CN109541221B - 一种c-Met特异性抗体、组合物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种c‑Met特异性抗体、组合物及试剂盒。所述c‑Met特异性抗体包含轻链CDR区和重链CDR区，所述轻链CDR区包含CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3，所述重链CDR区包含CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3。所述c‑MET抗体的优点包括：对c‑MET的亲和力强、特异性好，既无交叉反应，又稳定性好，能够在4℃下长时间保存。上述优点使得该c‑MET抗体及其衍生的组合物、试剂盒等产品有利于c‑MET的检测。

Description

一种c-Met特异性抗体、组合物及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及c-Met特异性抗体、组合物及试剂盒。

背景技术

受体酪氨酸激酶(c-Met)是由原癌基因Met编码，其前体蛋白分子量为140KD，经糖基化作用后形成170KD的糖蛋白，进而切割成50KD的α亚基和145KD的β亚基，两个亚基以二硫键相连形成190KD的成熟受体蛋白，位于细胞膜上。β亚基有胞外区、跨膜区和胞内区，α亚基只有胞外部分。α亚基和β亚基的胞外区是配体识别部位，而胞内部分具有酪氨酸激酶活性。c-Met的配体为肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)，HGF与c-Met胞外域结合形成一个紧密复合体，诱导受体的多聚化、内吞、胞内激酶结构域中多个酪氨酸残基的磷酸化，从而激活多条信号级联通路，调控细胞的生长、迁移、增殖和存活。c-Met的异常激活可通过非HGF依赖性机制发生，如Met基因的突变、基因扩增及转录水平上调等。c-Met还可通过与EGFR的相互作用而被激活，与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的耐药性有关。c-Met通路异常与肿瘤的发展、侵袭及转移密切相关，目前已在多种人类恶性肿瘤如肺癌、胃癌、乳腺癌等中发现异常高水平表达的c-Met。

基于c-Met基因表达与肿瘤发生的相关性、c-Met过表达对EGFR-TKI的抗性，以及c-Met与EGFR-TKI间的协同效应，如何同时快速、准确地检测c-Met蛋白的表达情况对肿瘤患者的用药选择具有重要意义。免疫检测法由于操作简单、耗时短、成本相对较少，已经成为目前检测c-Met蛋白表达的主要方法。而c-Met蛋白的免疫检测法依托于c-Met蛋白抗体，c-Met蛋白抗体的优劣直接影响检测结果的准确性，因此需要一种特异性强、稳定性好的c-Met特异性抗体。其除了可用于c-Met基因表达检测外，还可能用于c-Met-HGF信号通路的靶向治疗。鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明提出一种与常规c-Met抗体不同的非重叠表位结合的c-Met抗体，其可有效应用于c-Met基因表达检测。

为了实现上述目的，特采用以下技术方案：

一种c-Met特异性抗体，包含轻链CDR区和重链CDR区，所述轻链CDR区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述重链CDR区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；

其中，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～3所示；

所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4～6所示。

本发明还涉及组合物，所述组合物包括前述c-Met特异性抗体。

进一步，所述c-Met抗体在所述组合物中的浓度为0.1～0.8μg/mL，例如，0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL或0.8μg/mL。

进一步，所述组合物中还包括抗体稳定剂。

所述抗体稳定剂包括糖、醇类、生物碱、水溶性蛋白、无机盐和离子螯合剂中的一种或多种。

其中，所述糖选自葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、岩藻糖或海藻糖中的一种或多种；所述醇类选自甘油、山梨醇、甘露醇中的一种或多种；优选地，所述抗体稳定剂包括葡萄糖、山梨醇、甜菜碱、明胶、氯化钠、EDTA、Tween-20、Proclin-300(生物防腐剂)；更优选地，所述抗体稳定剂包括0.2-3％(质量比)葡萄糖、1-3％(质量比)山梨醇、0.2-4％(质量比)甜菜碱、0.05-0.1％(质量比)明胶、1-3％(质量比)的氯化钠、0.1-0.2％EDTA、0.1-2％(体积比)Tween20、0.005-0.05％(体积比)Proclin-300；最优选地，所述抗体稳定剂包括1％(质量比)葡萄糖、1.5％(质量比)山梨醇、2％(质量比)甜菜碱、0.5％(质量比)明胶、1.3％(质量比)的氯化钠、0.1％EDTA、1％(体积比)Tween20、0.01％(体积比)Proclin-300。

抗体主要是蛋白质，要保持抗体的活性，主要是保持抗体蛋白空间结构的稳定。所述的抗体稳定剂中糖类可以与蛋白分子形成氢键，代替了蛋白质极性基团周围的水分子，稳定了蛋白质的高级结构，起到保护抗体活性的作用；甘油、山梨醇可以保持抗原抗体表面的滋润，使其不至于因失水而失活。另外一些水溶性蛋白或化学惰性的高分子物质的聚合物(如PEG等)因其分子量大，能够在抗原抗体表面形成一种保护膜，使蛋白结构免遭破坏。离子螯合剂有多重功效，如抗氧化、防腐，亦可防止一些离子沉积，Proclin-300可以抑制微生物的生长。

本发明还涉及一种c-MET检测试剂盒，所述试剂盒包括前述c-Met特异性抗体或组合物。

进一步，所述试剂盒中还包括其他辅助检测试剂。

所述其他辅助检测试剂包括抗所述c-MET抗体的二抗、封闭液和内源性过氧化物酶阻断剂中的一种或多种，其中所述二抗标记有显色剂。

进一步，所述显色剂选自荧光标记、酶、金属离子或同位素。

优选地，所述显色剂为辣根过氧化物酶，所述试剂盒还包括显色底物DAB。

与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有以下优势：

本发明提供一种c-MET抗体及其衍生产品，所述抗体的优点包括：对c-MET的亲和力强、特异性好，既无交叉反应，又具有良好稳定性，同时能够长时间保存。上述优点使得该c-MET抗体及其衍生的组合物、试剂盒等产品有利于在实际c-MET检测中进行推广应用。

附图说明

图1为实施例8所述试剂盒对NCI-H441细胞的免疫组化染色结果；

图2为实施例8所述试剂盒对MCF-7细胞的免疫组化染色结果；

图3为实施例8中阴性试剂对NCI-H441细胞的免疫组化染色结果；

图4为实施例12所述试剂盒对c-MET高表达的非小细胞肺癌样本的免疫组合染色结果；

图5为实施例12所述试剂盒对c-MET低表达的非小细胞肺癌样本的免疫组合染色结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 c-MET单克隆抗体的制备

1.免疫动物

购买重组人Met(c-Met)蛋白(ab84806)作为免疫抗原，与弗氏完全佐剂1:1混合(每只小鼠的免疫抗原用量为100μg)，制备成"油包水"乳状液，免疫8-12周龄雌性Balb/c小鼠，免疫方式为皮下多点注射；两周之后，将免疫抗原与不完全弗氏佐剂混合(每只小鼠的免疫抗原用量为50μg)，对所述小鼠进行加强免疫，免疫方式为皮下多点注射；每隔两周以同样的方法进行加强免疫，共加强免疫3次。最后一次加强免疫采用静脉注射，免疫后的第3天，于小鼠眼眶后静脉丛采血并离心分离得到血清。采用方阵滴定法确定重组人Met(c-Met)蛋白的最佳包被浓度并以该浓度包被酶标板，其中空白对照以不含抗原的包被液包被。倍比稀释(起始稀释浓度1×10^-2μg/mL，稀释范围为1×10^-2～1×10^-7μg/mL)待测小鼠免疫血清，以小鼠免疫前血清为阴性对照，间接ELISA方法检测血清的抗体效价。酶标仪上测定OD450，若P/N≥2.1(P指免疫血清样品OD450值减去空白对照OD450值，N指阴性对照OD450减去空白对照OD450值)，则判断为阳性，反之若P/N＜2.1，则判断为阴性。

2.制备杂交瘤细胞和单克隆抗体

从阳性血清中挑选抗体效价高(血清效价≥1:10⁵)的小鼠，在无菌状态下取小鼠的脾脏，制备脾细胞悬液，取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0(2×10⁷-5×10⁷个/mL)1mL，与脾细胞(1×10⁸个/mL)1mL在预热至40℃的50％PEG(PH 8.0)的作用下融合，将融合后的细胞悬液分装至96孔细胞培养板，加入含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT选择培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱内培养，7天后改用HT培养基培养。融合细胞培养10天后，用间接ELISA方法检测细胞上清液，进行多轮反复筛选，选择强阳性，生长旺盛的融合细胞采用有限稀释法进行3次单克隆化培养，最终筛选获得5株稳定分泌单克隆抗体的细胞株1A2，2D5，2F3，5E1和6C6。

采用小鼠体内诱生法制备腹水型单克隆抗体：选用10周龄左右的Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5mL。7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠接种量为0.2mL(2.5×10⁶个/mL)。间隔4-5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待小鼠腹部明显膨大，即可用针头插入小鼠腹部采集腹水。将采集腹水于2000rpm离心5分钟，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，通过Protein G亲和层析纯化上述腹水上清，获得腹水型单克隆抗体1A2，2D5，2F3，5E1和6C6。

3.杂交瘤细胞染色体计数

将杂交瘤细胞培养至对数生长期，加入秋水仙素(0.3mg/L)，0.075mol/L KCl溶液低渗处理后，甲醇-冰醋酸溶液固定，制片，Giemsa染色，显微镜下选择分散良好的中期相，计数50个细胞的染色体平均数。结果显示5株杂交瘤细胞的染色体数在90-110条之间，符合杂交瘤细胞的核型特征。

4.鉴定单克隆抗体的亚型、效价、亲和常数

采用免疫球蛋白亚型检测试剂盒(Sigma公司)鉴定单克隆抗体1A2，2D5，2F3，5E1和6C6的Ig亚型，具体检测结果参见表1。

采用间接ELISA方法检测测定前述单克隆抗体的效价，具体检测结果参见表1。

采用非竞争酶联免疫实验测定前述单克隆抗体的亲和常数K_a，具体方法参见参考文献1，具体检测结果参见表1。

表1

实施例2测定单克隆抗体5E1的CDR区氨基酸序列

根据实施例1中表1所述检测结果判断单克隆抗体5E1为对c-MET的亲和力最强、特异性最高的抗体，将单克隆抗体5E1送至商业测序平台进行测序，获得其CDR区氨基酸序列。具体结果如表2所示。

表2

实施例3 c-MET免疫组化试剂盒的制备

本实施例提供一种c-MET免疫组化试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：

c-MET抗体试剂：单克隆抗体5E1，已由抗体稳定剂稀释至0.1μg/mL，其中所述抗体稳定剂的配方如下所示：1％(质量比)葡萄糖、1.5％(质量比)山梨醇、2％(质量比)甜菜碱、0.5％(质量比)明胶、1.3％(质量比)氯化钠、0.1％EDTA、1％(体积比)Tween20、0.01％(体积比)Proclin-300(生物防腐剂)；

内源性过氧化物酶阻断剂：3％(v/v)的H₂O₂溶液；

HRP-羊抗小鼠IgG：购买于上海碧云天生物技术有限公司，产品型号为：A0216；

封闭液：磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)溶液；

DAB显色液，购买于上海碧云天生物技术有限公司，产品编号为：P0203。

实施例4～7 c-MET免疫组化试剂盒的应用

实施例4～7参照实施例3制备免疫组化试剂盒，区别仅在于，所述单克隆抗体5E1的浓度分别为0.05μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL或0.8μg/mL。

实施例8 c-MET免疫组化试剂盒的应用

本实施例提供实施例3所述免疫组化试剂盒在细胞爬片染色中的具体应用：

1、细胞爬片的制备

在含5％CO₂的37℃细胞培养箱内用含10％胎牛血清的1640培养基培养NCI-H441细胞(c-MET阳性)，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养MCF-7细胞(c-MET阴性)；取对数生长期细胞用0.25％胰蛋白酶消化，将其转移至铺有灭菌圆玻片的六孔板中，所述玻片在使用前预先涂抹多聚赖氨酸；培养48h后，吸尽培养基，PBS洗涤2次，滴加4％甲醛固定20min，PBS洗涤4～5次后，备用或于4℃保存。

2.细胞免疫组化

(1)将内源性过氧化物酶阻断剂滴加至玻片上，4℃孵育10min以阻断内源性过氧化物酶干扰，之后，使用PBS洗涤3～4次；

(2)加入封闭剂封闭20min，吸弃封闭剂；

(3)滴加c-MET抗体试剂，37℃下孵育1h，PBS洗涤3～4次；

(4)滴加HRP-羊抗小鼠IgG，37℃孵育30min，PBS洗涤3～4次；

(5)滴加DAB显色液，室温下避光反应5min，蒸馏水洗涤终止反应，分别置于75％乙醇中5min，95％乙醇中5min，无水乙醇中5min，二甲苯中5min。然后滴加中性树脂，盖玻片封片，显微镜下观察染色情况。

3.染色结果

具体染色结果见图1～2。其中，图1为NCI-H441的染色结果(三次平行实验，结果分别为图1A、图1B和图1C)，c-MET着色为棕褐色部分，分布于细胞膜上，染色效果明显；图2为MCF-7的染色结果(三次平行实验，结果分别为图2A、图2B和图2C)，细胞无着色。

本实施例还设置空白对照组，使用阴性试剂对NCI-H441细胞进行免疫染色，具体染色方法与上述实验方法基本相同，区别仅在于，阴性试剂是不含c-MET抗体的抗体稳定剂，以其代替c-MET抗体试剂滴加至细胞爬片。具体染色结果如图3所示(三次平行实验，结果分别为图3A、图3B和图3C)。

根据图1～3的染色结果可知，本发明实施例3所述试剂盒在进行细胞免疫染色时，信噪比强，非特异性染色弱，具有灵敏度高和特异性强的优点。

实施例9抗体浓度对免疫组化检测效果的影响

采用本发明实施例3～7所述试剂盒对NCI-H441细胞和MCF-7细胞进行免疫组化检测，对比染色效果，并对染色结果进行半定量分析以评价抗体浓度对免疫组化检测效果的影响，具体检测方法参照实施例8。免疫组化的半定量一般分为三级：弱(1+)，中(2+)，强(3+)，本实施例的半定量分析结果如表3所示，本发明所述单克隆抗体5E1在0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、0.8μg/mL的浓度下对NCI-H441细胞的染色结果均为强阳性，表现出良好的检出效果，其中以0.1～0.8μg/mL单抗的检测效果较佳，对阴性对照MCF-7细胞均无假阳性结果检出，表明本发明所述单抗具有灵敏度高、特异性好的优点。

表3

抗体	NCI-H441染色结果	MCF-7染色结果
			0.8μg/mL	3+	＜1+
0.5μg/mL	3+	＜1+
			0.2μg/mL	3+	＜1+
0.1μg/mL	3+	＜1+
			0.05μg/mL	2+～3+	＜1+

实施例10抗体稳定剂对免疫组化检测效果的影响

对比试剂盒：参照实施例3制备试剂盒，区别仅在于，使用市售抗体稳定剂Sigma-55514稀释抗体。

使用实施例3所述试剂盒(4℃保存)和对比试剂盒(4℃保存)在0天、15天、30天、90天、180天、365天分别对NCI-H441细胞和MCF-7细胞进行免疫组化检测，对比染色效果，并对染色结果进行半定量分析，以评价抗体的稳定性，具体检测方法参照实施例8。免疫组化的半定量一般分为三级：弱(1+)，中(2+)，强(3+)，本实施例的半定量分析结果如表4所示，实施例3所述试剂盒在4℃下保存365天后，仍然对NCI-H441细胞具有良好的检出效果，表明与市售稳定剂Sigma-55514相比，本发明所述试剂盒所使用的稳定剂的效果更好。

表4

实施例11 c-MET免疫组化试剂盒稳定性评价

实施例3所述试剂盒、对比试剂盒、市售试剂盒和衍生试剂盒在4℃下保存15天、30天、90天、180天、360天、540天后，分别对NCI-H441细胞和MCF-7细胞进行免疫组化检测，对比染色效果，并对染色结果进行半定量分析，以评价抗体的稳定性。具体检测方法参照实施例8和市售试剂盒说明书。

其中市售试剂盒中使用的抗体为：鼠抗人c-MET单克隆抗体(Thermo Fisher:18-7366)，抗体稀释剂为Sigma-55514，所述单克隆抗体工作浓度为1:250。衍生试剂盒：同前述市售试剂盒，区别仅在于使用本发明实施例3所述抗体稳定剂稀释前述单克隆抗体至工作浓度。

具体半定量分析结果如表5所示，针对同样的样本，实施例3所述试剂盒无论是在短期还是较长时间内，其对阳性对照NCI-H441细胞的检出效果均显著优于市售试剂盒，表明与现有市售试剂盒相比，本发明所述试剂盒的灵敏度和稳定性更好。同时，通过实施例3与对比试剂盒的比较，以及实施例3与衍生试剂盒的比较可知，本发明所示试剂盒所示的优良稳定性是由本发明所述5E1单克隆抗体与本发明所述抗体稳定剂共同作用而产生的。

表5

实施例12 c-MET免疫组化试剂盒临床样本应用

以非小细胞肺癌组织切片样本(甲醛固定，石蜡包埋)为例，使用实施例3所述试剂盒(4℃保存)按如下方法进行检测：

(1)脱蜡水化：切片依次浸没在脱蜡剂中10分钟，脱蜡剂中10分钟，脱蜡剂中10分钟，无水乙醇中5min，无水乙醇中5min，95％乙醇中5min，75％乙醇中5min，PBS溶液中5分钟。

(2)抗原修复：将切片浸入1mM已煮沸的EDTA抗原修复溶液中(pH9.0)中，于微波炉中低火(60-70℃)加热10分钟。冷却后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5分钟。

(3)封闭内源性酶活：在切片上滴加3％H₂O₂，可覆盖整张组织切片。室温放置15分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。

(4)封闭：在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。

(5)一抗：将c-MET抗体试剂滴加在切片组织上，室温孵育1个小时。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。

(6)二抗：将HRP-羊抗小鼠IgG工作液滴加在切片组织上，室温孵育30min。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。

(7)DAB显色：在配备的小试管中依次滴加稳定型DAB缓冲液1mL，稳定型DAB底物50-100μl，稳定型DAB色原50-100μl，以配制DAB显色液，混匀，避光。混匀后加至切片。室温显色，镜下控制显色时间，一般5-10分钟。蒸馏水洗涤终止反应。

(8)苏木素复染：切片上滴加苏木素染液，1-2分钟，之后用蒸馏水洗涤。

(9)脱水、透明、封片：切片分别置于75％乙醇中5分钟，95％乙醇中5分钟，无水乙醇中5分钟，二甲苯中5分钟。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。

染色结果见图4和图5，图4为c-MET单克隆抗体免疫染色结果(c-MET着色为棕色部分，蓝色部分为细胞核)，图5为阴性对照。图4中棕色部分即为阳性着色，c-MET主要表达在肿瘤细胞的细胞膜中，可以看到棕色着色大部分围绕蓝色的细胞核分布。图5阴性对照中无任何棕色着色，表明实验体系正常，可有效避免非特异性背景着色。

参考文献1：Raghava GPS,Agrewala JN.Method for determining the affinityof monoclonal antibody using non-competitive ELISA：a computer program,JImmunoassay Immunochem,1994,15(2):115-128。

参考文献2：《感染与免疫学实验教程》，李立伟主编，2015年1月出版，浙江大学出版社，第237页。

SEQUENCE LISTING

<110> 益善生物技术股份有限公司

<120> 一种c-MET特异性抗体、组合物及试剂盒

<130> 2018

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 未知

<400> 1

Arg Leu Ala Asn Tyr Ala Ala Val Cys Lys Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 未知

<400> 2

Ser Asp Leu Ile Glu Gln Val

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 未知

<400> 3

Gln Leu Pro Trp Val Tyr

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 未知

<400> 4

Leu Ala His Glu Glu Asp Lys

1 5

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知

<400> 5

Asp Gly Thr Ile Ala Lys Thr Gln Ile Glu His Gln

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 未知

<400> 6

Asn Cys Met Ser Phe His Trp Gly Glu Gln Asp Asn His Lys

1 5 10

Claims (13)

1.一种c-Met特异性抗体，其特征在于包含轻链CDR区和重链CDR区，所述轻链CDR区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述重链CDR区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1~3所示；所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4~6所示。

2.一种组合物，其特征在于包含如权利要求1所述的c-Met特异性抗体。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述c-Met特异性抗体在所述组合物中的浓度为0.1~0.8μg/mL。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于还包括抗体稳定剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述抗体稳定剂包括糖、醇类、生物碱、水溶性蛋白、无机盐和离子螯合剂中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述糖选自葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、岩藻糖或海藻糖中的一种或多种；所述醇类选自甘油、山梨醇、甘露醇中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于所述抗体稳定剂包括葡萄糖、山梨醇、甜菜碱、明胶、氯化钠、EDTA、Tween-20、Proclin-300。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于所述抗体稳定剂包括质量比为0.2-3%的葡萄糖、质量比为1-3%的山梨醇、质量比为0.2-4%的甜菜碱、质量比为的0.05-0.1%明胶、质量比为1-3%的氯化钠、0.1-0.2%的 EDTA、体积比为0.1-2％的Tween20、体积比为0.005-0.05％的Proclin-300。

9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于所述抗体稳定剂包括质量比为1%的葡萄糖、质量比为1.5%的山梨醇、质量比为2%的甜菜碱、质量比为0.5%的明胶、质量比为1.3%的氯化钠、0.1% 的EDTA、体积比为1％的Tween20、体积比为0.01％的Proclin-300。

10.一种c-MET检测试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述的c-Met特异性抗体或如权利要求2～9任一项所述的组合物。

11.根据权利要求10所述的c-MET检测试剂盒，其特征在于还包括抗权利要求1所述c-MET特异性抗体的二抗、封闭液和内源性过氧化物酶阻断剂中的一种或多种，其中所述二抗标记有显色剂。

12.根据权利要求11所述的c-MET检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂选自荧光标记、酶、金属离子或同位素。

13.根据权利要求12所述的c-MET检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂为辣根过氧化物酶，所述试剂盒还包括显色底物DAB。

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