KR100756051B1 - Ｌ1ｃａｍ 단백질에 대한 새로운 단일클론항체, 이를분비하는 하이브리도마 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L1CAM 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규한 항체 A10-A3는 담도암과 폐암을 비롯한 여러 암세포에서 발현하는 L1CAM 단백질에 특이적으로 결합하여 암 세포의 성장, 침윤 및 이동을 억제할 수 있다.

L1CAM, 단일클론항체, A10-A3, 암전이, 암 치료

Description

Ｌ1ＣＡＭ 단백질에 대한 새로운 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이의 제조방법{A Novel monoclonal antibody specific to the L1CAM, a hybridoma producing the same and a method producing the same}

도 1은 생쥐 단일클론항체 A10-A3(도 1A) 및 공지의 항체 5G3 (도 1C) 및 UJ127(도1B)이 담도암과 소세포폐암을 포함한 다양한 암세포 및 정상세포 표면에 결합하는지 여부를 형광 세포염색 및 유세포 분석기를 이용하여 분석한 결과를 나타내는 것이고,

도 2는 A10-A3 항체가 결합하는 항원이 L1CAM 단백질임을 면역침강과 웨스턴 블럿팅 방법으로 증명한 결과를 나타낸 것으로서, 도 2A는 담도암세포 Choi-CK 세포 표면을 바이오틴화시킨 후에 항체 A10-A3나 공지의 항-L1CAM 단일클론항체(UJ127)로 면역 침강시킨 후 침강된 단백질을 10% SDS-PAGE와 Streptavidin-HRP를 이용한 웨스턴 블럿팅(Western blotting)을 수행한 결과이고, 도 2b는 항체 A10-A3로 면역침강시킨 단백질을 10% SDS-PAGE에서 공지의 항-L1CAM 항체(UJ127)를 사용한 웨스턴 블럿팅을 수행한 결과 L1CAM이 검출됨을 확인한 것으로, preclearing은 항체를 넣지 않고 면역침강시킨 음성대조군이고, IP with A10-A3는 항체 A10-A3로 면역침강시킨 것을 나타낸 것이며, IP with anti-L1CAM은 L1CAM에 대한 공지의 단일클론항체로 면역침강시킨 것을 나타낸 것이고, A10-A3 only는 항체 자체만을 SDS-PAGE한 것이며,

도 3은 Choi-CK세포에서 A10-A3 항체를 이용하여 면역침강시킨 단백질을 SDS-PAGE에서 분리하여 트립신으로 절단한 후 얻은 펩티드를 Q-TOF 분석을 통해 L1CAM임을 확인한 그림으로, 아래 아미노산 서열은 전체 L1CAM을 나타낸 것이고 위의 아미노산 서열은 분석된 펩타이드의 아미노산 서열로 전체 L1CAM에서 밑줄 친 부분에 각각 해당되며,

도 4는 A10-A3 항체가 인식하는 L1CAM의 도메인을 결정한 실험 결과를 나타낸 것으로서, 도 4A는 L1CAM을 면역글로불린 (Ig) 도메인이나 파이브로넥틴 타입 III(fibronectin type III, Fn) 도메인에 인간 Ig의 Fc를 각각 융합시켜 만든 Ig dom이나 Fn dom 단백질에 대하여 A10-A3, 5G3, UJ127 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 한 결과를 나타낸 것이고,

도 4B는 수용성 L1CAM (SolL1), Ig 도메인 중 1-6(Ig1-6), 1-5(Ig1-5), 1-4(Ig1-4), 1-3(Ig1-3), 1-2(Ig1-2), 1(Ig1), 2-6(Ig2-6) 도메인에 Ig Fc를 융합시킨 단백질에 대하여 A10-A3 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 한 결과를 나타낸 것이고, 도 4C는 상기 Ig 변형체에 대하여 5G3 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 한 결과를 나타낸 것이며,

도 5는 암환자 조직을 A10-A3 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 한 결과로서, 정상 간조직에는 결합하지 않고 인체 담도암, 유방암, 난소암, 피부암, 췌장암, 소세포폐암 및 비소세포폐암 조직에 결합하는 것을 나타내는 사진이고,

도 6은 항체 A10-A3 (도6A) 또는 공지의 L1CAM에 대한 항체 UJ127 또는 5G3(도6B)에 의하여 담도암세포 Choi-CK와 소세포폐암세포 DMS114의 성장이 억제되는지를 분석한 것으로서, 세포의 양성대조군으로 난소암세포 SK-OV3, 음성대조군으로 A10-A3 항체가 결합하지 않은 신장암세포 ACHN을 사용하였고, 항체의 음성대조군으로서는 항체를 넣지 않거나(control), 항체를 끓여서 불활성화시킨 항체(A10-A3b) 또는 정상적인 생쥐 IgG(normal mouse IgG)를 사용한 것이며, 배양 중인 세포에 항체 10 μg/ml를 넣고 72시간 배양한 후, 세포의 성장 정도를 항체를 넣지 않은 control에 비해 백분율로 표현한 것이고,

도 7은 항체 A10-A3에 의하여 담도암세포(Choi-CK, SCK)와 소세포폐암세포 DMS114, 난소암세포(SK-OV3)의 침윤과 이동이 억제되는 효과를 분석한 것으로서, 세포의 음성대조군으로서는 A10-A3 항체가 결합하지 않은 신장암세포 ACHN를 사용하였고, 항체의 음성대조군으로서는 항체를 넣지 않거나(control), 또는 정상적인 생쥐 IgG(normal mIgG)를 사용하였으며, 배양 중인 세포에 항체 10 μg/ml를 넣고 72시간 배양한 후, 세포의 침윤(도7A)과 이동(도7B) 정도를 항체를 넣지 않은 대조 군(control)에 대한 백분율로 표현한 것이고,

도 8은 항체 A10-A3에 의한 담도암세포의 사멸 유도 효과를 나타낸 것으로, 음성대조군은 생쥐 면역글로불린 IgG를 처리한 것으로 항체 A10-A3를 처리 한 후 도8A에서는 각각의 세포에 Annexin-V-FITC를 반응시켜 세포표면에 결합하는지 관찰하여 A10-A3 항체의 사멸유도 효과를 보여준 것이고, 도8B에서는 항체 A10-A3에 의해 활성화된 카스파제-3(Caspase-3)를 FACS로 검출한 것이고,

도 9는 항체 A10-A3에 의하여 암세포의 성장, 침윤 및 이동이 억제되는 세포신호전달기작을 분석한 결과를 나타낸 것으로서, 담도암 세포주 Choi-CK 또는 SCK의 배지에 항체를 넣지 않거나 A10-A3 항체나 생쥐 면역글로불린 IgG를 첨가하여 배양한 후 수거한 세포추출물의 양을 취하여 β-actin에 대한 항체로 확인하고, PCNA(도 9A), phospho-MAPK(도 9A), phospho-AKT(도 9B) 및 phospho-FAK(도 9C) 에 대한 항체들을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행한 사진이고,

도 10은 암세포의 인테그린(integrin) 발현 여부를 FACS로 분석하고 (도 10A), 인테그린에 대한 항체와 A10-A3 항체에 의한 암세포 성장억제를 비교한 결과(도 10B)를 나타낸 것이고,

도 11은 A10-A3 항체가 수용성 L1CAM에 의한 담도암세포의 증식을 억제하는 결과를 나타낸 것으로서, ◆는 담도암세포 배양액에 여러 농도의 수용성 L1CAM을 첨가하여 세포의 증식을 관찰한 결과이고, ■는 담도암세포 배양액에 수용성 L1CAM과 A10-A3 항체를 섞은 혼합물을 첨가하여 세포의 증식을 관찰한 결과이다. 도11A는 Choi-CK 세포를 사용하여 얻은 결과이고, 도11B는 SCK 세포를 사용하여 얻은 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 A10-A3 항체에 의한 암성장 억제 효과를 인체 담도암 이종이식(xenograft) 모델 생쥐에서 증명하는 실험 결과를 나타낸 것으로서, 도 12A는 항체를 투여한 쥐 5마리와(A10-A3군)와 투여하지 않은 쥐 5마리(대조군)의 암크기를 시간별로 나타낸 결과이며, 도 12B는 암세포 이식 한 후 3주 후에 측정한 암조직 무게를 나타낸 결과이고, 도 12C는 체중을 측정한 결과이다.

본 발명은 L1CAM에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 담도암 세포주로 면역화한 생쥐의 복강으로부터 얻은, 담도암과 폐암 등 각종 암세포에서 발현하는 L1CAM 단백질에 특이적으로 결합하는 새로운 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

L1CAM (L1 cell adhesion molecule)은 세포 표면에서 세포간부착(cell-to-cell adhesion)을 중개하는 면역글로불린 수퍼패밀리 세포부착단백질들(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules, CAMs)에 속하는 내재성 막 당단백질(integral membrane glycoprotein)중 하나로서, 그 분자량은 220 kDa에 달한다. L1CAM은 원래 뉴런, 조혈세포 및 신장 세포 등에서 발견되며(Bateman, et al, EMBO J. 15:6050-6059; 1996), 그 기능은 뉴런의 이동, 신경 돌기의 성장, 세포 이동이다. 사람의 L1CAM 유전자는 생쥐와 쥐의 L1CAM 상동체(homolog)에서 축퇴성 올리고뉴클레오타이드(degenerate oligonucleotide)를 프로브로 사용하여 인간 태아의 뇌 cDNA library로부터 분리하였다(Hlavin, M. L. & Lemmon, V. Genomics 11: 416-423, 1991; US patent 5872225, 등록일 1999. 2. 16). 이것은 원래 주로 뇌에서 발현되는 것으로 알려졌지만 몇몇 정상조직 및 최근에는 여러 암세포에서도 발견되기 시작하였다.

L1CAM과 암과의 연관성과 관련하여, L1CAM이 흑색종(melanoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 난소암 및 대장암 등 여러 암에서 발현되는 것이 보고되었으며 (Takeda, et al., J. Neurochem. 66:2338-2349, 1996; Thies et al, Eur. J. Cancer, 38:1708-1716, 2002; Arlt et al., Cancer Res. 66:936-943, 2006; Gavert et al., J. Cell Biol. 168:633-642, 2005), 막 결합 형(membrane bound form) 외에도 절단된 산물(cleavage product)이 세포 외로 분비되는 것이 발견되었다 (Gutwein et al., FASEP J. 17(2):292-4, 2003). 그리고 최근 암세포 성장에 중요한 역할을 하는 분자의 하나로 탐색됨으로써(Primiano, et al., Cancer Cell. 4(1):41-53 2003), 암치료의 새로운 타겟으로 부상되었다(US2004/0115206 A1 출원 2004.6.17). 최근 L1CAM이 대장암의 인베이시브 프론트(invasive front)에서 발현되고(Gavert, et al., J Cell Biol. 14;168(4):633-42. 2005), 난소암에서 이 분자에 대한 항체가 암세포 성장과 전이를 억제함이 밝혀졌다(Arlt, et al., Cancer Res. 66:936-943. 2006). 한편, US 20040115206은 L1CAM의 항체가 L1CAM의 시그널 트랜스덕션(signal transduction)을 억제하는 것이 아니라 촉진하였다는 보고도 있었다고 개시하고 있는 등, L1CAM의 항체가 반드시 L1CAM의 작용을 억제하는 것은 아니라는 것이 알려져 있었다.

유럽 특허출원 EP 1 172 654 A1 및 미국 특허출원 US 2004/0259084호는, L1CAM이 난소암, 자궁내막암 또는 그러한 암의 소인의 존재에 대한 표식이 된다는 전제 하에, 난소암 또는 자궁내막암의 진단 및 예후판정을 위해 환자의 샘플에서 L1CAM의 항체를 통해 L1CAM 수준을 결정하는 것을 특징으로 하는 수단, 및 세포 독성을 가진 약물과 L1CAM 항체를 결합시켜 충분한 양으로 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법에 대해 개시하고 있다.

또한, 미국 특허출원 US 2004/0115206호는 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 암세포 사멸을 유도하는 제제 및 세포 사멸을 위해 상기 항체를 사용하는 수단 및 L1CAM 항체가 포함된 약제학적 조성물에 관하여 개시하면서, 암세포에서 세포 성장을 저해하고 세포사를 유도할 수 있는 유효량의 항 L1CAM 항체를 세포에 접촉(contacting)시키는 것에 의해 세포의 성장을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 것이 개시되어 있다.

또한, 국제출원 PCT/EP2005/008148은 난소 및 자궁내막암에서 과발현되는 L1CAM 단백질 및 그들의 발현을 저해하는 조성물 및 이를 이용하여 난소 및 자궁내막암을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 이 문헌은 L1CAM 단백질의 기능을 저해하는 L1CAM 항체 및 그의 유도체를 포함하는 조성물이 난소암 및 자궁내막암의 기능을 억제하여 암세포의 이동 및 진전을 저지하여 암의 치료가 가능하다고 기재하고 있다.

그러나 이러한 문헌들에는 본 발명에 따른 신규한 항체 A10-A3 및 L1CAM 단백질의 Ig1 도메인에 특이적으로 결합하는 항체가 난소암, 유방암, 담도암 및 폐암 등의 각종 암세포의 성장, 전이 및 침윤을 효과적으로 억제하며 암세포의 사멸을 유도하는 항체라는 것에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않았다.

본 발명자는 담도암의 진단 또는 치료에 사용할 수 있는 항체를 개발하고자 노력하던 중, 최근 확립된 담도암 세포주(Kim et al, Genes, chromosome & Cancer 30:48-56, 2001)를 생쥐에 면역주사하여 담도암 표면에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 얻었으며, 이를 A10-A3 항체로 명명하였다. 또한, 본 발명자는 상기 A10-A3항체가 결합하는 특정 단백질이 L1CAM 단백질임을 확인하였는데, 상기 A10-A3 항체는 담도암 뿐만 아니라 유방암, 난소암, 폐암, 대장암 및 피부암 등의 암세포에 특이적으로 결합하나 말초혈관 림프구, 간세포, 혈액 내피세포와 같은 정상 세포와는 결합하지 않았다. 지금까지 L1CAM이 유방암, 난소암, 대장암, 피부암 등 에 발현됨은 밝혀졌으나 담도암 또는 폐암에 발현되는 사실은 알려져 있지 않았으므로, 본 발명자들은 L1CAM에 대한 항체가 담도암 또는 폐암의 성장이나 전이를 억제할 수 있는지를 분석한 결과, 상기 A10-A3 항체는 담도암 및 폐암 등의 암세포의 성장, 이동, 침윤을 억제한다는 놀라운 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명의 A10-A3 항체가 L1CAM에 대한 새로운 단일클론항체인지를 확인하기 위하여 A10-A3 항체의 에피토프(epitope)를 분석하고 공지의 L1CAM에 대한 단일클론항체인 5G3와 UJ127의 에피토프와 비교한 결과, A10-A3는 L1CAM의 Ig1 도메인(domain)에 결합하였으나, 5G3 및 UJ127은 각각 Ig2 도메인과 피브로넥틴 타입 III 도메인(fibronectin type III domain)에 결합함을 확인하여, A10-A3가 L1CAM에 대한 새로운 단일클론항체임을 발견하였다.

따라서, 본 발명자는 본 발명에 따른 신규한 항체 A10-A3가 L1CAM 단백질의 Ig1 도메인에 특이적으로 결합하여 암세포의 성장, 전이 및 침윤을 효과적으로 억제하며 암세포의 사멸을 억제하는 항체임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 L1CAM 단백질을 특이적으로 인식하는 신규한 단일클론항체, 이를 생산 및 분비할 수 있는 하이브리도마 및 상기 하이브리도마를 배양하여 상기 단일클론항체를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여 담도암과 폐암을 비롯하여 L1CAM이 발현되는 암의 성장 및 전이를 억제하는 방법 및 그러한 약제학적 조성물 을 제공하는 것이다.

본 발명은 L1CAM 단백질을 특이적으로 인식하는 새로운 단일클론항체에 관한 것이다.

본 발명의 용어 ‘단일클론항체’란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.

단일클론항체는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler et al., European Journal of Immunology 6;511-519). 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하 고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.

본 발명의 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피, 친화성크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 단일클론항체는 본 발명에 따른 하이브리도마에 의하여 분비되며 담도암 또는 폐암 세포 표면에 특이적으로 결합한다. 또한, 상기 암세포뿐만 아니라, 간암, 난소암, 위암, 피부암, 대장암 및 유방암 등 다른 암세포주에도 결합하지만(도 1 참조), 간세포, HUVEC(인간 유래의 탯줄정맥내피세포), 말초혈액 림프구(periperal blood lymphocyte) 등 정상 세포에는 결합하지 않는다(도 1 참조).

상기 단일클론항체는 항원과 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화 (neutralization)시키며, 세포를 죽일 수 있다. 예를 들어, 암세포를 특이적으로 인식하는 단일클론항체는 암세포 성장이나 이동에 관여하는 세포 표면 분자나 수용성 분자에 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화할 수 있고, 항원과 결합된 항체는 보체를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 보체에 의하여 항원이 제거되도록 할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 항원에 결합하여 그 항원이 식균세포에 의하여 더욱 잘 잡아먹히게 만들 수도 있다. 또한, 단일클론항체가 결합되어 있는 항원 세포는 자연살해세포(NK cell)에 의해 보다 쉽게 살해당함으로써, 상기 단일클론항체를 면역반응을 통한 항원의 제거에 이용할 수 있다. 따라서, 항체 자체만으로 면역반응을 통한 항원의 제거 및 항원 감소의 결과를 기대할 수 있어 본 발명의 항체는 담도암 및 폐암을 비롯한 상기 언급한 다양한 암의 진단 또는 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 양태에서, 상기 단일클론항체는 암세포와 결합하여 암세포의 성장 또는 전이를 억제하거나, 포식, 자살 또는 살해시킨다.

구체적으로는, 상기 단일클론항체는 암세포 표면 항원인 L1CAM과 결합하여 L1CAM의 활성을 저해함으로써 암세포의 성장과 전이를 억제할 수 있으며, 보다 구체적으로는 L1CAM의 Ig1 영역에 결합하여 L1CAM이 발현되는 암의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서는, 상기 단일클론항체는 분비된 L1CAM과 결합하여 암세포의 성장을 저해한다(실시예 11 참조).

US 20040115206에서는 2개의 상업적인 L1CAM에 대한 항체인 UJ127 및 5G3을 사용하여 유방암, 대장암, 자궁경부암 세포주에서 세표 사멸이 유도됨을 확인하였다고 기재하고 있으나, 본 발명의 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, L1CAM에 특이 적으로 결합하는 것으로 알려진 이들 공지의 항체를 담도암 세포와 소세포폐암 세포에 처리하였을 때, 5G3 항체의 경우에는 담도암 세포 및 폐암세포에 결합은 하나, 폐암세포에 대해서는 그 성장을 전혀 저해하지 않았다. 그러나, 본 발명에 따른 단일클론항체는 이들 담도암 또는 폐암 등의 여러 암세포에 결합할 뿐만 아니라, 그 성장, 침투 및 이동을 저해하는 매우 현저한 효과를 가짐을 알 수 있는데, 이는 특히 본 발명에 따른 L1CAM에 특이적인 단일클론항체가, 이후 실시예에서 자세히 설명하는 바와 같이, L1CAM에 결합하는 에피토프 및 결합력이 5G3와 다르기 때문인 것으로 생각된다.

한편, 본 발명의 또 다른 양태에서는 상기 단일클론항체에 공지의 치료제를 직접 또는 간접적으로 결합시켜 보다 효과적인 암 치료물질을 제공할 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종, 약제, 림포카인, 독소, 이중특이적 항체 등을 포함한다.

상기한 방사선핵종에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.

상기한 약제 및 독소에는, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.

당업자라면, 본 발명에 따른 단일클론항체가 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 카이메릭 항체, 인간화항체 및 인간 단일클론항체로 전환될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 카이메릭 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 재조합시킨 것이고, 인간화 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역에서 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정 영역(complementarity determining regions : CDRs) 또는 상보성 결정 영역 중에서도 항원 결합 특이성에 관여하는 아미노산 잔기들(specificity determining residues : SDRs)만을 인간 항체에 이식시킨 것이다.

인간 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역 중 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역을 인간 항체의 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역대신 치환하고, 그 결과 항원결합능을 나타내는 하이브리드(hybrid: 생쥐 중쇄/인간 경쇄 혹은 생쥐 경쇄/인간 중쇄) 항체로부터 생쥐 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역을 다시 인간 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역으로 치환하여 항원결합능을 나타내는 완전 인간 항체 가변영역을 골라낸 후 이를 인간 항체 불변영역과 연결시키는 등의 공지의 방법을 사용하여 본 발명의 단일클론항체로부터 용이하게 제조가능하며, 이러한 변이체가 본 발명의 범위에 속함은 당연하다. 위와 같이 제조된 카이메릭 항체, 인간화항체 및 인간 단일클론항체는 공지의 방법을 사용하여 동물세포에서 생산할 수 있다.

또한 본 발명의 단일클론항체는, 상기한 바와 같은 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분 자의 기능적인 단편으로서 암 치료 및 진단에 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 암세포의 표면항원을 특이적으로 인식하는 단일클론항체를 생산 및 분비하는 하이브리도마에 관한 것이다.

본 발명에서 용어‘하이브리도마’란, 항체를 생산하는 B 림프구와 골수종 암세포를 융합하여 얻은 세포를 의미하는데, 골수종세포는 형질전환된 세포로, 배양접시에서 오랜 기간 배양할 수 있는 장점이 있어, 한 가지 항체만을 만들어 내는 골수종 하이브리도마를 분리해 내면 손쉽게 단일클론항체를 대량으로 획득하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 단일클론항체를 제조하기 위한 본 발명의 하이브리도마는L1CAM을 발현하는 세포를 대량으로 배양한 후 생쥐에 면역 주사하고, 면역된 생쥐에서 채취한 림프구를 골수종 암세포와 융합하여 제조할 수 있다.

세포 융합에 사용되는 골수종 세포로는 마우스 유래의p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63Ag8, V653, S194, 랫트 유래의 R210 등 다양한 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에 사용된 세포주는 골수종 세포 F0 이다.

또한 상기 하이브리도마의 제조방법으로서, 추가적으로 담도암 세포에 특이 적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 형광세포 염색법을 이용하여 담도암세포에 특이적으로 결합하는 생쥐 단일클론항체를 생산하는 생쥐 하이브리도마를 선별할 수 있다.

구체적인 일 실시예로서, 본 발명자들은 담도암 세포를 대량 배양한 다음 생쥐 발바닥에 상기 세포를 주입하고, 상기 생쥐의 림프절(lymph node)에서 림프구를 분리하여 골수종(myeloma) 암세포와 세포 융합하여 담도암세포에 결합하는 항체를 생산하는 생쥐 하이브리도마를 제조하였다.

보다 구체적으로, 본 발명자들은 담도암세포 SCK와Choi-CK(Kim et al, Genes, chromosome & Cancer 30:48-56, 2001)를 생쥐의 발바닥에 주사하고, 상기 생쥐의 오금 림프절에서 림프구를 분리하였다. 상기 림프구와 FO 골수종 세포주를 세포 융합시키고, 항체가 발현되는 클론을 선발하였다. 상기 제조한 클론 중에서, 비교적 안정하게 단일클론항체들을 분비하는 하이브리도마 상층액의 담도암과 폐암세포에 대한 결합능을 조사하고, 이들 단일클론항체 및 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 A10-A3라 명명하고, 이를 2006년 2월20일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC10909BP).

본 발명은 또한 상기 하이브리도마를 이용한 단일클론항체의 대량생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 한 양태로서, 상기 단일클론 항체의 대량 생산 방법은, 선별된 하 이브리도마를 생쥐의 복강에 주사하여 복수액(ascites fluid)에서 배양한 후, 이에 제한되는 것은 아니나 단백질 G-세파로스(sepharose) 컬럼 크로마토그래피 등으로 분리하는 것을 포함한다.

또한, 원하는 하이브리도마 클론이 분리되면, 이 클론을 배양하여 배양액에 존재하는 단일클론항체를 분리하여 사용할 수도 있으며, 생쥐의 복강에 하이브리도마 클론을 주사하여 얻은 복수액으로부터 단일클론항체를 얻을 수도 있다. 상기와 같이 제조된 단일클론항체는 면역진단, 면역치료, 그리고 항원 및 항체의 분자세포생물학적인 연구, 더 나아가 촉매항체와 같은 유용한 항체를 얻는 데에도 널리 이용된다.

바람직하게 본 발명의 대량생산방법은 추가적으로 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 고순도(예컨대 95% 이상)로 정제하는 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전 또는 크로마토그래피 등의 정제방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 상기 단일클론항체를 분리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체에서 유래된 카이메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 단일클론항체를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 암 치료용 조성물은, 투여방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

투여 방식에 적합한 제제는 당 분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체에서 유래된 카이메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 단일클론항체를 포함하는 조성물은 암 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여 될 수 있으며 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화 할 수 있다. 본 발명의 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체에서 유래된 카이메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 단일클론항체를 포함하는 조성물을 0.1mg/kg(body) 내지 100mg/kg(body)로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 0.5mg/kg(body) 내지 50mg/kg(body), 더욱 바람직하게는 1mg/kg(body) 내지 10mg/kg(body)이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 암세포의 배양

암세포주는 모두 10% 우태아혈청(Gibco사)을 함유하는 다음과 같은 배지를 이용하여 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. SH-J1(간암, hepatocellular carcinoma), SCK(담도암, cholangiocarcinoma), Choi-CK(담도암, cholangiocarcinoma), ACHN(신장 세포암, Renal cell adenocarcinoma), WiDR(대장암, colorectal adenocarcinoma) 세포는 MEM(Gibco사) 배지를 이용하였고, AGS(위암, gastric cancer cell), A375(피부암, melanoma) 및 MDA-MB485(유방 암, mammary carcinoma)는 DMEM(Gibco사) 배지를 이용하였고, SK-OV3(난소암, ovary adenocarcinoma) 세포는 McCoy 5A Medium(Gibco사) 배지를 이용하였다. A549(비소세포폐암, non small cell lung carcinoma)는 Ham's F12K배지에서, NCI-H522(비소세포폐암, non small cell lung carcinoma), DMS114(소세포폐암, small cell lung carcinoma), NCI-H69(소세포폐암, small cell lung carcinoma)는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. SH-J1, SCK, Choi-CK 세포주는 김대곤 박사(전북대학교 의과대학)로부터 얻었고, 그 외 암세포주는 ATCC로부터 구입하였다.

정상 세포인 간세포(hepatocyte)는 Cambrax사에서 구입하고 HUVEC 세포도 Cambrax사에서 구입 후 10% 우태아혈청(Gibco)을 함유하는 EGM-2(Hyclone사)배지를 이용하여 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 말초 혈액 림프구(PBL)은 사람 혈액에서 피콜 밀도차이에 의한 분리(Ficoll gradient) 후 수득하였다.

< 실시예 2> 암세포 Choi - CK , SCK 에 결합하는 단일클론항체 A10-A3의 제조

배양한 암세포 Choi-CK와 SCK를 세포 분리 완충액(Cell dissociation buffer - Invitrogen)를 이용하여 떼어낸 후 약 5 × 10⁵의 세포를 30 ㎕의 PBS에 부유시킨 후, 세포를 Balb/c 생쥐의 오른쪽 발바닥에 Choi-CK를 주사하고, 3일 후 왼쪽 발바닥에는 SCK를 주사하였다. 이를 3-4일 간격으로 6회 반복투여하고 세포융합 1일 전 에 다시 주사하였다. 림프절 세포와 융합시킬 FO 골수종(myeloma) 세포주(ATCC, USA)는 10%의 우태아혈청를 함유한 DMEM(GIBCO사)배지에서 2주 전부터 배양하여 준비하였다.

암세포 Choi-CK와 SCK로 면역시킨 생쥐의 오금 림프절을 각각 꺼내 DMEM(GIBCO사)배지로 잘 씻고, 배양 접시에서 잘 분쇄하여 세포 부유물을 15 ㎖ 튜브에 옮겨두었다. FO 골수종 세포를 원심 분리하여 수확하고 10 ㎖의 DMEM 배지에 현탁하여 위의 림프절 세포와 함께 세포수를 계수하였다. 이후, 10⁶개의 골수종세포(FO)와 10⁷개의 림프절세포를 50 ㎖ 튜브에 옮겨 섞은 다음 200 × g로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 37℃ 물이 채워진 비이커에 2분간 방치하였다. 튜브를 가볍게 쳐서 세포를 부드럽게 만들고 37℃ 물에 담근 상태로 천천히 흔들면서 1 ㎖의 PEG용액(GIBCO사)을 1분 동안 천천히 첨가하였다. 100× g로 2분 동안 원심분리하고 5 ㎖의 DMEM 배지를 3분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 다시 5 ㎖의 DMEM 배지를 2분 동안 천천히 첨가한 다음 200 × g로 원심 분리하여 세포들을 회수하였다. 그리고, 세포 융합 효율과 생존율을 높이기 위해 하이브리도마 클로닝 인자(hybridoma Cloning Factor, BioVeris사, USA)를 미리 10%로 정상 배지(DMEM + 20% 우태아혈청)에 섞어두었다. 회수한 세포를 하이브리도마 클로닝 인자를 섞은 30 ㎖의 정상 배지(DMEM + 20% 우태아혈청)에 조심스럽게 현탁하였다. 37℃, CO₂ 배 양기에서 30분 동안 방치한 후, 96웰 플레이트에 웰당 70 ㎕씩 10⁵개의 세포가 되도록 분주하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 다음날 70 ㎕의 HAT를 더하고 3일 간격으로 HAT 배지에서 2주 이상 키우면서 자라는 콜로니를 관찰하였다. 이렇게 Choi-CK 세포를 면역주사 한 림프절과, SCK 세포를 면역 주사한 림프절에서 분리한 림프구를 골수종세포와 융합하여 얻은 하이브리도마 콜로니의 상층액을 사용하여 다음 실험을 수행하였다.

항체가 발현되는 클론을 선발하기 위하여, 샌드위치(sandwich) ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)법을 사용하였다. 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체를 2 ㎍/㎖로 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양액 100 ㎕을 첨가해 37℃에서 1 시간 반응시키고, 다시 항-마우스 IgG 또는 IgM의 HRP(horseradish peroxidase, Sigma사)의 1/5,000 희석액과 1시간 더 반응시켰다. 0.05%의 트윈 20을 첨가한 인산완충액으로 배양용기를 세척하고, OPD(Sigma사)와 과산화수소(H₂O_{2 )}가 포함된 기질용액을 첨가하고, 492 ㎚의 파장의 흡광분석기에서 흡광도를 측정하여 항체를 생산하는 클론을 선별하였다.

상기 제조한 클론 중에서, 비교적 안정하게 항체들을 분비하는 하이브리도마 상층액의 SCK와 Choi-CK 세포에 대한 결합능을 조사하였다. 구체적으로, 배양된 Choi-CK 세포를 세포 분리 완충액(GIBCO)으로 20분 37℃에서 처리하여 단일세포로 분리한 뒤, 40 μm 스트레이너(strainer)를 통과시켜 5 × 10⁵ 세포를 유세포 분석기(Flow cytometry)에 사용하였다. 먼저 단일 세포화된 SCK, Choi-CK 세포를 PBA(1%의 BSA를 PBS에 용해)에 부유시키고 항체 상층액을 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 4℃에서 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액 100 ㎕을 제거하고 여기에 항-마우스 Ig-FITC(BD)를 200배 희석하여 4℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 PBA로 2회 세척하고, 프로피디움 요오다이드(Propidium Iodide, PI) 음성인 세포들만 골라 유세포분석기(FACS caliber)로 SCK, Choi-CK 세포에 대한 결합능을 분석하였다.

그 결과, SCK, Choi-CK에 결합하는 항체를 분비하는 다양한 하이브리도마들을 선별하고, 지속적인 계대배양을 통하여 안정화를 유지시킨 후 서브클로닝하였다. 상기 서브클로닝으로 확실하게 안정성을 유지시킨 SCK, Choi-CK 세포에 대한 특이성을 유지한 항체 A10-A3(IgG1)를 분비하는 하이브리도마를 선별하였다.

상기 단일클론항체 A10-A3를 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 A10-A3(수탁번호:KCTC10909BP)이라 명명하고, 이들을 2006년 2월 20일자에 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁하였다.

< 실시예 3> A10-A3항체의 다양한 세포 결합 특이성 분석

A10-A3 하이브리도마 세포주를 무혈청배지 (PFHM, Invitrogen사)에서 배양한 후 배양액으로부터 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)을 사용하여 항체를 정제하였다(Fike et al., Focus 12: 79, 1990). 정제된 A10-A3 항체의 다양한 암세포에 대한 결합능을 형광세포염색을 통하여 상기 실시예<2>와 동일한 방법으로 조사하였다(도 1). 상기 도 1에서 실선은 단일클론항체 A10-A3이고 채워진 바탕은 2차 항체만 포함한 것이다. 다양한 암세포에 대한 A10-A3의 결합능력을 측정하기 위해 유세포 분석기를 이용하여 수행하였으며 그 결과 상기 단일클론항체가 암세포 중 SH-J1, SCK, Choi-CK, AGS, NCI-H522, A549, DMS114, NCI-H69, SK-OV3, A375 및 MDA-MB485에 결합하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 1). 그러나 암세포 중 ACHN, WiDR와 간세포(hepatocyte), HUVEC, 말초 혈액 림프구(PBL)와는 결합하지 않는 결과를 보여주었다.

< 실시예 4> 단일클론항체 A10-A3가 인식하는 항원의 분리 및 동정

< 실시예 4-1> 항원의 분리

단일클론항체 A10-A3가 인식하는 세포표면 인식인자를 분리하기 위하여, 먼저 배양한 Choi-CK 세포를 PBS 완충용액으로 세척하고EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Rockford, IL)로 바이오틴화(biotinylation)시킨 후 세포를 용해용액(25mM Tris-HCl, pH 7.5, 250mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 2 μg/ml aprotinin, 100 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 μg/ml leupeptin)으로 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후 세포 debris 제거하기위해 원심분리를 실시하였다. 상층액만을 회수하여 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.

단백질 G 플러스-세파로오스(Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz)에 비특이적으로 결합하는 단백질은 세포용해용액을 20 μl의 단백질 G 플러스-세파로오스와 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 상층액만 회수하여 준비하고, 회수한 상층액은 다시 약 1 μg의 A10-A3 항체와 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 여기에 20 μl의 단백질 G 플러스-세파로오스를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물을 세포용해용액으로 10회 이상 세척하고 남아있는 단백질을 10% SDS-PAGE에서 분리하였다. 이 단백질을 니트로셀룰로즈 막으로 옮겨 웨스턴 블럿을 수행하였다. 니트로셀룰로즈 막을 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 PBST(PBS + 0.1% Tween 20) 완충용액에서 1시간 동안 반응시키고 나서, 상기 PBST 완충용액으로 두 차례 이상 세척하였다. 상기 반응된 니트로셀룰로즈 막을 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP, horseradish peroxidase)결합체 (1:1,500 Amershambiosciences)를 첨가하여 1 시간 동안 반응시켰다.

상기 PBST 완충용액으로 5차례의 세척 후, 바이오틴화 된 단백질을 ECL 검출 시약(Amersham biosciences)로 발색시켰다. 그 결과, 약 200 kDa 크기의 단백질에 A10-A3 항체가 결합함을 확인하였다(도 2A). 항체 A10-A3에 의해 면역 침강되는 단백질을 모으기 위해 1X10⁸ Choi-CK 세포에서 얻은 세포용해액을 위와 같은 방법으로 면역침강법을 수행한 후 SDS-PAGE를 사용하여 분리하였다. 이 젤을 Coomassie G250 (Biorad)으로 염색하였다.

< 실시예 4-2> Mass Spectrometry 에 의한 항원의 동정

A10-A3에 의해 면역침강된 단백질을 포함하는 SDS 젤을 Coomassie G250(BIO-RAD)으로 공급자의 프로토콜대로 염색하였다. 단백질이 포함된 부분을 잘라내고 30% 메탄올로 5분 동안 세척하고 잘게 부수었다. 젤 부스러기를 30% 메탄올로 염색이 완전히 탈색 될 때까지 반응시키고 난 후, 젤 부스러기는 100% 아세토니트릴(acetonitrile)로 10 분 동안 수분을 제거하고 30분 동안 진공 원심분리기에서 말렸다. 단백질의 절편은 젤 부스러기에 300ng의 트립신(Promega)을 50mM 암모늄 바이카보네이트용액을 넣어 반응시키고 16 hr동안 37℃에서 반응시켰다. 잘린 펩타이드는 3차례 100 μl의 50 mM 암모늄 바이 카보네이트로 추출해내고 진공 원심분리기에서 말렸다. 펩타이드 혼합물은 Q-TOF micro(MicroMass)에서 electrospray quadrupole time of flight tandem mass spectrometry(ESI Q-TOF MS/MS)로 분석하였다. 그 결과 이 단백질이 L1 Cell Adhesion molecule (L1CAM)임을 확인하였다 (도 3). 도 3에서 밑줄 친 부분은 실제로 아미노산 서열이 Q-TOF에서 밝혀진 것을 표시한 것이다. 그래서 실제 L1CAM에 대한 항체 단일클론항체 UJ127.11를 Chemicon (USA)사에서 구입하여 biotin label 시킨 Choi-CK 세포 용해액을 이용하여 실시예 4-1처럼 면역 침강시키고 ECL로 확인하였다. 도 2A에 보이는 것처럼 A10-A3와 항-L1CAM 항체가 약 200kDa의 같은 위치에 단백질을 면역침강시킴을 알 수 있다.

< 실시예 4-3> 웨스턴블럿팅에 의한 L1CAM 항원의 확인

A10-A3 항체가 정말 L1CAM을 인식하는지 재확인하기 위하여, Choi-CK의 세포용해액을 사용하여 이 항체로 먼저 면역침강을 수행하였다. 단백질 G 플러스-세파로오스(Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz)에 비특이적으로 결합하는 단백질은 세포용해용액을 20 μl의 단백질 G 플러스-세파로오스와 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 상층액만 회수하여 준비하고(도2B의 preclearing), 회수한 상층액은 다시 약 1 μg의 항체와 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 여기에 20 μl의 단백질 G 플러스-세파로오스를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물을 세포용해 용액으로 10회 이상 세척하고 남아있는 단백질을 10% SDS-PAGE에서 2-머캅토에탄올 없이 분리하였다.

이 단백질을 니트로셀룰로즈 막으로 옮겨 웨스턴 블럿을 수행하였다. 니트로셀룰로즈 막을 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 PBST(PBS + 0.1% Tween 20) 완충용액에서 1시간 동안 반응시키고 나서, 상기 PBST 완충용액으로 두 차례 이상 세척하였다. 상기 반응된 니트로셀룰로즈 막을 공지의 항-L1CAM 항체 UJ127(Chemicon) 를 1차 항체로 첨가하여 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 PBST 완충용액으로 5차례의 세척 후 항-마우스 IgG의 horseradish peroxidase(HRP) conjugate(1:5000 Sigma)로 1 시간 반응시켰다. 다시 PBST 완충용액으로 5차례의 세척 후, ECL 검출 시 약(Amersham biosciences)로 발색시켰다. 그 결과, A10-A3에 의해 면역침강된 약 200 kDa 크기의 단백질에 L1CAM 항체가 결합함을 확인하였다(도 2B). 이것은 다시 A10-A3 항체가 L1CAM을 인식함을 말해준다.

< 실시예 5> A10-A3 항체의 에피토프 매핑( Epitope mapping )

< 실시예 5-1> L1 면역글로불린 도메인( Ig )- Fc 와 L1 파이브로넥틴 타입 III 도메인(Fn)-Fc 융합 단백질 발현

L1 면역글로불린 도메인(Ig)-Fc를 발현시키기 위한 발현벡터를 제작하기 위해서 pJK-dhfr2-L1-monomer(대한민국 특허출원 제10-2006-0079969호에 개시되어있음) DNA를 주형으로 L1 Ig 양 말단 프라이머 L1-Igdom-F(5'-GAG GAG GAA TTC CGG CGC CGG GAA AGA TGG TCG TGG CG-3') 와 L1-Igdom-R(5'-CTC CCC CTC GAG CGG CCC AGG GCT CCC CAC CAC CAA GAG CTG-3')를 사용하여 95℃에서 5분 동안 전처리반응 후, 95℃, 45초/58℃, 45초/72℃, 2분 동안 30회 DNA 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 시키고, 72℃에서 10분간 후처리 조건으로 중합효소반응을 수행하여 증폭하였다. 중합효소는 염기서열의 오류를 위해 pfu polymerase (Solgent co.)를 사용하였다. 증폭된 L1 면역글로불린 도메인 DNA단편을 pJK-dhfr2-FC 발현벡터(Aprogen)에 삽입하기 위해서 벡터와 증폭된 DNA단편을 EcoRI과 XhoI 효소로 각각 절단하여 1% 아가로스젤에 전기 영동하여해당되는 단편을 오려내어Gel purification kit(Intron co.)를 사용하여 회수하였다. 회수된 두 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제(Roche)를 이용하여 16℃에서 12시간 반응하여 대장균 (E. coli DH5α)에 heat shock법을 이용하여 형질 전환시켰다. 형질전환된 세포로부터 DNA를 분리하여 L1 면역글로불린 도메인 발현벡터인 pJK-dhfr2-L1Ig-FC를 제작하였다.

L1 파이브로넥틴 타입 III 도메인(Fn)-Fc를 발현시키기 위한 발현벡터를 제작하기 위해서 pJK-dhfr2-L1-monomer(대한민국 특허출원 제10-2006-0079969호에 개시되어 있음) DNA를 주형으로 L1 시그날 펩타이드 부분 양 말단 프라이머 Fn-leader-F (5'-GA GGA GGA ATT CCG GCG CCG GGA AAG ATG GTC GTG GCG -3') 와 Fn-Leader rcm-R (5'-CAC CGG CCC AGG GCT CCC CAT CAC ATG GTG TCC TTC-3')를 사용하여 위와 같은 조건으로 PCR을 수행한 후 얻어진 L1 시그날 서열 단편을 아가로스 젤로부터 회수하였다. 또한, 같은 pJK-dhfr2-L1-monomer DNA를 주형으로 L1 Fn 양 말단 프라이머Fn-dom rcm-F(5'-GAA GGA CAC CAT GTG ATG GGG AGC CCT GGG CCG GTG CCA-3')와 Fn-dom-R (5'-CTC CCC CTC GAG GAG CCT CAC GCG GCC TGT GCC ATT GGT CTT-3')를 사용하여 PCR을 수행한 후 L1 Fn 단편을 회수하였다.

회수된 L1 시그날 서열 단편및 L1 Fn 단편을 동량 섞은후 Fn-leader-F와 Fn-dom-R 를 사용하여 다시 PCR을 수행하였다. 증폭된 L1 시그날 서열-Fn DNA단편을 EcoR I과 Xho I 효소로 절단하여 JK-dhfr2-Fc 발현벡터(Aprogen)의 EcoRI-XhoI 위치에 클로닝하여 pJK-dhfr2-L1Fn-Fc를 제작하였다.

L1 Ig-FC와 L1 Fn-Fc 융합 단백질을 발현시키기 위해서 pJK-dhfr2-L1 Ig-Fc 나 pJK-dhfr2-L1Fn-Fc DNA를 HEK293T (ATCC NO., CRL11268) - 이하 293T라 한다 - 에 각각 발현시켰다. 이를 위하여, 500㎕의 Opti-MEM 배지(Gibco BRL)에 Lipofectamine 2000(Invitrogen)과 상기 발현벡터 20㎍을 각각 섞어 넣어서 5분간 상온에서 반응시킨 후, 두 반응액을 합치고 15분간 상온에서 다시 반응시켰다. Lipofectamine 2000과 DNA를 반응시킨 용액에 Opti-MEM 배지 4㎖을 넣고 섞어준 뒤, 이를 293T 세포가 있는 배양용기에 조심스럽게 넣어주고, 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 6시간 배양 후, 5㎖의 DMEM에 10% FBS가 포함된 배지를 다시 첨가하여주고 3일 동안 배양하였다.

< 실시예 5-2> 웨스턴블럿팅

293T 세포에서 L1 Ig-Fc를 발현시킨 세포 배양액과 L1 Fn-Fc를 발현시킨 세포 배양액을 각각 7.5% SDS-PAGE를 수행하여 단백질을 분리하였다. 이 단백질을 니트로셀룰로즈 막으로 옮겨 웨스턴 블럿을 수행하였다. 상기 니트로셀룰로즈 막에 A10-A3 항체나 공지의 항-L1CAM 항체인 UJ127(Chemicon) 또는 5G3(Pharmingen)항체를 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 TBST(TBS + 0.05% Tween 20) 완충용액으로 세 차례 세척하였다. 항-마우스 IgG의 horseradish peroxidase(HRP) conjugate (1:5000 Sigma)를 가하고 1 시간 반응시켰다. 다시 TBST 완충용액으로 5차례의 세척 후, ECL 검출 시약(Amersham biosciences)로 발색시켰다. 그 결과, A10-A3 항체와 공지의 5G3는 약 140 kDa 크기의 L1 Ig-Fc에 결합하고, 공지의 UJ127 항체는 약 140kDa 크기의 L1 Fn-Fc에 결합함을 확인하였다 (도 4a)

< 실시예 5-3> L1 Ig 도메인의 mutants 제작 및 A10-A3 항체의 에피토프 확인

6개의 L1 Ig 도메인 중 첫 번째~다섯번째(1-5), 첫 번째~네번째(1-4), 첫 번째~세번째(1-3), 첫 번째~두번째(1-2), 또는 첫 번째(1) 도메인만 발현하는 발현벡터를 각각 제작하기 위하여 상기 pJK-dhfr2-L1Ig-FC 클론을 주형으로 프라이머 L1-Igdom-F(5'-GAG GAG GAA TTC CGG CGC CGG GAA AGA TGG TCG TGG CG-3')와 L1-Ig5dom-R(5'-CTC CCC CTC GAG TTT CTT CTC GAT TGT GCT GCG-3'), L1-Ig4dom-R(5'-CTC CCC CTC GAG GAC AAC GTA GAT GTA GGC ATT-3'), L1-Ig3dom-R(5'-CTC CCC CTC GAG CTC CAC GGT GAC ATA GTA CGC-3'), L1-Ig2dom-R(5'-CTC CCC CTC GAG CTT GAC CCG GAG GTC AAT GGG-3'), 또는 L1-Ig1dom-R(5'-CTC CCC CTC GAG CTC GGC CAT GAG CCG GAT CTC-3')를 사용하여 각각 PCR을 수행한 후 증폭된 DNA단편을 EcoR I과 Xho I 효소로 각각 절단하여 JK-dhfr2-FC 발현벡터(Aprogen)의 EcoRI-XhoI 위치에 클로닝하여 각각pJK-dhfr2-L1Ig1-5dom-Fc, pJK-dhfr2-L1Ig1-4dom-Fc, pJK-dhfr2-L1Ig1-3dom-Fc, pJK-dhfr2-L1Ig1-2dom-Fc, pJK-dhfr2-L1Ig1dom-Fc를 제작하였다. 또한 6개의 L1 Ig 도메인 중 두 번째~여섯 번째(2-6) 도메인만 발현하는 발현벡터를 제작하기 위하여, 상기 pJK-dhfr2-L1Ig-Fc 클론을 주형으로 상기 L1-Igdom-F와L1delIg1-spR(5'-TGG CCA CTT GGG GGC ACC GAT CTG GATBAAG CAG GCA-3')를 사용하여 PCR을 수행하고, 프라이머 L1-Ig2-6dom-F(5'-TGC CTG CTT ATC CAG ATC GGT GCC CCC AAG TGG CCA-3')와 상기 L1-Igdom-R를 사용하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 DNA단편을 다시 L1-Igdom-F와 L1-Igdom-R을 사용하여 재조합 PCR을 수행한 후 얻어진 DNA 단편을 EcoR I과 Xho I 효소로 절단하여 JK-dhfr2-Fc 발현벡터(Aprogen)의 EcoRI-XhoI 위치에 클로닝하여 pJK-dhfr2-L1Ig2-6dom-Fc를 제작하였다.

L1의 Ig1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1, 2-6 도메인에 Fc가 융합된 단백질을 얻기 위하여 상기의 발현벡터를 각각 293T 세포에 발현시킨 후, 각 세포배양액을 A10-A3 항체나 5G3 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행한 결과, A10-A3는 L1의 첫번째 Ig 도메인을 포함한 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 도메인-Fc 융합 단백질에 다 결합하였다(도 4b). 그러나 도메인1을 제외한 L1 Ig2-6에는 결합하지 않았다. 이 결과는 A10-A3가 L1의 첫 번째 도메인에 결합함을 말해준다. 반면, 5G3는 첫 번째 도메인을 제외한 1-5, 1-4, 1-3, 1-2에 결합하여 L1의 두 번째 도메인에 결합함을 확인하였다(도 4c). 이 결과는 A10-A3가 UJ127과 5G3와는 다른 항체임을 말해준다.

< 실시예 6> A10-A3 항체의 암조직에 대한 면역조직화학적 염색

면역조직화학염색을 위하여 각각의 암종에서 박절한 절편에서 3μm두께의 절편을 각각 폴리-엘-라이신(poly-L-lysine)을 도포한 슬라이드에 부착하였다. 우선 60℃ 오븐에서 3시간 동안 건조한 다음 크실렌으로 실온에서 5분 동안 3회 탈파라핀화 시켰다. 100%, 90%, 80% 및 70% 알코올로 각각 1분 동안 처리하고, 항원성 회복을 위하여target retrieval solution(DAKO, Carpinteria, CA)에 슬라이드를 담근 후 압력솥(pressure cooker)을 이용하여 4분 동안 끓인 TBST(Tris-buffered saline-Tween 20) 완충용액으로 수세하였다. 고감도의 면역조직화학염색을 위하여Biotin-free Tyramide Signal Amplification System인CSA II kit(DAKO, Carpinteria, CA)를 이용하였다. 비특이 항원을 제거하기 위하여 3% 과산화수소에 5분 동안 반응시킨 후, 완충용액으로 5분 동안 2회 세척하고 비특이 단백의 결합을 제거하기 위하여 충분한 serum-free protein block으로 5분 동안 반응시켰다. 일차 항체로서 A10-A3(1:50 dilution)를 도포하여 15분 동안 반응시키고 항-마우스 면역글로불린-HRP에 15분 동안 처리하였다. 그런 다음 증폭제(Amplification reagent)에 15분 동안 방치한 후 항-플루오레세인-HRP에 15분 동안 반응시켰다. DAB를 이용하여 5분 동안 발색한 다음 Meyer's hematoxylin으로 대조염색을 하였다. 각각의 단계가 끝나면 TBST 완충용액으로 5분 동안 2회 세척하였다. 음성 대조군은 염색 때 일차항체를 제외하고 정상 면양 혈청을 첨가해 주거나, 일차 항체 대신 정상 마우스 IgG1 혈청을 첨가해 주고 나머지 모든 과정은 동일하게 하였다. 그 결과 정상조직에는 결합하지 않고, 담도암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 대장암 및 췌장암 조직에 이 항체가 잘 결합함을 알 수 있었다 (도 5)

위의 결과는 담도암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 대장암 및 췌장암 조직에서 L1CAM이 발현함을 의미한다. 따라서, 본 발명에서는 A10-A3 항체가 여러 암 세포의 증식이나 전이를 억제하는지를 분석하였다.

< 실시예 7> A10-A3 항체에 의한 암세포의 성장억제

L1CAM에 대한 항체가 암세포의 성장을 저해하는지를 실험하기 위하여, A10-A3 항체가 결합하는 Choi-CK, SCK, DMS114 및 SK-OV3와 음성대조군으로서 ACHN 세 포를 3 ml의 배지 내에 2 x 10⁵ cells 씩 계수하여 6 웰 플레이트에서 배양하고, 상기 단일클론항체를 10 μg/ml 농도로 첨가한 후, 세포를 37℃ CO₂ 반응기에서 72시간 동안 반응시켰다. 그리고 세포를 회수하여 0.2% 트리판 블루(Tryphan Blue) 용액에서 죽은 세포와 산세포를 세어서, 전체 세포 중에 살아있는 세포의 백분율을 구했다. 그 결과 A10-A3 항체에 의하여 Choi-CK, SCK, DMS114 및 SK-OV3 세포의 성장은 감소하고 ACHN은 아무런 영향을 받지 않았다(도6a). 이 결과는 A10-A3 항체가 담도암, 폐암 및 난소암 세포의 성장을 저해함을 의미한다.

L1CAM에 특이적으로 결합하며, 유방암, 대장암 및 자궁경부암 세포주의 성장을 억제하는 것으로 알려진 공지의 항체 UJ127(Chemicon), 5G3(Pharmingen)를 위의 담도암 세포와 소세포폐암 세포에 처리하였을 때, UJ127 항체는 위의 암세포의 성장을 저해하였으나 5G3 항체의 경우 담도암세포(Choi-CK)의 성장을 약간 저해하였으나 폐암세포(DMS114)에 대해서는 전혀 저해하지 않음을 관찰하였다(도 6b). 5G3 항체는 Choi-CK 및 DMS114 세포에는 결합하였다(도 1C). 이 결과는 L1CAM에 결합하는 단일클론항체라고 하여도 반드시 암세포의 증식을 억제하는 것이 아님을 증명하는 것이다.

< 실시예 8> A10-A3 항체에 의한 암세포의 침투 및 이동( invasion , migration ) 억제

인베이전 어세이(Invasion assay)를 수행하기 위해 CHEMICON사의 QCM 24-웰 세포 인베이전 어세이 키트(QCM 24-well cell invasion assay kit)을 사용하였다. 인서트(insert)의 ECM layer를 재수화 시키기 위해 300 μl의 미리 데워놓은serum free media(RPMI, 10mM HEPES, pH7.4)를 인서트에 넣고 상온에서 30분 방치해 놓았다. Choi-CK, SCK, SK-OV3, ACHN을 PBS로 두 번 씻어준 후, 3ml trypsin-EDTA 을 넣어주고, 37℃ 배양기에 넣었다. invasion medium(RPMI, 10mM HEPES pH7.4, 0.5% BSA) 으로 떨어진 세포들을 걷어내고, 세포수를 1X10⁵/200 μl invasion medium로 맞춰 준 다음, 각각의 인서트에 세포들을 넣어주고 항체 A10-A3 또는 공지의 항체 5G3 (10 μg/ml)과 normal mouse IgG(10 μg/ml)를 처리해 주었다. Lower chamber에 10% FBS를 넣은 invasion medium을 넣어 주고 72시간동안 37℃ 배양기에서 배양했다. 배양이 끝난 후 인서트(insert)에 남은 세포와 배지를 제거하고, 인서트를 새 웰(well)로 옮겼다. 미리 데워놓은 세포 분리 용액 225㎕에 인서트를 올리고 37℃배양기에서 30분 동안 배양했다. 남은 세포를 완전히 떼어내기 위해 인서트를 흔들어주고, 세포 분리 용액과 세포가 섞인 용액에 75㎕ Lysis buffer/Dye solution을 넣어주고 상온에서 15분 방치했다. 200 μl의 용액을 96 웰 로 옮겨 480 nm/520 nm fluorescence로 읽었다. 그 결과 A10-A3는 ACHN에서는 억제 작용이 없지만, Choi-CK, SCK 및 SK-OV3에서는 암세포의 침투를 억제함을 알 수 있었다(도7A). 그러나 공지의 항체 5G3는 DMS114의 침투를 저해하지 못하였다(도7A).

마이그레이션 어세이(Migration assay)시에는 인서트 바닥에 따로 콜라겐 타입 I 을 10 μg/ml로 코팅한 것을 제외하고는 위 방법과 동일하게 실험하였다. 그 결과 항체 A10-A3는 ACHN에서는 억제 작용이 없지만, Choi-CK, SCK 및 SK-OV3에서는 암세포 이동을 억제함을 알 수 있다 (도 7B).

< 실시예 9> A10-A3 항체에 의한 암세포 사멸 유도

A10-A3 항체가 암세포사멸(Apoptosis)을 유도하는지의 유무를 확인하기 위하여 Annexin V-FITC(BD Pharmingen)를 이용하여 Choi-CK, SCK 두가지 암세포에 면역세포화학 분석을 수행하였다. 세포사멸이 유도되면 세포 내막에 있는 포스파티딜세린(Phosphatidylserine)이 세포 외막으로 나와서 아넥신 V(Annexin V)가 사멸된 세포에 결합한다. 슬라이드 챔버에 각각 10,000개의 암세포를 계수하여 9시간 동안 배양한 후 A10-A3(10 μg/ml) 항체와 mouse IgG(10 μg/ml)를 세포에 처리하였다. 슬라이드 챔버에서 밤새 배양한 세포를 Ca^{2 +}-Mg^{2 +}-PBS 완충용액으로 세척한 후 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 상기 슬라이드를 완충용액으로 6번 세척하였다. 세포를 1 시간 동안 실온에서 블러킹 용액(10% 정상 말혈청 및 0.1% 소 혈청 알부민, PBS중)으로 처리하고, 아넥신 V-FITC(BD Biosciences)를 아넥신 V-FITC binding 용액[0.1M Hepes/NaOH(pH7.4), 1.4M NaCl, 25mM CaCl₂]에 1:1000 비율로 희석하여 세포에 40분간 결합시켰다. 상기 슬라이드를 완충용액으로 2번 세척한 후, Vectashield(Vector)로 마운팅한 후 형광 현미경으로 분석하였다. 그 결과, A10-A3 항체를 처리한 세포는 아넥신 V(Annexin V)가 뚜렷하게 결합하였고, 생쥐면역글로불린 IgG 항체를 처리한 대조군에서는 결합하지 않았다(도 8A).

또 다른 방법으로 세포사멸을 측정하기 위해 세포사멸의 척도가 되는 활성화된 카스파제-3의 발현 여부를 Choi-CK, SCK, ACHN 세포에서 알아보았다. 이를 위해 FITC-CONJUGATED MONOCLONAL ACTIVE CASPASE-3 ANTIBODY APOPTOSIS KIT (BD Bioscience)을 사용하였다. 배양된 Choi-CK, SCK 및 ACHN 세포에 A10-A3 항체와 normal mouse IgG 항체를 10 μg/ml 농도로 첨가한 후, 세포를 37℃ CO₂ 반응기에서 48시간 동안 반응시켰다. 세포 분리 완충액(GIBCO)으로 20분 37℃에서 처리하여 단일세포로 분리한 뒤, 40 μm 스트레이너(strainer)를 통과시켜 1 × 10⁵ 세포를 유세포분석기(Flow cytometry)에 사용하였다. 먼저 단일 세포화된 SCK, Choi-CK 및 ACHN세포를 Cytofix/Cytoperm에 부유시키고 얼음에서 20분 동안 반응시켰다. 세포를 침전시킨 후 상층액을 걷어낸 후 Perm/Wash 용액에 3번 씻었다. 세포의 대조군과 실험군 각각에 20㎕의 카스파제-3 항체를 넣어주고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 세포를 침전시킨 후 상층액을 걷어내고 Perm/Wash 용액으로 2번 씻어주었다. 이렇게 준비된 세포들로 유세포분석을 실시하였다. 그 결과, A10-A3 항체를 처리한 SCK, Choi-CK에는 카스파제-3 항체가 결합하는 결과가 나왔고, A10-A3가 결합하지 않는 ACHN 세포에는 카스파제-3 항체가 결합하지 못하였다(도 8B).

위 두 결과들은 A10-A3 항체가 암세포의 사멸을 유도함을 증명하는 것이다.

< 실시예 10> A10-A3 항체에 의한 암세포 신호전달 억제

A10-A3 항체에 의한 담도암세포의 증식, 이동, 침투 억제 효과가 암세포의 신호전달 억제 때문인지를 알기 위하여, 암세포의 증식, 이동, 침투, 생존에 기여하는 중요한 세포신호전달물질들(예, PCNA, 인산화된 MAPK, AKT, FAK)의 양적 변화를 항체 처리 후 분석하였다.

< 실시예 10-1> A10-A3 항체에 의한 암세포의 PCNA 발현 억제

세포의 증식을 표현하는 PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN (PCNA)의 발현이 A10-A3 항체에 의하여 저하되는지를 웨스턴 블럿팅으로 검증하기 위하여, Choi-CK 세포에 항체 A10-A3, 마우스 IgG 10μg을 각각 72시간 처리한 후 세포를 수거하여 세포용해 용액에 녹였다. BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하여 40μg의 단백질을 8% SDS-PAGE에서 전개하고 니트로셀룰로스 막으로 25V 90분 동안 Western transfer하였다. 막을 5% 스킴 밀크로 밤새 4°C에서 블라킹하고 마우스 모노클로날 항-PCNA (Novocastra Laboratories 1:500) 항체와 항-β 액틴 (Oncogene, 1:4000) 항체로 1시간 반응시켰다. 그리고 항-mouse horseradish peroxidase-conjugated antibody(Cell Signaling, 1: 1000)로 반응시키고 PBST로 세척한 후 enhanced chemiluminescence reagent(ECL) (Amersham Pharmacia Biotech)로 PCNA와 β-actin을 검출하였다. 항체 A10-A3로 처리한 Choi-CK에서만 PCNA의 발현이 현저하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 9A).

< 실시예 10-2> A10-A3 항체에 의한 MAPK 인산화 반응( phosphorylation ) 억제

암세포의 성장, 침투, 생존에 관여하는 MAPK(mitogen-activated protein kinases) 인산화 반응(phosphorylation)이 A10-A3 항체에 의하여 감소되는지를 웨스턴 블럿팅으로 검증하기 위하여, Choi-CK세포에 항체 A10-A3 및 마우스 IgG를 10 μg/ml로 각각 72시간 처리한 후 세포를 수거하여 세포용해 용액에 녹였다. BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하여 40 μg의 단백질을 12% SDS-PAGE에서 전개하고 니트로셀룰로스 막으로 25V 90분 동안 Western transfer하였다.

막을 5% 스킴 밀크로 밤새 4°C에서 블러킹하고 토끼 폴리클로날 항-phospho MAPK (Ab Cam 1:1000) 항체로 1% 탈지유에서 밤새 반응시켰으며, 인산화반응되지 않은 MAPK의 발현을 조사하기 위해서는 같은 양의 단백질을 위와 같이 동일하게 처리하여 블러킹한 니트로셀룰로스 막에 항-MAPK (Ab Cam, 1:1000) 항체로 1시간 반응시켰다. 그리고 항-토끼 horseradish peroxidase-conjugated antibody(Cell Signaling, 1: 10000)로 1시간 반응시키고 PBST로 세척한 후 ECL(Amersham Pharmacia Biotech)로 phospho MAPK와 MAPK을 검출하였다. 동일한 MAPK가 발현하는 Choi-CK 암세포에서 항체 A10-A3를 처리한 Choi-CK에서만 phospho-MAPK의 양이 현저하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 9A).

< 실시예 10-3> A10-A3 항체에 의한 AKT 인산화 반응 억제

암세포의 생존에 관여하는 Akt 인산화 반응이 A10-A3 항체에 의하여 감소되는지를 웨스턴 블러팅으로 검증하기 위하여, Choi-CK세포에 항체 A10-A3와 마우스 IgG 10 μg을 각각 30분, 1시간, 1시간 30분 및 2시간씩 처리한 후 세포를 수거하여 세포용해 용액에 녹였다. BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하여 40 μg의 단백질을 12% SDS-PAGE에서 전개하고 니트로셀룰로스 막으로 25V 90분 동안 Western transfer하였다. 막을 5% 스킴 밀크(skim milk)로 밤새 4°C에서 블러킹하고 토끼 폴리클로날(Rabbit polyclonal) 항-phospho Akt(Ab cam 1:1000)항체와 토끼 폴리클로날 항-Akt(Ab cam 1:1000)로 1% 스킴 밀크(skim milk)에서 밤새 반응시켰으며 항-토끼 IgG HRP(Santa Cruz 1:10000)항체로 1시간 반응시켰다. PBST로 세척한 후 enhanced chemiluminescence reagent (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech)로 phospho Akt와 전체 Akt를 검출하였다. 항체 A10-A3를 처리한 Choi-CK에서 phospho Akt의 양이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 9B).

< 실시예 10-4> A10-A3 항체에 의한 FAK 인산화반응 억제

암세포의 성장 및 이동에 중요하게 작용하는 인테그린(Integrin)의 활성화에서 필수적으로 나타나는 focal adhesion kinase(FAK)의 인산화 반응이 A10-A3 항체에 의하여 감소되는지를 웨스턴 블럿팅으로 분석하기 위하여, Choi-CK, SCK세포에 항체 A10-A3을 30분, 1시간, 1시간 30분, 2시간씩 처리한 후 세포를 수거하여 세포용해 용액에 녹였다. BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하여 40 μg의 단백질을 7.5% SDS-PAGE에서 전개하고 니트로셀룰로스 막으로 25V 90분동안 Western transfer하였다.

막을 5% 스킴 밀크로 밤새 4°C에서 블라킹하고 토끼 폴리클로날 항-phospho FAK(Ab cam 1:1000) 항체로 1% 스킴 밀크에서 밤새 반응시켰으며 항-β-actin(Oncogene, 1:4000) 항체로 1시간 반응시켰다. 그리고 항-토끼 horseradish peroxidase-conjugated antibody(Cell Signaling, 1: 10000)로 1시간 반응시키고 TBST로 세척한 후 enhanced chemiluminescence reagent(ECL)(Amersham Pharmacia Biotech)로 phospho FAK과 β-actin을 검출하였다.

항체 A10-A3로 처리한 Choi-CK와 SCK에서 phospho-FAK의 양이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 9C). 이 결과로부터 A10-A3에 의한 암세포의 성장 및 전이 억제 효과가 인테그린의 활성 억제와 관련되어 있음을 알 수 있다.

실제로, Choi-CK, SCK 세포의 인테그린의 발현 양상을 분석해본 결과 αvβ5가 발현되어 있음을 확인하였고(도 10A), αvβ5에 대한 단일클론항체(AbCam)를 이들 세포에 처리한 결과 세포의 성장이 억제함을 확인하였고 A10-A3 항체에 의한 억제 정도가 비슷하였다(도 10B). 이 결과는 L1CAM이 인테그린 αvβ5를 통하여 암세포의 성장, 전이에 관여함을 의미한다.

< 실시예 11> A10-A3 항체에 의한 수용성 L1CAM 의 암세포 증식억제 효과 확인

L1CAM은 세포막에 결합되어 있지만 때에 따라서는 ADAM10이나 플라즈민(plasmin)이라는 단백질 가수분해효소에 의하여 잘려 세포로부터 분비된다. 분비된 수용성 L1CAM은 세포의 인테그린에 결합하여 암세포의 이동, 생존을 촉진함이 밝혀졌다(Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 232: 236-239). 따라서, 본 발명 의 항체 A10-A3가 분비된 L1CAM에 결합하여 분비된 L1CAM에 의한 암세포의 성장을 억제하는지를 분석하였다.

< 실시예 11-1>수용성 L1CAM - Fc 의 발현 및 정제

수용성 L1CAM을 발현시키기 위하여 상기 실시예 <5-1>과 같이 pJK-dhfr2-L1-FC DNA를 HEK293T에 발현시켰다. 48시간 배양한 배양액을 모아 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)을 사용하여 4℃에서 2시간 동안 회전하면서 항체를 결합시키고 컬럼을 똑바로 세워서 혈청 분리관을 이용하여 컬럼의 벽면을 세척액(0.5 M의 NaCl, 0.1 M의 Tris, pH 8.0)으로 세척하고, 컬럼을 페리스타틱 펌프(peristatic pump)에 연결하여 세척액으로 충분히 세척하였다. 세척 완료 후, 0.2 M의 글리신(glycin)-HCl(pH 2.7)으로 항체를 용출하였다. 이때, 미리 준비한 1 M의 Tris(pH 9.0)를 포함한 튜브에 상기 용출액을 완충시켰다. 그리고 PBS(pH 7.4)에서 4회 반복하면서 투석하였다.

< 실시예 11-2> A10-A3 항체에 의한 수용성 L1CAM 의 암세포 증식 억제

담도암 세포(Choi-CK , SCK)의 증식에 수용성 L1CAM이 작용하는지 확인하고, A10-A3항체를 처리하면 수용성 L1CAM의 작용 억제에 의해 암세포의 증식이 저해되는지 확인하기 위해, 96 웰 플레이트의 각 웰 마다 Choi-CK 세포 3,000개와 SCK 세포 2,000개씩을 준비하였다. 또한 수용성 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 혹은 20 μg/ml 농도의 L1-Fc와 같은 농도의 A10-A3를 섞어준 뒤 상온에서 5 분간 방치한 후, 혼합액을 준비된 Choi-CK 세포와 SCK 세포에 첨가하였다. 세포들을 50시간 동안 배양한 후 WST-1을 첨가하고 45O nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과 수용성 L1CAM을 넣어준 세포들은 성장이 증가하는 결과를 볼 수 있었고, A10-A3와 수용성 L1CAM을 섞어서 넣어준 Choi-CK 세포와 SCK 세포들은 그 성장이 저해되는 결과를 볼 수 있었다(도 11).

< 실시예 12> 생쥐 모델에서 항체 A10-A3의 암 세포 성장 억제 실험

누드 마우스 Balb/c nu/nu를 중앙실험동물사를 통해 SLC(일본)에서 구입하였다. 주령 및 체중은 6~8주령 및 18~22g으로 한국생명공학연구원에서 1주일 순화시켰다. 그 후 피하에 3x10⁶ cells의 Choi-CK 세포를 이식하였으며, 20일째에 390 mm³의 크기로 성장하였다(도 12a). Tumor volume은 가로(mm)x세로(mm)x높이(mm)/2로 측정하였다. 실험최종일에 누드 마우스를 CO₂를 이용하여 희생시킨 후 종양을 분리하였으며, 무게를 측정했다. 동물에 대한 독성을 검증하기 위하여 동물의 체중을 측정하였다. 표준 편차(SDs) 및 p value는 ANOVA(Prisim, GraphPad software, USA) 및 student t test 을 사용하여 산출되었다.

A10-A3를 1일째부터 매주 3회씩 10 mg/kg의 농도로 꼬리정맥으로 주사하였을 때, 20일째까지 강함 항암효과가 관찰되었다(도 12a). 대조군(control)으로는 생쥐 IgG 항체를 동일한 양으로 꼬리정맥에 주사하였다. day 20에 종양의 크기는 232 mm³ 으로서 대조군과 비교하여 약 40%의 항암효과가 관찰되었다(도 12a). 실험최종일(20일째)에 종양을 분리한 후 무게를 측정하였다(도 12b). 대조군의 평균 종양무게는 872 mg 이었으며, A10-A3 투여군의 평균 종양무게는 516 mg으로 약 40%의 항암효과가 관찰되었다.

A10-A3의 독성을 예측하기 위하여, 누드 마우스의 체중변화를 20일 동안 측정하였으며, 또한 육안으로 행동의 변화를 검증하였다(도 12c). 20일째에 대조군과 비교하였을 때 체중감소 및 이상행동도 관찰되지 않았다.

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체는 담도암 또는 폐암 세포를 포함한 각종 암세포 표면의 L1CAM 단백질 또는 암세포에서 분비된 L1CAM에 결합하며, 이로 인해 암세포의 성장, 침윤 또는 이동을 억제하고 또한 암세포의 사멸을 유도함으로써 암 치료 및 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (10)

1. L1CAM의 첫 번째 면역글로불린-유사 도메인(Ig1)에 선택적으로 결합하고 암세포의 증식, 이동 또는 침윤을 억제하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편.
2. 제1항에 있어서, L1CAM은 세포막 결합 형태 또는 세포막에서 유리된 형태인 단일클론항체 또는 이의 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 기탁번호 KCTC 10909BP의 하이브리도마에 의해 분비되는 단일클론항체 또는 이의 단편.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암세포가 담도암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 대장암 또는 췌장암인 단일클론항체 또는 이의 단편.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체의 단편은 Fab, F(ab'), F(ab')₂ 또는 Fv인 단일클론항체 또는 이의 단편.
6. 기탁번호 KCTC 10909BP인 하이브리도마
7. 제1항의 항체 또는 이의 단편 또는 이로부터 제조한 카이메릭, 인간화 항체 또는 인간 단일클론항체를 포함하는 암 치료 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 암은 담도암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 대장암 또는 췌장암인 암 치료 조성물.
9. 제7항에 있어서, 상기 항체에 공지의 암 치료제를 추가적으로 결합시킨 것을 특징으로 하는 암 치료 조성물.
10. 삭제

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