KR101282374B1 - 층상 위족 형성 및 암 전이 조절용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 층상 위족 형성 및 암 전이 조절용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 gC1qR을 포함하는 층상 위족 형성 및 암 전이 조절용 조성물에 관한 것이다.

Description

층상 위족 형성 및 암 전이 조절용 조성물{Composition for regulating lamellipodia formation and cancer metastasis}

본 발명은 층상 위족 형성 및 암 전이 조절용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 gC1qR을 포함하는 층상 위족 형성 및 암 전이 조절용 조성물에 관한 것이다.

세포 이동은 조직 및 기관 발생, 상처 치유, 염증, 혈관 형성 및 암세포 전이와 같은 여러 기능에 필수적이다. 지정된(Directed) 세포 이동은 세포가 화학적 신호에 대하여 그 자신을 이동시키기 위한 일시적인 초점 부착 부위를 제공하는 이동하는 세포의 최첨단의 F-액틴 돌기부인 베일 유사(veil-like) 층상위족(lamellipodia)의 형성에 의하여 시작된다. 층상위족 형성은 케모카인 수용체, CD44,ezrin/radixin/meosin(ERM), 및 Rho-계열 GTPases를 포함하는 여러 분자들에 의하여 조절된다(Baumgartner, M., Sillman, A. L., Blackwood, E. M., Srivastava, J., Madson, N.,Schilling, J. W., Wright, J. H., and Barber, D. L. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103,13391-13396;Oliferenko, S., Kaverina, I., Small, J. V., and Huber, L. A. (2000) J Cell Biol 148, 1159-1164;Van Haastert, P. J., and Devreotes, P. N. (2004) Nat Rev Mol Cell Biol 5, 626-634)

gC1qR는 컴프리먼트 콤포넌트 C1q에 대한 수용체이다. C1q에 대한 수용체로서 그것의 작용 이외에, gC1qR는 여러 세포외 매트릭스 콤포넌트 및 바이러스 단백질과 관련이 있다(Chowdhury, A. R. K., A., Ghosh, I., and Datta, K. (2009) Hyaluronan binding protein 1( HABP1 / p32 / gC1qR ): A new perspective in tumor development ., In: Stern R ed.Hyaluroana in cancer biology. Academic Press, 2009: 51-68;Ghebrehiwet, B., Lim, B. L., Kumar, R., Feng, X., and Peerschke, E. I. (2001) Immunol Rev 180, 65-77).

본 발명의 목적은 새로운 층상위족 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 새로운 세포 이동 및 세포 부착 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 새로운 암 전이 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 새로운 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 새로운 항암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 gC1qR 단백질 또는 이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 층상위족 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 gC1qR 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 gC1qR 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 gC1qR 단백질 또는 이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 세포 이동 및 세포 부착 유도용 조성물.

또한 본 발명은 gC1qR 단백질 또는 이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 암 전이 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 gC1qR 유전자를 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

또 본 발명은 gC1qR 유전자를 표적물질로 이용하여 모델세포 또는 동물세포의 표현형 변화를 유도하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 gC1qR 단백질을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 단백질의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 gC1qR 유전자에 대한 억제제로, gC1qR 유전자에 대한 억제제로, 서열번호 2의 유전자로부터 전사되는 mRNA의 서열과 상보적인 염기서열을 갖고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 안티-센스 유전자는 서열번호 3 또는 4인 것이 바람직하나 이에 한정하지 아니한다.

본 발명의 진단 방법에서 상기 유전자를 포함하는 조성물과 시료 간의 반응의 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay), 효모 이중 혼성법(yeast twohybrid),2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 에세이 (in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 예컨대 상기 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerases chainreaction), 써던블로팅(southern blotting), 노던 블롯팅(Northern blooting) 등으로 이를 검출함으로써 대상자에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 조사하면 암의 발생 여부를 판단할 수 있다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다.

본 발명은 또한 gC1qR 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 전이 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

gC1qR 유전자는 전이성 암에서 특이적으로 발현이 증가하므로 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 이용하여 gC1qR 유전자 또는 단백질의 과발현 여부를 조사하면 암 전이를 진단할 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 상기 단백질의 암 진단 용도 및 상기 조성물과 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하여 암 전이를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 진단 방법에서 상기 단백질을 포함하는 조성물과 시료 간의 반응의 확인은 DNA-단백질, RNA-단백질,단백질-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소연쇄반응 (PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay), 특이적 면역염색(histoimmunostaining), 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 에세이 (in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 예컨대 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산 또는 단백질과 하이브리드화한 후 당분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerases chain reaction), 웨스턴 블로팅(western blotting) 등으로 이를 검출함으로써 대상자에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 조사하면 암의 전이 여부를 판단할 수 있다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다.

대안으로, 본 발명의 조성물은 상기 단백질 대신 상기 단백질에 대한 특이적 항체를 포함할 수 있다. 암 세포에서는 gC1qR 유전자가 과발현되어 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양 또한 증가하게 된다. 따라서 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 이용하는 경우, 항원-항체 반응을 통해상기 단백질을 검출해 내어 암의 전이를 진단할 수 있다.

상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 일반적으로 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석할 수도 있고, 아니면 직접 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.

본 발명은 또한 gC1qR 유전자를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 조성물의 항암제 스크리닝용 용도 및 상기 조성물을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 유전자를 포함하는 조성물과 시험대상물질 간의 반응 확인은, DNA-DNA, DNA-RNA,DNA-단백질, DNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를들면, 생체 외부에서(in vitro) 상기 유전자와 시험대상물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험,포유류세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 유전자 외에도, 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 표적물질로 이용하여 모델세포 또는 동물세포의 표현형 변화를 유도하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝방법을 제공한다.

본 발명의 항암제 스크리닝 방법에서 상기 유전자를 과발현시킨 모델생명체 및 동물세포를 이용한 세포성장속도변화 (growth rate), 형태적 변화 (morphological changes) 및 온도 민감성 변화 (temperature sensitivity)등의 phenotype 조사를 통한 cell-based 분석을 수행하여 상기 유전자의 발현 및 단백질의 작용을 직접 억제하는 물질 스크리닝을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 gC1qR 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 조성물의 항암제 스크리닝용 용도 및 상기 조성물을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 단백질의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 단백질을 포함하는 조성물과 시험대상물질 간의 반응 확인은,단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를들면, 상기 단백질과 시험대상물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid),상기 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 암전이 억제제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 유전자 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 시험대상물질 및 반대로 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 시험대상물질은, 전자의 경우, 시험대상물질에 대한 억제제를 개발함으로써 항암제 후보물질이 될 수 있고, 후자의 경우 는 항암제 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 항암제 후보물질은 이후의 항암제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 상기 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 항암제를 개발할 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 2의 유전자로부터 전사되는 mRNA의 서열과 상보적인 염기서열을 갖고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 제공한다.

안티-센스 유전자 염기서열은 서열번호 2의 gC1qR 유전자 염기서열에 상보적인 염기서열이 효율적인 서열일 수 있으며 서열번호 2의 서열에서, 연속된 19~30개의 염기서열에 상보적인 염기서열일 수 있으며 바람직하게는 서열번호 3 또는 4일 수 있다.

상기 본 발명의 안티-센스 유전자의 세포 내 전달 효율을 높이기 위해서는 안전하고 효율적인 전달 시스템이 요구되어진다. 이를 위해, 본 발명의 안티-센스 유전자는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)와의 복합체 형태로 암 치료용 의약 조성물 내에 포함될 수 있다.

세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위한 핵산 전달체는 크게 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 구분할 수 있다. 가장 널리 이용되는 것은 바이러스 벡터 (viral vector)로 전달 효율이 높고 지속 시간이 길기 때문이다.

여러 가지의 바이러스벡터 중 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector) 등이 주요하게 사용되고 있다. 이러한 바이러스 벡터는 리보핵산의 세포내 전달 면에서는 효율적이지만, 생체 내에서의 활성을 가진 바이러스로의 재조합, 면역 반응 유발, 숙주 염색체로의 무작위 삽입 등 안전성(safety) 측면에서 여러 문제점을 가지고 있다.

이에 비해 비바이러스 벡터(nonviral vector)는 바이러스 벡터에 비해 장점을 가지고 있는데, 독성과 면역 반응이 작고, 반복적으로 투여가 가능하며, 리보핵산과의 복합체 형성이 간편하고, 대량 생산이 용이하다. 또한, 질환 세포나 조직부위에 특이적 리간드를 비바이러스성 벡터에 접합하여, 장기·세포 선택적 핵산 전달을 가능하게 한다. 비바이러스성 벡터로서는 리포좀, 양이온성 고분자를 비롯하여, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 핵산 전달체는 동물 세포 내에 목적하는 핵산의 수송 효율을 현저히 증강시킬 수 있으며 전달하고자 하는 핵산의 사용 목적에 따라 어떤 동물 세포로도 핵산 전달이 가능하다.

본 발명의 shRNA(small hairpin RNA)는 타겟유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스 (lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.

본 발명의 헤어핀구조의 shRNA (small hairpin RNA)를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 미국 출원제2004/106567 및 2004/0086884는 shRNA를 포함하는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터 외에 리포솜 전달 운반체, 플라스미드 주입 시스템, 인공 바이러스 엔벨로프 및 폴리라이신 컨쥬게이트를 포함한 전달 메커니즘뿐만 아니라 많은 발현 컨스트럭트/벡터 관련 정보를 제공하고 있다.

본 발명은 또한 gC1qR 유전자에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 '유전자에 대한 억제제'는 유전자의 발현 억제제의 개념을 포함한다.

상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

적당한 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.

상기 유전자의 저해제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 shRNA 외에도 상기 유전자의 발현을 저해하는 저분자화합물, 천연물, 생체유용단백질, 생체 내 단백질 또는 신규단백질, 합성 및 천연화합물질 등 어떤것이든 가능하다. 따라서 종래 당해 기술 분야에서 상기 유전자의 저해제로 알려진 화합물 및 상기 유전자를 이용한 스크리닝을 통해 발굴한 물질도 이용가능하다.

본 발명의 유전자는 전이성 암 세포에서 발현되고, 상기 유전자의 억제제를 투여하여 상기 유전자의 발현을 저해시키면 암의 전이를 억제할 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 상기 유전자의 억제제의 암 치료 용도 및 유효량의 상기 유전자의 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 본 발명에 있어서 암 치료는 암의 예방 및 억제를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자에 대한 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 안티센스 뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다(Hogrefe, 1999). 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있고 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

또한, 상기 유전자에 대한 억제제는 상기 유전자의 siRNA(Small Interfering RNA)일 수 있다.

siRNA는 유전자의 정방향 서열(sense strand)과 세포 내에서 실제 유전자 억제효과를 나타내는 역방향 서열(anti-sense strand)을 함께 합성한 후 이중리보핵산쇄로 결합시켜 세포내로 도입된다.

본 발명은 또한 gC1qR 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 유전자를 억제하면 그에 따른 단백질의 발현이 억제되어 암 전이가 억제되는 것이므로, 상기 유전자의 단백질을 저해하면 암의 전이를 억제할 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 단백질에 대한 억제제의 암 치료 용도 및 유효량의 상기 단백질의 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 본 발명에 있어서 암 치료는 암 또는 암 전이의 예방 및 억제를 포함한다.

상기 단백질에 대한 억제제는 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체일 수 있다. 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 단백질에 대한 억제제가 항체일 경우 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 증가시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 최소량의 보조 물질로 구성될 수 있다.

또한 본 발명의 암 치료용 조성물은 하나 또는 그 이상의 항암제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 암 치료용 조성물은 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 화학요법약제(chemotherapeutic agent), 예컨대, 사이클로포스파마이드, 아지리딘, 알킬알콘설포네이트, 나이트로소우레아, 다카르바진, 카르보플라틴, 시스플라틴 등과 같은 알킬화제(alkylating agent), 마이토마이신 C, 안트라사이클린, 독소루비신(아드리아마이신) 등과 같은 항생제, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라신, 시타라빈 등과 같은 항대사제(antimetabolitic agent), 빈카 알칼로이드와 같은 식물유래 약제 및 호르몬 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 암 치료용 조성물은 상기 유효 성분 외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 가용화제 등이 있다.

또한 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 치료 방법에 있어서, "유효량"은 암을 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서,본 발명의 유효 성분의 "유효량"은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자 또는 단백질의 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, shRNA일 경우 0.01ng/kg~10㎎/kg, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/kg~10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 저분자화합물일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 천연물일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 생체유용단백질일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

추가로, 본 발명은 gC1qR 유전자 또는 이로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 전이 진단용 키트를 제공한다.

상기 암 전이 진단용 키트는 본 발명의 진단용 조성물 외에도 상기 조성물과 시료 간의 반응을 파악하는데 사용되는 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩 등의 적용을 위한 재료를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 gC1qR 단백질 또는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 염기서열 중 하나 이상의 아미노산 또는 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 서열을 가질 수 있다.

또한 본 발명의 안티-센스 유전자의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기 위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 gC1qR이 인간 폐암 A549 세포주에서 층상위족의 필수 콤포넌트라는 것을 밝혀내었다. 세포 표면 gC1qR이 인슐린, IGF-1, EGF, 또는 혈청으로 자극된 세포에서 CD44, GM1, 액틴 및 인산화된 초점 부착 키나제(p-FAK)와 함께 층상위족에서 집중되어 있었다. 성장 인자 유도된 층상위족 형성 및 세포 이동은 gC1qR-결손 세포에서는 현저하게 감소되었고, focal adhesion kinase 및 각 receptor tyrosine kinases (RTKs)의 약화된 활성화를 가진다. 또 gC1qR 결손된 세포는 이식된 마우스에서 감소된 종양성 및 전이 활성 뿐만 아니라 배양에서 감소된 증식 속도를 나타내었다. 따라서 본 발명자들은 세포 표면 gC1qR이 층상위족 형성 및 RTK 활성화를 통해서 전이를 조절한다는 결론을 얻었다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

층상위족에서 gC1qR 의 위치

세포 표면 gC1qR의 세포 기능을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 먼저 면역형광에 의해서 넌컨프루언트(nonconfluent) A549 인간 폐 선암 세포에서 gC1qR 위치를 조사하였다.

비록 gC1qR은 주로 세포 내에서 발견되었지만 적은 부분은 층상위족을 표현할 원형질 막의 패치 부위에서 검출되었다(도 1a). 층상위족은 성장인자 자극 후에 형성되므로, 본 발명자들은 다음 성장인자에 세포 노출이 층상위족으로 gC1qR의 이동을 유도하는지를 조사하였다. 넌컨프루언트 A549 세포를 혈청 결핍하게 하고 혈청 또는 인슐인, 인슐인 유사 인자 (IGF), 및 표피 성장 인자(EGF)와 같은 성장인자로 처리하였다. 처리 후, gC1qR의 세포내 위치를 면역형광에 의해서 침투된 A549 세포에서 모니터하였다. 도 1b에서 나타낸 것과 같이,gC1qR은 혈청 또는 성장인자로 처리 후 돌출 층상위족에 모였다. 층상위족에서 gC1qR의 발현은 5% 혈청 이하의 결핍 세포에서 관찰된 반면에 gC1qR 발현은 40%의 성장 인자 이상으로 자극된 A549 세포의 층상위족에서 관찰되었다(도 1c).

gC1qR 의 넉다운은 리간드 유도된 층상위족 형성을 저해함

세포 표면 gC1qR이 혈청 또는 성장 인자 처리 후에 층상위족에 모이므로, gC1qR은 성장인자 유도된 층상위족 형성을 조절할 수 있다. 이 가능성을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 gC1qR의 안정한 넉다운 후에 혈청 또는 성장인자 유도된 층상위족 형성을 모니터하였다. gC1qR의 넉다운은 A549 세포에서 small hairpin RNA (shRNA)에 의해서 수행되었다.

도 2a에서 나타낸 것과 같이, gC1qR의 발현은 sh-gC1qR로 트랜스팩션된 두 안정한 세포 클론에서 현저하게 감소되었다. 층상위족 형성은 세포를 혈청 결핍되게 하고 혈청 또는 성장인자로 자극된 A549 세포에서 CD44, 액틴 및 GM1의 세포 위치에 의하여 모니터하였다. 혈청 또는 성장인자에 세포 노출 후, 층상위족에서 CD44, 액틴 및 GM1의 패치된 응집이 대조군 세포에서는 나타나지만 gC1qR-결손된 세포에서는 나타나지 않았다(도 2b). 사실 층상위족은 리간드 활성화 후 44% 이상의 대조군 세포(sh-con)에서는 나타났지만 24% 이하의 gC1qR 넉다운 세포에서(sh-gC1qR)만 나타났다(도 2c). 이것은 gC1qR이 리간드 유도된 층상위족 형성에 필수적이라는 것을 나타낸다.

gC1qR 의 넉다운은 세포 부착 및 이동을 저해

본 발명자들은 먼저 플레이팅 후 16 및 48 h에서 sh-con 및 sh-gC1qR A549 세포의 세포 형태를 관찰하였다. 플레이팅 16시간 후, 그 sh gC1qR 세포는 sh-con 세포와 비교하여 현저하게 감소된 부착을 나타내었다(도 3a의 상단 패널). 또한, 플레이팅 48 h 후, sh-gC1qR 세포의 성장 패턴은 대조군 세포의 것과 현저하게 달랐다. 도 3a의 하단 패널에서 나타낸 것과 같이, sh-gC1qR A549 세포는 밀접한 세포-세포 접촉을 가지는 응집 성장 패턴을 가졌으나, sh-con 세포는 정상적으로 분산된 성장 패턴을 가졌다. gC1qR 결손된 세포에서 세포 부착의 감소는 콜라겐, 젤라틴 및 poly-D-lysine (PDL)와 같은 여러 세포외 매트릭스(ECM)로 코팅된 배양 플레이트 상에서 세포 부착 어세이에서 더 정량화하였다. 도 3b에서 나타낸 것과 같이, 그 sh-gC1qR 세포는 sh-con 세포에 비하여 여러 ECM 콤포넌트로 코팅된 웰에 덜 부착하였다. 세포 부착에서 gC1qR 조절의 메카니즘을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 세포 부착의 중요한 조절자인 FAK의 활성에 gC1qR 넉다운이 영향을 미치는지를 테스트하였다. 혈청 또는 성장인자 처리 후, FAK의 타이로신 397 및 925 잔기의 인산화는 sh-con 세포에서는 크게 증가하였으나 sh-gC1qR 세포에는 변화가 없었다(도 3c).또한 항-pFAK 항체로 면역 형광분석은 gC1qR 넉다운이 리간드 유도된 FAK 활성화를 파괴하였다는 것을 나타낸다(도 3d).gC1qR이 세포 부착에 절대적으로 관여한다는 발견에 기초하여 본 발명자들은 세포 이동에 대한 gC1qR 넉다운의 효과를 조사하였다. 상처 치유 및 트랜스웰 이동 어세이는 리간드 유도된 세포 이동은 gC1qR의 안정한 결손에 의하여 크게 영향을 받았다는 것을 보여주었다(도 4a-d). 이 데이터는 gC1qR이 층상위족 형성을 통해서 세포 이동을 매개한다는 것을 나타낸다.

gC1qR 의 넉다운은 리간드 유도된 RTK 활성화를 약화시킴

본 발명자들은 혈청 결핍 후에 sh-con 및 sh-gC1qR 세포를 혈청 또는 성장 인자로 자극하였다. sh-con 세포와 비교하여, shgC1qR 세포는 처리 후 Akt 및 Erk 인산화의 부족을 나타내었다(도 5a-d). 게다가, IR, IGFR, 및 EGFR의 리간드 유도된 타이로신 인산화는 sh-gC1qR 세포에서 파괴되었다. 이 결과는 일시적인 gC1qR 넉다운을 가지는 A549세포에서 재생되었다(도 5e-h). 이들 데이터로부터 본 발명자들은gC1qR이 RTKs의 활성화에서 필수불가결한 역할을 하다고 결론을 얻었다.

gC1qR 의 넉다운은 종양 형성 및 전이 활성을 저해

본 발명자들은 10% 우태아 혈청을 포함하는 배양 동안 sh-con 및 sh-gC1qR A549 세포의 수를 카운트하여서 세포 성장 속도를 측정하였다. 도 6a에 나타낸 것과 같이, sh-gC1qR 세포는 sh-con 세포에 비하여 감소된 성장 속도를 나타내었다; 5일 후 약 40% 더 적은 sh-gC1qR 세포가 관찰되었다. MTT 분석 또한 gC1qR 넉다운은 혈청 또는 리간드 의존적 세포 증식을 감소시킨다는 것을 나타내었다(도 6b). 또한 foci 형성 분석에서, sh-gC1qR 세포는 sh-con 세포에 비하여 더 적은 foci를 가졌다(도 6c). sh-con 및 sh-gC1qR 세포의 종양형성 능력을 조사하기 위하여, 양 세포주 모두를 BALB/c athymic 마우스에 피하 주사하고 49일 동안 종양 형성을 모니터하였다. 종양 크기의 차이는 이식 후 2주에 나타났다. 49일까지 shgC1qR 세포 유래된 종양의 크기는 대조군 세포로부터 유래된 세포의 크기의 약 1/3이었다(도 6d 및 e).

sh-gC1qR 세포의 전이 능력을 조사하기 위해서, athymic 마우스로 세포주의 정맥 주사 28일 후 간을 조사하였다. 대조군 동물의 간에서는 많은 결절이 관찰되었지만 sh-gC1qR 세포 주사된 동물의 간에서는 그러한 검출이 없었다(도 6f 및 g). 이들 결과는 gC1qR 넉다운이 인 비보에서 A549 세포의 전이 능력 및 종양 성장을 저해한다는 것을 나타낸다.

본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 gC1qR은 층상위족 형성에 필수적이며, gC1qR의 넉다운은 세포 부착 및 이동을 저해하였으며, gC1qR의 넉다운은 종양 형성 및 전이 활성을 저해하는 효과를 나타내었다.

도 1a 내지 도 1g는 세포 표면 gC1qR이 운동성 A549 세포의 층상위족을 모은다는 것을 나타낸 그림.
도 1a는 빠르게 증식하는 넌컨프루언트 A549 세포를 0.1% Triton X-100으로 침투시키고 항-gC1qR 항체로 면역형광으로 분석하였다. 박스 부위는 gC1qR의 차별적인 분포 패턴을 보여주기 위하여 확장함. 별표(*)는 층상위족에서 gC1qR의 위치를 나타냄. Scale bar = 20 μm.
도 1b 및 도 1c는 넌컨프루언트 A549 세포를 18시간 동안 혈청 결핍화시킨 후, 인슐린(100 nM), IGF (20 ng/ml), EGF (50 ng/ml), 및 혈청(10%)으로 20분간 자극하였다. 그 침투된 세포들을 항-gC1qR 항체를 사용한 면역형광으로 분석하였다 (도 1b).별표(*)는 gC1qR-포함 층상위족을 나타냄. Scale bar = 20 μm. 전체 세포수 대 gC1qR-함유 층상위족을 가지는 세포 수의 비는 (도 1c)에 나타냄.
도 1d는 층상위족에서 CD44, p-FAK (Y397), GM1,및 액틴과 같은 층상위족 마커들과 gC1qR의 동 위치화를 나타낸 그림. gC1qR,CD44, 및 p-FAK의 세포내 위치는 항gC1qR, 항-CD44, 및 항-p-FAK 항체를 사용한 면역형광에 의한 투과 후에 결정. 로다민-부착된 CTB를 GM1 검출에 사용하였고, 로다민-부착된 phalloidin를 액틴 검출에 사용. Scale bar = 20μm.
도 1e 및 도 1f는 gC1qR의 세포 내 위치를 항-gC1qR 항체를 가지는 면역형광에 의하여 비침투된 세포에서 결정(도 1e). 별표(*)는 gC1qR-함유 층상위족을 나타냄. Scale bar = 20 μm. 전체 세포수 대 gC1qR-함유 층상위족을 가지는 세포 수의 비는 (도 1f)에 나타냄.
도 1g는 층상위족에서 CD44와 gC1qR의 표면 발현을 나타냄. gC1qR 및 CD44의 표면 발현은 면역형광에 의한 비침투된 세포에서 결정됨. Scale bar = 20 μm.
도 2a 내지 도 2c는 gC1qR의 넉다운은 성장인자 유도된 층상위족 형성을 저해하는 것을 나타냄.
도 2a는 gC1qR의 발현을 scrambled control shRNA를 발현하는 A549클론 (sh-con), 및 gC1qR에 대한 안정하게 발현하는 shRNA 두 A549클론(sh-gC1qR #1 및 sh-gC1qR #2)으로부터 얻은 전체 세포 파쇄액의 면역블랏 분석에 의하여 결정함.액틴을 로딩 대조군으로 사용함.
도 2b 및 도 2c는 혈청 결핍 18시간 후, sh-con 및 sh-gC1qR 세포를 혈청 또는 성장인자로 자극하였다. 투과 후, gC1qR와 CD44, 액틴 및 GM1의 동 위치화를 항-gC1qR,항-CD44, rhodamine-부착된 phalloidin, 및 rhodamine-부착 CTB를 각각 사용한 면역형광에 의하여 결정하였다(도 2b).Scale bar = 20 μm. 전체 세포수 대 GM1-함유 층상위족을 가지는 세포 수의 비는 (도 2c)에 나타냄.
도 3a 내지 도 3d는 gC1qR의 넉다운은 세포 부착을 방해하는 것을 나타낸 그림.
도 3a는 gC1qR 넉다운 후 A549 세포의 부착 및 성장 패턴을 나타냄. shcon 및 sh-gC1qR #1 A549 세포를 16시간(상단 패널) 및 48시간(하단 패널) 동안 플레이팅 후, 세포 부착 및 성장 패턴을 현미경으로 관찰함. 상단 두 패널에서 박스 부위는 확장되고 분리된 박스로 나타냄. Scale bar = 100 μm.
도 3b는 부착 분석을 위해서, sh-con 및 sh-gC1qR #1 A549 세포를 콜라겐(5 μg/ml), 젤라틴(1 μg/ml), 또는 poly-D-lysine (50 μg/ml)로 코팅되거나 또는 코팅되지 않은 6-웰 플레이트 상에 시딩함. 30분 후, 그 플레이트를 크리스탈 바이올렛으로 염색. 각 플레이트의 흡광도를 570 nm에서 측정함.
도 3c 및 도 3d는 18 시간 혈청결핍화 후, sh-con 및 sh-gC1qR #1 A549 세포를 도 1b에 나타낸 것과 같이 혈청 또는 성장인자로 자극하였다. Y387 및 Y925에 대한 gC1qR, FAK, 및 p-FAK의 발현을 면역블럿팅에 의하여 전체 세포 파쇄액으로부터 결정하였다(도 3c). FAK 및 p-FAK (Y397)의 세포내 위치는 면역형광에 의하여 결정하였다(도 3d).
도 4a 내지 도 4d는 gC1qR의 넉다운은 세포 이동을 저해한다는 것을 나타낸 그림.
sh-con 및 sh-gC1qR #1 A549 세포에 대한 상처 치유 분석(도 4a 및 도 4b) 및 침윤(invasion) 분석(도 4c 및 도 4d)를 실시예에 기재된 것과 같이 수행함. 각 패널에서 현미경 이미지는 세 독립적 실험의 대표도(도 4a 및 도 4c). 상처 치유 및 침윤 분석에서 세포 이동의 정량화는 각각 도 4b 및 도 4d에서 나타냄.
도 5는 gC1qR의 안정 및 일시적 넉다운은 RTK 활성화를 감소시킨다는 것을 나타낸 그림.
대조군(sh-con 및 sh-con) 및 안정하고 일시적인 gC1qR-결손된(sh-gC1qR #1 및 sigC1qR) A549 세포를 18시간 동안 혈청 결핍화한 후 15 분 동안 인슐린(100 nM),IGF (20 ng/ml), EGF (50 ng/ml), 또는 혈청(10%)으로 자극함. gC1qR, Akt,phospho-Akt (p-Akt on S473), Erk1/2 및 phospho-Erk1/2 (p-Erk1/2)의 발현을 면역블럿팅으로 결정함. IRβ, IGFR, 및 EGFR의 타이로신 인산화는 면역침전 및 항-포스포-타이로신 항체로 면역블럿팅을 수반하여 결정되었다.
도 6a 내지 도 6g는 gC1qR의 넉다운은 누드 마우스에서 A549 세포의 전이 및 종양 형성을 파괴한다는 것을 나타낸 그림이다.
도 6a는 sh-con 및 sh-gC1qR #1 A549 세포의 증식을 나타냄. 전체 세포 수는 표시된 날짜에 계수함.
도 6b는 sh-con 및 sh-gC1qR A549 세포의 성장인자 의존적 증식을 나타냄. 세포 증식은 비처리된 세포와 비교한 배수 변화로 나타냄.
도 6c는 소프트 아가 상에서 sh-con 및 sh-gC1qR #1 A549 세포의 앵커리지(Anchorage)-독립적인 성장을 나타냄.콜로니의 현미경사진은 플레이팅 3 주 후에 얻음(x 40).
도 6d 및 도 6e는 종양 부피의 측정(도 6e) 및 사진 (도 6d). sh-con 또는 sh-gC1qR #1 A549 세포를 BALB/c athymic 마우스(n=4)의 오른쪽 뒷다리로 피하 주사함 . 사진은 49일에 찍었고 종양 부피를 49일까지 2일마다 측정(*, P < 0.05, n=4/군). Filled circle, sh-con; open circle, sh-gC1qR #1.
도 6f 및 도 6g는 간 전이의 관찰 (도 6f) 및 정량화(도 6g)를 나타낸 그림. Sh-con 또는 shgC1qR A549 세포를 BALB/c athymic 마우스(n=5)의 꼬리 정맥에 주사하고, 주사 후 28일에 간 결절을 계수함(*, P < 0.05, n=5/군).

이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명에서 사용된 항체 및 그 구입처는 다음과 같다: 항-IGFR 및 항-포스포-타이로신 단백질(Transduction Laboratories); 항-IR, 항gC1qR,단백질 A- 및 단백질 G-부착 아가로스 비드 (Upstate Biotechnology); 항-Akt, 항-포스포-Akt (ser 473-특이적),항-FAK, 항-포스포-FAK (tyr 397-, 또는 tyr925-특이적), 및 항-integrin β1 (Cell Signaling Biotechnology); 항-CD44, 항cytochrome c, 항-Erk, 항-phospho-Erk,항-EGF-R, 항-flotillin, 항-pan-Ras, 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology); 및 Alexa 488-부착 마우스 및 Alexa 555-부착 토끼 2차 항체,Alexa 555-부착 CTB, 및 Alexa 555-부착 phalloidin (Invitrogen). 프로테이즈 및 포스파테이즈 저해제 칵테일은 Roche Molecular Biochemicals로부터 구입하였다. 인간 재조합 IGF 및 EGF 단백질은 R&D Biotechnology로부터 구입하였다.gC1qR (si-gC1qR) 및 scrambled-sequence RNA (si-con)에 대한 합성 siRNA는 Ambion으로부터 구입하였고; 바이오틴,콜라겐, poly-D-lysine (PDL), 젤라틴, 및 인슐린은 Sigma로부터 구입하였다.

실시예 1: 세포 배양 및 전기천공

A549 폐 선암 세포를 ATCC로부터 구입하여 1% penicillin/streptomycin 및 10% 우태아 혈청(제일 바이오사이언트)가 보충된 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 안정한 세포주 sh-gC1qR를 플라즈미드 psh-gC1qR 또는 pSilencer 대조군(Ambion)로 트랜스팩션된 A549세포로부터 확립하였고 1 μg/ml puromycin을 포함한 배지에서 3주간 배양하였다. 플라즈미드 psh-gC1qR를 각각 gC1qR (accession # NM_001212)의 엑손 3 및 엑손 1과 2 사이의 연결점에 위치하는 상보적인 서열로부터 유래된 5'GCATC CCACC AACATTTGAT T(서열번호 3) 및 5'CCGAC GGAGA CAAAGCTTTC T(서열번호 4)의 타겟 서열을 가지는 shRNA를 발현하기 위하여 구축하였다. siRNA-유도된 사일런싱을 위하여,A549 세포(3 x 10⁵ 세포)를 제조업자의 지시에 따라서 MicroPorator MP-100 system(Digital Bio Technology)을 사용하여, 120 pmol의 si-gC1qR 또는 si-con로 전기천공하였다.

실시예 2: 면역블럿팅 , 면역침전, 면역형광 및 세포 표면 바이오틴화

세포를 SDS 라이시스 버퍼(25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1mM PMSF 및 프로테이즈 칵테일)로 4℃에서 30분간 파쇄하였다. 4℃에서 10분간 마이크로원심분리(14,000rpm) 후, 전체 세포 파쇄액(상등액)을 SDS-PAGE로 분리한 후 나이트로셀루로스 막으로 옮겼다.그 막을 TBS 버퍼에서 5% w/v 분유로 37℃에서 1시간 불록킹을 한 후 1 차 및 2차 항체로 상온에서 1시간 배양하였다. 그 신호는 자동 이미지 분석 시스템(LAS 3000, Fuji Life Science)으로 육안화하였다. 면역침전을 위하여, 500 μg의 전체 세포 파쇄액을 2 μg의 해당 항체로 4℃에서 18시간으로 배양한 후 30 μl의 단백질 A-아가로스(50%, w/v)로 4℃에서 1시간 배양하였다 그 면역침전체를 항-타이로신 포스포단백질 항체로 면역불럿팅에 의하여 분석하였다. 면역염색을 위해서, 세포를 7% paraformaldehyde로 20분간 고정한 후, 5분간 1% Triton X-100을 투과시키거나 투과시키지 않고 방치한 후 1시간 동안 블록킹 버퍼(5% BSA in PBS)로 블록킹하였다. 그 후 1차 및 fluorescein-부착 2차 항체로 상온에서 1시간 배양하였다.면역형광 이미지는 공초점 현미경(ZEISS LSM 510META)으로 캡쳐하였다. 세포 표면 바이오틴화는 Bae, T. J., 등(2004) Proteomics 4, 3536-3548의 방법에 따라 수행하였다. 표면 바이오틴 표지 후, 세포를 위에서와 같이 SDS 라이시스 버퍼로 파쇄하였다.

실시예 3: 세포 부착 분석

98-웰 배양 플레이트의 웰을 60분간 콜라겐(5 μg/ml), 젤라틴(1 μg/ml), 또는 poly-D-Lysine (50 μg/ml)으로 코팅하거나 코팅하지 않은 상태로 유지하였다. 그 후 그 웰을 비특이적인 세포 부착을 방지하기 위하여 100ul의 열 변성 BSA (10 mg/ml)로 상온에서 30분간 불록킹하였다. 약 2.5 x10⁴ 세포를 각 웰당 플레이팅하고 배양 버퍼(HBS;150 mM NaCl, 25 mM HEPES, pH 7.4, 및 2 mM EDTA)로 37℃에서 30분간 배양하였다. 그 후 웰을 HEPES-버퍼 식염수(25 mM HEPES, pH 7.4, 및 150 mM NaCl)로 2회 세척하였다. 결합되지 않고 느슨하게 결합된 세포를 교반에 의하여 제거하고 잔류 세포를 3.7% formaldehyde로 고정하였다. 그 웰을 500 μl의 증류수로 3회 세척하고 그 부착된 세포를 상온에서 1시간 동안 pH 6.0에서 100 μl의 0.1% (w/v) Crystal Violet in 200 mM MES으로 염색하였다. 과잉 염료를 500 μl의 증류수로 3회 세척하여 제거하고, 결합된 염료를 100 μl의 10% (v/v)초산으로 녹였다. 흡광도는 570 nm에서 측정하였다.

실시예 4:상처 치유 및 트랜스웰 이동 분석

상처 치유 분석을 위해서, 세포들을 12-웰 배양 플레이트에 고밀도로 시딩하였다. 그 다음날, 그 세포들을 혈청 결핍상태로 추가로 18시간을 유지하였다. 마이크로피펫 팁으로 세포 모노레이어를 스크랩핑한 후, 그 세포들을 각각 인슐린 (100 nM),IGF (20 ng/ml), EGF (50 ng/ml)을 포함하는 성장인자와 혈청(10% v/v)으로 각각 처리하였다. 30시간 후, 세포의 이동 활성을 결정하기 위하여 이미지를 캡쳐하였고 치유된 면적을 측정하였다. 트랜스웰 이동 분석은 제조업자(Costar)에 의해 기재된 방법을 약간 변형하여 수행하였다. sh-con 및 sh-gC1qR로 안정하게 트랜스팩션된 A549세포들을 트립신처리하고 0.5% BSA 및 0.1% 혈청이 보충된 RPMI 배지에 재부유하였다. 전체적으로, 5 x10⁴ 세포를 각 웰의 상단 챔버(8 μm 구경)의 0.3ml의 배지에 플레이트하였고; 그 챔버의 하단부에는 콜라겐으로 코팅하였다. 상기 언급한 성장인자를 포함하는 전체 0.3 ml의 혈청 없는 RPMI 배지를 이동을 유도하기 위하여 그 하단 챔버에 첨가하였다. 37℃에서 18시간 배양 후, 상단 표면에 잔류하는 세포들을 면봉으로 제거하고 필터를 통과하여 이동한 세포들을 hematoxylin (Sigma)로 염색하였다. 염색된 세포들의 이미지를 캡쳐하고 세 다른 부분에서의 세포 수를 정량용 필터 당 카운트하였다.

실시예 5: MTT 및 소프트 아가 분석

MTT 분석을 위해서, sh-con 및 sh-gC1qR A549 세포들을 96웰 플레이트 상에 1 x10⁴ 세포/웰로 시딩하고 48시간 성장시킨 후 18시간 혈청결핍화하였다. 그 세포들을 FCS (10%), 인슐린(100 nM), IGF (20ng/ml), 또는 EGF (50 ng/ml)로 처리하였다. 3일 동안 처리 후, 그 세포들을 5μg/ml의 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)로 37℃에서 4시간 동안 처리하였다. MTT-formazan 결정을 DMSO에서 녹이고 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 결정하였다. 소프트 아가 분석을 위해서,0.6% 아가로스(2 ml/웰)을 60-mm 디쉬에 첨가하고 상온에서 유지하여 고체화하였다. sh-con 또는 shgC1qR로 안정하게 트랜스팩션된 약 5 x 10⁴ A549 세포를 2 ml의 탑 아가(0.4%)에 재부유하고 그 소프트 아가의 상단에 플레이팅하였다. 그 플레이트를 상온에서 추가적으로 15분 더 배양하였고 그 후 그 세포들을 3주 동안 배양을 유지하였다. 그 콜로니들의 이미지는 광학 현미경 하에서 얻었다.

실시예 6: 누드 마우스에서 전이 및 종양형성

6주령 암컷 BALB/c athymic 마우스들을 Orient Co.로부터 구입하여서 12-h 명/12-h 암 조건 하에서 22 ±2℃ 및 50± 10%d 습도 조건을 유지하였다. 본 실험은 한국 원자력의학원의 동물실험위원회의 승인을 얻어서 실험동물윤리위원회의 가이드 라인 하에서 수행하였다.종양형성 실험을 위하여, sh-con 또는 sh-gC1qR A549 세포들 (4 x 10⁶ 세포 in 0.1 ml PBS)를 마우스 오른쪽 뒷다리(n=4)에 피하 주사하였다.종 양 부피를 디지털 캘리퍼를 사용하여 주사 후 1에서 7주 동안 2일 마다 측정하고 방정식에 따라서 계산하였다: V= 0.5 × (폭² × 길이). 전이 실험을 위해서, sh-con 또는 shgC1qR A549 세포들(5 × 10⁵ 세포들 in 0.1 ml PBS)을 마우스의 꼬리 정맥(n=5)에 주사하였다. 마우스를 주사 후 28일째 희생하고 간 전이 foci의 수를 현미경 하에서 카운트하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

1. 보체결합(complement component) C1q에 대한 수용체인 gC1qR 단백질 또는 이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하되,
   상기 gC1qR 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 층상위족(lamellipodia) 형성을 위한 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 gC1qR 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 층상위족(lamellipodia) 형성을 위한 조성물.
4. 보체결합(complement component) C1q에 대한 수용체인 gC1qR 단백질 또는 이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하되,
   상기 gC1qR 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포 이동 및 세포 부착 유도용 조성물.
5. 삭제
6. 제 4항에 있어서, 상기 gC1qR 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 세포 이동 및 세포 부착 유도용 조성물.
7. 보체결합(complement component) C1q에 대한 수용체인 gC1qR 단백질 또는 이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하되,
   상기 gC1qR 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 암 전이 진단용 조성물.
8. 삭제
9. 제 7항에 있어서, 상기 gC1qR 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 암 전이 진단용 조성물.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 보체결합(complement component) C1q에 대한 수용체인 gC1qR 유전자에 대한 억제제로, 서열번호 2의 유전자로부터 전사되는 mRNA의 서열과 상보적인 염기서열을 갖고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 포함하는 암 치료용 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 상기 안티-센스 유전자는 서열번호 3 또는 4인 암 치료용 조성물.

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