と INSL5のキメラペプチドを用いて、ペプチドの脳内での結合領域を示すことで SALPRの発現を調べている報告もあるが（Sutton et al., Neuroendocrinology, 180, p.298-307, 2004)、 SALPRの機能については良く分かっていない。一方、 GPR100 は全身性に発現しているレセプターであることが報告されている（Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003、 Boels et al., Br. J. PharamacoL, 140, p.932— 938 , 2003)が、 GPR100の機能についても不明なままである。

[0005] 一方、リラキシン 3は脳内の特定の領域に存在することが報告されており（Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003)、リラキシン 3が脳内ペプチドとして中枢性に何らかの機能を発揮して、る可能性は考えられて、たが、これまでにリラキシン 3が不安やうつをはじめとする精神状態を調節する力否かについては知られていなかった。

発明の概要

[0006] 本発明は、抗不安作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する治療剤、当該ポリペプチドを用いる不安の治療方法、当該ポリペプチドの受容体の賦活化もしくは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットなどを提供することを目的とする。

[0007] 本発明者は、リラキシン— 3をラットまたはマウス脳室内に投与し、不安惹起作用、抗不安作用を評価するための実験系にて投与後の前記ラットまたは前記マウスの行動を観察することにより、リラキシン 3が抗不安作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づ、て完成されたものである。

[0008] すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。

(1)リラキシン 3、その塩、あるいはこれらの水和物を含有する抗不安剤。

(2)リラキシン— 3が、ヒト型リラキシン— 3である、前記（1)に記載の抗不安剤。

(3)リラキシン 3が、リラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されているポリペプチドである、前記（1)に記載の抗不安剤。 (4)次の工程;被験物質を、

(A)リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、

(B)リラキシン 3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、

を含むことを特徴とする抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。

(4' )次の工程;被験物質を、

(C)リラキシン 3受容体 (例えば、 SALPR)を介した細胞刺激活性力アデニル酸シクラーゼの活性抑制を示した場合に、当該被験物質が不安作用を抑制する作用を有する化合物であると判定する工程、

(5)次の工程；

リラキシン 3、その塩、あるいはこれらの水和物と、被験物質とを、

を含むことを特徴とする不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。

(6)リラキシン一 3が、ヒト型リラキシン一 3である、前記（5)に記載のスクリーニング方法。

(7)リラキシン 3が、リラキシン 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されているポリペプチドである、前記（5)に記載のスクリーニング方法。 (8)次の工程；

をさらに含むことを特徴とする、前記（5)〜（7)の、ずれか一項に記載の不安を抑制または亢進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。 (8，）次の工程；

をさらに含むことを特徴とする、前記（5)〜（7)の、ずれか一項に記載の不安を抑制する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。

(9)リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記 (4)、 (4，）、 (5)、 (6)、 (7)、（8)、および (8，）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

(10) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記（9)に記載のスクリーニング方法。

(11)リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング用キット。

(12)リラキシン 3、その塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、前記（11) に記載のスクリーニング用キット。

(13)リラキシン一 3が、ヒト型リラキシン一 3である、前記（12)に記載のスクリーニング用キット。

(14)リラキシン 3が、リラキシン 3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されているポリペプチドである

、前記（12)に記載のスクリーニング用キット。 (15)リラキシン 3が標識されて、る、前記（ 12)〜（ 14)の、ずれか一項に記載のスクリーニング用キット。

(16)リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする、前記（11)〜（15)のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。

(17) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記（16)に記載のスクリーニング用キット。

(18)リラキシン— 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の不安作用を測定する工程を含むことを特徴とする、不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。

(19)不安作用を測定する工程が、 defensive burying testまたは高架式十字迷路試験である、前記（18)に記載のスクリーニング方法。

(20)リラキシン— 3受容体に作用する化合物が、前記 (4)、 (4，）、 (5)、（6)、（7)、 ( 8)、（8' )、（9)、および（10)のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（18)または（19)に記載のスクリーニング方法。

図面の簡単な説明

[図 l]pBabeCL (SALPR) IHの構築図を示す。

[図 2A]CRE4VIPZpBluescriptIISK ( + )の構築図を示す。

[図 2B]pBabeCLXの構築図を示す。

[図 2C]pBabeCLcre4vPdNNの構築図を示す。

[図 3]SALPRを発現させた SE302細胞におけるフォルスコリン添カ卩によって上昇した転写活性のリラキシン 3による特異的な用量依存的抑制を示す。黒四角はリラキシン一 3を添加した場合を示す。白四角はインスリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの最終濃度 (nmolZL)を示す。縦軸はフオルスコリン 1 μ molZLを添カ卩した細胞上清のアルカリフォスファターゼの活性を 100、フオルスコリンを添加して、な、細胞上清の活性を 0として算出した各活性の割合を示す。各点は平均値 (N = 3)と標準偏差を示す。

[図 4]Defensive buryingテストを用いた、ラット脳室内へのリラキシン 3の単回投与による抗不安作用を示す。白四角は対照 (vehicle)投与群を、斜線はリラキシン— 3の 0. 05nmol投与群を、黒四角はリラキシン— 3の lnmol投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの電極を床敷きで埋めている時間 (秒)の平均値と標準誤差を示す。図中において *は、ヒト型リラキシン— 3投与群が対照 (vehicle)投与群に有意差 (Dunnett型多重比較検定、 Pく 0. 05)があることを意味する。

[図 5]マウスを用いた高架式十字迷路試験（5分間）における、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計を示した図である。

[図 6]マウスを用いた高架式十字迷路試験（5分間）における、オープンアームにおける滞在時間の割合を示した図である。図中において *は、ヒト型リラキシン— 3投与群が対照 (vehicle)投与群に有意差 (t検定、 P< 0. 05)があることを意味する。

[図 7]ラットを用いた高架式十字迷路試験における、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計を示した図である。

[図 8]ラットを用いた高架式十字迷路試験（5分間）における、オープンアームにおける滞在時間の割合を示した図である。図中において *は、ヒト型リラキシン— 3投与群が対照 (vehicle)投与群に有意差 (Dunnett型多重比較検定、 Pく 0. 05)があることを意味する。

発明の具体的説明

[0010] リラキシン 3

本発明のリラキシン一 3は、リラキシン一 3 (または INSL7とも称される。）と名づけられたポリペプチドであり、成熟型または活性型のリラキシン 3を意味する。

[0011] 具体的には、本発明のリラキシンー3は、配列番号 2の N末端から第 26番目（Arg) 〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド (以下、単に「B鎖」と略記する場合がある。）と配列番号 2の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力なるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド (以下、単に「A鎖」と略記する場合がある。）が、 B鎖および A鎖のシスティン残基がジスルフィド結合により結合されて、ることを特徴とするポリペプチドを意味する。ジスルフイド結合は、 B鎖および A鎖のシスティン残基力分子間および分子内で結合していることが望ましい。

[0012] より具体的には、本発明のリラキシン— 3は、配列番号 2の N末端から第 26番目（A rg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）と配列番号 2 の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力もなるポリぺプチド (ヒト型 A鎖）がジスルフイド結合により結合されて、ることを特徴とするポリべプチドを意味し、 B鎖および A鎖のシスティン残基が分子間および分子内でジスルフイド結合を形成しているポリペプチドである。当該ジスルフイド結合は、配列番号 2の N末端から第 35番目の B鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端力第 129番目の A 鎖のシスティンが結合し、配列番号 2の N末端から第 47番目の B鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端から第 142番目の A鎖のシスティンが結合し、並びに配列番号 2の N末端力も第 128番目の A鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端力も第 1 33番目の A鎖のシスティンが結合して、ることが望まし、。

[0013] 本発明のリラキシン 3としては、下記のものが挙げられる。（数字はジスルフイド結合するシスティン残基を示し、同じ数字同士のシスティン残基がジスルフイド結合する。）

[ヒト型リラキシン一 3]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： DVLAGLSSSCCKWGCSKSEISSLC (配列番号 6)

31 3 2

B鎖および A鎖のアミノ酸配列は、本発明のリラキシン 3のプレプロプロテインのァミノ酸配列に含まれる。本発明のリラキシン 3のプレブ口プロテインは、配列番号 2 で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒト型プレプロプロテイン） (GenBank ァクセッション番号 NM— 080864)または当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド（以下、単に「プレブ口プロティン」と略記する場合もある。）が挙げられる。本発明のリラキシン— 3は、前記プレプロプロテイン力切断された B鎖および A鎖力 B鎖および A鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを含む。 [0014] 本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖およびプレプロプロテインは、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に由来する天然由来のポリペプチドであつても良ぐ組換えポリペプチド、合成ポリペプチドであっても良い。本発明のリラキシン 3には、本発明のリラキシン 3の塩が含まれ、さらには本発明のリラキシン 3またはその塩は糖鎖を有しな、ものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。塩につ!、ては、後述の塩の記載を参照するとよい。また、本発明のリラキシン— 3、 B鎖、 A鎖およびプレブ口プロテインには、 N末端環状グルタミン化、 C末端アミドィ匕など、分泌タンパクのプロセッシングを受けた形のポリペプチドを含む。

[0015] 上述の機能的に等価な改変ポリペプチドとは、配列番号 2の N末端から第 26番目（ Arg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）、配列番号 2の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力もなるポリべプチド (ヒト型 A鎖)または配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド (ヒト型プレブ口プロテイン）において、 1または複数個（好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列であって、しかも B鎖および A鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン 3と実質的に同じ活性 [例えばリラキシン 3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、アデ二ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、ィノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c—fosおよび c junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など）、不安作用の調節]を有するのであれば、上述の生物由来のポリペプチド、糸且換えポリペプチド、合成ポリペプチドの、ずれであってもよ、。

[0016] 配列番号 2の N末端から第 26番目（Arg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）、配列番号 2の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 A鎖)または配列番号 2で表されるアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型プレブ口プロテイン)のアミノ酸配列が欠失、置換および Zまたは挿入される場合は、その位置は、特に限定されないが、前記のアミノ酸配列中のシスティン残基以外のアミノ酸残基が挙げられる。

[0017] 本明細書において「置換」は、好ましくは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換える保存的置換を意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行なうことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性 (疎水性)アミノ酸としては、ァラニン、パリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フ -ルァラニン、メチォニンなどが挙げられる。極性（中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオ-ン、チロシン、グルタミン、ァスパラギン、システィンなどが挙げられる。陽電荷をもつ (塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性)アミノ酸としては、ァスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

[0018] 前記の欠失、置換、挿入および Zまたは付加されてもょ、アミノ酸残基の数は、例えば 1〜30個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5 個、特に好ましくは 1〜2個である。

[0019] 上述の相同ポリペプチドとは、配列番号 2の N末端から第 26番目（Arg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）、配列番号 2の N末端から第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 A 鎖)または配列番号 2で表されるアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型プレブロブ口ティン)のアミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力もなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、しかも B 鎖および A鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン 3と実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3 受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節）を有するのであれば、上述の生物由来のポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドの、ずれであってもよ！/、。

[0020] 本明細書において、「相同性」（「同一性」ということがある）の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよぐ例えば全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI)の相同性アルゴリズム BLAST (Basic 1 ocal alignment searcn tool) http： / / www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLA¾

TZにおいてデフォルト (初期設定)のパラメーターを用いることにより、算出することができる。

[0021] 上述の機能的に等価な改変ポリペプチドまたは相同ポリペプチドの B鎖、 A鎖、リラキシン 3またはプレプロプロテインの好ましい例としては、例えば、それ自体公知のマウス型、ラット型またはブタ型の B鎖、 A鎖、リラキシン 3またはそのプレプロプロテイン（国際公開第 01/81562号パンフレット）や、リラキシン一 1、リラキシン一 2、またはインスリン様ペプチド 3 (INSL— 3)のプレブ口プロテインまたは B鎖（国際公開第 2 006Z026355号パンフレット）などが挙げられる。

[0022] 「リラキシン— 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチド力も得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されているポリペプチド」は、好ましくは、本発明のリラキシン 3と実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節）を有する下記（1)または（2) のポリペプチドである：

(1)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 6のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 A鎖)またはそのアミノ酸配列にぉ、て、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端力ゝら第 11番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端から第 24 番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 6の N末端力も第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；および

(2)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90 %以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 6 のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 A鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上（好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型 A鎖とからなるポリペプチドであつて、配列番号 5の N末端力も第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端から第 11番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B 鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し

、そして配列番号 6の N末端力も第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 6の N末端力第 15番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド。

また、「リラキシン— 3のプレブ口プロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリべプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B鎖のシステイン残基がジスルフイド結合により結合されているポリペプチド」の例としては、国際公開第 2006/026355号パンフレットや Changlu Liu et al, Mol Pharmacol. 67(1):231 -40(2005)に開示されたリラキシンー3のキメラペプチドが挙げられる。

リラキシン一 3のキメラペプチドは、好ましくは、本発明のリラキシン一 3と実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節）を有する以下（3)〜（10)のポリペプチドである：

(3)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 7のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型リラキシン— 1の A鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付カロされた改変ヒト型リラキシン一 1の A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 11番目の A 鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 7 の N末端から第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合して、るポリペプチド；

(4)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90 %以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 7 のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型リラキシン一 1の A鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型リラキシン一 1の A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端力第 11番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 7の N末端力も第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 7の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；

(5)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 8のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型リラキシン 2の A鎖)またはそのアミノ酸配列にぉ、て、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付カロされた改変ヒト型リラキシン 2の A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 11番目の A 鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 8 の N末端から第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合して、るポリペプチド；

(6)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90 %以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 8 のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型リラキシン一 2の A鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型リラキシン一 2の A鎖と力なるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端力第 11番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 24番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 8の N末端力も第 10番目の A鎖のシスティンと、配列番号 8の N末端から第 15番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；

(7)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 9のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型インスリン様ペプチド 3の改変 A鎖)またはそのアミノ酸配列にお!ヽて、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド 3の A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端力も第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端から第 9番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端から第 22番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 9の N末端力ゝら第 8番目の A鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端力も第 13番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；

(8)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90 %以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 9 のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型インスリン様ペプチド 3の改変 A鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型インスリン様ペプチド 3の A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端力も第 1 0番目の B鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端から第 9番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 9の N 末端から第 22番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 9の N末端力第 8番目の A鎖のシスティンと、配列番号 9の N末端から第 13番目の A鎖のシスティンとが結合して、るポリペプチド；

(9)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型 B鎖と、配列番号 10のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型インスリン様ペプチド 6の改変 A鎖)またはそのアミノ酸配列において、 1または複数個（好ましくは 1または数個、より好ましくは 1、 2、 3、または 4個、さらに好ましくは、 1または 2個、特に好ましくは 1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド 6の A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 10の N 末端から第 7番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 10の N末端から第 20番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 10の N末端力も第 6番目の A鎖のシスティンと、配列番号 10の N末端から第 11番目の A鎖のシスティンとが結合しているポリペプチド；および (10)配列番号 5のアミノ酸配列力なるポリペプチド (ヒト型 B鎖)またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型 B鎖と、配列番号 10のアミノ酸配列力もなるポリペプチド（ヒト型インスリン様ペプチド 6の改変 A鎖）またはそのアミノ酸配列と 70%以上 (好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上）の同一性を有するアミノ酸配列力もなる相同ヒト型ィンスリン様ペプチド 6の A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号 5の N末端から第 10番目の B鎖のシスティンと、配列番号 10の N末端から第 7番目の A鎖のシスティンとが結合し、配列番号 5の N末端から第 22番目の B鎖のシスティンと、配列番号 10 の N末端から第 20番目の A鎖のシスティンとが結合し、そして配列番号 10の N末端から第 6番目の A鎖のシスティンと、配列番号 10の N末端から第 11番目の A鎖のシスティンとが結合して、るポリペプチド。

リラキシン 3のキメラペプチドは、より好ましくは、下記のものが挙げられる。（数字はジスルフイド結合するシスティン残基を示し、同じ数字同士のシスティン残基がジスルフイド結合する。）これらのキメラペプチドは、 SALPR (GPCR135)、 GPR100 (G PCR142)、および LGR7に対するリガンド活性が確認されている（国際公開第 200 6Z026355号パンフレットおよび Changlu Liu et al, Mol Pharmacol. 67(1):231- 40(2 005))。

[ヒト型 B鎖とヒト型リラキシン一 1の A鎖とのキメラペプチド]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： RPYVALFEKCCLIGCTKRSLAKYC (配列番号 7)

31 3 2

[ヒト型 B鎖とヒト型リラキシン一 2の A鎖とのキメラペプチド]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： QLYSALANKCQHVG£TKRSLARF£ (配列番号 8)

31 3 2

[ヒト型 B鎖とヒト型インスリン様ペプチド 3の改変 A鎖とのキメラペプチド]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： ATNPARY£QLSG£TQQDLLTL£ (配列番号 9)

31 3 2

[ヒト型 B鎖とヒト型インスリン様ペプチド 6の改変 A鎖とのキメラペプチド]

B鎖： RAAPYGVRL£GREFIRAVIFT£GGSRW (配列番号 5)

1 2

A鎖： GYSEKCCLTGCTKEELSIAC (配列番号 10)

31 3 2

本発明において用いられるリラキシン一 3は、また、リラキシン一 3と実質的に同じ活性を有するのであれば、 B鎖および A鎖の分子内あるいは分子間で、ジスルフイド結合あるいはそれ以外の結合形式により、結合していてもよい。このようなペプチドの例は、国際公開第 2004Z113381号パンフレット、 Halls et al., J. Pharmacol. Exp. Th er., 313, p.677— 687,2005、 Rosengren et al" J. Biol. Chem., 281, p.5845— 5851,200 6、 Bathgate et al., Biochemistry, 45, p.1043- 1053, 2006などに記載されている。本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレプロプロテインは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体力発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物力所望のポリペプチドを分離および精製することによつて調製することができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。

[0025] リラキシン 3をコードするポリヌクレオチド

本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレォチド (以下、単に「本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチド」と略記する場合もある。 )は、本発明のリラキシン一 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、 DNAおよび RNAの両方を意味する。

[0026] 本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号 1 の 5'末端力も第 76番目（c)〜第 156番目（g)の塩基配列力もなるポリヌクレオチド (ヒト型 B鎖をコードするポリヌクレオチド)、配列番号 1の 5'末端力も第 355番目（g)〜第 426番目（c)の塩基配列力もなるポリヌクレオチド (ヒト型 A鎖をコードするポリヌクレオチド）、配列番号 1で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチド (ヒト型プレブ口プロテインをコードするポリヌクレオチド）とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする塩基配列を有し、本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインと実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。

[0027] 本明細書にぉ、て、ストリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドとは、具体的には、 FASTA、 BLAST, Smith- Waterman (Meth. Enzym., 164, 765, 1988)などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号 1の 5'末端力も第 76番目（c)〜第 156番目（g)の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号 1の 5'末端力も第 355番目（g)〜第 42 6番目（c)の塩基配列力なるポリヌクレオチドまたは配列番号 1で表される塩基配列と少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダィゼーシヨン緩衝液中で、温度が 40°C〜70°C、好ましくは 60°C〜65°Cなどで反応を行い、塩濃度が 15〜3 OOmmolZL、好ましくは 15〜60mmolZLなどの洗浄液中で洗浄する方法に従つて行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。

[0028] 本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明のリラキシン一 3をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたは cDNAライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインの部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当な DNAプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。

[0029] B鎖 (配列番号 2の N末端から第 26番目（Arg)〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号 1の 5'末端から第 76番目（c)〜第 156番目（g)の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる

[0030] A鎖 (配列番号 2の N末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号 1の 5'末端から第 355番目（g)〜第 426番目（c)の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。

[0031] プレプロプロテイン (配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号 1で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。

[0032] プラスミビ前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。また、分離および精製の操作を容易にするために、必要に応じて本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロティンを切り出す融合タンパク質として発現することのできるプラスミドであってもよ、。

[0033] 形皙転龍

また、前記形質転換体も、上記のような本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明のリラキシン 3を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。また、別の態様によれば、前記形質転換体は、 B鎖、 A鎖が切り出される切断部位に作用するプロテアーゼを発現するプラスミドを同時に含んで、てもよ、。

[0034] 前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えば Escherichia coli JM109株）または酵母（例えば Saccharomyces cerevisi ae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えば CHO細胞、 H EK— 293細胞、または COS細胞）または昆虫細胞（例えば BmN4細胞）を挙げることがでさる。

[0035] また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、 pUC、 pTV、 p GEX、 pKK、または pTrcHisを；酵母に対しては、 pEMBLYまたは pYES2を； CH O細胞、 HEK— 293細胞および COS細胞に対しては、 pcDNA3、 pMAMneoまたは pBabe Puroを； BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウィルス（BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば PBK283)を挙げることができる。

[0036] 前記形質転換体を、本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、本発明のリラキシン一 3、 B鎖、 A鎖またはプレプロプロテインをコードする RN Aを注入し、本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。

[0037] 本発明のリラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロテインを、前記形質転換体の培養物から取得する場合は、培養後に、菌体、細胞または培養液を集め、分離および精製の公知の方法を組合せ、リラキシン 3、 B鎖、 A鎖またはプレブ口プロティンの生化学的性質または物理的性質などを利用しながら行なうことができる。例えば、限外濾過、液体クロマトグラフィー（例えば、ァフィ-ティクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー (HPLC)など）、透析法などの技術を利用することができる

[0038] 本発明のリラキシン一 3の B鎖および A鎖をそれぞれ独立に調製した場合、または融合タンパク質力も B鎖または A鎖を切り出して調製する場合は、生産されたまたは切り出された B鎖および A鎖を、常法に従い、単離精製し、それぞれ同士をジスルフイド結合で結合させることもできる。

[0039] リラキシン 3 含有する靠成物本願明細書において、「精神状態」とは、例えば、不安、緊張、抑うつ状態を意味する。

[0040] 本願明細書にぉ、て、「不安 (anxiety)」とは、身体的微候 (例えば発汗、頻拍、早められた呼吸、震え)を伴う感覚 (例えば危惧、恐怖)で表される感情状態、不快な情緒状態を意味する。不安は正常な感情であるが、重篤になれば不安障害になるため、前記不安には不安障害も含まれる。不安障害には、例えば広場恐怖をもつまたはもたないパニック障害、パニック障害の病歴をもたない広場恐怖 (Agoraphobia)、特別な恐怖症、例えば、特定動物恐怖症、社会恐怖症、強迫性、外傷性ストレス障害および急性ストレス障害を含むストレス障害、アルコール、薬物（例えばアンフェタミン、カフェイン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクジン（phencychdine) )、鎮静剤、催眠薬、不安解薬、その他物質により引き起こされる不安障害、不安または不安と抑うつの両者を伴う不安障害を含む。不安または不安障害はしばしば、他の病気 (例えば精神疾患、免疫疾患、代謝疾患、消化管疾患など)および症状と関連しているか、または、そのような他の症状によって引き起こされるものを含む。不安は、他の障害、例えば抑うつ障害における抑うつを伴ってまたは伴わないで存在しうる。

[0041] 本願明細書において、「抑うつ（depression)」とは、悲観的な悩み、激しい悲しみ、失望、動揺、精神活動の遅延、集中力の低下および卑下の感情状態を意味する。抑うつは程度によっては、食欲不振、体重減少、過食、不眠、過眠症、性的衝動、正常な概日性リズム (例えば、体温、内分泌機能)の破壊を生じる状態を含む。

[0042] 本発明のリラキシン 3または本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドは、精神状態の治療、好ましくは不安の治療の抗不安剤として用いることができる。例えば、それらは、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、他の病気 (例えば精神疾患、免疫疾患、代謝疾患、消化管疾患など）および症状と関連している力または、そのような他の症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物等の他物質によって引き起こされる不安障害の治療、検査時または手術前後における不安の緩ィ匕の治療に用いることができる。また、それらは不安症状を伴う精神疾患の治療、リラキシン 3またはリラキシン 3 をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬としても用いることができる。

[0043] 具体的には、不安作用とは、不快な情緒状態であって、しばしば恐怖によって引き起こされるものに似た生理学的変化や行動を伴うことから、抗不安作用を有するリラキシン— 3は、ヒトまたはヒト以外の生物の精神状態を安定ィ匕させる作用を有する。例えば、不安症、全般性不安障害、パニック障害、恐怖症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、心的外傷後ストレス障害の治療、精神疾患 (例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症)、免疫疾患 (例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症）、代謝疾患 (例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症)、消化管疾患 (例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群）、 AIDS、癌、悪液質)およびそのような症状と関連している力、または、そのような症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物（例えばアンフェタミン、カフェイン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクジン (phencychdine) )、鎮静剤、催眠薬、不安解薬により引き起こされる不安障害の治療に用いることができる。また、不安症状を伴う精神疾患 (例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症)の治療にも用いることができる。

[0044] 前記疾患の治療の医薬として使用するにあたり、本発明のリラキシン 3または本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドは塩を形成していてもよぐさらにそれらは水和物を形成していてもよぐ本発明に含まれる。前記疾患の治療の医薬として使用するにあたり、本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドは、単独または適当なベクターに挿入して、あるいは、シグナル配列、ポリペプチド安定ィ匕配列などの配列を付カ卩して用いることができる。前記ベクターとしては、例えば、アデノウィルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウィルスベクター、プラスミド、ファージミド、コスミドなどの公知のものを使用することができる。本発明のリラキシン 3または本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドもしくはその塩またはそれらの水和物は単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。

[0045] 本願明細書における前記の「塩」とは、本発明のリラキシン 3または本発明のリラキシン一 3をコードするポリヌクレオチドと塩を形成し、かつ薬学的に許容され得る塩であれば特に限定されないが、好ましくはハロゲンィ匕水素酸塩 (例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩 (例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など)有機カルボン酸塩 (例えば酢酸塩、トリフルォロ酢酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クェン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩 (例えばァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級ァミン塩、アルカリ金属塩 (例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩 (マグネシウム塩、カルシウム塩など)などが挙げられ、当該「薬学的に許容され得る塩」として、より好ましくは、トリフルォロ酢酸塩、塩酸塩、シユウ酸塩、などである。

[0046] この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従つて、本発明のリラキシン 3またはリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定ィ匕剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添カロ剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシゥム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クェン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

[0047] それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のリラキシン一 3または本発明のリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドの選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。適当な投与量は患者の体重 lkgあたり例えば約 0. 1〜500 g、好ましくは約 0. 1〜： LOO g、より好ましくは 1〜50 g程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。

[0048] リラキシン— 3^容体を用いた精神状態の調節に係る化合物のスクリーニング方法リラキシン一 3 容体

本発明のリラキシン一 3に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のリラキシン— 3と結合活性を有し、リラキシン— 3受容体発現細胞の細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、アデ二ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変ィ匕、細胞内タンパク質のリン酸化、 c— fosおよび c一 junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]のリラキシン一 3受容体を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、リラキシン一 3受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば本発明のリラキシン一 3に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。この場合、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、リラキシン一 3受容体のアミノ酸数の 90%、 80%、 70%、 60%、 50%、 40%、 30%、 20%、 10%または 5%である。

[0049] 具体的には、リラキシン一 3受容体として、報告されている公知の受容体、例えば L GR7 (GenBankァクセッション番号 NM— 021634)、 SALPR (GenBankァクセッシヨン番号 NM_016568) (GPCR135とも称されている。）または GPR100 (GenB ankァクセッション番号 AB一 083593) (hGPCRl l、 GPCR142とも称されている。）などを使用することが可能である。

[0050] SALPRを用いた不安作用の調節に係る化合物のスクリーニング方法

以下、本願明細書においては、本発明の好ましい一例として、 SALPRを使用し、精神状態の調節、例えば不安作用の調節 (不安作用を抑制または促進する）〖こ係る化合物のスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに結合し、不安作用の調節（不安作用を抑制または促進する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に不安作用を抑制または促進する作用を有するか否かを決定することができる。

[0051] ここで、本発明の SALPRまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチド（GenBankァクセッション番号 NM— 016568)を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ

、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、 SALPRの部分ポリペプチドは、 SALPRを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。別の態様によれば、 SALPRの部分ポリペプチドは、結合活性部位を有する部分ポリペプチドを調製するのが好まし、。

[0052] 本発明の SALPRをコードするポリペプチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号 4で表されるアミノ酸配列に関して、 70%以上の相同性、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99% 以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または不安作用の調節）を有するポリペプチドを意味する。

[0053] ここで、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリべプチドにおいて 1または複数個（好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または不安作用の調節）を有するポリペプチドを意味する。

[0054] さらに、 SALPRの部分ポリペプチドも、 SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または不安作用の調節）を有する限り、使用することができる。 SALPRの部分ポリペプチドには、リラキシン— 3との結合活性部位を有する部分ポリペプチドを使用することができる。

[0055] 以下、遺伝子工学的手法について、より具体的には SALPRを使用する場合について詳述する力その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されな、。

[0056] SALPRの調製方法

SALPRをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、その培養物から所望のポリペプチドを精製しないで調製したものを用いても良いし、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物力所望のポリペプチドを分離および精製すること〖こより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン A結合多糖類を用いる親和性力ラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。

[0057] SALPRをコードするポリヌクレオチド

本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。

[0058] なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、 DNAおよび RNAの両方が含まれる。本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドには、具体的には下記の（a )〜 (e)力らなる群より選択されるものが挙げられる。

(a)配列番号 3で表される塩基配列力もなる、ポリヌクレオチド；

(b)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；

(c)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；

(d)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および (e)「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダイズし、し力も、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。

[0059] 本発明の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、配列番号 3で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチドである。配列番号 3で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力なる SALPRをコードする。

[0060] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および Zまたは付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば 1〜30個、好ましくは 1 〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1〜2個である。

[0061] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリぺプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明の SALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、し力も、前記 SAL PRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。

[0062] プラスミド

前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。

[0063] 形皙転龍また、前記形質転換体も、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、 SALPR を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換すること〖こより得ることができる。

[0064] 前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えば Escherichia coli JM109株）または酵母（例えば Saccharomyces cerevisi ae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えば CHO細胞、 H EK— 293細胞、または COS細胞）または昆虫細胞（例えば BmN4細胞）を挙げることがでさる。

[0065] また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、 pUC、 pTV、 p GEX、 pKK、または pTrcHisを；酵母に対しては、 pEMBLYまたは pYES2を； CH O細胞、 HEK— 293細胞および COS細胞に対しては、 pcDNA3、 pMAMneoまたは pBabe Puroを； BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウィルス（BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば PBK283)を挙げることができる。

[0066] SALPRを含有する細胞は、 SALPRを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなぐ例えば前記形質転換体 (すなわち、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞)を、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、 SALPRをコードする RNAを注入し、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることちでさる。

[0067] 細朐麵分

また、 SALPRを含有する本発明の細胞膜画分は、例えば本発明による SALPRを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えば Potter— Elvehi em型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリンダブレンダーまたはポリトロン (Kinematica社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどでカロ圧しながら細いノズル力も細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。

[0068] SALPRを介する、本発明による不安作用を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、 SALPRまたは前記細胞 (すなわち、 SALPRを含有する細胞)もしくは前記細胞膜画分 (すなわち、 SALPRを含有する細胞膜画分)を用いることができる。

[0069] また、本発明によるスクリーニング方法においては、第一の態様として、被験物質が SALPRに特異的に結合するか否かを調べる方法と、第二の態様として、 SALPRに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性 (例えば細胞内の Ca²⁺の遊離、アデ-ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c fosおよび c junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。

[0070] 本発明によるスクリーニング方法の第一の態様では、例えば SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質とを接触させ、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質が結合するか否力を分析することにより、 SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることがでさる。

[0071] 具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、 SA LPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識した本発明のリラキシン 3とを接触させ、前記条件下における SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と当該リラキシン 3の特異的結合量を比較することにより、 SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、 SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下における SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と当該リラキシン 3の特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。

[0072] 本発明によるスクリーニング方法にぉ、て、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と本発明のリラキシン 3の特異的結合量を比較する場合には、当該リラキシン一 3として、標識した当該リラキシン一 3を用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 [ ]、 [¹⁴C]、 [¹²⁵I]、 [³⁵S]などを用いることができる。前記酵素としては、例えば j8—ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルォレセイソチオシァネート、 BODIPYなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、本発明のリラキシン一 3と標識物質を結合させるためにピオチンアビジンの系、リラキシン 3に対する抗体を用いることちでさる。

[0073] このように、本発明によるスクリーニング方法において、 SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと本発明のリラキシン— 3との結合を阻害する化合物を、 SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。

[0074] 本発明によるスクリーニング方法における第二の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した本発明のリラキシンー 3とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する当該リラキシン 3の特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における当該リラキシン 3の特定の細胞刺激活性を比較することにより、 SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。

[0075] 前記態様にお!、ては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、 SALPRを介する不安作用を抑制する化合物として選択することができる。

[0076] 一方、前記態様において、前記細胞と当該リラキシン 3との結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、 SALPRを介する不安作用を促進する化合物として選択することができる。 [0077] 本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデ二ル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。

[0078] この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕によって細胞内に生成する cAMPを公知の手法で測定すればよぐ SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、 SALPRに本発明のリラキシン一 3が結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、 SALPRの細胞刺激活性の一つであるアデ二ル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、 SALPRに当該リラキシン - 3が結合すると、 SALPRに共役して!/、る Gタンパク質ファミリーの一つである Giファミリ一が、アデ二ル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリック AMP (cA MP：アデ二ル酸シクラーゼにより ATP力も生成される）量を減少させることによる。

[0079] 例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)した哺乳動物由来細胞 (例えば HEK— 293細胞もしくは CHO細胞）にアデ-ル酸シクラーゼの活性化剤 [例えばフオルスコリン (FSK) ]を添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇する。

[0080] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン一 3を加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン一 3が本発明による SALPRに作用して生じるアデ- ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性ィ匕剤を単独投与した場合に比べて、 cAMPの生成量が減少する。従って、不安作用を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で SALPRを介する当該リラキシン 3に代わり、被験物質を単独で接触させて cAM Pの生成量を減少させる（すなわち当該リラキシン— 3と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0081] 不安作用を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシンー3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比ベて、当該リラキシン 3の作用で cAMPの生成量が減少する力被験物質が当該リラキシン— 3の作用に拮抗する場合には、 cAMP生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は不安作用を促進する化合物として選択できる。

[0082] 細胞内 cAMP量を測定する方法としては、例えばィムノアッセィなどがある力例えば市販の cAMP定量キットを使用することもできる。

[0083] 別の態様のスクリーニング方法にぉ、ては、例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)し、しかも、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファタ一ゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、または GFP (Green Fluorescent Protein)などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、 SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述の cAMPの生成が減少するとその結果、前記スクリ一ユング用細胞に導入されて、る CREをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。

[0084] 以下、前記態様による、 SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。

[0085] すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREは、細胞内の cAMP の濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群 (cAMP誘導性遺伝子)の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕剤（例えば FSK)をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇し、その結果、 CREの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。

[0086] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン一 3を加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン一 3が本発明による SALPRに作用して生じるアデ- ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性ィ匕剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従つて、不安作用を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、 SALPRを介する当該リラキシン 3に代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち当該リラキシン 3 と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0087] 不安作用を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシンー3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比ベて、当該リラキシン 3の作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少するが、被験物質が当該リラキシンー3の作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は不安作用を促進する化合物として選択できる。

[0088] 被験物質による作用が、 SALPRに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞 (すなわち、 SALPRを細胞膜上に発現し、し力も、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用、た前記試験と並行して、コントロール用細胞 (例えば CREが 5 '上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、 SALPRを細胞膜上に発現してヽな、細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、 SALPR に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、 SALPRに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。

[0089] また、別の態様として、被験物質、好ましくは上記のスクリーニング方法により選択される被験物質 (以下、単に「被験物質」と略記する場合がある。）を被験動物、例えばヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に投与し、投与後の行動観察、自発運動量、血中パラメーター (例えば、血中や脳内のホルモンや分泌ペプチドの量など)の変動などの指標を解析することにより不安作用の調節に影響を与える化合物 (すなわち、不安作用を抑制または促進する化合物）を確認および決定することができる。具体的には、 Defensive buryingテスト（Treitら、 Pharamacology Biochemistry and Behavior, 15, p.り丄 9—り 26, 1981)、才 ~~フンフィ ~~ ルド試験、明暗試験、高架式十字迷路試験、 Geller— Seifter型コンフリクトテスト、 Vogel型コンフリクトテスト、 social interaction試験、 Hole— board試験、 Marble burying試験、恐怖条件付けストレス試験、強制水泳試験、 tail suspension試験による行動観察をすることができる。非ヒト哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物または遺伝子改変動物が挙げられる。

[0090] 被験物質の投与形態としては、経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。被験物質の被験動物の脳室内への投与方法は、薬物などを脳室内の所定の位置へ投与する際の常法に従えばよぐ限定はされない。

[0091] 例えば、まず被験動物を麻酔した上で、ガイド力ニューレを所定の位置に固定する手術を施しておき、適当な回復期間（例えば 7日間〜 14日間、好ましくは少なくとも 1週間程度）の経過後、ガイド力-ユーレにインジェクション-一ドルを挿し込み、還流ポンプを接続したマイクロシリンジを用い、上記-一ドルを介して被験物質を投与することが好ましい。被験物質の投与量は、限定はされず、適宜設定できる。被験物質は、一般的には人工的脳脊髄液（artificial cerebrospinal fluid)または生理食塩水などを用いて所望の濃度の溶液として調製しておく。人工的脳脊髄液としては、公知の常用されているものを用いればよぐ限定はされないが、例えば、 aCSF (glucose 10mM、KCl 2mM、NaCl 115mM、CaCl 2. 5mM、 MgSO 1. 2mM、N

2 4

aHCO 25mM、 KH PO 2. 2mM ;pH7. 4)などが好ましい。被験物質の投与

3 2 4

回数は 1日あたり一回でも数回に分けても良ぐ被験物質を投与する期間や観察する期間は 1日力も数週間にわたってもよい。 [0092] リラキシン 3の被験動物への投与方法などは、前記の被験物質の場合と同様の方法が好ましい。また、リラキシン— 3の被験動物の脳室内への投与方法も、前記の被験物質と同様に、一般的には人工的脳脊髄液を用いて所望の濃度の溶液となるよう調製しておくことが好ま、。

[0093] 被験物皙

ここで、上述の被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸 (オリゴ DNA、オリゴ RNA) 、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞 (微生物、植物細胞、動物細胞)抽出液、細胞 (微生物、植物細胞、動物細胞)培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物など由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよぐこれらは本発明の被験物質に含まれる。

[0094] 本願明細書において被験化合物の「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されな、。具体的には、例えば好ましくはハロゲンィ匕水素酸塩 (例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩 (例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩 (例えば酢酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クェン酸塩など）、有機スルホン酸塩 (例えばメタンスルホン酸塩、トリフルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級ァミン塩、アルカリ金属塩 (例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など)などが挙げられる。

[0095] スクリーニング用キット

本発明のスクリーニング用キットは、リラキシン 3受容体または前記細胞 (すなわち、リラキシン 3受容体を含有する細胞)もしくは前記細胞膜画分 (すなわち、リラキシン— 3受容体を含有する細胞膜画分)と、場合によっては、リラキシン— 3とを少なくとも含有する。当該リラキシン— 3は、標識した当該リラキシン— 3であってもよい。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および Zまたは器具などをさらに含むことができる。ここで、リラキシン 3受容体の好適な例は、 SALPRである。

[0096] 本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、本発明のリラキシン 3、およびリラキシン 3受容体を細胞膜上に発現 (好ましくは、リラキシン 3受容体を含む発現べクタ一を導入して過剰に発現)し、し力も、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）を含有する細胞とを少なくとも含有する。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばレポーター遺伝子産物（例えば、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼなど）の基質、アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤（例えば F SK)、結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および Zまたは器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、リラキシン 3受容体を細胞膜上に発現してヽなヽ細胞を含んで!/ヽてもよヽ。

[0097] ここで、リラキシン 3受容体の好適な例は、 SALPRである。

[0098] 本明のスクリーユング法により得られる化合物含有する靠成物

本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節 (不安作用を抑制または促進する）に係る化合物である。当該化合物は塩を形成してもよぐさらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよい。

[0099] 従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、精神状態の治療、好ましくは不安の治療の抗不安剤として用いることができる。例えば、それらは、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、他の病気 (例えば精神疾患、免疫疾患、代謝疾患、消化管疾患など)および症状と関連しているか、または、そのような他の症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物等の他物質によって引き起こされる不安障害の治療、検査時または手術前後における不安の緩ィヒの治療に用いることができる。また、それらは、不安症状を伴う精神疾患の治療、リラキシンー3またはリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬にち用いることがでさる。

[0100] 具体的には、不安作用とは、不快な情緒状態であって、しばしば恐怖によって引き起こされるものに似た生理学的変化や行動を伴うことから、不安作用を抑制する化合物は、ヒトまたはヒト以外の生物の精神状態を安定ィ匕させる作用を有する。従って、例えば不安症、全般性不安障害、パニック障害、恐怖症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、心的外傷後ストレス障害の治療、精神疾患 (例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症)、免疫疾患 (例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症)、代謝疾患 (例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症)、消化管疾患 (例えば下痢、便秘

、機能性便秘症、過敏性腸症候群）、 AIDS、癌、悪液質)およびそのような症状と関連している力、または、そのような症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物（例えばアンフェタミン、カフェイン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクジン (phencychdine) )、鎮静剤、催眠薬、不安解薬により引き起こされる不安障害の治療に用いることができる。また、不安症状を伴う精神疾患 (例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症)の治療にも用いることができる。

[0101] 本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜9 0重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口 (例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クェン酸、塩ィ匕ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

[0102] それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重 lkgあたり例えば約 1. 0〜1, 500 g、好ましくは約 10〜50 0 g程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。

[0103] 本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および Zまたは症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒と!/、う点では治療的である。本明細書にぉ、て「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a)〜(c)の治療を含む：

(a)疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持って!/、ると診断されて、な、患者において、疾病または症状が起こることを予防すること； (b)疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；

(c)疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。

[0104] なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0105] 以下、実施例により本発明についてより詳細に説明する力本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。

[0106] 「実施例 11 SALPRをコードするポリヌクレオチドの調製

SALPRをコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号 3で表される塩基配列を基にして、以下のように行った。配列番号 3では 1410塩基対が示されており、 SALP Rをコードする領域は、 1番目から 1407番目（1410塩基対， 469アミノ酸残基）とされている（GenBank ァクセッション番号 NM— 016568)。 PCR (polymerase cha in reaction)により遺伝子を単離するために、配列番号 11および配列番号 12で表される PCRプライマーを常法に従ヽ作製した。

[0107] human genomic DNA (Roche Diagostics社）を铸型として、配列番号 11および配列番号 12の組合せからなる PCRプライマーと、 Expand High Fidelity P CR System (Roche Diagnostics社）を用い、 (98°C 1分— 57。C 1分— 72。C 3分)を添付の操作方法に従い、 30回繰り返すことにより PCRを行った。その結果、約 1, 400塩基対の DNA断片を得た。

[0108] この DNA断片を、 pCR2. 1 (Invitrogen社）に挿入し、 ABI prism DNA sequ encing kit (Perkin- Elmer Applied Biosystems社）により配列を確認した。その結果、配列番号 11および 12からなるプライマーの組合せによって得られた pCR2 . 1— SALPRに挿入された 1410塩基対の配列は、配列番号 3における 361番目力ら 1770番目と長さは同一であった力配列中には 1つの変異が見られた。この変異は、該当部位の核酸配列力翻訳されるアミノ酸には影響を与えないことは明らかであつたので、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを得ることができた。

[0109] 「実施例 2Ίレトロウイルスベクタープラスミドの調製 pBabe Puro (Morgenstern, J. P. and Land, H. Nucleic Acids Res. ,18, p.3587— 359 6, 1990) (配列番号 13)から Sailおよび Clalで切断することにより SV40 promoter —puro (r)領域を除き、末端を Klenow fragmentにより平滑化した。ここへ pIRES hyg (Clontech社）力 Nsilおよび Xbalで切断することにより IRES— hyg (r)領域を切り出し、 T4ポリメラーゼにより末端を平滑ィ匕したものを挿入し pBabeXIHを得た。

[0110] pBabeXIHから Ssplおよび BamHIで切断することにより 5，一 LTR— packaging signalを除、た。ここへ pCLXSN (IMGENEX社）から Ssplおよび BamHIで切断することにより切り出した 5，LTR—CMV promoter - packaging signalを挿入し pB abeCLXIHを得た。

[0111] 「実施例 31 SALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製

前記実施例 2に記載のレトロウイルス発現用プラスミド pBabeCLXIHを制限酵素 H palで切断した。ここへ前記実施例 1で得た pCR2. 1— SALPRから EcoRVで切断することにより SALPRをコードするポリヌクレオチドを切り出し、 T4ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入し pBabeCL (SALPR) IHを得た（図 1)。

[0112] 「実施例 41 SALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製

2 X 10⁶個の 293— EBNA細胞（Invitrogen社）を 10cmコラーゲンコートディッシュ（IWAKI社）で DMEM (Sigma社）ー10% fetal bovine serum (FCS)—ぺ -シリン（penicillin) 100units/mL ストレプトマイシン（streptomycin) 100 ^ gZml(PS) (以下、「EBNA培養液」と称する） 10mLを用いて培養した。翌日、 pV — gp (pVPack-GP (Stratagene社）から Nsilおよび Xbalで切断することにより IR ES— hisDを除き T4ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの）、 pVPack—V SV—G (Stratagene社）、および実施例 3で得た SALPR遺伝子導入用レトロウィルスベクタープラスミド（pBabeCL (SALPR) IH)それぞれ 3. 3 μ gをリポフエクシヨン試薬である TransIT(Panvera社）を用いて、前記 293— EBNA細胞にトランスフエクシヨンした。その 6〜 12時間後に EBNA培養液を交換し、 37°Cで培養を続けた。

[0113] トランスフエクシヨン 2日後に培養液を回収し、 1, 200 X gで 10分間遠心した。

[0114] その上清を 0. 45 μ mのフィルター（Millipore社）でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして、さらにウィルスベクターの濃縮を以下のように行った。 [0115] 超遠心用チューブ 50 Ultra -Clear Tubes (Beckman社）を 70%エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウィルスベクター約 35mLを入れた。これを超遠心ローター SW28 (Beckman社）に入れ、超遠心装置 XL— 90 (Beckman社）を使って 19, 500rpm 100分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。 1時間後、チューブ壁面に残った培養液約 100 /z L程度の濃縮ウィルスベクター溶液が得られた。

[0116] 「実施例 5Ίサイクリック AMP応答配列を含むレポーター系導入細朐 SE302の構築

(1)サイクリック AMP応答配列を含むレポーター DNAの作成

公表された論文（Durocher et al. Anal Biochem 2000 284(2):316- 26)を参考に cA MPに応じた転写がみられる unitを以下のように構築した。

[0117] cAMP responsive element (CRE)を含む unitの作成のために、 CREx2hb用として配列番号 14および配列番号 15、 CREx2bp用として配列番号 16および配列番号 17で表されるオリゴ DNAを常法に従い作成した。

[0118] それぞれの組合せ力もなるオリゴ DNAを 95°Cに熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖 DNA(CREx2hb、 CREx2bp)を形成させた。 CREx2hbを Hindlll, BamHI、 CREx2bpを BamHI, Pstlで消化するとともに、 pBluescriptllS K ( + ) (Stratagene社）を Hindlll, Pstlで消化した。消化した DNAを電気泳動して両端に制限酵素消化部位をもつ DNAを精製した後、これら 3つの DNA(CREx2hb 、 CREx2bp、 pBluescriptIISK( + ) )を一度に連結し（ligation)、得られたプラスミドの配列を解析して、 CRE4ZpBluescriptIISKを作成した。

[0119] 次に VIP (vasoactive intestinal peptide)プロモーターを含む DNAを得るために配列番号 18および配列番号 19で表される PCRプライマーを常法に従、作成した。

[0120] Human genomic DNA (Roche Diagostics社）を铸型とし、配列番号 18および配列番号 19の組合せからなる PCRプライマーと、 recombinant Taq polymer ase (Takara社）を用いて（94°C 30秒 55°C 30秒 72°C 1分）を 35回繰り返すことにより PCRしたところ、 264塩基対の DNA (配列番号 20)が得られた。この 26 4塩基対の DNAを Pstlで消化するとともに CRE4ZpBluescriptIISK ( + )の Pstlサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認して CRE4VIPZpBluescriptIISK ( + )を作成した（図 2A)。得られた CRE4VIPZpBluescriptIISK( + )から Hindlllと Smalで消化した後、得られた CRE4VIPプロモーター断片の末端平滑ィ匕を行なった

[0121] 前述の発現用ウィルスベクタープラスミド pBabeCLXIHより IRES〜hygro (r)領域を除去した pBabeCLXを作成した（図 2B)。 pBabeCLXよりレトロウイルス本来のェンハンサー活性 (LTR)中の NheI〜NarI領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、 CREと VIPプロモーターを含む配列と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ (PLAP) ( Goto et al., Molecular Pharmacology, 49, p.860— 873, 1996)を導入し、 pBabeCLcre 4vPdNNを得た（図 2C)。

[0122] (2)サイクリック AMP)^^:西 R歹 II 含すレポーター人糸田 SE302の榭

サイクリック AMP応答配列によりレポーター遺伝子 PLAPが誘導されるレトロウィルスベクタープラスミド pBabeCLcre4vPdNNを用い、実施例 4に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターを HEK293細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローンィ匕して、 PLAP誘導の反応性が最も良かつたクローン (以下、「SE302細胞」と称する）を以下の実験に供した。

[0123] 「実施例 61 SALPR遣伝子導入用レトロウイルスベクターによる SALPR発現細胞の謹

前記の実施例 4で調製したレトロウイルスベクターによる細胞への SALPR遺伝子導入を以下のように行った。

[0124] 前記実施例 5で構築した 3 X 10³個の SE302細胞を 96well plate (旭テクノガラス社）に DMEM (SIGMA社）ー10% fetal bovine serum (FCS)—PS (以下、「培養液」と称する） 100 μ Lを用いて培養した。翌日、実施例 4で調製したレトロウィルスベクターを適宜希釈し、その 100 Lを培養液で調製した polybrene (最終濃度 8 /z gZmL) (別名 hexadimethrine bromide Sigma社）とともに SE302細胞にカロえた。その翌日、培養液を 500 μ gZmLのハイグロマイシン（Hygromycin) (Invi trogen社)含有の培養液 200 Lと交換し培養した。この条件で増殖してきた SALP R遺伝子導入 SE302細胞（以下、「SALPR—SE302細胞」と称する）を適時継代して実験に供した。

[0125] 「実施例 71 SALPR— SE302細朐におけるフォルスコリン添加によって増加させた転写活件のリラキシン— 3による抑制

前記実施例 6で構築した SALPR— SE302細胞を、転写活性測定用培地 (DME M— 10%FBS (65°Cにて 30分非働ィ匕）をカ卩えたもの）にて縣濁した後、 96 well p late (Beckton Dickison社）に 1穴あたり 1 X 10⁴細胞となるようにまいた。翌日、ァッセィ用培地 (DMEMに 0. 1%ゥシ血清アルブミンをカ卩えたもの）で希釈した各濃度のヒト型リラキシン一 3 (Phoenix Pharamaceuticals社）またはインスリン（Invitrog en社）を添加し、その後フォルスコリン（Carbio Chem社）を最終濃度 1 μ molZLとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清を 15 L回収して化学発光測定用の 96well plate (住友ベークライト社）に移し、アツセィ用緩衝液（280mmolZL

Na CO -NaHCO、 8mmol/L MgSO、 pH10)を 60 μ L、 Lumiphos530 (L

2 3 3 4

umigen社） 70 /z Lを添カ卩して、室温にて 1時間反応させた後、各 wellの化学発光を Fusionプレートリーダー（Perkin Elmer社）にて測定し転写活性量とした。フォルスコリン 1 μ molZLを添加した細胞上清の転写活性を 100%とし、フオルスコリンを添カロして、な、細胞の上清の活性を 0%として各被験サンプルを加えた細胞上清中の活性を％で表示した (図 3)。

[0126] その結果、フオルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン 3は SALPRの活性化を介して抑制することが分力つた。この転写活性の上昇は関連ペプチドであるインスリンでは影響がな力つたので、リラキシン一 3特異的な反応であることが分力つた。すなわちこの実験系を用いることで、リラキシン 3による SALPRの活性化に影響を与える化合物、物質を判別できることが示された。

[0127] 「実施例 8Ί Defensive buryingテストを用いたリラキシン 3脳室内投与による抗不安

^ (ラット）

Defensive buryingァスト reit et al., Pharamacology Biochemistry and Behavior , 15, p.619-626, 1981)を用いて、リラキシン 3の不安作用へ及ぼす影響を調べた。 Defensive buryingテストは、被験動物に電極を介して電流刺激を与えると、その直後から電極を床敷きで覆い隠す行動をとることを利用して、不安作用やその他の精神症状 (例えばうつ状態)を評価する実験系である。

[0128] リラキシン— 3は、株式会社ペプチド研究所にて合成されたヒト型リラキシン— 3 (以下、単に「ヒト型リラキシン— 3 (ペプチド研究所社製)」と略記する場合もある。）を用いて実験を行った。ヒト型リラキシン— 3は、配列番号 2の N末端力も第 26番目（Arg) 〜第 52番目（Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド (ヒト型 B鎖）と配列番号 2の N 末端力も第 119番目（Asp)〜第 142番目（Cys)のアミノ酸配列力もなるポリペプチド (ヒト型 A鎖）が、配列番号 2の N末端から第 35番目の B鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端力も第 129番目の A鎖のシスティンが結合し、配列番号 2の N末端から第 47番目の B鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端力も第 142番目の A鎖のシスティンが結合し、並びに配列番号 2の N末端力ゝら第 128番目の A鎖のシスティンおよび配列番号 2の N末端から第 133番目の A鎖のシスティンが結合しているポリぺプチドである。

[0129] Π )撒験ラット ^のための tf ^置

F344雄性ラット（7週齢、日本チヤ一ルスリバ一 (株)）に実験動物用飼料 MF (オリェンタル酵母社)を与えて馴化した。ラット（150〜200g)を麻酔下で、側脳室に力- ユーレを挿入した。その後一週間以上、前記ラットを飼育した後にリラキシンー3の投与実験を行った。

[0130] (2) ,験への廳 II

Defensive buryingテスト実施の 3日前より毎日一回、 5cmの高さまで床敷きを敷いた試験箱に被験ラットを導入し 30分間以上放置して、被験ラットを試験環境へ馴化させた。テスト実施時まで試験箱には刺激用電極を取り付けず被験ラットを環境に馴化させた。

[0131] (3)リラキシン— 3溶液の調製

ヒト型リラキシン 3 (ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度 0. 05nmolZラットまたは 1 nmolZラットとなるように調製した。

[0132] (4)リラキシン— 3溶液の脳室内投与

ガイド力-ユーレを装着した被験ラットを 3群に分け、ヒト型リラキシン— 3投与液 (0. 05nmolZラット、 N = 6、 InmolZラット、 N= 8)もしくは vehicle (生理食塩水、 N = 6)各 5 μ Lを 5 μ LZ2分の速度でインフュージョンポンプを用いて投与した。

[0133] (5) Defensive burvingtestの実施と行動観察

試験当日は、刺激用電極を取り付けた試験箱 (床敷きの高さ 5cm)に被験ラットを導入して実験を開始する。被験ラットが刺激用電極に触れた際に 5mAの電気ショックが与えられる。その後、刺激用電極に 5mAの電流を通電したまま被験ラットを放置し、 15分間（900秒)の行動観察を開始した。被験ラットの行動は全てビデオカメラにて撮影し、録画テープを用いて、最初の電気ショックを受けてから 15分間における覆い隠し行動時間（buryingtime (秒)）を測定した。なお、覆い隠し行動は、被験ラットが前足を用いて電極方向へ向けて床敷きをかける行動と定義した。ヒト型リラキシンー 3投与群と vehicle群との比較には、 Dunnett型多重比較検定法による有意差検定を行った。図中において *は、 Pく 0. 05を示す。図 4に示されるように、 vehicle 投与群に比べてヒト型リラキシン 3投与群で、覆い隠し行動時間の低下が見られ、 lnmol投与群では有意な減少が観察された。この結果から、リラキシン 3が抗不安作用を有することが明らかとなった。

[0134] 列 9Ί ^^ + 用いたリラキシン 3 による^: ^ (乍 ffl (マ高架式十字迷路を用いて、リラキシン 3の不安作用へ及ぼす影響を調べた。高架式十字迷路試験は、オープンアームにおける探索行動 (オープンアーム滞在時間など)を指標にして、実験動物 (例えば、ラットまたはマウス)の不安水準の測定ゃ抗不安薬の薬効評価に広く用いられる行動薬理学的試験である。

( 1)撒験マウス脳内投与のための前処置

麻酔下の 7週令の BALBZc雄性マウス（日本チヤ一ルスリバ一 (株)）の側脳室に力ニューレを挿入した。その後一週間以上マウスを飼育した後にリラキシンー3の投与実験を行った。

[0135] (2)リラキシン— 3溶液の調製

ヒト型リラキシン 3 (ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度が InmolZマウスになるように調製した。 [0136] (3)リラキシン— 3溶液の脳室内投与

ガイド力-ユーレを装着した被験マウスに、ヒト型リラキシン— 3投与液 (N = 8)もしくは vehicle (生理食塩水）（N = 9)各 2 μ Lを 1 μ LZ分の速度でインフュージョンポンプを用いて脳室内に投与した。

[0137] (4)杭不^ ^(乍用の沏 I定

抗不安作用の測定は高架式十字迷路を用いて行った。迷路は床力 45cmの高さに設置し、中心に位置する中心プラットフォーム（5cm X 5cm)からそれぞれ広がつた 2つの対立するオープンアーム（長さ 30cm X幅 5cm)と 2つの対立するクローズドアーム（長さ 30cm X幅 5cm X壁高さ 15cm)力らなって!/、る。照明はオープンアームの床面が 60〜80ルクスになるようにセットした。試験は、脳室内投与 10分後にマウスを一方のオープンアームに頭が向くように中心プラットフォームに置いて、 5分間行つた。試験時間は午前 11時から 16時に限定した。マウスの行動はビデオで記録し、試験終了後ビデオ解析により、各マウスのオープンおよびクローズドアームへの進入回数、オープンおよびクローズドアームでの滞在時間を測定した。図 5および図 6に、ォープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計、 5分間中のオープンアームに滞在した割合（％)をそれぞれ示した。ヒト型リラキシン— 3投与群と vehicle群との比較には、 t検定法による有意差検定を行った。図中において *は、 P< 0. 05を示す。図 5に示されるように、ヒト型リラキシン 3投与群と vehicle群間でのオープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計に差はな力つた。し力しながら図 6に示されるように、ヒト型リラキシン 3投与群は vehicle群と比較して、オープンアーム内の滞在時間の割合が有意に高力つた。この結果から、リラキシン— 3には抗不安作用があることが示された。

[0138] 「実施例 10^ + を用いたリラキシン 3 ^^与による^:^ ^乍用 ( ラット）

高架式十字迷路を用いて、リラキシン 3の不安作用へ及ぼす影響を調べた。 ω撒験ラット脳内投与のための前処置

麻酔下の 9週令の Wistar雄性ラット（日本チヤ一ルスリバ一 (株)）の側脳室に力- ユーレを挿入した。その後一週間以上飼育した後にリラキシンー3の投与実験を行つた。

[0139] (2)リラキシン— 3溶液の調製

ヒト型リラキシン 3 (ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度が lOpmol/ラットまたは 50pmolZラットになるように調製した。

[0140] (3)リラキシン— 3溶液の脳室内投与

ガイド力-ユーレを装着した被験ラットに、ヒト型リラキシン— 3投与液（lOpmolZラット、 N = 8、 50pmolZラット、 N= 7)、もしくは vehicle群（生理食塩水、 N = 7)各 5 μ Lを 2. 5 μ LZ分の速度でインフュージョンポンプを用いて投与した。

[0141] (4)杭不^ ^(乍用の沏 I定

抗不安作用の測定は高架式十字迷路を用いて行った。迷路は床から 50cmの高さに設置し、中心に位置する中心プラットフォーム（10cm X 10cm)からそれぞれ広がつた 2つの対立するオープンアーム（長さ 50cm X幅 10cm)および 2つの対立するクローズドアーム（長さ 50cm X幅 10cm X壁高さ 40cm)力らなって!/ヽる。照明はォープンアームの床面が 60〜80ルクスになるようにセットした。試験は、脳室内投与 10分後にラットを一方のオープンアームに頭が向くように中心プラットフォームに置いて 5 分間行った。試験時間は午前 11時から 16時に限定した。ラットの行動はビデオで記録し、試験終了後ビデオ解析により、各ラットについて、オープンおよびクローズドアームへの進入回数、オープンおよびクローズドアームでの滞在時間を測定した。図 7 および図 8に、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計、 5分間中のォープンアームに滞在した割合 (％)をそれぞれ示した。ヒト型リラキシン— 3投与群と ve hicle群との比較には、 Dunnett型多重比較検定法による有意差検定を行った。図中において *印は、 P< 0. 05を示す。図 7に示されるように、 lOpmolZラット投与群、 50pmolZラット投与群は vehicle群と比較して、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計に差はなかった。し力しながら図 8に示されるように、 lOpmol/ ラット投与群および 50pmolZラット投与群は vehicle群と比較してオープンアーム内の滞在時間の割合が高ぐ lOpmolZラットの作用は統計学的に有意であった。この結果から、リラキシン 3には抗不安作用があることが示された。

産業上の利用可能性リラキシン 3は抗不安作用を有するので、例えば、不安の治療に有用である。また、リラキシン一 3が抗不安作用を有することから、リラキシン一 3受容体の賦活ィ匕または抑制化をする化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、不安の治療に利用可能であり、リラキシン 3受容体の賦活ィヒまたは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーユング用キットは有用である。

Claims

請求の範囲

[1] リラキシン 3、その塩、ある、はこれらの水和物を含有する抗不安剤。

[2] リラキシン— 3が、ヒト型リラキシン— 3である、請求項 1に記載の抗不安剤。

[3] リラキシン 3が、リラキシン 3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリべプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B 鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチドである、請求項 1に記載の抗不安剤。

[4] 次の工程;被験物質を、

(A)リラキシン— 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、

[5] 次の工程；

[6] リラキシン— 3が、ヒト型リラキシン— 3である、請求項 5に記載のスクリーニング方法

[7] リラキシン 3が、リラキシン 3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリべプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B 鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチドである、請求項 5に記載のスクリーニング方法。

[8] 次の工程； (B)リラキシン 3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、

をさらに含むことを特徴とする、請求項 5〜7のいずれか一項に記載の不安を抑制または亢進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 4〜8のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

SALPR力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 9に記載のスクリーニング方法。

リラキシン 3受容体またはリラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング用キット。

リラキシン 3、その塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、請求項 11に記載のスクリ一ユング用キット。

リラキシン一 3が、ヒト型リラキシン一 3である、請求項 12に記載のスクリーニング用キッ卜。

リラキシン 3が、リラキシン 3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリべプチド力得られる A鎖および B鎖もしくはリラキシン 3のプレプロプロテインの相同ポリペプチド力得られる A鎖および B鎖力なるポリペプチドであって、 A鎖および B 鎖のシスティン残基がジスルフイド結合により結合されて、るポリペプチドである、請求項 12に記載のスクリーニング用キット。

リラキシン一 3が標識されて、る、請求項 12〜14の、ずれか一項に記載のスクリーユング用キット。

リラキシン 3受容体が、 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする、請求項 11〜15のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。

SALPR力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項 16に記載のスクリーニング用キット。

リラキシン— 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の不安作用を測定する工程を含むことを特徴とする、不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。

[19] 不安作用を測定する工程が、 defensive burying testまたは高架式十字迷路試験である、請求項 18に記載のスクリーニング方法。

[20] リラキシン 3受容体に作用する化合物力請求項 4〜 10のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項 18または 19に記載のスクリ一ユング方法。