PT1648494E - Novo agente antiangiogénico e sua utilização no quadro do tratamento de cancros - Google Patents

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DESCRIÇÃO "Novo agente antiangiogénico e sua utilização no quadro do tratamento de cancros" 0 presente invento tem por objecto um novo agente antiangiogénico, bem como a sua utilização, especialmente no quadro do tratamento de cancros. A angiogénese é um processo de crescimento de novos capilares sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. Três fenómenos particulares estão principalmente na base deste processo: a proliferação, a migração e a diferenciação (a tubulogénese) das células endoteliais. A angiogénese é activada por certos factores de crescimento, ditos factores angiogénicos, tais como o VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, factor de crescimento endotelial vascular), o FGF-1 (Fibroblast Growth Factor 1, factor de crescimento de fibroblastos 1) ou o FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2, factor de crescimento de fibroblastos 2).

Em situação normal, a angiogénese está essencialmente restringida ao sistema reprodutor feminino e à cicatrização de feridas. No entanto, a angiogénese está igualmente implicada em numerosos casos patológicos, tais como a retinopatia diabética, a psoríase, a poliartrite reumatóide, a degenerescência macular associada à idade, e os cancros. Com efeito, neste último caso foi mostrado que o crescimento tumoral era grandemente favorecido pelo aparecimento no seio destes tumores, de uma neovascularização resultando em particular na secreção pelos tumores de factores angiogénicos.

Estão em curso numerosas tentativas de tratamentos terapêuticos baseados na utilização de proteínas antiangiogénicas. Entre estes compostos, um dos mais promissores é a endostatina (0'Reilly et al., 1997), que está actualmente em ensaios clinicos de fase I (Herbst et al., 2002) . A endostatina é uma proteína de 20 kDa correspondente a um fragmento do colagénio XVIII. O mecanismo de acção da endostatina permanece desconhecido. 2 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ

Certas tentativas terapêuticas fundamentam-se na elucidação de mecanismos de acção conhecidos. Assim as células endoteliais em proliferação exprimem a integrina avb3 enquanto as células endoteliais quiescentes não a exprimem (Brooks, 1994). Esta observação permitiu apurar inibidores desta molécula actualmente em ensaios clínicos.

Entre todos os actores moleculares implicados na activação da angiogénese, só o VEGF fez prova da sua eficácia em praticamente todos os modelos experimentais de medida da actividade da angiogénese (Ortéga, 1999). Além disso, na Primavera de 2003, foi tornado público pela sociedade Genentech que anticorpos anti-VEGF exerciam uma actividade antitumoral nos doentes com cancro do cólon. Assim, é pois de importância primordial investigar moléculas que se possam ligar a VEGF e desse modo exercer uma actividade antitumoral comparável à dos anticorpos anti-VEGF. O gene nov, em primeiro lugar identificado nos nefroblastomas aviários (Joliot et al., 1992; Martinerie e Perbal, 1991), foi clonado no ser humano (novH) (Martinerie et al., 1994), no ratinho (novM) (Snaith et al., 1996) e em Xenopus laevis (Ying e Ling, 1996). A proteína NOV, codificada pelo gene nov, cuja função é até à data desconhecida, pertence à família CCN (Bork, 1993) que compreende as proteínas seguintes: CYR61 (Lau e Nathans, 1985), CTGF (Bradham et al., 1991), ELM-1 ou WISP-1 (Pennica et al., 1998; Hashimoto et al., 1998), R-COP ou WISP-2 (Pennica et al., 1998; Kumar et al., 1999; Brigstock, 1999) e WISP-3 (Pennica et al., 1998). Estas proteínas são todas constituídas de quatro domínios distintos: uma proteína que se liga a um factor de crescimento análogo à insulina (IGFBP), um domínio de repetição factor Willebrand de tipo C, um domínio de repetição trombospondina de tipo I e um domínio COOH-terminal. As proteínas da família CCN regulam diferentes processos celulares normais compreendendo a proliferação, a adesão, a apoptose e a quimiotaxia. Estão igualmente implicadas na implantação, na formação esquelética, no desenvolvimento embrionário e em diferentes doenças tais como a fibrose, a cicatrização e os cancros (Chevalier et al., 1998). 3 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ A proteína NOV humana (NOVH) pode ser detectada nos tecidos normais (rins, músculos, cartilagem, cérebro, pulmões, ovários, coração e cortico-suprarrenal) a diferentes níveis (Joliot et al., 1992; Martinerie et al., 2001; Kocialkowski et al., 2001; Perbal et al., 1999) e a sua expressão varia no decurso do desenvolvimento.

Até à data as funções exercidas pela proteína NOV não estão claramente estabelecidas. Foi recentemente proposto que a NOV poderia exercer uma acção pró-angiogénica (Lin, 2003) permitindo-lhe ligar-se a certas integrinas (avb3, a6bl e a5bl). Adicionalmente estes autores mostram que a NOV exerce uma actividade pró-angiogénica no modelo da córnea de coelho. No entanto, foi demonstrado que este ensaio pode conduzir a resultados falsamente positivos por libertação de factores angiogénicos sintetizados e armazenados na córnea (Plouét, 1997).

Assim o presente invento resulta de ter sido evidenciada a actividade antiangiogénica de NOV devido à sua ligação a VEGF. O presente invento tem por objectivo fornecer um novo agente antiangiogénico possuindo um novo mecanismo de acção. O presente invento fundamenta-se na constatação feita pelos inventores de que a utilização: de uma proteína caracterizada por compreender ou ser constituída por:

* a proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, ou * um fragmento desta proteína, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 180 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, ou * qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, em particular por substituição, supressão ou adição 4

ΕΡ 1 648 494/PT de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou

* qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, de uma sequência nucleótidica caracterizada por compreender ou ser constituída por uma sequência nucleótidica codificando: * quer a proteina NOV tal como definida acima, * quer um fragmento da proteina NOV tal como definido acima, * quer uma sequência derivada da proteína NOV tal como definida acima, * quer uma sequência homóloga da proteina NOV tal como definida acima, a referida sequência nucleótidica correspondendo em particular à sequência nucleótidica SEQ ID NO: 1 codificando a SEQ ID NO: 2, ou à sequência SEQ ID NO: 3 codificando a SEQ ID NO: 4, ou à sequência SEQ ID NO: 5 codificando a SEQ ID NO: 6, ou à sequência SEQ ID NO: 7 codificando a SEQ ID NO: 8, ou à sequência SEQ ID NO: 9 codificando a SEQ ID NO: 10, ou à sequência SEQ ID NO: 11 codificando a SEQ ID NO: 12, de um anticorpo anti-idiotípico da proteina NOV, pode ser considerada para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento: de patologias necessitando a inibição da proliferação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: a degenerescência macular ligada à idade, as retinopatias diabéticas, a poliartrite reumatóide, os angiomas, os angiossarcomas, em particular a doença de Castelman e o sarcoma de Kaposi, ou de patologias necessitando a inibição da activação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: a rejeição de enxerto e de xenoenxerto, as acrocianoses, as esclerodermias, ou no quadro 5 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ preparação de enxertos entre a colheita e o transplante.

Também, o invento refere-se à utilização: de uma proteína caracterizada por ser constituída por: * a proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, ou * um fragmento desta proteína, representado pela sequência SEQ ID NO: 12, de uma sequência nucleótidica caracterizada por compreender ou ser constituída por uma sequência nucleótidica codificando: * quer a proteína NOV tal como definida acima, * quer um fragmento da proteína NOV tal como definido acima, a referida sequência nucleótidica correspondendo à sequência nucleótidica SEQ ID NO: 1 codificando a SEQ ID NO: 2, ou à sequência SEQ ID NO: 11 codificando a SEQ ID NO: 12, de um anticorpo anti-idiotípico da proteína NOV representada pela sequência SEQ ID NO: 2, o referido anticorpo mimetizando as funções da proteína NOV no reconhecimento de VEGF, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento: de patologias necessitando a inibição da proliferação endotelial, no quadro das patologias seguintes: a degenerescência macular ligada à idade, as retinopatias diabéticas, a poliartrite reumatóide, os angiomas, os angiossarcomas, em particular a doença de Castelman e o sarcoma de Kaposi, ou de patologias necessitando a inibição da activação endotelial, no quadro das patologias seguintes: a rejeição de enxerto e de xenoenxerto, as acrocianoses, as esclerodermias, ou no quadro da preparação de enxertos entre a colheita e o transplante.

Por outro lado, o presente invento fundamenta-se na constatação precedente de que a utilização de uma proteína caracterizada por compreender ou ser constituída por: 6 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ * a proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, ou * um fragmento desta proteína, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 180 aminoácidos, e de preferência de cerca de 40 a cerca de 80 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, ou * qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, em particular por substituição, supressão ou adição de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou * qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, pode ser considerada para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento: de patologias necessitando a inibição da proliferação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: a degenerescência macular ligada à idade, as retinopatias diabéticas, a poliartrite reumatóide, os angiomas, os angiossarcomas, em particular a doença de Castelman e o sarcoma de Kaposi, ou de patologias necessitando a inibição da activação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: a rejeição de enxerto e de xenoenxerto, as acrocianoses, as esclerodermias, ou no quadro da preparação de enxertos entre a colheita e o transplante. A sequência SEQ ID NO: 2 corresponde à proteína humana NOV codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO: 1. 7 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ A sequência SEQ ID ΝΟ: 4 corresponde ao fragmento IGFBP (proteína que se liga a um factor de crescimento análogo à insulina) da proteína humana NOV, o referido fragmento sendo codificado pela sequência nucleotídica SEQ ID NO: 3. Este fragmento compreende 72 aminoácidos e corresponde ao fragmento da proteína NOV desde o resíduo 33 ao resíduo 104 da sequência SEQ ID NO: 2. A sequência SEQ ID NO: 6 corresponde ao fragmento VWC (domínio de repetição factor Willebrand de tipo C) da proteína humana NOV, o referido fragmento sendo codificado pela sequência nucleotídica SEQ ID NO: 5. Este fragmento compreende 67 aminoácidos e corresponde ao fragmento da proteína NOV desde o resíduo 108 ao resíduo 174 da sequência SEQ ID NO: 2. A sequência SEQ ID NO: 8 corresponde ao fragmento TSP-1 (domínio de repetição trombospondina de tipo I) da proteína humana NOV, o referido fragmento sendo codificado pela sequência nucleotídica SEQ ID NO: 7. Este fragmento compreende 45 aminoácidos e corresponde ao fragmento da proteína NOV desde o resíduo 206 ao resíduo 250 da sequência SEQ ID NO: 2. A sequência SEQ ID NO: 10 corresponde ao fragmento CT (domínio COOH-terminal) da proteína humana NOV, o referido fragmento sendo codificado pela sequência nucleotídica SEQ ID NO: 9. Este fragmento compreende 75 aminoácidos e corresponde ao fragmento da proteína NOV desde o resíduo 264 ao resíduo 338 da sequência SEQ ID NO: 2. A sequência SEQ ID NO: 12 corresponde ao fragmento C-terminal da proteína humana NOV, o referido fragmento sendo codificado pela sequência nucleotídica SEQ ID NO: 11. Este fragmento compreende 170 aminoácidos e corresponde ao fragmento da proteína NOV desde o resíduo 188 ao resíduo 357 da sequência SEQ ID NO: 2. A actividade de inibição da angiogénese é igualmente designada actividade antiangiogénica. Esta actividade pode ser por exemplo evidenciada in vitro demonstrando a inibição, e ao mesmo tempo a multiplicação, a migração e a 8 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ diferenciação, de células endoteliais pelas sequências peptidicas do invento. A medição da inibição da multiplicação de células endoteliais pode ser realizada cultivando células endoteliais na presença da sequência peptídica cuja actividade se pretende avaliar. A medição da inibição da miqração das células endoteliais pode ser realizada efectuando uma "ferida" sobre uma camada de células endoteliais e incubando de seguida as células na presença da sequência peptidica a testar. Mede-se então o número de células que migraram sobre a ferida. A medição da inibição da diferenciação (tubulogénese) das células endoteliais pode ser realizada medindo o comprimento de túbulos formados pelas células endoteliais cultivadas sobre gel na presença da sequência peptidica a testar.

Entre os modelos clássicos de medição da angiogénese, podem-se citar modelos por entrega local tais como: a injecção subcutânea de Matrigel (Becton Dickinson) impregnada do composto do invento (Inoki et al., 2002), ou o depósito sobre a membrana cório-alantóica de galinha de um implante contendo um composto do invento (Celerier et al., 2002). O composto do invento pode ser injectado por via sistémica (intravenosa, intraperitoneal, subcutânea) em animais nos quais foi criada uma doença angiogénica experimental. O composto do invento pode também ser injectado directamente num tumor. Alternativamente a proteína NOV ou os fragmentos ou os anticorpos anti-idiotípicos de acordo com o invento (aqui depois descritos) podem ser entregues por um método de terapia génica por via local ou sistémica por qualquer método permitindo a expressão da proteína ou dos fragmentos ou dos anticorpos anti-idiotípicos de acordo com o invento (vírus ou plasmídeo contendo a sequência de NOV). Alternativamente a sequência de NOV ou dos fragmentos ou dos anticorpos anti-idiotípicos de acordo com o invento pode ser inserida num plasmídeo que é transfectado nas células cancerosas (aqui a medição consiste em medir a evolução de tumores desenvolvidos a partir de células cancerosas transfectadas por um plasmídeo contendo ou não a sequência de NOV ou de um fragmento). Todos estes processos de medição 9 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ estão em particular descritos no artigo de Jain et al. (1997).

Designa-se por actividade antitumoral, uma actividade permitindo inibir o crescimento tumoral e/ou induzir a regressão até ao desaparecimento de tumores. Esta actividade pode ser por exemplo evidenciada in vivo medindo a massa de tumores, cujo desenvolvimento foi induzido no ratinho por injecção de células tumorais, na presença e na ausência de administração de sequências peptidicas do invento e/ou de ácidos nucleicos exprimindo as sequências peptidicas do invento. A expressão "inibição da proliferação endotelial" designa qualquer substância capaz de refrear a proliferação de células endoteliais de acordo com o ensaio descrito mais adiante (parte experimental). A expressão "activação endotelial" corresponde a qualquer patologia implicando células endoteliais submetidas a uma concentração presumida em VEGF em relação ao estado não patológico.

De acordo com um modo de realização vantajoso, o presente invento refere-se à utilização tal como definida acima de uma proteina caracterizada por compreender ou ser constituída pela proteina NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2.

Uma utilização vantajosa de acordo com o presente invento consiste na utilização tal como definida acima de uma proteina caracterizada por compreender ou ser constituída pela proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de patologias necessitando a inibição da proliferação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: a degenerescência macular ligada à idade, as retinopatias diabéticas, a poliartrite reumatóide, os angiomas, os angiossarcomas, em particular a doença de Castelman e o sarcoma de Kaposi. 10 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ

Uma utilização vantajosa de acordo com o presente invento consiste na utilização tal como definida acima de uma proteina, caracterizada por compreender ou ser constituída pela proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de patologias necessitando a inibição da activação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: a rejeição de enxerto e de xenoenxerto, as acrocianoses, as esclerodermias, ou no quadro da preparação de enxertos entre a colheita e o transplante. O presente invento fundamenta-se igualmente na constatação feita pelos inventores relativa a uma proteína caracterizada por compreender ou ser constituída por: * um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 180 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, ou * qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, em particular por substituição, supressão ou adição de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou * qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, poder ser utilizada tal como definido acima. O presente invento fundamenta-se igualmente na constatação feita pelos inventores relativa a uma proteína caracterizada por compreender ou ser constituída por: 11 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ * um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 180 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, ou * qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, em particular por substituição, supressão ou adição de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou * qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de patologias necessitando a inibição da proliferação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: a degenerescência macular ligada à idade, as retinopatias diabéticas, a poliartrite reumatóide, os angiomas, os angiossarcomas, em particular a doença de Castelman e o sarcoma de Kaposi, poder ser utilizada tal como definido acima. O presente invento fundamenta-se igualmente na constatação feita pelos inventores relativa a uma proteína caracterizada por compreender ou ser constituída por: * um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 180 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ ID NO: 4, SEQ NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, ou 12 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ * qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, em particular por substituição, supressão ou adição de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou * qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, poder ser utilizada para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de patologias necessitando a inibição da activação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: a rejeição de enxerto e de xenoenxerto, as acrocianoses, as esclerodermias, ou no quadro da preparação de enxertos entre a colheita e o transplante. O presente invento fundamenta-se igualmente na observação feita pelos inventores de uma proteína caracterizada por compreender ou ser constituída por: * um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 180 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, ou * qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, em particular por substituição, supressão ou adição de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou * qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre 13 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, pode ser utilizada para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de cancros.

Também, o invento refere-se à utilização de uma proteina caracterizada por ser constituída por um fragmento da proteina NOV, o referido fragmento sendo representado pela sequência SEQ ID NO: 12, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de cancros

Igualmente a utilização: ser de uma proteina caracterizada por compreender ou constituída por: a proteina NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, ou um fragmento desta proteína, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 80 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, ou qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido abaixo, em particular por substituição, supressão ou adição de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou uma qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido abaixo, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, 14 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ de uma sequência nucleotídica caracterizada por compreender ou ser constituída por uma sequência nucleótidica codificando: * quer a proteína NOV tal como definida acima, * quer um fragmento da proteína NOV tal como definido acima, * quer uma sequência derivada da proteína NOV tal como definida acima, * quer uma sequência homóloga da proteína NOV tal como definida acima, a referida sequência nucleótidica, correspondendo em particular à sequência nucleótidica SEQ ID NO: 1 codificando a SEQ ID NO: 2, ou à sequência SEQ ID NO: 3 codificando a SEQ ID NO: 4, ou à sequência SEQ ID NO: 5 codificando a SEQ ID NO: 6, ou à sequência SEQ ID NO: 7 codificando a SEQ ID NO: 8, ou à sequência SEQ ID NO: 9 codificando a SEQ ID NO: 10, de um anticorpo anti-idiotípico da proteína NOV, pode ser utilizada para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de patologias necessitando a inibição da proliferação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: os cancros, a degenerescência macular ligada à idade, as retinopatias diabéticas, a poliartrite reumatóide, os angiomas, os angiossarcomas, em particular a doença de Castelman e o sarcoma de Kaposi.

Do mesmo modo, uma proteína caracterizada por compreender ou ser constituída por:

* a proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, ou * um fragmento desta proteína, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 80 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10, ou * qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido abaixo, em particular por substituição, supressão ou adição 15 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou

* qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido abaixo, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, uma sequência nucleotidica caracterizada por compreender ou ser constituída por uma sequência nucleotidica codificando: * quer a proteína NOV tal como definida acima, * quer um fragmento da proteína NOV tal como definido acima, * quer uma sequência derivada da proteína NOV tal como definida acima * quer uma sequência homóloga da proteína NOV tal como definida acima, a referida sequência nucleotidica correspondendo em particular à sequência nucleotidica SEQ ID NO: 1 codificando a SEQ ID NO: 2, ou à sequência SEQ ID NO:

3 codificando a SEQ ID NO: 4, ou à sequência SEQ ID NO: 5 codificando a SEQ ID NO: 6, ou à sequência SEQ ID NO: 7 codificando a SEQ ID NO: 8, ou à sequência SEQ ID NO: 9 codificando a SEQ ID NO: 10, um anticorpo anti-idiotipico da proteína NOV, podem ser utilizados para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de patologias necessitando a inibição da activação endotelial, em particular no quadro das patologias seguintes: a rejeição de aloenxerto e de xenoenxerto, as acrocianoses, as esclerodermias, ou no quadro da preparação de enxertos entre a colheita e o transplante.

Os inventores constataram igualmente que era possível preparar uma composição farmacêutica caracterizada por conter como substância activa: uma proteína caracterizada por compreender ou ser constituída por: 16 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ * a proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, ou * um fragmento desta proteína, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 180 aminoácidos, de preferência cerca de 40 a cerca de 80 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, ou * qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido abaixo, em particular por substituição, supressão ou adição de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou

* qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido abaixo, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, uma sequência nucleotídica caracterizada por compreender ou ser constituída por uma sequência nucleotídica codificando: * quer a proteína NOV tal como definida acima, * quer um fragmento da proteína NOV tal como definido acima, * quer uma sequência derivada da proteína NOV tal como definida acima, * quer uma sequência homóloga da proteína NOV tal como definida acima, a referida sequência nucleótidica correspondendo em particular à sequência nucleótidica SEQ ID NO: 1 codificando a SEQ ID NO: 2, ou à sequência SEQ ID NO: 3 codificando a SEQ ID NO: 4, ou à sequência SEQ ID NO: 5 codificando a SEQ ID NO: 6, ou à sequência SEQ ID NO: 7 codificando a SEQ ID NO: 8, ou à sequência 17 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ SEQ ID ΝΟ: 9 codificando a SEQ ID NO: 10, ou à sequência SEQ ID NO: 11 codificando a SEQ ID NO: 12, um anticorpo anti-idiotipico da proteína NOV, em associação com um vector farmaceuticamente aceitável.

Igualmente, é possível preparar uma composição farmacêutica caracterizada por conter como substância activa uma proteína caracterizada por compreender ou ser constituída por: * um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de este fragmento apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, o referido fragmento compreendendo em particular de cerca de 40 a cerca de 180 aminoácidos, e sendo em particular representado por uma das sequências seguintes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, ou * qualquer sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, em particular por substituição, supressão ou adição de um ou vários aminoácidos, com a condição de esta sequência derivada apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, ou * qualquer sequência homóloga da sequência SEQ ID NO: 2 ou de um fragmento definido acima, possuindo de preferência uma homologia de pelo menos cerca de 80%, e em particular 85%, com a região compreendida entre os aminoácidos na posição (33) e (338) da sequência SEQ ID NO: 2, com a condição de esta sequência homóloga apresentar uma actividade de inibição da angiogénese, em associação com um vector farmaceuticamente aceitável. O invento refere-se assim a uma composição farmacêutica caracterizada por conter como substância activa: uma proteína caracterizada por ser constituída por um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, o referido fragmento sendo representado pela sequência SEQ ID NO: 12, uma sequência nucleotídica caracterizada por compreender ou ser constituída por uma sequência nucleótidica codificando: 18 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ * quer a proteína NOV tal como definida acima, * quer um fragmento da proteína NOV tal como definido acima, a referida sequência nucleotídica correspondendo à sequência nucleótidica SEQ ID NO: 1 codificando a SEQ ID NO: 2, ou à sequência SEQ ID NO: 11 codificando a SEQ ID NO: 12, um anticorpo anti-idiotípico da proteína NOV representada pela sequência SEQ ID NO: 2, o referido anticorpo mimetizando as funções da proteína NOV no reconhecimento de VEGF, em associação com um vector farmaceuticamente aceitável.

Num modo de realização vantajoso, o invento refere-se a uma composição farmacêutica definida acima, caracterizada por conter como substância activa uma proteína caracterizada por ser constituída por um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, o referido fragmento sendo representado pela sequência SEQ ID NO: 12, em associação com um vector farmaceuticamente aceitável.

Igualmente, pode ser preparada uma composição farmacêutica vantajosa que contém, como substância activa, o fragmento TSP-1 acima mencionado (SEQ ID NO: 8).

Uma composição vantajosa de acordo com o invento é caracterizada por a actividade de inibição da angiogénese ser medida de acordo com o ensaio de proliferação, de migração ou de diferenciação, e por esta actividade de inibição corresponder a uma percentagem de inibição compreendida de 20% a 100% da angiogénese obtida na presença do veículo sozinho.

Os ensaios de proliferação, de migração e de diferenciação (angiogénese in vitro) são descritos mais adiante na parte experimental. O presente invento refere-se igualmente a uma composição tal como definida acima, caracterizada por conter como substância activa a proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2. 19 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ

De acordo com um modo de realização vantajoso do presente invento, a composição tal como definida acima é caracterizada por ser susceptível de ser administrada à razão de cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg/dia. O presente invento refere-se igualmente à utilização tal como definida acima, para a preparação de uma composição tal como definida acima, destinada a ser administrada à razão de cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg/dia. É também possível preparar uma composição tal como definida acima caracterizada por ser administrada sob a forma de um gene, de uma proteína ou de um péptido contendo a sequência de tipo TSP-1 (SEQ ID NO: 8).

Uma composição vantajosa do invento é em particular administrada de preferência sob forma injectável.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 corresponde à ligação da forma iodada do VEGFies sobre a proteína NOV. A proteína NOV (4 yg/ml) é imobilizada sobre plástico de acordo com as condições descritas na parte experimental, e depois incubada com VEGFi65 iodado (1 ng/poço) na ausência (coluna PBS) ou presença de 2 pg/ml de VEGF165 (coluna 0) ou de NOV (coluna NOV). Os resultados estão expressos em cpm de VEGF165 iodado fixado por poço, após lavagem. A Figura 2 corresponde à ligação da forma iodada do VEGFigg sobre a proteína NOV. A proteína NOV (4 yg/ml) é imobilizada sobre plástico de acordo com as condições descritas na parte experimental, e depois incubada com VEGFisg iodado (1 ng/poço) na ausência (coluna PBS) ou presença de 2 pg/ml de VEGF189 (coluna 0) ou de NOV (coluna NOV). Os resultados estão expressos em cpm de VEGF189 iodado fixado por poço, após lavagem. A Figura 3 corresponde ao ensaio de migração de células. As células são contadas em 8 campos e a média é representada 20 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ no eixo das ordenadas. Ο eixo das abcissas corresponde à concentração da proteína NOV em pg/ml. Os pontos representados por losangos correspondem às células não incubadas com VEGF e os pontos representados pelos quadrados correspondem às células previamente tratadas com VEGF. A Figura 4 corresponde ao ensaio de proliferação de células. O eixo das abcissas corresponde à concentração da proteína NOV em yg/ml e o eixo das ordenadas à densidade óptica medida a 595 nm. Os pontos representados por losangos correspondem às células que não foram estimuladas pelo VEGF e os pontos representados pelos quadrados correspondem às células que foram estimuladas pelo VEGF. A Figura 5 corresponde ao ensaio de adesão de células FBAE. O eixo das abcissas corresponde à concentração da proteína NOV em yg/ml e o eixo das ordenadas à densidade óptica medida a 595 nm. Os pontos representados por losangos correspondem às células não incubadas com VEGF e os pontos representados pelos quadrados correspondem às células previamente tratadas com VEGF.

As Figuras 6A e 6B representam o efeito de NOV e de seus fragmentos sobre a migração de células HUAEC estimuladas com VEGF165. A Figura 6A corresponde aos ensaios de controlo com células não estimuladas com VEGFi6s e a Figura 6B corresponde aos ensaios com células estimuladas com VEGFi6s. As colunas representam o número de células/campos. As colunas a branco correspondem às células de controlo (sem adicionar NOV ou um dos seus fragmentos); as colunas a preto correspondem às células estimuladas na presença de NOV; as colunas riscadas verticalmente correspondem às células estimuladas na presença do fragmento N-terminal de NOV (aminoácidos 1 a 187 de NOV) e as colunas riscadas horizontalmente correspondem às células estimuladas na presença do fragmento C-terminal de NOV. A Figura 7A representa o efeito da proteína NOV ou de um seu fragmento C-terminal na proliferação de HUAEC (células endoteliais arteriais umbilicais humanas) estimuladas com VEGF165. O eixo das abcissas corresponde à concentração da proteína NOV ou do fragmento C-terminal (SEQ ID NO 12) em yg/ml e o eixo das ordenadas à densidade óptica medida a 595 21 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ nm. A curva em traço a cheio com os quadrados brancos corresponde à proteína NOV e a curva em traço ponteado com os quadrados a negro corresponde ao fragmento SEQ ID NO: 12. A Figura 7B representa o efeito da proteína NOV ou de um seu fragmento C-terminal na proliferação de HUAEC estimuladas com bFGF. 0 eixo das abcissas corresponde à concentração da proteína NOV ou do fragmento C-terminal (SEQ ID NO: 12) em yg/ml e o eixo das ordenadas à densidade óptica medida a 595 nm. A curva em traço a cheio com os quadrados brancos corresponde à proteína NOV e a curva em traço ponteado com os quadrados a negro corresponde ao fragmento SEQ ID NO: 12.

As Figuras 8A et 8B representam o efeito do fragmento C-terminal da proteína NOV (SEQ ID NO: 12) sobre a angiogénese corneana. A Figura 8A corresponde à injecção de LPS sozinho e a Figura 8B à injecção de LPS e do referido fragmento C-terminal.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais: A molécula NOV é produzida por infecção de células de insecto SF9 por um baculovírus recombinante contendo o ADNc correspondente (SEQ ID NO: 1) (Thibout et ai., 2003).

As isoformas de 165 de 189 aminoácidos do VEGF são produzidas por infecção de células de insecto SF9 por um baculovírus recombinante contendo o ADNc correspondente (Plouét et ai., 1997).

As células endoteliais arteriais umbilicais humanas (HUAEC) foram isoladas a partir de artérias umbilicais perfundidas com colagénio (Sigma) para digerir a membrana basal. As células HUAEC foram mantidas em SFM (Life Sciences) adicionado com 20% de soro de vitelo fetal (SVF) inactivado por calor. As culturas das estirpes receberam 1 ng/ml de VEGF por dia.

As células endoteliais de aorta fetal bovina (FBAE) foram isoladas à partir de aortas fetais obtidas de um 22 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ matadouro local. As células foram mantidas em DMEM glutamax (Life Sciences) adicionado com 10% de soro de vitelo recém-nascido (NBCS) inactivado por calor, 100 yg/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina à 37°C em 10% de CO2 e 1 ng/ml de VEGF de 2 em 2 dias.

Interacção directa entre VEGF e NOV

Para a ligação à proteina NOV imobilizada, placas ELISA de 96 poços foram cobertos com 4 yg/ml de proteina NOV num tampão carbonato 0,05 M a pH 9,6 durante a noite a 4°C. Os locais de ligação não específicos foram bloqueados com 5 mg/ml de BSA num tampão carbonato. Após se terem lavado os poços duas vezes com PBS a pH 7,4, adicionou-se 1 ng de VEGF iodado a cada poço na presença ou não de 2 yg/ml de VEGFi65 ou de NOV, diluídos em PBS contendo 0,05% de Tween 20, 0,5% de BSA, 1 mM de MgCl2 e 1 mM de CaCl2.

Os poços foram lavados 3 vezes com uma mistura PBS-Tween 20 0,1%-BSA 0,5% e as proteínas ligadas foram solubilizadas em NaOH 0,2 M.

Os resultados destas experiências estão representados nas Figuras 1 e 2. A Figura 1 mostra que o VEGF165 iodado se associa especificamente à NOV visto que a adição de VEGF não radiomarcado (VEGF) inibe esta ligação. Do mesmo modo, a adição de NOV inibe a ligação de VEGFi65 radiomarcado a NOV.

Ensaios de migração

Células FBAE são inoculadas em poços de 4 cm2 com uma elevada densidade (50 000 células/poço). Quando a monocamada está confluente, a proliferação é parada pela incubação, durante uma noite, na presença de DMEM sem soro. Uma ferida é então efectuada na monocamada com a ajuda de uma espátula de espuma, permitindo delimitar uma superfície livre de qualquer célula. As monocamadas são de seguida lavadas 3 vezes com DMEM para remover as células não aderentes. É então tirada uma fotografia para delimitar a superfície antes de qualquer migração celular. Os poços são em seguida incubados em DMEM 23 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ sozinho ou na presença de 50 ng/ml de VEGF na presença de concentrações variáveis de NOV. Após 24 h os poços são lavados 3 vezes e corados com May-Grunwald-Giemsa e fotografados. As fotografias tiradas antes e depois da experiência são então sobrepostas para permitir a contagem das células que migraram.

Os resultados destes ensaios estão indicados na Figura 3. A adição de NOV na ausência de VEGF não teve efeito sobre a migração basal de células. Por outro lado, a NOV inibe a actividade do VEGF e 50% do efeito máximo são obtidos com uma concentração de 50-100 ng/ml de NOV.

Ensaios de proliferação

Placas de cultura de 96 poços foram semeadas com 1000 células FBAE por poço em DMEM adicionado com 5% de NBCS. As células foram estimuladas ou não com 2 ng/ml de VEGFi6s e diferentes concentrações de NOV. Ao fim de 5 dias, os poços foram enxaguados cuidadosamente com DMEM e as células foram fixadas em 1% de glutaraldeído durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células fixadas foram quantificadas por incorporação de violeta de cristal (Kueng et al., 1989): as células foram incubadas em 0,1% de violeta de cristal (Sigma) diluido em tampão borato 0,2 M a pH 9,5 durante 20 minutos à temperatura ambiente, o corante não incorporado foi eliminado lavando completamente os poços com grandes quantidades de água e o corante violeta de cristal incorporado foi em seguida solubilizado por 100 μΐ de ácido acético a 10% por poço. As leituras de densidade óptica foram efectuadas a 595 nm. Foram obtidos resultados similares em três experiências separadas (ver Figura 4). Os valores indicados são as densidades ópticas médias de 6 poços ± SD. A proteína NOV utilizada sozinha não teve efeito significativo sobre a proliferação basal (devido ao soro sozinho). Por outro lado, a proteína NOV inibe a proliferação induzida por VEGF de um modo dependente da dose. 50% do efeito máximo são obtidos com uma concentração de 100-200 ng/ml de NOV. 24 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ

Ensaios de adesão celular

Placas ELISA de 96 poços (Nunc) foram cobertas de proteína VEGF165 de acordo com o protocolo descrito no artigo de Hutchings et al. (2003), diluída num tampão carbonato 0,05 M a pH 9,6 durante a noite a 4°C. Os locais de ligação não específicos foram bloqueados durante 1 hora à 37°C com 5 mg/ml de BSA num tampão carbonato e lavados duas vezes com DMEM antes das experiências. As células foram tripsinizadas, lavadas e recolocadas em suspensão em 5 ml de DMEM com 10% de SVF num tubo de plástico não tratado e incubadas durante 1 hora a 37 °C com 10% de C02. As células foram de seguida concentradas por centrifugação e colocadas de novo em suspensão numa mistura de DMEM + 0,2% de BSA sem soro e a suspensão celular foi tratada durante 20 minutos (37°C, 10% de C02) com a proteína NOV utilizada para modular a adesão. Foram distribuídas 40 000 células por poço nos poços num volume de 100 μΐ de DMEM + 0,2% de BSA. As células foram deixadas aderir a 37 °C sob 10% de C02 durante o tempo desejado. Os poços foram lavados cuidadosamente três vezes com DMEM para retirar as células não aderentes e as células aderentes foram fixadas com 1% de glutaraldeído durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células fixadas foram quantificadas por incorporação de violeta de cristal (Kueng et al., 1989): as células foram incubadas com 0,1% de violeta de cristal (Sigma) diluído em tampão borato 0,2 M a pH 9,5 durante 20 minutos à temperatura ambiente, o corante não incorporado foi eliminado lavando completamente os poços com grandes quantidades de água e o corante violeta de cristal incorporado foi em seguida solubilizado por 100 μΐ de ácido acético a 10% por poço (ver Figura 5).

Angiogénese in vitro

Quatro caudas de rato foram esfoladas e dissecadas para recuperar os feixes brancos que são constituídos maioritariamente por colagénio de tipo I. O colagénio é extraído destas fibras em 50 ml de ácido acético 0,5 M frio e agitado durante a noite. O líquido é em seguida centrifugado à 5000 g durante 40 minutos e o sobrenadante é recuperado. A extracção é repetida uma vez com 20 ml de ácido acético, os 25 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ sobrenadantes são misturados e depois dialisados contra 1 litro de ácido acético 0,2 Μ. A concentração em colagénio é ajustada a 3 mg/ml por pesagem. A preparação de geles para a angiogénese in vitro é efectuada sobre gelo para conservar a solução de colagénio sob forma liquida. Mistura-se 1 ml de colagénio (5 mg/ml) com 0,5 ml de DMEM 10X (contendo uma concentração 10X em antibióticos e em glutamina) , 0,9 ml de H2O estéril e 0,1 ml de bicarbonato de sódio 1 M. Uma vez o pH ajustado a 7,4, é adicionado um volume igual de matrigel (Becton Dickinson). O gel é vertido nos poços de cultura (2 mm de espessura) e incubado a 37°C para solidificar. As células são adicionadas após 15 minutos (100 000 células/cm2) sobre a superfície do gel. Após 2 horas, são adicionados os diferentes factores solúveis e as células são observadas e fotografadas após 24 horas.

Produção de anticorpos anti-idiotipicos

Em primeiro lugar prepara-se um anticorpo neutralizante de NOV injectando num animal, em particular um ratinho, proteína NOV misturada com adjuvante completo de Freund (1 volume por volume de proteína NOV) . Selecciona-se uma quantidade de NOV compreendida entre 1 e 200 yg/kg de peso corporal para imunizar o animal. A mesma operação é efectuada com 15 e 30 dias de intervalo, excepto que o adjuvante completo é substituído pelo adjuvante incompleto. Ao dia 40 é realizada uma sangria, o soro é separado e as imunoglobulinas são purificadas por qualquer método de fraccionamento habitual, em particular precipitação por sulfato de amónio, cromatografia de afinidade por proteína A ou G. Mede-se a actividade neutralizante das imunoglobulinas por qualquer teste descrito (ligação de VEGF iodado, proliferação, migração, adesão celular). Um lote de imunoglobulinas será referido como neutralizante quando tiver a capacidade de inibir a interacção de NOV com VEGF.

Em segundo lugar preparam-se anticorpos anti-idiotipicos de NOV injectando em ratinhos pela via subcutânea 1-100 yg da preparação de imunoglobulinas neutralizantes da actividade de NOV descritas anteriormente em associação com 100 yl de adjuvante, em particular adjuvante completo de Freund (Sigma) . A injecção é repetida 15, 30 e 45 dias depois. 26 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ

Cinquenta e cinco dias após a primeira injecção, injectam-se nos ratinhos 10 yg do mesmo anticorpo por via intraperitoneal. Cinquenta e oito dias após a primeira injecção, os ratinhos são sacrificados e os seus baços são removidos e dilacerados em meio ISCOVE para libertar os esplenócitos. Os esplenócitos são fundidos com células de mieloma de ratinho, em particular células AG8X 63 (Keamey et al., 1979), e incubados a uma taxa de 100 000 células/poço. A fusão é efectuada por adição de 20 vezes 50 μΐ de polietilenoglicol (PEG) com 30 segundos de intervalo. São então adicionados 4 ml de meio ISCOVE pré-aquecido a 37 °C gota a gota sobre a suspensão celular, e depois, após um período de incubação de 4 minutos à 37°C, são adicionados 4 ml. A suspensão é centrifugada e depois o sedimento celular é então retomado em 100 ml de meio ISCOVE complementado com 20% de soro de vitelo fetal e HAT IX (50X: hipoxantina 5 mM, aminopterina 20 μΜ e timidina 0,8 mM) e distribuído à razão de 100 μΐ por poço sobre os macrófagos. Após 5 dias, são adicionados 100 μΐ de meio HAT e, entre 8 e 14 dias, o meio condicionado de cada hibridoma é recolhido para medir por ELISA os anticorpos dirigidos contra os anticorpos que serviram de agente imunogénico, isto é os anticorpos anti-NOV. Mede-se então a actividade dos anticorpos anti- idiotípicos por um ensaio ELISA:

Os fragmentos Fab de imunoglobulinas anti-NOV, preparados por qualquer técnica convencional, em particular uma digestão com papaína, são imobilizados sobre placas de microtitulação (0,1-20 yg/ml num tampão carbonato 50 mM pH 9,6). Após saturação dos locais não específicos por uma solução de albumina de soro diluída a 5 mg/ml no mesmo tampão, os sobrenadantes de culturas de hibridomas são adicionados diluídos a metade em tampão PBS contendo 0,05% de Tween 20. Após enxaguamento, os anticorpos anti-idiotípicos são revelados por adição de uma concentração apropriada de anticorpos anti-Fc de ratinho acoplados a peroxidase. A quantidade de anticorpos anti-idiotípicos fixada é então medida por revelação da peroxidase e é proporcional à intensidade da reacção colorimétrica.

Os hibridomas seleccionados pela sua capacidade de segregar anticorpos dirigidos contra os anticorpos anti-NOV 27 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ são então clonados, isto é as células são semeadas em condição de diluição limite (5 células/ml) sob um volume de 0,1 ml por poço. O meio é mudado após 10 dias. Após 15 dias, certos poços contêm foci de células que se multiplicam a partir da célula semeada de partida, pelo que todas estas células são idênticas e originárias do mesmo clone. Quando a superfície ocupada pelas células representa pelo menos metade da superfície total do poço, o meio é removido e analisado como anteriormente por um ELISA sobre Fab anti-NOV. Neste estádio podem-se seleccionar os clones produtores de anticorpos e conhecer a sua especificidade.

Uma vez os clones identificados, a sua natureza monoclonal é afirmada pela operação clássica consistindo em semear uma placa de 96 poços com células originárias do mesmo clone diluídas em condições limite como anteriormente. Os clones secretores têm pois de segregar todos anticorpos da mesma especificidade para que se declare este anticorpo monoclonal. É então efectuada uma terceira clonagem exactamente nas mesmas condições para assegurar que os clones são mesmo monoclonais.

Os anticorpos anti-idiotípicos são rastreados por uma bateria de ensaios, em particular por um ensaio ELISA sobre VEGF imobilizado. O VEGF é imobilizado (0,1-10 pg/ml) num tampão carbonato como anteriormente e todas as etapas deste ELISA são idênticas às descritas no ELISA sobre Fab anti-NOV. Este ensaio permite rastrear entre todos os anticorpos anti-idiotípicos aqueles que mimetizam as funções da proteína NOV (SEQ ID NO: 2) ou dos fragmentos do tipo TSP-1 (SEQ ID NO: 8), isto é anticorpos reconhecendo VEGF.

CONSTRUÇÃO DE MUTANTES DE NOV

Mutantes de deleção da proteína NOV foram construídos de acordo com a referência (Perbal et al., 1999) e produzidos num sistema de expressão de baculovírus: • N-Ter (corresponde a uma sequência compreendendo os aminoácidos 1-187 de NOV) e • C-Ter contendo os aminoácidos 188 à 357 (esta sequência contém o domínio de tipo trombospondina (SEQ ID NO: 8) e o domínio C-terminal rico em cisteínas (SEQ ID NO: 10). 28 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ

Ensaios de migração (Figura 6) Células HUAEC são inoculadas em poços de 4 cm2 com uma elevada densidade (50 000 células/poço). Quando a monocamada está confluente, a proliferação é parada pela incubação, durante uma noite, na presença de SFM com 1% de NBCS. Uma ferida é então efectuada na monocamada com a ajuda de uma espátula de espuma, permitindo delimitar uma superficie livre de qualquer célula. As monocamadas são de seguida lavadas 3 vezes com SFM para remover as células não aderentes. É então tirada uma fotografia para delimitar a superficie antes de qualquer migração celular. Os poços são em seguida incubados em SFM sozinho ou na presença de 50 ng/ml de VEGF na presença de concentrações variáveis de NOV ou dos seus fragmentos N-Ter ou C-Ter. Após 24 h os poços são lavados 3 vezes e corados com May-Grunwald-Giemsa e fotografados. As fotografias tiradas antes e depois da experiência são então sobrepostas para permitir a contagem das células que migraram.

Os resultados destes ensaios estão indicados na Figura 6. A adição de NOV ou do fragmento N-Ter na ausência de VEGF não teve efeito sobre a migração basal de células. A NOV inibe a actividade do VEGF e 50% do efeito máximo são obtidos com uma concentração de 50-100 ng/ml de NOV. O fragmento N-Ter não exerce actividade inibidora. Por outro lado, o fragmento C-Ter inibe a migração de células HUAEC.

Estas experiências demonstram que a sequência de NOV compreendendo os aminoácidos 188 a 357 é de facto responsável pela actividade de inibição da angiogénese devida a VEGF e que induz uma actividade inibidora da migração, incluindo na ausência de VEGF.

Ensaios de proliferação (Figura 7)

Placas de cultura de 96 poços foram semeadas com 2000 células HUAEC por poço em SFM com 10% de NBCS adicionados. As células foram estimuladas ou não com 2 ng/ml de VEGF165 e 29 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ diferentes concentrações de NOV ou do fragmento C-Ter. Ao fim de 5 dias, os poços foram enxaguados cuidadosamente com meio SFM e as células foram fixadas em 1% de glutaraldeido durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células fixadas foram quantificadas por incorporação de violeta de cristal: as células foram incubadas em 0,1% de violeta de cristal (Sigma) diluido em tampão borato 0,2 M a pH 9,5 durante 20 minutos à temperatura ambiente, o corante não incorporado foi eliminado lavando completamente os poços com grandes quantidades de água e o corante violeta de cristal incorporado foi em seguida solubilizado por 100 μΐ de ácido acético a 10% por poço. As leituras de densidade óptica foram efectuadas a 595 nm. Foram obtidos resultados similares em três experiências separadas (ver Figura 7). Os valores indicados são as densidades ópticas médias de 6 poços ± SD. A proteina NOV inibe a proliferação induzida por VEGF e por FGF de um modo dependente da dose. 50% do efeito máximo são obtidos com uma concentração inibidora de 50% de 200 ng/ml de NOV face a VEGF e FGF. Do mesmo modo o fragmento C-Ter inibe a proliferação induzida por VEGF ou por FGF com uma concentração de 200 ng/ml.

Estas experiências demonstram que a sequência de NOV compreendendo os aminoácidos 188 à 357 é de facto responsável pela actividade de inibição da angiogénese. A observação segundo a qual a actividade mitogénica de FGF é também inibida pelo fragmento NOV 188-357 demostra que a actividade inibidora não está limitada ao único factor VEGF.

Angiogénese da córnea

Ratos Wistar são anestesiados. São feitas incisões nas córneas e é obtido um bolso corneano dilacerando a espessura do estroma com o auxilio de uma espátula de espuma. No fundo do bolso é inserido um implante Elvax (DuPont) contendo lipopolissacárido, um agente inflamatório desencadeando uma reacção angiogénica dependente de vários factores angiogénicos. Após 8 dias é visivel uma reacção angiogénica em relação ao limbo. Quando o fragmento C-Ter é injectado no bolso corneano (5 yg a cada 2 dias entre D4 e D8), a reacção angiogénica é totalmente inibida (Figura 8). 30 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ

Estas experiências demonstram que o fragmento C-Ter de NOV exerce uma actividade antiangiogénica importante dependente da activação de vários factores angiogénicos.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> "NOVO AGENTE ANTIANGIOGÉNICO E SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE CANCROS"

<130> WOB 03 AW CNR GIOG <150> FR 03/09506 <151> 2004-08-01 33 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ <160> 12 <17 0> Patentln version <210> 1 <211> 2389 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> <223> (73) . .(1143) <400> 1 60 gggaaggcga gcagtgccaa tctacagcga agaaagtctc gtttggtaaa agcgagaggg gaaagcctga gc atg cag agt gtg cag age acg age ttt tgt etc cga aag 111

Met Gin Ser Vai Gin Ser Thr Ser Phe Cys Leu Arg Lys 15 10 cag tgc ctt tgc ctg acc ttc ctg ctt etc cat etc ctg gga cag gtc 159 Gin Cys Leu Cys Leu Thr Phe Leu Leu Leu His Leu Leu Gly Gin Vai 15 20 25 gct gcg act cag ege tgc cct CCC cag tgc ccg ggc cgg tgc cct gcg 207 Ala Ala Thr Gin Arg Cys Pro Pro Gin Cys Pro Gly Arg Cys Pro Ala 30 35 40 45 acg ccg ccg acc tgc gee CCC 990 gtg ege gcg gtg ctg gac ggc tgc 255 Thr Pro Pro Thr Cys Ala Pro Gly Vai Arg Ala Vai Leu Asp Gly Cys 50 55 60 tea tgc tgt ctg gtg tgt gee ege cag cgt ggc gag age tgc tea gat 303 Ser Cys Cys Leu Vai Cys Ala Arg Gin Arg Gly Glu Ser Cys Ser Asp 65 70 75 ctg gag cca tgc gac gag age agt ggc etc tac tgt gat ege age gcg 351 Leu Glu Pro Cys Asp Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Cys Asp Arg Ser Ala B0 85 90 gac CCC age aac cag act ggc ate tgc acg gcg gta gag gga gat aac 399 Asp Pro Ser Asn Gin Thr Gly Ile Cys Thr Ala Vai Glu Gly Asp Asn 95 100 105 tgt gtg ttc gat ggg gtc ate tac ege agt gga gag aaa ttt cag cca 447 Cys Vai Phe Asp Gly Vai Ile Tyr Arg Ser Gly Glu Lys Phe Gin Pro 110 115 120 125 34 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ age tgc aaa ttc cag tgc acc tgc aça gat ggg cag att ggc tgt gtg 4 95 Ser Cys Lys Phe Gin Cys Thr Cys Arg Asp Gly Gin Ile Gly Cys Val 130 135 140 ccc ege tgt cag ctg gat gtg cta ctg cct gag cct aac tgc cca gct 543 Pro Arg Cys Gin Leu Asp Val Leu Leu Pro Glu Pro Asn Cys Pro Ala 145 150 155 cca aga aaa gtt gag gtg cct gga gag tgc tgt gaa aag tgg ate tgt 591 Pro Arg Lys Val Glu Val Pro Gly Glu Cys Cys Glu Lys Trp ile Cys 160 165 170 ggc cca gat gag gag gat tea ctg gga ggc ctt acc ctt gea gct tac 639 Gly Pro Asp Glu Glu Asp Ser Leu Gly Gly Leu Thr Leu Ala Ala Tyr 175 180 185 agg cca gaa gee acc cta gga gta gaa gtc tet gac tea agt gtc aac 687 Arg Pro Glu Ala Thr Leu Gly Val Glu Val Ser Asp Ser Ser Val Asn 190 195 200 205 tgc att gaa cag acc aca gag tgg aca gea tgc tcc aag age tgt ggt 735 Cys Ile Glu Gin Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly 210 215 220 atg ggg ttc tcc acc cgg gtc acc aat agg aac cgt caa tgt gag atg 783 Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gin Cys Glu Met 225 230 235 ctg aaa cag act cgg etc tgc atg gtg cgg CCC tgt gaa caa gag cca 831 Leu Lys Gin Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Gin Glu Pro 240 245 250 gag cag cca aca gat aag aaa gga aaa aag tgt etc ege acc aag aag 879 Glu Gin Pro Thr Asp Lys Lys Gly Lys Lys Cys Leu Arg Thr Lys Lys 255 260 265 tea etc aaa gee ate cac ctg cag ttc aag aac tgc acc age ctg cac 927 Ser Leu Lys Ala Ile His Leu Gin Phe Lys Asn Cys Thr Ser Leu His 270 275 280 285 acc tac aag ccc agg ttc tgt ggg gtc tgc agt gat ggc ege tgc tgc 975 Thr Tyr Lys Pro Arg Phe Cys Gly Val Cys Ser Asp Gly Arg Cys Cys 290 295 300 a et ccc cac aat acc aaa acc ate cag gea gag ttt cag tgc tcc cca 1023 Thr Pro His Asn Thr Lys Thr ile Gin Ala Glu Phe Gin Cys Ser Pro 305 310 315 ggg caa ata gtc aag aag cca gtg atg gtc att ggg acc tgc acc tgt 1071 Gly Gin Ue Val Lys Lys Pro val Met Val Ile Gly Thr Cys Thr Cys 320 325 330 cac acc aac tgt cct aag aac aat gag gee ttc etc cag gag ctg gag 1119 His Thr Asn Cys Pro Lys Asn Asn Glu Ala Phe Leu Gin Glu Leu Glu 335 340 34 5 ctg aag act acc aga ggg aaa atg taacctatca ctcaagaagc acacctacag 1173 Leu Lys Thr Thr Arg Gly Lys Met 350 355 35 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ agcacctgta gctgctgcgc cacccaccat cacgatttca tccttgaatc ctatgtattt atctgtcttt tatttaacaa aaaatgtaat aggatatggc ttaggaatga cttactttcc aaatttaaga aaacaagtat ataatttact attttgttgt gcactagtgc aattccaaga agaatcatac ttaacatttc attgtacaag aagattctct attggctccc tttttgggta caaggaaaca tgcágctctt caacatgaca ttttacacta ggaaacgtgt tgtatctaca tcataaactt tctccattta agacacattg aaaactccca atacaaagat gactggtccc gctgctgagg cccccaagtt ttttaattaa catctaactg atgagtaaac tgaggcccaa tcaaatgcgc attttgtgga attttgagaa gagagaccac acattttatg agagtttgga tgggccataa ttatgaaaac tcatgatcaa ttgtcaggct acaaggtagg ctgcaaaatt cgtgttccgc ttctctcttt taaagtattt tattatgttt gatttctcta cttgtcatat aaaaaaaaaa aaaaaa caaaggaata taagaaaagt aatgaagaat 1233 tcctaatgtg atcatatgag gacctttcat 1293 taactgtaaa cttggaatca aggtaagctc 1353 tgtggtttta ttacaaatgc aaatttctat 1413 ttgtagactg tttcacattg cactcatcat 1473 aaatatcact gtaatgagtc agtgaagtct 1533 tattacaacc atatattgag gttcattggg 1593 aaccagctct gaacttccaa gctccaaatc 1653 tccagagatg actattactt ttctgtttag 1713 gtaatgaaat gtttactaag tggactggtg 1773 actcctttcc aatagaaaga aactaaacag 1833 tcatagccct cagacattta tatattggaa 1893 gcagaaacag catattagca gggattctct 1953 agcacttgct tacatcctct gatagctgtt 2013 aaatagagca aaatcaacat gactggtggt 2073 attattgtag acatgcccaa aacttatcct 2133 gatatatgtg tatacataca tgtatctggt 2193 aaatctagac attcttttaa tgccaccaca 2253 ataaaaatat aaattgtaca ttttgtaaaa 2313 cactaaataa acacgatttt attgctgaaa 2373 2389

<210> 2 <211> 357 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Gin Ser Vai Gin Ser Thr Ser Phe Cys Leu Arg Lys Gin Cys Leu 1 5 10 15 Cys Leu Thr Phe Leu Leu Leu His Leu Leu Gly Gin Vai Ala Ala Thr 20 25 30 Gin Arg Cys Pro Pro Gin Cys Pro Gly Arg Cys Pro Ala Thr Pro Pro 35 40 45 Thr Cys Ala Pro Gly Vai Arg Ala Vai Leu Asp Gly Cys Ser Cys Cys 50 55 60 Leu Vai Cys Ala Arg Gin Arg Gly Glu Ser Cys Ser Asp Leu Glu Pro 65 70 75 80 Cys Asp Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Cys Asp Arg ser Ala Asp Pro Ser 85 90 95 Asn Gin Thr Gly Ile Cys Thr Ala Vai Glu Gly Asp Asn Cys Vai Phe 100 105 110 Asp Gly Vai Ile Tyr Arg Ser Gly Glu Lys Phe Gin Pro Ser Cys Lys 115 120 125 Phe Gin Cys Thr Cys Arg Asp Gly Gin Ile Gly Cys Vai Pro Arg Cys 130 135 140 Gin Leu Asp Vai Leu Leu Pro Glu Pro Asn Cys Pro Ala Pro Arg Lys 145 150 155 160 Vai Glu Vai Pro Gly Glu Cys Cys Glu Lys Trp Ile Cys Gly Pro Asp 165 17Q 175 36 36 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ

Glu Glu Asp Ser Leu Gly Gly Leu Thr Leu Ala Ala Tyr Arg Pro Glu 180 185 190

Ala Thr Leu Gly Vai Glu Vai Ser Asp Ser Ser Vai Asn Cys Ile Glu 195 200 20S

Gin Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly Met Gly Phe 210 215 220

Ser Thr Arg Vai Thr Asn Arg Asn Arg Gin Cys Glu Met Leu Lys Gin 225 230 235 240

Thr Arg Leu Cys Met Vai Arg Pro Cys Glu Gin Glu Pro Glu Gin Pro 245 250 255

Thr Asp Lys Lys Gly Lys Lys Cys Leu Arg Thr Lys Lys Ser Leu Lys 260 265 270

Ala Ile His Leu Gin Phe Lys Asn Cys Thr Ser Leu His Thr Tyr Lys 275 280 285

Pro Arg Phe Cys Gly Vai Cys Ser Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His 290 295 300

Asn Thr Lys Thr Ile Gin Ala Glu Phe Gin Cys Ser Pro Gly Gin Ile 305 310 315 320

Vai Lys Lys Pro Vai Met Vai Ile Gly Thr Cys Thr Cys His Thr Asn 325 330 335

Cys Pro Lys Asn Asn Glu Ala Phe Leu Gin Glu Leu Glu Leu Lys Thr 340 345 350

Thr Arg Gly Lys Met 355 <210> 3 <211> 216 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento da proteina NOV <220> <221> CDS <222> <223> (D . . (216) <400> 3 cag cgc tgc cct ccc cag tgc ccg ggc cgg tgc cct gcg acg ccg ccg 48

Gin Arg Cys Pro Pro Gin Cys Pro Gly Arg Cys Pro Ala Thr Pro Pro 15 10 15 aec tgc gce ccc ggg gtg cgc gcg gtg ctg gac ggc tgc tca tgc tgt

Thr Cys Ala Pro Gly Vai Arg Ala Vai Leu Asp Gly Cys Ser Cys Cys 20 25 30 96 37 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ ctg gtg tgt gcc ege cag cgt ggc gag age tgc tea gat etg gag cca 144 Leu Vai Cys Ala Arg Gin Arg Gly Glu Ser Cys Ser Asp Leu Glu Pro 35 40 45 tgc gac gag age agt ggc etc tac tgt gat ege age gcg gac ccc age 192 Cys Asp Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Cys Asp Arg Ser Ala Asp Pro Ser 50 55 60 aac caç act ggc ate tgc a cg gcg 216 Asn Gin Thr Gly ILe Cys Thr Ala 65 70

<210> 4 <211> 72 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento da proteina NOV <400> 4

Gin Arg Cys Pro Pro Gin Cys Pro Gly Arg Cys Pro Ala Thr Pro Pro 1 5 10 15 Thr Cys Ala Pro Gly Vai Arg Ala Vai Leu Asp Gly Cys Ser Cys Cys 20 25 30 Leu Vai Cys Ala Arg Gin Arg Gly Glu Ser Cys Ser Asp Leu Glu Pro 35 40 45 Cys Asp Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Cys Asp Arg Ser Ala Asp Pro Ser 50 55 60 Asn Gin Thr Gly Ile Cys Thr Ala 65 70 <210> 5 <211> 201 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento da proteina NOV <22 0> <221> CDS <222> <223> (D · · (201) <400> 5 38 38 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ gat aa c tgt gtg ttc gat ggg gtc ate tac ege agt gga gag aaa ttt 48 Asp Asn Cys vai Phe Asp Gly Vai Ile Tyr Arg Ser Gly Glu Lys Phe 1 5 10 15 cag cca age tgc aaa ttc cag tgc acc tgc aga gat ggg cag att ggc 96 Gin Pro Ser Cys Lys Phe Gin Cys Thr Cys Arg Asp Gly Gin Ile Gly 20 25 30 tgt gtg ccc ege tgt cag ctg gat gtg cta ctg cct gag cct aac tgc 144 Cys Vai Pro Arg Cys Gin Leu Asp VaL Leu Leu Pro Glu Pro Asn Cys 35 40 45 cca gct cca aga aaa gtt gag gtg cct gga gag tgc tgt gaa aag tgg 192 Pro Ala Pro Arg Lys Vai Glu Vai Pro Gly Glu Cys Cys Glu Lys Trp 50 55 60 ate tgt ggc 201

Ilç Cys Gly 65

<210> 6 <211> 67 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> fragmento da proteina NOV <400> 6

Asp Asn Cys Vai Phe Asp Gly Vai Ile Tyr Arg Eer Gly Glu Lys Phe 1 5 10 15 Gin Pro Ser Cys Lys Phe Gin Cys Thr Cys Arg Asp Gly Gin Ile Gly 20 25 30 Cys Vai Pro Arg Cys Gin Leu Asp Vai Leu Leu Pro Glu Pro Asn Cys 35 40 45 Pro Ala Pro Arg Lys Vai Glu Vai Pro Gly Glu Cys Cys Glu Lys Trp 50 55 60

Ile Cys Gly 65

<210> 7 <211> 135 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> fragmento da proteina NOV <22 0>

<221> CDS 39 39 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ <222> (1)..(135) <223> <4Ο0> 7 tgc att gaa cag acc a ca gag tgg aca gca tgc tcc âag age tgt ggt 4 8 Cys Ile Glu Gin Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly 1 5 10 15 atg ggg ttc tcc acc cgg gtc acc aat agg aac cgt caa tgt gag atg 96 Met Gly Phe Ser Thr Arg Vai Thr Asn Arg Asn Arg Gin Cys Glu Met 20 25 30 ctg aaa cag act cgg ctc tgc atg gtg cgg ccc tgt gaa 135

Leu Lys Gin Thr Arg Leu Cys Met Vai Arg Pro Cys Glu 35 40 45

<210> 8 <211> 45 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> fragmento da proteina NOV <400> 8

Cys Ile Glu Gin Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly 1 5 10 15 Met Gly Phe Ser Thr Arg Vai Thr Asn Arg Asn Arg Gin Cys Glu Met 20 25 30 Leu Lys Gin Thr Arg Leu Cys Met Vai Arg Pro Cys Glu 35 40 45

<210> 9 <211> 225 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> fragmento da proteina NOV <22 0>

<221> CDS <222> (1)..(225) <223> <400> 9 40 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ tgt etc ege acc aag aag tea etc aaa gee ate cac ctg cag ttc aag 48 Cys Leu Arg Thr Lys Lys Ser Leu Lys Ala Ile His Leu Gin Phe Lys 1 5 10 15 aac tgc acc age ctg cac acc tac aag ccc agg ttc tgt ggg gtc tgc 96 Asn Cys Thr Ser Leu His Thr Tyr Lys Pro Arg Phe Cys Gly Val Cys 20 25 30 agt gat ggc ege tgc tgc act ccc cac aat acc aaa acc ate cag gea 144 Ser Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pxo His Asn Thr Lys Thr Ile Gin Ala 35 40 45 gag ttt cag tgc tcc cca ggg caa ata gtc aag aag cca gtg atg gtc 192 Glu Phe Gin Cys Ser Pre Gly Gin Ile val- Lys Lys Pro Val Met Val 50 55 60 att ggg acc tgc acc tgt cac acc aac tgt cct 225 Ile Gly Thr Cys Thr Cys His Thr Asn Cys Pro 65 TO 75

<210> 10 <211> 75 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento da proteína NOV <4 0 0> 10

Cys Leu Árg Thr Lys Lys Ser Leu Lys Ala Ile His Leu Gin Phe Lys 1 5 10 15 Asn Cys Thr Ser Leu His Thr Tyr Lys Pro Arg Phe Cys Gly Val Cys 20 25 30 Ser Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Asn Thr Lys Thr Ile Gin Ala 35 40 45 Glu Phe Gin Cys Ser Pro Gly Gin Ile Val Lys Lys Pro Val Met Val 50 55 60 Ile Gly Thr Cys Thr Cys His Thr Asn Cys Pro 65 70 <210> 11 <211> 510 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> <223> (D . . (510) <400> 11 41 41 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ gct tac agg ccâ gaa gcc acc cta gga gta gaa gtc tct gac tca agt 49

Ala Tyr Arg Pro Glu Ala Thr Leu Gly Vai Glu Vai Ser Asp Ser Ser 25 10 15 gtc aac tgc att gaa cag acc aca gag tgg aca gca tgc tcc aag age 96

Vai Asn Cys Ile Glu Gin Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser 20 25 30 tgt ggt atg ggg ttc tcc acc cgg gtc acc aat agg aac cgt caa tgt 144

Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Vai Thr Asn Arg Asn Arg Gin Cys 35 40 45 gag atg ctg aaa cag act cgg ctc tgc atg gtg cgg ccc tgt gaa caa 192

Glu Met Leu Lys Gin Thr Arg Leu Cys Met Vai Arg Pro Cys Glu Gin 50 55 '50 gag cca gag cag cca aca gat aag aaa gga aaa aag tgt ctc ege acc 240

Glu Pro Glu Gin Pro Thr Asp Lys Lys Gly Lys Lys Cys Leu Arg Thr 65 70 75 80 aag aag tca ctc aaa gcc ate cac ctg cag ttc aag aac tgc acc age 288

Lys Lys Ser Leu Lys Ala Ile His Leu Gin Phe Lys Asn Cys Thr Ser 85 90 95 ctg cac acc tac aag ccc agg ttc tgt ggg gtc tgc agt gat ggc ege 336

Leu His Thr Tyr Lys Pro Arg Phe Cys Gly Vai Cys Ser Asp Gly Arg 100 105 110 tgc tgc act ccc cac aat acc aaa acc ate cag gca gag ttt cag tgc 384

Cys Cys Thr Pro His Asn Thr Lys Thr Ile Gin Ala Glu Phe Gin Cys 115 120 125 tcc cca ggg caa ata gtc aag aag cca gtg atg gtc att ggg acc tgc 432

Ser Pro Gly Gin Ile Vai Lys Lys Pro Vai Met Vai Ile Gly Thr Cys 130 135 140 acc tgt cac acc aac tgt cct aag aac aat gag gcc ttc ctc cag gag 480

Thr Cys His Thr Asn Cys Pro Lys Asn Asn Glu Ala Phe Leu Gin Glu 145 150 155 160 ctg gag ctg aag act acc aga ggg aaa atg 510

Leu Glu Leu Lys Thr Thr Arg Gly Lys Met 165 170

<210> 12 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12 42 ΕΡ 1 648 494/ΡΤ

Ala Tyr Arg Pro Glu Ala Thr Leu Gly Vai Glu Vai Ser Asp Ser Ser 1 5 10 15 Vai Asn Cys Ile Glu Gin Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser 20 25 30 Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Vai Thr Asn Arg Asn Arg Gin Cys 35 40 45 Glu Met Leu Lys Gin Thr Arg Leu Cys Met Vai Arg Pro Cys Glu Gin 50 55 60 GlU Pro Glu Gin Pro Thr Asp Lys Lys Gly Lys Lys Cys Leu Arg Thr 65 70 75 80 Lys Lys Ser Leu Lys Ala Ile His Leu Gin Phe Lys Asn Cys Thr Ser 85 .90 95 Leu His Thr Tyr Lys Pro Arg Phe Cys Gly Vai Cys Ser Asp Gly Arg 100 105 110 Cys Cys Thr Pro His Asn Thr Lys Thr Ile Gin Ala Glu Phe Gin Cys 115 120 125 Ser Pro Gly Gin Ile Vai Lys Lys Pro Vai Met Vai Ile Gly Thr Cys 130 135 140 Thr Cys His Thr Asn Cys Pro Lys Asn Asn Glu Ala Phe Leu Gin Glu 145 150 155 160 Leu Glu Leu Lys Thr Thr Arg Gly Lys Met 165 170

Lisboa, 2012-05-21

Claims (8)

1. ΕΡ 1 648 494/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização: de uma proteína caracterizada por ser constituída por: * a proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, ou * um fragmento desta proteína, representado pela sequência SEQ ID NO: 12, de uma sequência nucleótidica caracterizada por compreender ou ser constituída por uma sequência nucleótidica codificando: * quer a proteína NOV tal como definida acima, * quer um fragmento da proteína NOV tal como definido acima, a referida sequência nucleótidica correspondendo à sequência nucleótidica SEQ ID NO: 1 codificando a SEQ ID NO: 2, ou à sequência SEQ ID NO: 11 codificando a SEQ ID NO: 12, de um anticorpo anti-idiotípico da proteína NOV representada pela sequência SEQ ID NO: 2, o referido anticorpo mimetizando as funções da proteína NOV no reconhecimento de VEGF, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento: de patologias necessitando a inibição da proliferação endotelial, no quadro das patologias seguintes: a degenerescência macular ligada à idade, as retinopatias diabéticas, a poliartrite reumatóide, os angiomas, os angiossarcomas, em particular a doença de Castelman e o sarcoma de Kaposi, ou de patologias necessitando a inibição da activação endotelial, no quadro das patologias seguintes: a rejeição de enxerto e de xenoenxerto, as acrocianoses, as esclerodermias, ou no quadro da preparação de enxertos entre a colheita e o transplante.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, de uma proteína caracterizada por ser constituída por: * a proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, ou ΕΡ 1 648 494/ΡΤ 2/3 * um fragmento desta proteína, representado pela sequência SEQ ID NO: 12, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento: de patologias necessitando a inibição da proliferação endotelial, no quadro das patologias seguintes: a degenerescência macular ligada à idade, as retinopatias diabéticas, a poliartrite reumatóide, os angiomas, os angiossarcomas, em particular a doença de Castelman e o sarcoma de Kaposi, ou de patologias necessitando a inibição da activação endotelial, no quadro das patologias seguintes: a rejeição de enxerto e de xenoenxerto, as acrocianoses, as esclerodermias, ou no quadro da preparação de enxertos entre a colheita e o transplante.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, de uma proteína caracterizada por ser constituída pela proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 2, de uma proteína caracterizada por ser constituída por um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, o referido fragmento sendo representado pela sequência SEQ ID NO: 12.
5. 5. Utilização de uma proteína caracterizada por ser constituída por um fragmento da proteína NOV, o referido fragmento sendo representado pela sequência SEQ ID NO: 12, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de cancros.
6. 6. Composição farmacêutica caracterizada por conter como substância activa: uma proteína caracterizada por ser constituída por um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, o referido fragmento sendo representado pela sequência SEQ ID NO: 12, uma sequência nucleotídica caracterizada por compreender ou ser constituída por uma sequência nucleótidica codificando: * quer a proteína NOV tal como definida acima, ΕΡ 1 648 494/ΡΤ 3/3 * quer um fragmento da proteína NOV tal como definido acima, a referida sequência nucleótidica correspondendo à sequência nucleótidica SEQ ID NO: 1 codificando a SEQ ID NO: 2, ou à sequência SEQ ID NO: 11 codificando a SEQ ID NO: 12, - um anticorpo anti-idiotípico da proteína NOV representada pela sequência SEQ ID NO: 2, o referido anticorpo mimetizando as funções da proteína NOV no reconhecimento de VEGF, em associação com um vector farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Composição farmacêutica de acordo com 6, caracterizada por conter como substância activa uma proteína caracterizada por ser constituída por um fragmento da proteína NOV, representada pela sequência SEQ ID NO: 2, o referido fragmento sendo representado pela sequência SEQ ID NO: 12, em associação com um vector farmaceuticamente aceitável.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 1 à 5, para a preparação de uma composição de acordo com uma das reivindicações 6 a 7, destinada a ser administrada à razão de cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg/dia. Lisboa, 2012-05-21