JP2003527441A - 細胞周期を阻止する薬剤及び抗体を含む医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標的細胞を細胞周期のG₂及び／又はM期に停止させる薬剤と、抗原などの内在化細胞表面構造物を標的とする別の治療剤とを含む組み合わせ医薬。医薬の製造における使用及び医学的治療方法における使用、特に、癌などの細胞周期調節疾患の治療における使用が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、哺乳動物患者、特に、癌などの細胞周期調節疾患、又は代謝機能不
全の疾患もしくは障害に罹患した哺乳動物患者の治療における組み合わせ医薬、
すなわち治療上活性な薬剤を組み合わせたもの、及びそれを含む医学的治療方法
に関する。より具体的には、本発明は、G₂及び／又はM期における細胞周期の進
行を阻止(又は遅延)させることにより細胞増殖(すなわち、細胞数)に影響するこ
とができる薬剤(本明細書においては「G₂/M剤」と呼ぶ)と、別の治療剤との組合
わせた使用に関する。またG₂/M剤及び別の治療剤を含む医薬品であって、その治
療剤の治療効果が少なくとも部分的には、再生利用される標的細胞上の細胞表面
構造物の存在に依存する前記医薬品も、開示される。本発明のその他の態様、対
象及び利点は、以下の説明から明らかとなるであろう。

【０００２】発明の背景 細胞周期とは、細胞におけるある有糸分裂と次の有糸分裂との間の一連の事象
を指す。休止期(G₀)の後、成長期(G₁)、次いでDNA合成期(S)が続く。細胞拡大の
第2成長期(G₂)及びDNA複製期(M期)の後、細胞は2個の子孫細胞に分裂する。DNA
をインターカレーション型色素(すなわち、ヨウ化プロピジウム又は4',6'-ジア
ミジノ-2-フェニルインドール(DAPI))を用いて染色し、フローサイトメトリーを
用いて、DNAの細胞内量を利用することにより細胞周期の分布を測定することが
できる。細胞機構への干渉は、細胞周期を通した進行を阻害する可能性がある。
例えば、特定の化学療法剤は、G₂及び／又はM期における進行を阻止し得る。換
言すれば、ある種の薬剤、例えば化学療法剤への曝露は、例えば、G₂及び／又は
M期に個々の細胞を停止させて、最終的には集団における細胞のほとんど又は全
てが、細胞周期を通した進行を止め、G₂及び／又はM期にて停止するようになる
。タンパク質のようないくつかの細胞表面構造物が、細胞周期の特定の段階でも
っぱら産生されるものとして、従って細胞周期の状況のマーカーとして役立つも
のとして同定されているが、ほとんどのその他のものは、特定の時点ではより高
いか又は低いレベルではあるものの細胞周期全体に渡って産生されるものである
。

【０００３】 細胞周期全体にわたる抗原密度の変動は、肉腫抗原p102及びp200(Song S, Ant
icancer Research 16(3A): 1171-5 (1996))、白血病／リンパ腫関連抗原JD118 (
Czuczmanら、Cancer immunology, immunotherapy 36(6): 387-96 (1993))及び胃
腫瘍抗原PC1 (Weiら、J. Oncology 9(3): 179-182 (1987))に関して典型的であ
る。いくつかの腫瘍抗原が、細胞周期依存的であると報告されており、例えば、
肝臓転移3H4 (Wulfら、J. Cancer research and clinical oncology 122(8): 47
6-82, 1996)及び小細胞肺癌抗原(Fargionら、Cancer Research 46: 2633-2638 (
1986))が挙げられる。また、Crissmanら、1990、Flow Cytometry and Cell sort
ing, 第2版、pp227-247, Wiley-Liss, New York中の「DNA及びその他の細胞成分
の多変量解析のための細胞化学的技術(Cytochemical techniques for multivari
ate analysis of DNA and other cell constituents)」も参照されたい。

【０００４】 結合型構造物(例えば、タンパク質、糖タンパク質)を含む細胞の細胞膜が陥入
するプロセスはエンドサイトーシスである。エンドサイトーシスにより、膜及び
結合型構造物は細胞内に取り込まれ、細胞機構によりさらに処理を受ける。受容
体のエンドサイトーシスは、表皮増殖因子受容体(Vieira, AV, Lamaze, C., 及
びSchmid, SL (1996) Nature 274, 2086-2089)、神経成長因子受容体(Riccio, A
, Pierchala, BA, Ciarallo, CL, 及びGinty DD (1997) Science 277, 1097-110
0)、及びインスリン増殖因子受容体1(Chow JC, Condorelli G, 及びSmith RJ (1
998) J. Biol. Chem. 273, 4672-4680)、並びに、内皮細胞由来Gタンパク質共役
型受容体(EDG-1)及びケモカイン受容体CXCR1(Barlic J, Khandaker, MH, Mahon,
E, Andrews, J, DeVries, ME, Mitchell, GB, Rahimpour, R, Tan, CM, Fergus
on, SSG,及びKelvin DJ (1999) J. Biol. Chem. 274(23), 16287-16294)などのG
タンパク質共役型受容体としての受容体などの種々のチロシンキナーゼ増殖受容
体のアゴニスト誘導性分裂促進シグナリングにとって必要である。さらに、エン
ドサイトーシスは、インテグリン活性化に関わるシグナリング事象に関与してい
る。インテグリンは、細胞質面上で細胞外マトリックスタンパク質を細胞骨格タ
ンパク質及びアクチンフィラメントに結合させ、アゴニスト誘導性タンパク質リ
ン酸化を調節することが示された(Clark, EA, Shattil, SJ及びBrugge, JS (199
4) Trends Biochem. Sci. 19, 464)。

【０００５】 受容体が介在するエンドサイトーシスの古典的なマーカーは、トランスフェリ
ン、低密度リポタンパク質又はアシアロ糖タンパク質受容体などの巨大分子であ
る。細胞表面で特定の受容体に結合したこれらの巨大分子は、エンドサイトーシ
スを介して細胞によって内在化される。最初に、巨大分子は初期エンドソーム中
に内在化され、そこで、細胞膜に再生利用されるか、又はリソソームに向かって
送られる前に選別エンドソームによって濃縮されていく。微小管依存的輸送は、
エンドサイトーシス、分泌、トランスサイトーシス、並びに膜の組織化及び維持
に関わる多くの膜輸送事象の構成要素である(Cole, N.B.及びLippincott-Schwar
tz，J. (1995)「Organisation of organelles and membrane traffic by Microt
ubules」 Curr. Opin. Cell Biol. 7, 55-64; Goodson, H.V., Valetti, C., 及
びKreis, T.E. (1997)「Motors and membrane traffic」 Curr. Opin. Cell Bio
l. 9, 18-28)。多くの研究が、初期エンドソームから後期エンドソーム及び／又
はリソソームまでの移動様式における細胞質ダイニン駆動性小胞輸送に関する役
割を支持している(Aniento, F., Emans, N., Griffiths, G., 及びGruenberg, J
. (1993)「初期エンドソームから後期エンドソームまでの細胞質ダイニン依存的
小胞輸送(Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to
late endosomes)」J. Cell Biol. 123, 1373-1387; Novikoff, P.M., Cammer, M
., Tao, L, Oda, H., Stockert, R.J., Wolkoff, A.W., 及びSatir, P. 「ラッ
ト肝細胞の細胞骨格の3次元組織化：アシアロ糖タンパク質エンドサイトーシス
経路との関連(Three-dimensional organisation of rat hepatocyte cytoskelet
on: relation to the asialoglycoprotein endocytosis pathway)」 J. Cell Sc
i. 109, 21-32; Oda, H., Stockert, R.J., Collins, C., Yoon, Y.,及びJung,
M.K. (1990) 「培養ラット肝細胞における微小管細胞骨格とエンドサイトーシス
小胞及び細胞質ダイニンとの相互作用(Interaction of the microtubule cytosk
eleton with endocytic vesicles and cytoplasmic dynein in cultured rat he
patocytes)」 J. Biol. Chem. 270, 15242-15249)。微小管配列の変化が、細胞
膜から初期エンドソームへのトランスフェリン受容体及び表皮増殖因子受容体の
移動を遅延させ得ることが、培養細胞により示された(Jin M.,及びSnider M.D.
(1993)「細胞表面からエンドソーム及びゴルジ複合体へのトランスフェリン受容
体輸送における微小管の役割(Role of microtubules in transferrin receptor
transport from the cell surface to endosomes and the Golgi complex)」 J.
Biol. Chem. 268, 18390-18397; Thatte, H.S., Bridges, K.R.,及びGolan D.E
. (1994) 「微小管阻害剤は、K562細胞においてトランスフェリン受容体の転位
移動、細胞表面発現及びエンドサイトーシスに示差的に影響を及ぼす(Microtubu
le inhibitors differentially affect translational movement, cell surface
expression and endocytosis of transferrin receptors in K562 cells)」 J.
Cell Physiol. 160, 345-357; Van't Hof, Ob J., Defize, L.H.K., Nuijdens,
R., De Brabander, M., Verkleji, A.J.,及びBoonstra, J. (1989) 「イムノゴ
ールド標識と組合せたナノビド光学顕微鏡及び電子顕微鏡により試験された表皮
増殖因子受容体内在化の動力学(Dynamics of epidermal growth factor recepto
r internalisation studied by nanovid light microscopy and electron micro
scopy in combination with immunogold labeling)」 Eur. J. Cell Biol. 48,
5-13)。だが、これが起こる機構については知られていない。しかし、微小管が
、エンドソーム区画及び分解区画を介した内在化された膜結合物質の移動におい
て中心的な役割を果たすことは明らかである。

【０００６】 癌治療のための従来の治療手法としては、外科手術、放射線療法及び化学療法
の様々な組み合わせが挙げられるが、ある型の癌に対する応答速度はこの20年、
それほど改善されていない。化学療法及び放射線療法の主要な制限は、正常な細
胞と腫瘍細胞の両方を非選択的に標的化することであり、これが有毒な副作用を
もたらす。より毒性が低く、より特異的な治療の代替方法の探索において、様々
な型の免疫療法が研究されてきた。これらの方法のうち、モノクローナル抗体に
基づく戦略が広範囲の悪性腫瘍に適用されてきた。モノクローナル抗体の有用性
は、それらのクローン的な抗原特異性、すなわち、抗原を含みうる特定のエピト
ープを分子レベルで認識し、高い親和性でこれらの抗原に結合すること、に基づ
いている。モノクローナル抗体は、悪性腫瘍細胞の表面上にユニークに又は優先
的に発現される抗原に結合することができ、従って、これを用いて、腫瘍細胞を
特異的に標的化し、破壊することができる。抗体を、薬剤もしくはDNAのための
送達ビヒクルとして、又は放射性核種とのコンジュゲートとして構築してもよい
。標的細胞への裸の抗体の結合は、標的化細胞の溶解又は食作用をもたらす、抗
体依存性細胞介在型細胞傷害(ADCC)及び補体介在型細胞傷害(CMC)などの生来の
抗腫瘍免疫機能を活性化することもできる。ADCC及びCMCは共に、抗体用量と関
連する免疫機能であり、従って、標的細胞に結合する抗体量はできるだけ多いの
が望ましい。この目的を達成する一つの方法は、細胞表面上に発現される抗原の
量を増加させることであり、この方法により、例えば、細胞に結合する抗体をよ
り多くするという理由で、標的細胞のADCCなどの抗体機能を効果的に増加させる
ことができる。

【０００７】 G₂/M剤及び微小管を標的とする薬剤を用いた予備処理の後の、いくつかの膵臓
腫瘍抗原(Mukerjee, S., McKnight, M.E., Nasoff, M., 及びGlassy, M.C. 「腫
瘍抗原の共発現及び多面的改変剤によるそれらのモジュレーションは膵臓癌に対
するヒトモノクローナル抗体の標的化を増強する(Co-expression of tumor anti
gens and their modulation by pleiotrophic modifiers enhance targeting of
human monoclonals antibodies to pancreatic carcinoma)」 Human Antibodie
s 9, 9-22 (1999))及び表皮増殖因子受容体(Zuckier G.及びTritton T.R. 「ア
ドリアマイシンは活発に増殖中の細胞における表皮増殖因子受容体のアップレギ
ュレーションを引き起こす(Adriamycin Causes Up Regulation of Epidermal Gr
owth Factor Receptors in Actively Growing Cells)」 Experimental Cell Res
earch 148, 155-161 (1983); Hanauske A.-R., Depenbrock, H., Shirvani, D.,
及びRastetter J. 「in vitroにおけるヒト乳癌細胞系の表皮増殖因子受容体結
合に対する微小管阻害剤ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、ビンブラスチ
ン及びビンクリスチンの効果(Effects of Microtubule-disturbing Agents Doce
taxel (Taxotere(登録商標)), Vinblastine and Vincristine on Epidermal Gro
wth Factor-receptor Binding of Human Breast Cancer Cell Lines In Vitro)
」 Eur. J. of Cencer, 30A (11), 1688-1694 (1994); Depenbrock, H., Shirva
ni, A., Rastetter J.,及びHanauske, A.-R. 「in vitroにおけるヒト乳癌細胞
系の表皮増殖因子受容体結合に対するビノレルビンの効果(Effects of vinorelb
ine on epidermal growth factor-receptor binding of human breast cancer c
ell lines in vitro)」 Invest. New Drugs 13, 187-193 (1995))の細胞表面発
現の増加が報告されている。しかし、表面抗原のこれらの報告された増加の範囲
及び機構は不明である。Mukerjeeらによる研究において、著者らは、膵臓細胞系
上の3つのユニークな細胞表面構造物が、インターフェロン-α、-β及び-γ、又
は微小管標的化剤ビンブラスチン、コルヒチン及びビンクリスチンへの曝露の後
、未処理の対照と比較してより高い共発現レベルを示すと主張した。この研究は
、PANC-1細胞系でのみ達成され、腺癌に共通するものではなく、さらに、ある場
合には、より大きな割合の細胞が抗原を共発現したが、細胞当りの抗原密度の増
加は証明されなかった。この著者らは、この治療に対するアプローチは、抗原代
謝回転率の増強に起因して機能するのかもしれないが、これらの細胞表面構造物
が内在化されるかどうかを特徴付けるものではないと推測している。最後に、少
なくとも1種のガングリオシド抗原に対するインターフェロンの作用は、表面密
度の増加の機構が遺伝子発現の増加の結果であることを示唆している。別の表面
抗原に関するHanauskeの研究室の一連の研究では、表皮増殖因子(EGF)の、その
受容体への結合に対する種々の細胞傷害剤の効果は、培養中の腺癌細胞系におい
ては評価されなかった。初期の研究では、ドキソルビシンはEFG結合を増加させ
たが、ビンブラスチン及びシスプラチンは結合親和性の低下を引き起こした。2
つの後の研究では、微小管標的化剤ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドセタキ
セル、及びビノレルビン(Navelbine)は、EGF結合の増加を引き起こした。著者ら
は、これが結合部位数の増加に起因するものと結論付けた。これらの研究は、分
裂促進ペプチドとしての天然のリガンドを考慮に入れて行われたが、治療に向け
られたものではなかった。Zuckier及びTrittonはまた、ドキソルビシンを用いた
治療後のEGF結合(天然のリガンドの結合)の増加を証明し、EGF結合部位数の増加
について同様の結論を得た。著者らは、受容体数のこの増加が治療上の利益を提
供することを示さず、天然のリガンドの結合と治療用モノクローナル抗体の結合
との間の区別を明確にしなかった。表皮増殖因子受容体を標的化する好結果な抗
体組み合わせとしては、G₂/M剤であるドキソルビシン及びシスプラチン、が挙げ
られる(Baselga, J., Norton, L., Masui, H., Pandiella, A., Coplan, K., Mi
ller Jr., W.,及びMendelsohn, J. 「抗表皮増殖因子受容体モノクローナル抗体
と組合わせたドキソルビシンの抗腫瘍効果(Antitumor Effects of Doxorubicin
in Combination with Anti-epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Ant
ibodies)」 J. Natl. Cancer Inst. 85(16) 1327-1333 (1993); Fan, Z., Basel
ga, J., Masui, H., 及びMendelsohn, J. 「定着したA431異種移植片に対する抗
表皮増殖因子受容体モノクローナル抗体＋シス-ジアミンジクロロプラチナの抗
腫瘍効果(Antitumor Effect of Anti-epidermal Growth Factor Receptor Monoc
lonal Antibodies plus cis-Diaminedichloroplatinum on Well Established A4
31 Xenografts)」 Cancer Research 53, 4637-4642 (1993))。ドキソルビシンは
、抗EGF受容体抗体と組合わせたときに表面密度の増加がその効力の増加の原因
となる唯一の薬剤であるが、そのことは抗体による受容体の阻害が細胞シグナル
の喪失を引き起こすことに起因して起こることが提唱された。シスプラチンの増
加した効力の機構は不明であり、表面受容体密度に対する作用の結果ではないよ
うだが、Fanらは、細胞減少、及び自己分泌増殖シグナルに対する微小環境(腫瘍
の血管分布など)の変化の干渉によると提唱した。どの場合においても、そこに
開示されたこれらのG₂/M剤と抗体との組み合わせは放棄されており、本明細書に
添付された特許請求の範囲により定義される本発明の一部を形成しない。

【０００８】 本発明は、抗体又は小分子治療薬などの多くの治療剤であって、その治療効果
が、少なくとも部分的には、例えば標的細胞上の抗原などの内在化される細胞表
面構造物（内在化細胞表面構造物）の存在に基づくもの、についての治療効果が
、G₂/M剤の使用により増強され得るという観察に少なくとも部分的には基づいて
いる。

【０００９】 理論に束縛されることは望まないが、G₂/M剤で処理した(従って、細胞周期を
通したさらなる進行を阻止されたか、又は少なくとも遅延された)細胞は、それ
にも拘わらず、その細胞表面上の細胞表面構造物を合成及び提示しつづけ、細胞
表面上の前記構造物の密度の増加をもたらすと考えられる。G₂/M剤を用いたこの
細胞の処理は、細胞の内在化機構を(一時的に、又は永続的に)中断／混乱／無力
化すると考えられる。従って、細胞表面構造物の密度の増加は、遺伝子発現自体
の増加の結果としてではなく、むしろ、細胞によるタンパク質合成及び／又は提
示の継続と、内在化機構に対する効果との組み合わせの結果であると考えられる
。

【００１０】 これらの構造物が治療的介入の上で魅力的である場合、その構造物を標的とす
る(例えば、それに対して結合、又は該構造物と相互作用することによる)抗体又
は小分子などの治療剤のその後の治療効果は、細胞表面上の標的構造物の密度の
増加のおかげで増強される。この増強された効果は、治療剤の効力を向上させる
(例えば、標的細胞表面構造物を発現する細胞における腫瘍細胞の殺傷又はアポ
トーシス誘導の増加)形態を取るか、又はより低い有効量の治療剤で同程度の効
力を達成することにより、患者に対する副作用を潜在的に減少させる。この増強
された効果は、典型的にG₂/M剤と治療剤との間の相乗的又は付加的な相互作用の
結果である。

【００１１】 従って、本発明者らは、細胞周期のG₂/M期における、細胞、特に、癌細胞の阻
止又は遅延が、いくつかの明らかに未関連の抗原について細胞表面(すなわち、
細胞膜)上の密度の増加をもたらすことを教示する。

【００１２】 本明細書に現れる引用物及び参考文献は全て、その全体が明らかに参照により
本明細書に組み入れられるものとする。

【００１３】発明の概要 本発明に従えば、臨床的な必要性を有する哺乳動物患者、好ましくはヒトの治
療方法が提供される。この方法は、G₂/M剤と、治療効果が少なくとも部分的には
、細胞の細胞周期が進行するにつれて内在化する細胞表面構造物の患者細胞の細
胞表面上での発現に依存する治療剤(例えば、細胞表面構造物への結合、又はこ
れとの相互作用による)と、を用いて、該患者を同時に処置する工程を含む。

【００１４】 本発明に従えば、臨床的な必要性を有する哺乳動物患者、好ましくはヒトの治
療方法であって、G₂/M剤と治療剤とを用いて該患者を同時に処置する工程を含み
、かつ、該G₂/M剤を用いた処置が標的患者細胞における細胞周期の進行をG₂及び
／又はM期で阻止又は遅延させることにより、標的患者細胞におけるタンパク質
もしくは糖タンパク質のような細胞表面構造物の密度を増加させて、その結果該
構造物が治療剤によって標的化される(例えば、特異的に結合される)ことを特徴
とする前記方法が提供される。

【００１５】 本発明に従えば、細胞周期調節の疾患又は障害(例えば、癌)に罹患した哺乳動
物患者、好ましくはヒトの治療方法が提供される。この方法は、その治療効果が
、少なくとも部分的に、好ましくは主に(単独さえも)、内在化細胞表面構造物、
特に、前記患者における癌の状態を維持するか又は進行させる役割を有すること
が知られるか又は考えられる内在化構造物、に依存する薬剤と、G₂/M剤とを用い
て、前記患者を同時に処置する工程を含む。

【００１６】 本発明の別の態様に従えば、G₂/M剤と、治療効果が少なくとも部分的に、好ま
しくは主に、内在化細胞表面構造物の存在に基づく治療剤との組み合わせも提供
される。

【００１７】 医薬、例えば医薬品の製造における、及び哺乳動物患者、特にヒトの治療にお
ける、本明細書の上記及び下記の組み合わせの使用も提供される。

【００１８】 用語「阻止する」及び「停止させる」は、互換的に用いられることが意図され
る。

【００１９】詳細な説明 用語「同時に処置すること」は、同時に投与することを必ずしも意味しない(
しかし、これを排除するものではない)ことは当業者にとって明らかであろう。
実際、多くの場合、まずG₂/M剤を患者に投与して、G₂及び／又はM期で細胞周期
の進行を阻止又は遅延させて、細胞表面構造物密度の所望の増加を達成するのが
望ましい。そして、通常は次いで、同細胞を、該細胞表面構造物を標的とする治
療剤に曝露し、それにより該治療剤の治療効果の増強を達成する。G₂/M剤を、該
治療剤と同日に、一緒に又は互いの投与の数時間以内に、投与してもよい。しか
し、G₂/M剤を、最大で約2ヶ月前、典型的には約1又は2週間前、より典型的には1
週間未満前、例えば、1〜3日前に投与することもできる。一般的には、G₂/M剤の
単独治療による使用について薬用量学が公知である場合、実質的には、治療剤の
投与の前又は一緒に、それを行ってもよい。治療剤の投与は、G₂/M剤の投与(そ
れ自身は経口投薬、輸液又はボーラス投与のいずれかとしての複数回投与を含ん
でもよい)の後、数週間以内に複数回投与する(経口投薬、輸液、又はボーラス投
与のいずれかとして)ことを含んでもよいが、G₂/M剤及び治療剤のそれぞれの薬
物動態及び効力プロフィールを考慮に入れるためにこの変化が必要とされる。

【００２０】 治療計画も、勿論、患者の体重、年齢、全身の健康状態、治療すべき疾患又は
障害の種類及び重篤度などの他の多数の要因に依存し、これらは全て、主治医の
裁量範囲内にある。本発明の特定の組み合わせによる治療に対する応答について
の患者の遺伝的素因も、考慮する必要がある。応答が遺伝子領域多型、例えば、
単一ヌクレオチド多型(SNP)などの遺伝的多型と関連するかどうかを決定するこ
とにより、それを治療に先んじて達成することができる。多型は、通常は、患者
のポリヌクレオチド(例えば、ゲノムDNAもしくはmRNA)又はタンパク質中の多型
配列の存在を直接決定することにより検出する。典型的には、多型の存在は、患
者のポリヌクレオチド又はタンパク質を、多型に対して特異的な結合薬剤と接触
させ、結合薬剤が該ポリヌクレオチド又はタンパク質中の多型に結合するかどう
かを決定することを含む方法で決定され、そして該薬剤の該多型への結合が、患
者の可能性としての応答プロフィールを示唆する。多型は、前記組み合わせのい
ずれかの構成要素の代謝に関連していてもよい(例えば、チトクロムP450の多型)
。

【００２１】 「治療効果」又は「治療上有効な」などの用語は、治療剤が疾患又は障害を治
癒させるのに十分有効であることを必ずしも意味する必要はない。治療剤は、疾
患又は障害の状態を、少なくともある程度まで改善するか、又は臨床上の利益を
もたらし得るのであれば十分である。本発明の種々の態様に従って用いることが
できる治療計画の例を、以下により詳細に考察する。しかし、少なくとも2つの
薬剤を用いて哺乳動物患者を処置することが必須条件ではないことは明らかであ
ろう。共通原理は、患者体内の標的細胞を、好ましくはG₂及び／又はM期に停止
させて(又は、少なくともG₂及び／もしくはM期を通過する進行を遅延させる)、
それとともに本発明の治療剤を用いることにより、治療効果を増強するものであ
る。従って、これらの役割を両方とも果たすことができる単独の薬剤は、本発明
の範囲から必ずしも排除されない。また、前駆体形態(すなわち、例えば投与す
ると、第I相代謝によって治療的に活性化される薬剤の形態である)の治療剤及び
／又はG₂/M剤が包含されることも明らかであろう。

【００２２】 1種以上の治療剤及び1種以上のG₂/M剤を用いる治療計画が予想される。本発明
の方法を必要に応じて予防的に用いることができることは明らかであろう。

【００２３】細胞表面構造物 用語「細胞表面構造物」とは、細胞の細胞表面上に存在し(例えば、発現され)
、細胞膜に固定されている構造物を指す。そのような構造物は、タンパク質又は
修飾タンパク質(糖タンパク質など)であって、細胞がその細胞周期を進行させる
につれて、該細胞により、典型的にはエンドサイトーシスのプロセスにより、内
在化されるものであり得る。従って、用語「内在化細胞表面構造物」とは、細胞
がその細胞周期を進行させるにつれて、該細胞により、典型的にはエンドサイト
ーシスにより内在化される細胞表面構造物を指す。この内在化細胞表面構造物は
、典型的には、抗原、膜貫通受容体(例えば、7回膜貫通受容体)、又は、細胞に
より合成及び発現される生物学的成分(biological moiety)であって、細胞表面
でのその密度が、G₂及び／もしくはM期で該細胞を停止させる(又は少なくともそ
の進行を遅延させる)ことにより増加するものである。この用語は、細胞膜自体
、すなわち、脂質二重層自体の成分にまで拡張することを意図されない。内在化
細胞表面構造物は、様々なプロセシング処理を受けた後、発現されるものであっ
てよい。内在化される細胞表面構造物を、考えられる内在化細胞表面構造物に特
異的な(すなわち、それに特異的に結合する)抗体であって、レポーター部分、す
なわち、その存在を従来の技術又は利用可能な技術に従って検出することができ
る部分にコンジュゲート／結合された該抗体の使用により、決定することができ
る。このレポーター部分は、例えば、蛍光色素又は放射性標識であってもよい。
抗体／レポーター部分(これが、抗体を、考えられる内在化細胞表面構造物に結
合させる)の存在下で、細胞培養時の細胞中への色素／マーカーの移動を検出す
ることにより、内在化細胞表面構造物が示唆される。細胞がG₂及び／又はM期に
停止するときの抗体／レポーター部分複合体の結合の増加を観察することにより
、本発明の考えられるG₂/M剤を同定することができる。ある細胞が存在する細胞
周期の特定の段階は、当業者には周知の既知の技術により決定することができる
。例えば、Crissmanら、上掲を参照されたい。

【００２４】 従って、本発明に従えば、G₂/M剤を同定する方法であって、 (a) 候補薬剤を提供する工程、 (b) 該薬剤と、好ましくは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、さらにより好ま
しくは悪性腫瘍哺乳動物細胞とを接触させる工程、 (c) 細胞表面の密度が増加しているかどうかを決定する工程、 (d) 工程(c)における増加を引き起こす該薬剤を選択する工程、 (e) 必要に応じて、工程(d)で選択された薬剤を合成及び／又は精製する工程、
を含む、前記方法が提供される。

【００２５】 さらなる態様に従えば、臨床的な必要性のある哺乳動物患者(例えば、細胞周
期調節疾患に罹患した患者)の治療方法であって、 (a) 細胞の内在化細胞表面構造物の細胞表面密度を増加させる能力について、候
補薬剤をスクリーニングする工程、 (b) 該細胞表面密度の増加を引き起こす薬剤を選択する工程、 (c) 治療上有効な量の工程(b)で選択された薬剤と、内在化細胞表面構造物、好
ましくは工程(a)に記載の該構造物に特異的に結合する治療剤と、によって、前
記患者を同時に処置する工程、 を含む、前記方法が提供される。

【００２６】 本発明に従えば、癌などの疾患又は障害に罹患した哺乳動物患者の治療方法で
あって、 (a) 好ましくは、薬剤が、内在化細胞表面構造物の細胞表面密度を増加させる能
力を有するかどうかを決定することによって、G₂/M剤を提供する工程、 (b) 必要に応じて、候補治療剤が内在化細胞表面構造物に結合する(例えば、特
異的に結合する)かどうかを決定することにより、内在化細胞表面構造物、好ま
しくは工程(a)に記載の前記構造物に、特異的に結合するか又はこれと相互作用
する治療剤を提供する工程、 (c) 治療上有効な量の工程(a)で提供されたG₂/M剤及び工程(b)で提供された治療
剤によって、前記患者を同時に処置する工程、 を含む前記方法が提供される。

【００２７】 内在化細胞表面構造物は、細胞外部分、膜貫通部分及び／又は細胞内部分を含
んでもよい。多くの場合、内在化細胞表面構造物(例えば、抗原)は、3つの部分
の全てを含むであろう。本発明の治療剤は、その治療効果が、少なくとも部分的
には、好ましくは主に、細胞表面上の内在化構造物の存在に依存するものである
。多くの場合、この依存性は、該治療剤と、内在化細胞表面構造物との特異的相
互作用(例えば、特異的結合)の結果としてのものである。この結合は、細胞表面
構造物の細胞外部分、膜貫通部分又は細胞内部分上で起こってもよい。好ましく
は、該薬剤が細胞内で結合する場合、この薬剤は、タンパク質の細胞内触媒ドメ
インに結合する(通常、細胞膜の内側の面にカップリングするか、又はそこに会
合する)。そのようなタンパク質の例としては、チロシンキナーゼ又はセリン／
スレオニンキナーゼなどのキナーゼ活性を有するものが挙げられる。チロシンキ
ナーゼの細胞内部分は、抗癌治療のための特に魅力的な標的である。特に興味深
いのは、チロシンキナーゼ阻害剤であり、特に、erB2の阻害剤(又は、erB2及びE
GFRとの相互作用において二重の役割を有するもの、例えば、参照によりその内
容全体が本明細書に組み入れられる、読者が特に注目すべき本発明者らの同時係
属中のPCT出願WO 99/35146を参照されたい)である。次いで、結合の後、結合に
対する生物学的応答(例えば、ADCC)の誘発、タンパク質の触媒特性の阻害、該タ
ンパク質の立体障害(例えば、該タンパク質の3次元コンフォメーションを変化さ
せるか、又は妨げることによる)、又は該タンパク質の重要なエフェクター部位
への競合的結合が、続いて起こる。

【００２８】 従って、細胞表面構造物の内在化の性質を、続く全身的な治療アプローチにお
いて用いることができる。細胞表面上での細胞表面構造物密度の増加は、標的細
胞への治療剤の送達を改善する機会を与える。標的細胞をG₂/M剤で処理して、細
胞表面構造物の密度を増加させた後、治療剤を用いて処理する。次いで、G₂/M剤
を用いた処理を中止又は低減させると、治療剤が内在化細胞表面構造物に結合し
ている標的細胞はその細胞周期を再開し、その結果、該治療剤を内在化させるこ
とが可能となる。

【００２９】 内在化細胞表面構造物としては、例えば、特定の疾患又は障害の発症、維持又
は進行において既知の又は考えられる役割(例えば、原因的役割)を有する、既知
の又は考えられる疾患関連性を有するものが挙げられる。また、細胞表面上に存
在することが特定の疾患状態又は障害状態を示す、細胞表面構造物も挙げられる
。本発明は、特に、細胞周期調節疾患(その最も知られているものが、総称的な
用語「癌」を含む名称の疾患である)における使用に向けられている。細胞表面
での細胞表面構造物の発現密度を増加させることにより、通常は比較的低密度で
細胞表面上に存在するこれらの構造物を、より高い密度で、おそらく、より治療
上有用な密度で存在させることができる。

【００３０】 本発明の治療剤(例えば、抗体)が標的としうる内在化腫瘍細胞表面構造物(例
えば、抗原)としては、癌性状態の開始、進行又は維持において確立された役割
を有するもの(又はその発現が示唆的であるもの)が挙げられる。これらの構造物
は、正常細胞により発現された突然変異型抗原もしくは他の改変型抗原、過剰発
現された抗原、又は新生抗原(すなわち、患者の発生における不適当な時点で発
現された抗原である)であってよい。そのような抗原の例は、c-erB2 (HER-2/neu
)、c-erbB3 (HER-3, Baulida Jら、J. Biological Chemistry 271(9), 5251-525
7, 1996)、c-erbB4 (HER-4, Baulida Jら、J. Biological Chemistry 271(9), 5
251-5257, 1996)、c-fms (Carlberg Kら、EMBO journal 10(4) 877-83, 1991)及
び葉酸受容体(Lewisら、Cancer Res, 58, 2952-2956)である。

【００３１】 本発明に従って標的化されうる腫瘍抗原の他の例としては、βインテグリン(J
. Biological Chemistry 272(5): 2736-2743, 1997, Jan 31)、β2インテグリン
、例えば、Mac1/LFA1、血管内皮増殖因子受容体1及び2(VEGFR-1及び2、Dougher, M.,ら、Blood (1999) 81(10): 2767-2773)、EDG-1(Liu CHら(1999) Mol. Biol. Cell, Apr:10 (4) 1179-90)、インスリン増殖因子(IGF-1)受容体(J. Biol. Che
m. 1998 Nov 27; 273(48): 31640-3)並びに前立腺特異的膜抗原(PSMA, Liuら、C
ancer Research 58, 4055-4060, 1998)が挙げられる。

【００３２】 他の治療上有用な標的となる内在化抗原としては、喘息及び／又は慢性閉塞性
肺疾患(COPD)において既知の又は考えられる役割を有するものが挙げられる。従
って、これらのものとしては、ケモカインCCR3 (El-Shazly A.,ら、Biochem. Bi
ophys. Research Comm. (1999), 264:163-170)、VLA、CXCR1(Barlic j.ら、J. B
iol. Chem. 23(4): 16287-16294)、β2インテグリン、P2Y₂ (Sromek, S.M. (199
8) Molecular Pharmacology 54: 485-494)が挙げられる。本発明はまた、インス
リン受容体の細胞表面密度を増加させることによる、及びG₂/M剤を用いた処置に
より密度が増加しうる細胞表面構造物を介して標的細胞中へ治療用遺伝子薬剤を
進入させる遺伝子治療における、真性糖尿病のための改良された治療をも想定し
ている。

【００３３】治療剤 本発明の治療剤は、特定の細胞機能のアゴニスト、アンタゴニスト又は模倣物
質であってもよく、抗体又は他の免疫グロブリン(特に、細胞表面構造物の細胞
外部分への結合が起こる場合)の形態をとってもよく、他のタンパク質もしくは
ペプチド種又は別の非タンパク質／非ペプチド性化学物質(すなわち、「小分子
」として当業者に知られているもの)であってもよい。本発明に従う内在化を受
けて細胞中へ送達される治療剤は、有利には、細胞死(アポトーシス又は壊死)を
もたらす細胞傷害性のものである。該治療剤が、内在化細胞表面構造物に特異的
な抗体である場合、内在化細胞表面構造物への結合後にいくつかの可能性のある
結果が生じると考えられ、それは、少なくとも部分的には、該抗体のエフェクタ
ー機能に依存する。該抗体が機能的なF_c機能を有する場合、これは補体介在型細
胞傷害(CMC)及び／又は抗体依存性細胞介在型細胞傷害(ADCC)の活性化をもたら
すことができ、そのいずれも標的細胞の溶解又は食作用をもたらし得る。他の実
施形態においては、この分野でよく知られ、実施されているように、この抗体を
、放射性核種、酵素又は毒素などの治療上有用な物質にコンジュゲートさせる。

【００３４】 内在化細胞表面構造物、例えば本発明の抗原、に特異的に結合する抗体は、天
然抗体又はそのフラグメントの構造を有するのが好ましい。抗体は、典型的には
、ジスルフィド結合により互いに連結された2つの重鎖と、2つの軽鎖とを含む。
各軽鎖は、ジスルフィド結合によりそれぞれの重鎖に連結されている。各重鎖は
、一方の端部に可変ドメインを有し、その後ろにいくつかの定常ドメインを有す
る。各軽鎖は、一方の端部に可変ドメインを有し、他方の端部に定常ドメインを
有する。軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。軽鎖定常ドメ
インは、重鎖の第1定常ドメインと並んでいる。軽鎖及び重鎖の定常ドメインは
、抗原への抗体の結合に直接関与しない。

【００３５】 各対の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖及び重
鎖上のドメインは、同じ全体構造を有し、各ドメインは、4つの領域のフレーム
ワークを含んでおり、そのフレームワーク配列は比較的保存されていて、3つの
相補性決定領域(CDR)により連結されている。4つのフレームワーク領域は、主に
βシートコンフォメーションを取り、またCDRはループ接続部を形成し、βシー
ト構造の一部を形成する場合もある。CDRは、他のドメインに由来するCDRと共に
、フレームワーク領域に近接して保持され、抗原結合部位の形成(本発明の場合
、内在化抗原結合部位の形成)に寄与する。抗体のCDR及びフレームワーク領域を
、Kabatら(「免疫学的対象のタンパク質の配列(Sequences of proteins of immu
nological interest)」 US Dept. of Health and Human Services, US Governme
nt Printing Office, 1987)を参照することにより決定することができる。

【００３６】 CDRが、抗体の可変ドメインのフレームワークとは異なる種に由来するような
抗体の作製が、EP-A-0239400に開示されている。CDRは、げっ歯類又は霊長類由
来のモノクローナル抗体から得てもよい。そのような改変抗体の可変ドメイン及
び定常ドメインのフレームワークは、通常、ヒト抗体から得る。そのようなヒト
化抗体は、ヒトに投与した場合、げっ歯類に由来する抗体などの完全に外来の抗
体に対してヒトが生じる免疫応答と比較して、それほど高い免疫応答を誘導しな
いはずである。

【００３７】 本発明の抗体は、天然抗体又はそのフラグメントの構造を有するのが好ましい
。従って、本明細書全体における抗体に関する言及は、完全抗体だけでなく、(F
ab')₂フラグメント、Fabフラグメント、軽鎖ダイマー又は重鎖ダイマーなどのフ
ラグメントをも含む。該抗体は、IgG₁、IgG₂、IgG₃もしくはIgG₄などのIgG、又
はIgM、IgA、IgEもしくはIgDあるいはそれらの修飾形態(放射性核種、酵素など
の他の分子にコンジュゲートされたものを含む)であってもよい。定常領域は、
典型的には、必要とされる機能性に従って選択される。通常、IgG₁は、補体への
結合を介する溶解活性を示し、ADCC(抗体依存性細胞傷害)を媒介する。非細胞傷
害性抗体が必要な場合には、IgG₄抗体が好ましい。本発明による抗体は、二重特
異的抗体をも含む。本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体で
あってもよいが、好ましい抗体はヒト化抗体である。

【００３８】 モノクローナル抗体をヒト化するには、4つの一般的な工程が存在する。これ
らは、 (1) 出発抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸
配列を決定すること、 (2) ヒト化抗体を設計すること、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト
化プロセス中に使用するかを決定すること、 (3) 実際のヒト化方法／技術、並びに (4) 該ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現、 である。

【００３９】 より具体的には、以下の通りである。

【００４０】工程1：抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸
配列を決定すること 抗体をヒト化するためには、該抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列が既知であれば十分である。定常ドメインの配列は、これらが再構成戦略に
は寄与しないため、関連性がない。抗体の可変ドメインのアミノ酸配列を決定す
る最も単純な方法は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインをコードするクローン化cDNA
に基づく。

【００４１】 所与の抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインcDNAをクローニングするためには、2
つの一般的方法がある：(1) 従来のcDNAライブラリーを介するか、又は(2) ポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR)を介する。これらの方法は双方とも、幅広く知られてい
る。該cDNAのヌクレオチド配列があれば、この情報を抗体可変ドメインの推定ア
ミノ酸配列に翻訳することは簡単なことである。

【００４２】工程2：ヒト化抗体の設計 ヒト化中にどのヒト抗体配列を使用するかを決定することにおいて考慮すべき
いくつかの因子がある。軽鎖及び重鎖のヒト化は互いに独立して考慮される。し
かし、その理由は基本的にはそれぞれについて類似している。

【００４３】 この選択プロセスは、以下の原理に基づいている：まず、所与の抗体の抗原特
異性及び親和性を、可変領域CDRのアミノ酸配列により決定する。可変ドメイン
フレームワークの残基は、ほとんど寄与しないか、又は直接的には寄与しない。
フレームワーク領域の主な機能は、CDRを、その適切な空間的配置に保持させて
、抗原を認識することである。従って、げっ歯類CDRのヒト可変ドメインフレー
ムワークへの置換は、そのヒト可変ドメインフレームワークが、それらが由来す
るげっ歯類可変ドメインに高度に相同である場合、その正確な空間的配置の保持
をもたらしやすい。従って、好ましくは、ヒト可変ドメインは、げっ歯類可変ド
メインに高度に相同なものから選択されるべきである。

【００４４】 好適なヒト抗体可変ドメイン配列を、以下のように選択することができる： 1. コンピュータープログラムを用いて、げっ歯類抗体可変ドメインに最も相同
的であるヒト抗体可変ドメイン配列について、すべての利用可能なタンパク質(
及びDNA)のデータベースを検索する。好適なプログラムの出力は、げっ歯類抗体
に最も相同な配列のリスト、各配列との相同性％、及びげっ歯類配列に対する各
配列のアラインメントである。これは、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列の双方に
ついて、独立して行う。上記分析は、ヒト免疫グロブリン配列のみが含まれる場
合、より簡単に達成される。

【００４５】 2. ヒト抗体可変ドメイン配列を列挙し、相同性について比較する。まず、完全
に可変性である重鎖のCDR 3以外のCDRの長さについて、比較を行う。ヒト重鎖並
びにκ及びλ軽鎖を、サブグループに分割する；重鎖3サブグループ、κ鎖4サブ
グループ、λ鎖6サブグループ。各サブグループ内のCDRのサイズは類似している
が、サブグループ間では異なる。通常、げっ歯類抗体CDRを、ヒトサブグループ
の一つに、相同性の正確に近い最初のものとして一致させることが可能である。
次いで、同様の長さのCDRを担持する抗体を、特にCDR内であるが、周囲のフレー
ムワーク領域において、アミノ酸配列相同性について比較する。最も相同的であ
るヒト可変ドメインをヒト化のためのフレームワークとして選択する。

【００４６】工程3：実際のヒト化方法／技術 EP-A-0239400(また、P.T. Jonesら、Nature 321: 522(1986); L. Reichmanら
、Nature 332: 323(1988); Verhoeyen M.ら、Science 239: 1534(1988)及びJ. E
llisら、The Journal of Immunonology, 155: 925-937(1995)も参照されたい)に
従って、所望のCDRをヒトフレームワーク上に移植することにより、抗体をヒト
化することができる。従って、所望の再構成された抗体をコードするDNA配列を
、再構成するのが望ましいCDRを有するヒトDNAから作製することができる。所望
のCDRを含むげっ歯類可変ドメインアミノ酸配列を、選択したヒト抗体可変ドメ
イン配列のCDRと比較する。げっ歯類中の対応する残基に変更するのに必要なヒ
ト可変ドメイン中の残基に印を付けて、げっ歯類CDRを組み込んだヒト可変領域
を作製する。該ヒト配列における置換、これへの付加又はこれからの欠失が必要
な残基が存在してもよい。

【００４７】 オリゴヌクレオチドを合成し、これを用いて、ヒト可変ドメインフレームワー
クを突然変異誘発し、所望の残基を含むようにすることができる。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、任意の都合のよい大きさのものであってよい。一つには、通
常、利用可能である特定の合成装置の性能によって、長さが制限されるにすぎな
い。オリゴヌクレオチド特異的in vitro突然変異誘発の方法は公知である。

【００４８】 あるいは、WO92/07075の組換えポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を用いて、ヒト
化を達成することもできる。この方法を用いると、ヒト抗体のフレームワーク領
域間でCDRをスプライシングすることができる。

【００４９】 一般的には、2つのヒトフレームワーク領域、ドナーCDRにより置換されるCDR
である、AB及びCD並びにそれらの間を含む鋳型を用いて、WO92/07075の技術を実
施することができる。プライマーA及びBを用いてフレームワーク領域ABを増幅し
、プライマーC及びDを用いてフレームワーク領域CDを増幅する。しかし、プライ
マーB及びCはそれぞれ、その5'末端に、ドナーCDR配列の全部又は少なくとも一
部に対応する付加的配列をも含む。プライマーB及びCは、PCRを行うことを可能
にする条件下で、その5'末端の互いへのアニーリングを可能にするのに十分な長
さでオーバーラップする。従って、増幅された領域AB及びCDは、オーバーラップ
伸長により遺伝子スプライシングを受けて、単一の反応でヒト化産物を産生する
。

【００５０】工程4：再構成された抗体のトランスフェクション及び発現 抗体を再構成するための突然変異誘発反応の後、突然変異DNAを、軽鎖又は重
鎖の定常領域をコードする適当なDNAに連結し、発現ベクター中にクローニング
し、宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞中にトランスフェクトすることができる
。これらの工程を、日常的な様式で実行することができる。従って、再構成され
た抗体を、 (a) 少なくともIg重鎖又は軽鎖の可変ドメイン(この可変ドメインは、ヒト抗体
に由来するフレームワーク領域及び本発明のヒト化抗体に必要なCDRを含む)をコ
ードするDNA配列に機能し得る形で連結された好適なプロモーターを含む第1の複
製可能な発現ベクターを調製すること、 (b) 少なくとも相補的Ig軽鎖又は重鎖の可変ドメインをそれぞれコードするDNA
配列に機能し得る形で連結された好適なプロモーターを含む第2の複製可能な発
現ベクターを調製すること、 (c) 第1又は双方の調製されたベクターを用いて、細胞系を形質転換すること、
並びに (d) 該形質転換された細胞系を培養して、前記改変抗体を産生させること、 を含むプロセスにより調製することができる。

【００５１】 工程(a)のDNA配列は、該ヒト抗体鎖の可変ドメイン及び各定常ドメインを双方
ともコードするのが望ましい。このヒト化抗体を回収し、精製することができる
。改変抗体を産生するように形質転換される細胞系は、チャイニーズハムスター
卵巣(CHO)細胞系又は不死化哺乳動物細胞系であってよく、ミエローマ、ハイブ
リドーマ、トリオーマ又はクアドローマ細胞系などのリンパ起源が有利である。
この細胞系は、エプスタイン-バーウイルスなどのウイルスを用いた形質転換に
より不死化された、B細胞などの正常リンパ球細胞をも含んでよい。最も好まし
くは、不死化細胞系はミエローマ細胞系又はその誘導体である。選択の発現系は
、WO87/00462(また、P.E. Stephensら、Nucleic Acid Res. 17: 7110(1989)及び
C.R. Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169(1992)も参照されたい)に記載され
たグルタミンシンテターゼ発現系である。

【００５２】 ヒト化抗体を産生させるのに用いる細胞系は、哺乳動物細胞系であるのが好ま
しいが、細菌細胞系又は酵母細胞系などの任意の他の好適な細胞系を、代わりに
用いることができる。一本鎖抗体鎖については、大腸菌由来細菌株を用いること
ができることが想定される。得られた抗体を、機能性について調べる。機能性が
失われている場合、工程(2)に戻り、該抗体のフレームワークを改変する必要が
ある。

【００５３】 一度発現されれば、本発明の抗体全体、そのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖、
又は本発明の他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティ
ーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの当業界の標準的手法
に従って精製することができる(一般的には、Scopes, R, Protein Purification
, Springer-Verlag, N.Y. (1982)を参照されたい)。医薬用途のためには、少な
くとも約90〜95％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、98〜99
％以上の均一性が最も好ましい。所望のように、部分的に又は均一になるまで、
一度精製されれば、次いで、抗体を治療的に用いることができる。

【００５４】G ₂ /M剤 本発明のG₂/M剤は、細胞周期のG₂及び／又はM期の進行を阻止(又は遅延)する
ことにより、細胞増殖に影響を及ぼし得る。G₂及び／又はM期において細胞周期
の進行を阻止(又は遅延)することができるG₂/M剤の例は、ビノレルビン、シスプ
ラチン、マイトマイシン、パクリタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン
及びCRT-II(カンプトテシン)である。

【００５５】 本発明に従って用いる用量及び治療計画は、そのG₂/M剤について確立された用
量及び治療計画と同一か、又は実質的に同様であってもよい。しかしながら、治
療すべき疾患又は障害の重篤度及び型などにより最適化が教示される。

【００５６】 酒石酸ビノレルビンは、化学名3',4'-ジデヒドロ-4'-デオキシ-C'-ノルビンカ
ロイブラスチン[R-(R^*,R^*)-2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(1:2)(塩)]を有
する半合成ビンカアルカロイドである。酒石酸ビノレルビンは、様々な固形腫瘍
、特に、非小細胞肺癌、進行乳癌、及びホルモン無反応性前立腺癌の治療におい
て、シスプラチンなどの他の化学療法剤と組合せて用いられるか、又は単独の薬
剤として用いられる。商標名Nevelbine（登録商標）は、北アメリカ及び欧州で
用いられている。Nevelbine（登録商標）は、典型的には、週ベースで20〜30 mg
/m²の用量で、単一の薬剤として、又は組合せ療法において静脈内投与される。
ビノレルビンの経口製剤は臨床開発中である。

【００５７】 シスプラチンは、化学名シス-ジアミンジクロロプラチナを有する。シスプラ
チンは、転移性睾丸腫瘍の治療においては組合せ療法として、転移性卵巣腫瘍に
おいては単独及び組合せ療法として、並びに進行膀胱癌においては単一の薬剤と
して用いられる。シスプラチンは、商標名Platinol（登録商標）及びPlatinol-A
Q（登録商標）としてBristol-Myers Squibb社により製造されている。シスプラ
チンはまた、以下の型の癌において、典型的には組合せ療法で用いられている：
非小細胞及び小細胞肺癌、頭部及び頸部、子宮内膜、頸部、及び非ホジキン性の
リンパ腫。シスプラチンは、典型的には、3〜4週間毎に1回、又は3〜4週間毎に5
日間毎日、15〜150 mg/m²の範囲の用量で静脈内投与される。しかしながら、よ
り高く、より頻繁な用量が投与される場合もあり、また、動脈内又は腹膜内など
の静脈内以外の投与経路を用いることもできる。

【００５８】 カルボプラチンは、化学名プラチナジアミン[1,1-シクロブタン-ジカルボキシ
ラート(2)-0,0']-(SP-4-2)を有する。カルボプラチンは、通常、パクリタキセル
及びエトポシドなどの他の細胞傷害剤と組み合わせて投与される。カルボプラチ
ンは、進行卵巣癌、非小細胞肺癌並びにシスプラチンを用いるのと同じ型の癌の
多くの治療に用いられる。Bristol-Myers Squibb社により製造されるカルボプラ
チンの商標名はParaplatin（登録商標）である。カルボプラチンは、典型的には
、300〜400 mg/m²で静脈内投与されるか、又は患者の評価された糸球体濾過率(G
FR)を用いて、4〜6 mg/ml-分の薬剤濃度対時間曲線(AUC)下で標的領域に対して
投与される。約1600 mg/m²までのより高い用量を、数日、通常は5日に分けて投
与することもできる。

【００５９】 パクリタキセルは、化学名(2R,3S)-N-ベンゾイル-3-フェニルイソセリンとの5
β,20エポキシ-1,2α,4,7β,10β,13α-ヘキサヒドロキシタクス-11-エン-9-オ
ン4,10-ジアセテート2-ベンゾエート13-エステルを有する。パクリタキセルは、
Bristol-Myers Squibb社によりTaxol（登録商標）として製造されている。それ
は、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、頭部癌及び頸部癌などの様々な癌の治療に用
いられる。典型的な用量としては、3〜4週間毎に、3又は24時間の静脈内輸液と
して135〜175 mg/m²が挙げられる。約300 mg/m²までのより高い用量を投与する
こともできた。

【００６０】 該活性成分と並んで、製造業者により提供される薬剤製品は、典型的には、滅
菌水、5％デキストロース水溶液又は0.9％塩化ナトリウム水溶液などの希釈剤と
、例えば、可溶性パクリタキセルを作製するために添加されるCremophorビヒク
ルなどのさらなる賦形剤とを含む。

【００６１】 G₂及び／又はM期で細胞周期の進行を阻止するか、又は遅延させることができ
る他のG₂/M剤としては、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン及びアク
ラルビシン；カルムスチン(BCNU)、カンプトテシン、9-ニトロ-カンプトテシン
、シクロホスファミド及びその誘導体、ドセタキセル、エトポシド、ラゾキサン
(ICRF-187)、アルキルリソ-ホスホリピド、例えば、イルモフォシン；メトトレ
キサート、MST-16、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びテニポシド
(VM-26)(再び、Martindale, The Extra Pharmacopoeia、第31版、JEF Reynolds
編、London、Royal Pharmaceutical Society, 1996を参照されたい)、並びにフ
ラボノイド、例えば、アピゲニン及びゲニステイン(The Merck Index、第12版、
Merck Research Laboratories, Merck and Co Inc, 1996を参照されたい)が挙げ
られる。さらに、アドゼレシン(ピラゾール化合物のクラス)(Cancer Research 1
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er 1995, Jul 17; 62(2): 170-175)、メルバロン(Environmental & Molecular M
utagenesis 1997; 29(1): 16-27及びCancer Research 1995, Apr 1; 55(7): 150
9-1516)並びにオラシン(FEBS Letters 1997, Jan 2; 400(1): 127-130)も、G₂及
び／又はM期で細胞周期の進行を阻止する(又は遅延させる)と考えられる。一般
的には、全てのトポII阻害剤、例えば、ポテカン(アブピ、1998-1999)、全ての
ビンカ誘導体及び放射線を含む全てのDNA損傷剤も、G₂及び／又はM期に細胞を停
止させると考えられる。さらなる例としては、RAFキナーゼ阻害剤(例えば、Clin
ical Can. Res. 4(5): 1111-1116, May 1998及び参照によりその内容全体が本明
細書に組み入れられ、読者が特に注目すべき本発明者らの同時係属中出願WO99/1
0325を参照されたい)が挙げられる。

【００６２】 さらに、5FUは、G₂及び／又はM期に細胞を停止させることが報告され(Oncolog
y Research 1994; 6(7):303-309)、従って、5FU並びにUFT、メトトレキサート、
カペシタビン及びゲンシタビンなどの5FUと類似する化合物が、いくつかの組織
において内在化抗原の発現を増加させるであろうと考えられる。同様に、S期に
細胞を停止させることが知られているトムデックス(Raloxifen)は、内在化抗原
の発現を増加させると考えられる。

【００６３】 従って、用語「G₂/M剤」は、細胞傷害療法に限定されないだけでなく、細胞増
殖抑制療法並びにG₂及び／又はM期で細胞周期の進行を阻止(又は遅延)すること
ができる任意の他の薬剤をも包含する。一緒になって、G₂/M期で、又はG₂/M期を
通過する細胞の進行を阻止するか、又は遅延させる薬剤の組み合わせも包含され
る。本明細書を通して、G₂/M剤に関する言及は、G₂及び／又はM期において内在
化細胞表面構造物を発現する細胞(特に腫瘍抗原)を停止させる(又は遅延させる)
1種以上の特定の化学療法剤の組み合わせを含む。典型的な組み合わせの例は、
シスプラチンを含むビノレルビン及びカルボプラチンを含むパクリタキセル；5F
Uを含むオキサリプラチン；メトトレキサート及び5FUを含むシクロホスファミド
；ドキソルビシン及び5FUを含むシクロホスファミドである。

【００６４】 G₂/M剤を単独で投与することができるが、上記のように、許容可能な担体と共
に、活性成分を含む医薬組成物としてそれを提供するのが好ましい。各担体は、
該組成物の他の成分と相溶性であり、受容物にとって有害ではないという意味で
「許容可能」でなければならない。

【００６５】治療プロトコル(又は計画) G₂/M剤及び治療剤(特に、該治療剤が抗体又はその他の免疫グロブリンである
場合)の投与のための好ましい投薬スケジュールは、必要な期間だけ、1もしくは
2週間毎に1回、好ましくは、3もしくは4週間毎に1回、又はそれらを組み合わせ
て、該治療剤を投与することを含む。G₂/M剤を、その薬剤について確立された計
画又はG₂/M期において阻止／停止もしくは遅延しようとする内在化細胞表面構造
物を発現する細胞の曝露を可能にする計画に従って与える。好ましい投薬スケジ
ュールは、治療剤及び疾患状態によって変わるが、例えば、週1回、3もしくは4
週間毎に1回、又は必要な期間だけ3もしくは4週間毎に、数日(例えば、3〜5日)
に渡って毎日反復投与することなどが挙げられる。治療剤の投薬は、G₂/M剤につ
いて指示されるのと同じ又は異なる日に行ってもよい。毒性もしくは副作用を防
止又は減少させるための投薬スケジュール又は用量の強度の調整を、治療剤又は
G₂/M剤のいずれかを用いて行ってもよい。

【００６６】 例えば、標的内在化細胞表面構造物(例えば、抗体)に結合する治療剤と組合せ
たビノレルビン及びシスプラチンの同時投与のための好ましい投薬スケジュール
は、臨床試験により支持された用量、例えば、30 mg/m²で、必要な期間だけ、し
かし典型的には3〜4週間に渡って、週1回、該薬剤を投与した後、必要な期間だ
け、２週毎に30 mg/m²の用量を投与することである。ビノレルビンを、1、8、15
及び22日目に25 mg/m²の用量で投与する。シスプラチンを、1日目に100 mg/m²の
用量で、1回だけ投与する。その後、ビノレルビン／シスプラチン計画を、必要
な期間だけ、28日毎に反復する。好ましくは、ビノレルビン、シスプラチン及び
抗体を、約2〜3時間に渡って、1日目に同時に投与する。

【００６７】 好ましい投薬スケジュールの別の例は、治療剤(例えば、抗体)と組合わせたパ
クリタキセル／カルボプラチンの投与を、上のビノレルビン／シスプラチンの例
と同様に投与すること、並びにパクリタキセル及びカルボプラチンを、1日目に
、それぞれ225 mg/m²及びAUC=6.0の用量で投与し、その後、必要な期間だけ、28
日毎に投薬を反復することである。また、パクリタキセル、カルボプラチン及び
抗体を、約2〜3時間に渡って、1日目に一緒に投与するのが好ましい。

【００６８】 ナベルビン、シスプラチン又はタキソールのうちのいずれかと、抗体との組合
せを含む他の好ましい投薬スケジュールは、2種の抗癌剤の代わりに1種のみの抗
癌剤を用いた、同様の用量及び投薬スケジュールを含む。

【００６９】 治療剤及びG₂/M剤の好ましい組み合わせは、以下の化学療法剤：UFT、カペシ
タビン、CPT-II、オキサリプラチン、5FU、5FU連続輸液、パクリタキセル、ドセ
タキセル、シクロホスファミド、メトトレキサート、ドキソルビシン、ナベルビ
ン(静脈内及び経口)、エピルビシン、マイトキサンサトロン、ラロキシフェン、
シスプラチン、マイトマイシン、カルボプラチナ、ゲンシタビン、エトポシド及
びトポテカンのいずれかと組合わせた前記治療剤である。

【００７０】 特に好ましい組み合わせは、CPT-II、5FU(連続輸液)、オキサリプラチン、カ
ペシタビン、UFT及びトムデックス(ラロキシフェン)を含む前記治療剤である。

【００７１】 これらの組み合わせは、癌の治療、特に、結腸癌、乳癌、胃癌、前立腺癌及び
非小細胞肺癌の治療に有用である。

【００７２】 具体的には、結腸癌に関しては以下の組み合わせが特に好ましい：UFT(必要に
応じてロイコボリンを含む)；カペシタビン；オキサリプラチン(必要に応じて5F
Uを含む)；CPT-II、5FU(必要に応じてエニルウラシル又はレバミソール又はロイ
コボリンを含む)；5FU延長連続輸液；及びマイトマイシンと組合わせた前記治療
剤。

【００７３】 乳癌の治療のための好ましい組み合わせは、パクリタキセル；ドセタキセル；
シクロホスファミド(必要に応じて5FU及びメトトレキサートもしくはドキソルビ
シンのいずれかを含む)；ナベルビン(静脈内及び／もしくは経口)；ドキソルビ
シン；エピルビシン；マイトキサントロン；並びにトムデックスと組合わせた前
記治療剤である。

【００７４】 胃癌の治療のための好ましい組み合わせは、シスプラチン；5FU；マイトマイ
シン；及びカルボプラチナと組合わせた前記治療剤である。

【００７５】 前立腺癌の治療のための好ましい組み合わせは、マイトキサントロンと組合わ
せた前記治療剤である。

【００７６】 非小細胞肺癌の治療のための好ましい組み合わせは、ナベルビン；シスプラチ
ン；カルボプラチン；パクリタキセル；ドセタキセル；ゲンシタビン、トポテカ
ン；及びエトポシドと組合わせた前記治療剤である。

【００７７】 治療計画、用量及び組成物などに関するより詳細な情報は、Martindale, The
Extra Pharmacopoeia, 第31版、JEF Reynolds編、London、Royal Pharmaceutica
l Society, 1996及びthe Physicians Desk reference, 第49版、1995、Medical
Economics Data Production Company, Montvaleなどの標準的な参考図書から取
得することができる。

【００７８】医薬調製物 本発明の医薬調製物としては、経口、直腸、経鼻、局所(頬及び舌下)、経膣、
非経口(皮下、筋肉内、静脈内及び皮内など)又は経皮投与に好適なものが挙げら
れる。該調製物を、都合よく、単位投与形態で提供することができ、製薬業界で
公知の任意の方法によって調製することができる。そのような方法は、活性成分
と、1種以上の付加成分から構成される担体とを結合させる工程を含む。一般的
には、活性成分と、液体担体もしくは微細に分割した固体担体又はその両方とを
、均一かつ密接に結合させた後、必要に応じて製造物を成形することにより、前
記組成物を調製する。該調製物は、投与に好適な別の組成物として、又は容易に
投与できる単一の組成物中に混合された、G₂/M剤及び治療剤を含んでもよい。

【００７９】 経口投与に好適なG₂/M剤の調製物を、それぞれ所定量の活性成分を含むカプセ
ル剤、カシェ剤もしくは錠剤などの別個の単位として；粉末剤もしくは顆粒剤と
して；水性もしくは非水性液体中の溶液又は懸濁液として；又は水中油滴型液体
乳剤もしくは油中水滴型液体乳剤として提供することができる。該活性成分を、
ボーラス、舐剤又はペーストとして提供することもできる。

【００８０】 必要に応じて、1種以上の付加成分を用いて、圧縮又は成型することにより、
錠剤を作製することができる。好適な機械中で、前記活性成分を、必要に応じて
、結合剤(例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)
、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、錠剤分解剤(例えば、デンプングリコール酸
ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、界
面活性剤又は分散剤と混合した、粉末剤又は顆粒剤などの自由流動形態に圧縮す
ることにより、圧縮錠剤を調製することができる。好適な機械中で、不活性液体
希釈剤で湿潤させた粉末状化合物の混合物を成型することにより、成型錠剤を作
製することができる。必要に応じて、錠剤を被覆するか、又は刻み目を付けても
よく、さらに例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを所望の放出プロフ
ィールを提供するように比率を変えて、そこに含まれる活性成分の遅延放出又は
制御放出を提供するように製剤化することができる。必要に応じて、胃以外の消
化管の部分における放出を提供するために腸溶性コーティングを用いて、錠剤を
提供することができる。

【００８１】 また、上記のような経口的使用に好適な調製物は、胃の酸性度を中和するよう
に設計された緩衝化剤を含んでもよい。好適なバッファーを、結合塩と混合した
弱酸又は弱塩基などの種々の有機又は無機物質から選択することができる。

【００８２】 口中での局所投与に好適な調製物としては、香料基剤、通常はスクロース及び
アカシア又はトラガカント中に前記活性成分を含むロゼンジ剤；ゼラチン及びグ
リセリン、又はスクロース及びアカシアなどの不活性基剤中に前記活性成分を含
む香錠並びに好適な担体中に前記活性成分を含む口内洗浄液が挙げられる。

【００８３】 直腸投与のための調製物を、例えば、ココアバター又はサリチル酸を含む好適
な基剤を含む坐剤として提供することができる。経膣投与に好適な調製物を、前
記活性成分に加えて、当業界で適当であると知られている担体を含むペッサリー
、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、気泡製剤又は噴霧製剤として提供する
ことができる。

【００８４】 非経口投与に好適な調製物としては、抗酸化剤、バッファー、静菌剤及び該組
成物と対象となるレシピエントの血液を等張にする溶質を含んでもよい水性及び
非水性の等張性滅菌注入溶液；並びにリポソーム又は前記化合物を血液成分もし
くは1種以上の器官を標的とするように設計されたその他の微粒子系などの懸濁
剤及び増ちょう剤を含んでもよい水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。該
調製物を、例えば、アンプル及びバイアルなどの単回用量もしくは複数回用量の
密封容器中で提供してもよく、また、使用直前に、注入用の水などの滅菌液体担
体の添加のみを要する凍結乾燥状態で保存してもよい。即時使用のための注入溶
液及び懸濁液を、以前に記載された種類の滅菌された粉末剤、顆粒剤及び錠剤か
ら調製することができる。

【００８５】 経皮投与に好適な調製物を、長時間に渡ってレシピエントの表皮と密接に接触
したままにするように適合させた分離性パッチ剤として提供することができる。
そのようなパッチは、必要に応じて、例えば、前記化合物に対して0.1〜0.2 Mの
濃度の緩衝化された水溶液として、前記活性成分を含むのが好適である。1つの
具体的な可能性として、該活性成分を、Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (
1986)に一般的に記載されるようなイオン泳動法によって、前記パッチ剤から送
達することができる。

【００８６】 特に上記した成分に加えて、例えば、経口投与に好適なものなどの問題の組成
物は、甘味料、増ちょう剤及び香料などのさらなる物質を含んでもよいことは理
解されるべきである。

【００８７】 本発明の別の態様に従えば、G₂/M剤及び治療剤を含む医薬調製物と一緒に、好
ましくは、該調製物を、哺乳動物患者、好ましくはヒトに投与するための説明書
(すなわち、医学的治療、特に、癌などの細胞周期調節の疾患又は該調製物が有
用である／認可された特定の疾患もしくは障害のための治療を実行するための説
明書)が提供される。該説明書に従う該患者の同時的処置は、該患者内で、G₂/M
剤と治療剤との間に生物学的な相互作用をもたらすことができ、この相互作用は
、増強された治療効果(例えば、相加効果又は相乗効果)を有する。多くの場合、
G₂/M剤と治療剤との間の相互作用は、一方でG₂/M剤と治療剤の同時的処置の有効
性と、非同時的処置の有効性とを比較することにより、増強されたもの(例えば
、相加的、しかし、好ましくは相乗的)として決定することができる。「相加的
」及び「相乗的」の定義は、当業界の用語である。

【００８８】 本発明の別の態様に従えば、癌に罹患した哺乳動物患者の治療方法であって、
細胞傷害剤及び細胞分裂抑制剤、特に、G₂及び／もしくはM期で細胞周期の進行
を阻止するか、又は遅延させるものを用いて、該患者を同時に処置する工程を含
む前記方法が提供される。

【００８９】 本発明の別の態様に従えば、細胞周期調節の疾患、例えば、癌に罹患した哺乳
動物患者、特に、ヒト患者の治療方法であって、G₂/M剤及び疾患性(すなわち、
癌性)細胞の細胞表面上に提示された内在化抗原に特異的に結合することができ
る治療剤(例えば、抗体もしくは小分子)を用いて、該患者を同時に処置する工程
を含む前記方法が提供される。

【００９０】 本発明の別の態様に従えば、細胞周期調節の疾患、例えば、癌に罹患した哺乳
動物患者の治療方法であって、G₂/M剤及び治療剤、好ましくは、以下のもの：チ
ロシンキナーゼ、例えば、erB2又はVEGFr-2のうちの1つ以上を標的とする(例え
ば、これに結合する、及び／又はその機能を阻害する)非タンパク質性／非ペプ
チド性化学物質を用いて、前記患者、例えば、ヒトを同時に処置する工程を含む
前記方法が提供される。

【００９１】 本発明の別の態様に従えば、癌などの細胞周期調節の疾患に罹患した哺乳動物
患者、例えば、ヒトの治療方法であって、有効量のG₂/M剤と、内在化抗原に結合
する(該内在化抗原の細胞外、膜貫通又は細胞内部分のいずれかで結合する)こと
により、前記患者に対する治療効果をもたらす有効量の治療剤とを用いて、前記
患者を同時に処置する工程を含む前記方法が提供される。

【００９２】 本発明の別の態様に従えば、癌などの細胞周期調節の疾患に罹患した哺乳動物
患者、例えば、ヒトの治療方法であって、有効量のG₂/M剤と、内在化抗原に結合
する(該内在化抗原の細胞外、膜貫通又は細胞内部分のいずれかで結合する)有効
量の治療剤とを用いて、前記患者を同時に処置する工程を含む前記方法が提供さ
れ、前記G₂/M剤及び治療剤は、前記患者内で相互作用し、該相互作用は、該患者
に対する相乗的な治療効果を有する。

【００９３】 本発明に従えば、G₂/M剤と、治療効果が、内在化がG₂/M剤によって阻止又は遅
延され得る標的疾患細胞上の抗原などの内在化細胞表面構造物の発現に依存する
治療剤との組み合わせが提供される。

【００９４】 本発明に従えば、G₂/M剤と、治療効果が、G₂/M剤を用いた細胞の処理によって
、細胞表面での密度を増加させることができる抗原などの内在化細胞表面構造物
の発現に少なくとも部分的には依存する治療剤との組み合わせが提供される。

【００９５】 本発明に従えば、G₂/M剤と、治療効果が、少なくとも部分的には、標的細胞上
の内在化細胞表面構造物の存在に依存する治療剤とを含む部分からなるキットが
提供される。

【００９６】 本発明は、組み合わせ(組み合わせとして記載されたものであるかどうかに拘
わらない)中の前記G₂/M剤及び治療剤が、 Ep-CAM特異的抗体とG₂/M剤、 WO 89/06692に開示されたようなモノクローナル抗体(特に、Herceptin（登録商
標）、これはtrastuzumab又はrhuMabとしても知られる)と、G₂/M剤としてのタキ
ソール、ドセタキセル又はナベルビン、 ナベルビンと、G₂/M剤としてのタキソール、 表皮増殖因子受容体(EGFr)を標的とする薬剤とG₂/M剤、 ではないという条件で、特許請求の範囲により特定される。

【００９７】 ここで、本発明を単なる例として説明する。これらは単に例示的な目的のため
のものに過ぎず、いかなる意味においても本発明を限定することを意図しない。

【００９８】図面： 図6 培養中のPC-3前立腺腺癌細胞の集団を、細胞周期のG₀/G₁期(実線)、S期(点線)
、及びG₂/M期(破線)における分布について評価し、各期におけるEp-CAM抗原につ
いて特徴付けを行った。Ep-CAMは、S期及びG₂/M期においてより高い密度及び均
一性で発現される。

【００９９】 抗原発現は、PC-3前立腺腺癌細胞上では細胞周期にわたって段階によって変化
した。PC-3前立腺腺癌細胞の集団を、細胞周期のG₀/G₁期、S期及びG₂/M期におけ
る分布、並びに該細胞表面のEp-CAMの発現について評価した。図6は、Ep-CAMが
、細胞周期に渡って発現されるが、G₀/G₁期よりもS期及びG₂/M期の細胞において
より高い密度及びより大きい均一性で発現されることを示すものである。この発
現パターンを、培養中の多くのその他のヒト大腸腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、及
び肺腫瘍細胞において実証した。

【０１００】図7 細胞周期の分析及び抗原発現の定量。腺癌細胞の集団を、細胞周期のG₀/G₁期
、S期及びG₂/M期における分布、並びに該細胞表面上でのEp-CAM提示について評
価した。サブコンフルエントな(subconfluent)細胞を、ナベルビン又はタキソー
ルに、24時間まで曝露した後、洗浄し、それぞれシスプラチン又はカルボプラチ
ンに、一晩曝露した。細胞を5-フルオロウラシル(5-FU)に、24時間曝露し、続い
て、インターフェロンに2〜5日間曝露した。細胞を洗浄し、さらに2日間培養し
た後、インターフェロンに曝露した細胞以外の抗原提示について分析した。細胞
を軽くトリプシン処理し、培養フラスコから機械的に分離し、ウシ血清アルブミ
ン及びアジ化ナトリウムを含有する、カルシウム及びマグネシウム非含有リン酸
緩衝生理食塩水中に再懸濁した。正確に2 x 10⁵個の細胞を、FITC-323/A3マウス
IgG抗体又はFITCマウスIgG(対照)を用いて染色した。細胞を冷パラホルムアルデ
ヒドで固定した後、Tween-20を用いてDNA染色のために浸透性にした。RNAse Aを
含むヨウ化プロピジウムバッファーを用いて、細胞のDNAを染色した。488 nmの
レーザーを備えたFACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson Immunocytom
etry Systems)でLysis IIソフトウェアを用いて、リスト方式のデータを獲得し
た。Cell-Fit上で、ヒストグラムのSOBRモデリングのためのCellFitソフトウェ
アを用いて(さもなければ可能である場合、手動による評価を用いた)、細胞周期
の分析を行った。培養細胞に結合したフルオレセインコンジュゲート323/A3の平
均蛍光強度と、補正した微小ビーズ標準の蛍光強度とを比較することにより、Ep
-CAM抗原提示を定量し、WinList(Verity Software House)のヒストグラム分析を
用いて個別に評価した。SoftMax Pro (Molecular Devices, Inc.)中で補正ビー
ズ濃度対蛍光強度の標準曲線を構築し、染色された細胞の蛍光強度を用いて、こ
の集団について、1細胞あたりの抗原分子数を算出した。

【０１０１】 化学療法剤で予備処理した後の培養中のHT-29大腸腺癌細胞上のEp-CAM抗原発
現の増加は、S期及びG₂/M期における細胞の細胞周期の進行及び蓄積の停止に関
連していた。腺癌細胞(HT-29)を、ナベルビン又はタキソール又は図7に示される
薬剤の組み合わせに曝露し、細胞周期の分布に加えて細胞表面のEp-CAM提示につ
いて、この細胞を評価した。細胞周期の分析により、ナベルビンの後にシスプラ
チン(CDDP)という組み合わせの場合の39.4％及びタキソールの後にカルボプラチ
ン(CPBDA)という組み合わせの場合の82.6％がS期及びG₂/M期にあるのに比較して
、培地対照細胞の6.3％のみがS期及びG₂/M期にあることが示された。より重要な
ことに、両方の薬剤の組み合わせは、細胞表面のEp-CAM発現の有意な増加を引き
起こした。5-FU、インターフェロン-α、又はインターフェロン-γに曝露した細
胞においては、抗原発現が有意に増加せず、それぞれ細胞の7.9％、12％、及び1
1.5％のみがS期及びG₂/M期にあった。従って、S期又はG₂/M期にある細胞の蓄積
を引き起こした薬剤のみが、Ep-CAM抗原提示の有意な増加をもたらすことができ
た。インターフェロンは、遺伝子発現レベルでその影響を発揮することにより、
特定の抗原の細胞表面提示における増加を引き起こすことが文献に報告された。
本発明者らの得た結果は、他者の公開された結果(Shimada, S., Ogawa, M., Sch
lom, J.及びGreiner J.W.「ヒト胃癌細胞により発現される腫瘍関連抗原のイン
ターフェロン-γ媒介調節の比較(Comparison of the Interferon-γ-Mediated R
egulation of Tumor-Associated Antigens Expressed by Human Gastric Carcin
oma Cells)」in vivo 7:1-8, 1993)と一致しており、インターフェロンがEp-CAM
の細胞表面提示に影響を与えないことを示した。

【０１０２】図8 培養における種々のヒト大腸(A,B)、肺(C,D)腺癌細胞に由来するEp-CAM抗原の
細胞表面における定量及び細胞周期の分布。細胞をナベルビン(NVL; 30 nM)とシ
スプラチン(CDDP; 5μM)、又はタキソール(TAX; 80 nM)とカルボプラチン(CBPDA
; 100μM)に曝露し、培地のみの場合と比較した。各バーの領域は、G₀/G₁期、S
期及びG₂/M期にある細胞の割合を示すように分割されている。各バーの高さは、
全体の集団内での1細胞あたりのEp-CAM分子の平均数を示す。

【０１０３】 腺癌細胞においては、Ep-CAM抗原提示の増加が観察されたが、培養において化
学療法剤に曝露された正常細胞においては観察されなかった。Ep-CAMの細胞表面
提示及び細胞周期分布を、種々の腺癌細胞並びに正常ヒト細胞の初代培養物にお
いて定量した。図3及び4は、大腸(図8A, 8B)、肺(図8C, 8D)、及び前立腺(図9A)
に由来する腺癌細胞が、周期特異的な薬剤の組み合わせへの曝露の後、より効率
的に細胞周期の阻止を達成し、より高いレベルのEp-CAMを発現したことを明確に
示していた。薬剤による処理後の細胞表面Ep-CAM提示の実証された増加は、2〜1
0倍変化した。Ep-CAM密度の増加は、用量依存的であり、周期阻止の効果と相関
していた(データは示さない)。対照的に、4種の正常細胞系は、効率的な周期阻
止を達成せず、抗原提示のいかなる増加も示さなかったが、正常細胞集団のうち
の2種においては未検出のままであった。

【０１０４】図9 培養前立腺腺癌のEp-CAM抗原発現及びADCC。抗体依存性細胞傷害(Antibody-de
pendent Cellular Cytotoxicity)によって測定されたin vitroにおける生物学的
効果。PC-3腺癌標的細胞を、上記のように、ナベルビン(30 nM)のみ、又はナベ
ルビンの後にシスプラチン(2.5μM)に曝露した後、回収し、⁵¹Cr放出細胞傷害ア
ッセイのために96ウエルプレートに播種した。100μCiのNa₂ ⁵¹CrO₄(Amersham)を
用いて培地中で一晩、標的細胞を培養した後、2 mM L-グルタミン、50μg/mLゲ
ンタマイシン、及び10％熱不活化FBSを含むRPMI-1640で3回洗浄した。新鮮なヒ
ト末梢血単核細胞を一晩接着させた後、50:1のエフェクター：標的比で、薬剤に
曝露された⁵¹Cr負荷標的細胞に添加した。自然に起こる溶解ウェル(CPM_{Spontane ous} )には培地を加え(エフェクターなし)、全溶解ウェル(CPM_Total)にはTriton-X
-100を加えた。培養物を37℃／5％ CO₂で6時間インキュベートした後、Skatron
フィルターフレーム(Skatron Instruments, Sterling VA)を用いて、上清を回収
した。ガンマ計数器で放射活性を計測し、自然に起こる溶解について補正された
比放出率を算出した。ナベルビンの後、シスプラチンに曝露した培養中のPC-3前
立腺腺癌細胞は、対照細胞よりもin vitroでのヒトADCC活性のためのより良い標
的であった。Ep-CAMの細胞表面提示の増加が標的抗体の生物学的効果の増加に相
関するか否かを決定するために、PC-3前立腺腺癌細胞を、ナベルビンのみ、又は
ナベルビンの後にシスプラチンで予備処理し、ヒト化抗体GW3622W94のin vitro
における溶解効率をADCCにより評価した。その結果を図8bに示す。ヒト末梢血AD
CCエフェクター細胞が抗体で被覆された腫瘍標的細胞を溶解する能力は、該標的
細胞をナベルビン(30 nM)のみ、又はシスプラチン(5μM)の存在下で予備処理し
た場合に改善された。さらに、低濃度の抗体GW3622W94(Ep-CAM抗原に結合し、ヒ
トIgG1フレームワーク内にマウスCDRを有するように構築されているA 323/A3ヒ
ト化抗体)。この再構築されたヒト化抗体は、ADCCのためのヒトエフェクター細
胞上のFc受容体と相互作用し、ヒト補体C1qに結合して、補体を媒介する溶解を
開始させることができる。6,6''-ビス{N,N,N'',N''-テトラ(カルボキシメチル)
アミノメチル-4'-(3-ブロモアセトアミド-4-メトキシフェニル)-2,2':6,2''-タ
ーピリジン、(TMT)との結合後、この抗体はGW1208W95になり(0.2 ng/mL＝1/10 E
C₅₀)、薬剤で予備処理されたA549(肺)、DU145(前立腺)及びH460(肺)の腺癌細胞
のADCCの媒介においてより有効であった(データは示さない)。

【０１０５】図10 Ep-CAM陽性異種移植片に対する抗体標的化は、ナベルビンを用いた予備処理に
より有意に改善された。ヒト大腸腺癌(HT-29)腫瘍を、雌CD-1ヌードマウス(Char
les River)への皮下移植により開始させた。この腫瘍が200〜300 mgに達したと
き、動物を5群に分けた。ナベルビンを、ビヒクル(蒸留水中の5％デキストロー
ス)中で28 mg/kgの用量で、1日目及び5日目に静脈内注入した。このナベルビン
の用量は、このマウス株にとってLD₁₀に近く、最少の腫瘍退化を引き起こした。
対照群には、1日目及び5日目に20 mg/kgで5-フルオロウラシル(5-FU)を腹腔内投
与した。6日目に、抗体GW1209W95をルテチウム-177で標識し、側尾静脈を介して
静脈内注入した。各マウスには、2.09μCiの¹⁷⁷Lu-GW1209W95 (4.1μgタンパク
質)を含む200μLの注射を与えた。直接ガンマ計測(Packard)のために、抗体投与
後1、3及び5日目に、血液、脾臓、肝臓、肺、腎臓、大腿、及び腫瘍を回収した
。

【０１０６】 ナベルビンを用いた培養細胞の予備処理はEp-CAMの細胞表面提示の増加を引き
起こしたため、本発明者らは、ナベルビンによる予備処理がCD-1ヌードマウスに
おけるEp-CAM発現腫瘍(HT-29大腸腺癌)への標的化の増加を引き起こすか否かを
調べた。図10は、ナベルビンによる予備処理が、ビヒクル又は5-FUで処理した動
物と比較して、2倍の腫瘍標的化の増加をもたらしたことを示すものである。

【０１０７】図11 培養HT-29大腸腺癌細胞上でのEp-CAM抗原の内在化は、化学療法剤を用いた予
備処理により有意に阻害された。ヒト大腸腺癌細胞によるルテチウム-177標識さ
れたGW1208W95(抗Ep-CAM)の内在化。大腸腺癌細胞(HT-29)を6ウエルプレートに
プレーティングし、培養した。サブコンフルエントな細胞を、24時間まで、細胞
傷害剤に曝露した。細胞を洗浄し、さらに2〜5日間培養した。このプレートを最
少で60分間、氷上(0℃)に置き、0.5〜1.0 mCi/mgで、6,6''-ビス{N,N,N'',N''-
テトラ(カルボキシメチル)アミノメチル)-4'-(3-ブロモアセトアミド-4-メトキ
シフェニル-2,2':6,2''-ターピリジン)にカップリングさせたルテチウム-177標
識を、6.7 nMの最終濃度で添加した。細胞を0℃にて3.5時間インキュベートした
。0℃でのインキュベーションの後、この細胞を2.5 mLのヒト血清アルブミン(1
％)を含む氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS-HSA)で洗浄した。次いで、2.5 mLの予
め暖めた培地を添加し、標識された細胞を37℃でインキュベートした。示された
時点で、2.5 mLのPBS-HSAを用いて細胞を2回洗浄した。2.5 mLの0.05 Mグリシン
(pH 2.8)中の0.1 M NaClと共に、室温にて5分間、細胞をインキュベートして、
標的表面抗原に結合した標識抗体を測定した。このインキュベーションを繰返し
、計数値をプールした。1.0 mLの1N NaOHを用いた細胞層の可溶化により、内在
化された計数値を測定した。Packard CliniGamma 5000を用いてサンプルを計測
した。各ウェルにつき細胞計数値に対して、データを正規化した。結合の特異性
を実証するために、未標識抗体GW1208W95(130 nM)を標識細胞に添加した後、こ
の細胞を上記のように処理した。

【０１０８】 微小管が細胞表面抗原の内在化に関与することはよく証明されており、Ep-CAM
が内在化することは以前に実証された(Kyriakos, R.J., Shih, L.B., Ong, G.L.
, Patel, K., Goldenberg, D.M.及びMattes, M.J. 「in vitroで腫瘍細胞の表面
に結合した抗体の運命(The Fate of Antibodies Bound to the Surface of Tumo
r Cells in Vitro)」 Cancer Research 52: 835-842, 1992)。この研究で評価さ
れた薬剤は微小管を標的とするため、Ep-CAMの内在化に対するこれらの薬剤の効
果を評価することは論理的であるようである。細胞周期及び細胞表面抗原定量の
評価のために、すでに記載されたように培養中の大腸腺癌細胞(HT-29)を化学療
法剤で予備処理した。ナベルビン(30 nM)のみ、又はナベルビンの後にシスプラ
チン(2.5μM)で処理した後、確立された文献のプロトコル(Novak-Hofer, I., Am
stutz, H.P., Morgenthaler J.及びSchubiger, P.A. 「ヒト神経芽腫細胞による
モノクローナル抗体chCE7の内在化及び分解(Internalization and Degradation
of Monoclonal Antibody chCE7 by Human Neuroblastoma Cells)」 Int. J. Can
cer 57:427-432, 1994)を用いて、抗原の内在化について細胞を評価した。¹⁷⁷Lu
-GW1208W95 (6.7 nM @ 0.5〜1.0 mCi/mgタンパク質)を用いて、氷上で0℃にて、
最少60分間、細胞をパルス標識して、表面抗原の内在化を阻害した。過剰の放射
標識抗体を洗浄除去した後、新鮮な培地を添加し、この細胞を示された時間、37
℃にてインキュベートした。等張性バッファーを用いて表面に結合した抗体を溶
出し、酸に不安定(表面に結合した)及び酸に安定(内在化した)な放射活性の双方
を定量した。図11Aは、細胞表面からの¹⁷⁷Lu-GW1208W95の消失を示す。処理にも
関わらず、全ての細胞は同様の放射標識抗体解離速度を有するようであった。ナ
ベルビン又はタキソールによる処理は、該放射標識抗体の内在化を有意に阻害し
た(図11B)。対照的に、5-FU又は培地で処理した細胞は、放射標識抗体を幅広く
内在化させた。本発明者らは、18倍の過剰量の未標識GW1208W95を用いて、93％
を超える放射活性と競合させることにより、放射標識抗体の結合がEp-CAMに特異
的であることを実証した(データは示さない)。

【０１０９】実施例 実施例1. 細胞周期の段階により変化した腺癌細胞上でのErbB2/neu提示 腺癌細胞の集団を、細胞周期のG₀/G₁、S及びG₂/M期における分布並びにerbB2/
neu提示について評価した。Versene(Gibco)を用いて細胞を培養プレートから解
離させ、ウシ血清アルブミン及びアジ化ナトリウムを含むカルシウム及びマグネ
シウム非含有リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。100μg/mLのマウスIgG(カタ
ログ番号15381, Sigma)を含むバッファー中のR-フィコエリトリンコンジュゲー
ト抗HER-2/neuマウスIgG(カタログ番号340552, Becton Dickinson)を用いて、正
確に2 x 10⁵個の細胞を染色した。細胞をFACSLyse(カタログ番号92-002, Becton Dickinson)を用いて固定した後、-20℃にてエタノールを用いて短時間固定後(p
ost-fix)処理を行った。RNase A (Sigma)を含むバッファー中のDAPI(カタログ番
号D1306, Molecular Probes)を用いて、細胞のDNAを染色した。

【０１１０】フローサイトメトリーのデータの収集及び分析 位置1に488 nmのアルゴンイオンレーザー、位置2に350 nmのアルゴンイオンレ
ーザーを備えたFACStar^PLUS（登録商標）フローサイトメーター(Becton Dickins
on)上で、サンプルデータを収集した。分析した各細胞につき、直線前方散乱の
高度及び幅に由来するシグナルパルス、DNAのためのDAPI蛍光の直線領域及び幅
、並びにHER-2/neu抗体プローブの対数蛍光高度上で、データを収集した。Winli
st 3D（著作権)ソフトウェア(Verity Software House, Topsham, ME)を用いて、
得られたリスト方式のファイルを処理した。細胞集団データのディスプレイを用
いて、前方散乱幅及びDAPI蛍光幅対DAPI蛍光領域により示された二重線と総計と
を識別した。手動ゲート制御及びHER-2/neu表面抗原密度により、細胞周期の位
置について、残りの細胞を分析した。実施例2に記載のビーズ標準系を用いて、H
ER-2/neu及び他の抗原の蛍光強度の平均値を、分析中に「1細胞あたりの結合し
た抗体(ABC)」の値に変換した。

【０１１１】 図1は、erbB2は細胞周期に渡って発現されるが、G₀/G₁期よりもS及びG₂/M期に
ある細胞において、より高い密度及びより大きい均一性(データは示さない)で発
現されることを示す。この例としては、MCF-7(乳腺癌)、MDA-MB-468(乳腺癌)、H
322(肺腺癌)及びA549(肺腺癌)が挙げられる。この発現パターンは、現在まで研
究された全ての上皮由来腫瘍細胞において実証されてきた。

【０１１２】実施例2. 腺癌細胞上のerbB2受容体の提示の増加は、S及びG ₂ /M期における細胞
周期の進行の停止及び細胞の蓄積に関係した 図2A〜Dに示されるように、腺癌細胞を種々の薬剤又は薬剤の組み合わせに曝
露した。サブコンフルエントな細胞を、24時間まで、ビノレルビン(ナベルビン(
登録商標)(NVL)、Glaxo Wellcome, Inc., RTP, NC)又はパクリタキセル(タキソ
ール(TAX)、Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ)に曝露した後、洗浄し、シ
スプラチン(CDDP, Bristol Laboratories, Princeton NJ)又はカルボプラチン(
パラプラチン(登録商標)(CBPDA), Bristol Oncology, Princeton, NJ)に曝露し
た。細胞を、24時間、ジェムザール(Gemzar)(ゲムシタビン(gemcitabine：GMZ),
Lilly, Indianapolis, IN)に曝露した。erbB2を高く発現する細胞系であるBT-4
74及びNCI H322(図2C、2D)を、メタロプロテアーゼ阻害剤BB-94(10μM)で処理し
て、エクトドメインシェディング(ectodomain shedding)を防止した(Codony-Ser
vat, J., Albanell, J., Lopez-Talvera, J.C., Arribas, J.,及びBaselga, J.
「HER-2エクトドメインの切断は、乳癌細胞中のメタロプロテアーゼ-1の組織阻
害剤によって阻害されるペルバナデートにより活性可能なプロセスである(Cleav
age of the HER-2 Ectodomain is a Pervanadate-activable Process That is I
nhibited by the Tissue Inhibitor of Metalloproteases-1 in Breast Cancer
Cells)」 Cancer Research 59, 1196-1201 (1999))。薬剤への曝露の後、細胞を
洗浄し、さらに2〜5日間培養し、次いで、BB-94で処理したものを除いて、抗原
提示及び細胞周期状態について分析した。ベルセン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞
を培養プレートから解離させ、ウシ血清アルブミン及びアジ化ナトリウムを含む
カルシウム及びマグネシウム非含有リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。正確に
2 x 10⁵個の細胞を、実施例1に記載のように染色した。マウスIgG結合容量につ
いて業者により補正された補正ビーズ標準(Quantum Simply Cellular Bead, カ
タログ番号QSC-100, Sigma)に対して、抗原提示を定量した。補正ビーズを、R-
フィコエリトリンコンジュゲート抗HER-2/neuマウスIgGで染色した。ビーズIgG
結合容量に対する蛍光強度のプロットを構築し、染色細胞の蛍光強度から、1細
胞あたりの結合したIgGの分子を読み取った。

【０１１３】 細胞がDNAを合成し、分裂する準備をするとき、有糸分裂が起こるまで細胞の
体積が増加し、従って、細胞周期と細胞の大きさとの関係を、より大きな表面積
及びおそらくより大きい抗原発現に翻訳し、等価な表面密度を推定することがで
きる。後期M期にある細胞はG₀/G₁期にある細胞の2倍の体積であるとすると、細
胞の半径はr³＝体積／(⁴/₃π)として計算し、次いで、表面積はA_s＝4πr²として
計算することができる。これらの仮定に基づくと、1.6倍より低い抗原提示の増
加は、周期に関連する細胞の大きさの増加に起因しうる一方、1.6倍を超える増
加は、細胞表面提示(抗原密度)の有意な変化である。培養中の組織球性リンパ腫
U-937細胞における最近の研究(Pocsik, E., Mihalik, R., Penzes M., Loetsche
r, H., Gallati, H.及びAggarwal, B. 「細胞表面調節ならびに分泌形態のI型及
びII型ヒト腫瘍壊死因子受容体に対する細胞周期の効果(Effect of Cell Cycle
on the Regulation of the Cell Surface and Secreted Forms of Type I and T
ype II Human Tumor Necrosis Factor Receptors)」 J. of Cell. Biochem. 59:
303-316, 1995)は、細胞周期の様々な段階で細胞を阻止する薬剤は、細胞周期の
進行に起因する以外に細胞の大きさを有意に変化させないという本発明者らの主
張を支持している。

【０１１４】 細胞周期の分析により、MCF-7(図2A)及びMDA-MB-468(図2B)乳腺癌細胞の双方
と組合わせた約30％の培地対照細胞がS及びG₂/M期にあることが示された。有効
濃度のナベルビンもしくはタキソールのみ、又はシスプラチンもしくはカルボプ
ラチンとの組合わせは、ぞれぞれ、70％を超えるまでS及びG₂/M期で阻止された
細胞を増加させた。さらに、これらの薬剤のみ、又は組合わせは、未処理の対照
と比較して細胞表面erbB2提示の有意な増加を引き起こした。erbB2提示の増加は
用量依存的であり、S及びG₂/M期にある細胞の割合に相関していた。

【０１１５】 高くerbB2受容体を提示する細胞系であるNCI H322肺腺癌及びBT-474乳腺癌細
胞は、該受容体の細胞外ドメインをシェディングし(Codony-Servat, J., Albane
ll, J., Lopez-Talvera, J.C., Arribas, J., 及びBaselga, J. 「HER-2エクト
ドメインの切断は、乳癌細胞中のメタロプロテアーゼ-1の組織阻害剤によって阻
害されるペルバナデートにより活性可能なプロセスである(Cleavage of the HER
-2 Ectodomain is a Pervanadate-activable Process That is Inhibited by th
e Tissue Inhibitor of Metalloproteases-1 in Breast Cancer Cells)」 Cance
r Research 59, 1196-1201 (1999))、受容体提示の正確な定量を阻害した。従っ
て、erbB2細胞外ドメインのシェディングを阻止し、erbB2受容体提示の定量を容
易にする広範囲のメタロプロテアーゼ阻害剤であるBB-94を用いて、細胞を処理
した。細胞周期の分析により、それぞれ、BT-474(図2C)及びH322(図2D)と組合わ
せた約15％及び35％の培地対照細胞がS及びG₂/M期にあることが示された。BB-94
のみによる処理は細胞周期の分布に影響しなかったが、双方の細胞系はerbB2提
示の増加を示した。それぞれ、シスプラチン又はカルボプラチンと組合わせた有
効濃度のナベルビン及びタキソール、並びにジェムザールは、未処理の対照と比
較して、40〜70％までS及びG₂/M期で阻止された細胞を増加させた。さらに、こ
れらの薬剤は、細胞表面erbB2提示の有意な増加を引き起こした。全ての場合に
おいて、最も高い増加は、BB-94の存在下で認められた。

【０１１６】実施例3. インターフェロン処理は細胞周期分布又はerbB2受容体提示に全く影響 しなかった 腺癌細胞を、図3A及びBに示されるような種々の薬剤又は薬剤の組み合わせに
曝露した。サブコンフルエントな細胞を、24時間まで、ビノレルビン(ナベルビ
ン(登録商標)(NVL)、Glaxo Wellcome, Inc., RTP, NC)又はパクリタキセル(タキ
ソール(TAX)、Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ)に曝露した後、洗浄し、
シスプラチン(CDDP, Bristol Laboratories, Princeton NJ)又はカルボプラチン
(パラプラチン(登録商標)(CBPDA), Bristol Oncology, Princeton, NJ)に曝露し
た。細胞を、引き続き2〜5日間、インターフェロンに曝露した。ベルセン(Gibco
)を用いて細胞を培養プレートから解離させ、ウシ血清アルブミン及びアジ化ナ
トリウムを含むカルシウム及びマグネシウム非含有リン酸緩衝生理食塩水に再懸
濁した。正確に2 x 10⁵個の細胞を、実施例1に記載のように染色し、抗原発現を
実施例2に記載のように定量した。

【０１１７】 細胞周期の分析により、徐々に増加する濃度のINF-α又はIFN-γに曝露したMC
F-7(図3A)及びMDA-MB-468(図3B)乳腺癌細胞は、培地対照細胞とは有意な差がな
いことが示された。さらに、erbB2受容体の細胞表面提示は、これらの薬剤に曝
露した細胞においては有意に増加しなかった。これらの結果は、S又はG₂/M期に
ある細胞の蓄積及びerbB2受容体提示の有意な増加をもたらした、ナベルビンと
シスプラチン、又はタキソールとカルボプラチンへの曝露と対比した。

【０１１８】実施例4. erbB2受容体提示の増加はin vitroで細胞傷害剤に曝露された正常細胞 では観察されなかった 肺(NHBE, Clonetics(登録商標))及び乳腺(HMEC, Clonetics(登録商標))に由来
する正常ヒト上皮細胞を、図4A〜Dに示されるような種々の薬剤又は薬剤の組み
合わせに曝露した。サブコンフルエントな細胞を、24時間まで、ビノレルビン(
ナベルビン(登録商標)(NVL)、Glaxo Wellcome, Inc., RTP, NC)又はパクリタキ
セル(タキソール(TAX)、Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ)に曝露した後、
洗浄し、シスプラチン(CDDP, Bristol Laboratories, Princeton NJ)又はカルボ
プラチン(パラプラチン(登録商標)(CBPDA), Bristol Oncology, Princeton, NJ)
に曝露した。細胞を、24時間、ジェムザール(ゲムシタビン(GMZ), Lilly, India
napolis, IN)又は5FU(アドルシル(Adrucil)(登録商標)、Pharmacia & Upjohn)に
曝露した。細胞を、引き続き2〜5日間、インターフェロンに曝露した。薬剤曝露
の後、細胞を洗浄し、さらに2〜5日間培養した後、インターフェロンで処理した
もの以外の抗原提示及び細胞周期状態について分析した。カルシウム及びマグネ
シウム非含有リン酸緩衝生理食塩水中のコラゲナーゼカクテル(1:1:1, I, II及
びIV型、0.1％(wt/vol), Gibco)を用いて、細胞を培養プレートから解離させた
。細胞を染色し、実施例1に記載のようにサイトメトリーのデータを収集し、実
施例2に記載のように抗原発現を定量した。

【０１１９】 細胞周期の分析により、NHBE(気管支、図4A、4B)及びHMEC(乳腺、図4C、4D)正
常上皮細胞の双方と組合わせた約30％の培地対照細胞がS及びG₂/M期にあること
が示された。有効濃度のナベルビンもしくはタキソールのみ、又はシスプラチン
もしくはカルボプラチンとの組み合わせは、それぞれ、70％を超えるまでS及びG ₂ /M期で阻止された細胞を増加させた。しかし、これらの薬剤のみ、又は組み合
わせは、未処理対照と比較して、細胞表面erbB2提示の有意な増加を引き起こさ
なかった。

【０１２０】実施例5. ナベルビン及びタキソールにより引き起こされるerbB2受容体提示の増 加は、遺伝子発現の増加の結果ではない 腺癌細胞を、図5に示されるような種々の薬剤又は薬剤の組み合わせに曝露し
た。サブコンフルエントな細胞を、24時間まで、ビノレルビン(ナベルビン(登録
商標)(NVL)、Glaxo Wellcome, Inc., RTP, NC)又はパクリタキセル(タキソール(
TAX)、Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ)に曝露した後、洗浄し、シスプラ
チン(CDDP, Bristol Laboratories, Princeton NJ)又はカルボプラチン(パラプ
ラチン(登録商標)(CBPDA), Bristol Oncology, Princeton, NJ)に曝露した。細
胞を、24時間、ジェムザール(ゲムシタビン(GMZ), Lilly, Indianapolis, IN)に
曝露した。この研究で用いた薬剤及び濃度は、すでに引用された例から、細胞周
期停止を引き起こすことが知られていた。細胞を、引き続き2〜5日間、インター
フェロンに曝露した。薬剤曝露の後、細胞を洗浄し、インターフェロンで処理し
たもの以外について、さらに2〜5日間培養した。細胞を洗浄し、溶解バッファー
中で保存した後、mRNA抽出を行った。

【０１２１】化学療法剤で処理した細胞系からのRNAの調製 培地のみ、又は種々の化学療法剤に曝露した細胞系を含む96ウエルプレートか
ら、製造業者のプロトコルに従って、ABI 6700 (Applied Biosystems)により、R
NAを単離した。18s rRNAのリアルタイムPCR分析により、単離されたRNAの量を測
定した。簡単に述べると、5μlの全RNAの1:100倍希釈液を、5.5 mM MgCl₂、1 X
バッファーA、300μM dNTP、10 U RNase阻害剤、12.5 U MuLV逆転写酵素、1.25
U Amplitaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA)、40 nMの順方向プラ
イマー(5'CGCCGCTAGAGGTGAAATTCT3')、20 nMの逆方向プライマー(5'CATTCTTGGCA
AATGCTTTCG3')及び50 nMのプローブ(5'Joe-6-カルボキシ-4,5-ジクロロ-2',7'-
テトラクロロフルオレセイン-ACCGGCGCAAGACGGACCAGA-TAMRA-6-カルボキシ-N,N,
N',N'-テトラメチルローダミン3')のカクテル混合物20μlを含む96ウエルプレー
トに添加した。このプローブは、5'リポーター色素及び3'クエンチャー色素に共
有結合されている。この反応物に水を添加して、25μlの最終容量にし、この混
合物をABI Prism 7700 Sequence Detectionサーモサイクラー(Applied Biosyste
ms)に配置した。反応物を48℃に30分間、次いで95℃に10分間加熱した後、95℃
で15秒間、60℃で1分間を40サイクル行う。各サンプル中の18s rRNAの量を、サ
イクル閾値(Ct)での蛍光量(分子数) により測定し、及び標準曲線に対して計算
した(Strum, J.C., Carrick. K.M., Stuart, J.S.及びMartensen, S.A.「リアル
タイムPCRを用いた組織発現プロファイリング(Tissue Expression Profiling us
ing Real-time PCR)」Current Protocols in Pharmacology (印刷中) (2001); B
ustin, S.A.「リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いたmRNAの絶対定
量(Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription
polymerase chain reaction)」J. Mol. Endo. 25, 169-193 (2000))。

【０１２２】処理したRNAのErbB2遺伝子発現の分析 5μlのRNAを、上記に概説したように、RT-PCR反応カクテルを含む複製した96
ウエルプレートに移した。ErbB2については、300 nMの順方向プライマー(5'GGAT
GTGCGGCTCGTACAC 3')、300 nMの逆方向プライマー(5'GTAATTTTGACATGGTTGGGACTC
T 3')及び150 nMのプローブ(5'FAM(6-カルボキシフルオレセイン)-ACTTGGCCGCTC
GGAACGTGC-TAMRA 3')を、前記カクテル混合物に添加した。すでに概説した標準
的な実験室プロトコル(Strum, J.C., Carrick. K.M., Stuart, J.S.及びMartens
en, S.A.「リアルタイムPCRを用いた組織発現プロファイリング(Tissue Express
ion Profiling using Real-time PCR)」Current Protocols in Pharmacology (
印刷中) (2001))を用いて、ErbB2発現についてのRNAのリアルタイムPCR分析を行
った。また逆転写酵素の不在下でErbB2遺伝子発現を測定して、存在するゲノムD
NA夾雑物の量を決定した。サンプルは全て、ゲノムDNAをほとんど含まないか、
全く含まなかった。

【０１２３】遺伝子発現量の算出 処理群と対照群の遺伝子発現量を比較することにより、各細胞系の遺伝子発現
量を測定した。対照群のCt値から処理群のCt値を差し引くことにより、ΔCt値を
求めた。各処理群についての折り畳み方程式(fold equation)(2^ΔCt)を求め、有
意差が2倍以上であると報告した。

【０１２４】 erbB2受容体mRNAの定量により、細胞周期のS及びG₂/M期で細胞を停止すること
がすでに示された薬剤への、培養中のSK-BR-3、MCF-7及びBT-474乳腺癌細胞(図5
A)並びにMDA-MB-468乳腺癌細胞(図5B)の曝露は、erbB2受容体遺伝子発現を有意
に増加させないことが示された。各処理についてのmRNAを18s値に対して正規化
して、薬剤曝露による細胞数の変動を明らかにした。ほとんどの場合、処理はer
bB2遺伝子発現に最小の変化(未処理対照と比較して2倍以内の変化)を引き起こす
か、又はerbB2遺伝子発現の減少を引き起こした。シスプラチン(CDDP)、ジェム
ザール(GMZ)及びIFN-γは、18s値に基づくと、SK-BR-3、MCF-7及びBT-474乳腺癌
細胞系に対して毒性であり(図5A)、低い比率が得られた。G₂/M期における細胞周
期の停止を阻止する薬剤に対する細胞系の曝露の後に本発明者らが見出したerbB
2受容体提示の増加は、erbB2受容体遺伝子の発現の増加に起因するものではない
ようである。

【０１２５】実施例6. G ₂ /M剤で予備処理した後の細胞表面標的の定量のための一般的プロト
コル 目的の細胞表面標的を提示する培養細胞を同定し、示された種々の薬剤又は薬
剤の組み合わせに曝露する。サブコンフルエントな細胞を、24時間まで、ビノレ
ルビン(ナベルビン(登録商標)(NVL)、Glaxo Wellcome, Inc., RTP, NC)又はパク
リタキセル(タキソール(TAX)、Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ)に曝露し
た後、洗浄し、シスプラチン(CDDP, Bristol Laboratories, Princeton NJ)又は
カルボプラチン(パラプラチン(登録商標)(CBPDA), Bristol Oncology, Princeto
n, NJ)に曝露した。細胞を、24時間、ジェムザール(ゲムシタビン(GMZ), Lilly,
Indianapolis, IN)に曝露した。細胞を、引き続き2〜5日間、インターフェロン
に曝露した。G₂/M期における細胞周期の阻止を最大化し、細胞死を最小化するた
めに、薬剤濃度及び曝露期間を最適化する。ベルセン(Gibco)、トリプシン(Gibc
o)、又はコラゲナーゼ(Gibco)を用いて細胞表面標的の無傷な状態(integrity)を
維持しながら培養プレートから細胞を解離させ、ウシ血清アルブミン及びアジ化
ナトリウムを含む、カルシウム及びマグネシウム非含有リン酸緩衝生理食塩水に
再懸濁した。100μg/mLのマウスIgG(カタログ番号15381, Sigma)を含むバッファ
ー中で、目的の細胞表面標的に高い親和性で結合する蛍光コンジュゲート抗体を
用いて、正確に2 x 10⁵個の細胞を染色した。細胞をFACSLyse(カタログ番号92-0
02, Becton Dickinson)で固定した後、-20℃でエタノールを用いて短時間固定後
処理した。RNase A (Sigma)を含むバッファー中で、ヨウ化プロピジウム(Molecu
lar Probes)又はDAPI(Molecular Probes)を用いて、細胞DNAを染色した。

【０１２６】フローサイトメトリーのデータの収集及び分析 FACStar^PLUS(登録商標)フローサイトメーター(Becton Dickinson)上でサンプ
ルデータを収集した。分析した各細胞について、直線前方散乱の高度及び幅に由
来するシグナルパルス、DNAのためのDAPI蛍光の直線領域及び幅、並びに目的の
細胞表面標的抗体プローブの対数蛍光パルス高度上で、データを収集した。Winl
ist 3D(著作権)ソフトウェア(Verity Software House, Topsham, ME)を用いて、
得られたリスト方式のファイルを処理した。細胞集団データのディスプレイを用
いて、前方散乱幅及びDAPI蛍光幅対DAPI蛍光領域により示された二重線と総計と
を識別した。手動ゲート制御により、表面抗原密度及び細胞周期の位置について
、残りの細胞を分析した。マウスIgG結合容量について業者により補正されたビ
ーズ標準(Quantum Simply Cellular Bead, カタログ番号QSC-100, Sigma)に対し
て、抗原提示を定量した。補正ビーズを、R-フィコエリトリンコンジュゲート抗
HER-2/neuマウスIgGで染色した。ビーズIgG結合容量に対する蛍光強度のプロッ
トを構築し、染色細胞の蛍光強度から、1細胞あたりの結合したIgGの分子を読み
取った。

【０１２７】実施例7. 生物学的データの測定のための一般化プロトコル 腫瘍研究 10％のウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム及びL-グルタミンを含むRPMI 164
0中、37℃にて、95/5％の空気／CO₂雰囲気下で、標的細胞を培養した。トリプシ
ン消化の後、細胞を回収し、PBS中で2 x 10⁶細胞/200μlの密度にした。腋窩部
に細胞懸濁液を皮下注入することにより、腫瘍を開始させた。

【０１２８】腫瘍研究：測定 ここで用いた異種移植モデルについては、皮膚を介して、電子カリパスにより
充実性腫瘍を測定した。典型的には、測定を週に2回行った。提供される実施例
においては、治療期間を過ぎても腫瘍をモニターした。

【０１２９】腫瘍研究：製剤及び投与 薬剤を、P.O.又はI.V.経路により投与した。G₂/M剤を、0.5％の水性ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース、0.1％のTween 80中に製剤化し、各図に示される
ように、21日間、1日2回、懸濁液として投与した。Cremophor-EL生理食塩水中に
予め製剤化されたタキソール(登録商標)(Bristol Myers Squibb Co.)を購入し、
それぞれ、10又は20 mg/kg タキソール療法のために、Cremophor-EL最終濃度が5
又は10％のCremophor-ELになるように生理食塩水中に希釈された。タキソールを
、各図に示されたように、5日間(1〜5日目)、1日1回、I.V.投与した。カルボプ
ラチン(Sigma)を生理食塩水中に製剤化し、5日間を2回に渡って、1日1回、I.V.
投与した。これらの研究は、IACUC # 468の下で行われた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図1は、MCF-7(乳腺癌)、MDA-MB-468(乳腺癌)、H322(肺腺癌)及びA549(肺腺癌)
における、細胞周期にわたるerbB2の発現を示す。

【図２】 図２Aは、MCF-7乳腺癌細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示す。 図２Bは、MDA-MB-468乳腺癌細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示
す。 図２Cは、BT-474乳腺癌細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示す。 図２Dは、H322肺腺癌細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示す。

【図３】 図３Aは、MCF-7乳腺癌細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示す。 図３Bは、MDA-MB-468乳腺癌細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示
す。

【図４】 図４Aは、正常気管支上皮細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示す
。 図４Bは、正常気管支上皮細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示す
。 図４Cは、正常乳腺上皮細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示す。 図４Dは、正常乳腺上皮細胞の細胞周期分布およびerbB2受容体の定量を示す。

【図５】 図５Aは、SK-BR-3、BT-474およびMCF-7乳腺癌細胞におけるerbB2受容体遺伝子
の発現を示す。 図５Bは、MDA-MB-468乳腺癌細胞におけるerbB2受容体遺伝子の発現を示す。

【図６】 図６は、PC-3前立腺腺癌細胞集団の細胞周期分布および該細胞表面のEp-CAMの
発現を示す。

【図７】 図７は、腺癌細胞集団の細胞周期分布および該細胞表面のEp-CAMの発現を示す
。

【図８】 図８Aは、ヒト大腸腺癌細胞の細胞周期分布および該細胞表面のEp-CAMの発現
を示す。 図８Bは、ヒト肺腺癌細胞の細胞周期分布および該細胞表面のEp-CAMの発現を
示す。

【図９】 図９Aは、PC-3前立腺腺癌細胞の細胞周期分布および該細胞表面のEp-CAMの発
現を示す。 図９Bは、PC-3前立腺腺癌細胞の抗体依存細胞媒介細胞傷害を示す。

【図１０】 図１０は、Ep-CAM陽性異種移植片に対する抗体標的化を示す。

【図１１】 図１１Aは、HT-29大腸腺癌細胞表面のEp-CAMに結合した¹⁷⁷Lu-GW1208W95の放
射活性を示す。 図１１Bは、HT-29大腸腺癌細胞において内在化した¹⁷⁷Lu-GW1208W95の放射活
性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スティンメル，ジュリー，ベス アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州，リサーチ トライアングル パー ク，ピーオー ボックス 13398，ファイ ブ ムーア ドライブ，グラクソスミスク ライン (72)発明者 サーモンド，リンダ，マーガライト アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州，リサーチ トライアングル パー ク，ピーオー ボックス 13398，ファイ ブ ムーア ドライブ，グラクソスミスク ライン (72)発明者 ニック，ビンセント，クラーク アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州，リサーチ トライアングル パー ク，ピーオー ボックス 13398，ファイ ブ ムーア ドライブ，グラクソスミスク ライン Ｆターム(参考） 4C084 AA20 MA02 NA05 ZB26 4C085 AA14 AA16 AA21 BB11 CC02 CC21 CC23 CC31 DD62 EE03 GG01 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 G₂/M剤及び治療剤を含む組み合わせ医薬であって、その治療
   効果が、少なくとも部分的に、標的細胞上の内在化細胞表面構造物の存在に依存
   する、前記組み合わせ医薬。
2. 【請求項２】 哺乳動物患者への投与のための説明書を添付した、請求項１
   に記載の組み合わせ医薬。
3. 【請求項３】 G₂/M剤が、酒石酸ビノレルビン、シスプラチン、カルボプラ
   チン、パクリタキセル、ドキソルビシン、5FU、ドセタキセル、ビンブラスチン
   、ビンクリスチン、シクロホスファミド、アピゲニン、ゲニステイン、シクロキ
   サゾリンからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の組み合わせ医薬。
4. 【請求項４】 前記構造物が、タンパク質もしくは修飾タンパク質(例えば
   、糖タンパク質)、7回膜貫通受容体又は抗原である、請求項１〜３のいずれか１
   項に記載の組み合わせ医薬。
5. 【請求項５】 前記構造物が、チロシンキナーゼ又はセリン／スレオニンキ
   ナーゼである、請求項４に記載の組み合わせ医薬。
6. 【請求項６】 前記構造物が、c-erB2、c-erbB3、c-erbB4、c-fms、葉酸、
   β-インテグリン、VEGFR-2、EDG-1、IGF-1である、請求項５に記載の組み合わせ
   医薬。
7. 【請求項７】 治療剤が、抗体又は小分子治療薬である、請求項１〜６のい
   ずれか１項に記載の組み合わせ医薬。
8. 【請求項８】 抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項７に記載
   の組み合わせ医薬。
9. 【請求項９】 抗体が、毒素又は放射性核種にコンジュゲートされている、
   請求項７又は８に記載の組み合わせ医薬。
10. 【請求項１０】 G₂/M剤を同定する方法であって、 (a) 候補薬剤を提供する工程、 (b) 該薬剤と、好ましくは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、さらにより好ま
    しくは癌性又は前癌性ヒト細胞とを接触させる工程、 (c) 細胞周期のG₂/M期を示す細胞表面構造物の密度(すなわち、数)が増加してい
    るかどうかを決定する工程、 (d) 工程(c)における増加を引き起こす薬剤を選択する工程、 (e) 必要に応じて、工程(d)で選択された薬剤を合成及び／又は精製する工程、
    を含む、前記方法。
11. 【請求項１１】 臨床的な必要性のある哺乳動物患者(例えば、細胞周期調
    節疾患に罹患した)を治療する方法であって、 (a) 細胞におけるG₂/M期の内在化細胞表面構造物の細胞表面密度を増加させる能
    力について、候補薬剤をスクリーニングする工程、 (b) 該細胞表面密度の増加を引き起こす薬剤を選択する工程、 (c) 治療上有効な量の、工程(b)で選択された薬剤と、G₂/M期の内在化細胞表面
    構造物、好ましくは工程(a)に記載の該構造物に特異的に結合する治療剤と、に
    よって、前記患者を同時に処置する工程、 を含む、前記方法。
12. 【請求項１２】 癌などの疾患又は障害に罹患した哺乳動物患者の治療方法
    であって、 (a) 好ましくは、薬剤が、細胞周期のG₂/M期を示す細胞表面構造物、例えばG₂/M
    期の内在化細胞表面構造物の細胞表面密度を増加させる能力を有するかどうかを
    決定することによって、G₂/M剤を提供する工程、 (b) 必要に応じて、候補治療剤が内在化G₂/M期細胞表面構造物に結合する(例え
    ば、特異的に結合する)かどうかを決定することにより、G₂/M期の内在化細胞表
    面構造物、好ましくは工程(a)に記載の前記構造物に、特異的に結合するか又は
    これと相互作用する治療剤を提供する工程、 (c) 治療上有効な量の、工程(a)で提供されたG₂/M剤及び工程(b)で提供された治
    療剤によって、前記患者を同時に処置する工程、 を含む、前記方法。
13. 【請求項１３】 臨床的な必要性のある哺乳動物患者、好ましくはヒトを治
    療する方法であって、G₂/M剤及び治療剤によって該患者を同時に処置する工程を
    含み、かつ、その治療剤の治療効果が、少なくとも部分的には、細胞がその細胞
    周期を進行させるにつれて内在化する細胞表面構造物の患者細胞の細胞表面上で
    の発現に依存することを特徴とする、前記方法。
14. 【請求項１４】 臨床的な必要性のある哺乳動物患者、好ましくはヒトを治
    療する方法であって、G₂/M剤及び治療剤によって該患者を同時に処置する工程を
    含み、かつ、G₂/M剤による処置が標的細胞においてG₂及び／又はM期で細胞周期
    の進行を阻止するか又は遅延させて、それにより治療剤が標的とする(例えば、
    特異的に結合する)細胞表面構造物(特に、内在化細胞表面構造物)の密度(すなわ
    ち、数)を増加させることを特徴とする、前記方法。
15. 【請求項１５】 臨床的な必要性のある哺乳動物患者を治療する方法であっ
    て、 (a) G₂/M剤を投与して、該患者の標的細胞上の抗原又は受容体、特に、内在化抗
    原又は受容体の密度を増加させる工程、 (b) 抗原／受容体密度を増加させた工程(a)で得られた標的細胞上の抗原又は受
    容体に特異的に結合する抗体などの治療剤を、投与する工程、 (c) 必要に応じて、G₂/M剤の阻止作用を低減又は排除することにより、工程(b)
    の標的細胞の細胞周期を進行させて、工程(b)で投与した薬剤を内在化させる工
    程、 を含む、前記方法。
16. 【請求項１６】 前記患者が、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、非小細
    胞肺癌、リンパ腫(例えば、非ホジキンリンパ腫)、肉腫、白血病からなる群より
    選択される癌に罹患している、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。