JP2003505432A - 抗ｅｐ−ｃａｍ抗体と化学療法剤との組合せ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】ＥＰ−ＣＡＭ抗原を発現している細胞をＳ又はＧ_２／Ｍで停止させ得る化学療法剤と、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体との組合せ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、細胞周期の進行をＧ_２／Ｍで停止させることによって細胞の増殖に
影響を与える化学療法剤とＥＰ−ＣＡＭ抗原に特異的に結合する抗体との組合せ
、及び前記抗原を発現する癌の治療におけるそれらの使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】

癌に対する従来の治療的なアプローチには、手術、放射線療法、及び化学療法
を様々に組み合わせたものが含まれるが、ここ２０年来、回復率はさほど向上し
ていない。化学療法と放射線療法における主たる制約は、正常な細胞と腫瘍細胞
の両者に非選択的なターゲッティングが行われ、有害な副作用をもたらすことで
ある。より毒性が低く、より特異的な代替治療を求めて、様々なタイプの免疫療
法が研究されてきた。これらの様式の中では、モノクローナル抗体に基づいた戦
略が広範囲の悪性腫瘍に用いられている（Ｒｉｅｔｈｍｔｕｌｌｅｒ ｅｔ ａ
ｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎ １９９２，４，６４７−６５５ ａｎ
ｄ Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ １９９３，５，７３２−７３９）。モノクローナル抗体の有用性は、クロ
ーン抗原の特異性（すなわち、抗原を有し得る特異的なエピトープを分子認識し
、これらの抗原に高い親和性で結合すること）に基づく。モノクローナル抗体は
、悪性細胞の表面上のみに発現されている、又は悪性細胞の表面上により多く発
現されている抗原に結合し得るため、腫瘍細胞を特異的な標的として、これを破
壊するために使用することができる。抗体は、薬物又はＤＮＡを輸送するための
担体として、又は放射性核種との接合体として作製し得る。裸の抗体が標的細胞
に結合することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）や補体依存性
細胞性細胞傷害（ＣＭＣ）等（何れも、標的細胞の溶解又は食作用をもたらし得
る）の生来的抗腫瘍免疫機能も活性化し得る。ＡＤＣＣとＣＭＣは何れも抗体用
量に相関する免疫機能なので、標的細胞にはできるだけ多くの抗体を結合させる
ことが望ましい。かかる課題を解決するための１つの方法は、より多くの抗体を
細胞に結合させることによって、例えば、標的細胞のＡＤＣＣのような抗体機能
を効果的に増強させ得る適切な抗原の発現レベルを増加させることである（Ｆｏ
ｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８：６３０３−
６３０８（１９８８））。

【０００３】 癌の治療で重要な抗原の１つは、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原（ヒトの汎癌腫性抗原；ｐ
ａｎ−ｃａｌｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ）である。該抗原は、細胞接着分子
として機能すると報告されている膜貫通型糖タンパク質であり（Ｌｉｔｖｉｎｏ
ｗ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２５：４３７−４４６
，１９９４）、１７−１Ａ抗原、４０ｋＤ抗原、ＥＧＰ４０、ＧＡ７３３−２、
ＫＳＡ、及びＥＳＡとしても知られているが、文献の中では他の名称又は記述で
知られているかもしれない。Ｅｐ−ＣＡＭ抗原は、単純な立方、又は円柱、偽重
層円柱及び移行上皮の大部分の基底外側表面上に発現されており、一般に、腫瘍
細胞上にはより高レベルで発現されている。上皮細胞は、ヒトの悪性腫瘍の進行
において最も重要な細胞種であることが知られている。このため、全悪性腫瘍の
うち９０％超が癌腫であり、従って内皮由来である（Ａｃｔａ Ａｎａｔｏｍｉ
ｃａ；１５６ （３）；２１７−２２６（１９９６））。

【０００４】 Ｅｐ−ＣＡＭ抗原は上皮由来の腫瘍細胞の多くに発現されているが、成体内皮
組織、表皮の成体ケラチン生成細胞、胃壁細胞、胸腺皮質上皮、筋上皮細胞、及
び肝細胞等のＥｐ−ＣＡＭを発現しない上皮由来の細胞の例も存在する。悪性腫
瘍細胞の表現型は、モノクローナル抗体の効力において重要な役割を果たす。腫
瘍特異的な抗原は捕捉し難いことが明らかとなっているが、正常な細胞と腫瘍細
胞との抗原の発現差は、抗体を腫瘍にターゲッティングするための手段を供与す
る。臨床的には、抗原の均一性と腫瘍細胞上での発現密度を増加することによっ
て、これらの差異を増幅させることが有用であろう。

【０００５】 多くの正常な抗原（例えば、ＨＬＡクラスＩ）の他、腫瘍抗原の発現を増加せ
しめることによって、インターフェロンが細胞の表現型を変化させることは周知
である。例えば、ヒトの組換えインターフェロンαとインターフェロンγはヒト
腫瘍抗原ＴＡＧ−７２とＣＥＡの発現を増加させ得る（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ
ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４４：３２０８−３２１４（１９８４））。イ
ンターフェロンへの暴露により、より多くのＣＥＡを細胞表面から流出させるよ
り均一なＣＥＡ陽性の腫瘍細胞集団が誘導されることが、胸腺欠損マウスにヒト
の癌腫を異種移植したインビボでの実験によって確認された。インターフェロン
γでの処理は、患者の悪性腹水中に存在する卵巣又は消化器腫瘍細胞上のＴＡＧ
−７２とＣＥＡの発現を増大させた（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌ
ｉｎ Ｏｎｃｏｌ １０：７３５−７４６ （１９９２））。細胞に対するイン
ターフェロンの効果は多様であり、直接的な細胞傷害作用から免疫強化、抗増殖
活性にまでわたる。抗原発現に対するインターフェロンの効果の中で、細胞周期
の進行の妨害が直接の原因とされているものは存在しなかった。

【０００６】 要約すれば、細胞周期の進行とは、ある有糸分裂と別の有糸分裂との間に介在
する細胞内での一連の現象を指す。静止期（Ｇ_０）の後にはＤＮＡ合成準備期（
Ｇ_１）が続き、その後ＤＮＡ合成期（Ｓ）が続く。分裂準備期（Ｇ_２）と分裂期
（Ｍ期）の後に、細胞は２つの子孫細胞に分裂する。細胞機構に何らかの妨害が
生じると、細胞周期の何れかの期で全ての周期の進行が阻害され得る。例えば、
特定の化学療法剤はＧ_２又はＭの何れか、又はＧ_２とＭの両者（Ｇ_２／Ｍ）で進
行を停止させ得る。換言すれば、ある種の薬物（例えば、化学療法剤）への暴露
により、例えば、各細胞がＧ_２及び／又はＭで停止し、最終的には、ある集団中
の殆ど又は全ての細胞がＧ_２及び／又はＭ（Ｇ_２／Ｍ）で停止することになろう
。ＨｅＬａ細胞では、例えば、Ｇ_１、Ｓ、Ｇ_２、及びＭ期は、それぞれ、８．２
、６．２、４．６、及び０．６時間である。有糸分裂間の期間は間期と称される
。細胞は、それらの発達段階又は組織の種類に応じて、異なる倍加時間を有し得
る。倍加時間の変動は、通常、Ｇ_１で費やした時間の関数である（Ａ Ｄｉｃｔ
ｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＲＣ Ｋ
ｉｎｇ ａｎｄ ＷＤ Ｓｔａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）。

【０００７】 細胞周期の特定の期だけで産生され、従って細胞周期の状態のマーカーとなり
得る数種のタンパク質が同定されているが、他の多くは、特定の時点において、
より高レベル又は低レベルとなるものの、細胞周期を通じて産生される。細胞周
期を通じた抗原密度の変動としては、肉腫抗原ｐ１０２とｐ２００（Ｓｏｎｇ
Ｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（３Ａ）：１１７１−５（
１９９６））、白血病／リンパ腫関連抗原ＪＤ１１８（Ｃｚｕｃｚｍａｎ ｅｔ
ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐ
ｙ ３６（６）：３８７−９６（１９９３））、及び胃癌抗原ＰＣ１（Ｗｅｉ
ｅｔ ａｌ．， Ｊ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ９（３）：１７９−８２ （１
９８７））が典型的である。数種の腫瘍抗原、例えば、肝臓転移物３Ｈ４（Ｗｕ
ｌｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２２（８）４７６−８２（１９９６））、
及び小細胞肺癌抗原（Ｆａｒｇｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ４６： ２６３３−２６３８（１９８６））は、細胞周期非依存性
であると報告されている。 驚くべきことに、薬物、例えば、Ｓ及び／又はＧ_２／Ｍで細胞周期の進行を停
止させることが知られている化学療法剤で前処理すると、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原集団
の密度を有意に増加させ、従って、Ｅｐ−ＣＡＭを発現している腫瘍に、より多
くの抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体がターゲッティングされることを見出した。溶解性抗体
では、これにより抗体依存性の細胞溶解が起こりやすくなる。腫瘍細胞の表現型
に対するかかる擾乱は、治療用抗体の生物学的な有効性に多大な影響を与え、化
学療法による標準的な治療法に対して相乗効果を与える。さらに、Ｅｐ−ＣＡＭ
抗原の発現のかかる増加は腫瘍に特異的なようである。換言すれば、Ｓ及び／又
はＧ_２／Ｍで細胞周期を停止させる化学療法剤による前処理は、非腫瘍細胞中で
のＥＰ−ＣＡＭ抗原の発現には影響を与えないようである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】

従って、本発明は、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発現している細胞をＳ又はＧ_２／Ｍ、
好ましくはＧ_２／Ｍに停止させることができる化学療法剤と、Ｅｐ−ＣＡＭ抗体
との組合せを提供する。

【０００９】

【発明の実施の形態】

抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体の例は、ＩＮＧ１（Ｃｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７８（５），３１９９
−３２０３（１９８１） ａｎｄ Ｌａｉｏ ｅｔ ａｌ， Ｈｕｍａｎ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ １（２），６６−７６ （１９９０））
、１７−１Ａ、例えば、Ｐａｎｏｒｅｘ（Ｈｅｒｌｙｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｂ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：１４３８−１４５２（
１９７９） ａｎｄ Ｈｅｒｌｙｎ ｅｔ ａｌ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９
８５；５ （ｓｕｐｐｌ． １） Ｓ３ ｔｏ Ｓ１０ ）、及びＮＲ−ＬＵ−
１０（Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４４，
５２７３ ｔｏ ５２７８ （１９８４））である。

【００１０】 パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）（Ａｄｊｕｑｕａｌ（Ｒ））は、１７．１Ａ
マウスモノクローナル抗体である。パノレックスは、グラクソウェルカムにより
、ドイツで結腸直腸癌の術後アジュバント療法用に販売されている。 抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体の例は、図１５に記載されている可変軽鎖ｃＤＮＡ配列と
図１６に記載されている重鎖ｃＤＮＡ配列とを有するものである（ヒト化３２３
／Ａ３／ＩｇＧ_１として知られている）。さらに２つの好ましい抗Ｅｐ−ＣＡＭ
抗体の例は、図１５に記載されている可変軽鎖ｃＤＮＡ配列と、それぞれ図１７
又は１８に記載されている重鎖ｃＤＮＡ配列とを有するものである（それぞれ、
ヒト化３２３／Ａ３ＩｇＧ_４及びＩｇＧ_２ｃｙｓとして知られている）。

【００１１】 抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体の好ましい例は１７．１Ａであり、最も好ましくはパノレ
ックスである。

【００１２】 特異的な抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体は単独で、又は他の抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体と組み合
わせて与えることができる。このような抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体の組合せの例は、図
１５に記載されている可変軽鎖ｃＤＮＡ配列と図１６に記載されている重鎖ｃＤ
ＮＡ配列を有する抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体とＩＮＧ１との組合せである。従って、本
明細書を通じて、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体という語には、様々な抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体
、好ましくは同一のＥｐ−ＣＡＭ抗原上に存在する、異なるエピトープを標的と
する非拮抗的な抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体の組合せが含まれる。Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発
現している細胞をＧ_２／Ｍで停止させることができる化学療法剤の例は、ビノレ
ルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、シスプラチン、マイトマイシン、パクリタ
キセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、及びＣＰＴ−ＩＩ（カンプトセシ
ン）である。

【００１３】 酒石酸ビノレルビンは、３’、４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−Ｃ’−ノ
ルビンカロイコブラスチン［Ｒ−（Ｒ^＊、Ｒ^＊）−２，３−ジヒドロキシブタン
ジオエート（１：２）（塩）］という化学名を有する半合成ビンカアルカロイド
である。酒石酸ビノレルビンは、シスプラチンのような他の化学療法剤と組み合
わせて、又は単独の薬剤として、様々な充実性腫瘍、とりわけ、非小細胞肺癌、
進行乳癌、及びホルモン難治性の前立腺癌の治療に用いられる。北米とヨーロッ
パでは商品名ナベルビン（Ｒ）（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）が用いられている。ナベ
ルビン（Ｒ）は、典型的には、週単位で、２０〜３０ｍｇ／ｍ^２の用量で単一の
薬剤として、又は併用療法において静脈内投与される。ビノレルビンの経口製剤
が臨床開発段階にある。

【００１４】 シスプラチンは、化学名シス−ジアミンジクロロプラチナを有する。シスプラ
チンは、進行膀胱癌に単一の薬剤として使用される他、併用療法として転移性精
巣癌の治療に、転移性卵巣癌において単独及び併用療法として使用される。シス
プラチンは、プラチノール（Ｒ）及びプラチノール−ＡＱ（Ｒ）の商品名でブリ
ストルマイヤーズスクイブによって製造されている。シスプラチンは、典型的に
は併用療法で、以下の種類の癌、非小細胞及び小細胞肺癌、頭部及び頸部の癌、
子宮内膜癌、子宮頸癌、並びに非ホジキンリンパ腫にも使用される。シスプラチ
ンは、典型的には、３〜４週毎に１度、１５〜１５０ｍｇ／ｍ^２の用量で、又は
３又は４週毎に５日間毎日続けて静脈内投与される。しかしながら、より大量且
つ高頻度で投薬されることもあり、動脈内又は腹腔内のような静脈内以外の投与
経路もあり得る。

【００１５】 カルボプラチンは、化学名白金、ジアミン［１，１−シクロブタン−ジカルボ
キシラート（２）−０，０’］−（ＳＰ−４−２）を有する。カルボプラチンは
、通常、パクリタキセルやエトポシドのような他の細胞傷害性物質と組み合わせ
て投与される。カルボプラチンは、進行卵巣癌、非小細胞肺癌、及びシスプラチ
ンと同じ種類の多くの癌の治療に用いられる。ブリストルマイヤーズスクイブに
よって製造されているカルボプラチンの製品名はパラプラチン（Ｒ）（Ｐａｒａ
ｐｌａｔｉｎｅ）である。カルボプラチンは、典型的には、３００〜４００ｍｇ
／ｍ^２で静脈内投与されるか、あるいは、患者の推定糸球体濾過速度（ＧＦＲ）
を用いて、４〜６ｍｇ／ｍＬ・分の標的濃度曲線下面積（ＡＵＣ）になるように
静脈内投与される。約１６００ｍｇ／ｍ^２を超えない、さらに多量のカルボプラ
チンを数日、一般的には５日にわたって、分割投与してもよい。

【００１６】 パクリタキセルは、化学名（２Ｒ、３Ｓ）−Ｎ−ベンゾイル−３−フェニルイ
ソセリンとの５β、２０エポキシ−１，２α−４，７β，１０β，１３α−ヘキ
サヒドロキタックス−１１−エン−９−オン４，１０−ジアセテート２−ベンゾ
エート１３−エステルを有する。パクリタキセルは、タクソール（Ｒ）としてブ
リストルマイヤーズスクイブによって製造されている。パクリタキセルは、卵巣
癌、乳癌、非小細胞肺癌、頭部及び頸部の癌を含む様々な癌腫を治療するために
使用されている。典型的な用量には、３又は４週毎に、３又は２４時間の静脈内
注入として１３５〜１７５ｍｇ／ｍ^２を与えることが含まれる。約３００ｍｇ／
ｍ^２を超えない、より多い用量も投与されている。

【００１７】 活性成分の他に、製薬業者が製造する医薬品は、典型的には、例えばパクリタ
キセルを可溶性にするために添加されるクレモホール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ビ
ヒクルのような更なる賦形剤とともに、無菌水、５％ブドウ糖水、又は０．９％
塩化ナトリウム水のような希釈剤を含有する。

【００１８】 治療計画、投薬量、及び組成等に関するより詳細な情報は、Ｍａｒｔｉｎｄａ
ｌｅ， Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ， ３１ｓｔ ｅｄ
ｉｔｉｏｎ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＪＥＦ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｌｏｎｄｏ
ｎ， Ｒｏｙａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １９９
６ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，
４９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９５， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉ
ｃｓ Ｄａｔａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｍｏｎｔｖａｌｅ
などの標準的な参考図書から取得することができる。

【００１９】 細胞をＧ_２／Ｍに蓄積せしめ得る他の化学療法剤には、アントラサイクリン類
、例えば、ドキソルビシン及びアクラルビシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、カ
ンプトセシン、９−ニトロカンプトセシン、シクロホスファミド及びその誘導体
、ドセタキセル、エトポシド、ラゾキサン（ＩＣＲＦ−１８７）、アルキルリゾ
リン脂質、例えばイルモフォシン、メトトレキサート、ＭＳＴ−１６、タキサン
類（ｔａｘａｎｅｓ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、並びにテニポシド（
ＶＭ−２６）（同じくＭａｒｔｉｎｄａｌｅ， Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｐｏｅｉａ， ３１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊ
ＥＦ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｒｏｙａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １９９６を参照）、並びにフラボノイド類、例
えばアピゲニン及びゲニステイン（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ， １２ｔ
ｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ， Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ Ｉｎｃ，１９９６参照）が含まれる。さら
に、アドゼレシン（ピラゾール化合物の一種）（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ １９９２、Ｏｃｔｏｂｅｒ １５；５２（２）５６８７−５６９２）)、ビ
ストラテンＡ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９６， Ｍａｒｃｈ
１；３６７ （３）：１６９−１７５）、シクロキサゾリン（Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９９４；３３（５）
：３９９−４０９）、イミダゾアクリジノン、メレファン（ｍｅｌｅｐｈａｎ）
（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８６；５４（３
）：１３８〜１４８ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １９９５， Ｊｕｌ １７；６２（２）：１７０−１７５
）、メルバロン（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ １９９７；２９（１）：１６−２７、及びＣａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９５， Ａｐｒ １；５５（７）：１５０９−１５１６
）、及びオラシン（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９７， Ｊａｎ ２；４０
０（１）：１２７−１３０）も細胞をＧ_２／Ｍに蓄積させると考えられている。
一般的に、全てのトポＩＩ阻害剤、例えばポテカン（ｐｏｔｅｃａｎ）（ａｂｐ
ｉ，１９９８−１９９９）、全てのビンカ誘導体、及び放射線を含む全てのＤＮ
Ａ損傷因子も細胞をＧ_２／Ｍに停止させると考えられている。

【００２０】 さらに、５ＦＵは、細胞をＧ_２／Ｍに停止させると報告されており（Ｏｎｃｏ
ｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９４； ６（７）：３０３−３０９）、従っ
て、５ＦＵ及びＵＦＴ、メトトレキサート、カペシタビン、及びゲンシタビン（
Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）のような５ＦＵ類似の化合物は、ある種の組織でＥｐ
−Ｃａｍの発現を増加させるであろうと考えられている。同様に、細胞をＳ期に
停止させることが知られているトムデックス（ラロキシフェン；Ｒａｌｏｘｉｆ
ｅｎ）は、Ｅｐ−Ｃａｍの発現を増加させると考えられている。

【００２１】 それ故、「化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」
という用語は、本明細書を通じて、細胞傷害性療法（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔｈ
ｅｒａｐｙ）に限定されず、細胞静止療法（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ｔｈｅｒａ
ｐｙ）や細胞をＧ_２／Ｍに停止させる他の任意の薬物も包含する。さらに、放射
線療法が細胞をＧ_２／Ｍに停止させ得ること、従って、本明細書を通じて化学療
法という用語は、「放射線療法」で置換し得るということにも留意しなければな
らない。

【００２２】 本明細書を通じて、化学療法剤という語には、ＥｐＣＡＭを発現している腫瘍
細胞をＧ_２／Ｍに停止させる１以上の特異的な化学療法剤の組合せも含まれる。
典型的な組合せの例は、ビノレルビンとシスプラチン及びパクリタキセルとカル
ボプラチン、オキサリプラチンと５ＦＵ、シクロホスファミドとメトトレキサー
ト及び５ＦＵ、シクロホスファミドとドキソルビシン及び５ＦＵである。

【００２３】 前記化学療法剤は単独で投与することも可能であるが、許容される担体ととも
に、上記のような活性成分を含む薬学的組成物として与えることが好ましい。各
担体は、前記組成物の他の成分と適合的（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であり、且つ
レシピエントに対して有害でないという意味で、「許容される」ものでなければ
ならない。

【００２４】 Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発現している細胞をＳ又はＧ_２／Ｍに停止させることがで
きる化学療法剤とＥｐ−Ｃａｍ抗体との好ましい組合せは、以下の化学療法剤：
ＵＦＴ、カペシタビン、ＣＰＴ−ＩＩ、オキサリプラチン、５ＦＵ、５ＦＵ連続
注入、パクリタキセル、ドセタキセル、シクロホスファミド、メトトレキサート
、ドキソルビシン、ナベルビン（静脈内及び経口）、エピルビシン、ミトキサン
トロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ラロキシフェン、シスプラチン、マイト
マイシン、カルボプラチナ（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、ゲンシタビン（Ｇ
ｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、及びトポテカン
（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）のうちの何れかとパノレックスとの組合せである。

【００２５】 特に好ましい組合せは、ＣＰＴ−ＩＩ、５ＦＵ（連続注入）、オキサリプラチ
ン、カペシチビン（Ｃａｐｅｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ＵＦＴ、及びトムデックス（
ラロキシフェン）とパノレックスとの組合せである。

【００２６】 これらのパノレックスの組合せは、癌の治療、とりわけ、結腸直腸癌、乳癌、
胃癌、前立腺癌、及び非小細胞肺癌の治療に有用である。

【００２７】 具体的には、以下の組合せ：パノレックスとＵＦＴ（必要に応じて、ロイコボ
リンとともに）、カペシタビン、オキサリプラチン（必要に応じて、５ＦＵとと
もに）、ＣＰＴ−ＩＩ、５−ＦＵ（必要に応じて、エニルウラシル（Ｅｎｉｌｕ
ｒａｃｉｌ）、又はレバミソール、又はロイコボリンとともに）組合せ、５ＦＵ
の保護された（ｐｒｏｔａｃｔｅｄ）連続注入、及びマイトマイシンとパノレッ
クスとの組合せが結腸直腸癌には特に好適である。

【００２８】 乳癌の治療に好ましい組合せは、パクリタキセル、ドセタキセル、シクロホス
ファミド（必要に応じて、５ＦＵとメトトレキサート又はドキソルビシンの何れ
かとともに）、ナベルビン（静脈内及び／又は経口）、ドキソルビシン、エピル
ビシン、ミトキサントロン、及びラロキシフィンとパノレックスとの組合せであ
る。

【００２９】 胃癌の治療に好ましい組合せは、シスプラチン、５ＦＵ、マイトマイシン、及
びカルボプラチナとパノレックスとの組合せである。

【００３０】 前立腺癌の治療に好ましい組合せは、ミトキサントロンとパノレックスとの組
合せである。

【００３１】 非小細胞肺癌の治療に好ましい組合せは、ナベルビン、シスプラチン、カルボ
プラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲンシタビン、トポテカン、及びエ
トポシドとパノレックスとの組合せである。

【００３２】 パノレックス及びパノレックスと組み合わせて与えられる上記化学療法剤の用
量に関する情報は、ＡＢＰＩ、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｄａｔａ Ｓｈｅ
ｅｔｓ ａｎｄ Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｓｔｉｃｓ、Ｄａｔａｐｈａｒｍ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｌｉｍｉ
ｔｅｄ， １９９８−１９９９のような標準的な参考図書に記載されているであ
ろう。

【００３３】 前記組成物には、経口、直腸、経鼻、局所（口腔及び舌下を含む）、膣、非経
口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内を含む）、又は経皮投与に適した組成物が含ま
れる。前記組成物は、適宜、単位投薬形態で与えることができ、薬学の分野で周
知である任意の方法によって調製し得る。このような方法は、１以上の補助成分
を構成する担体に活性成分を混合する工程を含む。一般的に、前記組成物は、活
性成分を、液状担体若しくは細かく砕かれた固体担体又は両者と均一に、よく混
ぜ合わせることによって調製した後、必要であれば、製品を成形する。

【００３４】 経口投与に適した化学療法剤の組成物は、所定量の活性成分を含有するカプセ
ル、小袋（ｃａｃｈｅｔ）、若しくは錠剤のような分離された単位として、粉末
若しくは顆粒として、水性若しくは非水性の液体中の溶液若しくは懸濁液として
、又は水中油液体エマルジョン若しくは油中水液体エマルジョンとして与えても
よい。前記活性成分は、丸薬、舐剤、又はペーストとして与えることもできる。

【００３５】 錠剤は、必要に応じて、１以上の補助成分とともに、圧縮又は成形によって作
製し得る。圧縮された錠剤は、適切な機械中で、必要に応じて、結合剤（例えば
、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活
性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポ
ビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、又は分散
剤を混合して、粉末又は顆粒のような流動性の形態に活性成分を圧縮することに
よって調製し得る。成形された錠剤は、適切な機械中で、不活性な液体希釈剤で
湿らせた粉末化合物の混合物を成形することによって作製し得る。前記錠剤は、
必要に応じて、被覆し、又は刻み目を付けてもよく、例えば、所望の放出プロフ
ィールを与えるために様々な比率でヒドロキシプロピルメチルセルロースを用い
て、その中の活性成分を徐放させ、又は制御しながら放出するように調合しても
よい。錠剤には、必要に応じて、胃以外の消化器の一部で放出されるように、腸
溶コーティングを施してもよい。

【００３６】 経口に使用するのに適した組成物は、上述のように、胃の酸性を中和するよう
にデザインされた緩衝剤を含んでもよい。このような緩衝液には、それらの共役
塩と混合された弱酸又は弱塩基のような様々な有機又は無機物から選択し得る。

【００３７】 口に局所投与するのに適した組成物には、芳香性基剤（通常、ショ糖、及びア
カシア、又はトラガカント）の中に活性成分を含むトローチ剤、ゼラチンとグリ
セリン、又はショ糖とアカシアのような不活性基剤中に活性成分を含む香錠（ｐ
ａｓｔｉｌｌｅ）、並びに適切な担体中に活性成分を含む洗口剤（ｍｏｕｔｈｗ
ａｓｈ）が含まれる。

【００３８】 直腸投与用の組成物は、例えば、ココアバター又はサリチル酸塩（ｓａｌｉｃ
ｙｌａｔｅ）を含む適切な基剤を有する座剤として与え得る。

【００３９】 膣内投与に適した組成物は、活性成分に加えて、本分野において適切であるこ
とが周知である担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペース
ト、フォーム（ｆｏａｍ）、又はスプレー製剤として与え得る。

【００４０】 非経口投与に適した組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、前記組成物を対
象レシピエントの血液と等張にする溶質、及び前記化合物を血液成分又は１以上
の臓器に標的化するようにデザインされたリポソーム又は他の微粒子系のような
、懸濁剤及び濃縮剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液を含有し得る水性及び
非水性等張無菌注射溶液が含まれる。前記組成物は、単位用量又は複数回用量が
封入された容器、例えば、アンプル及びバイアルの中に入れることができ、使用
直前に、無菌液体担体、例えば、注射水を添加するだけでよい凍結乾燥（ｆｒｅ
ｚｚｅ−ｄｒｉｅｄ／ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）条件で保存し得る。即時注射溶
液及び懸濁液は、前述した種類の無菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製し得る。

【００４１】 経皮投与に適した組成物は、より長時間にわたってレシピエントの表皮と密接
した状態を保つのに適した分離したパッチとして与え得る。このようなパッチは
、適切には、例えば、前記化合物に関して０．１〜０．２Ｍの濃度の、必要に応
じて緩衝化された水溶液として、前記活性成分を含有する。１つの可能性として
は、前記活性成分は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３
（６），３１８ （１９８６）に概説されているようなイオントフォレーシス
によって前記パッチから輸送され得る。

【００４２】 特に上記した前記成分に加え、当該組成物、例えば、経口投与に適した組成物
は、甘味剤、濃縮剤、及び香料のような物質をさらに含んでもよいことを理解し
なければならない。

【００４３】 前記抗体と同時投与すべき前記化学療法剤の投薬範囲は、典型的には、使用す
る化学療法剤に応じて、（患者の体表面積に基づき）約１〜１０００ｍｇ／ｍ^２ の間、又は（患者の体重に基づき）約２〜３０ｍｇ／ｋｇであり得る。このため
、例えば、ビノレルビン（ナベルビン）は、典型的には、約２０〜３０ｍｇ／ｍ ^２ の投薬量で、シスプラチンは約１５〜１００ｍｇ／ｍ^２で、カルボプラチンは
約３００〜６００ｍｇ／ｍ^２で、パクリタキセルは約１００〜３００ｍｇ／ｍ^２ で、好ましくは約１３５〜１７５ｍｇ／ｍ^２で投与されるであろう。投薬量を表
す別の方法は、それらのＡＵＣ値である。例えば、カルボプラチンは、典型的に
は、ＡＵＣ＝４〜６ｍｇ／ｍＬ・分と計算される用量で投与されるであろう。一
般的には、他の化学療法剤及び／又は抗体と組み合わせたときには、単一の化学
療法剤として単独で与えたときに比べて化学療法剤の用量は低くなる。抗Ｅｐ−
ＣＡＭ抗体と同時投与され得る化学療法剤の用量は、治療される癌腫の種類に対
して標準的な用量か、これよりも少ない用量となるものと思われる。一般的に、
許容される最大量の化学療法剤を単独で、又は組み合わせて投与する。

【００４４】 本発明の抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体は、好ましくは、天然の抗体又はその断片の構造
を有する。抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって互いに連結された２
本の重鎖と２本の軽鎖を有する。各軽鎖は、ジスルフィド結合によってそれぞれ
の重鎖と連結されている。各重鎖は、その後に多数の定常ドメインが続く可変ド
メインを一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメインを有し、他端に定常ドメ
インを有する。軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと併置されている。軽
鎖定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと併置されている。軽鎖及び重鎖
中の定常ドメインは、抗原への抗体の結合には直接関与していない。

【００４５】 各軽鎖及び重鎖の対の可変領域は抗原結合部位を形成する。軽鎖と重鎖上のド
メインは同一の一般的構造を有しており、各ドメインは、３つの相補性決定領域
（ＣＤＲ）が接続され、比較的配列が保存されている４つの領域のフレームワー
クを備えている。前記４つのフレームワーク領域の大部分はβシートコンフォメ
ーションを採っており、ＣＤＲはβシート構造を接続するループを形成し、場合
によってはβシート構造の一部を成す。ＣＤＲは、フレームワーク領域によって
近接した位置に保持されており、他のドメインのＣＤＲとともに、抗原結合部位
の形成（本発明の場合には、抗Ｅｐ−ＣＡＭ結合部位の形成である）に寄与して
いる。抗体のＣＤＲとフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔら（”Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅ
ｒｅｓｔ” ＵＳ Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓ
ｅｒｖｉｃｅｓ， ＵＳ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉ
ｃｅ， １９８７）を参照することによって決定し得る。

【００４６】 ＣＤＲが抗体の可変ドメインのフレームワークとは異なる種に由来する抗体の
作製はＥＰ−Ａ−０２３９４００に開示されている。ＣＤＲは、齧歯類又は霊長
類のモノクローナル抗体に由来するものであり得る。このような改変された抗体
の可変ドメイン及び定常ドメインのフレームワークは、通常、ヒトの抗体に由来
する。このようなヒト化抗体は、齧歯類由来の抗体のような完全な外来抗体に対
してヒトが示す免疫反応と比べて、ヒトに投与したときに大きな免疫反応を惹起
しないはずである。

【００４７】 前記抗体は、好ましくは、天然抗体又はその断片の構造を有する。従って、本明
細書を通じて、抗体という用語には、完全な抗体のみならず、（Ｆａｂ’）２断
片、Ｆａｂ断片、軽鎖二量体又は重鎖二量体のような断片も含まれる。前記抗体
は、放射線核種、酵素などの他の分子に接合され得るものを含むＩｇＧ_１、Ｉｇ
Ｇ_２、ＩｇＧ_３、若しくはＩｇＧ_４、又はＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、若しくはＩ
ｇＤ、又は修飾されたその変種のようなＩｇＧであり得る。典型的には、前記定
常領域は、必要とされる機能性に応じて選択される。通常、ＩｇＧ１は補体への
結合を通じて溶解能を示し、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）を媒介する
であろう。非細胞傷害性抗体が必要であれば、ＩｇＧ_４抗体が好ましいであろう
。本発明の抗体には、例えば、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５８：３９６５−３９７０に開
示されている１７−１Ａ抗体のような二重特異性抗体も含まれる。本発明の抗体
は、マウス、キメラ、又はヒト化抗体であり得、好ましい抗体はヒト化抗体であ
る。

【００４８】 モノクローナル抗体をヒト化するには、４つの一般的な工程が存在する。これ
らは、 （１）初発抗体の軽及び重可変ドメインのヌクレオチド配列と予想されるアミ
ノ酸配列を決定すること、 （２）ヒト化抗体をデザインすること（すなわち、ヒト化工程中に何れの抗体
フレームワーク領域を使用するか決定する） （３）実際のヒト化手法／技術、及び （４）ヒト化抗体のトランスフェクションと発現 である。

【００４９】 より具体的には、 工程Ｉ：抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列と予想されるア
ミノ酸配列を決定する 抗体をヒト化するためには、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列
を知る必要があるだけである。定常ドメインの配列は、再構築戦略に寄与しない
ので無関係である。抗体の可変ドメインのアミノ酸配列を決定する最も簡易な方
法は、重及び軽可変ドメインをコードするクローン化されたｃＤＮＡから決定す
ることである。

【００５０】 ある抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインのｃＤＮＡをクローニングする一般的な
方法としては、（１）慣用されているｃＤＮＡライブラリ−からクローニングす
る、又は（２）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングするとい
う２つの方法が存在する。これらの方法は何れも広く知られている。ｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列が得られれば、この情報を抗体可変ドメインの予想アミノ酸配
列に翻訳するのは容易なことである。

【００５１】 工程２：ヒト化抗体をデザインする ヒト化において、ヒト抗体の何れの配列を用いるかを決定する上で考慮すべき
要素が幾つか存在する。軽鎖及び重鎖のヒト化は、互いに独立して考察されるが
、基本的に、理屈は互いに同様である。

【００５２】 この選択過程は、以下の論拠、すなわちある抗体の抗原特異性と親和性は、主
として、可変領域であるＣＤＲのアミノ酸配列によって決定されるということに
基づいている。可変ドメインフレームワークの残基は、殆ど又は全く直接的な寄
与をしていない。フレームワーク領域の主な機能は、抗原を認識するのに適切な
空間位置にＣＤＲを固定することである。従って、ヒトの可変ドメインのフレー
ムワークが、ＣＤＲが由来した齧歯類の可変ドメインと極めて相同的であれば、
齧歯類のＣＤＲをヒトの可変ドメインへのフレームワークに置換したときに正し
い空間配置に保持される可能性が最も高いと思われる。従って、ヒトの可変ドメ
インは、好ましくは、齧歯類の可変ドメインと極めて相同的であるように選択す
べきである。適切なヒト抗体可変ドメインの配列は、以下のように選択すること
ができる。

【００５３】 １．コンピュータープログラムを用いて、入手可能な全てのタンパク質（及び
ＤＮＡ）データベースから、齧歯類抗体の可変ドメインと最も相同的であるヒト
抗体可変ドメインの配列を検索する。適切なプログラムの出力は、齧歯類の抗体
と最も相同的な配列、各配列のパーセント相同性、及び各配列と齧歯類配列との
アラインメントのリストである。これは、重鎖と軽鎖可変ドメインの両配列に対
して独立に行われる。ヒト免疫グロブリン配列のみが含まれていれば、上記解析
はさらに容易に為される。

【００５４】 ２．ヒト抗体可変ドメインの配列を表にして相同性を比較する。極めて可変的
である重鎖のＣＤＲ３を除き、この比較は、主として、ＣＤＲの長さに対して行
う。ヒトの重鎖とκ及びλ軽鎖は、重鎖−３つのサブグループ、κ鎖−４つのサ
ブグループ、λ鎖−６つのサブグループというサブグループに分けられる。各サ
ブグループ内のＣＤＲサイズは似ているが、サブグループ間で異なる。通常、齧
歯類抗体のＣＤＲは、最初に得られた相同性の近似の結果、ヒトのサブグループ
のうちの１つに合致し得る。続いて、特にＣＤＲ内とその周囲のフレームワーク
領域に存在する同じような長さのＣＤＲを有する抗体のアミノ酸配列の相同性を
比較する。最も相同的であるヒトの可変ドメインを、ヒト化用のフレームワーク
として選択する。

【００５５】 工程３：実際のヒト化手法／技術 ＥＰ−Ａ−０２３９４００（Ｐ．Ｔ． Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２１：５２２ （１９８６）； Ｌ． Ｒｅｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ
， Ｎａｔｕｒｅ ３３２ ：３２３（１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ Ｍ
． ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ （１９８８） ａｎｄ
Ｊ． Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ， １５５ ：９２５−９３７（１９９５）も参照）に従って、所
望のＣＤＲをヒトのフレームワークに移植することによって、抗体をヒト化し得
る。従って、ＣＤＲの再構築を所望しているヒトＤＮＡから開始して、所望の再
構築された抗体をコードするＤＮＡ配列を作製することができる。所望のＣＤＲ
を含有する齧歯類の可変ドメインのアミノ酸配列を、選択したヒト抗体の可変ド
メイン配列のアミノ酸配列と比較する。ヒトの可変領域に齧歯類のＣＤＲを取り
込ませるために、齧歯類中の対応する残基に取り替える必要があるヒト可変ドメ
イン中の残基をマークする。ヒトの配列と置換、付加、又は欠失する必要がある
残基も存在するかもしれない。

【００５６】 所望の残基を含有するようにヒトの可変ドメインのフレームワークを変異させ
るために使用することができるオリゴヌクレオチドを合成する。このオリゴヌク
レオチドは、都合の適宜なサイズであり得る。通常は、利用できる合成機の能力
によって、長さに制限が存在するにすぎない。オリゴヌクレオチドに対してイン
ビトロで突然変異を導入する方法は周知である。

【００５７】 あるいは、ＷＯ９２／０７０７５の組換えポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手
法を用いて、ヒト化を行ってもよい。この手法を用いれば、ＣＤＲをヒト抗体の
フレームワーク領域の間にスプライシングし得る。

【００５８】 一般的に、Ｗ０９２／０７０７５の技術は、ＡＢとＣＤ及びそれらの間（ドナ
ーＣＤＲによって置換すべきＣＤＲ）という２つのヒトのフレームワーク領域を
備えたテンプレートを用いて実施することができる。フレームワーク領域ＡＢを
増幅するためにはプライマーＡとＢを使用し、フレームワーク領域ＣＤを増幅す
るためにはプライマーＣとＤを使用する。しかしながら、プライマーＢとＣは、
それぞれ、５’末端に、ドナーＣＤＲ配列の全部又は少なくとも一部に対応する
付加的配列も含有する。プライマーＢとＣは、ＰＣＲの実施が可能な条件下で、
それらの５’末端を互いにアニーリングさせるのに十分な長さだけ重複している
。このため、増幅された領域ＡＢとＣＤは、重複的伸長によって遺伝子スプライ
シングを行って、単一の反応でヒト化産物を与え得る。

【００５９】 工程４：再構築された抗体のトランスフェクションと発現 抗体を再構築するための突然変異導入反応に続いて、軽鎖又は重鎖定常領域を
コードする適切なＤＮＡに変異導入が導入されたＤＮＡを連結し、発現ベクター
中にクローン化し、宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞中にトランスフェクトする
ことができる。これらの工程は、ごく一般的な様式で実施し得る。

【００６０】 再構築された抗体は、 （ａ）少なくとも、Ｉｇ重鎖又は軽鎖の可変ドメイン、ヒト抗体のフレームワ
ーク領域を有する可変ドメイン、及び本発明のヒト化抗体に必要とされるＣＤＲ
をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結された適切なプロモーターを含む第１
の複製可能な発現ベクターを調製することと、 （ｂ）少なくとも、それぞれ相補的なＩｇ軽鎖又は重鎖の可変ドメインをコー
ドするＤＮＡ配列に作用可能に連結された適切なプロモーターを含む第２の複製
可能な発現ベクターを調製することと、 （ｃ）前記第１のベクター又は調製した両ベクターにより細胞株を形質転換す
ることと、 （ｄ）前記形質転換された細胞株を培養して前記改変された抗体を産生させる
ことと を備えた方法によって調製し得る。

【００６１】 好ましくは、工程（ａ）のＤＮＡ配列は、ヒト抗体鎖の可変ドメイン及び／又
は各定常ドメインの両者をコードする。前記ヒト化抗体は回収し、精製すること
ができる。改変された抗体を産生させるために形質転換される細胞株は、チャイ
ニーズハムスター卵細胞（ＣＨＯ）細胞株、又は、有利には、ミエローマ、ハイ
ブリドーマ、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）、又はクアドローマ細胞株のようなリ
ンパ系由来である不死化した哺乳類細胞株であり得る。前記細胞株には、エプス
タインバールウイルスのようなウイルスで形質転換されることにより不死化した
Ｂ細胞などの通常のリンパ系細胞も含まれ得る。最も好ましくは、前記不死化し
た細胞株は、ミエローマ細胞株又はその誘導体である。特に適した発現系は、Ｗ
０８７／００４６２（Ｐ．Ｅ． Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １７：７１１０（１９８９）及びＣ．Ｒ． Ｂｅｂ
ｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９
（１９９２）も参照）に記載されているグルタミンシンテターゼ発現系である。

【００６２】 ヒト化抗体を産生させるために用いる細胞株は哺乳類細胞株であることが好ま
しいが、細菌の細胞株又は酵母の細胞株のような他の任意の適切な細胞株を代用
してもよい。一本抗体鎖に対しては、大腸菌由来の細菌株を使用し得ると予想さ
れる。得られた抗体は機能性についてチェックする。機能性が失われていれば、
工程（２）に戻って、抗体のフレームワークを改変する必要がある。

【００６３】 発現された時点で、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフ
ィー、ゲル電気泳動など（Ｓｃｏｐｅｓ， Ｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．（１９８２）
全般を参照）を含む本分野の標準的な手法に従って、本発明の完全な抗体、それ
らの二量体、各軽鎖及び重鎖、又はその他の免疫グロブリン形態を精製すること
ができる。医薬品に使用するには、少なくとも約９０〜９５％の均一性を有する
実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％以上の均一性が最も好
ましい。所望により部分的に又は均一になるまで精製されれば、抗体を治療に使
用してもよい。

【００６４】 抗体は、典型的には、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、活性成分として
、本発明の抗体とを含む薬学的組成物として提供される。前記抗体とその薬学的
組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、又は静脈内投与に特に有用で
ある。

【００６５】 非経口投与用の組成物は、通常、抗体又は許容される担体、好ましくは水性担
体中に溶解されたそのカクテルの溶液を含むであろう。様々な水性担体、例えば
、注射用の滅菌水、０．９％の塩化ナトリウム水、５％のブドウ糖水、及び乳酸
加リンガー液を使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般的には
、粒状物が存在しない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌
し得る。前記組成物は、ｐＨ調整剤や緩衝剤、毒性調整剤等の生理的な条件を近
似するのに必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム
、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有
し得る。これらの製剤中での抗体の濃度は大きく変わり得るものであり（例えば
、約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％から１５又
は２０重量％まで）、選択した投与様式に従い、主として液体の容量、粘度など
に基づいて選択されるであろう。

【００６６】 このため、典型的な筋肉内注射用の薬学的組成物は、１ｍＬの緩衝化された無
菌水と５０ｍｇの抗体を含有するように作製し得る。静脈内注入用の典型的な組
成物は、２５０ｍＬの無菌リンガー溶液と１５０ｍｇの抗体を含有するように作
製し得る。非経口的に投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者、とり
わけ非経口製品の調製に習熟した者には公知又は自明であり、例えば、Ｒｅｍｍ
ｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５ｔ
ｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔ
ｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ （１９９０）に、より詳しく記載されてい
る。

【００６７】 本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適切な容器中で元の状態
に戻すことができる。この技術は、従来の免疫グロブリンを用いて有効であるこ
とが示されている。任意の適切な凍結乾燥及び再構成技術を使用することができ
る。当業者であれば、凍結乾燥と再構成は様々な程度の抗体活性の喪失をもたら
し（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体に比べて、よ
り大きな活性の喪失をもたらす傾向がある）、使用レベルを調整して補償する必
要があるかもしれないことを理解できよう。

【００６８】 本発明の抗体の投薬範囲は、約０．５〜１０００ｍｇ／ｍ^２、好ましくは約０
．５〜２５０ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは０．５ｍｇ／ｍ^２と１００ｍｇ／ｍ^２ 及び０．５ｍｇ／ｍ^２と５０ｍｇ／ｍ^２の間であり、最も好ましくは、例えば１
５ｍｇ／ｍ^２のように５ｍｇ／ｍ^２と２５ｍｇ／ｍ^２の間である。

【００６９】 同様に、投薬当たりのｍｇで表すと、抗体の投薬量は約１〜２０００ｍｇ／投
薬、好ましくは約１〜５００ｍｇ／投薬、より好ましくは１〜２００ｍｇ／投薬
、及び１〜１００ｍｇ／投薬、最も好ましくは、例えば３０ｍｇ／投薬のような
１０ｍｇ／投薬と５０ｍｇ／投薬の間である。

【００７０】 投薬レベルとパターンを治療する医師が選択して、前記組成物を単回又は複数
回投与することができる。何れにしろ、前記薬学的製剤は患者を有効に治療する
のに十分な量の抗体を与えるべきである。

【００７１】 典型的には、前記化学療法剤と抗体は、同時投与するための別個の薬学的組成
物として与えられるが、単一の薬学的製剤として処方してもよい。このように、
抗体と化学療法剤はともに、１つの同じ組成物内から患者に与えられる。

【００７２】 本発明の全ての側面において、１以上の異なる化学療法剤と１以上の抗ＥｐＣ
ＡＭ抗体を同時投与し得る。従って、化学療法剤という語は、１以上の異なる化
学療法剤を包含する。２以上の化学療法剤が存在する場合、それぞれ単独で各別
に投与するか、及び／又は化学療法剤のカクテルとして同時に投与し得る。同様
に、抗体という語は、１以上の異なる抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体を包含する。２以上の
抗体が存在する場合には、同じく、それぞれ単独で各別に及び／又はカクテルと
して投与し得る。さらに、化学療法剤は、典型的には、抗体とは別個に投与され
るが、化学療法剤／抗体カクテルとして同時に投与してもよい。

【００７３】 化学療法剤／放射線療法と抗体との同時投与には、化学療法剤／放射線療法と
抗体の両者を実質的に同時に投与することも含まれる。本来、同時投与の基礎を
成す理論は、Ｇ_２／Ｍで細胞周期の進行を停止させることが知られている化学療
法剤／放射線療法に、Ｅｐ−ＣＡＭを発現している腫瘍細胞を十分暴露させて、
前記腫瘍細胞が抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体に暴露される前に、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原の密度
を望みどおりに増加させることにより、Ｅｐ−ＣＡＭを発現している腫瘍への抗
Ｅｐ−ＣＡＭ抗体のターゲッティングを増大させることにある。従って、同時投
与には、かかる結果を与えると思われる抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体と化学療法剤／放射
線療法を組み合わせた任意の投与様式が含まれる。本明細書を通じて、「化学療
法剤と抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体との組合せ」という用語は、化学療法剤／放射線療法
と抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体が同時投与される組合せを意味する。

【００７４】 好ましくは、前記化学療法剤は前記抗体と同時に投与され、より好ましくは前
記抗体の前に投与される。このため、前記化学療法剤は同じ日に前記抗体と投与
してもよいし、同時又は相互に数時間内の何れかにより投与してもよいが、約２
ヶ月前までに、典型的には約１又は２週前に、より典型的には１週前までに、す
なわち１〜３日前に投与することもできる。

【００７５】 さらに、同時投与には、１回以上化学療法剤を投薬してから数週以内に抗体を
２以上投薬することも含まれる。換言すれば、前記化学療法剤は、その後に抗体
を投与する毎に再投与する必要はなく、抗体治療中に一度だけ、又は間をおきな
がら投与してもよい。同時投与には、抗体から３週以内に、好ましくは１週以内
に、より好ましくは１〜５日のような数日内に前記化学療法剤を投与することも
含まれる。

【００７６】 前記抗体は１日に数回投与し得る。同様に、前記化学療法剤は、数時間、とき
には数日にわたって、連続的に注入し得る。

【００７７】 本発明は、癌に罹患した哺乳類の患者、好ましくはヒトを治療する方法であっ
て、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発現している細胞をＧ_２／Ｍに停止させることができる
化学療法剤と抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体を同時投与することを備えた方法も提供する。
好ましくは、前記化学療法剤は同時に与えられ、より好ましくは前記抗体の投与
に先立って与えられる。

【００７８】 該組合せ療法により特に有効に治療され得る癌は、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発現し
ている任意の組織学的又は組織発生学的な起源の原発又は転移癌である。これに
は、例えば、前立腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、及び卵巣癌が含まれる。

【００７９】 本発明の治療法の投薬スケジュールは、患者の特徴、病状、化学療法剤の特徴
、及び抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体の特徴に合わせて調整し得る。本発明における投薬ス
ケジュールの最終目標は、細胞周期の進行をＧ_２／Ｍで停止させることが知られ
ている化学療法への暴露によって抗原の発現が増加していると思われる時点で、
Ｅｐ−ＣＡＭを発現している腫瘍細胞が抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体に暴露されるように
抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体を投与することであろう。さらに、できる限り、患者にとっ
て都合のよい投薬スケジュールを維持しなければならない。

【００８０】 抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体と化学療法を投与する好ましい投薬スケジュールには、必
要とされる間、１若しくは２週毎に１度、好ましくは３若しくは４週毎に１度、
又はそれらの組合せで、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体を投与することが含まれる。前記化
学療法剤は、当該薬剤について確立された投薬法に従って、又はＧ_２／Ｍで停止
すべきＥＰ−ＣＡＭを発現している腫瘍細胞の暴露を可能とする投薬法に従って
与えられる。好ましい投薬スケジュールは、化学療法剤と病状に応じて変わるが
、例えば、必要とされる間、３又は４週毎に継続して、週に１回、３若しくは４
週毎に１回、又は数日（例えば、３〜５）間毎日投薬することが含まれる。抗Ｅ
ｐ−ＣＡＭ抗体の投薬は、前記化学療法剤について上記したように、同じ日又は
異なる日に為し得る。毒性又は副作用を抑え、又は減少させるために、抗Ｅｐ−
ＣＡＭ抗体又は化学療法剤の何れかを用いて、投薬スケジュール又は投薬の強度
を調整してもよい。

【００８１】 例えば、ビノレルビン及びシスプラチンとヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）と
の同時投与に好ましい投薬スケジュールは、必要とされる間（但し、典型的には
３〜４週間）、週に１回、３０ｍｇ／ｍ^２の投与量で、ヒト化３２３／Ａ３（Ｉ
ｇＧ_１）を投与した後、必要とされる間、一週おきに３０ｍｇ／ｍ^２の用量で投
与することである。ビノレルビンは、２５ｍｇ／ｍ^２の投与量で、１、８、１５
、及び２２日目に投与される。シスプラチンは、第１日目に１００ｍｇ／ｍ^２の
用量で１回だけ投与される。その後、必要とされる間、２８日毎に、このビノレ
ルビン／シスプラチン投薬法を繰り返す。ビノレルビン、シスプラチン、及びヒ
ト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）は、約２〜３時間にわたって、第１日目に同時投
与することが好ましい。

【００８２】 好ましい投薬スケジュールの別の例は、パクリタキセル／カルボプラチンとヒ
ト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）の投与であり、３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）は上記
ビノレルビン／シスプラチンの例のように投与され、パクリタキセルとカルボプ
ラチンは、第１日目に、それぞれ２２５ｍｇ／ｍ^２とＡＵＣ＝６．０の用量で与
えられ、その後必要とされる間、２８日毎に投薬を繰り返す。この場合にも、パ
クリタキセル、カルボプラチン、及びヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）は、約２
〜３時間にわたって、第１日目に同時投与することが好ましい。

【００８３】 ナベルビン、シスプラチン、又はタクソールの何れかのみと３２３／Ａ３（Ｉ
ｇＧ_１）の組合せを含む他の好ましい投薬スケジュールでは、２つの抗癌剤の代
わりにただ１つの抗癌剤を用いた同様の投薬量と投与スケジュールが含まれるで
あろう。

【００８４】 好ましい抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体がパノレックスであるときには、抗体の投薬量は
、１０〜５００ｍｇ／投薬、好ましくは１００ｍｇ／投薬である。

【００８５】 本発明の更なる側面は、細胞をＧ_２／Ｍで停止させることができる化学療法剤
を抗Ｅｐ−ＣＡＭとともに患者に同時投与することによって、Ｅｐ−ＣＡＭを発
現している細胞への抗ＥＰ−ＣＡＭ抗体の抗体結合を増加させる方法である。本
発明に従って、Ｅｐ−ＣＡＭ抗体とともに化学療法剤を同時投与することによっ
て、抗体の結合を約２〜１０倍、好ましくは４倍超、より好ましくは６倍超、最
も好ましくは８倍超増加させることが可能である。

【００８６】

【実施例】

以下の例で本発明を説明する。

【００８７】 例１．細胞周期を通じて期によって変動するＰＣ−３前立腺癌細胞上のＥｐ−
ＣＡＭ抗原の発現 ＰＣ−３前立腺癌細胞の集団において、細胞周期のＧ_０／Ｇ_１期、Ｓ期、及び
Ｇ_２／Ｍ期の分布とＥｐ−ＣＡＭの発現を測定した。細胞を穏やかにトリプシン
処理し、培養フラスコから機械的に剥離させ、カルシウム及びマグネシウムを含
まず、ウシ血清アルブミン及びＮａＮ_３を含有するリン酸緩衝食塩水に再懸濁し
た。正確に２×１０^５個の細胞をＦＩＴＣ−３２３／Ａ３マウスＩｇＧ抗体又は
ＦＩＴＣ−マウスＩｇＧ（対照）で染色した。冷却したパラホルムアルデヒドで
細胞を固定した後、ＤＮＡ染色のためにＴｗｅｅｎ−２０で透過化処理した。細
胞のＤＮＡをヨウ化プロピジウムとＲＮａｓｅ Ａで染色した。４８８ｎｍのレ
ーザーを備えたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）上で、Ｃｅｌ
ｌ Ｆｉｔソフトウェアを用いてリストモードデータを得た。Ｃｅｌｌ Ｆｉｔ
上でＳＯＢＲモデリング（利用可能な場合、不可能な場合は人が評価を行った）
を用いて細胞周期の解析を行った。Ｗｉｎ Ｌｉｓｔ（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ）のヒストグラム分析を独立に用いて、３２３／Ａ３結合
によって検出されるＥｐ−ＣＡＭ抗原の発現を評価した。

【００８８】 図１は、Ｅｐ−ＣＡＭが細胞周期を通じて発現されているが、Ｇ_０／Ｇ_１期の
細胞（実線）よりも、Ｓ期（点線）及びＧ_２／Ｍ期（破線）の細胞の方が高密度
且つ均質に発現していることを示している。該発現パターンは、他の多くのヒト
の大腸、前立腺及び肺の腫瘍細胞株で報告されている。

【００８９】 例２．腺癌細胞上のＥｐ−ＣＡＭ抗原の発現の増加は細胞周期の進行の停止並
びにＳ期及びＧ_２／Ｍ期にある細胞の蓄積と相関していた 腺癌の細胞株を図２で示したように様々な薬剤及び薬剤の組合せに暴露した。
準集密的な細胞をナベルビン又はタクソールに２４時間以内暴露した後、洗浄し
、シスプラチン又はカルボプラチンにそれぞれ１晩暴露した。細胞を５ＦＵに２
４時間暴露し、インターフェロンに２〜５日暴露した。細胞を洗浄し、例１に記
載したように抗原の発現及び細胞周期の状態を解析する前に、更に２〜５日培養
した。フルオレセインを結合させた３２３／Ａ３の培養細胞への結合と較正した
微粒子標準への結合とを比較することにより抗原の発現を定量化した。

【００９０】 細胞周期の解析によって、ＮＶＢ＋ＣＤＤＰの３９．４％及びＴＡＸ＋ＣＰＢ
ＤＡ細胞の８２．６％と比較して（（図２に示されているように）何れの組合せ
もＥｐ−ＣＡＭ抗原の発現を著しく増加させた）、対照培地細胞はＳ期とＧ_２／
Ｍ期を合わせても６．３％にとどまることが示された。５ＦＵ、ＩＦＮ−α又は
ＩＦＮ−γに暴露した細胞では抗原の発現は有意に増加しなかった（それぞれ、
Ｓ＋Ｇ_２／Ｍ期にある細胞のわずか７．９％、１２％、１１．５％である）。従
って、Ｓ期又はＧ２／Ｍ期の細胞を蓄積させる薬剤のみがＥｐ−ＣＡＭ抗原の発
現を著しく増加させることが可能であった。

【００９１】 例２ａ． 上述のように、ナベルビン＋シスプラチン、又はタクソールとともに培養した
ＨＴ２９腺癌細胞と１５分間インキュベートした後にＥｐ−ＣＡＭ抗原に特異性
を有する、関連するマウスのモノクローナル抗体であるパノレックスの結合を測
定した。ナベルビン＋シスプラチンで処理した細胞上で著しい抗体結合の増加（
３４％）が見られた。すなわち、対照細胞の２１％に比べて、これらの細胞の８
２％がＳ期又はＧ_２／Ｍ期に停止していた（図３ａに示されているように、タク
ソールで処理した細胞では抗体の結合の増加がより少なかったが（８％）、本実
験では前記細胞のうち５７％で細胞周期が停止しているにすぎなかった。）。

【００９２】 例３．インビトロで細胞傷害性の薬剤に暴露した腫瘍細胞ではＥｐ−ＣＡＭ抗
原の発現の増加が観察されたが正常な細胞では観察されなかった 様々な腺癌細胞株及び正常なヒト細胞の初代培養上のＥｐ−ＣＡＭ抗原の発現
を定量した。順次培地、又は３０ｎＭ ナベルビン後に５μＭ シスプラチン（
ＮＶＢ＋ＣＤＤＰ）、又は８０ｎＭ タクソール後に１００μＭ カルボプラチ
ン（ＴＡＸ＋ＣＰＢＤＡ）に、準集密的な培養細胞に暴露した。例１及び例２で
記述したように、抗原発現の解析前に細胞を培地で洗浄し、更に２〜５日間培養
した。

【００９３】 図３は、細胞周期特異的な薬剤の組合せに暴露した後に４つの腺癌細胞がより
高いレベルで抗原を発現することを明確に示しているのに対して、４つの正常な
細胞は抗原発現の増加を全く示しておらず、うち２つの正常細胞の集団では検出
不能なままであった。

【００９４】 例４．ナベルビン＋シスプラチンに暴露された細胞は、対照細胞に比べてヒト
ＡＤＣＣ活性の標的として適していた 上記例１及び２に記載したように、腺癌細胞を薬剤に暴露した後、^５１Ｃｒ放
出細胞傷害性試験の標的細胞として利用するために採取して、９６穴プレートに
播種した。^５１Ｃｒと共に１晩標的細胞を培養した後、洗浄した。１晩接着させ
たヒト末梢血単核細胞を５０：１の比率のエフェクター：標的で添加し、ＡＤＣ
Ｃ培養を６時間インキュベートした。上清を回収して、放射能をカウントし、特
異的放出のパーセントを計算した（図４参照）。

【００９５】 図４は、ナベルビン／シスプラチンへの暴露後に、これらの化学療法剤に暴露
されていない対照と比べて、ＰＣ−３前立腺癌細胞がヒトＡＤＣＣ活性の標的と
してより適していることを明らかに示している。この効果は、抗原発現の増加に
直接起因しており、従って、抗体結合の増加、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原の調節の減少、
標的細胞の脆弱性の増加、又は上記の組合せによるものであるかもしれない。

【００９６】 例５．ナベルビンでマウスを前処理することによりＥｐ−ＣＡＭ−陽性腫瘍へ
の抗体のターゲッティングは著しく向上した 雌のＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に皮下移植するこ
とによって、ヒトの大腸腺癌（ＨＴ２９）腫瘍を創出した。該腫瘍が２００〜３
００ｍｇに達した時点で、動物を５つのグループに分けた。１日目と５日目に２
８ｍｇ／ｋｇの量のナベルビンを静脈内注射した。対照群には、１日目と５日目
に２０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を腹腔内投与した。６日
目にヒト化３２３／Ａ３ ＩｇＧ_{４ｃｙｓ−ＴＭＴ}（Ｅｐ−ＣＡＭ抗原に特異性
を有するヒト化モノクローナル抗体のキレーター抱合体）をルテチウム−１７７
でラベルし、外側尾静脈から静脈内注射した。各々マウスに、４．１μｇのタン
パク質／２．０９ μＣｉ ルテチウム−１７７／０．２ｍＬの注射液を与えた
。γ線を直接カウントするために、血液、脾臓、肝臓、肺、腎臓、大腿骨及び腫
瘍を抗体投与後１日目、３日目、５日目に回収した（結果は図５を参照）。

【００９７】 図５は、ナベルビンで前処理するとＥｐ−ＣＡＭ陽性腫瘍への抗体のターゲッ
ティングが増加するのに対して、５−ＦＵで前処理しても増加しないことを示し
ている。

【００９８】 例６．ＮＳＯ細胞におけるヒト化抗体３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）変種の発現 １．目的／要約 遺伝子操作により、ヒト化３２３／Ａ３抗体の軽鎖及び重鎖（それぞれ図１５
及び１６を参照）をコードするｃＤＮＡを単一のＣｅｌｌｔｅｃｈグルタミン合
成酵素（ＧＳ）発現プラスミド、ｐＥＥ１８（図１０参照）に組み込み、マウス
ＮＳＯ細胞をトランスフェクトするために用いた。

【００９９】 ２．材料と方法 ２．１ 材料 Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｐｌｃ， Ｓｌｏｕｇｈ， ＳＬ１
４ＥＮ， Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ， ＵＫからＮＳＯ細胞を購入した。発現プラ
スミドｐＥＥ６ＨＣＭＶ及びｐＥＥ１２（図８及び９を参照）はＣｅｌｌｔｅｃ
ｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｐｌｃ， Ｓｌｏｕｇｈから購入した。

【０１００】 ２．２ 完全長のヒト化重鎖ＤＮＡをコードするｐＥＥ６ｈｍｃｖプラスミド
（図８参照）をＢａｍＨＩ及びＢｇｌIIで消化し、ヒトサイトメガロウイルスの
主要前初期プロモーター（ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒ
ｏｍｏｔｅｒ）の転写制御下にある、重鎖をコードするＤＮＡを含む３．２ｋｂ
の断片を遊離させた。ヒト化軽鎖をコードするＤＮＡを含有するｐＥＥ１２（図
９）のＢａｍ ＨＩ部位の中に前記断片をクローニングした（ヒト化３２３／Ａ
３（ＩｇＧ_１）κ軽鎖のアミノ酸配列に関しては図６、ヒト化３２３／Ａ３（Ｉ
ｇＧ_１）重鎖のアミノ酸配列に関しては図７を参照）。３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１ ）重鎖及び軽鎖をコードするｐＥＥ１８プラスミドの模式図は図１０を参照。

【０１０１】 ２．２．２ ＮＳＯ細胞のトランスフェクションと選択 ２．２．２．１ 組織培養 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）を分泌する安定な細胞株の産生にＮＳＯ細胞
を使用するためだけに用いられている、単層流フードとインキュベーターが置か
れた隔離された部屋で、全ての単一細胞培養活性を実施した。該環境下では、他
のＮＳＯ細胞株、ヒト細胞株、又はウイルスで形質転換された細胞株は使用され
ていなかった。

【０１０２】 ＮＳＯ細胞をバイアルからおこし、ＤＭＥＭ：ＲＰＭＩ−１６４０：Ｓｉｇｍ
ａ ＰＦＨＭ（１：１：１）から構成される１：１：１培地中で、細胞密度が０
．５〜１×１０^６ｍＬになるまで培養した。エレクトロポーレーションのために
、前記細胞を遠心によって回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。３２３／Ａ３（Ｉｇ
Ｇ_１）をコードするｐＥＥ１８プラスミドＤＮＡをＳａｌ Ｉで消化し、６５℃
で１５分間熱処理して不活化し、エタノール沈殿を行って風乾した。前記乾燥し
たＤＮＡのペレットを０．５μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳに再懸濁し、
２ｍｍのエレクトロポーレーションキュベット（ＢＴＸ）に１００μＬ分注した
。１．２×１０^７／ｍＬになるように洗浄したＮＳＯ細胞を再懸濁し、最終容積
０．５ｍＬの中に１０^６ｍＬの最終濃度となるように、前記キュベットに４００
μＬを加えた。ＢＴＸ８２０９ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒの中、３００Ｖ、１ｍ秒で
エレクトロポーレーションを行った後、氷上で５〜１０分インキュベートした。
１０^５細胞／ｍＬの濃度になるように、１：１：１培地でエレクトロポーレーシ
ョンの混合物を再懸濁し、９６穴プレート上に５０μＬ／ｗｅｌｌで分配した。
翌日、ウェルに１５０μＬのＧＳ培地（Ｇｌｎ−ｆｒｅｅ ＩＭＤＭ、１＝Ｘ
ＧＳ及びヌクレオシドサプリメント、５％ＤＦＢＳ）を加え、全てのウェルが最
終濃度３％になるようにＧＳセレクションプロセスを開始した。

【０１０３】 ２．２．２．２ 特異的生産率（ＳＰＲ） ＧＳ培地（３％ＤＦＢＳ）中で培養された選択した細胞株を０．２×１０^６細
胞／ｍＬの密度で５ｍＬのＧＳ培地（３％ＤＦＢＳ）を含有するＴ−２５フラス
コ（Ｃｏｓｔａｒ）中に播種した。３７℃で２４時間、一晩細胞をインキュベー
トした後、各培養上清のアリコットを除去した。分泌されたヒト化３２３／Ａ３
（ＩｇＧ_１）の濃度を決定するためのヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡアッセイに、前記
上清を用いた。前記上清中の３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）抗体の濃度に体積（５．
０）を乗じてＳＰＲの値を導き、μｇ／１０^６細胞／２４時間として表した。

【０１０４】 ２．２．２．３ 細胞の凍結保存 細胞密度が０．２×１０^６細胞／ｍＬを超えた時点で、選択された細胞株を一
般的な方法で回収した。適当な容量の細胞を取り出し、１，０００×ｇで５分間
、２２℃の遠心にかけた。１〜４×１０^６細胞／ｍＬになるように、２０％（ｖ
／ｖ）ＦＢＳ／１０−％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／ＧＳ培地（ろ過滅菌）からなる氷
冷した培地で、細胞のペレットを穏やかに再懸濁した。細胞懸濁液各１．０ｍＬ
を１．８ｍＬの凍結保存バイアル（ＮＵＮＣ）に分注し、−７０℃のフリーザー
中に置かれたＣｒｙｏ １℃ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（Ｎａｌ
ｇｅｎｅ）の中で、１晩徐々に凍結させた。その後前記バイアルを容器から取り
出し、液体窒素フリーザーの気相に保存した。

【０１０５】 ２０バイアルの各細胞株（ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ１）の生産が低いもの
を含む）を上記のように凍結させ、まずＭＶＥ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃｓ ＸＬＣ
４４０ 液体窒素フリーザーの気相に保存した。続いて、ＭＶＥ Ｃｒｙｏｇｅ
ｎｉｃｓ ＸＬＣ５００液体窒素フリーザーの気相に前記細胞を移し、保存した
。

【０１０６】 例７．ＮＳＯ細胞におけるヒト化抗体３２３／Ａ３（ＩｇＧ_４ｃｙｓ）の発現 １． 目的の要約 遺伝子操作により、ヒト化抗体３２３／Ａ３（ＩｇＧ４ｃｙｓ）（ヒト化３２
３／Ａ３抗体）抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡ（図１５及び１７参照
）を単一のＣｅｌｌｔｅｃｈ グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現プラスミド、ｐ
ＥＥ１８に組み込み、マウスＮＳＯ細胞にトランスフェクトするために用いた。

【０１０７】 ２．材料と方法 ２．１ 材料（上記例６のとおり） ２．２ ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ４ｃｙｓ）ｐＥＥ１８発現プラスミドの
作製 ２．３ 完全長のヒト化重鎖ＤＮＡをコードするｐＥＥ６ＨＭＣＶプラスミド
（図８参照）をＢＡＭ ＨＩ及びＢｇｌ IIで消化して、ヒトサイトメガロウイ
ルスの主要前初期プロモーターの転写制御下にある、重鎖をコードするＤＮＡを
含む３．２ｋｂの断片を遊離させた。ヒト化軽鎖（ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ _４ ）κ軽鎖のアミノ酸配列に関しては図１１、３２３／Ａ３ ＩｇＧ_４ｃｙｓ変
種重鎖のアミノ酸配列に関しては図１２を参照）をコードするＤＮＡを含むｐＥ
Ｅ１２のＢａｍ ＨＩ部位に、該断片をクローニングした。３２３／Ａ３の重鎖
と軽鎖をコードするｐＥＥ１８プラスミドの模式図については、図１０を参照。

【０１０８】 ２．２．２ ＮＳＯ細胞の感染及び選択：上記例６を参照。

【０１０９】 例８． ＮＳＯ細胞におけるヒト化抗体３２３／Ａ３（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）の発
現 １． 目的／要約 遺伝子操作により、ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）抗体の重鎖及び軽
鎖をコードするｃＤＮＡを単一のＣｅｌｌｔｅｃｈグルタミン合成酵素（ＧＳ）
発現プラスミドｐＥＥ１８に組み込み、マウスＮＳＯ細胞にトランスフェクトす
るために用いた。

【０１１０】 ２． 材料と方法 ２．１ 材料は上記例６及び例７のとおり ２．２ ３２３／Ａ３（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）ｐＥＥ１８発現プラスミドの作成 完全長のヒト化重鎖ＤＮＡをコードするｐＥＥＥ６ ｈｃｍｖプラスミドをＢ
ａｍ ＨＩ及びＢｇｌ IIで消化して、ヒトサイトメガロウイルスの主要前初期
プロモーターの転写制御下にある、重鎖をコードするＤＮＡを含む３．２ｋｂの
断片を遊離させた。ヒト化軽鎖（３２３／Ａ３（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）κ軽鎖のアミ
ノ酸配列に関しては図１３、３２３／Ａ３（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）重鎖アミノ酸配列
に関しては図１４を参照）をコードするＤＮＡを含むｐＥＥ１２のＢａｍII部位
に該断片をクローニングした。３２３／Ａ３（ＩｇＧ２ｃｙｓ）重鎖及び軽鎖を
コードするｐＥＥ１８プラスミドの模式図に関しては図１０を参照。

【０１１１】 ２．２．２ ＮＳＯ細胞の感染及び選択−上記例６及び例７を参照。

【０１１２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｅｐ−ＣＡＭは細胞周期を通じて発現されるが、Ｇ_０／Ｇ_１期の細胞（実線）
に比べて、Ｓ期（点線）及びＧ_２／Ｍ期（破線）の細胞の方がより高い密度で、
より均一に発現している。該発現パターンは他の多くのヒトの大腸、前立腺、肺
の腫瘍細胞株で報告されている。

【図２】 細胞周期の停止は、インビトロで、培地のみ、５−フルオロウラシル（５ＦＵ
）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α；１００Ｕ／ｍＬ），又はインターフェロ
ンγ（ＩＮＦ−γ；１００Ｕ／ｍＬ）に暴露した場合と比べた、ナベルビン（Ｎ
ＶＢ；３０ｎＭ）＋シスプラチン（ＣＤＤＰ；５μＭ）、又はタクソール（ＴＡ
Ｘ；８０ｎＭ）＋カルボプラチン（ＣＰＢＤＡ；１００μＭ）に暴露された腺癌
細胞の顕著な特徴である。各バーの面積は、Ｇ_０／Ｇ_１期及びＳ＋Ｇ_２／Ｍ期の
細胞の割合を示すために分割されている；各バーの高さは、集団中の細胞当たり
のＥｐ−ＣＡＭ分子の平均数を示している。Ｓ期の細胞及びＧ_２／Ｍ期の細胞は
Ｅｐ−ＣＡＭをより高いレベルで発現しており（図１）、細胞周期の進行を停止
させる薬剤は全般的にＥｐ−ＣＡＭの発現を上昇させた。

【図３】 様々な腺癌の細胞株と正常なヒトの細胞の初代培養において、Ｅｐ−ＣＡＭ抗
原の発現を定量化した。培養された細胞を、順次培地、又は３０ｎＭ ナベルビ
ンの後に５μＭ シスプラチン（ＮＶＢ＋ＣＤＤＰ）、又は８０ｎＭ タクソー
ルの後に１００μＭ カルボプラチン（ＴＡＸ＋ＣＰＢＤＡ）に暴露した。細胞
周期特異的な薬剤の組合せに４つの腺癌細胞を暴露すると、より高いレベルで抗
原を発現した。４つの正常な細胞は抗原の発現の増加を示さず、２つの正常な細
胞集団では検出不能なままであった。

【図３ａ】 先述したように、ナベルビン＋シスプラチン、又はタクソールとともに培養し
たＨＴ２９腺癌細胞と共に１５分間インキュベートした後に、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原
に対して特異性を有する関連マウスモノクローナル抗体であるパノレックスの結
合を測定した。ナベルビン＋シスプラチンで処理した細胞では抗体の結合が著し
く上昇した（３４％）；図３ａに示されているように、対照細胞では２１％であ
ったのに比べて、該細胞のうち８２％は細胞周期のＳ期又はＧ_２／Ｍ期で停止し
ていた（タクソールで処理した細胞の方が抗体結合の増加は少なかったが（８％
）、本実験で細胞周期が停止していたのは、前記細胞の５７％に留まった）。

【図４】 インビトロでヒト化３２３／Ａ３ （ＩｇＧ_１）（Ｅｐ−ＣＡＭ抗原に特異性
があり、ヒトのエフェクター細胞上に存在するＦｃ受容体と相互作用し得るヒト
化モノクローナル抗体）と共にインキュベートした腫瘍標的細胞を溶解するヒト
末梢血のＡＤＣＣエフェクター細胞の能力は、ナベルビン（３０ｎＭ）＋シスプ
ラチン（５μＭ）で標的細胞を前処理すると向上した。

【図５】 ヒト腫瘍の異種移植を受けたマウスを細胞周期特異的な細胞傷害性薬剤で処理
すると、Ｅｐ−ＣＡＭ特異的な抗体の腫瘍への局在が改善された。

【図６】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）κ軽鎖のアミノ酸配列。

【図７】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）重鎖のアミノ酸配列。

【図８】 ｐＥＥ６のベクター地図。

【図９】 ｐＥＥ１２のベクター地図。

【図１０】 ｐＥＥ１８のベクター地図。

【図１１】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_４ｃｙｓ）κ軽鎖のアミノ酸配列。

【図１２】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_４ｃｙｓ）変種重鎖のアミノ酸配列。

【図１３】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）κ軽鎖のアミノ酸配列。

【図１４】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）重鎖のアミノ酸配列。

【図１５−１】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）軽鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１５−２】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）軽鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１６−１】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）重鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１６−２】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）重鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１６−３】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_１）重鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１７−１】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_４）重鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１７−２】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_４）重鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１７−３】 ヒト化３２３／Ａ３（ＩｇＧ_４）重鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１８−１】 ヒト化３２３／３Ａ（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）重鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１８−２】 ヒト化３２３／３Ａ（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）重鎖のｃＤＮＡ配列。

【図１８−３】 ヒト化３２３／３Ａ（ＩｇＧ_２ｃｙｓ）重鎖のｃＤＮＡ配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/4535 Ａ６１Ｋ 31/4535 31/519 31/519 31/675 31/675 31/704 31/704 31/7068 31/7068 33/24 33/24 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ニック、ビンセント・シー アメリカ合衆国、ノース・カロライナ州 27709 リサーチ・トライアングル・パー ク、ボックス 13398、ファイブ・ムー ア・ドライブ、グラクソスミスクライン内 (72)発明者 スティムメル、ジュリー・ベス アメリカ合衆国、ノース・カロライナ州 27709 リサーチ・トライアングル・パー ク、ボックス 13398、ファイブ・ムー ア・ドライブ、グラクソスミスクライン内 (72)発明者 サーモンド、リンダ・エム アメリカ合衆国、ノース・カロライナ州 27709 リサーチ・トライアングル・パー ク、ボックス 13398、ファイブ・ムー ア・ドライブ、グラクソスミスクライン内 Ｆターム(参考） 4C084 AA17 MA02 NA14 ZB261 4C085 AA14 CC04 CC23 DD62 4C086 AA01 AA02 BA02 BB03 BC21 CB03 CB09 CB14 DA32 DA35 EA10 EA17 GA07 HA12 HA28 MA02 MA04 NA14 ZB26 4C206 AA01 AA02 FA31 MA02 NA14 ZB26

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＥＰ−ＣＡＭ抗原を発現している細胞をＳ又はＧ_２／Ｍで停
   止させ得る化学療法剤と、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体との組合せ。
2. 【請求項２】 前記Ｅｐ−ＣＡＭ抗体が１７．１Ａ抗体である請求項１に記
   載の組合せ。
3. 【請求項３】 前記Ｅｐ−ＣＡＭ抗体がパノレックスである請求項２に記載
   の組合せ。
4. 【請求項４】 前記化学療法剤が、ＵＦＴ、カペシタビン、ＣＰＴ−ＩＩ、
   オキサリプラチン、５ＦＵ、５ＦＵ連続注入、パクリタキセル、ドセタキセル、
   シクロホスファミド、メトトレキサート、ドキソルビシン、ナベルビン（静脈内
   及び経口）、エピルビシン、ミトキサントロン、ラロキシフェン、シスプラチン
   、マイトマイシン、カルボプラチナ、ゲンシタビン、エトポシド、及びトポテカ
   ンから選択される１以上の薬剤である上記請求項の何れか１項に記載の組合せ。
5. 【請求項５】 前記化学療法剤がＣＰＴ−ＩＩ、５ＦＵ（連続注入）、オキ
   サリプラチン、カペシチビン、ＵＦＴ、及びトムデックス（ラロキシフェン）で
   ある請求項４に記載の組合せ。
6. 【請求項６】 前記Ｅｐ−ＣＡＭを発現している細胞が上皮由来の細胞であ
   る上記請求項の何れか１項に記載の組合せ。
7. 【請求項７】 前記Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発現している細胞が腫瘍細胞及びそ
   れらの転移物である先行する請求項の何れか１項に記載の組合せ。
8. 【請求項８】 前記Ｅｐ−ＣＡＭを発現している腫瘍細胞が腺癌細胞及びそ
   れらの転移物である請求項７に記載の組合せ。
9. 【請求項９】 前記Ｅｐ−ＣＡＭを発現している細胞が前立腺、肺、乳、胃
   、又は腸由来の細胞又はＥｐ−ＣＡＭ抗原を発現することが知られている他の腫
   瘍である請求項７及び８に記載の組合せ。
10. 【請求項１０】 抗癌療法に使用するための医薬の製造における抗ＥｐＣＡ
    Ｍ抗体の使用であって、Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発現している細胞をＳ又はＧ_２／Ｍ
    で停止させ得る化学療法剤が、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体とともに患者に同時投与され
    ることを特徴とする使用。
11. 【請求項１１】 前記化学療法剤が、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体より前に、又は抗
    Ｅｐ−ＣＡＭ抗体と同時に投与される請求項１０に記載の抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体の
    使用。
12. 【請求項１２】 細胞をＳ又はＧ_２／Ｍで停止させ得る化学療法剤を、Ｅｐ
    −ＣＡＭ抗体とともに患者に同時投与することを備えた抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体の抗
    体結合を増加させる方法。
13. 【請求項１３】 前記化学療法剤の不存在下での結合と比べて、２〜１０倍
    抗体結合を増加させる請求項１１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発現している細胞をＳ又はＧ_２／Ｍで
    停止させ得る化学療法剤が、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体とともに患者に同時投与される
    治療方法。
15. 【請求項１５】 Ｅｐ−ＣＡＭ抗原を発現している細胞をＧ_２／Ｍで停止さ
    せ得る化学療法剤と共に抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体を含有する薬学的組成物。