JPH06510045A - 心臓血管の治療および神経退化性疾患の治療におけるリラキシンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 心臓血管の治療および神経退化性疾患の治療におけるリラキシンの使用発明の分 野 本発明は、心臓血管治療の分野に由来するものである。より詳細には、本発明は 心臓血管治療、特に病理学的に遅い心拍数（除脈）を特徴とする心不全および心 臓血管疾患の治療におけるリラキノンの使用に関する。さらに本発明は、神経退 化性疾患の治療におけるリラキンンの使用に関する。

背景の技術 心不全は、体内組織の代謝的な必要性に対して供給することが必要とされる血液 を動かす心臓ポンプの不能として定義される。ポンプの能力の低下は、心筋組織 の損失または損傷から生じることが最も多い。結果として、心室を空にすること が抑制され、これは心室充満圧および心室壁応力の上昇ならびに心拍出量の減少 を導く。心拍出量の減少に対する生理的な反応として、多くの神経内分泌反射が 活性化され、これは全身性の血管収縮、心臓および液体貯留の交換神経刺激をひ き起こす。これらの反射反応は最初は心拍出量を増強させる傾向があるが、長期 においては有害である。結果として生じる末梢抵抗の上昇は、心臓における後負 荷を上昇させ、血液容量の増加はさらに心室充満圧を上昇させる。心臓の増大し た交換神経刺激と共に、これらの変化は残りの機能的な心筋に対して代償不全に なる必要性を一層そして頻繁に導く。

多くの心臓血管疾患の通常の終点であるうっ血性心不全は、心臓が末梢組織を十 分に潅流することができない場合に結果として生じる。最近の推計によれば、こ の疾患であると診断された人は米国内に約４００万人が存在し、これらの症例の ５０％以上は診断から５年以内に致命的となる［丁ａｌｏｒ、　Ｍ、　Ｄ、ら、 　、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ：ｓ　ｉｎ　Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、　２２．８５ −９４　（１９８７）］。

うっ血性心不全を含む心不全に対する最近の治療は、心筋に対する過度の要求を ひき起こさずに心拍出量を増大させることに焦点を合わせている。これらの目的 を達成するために、血液容量を減少させ、末梢抵抗を低下させ、そして心収縮力 を増大させるための利尿薬、血管拡張薬および変力性薬物のさまざまな組み合わ せが用いられている。従って最近の治療は、個々の患者の臨床的必要性を達成す るために多数の薬物の効果を釣り合わせることに依存しており、用いられる薬物 に対する副作用により悩まされている。

例えば、利尿薬はカリウムおよびマグネシウムの血漿濃度を減少させ、ジキタリ ス投与を受けている磨者において不整脈の発生を増加させる。利尿薬は容量の涸 渇による硝酸塩の循環効果を強化し、心臓の充満圧、心拍出量および全身性動脈 圧の減少を導くことができる。

αアドレナリン拮抗薬は、全身性動脈圧の著しい降下を導き、冠状動脈の潅流を 損なうことがある。

アンキオテンノン変換酵素阻害物質は、動脈圧に対して同様の効果を有し、カリ ウムの血漿濃度の過度の上昇をさらに導くことがある。

正の変力を導く薬物、例えばジキタリスおよびβアドレナリン拮抗薬は不整脈を 誘発する可能性を有する。さらに、ジキタリスは狭い治療指数を有し、レセプタ ーの下方調節のためにカテコールアミン類似体は全てそれらの効力を急速に弱め る傾向がある。

ゆえに、生理学的に統合された動脈および静脈血管拡張および心筋変力の応答を 導き、理性用いられている治療薬の不利益がない治療薬に対する必要性が存在す る。

同様に、多数の患者が心臓不整脈を患っている。心拍数を設定するインパルスは 洞房結節（ＳＡ結節）中で形成されており、ゆえにこの洞房結節は心臓の主ペー スメーカーとも称されている。また、自発的作用の可能な形成は、分化した心房 細胞中、房室間（Ａ　Ｖ　）接合部のいくつかの領域中、およびヒス−プルキン エ線維中に示され得る。これらの領域は補助的なペースメーカーとして機能する 。正常な心臓において、ＳＡ結節において生じるインパルスの心室への伝導は、 房室結節（ＡＶ結節）を通して排他的に発生する。正常な心拍数は、年齢、性別 、身体の活動を含む多くの因子に依存して有意に変化し得るが、ヒトにおける正 常な洞調律は、約６０〜１００拍動／分の間の頻度で洞房結節に始まるインパル ス形成として任意に規定される。

ヒトの患者における洞房の除脈は、成人のＳＡ結節が約６０拍動／分以下の速度 て放出するときの状態として定義される。無症候性の除脈の治療は通常は必要て ないが、さまざまな状況、例えば心拍出量が不十分であるかまたは不整脈が遅い 心拍数に関係している場合には治療が必要である。さらに、いくつかの形態の心 臓手術の後、心拍数を不適当に遅くさせるであろうある種の薬物の投与の間、そ して症候性の除脈を有する患者へのペースメーカー移植の前などに症候性の除脈 が起こりそうな場合は治療が必要であろう。

心拍数を上昇させるための現在の薬理的なアプローチは、アトロピンまたは、心 筋の虚血が存在しない場合にはイソプロテレノールの投与を基礎とするのが普通 である。また、エフェドリン、エピネフリン、ヒドララジンまたはテオフィリン は症候性の除脈を有するある種の患者の管理において有用であろう。これらの全 ての薬物は多少とも重篤な副作用を伴っており、速すぎる心拍数を生み出さない ように非常に注意して投与する必要がある。アトロビンの効果は比較的一時的な ものであり、この薬物は多くの患者において比較的効果がなく、時には心拍数の 抑制されない上昇を導き得る。イソプロテレノールは、ＳＡ結節が適当に機能し てＡ〜′結節への伝導が無傷である場合には効果的であるが、これもまた心室の 不整脈を導き得る。［例えば、「心疾患」「心臓血管薬のテキストＪ、　Ｅ、Ｂ ｒａｕｎｗａｌｄ編。

第３版、　１９８８．　Ｗ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏｆｆ１ｐａｎｙ、　２ ２および２３章；「心臓学・基礎および実際Ｊ、Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ、Ｒ， Ｏら編、Ｙｅａｒ　Ｂｏｏｋ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌ、　Ｉｎｃ、、　Ｃｈ ｉｃａｇｏ、　Ｌｏｎр盾氏B ２９章を参照］。

従って、安全に投与されて心拍数を予測できるレベルに滴定することができ、心 室の刺激反応性を増大させないかまたは心室細動に対する域値を低下させる治療 薬に対する必要性が存在する。この性質を有する薬物は、例えば下壁心筋梗塞後 の一過性の除脈の治療において、一時的なペースメーカーの緊急移植を必要とす る患者を安定化するために、さらに例えばジキタリス、βブロッカ−またはカル シウム拮抗薬などの過剰投薬にょる除脈の管理において有用であろう。

成熟ヒトリラキ／ンは、約６０００ダルトンのジスルフィド架橋されているポリ ペプチドホルモンであり、これは多くの種において妊娠中に著しい濃度の上昇を 示すことが知られており、出産過程を容易にする分娩前の生殖路の再造形を担う ことが知られている。

リラキシンは、Ｆ、Ｌ、Ｈｉｓａｖ［Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏ］、Ｍ ｅｄ、　２３．６６１　（１９６２）コにより発見され、雌ブタ黄体からこのホ ルモンの粗水性抽出物を得たＦｅｖｏｌｄら［Ｊ、　Ａｔ　Ｃｈｅ＋ｓ。

Ｓｏｃ、　５２．３３４０　（１９３０）］からその名前を得た。粗すラキシン 調製物に関する多数の観察により、リラキンンは妊娠および分娩の間におそらく 重要な役割を果たしているであろうという考察が導かれた。

１９７４年から１９８】年の間に、高度に精製されたりラキシンが、妊娠したブ タ［Ｓｈｅｒｗｏｏｄおよび０°Ｂｙｒｎｅ　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｒａ、Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、１６０．１８５　（１９７４）コ、ラット［ＳｈｅｒｗB キシンが、つ７　［５ｔｅｖａｒｔ、　Ｄ、　ＲおよびＰａｐｋｏｆｆ、　Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ｆ１９．１０９３　（１９８６）n およびウサギ［Ｅｌｄｒｉｄｇｅ、　Ｒ，ＫおよびＦｉｅｌｄｓ、　Ｐ、＾、、 「リラキシンの生物学およびヒトにおけるその役割」中、　Ｍ、Ｂｉｇａｚｚｉ ら編、　３８９−３９１．　Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｃａ、　Ａｍ５ｔｅｒ ｄａ１１（１９８３）］の胎盤から単離された。部分精製されたりラキシンは、 雌牛およびヒト黄体（ＣＬ）、胎盤および脱落膜から得られた。ヒトにおいて、 リラキシンは妊娠中の黄体中に最も豊富に存在することが知られているが、リラ キンンは非妊娠女性ならびに男性（精液）においても検出されている［Ｂｒｙａ ｎｔ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｇ、Ｄ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ 　ｐ、　６２−９０　（１９８２）およびｔｅｉｓｓｅ、　Ｇ、、＾ｎｎ、Ｒｅ ｖ、Ｐｈｙｓｉｏ１．４６D４３− ５２　（１９８４）］。

精製されたりラキシンの入手可能性により、ブタ［Ｊａｍｅｓら、　Ｎａｔｕｒ ｅ　２６７、５４４（１９７７）：　５ｃｈｖａｂｅら、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅ ｓ、Ｃｏｍ＋ｎｕｎ、７５．　５０３　（１９７７）］、ラット［Ｊｏｈｎら、 u ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１０ｇ、　７２６　（１９８１）コおよびサメ［Ｓ ｃｈｗａｂｅら、　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　R８０． ６　（１９８２）］由来のりラキンンのアミノ酸配列決定が可能となった。

ヒト黄体、胎盤および脱落膜由来のりラキシンを精製するための努力がなされて きたが、ヒトリラキシン調製物のいずれも高度に精製されたことは示されなかっ た。

組換え法は、最初にラットおよびブタリラキシンに対するｃＤＮＡクローンの単 離に適用された［Ｈｕｄｓｏｎら、　Ｎａｔｕｒｅ　２９１．１２７　（１９８ １）；　Ｈａｌｅｙら７更値１，１５５　（１９８２）］。ブタリラキンン遺伝 子由来のプローブを用いたゲノムクローニングにより２つのヒト遺伝子型が同定 されているが［Ｈｕｄｓｏｎら、　Ｎａｔｕｒｅ　３０１．６２８　（１９８３ ）：Ｈｕｄｓｏｎら、　ＥＭＢＯＪ、　３．２３３３　（１９８４）；および米 国特許番号４．７５１１１．５１６（１９８８年７月１９日発行および４．８７ １．６７０（１９８９年１０月３日発行）］、これらの遺伝子型のうち１つのみ （Ｈ２と称する）が黄体において転写されることが見いだされている。他方の遺 伝子は別の組織部位で発現されるのか否か、または偽遺伝子を表しているのか否 かは明らかではない。Ｈ２リラキシンが卵巣中で合成され発現されるという事実 は、これが妊娠の生理機能に直接関与する配列であることを示唆する。

リラキシンは、ジスルフィド結合により結合されたＡおよびＢと称する２つのペ プチド鎖からなり、八−鎖内にインスリンと類似した様式の鎮内ジスルフィドル ープを有する。２つのヒトリラキシン遺伝子はヌクレオチドおよびアミノ酸配列 のかなりの相同性を互いに示すが、特にＡ−およびＢ−鎖両方のアミノ末端領域 において配列の相違を有するい（つかの顕著な領域が存在する。

リラキシンの構造は、進化中に種の間でかなり分岐したことが明らかである。

ブタ、ラット、サメおよびヒトリラキシンの間には４０％から４８％のアミノ酸 配列の相同性しか存在しない。

調べた全ての種と同様に、Ｈ２リラキシンの一次翻訳生成物は２５アミノ酸のシ グナル配列、続いて約２９〜３３アミノ酸のＢ鎖、１０４〜１０７アミノ酸の連 結ペプチド（Ｃペプチド）および２４アミノ酸のＡ鎖からなるプレプロレラキシ ンである。リラキシンの生合成の間に、形成期ペプチド鎖が小胞体を横切って移 動すると同時にシグナルペプチドは迅速に除去される。得られたプロホルモンの りラキンンへの後続のプロセシングおよび特にリラキシンにおけるＣペプチドの 機能は完全に理解されていない。１つの機能は、おそら（正しいジスルフィド結 合がＢおよびＡ鎖の間に形成されるように前駆体の折り畳みを指令するものであ ろう。

１９８８年の時点でのりラキソンについての知識の簡潔な総論は、Ｓｈｅｒｗｏ ｏｄ、　Ｄ［ｒ生殖の生理学」中、１６章、「リラキシンＪ、　［１ｏｂｉ１． 　Ｅ、およびＮｅ１１１．　Ｊ、ら編、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ、、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｐｐ、５８５−６７３　（１９８ｇ）］により提供された 。

リラキンンが、末梢血漿中、黄体形成ホルモンの周期中央の高まりの７〜１０日 後に上昇し、妊娠が発生した場合には上昇し続けて３週間で８００ｐｇ／ａ＋１ 以上のレベルに達することが知られている［５ｔｅｖａｒｔ、　Ｄ、　Ｒ，ら、 　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｅｎｄｏ、Ｍｅｔａｂ、　７０゜１７７１（７７３（１９９０ ）］。妊娠中、リラキンンの血清濃度は同種ラジオイムノアッセイにより測定し たときに、およそ１０週までに最も高くなり、妊娠の残りの期間に約５００ｐｇ ／＋ｎｌルベルニ達する［Ｂｅ１ｌ、　Ｒ，Ｊ、ら、　０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅ ｃｏｌ、　６９．５８５−５８９（１９８７）］。

上記のそして同様の生理学的な発見を考慮すると、リラキンンは一貫して妊娠状 聾と関係しており、その既知の有用性のほとんどはこの状態と関係している。

Ｈ２リラキンンは、子宮頚の成熟、妊娠子宮内膜の肥厚ならびにこの領域への血 管新生の増大、およびコラーゲン合成に対する効果を含む、出産過程を容易にす るための生殖路の再造形を行うことが開示されている。さらにＨ２リラキシンは 乳汁分泌と関係しており、リラキンンは乳房組織に対して成長促進効果を有して いることがいくつかの報告により示されている［Ｗｒｉｇｈｔ、　Ｌ、　Ｃ，お よびＡｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｒ。

察に基づく臨床研究により、卵巣由来のブタリラキンンは閉塞的末梢動脈性疾患 から発生するレイノー病変の治癒において有益であることが示されている［Ｃａ ５ｔｅｎ、　Ｇ、　Ｃ，およびＢｏｕｃｅｋ、Ｒ，Ｊ、、　Ｊ、ＡｍＪｅｄ、Ａ ｓ５ｏｃ、　１６６、３１９−３２４　（１９５８）；　Ｃａ５ｔ■氏AＧ、Ｃ ０ はりラキンンの生物活性を有することが報告されており［Ｗｅｉｓｓら、＾ｖａ 、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ。

Ｇｙｎｅｃｏｌ、　１５４．７４９　（１９８６）］、リラキンンはヒト精子ノ 移動性ヲ高メルト考エラれている。

結合組織に対するリラキシンの効果により、リラキシンは皮膚の弾性を改善し得 ることが示唆されている。

妊娠した女性においては心拍数は受胎後２週間まで上昇し、約７拍動／分の上昇 を示し、上昇を続けて１０週目までに約１０拍動／分の上昇が達成されることが 観察されている［Ｃ１ａｐｐ、　Ｊ、　Ｆ、　、＾ｍ、Ｊ、０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙ ｎｅｃｏ１．１．５２．６５９−６６０　（１，９８５）n。

妊娠初期におけるこの変化は、妊娠女性における循環リラキシンの最初の上昇と 一致する［Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｄ、　Ｒら、上記］。

同様に、受胎後３週まで心拍出量は増大し、全末梢抵抗は減少し、各々＋０゜５ ２リットル７分および−１１３６ｙｎ、ｒ’、ｃｒ’の変化を示す。心拍出量は 上昇を続け、全末梢血管抵抗は減少を続けて、１０〜１４週の間に各々＋２．２ １リットル／分および−４３３ｄｙｎ、　ｓ−’、　ａｍ−’に達し、その後に これらの値付近で横ばい状態になる［［１ｏｂｓｏｎ、　Ｓ、　Ｃ，ら、　ＡＩ ｌ、１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２５６．　Ｈ２Ｓ（＋−Ｈｌ０６５　（１９８９） コ。

特別の状況下での血圧および血管に対するリラキシン投与の効果についての散在 する報告があるが、報告された観察が潜在的な治療的関連を持ち得ることに関し ていかなる示唆も記載されていない。

ラット盲腸間膜へのブタリラキシンの局所的適用は、細静脈を拡張させ、ノルエ ピネフリンおよびプロメタシンの血管収縮性の効果に拮抗することが見いだされ た［Ｂｉｇａｚｚｉ、　ＩＩ　ら、Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　υ２．　 ２９６−２９９　（１９８６）＋　ＤｅＬＭｅｓｅ、＾、轣A「リ ラキンンの生物学およびヒトにおけるその役割」中、　Ｂｉｇａｚｚｉ、Ｍ、ら 編、　２９１−２９３゜Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉｃａ、　Ａｍｓｔｅｒｄａ ｍ　（１９８３）］。自然高血圧ラットへのラットリラキシンの２日間にわたる 長期注入は、潅流された腸間膜動脈に対するノルエピネフリンおよびバンプレシ ンの鈍い血管収縮性効果を導くことが報告されている［１Ｉａｓｓｉｃ。

ｔｉｅら、　Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、ＢｉｏＬＭｅｄ、１９Ｃ１，２５４− ２５９，（１９８９）］。しがし、これらの観察の生理学的な意義ははっきりし ないままであり、リラキシンが全末梢血管抵抗に影響を及ぼすか否かは知られて いない。

さらにまた、動脈血圧に対するリラキンンの可能な効果についてのいくつかの報 告は混乱させるものであり矛盾している。

Ｍｉｌｌｅｒら［Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、ｙ世、　 ４２６−４２７　（１９５７）］は、妊娠した雌ブタ卵巣の抽出物を麻酔下のイ ヌに注射した場合に、血圧の一次的な降下をひき起こすことを最初に報告した。

対照的に、精製されたブタリラキンン５０μｇまでの抽出物の注射は麻酔下のラ ットにおいて血圧に影響を及ぼさなかった［Ｐｏｒｔｅｒら。

Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　８３．１８３−１９２　（１９７９）］。

ラノトリラキン〉の長期注入は、動脈圧に対していかなる効果も有さないことが 正常血圧の非妊娠ラットにおいて［Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＪおよびＭａｓｓｉ ｃｏｔｔｅ、Ｇ、、　Ｌｉｆｅ　Ｎｅ仙の出版物により、ウレタン麻酔したラッ トにおけるブタリラキノンの静脈内注射が動脈圧を上昇させることが示されてい る［Ｊｏｎｅｓ、　Ｓ、＾、およびＳｕｍ＋ａｅｒｌｅｅ、＾ＪＳ、、Ｊ、Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、（Ｌｏｎｄｏｎ）、３８１：　３７Ｐ　（１９８６）；　Ｍｕｍｆ ｏｒｄ、＾、Ｄ、ら、Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ盾撃盾■ Ｘ　耳字、７４７−７５５　（１９８９）：　Ｐａｒｒｙら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｅ ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　２．　５３−５８　（１９９０j］。

動脈圧の上昇は、バソブレンンの遊離により主に媒介されると考えられている［ Ｐａｒｒｙ、　ｌ−、Ｊ　ら、Ｌ竺凹夕曹襲匹す凹社ｏｇｙ　２．　５３−５８ 　（１９９０）］。

ブタリラキ／ンの脳室内注入はウレタン麻酔下のラットにおける動脈圧を上昇さ せることが見いだされた［Ｍｕｍｆｏｒｄ、ＡＤら、！。Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ｏｇｙ　１２２．７４７−７５５　（１９８９）］。

これらの矛盾した発県ゆえに、動脈圧に対するリラキンンの効果はどう考え°Ｃ もはっきりしない。

ブタリラキノンの静脈内または脳室内注入は、つｌメタン麻酔下のう・ソトにお け・フル、・拍数を十昇させることが見いだされている［Ｐａｒｒｙ、　Ｌ、　 Ｊ、ら、　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏ１ｏ３Ｖ　２．、　５３−５８　 （１９９０）；　Ｍｕｎ＋ｆｏｒｄ、Ａ、Ｄ　ら、Ｊ、Ｅｎｃｌｏｃｒｉｎｏｌ ｏｇｙ　ｊ２２．　７４V−７５０　（１９８ ９）］。

リラヤノンのさまざまな生理学的効果の解釈は非常に難しく、リラキンンの分子 レベルての作用機序についてはほとんど知られていない。リラキシンは子宮組織 または細胞中［Ｂｒａｄｄｏｎ、Ｓ、Ａ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１０ ２．１２９２（２９９（１９７ｇ）；　５ａｎｂｏｒｎ。

ら、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、　２６６４７−６５６ 　（１９９０）］、さらに下垂体細胞中［Ｃｒｏｎｉｎ、　Ｍ、　Ｊ　ら、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｗｕｎ、１４８．　１２４６−１ ２５１　（１９８７）］のｃＡＭoレ ベルを上昇させることが知られているが、リラキンン作用の媒介物としてｃＡＭ Ｐがどのように作用するかについての決定的な証拠はない。

リラキノンは、エストロゲン−プライム化ラット子宮において、子宮のミオノン 軽鎖キナーゼ活性およびミオノン軽鎖リン酸化を減少させ、次いでＣａ”−活性 化アクトミオシンＡＴＰアーゼを阻害することが報告されている［Ｎ１５ｈｉｋ ｏｒｉら。

Ｅｎｄｏｃｒｊｎｏｌｏｇｙυ、１．　１７４３−１７４５　（１９８２）：　 Ｎ１５ｈｉｋｏｒｉら、Ｌ旦ｉｏ１．Ｃｈｅｗ、２５８．　Q４６８ −２４７４　（１９８３）］。リラキシンがミオノン軽鎖キナーゼを阻害する機 構は未だ解明されていない。

また、リラキノンの作用機序を理解するための別の重要な領域、すなわちリラキ ンンレセプターの研究は初期の段階にある。既に、Ｍｅｒｃａｄｏ−３ｉ■ｍｅ ｎら［Ｊ、　ＢＩｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２５５．３６１７−３６２３　（１９８０）；　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌｏｇｙ　１１０．２２０−２２６　（１９８２）；　Ｂ奄盾戟AＲｅｐ ｒｏｄ、　２６．１２０１２８　（１９ｇ２）］は、］′２５Ｉ−ラベル化ブタ リラキシを用いたラットおよびブタの子宮およびブタの子宮頚管のりラキシンレ セブターの部分的な特性化を報告している。１′Ｉ−ラベル化ブタリラキシンは Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘカラムにより部分的にのみ精製され、化学的には十分に特性 化されなかった。卵巣ｃＤＮＡクローンから得たヌクレオチド配列に基づく構造 を有する、生物学的に活性な合成ヒトリラキンンの入手可能性は、最近、特異的 なヒトリラキシンレセブターの最初の本発明は、リラキンンが雄性および雌性ラ ット両方の心房中のレセプターに特異的にそして高い親和性をもって結合すると いう全（意外な発見に基づいている。

さらに本発明は、ラット心臓から得た心房が直接リラキシンに反応し、より詳細 には単離されて自発的に拍動している右心房における収縮速度および単離され電 気的に整調された左心房の収縮力をリラキンンが上昇させるという意外な発見に 基づいている。

リラキシンが妊娠に関係したホルモンとして最も良（知られているという事実を 考慮すると、雄性および雌性ラット両方の心臓におけるリラキシン結合部位の本 発明者らの発見は予測されなかったものであった。

ラット（雄性および雌性）心臓由来の心房は収縮速度および収縮力の上昇により リラキンンに直接反応するので、リラキシンは心不全（慢性および急性）の治療 に対する有望な候補物質である。

本発明はさらに、リラキシンが、無傷のＳＡ結節の不在下で明らかにＳＡ結節の 下流に存在する補助的なペースメーカーによりもたらされる刺激の速度を上昇さ せることにより心拍数を有意に上昇させ得るという意外な発見に基づいている。

リラキノンが心拍数を上昇させ得ることを示している以前の文献は、全て、完全 な健康な心臓、またはインビトロ調製物を用いた場合にはＳＡ結節を含む心房に ついて言及している。リラキシンは室筋細胞に対してはほとんど効果を有さない 一方で、機能的なＳＡ結節の不在下で心拍数を上昇させ得るというこの観察が、 ＳＡ結節の機能不全の故に遅い心拍数となっている状態を含む除脈の治療に対し てリラキンンを有望な候補物にする。

さらに本発明は、リラキンンｍＲＮＡが脳内の、記憶過程に関与する領域内で合 成されるという発見に基づいている。

１つの態様において、本発明は、病理学的に減少した心拍出量を呈している患者 に、心房中のりラキンンレセプターに特異的に結合して心房の収縮力または酸槽 速度を上昇させ得る化合物の治療的有効量を投与することにより心拍出量を増大 させるための方法に関する。

別の態様において、本発明は、心不全を治療するための方法であって、このよう な治療を必要とする患者に、心房中のりラキシンレセブターに特異的に結合して 心房の収縮力または収縮速度を上昇させ得る化合物の治療的有効量を投与するこ とによる方法に関する。

さらに別の態様において、本発明は、心臓の変力性または変時性を刺激する方法 であって、このような刺激を必要とする患者に、心房中のりラキノンレセプター に特異的に結合して心房の収縮力または収縮速度を上昇させ得る化合物の治療的 有効量を投与することによる方法に関する。

またさらに別の態様において、本発明は、急性心不全後の心機能を回復させる方 法であって、このような治療を必要とする患者に、心房中のりラキシンレセブタ ーに特異的に結合し得る化合物を含む液体医薬製剤の、心筋収縮性を低下前のレ ベルに回復させ得る量を静脈内投与することからなる方法に関する。

別の態様において、本発明は、病理学的に遅い心拍数を有する患者に、心臓にお けるリラキンンレセブターに特異的に結合し得る化合物の、心拍数を正常なレベ ルに上昇させ得る量を投与することからなる除脈の治療のための方法に関する。

轡者はヒトであるのが好ましい。

さらに別の態様において、本発明は、神経退化性疾患を治療するための方法であ って、このような治療を必要とする患者に、脳、特に前嗅覚核および／または海 馬におけるリラキシンレセプターに選択的に結合し得る化合物の治療的有効量を 投与することによる方法に関する。この治療は、他の治療、例えばアルツハイマ ー病などの神経退化性疾患の治療に有用な他の治療薬の投与と組み合わせてよい 。

これらの方法の好ましい態様において、リラキンン、より好ましくはヒトリラキ ノン（両者は以下に定義する）を用いる。

本発明のこれらのそしてさらに別の態様は、以下に示す詳細な説明から明らかと な５であろう。

図面の説明 図１は、１１００ｎ非ラベル化リラキンンの不在（Ａ）および存在下（Ｂ）、な らびに１１００ｎ　ＩＧＦ−１の存在下（Ｃ）の雌性ラット心臓に対する”Ｐ− Ｈ２リラキシン（以下、３２ｐリラキンンと称するＸ１Ｘ１００ｐの結合を表す 。１００ｐＭ１００ｐリラキンンの雄性ラット心臓に対する結合は図ＩＤに示す 。組織切片に対する結合およびコンピューターによる結合オートラジオグラフィ ーのイメージ分析は、実施例１に記載のように行った。低〜高結合強度はＯＤ単 位で示す。Ａにおける矢印は心房の領域を指す。組織学については図４Ｅを参照 。

図２は、ラット子宮（Ａ）、雌性ラット心臓の心房（Ｂ）およびエストロゲン処 置した卵巣摘出ラットの心房（Ｃ）における非ラベル化すラキシンによる３！Ｐ −リラキノンの結合の置換を示す。一連の組織切片と、濃度を増大させた非ラベ ル化すラキノンの不在（Ｂｏ）および存在（Ｂ）下に１００Ｍ”Ｐ−リラキシン とインキュベートした。コンピューター化された濃度計により結合強度を分析し て、ＯＤ単位または放射活性（ｃｐｍ）とし７て表した。詳細には、予め決定さ れた均一な大きさくＲＡ　Ｓ−３０００スクリーン上、９關２）の正方形を各々 の特定の領域における最大結合を有する範囲の上に置いた。ＯＤまたはｃｐｓは 、５０〜２０００ＣＩ）１１の範囲の平行する３２ｐ−リラキシン標準に基づく 、その特定の正方形内の強度の総和を示す。バックグラウンド結合は全ての示数 から差し引いた。ＯＤｏ、０５に対応する結合強度が容易に検出され、バックグ ラウンドの結合から分離された。各点は各領域内の５個の最も高い結合範囲の平 均を表す。各パネルにおける２つの曲線は各組織：Ａ中、ム：子宮角、ロ：子宮 順管、ＢおよびＣ中、△、ム：右心房、口８左心房における２つの別の領域にお ける測定値を表す。置換データを４助変数方程式に当てはめ、リラキノンに対す る解離定数（Ｋｄ）は、Ａにおいて１．３±０．２２ｎＭ；Ｂにおいて１．３７ ±Ｏ，１３ｎＭ：およびＣにおいて０．８６±０゜３５ｎＭと算出された。

図３は、雌性ラット心臓の心房における非ラベル化Ｈ１リラキシンによる３２′ Ｐ−Ｎ２リラキシンの結合の置換を示す。ロ：左心房：ム：右心房。

図４は、Ａ：卵巣摘出雌性ラット；Ｂ：エストロゲンで処置した卵巣摘出雌性ラ ット、Ｃ：正常周期の雌性ラット；およびＤ・エストロゲンで処置した正常な雌 の心房における１１００ｐ　３”Ｐ−リラキノンの結合を示す。増大したスペク トルがＤ中に示されている。Ｅは、Ｃにおいて中の印を付けた領域に相当する、 ヘマトキンリン−エオシン染色された雌性ラット心臓切片の一部分である。元の 倍率１０× 図５は、自然高血圧（ＳＨＲ）雌性ラットの心拍数に対するＮ２リラキシンの連 続皮下注入の効果を示す。

図６は、正常血圧の非妊娠雌性スプラグ−・ドーリ−（Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗ ｌｅｙＸＳ　Ｄ）ラットの心拍数に対するＮ２リラキンンの連続皮下注入の効果 を示す。

図７は、図５と同じ自然高血圧（ＳＨＲ）ラットにおいてＮ２リラキシンの連続 皮下注入に反応した子宮重量の増加を示す。

図８は、図６と同じ正常血圧の非妊娠雌性スプラグ−・ドーリ−（Ｓ　Ｄ）ラッ トにおいてＮ２リラキンンの連続皮下注入に反応した子宮重量の増加を示す。

図９は、インビトロでのりラキシン処置に反応した雄性ラット右心房の心拍数の 用量依存的な上昇を示す。

ｉｌｏは、インヒトａでのリラキシン処置に対する雄性ラットの電気的に整調さ れた左心房の反応を示す。

図１１は、無傷のラットの単離された心臓調製物（・）および心房除去後（ＯＸ ｎ＝６）におけるヒト組換えリラキノンの変時性の効果を示す。これらを無傷の 調製物におけるアドレナリンの効果（ロ）（ｎ＝６）と比較する。各点は、平均 ±ｓ、ｅ。

平均を表す。星印は、各点とその個々の基礎的な速度の間の統計的な有意性を示 す。

図１２は、無傷のラットの単離された心臓調製物（・）（ｒ＋−４）および心房 除去１（ＯＸｎ＝６）におけるヒト組換えＮ２リラキシンの変力性の効果を示す 。これらを嘩傷の調製物におけるアドレナリンの効果（口Ｘｎ＝６）と比較する 。各点は、平均±ｓ、ｅ、平均を表す。星印は各点とその個々の基礎的な発生圧 力の間の統計学的な有意性を示す。

図１３は、ラット脳＝１）前嗅覚核（ＡＯＮ）；　２）蓋ひも（ｔｔ）　：　３ ）梨状皮質（Ｐｉｒ）；および４）海鳥、特に歯状回（ＤＧ）および海馬構成体 （ｈｆ）のＯＡ１〜４野におけるクラキシンｍＲＮＡ合成を検出するために行っ たｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン実験の結果を示す。

発明の詳細な説明 本発明以前に、リラキノンに対するレセプターは、部分的にのみ精製され化学的 には特性化されていない１２５Ｉ−ラベル化ブタリラキシンを用いることにより 、ラットおよびブタの子宮およびブタの子宮頚管の膜において部分的に特性化さ れている［）Ｉｅｒｃａｄｏ−３ｉｍｍｅｎ、　Ｒ，Ｃら、　Ｊ、ＢｉｏＬ、Ｃ ｈｅｍ、　２５５．３６１７−３６２３　（１９８０）；　Ｍ■窒モ≠■ ｏ−３ｉｍｍｅｎ、　Ｒ，Ｃ，ら、Ｉ：１ｄＯ（ｒｉｎｏｌｏｇｙ貝０．　２２ ０−２２６　（１９８２）；Ｍｅｒｃａｄｏ−３ｉａ＋ｍｅ氏AＲ，Ｃ。

化ヒトリラキシン（３２Ｐ−リラキノン）を用いて、特異的なりラキシン結合部 位がリカンドオートラジオグラフィーにより、子宮、子宮頚管および脳において 同定されている［０ｓｈｅｒｏｆｆ、　Ｐ、　Ｌら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、　２６５．９３９６−９４０１　（１９９０）＋　０ｓｈｅｒ盾■■ 、Ｐ、ＬおよびＰｈｊｌｌｊｐｓ、＋＋、Ｓ５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８８．６４１３−６４１７@（１９９１）］。

本発明は、雌性および雄性ラット両方の心臓の心房中の特異的なりラキシン結合 部位（レセプター）の局在性に基づいている。

さらに本発明は、単離され電気的に整調されたラット左心房の収縮速度をリラキ ノンが上昇させるという実験的発見に基づいている。心房中のりラキシンに対す るレセプター親和性には雄性および雌性ラットの間でいかなる差異も観察されな かったので、測定値は雄性ラットにおいて得た。収縮速度および収縮力の両方は 用量依存的な様式で上昇した。

これらのデータは、ラット上１臓由来の心房が収縮速度および収縮力における上 昇によりリラキノンに直接反応することを示している。

さらに本発明は、リラキノンが、ＳＡ結節（心臓の生ペースメーカー）が欠けて いる心臓において、さらに全ての心房組織を除去した後でさえ心拍数を上昇させ 得るという観察に基づいている。

リラキノンは妊娠の生理学において重要な役割を有する性依存的なペプチドホル モンとして最も良く知られているので、両性のラットの心臓における特異的なり ラットレセプターの存在、および雄性および雌性ラット由来の心房に対するリラ キ／ンの直接的な効果を証明する本発明者らの結果は、非常に興味をそそるもの であり、リラキシンを急性および慢性心不全、特にうつ血性心不全、および他の 心臓血管疾患の治療に対する候補物質としている。さらに、リラキシンが機能的 なＳＡ結節の不在下で、補助的なペースメーカー（例えばＡＶ結節）を刺激する 二とにより心拍数を上昇させ得るという発見は、除脈を有する患者の治療におい てリラキノンが有用となり得ることを示すものである。

本明細書および請求の範囲において用いられる「リラキシン」とは、心房収縮の 力または速度を上昇させ得る機能的なリラキノンタンパク質を意味する。構造的 には、「リラキノン」の用語は、心房筋の収縮力または収縮速度を上昇させる質 的な能力が保持されているなら、天然に存在する（ヒトまたは非ヒト動物、例え ばブタ、ネズミなどの）リラキノンのアミノ酸配列を含むポリペプチド、または 個々の天然りラキノンのＡ−および／またはＢ−鎖中の１またはそれ以上のアミ ノ酸残基の置換、欠失、付加および／または修飾によりこのような天然のりラキ ノンアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびにこのよ うな天然のおよび修飾されたポリペプチドのグリコジル化変異体、非グリコジル 化型、有機および無機塩、共有結合修飾された誘導体を含むことを意図している 。本明細書中で定義される「リラキノン」は、通常、天然りラキシンポリペプチ ドのＢ−または八−鎖との相同性が約７０％より大きい配列を有する。好ましく は、相同性は約７５％より大きく、より好ましくは約８０％より大きい。この定 義は詳細には、Ｎ２およびＮ１型を含み、プレブロー、ブローおよび成熟ヒトリ ラキシンＬＨ２リラキンンについては米国特許番号４．７５８．５１６（１９８ ８年７月１７日発行）および５．ｏ２３．３２１（１９９１年６月１１日発行） ：Ｈ１リラキシンについては米国特許番号４．８７１．６７０（１９８９年１０ 月３０日発行）、および両ヒト遺伝子配列を非ヒト動物リラキシン配列と共に開 示しているＳｈｅｒｗｏｏｄ、　Ｏ，Ｄ、　（上記）を参照］を含む。合成Ｎ２ リラキシンおよびある種のヒトリラキノン類似体を生物学的活性について試験し たときに、その試験は生物学的活性のために必要なりラキシンコアならびに生物 学的活性に影響しないメチオニンに代わるある種のアミノ酸置換を明らかにした ［Ｊｏｈｎｓｔｏｎら１「ペプチド　構造および機能」中、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ１ ｎｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕ（Ｄｅｂｅｒ。

ＣＭ、ら編、　（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｃｏ、　１９８５）］。また 、非常に限られたアミノ酸配列の同一性にもかかわらず、これまでに単離された 全ての哺乳動物リラキノン（ヒトＨ２およびＨ１リラキ／ンを含む）がラットに おいて生物学的に活性であるという本発明者らの発見は、異なる種由来のりウキ シン分子上の、ラットレセプターと相互作用する特異的な保存領域の存在を示し ている［Ｋｅｍｐ、　Ｂ、　ＥおよびＮ１ａ１１．　Ｈ，Ｄ、　。

Ｖｉｔａｍ、Ｈｏｒｍ、　（ＮＹ）　４１．７９−１１５　（１９８４）も参照 ］。従って、この「コアペプチド」は特にこの定義内に含まれる。

「ヒトリラキノン」の用語は同様の意味で用いられ、上記に定義した全てのヒト リラキノン分子、フラグメントおよび誘導体を含む。この定義は、特にヒトＮ２ リラキノンＡ−鎖のアミノ酸１−２４から１０−２４、およびヒ１−Ｈ２リラキ ンンＢ−鎖のアミノ酸−１−３２から１０−２２を有するリラキノン類似体を含 む。

Ａ−鎖のＡ（１−２４）、Ａ（２−２４）およびＡ（３−２４）のうちのいずれ か１つとＢ−鎖のＢ（−１−２３）からＢ（−１−３２）のうちのいずれか１つ との組み合わせが好ましい［米国特許番号５．０２３．３２１を参照］。リラキ シン類似体は、好ましくは両遺伝子型の完全長のＡ−鎖およびカルボキン末端を 短くしたＢ−鎖を有する。

高速原子衝撃を用いる質量分光分析的イオン化により、黄体および血清中のヒト °リラキシンの主な種は完全長のＡ−鎖およびＢ−鎖が位置２９のセリンで終わ るように４個のＣ末端アミノ酸が欠けているＢ−鎖を有するＨ２リラキシン型で あることが見いだされている。この型［Ｂ２（Ｂ２９Ａ２４）：　３３アミノ酸 を有するＢ鎖を含む「長いリラキノン」に対して「短いりラキシン」とも称する コが、特に好ましい。通常の置換は、天然のヒトリラキノン配列中のメチオニン と異なるアミノ酸、例えばリノンまたはアラニンとの置換である。このようなヒ トリラキシン類似体の例には、Ｈｌ（Ｂ２−２７　Ａ２４）−Ａｌａ”；Ｂ２（ Ｂ２−２５　Ａ２４）：Ｂ２（Ｂ３３　Ａ２４）：Ｂ２（Ｂ３３　Ａ２４）−Ｌ ｙｓ’　ＩＩＡ１ａ２５：Ｂ２（Ｂ２−３３　Ａ　２４）ｌｌＬｙｓ’　ＲＡｌ ａ２５；　Ｂ２（Ｂ　２−３３　Ａ２４）Ａｐｙｒｏ−Ｇｌｕ’　ＢＬｙｓ’　 ＩＩＡ１ａ２５．およびＨ２（Ｂ　３３　Ａ　２４　）Ａｐｙｒｏ−Ｇｌｕ’　 ＲＬＹＳ’　１Ａ１ａ２Ｆ′が含まれるが、これらに限定されない。この命名法 は以下の通りである。Ｈｌ、Ｂ２はヒトリラキノンをコードする２つのヒト遺伝 子を表す。ＡおよびＢはヒトリラキノンの各々の鎖を表す。ＡまたはＢの後ろの 数は鎖の長さ、すなわちＡ−またはＢ−鎖を構成するアミノ酸の数を表す。アミ ノ酸は通例の３文字表記により表示する。アミノ酸の前の下付き文字は、そのア ミノ酸が位置するＡ−またはＢ−鎖を表し、一方、アミノ酸の後ろの上付き文字 は鎖における位置を示す。

「天然に存在する（ヒト）リラキノン」および「天然の（ヒト）リラキノン」の 用語は、天然の供給源から単離されるか、組換え法により製造されるかもしくは 化学的に合成されるか、またはこのような方法の任意の組み合わせにより製造さ れる、天然に存在するアミノ酸配列を有する成熟完全長のりラキノン分子を集合 的に表すために用いられる。ヒトリラキノンについては、これらの定義は、Ｈｕ ｄｓｏｎらす１四５上記］およびＨｕｄｓｏｎら［ＥＭＢＯＪ−、上記］および ＵＳ　４．７５８．５１６、ＵＳ　５．０２３．３２１およびＵＳ　４．８７１ ．６７０．上記中に開示されたアミノ酸配列を有する、成熟完全長のＨｌおよび Ｂ２ポリペプチドを包含している。

本発明の方法は、上に定義したりラキノンの使用に限定されない。さらに心房に おける特異的なリラキノン結合部位に特異的に結合することができ、心房の収縮 速度または収縮力を上昇させ得るあらゆる化合物の使用が意図されている。実施 例において開示するオートラジオグラフィーアッセイを含む当分野で既知の方法 により、レセプター結合を研究することができる。同様に、心房の収縮速度およ び収縮力を試験するための方法（インビトロおよびインビボの両方）は、当分野 で周知であり、以下に詳しく説明し、実施例に詳細に開示する。

「治療的有効量」の用語は、治療すべき生理学的状態の改善を結果として生じる 量を定義するために用いる。実際の用量は、さまざまな特定の生理学的な状態お よび分子に対して異なるであろうし、患者の総合的な症状、徴候の重篤度、反対 徴候などに応じて変化するであろう。有効用量の決定は、実施する医師の技術の 十分な範囲内にある。

リラキノンＡ−およびＢ−鎖または類似鎖を作成するための方法は当分野で知ら れており［例えば、Ｂａｒａｎｙ、　Ｇ、およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｂ 、　ｒペプチドＪ、　２．１　（１９８０）。

Ｇｒｏｓｓ　Ｅ、およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、　Ｊ編、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照］、リラキノンを得るために八−およびＢ −鎖を結合するための方法もまた同様である［Ｔｒｅｇｅａｒら、「リラキノン の生物学およびヒトにおけるその役割」中、　Ｂｉｇａｚｚｉら編、　Ｅｌｓｅ ｖｉｅｒ　Ｎ、Ｙ、、　Ｎ、Ｙ、　ｐｐ、　４２−５５；　Ｊｏｈｎｓｔｏｎら 、上記、　ＥＰ　２５１，６１５（１９８８年１月７日発行）および米国特許番 号４．８３５．２５１（１９８９年５月３０日発行）］。同様に、さまざまな天 然源からりラキシンを単離および精製するための当分野で既知の多くの方法が存 在する［例えば、ＥＰ　１０７．７ｇ２およびＥＰ　１０７，０４５を参照］。

本発明におけるリラキシンは、ＥＰ　２５１．６１５（上記）およびＵＳ　４． ８３５．２５１　（上記）に開示されているように、例えばＡおよびＢ鎖の合成 、およびそれらの精製および組み立てにより調製することができる。合成リラキ シンのために、４：１モル比のＡ：Ｂｌｍが通常用いられる。次いで得られる生 成物を、逆層ＨＰＬＣ１イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、透析など、 またはこのような方法のあらゆる組み合わせを含む当業者に既知のあらゆる方法 により精製する。本明細書中での実験において用いられるＨ２リラキンン種の調 製は、ＰＣＴ特許出願公開Ｎｏ冒０９０／１３６５９（１９９０年１１月１５日 発行）中に開示されている。

リラキノンのアミノ酸配列変異体は、好ましくは対応する天然（野生型）リラキ ノンまたは既知のリラキノン誘導体の各々の鎖をコードするＤＮＡ配列を突然変 異させることにより構築する。通常、ＤＮＡの特定の領域または部位が突然変異 誘発の標的となり、ゆえにこれを行うのに用いられる常法は部位特異的突然変異 誘発と称される。突然変異はＤＮＡ修飾酵素、例えば制限エンドヌクアーセ（特 定の位置でＤＮＡを切断する）、リガーゼ（２つのＤＮＡ断片を共に結合させる ）、ヌクレアーゼ（ＤＮＡを分解する）および／またはポリメラーゼ（ＤＮＡを 合成する）を用いて行う。

（以下、余白） １、単純欠失および挿入 ５ａＩｌｌｂｒｏｏｋら［「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）］のセクシｇン１５．３１ｍ開示されてい るように、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続く連結を欠失を生じ させるのに用いることができる。この方法を使用するために、外来ＤＮＡをプラ スミドベクターに挿入するのが好ましい。外来（挿入された）ＤＮＡおよびベク ターＤＮＡの両方の制限地図が利用可能でなければならないか、または、外来Ｄ ＮＡおよびベクターＤＮＡの配列が既知でなければならない。外来ＤＮＡはベク ターには存在しない独特の制限部位を有していなければならない。次いで適当な 制限エンドヌクレアーゼを用い酵素の製造者により示された条件下で、外来ＤＮ Ａにおいてこれらの独特の制限部位の間でこれを消化することにより欠失を行う 。

用いられる制限酵素が平滑末端または付着末端を造るなら、Ｓａｍｂｒｏｏｋら （上記）のセクション１６８に開示されているようにバクテリオファージＴ４　 ＤＮＡリガーゼなどのりガーゼを用いて混合物を１６℃で１〜４時間、ＡＴＰお よびリガーゼ緩衝液の存在下でインキュベートすることにより該末端を共に直接 連結することができる。該末端が適合性でない（非付着性）ならば、それらをま ずＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントまたはバクテリオファージＴ４ 　ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にしなければならないが、その両方は消化さ れたＤＮＡの突出している一本鎖末端を充填するために４つのデオキシリボヌク オチド三リン酸を必要とする。別法では、該末端をヌクレアーゼ、例えばヌクレ アーゼＳ１またはヤエナリヌクレアーゼを用いて平滑化することができる（その 両方はＤＮＡの突出している一本鎖を短く切り込むことにより機能する）。次い で該ＤＮＡをリガーゼを用いて再連結する。得られる分子はりラキシン鎖欠失変 異体である。

Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１５．３に開示されているように、類 似の方法を用いてリラキノン鎖の挿入変異体を構築することができる。標的であ る外来ＤＮ、Ａの独特の制限部位（複数の部位）での消化の後に、オリゴヌクレ オチドを外来ＤＮＡが切断された部位に連結する。該オリゴヌクレオチドは挿入 すべき所望のアミノ酸をコードするように設計され、さらに指向性の連結が可能 となるように消化された外来ＤＮＡ末端と適合性の５゛および３°末端を刊する 。

２．オリゴヌクレオチド−介在性突然変異誘発オリゴヌクレオチド−指向性突然 変異誘発は、本発明のリラキノン鎖の置換変異体を製造するための好ましい方法 である。また、それを用いて欠失および挿入変異体を都合よく製造することがで きる。この方法はＡｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ、　２：１８３　（１９８３）］に より開示されているように当分野で周知である。

通常、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを用いてリラキ ノン分子中２のまたはそれ以上のヌクレオチドを挿入、欠失または置換する。

最適のオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードしているヌクレオチドの両側に 完全に対合する１２〜１５のヌクレオチドを有するであろう。これによりオリゴ ヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に正しくハイブリダイズすることが確実に なる。該オリゴヌクレオチドは、例えばＣｒｅａら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１ ．＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＬｌｓＡ、　７５：５７６５　（１９７８）］により開示 されているように当分野で周知の方法を用いて容易に合成される。

ＤＮＡ鋳型分子は、野生型のｃＤＮＡリラキシン鎖挿入物を有するベクターの一 本鎖の形態である。−末鎖鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販品 として入手可能なＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適当である） またはＶｅｉｒａら［Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５３：３　（１９８７ 月により開示されている一末鎖ファーシ複製起点を含有するベクターのどちらか から得られるベクターによってのみ生成させることができる。従って、−末鎖の 鋳型を得るために、突然変異を起こすべきリラキノン鎖のｃＤＮＡをこれらのベ クターの１つに挿入しなければならない。−末鎖鋳型の製造は、５ａＩＩｌｂｒ ｏｏｋら（上記）のセクション４．２１〜４．４１に開示されている。

野生型リラキノン鎖に突然変異を起こさせるために、適当なハイブリダイゼーシ ョン条件下でオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡ鋳型分子にアニーリングさせる 。次いでＤＮＡ重合酵素、通常はＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ フラグメントを添加する。この酵素はオリゴヌクレオチドをプライマーとして利 用して突然変異−含有ＤＮＡＨの合成を完了させる。ゆえに、一方のＤＮＡ鎖が ベクター中に挿入された野生型リラキノ／鎖をコードし、第二のＤＮＡ細か同じ ベクター中に挿入されたりラキノン鎮の突然変異形をコートするように１寸ロ二 本鎖分子が形成される。次いで、この・＼テロ二本鎖分子を適当な宿主細胞、通 常はＥ、ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍｌ　０１などの原核生物中に導入する。細胞を増殖さ せた後に、アガロースプレート上にプレートし、３２−Ｐで放射ラベルされたオ リゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングして突然変異した鎖を含有 するコロニーを同定する。これらのコロニーを選択し、ＤＮＡを配列決定して、 リラキシン鎖中の突然変異の存在を確認する。

１を越えるアミノ酸が置換された突然変異体をいくつがの方法のうちの１つで得 ることができる。アミノ酸がポリペプチド鎖中で共に近接して位置しているなら 、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１個のオリゴヌクレオチドを用いて同 時に突然変異させることができる。しがし、アミノ酸が互いに距離を置いて位置 している（例えば、１０を越えるアミノ酸により分離されている）なら、全ての 所望の変化をコードする１個のオリゴヌクレオチドを得ることは比較的困難であ る。その代わりに、２つの別法のうちの１つを用いることができる。第一の方法 においては、置換すべき各アミノ酸に対して別のオリゴヌクレオチドを生成させ る。次いでそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングさ せると、その鋳型から合成された第二のＤＮＡ鎖は全ての所望のアミノ酸置換を コートするであろう。もう１つの方法は、所望の突然変異体を製造するために２ またはそれ以上の突然変異誘発を繰り返すことからなる。初回は一個の突然変異 について述べたものと同様である；野生型リラキシンＤＮＡを鋳型として用い、 最初の所望のアミノ酸置換コードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニ ーリングさせ、次いでヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を得る。二回目の突然変異誘発は 初回の突然変異誘発において製造された突然変異されたＤＮＡを鋳型として用い る。ゆえに、この鋳型はすでに１またはそれ以上の突然変異を含んでいる。次い で、別の所望のアミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型に アニーリングさせると、この時に得られるＤＮＡ鎖は初回および二回目の突然変 異誘発の両方から生じた突然変異をコードしている。この得られたＤＮＡを第三 回目以降の突然変異誘発における鋳型として用いることができる。

リラキノン鎖変異体をコードしているＤＮＡをポリペプチドとして発現させるた めに、このＤＮＡをベクターから切除して真核性宿主細胞の発現に適当な発現ベ クター中に挿入する。

変異体リラキノン鎖は、上に詳述し製造例中に例示されているように、当分野て 既知の方法により組み合わせて機能的なりラキシン分子を得ることができる。

Ｈ２リラキノンをカルボキンペプチダーゼＡ（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｅｍｄｉｃ ａｌ、０．２単位７１００μｇリラキンン）と共に０．２〜ＩＮ−二チルモルホ リン（ｐＨ８，２）中、３７℃で６０分間インキュベートすることによりＨ２リ ラキシンのＢ−３１類似体（Ｃ末端のＳ　ｅｒ−Ｌ　ｅｕの欠失）を製造した。

このような条件下で、２つのアミノ酸の除去が完了したことがＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｖ ｙｄａｃ　Ｃ１８逆層カラム上、０．１％ＴＦＡ中の３０〜４０％アセトニトリ ル勾配を使用）により判断された。アミノ酸分析および質量分析により、それら の２つのアミノ酸残基のみの除去が確認された。他の、短（されたりラキノン誘 導体は類似の方法により作成することができる。

リラキシンおよび心房中のりラキノンレセプターに特異的に結合し得る他の化合 物の心臓血管性の効果は、既知の正の変時性または変力性薬物を試験するために 開発された常法により実験することができる。この試験には、心拍数および心呵 圧の測定を含む血流力学的測定：血液量測定、および血漿パップレシンおよび心 房のナトリウム排泄増加性因子レベルの測定を含むホルモンアッセイおよびサン プリング法が含まれる。

心房筋に対するリラキ／ンの効果のインビトロでの評価のための常法は、実施例 ３に開示する。心房中のりラキ／ンレセプターに特異的に結合し得る池の化合物 の心房収縮力および収縮速度に対する効果を類似の方法で評価することができる 。

非麻酔下の、自由に行動させているラットにおけるインビボでの心臓血管系の測 定は、当分野て既知であるＩＷａｒｄ、　Ｄ、　Ｇら、　Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　 Ｒｅｐｏｒｔｓ　Ｎｏ、　８８−４８５−５６１（１９８９）］。この方法に従 い、ラットを塩酸ケタミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して左腸骨動脈にカニユ ーレを挿入し、浸透ポンプを移植する。この方法は実施例２に、心拍数および子 宮重量の測定に対するその適用と共に詳述する。

このモデルで測定し得る他のパラメーターには、エバンスブルー染料（Ｔ１８２ ４）の希釈に基づく血液量の測定が含まれる。血液量の最初の測定の前に、細網 内皮系を飽和させるためにエバンスブルー（ｌｌｌ１ｇ／ｋｇ、　０．５ａ＋１ の８１で）を心房のカニユーレを通して注射する。各々の後の測定のために、血 液サンプル（０，５ｍ１）を採取し、エバンスブルーを注射して第二の血液サン プルを１．５分後に採取する。血漿中のエバンスブルーの濃度を分光測光法によ り測定して、血漿量を決定し、血液量は血漿量＋（血漿量×ヘマトクリット）／ （１−へマドクリット）として算出する。各血液をサンプルとした後に、赤血球 を無菌性食塩水に懸濁して再注入した。

血漿バソプレノンおよびナトリウム排泄増加性因子はラジオイムノアッセイによ り測定することができる。血清りラキシンレベルは酵素−結合免疫吸着剤アッセ イ（ＥＬＩＳＡ）により測定することができる。血液サンプル（２ｍｌ）を心房 カニユーレから採取して１４．００　Ｏｒｐｍで９０ｍ５ｅｃｉ心した。血漿を ＥＤＴＡと混合し、直ちに凍結し：赤血球を無菌性食塩水に懸濁して再注入した 。

さらに、リラキノンおよび心房リラキノンレセプターに特異的に結合する他の化 合物のインビボでの心臓血管性効果は、Ｅｖａｎｓ、　Ｄ、　Ｂ、ら［Ｄｒｕｇ 　Ｄｅｖｅｌ、Ｒｅｓ、　ｇ、　１４３−１５７　（１９８６）］により開示さ れている麻酔下の開胸イヌモデルにおいて評価することができる。リラキノンの 直接の血管拡張性活性は、麻酔下のイヌにおいて前肢の潅流に対するその効果を 調べることにより試験することができる［５ｔｅｆｆｅｎら。

Ｊ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、Ｒｅｓ、　８．５２０−５２６　（１９８６）］。

心臓への血流に対するリラキシンの効果は、例えば麻酔下のイヌにおいて放射ラ ベルされたミクロスフェアを用いて評価することができる［５ｔｅｆｆｅｎ、　 Ｒ，Ｐ、ら、［新しい心臓血管薬Ｊ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＲａｖｅｎＰｒｅ ｓｓ、　１９８６．　ｐ、８１］。また、心拍出量、左心室収縮性および心房血 圧などの心臓血管の血流力学は、例えば５ｔｅｆｆｅｎ、　Ｒ，Ｐ、ら（上記） により開示されている意識のあるイヌにおいて測定することができる。

リラキシンまたは心房リラキノンレセプターに特異的に結合する池の化合物の、 ＳＡ結節切除後の補助的なペースメーカーに対する効果は、例えば開胸ブタにお いて試験することができる。このモデルでは、麻酔下の開胸ブタにおいて、カテ ーテルを肺静脈に挿入し、動かせなくなる位置に進める。楔人圧、ＰＡ圧および 心拍出量などのベースラインの血流力学的パラメーターを測定する。透視装置に よる誘導の下に、標準的な四極の電気生理学カテーテルを右大腿静脈を通してヒ ス東領域へと進め、ヒス東電位を記録する。０．２５ｍｍ直径の銀ワイヤを左心 室および右心房に挿入する。心房、ノ＋’、−室、ＡＶ結節およびヒス−プルキ ンエ系の有効な不応期を測定する。次いで、ＳＡ結節の回復時間を測定する。最 後に、心室性細動閾値試験を行う。

ＳＡ結節は側後部右心房に沿った止血鉗子で押し潰す。接合部調律または異所性 ノし・房調律が引き継ぐことが予想される。２０分後に、心拍数および血圧が安 定したときに、前述の血流力学的および電気生理学的パラメーターを測定する。

次いてリラキノンまたは心房リラキノンレセブターに特異的に結合する他の化合 物を注入により投与し、安定な一定注入の開に同じ血流力学的および電気生理学 的パラメーターを繰り返し記録する。

また、リラキノンの心拍数に対する効果を、永続的なペースメーカーを移植した 、長期にわたり意識のある動物（イヌ、ブタまたは高等動物）において試験する ことができる。

治療的使用のために、リラキノンを医薬製剤の形態て投与する。注射可能なりラ キノン組成物は、例えば米国特許番号２．０６４．４４ｇ（１９６０年１２月１ ３日発行）に開示さねている。ヒトリラキノノの有効量を４〜７、好ましくは４ ．５〜５．５の緩衝液中に含む医薬組成物は、ＰＣＴ出願公開番号Ｗ０８９１０ ７９４５（１，９８９年９月８日発行）中に開示さねている。リラキノンの医薬 製剤は、液体、凍結、またはゲルの形態にあるのが好ましく、または凍結乾燥し て再組成することができ、治療的有効量のヒトリラキノンを含む。本明細書中て 好ましい液体組成物は、適当なオスモル濃度を表す約０１５μの全イオン強度に なるように塩化ナトリウムが存在するｌＱｍＭクエン酸緩衛液（ｐ）！５）中の ヒトリラキノンである。本明細書中の医薬組成物は、心房におけるリラキノンレ セブターに特異的に結合する２またはそれ以上の化合物の泄合物を含むことがで き、さらに減少した心拍出量またはこれに関係するあらゆる生理学的な法要の治 療に適した別の薬物、例えば利尿薬、血管拡張薬および血液量または末梢抵抗を 減少させて心収縮力を増大させることが知られている変力性薬物を含み得る。ま た、１またはそれ以上のこのような別の薬物を別の医薬製剤の形態で、リラキシ ンまたは心臓のりラキノンレセブターに特異的に結合する他の化合物の投与と同 時またはそれに続いて投与することができる。

本発明方法におけるヒトリラキ／ンおよび本発明の範囲内にある他の化合物の治 療的有効量は、患者代ト、非ヒト哺乳類、鳥類など）、治療される特定の症状、 生者の医学的病歴、および用いられる治療経路および計画を含むいくつかの変数 に基づいて選択される。治療経路には、例えば皮下、腹腔内、静脈内および筋肉 内投与などの非経口投与が含まれる。うっ血性心不全の治療のための平均用量は 、投与経路および計画、患者の症状の重篤度、患者の年齢、医薬組成物の形態、 および医師には既知であろう他の考慮を含む、通常の技術を有する医師には既知 の多くの特徴に従い変化する。ヒト患者の治療のための通常の連続皮下用量の範 囲は、１日当たり約１５μｇ〜約０．１５ｍｇ／ｋｇ（体重）である。

本発明のさらに詳細については、以下に示す非限定的な実施例から明らかにな合 成ヒト（Ｈ２）リラキノン［Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、「ペプチド　構造および機能 」中、　Ｄｅｖｅｒ、　Ｃ，Ｍら編６８３−６８６．　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｌ Ｉｌｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ　（１９８５）R（ 本実施 例中「リラキノン」とも称する）は、本質的にＷｏ　９０／１３６５９（上記） に開示されているように調製した。

リラキノンは、マウス恥骨結合アッセイ［５ｔｅｉｎｅｔｚら、　Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌｏｇｙ　６７、１０２−１１５　（１９６０）］および以下に記載する ｃＡＭＰバイオアッセイにおいて生物学的に活性であった。リラキノンの濃度は アミノ酸分析により測定した。

ｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニット（ウソ心筋由来、Ｓｉ ｇｍａ）および［γ−３２ｐコＡＴＰ（比活性５０００　Ｃｉ／＋＋＋ｍｏｌ、 　Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｊｌｅｊｇｈｊｓ、　ＩＬ）によ るＨ２リラキノンのリン酸化は、ヒトＩＦＮ−γのリン酸化のための修飾を有す る方法［Ｋｕｎｇ、　Ｈ，ＦおよびＢｅｋｅｓｉ、Ｅ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌ、　１１９．２９６−３０１　（］９８６）］に従い行った。リン 酸化反応生成物は、ンリカを含浸させたグラスファイ・＼−７−トを用いる即時 薄層クロマトグラフィー（Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｃ，Ｇｅｌｍａｎ）により分析した。、 ０．２Ｍ　ＫＣＩ、５％ＴＣＡを含む溶媒で展開した後に、ＴＣＡ−沈殿したタ ンパク賃は原点に留まり、遊離のＡＴＰは溶媒前部に移動したことがＫｏｄａｋ 　Ｘ、へＲフィルムを用いたクロマトグラムのオートランオグラフィーにより判 明した。

オートラノオグラフィーの後に、放射活性を含有している領域を切除し、Ｂｅｃ ｋｍａｎ　ＬＳ　３８０］ｅ、体ノンチレーノヨン分光計において＾ｑｕａｓｏ ｌ−２（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を用い、３２ｐに対して９５ ％の計数効率で計測した。この方法を用いて、最終のり／酸化反応条件を次のよ うに決定した・ヒトリラキノン５μｇを、２０ｍ’；ｙ１Ｔｒｉｓ−Ｔ−ＩＣＩ （ｐＨ７，５）、１００ｍＭ　ＮａＣ１，２０ＩＩＩＭＭｇＣ１２，２５ｕ　Ｃ ｉ［７ｊ２ｐ３へＴＰ（１６７ｎＭ、比活性５０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅ ｒｓｈａｍ、３２ｐ−リラキノン調製用）または１　、４　ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ　 （Ｓｉｇｍａ、非うヘル化すン酸化すラキ／ン用）、および１０単位のつ７心筋 由来ｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（Ｓｉｇｍａ）を含 む反応混合液（全容量３０μｍ）中、３７°Ｃて６０分間インキュベートした。

インキュヘー／ヨノ時間の終わりの時点て、混合液を氷上に置くことにより反応 を停止させ、続いてこの混合液を０１％ＴＦＡ、１１μＭＡＴＰて平衡化した５ ｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）上に載せた。このカラムを最初に 平衡化緩衝液で、次いて０　］％ＴＦ八中の１０％アセトニトリルで洗浄した。

次いで、天然のリラキ、ンおよびリン酸化されたりラキノンを０１％ＴＦＡ中の ８０％下セトニト１１ルて溶離し、分画を上記のような液体ノンチレーノヨン計 測により放射活性についてぞ→析した。

陽イオン交換）（ＰＬＣ上での１１７酸化リラキ７／の精製ワ、酸化さねたリラ キ／シのＪ（Ｐ　Ｌ　ＣｒＰｏｌｙ　ＣＡＴ　Ａ、　Ｐｏ１ｙ　ＬＣ，Ｃｏｌｕ ｍｂｉａ、　ＭＤ）はＬＫＢ系を用いて行った。放射活性を含んでいる５ｅｐ− Ｐａｋ　Ｃ】８カラム溶出液（または非ラベル化すン酸化すラキノンを含んてい る相当する分画）をプールして、５０ｍＭ　ＮａＪ（２ＰＯ＜（ｐＨ７）、２５ ％アセトニ）・リル（Ｖ／Ｖ）　（緩衝液Ａ）で平衡化したＰｏ１ｙ　ＣＡＴ　 Ａカラム（Ｐｏｌ）・ＬＣ）上に注入した。このカラムを緩衝液Ａ中の０〜０． ５Ｍ　ＮａＣ］の直線勾配を用いて５０分間にわたり１ｍ１７分で溶離した。

１分間の分画を集めて、その一部分を上記のように放射活性について計測した。

ピークの放射活性分画に１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（結晶化、ＭＮｅｓ）、１　ｍＭ 　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　（Ｂｏｅｈｒｊｎｇｅｒ−１１ａｎｎｈｅｉｍ）およびｌ　 μｇ／ｍｌｏイベブチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、 二わを４℃て保存した。

リン酸化リラキノンのバイオアッセイおよびＥＬ　Ｉ　ＳＡリン酸化リすキンノ ン初代ヒト子宮セルラインにおいてｃＡＭＰレベルを上昇させるその能力にライ てアッセイした。Ｋｒａｍｅｒら［Ｋｒａｍｅｒら、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ １１．Ｄｅｖ。

Ｂｉｏｌ、　２６．６４７−６５６　（１９９０）］の方法を修飾して以下のよ うに行った＝１５〜２２継代のヒト子宮細胞を１０％熱−不活性化新生子牛血清 、１００単位／ｍｌペニシリン、１００　μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ノ ングルタミンおよび２４＋ＩＩＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）を追加したハムのＦ １２／ＤＭＥＭ（１／１、ｖ／ｖ）培地中で集密的になるまで増殖させた。細胞 を６−ウェル培養プレート中に１０’細胞／ウエルでプレートし、空気中の５％ ＣＯ２て一晩、３７℃てインキュベートした。次いて、細胞（６０−８０％集密 ）をＦ１２／ＤＭＥＭ−２４ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４０緩衝液Ｂ）を用い て室温で２回洗浄した。次いで、リン酸化リラキノンサンプルおよび標準のりラ キノン溶液（０１％ＢＳＡおよび０，０１％Ｔｖｅｅｎ−８０を有する緩衝液Ｂ 中に希釈）をフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）（１μＭ）およびＩ　ＢＭ Ｘ（０，０５ｍＭ）と共にこの細胞に加え、０．ｌＮＨＣｌと共に室温で３０分 間インキュベートした。次いてこの抽出物の一部を０．１Ｎ　ＮａＯＨで中和し 、ラジオイムノアンセイにおいてｃＡＭＰレベルを測定した。このアッセイは、 ヤギ抗ｃＡＭＰ抗体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）への結合に対するｃＡＭＰと固定さ れた量の１２Ｊ−ラベル化ｃＡＭＰ（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）の間の競合に基づいてい る。４℃で２４時間のインキュベーションの後に、抗原−抗体複合体をポリエチ レングリコール中のロバ抗ヤギＩ　ｇＧ　（Ｐｅｌｆｒｅｅｚｅ）を用いて室温 で１時間沈殿させ、遠心およびデカンテーションにより分離した。ペレット中の 放射活性をガンマカウンターにおいて測定し、サンプル中のｃＡＭＰの量を標準 ｃＡＭＰ曲線との比較により決定した。リラキシン標準曲線は、ラジオイムノア ッセイにおいて測定されたｃＡＭＰ濃度（ｐ＋＊ｏｌ／ｍｌ）を、刺激するりラ キシン濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数としてプロットして作成した。このデータを４ 助変数方程式に合てはめた。

また、リラキシンに対する二重−抗体ＥＬＩ　ＳＡを用いてリン酸化リラキシン を定量した［Ｌｕｃａｓら、　Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１２０　（１９８ ９）］。このア・ソセイでは、２つのりラキノンアフィニテイー精製抗体、ヤギ 抗すラキシン抗体コートおよびウサギ抗すラキシンホースラデイッノユペルオキ シダーゼコンジュゲート化第二抗体を用いた。

ラント子宮および心臓組織切片に対する３２ｐ−リラキノンの結合１０週齢の正 常な雄性および周期性の雌性スプラグ−・ドーリーラ・ソト（Ｃｈａｒｌｅｓ　 Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ｌｌｉｌｍｏｎ ｔｏｎ、Ｍ＾）を、結合特異性および結合置換実験のために用いた。これらには 自由に飼料および水を与え、約２１℃１こｊｌｔ制御された周囲温度を有する室 内で飼育した。

ホルモンの制御実験のために、１０〜１１週齢の雌性う・ソトを２週間、卵巣摘 出し、次いて０２％ビーナツツ油賦形剤中の１０ｇｇエストラジオールシク口ペ ンチルブロビオ不一トまたは賦形剤のみを皮下注射した。同様に、１０〜１１週 齢の雄性ラットを２週間、精巣除去し、１０ｇｇエストラジオールシクロペンチ ルブロビオ不一ト、１０ｇｇテストステロンまたは賦形剤のみを注射した。この ラットを７日後にＣＯ２を用いた窒息により屠殺した。関連の組織を迅速↓二除 去し、粉末化トライアイス中て直ちに凍結させた。

凍結された組織を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ　Ｍｏｄｅｌ　２８００　Ｆｒ ｉｇｏｃｕｔ低温保持装置（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｉｎ５ｔｒｕｌＩｅｎｔｓ） を用いて１６μｍ厚さの薄片に切った。組織切片を暖め、直ちに再凍結させて一 ８０℃て一晩以上保存することにより、ゼラチン／硫酸クロムカリウム処理され た顕微鏡スライド上に固定化させた。

３２ｐ−リラキノンの組織切片への結合のために、凍結されｊこスライドを結合 緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、、、ｐＨ７，２，１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、０． １ｍＭ　ＰＭＳＦ、および１ｐｇ／ｍｌロイペプチンを追加したハンクス平衡塩 類溶液）を用いて４℃で１゜５〜２時間予め洗浄した。次いで、この組織切片を 、過剰な非ラベル化すラキノンおよび他の競合薬物を特異性対照として含むかま たは含まない６００〜７００μｌの１００ｐＭ１００ｐリラキンンで覆い、４℃ で１時間インキュベートした。このスライドを、結合緩衝液で各々１５〜３０分 間、３回洗浄した。スライドを空気−乾燥して濾紙上に載せ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌ ｍ−βＭ、１（ＡＩＩｌｅｒｓｈａｍ）に３〜５日間露出した。

結合領域は、ヘマトキシリンーエオノンで対比染色された近接した切片をオート ランオグラフにかぶせることにより測定した。リラキシン結合置換実験のために 、非ラベル化すラキノンの０．１〜１１００ｎの範囲内での増大する濃度（連続 した３倍の増大）の不在および存在下で１１００ｐの５ｔｐ−リラキシンと共に 、連続的な１６μｍ切片をインキュベートした。＋ｌ２ｐ−リラキシン結合オー トラジオグラフの偽色（ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｏｒ）再構成および定量分析をＲＡ Ｓ−３０００イメ一ジ分析系（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。結合した３ ２ｐリラキシン（特定領域の最大結合）のＯＤまたは放射活性（ｃｐｍ）を、ニ トロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ　ＳＦ、　Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃ ｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）上にプロットされた３２ｐ−リラキシン標準（５０〜２０ ００ｃｐｍの範囲）の平行する組に基づいたコンピューター化濃度計により定量 した。結合阻害データを４助変数方程式に合ではめてＥＤｓａ（３２Ｐ−リラキ シンの結合の５０％置換が得られる非ラベル化すラキシンの濃度）を得た。リラ キノンに対する解離定数（Ｋ、）をＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆの方法［Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　２２．３０９９−３１０８　（１９７３ ）］により算出した。

墾 ラット心臓におけるリラキノン結合部位肝臓、膵臓、胸腺、腎臓、副腎、心臓、 肺、皮膚および精巣を含む９個の異なるラット組織を、３２ｐ−リラキシンの結 合についての本実験において調べた。これらの全ての組織の中で、結合を示した 唯一の組織は（正常な雌性の）う・ント心臓であった（図ＩＡ）。結合は心房中 に見られたが、心室には見られなかった。結合の特異性は、１００ｐＭ　３２Ｐ −リラキ／ンの結合の１００１ｎ非ラベル化リラキシンによる置換により示され た（図ＩＢ）が、１００ｎＭ　Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、　Ｉｎ ｃ、　）（図ＩＣ）、インスリン（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ、　Ｐｅａｒｌ　Ｒｉｖ ｅｒ、　Ｎ、　Ｙ、　）、アンギオテンシンＩＩおよび心房性ナトリウム排泄増 加ペプチド（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯＸデータは示されていない ）によっては示されなかった。正常な雄性ラット心臓の心房における同様の結合 （図ＩＤ）は、１１００ｎ非ラベル化リラキシンにより完全に置換することがで きる（データは示されていない）。

ラット心臓およびラット子宮に対するリラキノン結合の親和性増大する濃度の非 ラベル化すラキシンの存在下での３２ｐ−リラキノン結合の阻害の測定により、 ラット子宮（図２Ａ）および心臓（図２Ｂおよび２Ｃ）における１種類のりラキ ノン結合部位と一致した置換曲線が得られる。全置換は心臓において達成され（ 図２Ｂおよび２Ｃ）、部分的な置換が子宮において観察された（図２Ａ）ｃリラ キノンに対する解離定数（Ｋｄ）は、同じ組織上の２つの別の領域の平均±Ｓ、 Ｅ　として算出された　子宮において１３±０．２２ｇＭ（図２Ａ）、および正 常な心臓において１３７土Ｏ０１，３ｎＭ（図２Ｂ）、およびエストロゲン処置 された卵巣摘出ラット心臓において０．８６±０，３５ｇＭ（図２Ｃ）。

類似の置換曲線が雌性ラット心臓の心房においてＨ１リラキンンを用いて得られ た（図３）。Ｈ１リラキンンに対する解離定数（Ｋｄ）は、１．５３±０．０４ ｇＭであることが見いだされた。

う、ト心臓におけるリラキノンレセプターに対するステロイドホルモンの効果卵 巣摘出は、雌性ラット心臓における３２ｐ−リラキノン結合を変化させなかった （図４ＡおよびＢ）。同様に、精巣摘出した雄性ラット心臓は、無傷の雄性ラッ ト心臓と同じリラキノン結合を示した（データは示されていない）。正常または 卵巣摘出レニ雌性ラットのエストロゲン処置は、心臓におけるリラキノン結合に 対していかなる効果も有していなかった（図４０および４Ｄ）。同様に、無傷の または精巣摘出した雄性ラットのテストステロン処置、またはエストロゲンプラ イム化精巣摘出雄性ラットは、心臓におけるリラキシン結合においていかなる変 化も引き起こさなかった（データは示されていない）。上記のデータは、異なる 組織切片を用いた別の実験の組において繰り返された。エストロゲン処置された 卵巣摘出ラットにおける心房に対するリラキノン結合の親和性（Ｋｄ＝０．８６ ±０．３５ｇＭ、図２Ｃ）は、無傷の雌性心房における親和性（１，３７±０． １３ｇＭ、図２Ｂ）と有意に異ならなかった。

３２ｐ−ラベル化Ｈ２リラキシンのラット子宮および脳に対する特異的結合に関 する以前の報告［０ｓｈｅｒｏｆｆ、　Ｐルら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋ 、　２６５．９３９６−９４０１　（１９９０）；およびＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８８．６４１３−６４１７　（１９９１）］は、 妊娠におけるその役割に加えてリラキノンが他の生理学的な役割をも有するであ ろうことを示唆した。

この実験において、さまざまな他のラット組織に対するリラキシンの結合を調べ 、心臓がこれらの中てリラキノン結合を示す唯一の組織であったことは驚くべき ことであった。この結合は、心室ではなく特に心房に局在化していた。リラキノ ンレセプターの非常に選択的な組織分布は概して興味をそそるものであり、これ らの組織においてリラキノンが有しているであろうある種の新規な機能を示して いる可能性がある。心房に対する特異的結合は、リラキシンが心房機能の制御に 関与しているであろうことを示唆している。

心房の結合部位に対するリラキノンの供給源は現在は知られていない。リラキシ ンの最も高い循環濃度は妊娠中に見い出されており、検出可能な濃度（３０〜１ ５０ｐｇ／ｍｌ）が受胎不可能な黄体期中の末梢血中に報告されている［５ｔｅ ｖａｒｔ、　Ｄ、　Ｒ。

ら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、　７０．１７７１− １７７３　（１９９０）］。リラキシンの循環濃度は雄においては確認されてい ない。しかし、免疫反応性および生物学的に活性なりラキシンがヒト精漿中に報 告されており（平均４５ｎｍ／ｍｌ）、予想される供給源は前立腺である［Ｌｏ ｕｍａｙｅ、　Ｅ、ら、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、 　５０．１１４２−１１４３　（１９W ０）；　Ｅｓ５１ｇ、Ｍ、ら、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、３８０．　 ２２４−２３０　（１９ｇ２）；　Ｗｅｉｓｓ、Ｇ、、Ｂｉ盾戟A［１ｅ ｐｒｏｄ、　４０．１９７−２２０　（１９８９）］。心臓におけるリラキシン の合成の可能性もまた除外することができない。ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼ ーシヨン実験はこの後者の可能性に対する答えをもたらすであろう。

心房、子宮および脳におけるリラキシン結合の特異性および親和性は互いに類似 している。卵巣摘出後の子宮リラキノンレセプターの有意な減少の観察は、子宮 リラキノンレセプターがエストロゲン依存性であることを示唆しているようであ る。異なる状況が心臓において存在している。雄および雌の脳において見られＳ 状響と同楼に、雄のノ（２・房における・１ラキンノ結含の親和性は、雌の心房 における観相性と区別する。′−とが℃きない１、さらに、りらギノンレセブタ ーの濃度は性ステロイドに依存性である。

予４〜例２．　畔４馳〜乙」・−ｐ工・迫↑（二幻〕１ｐ−リ＼４ゾ２宏＋−’ （と４ｅ汗Ｋ］ジ実しく冬す攻黒意撤のある、非妊娠、自然高血圧症（ＳＨＲ） およびスプラグ−・ドーリ−（Ｓｔ））の雌性ラット（各体重的１４４〜３８５ ｇ）の群（各群中、４〜９匹）を本実験において用いた。ラットの左腸骨動脈に カニユーレを挿入し、浸透ポンプを移植するために塩酸ケタミン（１５０ｍｇ／ ｋｇ）で麻酔した。全ての手術は無菌条件下で行った。伸ばしたＰＥ５０管を注 射キャップで固定し、ヘパリンを加えた食塩水で洗い、皮下経路で、カプセルの 間を体外に出し１、ナイロンボタンで皮膚につなぎ留めているスプリングつなぎ を通した。カニユーレを左腸骨動脈に挿入する際に非常に注意を払って、副杆循 環および局所の神経支配の損傷を避けた。次いで、リラキノンまたは賦形剤で満 たした浸透ポンプ（Ａｌｚｅｔ）を、カニユーレの出口地点への尾部である皮下 ポケットへと挿入した。

全ての傷を縫合により閉じ、キノロカイン（Ｘｙｌｏｃａｉｎｅ）を浸透させて ベタジン（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）で覆った。動物は、カニユーレを自由に回転する スクイベル（ｓｑｕｉｖｅｉ）に結合させて妨げら第１ずに動（プるようにして それらのケージに戻した。動脈圧および心拍数、水摂取、尿量および血管血液量 を実験の間毎日測定した。

動脈圧および心拍数を標準的な圧力］・ランスデューサ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ） およびストｌノイノゲーソ増幅器（Ｓｔｏｅｌｔｊｎｇ）を用いて動脈カニユー レを通して直接測定した。

動脈圧を、オンライン表示および磁気ディスク上の保存（Ｔａｎｄｙ　１０００ コンピユーター）のためにＡ　／　Ｄコンバーター（Ｍｅｔｒａｂｙｔｅ　ＤＡ Ｓ−８）を用いてサンプルとした（３０／５ｅｃ）。時間の特定の間隔に対する 平均動脈圧および心拍数をこれらの保存されたデータから統合して平均化した。

＾］、Ｚｅ　ｔ　？Ｎ透ポンプを用いてＨ２リラキ／ンを１または１０ｎｇ／分 の速度で連続的および皮下に注入した。ＳＨＲおよびＳＤクラットおける心拍数 に対する効果を各々、図５および６に示す。図６に示された結果は、検詞＃１に ついて１４４７１μ／日、検討＃２について１４４μｇ７日の用量で得られた。

安楽死の後に子宮全体を解剖し、最も追いｍ＆珈ｉ１よｌ゛嵐墓側７Ｊ、　シた 。し：、Ｉ　”ｔよＪよび６（袴へ・、　Ｓ　ＬＲ）５よびＳＤクラットに示す ように、Ｉ（２リラキシンの生物活性が子宮重量のＦ昇により確認された。

刃ｋＩ明け　Ｊ先々隻２土イ」Ｑ７攪（町１よμ四へ層１−１且対プ３豪衷黒心 房は、心房の充填、収縮および伸張に関して脳に信号を送る伸展レセプターを有 している。リラキ／ンレセプターが心房（実施例１）および視床下部の選択され た自津神経核（Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、上記）に位置しているという観察は、リラ キノンが心房の伸展レセプターの反応の修飾において重要な役割を果たしている であろうことを示唆している。心房筋に対するリラキノンの直接の効果を、以下 のインビトロ実験において評価した。

［ｔＬＬクレープスーヘンゼライト溶液を次の組成（ミリモル）で調製した：Ｎ ａＣ１１１８：ＫＣｌ　４．７　＋Ｍｇ５Ｏ＜　１．６４　＋ＮａＨＣＯ３２４ ，８８；ＫＨｚＰヒト（Ｈ２）リラキノン（ｈＲＬｘ−２，１，５ｍｇ／ｍｌ　 ；　Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を毎日新たに希釈し、クレープスーヘンゼライト溶液 中で所望の濃度（５００・１；５０００：１；５００００・１）にした。

組織採収　雄性ウィスター（Ｗｊｓｔａｒ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅ ｒ）（各々の体重４７５〜５２５　ｇ）をベントパルビタールナトリウム（６０ ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。開胸の後に、心臓を迅速に除去し、自発的な収縮が停 止するまで冷（４℃）クレープスーヘンゼライト溶液中に置いた。右および左心 房を切除した。

実験装置　９５％０２１５％ＣＯ２で通気し、温度制御された水ジャケットで３ ７℃に加熱したクレープスーヘンゼライト溶液（４２ｍｌ）を有する器官チャン バー中に組織を浸けた。組織の収縮をカー置換トランスデユーサ（Ｇｒａｓｓ　 ＦＴ　０．３）で測定し、チャート紙上に記録した（Ｇｒａｓｓ　ｍｏｌｅｄ　 ７．９ポリグラフ）。収縮の速度をカルジオタコメータ（Ｇｒａｓｓ）で測定し た。組織の電気刺激は、刺激装置に刺激分離ユニット（Ｇｒａｓｓ　ｍｏｄｅｌ 、　Ｓ４ｇ）を通して結合された双極クリップ電極により誘導した。

右心房速度の測定：各々０．５ｇ重量のステンレス鋼クリップを右心房の各端に 取り付けた。一方のクリップは器官チャンバー内のフックに固定し、他方のクリ ・ツブはカー置換トランスデユーサ−に取り付けた。トランスデユーサ−の位置 は０゜５ｇの静止張力が得られるように調整した。

位の端は双極電極に取り付けた。この電極部品は器官チャンバー内に固定し、上 方のクリップをカー置換トランスデユーサ−に取り付けた。トランスデユーサ− の位置は、１．０ｇの静止張力が得られるように調整した。左心房は１．５×閾 値て、３Ｈｚで刺激した。パルスの間隔（３ｍ５ｅｃ）および強度（１５〜３． ０ボルト）を実験中一定に保った。

化させた。予備実験により、リラキノンは心房組織から容易に洗い流されなし１ ことが示された。従って、累積用量−反応曲線を作成した。１０分間隔で、１１ ００μ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、ｌ　ｎｇ／ｍｌ、３　ｎｇ／ｌ１ｌｌ、１． 　Ｏｎｇ／ｍｌおよび３０ｎｇ／ｍｌの浴内濃度が得られるようにリラキノンを 各器官チャンバーに加えた。

反応が定常状態に達した後に得た。速度をカルジオタコメータの出力から直接測 定した。収縮力を収縮性重縮の大きさとして測定しこ。組織の間の変動を調整す るために、データを投薬前の値からのパーセント変化として、平均上標準誤差と して表した。速度の測定値は７つの右心房において得；収縮力の測定値は４つの 左心房において得た。

（以下、余白） 結果 右心房心拍数測定の記録は以下の表１に示す。

０　３０μｇ　１１００ｐ　３００μｇ　Ｉｎｇ　３ｎｇ　ＩＯｎｇ　３０ｎｇ ３　２７０　２７０　２９５　３］、０　３５０　３９０実験＃　％△ ５　０　０　３　７　２０　２３　２ｇＸ　０　０．１７　３．８３　１１．６ ７　２３．３３　３２．０　３６．２ＳＤ　±０．３２　２，７３　４，９５　 ７．９９　１５．４７　１０．５０ＳＥＭ　Ｏ，１４１，２２２，２＋、３，５ ７　６，３２　５．２５投薬前の右心房の平均自発性収縮速度は２８７±９．４ 拍動／分であった。図９に示すように、リラキシンは３０ｎｇ／分の用量で平均 ３６％の収縮速度の用量依存性の上昇を導いた。収縮速度における最大上昇の半 分の点は約１．８ｎｇ／■１で生じた。

電気的に整調した左心房における収縮性の測定結果を表２に要約する。

０　３０ｐｇ　１１００ｐ　３００ｐｇ　ｌｎｇ　３ｎｇ　１０％ｇ　３０％ｇ ５　０．６８ｇｍ−０，６００，５５０，６５０，７５０，８３０，３５ｇｍ６ 　１．０５　−　１．００　０．９５　１．１０　１．３０　１．４５　１．５ ０７　０．５０　０．４ｇ　０．４５　０．４８　０．５８　’０．７０　０． ７８８　０．７５　０．７３　０，７５　０．８０　０．８０　０．９０　０． ９５Ｘ　−６−９，５１，０１４，３３０３７，８ＳＤ　３．５３　６，７３　 ５，０５　６．５０　９．０６　１２．６ＳＥＭ　２，０４　３．８８　２，９ ２　３，７５　５，２３　７．３０電気的に整調した左心房の収縮性傘縮の平均 の大きさは０．７５±０．１１ｇであった。図１０に示すように、リラキノンは 収縮力に対する二相性の用量効果を導いた。１０％の収縮力の減少ピークは３０ ０ｐｇ／ｍｌで発生したが、３８％の上昇ピークは３０％ｇ／ｍｌで発生した。

収縮力の最大上昇の半分の点は約４　、８ｎｇ／＋ｍｌて生じた。

以前の実験で、本発明者らは、リラキシンの静脈内注射が心拍数の小さＬ）が− 貫した上昇ならびに収縮期圧および拡張期圧の減少と関係していることを見ｐｚ だしている。

これらの結果は、血圧の用量依存性の減少および心拍数の最小限の増加を伴うこ とが報告されている他の変力性薬物に反応する心筋収縮性の用量相関性の上昇に 非常に似ている［Ｅｖａｎｓ、Ｄ、　Ｂ、ら、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｓｔ 　２５．５５０　（１９８３）；　Ｅｖａｎｓ、Ｄ、Ｂ。

ら、　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌ　Ｒｅｓ、　９．１４３−１５７　（１９８６）； およびｆｅｉｓｈａａｒ、　Ｒ，Ｅ、ら、　Ｃａｒｄｉｏｖ≠唐■ ｕｌａｒ　Ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３．２９−４２　（１９８９ ）］。

実施例４　之とヱ乞上上Ｚ匹凹駐回匹す之ヱ上心！匹奎す灸寒吟牲主主ｇ露カ性 に対するリラキシンの効果 雄性スプラグ−・ドーリ−ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、　Ｐｏｒｔａ ｇｅ、ＩＮ、ＵＳＡ）（体重３００〜３５０ｇ）を、６０ｍｇ／ｋｇベントバル ビターノはト１功ム（Ｆｏｒｔ　Ｄｏｄｇｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ ｎｃ、　、　Ｆｏｒｔ　Ｄｏｄｇｅ、　ＩＡ、　ＵＳＡ）の腹腔内投与により麻 酔した。開胸の後に、心臓を除去して４℃のクレープスーヘンゼライト溶液（１ １８腸ＭＮａＣ１，４，７謹ＭＫＣＩ、２．５２ｍＭ　ＣａＣｌ２．１　、６４ 　ｍＭ　Ｍｇ　Ｓ　０４．２４．８８ｍＭ　ＮａＨＣＯ，，１，１８ｒｍＭ　Ｋ Ｈ２ＰＯ，および１１ｍＭグルコースを含み、９５％０２１５％ｃ。

２で通気）中に入れた。結合した肺および胸腺組織を切り取り、上行動脈番＝カ ニユーレを挿入した。次いで、心臓を３７℃でクレープスーヘンゼライト溶液を 用０て１０ｍ１／分で潅流した。潅流圧を常にモニターした。左心室の展開圧力 （ＬＶＤＰ）を測定するために、左心房中に小さな切り口を作り、圧力ドランス デューサー（Ｇｏｕｌｄ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　Ｖａｌｌｅｙ　Ｖｉｅｗ 、０１１．ＵＳＡ）に結合された水充填ｌ（ル−ン（Ｅｕｇ。

５ａｃｈｓ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ、　Ｍａｒｃｈ−１’ｌｕｇｓｔｅｔｔｅｎ 、Ｇｅｒｍａｎｙ）を左心１室（こ入れた。この圧力力）ら、記録心拍数は電子 的にグラス（Ｇｒａｓｓ）・ポリグラフ（Ｑｕｉｎｃｙ、　Ｍ＾、ＵＳＡ）上（ 二得られた。

６つの実験において、１５〜２０分の安定化期後に心房を除去した。次し）で、 心拍数をリラキシンの投与前のその断速度に安定化させた。３つの実験導こお（ 嵐で、た。累積用量−反応曲線をヒト組換えＨ２リラキシン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃ ｈ、　Ｉｎｃ、　５ｏｕｔｈ　５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃ＾、ＵＳＡ）を 用いて作成した。酒石酸水素アドレナリン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、　、Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）をｌ　ｍｇ／ｍｌアスコルビン 酸ナトリウムを含む０．９％（ｖ／Ｖ）食塩水溶液中に１　ｍｇ／口１保存溶液 として溶解し、５０またｌ；！　１５０μｌポーラス注射として潅水中に投与し た。両薬物の連続希釈液を０．９％（Ｗ／Ｖ）食塩水溶液を用いて作成した。

統計学的な有意性を両側スチューデント非対（ｕｎｐａｉｒｅｄ）　を検定によ り決定し、ｐ＜０．００５を有意であるとみなした。

５４±５ｍｍＨｇで潅流した、単離されたラット心臓調製物は、２７０±７拍動 ／分（ｂｐｗ）の基礎的な収縮速度およびＬＶＤＰ８３±４ｎｏ＋Ｈｇを有して いた。心房を除去した後に、心拍数は１３９±１５ｂｐａ＋に降下しくＰ〈０． ０５）、一方でＬＶＤＰは１４３±９關Ｈｇに上昇した（Ｐ＜０．０５）。

無傷の心臓調製物の潅流液へのりラキノンの添加は、用量−依存性の変時性反応 をひき起こし、８３ｐＭｏｌで４１２±１８ｂｐｍの最大収縮速度に達した（Ｐ 　＜　０゜０５）（図１１）。心房を除去した調製物において、リラキシンの添 加は同様に８３１）Ｍｏｌに反応して２６８±７ｂｐ−最大速度を有する用量− 依存性の変時性効果をひき起こした（Ｐ＜０．０５Ｘ図１１）。これらの効果は 、８３０　ｐＭｏｌの単回ポーラス投与の２時間後まで持続した。逆に、短時間 持続する用量−依存性変時性効果がアドレナリン投与に反応して観察された。ア ドレナリン後の最大の到達可能な収縮速度は１５０ｐＭｏｌＴ３４９±８ｂｐＨ ′ｒあった（Ｐ＜０．０５）（図１１）。

比較的高用量のアドレナリンは、収縮速度の正確な測定が困難である過剰な不整 脈をひき起こした。

用量−依存性の正の変力性効果がアドレナリンに対する変時性反応に付随してイ タ。ＬＶＤＰｌｔ４．５ｐＭｏｌＴ１９５±１０Ｉｌｌ＋ｍＨｇ１：上昇した（ Ｐ＜０．０５）。比較的高用量により、わずかに弱められた正の変力性反応が生 じた（図１２）。アドレナリンとは異なり、リラキノンは正の変力性効果を有し ていなかった。心房を除去することにより収縮速度が減少し、より高いＬＶＤＰ を有する調製物において、リラキノン（０，８３ｐＭｏｌ）はＬＶＤＰを対照の レベルまで有意に減少させた（Ｐ＜０．０５）（図１２）。

さらにアドレナリンは冠動脈潅流圧において小さな（５〜１０ｍ鵬Ｈｇ）一過性 の上昇をひき起こした。この反応はワラキシン投与後には見られなかった。

最近の研究により、リラキシンが単離されたう・ソト心房調製物に対して正の変 時性および変力性効果を有することが示されている［Ｋａｋｏｕｒｉｓら、匡匹 懸η隻１０７６−１０７８　（１９９２）］。本発明者らの単離された心臓調製 物において、リラキシンはブセット、または単に心室組織におけるレセプター刺 激に対する変力性反応の欠如を示している可能性がある。本研究の中で、ワラキ シン投与後の心拍数の上昇は心房に限定されず、心室組織にもまた存在すること は明らかであった。変時性効果がＳＡ、ＡＶを動かした調製物の両方において最 大に達することもまた注目に値する。実際に、用量−反応曲線は平行することが 明らかである。

実施例５　ラット脳におけるリラキシンｍＲＮＡの局在性脳、特に血液−脳関門 のない胃周囲器官以外の領域におけるリラキシン結合部位の存在を考慮すると、 これらの結合部位のためのリラキシンの内因性供給源および中枢神経系における リラキノンの潜在的な機能的意義についての問題が生ずる。予備的なウェスタン およびノーザンプロット分析によりリラキシン様免疫反応性ならびにラット脳に おけるリラキシン■ＲＮＡの存在が示唆された［Ｂａｋｈｉｔら。

５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１７ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ 　Ｍｅｅｔｉｎｇ、　Ｎｅｗ　０ｒｌｅａｎｓル＾０．＾ｂ唐狽窒≠モ■ Ｎｏ、　４６１．１７　（１９８７）］が、いかなる明白な証拠も開示されてい ない。

脳におけるリラキシンの合成部位をさらに調べるために、本発明者らは、ｐＧＥ Ｍ４Ｚベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｍａｄｉｓｏｎ ｊｌ）中にサブクローン化されたラットプレブロリラキシンｃＤ　Ｎ　Ａ　［Ｈ ｕｄｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ　２９１．１２７−１３１．　（１９８１））のヌ クレオチド配列のうち、塩基２５７〜６２８、Ｐ　ｓｔｌおよびＳ■ａＩ制限部 位の間］の３７２−ｂｐフラグメントを５ｂＳ−ラベル化ＲＮＡプローブ［Ｍｅ ｌｔｏｎら、熟蛙罐ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．７０３５−７０７０　（ １９８４）］の合成における鋳型として用いたｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼー シヨンにより、ラット脳におけるリラキシン園ＲＮＡの発現を研究した。結果は 、リラキシ：／ｌＲＮＡが生に４つの異なる領域（図１３）：１）前嗅覚核（Ａ ＯＮ）：　２）蓋ひも（ｔｔ）　＋　３）梨状皮質（Ｐｉｒ）＋および４）海馬 、特に海馬の歯状回および海馬構成体（ｈｆ）のＣＡＩ〜４野に発現されること を示した。

海馬は記憶過程、特に最近の記憶に関与していることが知られている。さらに、 解剖学的および病理学的な研究により、アルツハイマー病の様な神経退化性疾患 の初期に嗅覚経路が関与しているであろうことが示唆されている［Ｐｅａｒｓｏ ｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８２．　４ ５３１　（１９８５）；　Ｔａｌａｍｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３３７．　７R６− ７３９　（１９ｇ ９）コ。このことは、本発明者らの観察と共に、神経退化性疾患の治療のための 治療薬としてリラキシンを適用する可能性を生じさせている。

上記は特定の好ましい態様について言及するものであるが、本発明はこのように 限定されないことは理解されるであろう。本発明の全体の概念から逸脱すること なく開示された態様に対して様々な修飾を行うことが当業者に生じるであろう。

このような全ての修飾は本発明の範囲内にあることが意図されている。

ＦＩＧ、ＩＡ　ＦＩＧ、Ｉｃ ＦＩＧ、２Ｂ リラキソン濃度　ＣＭ） リラキシン濃度　ＣＭ） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４Ａ　ＦＩＧ、４Ｃ ＦＩＧ、４８　ＦＩＧ、４Ｄ ＦＩＧ、　４Ｅ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ０口　対照 ・ｌ　リラキシン 日数 ＦＩＧ。７ リラキシン用量（μｇ７日） ＦＩＧ、８ リラキシン用量（μｇ／日） ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ＩＯ リラキシン濃度（ｎ、ｇ／ｍ１） ＦＩＧ、ＩＩ 国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０６９２７ ７コントページの綺き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ 、ＣＡ、ＪＰ （７２）発明者　トーマス、ジー・ロジャーアメリカ合衆国カリフォルニア９４ ０１０、バーリンゲーム、パーク・アベニュー８１２番（７２）発明者　ワード 、ディピッド・ジ−アメリカ合衆国カリフォルニア９５３６１、オークダール、 バレイ・ホーム・ロード １３９０６番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．心房中のリラキシンレセプターに特異的に結合することができ、心房収縮力 または収縮速度を上昇させることができる化合物の治療的有効量を、病理学的に 減少した心拍出量を呈している患者に投与することにより心拍出量を増大させる 方法。 ２．該化合物がリラキシンである請求項１に記載の方法。 ３．該患者がヒトであり、該化合物がヒトリラキシンである請求項２に記載の方 法。 ４．該化合物が、Ｈ２リラキシンまたはＨ１リラキシンである請求項３に記載の 方法。 ５．該化合物が、天然のＨ２リラキシンまたはＨ１リラキシンのアミノ酸配列を 含む請求項４に記載の方法。 ６．該化合物が、Ｈ２リラキシンまたはＨ１リラキシンの完全長のＡ−鎖および カルボキシ末端が短縮されたＢ−鎖を含む請求項４に記載の方法。 ７．該化合物が、Ｈ２リラキシンＡ−鎖Ａ（１−２４）、Ａ（２−２４）、Ａ（ ３−２４）のいずれか１つとＨ２リラキシンＢ−鎖Ｂ（−１−２３）〜Ｂ（−１ −３２）のいずれか１つとの組み合わせを含む請求項４に記載の方法。 ８．Ｈ２リラキシンまたはＨ１リラキシンが、液体の注射可能な医薬製剤の形態 で投与される請求項４に記載の方法。 ９．該製剤が、治療的有効量のＨ２リラキシンを４．５〜５．５の緩衝液中に含 む請求項８に記載の方法。 １０．心不全を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする患者 に、心房中のリラキシンレセプターに特異的に結合することができ、心房収縮力 または収縮速度を上昇させることができる化合物の治療的有効量を投与すること による方法。 １１．該心不全がうっ血性心不全である請求項１０に記載の方法。 １２．該患者がヒトであり、該化合物がリラキシンである請求項１１に記載の方 法。 １３．該化合物がＨ２リラキシンまたはＨ１リラキシンである請求項１２に記載 の方法。 １４．心不全またはそれに関連した状態の治療に適している別の治療薬の投与を 含む請求項１３に記載の方法。 １５．該心不全が急性心不全であり、該投与が治療的有効量のＨ２リラキシンま たはＨ１リラキシンを含む液体医薬製剤の静脈内注射による請求項１３に記載の 方法。 １６．心臓の変力性または変時性を刺激する方法であって、そのような刺激を必 要とする患者に、心房中のリラキシンレセプターに特異的に結合することができ 、心房収縮力または収縮速度を上昇させることができる化合物の治療的有効量を 投与することからなる方法。 １７．該化合物がリラキシンである請求項１６に記載の方法。 １８．該化合物が、Ｈ２リラキシンまたはＨ１リラキシンである請求項１６に記 載の方法。 １９．心臓の変力性を刺激し得る別の治療薬の投与を含む請求項１８に記載の方 法。 ２０．急性心不全後の心機能を回復させる方法であって、そのような治療を必要 とする患者に、心房中のリラキシンレセプターに特異的に結合し得る化合物の、 心筋の収縮性を低下前のレベルに回復させ得る量を含む液体医薬製剤を静脈内投 与することからなる方法。 ２１．該化合物がリラキシンである請求項２０に記載の方法。 ２２．該化合物が、Ｈ２リラキシンまたはＨ１リラキシンである請求項２１に記 載の方法。 ２３．少なくとも一つの別の心臓血管薬による治療をさらに含む請求項２２に記 載の方法。 ２４．洞性除脈を有する患者に、心臓のリラキシンレセプターに特異的に結合し 得る化合物の、心拍数を正常レベルヘと上昇させるに有効な量を投与することか らなる心拍数を上昇させる方法。 ２５．該化合物がリラキシンである請求項２４に記載の方法。 ２６．該患者がヒトであり、該リラキシンがヒトリラキシンである請求項２５に 記載の方法。 ２７．該化合物が、Ｈ２リラキシンまたはＨ１リラキシンである請求項２６に記 載の方法。 ２８．リラキシンが、Ｈ２リラキシンまたはＨ１リラキシンの完全長のＡ−鎖お よびカルボキシ末端が短縮されたＢ−鎖を含む請求項２６に記載の方法。 ２９．リラキシンが、Ｈ２リラキシンＡ−鎖Ａ（１−２４）、Ａ（２−２４）、 Ａ（３−２４）のいずれか１つとＨ２リラキシンＢ−鎖Ｂ（−１−２３）〜Ｂ（ −１−３２）のいずれか１つとの組み合わせを含む請求項２６に記載の方法。 ３０．Ｈ２リラキシンまたはＨ１リラキシンが、液体の注射可能な医薬製剤の形 態で投与される請求項２７に記載の方法。 ３１．該製剤が、治療的有効量のＨ２リラキシンを４．５〜５．５の緩衝液中に 含む請求項３０に記載の方法。 ３２．治療される患者の心臓が洞房（ＳＡ）結節機能に欠陥を有する請求項２６ に記載の方法。 ３３．心拍数の増加が変力性の効果を伴わない請求項３２に記載の方法。 ３４．成人ヒト患者を治療し、心拍数の正常レベルが約６０〜約１００拍動／分 の間である請求項２６に記載の方法。 ３５．該治療を、症候性の除脈を有する患者にペースメーカーを移植する前に行 う請求項３４に記載の方法。 ３６．該除脈が下壁心筋梗塞後の一過性の除脈である請求項３４に記載の方法。 ３７．神経退化性疾患を治療するための方法であって、そのような治療を必要と する患者に、脳のリラキシンレセプターに選択的に結合し得る化合物の治療的有 効量を投与することからなる方法。 ３８．該レセプターが脳の海馬または前嗅覚核中に存在する請求項３７に記載の 方法。 ３９．該化合物がリラキシンである請求項３８に記載の方法。 ４０．該神経退化性疾患がアルツハイマー病である請求項３９に記載の方法。 ４１．心房中のリラキシンレセプターに特異的に結合することができ、心房収縮 力または収縮速度を上昇させることができる化合物の使用であって、心拍出量を 増大させるための医薬組成物を製造する際に該化合物の治療的有効量を薬学的に 許容し得る担体と混合することからなる使用。 ４２．該化合物がリラキシンである請求項４１に記載の使用。 ４３．心房中のリラキシンレセプターに特異的に結合することができ、心房収縮 力または収縮速度を上昇させることができる化合物の使用であって、心不全を治 療するための医薬組成物を製造する際に該化合物の治療的有効量を薬学的に許容 し得る担体と混合することからなる使用。 ４４．該化合物がリラキシンである請求項４３に記載の使用。 ４５．心房中のリラキシンレセプターに特異的に結合することができ、心房収縮 力または収縮速度を上昇させることができる化合物の使用であって、心臓の変力 性または変時性を刺激するための医薬組成物を製造する際に該化合物の治療的有 効量を薬学的に許容し得る担体と混合することからなる使用。 ４６．該化合物がリラキシンである請求項４５に記載の使用。 １７．心房中のリラキシンレセプターに特異的に結合し得る化合物の使用であっ て、急性心不全後の心機能を回復させるための液体医薬製剤を製造する際に、心 筋収縮性を低下前のレベルに回復させ得る量の該化合物を液体医薬担体と混合す ることからなる使用。 ４８．該化合物がリラキシンである請求項４７に記載の使用。 ４９．心臓中のリラキシンレセプターに特異的に結合し得る化合物の使用であっ て、洞性除脈を治療するための医薬組成物を製造する際に、心拍数の正常レベル ヘの増加に有効な量の該化合物を薬学的に許容し得る担体と混合することからな る使用。 ５０．該化合物がリラキシンである請求項４９に記載の方法。 ５１．脳中のリラキシンレセプターに選択的に結合し得る化合物の使用であって 、神経退化性疾患を治療するための医薬組成物を製造する際に該化合物の治療的 有効量を薬学的に許容し得る担体と混合することからなる使用。 ５２．該疾患がアルツハイマー病であり、該化合物がリラキシンである請求項５ １に記載の使用。