JP4778679B2 - 併用薬剤を送達するための組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条(e)項(35 U.S.C. §119(e))に基づき、2001年10月3日に提出された米国仮特許出願第60/326,671号;2001年12月17日に提出された第60/341,529号;2002年2月15日に提出された第60/356,759号;2002年4月23日に提出されたカナダ仮特許出願第2,383,259号;2002年8月7日に提出された米国仮特許出願第60/401,984号および2002年9月6日に提出された第60/408,733号の恩典を主張する。これらの出願の内容は参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、治療薬の相乗的または相加的な組合せを送達する、改良された送達のための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、送達媒体を含む製剤を提供することによって、薬剤を意図した標的に対して送達する場合に、相乗的または相加的な比を維持することを保証する送達システムに関する。
癌、AIDS、感染症、免疫疾患および心血管疾患といった命にかかわる多くの疾患は、数多くの分子機構による影響を受ける。この複雑性のために、単一の薬剤を用いて治癒を達成しようとした場合の奏功性には限界がある。このため、薬剤の併用が、疾患との戦い、特に癌の治療にしばしば用いられている。投与した薬剤の数と急性リンパ球性白血病などの癌の治癒率との間には強い相関があるように思われる(Freiら、Clin. Cancer Res. (1998) 4: 2027-2037)。ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート、ロイコボリン(救済用)およびシタラビンの組合せ(ACOMLA)、またはシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびブレオマイシンの組合せ(CHOP-b)を用いた臨床試験では、組織球性リンパ腫の治療にこれらが用いられて奏功している(Toddら、J. Clin. Oncol. (1984) 2: 986-993)。
ビンブラスチンと組換えインターフェロンβ(Kueblerら、J. Interferon Res. (1990) 10: 281-291);
シスプラチンとカルボプラチン(Kobayashiら、Nippon Chiryo Gakkai Shi (1990) 25: 2684-2692);
エチルデスヒドロキシ-スパルソマイシンとシスプラチンまたはシトシンアラビノシド(AraC)またはメトトレキサートまたは5-FUまたはビンクリスチン(Hofsら、Anti Cancer Drugs (1994) 5: 35-42);
全トランスレチノイン酸と酪酸またはトリブチリン(Chenら、Chin. Med. Engl. (1999) 112: 352-355);および
シスプラチンとパクリタキセル(Engblomら、Br. J. Cancer (1999) 79: 286-292)。
本発明は、非拮抗的な比の複数の治療薬、好ましくは抗腫瘍薬を、2種類またはそれ以上の薬剤を封入する送達媒体組成物を用いて投与するための方法であって、薬剤がある濃度範囲にわたって相乗的または相加的(すなわち、非拮抗的)な比で媒体中に存在するような方法に関する。封入の前に、組合せにおける治療薬の比は、組合せが所望の濃度範囲にわたって相乗作用または相加作用を示すように選択される。送達媒体中への封入により、2種類またはそれ以上の薬剤を協調的な様式で罹患部に送達することが可能になり、それによって薬剤が罹患部に非拮抗的な比で存在することが保証される。この結果は、薬剤を送達媒体中に共封入した場合にも、または罹患部で非拮抗的な比が維持されるように投与される送達媒体中に別個に封入した場合にも達成されると考えられる。組成物の薬物動態(PK)は、協調的な送達が得られるように送達媒体それ自体によって制御される(送達システムのPKが類似しているという条件で)。
本発明の方法は、インビトロで所望の濃度範囲にわたって非拮抗的である治療薬の比を決定すること、および、その比が所望の作用部位で確実に維持されると考えられる様式でこの非拮抗的な比を提供することを含む。相乗的な比または相加的な比は、2種類またはそれ以上の治療薬の少なくとも1つの比を妥当な細胞培養物または無細胞系に対してある濃度範囲にわたってインビトロで試験することによって得られた結果に対して、標準的な分析ツールを適用することによって決定される。例えば、個々の薬剤および種々の組合せを、細胞培養物または無細胞系に対する生物作用、例えば細胞死を引き起こすこと、または細胞増殖を抑制することに関して、種々の濃度レベルで試験する。あらかじめ設定した比の濃度レベルを細胞生存率に対してプロットして相関を得て、それを既知かつ確立された数学的手法によって操作して「組合せ指数(combination index)」(CI)を算出することができる。この数学的手法は、CIが1(すなわち0.9〜1.1)であれば薬剤の相加作用を表し、CT>1(すなわち>1.1)であれば拮抗作用を表し、CIが<1(すなわち<0.9)であれば相乗作用を表すというものである。
以下の略号を用いる。
PE:ホスファチジルエタノールアミン;PS:ホスファチジルセリン;DPPS:ジパルミトイルホスファチジルセリン;DSPS:ジアステロイルホスファチジルセリン;DLPS:ジラウロイルホスファチジルセリン;DOPS:ジオレオイルホスファチジルセリン;POPS:パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン;PC:ホスファチジルコリン;SM:スフィンゴミエリン;PG:ホスファチジルグリセロール;PI:ホスファチジルイノシトール;PA:ホスファチジン酸;DSPC:ジアステロイルホスファチジルコリン;DMPC:ジミリストイルホスファチジルコリン;DSPG:ジアステロイルホスファチジルグリセロール;DSPE:ジアステロイルホスファチジルエタノールアミン;Chol:コレステロール;CHまたはCHE:コレステリルヘキサデシルエーテル;
PEG:ポリエチレングリコール;DSPE-PEG:ジアステロイルホスファチジルエタノールアミン-N-[ポリエチレングリコール];PEGの後に数字が続く場合、その数字はダルトン単位で表現したPEGの分子量である;DSPE-PEG2000:ジアステロイルホスファチジルエタノールアミン-N-[ポリエチレングリコール 2000];
SUV:小型単ラメラ小胞;LUV:大型単ラメラ小胞;MLV:多重ラメラ小胞;
MTT:3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-2Hテトラゾリウムブロミド;DMSO:ジメチルスルホキシド;OD:光学密度;OGP:N-オクチルβ-D-グルコピラノシド;EDTA:エチレンジアミン四酢酸;HEPES:N-[2-ヒドロキシルエチル]-ピペラジン-N-[2-エタンスルホン酸];HBS:HEPES緩衝生理食塩水(20mM HEPES、150mM NaCl、pH 7.4);SHE:300mMスクロース、20mM HEPES、30mM EDTA;ED50、ED75およびED90:培養下にある細胞の50、75および90%に影響を及ぼすために必要な有効量;LD50:培養下にある細胞の50%の死滅を引き起こすために必要な用量;CI:組合せ指数;CI maxまたはCI最大値:異なる比の薬剤に関してCI値に最も大きな差が観察される単一のfa値(0.2〜0.8の間)について得られたCI値;fa:影響率;TEA:トリエタノールアミン;
FDA:米国食品医薬品局;NCI:米国国立癌研究所。
本発明の組成物を調製するためには、送達媒体中に含まれる薬剤の所望の比をまず決定する必要がある。この比は、相乗作用または相加作用が組合せによってある濃度範囲にわたって示されるものであることが望ましい。このような比は、インビトロの細胞培養物または無細胞系においてさまざまな数学モデルを用いて決定することができる。
D=Dm[fa/(1-fa)]1/m
によって与えられる式が用いられ、ここでDは用いる薬剤の用量であり、faはその用量による影響を受けた細胞の率であり、Dmは効力を表す中位効果(median effect)であり、mは用量-効果曲線の形状を表す係数である(一次反応ではmは1である)。
CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2 [式1]
を得ており、さらに、完全に独立した作用機序を有する排反的でない薬剤に関して
CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+(D1)(D2)/(Dx)1(Dx)2 [式2]
を得ている。CI<1、=1および>1はそれぞれ相乗作用、相加作用および拮抗作用を示す。式1または式2は、併用した薬剤1、(D)1および薬剤2、(D)2(分子にあるもの)が、実際の実験でx%を阻害することを指示している。このため、実験的に観察される阻害率x%は、概数ではなくて小数部を有する可能性が高い。式1および2の(D)1および(D)2(分母にあるもの)は、それぞれ薬剤1および薬剤2が単独でx%を阻害する用量である。
上記の非拮抗的な作用に関する基準を満たすことが判明した治療薬のさまざまな組合せは、その後、薬物送達媒体の配合物の形態で提供される。「治療薬」とは、単独で、または他の化合物との組合せで、望ましくない状態または疾患に冒された対象に対して望ましい効果を有する、化合物のことである。
「シグナル伝達阻害物質」、これは癌細胞が増殖または分裂する原因になるシグナルを妨げる、またはそれを阻止する;
「細胞傷害物質」;
「細胞周期阻害物質」または「細胞周期制御阻害物質」、これは細胞が正常な細胞周期、すなわち細胞の生涯を、それを派生させた有糸分裂から、分裂して娘細胞を生じさせる有糸分裂後の事象へと進行させることを妨げる;
「チェックポイント阻害物質」、これは細胞周期チェックポイント、例えば、S/G2チェックポイント、G2/MチェックポイントおよびGl/Sチェックポイントの正常な機能を妨げる;
「トポイソメラーゼ阻害物質」、これにはカンプトテシンなどがあり、DNAの複製および転写に必要な酵素であるトポイソメラーゼIまたはIIの活性を妨げる;
「受容体チロシンキナーゼ阻害物質」、これは、チロシンキナーゼ活性を有する増殖因子受容体の活性を妨げる;
「アポトーシス誘導物質」、これはプログラム細胞死を促進する;
「代謝拮抗物質」、これにはゲムシタビンまたはヒドロキシ尿素などがあり、必須代謝産物とよく似ているために、それがかかわる生物反応を妨げる;
「テロメラーゼ阻害物質」、これは、テロメア長を延長させて細胞の寿命およびその複製能力を向上させる酵素であるテロメラーゼの活性を妨げる;
「サイクリン依存性キナーゼ阻害物質」、これは、ヒストン、細胞骨格タンパク質、転写因子、腫瘍抑制遺伝子といった細胞タンパク質のリン酸化を介して細胞周期の異なる時期間の主要な段階を制御するサイクリン依存性キナーゼを妨げる;
「DNA損傷物質」;
「DNA修復阻害物質」;
「血管形成抑制物質」、これは腫瘍増殖時に起こる新たな血管の形成または既存の血管の成長を妨げる;および
「ミトコンドリア毒」、これはミトコンドリアの呼吸鎖機能を直接的または間接的に破壊する。
薬剤の新規な非拮抗的組合せを同定するために、薬剤の化学物質ライブラリーを互いにさまざまな比でスクリーニングすることができる。化学物質ライブラリーは新規な薬剤を含んでも従来の薬剤を含んでもよい。2種類の薬剤の組合せに関するスクリーニングに加えて、3種類または4種類の薬剤の組合せを非拮抗的な併用効果に関してスクリーニングすることもできる。薬物の相乗作用を決定するために用いるデータ解析法は、前記のメディアンエフェクト解析(Median Effect Analysis)であることが好ましい。この方法によれば、薬剤のライブラリーを、個別に、および種々の比で組み合わせて検討する。続いて、ChouおよびTalalayによって開発された前記の方法を用いて組合せ指数を算出する。特定の比で非拮抗的な作用を示す薬剤の組合せを送達媒体中に非拮抗的な比で封入する。
薬剤の適切な比が上記のようにして決定されれば、1つまたは複数の送達媒体が2種類またはそれ以上の薬剤を封入するように、薬剤をその適切な比で送達媒体組成物中に収める。組成物中のすべての送達媒体が同一である必要はない。組成物中の送達媒体は粒子であり、そのサイズは投与経路に依存し、本発明の薬剤を封入しうる水性溶媒または他の溶媒中に懸濁化されうる。このような媒体には、例えば、前述した、脂質担体、リポソーム、シクロデキストリン、ポリマー性ナノ粒子およびポリマー性微粒子(ナノカプセルおよびナノスフェアを含む)、ブロック共重合体ミセル、脂質安定化エマルション、誘導体化された一本鎖ポリマー、ポリマー脂質ハイブリッド系、脂質ミセル、リポタンパク質ミセルが含まれる。静脈内投与のための送達媒体は一般に直径約4〜6,000nmである。好ましい直径は直径約5〜500nm、より好ましくは直径5〜200nmである。吸入投与、クモ膜下腔内投与、関節内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与のための送達媒体は一般に4μmから50μmを超える範囲である。眼内投与用に設計される送達媒体組成物は一般にそれよりも小さい。
これらの送達媒体組成物は、温血動物および鳥類における種々の疾患の治療に用いうる。したがって、本発明の方法および組成物による治療に適した対象には、ヒト、家畜または家庭内動物などの哺乳動物、ニワトリおよびアヒルなどの家畜化された鳥類対象、ならびに研究用の実験動物が含まれる。本発明の組成物の医学的用途の例には、癌の治療、高血圧、不整脈および再狭窄などの心血管疾患の治療、細菌性、ウイルス性、真菌性もしくは寄生生物性の感染症の治療、本発明の組成物のワクチンとしての使用による疾患の治療および/もしくは予防、炎症の治療、または自己免疫疾患の治療が含まれる。
上記の通り、本発明の送達媒体組成物を、ヒトを含む温血動物、ならびに家畜鳥類に投与することができる。ヒトの疾患の治療の場合、有能な医師は、本発明の組成物を、確立されたプロトコールを用いて、用量、投与計画および投与経路の点でいかにして用いるべきかを決定しうると考えられる。本発明の送達媒体組成物中に封入された薬剤が対象の健常組織に及ぼす毒性が低ければ、このような用途に用量漸増法を用いてもよい。
2種類またはそれ以上の薬剤が封入された送達媒体組成物の治療活性は、動物モデルへの投与後に測定することができる。動物モデルは腫瘍を含むことが好ましいが、送達媒体組成物を他の疾患の動物モデルに投与することもできる。マウスおよびラットなどの齧歯類種、例えば、免疫能力があるものおよび免疫不全のものを含む、近交系、非近交系または雑種由来のもの、ならびにノックアウトモデルまたはトランスジェニックモデルを用いることができる。
log10細胞死/用量=(T-C)/((3.32)(Td)(投与回数))
log10細胞死(合計)=(T-C)/((3.32(Td))
log10細胞死(正味)=((T-C)-(Rxの期間))/((3.32(Td))
ここで、(T-C)=腫瘍増殖遅延
Td=腫瘍倍加時間である。
i)TD50またはエンドポイント希釈アッセイ法:これはインビボの接種材料から採取した細胞が腫瘍を生成するために必要な数を決定する。
ii)インビボコロニーアッセイ法:これは個々の細胞が、例えば肺に、小結節(コロニー)を形成する能力を評価する。
iii)インビトロコロニーアッセイ法、これは個々の細胞が、コロニーが培養皿のプラスチックまたはガラスの表面に形成される場合には液体培地中で、またはコロニーが浮遊液中に形成される寒天などの半流動培地中で、増殖してコロニーとなる能力を調べる。
以下の実施例では、細胞傷害性の決定および非拮抗的な作用の評価のために以下の方法を用いている。
以下の実施例では、標準的なテトラゾリウム比色MTT細胞傷害性アッセイ法のプロトコール(Mosmannら、J. Immunol Methods (1983) 65(1-2):55-63)を、影響を受けた細胞の率に関する読み取り値の決定に用いた。簡潔に述べると、生きた細胞は、テトラゾリウム塩である3-(4,5-ジエチルチアゾイル-2-イル)-2,5ジフェニルテトラゾリウムブロミド(3-(4,5-diethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide、MTT)を、分光分析によって読み取れる青色のホルマザンへと還元する。25cm2フラスコ内で増殖させたヒトH460非小細胞肺癌(NSCLC)細胞などの細胞を継代し(継代数<20)、新たなRPMI細胞培養液中に再懸濁した上で、96ウェル細胞培養プレートに、1ウェル当たり細胞1000個(1ウェル中に100μL)の濃度でプレーティングする。続いて細胞を37℃、5%CO2下で24時間インキュベートする。その翌日に、薬剤の系列希釈物を12ウェル細胞培養プレート中に用意する。前もって種々の溶液中に調製しておいた薬剤を新たなRPMI細胞培養液中に希釈する。薬剤を、ラテン方格配置法または「チェッカーボード」希釈法を用いて、単一の薬剤(20μl)および特定の固定比での二剤の組合せ(増分20μL)に関する適切なまたは特定されたウェルに投与する。新たな培地を加えてウェル内の総容積を200μLにする。薬剤の曝露は72時間にわたって行う。
薬剤の組合せの解析には、ChouおよびTalalayによるメディアンエフェクト原理を基盤とするソフトウエアプログラムCalcuSyn(Biosoft, Ferguson, MO, USA)を用いた。まず、二剤の組合せに関する固定比を、単剤の細胞傷害性プロフィールによるIC50:IC50比から導き出す。続いて、製剤の目的に関する考察に基づき、より妥当な固定比(例えば、10:1〜1:10の範囲;モル比)を選択する。細胞生存性に対する薬剤の効果に基づいて算出した平均値から、用量および各々の分割効果の値をCalcuSynコンピュータプログラムに入力する。するとソフトウエアが、薬剤の組合せが相乗的、相加的または拮抗的のいずれであるかを組合せ指数(CI)値に基づいて算出する。
用量-効果分析のさまざまな表現
薬剤の量(用量または濃度)とその生物作用との間の関係、ならびに薬剤の組合せの連合効果に関する定量分析は、さまざまなやり方で計測および報告を行うことができる。図2は、このような5通りの方法を、一例としてイリノテカンとカルボプラチンとの組合せを用いて示している。
CIは濃度に依存する
イリノテカンおよび5-フルオロウラシル(5-FU)のモル比1:1および1:10での組合せ、ならびにエトポシドおよびカルボプラチンのモル比10:1および1:10での組合せという薬剤の組合せを、前の実施例の項で説明した、標準的なテトラゾリウム比色MTT細胞傷害性アッセイ法およびメディアンエフェクト解析を用いて、相加的、相乗的または拮抗的な作用に関して検討した。HT29細胞またはMCF-7細胞を、単一の薬剤ならびに薬剤の所定の比での組合せに対して曝露させた。単一の薬剤および組合せについて、8種類の薬剤濃度を用いた。光学密度の値をMTTアッセイ法によって入手し、これを対照に対する百分率に変換し、平均した上で、影響率の値に変換した。用量および影響率の値をCalcuSynに入力し、図3に示されたCIとfaとの関係をみたグラフを得た。
さまざまな二剤の組合せに関するCIの決定
以下の表に示したさまざまな薬剤の組合せを、上記のMTT細胞傷害性アッセイ法プロトコールおよびメディアンエフェクト解析手順を用いて、相加的、相乗的または拮抗的な作用に関して検討した。CIとfaとの関係をみたグラフからの結果を以下に表としてまとめている。非拮抗的な作用が認められたfa範囲のおおよその百分率を、比の後ろのカギ括弧の中に報告している。測定はfa値0.2〜0.8の範囲で行い、CI値1.1未満に該当する曲線の百分率を決定することにより、相乗作用または相加作用(非拮抗的)を示したfa範囲の百分率を算出した。データは、少なくとも1つの実験を3回ずつ行ったものに由来する。
a「相乗的または相加的である百分率%」は、fa値0.2〜0.8の範囲での、Chou-Talalay方法に基づくClと影響率(fa)とのプロット上で、拮抗的な範囲(CI値>1.1は拮抗的である)に該当しないfa範囲の百分率として算出される。CIは用量およびfa値をCalcuSynに入力することによって測定した。
b この比に関するデータセットは「相加的な」範囲にあった(CIが0.9〜1.1の間)。
カルボプラチンおよびダウノルビシンの相乗作用
相加的、相乗的または拮抗的な作用を計測するための上記の手順を、カルボプラチン/ダウノルビシンをH460細胞にてモル比10:1、1:1および1:10で用い、さらにMCF-7細胞にて比10:1および1:1で用いて再び行った。上記の通りにCI-fa曲線を作成し、続いてfa値0.50、0.75および0.90でのCIを決定することにより(それぞれED50、ED75およびED90でのCI値を得るため)、組合せ指数を各用量について決定した。標準偏差はCalcuSynプログラムによって算出した。図5Aの挿入図に示されているように、カルボプラチンおよびダウノルビシンはモル比10:1では、MCF-7細胞においてED50、ED75およびED90値で相乗的な相互作用を示す。図5Aの挿入図にさらに示されているように、カルボプラチンおよびダウノルビシンは1:1モル比の場合、ED75およびED90では平均CI値による判定で相乗的であるが、ED50では相加的である。H460細胞においては、CI最大値とカルボプラチン/ダウノルビシンのモル比とのプロットから、モル比10:1ではこれらの薬剤は相乗的であるが、モル比1:1では幾分拮抗的な作用が観察されることが判明した。これに対して、比1:10では高度に拮抗的な作用が認められる(図5A)。このデータは図5Bにも、相乗作用に対する濃度の影響をより適切に図示するために、CIと影響を受けたH460細胞の率との関係としてプロットされている。モル比1:1のカルボプラチン/ダウノルビシンは、影響率の値が0.42までの範囲では非拮抗的である。比が10:1だと、fa値のかなりの範囲(0.2より上)で相乗作用が認められ、比1:10はすべてのfa値で拮抗的である。図5Bの挿入図は、H460細胞において比10:1ではED50、75および90で相乗作用(平均CI値による判定)が観察され、比1:1ではED50で相加作用が示されることを示している。比が1:10だと、カルボプラチン/ダウノルビシンはED50、75および90値で高度に拮抗的である。このため、これらの結果に基づき、カルボプラチンおよびダウノルビシンはモル比1:10では、測定したすべてのED値でCI-faプロット内のすべてのfa範囲にわたって拮抗作用が認められるために、これ以上の製剤およびインビボ試験の対象としては選択されないと考えられる。モル比10:1および1:1のカルボプラチン:ダウノルビシンは、これらの比のそれぞれで、薬剤が(細胞の1%超が影響を受ける)fa範囲の少なくとも5%にわたって相乗作用を示しているため、製剤および有効性試験の対象として選択される。
インビボでのカルボプラチンおよびダウノルビシンの相乗作用の維持
カルボプラチンおよびダウノルビシンを、単一のコレステロール非含有リポソーム中に、モル比10:1、5:1および1:1(カルボプラチン/ダウノルビシン)で共装填(co-load)した。DSPCはクロロホルム中に溶解し、DSPGは微量の14C-CHEとともにクロロホルム/メタノール/水(50:10:1 vol/vol)中に溶解した。これらの溶液をモル比80:20(DSPC/DSPG)で混ぜ合わせた。温度を60℃超に保ちながら、溶媒をN2ガス流によって除去した。続いて脂質薄膜を真空ポンプ内に2分間置き、その後にクロロホルムのみの中に再び溶解した。続いてクロロホルムを上記の通りに除去した。その結果生じた脂質薄膜を残留溶媒を除くために真空下に一晩おき、その後に、カルボプラチンの溶解性を高めるための4%(v/v)DMSOとともに80mg/mLカルボプラチンを含む150mM CuSO4、pH 7.4(pHはトリエタノールアミンで調整)中に再水和した。その結果生じた多重ラメラ小胞(MLVs)を70℃で孔径80および100nmの積み重ねた2枚のフィルターを通して押し出し、合計10回通過させた。この試料を生理食塩水中に入れた上で、接線流透析を用いる交換によって300mMスクロース、20mM HEPES、30mM EDTA、pH 7.4(SHE)中に入れた。モル比10:1、5:1および1:1のカルボプラチン/ダウノルビシンが得られる薬剤-脂質比で、60℃にて5分間インキュベートすることにより、ダウノルビシン(微量の3H-ダウノルビシンを含む)をリポソーム中に装填した。その後に、各試料の緩衝液を接線流によって生理食塩水に交換した。共装填した製剤の調製中の種々の時点での薬剤装填の程度を決定するために、液体シンチレーション計数によってダウノルビシンおよび脂質のレベルを測定した。カルボプラチン濃度は原子吸光分光法によって測定した。共装填製剤におけるモル比10:1、5:1および1:1のカルボプラチン/ダウノルビシンの場合、Balb/cマウスに対して8mg/kgカルボプラチンが静脈内投与され、ダウノルビシンの用量はそれぞれ1.2mg/kg、6mg/kgおよび12mg/kgとなった。指定した時点(各時点当たりマウス3匹)で、血液を心臓穿刺によって採取し、EDTAをコーティングしたマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して血漿を慎重に別にチューブに移した。液体シンチレーション計数を用いてダウノルビシンおよび脂質の血漿中濃度を定量した;カルボプラチンの血漿中濃度は原子吸光分光法によって測定した。原子吸光分光法による定量のためには、標準曲線の直線範囲に収まるように試料を0.1%硝酸で希釈した。
リポソーム性カルボプラチンおよびダウノルビシンの有効性
ダウノルビシンおよびカルボプラチンがモル比1:1(これは実施例4で製剤に関して選択された)で共封入されたDSPC/DSPGリポソーム(80:20mol%)を、脂質薄膜を25mg/mLのカルボプラチンを含む溶液である150mM CuSO4、pH 7.4(pHはトリエタノールアミンで調整)中に水和させた点を除き、実施例5における記載の通りに調製した。さらに、脂質薄膜を乾燥させた後にメタノールまたは水を除くためにクロロホルム中に再び溶解し、続いて溶媒を以前の記載の通りに除去した。
シスプラチンおよびダウノルビシンの相乗作用
シスプラチン/ダウノルビシンの組合せを、上記の方法を用いて、相加的、相乗的または拮抗的な作用に関して調べた。その結果を図11にまとめた。図11Aに示されているように、シスプラチン/ダウノルビシンのモル比10:1ではfaの全範囲にわたって相乗作用が観察されたが、モル比1:1ではすべてのfa範囲にわたって拮抗作用が示された。CI最大値(CI max)とシスプラチン-ダウノルビシン比との関係をプロットした図11Bは、組合せ指数に対する2種類の薬剤の組合せ比の依存性をさらに示している。これらの結果は、モル比10:1ではCI max値は相乗的であるが、モル比1:1および1:10ではCI max値は拮抗的であることを示している。
インビボでのシスプラチンおよびダウノルビシンの相乗作用の維持
シスプラチンおよびダウノルビシンを、DMPC/Chol(55:45mol%)リポソーム中に、実施例7で非拮抗的であることが特定されたモル比10:1で共装填した。
リポソーム性シスプラチンおよびダウノルビシンの有効性
別個のリポソーム中に調合したシスプラチンおよびダウノルビシンの有効性を、実施例26に詳述した通りにSCID/rag2マウス(H460異種移植モデル)において評価した。H460腫瘍を有するマウス(各群当たりマウス4匹)に対して、生理食塩水、または実施例7で非拮抗的であるとインビトロで特定されたモル比10:1のシスプラチン/ダウノルビシンを投与した。シスプラチンおよびダウノルビシンは、押出処理後にDMPC/CholリポソームをHBSに対して透析した点を除き、実施例8の記載の通りに、それぞれDMPC/Chol(55:45mol%)リポソームおよびDSPC/DSPE-PEG2000(95:5mol%)リポソーム中に調合した。薬剤の組合せを投与するマウスに対しては、薬剤を遊離性薬剤混合物(10:1の混合物、モル比)として、またはリポソーム性ダウノルビシンとリポソーム性シスプラチンとの同時投与(リポソーム製剤;モル比10:1)として、第14、17および21日に投与した。遊離物および調合物の投与のいずれに関しても、用量は2.0mg/kgシスプラチンおよび0.375mg/kgダウノルビシンとした。脂質用量は、リポソーム性シスプラチンについては400mg/kgであり、リポソーム性ダウノルビシンについては3.75mg/kgであった。
拮抗的なモル比にある薬剤の組合せのリポソーム性投与の効果
シスプラチンおよびダウノルビシンを、DMPC/Chol(55:45mol%)リポソーム中に、実施例7で拮抗的であることが決定されたモル比1:1で共装填した。シスプラチンは受動的に封じ込め、ダウノルビシンは能動的に封じ込めてシスプラチン/ダウノルビシンのモル比1:1を達成した。単一のリポソーム中への薬剤の装填には、実施例8に概要を示した手順を用いた。
シスプラチンおよびトポテカンの相乗作用
相乗的、相加的または拮抗的な作用を決定するための上記の手順(実施例1参照)を、シスプラチン/トポテカンをモル比10:1およびモル比1:1の両方で用いて再び行った。図17Aに示されているように、シスプラチン/トポテカンはモル比10:1では、細胞の5%〜99%が影響を受ける(fa=0.05〜fa=0.99)広範囲の用量にわたって非拮抗的な相互作用を示した。これに対して、モル比1:1のシスプラチン/トポテカンは、同じfa範囲にわたって高度に拮抗的であった(図17A)。
インビボでのシスプラチンおよびトポテカンの相乗作用の維持
シスプラチンおよびトポテカンを、それぞれDMPCICholリポソームおよびDSPC/Cholリポソーム中に調合した上で、実施例11で相乗的であることが特定されたモル比10:1でマウスに静脈内注射した。
リポソーム性シスプラチンおよびトポテカンの有効性
別個のリポソーム中に装填されたシスプラチンおよびトポテカンの有効性を、2種類の薬剤を別個のリポソーム中に調合した上で、それらの製剤を、実施例11で非拮抗的であることが特定されたモル比10:1で投与することによって調べた。リポソーム性シスプラチンは、実施例12の手順の記載の通りにDMPC/Chol(55:45mol%)リポソーム中に受動的に封じ込めた。トポテカンは、トポテカンの装填は最終的なトポテカン/脂質重量比が0.1(w/w)となるように行った点を除き、実施例12の通りにDSPC/Chol(55:45mol%)中に調合した。装填後に外部緩衝液をHBSに交換した。
シスプラチンおよびイリノテカンの相乗作用
シスプラチンおよびイリノテカンのモル比1:1、10:1、1:5および1:10での組合せを、上記の方法に従って相乗作用、相加作用または拮抗作用に関して調べた(実施例1参照)。図20Aにまとめた結果は、モル比10:1、1:5および1:10ではfa値の全範囲にわたって非拮抗的であるが、1:1の比はfa値のかなりの範囲にわたって拮抗的であったことを示している。図20Bはさらに、組合せ指数の最大値をシスプラチン-イリノテカンのモル比に対してプロットすることによって概括されているように、併用効果の性質に対する比の依存性を示している。
インビボでのシスプラチンおよびイリノテカンの相乗作用の維持
6.0mg/mLシスプラチンを含む225mM銅(75mM CuCl2、150mM CuSO4、トリエタノールアミン(TEA)、pH 6.8)中に脂質薄膜を再水和させた点を除き、実施例5の記載の通りに調製したDSPC/DSPG(80:20mol%)リポソーム中に、シスプラチンおよびイリノテカンを共装填した。押出処理および封入されなかった薬剤の除去の後のリポソーム性シスプラチンの濃度はシスプラチン0.025モル/脂質1モルであった。その結果生じたリポソームをSHE、pH 6.8に対して一晩透析した。続いてイリノテカンを調製物に添加し、リポソームを45℃で1.5時間インキュベートした。HPLCによる評価では、添加したイリノテカンの60%がリポソームに装填された。続いてリポソームの緩衝液を接線流によって0.9%生理食塩水に交換した。接線流の後に、リポソームは最初のシスプラチンおよびイリノテカンの約80%を保持していた。それぞれ原子吸光分光法およびHPLC分析によって評価したシスプラチンおよびイリノテカンの分析により、最終的な調製物がシスプラチン-イリノテカンをモル比1:3で有することが示された。SCID/rag2マウスに対して2mg/kgシスプラチンおよび38.6mg/kgイリノテカンを静脈内投与した。指定された時点(各時点当たりマウス3匹)で血液を心臓穿刺によって採取し、EDTAをコーティングしたマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して血漿を慎重に別のチューブに移した。イリノテカンおよびシスプラチンの血漿中濃度はそれぞれHPLCおよび原子吸光分光法によって測定した。
リポソーム性シスプラチンおよびイリノテカンの有効性
別個のリポソーム中に調合されたリポソーム性シスプラチンおよびイリノテカンに対して有効性試験を行った。実施例15に詳述した通りに、シスプラチンはDMPC/Chol(55:45mol%)リポソーム中に受動的に封じ込め、イリノテカンはDSPC/DSPE-PEG2000(95:5mol%)リポソーム中に装填した。実施例26に記載の方法に従って、リポソーム性シスプラチンおよびイリノテカンを、実施例14で非拮抗的であることが決定されたモル比1:5で、H460腫瘍を有するSCID/rag2マウスに対して同時投与した。リポソーム性シスプラチンおよびイリノテカンの投与(第14、18および22日に各群当たりマウス4匹に対して)は、非拮抗的なモル比1:5で以下の用量を用いて行った:1mg/kgシスプラチン、10mg/kgイリノテカンおよび130mg/kg脂質(白い四角);2.5mg/kgシスプラチン、25mg/kgイリノテカンおよび175mg/kg脂質(白い三角);または5mg/kgシスプラチン、50mg/kgイリノテカンおよび250mg/kg脂質(白い逆三角)。遊離性シスプラチン/イリノテカンは、モル比1:5を反映する1mg/kgシスプラチンおよび10mg/kgイリノテカンの用量で投与した(黒い四角)。
薬剤および脂質の組合せの相乗作用
ビノレルビンを、脂質二重層に組み入れられたPOPS(黒い逆三角)、DPPS(黒い三角)、DLPS(黒丸)、DSPS(黒い菱形)またはDOPS(黒い四角)といった種々の治療的脂質候補とともにモル比1:1で含む組合せを、上記の方法を用いて相加的、相乗的または拮抗的な作用に関して検討した(実施例1参照)。
リポソーム性ビノレルビンおよびホスファチジルセリンの薬物動態
以下の通りに、SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000(35:45:10:10mol%)からなるリポソームを調製して、ビノレルビンを装填した。
H460ヒト肺癌モデルにおけるリポソーム性ホスファチジルセリンおよびビノレルビンの有効性
実施例18の記載の通りに、DSPC/Chol/DSPS/DSPE-PEG2000(35:45:10:10mol%)リポソーム、SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000(35:45:10:10mol%)リポソームおよびDAPC/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000(35:45:10:10mol%)リポソームを調製し、ビノレルビンを装填した。ホスファチジルセリンおよびビノレルビンはリポソーム中に非拮抗的なモル比(1:1)で存在させた。有効性試験は、実施例26に記載した通り、H460ヒト肺癌モデルを用いて行った。
マウス白血病モデルにおけるリポソーム性ホスファチジルセリンおよびビノレルビンの有効性
リポソームを孔径100nmフィルターと80nmフィルターを重ねたものを通して押し出した点を除き、実施例18の記載の通りに、SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000(35:45:10:10mol%)からなるリポソームを調製し、ビノレルビンを装填した。
スフィンゴシンとドキソルビシンとの共調合
ホスファチジルセリンのほかに、他の治療的脂質をリポソーム膜に組み入れることもできる。例えば、スフィンゴシンおよびスフィンゴシン類似体はリポソーム中に調合するのに適合した脂質であり、水性内部に封入した治療薬(例えば、ドキソルビシン)とともに調合することができる。このような薬学的組成物(スフィンゴシン)の調製は以下のようにして行いうる。
フロクスウリジン(FUDR)およびイリノテカン(CPT-11)の相乗作用
相加的、相乗的または拮抗的な作用を計測するための上記の手順を、HT 29細胞においてFUDR/CPT-11をモル比10:1、5:1、1:1、1:5および1:10で用いて再び行った。上記の通りにCI-fa曲線を作成することにより、組合せ指数を各用量に関して決定した。影響を受けたHT-29細胞の率に対してCIをプロットした図29におけるデータは、相乗作用に対する濃度の影響を明らかに示している。比が5:1または1:1の場合は、影響率の値の全範囲(0.2〜0.8)にわたって相乗作用が観察されるが、比10:1では0.76未満のfa値で非拮抗的であり、FUDR/CPT-11のモル比が1:5であれば0.62未満のfa値で非拮抗的である。比1:10はfa値の実質的な範囲(50%超)にわたって拮抗的である。これらの結果に基づき、この比がfa値の有意な範囲(細胞の1%超が影響を受ける範囲の少なくとも20%)にわたって相乗作用を示したことから、FUDR:CPT-11のモル比1:1を製剤化および有効性試験の対象として選択した。5:1および10:1の比で調製した製剤も、fa値の実質的な範囲にわたって所定の非拮抗的な比を示すという必要条件を満たすと考えられる。
インビボでのFUDRおよびCPT-11の相乗作用の維持
FUDRおよびCPT-11をDSPC/DSPG/Chol(70:20:10mol%)リポソーム中に、実施例Aにおいて相乗的であることが特定されたモル比1:1で調合した。DSPCおよびコレステロールをクロロホルム中に溶解し、DSPGをクロロホルム/メタノール/水(16/18/1)中に溶解することによって脂質薄膜を調製した。これらの溶液を所定のモル比が得られるように混ぜ合わせ、リポソーム脂質標識として微量の14C-CHEを添加した。溶媒の除去後に、生成された脂質薄膜を、250mM CuSO4および25mg/mLのFUDR(微量の3H-FUDRを含む)からなる溶液によって70℃で水和させた。その結果生じたMLVを、70℃で、重ね合わせた2枚の孔径100nmフィルターに10回通過させることにより、押し出し処理を行った。その後に、リポソームの緩衝液を接線流透析によってSHE、pH 7.4に交換し、それにより、封入されなかったFUDRおよびCuSO4を除去した。
リポソーム性FUDRおよびCPT-11の有効性
薬剤装填後にリポソーム外部緩衝液を0.9%NaClに交換した点を除いて、実施例Bの記載の通りに、FUDRおよびイリノテカンをモル比1:1で共封入したDSPC/DSPG/Chol(70:20:10mol%)リポソームを調製した。
さまざまな3剤の組合せに関するCIの決定
トポテカン、シスプラチン、HB5-5A(エデルフォシン類似体)およびスフィンゴシンを含む組合せを、標準的なテトラゾリウム比色MTT細胞傷害性アッセイ法(実施例の項の細胞傷害性アッセイ法を参照)を用いて、相加的、相乗的または拮抗的な作用に関して検討した。以前の実施例に記載したメディアンエフェクト解析を用いて併用効果を算出した。CTとfaとの関係を示すグラフを以前の実施例の記載の通りに作成し、fa値0.50、0.75および0.90に対応するCI値(ED50、75および90によって表される)を以下の表に報告した。
a 組合せ指数(CI)は、用量-効果分析に関するChou-Talalay理論に基づく相乗作用(CI<0.9)または相加作用(CIが0.9〜1.1の間)の決定に用いられる。各値はCalcuSynソフトウエアを用いて算出される。
b ED50、ED75、ED90は、測定される応答のそれぞれ50、75または90%が影響を受ける薬剤の用量のことを指す。
腫瘍モデルの作製、細胞の調製および皮下固形腫瘍の移植法
H460ヒト非小細胞肺癌細胞は、NCIのDCTC腫瘍レポジトリ(Tumor Repository)から入手しうる。細胞は組織培養下で最大20回の継代にわたって維持される。20回の継代後に、液体窒素中で保存していた凍結貯蔵物から新たな細胞を増殖させる。培養細胞が集密度80〜90%に達した時点で、それらをハンクス平衡塩類溶液ですすぎ洗い、付着細胞を0.25%トリプシン溶液によって取り出す。細胞を血球計算器で算定し、培地で希釈して濃度を20×106細胞/mLにする。
1.投与開始前およびグループ分けの後の各群に関する個々のマウスの腫瘍体積。
2.時間の関数としての各群の平均体重。
3.時間の関数としての各群の平均腫瘍体積。
4.図および表を含む生データの作成、これには腫瘍増殖と時間との関係、腫瘍増殖阻止および腫瘍増殖遅延が含まれる。
5.異常または顕著な観察所見のまとめ。
腫瘍モデルの作成、細胞の調製および腹腔内腫瘍の移植方法
マウスを体重別にグループ分けする。25g針を用いて、BDF-1マウス(n=4)の腹腔内に1×106個のP388細胞、容積500μLを移植する(第0日)。ATCC癌細胞貯蔵部門(ATCC tumor repository)から入手したP388細胞をBDF-1マウスの腹水として維持し、新たなマウスに週1回継代する。マウスを安楽死させ、20g針を用いて腹壁を介して腹水細胞を採取する。実験に用いる細胞は継代回数3〜20回のものを用いる。マウス体内での20回の継代後には、液体窒素中の凍結貯蔵物から新たな細胞を増殖させてマウスに接種する。実験用の細胞はハンクス平衡塩類溶液ですすぎ洗い、血球計算器で算定した上で、HBSSで希釈して濃度を2×106個/mLとする。
Claims (4)
- 協調的な薬物動態を有するリポソームを含む組成物を調製するための方法であって、該リポソームには、相乗的なモル比にある少なくとも第1の抗腫瘍薬および第2の抗腫瘍薬が安定的に会合しており、該安定的会合は、インビボで投与した場合に、血液中における該抗腫瘍薬の該相乗的な比を少なくとも1時間維持するものであり、
a)該比の抗腫瘍薬によって影響を受ける細胞画分が0.20〜0.80である濃度範囲の少なくとも20%にわたり相乗的である第1および第2の抗腫瘍薬のモル比を、細胞傷害作用または細胞分裂抑制作用に関する妥当な癌細胞培養物アッセイ法において決定する段階、
b)段階a)において相乗的であると決定されたモル比で、該リポソームに抗腫瘍薬を安定的に会合させる段階、ならびに
c)リポソームをインビボで投与した場合に血液中における該抗腫瘍薬の該相乗的な比を少なくとも1時間維持するか否かを確認する段階、
を含む方法。 - 決定が、抗腫瘍薬の複数の比を複数の濃度で試験することと、ある濃度範囲にわたって該比に関して相乗的、相加的または拮抗的な作用を算出するためのアルゴリズムを適用することとを用いる、請求項1記載の方法。
- アルゴリズムがChou-Talalayのメディアンエフェクト法である、請求項2記載の方法。
- 第1の抗腫瘍薬がイリノテカンであって第2の抗腫瘍薬が5-FUもしくはFUDRである、または
第1の抗腫瘍薬がシスプラチンであって第2の抗腫瘍薬が5-FUもしくはFUDRである、または
第1の抗腫瘍薬がイダルビシンであって第2の抗腫瘍薬がAraCである、または
第1の抗腫瘍薬がオキサリプラチンであって第2の抗腫瘍薬が5-FUもしくはFUDRである、または
第1の抗腫瘍薬がイリノテカンであって第2の抗腫瘍薬がシスプラチン(もしくはカルボプラチン)である、または
第1の抗腫瘍薬がゲムシタビンであって第2の抗腫瘍薬がシスプラチン(もしくはカルボプラチン)である、または
第1の抗腫瘍薬がメトトレキサートであって第2の抗腫瘍薬が5-FUもしくはFUDRである、または
第1の抗腫瘍薬がパクリタキセルであって第2の抗腫瘍薬がシスプラチン(もしくはカルボプラチン)である、または
第1の抗腫瘍薬がエトポシドであって第2の抗腫瘍薬がシスプラチン(もしくはカルボプラチン)である、または
第1の抗腫瘍薬がドセタキセルもしくはパクリタキセルであって第2の抗腫瘍薬がドキソルビシンである、または
第1の抗腫瘍薬がアドリアマイシンであって第2の抗腫瘍薬がビノレルビンである、または
第1の抗腫瘍薬がカルボプラチンであって第2の抗腫瘍薬がビノレルビンである、または
第1の抗腫瘍薬が5-FUもしくはFUDRであって第2の抗腫瘍薬がゲムシタビンである、
請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
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Citations (1)
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JPH07277956A (ja) * | 1994-04-13 | 1995-10-24 | Pola Chem Ind Inc | 薬効成分含有リポソーム製剤の製造方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL26210A (en) * | 1965-08-02 | 1970-12-24 | Merck & Co Inc | Pharmaceutical compositions containing substituted sulphoxides |
AU762078B2 (en) * | 1999-03-24 | 2003-06-19 | Secretary Of State For Defence, The | Vaccine composition |
EP1171118A2 (en) * | 1999-04-09 | 2002-01-16 | Jessie L.S. Au | Methods and compositions for enhancing delivery of therapeutic agents to tissues |
WO2000074634A2 (en) * | 1999-06-03 | 2000-12-14 | Au Jessie L S | Methods and compositions for modulating cell proliferation and cell death |
US6352996B1 (en) * | 1999-08-03 | 2002-03-05 | The Stehlin Foundation For Cancer Research | Liposomal prodrugs comprising derivatives of camptothecin and methods of treating cancer using these prodrugs |
AU782714B2 (en) * | 1999-09-09 | 2005-08-25 | Regents Of The University Of California, The | Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels |
EP1220657A1 (en) * | 1999-10-14 | 2002-07-10 | 1170535 Ontario Inc. | Liposome encapsulated silver salt compositions |
US6511676B1 (en) * | 1999-11-05 | 2003-01-28 | Teni Boulikas | Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes |
DE60105977T2 (de) * | 2000-02-10 | 2006-02-23 | Liplasome Pharma A/S | Auf lipiden basierende systeme zur arzneistoffabgabe |
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