TW202210519A - 抗ｃ－Ｍｅｔ抗體藥物偶聯物及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及c-Met抗體藥物技術領域，特別是涉及靶向c-Met的抗體藥物偶聯物及其應用。本發明的抗體藥物偶聯物，包含與一個或更多個治療劑偶聯的抗體或其抗原結合片段，其能夠有效抑制腫瘤組織的生長，針對c-Met陽性癌症均具有顯著的抑制效果，並且安全性好。

Description

抗c-Met抗體藥物偶聯物及其應用
本發明涉及抗體藥物偶聯物領域，具體涉及一種靶向c-Met的抗體藥物偶聯物及其應用。
c-Met(tyrosine-protein kinase Met)是一個原癌基因(文獻1：Edakuni G,Sasatomi E,Satoh T,et al.Expression of the hepatocyte growth factor/c-Met pathway is increased at the cancer front in breast carcinoma.[J].Pathology International,2010,51(3)：172-178)，轉錄翻譯後產物為肝細胞生長因數受體，同HGF(hepatocyte growth factor receptor)一致，其前體為一條單鏈，經各種修飾後斷裂成α鏈和β鏈，由二硫鍵連接。c-Met在細胞上主要分為胞內和胞外兩部分，關於β鏈的胞外區包括SD(Sema domain)區、PSID(plexin-semaphorin-integrin)區以及IPTD(immunoglobulin-like regions in plexins and transcription factors)區，胞內區主要包括JD(juxtamembrane domain)和TKCD(a tyrosine kinase domain(TK domain)and a c-terminal docking site)(文獻2：Sattler M,Reddy M M,Hasina R,et al.The role of the c-Met pathway in lung cancer and the potential for targeted therapy[J].Therapeutic Advances in Medical Oncology,2011,3(4)：171-84.)。c-Met是HGF的受體，當HGF與c-Met結合後導致c-Met的結構發生改變，啟動胞內的蛋白酪氨酸激酶，從而導致自身結構的磷酸化，主要磷酸化Try1235以及Try1234位點，c-Met啟動後，導致位於β鏈末端的Try1349和Try1256的磷酸化(文獻3：Peruzzi B,Bottaro D P.Targeting the c-Met Signaling Pathway in Cancer[J].Clinical Cancer Research,2006, 12(12)：3657-3660)。當HGF與c-Met結合後引發多條信號通路的發生：其一，Ras-Rac信號通路導致細胞骨架的運動；其二，Ras-MAPK級聯反應促進細胞的分裂與分化；其三，PI3K-FAK信號通路促進細胞的遷移以及侵襲；其四，PI3K-AKT信號通路促進細胞的存活。HGF/c-Met信號通路促進了腫瘤細胞的生長以及遷移。
c-Met在許多腫瘤細胞上過表達，其中以頭頸鱗癌和下嚥癌為首，在腎細胞癌、結直腸癌、肺腺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、非小細胞癌和胃癌中均有表達，c-Met在腫瘤細胞中的高表達和在正常細胞中的低表達，使得c-Met成為靶向治療的優良靶標。
抗體藥物偶聯物(antibody-drug conjugate，ADC)是一種通過化學連接子(Linker)將具有生物活性的藥物(Drug)和抗體(Antibody)連接起來的一類生物藥。近些年，多個抗體藥物偶聯物在治療惡性腫瘤方面取得了突破性的進展，使其成為了繼手術、化療、放療後的一大新興治療方法。但截止到2021年3月，全球僅批准了11種抗體偶聯藥物(美國FDA批准了10種，日本PMDA批准了一種)，且獲批適應症種類較少，遠不能滿足目前惡性腫瘤患者的臨床需求。
Figure 110132408-A0101-12-0002-1
Figure 110132408-A0101-12-0003-2
目前處於研究或臨床階段的靶向c-Met的生物藥以單克隆抗體為主，抗體藥物偶聯物(Antibody Drug conjugate，ADC)類藥物較少(文獻4：LILIANE GOETSCH,A.J.Anti-CMET antibody and its use for the detection and the diagnosis of cancer.WO2011020925 A1,2012)。其中恒瑞醫藥研發中的注射用SHR-A1403為一種人源化抗c-Met單克隆抗體與微管抑制劑通過化學偶聯之後形成的一種ADC，可通過與腫瘤細胞表面的c-Met結合，將抗體藥物偶聯物內吞進入腫瘤細胞後，在溶酶體發生降解後釋放小分子毒素，起到殺傷腫瘤細胞的作用(文獻5：Ki-Hyun Kim Progress of antibody-based inhibitors of the HGF-cMET axis in cancer therapy，Experimental & Molecular Medicine(2017)49,e307)。SHR-A1403於2017年1月被FDA批准在美國開展臨床試驗，根據FDA(https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03856541？term=SHR-A1 403&rank=1)官網顯示，該I期臨床試驗目前處於招募患者階段。
ABBVie公司研發管線ABBV-399在美國也處於I期臨床研究階段，其為ABT-700抗體與MMAE的偶聯物，DAR(Drug-to-antibody ratio)值為3.1，用於治療c-Met過度表達的非小細胞肺癌。c-Met早期臨床試驗研究結果顯示，ABBV-399能對c-Met呈陽性的癌細胞產生細胞毒性作用。I期臨床試驗(NCT02099058)以29名c-Met呈陽性的NSCLC患者為物件，初步考察了ABBV-399單獨給藥或聯合厄洛替尼給藥的安全性與有效性。單獨給藥的佇列中，
Figure 110132408-A0101-12-0003-91
10%的患者發生了不良反應，以疲勞、噁心、神經痛與噁心為主(分別43.8%、37.5%、25%與18.8%)。單獨給藥組內，3/16名患者出現部分緩解，持續時間在3.1~11.1月之間。給藥12周後，單獨給藥組內56.3%的患者病情得以控制。聯合給藥組內亦有
Figure 110132408-A0101-12-0003-92
10%的患者發生不良反應，以神經痛與噁心為主(分別為46.2與23.1%)，該組內4/13名患者出現部分緩解，其 中1名有待確認，其持續時間從2.8~9.1個月。治療12周後，聯合給藥組內76.9%的患者病情得以控制。單獨給藥組與聯合給藥組內均未出現與治療相關的死亡病例。試驗結果證實，ABBV-399在2.7mg/kg劑量下具有良好的耐受性，且對HGF呈陽性的NSCLC患者表現出良好的抗腫瘤活性(文獻6：Wang J,Anderson M G,Oleksijew A,et al.ABBV-399,a c-Met Antibody Drug Conjugate that Targets Both MET Amplified and c-Met Overexpressing Tumors,Irrespective of MET Pathway Dependence[J].Clinical Cancer Research,2016,23(4)：992-1000.)。在2016年ABBVie發佈的最新資料顯示，H-score
Figure 110132408-A0101-12-0004-93
150的NSCLC患者使用ABBV-399治療後，約19%出現部分緩解，ABBV-399的耐受劑量為每三周給藥2.7mg/kg，最常發生的毒性反應是疲勞(25%)、噁心(23%)、神經痛(15%)、食欲降低(13%)、嘔吐(13%)和腹瀉(10%)(文獻7：Angevin E,Kelly K,Heist R,et al.First-in-human phase 1,dose-escalation and -expansion study of ABBV-399,an antibody-drug conjugate(ADC)targeting c-Met,in patients(pts)with advanced solid tumors[J].Annals of Oncology,2016,27(suppl_6).
儘管目前靶向c-Met的抗體處於臨床階段的有數十個，但腫瘤治癒效果不盡如人意。ADC藥物可以將這些靶向性很好的單抗和細胞毒素進行有效的組合，保持靶向性的同時增強對細胞的殺傷作用。目前靶向c-Met的ADC研發進展相對緩慢處於臨床階段的較少，且處於臨床早期，如ABBVie的ABBV-399和恒瑞醫藥的SHR-A1403，這兩種ADC均處於臨床試驗I期，藥品的安全性及有效地針對性適應症還處於探索中。因此，目前臨床上亟需開發藥效和安全性更好的抗c-Met的抗體藥物偶聯物，從而能夠拓展更多的針對性適應症進行有效治療。
本發明提供了一種靶向c-Met的抗體或抗原結合片段及其在治療癌症中的用途。本發明還提供了包含上述抗體的抗體藥物偶聯物(ADC)編碼上述c-Met抗體的的核苷酸、多核苷酸組合、表達載體及宿主細胞、包含上述c-Met的抗體、抗體藥物偶聯物的藥物組合物以及它們在製備治療或預防癌症藥物中的應用。
具體的，本發明提供了一種靶向c-Met的人源化抗體或其抗原結合片段，所述的人源化抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
(1)重鏈可變區的序列如SEQ ID NO：7所示，或與SEQ ID NO：7具有相同的CDR 1-3且與SEQ ID NO：7相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列；和/或
(2)輕鏈可變區的序列如SEQ ID NO：8所示，或與SEQ ID NO：8具有相同的CDR 1-3且與SEQ ID NO：8相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列。
在一些優選的實施例中，所述的人源化抗體或其抗原結合片段選自單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、包含所述抗原結合片段的重組蛋白或Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb、Fd、單鏈抗體(scFv)。
在一些優選的實施例中，所述的抗體或抗原結合片段還包含免疫球蛋白的恒定區，其中所述的免疫球蛋白選自IgG1,IgG2,IgG3,IgG4。
在一些具體的實施例中，所述的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；和/或所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
所述的SEQ ID NO：7涉及的氨基酸序列如下：
Figure 110132408-A0101-12-0005-94
所述的SEQ ID NO：8涉及的氨基酸序列如下：
Figure 110132408-A0101-12-0005-4
在另一些具體的實施例中，所述的抗體或其抗原結合片段的重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；和/或所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
所述的SEQ ID NO：9涉及的氨基酸序列如下：
Figure 110132408-A0101-12-0006-5
所述的SEQ ID NO：10涉及的氨基酸序列如下：
Figure 110132408-A0101-12-0006-6
本發明還涉及一種分離的多核苷酸，其編碼上述任一項所述的抗體或其抗原結合片段
本發明還涉及一種核酸構建體，其包含上述所述的多核苷酸。
如上所述的核酸構建體優選為表達載體，如上所述的多核苷酸與允許其所編碼的多肽在宿主細胞或無細胞表達系統中表達的調節序列有效連接。
本發明還涉及一種宿主細胞，其包含上述所述的多核苷酸或者表達載體，並且所述的宿主細胞優選自原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、大腸桿菌細胞；進一步的，所述的宿主細胞優選為CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞或BHK細胞。
本發明還提供了上述任一項所述的抗體或其抗原結合片段的生產方法，該方法包括：在允許上述核酸構建體表達的條件下培養上述所述的宿主細胞，並從培養物中回收產生的表達蛋白。
本發明還提供了一種靶向c-Met的抗體藥物偶聯物，其為上述任意一項所述的抗體或其抗原結合片段與一個或多個治療劑的偶聯物。
在一些實施例中，所述治療劑選自細胞毒性分子、免疫增強劑和放射性同位素，所述細胞毒性分子包括但不限於微管蛋白抑制劑或DNA損傷劑；進一步優選的，所述微管蛋白抑制劑包括但不限於海兔毒素(dolastatin)及奧瑞他汀(auristatin)類細胞毒分子，美登素(maytansine)類細胞毒分子；所述DNA損傷劑包 括但不限於卡奇黴素(calicheamicin)類、倍癌黴素(duocarmycin)類、安麯黴素類衍生物PBD、喜樹堿(camptothecins)及喜樹堿類衍生物、SN-38、Dxd；進一步優選的，所述奧瑞他汀(auristatin)類細胞素分子包括但不限於MMAE或MMAF或它們的洐生物，所述美登素類細胞毒分子包括但不限於DM1、DM4或它們的洐生物。
本發明所提供抗體藥物偶聯物優選的結構通式為A-(L-U)n，其中：所述A表示上述任一項所述的抗體或其抗原結合片段；所述U為活性藥物單元；所述L為任一連接基團，其分別與抗體或其抗原結合片段A及活性藥物單元U共價連接；n為1、2、3、4、5、6、7或8；所述A可通過一個或多個連接基團L連接1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個活性藥物單元U。
所述的連接基團L與所述的靶向c-Met的抗體或抗原結合片段A上的氨基殘基或巰基殘基共價連接；優選的，所述的連接基團L與所述的靶向c-Met的抗體或抗原結合片段A上的巰基殘基共價連接；更優選的，所述的連接基團L與所述的靶向c-Met的抗體或抗原結合片段A上的鏈間二硫健打開後形成的巰基殘基共價連接。所述的連接基團L包括可裂解連接子和不可裂解連接子。所述的可裂解連接子包含肽單元，所述的肽單元包含2-20個氨基酸，優選的所述的肽單元選自由-纈氨酸-瓜氨酸-(-Val-Cit-)、-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-(-Gly-Gly-Phe-Gly-)、-纈氨酸-丙氨酸-(-Val-Ala-)、-纈氨酸-賴氨酸-(-Val-Lys-)、-纈氨酸-精氨酸-(-Val-Arg-)、-苯丙氨酸-瓜氨酸-(-Phe-Cit-)、-苯丙氨酸-賴氨酸-(-Phe-Lys-)、-苯丙氨酸-精氨酸-(-Phe-Arg-)及它們的組合。
在一些優選的實施例中，所述的L包括以下結構：
Figure 110132408-A0101-12-0007-7
Figure 110132408-A0101-12-0008-8
Figure 110132408-A0101-12-0009-9
Figure 110132408-A0101-12-0010-10
在一些優選的實施例中，所述的活性藥物單元U選自以下結構：
Figure 110132408-A0101-12-0010-11
Figure 110132408-A0101-12-0011-12
Figure 110132408-A0101-12-0012-13
在一些優選的實施例中，所述抗體藥物偶聯物選自如下結構：
Figure 110132408-A0101-12-0012-14
 其中，ADC-1中所述的n為選自1、2、3、4、5、6、7、8中的整數；或者
Figure 110132408-A0101-12-0012-15
 其中，ADC-2中所述的n為選自1、2、3、4中的整數；或者
Figure 110132408-A0101-12-0012-16
 其中，ADC-3中所述的n為選自1、2、3、4中的整數；或者
Figure 110132408-A0101-12-0013-17
 其中，ADC-4中所述的n為選自1、2中的整數；或者
Figure 110132408-A0101-12-0013-18
 其中，ADC-5中所述的n為選自1、2、3、4、5、6、7、8中的整數；或者
Figure 110132408-A0101-12-0013-19
 其中，ADC-6中所述的n為選自1、2、3、4、5、6、7、8中的整數；或者
Figure 110132408-A0101-12-0013-20
 其中，ADC-7中所述的n為選自1、2、3、4、5、6、7、8中的整數。
本發明還提供了一種藥物組合物，其包含上述任一項的抗體或其抗原結合片段和/或抗體藥物偶聯物，以及可藥用載體。
本發明還提供了上述任一項的抗體或其抗原結合片段、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、抗體藥物偶聯物或藥物組合物在製備用於治療或預防癌症的藥物中的用途。
在一些優選的實施例中，所述的癌症為c-Met陽性癌症。
在一些具體的實施例中，所述c-Met陽性癌症為肺癌和胃癌。
本發明還提供了一種疾病的治療方法，該方法包括向有需要的患者施用治療有效量的上述任一項所述的抗體藥物偶聯物或藥物組合物；其中，所述疾病為c-Met陽性癌症，優選為肺癌和胃癌。
本發明還提供了一種試劑盒，其包括容器、置於所述容器中的製劑和任選的說明書；其中所述製劑包含上述任一項所述的抗體、抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物以及藥物組合物。
本發明還提供了上述任一項所述的抗體或其抗原結合片段、抗體藥物偶聯物、多核苷酸、核酸構建體、表達載體、或藥物組合物在製備用於治療或預防癌症的藥物中的用途。其中，所述的癌症為實體瘤；所述實體瘤進一步的包括肺癌和胃癌。
本發明還提供了一種重組蛋白，其包括上述任一項的抗體或抗原結合片段。
上述所述的重組蛋白優選的為雙特異性抗體或多特異性抗體，所述的多特異性抗體優選的如三特異性抗體、四特異性抗體、五特異性抗體等。
本發明還提供了上述任一項的抗體或抗原結合片段在製備重組蛋白中的應用。
圖1為人源化抗體AAJ8D6和嵌合抗體cAAJ8D8的親和力對比圖；
圖2為人源化抗體AAJ8D6與ABT-700的結合力比較圖；
圖3為人源化抗體AAJ8D6與AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE、AAJ8D6-PY-Val-Cit-MMAE、 AAJ8D6-D07-Val-Cit-MMAE的內吞效果圖；
圖4A、圖4B、圖4C、圖4D為人源化抗體AAJ8D6及其抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE以及對照組的細胞毒活性對比圖，其中圖4A中的代表細胞株為MKN-45、圖4B的代表細胞株為SNU-620、圖4C的代表細胞株為HT29、圖4D的代表細胞株為BXPC-3；
圖5為抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE及抗體藥物偶聯物ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE最大抑制率對比圖；
圖6為抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE及對照組對MKN-45荷瘤裸小鼠移植瘤療效對比圖；
圖7為抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE及對照組對小鼠(胃癌GA0046)PDX模型的療效對比圖；
圖8為抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE及對照組對小鼠(肺癌LU2503)PDX模型的療效對比圖。
定義
除非另有定義，本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同含義。關於本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。
定義
儘管本發明的廣義範圍所示的數字範圍和參數近似值，但是具體實施例中所示的數值盡可能準確的進行記載。然而，任何數值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自的測量中存在的標準差所致。另外，本文公開的所有範圍應理解為涵蓋其中包含的任何和所有子範圍。例如記載的“1至10”的範圍應認為包含最小值1和最大值10之間(包含端點)的任何和所有子範圍；也就是說，所有以最小值1或更大起始的子範圍，例如1至6.1，以及以最大值10或更小終止的子範圍，例如5.5至10。另外，任何稱為“併入本文”的參考文獻應理解為以其整體併入。
另外應注意，如本說明書中所使用的，單數形式包括其所指物件的複數形式，除非清楚且明確的限於一個所指物件。術語“或”可與術語“和/或”互換使用，除非上下文另有清楚指明。
本文使用的術語“藥物組合物”、“組合藥物”和“藥物組合”可互換地使用，其表示組合在一起以實現某種特定目的的至少一種藥物以及任選地可藥用載體或輔料的組合。在某些實施方案中，所述藥物組合物包括在時間和/或空間上分開的組合，只要其能夠共同作用以實現本發明的目的。例如，所述藥物組合物中所含的成分(例如根據本發明的抗體、核酸分子、核酸分子組合和/或抗體藥物偶聯物)可以以整體施用於物件，或者分開施用於物件。當所述藥物組合物中所含的成分分開地施用于物件時，所述成分可以同時或依次施用於物件。優選地，所述可藥用載體是水、緩衝水溶液、等滲鹽溶液如PBS(磷酸鹽緩衝液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鎂、0.3%甘油、透明質酸、乙醇或聚亞烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可藥用載體的類型尤其依賴于根據本發明的組合物是否配製為用於口服、鼻、皮內、皮下、肌內或靜脈施用。根據本發明的組合物可包含潤濕劑、乳化劑或緩衝液物質作為添加劑。
根據本發明的藥物組合物、疫苗或者藥物製劑可通過任何適宜的途徑施用，例如可口服、鼻、皮內、皮下、肌內或靜脈內施用。
本文使用的術語“治療劑”表示能夠起到治療作用(例如治療、預防、緩解或抑制任何疾病和/或病症)的任何物質或實體(entity)，其包括但不限於：化學治療劑、放射治療劑、免疫治療劑、熱治療劑(thermally therapeutic agent)等。
本文使用的“CDR區”或“CDR”是指免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高變區，如Kabat et al.所定義(Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest,5th Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991，以及以後版本)。存在三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR。根據情況，本文所用術語CDR或CDRs是為了指示這些區域之一、或者這些區域的幾個或者甚至全部，所述區域包含通過抗體對抗原或其識別表位的親和力而負責結合的大部分氨基酸殘基。
對本發明來說，兩種核酸或者氨基酸序列間的“一致性”、“同一性”或“相似性”是指，在最佳比對(最優比對)後所獲得的、待比較的兩序列之間相同核苷酸或相同氨基酸殘基的百分數，該百分數是純粹統計學的並且兩種序列間的差異隨機分佈並覆蓋其全長。兩種核酸或者氨基酸序列之間的序列比較通常是在以最優方式使它們匹配以後，通過比較這些序列而進行，所述比較能夠通過區段或者通過“比較窗”實施。除了能夠手工實施外，用於比較序列的最優比對，還能夠通過Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2：482]的局部同源性演算法、通過Neddleman和Wunsch的(1970)[J.MoI.Biol.48：443]局部同源性演算法、通過Pearson和Lipman的(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444]相似性搜索方法、通過使用這些演算法的電腦軟體實施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI，或者通過BLAST N or BLAST P比較軟體)。
本文使用的“治療有效量”或“有效量”是指足以顯示其對於所施用物件益處的劑量。施用的實際量，以及施用的速率和時間過程會取決於所治療者的自身情況和嚴重程度。治療的處方(例如對劑量的決定等)最終是全科醫生及其它醫生的責任並依賴其做決定，通常考慮所治療的疾病、患者個體的情況、遞送部位、施用方法以及對於醫生來說已知的其它因素。
本文所使用的術語“物件”是指哺乳動物，如人類，但也可以是其它動物，如野生動物(如蒼鷺、鸛、鶴等)，家畜(如鴨、鵝等)或實驗動物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土撥鼠、地松鼠等)。
術語“抗體”包括單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體或包含抗原結合片段的重組蛋白；術語“抗原結合片段”包括Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb、Fd、單鏈抗體(scFv)、scFv-Fc片段或者雙抗體(diabody)、或者通過化學修飾或通過摻入脂質體中應能夠增加半壽期的任何片段，所述化學修飾例如添加聚(亞烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被稱為Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab')2-PEG或Fab'-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”為聚乙二醇)，所述片段具 有EGFR結合活性。優選地，所述功能片段將由其來源抗體的重或輕可變鏈的部分序列構成或者包含它們，所述部分序列足以保留與其來源抗體相同的結合特異性和充分的親和力，對於EGFR，優選至少等於其來源抗體親和力的1/100，在更優選方式中至少等於1/10。這種功能片段將包含最少5個氨基酸，優選其來源的抗體序列的10、15、25、50和100個連續氨基酸。
術語“人源化抗體”是指一種抗體，其包含來源於非人源抗體的CDR區、並且該抗體分子的其他部分來源於一種(或幾種)人抗體。而且，為了保留結合親和力，可以修飾骨架(稱為FR)區段的一些殘基(Jones et al.,Nature,321：522-525,1986；Verhoeyen et al.,Science,239：1534-1536,1988；Riechmann et al.,Nature,332：323-327,1988)。通過本領域技術人員已知的技術可以製備根據本發明的人源化抗體或其片段；
術語“嵌合抗體”系指以下抗體，其中的可變區序列來自一物種而恒定區序列來自另一物種，例如可變區序列來自小鼠抗體而恒定區序列來自人抗體的抗體。通過使用基因重組技術可以製備根據本發明的嵌合抗體或其片段。例如，所述嵌合抗體可以通過克隆重組DNA來生產，所述重組DNA包含啟動子和編碼根據本發明的非人尤其是鼠單克隆抗體可變區的序列、以及編碼人抗體恒定區的序列。由這種重組基因編碼的本發明嵌合抗體將是，例如，鼠-人嵌合體，該抗體的特異性由來源於鼠DNA的可變區確定，並且其同種型由來源於人DNA的恒定區來確定。對於製備嵌合抗體的方法，例如，可以參考檔Verhoeyn et al.(BioEssays,8：74,1988)。
術語“單克隆抗體”系指具有單一分子組成的抗體分子的製備物。單克隆抗體組合物顯示出對於特定表位元的單一結合特異性和親和性。
本文中所使用的術語“AAJ8D6抗體”，除另有說明外，均指本發明人所得到的靶向c-Met的人源化單克隆抗體AAJ8D6。
本文中所指cAAJ8D6抗體，指人-鼠嵌合抗體，包含鼠源可變區和人源恒定區。cAAJ8D6抗體與AAJ8D6抗體的區別只在於可變區中框架區的不同，cAAJ8D6的框架區為鼠源的，AAJ8D6的框架區為人源的。
通常，為了製備單克隆抗體或其功能片段，尤其是鼠源的單克隆抗體或其功能片段，可以參考尤其描述在手冊“Antibodies”中的技術(Harlow and Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp.726,1988)或者參考Kohler和Milstein描述的從雜交瘤細胞製備的技術(Nature,256：495-497,1975)。
根據本發明的單克隆抗體例如可以在親和柱上純化，已經預先在所述親和柱上固定了c-Met抗原或其包含可被根據本發明所述單克隆抗體特異性識別的表位的片段之一。更具體而言，所述單克隆抗體可以如此純化，通過蛋白質A和/或G色譜，接或不接目的在於消除殘留蛋白質污染物以及DNA和LPS的離子交換色譜，其本身接或不接在Sepharose凝膠上的排阻色譜以消除由於二聚體或其他多聚體存在而潛在的聚集體。在更優選的方式中，全部這些技術可以同時或者連續使用。
本文使用的術語“海兔毒素肽(dolastatin)”是指分離自一種海洋生物截尾海兔(Dollabella auricularia)的多肽，其包括但不限於海兔毒素肽10(dolastatin 10)和海兔毒素肽15(dolastatin 15)。海兔毒素肽是有絲分裂抑制劑，其表現出強的抗癌活性，因此被作為抗癌藥物的候選。研究人員進一步發現和合成了許多海兔毒素肽的衍生物，例如MMAE和MMAF。
本文使用的術語“連接子”是指抗體藥物偶聯物(即ADC)中將抗體與藥物相連接的部分，其可以是可切割的或者不可切割的。可切割的連接子(即可斷裂的接頭或生物可降解接頭)可以在靶標細胞內或其上斷裂，從而釋放藥物。在某些實施方案中，本發明的連接子具有非常好的穩定性，大大減少了藥物在遞送到靶標過程中(例如在血液中)的釋放，從而減少了副作用和毒性。在一些特定實施方案中，本發明的連接子選自可切割的連接子，例如基於二硫化物的連接子(其在巰基濃度更高的腫瘤細胞中選擇性斷裂)、肽連接子(其被腫瘤細胞中的酶所切割)、腙接頭。在另一些特定實施方案中，本發明的接頭選自不可切割的連接子，例如硫醚連接子。優選地，本發明的接頭選自可切割的mc-vc-PAB連接子和不可切割的mc連接子。
[具體實施例]
實施例1 人源化的c-Met抗體的製備及其氨基酸序列的確定
根據c-Met鼠源抗體mAAJ8D6進一步設計了多種嵌合抗體和人 源化抗體並進行親和力比較，最終確定候選的嵌合c-Met抗體c AAJ8D6 和人源化抗抗體AAJ8D6。
Figure 110132408-A0101-12-0020-52
抗c-Met人源化抗體AAJ8D6重鏈可變區氨基酸序列(SEQ ID NO：7)：
Figure 110132408-A0101-12-0020-53
抗c-Met人源化抗體AAJ8D6輕鏈可變區氨基酸序列(SEQ ID NO：8)：
Figure 110132408-A0101-12-0020-54
抗c-Met人源化抗體AAJ8D6重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO：9)：
Figure 110132408-A0101-12-0020-55
抗c-Met人源化抗體AAJ8D6輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO：10)：
Figure 110132408-A0101-12-0020-56
Figure 110132408-A0101-12-0021-57
實施例2 嵌合的cAAJ8D6和人源化抗體AAJ8D6親和力比較
用ELISA法測定嵌合的cAAJ8D6和人源化抗體AAJ8D6的親和力，以可溶性ED蛋白包被96孔板，之後與稀釋的抗體一起孵育，對於與ED相關的抗體用HRP-偶聯的羊F(ab')2抗-人IgG Fc-特異性二抗進行檢測。使用GraphPaD Prism軟體，將X變為logX，使用劑量反應曲線擬合作圖，擬合曲線見圖1。
從圖1給出的實驗結果可知：AAJ8D6與cAAJ8D6相比，通過人源化改造後的抗體AAJ8D6相對於嵌合抗體cAAJ8D6，不僅結合親和力未降低，反而有了更為顯著的提升，同樣的結合強度下，需要的抗體量降低一半以上，具體結果見表3：
Figure 110132408-A0101-12-0021-58
實施例3 人源化抗體AAJ8D6與競品ABT-700的結合力比較
釋液配置c-Met蛋白至終濃度2μg/ml，加入酶標板，每孔100μl，4℃過夜；棄去孔內溶液，PBST洗滌3次；加入封閉液，300μl/孔，37℃，孵育2h；棄去孔內溶液，PBST洗滌3次；將AAJ8D6抗體和ABT-700(即telisotuzumab，也稱特立妥組單抗，其序列資訊參見https：//extranet.who.int/soinn/mod/page/view.php？id=137&inn_n=10366，下同)稀釋9個濃度點，加入96孔板，孵育2h；棄去孔內溶液，PBST洗滌3次；加入稀釋液配置HRP檢測抗體，稀釋度為1：5000，每孔100μl，37℃，孵育1h；棄去孔內溶液，PBST洗滌3次；加入TMB顯色液室溫孵育2min，隨後加入Elisa終止液，上機讀數，獲得資料，結果見表4及圖2。
從表4和圖2可以看出，AAJ8D6的EC50值為0.54ng/ml，ABT-700的EC50值為1.33ng/ml，結果表明，AAJ8D6抗體與c-Met抗原的結合能力明顯優於ABT-700。
Figure 110132408-A0101-12-0022-59
實施例4 抗體藥物偶聯物的製備
抗體藥物偶聯物的製備採用通用的偶聯方法：用純化水分別配製還原劑和保護劑如下：1~20mM TCEP(Tris-2-carboxyethyl-phosphine)、1~20mM DTPA(Diethylene triamine pentacetate acid)母液，還原劑用量根據所需偶聯率不同可在一定濃度範圍內添加，與一定濃度單克隆抗體(如：5~30mg/mL)按照一定體積比(1：1)混合，TCEP與抗體的終濃度摩爾比0.5~6.0：1，於25℃攪拌反應1h。TCEP還原後的抗體可直接進行偶聯。
配製一定濃度(5mM)連接子-活性藥物單元化合物溶於25%的DMSO(dimethyl sulfoxide，二甲亞碸)，按照藥物與巰基的摩爾比0.3~2.8：1緩慢加藥，於25℃攪拌反應1-4h。反應結束後，用PBS緩衝液離心超濾3次，純化去除殘餘未反應藥物以及DMSO等游離小分子，並且利用SDS-PAGE電泳和疏水高效液相(HIC-HPLC)法檢測偶聯情況。
本實施例採用的連接子-活性藥物單元化合物為Mc-Val-Cit-PAB-MMAE、D07-Val-Cit-PAB-MMAE和Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE，其結構式分別如下所示(合成方法分別參見專利申請CN108853514A(說明書第14頁)，CN111433188A(說明書第53頁)，WO2019223579A1(說明書第25-27頁))。
Figure 110132408-A0101-12-0022-21
Figure 110132408-A0101-12-0023-83
Figure 110132408-A0101-12-0023-84
利用上述方法製備了如下ADC(p為選自1、2、3、4、5、6、7、8的整數，q為選自1、2、3、4的整數，Ab為本發明提供的AAJ8D6抗體)，這些ADC的平均DAR為4。
Figure 110132408-A0101-12-0023-86
Figure 110132408-A0101-12-0023-87
Figure 110132408-A0101-12-0024-88
除此之外，本實施例還製備了抗體部分為ABT-700抗體，連接基團為Mc-Val-Cit-PAB，活性藥物單元為MMAE的抗體藥物偶聯物，p為選自1、2、3、4、5、6、7、8的整數，其平均DAR為4。
Figure 110132408-A0101-12-0024-89
除此之外，本實施例還製備了人免疫球蛋白IgG1和Mc-Val-Cit-PAB以及MMAE的抗體藥物偶聯物(即IgG1-Mc-Val-Cit-PAB)，p為選自1、2、3、4、5、6、7、8的整數，其平均DAR為4。
Figure 110132408-A0101-12-0024-90
實施例5 細胞內吞實驗
將HT29細胞以每孔約1×105個細胞重懸于6孔板中。將AAJ8D6抗體、AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE、AAJ8D6-PY-Val-Cit-MMAE、AAJ8D6-D07-Val-Cit-MMAE分別與pHAb胺反應性染料綴合，然後用細胞培養基稀釋至10μg/ml。將100μl AAJ8D6抗體、AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE、AAJ8D6-PY-Val-Cit-MMAE、AAJ8D6-D07-Val-Cit-MMAE的染料複合物加入到細胞中，在指示時間(0小時、1小時、3小時、5小時、21小時和24小時)下于37℃溫育。通過流式細胞儀測量AAJ8D6抗體、AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE、AAJ8D6-PY-Val-Cit-MMAE、AAJ8D6-D07-Val-Cit-MMAE的內吞效果。24小時後，樣品在HT29細胞中內吞明顯；3小時後，內吞效果均在90%左右，可見本發明提供的人源化抗體和製備的ADC均其有良好的內吞效果，將能夠將藥物高效傳遞到靶細胞中。結果如圖3所示。
實施例6 人源化抗體AAJ8D6及其抗體藥物偶聯物(AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE)的細胞毒活性
將指數倍增期的不同c-Met表達水準的細胞MKN-45、SNU-620、HT29、BXPC-3分別接種于96孔板。37℃、5% CO2培養箱孵育過夜。將AAJ8D6、AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE、IgG1-Mc-Val-Cit-PAB用完全培養基配製為濃度1.25~2000ng/mL，MMAE用完全培養基配製為濃度0.0021~80ng/mL，100μL加入孔中，每個濃度設立3個複孔，同時設置空白對照組。藥物作用72±2h後，加CCK-8試劑，37℃、5% CO2培養箱孵育1~4h，於酶標儀450nm處檢測各孔的OD值。計算抑制率IR%=(OD空白-OD藥物)×100/OD空白。將抑制率和藥物濃度進行四參數擬合，計算IC50。
結果及結論：如圖4A、圖4B、圖4C、圖4D所示，AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE的細胞毒性活性與細胞株c-Met表達量正相關，AAJ8D6對靶細胞不具備細胞毒作用，AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE的細胞毒性主要來源於MMAE，與IgG1-Mc-Val-Cit-PAB相比，具有明顯的靶向性。
實施例7 抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE與 抗體藥物偶聯物ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE的體外藥效差異
將人結腸癌細胞HT29細胞株懸液以100μL/孔、5000個/孔的密度加到96孔板中，置於水飽和的37℃的CO2培養箱培養過夜。將抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE和抗體藥物偶聯物ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE進行梯度稀釋並加到含有細胞的96孔板中，100μL/孔。繼續置於37℃培養箱中培養72小時。酶標儀讀取450nm處OD值，抑制率計算公式為：IR%=(OD空白-OD藥物)×100/OD空白。由曲線擬合軟體Softmax Pro7.0.3 Gxp計算得IC50值。
結果如表5和圖5所示。實驗結果表明，AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE的IC50最大抑制率顯著優於抗體藥物偶聯物ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE。表明AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE的體外藥效優於抗體藥物偶聯物ABT-700-Mc-Val-Cit-MMAE。
Figure 110132408-A0101-12-0026-60
實施例8 抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE對人胃癌細胞MKN-45在Balb/c裸小鼠皮下移植瘤療效
取42只6-7周齡Balb/c裸小鼠，在小鼠右腋下靠背部皮下植入0.1mL MKN-45細胞懸液(2.4×106cells/只)，待腫瘤生長至約100~300mm3時，按照腫瘤體積大小隨機分組，分為Vehicle(PBS)組，IgG1-Mc-Val-Cit-PAB(3mg/kg)組，抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE(0.75mg/kg)組，抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE(1.5mg/kg)組，抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE(3mg/kg)，人源化抗體AAJ8D6(3mg/kg)組，每組6只荷瘤鼠，各組均靜脈注射給藥，每週給藥1次，共給藥3次，給藥期間每週測量2次腫瘤長徑、短徑及體重。 給藥後第21天時計算腫瘤抑制率(TGIRTV)進行藥效評價。
【00100】計算公式：
【00101】腫瘤體積：TV=D1×D22/2，其中D1、D2分別表示瘤長徑、 瘤短徑；
【00102】相對腫瘤體積：RTV=TVn/TV0，其中TV0為給藥前腫瘤體積，TVn為每次測量時腫瘤體積；
【00103】相對腫瘤抑制率：TGIRTV(%)=(1-TRTV/CRTV)×100%，TRTV表示給藥組或陽性對照組RTV，CRTV表示陰性對照組RTV。
Figure 110132408-A0101-12-0027-61
【00104】結果及結論：各實驗組和對照組對MKN-45裸小鼠皮下移植瘤抑制作用分別如表6和圖6所示，其中表6為各實驗組和對照組對MKN-45裸小鼠皮下移植瘤體積以及抑制率，圖6為給藥後腫瘤生長曲線。實驗結果表明，抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE對MKN-45裸小鼠皮下移植瘤具有顯著的抑瘤作用。
【00105】實施例9 抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE對小鼠PDX模型(胃癌GA0046)的療效
【00106】小鼠胃癌GA0046的PDX模型(即人源性組織異種移植，patient-derivedxenografts)是通過將人胃癌患者的腫瘤組織移植至重症免疫缺陷型小鼠體內構建，胃癌組織在小鼠體內生長，形成移植瘤。
【00107】挑取腫瘤生長狀態良好的荷瘤鼠安樂死，取下腫瘤後切成小塊(直徑2-3mm)，然後接種於小鼠右側肩部，建立胃癌皮下模型。定期觀察腫瘤生長情況，待腫瘤生長至平均體積約100~150mm3時根據腫瘤大小和小鼠體重隨機分組給藥，按照腫瘤體積大小隨機分組，分為Vehicle(PBS)組，抗體藥物偶聯物 AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE(10mg/kg)組，IgG1-Mc-Val-Cit-PAB(10mg/kg)組，每組6只荷瘤鼠，各組靜脈注射給藥，每週給藥1次，共給藥2次，共給藥21次。給藥期間每週測量2次腫瘤長徑、短徑及體重。給藥後第21天時計算腫瘤抑制率(TGIRTV)進行藥效評價。
【00108】計算公式：
【00109】腫瘤體積：TV=D1×D22/2，其中D1、D2分別表示瘤長徑、瘤短徑；
【00110】相對腫瘤體積：RTV=TVn/TV0，其中TV0為給藥前腫瘤體積，TVn為每次測量時腫瘤體積；
【00111】相對腫瘤抑制率：TGIRTV(%)=(1-TRTV/CRTV)×100%，TRTV表示給藥組或陽性對照組RTV，CRTV表示陰性對照組RTV。
【00112】結果及結論：各實驗組和對照組對小鼠胃癌PDX模型(GA0046)腫瘤抑制作用分別如表7和圖7所示，其中表7為小鼠胃癌PDX模型(GA0046)腫瘤體積以及抑制率，圖7為給藥後腫瘤生長曲線。結果顯示，抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE以10mg/kg劑量單對胃癌GA0046PDX腫瘤模型具有顯著的抗腫瘤效果。
Figure 110132408-A0101-12-0028-62
【00113】實施例10 抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE對小鼠PDX模型(肺癌LU2503)的療效
【00114】小鼠肺癌LU2503的PDX模型(即人源性組織異種移植，patient-derivedxenografts)是通過將人肺癌患者的腫瘤組織移植至重症免疫缺陷型小鼠體內構建，肺癌組織在小鼠體內生長，形成移植瘤。
【00115】挑取腫瘤生長狀態良好的荷瘤鼠安樂死，取下腫瘤後切成 小塊(直徑2-3mm)，然後接種於小鼠右側肩部，建立肺癌皮下模型。定期觀察腫瘤生長情況，待腫瘤生長至平均體積約150mm3時根據腫瘤大小和小鼠體重隨機分組給藥，分為Vehicle(PBS)組，人源化抗體AAJ8D6(10mg/kg)組，抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE低、中、高(1.1、3.3、10mg/kg)組，每組6只荷瘤鼠，抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE及人源化抗體AAJ8D6組靜脈注射給藥，每週給藥1次，共給藥2次。給藥期間每週測量2次腫瘤長徑、短徑及體重。給藥後第21天時計算腫瘤抑制率(TGIRTV)進行藥效評價。
【00116】計算公式：
【00117】腫瘤體積：TV=D1×D22/2，其中D1、D2分別表示瘤長徑、瘤短徑；
【00118】相對腫瘤體積：RTV=TVn/TV0，其中TV0為給藥前腫瘤體積，TVn為每次測量時腫瘤體積；
【00119】相對腫瘤抑制率：TGIRTV(%)=(1-TRTV/CRTV)×100%”TRTV表示給藥組或陽性對照組RTV，CRTV表示陰性對照組RTV。
【00120】結果及結論：各實驗組和對照組對小鼠肺癌PDX模型(LU2503)腫瘤抑制作用分別如表8和圖8所示，其中表8為小鼠肺癌PDX模型(LU2503)腫瘤體積以及抑制率，圖8為給藥後腫瘤生長曲線。結果顯示，抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE以1.1mg/kg、3.3mg/kg、10mg/kg劑量單獨使用對LU2503腫瘤模型有顯著的抗腫瘤效果，尤其是3.3mg/kg、10mg/kg組小鼠腫瘤完全消失。
Figure 110132408-A0101-12-0029-63
【00121】上述實施例顯示，本發明提供的抗體藥物偶聯物AAJ8D6-Mc-Val-Cit-MMAE具有十分顯著的針對c-Met陽性腫瘤的治療效果。
【00122】本文中應用了具體實施例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用於幫助理解本發明的方法及其中心思想。應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護。
<110> 榮昌生物製藥(煙臺)股份有限公司
<120> 抗c-Met抗體藥物偶聯物及其應用
<130> 2021
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Figure 110132408-A0101-12-0031-64
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Figure 110132408-A0101-12-0031-65
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Figure 110132408-A0101-12-0031-66
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Figure 110132408-A0101-12-0031-67
Figure 110132408-A0101-12-0032-69
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Figure 110132408-A0101-12-0032-70
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<2 3> 人工序列
<400> 6
Figure 110132408-A0101-12-0032-71
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Figure 110132408-A0101-12-0032-72
Figure 110132408-A0101-12-0033-73
<210> 8
<211> 115
<212> PRT
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<210> 9
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Figure 110132408-A0101-12-0033-75
Figure 110132408-A0101-12-0034-77
Figure 110132408-A0101-12-0035-80
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Figure 110132408-A0101-12-0036-81
Figure 110132408-A0101-12-0037-82

Claims (29)

  1. 一種靶向c-Met的人源化抗體或其抗原結合片段，所述的人源化抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其特徵在於：
    (1)重鏈可變區的序列如SEQ ID NO：7所示，或與SEQ ID NO：7具有相同的CDR 1-3且與SEQ ID NO：7相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列；和/或
    (2)輕鏈可變區的序列如SEQ ID NO：8所示，或與SEQ ID NO：8具有相同的CDR 1-3且與SEQ ID NO：8相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列。
  2. 根據請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的人源化抗體或其抗原結合片段選自單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、包含所述抗原結合片段的重組蛋白或Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb、Fd、單鏈抗體(scFv)。
  3. 根據請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的抗體或抗原結合片段還包含免疫球蛋白的恒定區，其中所述的免疫球蛋白選自IgG1,IgG2,IgG3,IgG4。
  4. 根據請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中：
    (1)重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；和/或
    (2)輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
  5. 根據請求項4所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的靶向c-Met的人源化抗體的重鏈和輕鏈分別為：
    (1)重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；和/或
    (2)輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
  6. 分離的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸編碼根據請求項1-5所述的抗體或其抗原結合片段。
  7. 一種核酸構建體，其特徵在於，所述核酸構建體包含請求項6所述的多核苷酸。
  8. 根據請求項7所述的核酸構建體，其特徵在於，所述核酸構建體為表達載體，其中所述的多核苷酸與允許其所編碼的多肽在宿主細胞或無細胞表達系統中表達的調節序列有效連接。
  9. 一種宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞包含請求項6所述的多核苷酸或者請求項7或8所述的核酸構建體；其優選自原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、大腸桿菌細胞；更優選的，所述的宿主細胞選自CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞或BHK細胞。
  10. 請求項1至5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的生產方法，其特徵在於，所述方法包括在允許請求項8所述的核酸構建體表達的條件下培養請求項9所述的宿主細胞，並從培養物中回收產生的表達蛋白。
  11. 一種靶向c-Met的抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述抗體藥物偶聯物包含與一個或多個治療劑偶聯的請求項1-5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  12. 根據請求項11所述的抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述治療劑選自細胞毒性分子、免疫增強劑和放射性同位素，所述細胞毒性分子包括但不限於微管蛋白抑制劑或DNA損傷劑；進一步優選的，所述微管蛋白抑制劑包括但不限於海兔毒素(dolastatin)及奧瑞他汀(auristatin)類細胞毒分子，美登素(maytansine)類細胞毒分子；所述DNA損傷劑包括但不限於卡奇黴素(calicheamicin)類、倍癌黴素(duocarmycin)類、安麯黴素類衍生物PBD、喜樹堿(camptothecins)及喜樹堿類衍生物、SN-38、Dxd；進一步優選的，所述奧瑞他汀(auristatin)類細胞素分子包括但不限於MMAE或MMAF或它們的洐生物，所述美登素類細胞毒分子包括但不限於DM1、DM4或它們的洐生物。
  13. 根據請求項12所述的抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述的抗體藥物偶聯物結構通式為A-(L-U)n，其中：所述A表示請求項1-5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段；所述U為活性藥物單元；所述L為任一連接基團，所述L分別與所述A及所述U共價連接；n為選自1、2、3、4、5、6、7或8中的整數；所述A上通過一個或多個所述L連接1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個所述的U。
  14. 根據請求項13所述的抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述L與所述A上的氨基殘基或巰基殘基共價連接；優選的，所述L與所述A上的巰基殘基共價連接；更優選的，所述L與所述A上的鏈間二硫健打開後形成的巰基殘基共價連接。
  15. 根據請求項14所述的抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述L包括可裂解連接子和不可裂解連接子。
  16. 根據請求項15所述的抗體藥物偶聯物，其特徵在於：所述的可裂解連接子包含肽單元，所述的肽單元包含2-20個氨基酸，優選的所述的肽單元選自由-纈氨酸-瓜氨酸-(-Val-Cit-)、-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-(-Gly-Gly-Phe-Gly-)、-纈氨酸-丙氨酸-(-Val-Ala-)、-纈氨酸-賴氨酸-(-Val-Lys-)、-纈氨酸-精氨酸-(-Val-Arg-)、-苯丙氨酸-瓜氨酸-(-Phe-Cit-)、-苯丙氨酸-賴氨酸-(-Phe-Lys-)、-苯丙氨酸-精氨酸-(-Phe-Arg-)及它們的組合。
  17. 根據請求項15或16所述的抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述L包括以下結構：
    Figure 110132408-A0101-13-0003-24
    Figure 110132408-A0101-13-0004-95
    Figure 110132408-A0101-13-0005-96
    Figure 110132408-A0101-13-0006-97
  18. 根據請求項13或請求項17所述的抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述U選自以下結構：
    Figure 110132408-A0101-13-0006-29
    Figure 110132408-A0101-13-0007-98
    Figure 110132408-A0101-13-0008-99
  19. 請求項13所述的抗體藥物偶聯物，所述抗體藥物偶聯物選自如下結構：
    Figure 110132408-A0101-13-0008-32
     其中，ADC-1中所述的n為選自1、2、3、4、5、6、7、8中的整數；或者
    Figure 110132408-A0101-13-0008-33
     其中，ADC-2中所述的n為選自1、2、3、4中的整數；或者
    Figure 110132408-A0101-13-0009-34
     其中，ADC-3中所述的n為選自1、2、3、4中的整數；或者
    Figure 110132408-A0101-13-0009-35
     其中，ADC-4中所述的n為選自1、2中的整數；或者
    Figure 110132408-A0101-13-0009-36
     其中，ADC-5中所述的n為選自1、2、3、4、5、6、7、8中的整數；或者
    Figure 110132408-A0101-13-0009-37
     其中，ADC-6中所述的n為選自1、2、3、4、5、6、7、8中的整數；或者
    Figure 110132408-A0101-13-0010-38
     其中，ADC-7中所述的n為選自1、2、3、4、5、6、7、8中的整數。
  20. 一種藥物組合物，其包含請求項1-5中任一項的抗體或其抗原結合片段和/或請求項11-19中任一項的抗體藥物偶聯物，以及可藥用載體。
  21. 請求項1-5中任一項的抗體或其抗原結合片段、請求項6所述的多核苷酸、請求項7或8所述的核酸構建體、請求項11-19中任一項的抗體藥物偶聯物或請求項20所述的藥物組合物在製備用於治療或預防癌症的藥物中的用途。
  22. 根據請求項21的用途，其中所述癌症為c-Met陽性癌症。
  23. 根據請求項22的用途，所述c-Met陽性癌症為肺癌和胃癌。
  24. 一種試劑盒，其包括容器、置於所述容器中的製劑和任選的說明書；其中所述製劑包含請求項1-5所述的抗體或其抗原結合片段或請求項11-19所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物以及請求項20所述的藥物組合物。
  25. 請求項1-5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、請求項11-19中任一項所述的抗體藥物偶聯物、請求項6所述的多核苷酸、請求項7或8所述的核酸構建體、或請求項20所述的藥物組合物在製備用於治療或預防癌症的藥物中的用途。
  26. 根據請求項25所述的用途，其中所述癌症為實體瘤；進一步的，所述實體瘤包括肺癌和胃癌。
  27. 一種重組蛋白，其特徵在於，所述重組蛋白包括請求項1-5中任一項的抗體或抗原結合片段。
  28. 根據請求項27所述的重組蛋白，其中所述重組蛋白為雙特異性抗體或多特異性抗體。
  29. 請求項1-5中任一項的抗體或抗原結合片段在製備重組蛋白中 的應用。
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