DE69934259T2

DE69934259T2 - Kombination von einem Anti-Ep-CAM-Antikörper mit einem chemotherapeutischen Mittel

Info

Publication number: DE69934259T2
Application number: DE69934259T
Authority: DE
Inventors: Vincent C. Research Triangle Park Knick; Julie Beth Research Triangle Park Stimmel; Linda M. Research Triangle Park Thurmond
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 1999-07-23
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2019-07-24
Also published as: ES2277683T3; US20100172903A1; JP2003505432A; US20050163785A1; AU5286999A; US7648703B2; EP1198251B1; EP1198251A1; US7939074B2; WO2001007082A1; DE69934259D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kombination aus Antikörpern, die spezifisch das Ep-CAM-Antigen binden, mit chemotherapeutischen Mitteln, die das Zellwachstum durch Blockierung des Voranschreitens des Zellzyklus in G₂/M beeinflussen, und ihre Verwendung in der Therapie von Krebsformen, die das Antigen exprimieren.
Konventionelle therapeutische Ansätze gegen Krebs schließen Chirurgie, Radiotherapie und Chemotherapie in verschiedenen Kombinationen ein; jedoch haben sich die Ansprechraten in den letzten 20 Jahren nicht signifikant verbessert. Die Hauptbeeinträchtigung der Chemotherapie und Radiotherapie ist die nicht-selektive Beeinflussung sowohl normaler als auch Tumorzellen, was zu toxischen Nebenwirkungen führt. Bei der Suche nach weniger toxischen und spezifischeren Behandlungsalternativen sind verschiedene Arten an Immuntherapien untersucht worden. Unter diesen Ansätzen sind Strategien, die auf monoklonalen Antikörpern beruhen, auf ein breites Spektrum maligner Erkrankungen angewendet worden (Riethmüller et al. Curr Opin Immun 1992, 4, 647-655 und Riethmüller et al. Curr Opin Immunol 1993, 5, 732-739). Die Nützlichkeit monoklonaler Antikörper beruht auf ihrer klonalen Antigen-Spezifität, d. h. der molekularen Erkennung der spezifischen Epitope, die ein Antigen umfassen können, und darauf, dass sie an diese Antigene mit hoher Affinität binden. Monoklonale Antikörper können an Antigene binden, die nur, oder bevorzugt, auf der Oberfläche maligner Zellen exprimiert werden, und daher können sie verwendet werden, um Tumorzellen spezifisch ins Ziel zu nehmen und sie zu zerstören. Antikörper können als Verabreichungsvehikel für Medikamente oder DNA konstruiert werden, oder als Konjugate mit Radionucliden. Die Bindung eines bloßen Antikörpers an Zielzellen kann auch eigene Antitumor-Immunfunktionen aktivieren, wie die Antikörper-abhängige Zell-vermittelte Zytotoxizität (ADCC) und die Komplement-vermittelte Zytotoxizität (CMC), von denen beide zur Lyse oder Phagozytose der Zielzelle führen können. Sowohl die ADCC und die CMC sind Antikörperdosis-abhängige Immunfunktionen und es ist daher wünschenswert, so viele Antikörper an die Zielzellen gebunden zu haben, wie möglich. Eine Möglichkeit, dieses Ziel zu erreichen, liegt darin, das Expressionsniveau des relevanten Antigens zu steigern, das die Antikörper-Funktionen wirksam erhöhen kann, wie bei spielsweise die ADCC von Zielzellen, dadurch, dass mehr Antikörper an die Zellen gebunden wird (Folger et al. Cancer Research 48: 6303-6308 (1988)).
Ein Antigen von Bedeutung in der Krebstherapie ist das Ep-CAM-Antigen (menschliches Pankarzinom-Antigen). Dieses Antigen ist ein Transmembran-Glycoprotein, von dem berichtet worden ist, dass es als Zelladhäsions-Molekül dient (Litvinow et al. J. Cell Biology 125: 437-446, 1994) und das ebenfalls als 17-1A-Antigen, 40kD-Antigen, EGP40, GA733-2, KSA und ESA bekannt ist, aber unter anderen Namen oder Beschreibungen in der Literatur ebenfalls bekannt sein kann. Es wird auf der basolateralen Oberfläche einer Vielzahl einfacher kubusförmiger oder säulenartiger, pseudogestreifter säulenartiger und Transitionsepithelien exprimiert, und allgemein in höheren Mengen in Tumorzellen. Epithelzellen sind dafür bekannt, dass sie bei der Entwicklung von menschlichen Entartungen der wichtigste Zelltyp sind.
D. h., dass mehr als 90% aller malignen Tumore Karzinome, und daher epithelialen Ursprungs sind (Acta Anatomica; 156 (3); 217-226 (1996)). Obwohl das Ep-CAM-Antigen auf den meisten Tumorzellen epithelialen Ursprungs exprimiert ist, gibt es Beispiele von Zellen epithelialen Ursprungs, die nicht Ep-CAM exprimieren, wie adulte epitheliale Gewebe, epidermale adulte Keratinozyten, Magenparietalzellen, Thymuscortexepithel, Myoepithelzellen und Hepatozyten. Der Phänotyp einer malignen Zelle spielt eine wichtige Rolle bei der Wirksamkeit monoklonaler Antikörper. Während tumorspezifische Antigene sich als schwer fassbar herausgestellt haben, haben Unterschiede in der Expression der Antigene zwischen normalen Zellen und Tumorzellen ein Mittel bereitgestellt, um Antikörper gegen Tumore zu richten. Es wäre klinisch vorteilhaft, diese Unterschiede durch Verstärkung der Antigen-Homogenität und der Dichte der Expression auf Tumorzellen zu verbessern.
Interferone sind dafür gut bekannt, dass sie Zellphänotypen durch Erhöhung der Expression von Tumor-Antigenen wie auch vieler normaler Antigene verändern, z. B. Klasse I HLA. Beispielsweise kann menschliches rekombinantes Interferon-α und Interferon-γ die Expression der menschlichen Tumorantigene TAG-72 und CEA erhöhen (Greiner et al. Cancer Res 44: 3208-3214 (1984)). Die Exposition gegenüber Interferon rief eine homogenere CEA-positive Tumorzell-Population hervor, welche mehr CEA von der Zelloberfläche ausschüttete, wie durch in vivo-Studien mit menschlichen Karzinom-Xenotransplantaten in athymischen Mäusen bestätigt wurde. Die Behandlung mit Interferon-γ verstärkte TAG-72 und die Expression von CEA auf Eierstock- oder Gastrointestinal-Tumorzellen in der Ascites-Flüssigkeit bei Patienten mit Krebserkrankungen (Greiner et al. J Clin Oncol 10: 735-746 (1992)). Die Wirkungen von Interferonen auf Zellen sind unzählig und reichen von der direkten Zytotoxizität bis zur Immunpotentierung bis zu antiproliferativen Wirkungen. Keine der Wirkungen von Interferonen auf die Antigen-Expression sind direkt mit dem Interferenzieren mit der Progression des Zellzyklus in Verbindung gebracht worden.
Kurz gesagt bezeichnet die Zellzyklus-Progression eine Abfolge von Ereignissen zwischen einer mitotischen Teilung und einer anderen in einer Zelle. Auf eine stille Ruhephase (G₀) folgt eine Wachstumsphase (G₁), dann die DNA-Synthese-Phase (S). Eine zweite Wachstumsphase mit Zellvergrößerung (G₂) und DNA-Replikation (M-Phase) wird von der Teilung der Zelle in zwei Tochterzellen gefolgt. Jedes Interferenzieren mit der Zellmaschinerie kann jede Progression des Zyklus in irgendeinem Stadium des Zellzyklus inhibieren. Beispielsweise können spezifische chemotherapeutische Mittel die Progression entweder in G₂ oder M oder sowohl in G₂ und M (G₂/M) blockieren. Anders gesagt hält die Exposition gegenüber bestimmten Medikamenten, z. B. chemotherapeutischen Mitteln individuelle Zellen in G₂ und/oder M an, bis schließlich die meisten, oder alle Zellen einer Population in G₂ und/oder M (G₂/M) angehalten sind. In HeLa-Zellen dauern die G₁, S, G₂ und M-Phasen beispielsweise 8,2, 6,2, 4,6 beziehungsweise 0,6 Stunden. Der Zeitraum zwischen den Mitosen wird als Interphase bezeichnet. Zellen können unterschiedliche Verdoppelungszeiten haben, abhängig von ihrem Entwicklungsstadium oder dem Gewebetyp. Die Variation der Verdoppelungszeiten ist für gewöhnlich eine Funktion der Dauer, die in G₁ verbracht wird (A Dictionary of Genetics, 5. Ausgabe, RC King and WD Stansfield, Oxford University Press, 1997).
Während einige Proteine identifiziert worden sind, die nur in bestimmten Phasen des Zellzyklus hergestellt werden, und daher als Marker des Zellzyklus-Status dienen können, werden die meisten anderen über den gesamten Zellzyklus, jedoch in höheren oder niedrigeren Mengen, zu bestimmten Zeitpunkten hergestellt. Die Veränderung der Antigen-Dichte über den Zellzyklus ist typisch für die Sarkom-Antigene p102 und p200 (Song S, Anticancer Research 16 (3A): 1171-5 (1996)), das Leukämie/Lymphom-assoziierte Antigen JD118 (Czuczman et al. Cancer Immunology, Immunotherapy 36 (6): 387-96 (1993)), und das Magentumor-Antigen PC1 (Wei et al., J of Oncology 9 (3): 179-82 (1987)). Einige wenige Tumor-Antigene wurden als Zellzyklus-unabhängig beschrieben, z. B. die Lebermetastasen 3H4 (Wulf et al., J. Cancer Research and Clinical Oncology 122 (8): 476-82 (1996)) und die kleinzelli gen Lungenkrebs-Antigene (Fargion et al., Cancer Research 46: 2633-2638 (1986)).
Überraschenderweise ist gefunden worden, dass die Vorbehandlung mit einem Medikament, z. B. einem chemotherapeutischen Mittel, von dem bekannt ist, dass es die Zellzyklusprogression in S und/oder G₂/M blockiert zu einem signifikanten Ansteigen der Dichte der Ep-CAM-Antigenpopulation führt, und daher zu einem verbesserten Zielen von Anti-Ep-CAM-Antikörpern gegen Tumoren, die Ep-CAM exprimieren. Bei lytischen Antikörpern führt dies zu einer verstärkten Empfindlichkeit gegen eine Antikörper-abhängige Zytolyse. Diese Störung des Tumorzellphänotyps hat eine bedeutende Wirkung auf die biologischen Wirksamkeiten therapeutischer Antikörper, und stellt einen synergistischen Nutzen chemotherapeutischer Standardbehandlungsformen dar. Außerdem scheint dieser Anstieg der Ep-CAM-Antigenexpression tumorspezifisch zu sein. Anders gesagt, scheint die Vorbehandlung mit chemotherapeutischen Mitteln, die den Zellzyklus in S und/oder G₂/M blockieren, nicht die Ep-CAM-Antigenexpression in Tumorzellen zu betreffen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine Kombination eines Ep-CAM-Antikörpers und eines chemotherapeutischen Mittels bereit, das in der Lage ist, die Ep-CAM-Antigen-exprimierenden Zellen in S oder G₂/M, bevorzugt in G₂/M zu arretieren.
Beispiele von Anti-Ep-CAM-Antikörpern sind ING1 (Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (5), 3199 bis 3203 (1981) und Laio et al., Human Antibody Hybridomas 1 (2), 66-76 (1990)); 17-1A, z. B. Panorex (Herlyn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1438-1452 (1979) und Herlyn et al., Hybridoma 1985; 5 (suppl. 1) S3 bis S10); und NR-LU-10 (Okabe et al., Cancer Research, 44, 5273 bis 5278 (1984)).
Panorex (Adjuqual^®) ist ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen 17.1A. Er wird in Deutschland von Glaxo Wellcome für die postoperative Adjuvanstherapie von Kolorektalkrebs vermarktet.
Ein Beispiel eines Anti-Ep-CAM-Antikörpers ist einer mit der cDNA-Sequenz der variablen leichten Kette, die in 15 dargestellt ist, und der cDNA-Sequenz der schweren Kette, die in 16 dargestellt ist (bekannt als humanisierter 323/A3/IgG₁). Zwei weitere bevorzugte Beispiele von Anti-Ep-CAM-Antikörpern sind solche mit den in den 15 dargestellten cDNA-Sequenzen der variablen leichten Kette und den in den 17 bzw. 18 dargestellten cDNA-Sequenzen der schweren Kette (bekannt als humanisierte 323/A3 IgG₄ beziehungsweise IgG₂cys).
Ein bevorzugtes Beispiel eines Anti-Ep-CAM-Antikörpers ist 17.1A, am meisten bevorzugt Panorex.
Spezifische Anti-Ep-CAM-Antikörper können alleine oder in einer Kombination mit anderen Anti-Ep-CAM-Antikörpern verabreicht werden. Beispiele für solche Anti-Ep-CAM-Antikörper-Kombinationen sind ein Anti-Ep-CAM-Antikörper mit der cDNA-Sequenz der variablen leichten Kette, die in 15 dargestellt ist, und der cDNA-Sequenz der schweren Kette, die in 16 dargestellt ist, in Kombination mit ING1. D. h., dass in der Beschreibung eine Bezugnahme auf ein Anti-Ep-CAM-Antikörper Antikörper-Kombinationen verschiedener Anti-Ep-CAM-Antikörper einschließt, bevorzugt nicht kompetitive Anti-Ep-CAM-Antikörper, die verschiedene Epitope auf dem gleichen Ep-CAM-Antigen ins Visier nehmen.
Beispiele chemotherapeutischer Mittel, die in der Lage sind, Ep-CAM-Antigen-exprimierende Zellen in G₂/M zu arretieren, sind Vinorelbin, Cisplatin, Paclitaxel, Carboplatin, Oxaliplatin und CPT-II (Camptothecin).
Vinorelbintartrat ist ein semisynthetisches Vinca-Alkaloid mit dem chemischen Namen 3',4'-Didehydro-4'-deoxy-C'-norvincaleukoblastin [R-(R'',R'')-2,3-dihycroxybutanedioat (1:2)(salz)]. Vinorelbintartrat wird in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Mitteln wie Cisplatin verwendet, oder als einzelnes Mittel bei der Behandlung verschiedener solider Tumoren, insbesondere bei nicht kleinzelligem Lungenkrebs, dem fortgeschrittenen Brustkrebs und dem hormonrefraktären Prostatakrebs. Der Markenname Navelbin^® wird in Nordamerika und Nordeuropa verwendet. Navelbin^® wird intravenös als Einzelmittel oder in Kombinationstherapie typischerweise in Dosierungen von 20-30 mg/m² wöchentlich verabreicht. Eine orale Formulierung von Vinorelbin ist in klinischer Entwicklung.
Cisplatin hat den chemischen Namen Cis-Diamindichlorplatin. Cisplatin wird zur Behandlung metastasierender Hodentumoren als Kombinationstherapie, als Einzel- und Kombinationstherapie bei metastasierenden Eierstocktumoren wie auch als Einzelmittel bei fortgeschrittenem Blasenkrebs verwendet. Cisplatin wird von Bristol-Myers Squibb unter dem Markennamen Platinol^® und Platinol-AQ^® hergestellt. Cisplatin wird ebenfalls für die folgenden Krebstypen verwendet – typischerweise in Kombinationstherapie: nicht kleinzelliger und kleinzelliger Lungenkrebs, Kopf- und Nacken-Krebs, Endometrium-Krebs, Gebärmutterhalskrebs und Non-Hodgkin-Lymphom. Cisplatin wird typischerweise intravenös in Dosierungen, die von 15-150 mg/m² reichen, einmal alle 3 bis 4 Wochen, oder täglich über 5 Tage, die alle 3 oder 4 Wochen wiederholt werden, verabreicht. Jedoch werden gelegentlich höhere und häu figere Dosierungen verabreicht, und der Darreichungsweg kann vom intravenösen verschieden sein, wie beispielsweise intra-arteriell oder intraperitoneal.
Carboplatin hat den chemischen Namen Platin-Diamin [1,1-cyclobutandicarboxylat(2)-0,0']-(SP-4-2). Carboplatin wird für gewöhnlich in Kombination mit anderen Zytotoxinen, wie Paclitaxel und Etoposid verabreicht. Es wird zur Behandlung von fortgeschrittenem Eierstockkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, wie auch in vielen gleichen Arten von Krebs, wie Cisplatin, verwendet. Der Markenname von Carboplatin, das von Bristol-Myers Squibb hergestellt wird, ist Paraplatin^®. Carboplatin wird typischerweise intravenös zu 300-400 mg/m² verabreicht, oder in ein Zielgebiet bei einer Medikamentenkonzentration gegenüber dem Zeitverlauf (AUC) von 4-6 mg/ml-min unter Verwendung der geschätzten glomerulären Filtrationsrate (GFR) des Patienten. Höhere Dosierungen bis zu ungefähr 1.600 mg/m², die über mehrere, für gewöhnlich 5, Tage verteilt werden, können ebenfalls verabreicht werden.
Paclitaxel hat den chemischen Namen 5⌷, 20 Epoxy-1, 2⌷, 4, 7⌷, 10⌷, 13⌷ -hexadydroxytax-11-en-9-on 4,10-diacetat 2-benzoat 13-ester mit (2R, 3S)-N-benzoyl-3-phenylisoserin. Paclitaxel wird von Bristol-Myers Squibb als Taxol^® hergestellt. Es wird verwendet, um eine Vielzahl an Karzinomen, einschließlich des Eierstocks, der Brust, nicht kleinzelligen Lungenkrebs, des Kopfes und Nackens, zu behandeln. Typische Dosierungen schließen 135-175 mg/m² entweder als eine 3 h oder 24 h intravenöse Fusion ein, die alle 3 oder 4 Wochen verabreicht wird. Höhere Dosierungen bis zu ungefähr 300 mg/m² sind ebenfalls verabreicht worden.
Neben dem wirksamen Inhaltsstoff enthalten die Medikamentenprodukte, die von den Herstellern bereitgestellt werden, typischerweise ein Verdünnungsmittel, wie steriles Wasser, Dextrose 5% in Wasser oder 0,9% Natriumchlorid in Wasser, mit zusätzlichen Excipienten, wie Cremophor-Vehikel, welches hinzugegeben wird, um beispielsweise Paclitaxel löslich zu machen.
Eine detaillierte Information über Behandlungsmodi, Dosierungen und Zusammensetzungen etc. kann aus Standardreferenzbüchern, wie Martindale, The Extra Pharmacopoeia, 31. Ausgabe, herausgegeben von JEF Reynolds, London, Royal Pharmaceutical Society, 1996 und der Physicians Desk reference, 49. Ausgabe, 1995, Medical Economics Data Production Company, Montvale, gewonnen werden.
Andere chemotherapeutische Mittel, die dazu führen können, dass Zellen in G₂/M akkumulieren, schließen Anthracycline, z. B. Aclarubicin; Camustin (BCNU), Camptothecin, 9-Nitro-camptothecin, Cyclophosphamid und dessen Derivate, Docetaxel, Etoposid, Razoxan (ICRF-187), Alkyllyso-phospholipid, z. B. Ilmofosin, Methotrexat, MST-16, Taxan, Vinblastin, Vincristin und Teniposid (VM-26) (siehe ebenfalls Martindale, The Extra Pharmaceopoeia, 31. Ausgabe, herausgegeben von JEF Reynolds, London, Royal Pharmaceutical Society, 1996), sowie Flavonoide, z. B. Apigenin und Genistein (siehe den Merck Index, 12. Ausgabe, Merck Research Laboratories, Merck and Co Inc, 1996) ein. Zusätzlich glaubt man, dass Adozelesin (eine Klasse von Pyrazolverbindungen) (Cancer Research 1992, October 15; 52 (2): 5687 to 5692)), Bristraten A (Mutation Research 1996, March 1; 367 (3): 169 to 175), Cycloxazolin (Cancer Chemotherapy & Pharmacology 1994: 33 (5): 399 to 409), Imidazoarcridinon, Melephan (Experimental Cell Biology 1986; 54 (3): 138 to 148 and International Journal of Cancer 1995, Jul 17; 62 (2): 170 to 175), Merbaron (Environmental & Molecular Mutagenesis 1997; 29 (1): 16 to 27 and Cancer Research 1995, Apr 1; 55 (7): 1509 to 1516) und Oracin (FEBS letters 1997, Jan 2; 400 (1): 127 to 130) ebenfalls dazu führen, dass Zellen in G₂/M angehäuft werden sowie im Allgemeinen alle Topo II-Inhibitoren, z. B. Potecan (abpi, 1998-1999), alle Vincaderivate und alle DNA-schädigenden Mittel, einschließlich Bestrahlung, halten Zellen vermutlich alle in G₂/M an.
Es wird vermutet, dass UFT, Methotrexat, Capecitabin und Gemcitabin die Ep-Cam-Expressionen in einigen Geweben erhöhen. Gleichermaßen wird von Tumodex (Raloxifen), welches dafür bekannt ist, dass es Zellen in der S-Phase arretiert, vermutet, dass es die Ep-CAM-Expression steigert.
Der Begriff „Chemotherapeutisches Mittel" in der Beschreibung wird daher nicht auf die zytotoxische Therapie beschränkt, sondern umfasst auch die zytostatische Therapie und alle anderen Medikamente, die in der Lage sind, Zellen in G₂/M zu stoppen. Es sollte weiter zur Kenntnis genommen werden, dass Radiotherapie in der Lage ist, Zellen in G₂/M anzuhalten, und dass der Begriff „chemotherapeutisch" in der Beschreibung daher durch „Radiotherapie" substituiert werden kann.
In der Beschreibung schließt die Bezugnahme auf ein chemotherapeutisches Mittel Kombinationen aus einem oder mehreren spezifischen chemotherapeutischen Mitteln ein, die Ep-CAM-exprimierende Tumorzellen in G₂/M arretieren. Beispiele typischer Kombinationen sind Vinorelbin mit Cisplatin und Paclitaxel mit Carboplatin; Oxaliplatin mit 5FU; Cyclophosphamid mit Methotrexat und 5FU; Cyclophosphamid mit Doxorubicin und 5FU.
Während es möglich ist, dass das chemotherapeutische Mittel alleine verabreicht werden kann, ist es bevorzugt, es als pharmazeutische Zusammensetzung, das den oben definierten wirksamen Inhaltsstoff umfasst, zusammen mit einem annehmbaren Träger hierfür bereitzustellen. Jeder Träger muss in dem Sinne „annehmbar" sein, dass er mit den anderen Inhaltsstoffen der Zusammensetzung kompatibel ist und nicht für den Empfänger schädlich ist.
Bevorzugte Kombinationen eines Ep-CAM-Antikörpers und eines chemotherapeutischen Mittels, das/die in der Lage ist/sind, die Ep-CAM-Antigenexprimierenden Zellen in S oder G₂/M zu arretieren, sind: Panorex in Kombination mit irgendeinem der folgenden chemotherapeutischen Mittel: UFT, Capecitabin, CPT-11, Oxaliplatin, 5FU, 5FU kontinuierliche Infusion, Paclitaxel, Docetaxel, Cyclophosphamid, Methotrexat, Navelbin (iv und oral), Epirubicin, Mitoxantron, Raloxifen, Cisplatin, Carboplatin, Gemcitabin, Etoposid und Topotecan.
Insbesondere bevorzugte Kombinationen sind Panorex mit CPT-II, Oxaliplatin, Capecitibin, UFT und Tomudex (Raloxifen).
Diese Panorexkombinationen sind nützlich zur Behandlung von Krebs, insbesondere zur Behandlung von Kolorektalkrebs, Brustkrebs, Magenkrebs, Prostatakrebs und dem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.
Spezifisch sind die folgenden Kombinationen besonders für Kolorektalkrebs bevorzugt: Panorex in Kombination mit: UFT (gegebenenfalls mit Leucovorin); Capecitabin, Oxaliplatin (gegebenenfalls mit 5FU); CPT-II, 5FU (gegebenenfalls mit Eniluracil oder Levamisol oder Leucovorin); protrahierte kontinuierliche 5FU-Infusion.
Bevorzugte Kombinationen zur Behandlung von Brustkrebs sind: Panorex in Kombination mit Paclitaxel; Docetaxel; Cyclophosphamid (gegebenenfalls mit 5FU und entweder Methotrexat oder Doxorubicin); Navelbin (iv und/oder oral); Epirubicin; Mitoxantron; und Raloxifin.
Bevorzugte Kombinationen zur Behandlung von Magenkrebs sind: Panorex in Kombination mit Cisplatin; und Carboplatin.
Eine bevorzugte Kombination zur Behandlung von Prostatakrebs ist: Panorex in Kombination mit Mitoxantron.
Bevorzugte Kombinationen zur Behandlung des nicht kleinzelligen Lungenkrebs sind Panorex in Kombination mit: Navelbin; Cisplatin; Karboplatin; Paclitaxel; Docetaxel; Gemicitabin; Topotecan; und Etoposid.
Informationen bezüglich der Dosierung von Panorex und der oben erwähnten chemotherapeutischen Mittel, die in Kombination mit Panorex verabreicht werden, können in Standardreferenzbüchern, wie dem ABPI, Kompendium of Data Sheets and Summaries of Product Characteristics, Datapharm Publications Limited, 1998-1999, gefunden werden.
Die Zusammensetzungen (comparisons) schließen solche ein, die für orale, rektale, nasale, topische (einschließlich buccale und sublinguale), vaginale, parenterale (inklusive subcutane, intramuskuläre, intravenöse und intradermale) oder die transdermale Verabreichung geeignet sind. Diese Zusammensetzungen können einfach in Einheitsdosierungsform bereitgestellt werden, und können durch irgendwelche Verfahren, die im pharmazeutischen Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Solche Verfahren schließen den Schritt des in-Verbindung-Bringens des wirksamen Inhaltsstoffs mit dem Träger ein, welcher einen oder mehrere zusätzliche Inhaltsstoffe darstellt. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch gleichmäßiges und enges in-Verbindung-Bringen des wirksamen Inhaltsstoffs mit Flüssigträgern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden hergestellt, und dann, falls notwendig, durch Formen des Produkts.
Zusammensetzungen des chemotherapeutischen Mittels, das für die orale Verabreichung geeignet ist, können als einzelne Einheiten, wie Kapseln, Cachets oder Tabletten, vorgelegt werden, die jeweils eine vorherbestimmte Menge des wirksamen Inhaltsstoffs enthalten; als ein Pulver oder Körner; als eine Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht wässrigen Flüssigkeit; oder als eine Öl-in-Wasser-Flüssigemulsion oder eine Wasserin-Öl-Flüssigemulsion. Der wirksame Inhaltsstoff kann auch als Bolus, Electuarium oder Paste vorliegen.
Eine Tablette kann durch Komprimieren oder Formen hergestellt werden, gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Inhaltsstoffen. Komprimierte Tabletten können durch Komprimieren des wirksamen Inhaltsstoffs in einer frei vorhandenen Form, wie als Pulver oder als Körner, gegebenenfalls gemischt mit einem Bindemittel (z. B. Povidon, Gelatine, Hydroxypropylmethylzellulose), Schmiermittel, trägen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Zersetzungsförderern (z. B. Natriumstärkeglycolat, vernetztes Povidon, vernetztes Natriumcarboxylmethylzellulose) oberflächenaktive oder Dispersionsmittel in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen einer Mischung der pulverisierten Verbindung in einer geeigneten Maschine hergestellt werden, die mit einem trägen Flüssigkeitsverdünnungsmittel angefeuchtet ist. Die Tabletten können gegebenenfalls beschichtet werden oder angeritzt werden, und können so formuliert werden, dass sie eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des wirksamen Inhaltsstoffs darin ermöglichen, beispielsweise durch Verwendung von Hydro xypropylmethylzellulose in verschiedenen Anteilen, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen. Tabletten können gegebenenfalls mit einer enterischen Beschichtung bereitgestellt werden, um die Freisetzung in Teilen des Darms außerhalb des Magens zu ermöglichen.
Zusammensetzungen, die für die orale Verwendung geeignet sind, wie oben beschrieben worden ist, können ebenfalls Pufferungsmittel enthalten, die darauf ausgerichtet sind, die Magensäure zu neutralisieren. Solche Puffer können aus einer Vielzahl organischer oder anorganischer Mittel gewählt werden, wie schwachen Säuren oder Basen, die mit ihren konjugierten Salzen gemischt werden.
Eine Zusammensetzung, die für die topische Verabreichung im Mund geeignet ist, schließt Lutschtabletten, die den wirksamen Inhaltsstoff in einer Geschmacksmittelgrundlage, für gewöhnlich Saccharose und Acacia oder Tragacanth enthalten; Pastillen, die den wirksamen Inhaltsstoff in einer trägen Grundlage, wie Gelatine und Glycerin umfassen, oder Saccharose und Acacia, und Mundspülungen, die den wirksamen Inhaltsstoff in einem geeigneten Träger umfassen, ein.
Zusammensetzungen für die rektale Verabreichung können als Zäpfchen mit einer geeigneten Grundlage vorliegen, welche beispielsweise Kakaobutter oder ein Salicylat umfassen.
Zusammensetzungen, die für die vaginale Verabreichung geeignet sind, können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen vorliegen, die zusätzlich zum wirksamen Inhaltsstoff solche Träger enthalten, die in dem Fachgebiet dafür bekannt sind, dass sie geeignet sind.
Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, schließen wässrige und nicht-wässrige isotone, sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidationsmittel, Puffer, Bacteriostatica und gelöste Stoffe enthalten können, die die Zusammensetzungen isotonisch mit dem Blut des gewünschten Empfängers machen; und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel einschließen, wie Liposomen oder andere micropartikuläre Systeme, die darauf ausgerichtet sind, die Verbindungen zu Blutbestandteilen oder einem oder mehreren Organen zu führen. Die Zusammensetzungen können in Einheitsdosis- oder versiegelten Mehrfachdosis-Behältern vorliegen, beispielsweise in Ampullen und Phiolen, und sie können in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, welcher nur die Zugabe eines sterilen Flüssigträgers benötigt, beispielsweise Wasser für Injektionen, direkt vor der Verwendung. Nicht vorgefertigte Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Körnern und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Zusammensetzungen, die für die transdermale Verabreichung geeignet sind, können als einzelne Pflaster bereitgestellt werden, die so angepasst worden sind, dass sie über einen längeren Zeitraum in engem Kontakt mit der Epidermis des Empfängers bleiben. Solche Pflaster enthalten geeigneterweise den wirksamen Inhaltsstoff als eine gegebenenfalls gepufferte wässrige Lösung, beispielsweise in einer 0,1 bis 0,2 M Konzentration bezogen auf diese Verbindung. Als eine besondere Möglichkeit kann der wirksame Inhaltsstoff vom Pflaster durch Iontophorese, wie allgemein beschrieben in Pharmaceutical Research, 3 (6), 318 (1996), bereitgestellt werden.
Es ist zu verstehen, dass zusätzlich zu den besonders oben erwähnten Inhaltsstoffen die fraglichen Zusammensetzungen, beispielsweise solche, die für die orale Verabreichung geeignet sind, weitere Mittel enthalten können, wie Süßungsmittel, Verdickungsmittel und Geschmacksmittel.
Der Dosierungsbereich des chemotherapeutischen Mittels, das mit dem Antikörper gemeinsam verabreicht wird, kann typischerweise zwischen ungefähr 1 bis 1000 mg/m² (beruhend auf dem Oberflächenbereich des Patientenkörpers) oder ungefähr 2-30 mg/kg liegen (auf Grundlage des Körpergewichts des Patienten), abhängig von den verwendeten chemotherapeutischen Mitteln. D. h., dass beispielsweise Vinorelbin (Navelbin) typischerweise in einer Dosis von ungefähr 20-30 mg/m² verabreicht wird, Cisplatin zu ungefähr 15-100 mg/m², Carboplatin zu ungefähr 300-600 mg/m² und Paclitaxel zu ungefähr 100-300 mg/m², bevorzugt ungefähr 135-175 mg/m². Ein weiterer Weg der Darstellung der Dosierung ist durch ihren AUC-Wert. Beispielsweise würde Carboplatin typischerweise in einer Dosis verabreicht werden, die als AUC = 4-6 mg/ml-min berechnet wird. Im Allgemeinen sind die Dosierungen der chemotherapeutischen Mittel niedriger, wenn sie in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Mitteln und/oder Antikörpern verabreicht werden, als wenn sie alleine, als einzelnes chemotherapeutisches Mittel gegeben werden. Die Dosis der chemotherapeutischen Mittel, die mit dem/den Anti-Ep-CAM-Antikörper/Antikörpern gemeinsam verabreicht wird, ist/sind wahrscheinlich die Standarddosen für das zu behandelnde Karzinom oder niedrigere Dosierungen. Im Allgemeinen werden die höchsten tolerierten Dosierungen der chemotherapeutischen Mittel entweder alleine oder in Kombination verabreicht.
Die Anti-Ep-CAM-Antikörper der vorliegenden Erfindung haben vorzugsweise die Struktur eines natürlichen Antikörpers oder eines Fragments da von. Antikörper, umfassen typischerweise zwei schwere Ketten, die durch Disulphidbrücken verbunden sind und zwei leichte Ketten. Jede leichte Kette ist an eine entsprechende schwere Kette durch Disulphidbrücken gebunden. Jede schwere Kette hat an einem Ende eine variable Domäne, gefolgt von einer Anzahl konstanter Domänen. Jede leichte Kette hat eine variable Domäne an einem Ende und eine konstante Domäne an einem anderen Ende. Die leichte Kette variable Domäne wird mit der variablen Domäne der schweren Kette aneinander gelagert. Die konstante Domäne der leichten Kette wird mit der ersten konstanten Domäne der schweren Kette aneinander gelagert. Die konstanten Domänen in den leichten und schweren Ketten sind nicht direkt an der Bindung des Antikörpers an das Antigen beteiligt.
Die variablen Domänen jedes Paars leichter und schwerer Ketten bilden die Antigen-Bindungsstelle. Die Domänen der leichten und schweren Ketten haben die gleiche allgemeine Struktur und jede Domäne umfasst einen Rahmen aus vier Regionen, deren Sequenzen relativ konserviert sind, verbunden durch drei Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDRs). Die vier Rahmenregionen nehmen im Großen und Ganzen eine beta-Faltblattkonformation ein, und die CDRs bilden Schlaufen, die in einigen Fällen die beta-Faltblattstruktur verbinden und diese in einigen Fällen formen. Die CDRs werden durch die Rahmenbereiche fest zusammengehalten, und mit den CDRs, die die andere Domäne bilden, haben sie an der Bildung der Antigen-Bindungsstelle teil, welche im Fall der vorliegenden Erfindung die Bildung einer Anti-Ep-CAM-Bindungsstelle ist. CDRs und Rahmenbereiche von Antikörpern können durch Bezugnahme auf Kabat et al. („Sequences of proteins of immunological interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987) bestimmt werden.
Die Herstellung eines Antikörpers, bei dem die CDRs von anderen Spezies stammen als der Rahmen der variablen Domänen des Antikörpers, wird in EP-A-0239400 offenbart. Die CDRs können von einem monoklonalen Nager- oder einem Primaten-Antikörper stammen. Der Rahmen der variablen Domänen und die konstanten Domänen solcher veränderter Antikörper stammen für gewöhnlich von einem menschlichen Antikörper. Ein solcher humanisierter Antikörper sollte keine so starke Immunantwort hervorrufen, wenn er einem Menschen verabreicht wird, verglichen mit der Immunreaktion, die von einem Menschen gegen ein vollkommen fremden Antikörper ausgelöst wird, wie einem der von einem Nager stammt.
Der Antikörper hat bevorzugt die Struktur eines natürlichen Antikörpers oder eines Fragments davon. In der Beschreibung umfasst die Bezugnahme auf einen Antikörper daher nicht nur einen vollständigen Antikörper, sondern auch Fragmente, wie das (Fab')₂-Fragment, ein Fab-Fragment, einen Dimer der leichten Kette oder ein Dimer der schweren Kette. Der Antikörper kann ein IgG sein, wie IgG₁, IgG₂, IgG₃ oder IgG₄; oder IgM, IgA, IgE oder IgD, oder eine modifizierte Variante davon, einschließlich solcher, die an andere Moleküle konjugiert werden können, wie Radionuclide, Enzyme etc. Typischerweise wird der konstante Bereich gemäß der gewünschten Funktionalität ausgewählt. Normalerweise weist IgG₁ durch die Bindung an Komplement lytische Fähigkeiten auf, und vermittelt ADCC (Antikörper-vermittelte Zellzytotoxizität). Ein IgG₄-Antikörper wird bevorzugt, wenn ein nicht zytotoxischer Antikörper benötigt wird. Antikörper gemäß der Erfindung schließen auch bispezifische Antikörper ein, wie beispielsweise den 17-1A Antikörper, der in Mack et al., The Journal of Immunology, 1997, 158: 3965-3970, offenbart ist. Antikörper der vorliegenden Erfindung können murin sein, chimär oder humanisiert, wobei der bevorzugte Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Es gibt vier allgemeine Schritte, um einen monoklonalen Antikörper zu humanisieren. Diese sind.

(1) Bestimmung der Nucleotid- und der abgeleiteten Aminosäuresequenz der leichten und schweren Ketten der variablen Domänen des Ausgangsantikörpers;
(2) Entwerfen des humanisierten Antikörpers, d. h. Entscheiden, welcher Antikörperrahmenbereich während des Humanisierungsschritts zu verwenden ist;
(3) die tatsächlichen Humanisierungsmethoden/-techniken; und
(4) Transfektion und Expression des humanisierten Antikörpers. Genauer gesagt,

Schritt 1: Bestimmung der Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequeaz der variablen Domänen der leichten und schweren Kette des Antikörpers
Um einen Antikörper zu humanisieren, muss nur die Aminosäuresequenz der variablen Domänen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers bekannt sein. Die Sequenz der konstanten Domänen ist irrelevant, da diese nicht zu der Umformungsstrategie beitragen. Das einfachste Verfahren zum Bestimmen der Aminosäuresequenz der variablen Domäne eines Antikörpers stammt von klonierter cDNA, die die variable Domäne der schweren und leichten Kette kodiert.
Es gibt zwei allgemeine Verfahren zum Klonieren einer variablen Domäne cDNA der schweren und leichten Kette eines Antikörpers: (1) über eine kon ventionelle cDNA-Bibliothek, oder (2) über die Polymerasekettenreaktion (PCR). Diese beiden Verfahren sind allgemein bekannt. Mit der Nucleotidsequenz der cDNAs ist es eine einfache Angelegenheit, diese Information in die vorhergesagte Aminosäuresequenz der variablen Domänen des Antikörpers zu translatieren.
Schritt 2: Entwerfen des humanisierten Antikörpers
Es gibt mehrere Faktoren, die zu beachten sind, wenn entschieden werden soll, welche menschliche Antikörpersequenz während der Humanisierung zu verwenden ist. Die Humanisierung der leichten und schweren Ketten werden unabhängig voneinander in Betracht gezogen, aber der Hintergrundgedanke ist für jeden im Grunde ähnlich.
Dieser Auswahlschritt beruht auf der folgenden Überlegung: primär wird die Antigen-Spezifität und Affinität eines gegebenen Antikörpers durch die Aminosäuresequenz der CDRs der variablen Regionen bestimmt. Die Reste des Rahmens der variablen Domänen haben nur eine geringe oder gar keine direkte Beteiligung. Die primäre Funktion der Rahmenbereiche liegt darin, die CDRs in ihrer passenden räumlichen Orientierung zu halten, um das Antigen zu erkennen. D. h., dass die Substituierung der CDRs eines Nagers in einen Rahmen einer menschlichen variablen Domäne am wahrscheinlichsten zu einer Bewahrung ihrer korrekten räumlichen Orientierung führt, wenn der Rahmen der menschlichen variablen Domäne stark homolog mit der variablen Domäne des Nagers ist, von dem sie stammt. Die menschliche variable Domäne sollte vorzugsweise daher so ausgewählt werden, dass sie mit der/den variablen Domäne/variablen Domänen des Nagers hoch homolog ist.
Eine geeignete humane Sequenz der variablen Domäne eines menschliches Antikörpers kann wie folgt ausgewählt werden:

1. Unter Verwendung eines Computerprogramms werden alle verfügbaren Protein- (und DNA-) Datenbanken auf solche variablen Domänsequenzen für humane Antikörper untersucht, die zu den variablen Domänen des Nager-Antikörpers am homologsten sind. Das Ergebnis eines geeigneten Programms ist eine Liste von Sequenzen, die zu dem Nager-Antikörper am homologsten sind, wobei die prozentuale Homologie jeder Sequenz und eine Anlagerung jeder Sequenz an die Nagersequenz erfolgt. Das wird unabhängig sowohl für die schwere und leichte Kette Sequenzen der variablen Domänen durchgeführt. Die oben erwähnten Analysen werden leichter durchgeführt, wenn nur Immunglobulinsequenzen des Menschen eingeschlossen werden.
2. Auflistung der Sequenzen der variablen Domänen des menschlichen Antikörpers und Vergleich auf die Homologie. Primär wird der Vergleich auf grund der Länge der CDRs durchgeführt, außer für CDR 3 der schweren Kette, welche ziemlich variabel ist. Die schweren Ketten des Menschen und die leichten Ketten Kappa und Lambda werden in Subgruppen unterteilt; schwere Kette in 3 Subgruppen, Kappa-Kette in 4 Subgruppen, Lambda-Kette in 6 Subgruppen. Die CDR-Größen in jeder Untergruppe sind ähnlich, variieren aber zwischen den Untergruppen. Es ist für gewöhnlich möglich, den CDR eines Antikörpers eines Nagers auf eine der Untergruppen des Menschen als erste Annäherung der Homologie anzupassen. Antikörper, die CDRs ähnlicher Länge tragen, werden dann hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz-Homologie verglichen, insbesondere innerhalb der CDRs, aber auch in den umgebenden Rahmenbereichen. Die menschliche variable Domäne, die am homologsten ist, wird als Rahmenbereich für die Humanisierung ausgewählt.

Schritt 3: Tatsächliche Humanisierungsmethoden/-techniken
Ein Antikörper kann gemäß EP-A-0239400 (siehe ebenfalls P. T. Jones et al., Nature 321:522 (1986); L. Reichman et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen M. et al., Science 239:1534 (1988) und J. Ellis et al., The Journal of Immunology, 155:925-937 (1995)) durch Verpflanzen der gewünschten CDRs auf einen menschlichen Rahmen humanisiert werden. Eine DNA-Sequenz, die den gewünschten umgeformten Antikörper kodiert, kann daher ausgehend von der menschlichen DNA hergestellt werden, deren CDRs zur Umformung gewünscht werden. Die Aminosäuresequenz der variablen Domäne des Nagers, die die gewünschten CDRs enthält, wird mit der Sequenz der variablen Domäne des menschlichen Antikörpers, der ausgewählt worden ist, verglichen. Die Reste in der variablen Domäne des Menschen, die in die entsprechenden Reste des Nagers umgeändert werden müssen, werden markiert, damit die variable Region des Menschen die CDRs des Nagers aufnimmt. Es können auch Reste vorhanden sein, die eine Substituierung, Addition oder Deletion der menschlichen Sequenz benötigen.
Es werden Oligonucleotide synthetisiert, die verwendet werden können, um den Rahmen der variablen Domäne des Menschen zu mutieren, um die gewünschten Reste zu enthalten. Diese Oligonucleotide können irgendeine passende Größe haben. Normalerweise ist man in Bezug auf die Länge nur durch die Fähigkeiten eines jeweils verfügbaren Synthesegeräts nicht limitiert. Das Verfahren zur Oligonucleotid-beeinflussten in vitro Mutagenese ist allseits bekannt.
Alternativ dazu kann eine Humanisierung unter Verwendung der rekombinanten Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Methodik aus WO 92/07075 erreicht werden. Unter Verwendung dieser Methode kann ein CDR zwischen den Rahmenbereichen eines menschlichen Antikörpers gespliced werden.
Im Allgemeinen kann die Technik aus WO 92/07075 unter Verwendung einer Matrize durchgeführt werden, die zwei menschliche Rahmenbereiche, AB und CD umfasst, und dazwischen den CDR, welcher durch den Donor-CDR ersetzt werden soll. Die Primer A und B werden verwendet, um die Rahmenregion AB zu amplifizieren, und die Primer C und D werden verwendet, um den Rahmenbereich CD zu amplifizieren. Die Primer B und C enthalten jedoch an ihren 5'-Enden jeweils eine zusätzliche Sequenz, die den gesamten oder mindestens einem Teil der Donor-CDR-Sequenz entspricht. Die Primer B und C überlappen in einer Länge, die ausreicht, um eine Anlagerung ihrer 5'-Enden aneinander unter Bedingungen zu erlauben, die ermöglichen, dass eine PCR durchgeführt werden kann. Auf diese Weise können die amplifizierten Bereiche AB und CD ein Gen-Splicing durch die Verlängerung der überlappenden Bereiche durchmachen, um das humanisierte Produkt in einer einzelnen Reaktion herzustellen.
Schritt 4: Die Transfektion und Expression des umgeformten Antikörpers
Nach der Mutagenese-Reaktion, um den Antikörper umzuformen, können die mutierten DNAs an eine geeignete DNA gebunden werden, die die konstante Region einer leichten oder schweren Kette kodiert, in einen Expressionsvektor kloniert werden, und in Wirtszellen, bevorzugterweise Säugerzellen transfiziert werden. Diese Schritte können nach Routineverfahren durchgeführt werden. Ein umgeformter Antikörper kann daher durch ein Verfahren hergestellt werden, das umfasst:

(a) Herstellen eines ersten replizierbaren Expressionsvektors, der einen geeigneten Promotor einschließt, der operativ an eine DNA-Sequenz gebunden ist, die mindestens eine variable Domäne einer leichten oder schweren Kette eines Ig kodiert, wobei die variable Domäne Rahmenbereiche umfasst, die von einem menschlichen Antikörper stammen, sowie die CDRs, die für den humanisierten erfindungsgemäßen Antikörper benötigt werden.
(b) Herstellen eines zweiten replizierbaren Expressionsvektors, der einen geeigneten Promotor operativ verbunden an eine DNA-Sequenz einschließt, welche mindestens die variable Domäne der komplementären leichten oder schweren Kette des Ig kodiert;
(c) Transformieren einer Zelllinie mit dem ersten oder beiden hergestellten Vektoren; und
(d) Kultivieren dieser transformierten Zelllinie, um diesen umgeänderten Antikörper herzustellen.

Vorzugsweise kodiert die DNA-Sequenz in Schritt (a) sowohl die variable Domäne und die oder jeder konstante Domäne der menschlichen Antikörperkette. Der humanisierte Antikörper kann gewonnen und gereinigt werden. Die Zelllinie, die transformiert wird, um den umgeänderten Antikörper herzustellen, kann die Chinesische Hamster Ovar (CHO)-Zelllinie oder eine immortalisierte Säugerzelllinie sein, die vorzugsweise lymphoiden Ursprungs ist, wie eine Myelom-, Hybridom-, Triom- oder Quadrom-Zelllinie. Die Zelllinie kann ebenfalls eine normale lymphoide Zelle umfassen, wie eine B-Zelle, die immortalisiert worden ist, indem sie mit einem Virus transformiert wurde, wie beispielsweise dem Epstein-Barr-Virus. Am bevorzugten ist die immortalisierte Zelllinie einer Myelom-Zelllinie oder ein Derivat davon. Das Expressionssystem der Wahl ist das Glutaminsynthetase-Expressionssystem, das in WO 87/00462 (siehe auch P. E. Stephens et al., Nucleic Acid Res. 17:7110 (1989) und C. R. Bebbington et al., Bio/Technology 10:169 (1992)) beschrieben ist.
Obwohl die Zelllinie, die verwendet wird, um den menschlichen Antikörper herzustellen, bevorzugterweise eine Säugerzelllinie ist, kann alternativ jede andere geeignete Zelllinie, wie eine bakterielle Zelllinie oder eine Hefezelllinie, verwendet werden. Für einzelne Antikörperketten wird beabsichtigt, dass von E.coli abstammende Bakterienstämme verwendet werden sollten. Der erhaltene Antikörper wird hinsichtlich der Funktionalität überprüft. Wenn die Funktionalität verloren geht, ist es notwendig, zu Schritt (2) zurückzukehren, und den Rahmen des Antikörpers zu ändern.
Sobald sie exprimiert worden sind, können die gesamten Antikörper, ihre Dimere, die einzelnen leichten und schweren Ketten oder andere Immunglobulinformen der vorliegenden Erfindung nach Standardverfahren des Fachgebiets, einschließlich der Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und ähnlicher (siehe im Allgemeinen Scopes, R, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)) gereinigt werden. Im Wesentlichen reine Immunglobuline von mindestens ungefähr 90-95% Homogenität werden bevorzugt, und 98-99% oder mehr Homogenität wird für pharmazeutische Verwendungen am meisten bevorzugt. Sobald sie teilweise oder bis zur Homogenität je nach Wunsch gereinigt worden sind, kann ein Antikörper therapeutisch verwendet werden.
Antikörper werden typischerweise als pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst, und als wirksamen Inhaltsstoff einen Antikörper gemäß der Erfindung. Der Antikörper und die pharmazeutischen Zusammensetzungen daraus sind besonders nützlich zur parenteralen Verabreichung, d. h. subkutan, intramuskulär oder intravenös.
Die Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung werden für gewöhnlich eine Lösung des Antikörpers oder ein Cocktail daraus umfassen, der in einem annehmbaren Träger, bevorzugterweise einem wässrigen Träger, gelöst ist. Eine Vielzahl wässriger Träger kann verwendet werden, z. B. steriles Wasser für die Injektion, 0,9% Natriumchlorid in Wasser, 5% Dextrose in Wasser und Lactat-Ringer-Lösung. Diese Lösungen sind steril und im Allgemeinen frei von partikelförmigen Substanzen. Diese Zusammensetzungen können mit konventionellen, allgemein bekannten Sterilisierungstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare zusätzliche Substanzen enthalten, die gewünscht werden, um sie physiologischen Bedingungen anzunähern, wie beispielsweise die Einstellung des pH-Werts und Pufferungsmittel, Mittel zur Einstellung der Toxizität und ähnliche, z. B. Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat etc. Die Antikörperkonzentration in diesen Formulierungen kann weit variieren, beispielsweise von weniger als ungefähr 0,5%, für gewöhnlich weniger als ungefähr 1% bis zu 15 oder 20 Gew.-%, und wird primär aufgrund der Flüssigvolumina, der Viscositäten etc. gemäß dem besonderen Administrationsmodus, der ausgewählt worden ist, gewählt.
Das bedeutet, dass eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur intramuskulären Injektion so hergestellt werden kann, dass sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50 mg Antikörper enthält. Eine typische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion könnte so gemacht werden, dass sie 250 ml steriler Ringers-Lösung und 150 mg Antikörper enthält. Die tatsächlichen Verfahren zum Herstellen von parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen werden den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sein oder einleuchten, insbesondere solchen, die in der Herstellung parenteraler Produkte ausgebildet sind, und sie sind in detaillierterer Form beispielsweise in Remmington's Pharmaceutical Science, 15. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1990) beschrieben.
Die Antikörper dieser Erfindung können zur Lagerung lyophilisiert werden und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung rekonstituiert werden. Diese Technik hat sich als wirksam für konventionelle Immunglobulin herausgestellt. Jede geeignete Lyophilisierung und Rekonstituierungstechniken können verwendet werden. Es wird von Fachleuten auf dem Gebiet in Erwägung gezogen, dass die Lyophilisierung und Rekonstituierung zur variierenden Graden an Wirksamkeitsverlust des Antikörpers führen kann (z. B. bei konventionellen Immunglobulinen, neigen IgM-Antikörper dazu, einen größeren Wirksamkeitsverlust zu haben, als IgG-Antikörper), und dass die Verwendungsniveaus eingestellt werden müssen, um zu kompensieren.
Der Dosisbereich des erfindungsgemäßen Antikörpers liegt bei ungefähr 0,5-1.000 mg/m², bevorzugterweise bei ungefähr 0,5 bis 250 mg/m², mehr bevorzugt zwischen 0,5 und 100 mg/m² und 0,5 und 50 mg/m² und am meisten bevorzugt zwischen 5 und 25 mg/m², wie beispielsweise 15 mg/m².
Gleichermaßen, ausgedrückt als mg pro Dosis, können die Dosen des Antikörpers ungefähr 1 bis 200 pro Dosis sein, bevorzugt ungefähr 1 bis 500 mg pro Dosis, mehr bevorzugt zwischen 1 bis 200 mg pro Dosis und zwischen 1 bis 100 mg pro Dosis und am meisten bevorzugt zwischen 10 und 50 mg pro Dosis, wie beispielsweise 30 mg pro Dosis.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können mit Dosierungsniveaus und in einer Form durchgeführt werden, die von dem behandelnden Arzt ausgewählt wird. Auf jeden Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge der Antikörper bereitstellen, die ausreicht, um den Patienten wirksam zu behandeln.
Typischerweise wird das chemotherapeutische Mittel und der Antikörper als getrennte pharmazeutische Zusammensetzung für die gemeinsame Verabreichung vorliegen, aber sie können auch als einzelne pharmazeutische Rezeptur formuliert werden. Auf diese Weise werden dem Patienten in ein und derselben Zusammensetzung sowohl der Antikörper und das chemotherapeutische Mittel bereitgestellt.
Einer oder mehrere verschiedene chemotherapeutische Mittel und ein oder mehrere verschiedene Anti-Ep-CAM-Antikörper können in allen Aspekten der vorliegenden Erfindung gemeinsam verabreicht werden. D. h., dass die Bezugnahme auf ein chemotherapeutisches Mittel einen oder mehrere verschiedene chemotherapeutische Mittel umfasst. Wenn mehr als ein chemotherapeutisches Mittel vorhanden ist, können diese entweder einzeln jeweils alleine und/oder zusammen als ein Cocktail aus chemotherapeutischen Mitteln verabreicht werden. Gleichermaßen umfasst die Bezugnahme auf einen Antikörper einen oder mehrere verschiedene Anti-Ep-CAM-Antikörper. Wenn mehr als ein Antikörper vorliegt, können diese wiederum entweder einzeln jeweils alleine und/oder zusammen als ein Cocktail verabreicht werden. Zusätzlich werden die chemotherapeutischen Mittel normalerweise getrennt von den Antikörpern verabreicht, aber sie können auch zusammen als ein Cocktail aus chemotherapeutischen Mitteln/Antikörpern verabreicht werden.
Die gemeinsame Verabreichung des chemotherapeutischen Mittels/Radiotherapie mit dem Antikörper umfasst die im Wesentlichen gleichzeitige Verabreichung sowohl des chemotherapeutischen Mittels/Radiotherapie und des Antikörpers. Im Wesentlichen ist der Grund der gemeinsamen Verabreichung der, eine ausreichende Exposition Ep-CAM-exprimierender Tumorzellen gegenüber einem chemotherapeutischen Mittel/Radiotherapie zu ermöglichen, welche bekannt sind, das Voranschreiten des Zellzyklus bei G₂/M zu blockieren, um den gewünschten Anstieg der Ep-CAM-Antigendichte vor der Exposition der gleichen Tumorzellen gegen den Anti-Ep-CAM-Antikörper zu erreichen, wodurch eine stärkere Ins-Zielnahme der Anti-Ep-CAM-Antikörper gegen Ep-CAM-exprimierende Tumoren erreicht wird. Die gemeinsame Verabreichung umfasst daher jeden Verabreichungsmodus eines chemotherapeutischen Mittels/einer Radiotherapie zusammen mit einem Anti-Ep-CAM-Antikörper, welcher zu diesem Ergebnis führt. In der Beschreibung bezieht sich der Begriff „Kombination eines Anti-Ep-CAM-Antikörpers mit einem chemotherapeutischen Mittel" auf eine, worin das chemotherapeutische Mittel/die Radiotherapie und der Anti-Ep-CAM-Antikörper gemeinsam verabreicht worden sind.
Vorzugsweise wird das chemotherapeutische Mittel gleichzeitig mit dem Antikörper verabreicht und mehr bevorzugt vor dem Antikörper. Das bedeutet, dass das chemotherapeutische Mittel am gleichen Tag wie der Antikörper verabreicht werden kann, entweder zusammen oder innerhalb von Stunden nacheinander, aber auch bis zu zwei Monate zuvor verabreicht werden kann, typischerweise ungefähr ein bis zwei Wochen vor, und noch typischer, weniger als eine Woche vor, z. B. ein bis drei Tage zuvor.
Zusätzlich schließt die gemeinsame Verabreichung auch die Verabreichung von mehr als einer Dosis des Antikörpers innerhalb mehrerer Wochen nach einer oder mehrerer Dosen des chemotherapeutischen Mittels ein, anders gesagt, muss das chemotherapeutische Mittel nicht wieder mit jeder anschließenden Verabreichung des Antikörpers erneut verabreicht werden, sondern kann nur einmal verabreicht werden, oder abwechselnd über den Verlauf der Antikörperbehandlung. Die gemeinsame Verabreichung umfasst auch die Verabreichung des chemotherapeutischen Mittels bis zu drei Wochen nach dem Antikörper, bevorzugt innerhalb einer Woche, und mehr bevorzugt innerhalb weniger Tage, beispielsweise für einen bis fünf Tage nach dem Antikörper.
Der Antikörper kann mehrere Male täglich verabreicht werden. Gleichermaßen kann das chemotherapeutische Mittel kontinuierlich über mehrere Stunden oder sogar Tage infundiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung an Säuger-Patienten bereit, bevorzugt Menschen, die durch einen Krebs betroffen sind, welches die Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels, das in der Lage ist, die Ep-CAM-Antigen-exprimierenden Zellen in G₂/M zu arretieren, gemeinsam mit einem Anti-Ep-CAM-Antikörper umfasst. Vorzugsweise wird das chemotherapeutische Mittel simultan, und mehr bevorzugt, vor der Verabreichung des Antikörpers gegeben.
Die Krebsarten, die besonders wirksam durch diese Kombinationstherapie behandelt werden können, sind primäre oder metastasierende Krebse jedes histologischen oder histogenetischen Ursprungs, welche das Ep-CAM-Antigen exprimieren. Diese schließen beispielsweise Prostatakrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Pankreaskrebs und Eierstockkrebs ein.
Dosierungsschemata für das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren können eingestellt werden, um die Eigenschaften des Patienten, das Stadium der Erkrankung, die Eigenschaften des chemotherapeutischen Mittels und die Eigenschaften des Anti-Ep-CAM-Antikörpers zu berücksichtigen. Das Ziel der Dosierungsschemata dieser Erfindung liegt darin, den Anti-Ep-CAM-Antikörper in einer Weise zu verabreichen, der die Ep-CAM-exprimierenden Tumorzellen gegenüber dem Anti-Ep-CAM-Antikörper zu einem Zeitpunkt aussetzt, an dem die Antigenexpression aufgrund der Exposition gegenüber einer Chemotherapie wahrscheinlich erhöht ist, welche dafür bekannt ist, die Zellzyklusprogression in G₂/M zu blockieren. Zusätzlich sollte ein Dosierungsschema, das für den Patienten günstig ist, so weit wie möglich beibehalten werden.
Bevorzugte Dosierungsschemata zur Verabreichung des Anti-Ep-CAM-Antikörpers und der Chemotherapie schließen ein: Verabreichung des Anti-Ep-CAM-Antikörpers einmal jede oder alle zwei Wochen, bevorzugt einmal alle drei oder vier Wochen, oder eine Kombination davon, solange es notwendig ist. Das chemotherapeutische Mittel wird gemäß dem bereits etablierten Darreichungsschema für dieses Mittel oder nach einem Schema gegeben, das den Ep-CAM-exprimierenden Tumorzellen nach Exposition ermöglicht, in G₂/M arretiert zu werden. Bevorzugte Dosierungsschemata varrieren mit dem chemotherapeutischen Mittel und dem Erkrankungsstadium, aber schließen beispielsweise einmal wöchentlich, einmal alle drei oder vier Wochen, oder täglich über mehrere (z. B. 3-5) Tage ein, welche alle drei oder vier Wochen wiederholte werden, solange es notwendig ist. Die Dosierung des Anti-Ep-CAM-Antikörpers kann am gleichen Tag stattfinden, oder an verschiedenen Tagen, wie für dieses chemotherapeutische Mittel indiziert ist. Die Einstellung des Dosierungsschemas oder der Stärke der Dosis zur Verhinderung oder zur Absenkung der Toxizität oder der Nebenwirkungen kann entweder beim Anti-Ep-CAM-Antikörper oder beim chemotherapeutischen Mittel stattfinden.
Beispielsweise ist das bevorzugte Dosierungsschema für die gemeinsame Verabreichung von Vinorelbin und Cisplatin in Kombination mit dem humanisierten 323/A3 (IgG₁) die Verabreichung des humanisierten 323/A3 (IgG₁) in einer Dosis von 30 mg/m² einmal pro Woche so lange es notwendig ist, aber typischerweise für einen Zeitraum von drei bis vier Wochen, gefolgt von einer Dosis aus 30 mg/m² in jeder zweiten Woche danach, solange es notwendig ist. Vinorelbin wird in einer Dosis von 25 mg/m² am Tag 1, 8, 15 und 22 verabreicht. Cisplatin wird nur einmal in einer Dosis von 100 mg/m² am Tag 1 gegeben. Danach wird das Vinorelbin/Cisplatin-Schema alle 28 Tage solange es notwendig ist wiederholt. Bevorzugterweise werden Vinorelbin, Cisplatin und humanisierte 323/A3 (IgG₁) zum gleichen Zeitpunkt am Tag 1 über einen Zeitraum von ungefähr 2 bis 3 Stunden verabreicht.
Ein weiteres Beispiel eines bevorzugten Dosierungsschemas ist die Verabreichung von Paclitaxel/Carboplatin in Kombination mit humanisiertem 323/A3 (IgG₁), wobei 323/A3 (IgG₁) wie bei dem Vinorelbin/Cisplatin-Beispiel oben verabreicht wird, und Paclitaxel und Carboplatin in einer Dosis von 225 mg/m² und einer AUC = 6,0 jeweils am Tag 1 gegeben werden, mit einer wiederholten Dosierung alle 28 Tage danach, solange es notwendig ist. Wiederum werden Paclitaxel, Carboplatin und der humanisierte 323/A3 (IgG₁) vorzugsweise zusammen am Tag 1 über einen Zeitraum von ungefähr 2 bis 3 Stunden verabreicht.
Andere bevorzugte Dosierungsschemata, die die Kombination von 323/A3 (IgG₁) mit irgendeinem aus Navelbin, Cisplatin oder Taxol umfassen, würden selbst ähnliche Dosierungen und Darreichungsschemata umfassen, wobei nur ein Antikrebsmittel statt zweier verwendet wird.
Wenn der bevorzugte Anti-Ep-CAM-Antikörper Panorex ist, liegt die Dosis des Antikörpers zwischen 10 bis 500 mg pro Dosis, bevorzugt bei 100 mg pro Dosis.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist ein Verfahren zum Erhöhen der Antikörperbindung von Anti-Ep-CAM-Antikörper an Ep-CAM-exprimierende Zellen durch gemeinsame Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels, das in der Lage ist, Zellen in G₂/M zu arretieren mit diesem Anti-Ep-CAM-Antikörper an einen Patienten.
Unter gemeinsamem Verabreichen eines chemotherapeutischen Mittels gemäß der Erfindung zusammen mit einem Anti-Ep-CAM-Antikörper, ist es möglich, die Antikörperbindung ungefähr 2-10-fach zu steigern, bevorzugt mehr als 4-fach, mehr bevorzugt mehr als 6-fach und am meisten bevorzugt mehr als 8-fach.
Figuren
1.
Ep-CAM wird über den Zellzyklus exprimiert, in höherer Dichte und stärkerer Homogenität auf Zellen in S- (gepunktete Linie) und in G₂/M- (gestrichelte Linie) Phasen als in G₀/G₁-Zellen (durchgezogene Linie). Dieses Expressionsmuster ist bei einer Vielzahl anderer menschlicher Darm-, Prostata-, und Lungentumor-Zelllinien beschrieben worden.
2.
Die Zellzyklus-Blockade ist ein auffälliges Merkmal von Adenokarzinomzellen, die in vitro gegenüber Navelbin (NVB; 30 nM), plus Cisplatin (CDDP; 5 μM) oder Taxol (TAX; 80 nM) plus Carboplatin (CPBDA; 100 μM) exponiert werden, verglichen mit Medium allein, 5-Fluororacil (5FU), Interferon-alpha (IFN-alpha; 100 U/ml) oder Interferon-gamma (IFN-gamma; 100 U/ml). Der Bereich jedes Balkens wird geteilt, um den Prozentsatz an Zellen in G₀/G₁ und in S + G₂/M-Phasen anzuzeigen; die Höhe jedes Balkens gibt die durchschnittliche Anzahl an Ep-CAM-Molekülen pro Zelle innerhalb der Population wieder. Zellen in der S-Phase und in der G₂/M-Phase exprimieren höhere Mengen an Ep-CAM (1) und die Mittel, welche die Zellzyklusprogression blockierten, hatten eine insgesamt erhöhte Ep-CAM-Expression.
3.
Die Expression des Ep-CAM-Antigens wurde auf einer Vielzahl von Adenokarzinomzelllinien wie auch auf Primärkulturen normaler menschlicher Zellen quantifiziert. Kultivierte Zellen wurden nacheinander gegenüber Medium, oder gegenüber 30 nM Navelbin, gefolgt von 5 μM Cisplatin (NVB + CDDP), oder gegenüber 80 nM Taxol, gefolgt von 100 μM Carboplatin (TAX + CPDBA) exponiert. Die 4 Andenokarzinomazellen exprimierten nach der Exposition gegenüber den Zyklus-spezifischen Medikamentenkombinationen höhere Antigen-Mengen, wobei die 4 normalen Zellen keinen Anstieg der Antigenexpression zeigten, welche in 2 der normalen Zellpopulationen nicht nachweisbar war.
3a.
Die Bindung von Panorex, einem verwandten monoklonalen Antikörper der Maus mit einer Spezifität für das Ep-CAM-Antigen wurde nach 15 min. Inkubation mit HT29 Adenokarzinomzellen untersucht, welche mit Navelbin plus Cisplatin oder mit Taxol, wie zuvor beschrieben, kultiviert worden sind. Ein signifikanter Anstieg (34%) der Antikörperbindung wurde bei allen Zellen gesehen, die mit Navelbin plus Cisplatin behandelt wurden; 82% dieser Zel len wurden in der S- oder G₂/M-Phase des Zyklus arretiert, verglichen mit 21% der Kontrollzellen. (Ein geringerer Anstieg (8%) in der Antikörperbindung wurde bei Zellen gesehen, die mit Taxol behandelt worden sind, aber in diesem Experiment wurden nur 57% der Zellen Zyklus-arretiert) wie in 3a gezeigt ist.
4.
Die Fähigkeit menschlicher peripherer Blut-ADCC-Effektorzellen, Tumorzielzellen zu lysieren, die mit humanisiertem 323/A3 (IgG₁) inkubiert worden sind (einem humanisierten monoklonalen Antikörper mit Spezifität für das Ep-CAM-Antigen, der in der Lage ist, mit Fc-Rezeptoren auf menschlichen Effektorzellen zu interagieren) in vitro wurde verbessert, wenn die Zielzellen mit NAVELBIN (30 nM) plus Cisplatin (5 μM) vorbehandelt worden waren.
5.
Die Behandlung menschlicher Tumor-Xenograft-tragender Mäuse mit einem Zellzyklus-spezifischen cytotoxischen Mittel förderte eine verbesserte Lokalisierung des Antikörpers, der für Ep-CAM spezifisch ist, in den Tumoren.
6.
Aminosäuresequenz der humanisierten 323/A3 (IgG₁) leichten Kappa Kette
7.
Aminosäuresequenz der humanisierten 323/A3 (IgG₁) schweren Kette
8.
Vektorkarte von pEE6
9.
Vektorkarte von pEE12
10.
Vektorkarte von pEE18
11.
Aminosäuresequenz der humanisierten 323/A3 (IgG_4cys) leichten Kappa Kette
12.
Aminosäuresequenz der humanisierten 323/A3 (IgG_4cys) varianten schweren Kette
13.
Aminosäuresequenz der humanisierten 323/A3 (IgG_2cys) leichten Kappa Kette
14.
Aminosäuresequenz der humanisierten 323/A3 (IgG_2cys) schweren Kette
15.
cDNA-Sequenz der humanisierten 323/A3 (IgG₁) leichten Kette
16.
cDNA-Sequenz der humanisierten 323/A3 (IgG₁) schweren Kette
17.
cDNA-Sequenz der humanisierten 323/A3 (IgG₄) schweren Kette
18.
cDNA-Sequenz der humanisierten 323/A3 (IgG_2cys) schweren Kette
Die folgenden Beispiele stellen die Erfindung dar.
Beispiel 1. Ep-CAM-Antigenexpression variierte in den Phasen über den Zellzyklus auf PC-3 Prostata Adenokarzinomzellen.
Populationen von PC-3 Prostata-Adenokarzinomzellen wurden auf ihre Verteilung in den G₀/G₁-, S-, und G₂/M-Phasen des Zellzyklus, wie auch auf die Ep-CAM-Expression untersucht. Die Zellen wurden leicht trypsinisiert und mechanisch von den Kulturflaschen abgelöst und in Calcium- und Magnesium-freier Phosphat-gepufferter Salzlösung resuspendiert, die Rinderserumalbumin und NaN₃ enthält. Genau 2 × 10⁵ Zellen wurden mit FITC-323/A3 Maus-IgG-Antikörper oder FITC-Maus-IgG (Kontrolle) gefärbt. Die Zellen wurden mit kaltem Paraformaldehyd fixiert, dann für die DNA-Färbung mit Tween-20 permeabilisiert. Zelluläre DNA wurde mit Propiumiodid und RNase A gefärbt. Listmode-Daten wurden auf einem FACScan-Durchflusscytometer (Becton Dickinson Immunocytoetry Systems) ermittelt, welcher mit einem 488 nm Laser ausgerüstet ist, indem die Cell Fit Software benutzt wurde. Die Zellzyklusanalyse wurde unter Verwendung von der SOBR-Modellierung (wo möglich, ansonsten wurden manuelle Einschätzungen verwendet) auf Cell Fit durchgeführt.
Die Ep-CAM-Antigenexpression, wie durch 323/A3-Bindung detektiert wurde, wurde unter Verwendung der Histogrammanalyse in Win List (Verity Software House) getrennt untersucht.
1 zeigt, dass Ep-CAM über den Zellzyklus exprimiert wird, aber in höherer Dichte und größerer Homogenität auf Zellen in S- (gepunktete Linie) und in G₂/M- (gestrichelte Linie) Phasen als in G₀/G₁-Zellen (durchgezogene Linie). Dieses Expressionsmuster ist bei einer Vielzahl anderer menschlicher Darm-, Prostata-, und Lungentumorzelllinien dokumentiert worden.
Beispiel 2: Erhöhte Expression des Ep-CAM-Antigens auf Adenocarcinomzellen war mit einem Stillstand der Zellzyklusprogression und einer Anhäufung der Zellen in S und G₂/M-Phasen assoziiert.
Adenocarcinomzelllinien wurden gegenüber verschiedenen Medikamenten oder Kombinationen aus Medikamenten, wie in 2 angegeben, ausgesetzt. Subkonfluente Zellen wurden gegenüber Navelbin oder Taxol für bis zu 24 Stunden exponiert, dann gewaschen und gegenüber Cisplatin beziehungsweise Carboplatin über Nacht exponiert. Die Zellen wurden gegenüber 5FU für 24 Stunden exponiert, und für 2-5 Tage gegenüber Interferonen. Die Zellen wurden gewaschen und für weitere 2-5 Tage vor der Analyse auf die Antigenexpression und den Zellzyklus-Status, wie in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert. Die Antigenexpression wurde durch einen Vergleich der Bindung von Fluoreszin-konjugierten 323/A3 an kultivierte Zellen durch Bindung an kalibrierte Microkügelchen-Standards quantifiziert.
Die Zellzyklusanalyse zeigte, dass nur 6,3% der Medium-Kontrollzellen in den S und G₂/M-Phasen zu finden waren, verglichen mit 39,4% bei NVB + CDDP und 82,6% bei TAX + CPBDA-Zellen, wobei beide Kombinationen signifikante Anstiege der Ep-CAM-Antigenexpression verursachten (wie in 2 nachgewiesen). Die Antigenexpression wurde nicht signifikant in Zellen erhöht, die gegenüber 5FU, IFN-⌷, oder IFN-⌷ exponiert waren, welche nur 7,9%, 12% bzw. 11,5% an Zellen in S + G₂/M-Phase hatten. D. h., dass nur die Medikamente, die eine Anhäufung von Zellen in S oder G₂/M-Phasen verursachten, in der Lage waren, einen signifikanten Anstieg der Ep-CAM-Antigenexpression zu verursachen.
Beispiel 2a.
Die Bindung von Panorex, einem verwandten monoclonalen Antikörper der Maus mit Spezifität für das Ep-CAM-Antigen wurde nach einer 15-minütigen Inkubation mit HT29 Adenocarcinomzellen untersucht, welche mit Navelbin + Cisplatin oder mit Taxol kultiviert worden sind, wie zuvor beschrieben worden ist. Ein signifikanter Anstieg (34%) der Antikörperbindung wurde bei den Zellen gesehen, die mit Navelbin + Cisplatin behandelt worden waren; 82% dieser Zellen waren in S oder G₂/M-Zyklusphase arretiert, verglichen mit 21% der Kontrollzellen. (Ein kleinerer Anstieg (8%) der Antikörperbindung wurde bei Zellen gesehen, die mit Taxol behandelt worden sind, aber in diesem Experiment waren nur 57% der Zellen zyklusarretiert) wie in 3a gezeigt wird.
Beispiel 3. Eine erhöhte Ep-CAM-Antigenexpression wurde auf Tumorzellen beobachtet, aber nicht auf normalen Zellen, die in vitro gegenüber zytotoxischen Medikamenten ausgesetzt worden sind.
Die Expression von Ep-CAM-Antigen wurde auf eine Vielzahl von Adenocarcinom-Zelllinien wie auch auf Primärkulturen normaler menschlicher Zel len quantifiziert. Kultivierte subkonfluente Zellen wurden nacheinander gegenüber Medium, oder gegenüber 30 nM Navelbin, gefolgt von 5 μM Cisplatin (NVB + CDDP) oder gegenüber 80 nM Taxol, gefolgt von 100 μM Carboplatin (TAX + CPBDA) exponiert. Die Zellen wurden mit Medium gewaschen und für weitere 2-5 Tage vor der Analyse auf die Antigenexpression wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, kultiviert.
3 zeigt eindeutig, dass die 4 Adenocarcinom-Zellen höhere Antigen-Mengen nach Exposition gegenüber zyklusspezifischen Medikamentenkombinationen exprimierten, wobei die 4 normalen Zellen keinerlei Anstieg der Antigenexpression zeigten, welche bei 2 der normalen Zellpopulationen nicht nachweisbar blieben.
Beispiel 4. Zellea, die gegenüber NAVELBIN + Cisplatin exponiert worden waren, waren bessere Ziele für menschliche ADDC-Aktivität als Kontrollzellen.
Adenocarcinomzellen wurden gegenüber Medikamenten, wie in den Beispielen 1 und 2 oben beschrieben, exponiert, und dann geerntet und in 96-Well-Plates zur Verwendung als Zielzellen in einem ⁵¹Cr-Release Cytotoxizitätsassay ausgesät. Zielzellen wurden über Nacht mit ⁵¹Cr kultiviert und dann gewaschen. Mononukleäre Zellen aus menschlichem peripheren Blut, welche über Nacht adhärieren lassen wurden, wurden in einer 50:1 Effektor: Zielverhältnis hinzugegeben, und die ADCC-Kulturen wurden für 6 Stunden inkubiert. Die Überstände wurden eingesammelt und hinsichtlich der Radioaktivität ausgezählt, und der Prozentsatz der spezifischen Freisetzung wurde berechnet. (siehe 4).
4 zeigt eindeutig, dass PC-3 Prostata-Adenocarcinomzellen bessere Ziele für die menschliche ADCC-Aktivität nach Exposition gegenüber Navelbin/Cisplatin sind, verglichen mit Kontrollen, die nicht gegenüber diesem chemotherapeutischen Mittel exponiert worden sind. Diese Wirkung kann direkt auf der erhöhten Antigenexpression beruhen, und dadurch auf einer erhöhten Antikörperbindung, einer abgesenkten Modulierung des Ep-CAM-Antigens, einer gesteigerten Empfindlichkeit der Zielzellen oder einer Kombination dieser Faktoren.
Beispiel 5. Antikörper-Targeting gegen Ep-CAM-positive Tumoren wurde signifikant durch Vorbehandlung der Mäuse mit NAVELBIN verbessert.
Durch subkutane Implantation menschlicher Kolon-Adenocarcinom(HAT-29) in weibliche CD-1 Nackmäuse (Charles River) wurden Tumore ausgelöst. Sobald die Tumore 200-300 mg erreicht hatten, wurden die Tiere in Gruppen aus fünf unterteilt. Navelbin wurde intravenös in einer Dosis von 28 mg/kg an den Tagen 1 und 5 injiziert. Eine Kontrollgruppe wurde mit 5-Fluorouracil (5-FU) intraperitoneal zu 20 mg/kg an den Tagen 1 und 5 dosiert. Am Tag 6 wurde der menschliche 323/A3 IgG_4cys-TMT (ein humanisierter monoklonaler Antikörper Chelator-Konjugat mit Spezifität für das Ep-CAM-Antigen) mit Lutetium-177 markiert und intravenös über die laterale Schwanzvene injiziert. Jede Maus erhielt 4,1 μg Protein/2,09 μCi Lutetium-177/0,2 ml Injektion. Blut, Milz, Leber, Lunge, Niere, Oberschenkel und Tumor wurden an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Antikörper-Verabreichung für direkte Gamma-Zählung geerntet (siehe 5 für die Ergebnisse).
5 zeigt, dass die Vorbehandlung mit Navelbin das Antikörper-Targeting Ep-CAM-positiver Tumoren erhöht, während die Vorbehandlung mit 5-FU das nicht tut.
Beispiel 6. Expression des humanisierten Antikörpers 323/A3 (IgG₁) variant in NSO-Zellen.

1. Zweck/Zusammenfassung Die cDNAs, die die leichte und schwere Kette des humanisierten 323/A3 Antikörpers kodieren (siehe 15 beziehungsweise 16) wurden genetisch in einem einzelnen Celltech-Glutamin-Synthetase (GS) Expressionsplasmid, pEE18 (siehe 10) konstruiert, und verwendet, um Maus-NSO-Zellen zu transfizieren.
2. Material und Methoden
2.1. Materialien NSO-Zehlen wurden von Celltech Biologics plc, Slough, SL1 4EN, Berkshire, UK, bezogen. Die Expressionsplasmide pEE6HCMV und pEE12 (siehe 8 und 9) wurden von Celltech Biologics plc, Slough, bezogen.
2.2 Das pEE6HMCV Plasmid (siehe 8), welches die humanisierte schwere Kette DNA vollständiger Länge kodiert, wurde mit BamHI und BglII verdaut, um das 3,2 kb Fragment freizusetzen, das die DNA enthielt, die die schwere Kette unter der Transkriptionskontrolle des Major Immediate Early Promoter des menschlichen Cytomegalievirus enthielt. Dieses Fragment wurde in die BamHI-Schnittstelle von pEE12 (9) kloniert, welches die DNA enthielt, die die humanisierte leichte Kette kodiert. (Siehe 6 für die Aminosäuresequenz der humanisierten 323/A3 (IgG₁) leichten Kappa Kette und 7 für die Aminosäuresequenz der humanisierten 323/A3 (IgG₁) schweren Kette. Siehe 10 für eine schematische Darstellung des pEE18-Plasmids, das die schweren und leichten Ketten von 323/A3 (IgG₁) kodiert.
2.2.2 Transfektion und Selektion von NSO-Zellen
2.2.2.1 Gewebekultur

Alle Einzelzellkulturaktivitäten wurden in isolierten Räumen durchgeführt, die eine einzelne Laminar-Sterilbank enthalten, und einen einzelnen Inkubator, der einzig auf die Verwendung von NSO-Zellen zur Produktion stabiler Zelllinien ausgerichtet war, die humanisierten 323/A3 (IgG₁) sezenieren. Keine anderen NSO-Zelllinien, menschliche Zelllinien oder Virustransformierten Zelllinien wurden in dieser Umgebung verwendet.
Ein Fläschchen NSO-Zellen wurde wiederbelebt und in 1:1:1 Medium gezüchtet, das sich aus DMEM:RPMI-1640:Sigma PFHM (1:1:1) zusammensetzte, in einer Zelldichte zwischen 0,5 und 1×10⁶ ml. Für die Elektroporation wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, und einmal mit PBS gewaschen. pEE18 Plasmid-DNA, die das 323/A3 (IgG₁) kodiert, wurde mit SalI verdaut, hitzeinaktiviert und bei 65°C für 15 min., mit Ethanol präzipitiert und luftgetrocknet. Das getrocknete DNA-Pellet wurde in PBS auf eine Konzentration von 0,5 μg/ml resuspendiert und 100 μl in einer 2 mm Electroporationscuvette (BTX) aliquotiert. Gewaschene NSO-Zellen wurden zu 1,2 × 10⁷/ml resuspendiert und 400 μl in die Cuvette gegeben, um eine endgültige Dichte von 10⁶ ml in einem Endvolumen von 0,5 ml zu ergeben. Die Electroporation wurde bei 300 V für 1 msek. in einer BTX 8209 GenePulser durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation auf Eis für 5-10 min. Das Electroporationsgemisch wurde zu 105 Zellen/ml mit 1:1:1 Medium resuspendiert und über 96-Well-Platten zu 50 μl/Well verteilt. Am folgenden Tag wurden die Wells mit 150 μl GS-Medium (Gln-freies IMDM, 1 = X GS und Nucleotidsupplement, 5% DFBS) gefüttert, um den GS-Selektionsprozess zu starten, so dass alle Wells eine finale Konzentration von 3% DFBS hatten.

2.2.2.2 Spezifisches Produktionsverhältnis (SPR) Ausgewählte Zelllinien, die in GS-Medium gezüchtet wurden (3% DFBS), wurden in einer Dichte von 0,2 × 10⁶ Zellen/ml in T-25 Flaschen (Costar) ausgesät, die 5 ml GS-Medium (3% DFBS) enthalten. Zellen wurden über Nacht bei 37°C für 24 h inkubiert, worauf ein Aliquot jedes Kulturüberstands entfernt wurde. Die Überstände wurden im Menschen-IgG-ELISA Assay verwendet, um die Konzentration des sezenierten menschlichen 323/A3 (IgG₁) zu bestimmen. Der SPR-Wert wurde durch Multiplizierten der Konzentration des 323/A3 (IgG₁) Antikörpers im Überstand mal dem Volumen (5,0) erhalten, und wird als μg/10⁶ Zellen/24 h ausgedrückt.
2.2.2.3 Cryokonservierung von Zellen Ausgewählte Zelllinien wurden routinegemäß geerntet, wenn die Zelldichte höher als 0,2 × 10⁶ Zellen/ml betrug. Ein geeignetes Volumen an Zellen wurde entnommen und einer Zentrifugation bei 1.000 × g für 5 min. bei 22°C unterworfen. Das Zellpellet wurde vorsichtig zu 1-4 × 10⁶/ml mit eiskaltem Einfriermedium resuspendiert, das 20% (v/v) FBS/10% (v/v) DMSO/GS-Medium (steril filtriert) enthält. Jeweils 1,0 ml der Zellsuspension wurden in ein 1,8 ml Cryokonservierungsgefäß (NUNC) aliquotiert und über Nacht in einem Cryo 1°C Einfriercontainer (Nalgene) graduierlich eingefroren, welcher in einen –70°C Gefrierschrank gestellt worden ist. Die Röhrchen wurden dann aus dem Container entfernt, und in der Gasphase eines Flüssigstickstoff-Gefrierschranks gelagert.

Zwanzig Fläschchen von jeder Zelllinie, einschließlich eines geringfügig humanisierten 323/A3 (IgG₁) Produzenten wurden, wie oben beschrieben, heruntergekühlt und anfänglich in der Gasphase eines MVE Cryogenics XLC-440 Flüssigstickstoff-Gefrierschranks gelagert. Die Zellen wurden anschließend transferiert und in der Gasphase eines MVE Cryogenics XLC500 Flüssigstickstoff-Gefrierschranks gelagert.
Beispiel 7. Expression des humanisierten Antikörpers 323/A3 (IgG_4cys) in NSO-Zellen

1. Zusammenfassung des Zwecks Die cDNAs, die die leichte und schwere Kette des humanisierten Antikörpers 323/A3 (IgG_4cys) (ein humanisierter 323/A3 Antikörper) Anitkörper (siehe 15 und 17) kodieren, wurden genetisch in ein einzelnes Celltech Glutamin Synthetase (GS) Expressionsplasmid, pEE18, konstruiert und verwendet, um Maus-NSO-Zellen zu transfizieren.
2. Material und Methoden
2.1 Materialien (wie bei Beispiel 6 oben)
2.2 Herstellung eines humanisierten 323/A3 (IgG_4cys pEE18-Expressionsplasmids) Das pEE6HMCV-Plasmid (siehe 8), das die DNA der humanisierten schweren Kette gesamter Länge kodiert, wurde mit BamHI und BglII verdaut, um ein 3,2 kb Fragment freizusetzen, das die DNA enthält, die die schwere Kette unter transkriptioneller Kontrolle des Major Immediate Early Promoters des menschlichen Cytomegalievirus enthält. Dieses Fragment wurde in die BamHI-Schnittstelle von pEE12 kloniert, das die DNA enthielt, die die humanisierte leichte Kette (siehe 11) für die humanisierte 323/A3 (IgG₄) Kappa Leichte Kette Aminosäuresequenz und 12 für die 323/A3 (IgG_4cys) variante Schwere Kette Aminosäuresequenz) enthält. Siehe 10 für eine schematische Darstellung des pEE18-Plasmids, das die schweren und leichten Ketten von 323/A3 kodiert.
2.2.2 Transfektion und Selektion von NSO-Zellen: siehe Beispiel 6 oben.

Beispiel 8. Expression des Humaisierten Antikörpers 323/A3 (IgG_2cys) in NSO-Zellen

1. Zweck/Zusammenfassung Die cDNAs, die die schweren und leichten Ketten des humaniserten 323/A3 (IgG_2cys) Antikörpers kodieren, wurden genetisch in ein einzelnes Celltech Glutamine Synthetase (GS) Expressionsplasmid, pEE18, konstruiert und verwendet, um Maus-NSO-Zellen zu transfizieren.
2. Materialien und Methoden
2.1 Materialien wie die Beispiele 6 und 7 oben
2.2 Ermöglichung der 323/A3 (IgG_2cys)pEE18 Expression des Plasmids. Das pEEE6 HCMV-Plasmid, das die DNA der humanisierten schweren Kette vollständiger Länge kodiert, wurde mit Bam HI und Bgl II verdaut, um ein 3,2 kb Fragment freizusetzen, das die DNA enthält, die die schwere Kette unter transkriptioneller Kontrolle des Major Immediate Early Promoters des menschlichen Cytomegalievirus kodiert. Dieses Fragment wurde in die Bam II-Schnittstelle des pEE12 kloniert, das die DNA enthielt, die die humanisierte leichte Kette kodiert (siehe 13 für 323/A3 (IgG_2cys) Kappa Leichte Kette Aminosäuresequenz und 14 für die 323/A3 (IgG_2cys) Schwere Kette Aminosäuresequenz). Siehe 10 für eine schematische Darstellung des pEE18-Plasmids, das 323/A3 (IgG_2cys) schwere und leichte Ketten kodiert.
2.2.2 Transfektion und Selektion von NSO-Zellen – siehe Beispiele 6 und 7 oben.

SEQUENZLISTE

Claims

Ein Kit-of-parts aus einem Anti-Ep-CAM-Antikörper mit einem oder mehreren chemotherapeutischen Mitteln, das in der Lage ist, die Ep-CAM-Antigen-exprimierenden Zellen in S oder G₂/M zu arretieren, wobei das chemotherapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Capecitibin, Camptothecin, Oxaliplatin, Paclitaxel, Docetaxel, Cyclophosphamid, Methotrexat, Vinorelbin, Epirubicin, Mitoxantron, Tomudex, Cisplatin, Carboplatin, Gemcitabin, Etoposid und Topotecan.
Der Kit nach Anspruch 1, wobei der Antikörper Panorex ist.
Kit nach Anspruch 1 oder 2, worin das chemotherapeutische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Camptothecin, Oxaliplatin, Capecitibin, Tomudex besteht.
Kit gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung von Prostata-, Lungen-, Brust-, Magen- oder Darmtumoren.
Verwendung eines Anti-Ep-CAM-Antikörpers und eines oder mehrerer in S oder G₂/M chemotherapeutischen Mitteln, die in der Lage sind, die Ep-CAM-Antigen-exprimierenden Zellen zu arretieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Capecitibin, Camptothecin, Oxaliplatin, Paclitaxel, Docetaxel, Cyclophosphamid, Methotrexat, Vinorelbin, Epirubicin, Mitoxantron, Tomudex, Cisplatin, Carboplatin, Gemcitabin, Etoposid und Topotecan zur Herstellung eines Kit-of-parts zur Behandlung von Krebsarten, die Ep-CAM-Antigen exprimieren.