JP5435388B2 - インスリン様増殖因子結合タンパク質を含有するWntシグナル伝達阻害剤 - Google Patents
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Description
(1)配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(2)前記(1)のタンパク質と70%以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質、および
(3)前記(1)のタンパク質のアミノ酸配列において1個から10個のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質。
(1)配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
(2)前記(1)のポリヌクレオチドと70%以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(3)前記(1)のポリヌクレオチドの塩基配列において1個から30個のヌクレオチドの変異を有する塩基配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
(4)前記(1)から(3)のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
(1)配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
(2)前記(1)のタンパク質と70%以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質、および
(3)前記(1)のタンパク質のアミノ酸配列において1個から10個のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質。
(1)配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
(2)前記(1)のポリヌクレオチドと70%以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(3)前記(1)のポリヌクレオチドの塩基配列において1個から30個のヌクレオチドの変異を有する塩基配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
(4)前記(1)から(3)のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
(プラスミドおよび試薬)
マウスIGFBPおよびアフリカツメガエルIGFBP-4(以下、XIGFBP-4と略称することがある)のcDNAクローンはOpen Biosystmes社より購入した。XIGFBP-4において第74番目のヒスチジン(His)がプロリン(Pro)により置換された変異体(XIGFBP-4-H74P)はQuikChange登録商標 Site-Directed Mutagenesisキット(Stratagene社製)により作製した。このような変異体はIGFに結合しない。Hisタグが付加されたヒト野生型IGFBP-4および変異体IGFBP-4-H74P(Qin, X., Strong, D.D., Baylink, D.J. & Mohan, S., Structure-function analysis of the human insulin-like growth factor binding protein-4., J Biol Chem 273, 23509-16 (1998))はHitTrap HPキット(Amersham社製)を用いて作製し、そして精製した。
P19CL6細胞およびES細胞の心筋細胞への分化の誘導および培養は、本質的には従前の報告に記載された方法と同様の方法で実施した(Monzen, K. et al., Bone morphogenetic proteins induce cardiomyocyte differentiation through the mitogen-activated protein kinase kinase kinase TAK1 and cardiac transcription factors Csx/Nkx-2.5 and GATA-4., Mol Cell Biol 19, 7096-105 (1999); Naito, A.T. et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006))。
IP/ウエスタン解析は、全長IGFBPまたはその様々な欠失変異体、LRP6、Frz8CRD、およびDKK1をそれぞれ含む各馴化培地(conditioned medium)を293細胞を用いて作製し、これらを用いて実施した。結合反応は4℃にて一晩実施した。免疫沈降はProtein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham社製)を用いて実施した。IGFBP-4およびWnt3Aの125I標識は、IODO-BEADS登録商標ヨード化試薬(Pierce社製)を用いて実施した。液相結合アッセイは、基本的には従前報告された方法と同様の方法で実施した(Semenov, M.V. et al., Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6., Curr Biol 11, 951-61 (2001))。簡潔にいえば、Mycタグを付加したLRP6N(LRP6N-Myc)またはMycタグを付加したFrz8CRD(Frz8CRD-Myc)を様々な濃度の125I標識IGFBP-4と混合し、そして4℃にて一晩インキュベーションした。LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを免疫沈降させ、そしてProtein G Sepharose ビーズを徹底的に洗浄した後、結合したIGFBP-4の放射活性を測定した。競合結合アッセイのために、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを含む馴化培地を125I標識Wnt3Aおよび非標識IGFBP-4と混合し、そして4℃にて一晩インキュベーションした。次いで、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを免疫沈降させ、そして結合したWnt3Aの放射活性を測定した。
アフリカツメガエルにおけるアキシスデュプリケーションアッセイ、アニマルキャップアッセイ、およびin situハイブリダイゼーション解析は、基本的には従前報告された方法と同様の方法で実施した(Kobayashi, H. et al., Novel Daple-like protein positively regulates both the Wnt/beta-catenin pathway and the Wnt/JNK pathway in Xenopus., Mech Dev 122, 1138-53 (2005))。XIGFBP-4について、2つの別個のcDNA、おそらく偽四倍体ゲノム(pseudotetraploid genome)に起因するものを、5'RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法により同定した。これら2つのIGFBP-4転写物の両方を標的とする2つの別個のMOを設計した(Gene Tools社)。MO1は、翻訳開始コドン上流に隣接する2番目のヌクレオチドから翻訳領域の23番目のヌクレオチドまでの25ヌクレオチドからなる配列を標的とし、MO2は、非翻訳領域の25ヌクレオチドからなる配列を標的とする。MO感受性XIGFBP-4 cDNAは、41bpの5'非翻訳領域を含むものであり、PCRにより作成した。MO抵抗性XIGFBP-4 cDNA(野生型およびH74P変異体)は、MO1標的配列に5つのサイレント変異を導入し、そして5'非翻訳領域を削除することにより作成した。MOの特異性を決定するため、MO感受性またはMO抵抗性のXIGFBP-4-Myc mRNAをMOと共にまたはMOなしでアフリカツメガエル胚に注入し、そしてタンパク質およびmRNA発現を分析した。PCRプライマーおよびPCR条件は上記表1に一覧表示する。MOおよびプラスミドDNAは8細胞段階において、心臓および肝臓原基へと運命付けられた2つの背側植物割球の背側領域に注入した。mRNAの電気穿孔法による導入は、本質的には従前報告された方法と同様の方法で実施した(Sasagawa, S., Takabatake, T., Takabatake, Y., Muramatsu, T. & Takeshima, K., Improved mRNA electroporation method for Xenopus neurula embryos., Genesis 33, 81-5 (2002))。mRNA(5nl溶液中5ng)の心臓原基近辺への注入および電気パルスの適用は段階29に実施した。マウスIGFBP-4のホールマウントin situハイブリダイゼーション解析は、従前報告された方法と同様の方法で実施した(Hosoda, T. et al., A novel myocyte-specific gene Midori promotes the differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes., J Biol Chem 276, 35978-89 (2001))。
形態形成や細胞増殖、例えば心臓の発達および/または心筋細胞の分化を調節する新たな液性因子の探索を、心筋細胞に分化するマウス由来の細胞株P19CL6細胞を用いて実施した。P19CL6細胞は1% DMSO存在下で高い効率をもって心筋細胞へ分化することが知られている(Monzen, K. et al., Bone morphogenetic proteins induce cardiomyocyte differentiation through the mitogen-activated protein kinase kinase kinase TAK1 and cardiac transcription factors Csx/Nkx-2.5 and GATA-4., Mol Cell Biol 19, 7096-105 (1999))。
IGFBPはIGFに結合してその作用を調節する分子とみなされているため、IGFBP-4による心臓発生促進効果がIGFの作用の増強および阻害のいずれによるかを検討した。まずP19CL6細胞を抗IGF-I中和抗体(Sigma社製)および抗IGF-II中和抗体(Sigma社製)の組み合わせ、またはIGFタイプI受容体に対する中和抗体(Oncogene社製)で処理した。これら抗体による処理が心筋細胞の分化を誘導するおよび/またはIGFBP-4の心臓発生効果を増大させる場合は、IGFBP-4がIGFシグナル伝達を阻害することにより心筋細胞の分化を誘導すると判定した。他方、これら抗体による処理がIGFBP-4による心臓発生を低減させる場合は、IGFBP-4がIGFシグナル伝達を増強することにより心筋細胞の分化を誘導すると判定した。また、IGFBP-4の代わりに、IGFに結合しないIGFBP-4変異体(IGFBP-4-H74P)を用いて、P19CL6細胞の心筋細胞への分化を試験した。
P19CL6細胞の心筋細胞への分化におけるIGFBPファミリーメンバーの発現を検討した。P19CL6細胞の心筋細胞への分化はDMSO添加により誘導し、DMSO添加後、第0日、第2日、第4日、第6日および第8日にIGFBP発現をRT-PCRにより測定した。
内因性IGFBP-4のin vivoでの心臓の発達における役割を、アフリカツメガエル胚を用いて試験した。まず、アフリカツメガエル胚におけるNkx2.5(初期心臓マーカー)、cTnI(成熟心臓マーカー)、Hex(肝臓マーカー)、およびXIGFBP-4 mRNAの、段階34、38および42における発現をin situハイブリダイゼーション解析した。その結果、XIGFBP-4の強い発現が段階38において心臓に隣接する前方肝臓で検出された(図4-a)。
配列番号3:IGFBP-1(配列番号4)をコードする遺伝子。
配列番号5:IGFBP-2(配列番号6)をコードする遺伝子。
配列番号7:IGFBP-6(配列番号8)をコードする遺伝子。
配列番号9:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号10:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号11:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号12:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号13:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号14:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号15:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号16:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号17:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号18:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号19:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号20:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号21:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号22:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号23:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号24:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号25:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号26:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号27:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号28:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号29:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号30:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号31:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号32:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号33:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号34:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号35:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号36:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号37:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号38:siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号39:siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号40:siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号41:siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号42:モルフォリノ用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号43:モルフォリノ用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号44:アフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子の部分配列。
配列番号45:アフリカツメガエルIGFBP-4変異体遺伝子の部分配列。
配列番号46:アフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子内のモルフォリノ標的配列。
配列番号47:アフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子内のモルフォリノ標的配列。
配列番号48:モルフォリノ抵抗性のアフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子の部分配列。
Claims (9)
- 配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質の少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤。
- 配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤。
- 配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質の少なくとも1種類を用いることを手段とするインビトロにおけるWntシグナル伝達阻害方法。
- 配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの少なくとも1種類を用いることを手段とするインビトロにおけるWntシグナル伝達阻害方法。
- 配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質の少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有する、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導剤。
- 配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有する、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導剤。
- 配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質の少なくとも1種類を多能性幹細胞とインビトロで接触させることを手段とする心筋細胞分化誘導方法。
- 配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの少なくとも1種類を多能性幹細胞とインビトロで接触させることを手段とする心筋細胞分化誘導方法。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞である請求項7または請求項8に記載の心筋細胞分化誘導方法
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