KR20100060351A - Ｌ１ｃａｍ의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 및 항암제를포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 및 항암제를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 L1CAM의 활성을 억제하는 물질로서 L1CAM에 특이적인 항-L1CAM 항체, L1CAM의 발현을 억제하는 물질로서 L1CAM의 발명을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 및 항암제로서 시스플라틴, 젬시타빈(gemcitabine), 5-플루오로우라실 및 탁솔에서 선택되는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 그에 포함되는 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 및 항암제를 동시에, 별도로 또는 순차적으로 병용함으로써, 이들 물질을 단독으로 처리한 각각의 약리학적 효과에 비해 훨씬 강력하면서도 유의적인 암세포 성장 및 사멸 효과를 나타내어 암의 치료에 매우 유용하다.
L1CAM, 항체, siRNA, 시스플라틴, 병용 투여

Description

Ｌ１ＣＡＭ의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 및 항암제를 포함하는 항암용 조성물 {A composition for treating L1CAM-expressing cancer comprising an inhibitor of activity or expression of L1CAM and anticancer agent}
본 발명은 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 및 항암제를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 L1CAM의 활성을 억제하는 물질로서 L1CAM에 특이적인 항-L1CAM 항체, L1CAM의 발현을 억제하는 물질로서 L1CAM의 발명을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 및 항암제로서 시스플라틴, 젬시타빈(gemcitabine), 5-플루오로우라실 및 탁솔에서 선택되는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 두 물질을 단독으로 투여하였을 때보다 상승적인 치료효과를 나타내어 암, 특히 L1CAM을 발현하는 암을 효과적으로 치료하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
L1CAM (L1 cell adhesion molecule)은 세포 표면에서 세포간부착(cell-to-cell adhesion)을 중개하는 면역글로불린 수퍼패밀리 세포부착단백질들(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules, CAMs)에 속하는 내재성 막 당단백질(integral membrane glycoprotein)중 하나로서, 그 분자량은 220 kDa에 달한다. L1CAM은 원래 뉴런에서 발견되었으며 그 기능은 뉴런의 이동, 신경돌기의 성장 및 세포 이동으로 알려져 있다. L1CAM은 신경조직 외에도 몇몇 정상조직에서 발현하는 것으로 알려졌으며, 최근에는 여러 암세포에서도 발견되기 시작하였다.
L1CAM과 암과의 연관성은, L1CAM이 흑색종 (melanoma), 신경아세포종 (neuroblastoma), 난소암 및 대장암 등 여러 암에서 발현되는 것이 보고되었으며 (Takeda, et al., J. Neurochem. 66:2338-2349, 1996; Thies et al, Eur. J. Cancer, 38:1708-1716, 2002; Arlt et al., Cancer Res. 66:936-943, 2006; Gavert et al., J. Cell Biol. 168:633-642, 2005), 막 결합 형 (membrane bound form) 외에도 절단된 산물 (cleavage product)이 세포 외로 분비되는 것이 발견 된다 (Gutwein et al., FASEP J. 17(2):292-4, 2003). 그리고 최근 암세포의 성장에 중요한 역할을 하는 분자의 하나로 탐색됨으로써 (Primiano, et al., Cancer Cell. 4(1):41-53 2003), 암치료의 새로운 타겟으로 부상되었다 (US2004/0115206 A1 출원 2004.6.17). 최근 L1CAM에 대한 항체가 난소암세포의 성장과 전이를 억제함이 밝혀졌다 (Arlt, et al., Cancer Res. 66:936-943. 2006).
유럽 특허출원 EP 1 172 654 A1 및 미국 특허출원 US 2004/0259084호는, L1CAM이 난소암, 자궁내막암 또는 그러한 암의 소인의 존재에 대한 표식이 된다는 전제 하에, 난소암 또는 자궁내막암의 진단 및 예후를 위해 환자의 샘플에서 L1CAM의 항체를 통해 L1CAM 수준을 결정하는 것을 특징으로 하는 수단 및 세포 독성을 가진 약물과 L1CAM 항체 및 그 부분을 결합시켜 충분한 양으로 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법에 대해 개시하고 있다. 그러나 이 문헌들은 단지 L1CAM 단백질이 체액 또는 조직에서 난소암 또는 자궁내막암의 매우 특이적인 마커임을 기재하고 있을 뿐이다.
미국 특허출원 US 2004/0115206호는 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 유방암, 대장암, 자궁경부암등 암세포 사멸을 유도하는 제제, 세포 사멸을 위해 상기 항체를 사용하는 수단 및 L1CAM 항체가 포함된 약제학적 조성물에 관하여 개시하면서, 암세포에서 세포 성장을 저해하고 세포사를 유도할 수 있는 유효량의 항 L1CAM 항체를 세포에 접촉(contacting)시키는 것에 의해 세포의 성장을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 것이 개시되어 있다.
또한, 국제출원 PCT/EP2005/008148은 난소 및 자궁내막암에서 과발현되는 L1CAM 단백질 및 그들의 발현을 저해하는 조성물 및 이를 이용하여 난소 및 자궁내막암을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 이 문헌은 L1CAM 단백질의 기능을 저해하는 L1CAM 항체 및 그의 유도체를 포함하는 조성물이 난소암 및 자궁내막암의 기능을 억제하여 암세포의 이동 및 진전을 저지하여 암의 치료가 가능하다고 기재하고 있다.
최근, 대한민국특허출원 10-2007-0084868에서는 담도암 세포주로 생쥐를 면역시켜 단일클론항체(A10-A3)를 얻고, A10-A3 항체가 L1CAM을 특이적으로 인식함을 확인하였으며, 상기 A10-A3 항체를 이용하여 L1CAM이 담도암 세포 표면에 발현함을 확인하였고, 담도암 환자의 L1CAM의 발현율과 생존율과의 관계에 대한 통계학적 분석 결과로부터, L1CAM 발현율이 높은 그룹의 사망률이 L1CAM 발현율이 낮은 그룹의 사망률보다 확실히 높음을 확인하여 L1CAM이 담도암의 나쁜 예후 인자(poor prognositic factor)로서 작용함을 기재하였으며, 인 비트로(in vitro)와 인 비보(in vivo) 동물실험을 통해서 L1CAM에 대한 항체가 담도암 세포의 성장, 이동 또는 침윤을 억제하는 효과가 있음을 밝힘으로써, L1CAM이 담도암에 대한 탁월한 진단 또는 치료 효과를 가질 수 있음을 기재하고 있다.
최근 연구에 따르면 L1CAM이 C2-ceramide, staurosporine, cisplatin, 그리고 hypoxia에 의한 난소암의 세포사를 억제하는 기능을 보고하고 있으며 (Stoeck A. et al Gynecol Oncol. 2007;104(2):461-469), 시스플라틴(cisplatin)을 처리한 난소암, 췌장암 세포에서 L1CAM이 증가되어 있음을 보고하고 있다.
그러나 위의 어느 문헌들도 L1CAM의 작용을 저해하는 항체와 항암제의 병용 투여 시 상승적인 암치료 효능을 관찰한 것에 대해서는 기재하고 있지 않다.
항암제란 암세포의 각종 대사경로에 작용하여 암세포에 대하여 세포독성(cytotoxicity)이나 성장억제효과(cytostatic effects)를 나타내는 약제를 총칭하며, 지금까지 개발된 항암제는 그 작용기전과 화학구조에 따라 대사길항제, 식물 성 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제(topoisomerase inhibitor), 알킬화제, 항암성 항생물질, 호르몬제 및 기타 약제로 분류할 수 있다. 항암제들은 약제에 따라 세포 내 표적이 다양한데, 세포의 DNA복제, 전사 및 번역과정을 차단하거나 세포생존에 중요한 단백질의 작용을 방해하며, 이러한 세포 내 표적에의 영향은 이후 necrosis나 apoptosis의 과정을 통해 세포를 사멸케 한다. 이러한 항암제가 작용하는 대사경로는 암세포에만 특이한 것이 아니고 정상세포에도 동일하기 때문에 항암제 투여 시 정상조직의 손상, 즉 독성은 불가피하다고 할 수 있다. 그러나 암세포와 정상세포의 대사 사이에는 양적인 차이가 존재하고 이로 인하여 항암제는 암조직에 보다 큰 독성을 나타내게 되는 바 이러한 항암제의 선택적 독성(selective toxicity)을 이용하여 임상적으로 항암화학요법이 가능하며, 치료학적 지수(therapeutic index)가 클수록 정상조직의 독성은 피하면서 암세포를 없앨 수 있어 안전한 항암제라고 할 수 있다.
지금까지 50여개 이상의 항암제가 개발되었으며, 암의 종류 및 특성에 따라 사용되는 항암제도 차이가 있으며 단독 혹은 다른 항암요법과 병용하여 암치료에 이용되고 있다. 가장 일반적으로 사용되는 항암제로는 DNA 알킬화제 (시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide)), 대사길항제 (메톡트렉세이트(methotrexate), 폴레이트(folate) 저해제, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 피리미딘 저해제), 미세소관(microtubule) 저해제 (빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel)), DNA 삽입물질(intercalators) (독 소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin)), 그리고 호르몬 치료제 (타목시펜(tamoxifen), 플루타미드(flutamide)) 등이 개발되었다.
시스플라틴(Cisplatin)은 1968년 세포독성을 가진 항암제로 개발되었으며 DNA의 이중 가닥에 결합해 이웃한 DNA와 서로 연결시켜서 DNA 가닥의 분리를 저해함으로써 세포 분열(cell division)을 억제하는 것으로 알려져 있다. 시스플라틴은 가장 광범위하게 사용되는 항암제로 특히 난소암, 고환암 및 두경부암과 같은 고형암 치료에 사용되고 있다. 그러나 내재적 혹은 외래적 요인으로 시스플라틴에 대해서 내성을 획득한 암들에 있어서는 그 사용이 제한적이다 (Andrews, P.A> and Howell, SB.(1990) Cancer cells.; Kelley, s.l. and Rozencweig, M (1989) Eur. J. Clin. Oncol. 25:1135-1140; Perez, R.P. et al. (1990) pharmacol. Ther. 48:19-27; and Timmer-Bosscha, H. et al. (1992) Br. J. Cancer 66:227-238) 따라서 내성을 유도하는 인자에 대한 저해제와 병용투여를 통한 치료가 요구되고 있다.
젬시타빈(Gemcitabine) (2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘)은 뉴클레오사이드 유사체로서 DNA의 합성을 통해서 세포증식을 억제하는 항암제로 방광암, 유방암, 폐암, 난소암, 담도암, 및 췌장암과 같은 고형암 치료에 이용되고 있다. 젬시타빈은 임상학적으로 그 효능은 매우 우수하나 빈혈, 백혈구 및 중성구감소증, 간에서의 효수증가, 구토, 및 고열과 같은 부작용이 심각하기 때문에 사용되는 농도가 매우 제한적이다. 따라서 젬시타빈의 농도를 감소시키면서 치료 효능은 증가시 킬 수 있는 병용치료제 개발이 요구되고 있다.
5-플루오로우라실(5-fluorouracil)은 세포독성을 가진 대사길항제로서 위장암, 유방암, 그리고 두경부암 등 고형암 치료에 이용되고 있는 항암제이며 특히 다른 항암제와의 병용투여로 널리 이용되고 있다. 특히 류코보린(leucovorin) 그리고 포리닌산(folinic acid)의 칼슘염과 병용투여시 고형암 치료에 매우 효과적인 것으로 알려져있다 (Malet-martino M et al. Clinical studies of three oral prodrugs of 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) (Capecitabine, UFT, S-1): A review. Oncologist 2002;4(4)228-323). 그러나 경구 투여에 따른 세포독성과 낮은 생체 이용률으로 인하여 정맥 투여만 가능하다는 단점과 정맥 투여시 85%이상이 dihydropyrimidine dehydrogenase(DPD)효소에 의해 불활성되기 때문에 DPD의 강한 활성을 나타내는 환자를 치료하는데 있어서는 제한적이다. 따라서 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)의 효능을 증가시키기 위해서는 다른 항암제와 병용투여가 요구되고 있다 (Malet-martino M et al.)
도세탁셀(Docetaxel, Taxol)과 그것의 유도체인 파클리탁셀(paclitaxel)은 고형암이나 전이성이 강한 악성종양을 치료하는데 사용되는 항암제로서, 유럽 특허EP 0 253 738과 국제 공개 특허 WO 92/09589는 도세탁셀의 제조 방법에 대해서 개시하고 있다. 도세탁셀의 사용량은 60-300 mg/m2으로 환자에 따라 매우 다르며, 일반적으로 정맥투여경로를 통해서 60-100 mg/m2의 농도로 3주간 1시간 이상 주입된다 (Texbook of Medical Oncology, Franco Cavelli et al., Martin Dunitz Ltd., p.4623 (1997)). 많은 임상학적 연구들에서, 특히 유방암에 치료에 있어 도세탁셀의 효능이 검증되었으며, 일반적으로 그 효능은 1-2 치료 후에 볼 수 있다고 알려져 있다. 도세탁셀의 작용기전은 미세소관(microtuble)의 회합(assembly)을 증가시키고 튜불린(tublin)의 탈극화(depolymerization)를 억제시키는 것으로 밝혀졌다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 항암제로서 탁월한 효과를 가지는 유효한 성분을 연구하던 중 각각 단일제제로 이용할 수 있는 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질과 기존의 항암제를 병용함으로써, 현저하게 효과가 우수한 항암제를 제공할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 및 항암제를 포함하되, 상기 두 물질을 단독으로 투여하였을 때보다 상승적인 치료효과를 나타내어 암, 특히 L1CAM을 발현하는 암을 효과적으로 치료하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기의 (a) 및 (b)를 동시에, 별도로 또는 순차적으로 병용하기 위해 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다:
(a) L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질; 및
(b) 항암제.
구체적인 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 상기 (a)로서 L1CAM의 활성을 억제하는 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 활성억제물질은 암세포 표면 항원 또는 분비된 표면 항원으로 알려진 L1CAM을 특이적으로 인식하는 항-L1CAM 항체이다. 이러한 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간화 항체를 모두 포함하는 것이고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있으며, 이들은 당해 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다. 예로써, 본 발명의 조성물에 포함되는 항체는 공지의 단일클론항 체 제조기술 및 이러한 단일클론항체를 카이메릭화, 인간화 하는 공지의 방법에 의해 로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
파지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적인파지 디스플레이 기술은 1) 파지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로 구성된다.
따라서 L1CAM 특이적인 항-L1CAM 제조방법은 예컨대 인간 항체 라이브러리로부터 L1CAM에 결합하는 항체를 패닝에 의해 골라내는 파지 디스플레이 방법에 의하거나, L1CAM 단백질로 생쥐를 면역시켜 라이브러리를 제조하거나 하이브리도마를 제조하여 L1CAM에 결합하는 항체를 제조하는 방법에 의할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체는 대한민국 등록특허 제10-0756051호 및/또는 대한민국 공개특허 제10-2008-0018149호에 기재된 항-L1CAM 항체인 A10-A3이며, 이러한 A10-A3 항체는 상기 공지 문헌에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산될 수 있으며, 바람직하게는 수탁번호 KCTC10909BP에 의해 분비되어 생산된다.
상기 항-L1CAM 항체는 L1CAM을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 항원성 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 항원성 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
또 다른 구체적인 일 양태로서, 상기 항암용 조성물은 상기 (a)로서 L1CAM의 발현을 억제하는 물질을 포함할 수 있다. L1CAM을 발현하는 암세포에서 L1CAM의 발현을 억제하는 물질들을 이용하여 L1CAM의 발현을 억제시키면, 암세포의 성장과 전이 역할을 하는 L1CAM의 작용이 줄어들어, 암치료가 가능하다. 바람직하게는, 상기 L1CAM의 발현을 억제하는 물질은 siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)로 구성되는 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 5'-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3' 서열(서열번호 1)을 포함하는 siRNA이다.
용어 "siRNA"는 RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, "shRNA"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 최근 유전자 수준에서 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법으로 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 이용한 방법이 연구되고 있으며, 일반적으로 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 조성물에 포함되는 siRNA를 제조하는 방법에는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520), 인 비트로 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.
용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 L1CAM 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고머이다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 (b)로서 항암제를 (a)와 병용 투여 하기 위해 포함한다.
용어 "항암제"란 암세포의 각종 대사경로에 작용하여 암세포에 대하여 세포독성(cytotoxicity)이나 성장억제효과(cytostatic effects)를 나타내는 기존의 암 치료에 사용되는 공지의 약제를 총칭하는 것이며, 지금까지 개발된 대사길항제, 식물성 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제(topoisomerase inhibitor), 알킬화제, 항암성 항생물질, 호르몬제 및 기타 약제를 모두 포함하는 것이다. 본 발명에 따른 조성물에 포함되어 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질과 특히 상승 효과를 나타내는 항암제로는 시스플라틴, 카보플라틴 및 헵타플라틴과 같은 시스플라틴(cisplatin)류, 젬시타빈, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 및 도세탁셀 및 그의 유도체인 파클리탁셀과 같은 탁솔류가 바람직하며, 특히 바람직한 항암제는 시스플라틴이다. 이러한 항암제들은 공지의 방법에 의해 제조하거나 혹은 시판품을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질과, 항암제는 혼합하여 동시에 투여하는 것도 가능하지만, 각각을 별개로 동시 또는 연쇄적으로, 혹은 시간을 두고 별개로 투여하는 것도 가능하다. 동시에 투여하는 것이 아닌 경우는, 예를 들면 두 유효 성분을 교대로 번갈아 투여하거나 혹은 하나를 계속해서 투여한 후 다른 하나를 투여하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 조성물은 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질, 및 항암제를 유효 성분으로 함유하고 있으면 되며, 어떤 형태의 약제여도 가능하다. 예를 들면, 두 유효 성분을 포함한 합제를 구성해도 좋고, 각각 단제로서 구성되어도 좋다. 여기에서 합제란, 하나의 제제에 2 가지 이상의 유효 성분을 배합한 것을 말하며, 단제란 하나의 제제에 하나의 유효 성분을 함유한 것을 말하며, 이때 상기 유효 성분들은 각각의 약리, 약동학적 특성에 따라 각기 다른 제형으로 제조되어 합쳐질 수도 있다. 본 발명에 있어서, 두 유효 성분이 단제인 경우의 치료제는 각각 단일로 이용이 가능한 단제를 조합하여 이용하는 약제를 의미한다. 두 유효 성분이 단제인 경우는, 두 성분을 한 번에 갖춘 형태인 키트의 형태일 수도 있다.
또한, 본 발명의 항암용 조성물은, 매일 투여 또는 간헐적으로 투여할 수도 있으며, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 수회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효 성분이 각각 단제인 경우의 투여 횟수는 같은 횟수일 수도, 다른 횟수일 수도 있다.
본 발명의 항암용 조성물은, 그들만 혹은 이하에서 설명하는 것과 같은 적당한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 공지의 방법으로 제제화 할 수 있다. 이와 같은 제형의 구체적인 예로서는, 연질캡슐제, 경질캡슐제, 정제, 시럽제 등의 경구제, 주사제 또는 외용제를 들 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체에는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용되는 표준의 제약학적 담체 중 어느 것이든 포함된다. 전형적으로 이러한 담체는 폴리비닐피롤리돈, 덱스트린, 전분, 밀크, 당, 특정 종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 (예를 들면 식용유, 면실유, 코코넛유, 아몬드유, 낙화생유를 들 수 있다) 중성지방산 글리세라이드 등의 유상 에스테르, 광물유, 바세린, 동물유지, 셀룰로오스 유도체(예를 들면 결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스를 들 수 있다) 등의 부형제, 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함한다. 이러한 담체에는 또한 산화방지제, 습윤제, 점도안정제, 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다. 이러한 담체를 함유하는 조성물은 주지된 방법에 의해 제형화 될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 암 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 전형적인 투여량 수준 및 (a) 및 (b) 물질의 비율은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항암용 조성물을 이용하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 치료방법은 상기 항암용 조성물을 약학적 유효량으로 인체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 항암용 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식은 정맥 주사, 피하주사, 피내 주사제, 근육주사 및 점적 주사이다.
앞서 언급한 바와 같이, 상기 물질들의 투여량은 다양한 요소에 의해 달라질 수 있으며, 그 투여 경로 또한 환자의 연령, 투여기간, 체중, 질환의 중증도, 환자의 의식 여부, 병용 약물의 종류 등과 같은 다양한 요소에 의해 경구 또는 비경구의 다양한 투여 경로를 사용할 수 있다. 또한, 각각을 별개로 동시 또는 연쇄적으로, 혹은 시간을 두고 별개로 투여하는 것도 가능하다
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자는 L1CAM을 발현하는 암세포들에게 항-L1CAM 항체와 항암제를 병용 투여시 각각을 단독으로 투여했을 때보다 효과적으로 암세포증식이 억제되는 지 알아보기 위해서, L1CAM의 작용을 저해하는 단 일클론항체인 A10-A3와, 시스플라틴(cisplatin), 젬시타빈 및 5-플루오로우라실을 병용 투여한 결과, 최대 80%까지 암세포의 증식을 억제함을 확인함으로써, 각각의 단독 투여시보다 탁월한 상승 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, L1CAM을 발현하는 담도암 세포주에서 L1CAM의 발현을 넉다운(knockdown)시키기 위해 L1CAM에 대한 특이적인 siRNA를 형질 도입하여 배양한 후에 세포증식 실험과 세포사멸 실험을 실시한 결과 담도암 세포주에서 L1CAM의 발현을 억제 시켰을 때, 시스플라틴(cisplatin)에 의한 증식 저해효과 및 세포사멸 유도의 상승 효과가 있음을 확인하였다.
이러한 본 발명에 따른 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 및 항암제를 포함하는 조성물을 투여하는 경우, 이들 각각을 단독으로 투여했을 때보다 탁월한 상승적인 치료효과를 나타내어 암의 치료, 특히 L1CAM을 발현하는 암종으로 알려진 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 유방암, 대장암, 흑색종, 신경아세포종, 담도암, 폐암 및 췌장암과 같은 다양한 암에 대해 효과적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 암세포의 배양
암세포주는 모두 10% 우태아혈청(Gibco사)을 함유하는 다음과 같은 배지를 이용하여 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. SCK(담도암 세포주), SK-OV3 (난소암 세포주)는 DMEM(Well GENE사) 배지를 이용하였다. SCK 세포주는 김대곤박사(전북대학교 의과대학)로부터 얻었고, 난소암 암세포주는 ATCC로부터 구입하였다.
실시예 2. L1CAM에 대한 항체와 시스플라틴(cisplatin)의 병용투여에 의한 암세포 증식저해 및 암세포 사멸의 상승효과 분석
L1CAM을 발현하는 암세포들에게 L1CAM의 작용을 저해하는 단일클론항체인 A10-A3와 시스플라틴(cisplatin)을 병용 투여 시 각각을 단독으로 투여했을 때보다 효과적으로 세포증식이 억제되는 지 알아보기 위해서, 세포증식 실험을 수행하였다.
항-L1CAM 항체로서 사용한 A10-A3 항체는 대한민국 공개특허 제10-2008-0018149호에 개시된 방법에 의해 제조하였다.
각각의 암세포들을 3 ml의 배지 내에 2 x 105 cells 씩 계수하여 6 well plate에서 배양하고, 시스플라틴(cisplatin) 및 A10-A3 (10 μg/ml)를 단독 혹은 병용 처리한 후, 세포를 37℃ CO2 반응기에서 72시간 동안 배양하였다. 그리고 세포를 회수하여 0.2% 트리판 블루(Tryphan Blue) 용액에서 죽은 세포와 살아있는 세포를 계수하여, 전체 세포 중에 살아있는 세포를 백분율로 계산하였다. 그 결과, 시스플라틴(cisplatin) 및 A10-A3 (10 μg/ml)를 단독으로 처리한 군에서 이들 암세포들의 증식이 30-50% 저해되는 것을 확인 할 수 있었으며, 병용처리 시에는 최대 80% 정도의 세포증식이 억제되는 상승 효과를 확인할 수 있었다 (도 1의 A).
또한 L1CAM에 대한 A10-A3와 시스플라틴(cisplatin)의 병용 투여 시 보다 효과적으로 세포사멸이 유도되는 지 알아보기 위해서, 세포사멸 실험을 수행하였다. 본 실험은 세포가 사멸을 일으키면 DNA가 조각나는 원리를 이용하였다. 각각의 암세포주들을 100 μl의 배지 내에 2 x 104cells씩 계수하여 96 웰 플레이트(well plate)에서 배양하고, 시스플라틴(cisplatin) 및 A10-A3 (10 μg/ml)를 단독 혹은 병용 처리한 후, 24시간을 배양 하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고 PBS 완충용액으로 세척한 다음, 세포용해액(RIPA buffer)을 37℃에서 30분간 반응 시킨다. 이렇게 용해된 세포액에 DNA 특이적인 바이오틴(biotin)을 결합시키고 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합 되어있는 96 웰 플레이트에 20 μl를 옮긴 후, 여기에 80 μl의 immunoreagent를 반응시켜 OD 405nm에서 흡광도를 확인하였다. 그 결과, A10-A3와 시스플라틴(cisplatin)을 병용처리 하였을 때, 단독으로 처리한 군에 비해서 세포사멸이 뚜렷이 증가되었음을 확인 할 수 있었다 (도 1의 B).
상기 결과는 L1CAM에 대한 항체와 시스플라틴(cisplatin)의 병용 투여 시 암세포의 치료 효능을 증가시킬 수 있음을 제시하고 있다.
실시예 3. 생쥐 동물 모델에서 A10-A3와 시스플라틴(cisplatin)의 병용 투여에 의한 암 성장 저해효과 분석
누드 마우스 Balb/c nu/nu를 중앙실험동물사를 통해 SLC (일본)에서 구입하였다. 주령 및 체중은 6~8주령 및 18~22g으로 한국생명공학연구원에서 1주일 순화시켰다. 그 후, 40마리의 피하에 1x107cells의 SCK 세포를 이식하였으며, 1주일 후, 종양 용적이 100-200mm3되었을 때, 무작위로 10마리씩 4개의 군으로 분리 하였다. 그리고 A10-A3는 10 mg/kg 농도로 1주일에 3회씩 처리하였으며, 시스플라틴(cisplatin)은 3 mg/kg 농도로 1주일에 2회씩 처리 하였다. 대조군에는 A10-A3 대신 mIgG를 같은 양으로 처리 하였고, 시스플라틴(cisplatin) 대신 식염수를 같은 양 처리 하였다. 누드 마우스의 질량과 종양 무게를 1주일에 3회씩 측정하였다. 그 결과, A10-A3와 시스플라틴(cisplatin)을 단독으로 처리한 군에서는 약 30% 정도의 증식 저해 효과를 확인 할 수 있었던 반면, 병용 투여한 군에서는 70% 이상의 뚜렷한 저해 효과를 확인 할 수 있었다 (도 2).
실시예 4. L1CAM에 대한 항체와 gemcitabine의 병용투여에 의한 암세포 증식 저해효과 분석
상기 <실시예 2>의 방법과 동일하게 A10-A3와 젬시타빈(gemcitabine)을 병용 투여 시 각각을 단독으로 투여했을 때보다 효과적으로 세포증식이 억제되는 지 분석하였다. 그 결과, 젬시타빈 및 A10-A3 (10 μg/ml)를 단독으로 처리한 군에서 이들 암세포들의 증식이 20-25% (담도암, SCK) 혹은 20-40% (난소암, SK-OV3) 저해되는 것을 확인 할 수 있었으며, 병용처리 시에는 40-60% 정도의 세포증식이 억제되는 상승 효과를 확인할 수 있었다 (도 3의 A).
상기 결과는 L1CAM에 대한 항체와 젬시타빈의 병용 투여 시 암세포의 치료 효능을 증가시킬 수 있음을 제시하고 있다.
실시예 5. L1CAM에 대한 항체와 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)의 병용투여에 의한 암세포 증식 저해효과 분석
상기 <실시예 2>의 방법과 동일하게 A10-A3와 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)을 병용 투여 시 각각을 단독으로 투여했을 때보다 효과적으로 세포증식이 억제되는 지 분석하였다. 그 결과, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및 A10-A3 (10 μg/ml)를 단독으로 처리한 군에서 이들 암세포들의 증식이 20-40% (담도암, SCK) 혹은 20-30% (난소암, SK-OV3) 저해되는 것을 확인 할 수 있었으며, 병 용처리 시에는 40-50% 정도의 세포증식이 억제되는 상승 효과를 확인할 수 있었다 (도 4).
상기 결과는 L1CAM에 대한 항체와 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)의 병용 투여 시 암세포의 치료 효능을 증가시킬 수 있음을 제시하고 있다.
실시예 6-1. 역전사 연쇄 중합 반응(RT-PCR)에 의한 L1CAM의 mRNA 발현 확인
담도암 세포주 SCK에서 L1CAM의 발현을 넉다운(knockdown)시키기 위해 L1CAM에 대한 특이적인 siRNA (5'-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3', 서열번호 1)와 비특이적인 siRNA (5'-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3', 서열번호 2)를 각각 형질도입한 후, 72시간 동안 배양하였다. 배양된 담도암세포의 전체 RNA를 분리 하기 위해서 1ml Trizol reagent(Invitrogen 사)를 상온에서 5분 동안 처리하였다. 여기에 0.2ml chloroform을 처리하여 15회 정도 강하게 흔들어 준 후, 상온에서 3분 반응 시킨다. 4℃에서 14000 rpm으로 15분 동안 원심 분리하여, 상층의 투명 부분 400μl를 다른 튜브로 옮기고 같은 양의 이소프로판올을 처리한 후, 상온에서 10분 반응 시킨다. 다시 4℃에서 14000 rpm으로 15분 동안 원심 분리하여, 상층액을 버리고 75% 에탄올로 세척한다. 이렇게 추출한 RNA 2ug에 oligo(d)T, dNTP, RNase 저해제와 역전사 효소를 넣어 42℃에서 1시간 반응 시켜 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA에 L1CAM 프라이머, dNTP, Taq 중합효소를 이용하여 30초/95℃, 30초/56℃ 및 30초/72℃ 30회 연쇄 중합반응을 시키고, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다. 그 결 과, L1CAM에 대한 비특이적인 siRNA를 처리한 대조군에 비해서 특이적인 siRNA를 처리한 군에서 L1CAM의 전체 발현양이 감소한다는 것을 확인하였다 (도 5의 A의 위쪽 도면)
실시예 6-2. 웨스턴 블러팅(Western blotting)에 의한 L1CAM의 단백질 발현 확인
담도암 세포주 SCK에서 L1CAM의 발현을 넉다운(knockdown)시키기 위해 L1CAM에 대한 특이적인 siRNA (5'-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3')와 비특이적인 siRNA (5'-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3')를 각각 형질 도입하여 72시간 동안 배양한 후, 웨스턴 블러팅을 이용하여 단백질 수준에서 L1CAM의 발현을 확인 하였다. siRNA를 처리한 세포주의 전체 단백질을 분리하기 위하여 500 μl 세포 용해액(RIPA buffer)을 처리한 후, 여기서 얻어진 단백질들을 10% SDS-PAGE에서 분리하였고, 니트로셀룰로즈 막으로 옮겨 웨스턴 블럿을 수행하였다. 니트로셀룰로즈 막을 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 PBST(PBS + 0.1% Tween 20) 완충용액에서 1시간 동안 반응 시킨 후, 상기 PBST 완충용액으로 두 차례 이상 세척하였다. 상기 반응된 니트로셀룰로즈 막을 공지의 항-L1CAM 항체 A10-A3를 1차 항체로 첨가하여 2 시간 동안 반응시켰다. 상기 PBST 완충용액으로 5차례의 세척 후 항-마우스 IgG의 horseradish peroxidase (HRP) conjugate (1:5000 Sigma)로 1 시간 반응시켰다. 다시 PBST 완충용액으로 5차례의 세척 후, ECL 검출 시약(Amersham biosciences)로 발색시켰다. 그 결과, L1CAM에 대한 비특이적인 siRNA를 처리한 대조군에 비해서 특이적인 siRNA를 처리한 군에서 L1CAM의 전체 단백질 발현양이 감소되었음을 확인하였다 (도 5의 A 아래 도면).
실시예 6-3. L1CAM의 발현을 억제하는 siRNA와 항암제 병용투여에 의한 세포증식 억제효능 및 세포사멸 유도효과 분석
L1CAM을 발현하는 담도암 세포주 SCK에서 L1CAM의 발현을 넉다운(knockdown)시키기 위해 L1CAM에 대한 특이적인 siRNA (5'-GCCAATGCCTACATCTACGTT-3')와 비특이적인 siRNA (5'-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3')를 각각 형질 도입하여 72시간 동안 배양하였다. 그 후에 <실시예 2>에서 실시했던 방법으로 세포증식 실험과 세포사멸 실험을 실시하였다. 하기 도 5의 B 및 C에 나타난 바와 같이 담도암 세포주 SCK에서 L1CAM의 발현을 억제 시켰을 때, 시스플라틴(cisplatin)에 의한 증식 저해효과 및 세포사멸 유도효과가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 상기 결과들은 L1CAM의 작용을 억제하는 항체뿐만 아니라, 발현을 억제하는 siRNA와 항암제를 병용 투여하였을 때에도 암치료 상승효능이 있음을 제시하고 있다.
본 발명에 따른 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 및 항암제를 포함하는 항암용 조성물을 투여하는 경우, 그에 포함되는 L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 및 항암제를 동시에, 별도로 또는 순차적으로 병용함으로써, 이들 물 질을 단독으로 처리한 각각의 약리학적 효과에 비해 훨씬 강력하면서도 유의적인 암세포 성장 및 사멸 효과를 나타내어 암의 치료, 특히 L1CAM을 발현하는 암종으로 알려진 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 유방암, 대장암, 흑색종, 신경아세포종, 담도암, 폐암 및 췌장암과 같은 다양한 암에 대해 에 매우 유용하다.
도 1의 A는 L1CAM을 발현하는 담도암 세포주(SCK)에 L1CAM에 대한 항체 A10-A3와 시스플라틴을 각각, 혹은 병용 투여한 후, 세포증식 억제 효과를 분석한 결과이며, 도 1의 B는 L1CAM을 발현하는 담도암 세포주(SCK)에 L1CAM에 대한 항체 A10-A3와 시스플라틴을 각각, 혹은 병용 투여한 후, 세포사멸 유도효과을 분석한 결과이며,
도 2는 L1CAM을 발현하는 담도암 세포주(SCK)를 이식한 마우스 (xenograft) 모델에서 mIgG, L1CAM에 대한 항체 A10-A3, 시스플라틴, 혹은 A10-A3와 시스플라틴을 병용 투여한 마우스 군들 (각 10마리)에서 암의 성장 정도를 나타낸 결과이며,
도 3의A 및 B는 L1CAM을 발현하는 담도암 세포주(SCK)와 난소암세포주 (SK-OV3)에 L1CAM에 대한 항체 A10-A3와 젬시타빈을 각각, 혹은 병용 투여한 후, 세포증식 억제 효과를 분석한 결과이며,
도 4의 A와 B는 L1CAM을 발현하는 담도암 세포주(SCK)와 난소암세포주 (SK-OV3)에 L1CAM에 대한 항체 A10-A3와 5-플루오로우라실을 각각 혹은 병용 투여한 후, 세포증식 억제 효과를 분석한 결과이며,
도5의 A는 L1CAM을 발현하는 담도암 세포주(SCK)에 L1CAM에 대한 특이 siRNA를 이용하여 L1CAM의 발현을 저해시킨 세포주와 대조군 세포주에서 L1CAM의 mRNA 및 단백질의 발현양을 비교한 결과이며,
도 5의 B는 L1CAM을 발현하는 담도암 세포주(SCK)에 L1CAM에 대한 특이 siRNA를 이용하여 L1CAM의 발현을 저해시킨 세포주와 대조군 세포주에서 시스플라 틴의 병용투여에 의한 세포증식 저해효과를 나타낸 결과이며,
도 5의 C는 L1CAM을 발현하는 담도암 세포주(SCK)에 L1CAM에 대한 특이 siRNA를 이용하여 L1CAM의 발현을 저해시킨 세포주와 대조군 세포주에서 시스플라틴의 병용투여에 의한 세포사멸 유도효과를 나타낸 결과이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A composition for treatging L1CAM-expressing cancer comprising an inhibitor of activity or expression of L1CAM and anticancer agent <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L1CAM specific siRNA <400> 1 gccaatgcct acatctacgt t 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L1CAM non specific siRNA <400> 2 cagtcgcgtt tgcgactgg 19

Claims (10)

  1. 하기의 (a) 및 (b)를 동시에, 별도로 또는 순차적으로 병용하기 위해 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물:
    (a) L1CAM의 활성 또는 발현을 억제하는 물질; 및
    (b) 항암제
    이때, 상기 L1CAM의 활성을 억제하는 물질은 L1CAM 특이적인 항-L1CAM 항체, 그의 항원성 결합 단편 및 항-L1CAM 항체 또는 그 항원성 결합 단편의 변이체에서 선택되는 것이고, L1CAM의 발현을 억제하는 물질은 L1CAM의 발명을 억제하는 올리고 뉴클레오티드이고,
    상기 항암제는 시스플라틴, 젬시타빈(gemcitabine), 5-플루오로우라실, 도세탁셀 및 파클리탁셀에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
  2. 제1항에 있어서, L1CAM의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 L1CAM을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-L1CAM 항체가 수탁번호 KCTC 10909BP의 하이브리도마에 의해 분비되는 A10-A3 항체인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 1로 정의되는 서열로 구성되는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 암세포의 성장을 억제하거나 암세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 암은 담도암, 자궁내막암, 자궁경부암, 유방암, 대장암, 난소암, 흑색종, 신경아세포종, 폐암 및 췌장암에서 선택되는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항암용 조성물은 상기 (a) 및 (b)를 각각 포함하는 독립한 단제의 형태로 제형화 된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항의 항암용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 담도암, 자궁내막암, 자궁경부암, 유방암, 대장암, 난소암, 흑색종, 신경아세포종, 폐암 및 췌장암에서 선택되는 것인 방법.
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