CN110755620B - 一种结合met的靶基因在调控肿瘤转移和代谢中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种结合MET的靶基因在调控癌症转移和代谢中的应用，所述的结合MET的靶基因为EGFL9基因，其编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，应用该基因可以通过结合MET位点对肿瘤进展与代谢起到明显调控作用，为进一步临床诊疗和新型的靶向药物的研发提供理论和实验依据。

Description

一种结合MET的靶基因在调控肿瘤转移和代谢中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种结合MET的基因在调控肿瘤转移和代谢中的应用。

背景技术

MET也称c-Met或肝细胞生长因子受体，是一种酪氨酸激酶。MET及其配体广泛表达于各 种正常细胞以及上皮和间质起源的组织结构中。MET信号的激活在胚胎和正常人体中起到关 键的作用。上个世纪八十年代，MET首次作为癌基因在骨肉瘤细胞系中被科研人员发现。异 常激活MET信号通路主要由基因突变、重排、扩增和蛋白过表达，以及配体HGF导致的自分 泌和旁分泌环的形成。

研究证明表达异常上调的MET与罹患各类癌症患者的生存期呈负相关。由于酪氨酸激酶 受体家族中的共激活和致癌基因之间相互切换，尤其是MET与EGFR之间的串扰作用，是肿瘤 进展以及耐药的重要原因。活化的线粒体中的MET能够对MET抑制剂更加敏感。功能失调的 线粒体有助于癌症细胞的代谢重编程，通过增加葡萄糖的摄取和糖酵解以获得足够的能量维 持生长和增殖。另有研究认为肿瘤糖酵解在侵袭性肿瘤进展过程具有强大的生长优势。大量 的乳酸堆积导致过酸的肿瘤微环境，不仅能够破坏正常的临近细胞，而且通过降解细胞外基 质和促进血管生成完成癌细胞转移。

现有技术中MET抑制剂作为抗癌药物的研发及应用已在治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、食 道癌、前列腺癌、甲状腺癌等恶性肿瘤中广泛报道。MET抑制剂在最初使用时成效明显，但 后续治疗中单一药物治疗不可避免地会产生耐药。在靶向MET或其配体的药物临床前和临床 研究中，大型III期实验在不同试验人群中的显著失败结果凸显了急需了解耐药机制的重要 性。MET靶向药物的耐药多由MET蛋白自身过表达、结构突变以及激活EGFR信号通路所导致。 因此现有的MET抑制剂已经难以满足现有技术的需要。

表皮生长因子样结构域9型蛋白(EGF-like-domain，multiple 9，EGFL9)在细胞膜外含 有6个EGF重复序列、跨膜结构域以及细胞膜内的尾端。通过调节Notch信号通路调控脂肪 生成，转录因子KLF4能够在早期脂肪生成过程中直接与EFGL9启动子结合，并在IBMX的作 用下增加EGFL9的表达。EGFL9还可以负性调节软骨细胞的形成，在骨髓血管生成中起作用。 有研究认为EGF样蛋白与EGF具有相似的二级结构，从而产生部分共同的生物学特征。EGF 样因子通过与EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4跨膜酪氨酸激酶受体结合，触发大量的细胞内信 号级联反应，例如PI3K、MAPK和STAT通路的激活，参与细胞周期、增殖和发育过程的调节 等。目前，现有技术中没有任何EGFL9与MET之间具有相关性的报道，两者是否具有相关性， 且这种相关性是否能够应用到本领域中起到更大的作用，本领域技术人员均无法获知。

发明内容

针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人提供了一种结合MET的靶基因在调控癌症 转移和代谢中的应用，所述的结合MET的靶基因为EGFL9基因，其编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，应用该基因可以通过结合MET位点对 肿瘤进展与代谢起到明显调控作用，为进一步临床诊疗和新型的靶向药物的研发提供理论和 实验依据。

本发明的具体原理如下：

发明人首次通过使用磷酸化受体酪氨酸激酶阵列探查到EGFL9能够同时激活MET和EGFR 磷酸化水平，发现了EGFL9与MET、EGFR之间的显著相关性，通过荧光免疫共聚焦实验结果， 清楚显示了EGFL9与MET不仅大量聚集在乳腺癌细胞的细胞膜以及细胞核周围，而且与MET 呈现高度共定位关系，与EGFR仅为中度共定位。表明EGFL9激活MET磷酸化可能是通过结合 细胞膜和线粒体内MET导致的。进一步检测发现，异位表达EGFL9细胞的葡萄糖摄取量和乳 酸生成量亦明显增加。因此，EGFL9-MET的结合造成该下游信号通路激活和代谢功能紊乱诱 导了相关癌细胞的转移；两者之间的关系为正相关，也就是说EGFL9的过量表达会大量激活 MET磷酸化，从而影响到癌细胞的扩散，更为重要的是，发明人在研究中发现，通过调控EGFL9 的表达，除了影响MET磷酸化进程外，还通过MET-EGFR的通路，影响了EGFR磷酸化；然而， 反之通过EGFR-MET的通路时，则难以获得上述的效果，说明本申请所提供的EGFL9调控MET 进而同时调控MET和EGFR是一种单向的调控通路,反向是没有任何作用的，本领域技术人员 无法通过EGFR-MET来获得相应的效果。在此基础上，发明人进一步发现通过靶向EGFL9位点， 则可以实现对MET的调控作用，不仅能够影响MET和EGFR信号通路，同时还能对肿瘤细胞的 代谢重组产生重要影响，从而更优异地取代现有的MET抑制剂的地位，成为预防癌症相关转 移和代谢的新方向。

本发明所述的结合MET的靶基因为EGFL9基因，其编码区核苷酸序列如SEQ IDNO.1所 示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为了验证该基因与在MET之前的相互关系，并验证两者之间对于癌症肿瘤的转移和复发 之间的关系，发明人选择三阴性乳腺癌为典型研究对象，进行了如下的实验：

1.EGFL9在基底样和转移型乳腺癌细胞和乳腺癌组织中高表达

使用实时定量PCR检测人乳腺癌共14种细胞系(基底样细胞系7种，管腔样细胞系7种) 中表皮生长因子样结构域(EGFL)超家族成员EGFL1-9的表达情况，绘制热图。经过分析，红 色颜色越深代表该基因相对表达差异越明显。研究结果表明，仅EGFL9在基底样乳腺癌细胞 系中集中高表达(如附图1和2所示)，相比之下，EGFL2、EGFL5、EGFL6和EGFL7在管腔样 乳腺癌细胞系中表达相对较高；

接下来，在一组具有不同转移潜能的人乳腺癌细胞系中分别进行了PCR和免疫蛋白印迹 实验，在基因和蛋白表达水平上分别验证了这一实验结果。EGFL9在大部分为转移性的基底 样乳腺癌细胞系如SUM1315、MDA231、SUM159中高表达，而在大多数非转移或低转移细胞系 如MCF7、BT20中的表达较低(附图3A,B)。此外，在转移性的小鼠细胞系模型中EGFL9高表 达(附图3C,D)。

使用免疫组织化学的方法，研究分析了EGFL9在临床乳腺肿瘤样本中的表达以及与临床 病理特征的关系。发明人发现EGFL9的高表达可以在28％(7/25)的具有转移性乳腺肿瘤中 发现，相比之下，将近51.1％(23/45)没有转移的乳腺肿瘤中，EGFL9低表达(附表1-2)。通 过Cochran-Armitage趋势检验结果分析表明，随着EGFL9在组织芯片上染色强度的增加，转 移的概率增加(P＝0.021)(附图4-5)。低分化(Ⅲ级)肿瘤有呈现EGFL9染色强度增强的倾向 (P＝0.062)。

表1 EGFL9表达和乳腺癌临床病理分级的关系

表2 EGFL9表达和乳腺癌转移的关系

2.异位表达EGFL9影响体外乳腺癌细胞迁移和侵袭并增强糖酵解

在体外研究EGFL9肿瘤中的功能上，使用人乳腺上皮细胞系HMLE和小鼠乳腺上皮细胞 系EpRas建立了两个EGFL9高表达细胞模型。与对照组相比，在HMLE/EGFL9细胞增殖上并没 有显著差异(附图6A)，但是细胞迁移和侵袭能力显著增强(P＝0.001，P＝0.01)(附图6B)。类 似地，EGFL9在EpRas中的异位表达对细胞增殖没有影响(附图7A)，但可以导致细胞迁移增 加(P＝0.007)和细胞侵袭(P＝0.002)增强(附图7B)。

建立基于高度转移的小鼠细胞系4T1细胞系和人乳腺癌SUM159细胞系中的两个模型细 胞系。这两种细胞系通常用于乳腺肿瘤发生和转移的研究：

在4T1细胞中敲除EGFL9基因导致细胞迁移显著降低(shRNA2/空白对照＝48％，P＝0.01； shRNA3/空白对照＝48％，P＝0.01)和侵袭作用减弱(shRNA2/空白对照＝53％，P＝0.01；shRNA3/ 空白对照＝48％，P＝0.01)(附图8)；

在SUM159细胞中敲除EGFL9基因导致细胞迁移显著降低(shRNA2/空白对照＝48％， P＝0.015和shRNA3/空白对照＝48％，P＝0.01)和侵袭作用下降(shRNA2/空白对照＝53％， P＝0.017；shRNA3/空白对照＝48％，P＝0.01)(附图9)。

所有敲除模型细胞系的细胞增殖情况，模型细胞系与其对照组之间没有观察到显著差 异。

另外，可以观察到HMLE/EGFL9细胞的乳酸产量(1.58倍)和葡萄糖摄取量(1.51倍)明显 高于HMLE/LacZ细胞(附图10)，表明从氧化状态向糖酵解状态的生物能量转换。在SUM159 细胞中EGFL9的下调，导致乳酸产量下降(-40.8％和-27.1％)和葡萄糖摄取量下降(-80％和-40％) (附图11)。

3.EGFL9的过度表达和敲除影响体内乳腺癌远处转移

为了研究体内EGFL9对肿瘤生长和远处转移的影响，将含有空白对照或EGFL9基因过表 达载体的EpRas细胞注射到裸鼠乳腺中，对肿瘤生长情况进行测量，并在注射后第4周检查 肺的转移情况。观察到EGFL9过表达的EpRas细胞在生长状况方面没有显著优势。在肺转移 方面，使用H&E染色法对两组肺切片进行了染色分析。在注射过表达EGFL9的EpRas细胞的 小鼠5个肺切片中，转移性病变约占3-15％(P＝0.001)。在注射了空白对照LacZ的EpRas细 胞5只小鼠的肺切片中，只有一个病例在整个切片中显示了1％的肿瘤面积(附图12)。

进一步验证EGFL9在肿瘤生长和远处转移中的作用，将EGFL9敲除的4T1细胞及其空白 对照组4T1/NT细胞分别注射到BALB/c小鼠的皮下脂肪垫中。在小鼠接受手术后30天处死。 在处死前，使用MRI检查分析肿瘤大小和淋巴转移程度。我们发现两组之间的肿瘤大小相似。 此外，在用4T1/NT细胞空白对照移植的所有5只小鼠中，MRI检测到周围和腋窝淋巴结转移， 在注射4T1/EGFL9-sh3细胞的5只小鼠中未检测到周围和腋窝淋巴结转移(附图13)。最后， 移植4T1/NT的小鼠中有4只显示肺转移，而4T1/EGFL9-sh3的5只小鼠中只有一只在肺中显 示出肿瘤转移性病变(附图14)。

与体外结果类似，对照组的4T1细胞与EGFL9敲除组之间的肿瘤增殖和最终肿瘤大小没 有显著差异。然而，可以观察到注射了空白对照组4T1/NT细胞的肺切片中平均具有15％ (P＝0.002)的转移性损伤，而敲除EGFL9的4T1细胞的肺部切片平均仅显示出约5％的转移性 病变(附图15)。

4.EGFL9结合c-MET共同激活c-MET和EGFR磷酸化信号通路

在上述研究的基础上，发明人为了进一步验证EGFL9对下游信号通路特别是MET的影响。 选用磷酸化受体酪氨酸激酶抗体阵列研究HMLE/EGFL9及其对照组HMLE/LacZ细胞中共49个 受体酪氨酸激酶磷酸化的表达水平。标准化处理后，与HMLE/LacZ对照细胞相比，HMLE/EGFL9 细胞中EGFR和c-MET的磷酸化水平分别提高了1.4和6倍(附图16)，表明EGFL9高表达可 以特异性共同激活c-MET和EGFR的磷酸化信号通路。

使用Western Blot实验进一步证实了这一结果。并且在敲除EGFL9的SUM159细胞系中， 可以看到c-MET和EGFR磷酸化程度明显下降。在分析了EGFL9过度表达和敲除后几个重要 的细胞内信号通路的调节情况后，可以看到在HMLE细胞和SUM159细胞中FAK、AKT、ERK和 p38MAPK的磷酸化水平受到该基因的调控，SRC仅在EGFL9过表达时出现磷酸化的增多，但是 当EGFL9敲除后其磷酸化并没有发生变化(附图17)。EGFL9依赖的c-MET和EGFR磷酸化在 细胞膜上的变化，通过免疫荧光实验在HMLE和SUM159细胞模型进一步得到证实(附图18-19)。

5.EGFL9与MET在细胞膜和线粒体中相互结合并高度共定位

发明人为了进一步证实上述结论，研究EGFL9作为跨膜蛋白与膜受体c-MET和EGFR在 细胞膜上的位置关系。经倒置雷射扫描共轭焦点显微镜观察，EGFL9(绿色荧光)和c-MET(红 色荧光)在HMLE/EGFL9和SUM159细胞的细胞膜和细胞核周围位置上有共定位，呈现黄色色调 (附图20-21)。

根据蛋白临位分析软件的分析结果，EGFL9和c-MET共定位指数R和K1分别达到0.845 和0.885，说明两个蛋白之间存在高度共定位关系，提示存在相互作用。检测EGFL9和EGFR 在HMLE高表达EGFL9细胞膜位置上的关系时(附图22)，两者共定位指数R和K1分别为0.745 和0.665，说明EGFL9与EGFR仅存在中度共定位。

在HMLE/EGFL9细胞系中，使用免疫共沉淀技术验证EGFL9与MET蛋白之间相互结合能 力，结果可以观察到免疫沉淀MET时，EGFL9也被沉淀下来，反之亦然。说明蛋白MET和蛋白EGFL9存在相互作用(附图23)。

使用Mitotracker对线粒体进行染色，对细胞其他蛋白常规免疫荧光染色。检测到EGFL9 和cMET在HMLE/EGFL9细胞中的细胞核周围的线粒体中存在共定位情况(附图24)。进一步 对HMLE/EGFL9和SUM159细胞的细胞器组分进行分析，可以发现线粒体组分中p-cMET和EGFL9 的表达均优于细胞质组分。EGFL9高表达的HMLE/EGFL9以及SUM159/NT中MET和EGFL9的表 达水平明显高于对照组HMLE/LacZ及SUM159/sh细胞系。进一步验证了MET和EGFL9在线粒 体中的存在(附图25)。

6.抑制MET与EGFL9的相互关系研究，发现抑制MET对EGFL9的导致的信号通路激活与转移有直接关系，但是抑制EGFR则与EGFL9的导致的信号通路激活与转移效果并不明显

当使用JNJ38877605(MET抑制剂)和吉非替尼(EGFR抑制剂)分别处理HMLE过表达EGFL9 细胞时，可以显著降低MET和EGFR磷酸化。随着两个受体磷酸化程度的下降，FAK、ERK也 随之显著下降，而且这种下降是剂量依赖的(附图26)。

在具有强迁移侵袭能力的乳腺癌SUM159细胞系中，使用药物分别抑制MET和EGFR的情 况下，查看相应的MET和EGFR磷酸化水平变化，当药物抑制MET时，能够有效降低EGFR的 磷酸化；但抑制EGFR时，MET磷酸化的抑制效果并不明显(附图27)。阐明了MET和EGFR在EGFL9介导的信号通路中的调控关系，即EGFL9通过结合MET引发磷酸化MET和EGFR共同激活。使用MET抑制剂作用于HMLE高表达EGFL9细胞时，细胞迁移侵袭能力显著降低(附图28)，证明MET在MET-EGFR信号通路传导中的主导作用，表明靶向MET对肿瘤进展和转移中的重要影响。

综合上述各种验证实验可知，本申请所研究提供的一种结合MET的靶基因在调控癌症转 移和代谢中的应用，为进一步临床诊疗和新型的靶向药物的研发提供理论和实验依据，发明 人验证了EGFL9是影响MET的关键因素，可以通过调控EGFL9的方式对重要的致癌基因MET 产生影响。通过抑制EGFL9来实现对MET的抑制，同时还进一步抑制EGFR信号通路的异常激 活。实现了更为有效的抑制肿瘤转移复发和代谢重组的路径，较目前现有单纯MET抑制剂或 组合双靶抑制剂具有更为广泛的应用前景。

现有技术中有且仅有一篇文章记载了特异性抑制肝癌细胞中EGFL9基因的表达，从而实 现抑制肝癌细胞侵袭转移的作用，进一步验证了本发明中EGFL9对恶行肿瘤的重要作用，然 而前者并没有对具体的转移现象做出机制上的解释，难以将其更好的推广和应用。本发明不 仅发现了EGFL9与致癌基因MET之间具有重要相关性，而且将促进转移基因及其信号通路与 肿瘤代谢重编程联系起来，具有更好的推广和应用前景。

而发明人通过本申请的上述实验，首次验证了EGFL9是影响MET的关键因素，是影响癌 症转移和复发的主要原因所在，证实了通过结合MET的方式产生相应的影响。与现有技术相 比，从根本上解释了EGFL9的作用机理，可以将其应用到与MET相关的各种恶性肿瘤的预防 和治疗当中，同时还可以通过EGFL9的过表达，来构建MET异常表达的动物模型，为研究恶 性肿瘤的转移和复发提供更加有力的支持。

同时通过上述研究发现，EGFL9在影响MET的同时还进一步影响了EGFR，实现了更为有 效的抑制肿瘤转移与复发的路径，较之现有单纯MET抑制剂具有更为广泛的应用前景；本发 明通过三阴性乳腺癌验证了上述的机理，也与上述现有技术中的相关发现相符合，解释了现 有技术中未能解答的相关问题。将促进转移基因及其信号通路与肿瘤转移复发和代谢重编程 联系起来，为其他恶性肿瘤的预防和治疗提供了一个全新的途径。

附图说明

图1为EGFL1-9在乳腺癌细胞系中基因表达情况示意图；

图2为图1的彩色示意图，

图中由左至右SUM1315到MDA157为基底样细胞系，MDA361到SUM52为管腔样细胞系；

图3为EGFL9在人乳腺细胞系和转移性小鼠细胞系中表达情况示意图，

图中(A)(B)为EGFL9在人乳腺癌细胞系中PCR和蛋白表达情况；(C)(D)为EGFL9在小 鼠乳腺癌细胞系中PCR和蛋白表达情况；

图4为组织芯片上EGFL9染色强度的增加与转移率之间关系的示意图；

图中内容显示随组织芯片上EGFL9染色强度的增加而转移率增加；

图5为典型EGFL9染色强度分类示意图；

图中0表示无染色；1表示低度染色；2表示中度染色；3表示高度染色，结果证明，EGFL9 的高表达与转移进展性乳腺癌密切相关；

图6为EGFL9高表达对HMLE细胞增殖和转移的影响示意图，

图7为EGFL9高表达对EpRas细胞增殖和转移的影响示意图，

图8为EGFL9敲除对4T1细胞增殖和转移的影响示意图，

图9为EGFL9敲除对SUM159细胞增殖和转移的影响示意图，

图10为EGFL9过表达模型中乳酸产量和葡萄糖摄取量示意图，

可见EGFL9过表达模型中乳酸产量和葡萄糖摄取明显高于对照组；

图11为乳腺癌细胞系SUM159敲除EGFL9细胞中乳酸产量和葡萄糖摄取示意图，

可见乳腺癌细胞系SUM159敲除EGFL9细胞中乳酸产量和葡萄糖摄取明显低于对照组；

图12为EGFL9过表达的EpRas细胞导致体内肿瘤肺转移面积示意图，

图13为EGFL9敲除导致乳腺肿瘤向周围和腋窝淋巴结转移显著降低示意图，

图中箭头标记位置为转移处，证明敲除EGFL9后并未导致乳腺肿瘤向周围和腋窝淋巴结 转移；

图14为EGFL9敲除导致乳腺肿瘤向肺部转移显著降低示意图，

深色箭头标记处为肺转移，证EGFL9敲除仅导致一只受试动物乳腺肿瘤向肺部转移，转 移率明显低于未敲除的试验组；

图15为EGFL9敲除的4T1细胞导致体内肿瘤肺转移面积示意图，

图16为EGFL9高表达同时激活c-MET和EGFR磷酸化情况示意图，

图17为EGFL9过度表达和敲除对细胞内信号通路的调节情况示意图，

图18为磷酸化c-MET在HMLE和SUM159细胞膜上表达情况示意图，放大倍数×40，

图18-1为图18的彩色示意图；

图19为磷酸化EGFR在HMLE和SUM159细胞膜上表达情况情况示意图，放大倍数×20，

图19-1为图19的彩色示意图；

图20为EGFL9(绿色荧光)与c-MET(红色荧光)在HMLE/EGFL9细胞膜位置上共定位关系 示意图，

图中箭头标记位置为共定位，放大倍数×63，

图20-1为图20的彩色示意图；

图21为EGFL9(绿色荧光)与c-MET(红色荧光)在SUM159细胞膜位置上共定位关系示意 图，

图中箭头标记位置为共定位，放大倍数×63，

图21-1为图21的彩色示意图；

图22为EGFL9与EGFR在HMLE/EGFL9细胞膜位置上共定位关系检测结果示意图，

图中可见EGFL9(绿色荧光)与EGFR(红色荧光)在HMLE/EGFL9细胞膜位置上共定位关系 (箭头标记处)，放大倍数×40；

图22-1为图22的彩色示意图；

图23为HMLE/EGFL9细胞中EGFL9与cMET的相互作用示意图，

左图中免疫沉淀用抗v5抗体，免疫印迹用cMET抗体；右图中免疫沉淀用抗cMET抗体， 免疫印迹用v5抗体；

图24为EGFL9-MET在HMLE/EGFL9细胞线粒体中的共定位关系示意图，

线粒体用远红荧光染料进行染色，放大倍数×63；

图24-1为图24的彩色示意图；

图25为EGFL9-MET在异位表达EGFL9细胞的线粒体中共定位关系图，

由图可知，分别在(A)HMLE/EGFL9细胞以及(B)SUM159细胞的胞质和线粒体组分中检测 到EGFL9和MET的含量；

图26为药物对HMLE/EGFL9导致的信号通路激活作用示意图，

可知药物对HMLE/EGFL9导致的信号通路激活有抑制作用，

图27为SUM159细胞中c-MET和EGFR在EGFL9介导的信号通路中的调控关系示意图；

图28为药物抑制c-MET与HMLE/EGFL9的细胞转移能力关系示意图，

由图可知药物抑制c-MET能够降低HMLE/EGFL9的细胞转移能力。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。应理解，这些实施例仅为 了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。实施例中所采用的具体技术均为本领域的 常规技术，所采用的生物材料均为发明人在研究过程中从正规途径和合法渠道获得的已知生 物材料，发明人列举相关技术如下：但是其他未被列入的具体技术也均为已知技术，发明人 不再赘述。

构建表达载体、干扰载体并建立稳定细胞模型

(1)全长EGFL9质粒购自Open Biosystems公司。将EGFL9基因克隆到pEntry载体进行 扩增，然后重组入pLenti-6表达载体中。从Open Biosystems公司购买一组5个shRNA用于 EGFL9干扰载体构建。使用慢病毒表达系统(Invitrogen公司)和Trans-Lentiviral包装系统 (Open Biosystems公司)在细胞中进行病毒的包装，产生EGFL9的shRNA慢病毒载体。

(2)将构建好的载体转染入靶细胞，用10μg/ml杀稻瘟菌素处理过表达细胞系，用12μ g/ml嘌呤霉素(Puromycin，Invivogen公司)处理干扰细胞系，20天后筛选出高表达或干扰 EGFL9基因的稳定细胞系。

细胞培养

(1)大部分人类和鼠乳腺癌细胞系通过美国ATCC公司(American Type CultureCollection)获得并对其相关遗传学分析鉴定。所有的细胞系生长培养条件按照ATCC的推荐 步骤进行。

(2)小鼠乳腺上皮细胞系EpRas和人乳腺上皮细胞系HMLE取自麻省理工学院的Robert A.Weinberg实验室。细胞系鉴定是通过与两株细胞系原始形态和生长特性进行对比，使用PCR 技术验证EpRas细胞系中HA-Ras癌基因以及HMLE细胞系的SV40大T抗原和端粒酶催化亚基。

(3)EpRas细胞维持生长在DMEM培养基，加入8％FBS和500μg/ml G418中。HMLE细胞维持在相同的培养条件下生长。DMEM：HAMF12(Invitrogen公司)比例为1：1混合，加入10％FBS、 100U/ml青霉素-链霉素、2mM谷氨酰胺(Invitrogen公司)、10ng/ml人表皮生长因子(PromoCell公司)、0.5□g/ml氢化可的松(Sigma公司)以及10□g/ml胰岛素(Sigma公司)。小鼠转移性乳腺癌细胞系4T1在KCI肿瘤研究中心获得。这些4T1细胞培养在含有5％FBS、5％水仙环素、NEAA细胞培养添加物(Non-essential amino acids，NEAA)和100U/ml青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中。

药物处理

(1)使用不同剂量的JNJ38877605(c-MET抑制剂，Selleckchem公司)或吉非替尼(EGFR抑 制剂，Cellagen Technology公司)按照浓度梯度(JNJ38877605用量为0、50、250和500nM， 吉非替尼用量为0、2.5、5和10μM)对细胞进行处理。使用预置RIPA缓冲液(ThermoScientific公司)收集细胞的蛋白裂解物，并进行后续Western Blot实验。

(2)在检测高表达EGFL9细胞系的肿瘤干性特征实验中，250nM和500nM的JNJ38877605 抑制剂和10μM的吉非替尼抑制剂用于处理细胞。并进行后续迁移侵袭实验、流式细胞术分 析检测和干细胞成球实验。

蛋白质免疫印迹实验、磷酸化RTK抗体芯片检测和组织微阵列实验

(1)蛋白质免疫印迹实验。将实验所用细胞加入预置裂解液RIPA：PMSF：蛋白酶抑制剂 (Thermo Scientific公司，产品号78411B)，比例为100：1：1。共30到50μg的蛋白质样品依次使用6％-10％Tris-Bis凝胶(Bio-Rad Laboratories公司)分离后转移到硝酸纤维素 膜(Bio-Rad Laboratories公司)上。使用抗体对相应蛋白表达量进行检测：p-cMET、c-MET、 p-EGFR、EGFR、p-FAK^T925、FAK、p-SRC、SRC、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK1/2、p-p38MAPK、p38MAPK(Cell Signaling公司)、EGFL9(Proteintech公司)、Sox2(Cell Signaling公司)、Oct4(Proteintech 公司)、Nanog(Cell Signaling公司)和β-actin(SantaCruzBiotechnology公司)抗体。

(2)磷酸化RTK抗体芯片检测。试剂盒购自R&D公司(产品号ARY001B)，共含有49个磷 酸化RTK抗体。按照产品使用说明，将抗体芯片与300μg全细胞裂解物一起置于4℃振荡孵 育过夜，使用提供的洗涤缓冲液冲洗后，与抗磷酸酪氨酸-HRP抗体在摇床上共同孵育2小时。 加入化学发光试剂，用Bio-Rad凝胶成像分析仪扫描抗体芯片。图像结果用Image J软件定 量分析。

(3)乳腺癌组织微阵列(Tissue microarray，Richmond公司)实验。将乳腺组织共计150 个标本位点包括5个正常组织对照和70个多类型癌变组织进行免疫组织化学染色(IHC)测定。 EGFL9抗体购自Abnova公司，工作稀释浓度为1：100。

RNA提取、cDNA合成和实时定量PCR检测

(1)选取对数生长期的稳定细胞系，使用Trizol试剂提取总RNA，Nanodrop2000检测RNA 质量，OD比值在1.8-2.0之间视为合格。

(2)用Superscript First Strand试剂盒(Invitrogen公司)合成第一链cDNA。按照配 置体系1μg总RNA、1μl引物，10mM dNTP混合物加水至总体积10μl混合均匀，在65℃水浴锅中孵育5分钟后取出放在冰上至少1分钟。按照产品说明书要求的体系，配置cDNA合成所需要的混合物，并将10μl的cDNA合成混合物加到每一管RNA/引物混合物中轻柔混合均匀，简单离心后将产品按照50℃下50分钟，85℃下5分钟的反应流程孵育后，放置在冰上。简单离心后，向每试管反应物中加入1μl的RNA酶，放在37℃水浴锅中孵育20分钟，-20 ℃保存。

(3)使用cDNA做实时定量RT-PCR扩增模版，按照SYBR Green试剂盒(AppliedBiosystem 公司)使用说明，依次加入DEPC水、引物、dNTP混合物以及模版进行实时定量PCR。使用GAPDH 组作为内部参照。

细胞增殖测定、体外迁移和侵袭测定

对于细胞增殖测定，第0天在96孔板中以每孔2.5×10³的密度接种细胞。接下来第1、 3、5和7天同一时段，按照MTT试剂(Fisher Scientific公司)说明加入MTT溶液，4h后加入DMSO充分溶解蓝紫色结晶，置于酶标仪上检测540nm波长下的吸光度值。体外迁移和侵袭实验则按照预置Matrigel的小室(Corning公司)使用说明，铺置3000个细胞，24h后使用HEMA-3染色液和固定剂试剂盒(Fischer Scientific公司)染色固定，置于倒置光学显微镜下 观察计数。每孔选取4个不同视野计数细胞取平均值。

免疫荧光染色和激光共聚焦实验(Confocal Microscope)

将细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，0.1％Triton X-100通透15分钟，5％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)封闭1h后，室温孵育目的抗体1h，PBS冲洗3次， 每次5分钟。分别加入荧光二抗(Thermo Fisher公司，产品号11008，11012)室温孵育1h， PBS漂洗3次，每次5分钟。DAPI染核10分钟后，封片。利用Zeiss LSM 510META NLO 倒置雷射扫描共轭焦点显微镜进行观察与分析。

免疫共沉淀

加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min,细胞裂解液于4℃，最 大转速离心30min后取上清。取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜。取10μl的protein A琼脂糖珠， 用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min。将预处理过的10μl的protein A琼 脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2h，使抗体与protein A琼 脂糖珠偶连。免疫沉淀反应后，在4℃以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管 底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS上 样缓冲液，沸水煮5min。行Western blotting分析。

线粒体蛋白制备与检测

采用线粒体/胞液分馏试剂盒提取分离细胞核。按照实验步骤，收集细胞质和线粒体组分。 采用Bradford法测定各组分的蛋白浓度。将每个细胞系的每个片段中约20μg的蛋白电转移 到PVDF膜上。以β-actin作为细胞质对照，以细胞色素C作为线粒体片段对照。分别检测 pMET、MET和EGFL9在细胞质和线粒体中的表达。

乳酸生产分析

用糖酵解细胞检测试剂盒分析乳酸水平。简单地说，在96孔中培养了1万个HMLE/LacZ 或HMLE/EGFL9细胞。次日，离心5min，取各孔上清10μl，加入实验板，室温下与糖酵解底 物及辅助因子共孵育30min。测量490nm处的吸光度，并根据标准曲线定量乳酸生成。

葡萄糖吸收的分析

用试剂盒测定葡萄糖浓度。简单地说，每个细胞系大约2×105个细胞被播种到一个24 孔板的孔中。每口井的培养基在给定的时间点收集，稀释200倍。在96孔板中加入50μl稀 释后的培养基。将100μM Amplex Red试剂、0.2U/ml HRP和2U/ml葡萄糖氧化酶分别加入50μl的工作液中。在室温下孵育30min，用平板阅读器记录560nm处的吸光度。根据标 准曲线计算各样品的葡萄糖浓度。初始培养基与每个样品的葡萄糖浓度之差为每个实验样品的葡萄糖摄入量。

体内肿瘤生长转移测定

将100μl的PBS重悬2×10⁵个EpRas肿瘤细胞注射到五周龄雌性NCr Nu/Nu裸鼠的乳腺 中(Taconics公司)。将50μl的2×10⁴的4T1肿瘤细胞注射到五周龄雌性BALB/c小鼠的乳 腺中(The Jackson Laboratory公司)。在肿瘤细胞注射后第四周处死小鼠，取出乳房肿瘤和 小鼠肺部，用10％福尔马林固定，包埋在石蜡块中。使用标准H&E组织免疫染色检测肿瘤转 移和目的基因的表达情况。所有的动物实验均已取得KCI肿瘤研究中心实验动物伦理委员会 的许可。

体内磁共振成像(MRI)实验

处死小鼠前以1.5％异氟烷/空气(v/v)持续麻醉小鼠，并在MRI扫描期间将小鼠的体温 控制在37℃。将小鼠在7T 60-mm垂直孔显微成像系统中，使用单匝螺旋管射频(RadioFrequency，RF)表面线圈(ClinicalSpin，Bruker)中拍照成像。对于原发肿瘤，冠状位脂肪抑制T2加权成像序列(TR/TE＝2200msec/32ms，18切片，切片厚度＝1mm，无间隙，图像矩 阵大小＝256×256，视场角(Field of view，FOV)＝35×30mm，平均脉冲重复激发次数(Number of excitation，NEX)＝2次)。为了检测肺转移，采用轴位和冠状位脂肪抑制T2加权成像序 列(TR/TE＝3200msec/26ms，18-32切片，切片厚度＝0.8mm，无间隙，图像矩阵大小＝192×192， FOV＝36×28mm，平均NEX＝8次)。总的成像时间是10分钟。成像结束后，对原发肿瘤、肿瘤 肺及周边淋巴转移数量的肿瘤信号变化进行独立评估。

统计分析

采用学生t检验和单因素方差分析，对细胞生长、克隆形成、细胞迁移侵袭、肿瘤生成 和肿瘤转移结果进行统计。采用双侧Cochran-Armitage趋势检验对TMA芯片中EGFL9组织 免疫染色强度的线性趋势进行分析。置信区间为95％，当P值小于0.05时，认为数据差异具 有统计学意义。

在上述具体技术方案的支持下，发明人进行了如下的实施例操作：

实施例1 EGFL9在基底样和转移型乳腺癌细胞和乳腺癌组织中高表达

使用实时定量PCR检测人乳腺癌共14种细胞系(基底样细胞系7种，管腔样细胞系7种) 中表皮生长因子样结构域(EGFL)超家族成员EGFL1-9的表达情况，绘制热图。经过分析，红 色颜色越深代表该基因相对表达差异越明显。研究结果表明，仅EGFL9在基底样乳腺癌细胞 系中集中高表达(如附图1和2所示)，相比之下，EGFL2、EGFL5、EGFL6和EGFL7在管腔样 乳腺癌细胞系中表达相对较高；

接下来，在一组具有不同转移潜能的人乳腺癌细胞系中分别进行了PCR和免疫蛋白印迹 实验，在基因和蛋白表达水平上分别验证了这一实验结果。EGFL9在大部分为转移性的基底 样乳腺癌细胞系如SUM1315、MDA231、SUM159中高表达，而在大多数非转移或低转移细胞系 如MCF7、BT20中的表达较低(附图3A,B)。此外，在转移性的小鼠细胞系模型中EGFL9高表 达(附图3C,D)。

使用免疫组织化学的方法，研究分析了EGFL9在临床乳腺肿瘤样本中的表达以及与临床 病理特征的关系。发明人发现EGFL9的高表达可以在28％(7/25)的具有转移性乳腺肿瘤中 发现，相比之下，将近51.1％(23/45)没有转移的乳腺肿瘤中，EGFL9低表达(附表1-2)。通 过Cochran-Armitage趋势检验结果分析表明，随着EGFL9在组织芯片上染色强度的增加，转 移的概率增加(P＝0.021)(附图4-5)。低分化(Ⅲ级)肿瘤有呈现EGFL9染色强度增强的倾向 (P＝0.062)。

表1 EGFL9表达和乳腺癌临床病理分级的关系

表2 EGFL9表达和乳腺癌转移的关系

实施例2异位表达EGFL9影响体外乳腺癌细胞迁移和侵袭并增强糖酵解

在体外研究EGFL9肿瘤中的功能上，使用人乳腺上皮细胞系HMLE和小鼠乳腺上皮细胞 系EpRas建立了两个EGFL9高表达细胞模型。与对照组相比，在HMLE/EGFL9细胞增殖上并没 有显著差异(附图6A)，但是细胞迁移和侵袭能力显著增强(P＝0.001，P＝0.01)(附图6B)。类 似地，EGFL9在EpRas中的异位表达对细胞增殖没有影响(附图7A)，但可以导致细胞迁移增 加(P＝0.007)和细胞侵袭(P＝0.002)增强(附图7B)。

建立基于高度转移的小鼠细胞系4T1细胞系和人乳腺癌SUM159细胞系中的两个模型细 胞系。这两种细胞系通常用于乳腺肿瘤发生和转移的研究：

在4T1细胞中敲除EGFL9基因导致细胞迁移显著降低(shRNA2/空白对照＝48％，P＝0.01； shRNA3/空白对照＝48％，P＝0.01)和侵袭作用减弱(shRNA2/空白对照＝53％，P＝0.01；shRNA3/ 空白对照＝48％，P＝0.01)(附图8)；

在SUM159细胞中敲除EGFL9基因导致细胞迁移显著降低(shRNA2/空白对照＝48％， P＝0.015和shRNA3/空白对照＝48％，P＝0.01)和侵袭作用下降(shRNA2/空白对照＝53％， P＝0.017；shRNA3/空白对照＝48％，P＝0.01)(附图9)。

所有敲除模型细胞系的细胞增殖情况，模型细胞系与其对照组之间没有观察到显著差 异。

另外，可以观察到HMLE/EGFL9细胞的乳酸产量(1.58倍)和葡萄糖摄取量(1.51倍)明显 高于HMLE/LacZ细胞(附图10)，表明从氧化状态向糖酵解状态的生物能量转换。在SUM159 细胞中EGFL9的下调，导致乳酸产量下降(-40.8％和-27.1％)和葡萄糖摄取量下降(-80％和-40％) (附图11)。

实施例3 EGFL9的过度表达和敲除影响体内乳腺癌远处转移

为了研究体内EGFL9对肿瘤生长和远处转移的影响，将含有空白对照或EGFL9基因过表 达载体的EpRas细胞注射到裸鼠乳腺中，对肿瘤生长情况进行测量，并在注射后第4周检查 肺的转移情况。观察到EGFL9过表达的EpRas细胞在生长状况方面没有显著优势。在肺转移 方面，使用H&E染色法对两组肺切片进行了染色分析。在注射过表达EGFL9的EpRas细胞的 小鼠5个肺切片中，转移性病变约占3-15％(P＝0.001)。在注射了空白对照LacZ的EpRas细 胞5只小鼠的肺切片中，只有一个病例在整个切片中显示了1％的肿瘤面积(附图12)。

进一步验证EGFL9在肿瘤生长和远处转移中的作用，将EGFL9敲除的4T1细胞及其空白 对照组4T1/NT细胞分别注射到BALB/c小鼠的皮下脂肪垫中。在小鼠接受手术后30天处死。 在处死前，使用MRI检查分析肿瘤大小和淋巴转移程度。我们发现两组之间的肿瘤大小相似。 此外，在用4T1/NT细胞空白对照移植的所有5只小鼠中，MRI检测到周围和腋窝淋巴结转移， 在注射4T1/EGFL9-sh3细胞的5只小鼠中未检测到周围和腋窝淋巴结转移(附图13)。最后， 移植4T1/NT的小鼠中有4只显示肺转移，而4T1/EGFL9-sh3的5只小鼠中只有一只在肺中显 示出肿瘤转移性病变(附图14)。

与体外结果类似，对照组的4T1细胞与EGFL9敲除组之间的肿瘤增殖和最终肿瘤大小没 有显著差异。然而，可以观察到注射了空白对照组4T1/NT细胞的肺切片中平均具有15％ (P＝0.002)的转移性损伤，而敲除EGFL9的4T1细胞的肺部切片平均仅显示出约5％的转移性 病变(附图15)。

实施例4 EGFL9结合c-MET共同激活c-MET和EGFR磷酸化信号通路

在上述研究的基础上，发明人为了进一步验证EGFL9对下游信号通路特别是MET的影响， 选用磷酸化受体酪氨酸激酶抗体阵列研究HMLE/EGFL9及其对照组HMLE/LacZ细胞中共49个 受体酪氨酸激酶磷酸化的表达水平。标准化处理后，与HMLE/LacZ对照细胞相比，HMLE/EGFL9 细胞中EGFR和c-MET的磷酸化水平分别提高了1.4和6倍(附图16)，表明EGFL9高表达可 以特异性共同激活c-MET和EGFR的磷酸化信号通路。

使用Western Blot实验进一步证实了这一结果。并且在敲除EGFL9的SUM159细胞系中， 可以看到c-MET和EGFR磷酸化程度明显下降。在分析了EGFL9过度表达和敲除后几个重要 的细胞内信号通路的调节情况后，可以看到在HMLE细胞和SUM159细胞中FAK、AKT、ERK和 p38MAPK的磷酸化水平受到该基因的调控，SRC仅在EGFL9过表达时出现磷酸化的增多，但是 当EGFL9敲除后其磷酸化并没有发生变化(附图17)。EGFL9依赖的c-MET和EGFR磷酸化在 细胞膜上的变化，通过免疫荧光实验在HMLE和SUM159细胞模型进一步得到证实(附图18-19)。

实施例5 EGFL9与MET在细胞膜和线粒体中相互结合并高度共定位

发明人为了进一步证实上述结论，研究EGFL9作为跨膜蛋白与膜受体c-MET和EGFR在 细胞膜上的位置关系。经倒置雷射扫描共轭焦点显微镜观察，EGFL9(绿色荧光)和c-MET(红 色荧光)在HMLE/EGFL9和SUM159细胞的细胞膜和细胞核周围位置上有共定位，呈现黄色色调 (附图20-21)。

根据蛋白临位分析软件的分析结果，EGFL9和c-MET共定位指数R和K1分别达到0.845 和0.885，说明两个蛋白之间存在高度共定位关系，提示存在相互作用。检测EGFL9和EGFR 在HMLE高表达EGFL9细胞膜位置上的关系时(附图22)，两者共定位指数R和K1分别为0.745 和0.665，说明EGFL9与EGFR仅存在中度共定位。

在HMLE/EGFL9细胞系中，使用免疫共沉淀技术验证EGFL9与MET蛋白之间相互结合能 力，结果可以观察到免疫沉淀MET时，EGFL9也被沉淀下来，反之亦然。说明蛋白MET和蛋白EGFL9存在相互作用(附图23)。

使用Mitotracker对线粒体进行染色，对细胞其他蛋白常规免疫荧光染色。检测到EGFL9 和cMET在HMLE/EGFL9细胞中的细胞核周围的线粒体中存在共定位情况(附图24)。进一步 对HMLE/EGFL9和SUM159细胞的细胞器组分进行分析，可以发现线粒体组分中p-cMET和EGFL9 的表达均优于细胞质组分。HMLE/EGFL9以及SUM159/NT中MET和EGFL9的表达水平明显高于 对照组HMLE/LacZ及SUM159/sh细胞系。进一步验证了MET和EGFL9在线粒体中的存在(附 图25)。

实施例6抑制MET与EGFL9的相互关系研究，发现抑制MET对EGFL9的导致的信号通路激活与转移有直接关系，但是抑制EGFR则与EGFL9的导致的信号通路激活与转移效果并不明显

当使用JNJ38877605(MET抑制剂)和吉非替尼(EGFR抑制剂)分别处理HMLE过表达EGFL9 细胞时，可以显著降低MET和EGFR磷酸化。随着两个受体磷酸化程度的下降，FAK、ERK也 随之显著下降，而且这种下降是剂量依赖的(附图26)。

在具有强迁移侵袭能力的乳腺癌SUM159细胞系中，使用药物分别抑制MET和EGFR的情 况下，查看相应的MET和EGFR磷酸化水平变化，当药物抑制MET时，能够有效降低EGFR的 磷酸化；但抑制EGFR时，MET磷酸化的抑制效果并不明显(附图27)。阐明了MET和EGFR在EGFL9介导的信号通路中的调控关系，即EGFL9通过结合MET引发磷酸化MET和EGFR共同激活。使用MET抑制剂作用于HMLE高表达EGFL9细胞时，细胞迁移侵袭能力显著降低(附图28)。说明结合MET是EGFL9导致肿瘤转移的重要位点。

综上本申请首次验证了EGFL9是影响MET的关键因素，是影响癌症转移和复发的主要原 因所在，证实了通过结合MET的方式产生相应的影响。与现有技术相比，从根本上解释了EGFL9 的作用机理，可以将其应用到与MET相关的各种恶性肿瘤的预防和治疗当中，同时还可以通 过EGFL9的过表达，来构建MET异常表达的动物模型，为研究恶性肿瘤的转移和复发提供更 加有力的支持。同时通过上述研究发现，EGFL9在影响MET的同时还进一步影响了EGFR，实 现了更为有效的抑制肿瘤转移与复发的路径，较之现有单纯MET抑制剂或双靶抑制剂具有更 为广泛的应用前景；本发明通过三阴性乳腺癌验证了上述的机理，也与上述现有技术中的相 关发现相符合，解释了现有技术中未能解答的相关问题。将促进转移基因及其信号通路与肿 瘤转移复发和代谢重编程联系起来，为其他恶性肿瘤的预防和治疗提供了一个全新的途径。

序列表

<110> 山东大学齐鲁医院

<120> 一种结合MET的靶基因在调控癌症转移和代谢中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atgcccagcg gctgccgctg cctgcatctc gtgtgcctgt tgtgcattct gggggctccc 60

ggtcagcctg tccgagccga tgactgcagc tcccactgtg acctggccca cggctgctgt 120

gcacctgacg gctcctgcag gtgtgacccg ggctgggagg ggctgcactg tgagcgctgt 180

gtgaggatgc ctggctgcca gcacggtacc tgccaccagc catggcagtg catctgccac 240

agtggctggg caggcaagtt ctgtgacaaa gatgaacata tctgtaccac gcagtccccc 300

tgccagaatg gaggccagtg catgtatgac gggggcggtg agtaccattg tgtgtgctta 360

ccaggcttcc atgggcgtga ctgcgagcgc aaggctggac cctgtgaaca ggcaggctcc 420

ccatgccgca atggcgggca gtgccaggac gaccagggct ttgctctcaa cttcacgtgc 480

cgctgcttgg tgggctttgt gggtgcccgc tgtgaggtaa atgtggatga ctgcctgatg 540

cggccttgtg ctaacggtgc cacctgcctt gacggcataa accgcttctc ctgcctctgt 600

cctgagggct ttgctggacg cttctgcacc atcaacctgg atgactgtgc cagccgccca 660

tgccagagag gggcccgctg tcgggaccgt gtccacgact tcgactgcct ctgccccagt 720

ggctatggtg gcaagacctg tgagcttgtc ttacctgtcc cagacccccc aaccacagtg 780

gacacccctc tagggcccac ctcagctgta gtggtacctg ccacggggcc agccccccac 840

agcgcagggg ctggtctgct gcggatctca gtgaaggagg tggtgcggag gcaagaggct 900

gggctaggtg agcctagctt ggtggccctg gtggtgtttg gggccctcac tgctgccctg 960

gttctggcta ctgtgttgct gaccctgagg gcctggcgcc ggggtgtctg cccccctgga 1020

ccctgttgct accctgcccc acactatgct ccagcgtgcc aggaccagga gtgtcaggtt 1080

agcatgctgc cagcagggct ccccctgcca cgtgacttgc cccctgagcc tggaaagacc 1140

acagcactg 1149

<210> 2

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Pro Ser Gly Cys Arg Cys Leu His Leu Val Cys Leu Leu Cys Ile

1 5 10 15

Leu Gly Ala Pro Gly Gln Pro Val Arg Ala Asp Asp Cys Ser Ser His

20 25 30

Cys Asp Leu Ala His Gly Cys Cys Ala Pro Asp Gly Ser Cys Arg Cys

35 40 45

Asp Pro Gly Trp Glu Gly Leu His Cys Glu Arg Cys Val Arg Met Pro

50 55 60

Gly Cys Gln His Gly Thr Cys His Gln Pro Trp Gln Cys Ile Cys His

65 70 75 80

Ser Gly Trp Ala Gly Lys Phe Cys Asp Lys Asp Glu His Ile Cys Thr

85 90 95

Thr Gln Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Gln Cys Met Tyr Asp Gly Gly

100 105 110

Gly Glu Tyr His Cys Val Cys Leu Pro Gly Phe His Gly Arg Asp Cys

115 120 125

Glu Arg Lys Ala Gly Pro Cys Glu Gln Ala Gly Ser Pro Cys Arg Asn

130 135 140

Gly Gly Gln Cys Gln Asp Asp Gln Gly Phe Ala Leu Asn Phe Thr Cys

145 150 155 160

Arg Cys Leu Val Gly Phe Val Gly Ala Arg Cys Glu Val Asn Val Asp

165 170 175

Asp Cys Leu Met Arg Pro Cys Ala Asn Gly Ala Thr Cys Leu Asp Gly

180 185 190

Ile Asn Arg Phe Ser Cys Leu Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Arg Phe

195 200 205

Cys Thr Ile Asn Leu Asp Asp Cys Ala Ser Arg Pro Cys Gln Arg Gly

210 215 220

Ala Arg Cys Arg Asp Arg Val His Asp Phe Asp Cys Leu Cys Pro Ser

225 230 235 240

Gly Tyr Gly Gly Lys Thr Cys Glu Leu Val Leu Pro Val Pro Asp Pro

245 250 255

Pro Thr Thr Val Asp Thr Pro Leu Gly Pro Thr Ser Ala Val Val Val

260 265 270

Pro Ala Thr Gly Pro Ala Pro His Ser Ala Gly Ala Gly Leu Leu Arg

275 280 285

Ile Ser Val Lys Glu Val Val Arg Arg Gln Glu Ala Gly Leu Gly Glu

290 295 300

Pro Ser Leu Val Ala Leu Val Val Phe Gly Ala Leu Thr Ala Ala Leu

305 310 315 320

Val Leu Ala Thr Val Leu Leu Thr Leu Arg Ala Trp Arg Arg Gly Val

325 330 335

Cys Pro Pro Gly Pro Cys Cys Tyr Pro Ala Pro His Tyr Ala Pro Ala

340 345 350

Cys Gln Asp Gln Glu Cys Gln Val Ser Met Leu Pro Ala Gly Leu Pro

355 360 365

Leu Pro Arg Asp Leu Pro Pro Glu Pro Gly Lys Thr Thr Ala Leu

370 375 380

Claims (1)

1.抑制EGFL9表达的shRNA在制备治疗三阴性乳腺癌转移和代谢药物中的应用。

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