JP5923233B2 - 胆管癌治療用薬学的組成物、胆管癌の成長または浸潤抑制方法、および胆管癌の治療方法 - Google Patents
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Description
本発明の他の目的は、前記薬学的組成物を用いて胆管癌を治療する方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、L1CAMの活性を抑制するL1CAMに対する抗体を提供することにある。
本発明の別の目的は、L1CAMの発現を抑制するオリゴヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記薬学的組成物を用いて胆管癌細胞の成長または転移を抑制する方法を提供することにある。
また、本発明に係る組成物は、投与方式によって許容可能な担体を含むことができる。
具体的に、本発明の治療方法は、前記薬学的組成物を薬学的有効量で人体内に投与することを含む。前記薬学的組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内に投与でき、局部的免疫抑制治療のために、必要であれば病変内投与を含む適切な方法によって投与される。非経口注入には筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。好ましい投与方式は静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射および点滴注射である。
癌細胞株は、全て10%牛胎児血清(Gibco社)を含有する次の培地を用いて、5%の二酸化炭素が維持される37℃の高温培養器で培養した。SH−J1(hepatocellular carcinoma)、SCK(cholangiocarcinoma)、Choi−CK(cholangiocarcinoma)およびACHN(Renal cell adenocarcinoma)細胞はMEM(Gibco社)培地を利用し、SK−OV3(ovary adenocarcinoma)細胞はMcCoy 5A Medium(Gibco社)培地を利用した。A549(non small cell lung carcinoma)は、Ham’s F12K培地で、NCI−H522(non small cell lung carcinoma)、DMS114(small cell lung carcinoma)、DMS53(small cell lung carcinoma)、NCI−H69(small cell lung carcinoma)はWaymouth’s(Gibco社)培地で培養した。SH−J1、SCKおよびChoi−CK細胞株は、キムデゴン博士(韓国の全北大学校医科大学)から得、その他の癌細胞株はATCCから購入した。
正常細胞である肝細胞(hepatocyte)はCambrax社から購入し、HUVEC細胞もCambrax社から購入した後、10%の牛胎児血清(Gibco社)を含有するEGM−2(Hyclone社)培地を用いて、5%の二酸化炭素が維持される37℃の恒温培養器で培養した。抹消血液リンパ球(PBL)は、ヒトの血液からフィコール密度勾配で遠心分離により分離した後で収得した。
培養した癌細胞Choi−CKとSCKを細胞分離緩衝液(Cell dissociation buffer)(Invitrogen)を用いて取り外し、約5×105の細胞を30μLのPBSに浮遊させた後、Balb/cマウスの右足底にChoi−CKを注射し、3日後に左足底にはSCKを注射した。これを3〜4日間隔で6回反復投与し、細胞融合1日の前にさらに注射した。リンパ節細胞と融合させるFO骨髄腫細胞株(ATCC、USA)は、10%の牛胎児血清を含有したDMEM(Gibco社)培地で2週前から培養して準備した。
A10−A3ハイブリドーマ細胞株を無血清培地(PFHM、Invitrogen社)で培養した後、培養液からタンパク質G−セファロースカラム(Pharmacia、スウェーデン)を用いて精製した(Fike et al., Focus 12:79, 1990)。精製されたA10−A3抗体の胆管癌細胞に対する結合能を蛍光細胞染色によって実施例3と同様の方法によって調査した(図1)。図1において、実線部分はモノクローナル抗体A10−A3、4−63、およびL1CAMに対する公知の抗体5G3(Pharmingen、San Diego、USA)とUJ127(Chemicon)であり、陰影部分は2次抗体のみを含んだものである。様々な癌細胞に対するA10−A3、4−63、5G3およびUJ127の結合能力を測定するために、フローサイトメトリーを用いた。その結果、前記モノクローナル抗体が癌細胞の中でもSCK、Choi−CKおよびSK−OV3などの癌細胞に結合することを観察することができた(図1のパネルA、B、CおよびD)。ところが、ACHN癌細胞、肝細胞、HUVEC、抹消血液リンパ球(PBL)とは結合しない結果を示した。
実施例4−1:抗原の分離
モノクローナル抗体A10−A3が認識する細胞表面認識因子を分離するために、まず、培養したChoi−CK細胞をPBS緩衝溶液で洗浄し、EZ−Link Sulfo−NHS−LC−Biotin(Pierce、Rockford、IL)でビオチン化させた後、細胞を溶解溶液(25mM Tris−HCl、pH7.5、250mM NaCl、5mM EDTA、1%Nonidet P−40、2μg/mLのアプロチニン、100μg/mLのフェニルメチルフルホニルフッ化物、5μg/mLのロイペプチン)を用いて4℃で20分間反応させた後、細胞残骸(debris)を除去するために遠心分離を行った。上澄み液のみを回収してBCA(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット(Pierce)を用いてタンパク質の濃度を決定した。
A10−A3によって免疫沈降したタンパク質を含むSDSゲルをCoomassie G250(BIO−RAD)で供給者のプロトコール通りに染色した。タンパク質含有部分を切り出し、30%のメタノールで5分間洗浄し、細かく粉砕した。ゲル切片を30%メタノールによって染色が完全に脱色するまで反応させてから、100%のアセトニトリルによって10分間水分を除去し、30分間真空遠心分離器によって乾燥させた。乾燥したゲル切片は50mMの重炭酸アンモニウム溶液で300ngのトリプシン(Promega)と16時間37℃で反応させた。切断されたペプチドは3回100μLの50mM重炭酸アンモニウムで抽出し、真空遠心分離器で乾燥させた。ペプチド混合物はQ−TOF micro(MicroMass)でESI Q−TOF MS/MS(electrospray quadrupole time of flight tandem mass spectrometry)によって分析した。その結果、このタンパク質がL1CAM(L1 Cell Adhesion molecule)であることを確認した(図3)。図3における下線部分は、実際アミノ酸配列がQ−TOFで解明されたことを表示する。よって、実際L1CAMに対する抗モノクローナル抗体UJ27.11をChemicon(USA)社から購入してビオチン標識付きChoi−CK細胞溶解液を用いて実施例4−1のように免疫沈降させ、ECLで確認した。図2のパネルAに示すように、A10−A3と抗−L1CAM抗体が約200kDAの同一位置にタンパク質を免疫沈降させることが分かる。
A10−A3抗体が本当にL1CAMを認識するかを再確認するために、Choi−CKの細胞溶解液を用いてこの抗体でまず免疫沈降を行った。タンパク質Gプラス−セファロース(Santa Cruz Biotechnology;Santa Cruz)に非特異的に結合するタンパク質は、細胞溶解液を20μLのタンパク質Gプラス−セファロースと4℃で2時間反応させた後、遠心分離して上澄み液のみを回収して準備し(図2のpreclearing)、回収した上澄み液はさらに約1μgの抗体と4℃で12時間反応させた。ここに20μLのタンパク質Gプラス−セファロースを添加して4℃で2時間反応させた後、遠心分離して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を細胞溶解液で10回以上洗浄し、残っているタンパク質を10%SDS−PAGEで2−メルカプトエタノールなしに分離した。このタンパク質をニトロセルロース膜に移してウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を5%脱脂乳含有のPBST(PBS+0.1%Tween20)緩衝溶液で1時間反応させてから、前記PBST緩衝溶液で2回以上洗浄した。前記反応されたニトロセルロース膜を公知の抗−L1CAM抗体UJ127(Chemicon)を1次抗体として添加して1時間反応させた。前記PBST緩衝溶液で5回洗浄した後、抗−マウスIgGのホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート(1:5000、Sigma)で1時間反応させた。さらにPBST緩衝溶液で5回洗浄した後、ECL検出試薬(Amersham biosciences)で発色させた。その結果、A10−A3によって免疫沈降した約200kDaサイズのタンパク質にL1CAM抗体が結合することを確認した(図2のパネルB)。これはさらにA10−A3抗体がL1CAMを認識することを示す。
水溶性L1CAMを発現させるための発現ベクターを製作するために、培養された癌細胞Choi−CKからRNA抽出キット(Roche co.)を用いてtotal RNAを分離した。分離されたtotal RNAを鋳型としてRT−PCRキット(Roche co.)を用いて、2つの両末端プライマーIg−dom−F(5’−gAg gAg gAA TTC Cgg CgC Cgg gAA AgA Tgg TCg Tgg Cg−3’、38mer)とL1−Fn−Stop−R(5’−CTC TAg AgT TCT CgA gTC AgA gCC TCA CgC ggC C−3’、34mer)とpfu重合酵素(Solgent co.)を用いて95℃で5分間前処理反応させた後、95℃、30秒/58℃、30秒/72℃、2分間25回連鎖重合反応を行い、72℃で10分間重合反応を行って増幅した。増幅された水溶性L1 DNA断片をpJK−dhfr2発現ベクター(Aprogen)に挿入するために、ベクターと増幅されたDNA断片をEcoRIとXhoI酵素でそれぞれ切断して1%アガロースゲルに電気泳動して当該断片を切り取ってGel purification kit(Intron co.)を用いて回収した。回収された2つのDNA断片をT4 DNAリガーゼ(Roche co.)を用いて16℃で30分間反応させて大腸菌(E.coli DH5α)にヒートショック(heat shock)法によって形質転換させた。形質転換された細胞からプラスミドDNAを分離して塩基配列を分析することにより、水溶性L1CAMのcDNAがクローニングされていることを確認した。製造された発現ベクターはpJK−dhfr2−L1−monomerと命名した。
293T細胞で水溶性L1CAMを発現させた細胞培養液と、水溶性L1CAMを発現させていない細胞培養液に対して10%SDS−PAGEとウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を5%脱脂乳含有のTBST(TBS+0.05%Tween20)緩衝溶液を用いて4℃で12時間反応させてから、前記TBST緩衝溶液で2回以上洗浄した。公知の抗−L1CAM抗体UJ127(Chemicon)および5G3(Pharmingen)と前記A10−A3および4−63抗体を、5%脱脂乳含有のTBST緩衝溶液に1:10000で希釈された1次抗体と1時間反応させた。前記TBST緩衝溶液で5回洗浄した後、抗マウスIgGのホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート(1:5000、Sigma)で1時間反応させた。さらにTBST緩衝溶液で5回洗浄した後、ECL検出試薬(Amersham biosciences)で発色させた。その結果、前記各抗体は約200kDaサイズの水溶性L1CAMに結合することを確認した(図2のパネルC)。また、前記L1発現細胞培養液に対して前記抗体を用いてELISAを行った結果、各抗体は発現した水溶性L1CAMに対する結合特異性があることを確認した。
胆管癌の免疫組織化学染色のために、癌から厚さ3μmの切片を準備した。この切片を、それぞれポリ−L−リジンを塗布したスライドに接着させた。まず、60℃のオーブンで3時間乾燥させた後、キシレンによって室温で5分間3回脱パラフィン化させた。100%、90%、80%および70%のアルコールでそれぞれ1分間処理し、抗原性回復のためにtarget retrieval solution(DAKO、Carpinteria、CA)にスライドを浸漬した後、圧力釜を用いて4分間沸かしたTBST(Tris-buffered saline-Tween 20)緩衝溶液で水洗した。高感度の免疫組織化学染色のために、Biotin−free Tyramide Signal Amplification SystemであるCSAIIkit(DAKO、Carpinteria、CA)を用いた。非特異抗原を除去するために、3%の過酸化水素に5分間反応させた後、緩衝溶液で5分間2回洗浄し、非特異タンパクの結合を除去するために十分な無血清蛋白質ブロック(serum-free protein block)で5分間反応させた。1次抗体(A10−A3、4−63、1:50希釈)を塗布して15分間反応させ、抗−マウス免疫グロブリン−HRPに15分間処理した。その後、増幅剤(Amplification reagent)に15分間放置した後、抗−フルオレセイン−HRPに15分間反応させた。DABを用いて5分間発色させた後、Meyer’s hematoxylin で対照染色を行った。それぞれの段階が終わると、TBST緩衝溶液で5分間2回洗浄した。陰性対照群は染色の際に1次抗体を除外して正常羊血清を添加するか、あるいは1次抗体の代わりに正常マウスIgG1血清を添加し、残りの全ての過程は同様にした。その結果、正常組織には結合せず、胆管癌組織にはA10−A3および4−63抗体がよく結合することが分かった(図4)。
前記結果は胆管癌組織でL1CAMが発現することを意味する。
L1CAMの発現率と胆管癌患者の生存率との関連性を肝外胆管癌患者(60ケース)を対象として分析した結果、高いL1CAM発現率を有するグループが、低いL1CAM発現率を有するグループよりOS(overall survival)およびDFS(disease free survival)が統計学的に有意的に低い、すなわち死亡危険性が高いことを確認した(図6)。生存グラフにおいて、L1CAMの過発現と低発現は胆管癌患者の2年間の総生存率(OS)に多くの差異を示し、統計学的に最も有効性があるものと確認された。また、生存グラフにおいて、L1CAMの過発現および低発現は胆管癌患者の2年間再発せずに生存することが可能な確率(DFS)が統計学的に有意性を持つものと確認された。
実施例7−1:胆管癌細胞におけるsiRNAを用いたL1CAMの発現抑制
Choi−CKとSCKでL1CAMの発現をノックダウンさせるために、L1CAMに対するsiRNAオリゴヌクレオチド(5’−TGGTACAGTCTGGGdtdt−3’および5’−CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt−3’)と非特異的なオリゴヌクレオチド(5’−CAGTCGCGTTTGCGACTGGdtdt−3’)をそれぞれ形質感染させた後、72時間培養した。L1CAMのノックダウン(knock down)はA10−A3を用いたフローサイトメトリー(flow cytometry)、RT−PCRおよびウエスタンブロットによって確認した。その結果、L1CAMに対するsiRNAをChoi−CKとSCKに処理したところ、非特異的なsiRNAを処理した対照群と比較したとき、L1CAMの全体発現量と細胞表面に存在するL1CAMの量が減少することを確認した(図7のパネルA)。
L1CAMに対するsiRNAを形質感染させた胆管癌細胞と非特異的なsiRNAを形質感染させた胆管癌細胞の増殖(proliferation)、浸潤(invasion)および移動(migration)の度合いを比較した。増殖の度合いは、それぞれ同数の細胞を計数して72時間後の細胞をトリファンブルー(Tryphan Blue)溶液を用いて測定した。また、浸潤および移動の度合いはQCM24−well cell invasion assay kit(Chemicon)とQCM 24−well colorimetric cell migration assay kit(Chemicon)を用いて分析した。L1CAMがノックダウンされた細胞群は、L1CAMが正常的に発現する細胞群に比べて増殖、浸潤および移動の度合いが減少することを確認した。これはL1CAMが胆管癌細胞の成長、移動および浸潤に作用していることを示唆する(図7のパネルB)。
L1CAMに対する抗体が胆管癌細胞の成長を阻害するかを実験するために、A10−A3抗体が結合するChoi−CKおよびSCKと、陽性対照群としての卵素癌細胞株SK−OV−3と、陰性対照群としてのACHN細胞を3mLの培地内に2×105cellsずつ計数して6ウェルプレートで培養し、前記モノクローナル抗体を10μg/mLの濃度で添加した後、細胞を37℃のCO2反応器で72時間反応させた。そして、細胞を回収して0.2%トリファンブルー溶液で死細胞と生細胞を数え、全体細胞中の生細胞の百分率を求めた。その結果、A10−A3抗体によってChoi−CKおよびSCK細胞の成長はSK−OV3細胞のように著しく減少し、ACHNは何の影響も受けなかった(図8のパネルA)。一方、4−63抗体も胆管癌の成長を抑制した(図8のパネルB)。
L1CAMに特異的に結合するものと知られている公知の抗体UJ127(Chemicon)と5G3(Pharmingen)を前記胆管癌細胞に処理したとき、UJ127抗体は前記癌細胞の成長を阻害したが、5G3抗体の場合には胆管癌細胞(Choi−CK)の成長を若干阻害した(図8のパネルC)。5G3抗体はChoi−CK細胞には結合した(図1のパネルC)。この結果は、モノクローナル抗体が癌細胞に結合するとしても、必ずしも癌細胞の成長を阻害するのではないことを示唆する。
インベイションアッセイ(Invasion assay)を行うために、CHEMICON社のQCM 24−well cell invasion assay kitを使用した。インサート(insert)のECM層を再水和するために、予め温め直した300μLの無血清培地(RPMI、10mM HEPES、pH7.4)をインサートに入れ、常温で30分間放置しておいた。Choi−CK、SCK、SK−OV3およびACHNをPBSによって2回洗浄した後、3mLのトリプシン−EDTAを添加し、37℃の培養器に入れた。インベイジョン培地(RPMI、10mM HEPES pH7.4、0.5%BSA)から取り外した細胞を収去し、細胞数を1×105/200μLのインベイジョン培地に合わせた後、それぞれのインサートに細胞を仕込み、抗体A10−A3、4−63または公知の抗体5G3(10μg/mL)と正常マウスIgG(10μg/mL)を処理した。Lower chamberに10%FBSを入れたインベイジョン培地を仕込み、72時間37℃の培養器で培養した。培養が終わった後、インサートに残った細胞と培地を除去し、インサートを新規のウェルに移した。予め温め直した細胞分離溶液225μLにインサートを乗せ、37℃の培養器で30分間培養した。残った細胞を完全に取り外すためにインサートを振とうし、細胞分離溶液と細胞入り溶液に75μLのLysis buffer/Dye solutionを仕込み、常温で15分間放置した。200μLの溶液を96ウェルに移して480nm/520nmのfluorescenceで読み取った。その結果、A10−A3はACHAでは抑制作用がないが、Choi−CK、SCKおよびSK−OV3では癌細胞の浸潤を抑制することが分かった(図9のパネルA)。4−63抗体もChoi−CK細胞の浸潤を抑制した(図9のパネルA)。ところが、5G3抗体はChoi−CK細胞の浸潤抑制作用がA10−A3および4−63抗体より良くなかった(図9のパネルA)。
実施例10−1:A10−A3抗体による癌細胞のPCNA発現抑制
細胞の増殖を表現するPCNA(Proliferating cell nuclear antigen)の発現がA10−A3抗体によって低下するかをウエスタンブロットによって検証するために、Choi−CK細胞に抗体A10−A3、マウスIgG10をそれぞれ72時間処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。BCA(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット(Pierce)を用いてタンパク質の濃度を決定した後、40μgのタンパク質を8%SDS−PAGEで展開し、ニトロセルロース膜に25Vで90分間ウエスタントランスファー(Western transfer)した。膜を5%脱脂乳で一晩4℃でブロッキングし、マウスモノクローナル抗−PCNA(Novocastra Laboratories、1:500)抗体および抗−βアクチン(Oncogene、1:4000)抗体と1時間反応させた。そして、抗−マウスホースラディシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗体(Cell Signaling、1:1000)と反応させ、PBSTで洗浄した後、ECL(Enhanced Chemiluminescence Reagent)(Amersham Pharmacia Biotech)でPCNAとβ−actinを検出した。抗体A10−A3で処理したChoi−CKでのみPCNAの発現が著しく減少することを観察することができた(図10のパネルA)。
癌細胞の成長、浸潤および生存に関与するMAPK(mitogen-activated protein kinase)リン酸化がA10−A3抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって検証するために、Choi−CK細胞に抗体A10−A3およびマウスIgGを10μg/mLでそれぞれ72時間処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。BCA(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット(Pierce)を用いてタンパク質の濃度を決定した後、40μgのタンパク質を12%SDS−PAGEで展開し、ニトロセルロース膜に25Vで90分間ウエスタントランスファーした。膜を5%脱脂牛で一晩4℃でブロッキングし、Rabbit polyclonal anti−phospho MAPK(Ab Cam、1:1000)抗体と1%脱脂乳で一晩反応させた。リン酸化していないMAPKの発現を調査するためには、同量のタンパク質を前述のように同様に処理し、ブロッキングしたニトロセルロース膜とanti−MAPK(Ab Cam、1:1000)抗体を1時間反応させた。そして、抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗体(Cell Sgnaling、1:10000)と1時間反応させ、PBSTで洗浄した後、ECL(Amersham Pharmacia Biotech)でphospho MAPKとMAPKを検出した。同一のMAPKが発現するChoi−CK癌細胞で抗体A10−A3を処理したChoi−CKでのみphospho−MAPKの量が著しく減少することを観察することができた(図10のA)。
癌細胞の生存に関与するAktリン酸化(phosphorylation)がA10−A3抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって検証するために、Choi−CK細胞に抗体A10−A3とマウスIgG10をそれぞれ30分、1時間、1時間30分および2時間ずつ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。BCA(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット(Pierce)を用いてタンパク質の濃度を決定した後、40μgのタンパク質を12%SDS−PAGEで展開した後、ニトロセルロース膜に25Vで90分間ウエスタントランスファーした。膜を5%脱脂牛で一晩4℃でブロッキングし、rabbit polyclonal anti−phospho Akt(Ab cam、1:1000)抗体およびrabbit polyclonal anti−Akt(Ab cam、1:1000)と1%脱脂乳で一晩反応させ、抗−ウサギIgG HRP(Santa Cruz、1:10000)抗体と1時間反応させた。PBSTで洗浄した後、ECL(enhanced chemiluminescence reagent)(Amersham Pharmacia Biotech)でphospho Aktと全体Aktを検出した。抗体A10−A3を処理したChoi−CK細胞でphospho Aktの量が減少することを観察することができた(図10のB)。
癌細胞の成長および移動に重要に作用するFAK(focal adhesion kinase)のリン酸化がA10−A3抗体によって減少するかをウエスタンブロットによって分析するために、Choi−CKおよびSCK細胞に抗体A10−A3を30分、1時間、1時間30分、2時間ずつ処理した後、細胞を収去して細胞溶解液に溶かした。BCA(bicinchoninic acid)タンパク質検定キット(Pierce)を用いてタンパク質の濃度を決定した後、40μgのタンパク質を7.5%SDS−PAGEで展開した後、ニトロセルロース膜に25Vで90分間ウエスタントランスファーした。膜を5%脱脂乳で一晩4℃でブロッキングし、rabbit polyclonal anti−phospho FAK(Ab cam、1:1000)抗体と1%脱脂乳で一晩反応させ、anti−β actin(Oncogene、1:4000)抗体と1時間反応させた。そして、抗−ウサギホースラディシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗体(Cell Signaling、1:10000)と1時間反応させ、TBSTで洗浄した後、ECL(enhanced chemiluminescence reagent)(Amersham Pharmacia Biotech)でphospho FAKとβ−actinを検出した。抗体A10−A3で処理したChoi−CKおよびSCKでphospho−FAKの量が著しく減少することを観察することができた(図10のC)。
ヌードマウスBalb/c nu/nuを中央実験動物社を介してSLC(日本)から購入した。週齢および体重は6〜8週齢および18〜22gであって、韓国生命工学研究院で1週間馴化させた。その後、皮下に3×106cellsのChoi−CK細胞を利殖し、20日目に390mm3の大きさに成長した(図10のA)。腫瘍容積(Tumor volume)は横(mm)×縦(mm)×高さ(mm)/2で測定した。実験最終日にヌードマウスをCO2を用いて犠牲にした後、腫瘍を分離し、その重量を測定した。動物に対する毒性を検証するために、動物の体重を測定した。標準偏差(SDs)およびp−valueはANOVA(Prisim、GraphPad software、USA)およびStudent t testを用いて算出した。
A10−A3を1日目(day 1)から毎週3回ずつ10mg/kgの濃度で尾静脈に注射したとき、20日目(day 20)まで強い抗癌効果が観察された(図10のA)。対照群(control)としてはマウスIgG抗体を同量で尾静脈に注射した。20日目の腫瘍のサイズは232mm3であって、対照群と比較して約40%の抗癌効果が観察された(図11のA)。実験最終日(20日目)に腫瘍を分離した後、その重量を測定した(図11のB、C)。対照群の平均腫瘍重量は872mgであり、A10−A3投与群の平均腫瘍重量は516mgであって、約40%の抗癌効果が観察された。
Claims (5)
- L1CAMの活性または発現を抑制する物質を含んでなり、
前記L1CAMの活性を抑制する物質は胆管癌細胞の成長、浸潤及び移動を抑制するL1CAM特異的な抗−L1CAM抗体であり、
前記L1CAMの発現を抑制する物質はL1CAMの発現を抑制するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、胆管癌の成長または転移を抑制するための薬学的組成物。 - 前記L1CAMの活性を抑制する物質が、細胞膜結合形態または細胞膜から遊離された形態を認識することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記L1CAMの発現を抑制するオリゴヌクレオチドが、L1CAMをコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAおよびshRNAよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗体が、受託番号KCTC10966BPのハイブリドーマによって分泌される4−63、またはUJ127であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記siRNAが5’−TGGTACAGTCTGGGdtdt−3’または5’−CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt−3’の配列を有することを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
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