KR20080018149A

KR20080018149A - 담도암 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 담도암의성장, 전이 억제 및 치료 방법

Info

Publication number: KR20080018149A
Application number: KR1020070084868A
Authority: KR
Inventors: 홍효정; 이중회; 김진만; 손연성; 이응석
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-08-23
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2008-02-27
Also published as: US20100196350A1; AU2007288620A1; MX2009002064A; EP2054083B1; CA2661669A1; WO2008023946A1; WO2008023947A1; AU2007288620B2; CA2661669C; CN101528258A; KR100931976B1; JP5923233B2; CN101605560B; MX2009002065A; JP2015007045A; KR100932698B1; CN101605560A; JP2010501548A; EP2051733A1; EP2054083A1

Abstract

본 발명은 담도암에서 L1CAM이 고발현되어 담도암의 성장과 전이에 중요하게 작용하고, L1CAM의 발현율이 높을수록 담도암 환자의 사망률이 높으며, L1CAM의 활성을 억제하는 항체나 L1CAM의 발현을 억제하는 siRNA가 담도암세포의 성장, 침윤을 감소시키는 것으로 보아, L1CAM이 담도암 치료의 유용한 타겟이 될 수 있음을 밝힘으로써, 이에 착안하여 담도암 세포 표면 단백질인 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는, 담도암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것으로,

상기 담도암 세포 표면의 L1CAM 단백질을 인식하며 담도암의 암조직에 특이적으로 결합하는 생쥐 단일클론항체 또는 SiRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 ShRNA는 담도암 세포의 성장, 침윤 또는 이동을 억제함으로써 담도암의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

담도암, L1CAM, 단일클론항체, 암 치료

Description

담도암 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 담도암의 성장, 전이 억제 및 치료 방법{A pharmaceutical composition for treating cholangiocarcinoma, a method for inhibiting growth or invasion of cholangiocarcinoma and a method for treating cholangiocarcinoma}

본 발명은 담도암의 세포 표면에 존재하는 단백질인 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 담도암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것이다.

담도암은 간의 담관에 생기는 암으로 간암과 같은 줄기세포에서 발생하는 것으로 생각된다 (Sell and Dunsford Am J. Pathol. 134:1347-1363, 1989). 세계적으로 담도암의 발생빈도는 간암에 비해 훨씬 낮으나, 동남아시아에서의 발생빈도는 유럽이나 북아메리카 보다 훨씬 높게 나타난다. 담도암은 높은 재발률 때문에 외과적 절제술이 효과적이지 않고 보통의 화학요법이나 방사선요법이 잘 듣지 않는다는 특징을 가진다 (Pederson et al Cancer Res. 4325-4332, 1997). 게다가, 담도암의 진단이 쉽지 않고, 담즙관의 박테리아나 기생충 감염으로 인한 만성염증으로부터 오는 만성 담즙관의 염증이 담도암을 형성하는 경향이 있다는 소견이 있다 (Roberts et al., Gastroenterology 112:269-279, 1997).

그럼에도 불구하고, 담도암의 발생 원인에 대한 기전은 아직 잘 알려져 있지 않으며, 담도암의 치료를 위한 타겟 분자도 알려져 있지 않다. 또한, 몇몇 담도암의 세포유전적 연구들이 발표되고 극소수의 세포주만이 확립되어 있으며(Yamaguchi et al., J. Natl Cancer Inst 75: 29-35, 1985; Ding et al., Br J Cancer 67: 1007-1010, 1993), 이 세포주를 이용하여 담도암에 결합하는 항체를 제조하는 방법도 알려지지 않았다.

최근, 한국인 담도암 환자로부터 담도암세포 Choi-CK, SCK가 확립되어(Kim et al, Genes, chromosome & Cancer 30:48-56, 2001), 이들 암세포를 생쥐에 주사하여 암세포 표면 항원을 인식하는 단일 클론항체를 제조하고, 이들 항체가 담도암 세포의 성장을 억제하는 효과가 있음을 확인한다면, 이 항체들을 이용하여 담도암의 치료 방법을 개발할 수 있을 것이다.

공지의 암 예후 인자(prognostic factor)로 잘 알려져 있는 EGFR(epidermal growth factor receptor, 상피성장인자 수용체)의 유전자는 원암유전자(proto-oncogene)으로서 암의 생성(tumorigenesis)과 aggressive growth behaviour에 관여하는 것으로 밝혀져 있으며, EGFR은 유방암, 폐암, 대장암, 신장암, 담낭암, 두경부암, 난소암, 전립선암, 자궁경부암 및 위암 등 여러 다양한 암에서 과다발현된다 (Modjtahedi, H. and Dean, C. The receptor for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in cancer. Int. J. Oncol. 4: 277-296, 1994). 또한, EGFR 발현과 암 예후와의 관계는 암마다 다 같지 않다 (Nicholson, R.I. et al. EGFR and cancer prognosis. Eur. J. Cancer 37, S9-S15, 2001). 예를 들면, EGFR은 방광암, 자궁경부암, 식도암, 두경부암 및 난소암에서는 강력한 예후 인자(strong prognosis factor)이지만, 비소세포폐암(NSCLC, non-small cell lung carcinoma)에서는 약한 예후 인자(weak pronostic indicator)로 밝혀졌다. 그러나 담도암에 대해서는 알려진 바가 없다.

또한 EGFR에 대한 치료용 항체의 각 암세포 성장에 대한 억제 효율도 15-50% 정도로 다르게 나타났으며, 또한 같은 암 종류라 하더라도 생체 외 및 생체 내 성장 저해 (in vitro and in vivo growth inhibition) 효과가 다르게 나타났다 (Dassonville, O. et al., EGFR targeting therapies: monoclonal antibodies versus tyrosine kinase inhibitors similarities and differences. Critical Reviews in Oncology/Hematology 62, 53-61,2007). 현재 EGFR에 대한 항체는 대장암 및 두경부암 치료제로서 임상적으로 이용되고 있을 뿐, 상기에서 열거한 EGFR이 과발현된 암조직 모두에 대한 치료제로 다 사용되고 있는 것이 아니다.

이와 같이, 단백질이 암세포에서 발현되는 것만으로 상기 단백질이 암의 예후 인자일 것임은 쉽게 유추할 수 있는 것이 아닐 뿐만 아니라, 이와 같은 발현 및 암의 예후와의 관련성은 암 종류마다 다름이 종래에 잘 알려져 있었다. 암에 있어 강력하고 나쁜(strong and poor) 예후 인자는 암에 대한 치료 효과 및 예후를 용이하게 예측할 수 있게 할 뿐만 아니라, 이들 인자를 타겟으로 하는 치료제를 개발하여 선택적이고 효과적인 암의 치료 방법의 개발을 가능하게 하는바, 각 암의 종류 에 따른 이러한 예후 인자의 발굴은 암의 진단 및 치료에 있어 매우 중요하다.

한편, L1CAM (L1 cell adhesion molecule)은 세포 표면에서 세포간부착(cell-to-cell adhesion)을 중개하는 면역글로불린 수퍼패밀리 세포부착단백질들(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules, CAMs)에 속하는 내재성 막 당단백질(integral membrane glycoprotein)중 하나로서, 그 분자량은 220 kDa에 달한다. L1CAM은 원래 뉴런에서 발견되었으며(Bateman, et al, EMBO J. 15:6050-6059; 1996), 그 기능은 뉴런의 이동, 신경 돌기의 성장 및 세포 이동으로 알려져 있다. 사람의 L1CAM 유전자는 생쥐와 쥐의 L1CAM 상동체(homolog)에서 축퇴성 올리고뉴클레오타이드(degenerate oligonucleotide)를 프로브로 사용하여 인간 태아의 뇌 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다(Hlavin, M. L. & Lemmon, V. Genomics 11: 416-423, 1991; 미국 특허 제 5872225 호, 등록일 1999. 2. 16). 이것은 원래 주로 뇌에서 발현되는 것으로 알려졌지만 몇몇 정상조직 및 최근에는 여러 암세포에서도 발견되기 시작하였다.

L1CAM과 암과의 연관성은, L1CAM이 흑색종(melanoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 난소암 및 대장암 등 여러 암에서 발현되는 것이 보고되었으며 (Takeda, et al., J. Neurochem. 66:2338-2349, 1996; Thies et al, Eur. J. Cancer, 38:1708-1716, 2002; Arlt et al., Cancer Res. 66:936-943, 2006; Gavert et al., J. Cell Biol. 168:633-642, 2005), 막 결합 형(membrane bound form)외에 도 절단된 산물(cleavage product)이 세포 외로 분비되는 것이 발견된다 (Gutwein et al., FASEP J. 17(2):292-4, 2003). 그리고 최근 암세포의 성장에 중요한 역할을 하는 분자의 하나로 탐색됨으로써(Primiano, et al., Cancer Cell. 4(1):41-53 2003), 암치료의 새로운 타겟으로 부상되었다(US2004/0115206 A1 출원 2004.6.17). 최근 L1CAM이 대장암의 인베이시브 프론트(invasive front)에서 발현되고(Gavert, et al., J Cell Biol. 14;168(4):633-42. 2005), 난소암에서 이 분자에 대한 항체가 암세포 성장과 전이를 억제함이 밝혀졌다(Arlt, et al., Cancer Res. 66:936-943. 2006).

그러나 L1CAM이 담도암에 발현된다는 사실은 아직 알려져 있지 않았으며, 더욱이 담도암의 성장과 전이에 중요하게 작용하는지도 알려져 있지 않으며, L1CAM이 고발현되어 있는 담도암 환자의 사망률이 저발현되어 있는 담도암 환자의 사망률보다 더 높은지 즉 L1CAM이 담도암의 나쁜 예후 인자임이 아직 알려지지 않았으며, 더욱이 L1CAM에 대한 항체가 담도암의 증식이나 전이를 억제함으로써 치료제로서 가능성이 있다는 사실은 아직 알려지지 않았다.

유럽 특허출원 EP 1 172 654 A1 및 미국 특허출원 US 2004/0259084호는, L1CAM이 난소암, 자궁내막암 또는 그러한 암의 소인의 존재에 대한 표식이 된다는 전제 하에, 난소암 또는 자궁내막암의 진단 및 예후를 위해 환자의 샘플에서 L1CAM의 항체를 통해 L1CAM 수준을 결정하는 것을 특징으로 하는 수단 및 세포 독성을 가진 약물과 L1CAM 항체 및 그 부분을 결합시켜 충분한 양으로 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법에 대해 개시하고 있다. 그러나 이 문헌들은 단지 L1CAM 단백질이 체액 또는 조직에서 난소암 또는 자궁내막암의 매우 특이적인 마커임을 기재하고 있을 뿐이다.

미국 특허출원 US 2004/0115206호는 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 암세포 사멸을 유도하는 제제, 세포 사멸을 위해 상기 항체를 사용하는 수단 및 L1CAM 항체가 포함된 약제학적 조성물에 관하여 개시하면서, 암세포에서 세포 성장을 저해하고 세포사를 유도할 수 있는 유효량의 항 L1CAM 항체를 세포에 접촉(contacting)시키는 것에 의해 세포의 성장을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 것이 개시되어 있다. 그러나 이 문헌 역시 L1CAM이 발현되는 암의 예로서 유방암, 대장암, 자궁경부암에 대해서만 언급하고 있고, 인 비트로 시험만 했을 뿐 인 비보 결과는 뒷받침되어 있지 않으며, 담도암과의 관련성에 대해서는 언급하고 있지 않다. 또한, 항 L1CAM 항체를 암세포에 접촉시킴으로써 세포 성장 억제 및 세포 사멸을 유도하는 것에 대해서만 개시하고 있을 뿐, 암세포의 이동, 침투 및 전이를 억제할 수 있다는 것은 개시하고 있지 않다.

또한, 국제출원 PCT/EP2005/008148은 난소 및 자궁내막암에서 과발현되는 L1CAM 단백질 및 그들의 발현을 저해하는 조성물 및 이를 이용하여 난소 및 자궁내막암을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 이 문헌은 L1CAM 단백질의 기능을 저해하는 L1CAM 항체 및 그의 유도체를 포함하는 조성물이 난소암 및 자궁내막암의 기 능을 억제하여 암세포의 이동 및 진전을 저지하여 암의 치료가 가능하다고 기재하고 있다. 그러나 이 문헌 역시 단지 난소암 및 자궁내막암에서 세포 표면 또는 수용성 형태의 L1CAM이 암세포의 이동을 촉진한다는 것에 대해서만 기재하고 있을 뿐이다.

요컨대, 종래 공지된 문헌들에는 L1CAM이 담도암에서 높은 발현율로 발현되고, 담도암에 특이적인 나쁜 예후 인자(poor prognositic factor)로서 작용하며, 따라서 L1CAM에 대한 항체와 같이 L1CAM의 활성을 억제하는 물질은 특히 담도암에 대한 탁월한 진단 또는 치료 효과를 가질 수 있음에 대해서는 전혀 개시하지 않고 있다.

본 발명자는 담도암의 진단 또는 치료에 사용할 수 있는 항체를 개발하고자 노력하던 중, 최근 확립된 담도암 세포주(Kim et al, Genes, chromosome & Cancer 30:48-56, 2001)를 생쥐에 면역주사하여 담도암 세포 표면에 결합하는 단일클론항체를 얻어, 이를 A10-A3 항체로 명명하였으며, A10-A3 항체가 L1CAM을 특이적으로 인식함을 확인하였다.

또한, 상기 A10-A3 항체 및 공지의 L1CAM에 대한 항체를 이용하여 L1CAM이 담도암 세포주 표면에 발현함을 확인하였으며 말초혈관 림프구, 간세포, 혈액 내피세포와 같은 정상 세포에는 발현하지 않음을 확인하였다. 지금까지 L1CAM이 유방암, 난소암, 대장암, 피부암 등에 발현됨은 밝혀졌으나 담도암에서 발현된 사실은 밝혀지지 않았다. 본 발명자들은 A10-A3 항체를 이용하여 간내담도암 환자와 간외 담도암 환자의 암조직에서 L1CAM이 어느 정도 발현되는지를 분석한 결과, 간내담도암 환자의 45.2%, 간외담도암 환자의 39.8%가 L1CAM을 고발현함을 확인하였으며, 특히 담도암의 전이의 시작을 알리는 인베이시브 프론트(invasive front)에서 L1CAM이 고발현됨을 확인하였다. 그리고 L1CAM의 발현율과 생존율과의 관계에 대한 통계학적 분석 결과로부터, L1CAM 발현율이 높은 그룹의 담도암 환자의 사망률이 L1CAM 발현율이 낮은 그룹의 담도암환자의 사망률보다 확실히 높음을 확인하였다. 이 결과는 L1CAM이 담도암의 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)임을 증명하는 것이고 L1CAM이 담도암 치료의 중요 타겟이 될 수 있음을 시사한다. 이에 반하여 현재 임상적으로 사용중인 암치료제(예, 세툭시맙(cetuximab), EGFR에 대한 키메릭 항체(chimeric antibody))의 타겟인 EGFR이 담도암에서 고발현되지만 담도암에서의 발현율과 담도암 환자의 생존율과의 관계를 분석한 결과 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타나 EGFR은 담도암의 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)가 아님을 확인하였다. 이는 암세포에서 과다발현되는 분자가 반드시 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)가 되는 것은 아니며 중요한 치료 타겟이 되는 것이 아님을 증명하는 것이다.

L1CAM이 담도암의 성장이나 전이에 실제로 관여하는지를 확인하기 위하여, L1CAM을 발현하는 담도암세포주(Choi-CK, SCK)에 L1CAM에 대한 SiRNA를 도입시켜 L1CAM의 발현을 억제시킨 후 담도암세포의 성장, 이동, 침투에 영향을 미치는 지를 분석한 결과, L1CAM의 발현이 억제된 담도암세포의 성장, 이동, 침윤이 저해됨을 확인하였다. 이 결과는 L1CAM이 담도암세포의 성장과 전이에 중요하게 작용하고 있음을 증명하는 것이다.

L1CAM에 대한 항체가 담도암을 치료할 수 있는지를 분석하기 위하여, 담도암세포주(Choi-CK, SCK)의 배지에 A10-A3 항체나 공지의 L1CAM에 대한 항체(UJ127)를 처리한 결과 L1CAM에 대한 항체가 담도암 세포의 성장, 이동 또는 침윤을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 또한 동물실험에서 담도암세포주를 누드 마우스에 주사하여 담도암을 형성할 때 A10-A3 항체를 주사하면 담도암의 성장이 저해됨을 확인하였다. 또한, 인간배아줄기세포를 생쥐에 면역주사하여 얻은 하이브리도마(KCTC 10966BP)가 생산하는 단일클론항체 4-63도 암세포 표면의 L1CAM을 인식하였고 이 항체를 사용하였을 때 담도암의 성장이 억제되었다. 따라서 L1CAM에 대한 항체를 담도암의 진단 및 치료에 이용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 담도암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 또한 상기 약제학적 조성물을 이용하여 담도암을 치료하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 또한 L1CAM 활성을 억제하는 L1CAM에 대한 항체를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 또한 L1CAM 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 또한 상기 약제학적 조성물을 이용하여 담도암 세포의 성장 또는 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 담도암 세포의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

구체적인 일 양태로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 L1CAM의 활성을 억제하는 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 활성억제물질은 담도암세포 표면 항원 또는 분비된 표면 항원(L1CAM)을 특이적으로 인식하는 항체이다. 이러한 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함 하는 것이고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체는 신규한 L1CAM에 대한 단일클론항체인 A10-A3 또는 4-63, 공지의 항체 UJ127 및 이들의 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체이다. 이들 A10-A3 및 4-63 항체는 각각 수탁번호 KCTC10909BP 및 KCTC 10966BP에 의해 분비되어 생산된다.

상기 항체는 L1CAM을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

또 다른 구체적인 일 양태로서, 상기 약제학적 조성물은 L1CAM의 발현을 억제하는 물질을 포함할 수 있다. L1CAM을 발현하는 암세포에서 L1CAM의 발현을 억제하는 물질들을 이용하여 L1CAM의 발현을 억제시키면, 암세포의 성장과 전이 역할을 하는 L1CAM의 작용이 줄어들어, 암치료가 가능하다. 바람직하게는, 상기 L1CAM의 발현을 억제하는 물질은 siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)로 구성되는 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3' 또는 5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3'의 서열을 포함하는 siRNA이다.

용어 "siRNA"는 RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있 는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, "shRNA"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 최근 유전자 수준에서 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법으로 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 이용한 방법이 연구되고 있으며, 일반적으로 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 조성물에 포함되는 siRNA를 제조하는 방법에는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520), 인 비트로 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 L1CAM 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고머이다.

바람직하게는 본 발명의 조성물에는 공지의 치료제를 직접 또는 간접적으로 결합시키거나, 함께 포함시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종, 약제, 림포카인, 독소 및 이중특이적 항체 등을 포함되나, 본 발명의 조성물에 포함되는 치료제는 이에 제한되는 것은 아니며, 항체와 결합시킬 수 있거나 항체, siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 투여하여 암 치료 효과를 얻을 수 있는 공지의 치료제라면 가능하다.

상기한 방사선핵종에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I 및 ¹⁸⁶Re 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.

상기한 약제 및 독소에는, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은, 투여방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

투여 방식에 적합한 제제는 당 분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 암 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다.

또 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 이용하여 담도암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 치료방법은 상기 약제학적 조성물을 약학적 유효량으로 인체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식은 정맥 주사, 피하주사, 피내 주사제, 근육주사 및 점적 주사이다.

본 발명의 약제학적 조성물 인체 내에 투여하여, 이에 포함된 L1CAM에 특이적인 항체를 암세포 표면 항원인 L1CAM에 결합시켜 암세포의 증식 또는 전이를 억제시킴으로써 담도암을 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 인체 내에 투여하여 항체를 분비된 L1CAM과 결합시켜 암세포의 성장 및 전이를 차단시킴으로써 담도암을 치료할 수 있 을 뿐만 아니라 이를 인체 내에 투여하여 암세포 표면 항원인 L1CAM에 결합시켜 이를 인지하는 면역세포가 암세포를 포식, 자살 또는 살해시킴으로써 담도암을 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 L1CAM의 발현 억제물질을 이용하여 L1CAM의 발현을 억제시키면, 암세포의 성장과 전이 역할을 하는 L1CAM의 작용이 줄어들어, 암치료가 가능하다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 L1CAM 활성을 억제하는 L1CAM에 대한 항체 또는 L1CAM의 발현을 억제하는 L1CAM에 대한 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.

구체적인 일 양태에서, 상기 항체는 상기 본 발명에 따른 조성물에서 언급한 바와 같이 L1C에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

바람직하게는, 상기 항체는 담도암세포 표면 항원 또는 분비된 표면 항원(L1CAM)을 인식하는 항체로서 상기 항체는 담도암 세포 표면 단백질 L1CAM과 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화(neutralization)시키며, 암세포와 결합하여 암 세포의 성장 및 전이 억제, 포식, 자살 또는 살해시킬 수 있음을 특징으로 한다.

상기에 언급한 US 20040115206에 개시된 바와 같이, L1CAM의 항체들은 L1CAM의 작용을 반드시 억제하는 것은 아니다. 본 발명의 항체는 L1CAM의 작용을 촉진하는 것이 아닌 L1CAM의 활성을 억제하는 항체임을 특징으로 한다.

더욱 바람직하게는, 상기 단일클론항체는 신규한 항체인 A10-A3 또는 4-63이다.

구체적인 또 다른 일 양태에서, 본 발명의 L1CAM의 발현을 억제하는 L1CAM에 대한 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 조성물에서 언급된 L1CAM에 대한 siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드에서 선택되는 것이다.

구체적인 일 실시예로서, 본 발명자들은 담도암 세포를 대량 배양한 다음 생쥐 발바닥에 상기 세포를 주입하고, 상기 생쥐의 림프절(lymph node)에서 림프구를 분리하여 골수종(myeloma) 암세포와 세포 융합하여 담도암세포에 결합하는 항체를 생산하는 생쥐 하이브리도마를 제조하였다.

보다 구체적으로, 본 발명자들은 담도암세포 SCK와 Choi-CK를 생쥐의 발바닥에 주사하고, 상기 생쥐의 림프절에서 림프구를 분리하였다. 상기 림프구와 FO 골수종 세포주를 세포 융합시키고, 항체가 발현되는 클론을 선발하였다. 상기 제조한 클론 중에서, 비교적 안정하게 단일클론항체들을 분비하는 하이브리도마 상층액의 담도암 세포에 대한 결합능을 조사하고, 이들 단일클론항체 및 단일클론항체를 분 비하는 하이브리도마를 하이브리도마 A10-A3라 명명하고, 이를 2006년 2월20일자로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC10909BP). 구체적으로, 상기한 단일클론항체가 인식하는 암세포는 담도암 세포주에는 결합하지만(도 1 참조), 간세포, HUVEC(인간 유래의 탯줄정맥내피세포) 및 말초혈액 림프구(periperal blood lymphocyte) 등 정상 세포에는 결합하지 않으며(도 1 참조), 이들 항체를 사용하였을 때 담도암 세포의 성장, 이동 또는 침윤이 억제되었다. 또한, 공지의 L1CAM에 대한 항체 5G3은 담도암 세포에 결합하지만 암의 성장 억제 효과가 낮았으나(도 8 참조)지는 못하였으나, 다른 공지의 항체 UJ127은 담도암 세포에 결합하여 이들의 성장을 억제하였다. 이에 의해 L1CAM의 항체가 반드시 L1CAM의 작용을 억제하는 것은 아니라는 것을 알 수 있었다.

구체적인 또 다른 일 실시예에서, 본 발명자는 5-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3 및 5-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3의 서열을 가지는 siRNA를 각각 Choi-CK 및 SCK에 형질감염시켜 비특이적인 올리고 뉴클레오티드 서열을 형질감염시킨 것과 비교한 결과, 비특이적인 올리고 뉴클레오티드를 처리한 대조군과 달리 L1CAM의 양이 감소하였을 뿐 아니라, siRNA에 의해 L1CAM이 넉다운(knock-down)된 세포군이 정상적으로 L1CAM을 발현하는 세포군에 비해 암세포의 증식, 침투 및 이동 정도가 감소됨을 확인하였다.

본 발명의 실시예(실시예 5, 6 및 7 참조)에서 알 수 있는 바와 같이, L1CAM 이 담도암 세포에서 발현됨, L1CAM이 담도암 환자의 약 40%에서 과발현되며, 담도암의 진행에 중요하게 작용하여 사망위험율이 높게 만드는 담도암의 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)임 및 이에 반하여 다른 암에서 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)로 알려진 EGFR은 담도암의 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)가 아님은 본 발명자에 의해 최초로 밝혀진 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질, 이를 포함하는 암 중에서도 담도암에 특이적으로 현저한 암 진단 및 치료가 가능하다는 효과를 가진다.

뿐만 아니라, 본 발명자는 면역조직화학염색방법을 통하여 비소세포폐암 환자에서 L1CAM 발현율은 10% 미만임을 확인하였고, A10-A3 항체를 L1CAM을 발현하는 비소세포폐암세포주 A549와 NCI-H522에 처리하였을때 암세포의 성장 저해율은 각각 14% 및 24%임을 확인하였는데, 이는 A10-A3의 담도암세포 성장 저해율인 약 40%에 크게 미치지 못하는 것으로, 이에 의해 본 발명의 조성물이 담도암에 특이적인 효과를 가짐은 더욱 증명되는 것이라 할 수 있다. 이와 관련된 사항은 본 발명자가 본 출원과 동일자로 출원하는 대한민국 특허출원의 명세서(발명의 명칭 : "폐암의 치료용 약제학적 조성물 및 이를 이용한 폐암의 성장, 전이 억제 및 치료방법")에 구체적으로 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 발명에 대한 참고문헌으로 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 암세포의 배양

암세포주는 모두 10% 우태아혈청(Gibco사)을 함유하는 다음과 같은 배지를 이용하여 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. SH-J1 (hepatocellular carcinoma), SCK(cholangiocarcinoma), Choi-CK(cholangiocarcinoma) 및 ACHN(Renal cell adenocarcinoma) 세포는 MEM(Gibco사) 배지를 이용하였고, SK-OV3(ovary adenocarcinoma) 세포는 McCoy 5A Medium(Gibco사) 배지를 이용하였다. A549(non small cell lung carcinoma)는 Ham's F12K배지에서, NCI-H522(non small cell lung carcinoma), DMS114(small cell lung carcinoma), DMS53(small cell lung carcinoma), NCI-H69 (small cell lung carcinoma)는 Waymouth's(Gibco) 배지에서 배양하였다. SH-J1, SCK 및 Choi-CK 세포주는 김대곤 박사(전북대학교 의과대학)로부터 얻었고, 그 외 암세포주는 ATCC로부터 구입하였다.

정상 세포인 간세포(hepatocyte)는 Cambrax사에서 구입하고 HUVEC 세포도 Cambrax사에서 구입 후 10% 우태아혈청(Gibco)을 함유하는 EGM-2 (Hyclone사)배지를 이용하여 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 말초 혈액 림프구(PBL)은 사람 혈액에서 피콜 밀도차이에 의한 분리(Ficoll gradient) 후 수득하였다.

<실시예 2> 암세포 Choi-CK, SCK에 결합하는 단일클론항체 A10-A3의 제조

배양한 암세포 Choi-CK와 SCK를 세포 분리 완충액(Cell dissociation buffer - Invitrogen)를 이용하여 떼어낸 후 약 5 × 10⁵의 세포를 30 ㎕의 PBS에 부유시킨 후, 세포를 Balb/c 생쥐의 오른쪽 발바닥에 Choi-CK를 주사하고, 3일 후 왼쪽 발바닥에는 SCK를 주사하였다. 이를 3-4일 간격으로 6회 반복투여하고 세포융합 1일 전에 다시 주사하였다. 림프절 세포와 융합시킬 FO 골수종(myeloma) 세포주(ATCC, USA)는 10%의 우태아혈청를 함유한 DMEM(GIBCO사)배지에서 2주 전부터 배양하여 준비하였다.

암세포 Choi-CK와 SCK로 면역시킨 생쥐의 오금 림프절을 각각 꺼내 DMEM(GIBCO사)배지로 잘 씻고, 배양 접시에서 잘 분쇄하여 세포 부유물을 15 ㎖ 튜브에 옮겨두었다. FO 골수종 세포를 원심 분리하여 수확하고 10 ㎖의 DMEM 배지에 현탁하여 위의 림프절 세포와 함께 세포수를 계수하였다. 이후, 10⁶개의 골수종세포(FO)와 10⁷개의 림프절세포를 50 ㎖ 튜브에 옮겨 섞은 다음 200 × g로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 37℃ 물이 채워진 비이커에 2분간 방치하였다. 튜브를 가볍게 쳐서 세포를 부드럽게 만들고 37℃ 물에 담근 상태로 천천히 흔들면서 1 ㎖의 PEG용액(GIBCO사)을 1분 동안 천천히 첨가하였다. 100× g로 2분 동안 원심분리하고 5 ㎖의 DMEM 배지를 3분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 다시 5 ㎖의 DMEM 배지을 2분 동안 천천히 첨가한 다음 200 × g로 원심 분리하여 세포들을 회수하였다. 그리고, 세포 융합 효율과 생존율을 높이기 위해 Hybridoma Cloning Factor (BioVeris사, USA)를 미리 10%로 정상 배지(DMEM + 20% 우태아혈청)에 섞어두었다. 회수한 세포를 Hybridoma Cloning Factor를 섞은 30 ㎖의 정상 배지(DMEM + 20% 우태아혈청)에 조심스럽게 현탁하였다. 37℃, CO₂ 배양기에서 30분 동안 방치한 후 96웰 플레이트에 웰당 70 ㎕씩 10⁵개의 세포가 되도록 분주하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 다음 날 70 ㎕의 HAT를 더하고 3일 간격으로 HAT 배지에서 2주 이상 키우면서 자라는 콜로니를 관찰하였다. 이렇게 Choi-CK 세포를 면역주사 한 림프절과, SCK 세포를 면역 주사한 림프절에서 분리한 림파구를 골수종세포와 융합하여 얻은 하이브리도마 콜로니의 상층액을 사용하여 다음 실험을 수행하였다.

항체가 발현되는 클론을 선발하기 위하여, 샌드위치(sandwich) ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)법을 사용하였다. 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체를 2 ㎍/㎖로 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양액 100 ㎕을 첨가해 37℃에서 1 시간 반응시키고, 다시 항-마우스 IgG 또는 IgM의 HRP(horseradish peroxidase, Sigma사)의 1/5,000 희석액과 1시간 더 반응시켰다. 0.05%의 트윈 20을 첨가한 인산완충액으로 배양용기를 세척하고, OPD(Sigma사)와 과산화수소(H₂O₂₎가 포함된 기질용액을 첨가하고, 492 ㎚의 파장의 흡광분석기에서 흡광도를 측정하여 항체를 생산하는 클론을 선별하였다.

상기 제조한 클론 중에서, 비교적 안정하게 항체들을 분비하는 하이브리도마 상층액의 SCK와 Choi-CK 세포에 대한 결합능을 조사하였다. 구체적으로, 배양된 Choi-CK 세포를 세포 분리 완충액(GIBCO)으로 20분 37℃에서 처리하여 단일세포로 분리한 뒤, 40 μm 스트레이너(strainer)를 통과시켜 5 × 10⁵세포를 유세포 분석기(Flow cytometry)에 사용하였다. 먼저 단일 세포화된 SCK, Choi-CK 세포를 PBA(1%의 BSA를 PBS에 용해)에 부유시키고 항체 상층액을 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 4℃에서 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액 100 ㎕을 제거하고 여기에 항-마우스 Ig-FITC(BD)를 200배 희석하여 4℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 PBA로 2회 세척하고, 프로피디움 요오다이드(Propidium Iodide, PI) 음성인 세포들만 골라 유세포분석기(FACS caliber)로 SCK, Choi-CK 세포에 대한 결합능을 분석하였다.

그 결과, SCK 및 Choi-CK에 결합하는 항체를 분비하는 다양한 하이브리도마들을 선별하고, 지속적인 계대배양을 통하여 안정화를 유지시킨 후 서브클로닝하였다. 상기 서브클로닝으로 확실하게 안정성을 유지시킨 SCK, Choi-CK 세포에 대한 특이성을 유지한 항체 A10-A3를 분비하는 하이브리도마를 선별하였다.

상기 단일클론항체 A10-A3를 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 A10-A3(수탁번호:KCTC 10909BP)이라 명명하고, 이들을 2006년 2월 20일자에 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁하였다.

< 실시예 3> 단일클론항체 A10-A3의 암세포 결합 특이성 분석

A10-A3 하이브리도마 세포주를 무혈청배지 (PFHM, Invitrogen사)에서 배양한 후 배양액으로부터 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)을 사용하여 정제하였다(Fike et al., Focus 12: 79, 1990). 정제된 A10-A3 항체의 담도암세포에 대한 결합능을 형광세포염색을 통하여 상기 실시예<3>과 동일한 방법으로 조사하였다(도 1). 상기 도 1에서 실선은 단일클론항체 A10-A3, 4-63 및 L1CAM에 대한 공지의 항체 5G3 (Pharmingen, San Diego, USA), UJ127(Chemicon)이고 채워진 바탕은 2차 항체만 포함한 것이다. 다양한 암세포에 대한 A10-A3, 4-63, 5G3 및 UJ127의 결합능력을 측정하기위해 유세포 분석기를 이용하여 수행하였으며 그 결과 상기 단일클론항체가 암세포 중 SCK, Choi-CK 및 SK-OV3 등의 암세포에 결합하는 것을 관찰할 수 있었다 (도1A, B, C, D). 그러나 암세포 중 ACHN과 간세포(hepatocyte), HUVEC, 말초 혈액 림프구(PBL)와는 결합하지 않는 결과를 보여주었다.

< 실시예 4> 단일클론항체 A10-A3가 인식하는 항원의 분리 및 동정

< 실시예 4-1> 항원의 분리

단일클론항체 A10-A3가 인식하는 세포표면 인식 인자를 분리하기 위하여, 먼저 배양한 Choi-CK 세포를 PBS 완충용액으로 세척하고 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Rockford, IL)로 바이오틴화(biotinylation)시킨 후 세포를 용해용액 (25mM Tris-HCl, pH 7.5, 250mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 2 μg/ml aprotinin, 100 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 μg/ml leupeptin)으로 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후 세포 부스러기(debris)를 제거하기 위해 원심분리를 실시하였다. 상층액만을 회수하여 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.

단백질 G 플러스-세파로오스 (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz)에 비특이적으로 결합하는 단백질은 세포용해 용액을 20 μl의 단백질 G 플러스-세파로오스와 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 상층액만 회수하여 준비하고, 회수한 상층액은 다시 약 1 μg의 항체와 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 여기에 20 μl의 단백질 G 플러스-세파로오스를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 침전물을 회수하였다.

회수한 침전물을 세포용해용액으로 10회 이상 세척하고 남아있는 단백질을 10% SDS-PAGE에서 분리하였다. 이 단백질을 니트로셀룰로즈 막으로 옮겨 웨스턴 블럿을 수행하였다. 니트로셀룰로즈 막을 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 PBST(PBS + 0.1% Tween 20) 완충용액에서 1시간 동안 반응시키고 나서, 상기 PBST 완충용액으로 두차례 이상 세척하였다. 상기 반응된 니트로셀룰로즈 막을 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP, horseradish peroxidase) 결합체 (1:1,500 Amershambiosciences)를 첨가하여 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 PBST 완충용액으로 5차례의 세척 후, 바이오틴화된 단백질을 ECL 검출 시약(Amersham biosciences)로 발색시켰다.

그 결과, 약 200 kDa 크기의 단백질에 A10-A3 항체가 결합함을 확인하였다 (도 2A). 항체 A10-A3에 의해 면역 침강되는 단백질을 모으기 위해 1X10⁸ Choi-CK 세포에서 얻은 세포용해액을 위와 같은 방법으로 면역침강법을 수행한 후 SDS-PAGE를 사용하여 분리하였다. 이 젤을 Coomassie G250 (Biorad)으로 염색하였다.

< 실시예 4-2> 질량분석기( Mass Spectrometry )에 의한 항원의 동정

A10-A3에 의해 면역침강된 단백질을 포함하는 SDS 젤을 Coomassie G250(BIO-RAD)으로 공급자의 프로토콜대로 염색하였다. 단백질이 포함된 부분을 잘라내고 30% 메탄올로 5분 동안 세척하고 잘게 부수었다. 젤 부스러기를 30% 메탄올로 염색이 완전히 탈색 될 때까지 반응시키고 난 후, 젤 부스러기는 100% 아세토니트릴(acetonitrile)로 10 분 동안 수분을 제거하고 30분 동안 진공 원심분리기에서 말렸다. 단백질의 절편은 젤 부스러기에 300ng의 트립신(Promega)을 50mM 암모늄 바이카보네이트용액을 넣어 반응시키고 16 시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 잘린 펩타이드는 3차례 100 μl의 50 mM 암모늄 바이 카보네이트로 추출해내고 진공 원심분리기에서 말렸다. 펩타이드 혼합물은 Q-TOF micro (MicroMass)에서 electrospray quadrupole time of flight tandem mass spectrometry (ESI Q-TOF MS/MS)로 분석하였다. 그 결과 이 단백질이 L1 Cell Adhesion molecule (L1CAM)임을 확인하였다 (도 3). 도 3에서 밑줄 친 부분은 실제로 아미노산 서열이 Q-TOF에서 밝혀진 것을 표시한 것이다. 그래서 실제 L1CAM에 대한 항체 단일클론항체 UJ127.11를 Chemicon (USA)사에서 구입하여 biotin label 시킨 Choi-CK 세포 용해 액을 이용하여 실시예 4-1처럼 면역 침강시키고 ECL로 확인하였다. 도 2A에 보이는 것처럼 A10-A3와 anti-L1CAM 항체가 약 200kDa의 같은 위치에 단백질을 면역침강시킴을 알 수 있다.

< 실시예 4-3> 웨스턴 블러팅(Western blotting)에 의한 L1CAM 항원의 확인

A10-A3 항체가 정말 L1CAM을 인식하는지 재확인하기 위하여, Choi-CK의 세포용해액을 사용하여 이 항체로 먼저 면역침강을 수행하였다. 단백질 G 플러스-세파로오스(Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz)에 비특이적으로 결합하는 단백질은 세포용해용액을 20 μl의 단백질 G 플러스-세파로오스와 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 상층액만 회수하여 준비하고 (도 2B의 preclearing), 회수한 상층액은 다시 약 1 μg의 항체와 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 여기에 20 μl의 단백질 G 플러스-세파로오스를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물을 세포용해 용액으로 10회 이상 세척하고 남아있는 단백질을 10% SDS-PAGE에서 2-머캅토에탄올 없이 분리하였다. 이 단백질을 니트로셀룰로즈 막으로 옮겨 웨스턴 블럿을 수행하였다. 니트로셀룰로즈 막을 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 PBST(PBS + 0.1% Tween 20) 완충용액에서 1시간 동안 반응 시키고 나서, 상기 PBST 완충용액으로 두 차례 이상 세척하였다. 상기 반응된 니트로셀룰로즈 막을 공지의 항-L1CAM 항체 UJ127(Chemicon) 를 1차 항체로 첨가하여 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 PBST 완충용액으로 5차례의 세척 후 항-마우스 IgG의 horseradish peroxidase (HRP) conjugate (1:5000 Sigma)로 1 시간 반응시켰다. 다시 PBST 완충용액으로 5차례의 세척 후, ECL 검출 시약(Amersham biosciences)로 발색시켰다. 그 결과, A10-A3에 의해 면역침강된 약 200 kDa 크기의 단백질에 L1CAM 항체가 결합함을 확인하였다 (도 2B). 이것은 다시 A10-A3 항체가 L1CAM을 인식함을 말해준다.

< 실시예 4-4> 수용성 L1CAM 의 발현

수용성 L1CAM을 발현시키기 위한 발현벡터를 제작하기 위해서 배양된 암세포주 Choi-CK로부터 RNA 추출키트 (Roche co.)를 사용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA를 주형으로 RT-PCR 키트 (Roche co.)를 사용하여 2개의 양 말단 프라이머인 Ig-dom-F (5'-gAg gAg gAA TTC Cgg CgC Cgg gAA AgA Tgg TCg Tgg Cg-3', 38mer) 와 L1-Fn-Stop-R (5'-CTC TAg AgT TCT CgA gTC AgA gCC TCA CgC ggC C-3', 34mer)와 pfu 중합효소 (Solgent co.)를 사용하여 95℃에서 5분 동안 전처리반응 후, 95℃, 30초/58℃, 30초/72℃, 2분 동안 25회 연쇄 중합반응을 시키고, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하여 증폭하였다. 증폭된 수용성 L1 DNA단편을 pJK-dhfr2 발현벡터 (Aprogen)에 삽입하기 위해서 벡터와 증폭된 DNA단편을 EcoR I과 Xho I 효소로 각각 절단하여 1% 아가로스젤에 전기영동하여 해당되는 단편을 오려내어 Gel purification kit (Intron co.)를 사용하여 회수하였다. 회수된 두 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제 (Roche co.)를 이용하여 16℃에서 30분간 반응하여 대장균 (E. coli DH5α)에 히트 쇼크(heat shock)법을 이용하여 형질 전환시켰다. 형질전환된 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 염기서열을 분석하여 수용성 L1CAM의 cDNA가 클로닝되어 있음을 확인하였다. 제조된 발현벡터는 pJK-dhfr2-L1-monomer라 명명하였다.

수용성 L1CAM을 발현시키기 위하여 pJK-dhfr2-L1-monomer DNA를 HEK293T (ATCC CRL11268, 이하 293T라 한다)에 형질전환하여 L1-monomer를 발현시켰다. 500㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco BRL)에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen co.)과 상기 발현벡터 10㎍을 각각 섞어 넣어서 5분간 상온에서 반응시킨다. 두 반응액을 합친 후, 15분간 상온에서 다시 반응시켰다. 두 반응액을 상온에서 반응시키는 동안 293T세포를 PBS 완충용액 (pH 7.4)로 조심히 씻고 제거한 뒤, Opti-MEM 배지를 조심스럽게 넣어준 뒤, 다시 제거한다. 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)과 DNA를 반응시킨 용액에 Opti-MEM 배지 4㎖을 넣고 섞어준 뒤, 이를 293T 세포가 있는 배양용기에 조심스럽게 넣어주고, 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 6시간 배양 후, 5㎖의 Opti-MEM 배지를 다시 첨가하여주고 3일 동안 배양하였다.

< 실시예 4-5> 항체의 수용성 L1CAM 에 대한 결합 특이성 확인

293T 세포에서 수용성 L1CAM을 발현시킨 세포 배양액과 발현시키지 않은 세포 배양액을 10% SDS-PAGE과 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 니트로셀룰로즈 막을 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 TBST(TBS + 0.05% Tween 20) 완충용액으로 4℃에서 12시간 동안 반응 시키고 나서, 상기 TBST 완충용액으로 두 차례 이상 세척하였다. 상기 반응된 니트로셀룰로즈 막을 공지의 anti-L1CAM 항체 UJ127(Chemicon) 및 5G3(Pharmingen)과 상기의 A10-A3 및 4-63항체를 5% 탈지유가 함유된 TBST 완충용액에 1:10,000으로 희석된 1차 항체를 첨가하여 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 TBST 완충용액으로 5차례 세척 후 항-마우스 IgG의 horseradish peroxidase (HRP) conjugate (1:5000 Sigma)로 1 시간 반응시켰다. 다시 TBST 완충용액으로 5차례의 세척 후, ECL 검출 시약(Amersham biosciences)로 발색시켰다. 그 결과, 상기 각 항체는 약 200 kDa 크기의 수용성 L1CAM에 결합함을 확인하였다(도 2C). 또한, 상기 L1 발현 세포배양액을 위의 항체들을 이용하여 ELISA를 수행한 결과, 각 항체는 발현된 수용성 L1CAM에 대한 결합특이성이 있음을 확인하였다.

< 실시예 5> 담도암 조직에 대한 면역조직화학적 염색

담도암의 면역조직화학염색을 위하여 암에서 박절한 절편에서 3μm두께의 절편을 각각 폴리-엘-라이신(poly-L-lysine)을 도포한 슬라이드에 부착하였다. 우선 60℃ 오븐에서 3시간 동안 건조한 다음 크실렌으로 실온에서 5분 동안 3회 탈파라핀화 시켰다. 100%, 90%, 80% 및 70% 알코올로 각각 1분 동안 처리하고, 항원성 회복을 위하여 target retrieval solution (DAKO, Carpinteria, CA)에 슬라이드를 담근 후 압력솥(pressure cooker)을 이용하여 4분 동안 끓인 TBST(Tris-buffered saline-Tween 20) 완충용액으로 수세하였다. 고감도의 면역조직화학염색을 위하여 Biotin-free Tyramide Signal Amplification System인 CSA II kit(DAKO, Carpinteria, CA)를 이용하였다. 비특이 항원을 제거하기 위하여 3% 과산화수소에 5분 동안 반응시킨 후, 완충용액으로 5분 동안 2회 세척하고 비특이 단백의 결합을 제거하기 위하여 충분한 무혈청 단백질 블럭(serum-free protein block)으로 5분 동안 반응시켰다. 일차 항체(A10-A3, 4-63, 1:50 dilution)를 도포하여 15분 동안 반응시키고 항-마우스 면역글로불린-HRP에 15분 동안 처리하였다. 그런 다음 증폭제(Amplification reagent)에 15분 동안 방치한 후 항-플루오레세인-HRP에 15분 동안 반응시켰다. DAB를 이용하여 5분 동안 발색한 다음 Meyer's hematoxylin으로 대조염색을 하였다. 각각의 단계가 끝나면 TBST 완충용액으로 5분 동안 2회 세척하였다. 음성 대조군은 염색 때 일차항체를 제외하고 정상 면양 혈청을 첨가해 주거나, 일차 항체 대신 정상 마우스 IgG1 혈청을 첨가해 주고 나머지 모든 과정은 동일하게 하였다. 그 결과 정상조직에는 결합하지 않고, 담도암 조직에 A10-A3 및 4-63 항체가 잘 결합함을 알 수 있었다 (도 4).

위의 결과는 담도암 조직에서 L1CAM이 발현함을 의미한다.

상기 L1CAM이 발현된 암 중 담도암에서의 L1CAM의 발현율을 알아보기 위해 A10-A3항체를 이용한 면역조직화학 염색법을 이용하여 간내담도암 환자(42 cases)와 간외담도암 환자(103 cases)의 암조직에서 L1CAM이 어느 정도 발현되는지를 분석한 결과, 간내담도암 환자의 45.2%, 간외담도암 환자의 39.8%가 L1CAM을 고발현함을 확인하였다(도 5). 특히 담도암의 전이의 시작을 알리는 인베이시브 프론트(invasive front)에서 L1CAM이 고발현됨을 확인하였다(도 4).

< 실시예 6> 담도암에서 L1CAM 의 발현율과 환자 생존율과의 관계에 대한 통계학적 분석

L1CAM의 발현율과 담도암 환자의 생존율과의 관련성을 간외담도암 환자(60 cases)를 대상으로 분석한 결과, L1CAM의 발현율이 높은 그룹이 낮은 그룹보다 생존율 [OS (overall survival) 및 DFS (disease free survival)] 이 통계학적으로 유의성 있게 낮음, 즉 사망 위험성이 높음을 확인하였다 (도 6). 생존그래프에서 L1CAM의 과발현과 저발현은 담도암 환자의 2년간 총적인 생존율(OS)에 많은 차이를 보이며 통계학적으로 아주 유효성이 있는 것으로 나타났으며, 또한 L1CAM의 과발현과 저발현은 담도암 환자의 2년간 재발하지 않고 생존할 수 있는 확률(DFS)이 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 나타났다.

반면 담도암이나 다른 종양에서 과발현되는 것으로 알려진 EGFR(epidermal growth factor receptor)의 발현율과 생존율과의 상관 관계는 통계학적으로 유의성 있게 나타나지 않았다 (도 6). 이는 L1CAM에 대한 항체를 담도암의 진단 및 치료에 이용할 수 있음을 시사하며, 특히 사망률이 높은 담도암의 전이를 조기에 진단 및 치료하여 치료 효과를 높일 수 있음을 시사한다.L1CAM의 발현율과 생존율과의 관계에 대한 통계학적 분석 결과로부터, L1CAM 발현율이 높은 그룹의 담도암 환자의 사망률이 L1CAM 발현율이 낮은 그룹의 담도암환자의 사망률보다 확실히 높음을 확인하였다.

이 결과는 L1CAM이 담도암의 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)임을 증명하는 것이고 L1CAM이 담도암 치료의 중요 타겟이 될 수 있음을 시사한다. 이에 반하여 현재 임상적으로 사용중인 암치료제(예, 세툭시맙(cetuximab), EGFR에 대한 카이메릭 항체(chimeric antibody))의 타겟인 EGFR이 담도암에서 고발현되지만 담도암에서의 발현율과 담도암 환자의 생존율과의 관계를 분석한 결과 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타나 EGFR은 담도암의 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)가 아님을 확인하였다. 이는 암세포에서 과다발현되는 분자가 반드시 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)가 되는 것은 아니며 중요한 치료 타겟이 되는 것이 아님을 증명하는 것이다.

< 실시예 7> L1CAM 발현 억제의 담도암 세포 기능에 대한 효과

< 실시예 7-1> 담도암 세포에서의 siRNA 를 이용한 L1CAM 의 발현 억제

Choi-CK와 SCK에서 L1CAM의 발현을 넉다운 시키기 위해 L1CAM에 대한 siRNA 올리고뉴클레오티드 (5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3' 및 5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3')와 비특이적인 올리고뉴클레오티드 (5'-CAGTCGCGTTTGCGACTGGdtdt-3')를 각각 형질감염한 후 72시간 배양하였다. L1CAM의 넉다운(knock down)은 A10-A3를 이용한 유세포 분석(flow cytometry), RT-PCR 및 웨스턴 블러팅으로 확인하였다. 그 결과, L1CAM에 대한 siRNA를 Choi-CK와 SCK에 처리한 결과 비특이적인 siRNA를 처리한 대조군과 비교했을때 L1CAM의 전체 발현양과 세포표면에 존재하는 L1CAM의 양이 감소한다는 것을 확인하였다 (도 7A).

< 실시예 7-2> L1CAM 에 대한 siRNA 를 처리한 담도암세포의 활성 분석

L1CAM에 대한 siRNA를 형질감염시킨 담도암 세포와 비특이적인 siRNA를 형질감염시킨 담도암 세포의 증식(proliferation), 침투(invasion) 및 이동(migration) 정도를 비교하였다. 증식 정도는 각각 같은 수의 세포를 계수하여 72시간 후의 세포를 트리판 블루(Tryphan Blue) 용액을 이용해 측정하였으며, 침투 및 이동 정도는 QCM 24-well cell invasion assay kit(Chemicon)과 QCM 24-well colorimetric cell migration assay kit(Chemicon)을 이용하여 분석하였다. L1CAM이 넉다운된 세포군이 L1CAM이 정상적으로 발현되는 세포군에 비해 증식, 침투 및 이동 정도가 감소됨을 확인하였다. 이는 L1CAM이 담도암세포의 성장, 이동 및 침투에 작용하고 있음을 시사한다 (도 7B).

< 실시예 8> L1CAM 특이적 항체에 의한 담도암 세포의 성장억제

L1CAM에 대한 항체가 담도암 세포의 성장을 저해하는지를 실험하기 위하여, A10-A3 항체가 결합하는 Choi-CK, SCK와 양성 대조군으로서 난소암세포주인 SK-OV-3와 음성대조군으로서 ACHN 세포를 3 ml의 배지 내에 2 x 10⁵cells 씩 계수하여 6 well plate에서 배양하고, 상기 단일클론항체를 10 μg/ml 농도로 첨가한 후, 세포를 37℃ CO₂ 반응기에서 72시간 동안 반응시켰다. 그리고 세포를 회수하여 0.2% 트리판 블루(Tryphan Blue) 용액에서 죽은 세포와 산 세포를 세어서, 전체 세포 중에 살아있는 세포의 백분율을 구했다. 그 결과 A10-A3 항체에 의하여 Choi-CK, SCK 세포의 성장은 SK-OV3 세포처럼 뚜렷이 감소하고 ACHN은 아무런 영향을 받지 않았다 (도8A). 한편 4-63 항체도 담도암의 성장을 억제 하였다 (도 8B).

L1CAM에 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 공지의 항체 UJ127(Chemicon), 5G3(Pharmingen)를 위의 담도암 세포에 처리하였을때, UJ127 항체는 위의 암세포의 성장을 저해하였으나 5G3 항체의 경우 담도암세포(Choi-CK)의 성장을 약간 저해하였다 (도 8C). 5G3 항체는 Choi-CK 세포에는 결합하였다(도 1C). 이 결과는 단일클론항체가 암세포에 결합한다 하여도 반드시 이 암세포의 성장을 저해하지는 않음을 시사한다.

< 실시예 9> L1CAM 특이적 항체에 의한 담도암 세포의 침투 및 이동( invasion , migration ) 억제

인베이전 어세이(Invasion assay)를 수행하기 위해 CHEMICON사의 QCM 24-웰 세포 인베이전 어세이 키트(QCM 24-well cell invasion assay kit)을 사용하였다. 인서트(insert)의 ECM layer를 재수화 시키기 위해 300ul의 미리 데워놓은 serum free media(RPMI, 10mM HEPES, pH7.4)를 인서트에 넣고 상온에서 30분 방치해 놓았다. Choi-CK, SCK, SK-OV3, ACHN을 PBS로 두 번 씻어준 후, 3ml trypsin-EDTA 을 넣어주고, 37℃ 배양기에 넣었다. invasion medium (RPMI, 10mM HEPES pH7.4, 0.5% BSA) 으로 떨어진 세포들을 걷어내고, 세포수를 1X10⁵/200 μl invasion medium 로 맞춰 준 다음, 각각의 인서트에 세포들을 넣어주고 항체 A10-A3, 4-63 또는 공지의 항체 5G3 (10 μg/ml)과 normal mouse IgG(10 μg/ml)를 처리해 주었다. Lower chamber에 10% FBS를 넣은 invasion medium을 넣어 주고 72시간 동안 37℃ 배양기에서 배양했다. 배양이 끝난 후 인서트(insert)에 남은 세포와 배지를 제거하고, 인서트를 새 웰(well)로 옮겼다. 미리 데워놓은 세포 분리 용액 225㎕에 인서트를 올리고 37℃배양기에서 30분 동안 배양했다. 남은 세포를 완전히 떼어내기 위해 인서트를 흔들어주고, 세포 분리 용액과 세포가 섞인 용액에 75㎕ Lysis buffer/Dye solution을 넣어주고 상온에서 15분 방치했다. 200 μl의 용액을 96 well로 옮겨 480nm/520nm fluorescence로 읽었다. 그 결과 A10-A3는 ACHN에서는 억제 작용이 없지만, Choi-CK, SCK 및 SK-OV3에서는 암세포의 침투를 억제함을 알 수 있었다 (도 9A). 4-63 항체도 Choi-CK 세포의 침투를 억제하였다(도 9A). 그러나 5G3 항체는 Choi-CK 세포의 침투 억제 작용이 A10-A3, 4-63 항체보다 좋지 않았다(도 9A).

마이그레이션 어세이(Migration assay)시에는 인서트 바닥에 따로 콜라겐 타입 I 을 10 μg/ml로 코팅한 것을 제외하고는 위 방법과 동일하게 실험하였다. 그 결과 항체 A10-A3는 ACHN에서는 억제 작용이 없지만, Choi-CK, SCK 및 SK-OV-3에서는 암세포 이동을 억제함을 알 수 있다 (도 9).

< 실시예 10> A10-A3 항체에 의한 암세포 신호전달 억제

< 실시예 10-1> A10-A3 항체에 의한 암세포의 PCNA 발현 억제

세포의 증식을 표현하는 PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN (PCNA)의 발현이 A10-A3 항체에 의하여 저하되는지를 웨스턴 블럿팅으로 검증하기 위하여, Choi-CK세포에 항체 A10-A3, 마우스 IgG 10 을 각각 72시간 처리한 후 세포를 수거하여 세포용해 용액에 녹였다. BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하여 40μg의 단백질을 8% SDS-PAGE에서 전개하고 니트로셀룰로스 막으로 25V 90분동안 Western transfer하였다. 막을 5% skim milk로 밤새 4°C에서 블라킹하고 마우스 모노클로날 항-PCNA (Novocastra Laboratories 1:500) 항체와 항-β 액틴 (Oncogene, 1:4000) 항체로 1시간 반응시켰다. 그리고 anti-mouse horseradish peroxidase-conjugated antibody (Cell Signaling, 1: 1000)로 반응시키고 PBST로 세척한 후 enhanced chemiluminescence reagent (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech)로 PCNA와 β-actin을 검출하였다. 항체 A10-A3로 처리한 Choi-CK에서만 PCNA의 발현이 현저하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 10A).

< 실시예 10-2> MAPK 인산화( phosphorylation ) 억제

암세포의 성장, 침투, 생존에 관여하는 MAPK(mitogen-activated protein kinases) 인산화가 A10-A3 항체에 의하여 감소되는지를 웨스턴 블럿팅으로 검증하기 위하여, Choi-CK세포에 항체 A10-A3 및 마우스 IgG를 10 /ml로 각각 72시간 처리한 후 세포를 수거하여 세포용해 용액에 녹였다. BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하여 40μg 의 단백질을 12% SDS-PAGE에서 전개하고 니트로셀룰로스 막으로 25V 90분 동안 Western transfer하였다. 막을 5% skim milk로 밤새 4°C에서 블라킹하고 Rabbit polyclonal anti-phospho MAPK (Ab Cam 1:1000) 항체로 1% 탈지유에서 밤새 반응시켰으며, phosphorylation 되지 않은 MAPK의 발현을 조사하기 위해서는 같은 양의 단백질을 위와 같이 동일하게 처리하여 블라킹한 니트로셀룰로스 막에 anti-MAPK (Ab Cam, 1:1000) 항체로 1시간 반응시켰다. 그리고 anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated antibody (Cell Signaling, 1: 10000)로 1시간 반응시키고 PBST로 세척한 후 ECL(Amersham Pharmacia Biotech)로 phospho MAPK와 MAPK을 검출하였다. 동일한 MAPK가 발현하는 Choi-CK 암세포에서 항체 A10-A3를 처리한 Choi-CK에서만 phospho-MAPK의 양이 현저하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 10A).

< 실시예 10-3> A10-A3 항체에 의한 AKT phosphorylation 억제

암세포의 생존에 관여하는 Akt 인산화(phosphorylation)가 A10-A3 항체에 의하여 감소되는지를 웨스턴 블러팅으로 검증하기 위하여, Choi-CK세포에 항체 A10-A3와 mouse IgG 10 을 각각 30분, 1시간, 1시간 30분 및 2시간씩 처리한 후 세포를 수거하여 세포용해 용액에 녹였다. BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하여 40μg의 단백질을 12% SDS-PAGE에서 전개하고 니트로셀룰로스 막으로 25V 90분 동안 Western transfer하였다. 막을 5% skim milk로 밤새 4°C에서 블라킹하고 토끼 폴리클로날 항-포스포(phospho) Akt(Ab cam 1:1000) 항체와 토끼 폴리클로날 항-Akt (Ab cam 1:1000) 로 1% skim milk에서 밤새 반응시켰으며 항-토끼 IgG HRP (Santa Cruz 1:10000) 항체로 1시간 반응시켰다. PBST로 세척한 후 enhanced chemiluminescence reagent (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech)로 phospho Akt와 전체 Akt를 검출하였다. 항체 A10- A3를 처리한 Choi-CK에서 phospho Akt의 양이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 10B).

< 실시예 10-4> A10-A3 항체에 의한 FAK 인산화( FAK phosphorylation ) 억제

암세포의 성장 및 이동에 중요하게 작용하는 focal adhesion kinase(FAK)의 인산화(phosphorylation)가 A10-A3 항체에 의하여 감소되는지를 웨스턴 블럿팅으로 분석하기 위하여, Choi-CK, SCK세포에 항체 A10-A3을 30분,1시간,1시간 30분,2시간씩 처리한 후 세포를 수거하여 세포용해 용액에 녹였다. BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하여 40μg의 단백질을 7.5% SDS-PAGE에서 전개하고 니트로셀룰로스 막으로 25V 90분동안 Western transfer하였다. 막을 5% 탈지유(skim milk)로 밤새 4°C에서 블라킹하고 Rabbit polyclonal anti-phospho FAK (Ab cam 1:1000) 항체로 1% skim milk에서 밤새 반응시켰으며 anti-βactin (Oncogene, 1:4000) 항체로 1시간 반응시켰다. 그리고 anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated antibody (Cell Signaling, 1: 10000)로 1시간 반응시키고 TBST로 세척한 후 enhanced chemiluminescence reagent (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech)로 phospho FAK과 β-actin을 검출하였다. 항체 A10-A3로 처리한 Choi-CK와 SCK에서 phospho-FAK의 양이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 10C).

< 실시예 11> 생쥐 모델에서 항체 A10-A3의 암 세포 성장 억제 실험

누드 마우스 Balb/c nu/nu를 중앙실험동물사를 통해 SLC (일본)에서 구입하였다. 주령 및 체중은 6~8주령 및 18~22g으로 한국생명공학연구원에서 1주일 순화시켰다. 그 후 피하에 3x10⁶ cells의 Choi-CK 세포를 이식하였으며, day 20일에 390 mm³의 크기로 성장하였다 (도 10A). 종양 용적(Tumor volume)은 가로(mm)x세로(mm)x높이(mm)/2로 측정하였다. 실험최종일에 누드 마우스를 CO₂를 이용하여 희생시킨 후 종양을 분리하였으며, 무게를 측정했다. 동물에 대한 독성을 검증하기 위하여 동물의 체중을 측정하였다. 표준 편차 (SDs) 및 p value는 ANOVA(Prisim, GraphPad software, USA) 및 student t test 을 사용하여 산출되었다.

A10-A3를 1일째(day 1)부터 매주 3회씩 10 mg/kg의 농도로 꼬리정맥으로 주사하였을 때, 20일째(day 20)까지 강한 항암효과가 관찰되었다 (도 10A). 대조군(control)으로는 생쥐 IgG 항체를 동일 양으로 꼬리정맥에 주사하였다. day 20에 종양의 크기는 232 mm³으로서 대조군과 비교하여 약 40%의 항암효과가 관찰되었다(도 11A). 실험최종일(day 20)에 종양을 분리한 후 무게를 측정하였다(도 11B, 11C). 대조군의 평균 종양무게는 872 mg 이었으며, A10-A3 투여군의 평균 종양무게는 516 mg으로 약 40%의 항암효과가 관찰되었다.

A10-A3의 독성을 예측하기 위하여, 누드 마우스의 체중변화를 20일 동안 측 정하였으며, 또한 육안으로 행동의 변화를 검증하였다(도 11D). 20일째(day 20)에 대조군과 비교하였을 때 체중감소 및 이상행동도 관찰되지 않았다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자는 담도암 세포 표면에 L1CAM이 발현되어 담도암의 증식 및 침투에 관여하고, 이러한 L1CAM은 담도암에 특이적인 나쁜 예후 인자(poor prognostic factor)임을 밝혀낸바, 본 발명에 따른 담도암 세포 표면의 L1CAM 단백질을 인식하며 담도암 조직에 특이적으로 결합하는 항체 또는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 담도암의 성장, 침윤 및 이동을 억제 및 세포 사멸을 유도함으로써 담도암의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1는 생쥐 단일클론 항체 A10-A3(도1A), 4-63 (도1B) 및 공지의 항체 5G3 (도1C)와 UJ127(도1D)이 담도암을 포함한 다양한 암세포 및 정상세포 표면에 결합하는지 여부를 형광 세포염색 및 유세포 분석기를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 것이고,

도 2는 A10-A3 항체가 결합하는 항원이 L1CAM 단백질임을 면역침강과 웨스턴 블럿팅 방법으로 증명한 결과를 나타낸 것으로서, 도2A는 담도암세포 Choi-CK 세포 표면을 바이오틴화 시킨 후에 항체 A10-A3이나 공지의 항-L1CAM 단일클론항체(UJ127)로 면역 침강시킨 후 침강된 단백질을 10% SDS-PAGE과 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)를 이용한 웨스턴 블럿팅(Western blotting)을 수행한 결과이고, 도2B는 항체 A10-A3로 면역침강시킨 단백질을 10% SDS-PAGE에서 공지의 항-L1CAM 항체 (UJ127)를 사용한 웨스턴 블럿팅을 수행한 결과 L1CAM이 검출됨을 확인한 것으로, preclearing은 항체를 넣지 않고 면역침강시킨 음성대조군이고, IP with A10-A3는 항체 A10-A3로 면역침강시킨 것을 나타낸 것이며, IP with anti-L1CAM은 L1CAM에 대한 공지의 단일클론항체로 면역침강시킨 것을 나타낸 것이고, A10-A3 only는 항체 자체만을 SDS-PAGE한 것이며, 도2C는 수용성 L1을 발현시킨 HEK293T 세포 배양액을 공지의 항체인 UJ127, 5G3나 A10-A3 항체, 4-63항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅한 결과를 나타낸 것으로, -는 L1 발현백터를 넣지 않은 세포배양액이고, +는 수용성 L1 발현벡터를 넣어 배양한 세포배양액을 나타낸 것이며,

도 3은 Choi-CK세포에서 A10-A3 항체를 이용하여 면역침강시킨 단백질을 SDS-PAGE에서 분리하여 트립신으로 절단한 후 얻은 펩티드를 Q-TOF 분석을 통해 L1CAM임을 확인한 그림으로, 아래 아미노산 서열은 전체 L1CAM을 나타낸 것이고 위의 아미노산 서열은 분석된 펩타이드의 아미노산 서열로 전체 L1CAM에서 밑줄 친 부분에 각각 해당되며,

도 4는 암환자 조직을 A10-A3(도4 A), 4-63(도 4B) 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 한 결과로서, 정상 간조직에는 결합하지 않고 인체 담도암 조직에 결합하는 것을 나타내는 사진이고,

도 5는 간내담도암(도 5a) 및 간외담도암(도 5b)의 L1CAM 발현 및 임상병리학적 특징 사이에서의 관련성을 나타낸 도면이고,

도 6은 L1CAM의 발현율과 담도암 환자의 생존율과의 관련성을 간외담도암 환자(60 cases)를 대상으로 분석한 결과를, 생존율 [OS (overall survival) 및 DFS (disease free survival)]로 나타낸 자료이며,

도 7은 L1CAM에 대한 siRNA를 형질감염시킨 담도암 세포와 비특이적인 siRNA를 형질감염시킨 담도암 세포의 L1CAM 발현 수준(도 7A)과, 세포 증 식(proliferation), 침투(invasion) 및 이동(migration) 정도(도 7B)를 비교한 자료이며,

도 8은 항체 A10-A3 (도 8A), 4-63 (도 8B), 또는 공지의 L1CAM에 대한 항체 UJ127 및 5G3(도 8C)에 의하여 담도암세포 Choi-CK, SCK의 성장이 억제되는 효과를 분석한 것으로서, 세포의 양성대조군으로 난소암세포 SK-OV3, 음성대조군으로 A10-A3 항체가 결합하지 않은 신장암세포 ACHN을 사용하였고, 항체의 음성대조군으로서는 항체를 넣지 않거나(control), 항체를 끓여서 불활성화시킨 항체 (A10-A3b 또는 4-63b) 또는 정상적인 생쥐 IgG(normal mouse IgG)를 사용한 것이며, 배양 중인 세포에 항체 10 μg/ml를 넣고 72 시간 배양한 후, 세포의 성장 정도를 항체를 넣지 않은 control에 비해 백분율로 표현한 것이고,

도 9는 항체 A10-A3, 4-63 및 공지의 항체 5G3에 의하여 담도암세포(Choi-CK, SCK)의 침윤과 이동이 억제되는 효과를 분석한 것으로서, 세포의 음성대조군으로서는 A10-A3 항체가 결합하지 않은 신장암세포 ACHN를 사용하였고, 항체의 음성대조군으로서는 항체를 넣지 않거나(control), 또는 정상적인 생쥐 IgG(normal mIgG)를 사용하였으며, 배양 중인 세포에 항체 10 μg/ml를 넣고 72 시간 배양한 후, 세포의 침윤(도 9A)과 이동(도 9B) 정도를 항체를 넣지 않은 대조군(control)에 대한 백분율로 표현한 것이고,

도 10은 항체 A10-A3에 의하여 암세포의 성장, 침윤 및 이동이 억제되는 세포신호전달기작을 분석한 결과를 나타낸 것으로서, 담도암 세포주 Choi-CK 또는 SCK의 배지에 항체를 넣지 않거나 A10-A3 항체나 생쥐 면역글로불린 IgG를 첨가하여 배양한 후 수거한 세포추출물의 양을 취하여 β-actin에 대한 항체로 확인하고, PCNA(도 10A), phospho-MAPK(도 10A), phospho-AKT(도 10B), phospho-FAK(도 10C) 에 대한 항체들을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행한 사진이고,

도 11은 A10-A3 항체에 의한 암 성장 억제 효과를 인체 담도암 이종이식(xenograft) 모델 생쥐에서 증명하는 실험 결과를 나타낸 것으로서, 도 11A는 항체를 투여한 쥐 5마리와(A10-A3군)와 투여하지 않은 쥐 5마리(대조군)의 암크기를 시간별로 나타낸 결과이며, 도 11B는 암세포 이식 한 후 3주 후에 측정한 암조직 무게를 나타낸 결과이고, 도 11C는 암조직의 사진이며, 도 11D는 체중을 측정한 결과이다.

Claims

L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하되, 상기 L1CAM의 활성을 억제하는 물질은 L1CAM의 활성을 억제하는 L1CAM 특이적인 항-L1CAM 항체, 그 항-L1CAM 항체의 항원 결합 단편 및 항-L1CAM 항체 또는 그 항원 결합 단편의 변이체에서 선택되는 것이고, L1CAM의 발현을 억제하는 물질은 L1CAM의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드인, 담도암의 성장 또는 전이를 억제하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, L1CAM 활성을 억제하는 물질은 세포막 결합 형태 또는 세포막에서 유리된 형태를 인식하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, L1CAM의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 L1CAM을 암호하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항체가 수탁번호 KCTC 10966BP의 하이브리도마에 의해 분비되는 4-63, 또는 UJ127인 조성물.
제3항에 있어서, 상기 siRNA는 5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3' 또는 5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3'의 서열을 가진 조성물.
제1항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 담도암의 치료 방법.
L1CAM의 발현 또는 활성을 억제함으로써 담도암의 성장 또는 전이를 억제하는 방법.
L1CAM에 특이적인 항-L1CAM 항체를 이용하여 나쁜 예후를 가지는 담도암을 진단하는 방법.