KR20100056559A - 항-ｂｃｌ-2 활성제와 유형 ⅱ 항-ｃｄ20 항체의 조합 요법 - Google Patents

항-ｂｃｌ-2 활성제와 유형 ⅱ 항-ｃｄ20 항체의 조합 요법 Download PDF

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본 발명은 항-Bcl-2 활성제와 조합으로의 암, 특히 CD20 발현 암 치료용 의약의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

항-ＢＣＬ-2 활성제와 유형 Ⅱ 항-ＣＤ20 항체의 조합 요법 {COMBINATION THERAPY OF A TYPE Ⅱ ANTI-CD20 ANTIBODY WITH AN ANTI-BCL-2 ACTIVE AGENT}
본 발명은 항-Bcl-2 활성제와 조합으로의 암, 특히 CD20 발현 암 치료용 의약의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도에 관한 것이다.
CD20 분자 (또한 인간 B-림프구-제약 (restricted) 분화 항원 또는 Bp35) 는 예비-B 및 성숙 B 림프구 상에 위치하는 분자량이 대략 35 kD 인 소수성 막통과 단백질이다 (Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264 (19) (1989) 11282-11287; 및 Einfield, D.A., et al. EMBO J. 7(3) (1988) 711-717). CD20 은 말초 혈액 또는 림프 기관으로부터의 90% 초과의 B 세포의 표면 상에서 발견되며, 초기 예비-B 세포 발달 동안 발현되고 혈장 세포 분화시까지 남아있다. CD20 은 정상 B 세포 뿐 아니라 악성 B 세포 모두에 존재한다. 특히, CD20 은 90% 초과의 B 세포 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphomas: NHL) 에서 발현되나 (Anderson, K.C., et al., Blood 63(6) (1984) 1424-1433), 조혈 줄기 세포, 프로-B 세포, 정상 혈장 세포, 또는 기타 정상 조직에서는 발견되지 않는다 (Tedder, T.F., et al., J, Immunol. 135(2) (1985) 973-979).
CD20 단백질의 85 개의 아미노산 카르복실-말단 영역은 세포질 내에 위치한다. 상기 영역의 길이는 각각 3, 3, 28, 15 및 16 개의 아미노산의 비교적 짧은 세포질내 영역을 갖는 IgM, IgD 및 IgG 중쇄 또는 조직적합성 항원 계열 Ⅱα 또는 β 사슬과 같은 기타 B 세포-특이적 표면 구조와 대조된다 (Komaromy, M., et al., NAR 11 (1983) 6775-6785). 마지막 61 개의 카르복실-말단 아미노산 중에서, 21 개는 산성 잔기인 반면, 오직 2 개만이 염기성으로, 상기 영역이 강한 순 음전하를 갖고 있음을 나타낸다. GenBank 접근 번호는 NP-690605 이다. CD20 이 B 세포의 활성화 및 분화 과정 중의 초기 단계(들) 을 조절하는데 관여할 수 있고 (Tedder, T.F., et al., Eur. J. Immunol. 16 (1986) 881-887), 칼슘 이온 채널로서 작용할 것이라고 생각된다 (Tedder, T.F., et al., J. Cell. Biochem. 14D (1990) 195).
CD20 결합 방식과 생물학적 활성이 유의하게 상이한 2 가지 상이한 유형의 항-CD20 항체가 존재한다 (Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; 및 Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052). 예를 들어, 리툭시맙과 같은 유형 Ⅰ 항체는 보체 매개 세포독성이 강력한 반면, 예를 들어, 토시투맙 (Tositumomab: B1), 11B8, AT80 또는 인간화 B-Ly1 항체와 같은 유형 Ⅱ 항체는 포스파티딜세린 노출시 캐스페아제-의존성 세포자멸사를 통한 표적 세포 사멸을 효과적으로 개시한다.
유형 Ⅰ 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가 공유하는 공통의 특징은 하기 표 1 에 요약되어 있다.
유형 Ⅰ 및 유형 Ⅱ 항- CD20 항체의 특성
유형 Ⅰ 항- CD20 항체 유형 Ⅱ 항- CD20 항체
유형 Ⅰ CD20 에피토프 유형 Ⅱ CD20 에피토프
CD20 을 지질 라프트로 위치시킴 CD20 을 지질 라프트로 위치시키지 않음
CDC 를 증가시킴 (IgG1 이소형인 경우) CDC 를 감소시킴 (IgG1 이소형인 경우)
ADCC 활성 (IgG1 이소형인 경우) ADCC 활성 (IgG1 이소형인 경우)
완전한 결합 수용력 감소된 결합 수용력
동형 응집 보다 강한 동형 응집
교차 결합시 세포자멸사 유도 교차 결합 없이 강한 세포 사멸 유도
Bcl-2 계열 단백질은 발달 신호에 의해 그리고 복합 스트레스 신호에 응답하여 촉발되는 프로그램화 세포 사멸을 조절한다 (Cory. S., and Adams, J.M., Nature Reviews Cancer 2 (2002) 647-656; Adams, Genes und Development 17 (2003) 2481-2495; Danial, N.N., and Korsmeyer, SJ., Cell 116 (2004) 205-219). 세포 생존은 Bcl-2 그 자체 및 3 개 또는 4 개의 보존된 Bcl-2 상동 (BH) 영역을 갖는 여러 가까운 관련 단백질 (Bcl-xL, Bcl-W, Mcl-1 및 A1) 에 의해 촉진되는 반면, 세포자멸사는 2 가지 기타 서브-계열에 의해 유도된다. 세포 사멸에 대한 개시 신호는 작은 BH3 상호작용 도메인만을 공통으로 갖는, Bad, Bid, Bim, Puma 및 Noxa 를 비롯한 BH3-만의 (BH3-only) 단백질이 다양한 군에 의해 전달된다 (Huang and Strasser, Cell 103 (2000) 839-842). 그러나, BH1-BH3 을 함유하는 멀티-도메인 단백질인 Bax 또는 Bak 가 세포 사멸을 위해 필요하다 (Cheng, et al., Molecular Cell 8 (2001) 705-711; Wei, M.C., et al., Science 292 (2001) 727-730; Zong, W.X., et al., Genes and Development 15 148 (2001) 1-1486).
활성화 시, 이들은 미토콘드리아의 외부 막을 투과하여 세포를 해체시키는 캐스페아제를 활성화시키는데 필요한 전-세포자멸사 인자 (예를 들어, 사이토크롬 C) 를 방출시킬 수 있다 (Wang, K., Genes and Development 15 (2001) 2922-2933; (Adams, 2003 supra); Green, D.R., and Kroemer, G., Science 305 (2004) 626-629).
Bcl-2 계열의 이러한 3 가지 개체원 사이의 상호작용이 세포가 살거나 죽는지를 결정한다. BH3-만의 단백질이 예를 들어 DNA 손상에 반응하여 활성화되는 경우, 이들은 BH3 도메인을 통해 이들의 전-생존 관련계열 상의 홈에 결합할 수 있다 (Sattler, et al., Science 275 (1997) 983-986). 그러나, 어떻게 BH3-만의 및 Bcl-2-유사 단백질이 Bax 및 Bak 의 활성을 조절하는 지에 대해서는 잘 이해되어 있지 않다 (Adams, 2003 supra). 가장 주목하는 것은 Bax 에 초점을 두고 있다. 이 가용성 단량체성 단백질 (Hsu, Y.T., et al., Journal of Biological Chemistry 272 (1997) 13289-1 3834; Wolter, K.G., et al., Journal of Cell Biology 139 (1997) 1281-92) 은 정상적으로, 아마도 세포질 위치화를 담당할 것으로 보이는 이것의 홈 내로 삽입된 막 표적 도메인을 갖는다 (Nechushtan, A., et al., EMBO Journal 18 (1999) 2330-2341; Suzuki, et al., Cell 103 (2000) 645-654; Schinzel, A., et al., J Cell Biol 164 (2004) 1021-1032). 여러 무관한 펩티드/단백질이 문헌 [Lucken-Ardjomande, S., and Martinou, J.C., J Cell Sci 118 (2005) 473-483] 에서 검토된 Bax 활성을 조절하는 것으로 제안되었지만, 이것의 생리학적 관련성이 성립되어야 하는 것으로 남아있다. 대안적으로는, Bax 는 특정 BH3-만의 단백질에 의한 직접적인 참여를 통해 활성화될 수 있고 (Lucken-Ardjomande, S., and Martinou, J. C, 2005 supra), 가장 적합한 것으로 문서에 언급된 것은 Bid 의 절단된 형태인 tBid 이다 (Wei, M.C., et al., Genes und Development 14 (2000) 2060-2071; Kuwana, T., et al., Cell 111 (2002) 331-342; Roucou, X., et al., Biochemical Journal 368 (2002) 915-921; Cartron, P.F., et al., MoI Cell 16 (2004) 807-818). 그 밖에 논의된 바와 같이 (Adams 2003 supra), Bcl-2 이 Bax 에 직접적으로 참여한다는 모델의 가장 오래된 문헌에서는 (Oltvai, Z.N., et al., Cell 74 (1993) 609-619), Bcl-2 는 막에 결합되어 있는 반면 Bax 는 세포질에 있기 때문에, 이들의 상호 작용은 세포 용해시 사용되는 세제에 따라 매우 다를 것이라는 문제가 있었다 (Hsu, Y.T., and Youle, 1997 supra). 그럼에도 불구하고, Bax 의 BH3 영역이 Bcl-2 와의 연합을 매개할 수 있고 (Zha, H., and Reed, J., Journal of Biological Chemistry 272 (1997) 31482-88; Wang, K., et al., Molecular und Cellular Biology 18 (1998) 6083-6089), Bcl-2 가 심지어 헤테로이량체가 검출될 수 없을지라도 Bax 의 올리고머화를 방지한다는 것은 잘 성립되어 있다 (Mikhailov, V., et al., Journal of Biological Chemistry 276 (2001) 18361-18374). 그러므로, 전-생존 단백질이 Bax 활성화를 직접적으로 또는 간접적으로 억제시키는지의 여부는 아직 명확하지 않다.
Bax 및 Bak 가 대부분의 경우 기능적으로 동등한 것처럼 여겨짐에도 불구하고 (Lindsten, T., et al., Molecular Cell 6 (2000) 1389-1399; Wei, M.C., et al., 2001 supra), 이들 조절에서의 실질적인 차이는 건강한 세포에서의 구별되는 위치화로부터 예상될 것이다. 대부분 세포질 내에 있는 Bax 와는 달리, Bak 는 건강한 세포의 미토콘드리아의 외부 막 및 소포체 상에 복합체로 상존한다 (Wei, M. C, et al., 2000 supra; Zong, W.X., et al., Journal of Cell Biology 162 (2003) 59-69). 그럼에도 불구하고 세포독성 신호를 받으면, Bax 및 Bak 모두는 형태학적 변화를 일으키고, Bax 가 세포기관 막으로 이동하며, 그 다음 여기서 Bax 및 Bak 모두는 연합될 수 있는 호모-올리고머를 형성하여, 막 투과를 야기한다 (Hsu, Y.T., et al., PNAS 94 (1997) 3668-3672; Wolter, K.G., et al., 1997 supra; Antonsson, B., et al., Journal of Biological Chemistry 276 (2001) 11615-11623; Nechushtan, A., et al., Journal of Cell Biology 153 (2001) 1265-1276; Wei, M.C., et al., 2001 supra; Mikhailov, V., et al., Journal of Biological Chemistry 278 (2003) 5367-5376).
모두, Bcl-2 계열 단백질의 전생존 일원을 억제하는 동일한 특성을 갖는 다양한 Bcl-2 억제제가 존재하며, 그러므로 암 치료를 위한 유망한 후보자이다. 이러한 Bcl-2 억제제는 예를 들어, 오블리메르센 (Oblimersen), SPC-2996, RTA-402, 고시폴 (Gossypol), AT-101, 오바토클락스 메실레이트 (Obatoclax mesylate), A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-메톡시안티마이신 (2-Methoxyantimycin) A3, HA-14-1, KF-67544, 푸르푸로갈린 (Purpurogallin), TP-TW-37, YC-137 및 Z-24 이고, 예를 들어 문헌 [Zhai, D., et al., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1419-1421] 에 기재되어 있다.
문헌 [Smith, M. R., et al, Molecular Cancer Therapeutics 3(12) (2004) 1693-1699 및 Ramanarayanan, J. et al., British Journal of Haematology 127(5) (2004) 519-530] 에는 유형 Ⅰ 항-CD20 항체 (리툭시맙) 와 안티센스 Bcl-2 올리고뉴클레오티드 (오블리메르센: Oblimersen) 의 조합이 언급되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 항-Bcl-2 활성제와 조합으로의, CD20 발현 암의 치료용 의약의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 항-Bcl-2 활성제와 조합으로의, CD20 발현 암 환자의 치료용 의약의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도를 추가로 포함한다.
바람직하게는 상기 항-Bcl-2 활성제는 5 μM 이하의 항-Bcl-2 억제 활성의 IC50 을 갖는 Bcl-2 억제제이다.
바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시맙에 비한, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비가 0.3 내지 0.6, 더욱 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 더욱 더 바람직하게는 0.4 내지 0.5 이다.
바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 인간화 B-Ly1 항체이다.
바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 증가된 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 을 갖는다.
바람직하게는 상기 항-Bcl-2 활성제는 오블리메르센 (Oblimersen), SPC-2996, RTA-402, 고시폴 (Gossypol), AT-101, 오바토클락스 메실레이트 (Obatoclax mesylate), A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-메톡시안티마이신 (2-Methoxyantimycin) A3, HA-14-1, KF-67544, 푸르푸로갈린 (Purpurogallin), TP-TW-37, YC-137 및 Z-24 로 이루어지는 군, 더욱 바람직하게는 ABT-263 및 ABT-737 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 CD20 발현 암은 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL) 이다.
상세한 설명
"항체" 라는 용어는 전체 항체, 인간 항체, 인간화 항체 및, 단일클론 항체, 키메라성 항체 또는 재조합 항체와 같은 유전 조작 항체 뿐 아니라 본 발명에 따른 특성을 보유한다면 이러한 항체의 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물" 이라는 용어는 단일 아미노산 조성의 항체 분자 제제를 말한다. 따라서, "인간 단일클론 항체" 라는 용어는 인간 생식선 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 하나의 구현예에서, 인간 단일클론 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 이식유전자 및 인간 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 비-인간 동물, 예를 들어 유전자이식 마우스로부터 수득되는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 제조된다.
바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 단일클론 항체이다.
"키메라성 항체" 라는 용어는 가변 영역, 즉, 하나의 기원 또는 종으로부터의 결합 영역 및 통상 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 상이한 기원 또는 종 유래의 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 단일클론 항체를 말한다. 쥣과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라성 항체가 특히 바람직하다. 이러한 쥣과/인간 키메라성 항체는 쥣과 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 조각 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 조각을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 본 발명에 포함되는 "키메라성 항체" 의 다른 형태는 계열 또는 서브계열이 본래 항체의 것으로부터 변형되는 또는 변화되는 항체이다. 이러한 "키메라성" 항체는 또한 "계열-스위치 항체" 로서도 언급된다. 키메라성 항체의 제조 방법에는 현재 당업계에 잘 알려진 통상의 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술이 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; US 5,202,238 호 및 US 5,204,244 호를 참조한다.
"인간화 항체" 라는 용어는, 골격 또는 "상보성 결정 영역" (complementarity determining regions: CDR) 이 모 면역글로불린과 비교해 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 변형된 항체를 말한다. 바람직한 구현예에서, 쥣과 CDR 이 인간 항체의 골격 영역 내에 그래프트되어 "인간화 항체" 가 제조된다. 예를 들어, 문헌 [Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270] 를 참조한다. 특히 바람직한 CDR 은 키메라성 및 2 작용성 항체에 대해 상기 표시된 항원을 인지하는 서열을 나타내는 것에 상응한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "인간 항체" 라는 용어는 인간 생식선 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 당업계에 잘 알려져 있다 (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). 이러한 기술에 기반하여, 매우 다양한 표적에 대한 인간 항체가 제조될 수 있다. 인간 항체의 예는 예를 들어, 문헌 [Kellermann, S. A., et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597] 에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "재조합 인간 항체" 라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조되고, 발현되고, 제작되고 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식된 동물 (예를 들어, 마우스) 로부터 단리되는 항체 또는 숙주 세포 내에 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현되는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태로의 인간 생식선 면역글로불린 서열 유래의 가변 및 불변 영역을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내 체세포 과돌연변이에 적용된다. 그러므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 서열이 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 반면, 생체 내 인간 항체 생식선 레퍼토리 (repertoire) 내에 자연적으로 존재할 수는 없는 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "특이적으로 결합하는" 또는 "~ 에 특이적으로 결합한다" 라는 용어는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 바람직하게는 결합 친화성은 10-9 mol/ℓ 이하의 KD 값 (예를 들어, 10-10 mol/ℓ), 바람직하게는 10-10 mol/ℓ 이하의 KD 값 (예를 들어, 10-12 mol/ℓ) 이다. 결합 친화성은 CD20 발현 세포에 대해 스캐차드 플롯 (Scatchard plot) 분석과 같은 표준 결합 어세이로 측정된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "핵산 분자" 라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 이다.
"불변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는데에는 직접적으로 관여하지 않으나 효과기 기능 (ADCC, 보체 결합, 및 CDC) 에는 관여한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "가변 영역" (경쇄 가변 영역 (VL), 중쇄 가변 영역 (VH)) 은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관여하는 경쇄 및 중쇄 쌍의 각각을 표시한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반적인 구조를 갖고, 각각의 도메인은 그 서열이 널리 보존되고, 3 개의 "과가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결되는 4 개의 골격 (FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-시트 형태를 채택하며 CDR 은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 사슬 내의 CDR 은 골격 영역에 의해 3 차원 구조를 유지하고, 기타 사슬로부터의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 하므로, 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "과가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부분" 이라는 용어는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격 (Framework)" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 바와 같은 과가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 에서 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 항원 결합에 최고로 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌 [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 의 표준 정의 및/또는 "과가변 루프" 로부터의 이들 잔기에 따라 정의된다.
"CD20" 및 "CD20 항원" 이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 CD20 유전자로 트랜스펙션된 세포 상에서 발현되는 인간 CD20 의 임의의 변이체, 이소형태 및 종 상동이 포함된다. CD20 항원에 대한 본 발명의 항체의 결합은 CD20 의 불활성화에 의해 CD20 을 발현하는 세포 (예를 들어, 종양 세포) 의 사멸을 매개한다. CD20 을 발현하는 세포의 사멸은 세포 사멸/세포자멸사 유도, ADCC 및 CDC 매카니즘 중 하나에 의해 일어날 수 있다.
당업계에서 인지되는 바와 같은 CD20 의 동의어에는 B-림프구 항원 CD20, B-림프구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35, BM5 및 LF5 가 포함된다.
본 발명에 따른 "항-CD20 항체" 라는 용어는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. CD20 항원에 대한 항-CD20 항체의 결합 특성 및 생물학적 활성에 따라, 문헌 [Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; 및 Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052] 에 따르면 2 가지 유형의 항-CD20 항체 (유형 Ⅰ 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체) 로 구별될 수 있다 (하기 표 2 참조).
유형 Ⅰ 및 유형 Ⅱ 항- CD20 항체의 특성
유형 Ⅰ 항- CD20 항체 유형 Ⅱ 항- CD20 항체
유형 Ⅰ CD20 에피토프 유형 Ⅱ CD20 에피토프
CD20 을 지질 라프트로 위치시킴 CD20 을 지질 라프트로 위치시키지 않음
CDC 를 증가시킴 (IgG1 이소형인 경우) CDC 를 감소시킴 (IgG1 이소형인 경우)
ADCC 활성 (IgG1 이소형인 경우) ADCC 활성 (IgG1 이소형인 경우)
완전한 결합 수용력 감소된 결합 수용력
동형 응집 보다 강한 동형 응집
교차 결합시 세포자멸사 유도 교차 결합 없이 강한 세포 사멸 유도
유형 Ⅰ 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 하나의 필수적인 특성은 이들의 결합 방식이다. 그러므로, 유형 Ⅰ 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시맙에 비한, 상기 항-CD20 항체의 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비에 의해 분류될 수 있다.
상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시맙에 비한, 상기 항-CD20 항체의 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비가 0.3 내지 0.6, 더욱 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 더욱 더 바람직하게는 0.4 내지 0.5 이다. 이러한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 예에는 예를 들어, 토시투모맙 (B1 IgG2a), 인간화 B-Ly1 항체 IgG1 (WO 2005/044859 호에 기재된 바와 같은 키메라성 인간화 IgG1 항체), 11B8 IgG1 (WO 2004/035607 호에 기재됨), 및 AT80 IgG1 이 포함된다. 바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 인간화 B-Ly1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단일클론 항체이다 (WO 2005/044859 호에 기재됨).
유형 Ⅱ 항체와 대조적으로 유형 Ⅰ 항-CD20 항체는 리툭시맙에 비한, 상기 항-CD20 항체의 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비가 0.8 내지 1.2, 바람직하게는 0.9 내지 1.1 이다. 이러한 유형 Ⅰ 항-CD20 항체의 예에는 예를 들어, 리툭시맙, 1F5 IgG2a (ECACC, 하이브리도마; Press, et al., Blood 69/2 (1987) 584-591), HI47 IgG3 (ECACC, 하이브리도마), 2C6 IgG1 (WO 2005/103081 호에 기재됨), 2F2 IgG1 (WO 2004/035607 호 및 WO 2005/103081 호에 기재됨) 및 2H7 IgG1 (WO 2004/056312 호에 기재됨) 이 포함된다.
"리툭시맙에 비한, 항-CD20 항체의 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비" 는 실시예 2 에서 기재되는 바와 같이 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 를 사용하는 FACSArray (Becton Dickinson) 에서 Cy5 와 공액된 상기 항-CD20 항체 및 Cy5 와 공액된 리툭시맙을 사용하여 직접적인 면역형광 측정 (평균 형광 강도 (MFI) 를 측정함) 에 의해 측정되고 하기와 같이 계산된다:
라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비 =
Figure pct00001
MFI 는 평균 형광 강도 (mean fluorescent intensity) 이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "Cy5-표지 비" 는 항체 분자 당 Cy5-표지 분자의 수를 의미한다.
전형적으로 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시맙에 비한, 상기 제 2 항-CD20 항체의 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비가 0.3 내지 0.6, 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 0.5 이다.
바람직한 구현예에서, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체, 바람직하게는 인간화 B-Ly1 항체는 증가된 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 을 갖는다.
본원에 정의되는 바와 같은 "증가된 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 을 갖는 항체" 라는 구절은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정된 바와 같이 증가된 ADCC 을 갖는 항체를 의미한다. 하나의 허용되는 시험관 내 ADCC 어세이는 다음과 같다:
1) 어세이에서는 항체의 항원-결합 영역에 의해 인지되는 표적 항원을 발현하는 것으로 알려진 표적 세포를 사용한다;
2) 어세이에서는 효과기 세포로서 랜덤하게 선택된 건강한 수여자의 혈액으로부터 단리되는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 사용한다;
3) 어세이는 하기 프로토콜에 따라 실시한다:
i) PBMC 를 표준 밀도 원심분리 절차를 사용하여 단리하고 RPMI 세포 배양 배지 내에 5 x 106 세포/㎖ 로 현탁한다;
ii) 표적 세포를 표준 조직 배양법에 의해 성장시키고, 90% 초과의 생존능을 갖는 급격 성장상으로부터 수확하여, RPMI 세포 배양 배지로 세정하고, 100 마이크로-큐리 (Curies) 의 51Cr 로 표지하고, 세포 배양 배지로 2 회 세정하고, 세포 배양 배지에 105 세포/㎖ 의 밀도로 재현탁한다;
iii) 상기 최종 표적 세포 현탁액 100 ㎕ 를 96 웰 마이크로역가 플레이트의 각 웰에 옮긴다;
iv) 항체를 세포 배양 배지에 4000 ng/㎖ 내지 0.04 ng/㎖ 로 연속 희석하고, 수득되는 항체 용액 50 ㎕ 를 96 웰 마이크로역가 플레이트 중의 표적 세포에 첨가하고, 상기 전체 농도 범위를 포함하는 다양한 항체 농도를 3 중으로 시험한다;
v) 최대 방출 (MR) 대조군의 경우에는, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트 내의 3 개의 부가적인 웰에, 항체 용액 (상기 iv 문단) 대신에 2% (VN) 비이온성 세제 수용액 (Nonidet, Sigma, St. Louis) 50 ㎕ 를 넣는다;
vi) 자발적 방출 (SR) 대조군의 경우에는, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트 내의 3 개의 부가적인 웰에, 항체 용액 (상기 iv 문단) 대신에 RPMI 세포 배양 배지 50 ㎕ 를 넣는다;
vii) 그 다음 96 웰 마이크로역가 플레이트를 50 x g 에서 1 분 동안 원심분리하고 1 시간 동안 4℃ 에서 인큐베이션시킨다;
viii) PBMC 현탁액 (상기 i 문단) 50 ㎕ 를 효과기 세포:표적 세포 비가 25:1 이 되도록 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% CO2 분위기, 37℃ 의 인큐베이터에 4 시간 동안 둔다;
ix) 각 웰로부터 세포가 없는 상청액을 수확하고, 실험적으로 방출된 방사능활성 (ER) 을 감마선 계수기를 사용하여 정량화한다;
x) 특정 용해 백분율은 식 (ER-MR)/(MR-SR) x 100 [식 중, ER 은 해당 항체 농도에 대해 정량된 평균 방사능활성 (상기 ix 문단 참조) 이고, MR 은 MR 대조군 (상기 V 문단 참조) 에 대해 정량된 평균 방사능활성 (상기 ix 문단 참조) 이고, SR 은 SR 대조군 (상기 vi 문단 참조) 에 대해 정량된 평균 방사능활성 (상기 ix 문단 참조) 임] 에 따라 각 항체 농도에 대해 계산된다;
4) "증가된 ADCC" 는 상기 시험된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 최대 특정 용해 백분율의 증가, 및/또는 상기 시험된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 최대 특정 용해 백분율의 절반을 달성하는데 필요한 항체의 농도의 감소로서 정의된다. ADCC 의 증가는, 당업자에게 알려진 동일한 표준 방법, 정제, 제형 및 저장 방법을 사용하여, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되나, GnTⅢ 을 과발현시키기 위해 조작된 숙주 세포에 의해 생성되지 않는 동일한 항체에 의해 매개되는 상기 어세이로 측정되는 ADCC 와 관련이 있다.
상기 "증가된 ADCC" 는 문헌 [Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 US 6,602,684 호에 기재되는 바와 같이 올리고당 성분을 조작함으로써 단일클론 항체의 상기 자연적인, 세포-매개 효과기 작용을 향상시키는 것을 의미하는 상기 항체의 당조작에 의해 수득될 수 있다.
"보체-의존성 세포독성 (CDC)" 이라는 용어는 보체의 존재하에서 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 종양 표적 세포의 용해를 말한다. CDC 는 바람직하게는, 보체의 존재하에서 본 발명에 따른 항-CD20 항체로 CD20 발현 세포 제제를 처리함으로써 측정된다. CDC 는 항체가 100 nM 의 농도에서 4 시간 후 종양 세포의 20% 이상의 용해 (세포 사멸) 를 유도하는 경우 발견된다. 어세이는 바람직하게는 51Cr 또는 Eu 표지 종양 세포로 실시되고, 방출된 51Cr 또는 Eu 를 측정한다. 대조군에는 보체는 있으나 항체는 없는 종양 표적 세포의 인큐베이션이 포함된다.
전형적으로는 IgG1 이소형의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가 특징적인 CDC 특성을 나타낸다. 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 IgG1 이소형의 유형 Ⅰ 항체에 비해 감소된 CDC (IgG1 이소형인 경우) 를 갖는다. 바람직하게는 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 IgG1 이소형 항체이다.
"리툭시맙" 항체 (참조 항체; 유형 Ⅰ 항-CD20 항체의 예) 는 인간 CD20 항원에 대한 단일클론 항체를 함유하는 유전적으로 조작된 키메라성 인간 감마 1 쥣과 불변 도메인이다. 상기 키메라성 항체는 인간 감마 1 불변 도메인을 함유하고, 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 (IDEC Pharmaceuticals Corporation) 의 1998 년 4 월 17 일에 발행된 US 5,736,137 호 (Andersen, K.C., et. al.) 에서 명칭 "C2B8" 로 확인된다. 리툭시맙은 재발 또는 난치성 저 악성도 (low-grade) 또는 소포, CD20 양성의, B-세포 비호지킨 림프종 환자의 치료를 위해 승인되었다. 시험관 내 작용 메카니즘 연구는 리툭시맙이 인간 보체-의존성 세포독성 (CDC) 을 나타내는 것을 보여준다 (Reff, et. al, Blood 83(2) (1994) 435-445). 부가적으로는, 이것은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 을 측정하는 어세이에서 유의한 활성을 나타낸다.
"인간화 B-Ly1 항체" 라는 용어는 IgG1 로부터의 인간 불변 도메인과 키메라화 후 인간화에 의해 쥣과 단일클론 항-CD20 항체 B-Ly1 (쥣과 중쇄 가변 영역 (VH): SEQ ID NO: 1; 쥣과 경쇄 가변 영역 (VL): SEQ ID NO: 2- 문헌 [Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139] 참조;) 로부터 수득되는, WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호에 기재된 바와 같은 인간화 B-Ly1 항체를 말한다 (WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호 참조). 이러한 "인간화 B-Ly1 항체" 는 WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호에 상세히 기재되어 있다.
바람직하게는 "인간화 B-Ly1 항체" 는 SEQ ID No.3 내지 SEQ ID No.20 (WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호의 B-HH2 ~ B-HH9 및 B-HL8 ~ B-HL17) 의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH) 을 갖는다. 특히 바람직한 것은 Seq. ID No. 3, 4, 7, 9, 11, 13 및 15 (WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호의 B-HH2, BHH-3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 및 B-HL13) 이다. 바람직하게는 "인간화 B-Ly1 항체" 는 SEQ ID No. 20 의 경쇄 가변 영역 (VL) (WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호의 B-KV1) 을 갖는다. 게다가, 인간화 B-Ly1 항체는 바람직하게는 IgG1 항체이다. 바람직하게는 이러한 인간화 B-Ly1 항체는 WO 2005/044859 호, WO 2004/065540 호, WO 2007/031875 호, 문헌 [Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 WO 99/154342 호에 기재된 방법에 따라 Fc 영역에서 당조작 (glycoengineered: GE) 된다. 이러한 당조작된 인간화 B-Ly1 항체는 Fc 영역에서의 변경된 당화 패던을 갖는다 (바람직하게는 감소된 푸코오스 잔기 수준을 갖는다). 바람직하게는 Fc 영역의 올리고당의 적어도 40% 이상 (하나의 구현예에서는 40% 내지 60%, 또다른 구현예에서는 적어도 50%, 또다른 구현예에서는 적어도 70% 이상) 이 비-푸코실화된다. 게다가 Fc 영역의 올리고당은 바람직하게는 양분된다.
올리고당 성분은 물리적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 내성, 면역계와의 상호작용, 약동학, 및 특이적 생물학적 활성을 비롯한 치료적 당단백질의 효능에 관련된 특성에 유의하게 영향을 줄 수 있다. 이러한 특성은 올리고당의 존재 또는 부재 뿐 아니라 이것의 특이적인 구조에 따라 다를 수 있다. 올리고당 구조와 당단백질 기능 사이에는 몇몇의 일반화가 이뤄질 수 있다. 예를 들어, 특정의 올리고당 구조는 특이적인 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 혈류로부터 당단백질의 빠른 제거를 매개하는 반면, 다른 구조는 항체에 의해 결합되고 원치 않는 면역 반응을 촉발시킬 수 있다. (Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).
포유류 세포는 인간 적용에 가장 상용성인 형태로 단백질을 글리코실화시키는 역량으로 인해, 치료적 당단백질 제조를 위한 바람직한 숙주이다. (Cumming, D.A., et al., Glycobiology 1 (1991) 115-130; Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981). 박테리아는 단백질을 거의 글리코실화시키지 않고, 효모, 사상 진균류, 곤충 및 식물 세포와 같은 기타 종류의 통상의 숙주는, 혈류로부터의 빠른 제거, 원치 않는 면역 상호작용, 및 일부 특정 경우에서는 감소된 생물학적 활성과 관련된 글리코실화 패턴을 산출한다. 포유류 세포 중, 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO) 세포가 지난 20 년 동안 가장 통상적으로 사용되어 왔다. 적합한 글리코실화 패턴을 제공하는 것 외에도, 이들 세포들은 유전적으로 안정한, 고도로 생산적인 클론 세포주의 일관된 세대를 가능하게 한다. 이들은 무혈청 배지를 사용하는 간단한 생물반응기에서 고밀도로 배양될 수 있고, 안전하고 재현성 있는 생물공정 개발을 가능하게 한다. 기타 통상적으로 사용되는 동물 세포에는 아기 햄스터 신장 (baby hamster kidney: BHK) 세포, NSO- 및 SP2/0-마우스 골수종 세포가 포함된다. 더욱 최근에는, 유전자이식 동물로부터의 생산이 시험되고 있다. (Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).
모든 항체는 중쇄 불변 영역 내의 보존된 위치에 탄수화물 구조를 함유하고, 각각의 이소형은 단백질 연합, 분비 또는 작용 활성에 다양하게 영향을 미치는 N-연결 탄수화물 구조의 차별되는 어레이를 갖는다. (Wright, A., and Monison, S. L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). 부착된 N-연결 탄수화물의 구조는 가공 정도에 따라 상당히 다르며, 고-만노오스, 복합 분지 뿐 아니라 바이안테너리 (biantennary) 복합체 올리고당이 포함될 수 있다. (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). 전형적으로는, 심지어 단일클론 항체가 복합 글리코형태로서 존재하는 식의 특정 글리코실화 부위에서 부착된 코어 올리고당 구조의 이질적 가공이 있다. 마찬가지로, 세포주 사이에서 항체 글리코실화의 주된 차이가 발생할 수 있고, 상이한 배양 조건 하에서 성장되는 제공된 세포주에 대해서 심지어 작은 차이도 발견되었다는 것이 제시되었다. (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822).
간단한 생산 공정을 유지하고 유의한, 원치 않는 부작용을 가능하게 피하면서 큰 효능 증가를 수득하기 위한 하나의 방법은, 문헌 [Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 US 6,602,684 호에 기재되는 바와 같이 항체의 올리고당 성분을 조작함으로써 단일클론 항체의 자연적인, 세포-매개 효과기 작용을 향상시키는 것이다. 암 면역요법에 가장 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인 내의 Asn297 에서 보존된 N-연결 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297 에 부착된 2 개의 복합체 바이안테너리 올리고당은 CH2 도메인 사이에 묻혀서 폴리펩티드 골격과의 폭넓은 접촉을 형성하고, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 작용을 매개하기 위해서는 이들의 존재가 항체에 필수적이다 (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32).
양분된 올리고당의 형성을 촉매화하는 글리코실트랜스페라아제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 Ⅲ ("GnTⅢ7y) 의 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서의 과발현이, 조작된 CHO 세포에 의해 생성되는 항신경모세포종 키메라성 단일클론 항체 (chCE7) 의 시험관 내 ADCC 활성을 유의하게 증가시킨다는 것이 이미 제시되어 있다 (전체 내용이 본원에 참조로서 인용되는 문헌 [Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180]; 및 WO 99/154342 호를 참조). 항체 chCE7 은 높은 종양 친화성 및 특이성을 갖지만, GnTⅢ 효소가 결합되는 표준 산업적 세포주에서 생성되는 경우 임상적으로 사용하기에는 효능이 너무 약한 비공액 단일클론 항체의 큰 계열에 속한다 (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180). 상기 연구는 ADCC 활성의 큰 증가가 GnTⅢ 을 발현하도록 항체 생산 세포를 조작합으로써 수득될 수 있을 것이고, 이것은 또한 양분된, 비-푸코실화 올리고당을 비롯한 불변 영역 (Fc) 에 관련된 양분된 올리고당의 비율을, 자연 발생 항체에서 발견되는 수준 초과로 증가시킨다는 것을 처음으로 보여주었다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "Bcl-2" 라는 용어는 Bcl-2 계열 단백질의 일원인 Bcl-2 단백질 (Swiss Prot ID No. P10415) 을 말한다 (Cory, S., and Adams, j.M., Nature Reviews Cancer 2 (2002) 647-656; Adams, Genes und Development 17 (2003) 2481-2495; Danial, N.N., and Korsmeyer, S.J., Cell 116 (2004) 205-219; Petros, A. M., Biochim Biophys Acta 1644 (2004) 83-94).
"항-Bcl-2 활성제" 라는 용어는 "항-Bcl-2 안티센스 뉴클레오티드" 및 "Bcl-2 억제제" 를 포함한다. "항-Bcl-2 안티센스 뉴클레오티드" 는 Bcl-2 mRNA 수준을 하향 조절하고 Bcl-2 단백질 발현을 감소시킨다. 이러한 항-Bcl-2 안티센스 뉴클레오티드의 예에는 오블리메르센 (Oblimersen) 및 SPC-2996 이 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "Bcl-2 억제제" 라는 용어는 예를 들어 RTA-402 와 같은 Bcl-2 ("Bcl-2 단백질 인산화 억제제") 의 인산화를 억제함으로써 또는 Bcl-2 단백질에 결합함으로써 Bcl-2 단백질 상호작용 활성을 억제하고, 그리하여 Bad/Bcl-2 복합체의 분열을 억제하는 작용제를 말한다 (이들은 "Bcl-2 단백질 결합 억제제" 로서 언급됨). 바람직하게는 상기 Bcl-2 억제제는 Bcl-2 단백질 결합 억제제이다. 이러한 Bcl-2 단백질 결합 억제제의 직접적인 결합을 통한 Bcl-2 억제 활성은 경쟁적 결합 어세이를 통해 측정될 수 있다. 그러므로 Bcl-2 단백질 활성의 억제의 IC50 은 실시예 3 에 따른 균일 시분해 형광 (homogenous time resolved fluorescence: HTRF) 어세이로 결정될 수 있다. 바람직하게는 항-Bcl-2 억제 활성의 IC50 은 5 μM 이하, 더욱 바람직하게는 1 μM 이하이다. 이러한 Bcl-2 단백질 결합 억제제에는 고시폴 (Gossypol), AT-101, 오바토클락스 메실레이트 (Obatoclax mesylate), A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, ABT-263, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-메톡시안티마이신 (2-Methoxyantimycin) A3, HA-14-1, KF-67544, 푸르푸로갈린 (Purpurogallin), TP-TW-37, YC-137 및 Z-24, 바람직하게는 ABT-263 및 ABT-737 과 같은 화합물이 포함된다.
오블리메르센 (Oblimersen) 은 Bcl-2 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이의 서열 및 이의 제제는 예를 들어 WO 95/08350 호, WO 1999/051259 호, WO 2002/017852 호, WO 2004/056971 호 및 US 5,734,033 호에 기재되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 오블리메르센 (Oblimersen) (또는 기타 동의어: 게난센스 (Genansense), G-3139, 오블리메르센 (Oblimersen) 나트륨) 은 그 서열이 다음과 같은 18 량체 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드의 헵타데카나트륨 염 (이의 서열은: 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3' 임); 인간 BCL2 cDNA 의 분절 32-49 nt (출발 코돈 영역) 로부터의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 헵타데카나트륨 염; d(P-티오)(T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T) DNA 헵타데카나트륨 염; P-티오티미딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오시티딜릴-(3'--5')-P-티오티미딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오시티딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오시티딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오시티딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오아데닐릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오구아닐릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오시티딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오구아닐릴-(3'--5')-P-티오티미딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오구아닐릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오시티딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오구아닐릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오시티딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오시티딜릴-(3'--5')-2'-데옥시-P-티오아데닐릴-(3'--5')-티미딘 헵타데카나트륨 염을 의미한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드인 SPC-2996 은 16 량체 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로서 이의 서열이 5'-CTCCCAACGTGCGCCA-3' 이고, 이 때 뉴클레오티드 1, 2, 14 및 15 는 뉴클레아제 소화에 향상된 내성을 갖는 고정된 핵산 (LNA) 뉴클레오티드이다. 상기 안티센스 LNA 올리고뉴클레오티드는 인간 Bcl-2 의 뉴클레오티드 33-48 (코딩 서열) 을 표적한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 RTA-402 는 Bcl-2 단백질 인산화를 차단하는 (Konopleva, M., et al., Blood 99 (2002) 326-35) C28-트리테르페노이드: 올레아난 트리테르페노이드 2-시아노-3,12-디옥소올레안-1,9-디엔-28-오산 (CDDO) (예를 들어, Honda, T., Rounds BV Bore, L., et al. J Med Chem. 43 (2000) 4233-4246 참조) 의 메틸 에스테르인 CDDO-Me 을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 ABT-737 은 WO 2006/099667 호 또는 문헌 [Corey, S., et al., Cancer Cell 8 (2005) 5-6] 에 기재되어 있는, 하기 화학식 I 의 Bcl-2 억제제인 N-[4-[4-(4'-클로로비페닐-2-일메틸)피페라진-1-일]벤조일]-3-[3-(디메틸아미노)-1(R)-(페닐술파닐메틸)프로필아미노]-4-니트로벤젠술폰아미드; 4-[4-(4'-클로로비페닐-2-일메틸)피페라진-1-일]-N-[3-[3-(디메틸아미노)-1(R)-(페닐술파닐메틸)프로필아미노]-4-니트로페닐술포닐]벤자미드를 의미한다:
[화학식 I]
Figure pct00002
.
본원에서 사용되는 바와 같은 ABT-263 은 US 2007/027,135 호에 기재되어 있는, 하기 화학식 Ⅱ 의 Bcl-2 억제제를 의미하고:
[화학식 Ⅱ]
Figure pct00003
본원에서 사용되는 바와 같은 A-371191 은 하기 화학식 Ⅲ 의 Bcl-2 억제제를 의미한다:
[화학식 Ⅲ]
Figure pct00004
.
본원에서 사용되는 바와 같은 A-385358 은 하기 화학식 Ⅳ 의 Bcl-2 억제제인 [(R)-4-(3-디메틸아미노-1-페닐술파닐메틸-프로필아미노)-N-[4-(4,4-di메틸-피페리딘-1-일)-벤조일]-3-니트로벤젠-술폰아미드 (예를 들어 문헌 [Shoemaker, A.R., et al., Cancer Research 66 (2006) 8731-8739] 에 기재됨) 를 의미한다:
[화학식 Ⅳ]
Figure pct00005
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본원에서 사용되는 바와 같은 고시폴 (Gossypol) 은 (+)-고시폴 또는 (-)-고시폴의 라세미 혼합물 (하기 화학식 Ⅴ 의 Bcl-2 억제제), 또는 순수한 (+)-고시폴 또는 (-)-고시폴을 의미하고, 바람직하게는 고시폴은 순수한 (-)-고시폴을 말한다:
[화학식 Ⅴ]
Figure pct00006
.
본원에서 사용되는 바와 같은 AT-101 은 아센타 써라퓨틱스 (Ascenta Therapeutics) 의 임상적 선도 화합물 AT-101, Bcl-2 억제제 및 R (-)-고시폴의 유도체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 오바토클락스 메실레이트 (Obatoclax mesylate) (또는 다른 동의어: GX-015-070; 또는 GX15-070) 는 예를 들어 WO 2004/106328 호, WO 2006/089397 호 및 문헌 [Walensky, L.D., Cell Death and Differentiation, 13 (2006) 1339-1350] 에 기재된, Bcl-2 억제제인 2-[2-(3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일]-1H-인돌 메탄술포네이트를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 TW-37 은 하기 화학식 Ⅵ 의 Bcl-2 억제제를 의미한다:
[화학식 Ⅵ]
Figure pct00007
.
본원에서 사용되는 바와 같은 BL-193 은 하기 화학식 Ⅶ 의 Bcl-2 억제제를 의미한다:
[화학식 Ⅶ]
Figure pct00008
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본원에서 사용되는 바와 같은 NSC-719664 는 안티마이신 (Antimycin) A3 으로부터 유도된 Bcl-2 억제제인 2-메톡시-안티마이신 A3 을 의미한다.
YC-137 은 예를 들어 문헌 [Walensky, L.D., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1339-1350] 에 기재되어 있다.
푸르푸로갈린 (Purpurogallin) 은 예를 들어 문헌 [Walensky, L.D., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1339-1350] 에 기재되어 있다.
HA-14-1 은 예를 들어 문헌 [Walensky, L.D., Cell Death and Differentiation 13 (2006) 1339-1350] 에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 Z-24 는 3Z-3-[(1H-피롤-2-일)-메틸리덴]-1-(1-피페리디닐메틸)-1,3-2H-인돌-2-온으로, 하기 화학식 Ⅷ 의 Bcl-2 억제제를 의미한다:
[화학식 Ⅷ]
Figure pct00009
.
바람직하게는 항-Bcl-2 활성제는 오블리메르센 (Oblimersen), SPC-2996, RTA-402, 고시폴 (Gossypol), AT-101, 오바토클락스 메실레이트 (Obatoclax mesylate), A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-메톡시안티마이신 (2-Methoxyantimycin) A3, HA-14-1, KF-67544, 푸르푸로갈린 (Purpurogallin), TP-TW-37, YC-137 및 Z-24 로부터 선택된다.
바람직하게는 항-Bcl-2 활성제는 5 μM 이하의 항-Bcl-2 억제 활성의 IC50 을 갖는 Bcl-2 단백질 결합 억제제이다. 이러한 Bcl-2 단백질 결합 억제제는 바람직하게는 고시폴 (Gossypol), AT-101, 오바토클락스 메실레이트 (Obatoclax mesylate), ABT-263 및 ABT-737, 더욱 바람직하게는 ABT-263 또는 ABT-737 로부터 선택된다.
용어 "CD20 의 발현" 항원은 종양 또는 암, 각각, 바람직하게는 비-고형 종양으로부터의 세포, 바람직하게는 T- 또는 B-세포, 더욱 바람직하게는 B-세포의 세포 표면 상에서 유의한 발현 수준의 CD20 항원을 나타내는 것으로 의도된다. "CD20 발현 암" 환자는 당업계에 공지된 표준 어세이에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 CD20 항원 발현은 면역조직화학 (IHC) 검출, FACS 를 사용해서 또는 상응하는 mRNA 의 PCR-기반 검출을 통해 측정된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "CD20 발현 암" 이라는 용어는 암 세포가 CD20 항원의 발현을 나타내는 모든 암을 말한다. 이러한 CD20 발현 암은 예를 들어, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비 소세포 폐 (NSCL) 암, 세기관지폐포 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목암, 피부 또는 안내 (intraocular) 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 위장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 외음부암종, 호지킨 질환, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 콩팥세포암종, 콩팥골반암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추 신경계 (CNS) 의 신생물, 척추종양, 뇌줄기신경아교종, 다형성 아교모세포종, 별아교세포종, 신경초종, 뇌실막세포종, 속질모세포종, 수막종, 편평세포암종, 뇌하수체샘종일 수 있고, 상기 임의의 암 중 난치성 유형을 포함하며, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합일 수 있다.
바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같은 CD20 발현 암은 림프종 (바람직하게는 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL)) 및 림프구성 백혈병을 말한다. 이러한 림프종 및 림프구성 백혈병에는 예를 들어 a) 소포 림프종, b) 소 비-분할 세포 림프종/버킷 (Burkitt) 림프종 (토착성 버킷 (Burkitt) 림프종, 산발성 버킷 림프종 및 비-버킷 림프종을 포함) c) 변연대 림프종 (림프절 이외 변연대 B 세포 림프종 (점막-관련 림프 조직 림프종, MALT 포함), 결절 변연대 B 세포 림프종 및 지라 변연대 림프종), d) 외투층 세포 림프종 (MCL), e) 대세포 림프종 (B-세포 확산 대세포 림프종 (DLCL), 확산 혼합 세포 림프종, 면역모세포 림프종, 일차성 종격동 B-세포 림프종, 혈관중심성 림프종-폐 B-세포 림프종 포함) f) 모발상 세포 백혈병, g) 림프성 림프종, 발덴스트룀 마크로글로불린혈증, h) 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소 림프성 림프종 (SLL), B-세포 전림프구성 백혈병, i) 형질 세포 신생물, 형질 세포 골수종, 다발성 골수종, 형질세포종 j) 호지킨 질환이 포함된다.
더욱 바람직하게는 CD20 발현 암은 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL) 이다. 특히 CD20 발현 암은 외투층 세포 림프종 (MCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), B-세포 확산 대세포 림프종 (DLCL), 버킷 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소포 림프종, 다발성 골수종, 변연대 림프종, 이식후 림프세포 증식 장애 (PTLD), HIV 관련 림프종, 발덴스트룀 마크로글로불린혈증, 또는 일차성 CNS 림프종이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "치료하기" 라는 용어는 다르게 지시되지 않는다면, 환자에서 종양의 성장, 종양 전이, 또는 기타 암-유발 또는 신생물 세포를 부분적으로 또는 완전히 예방 또는 과정의 역행, 경감, 억제를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "치료" 라는 용어는 다르게 지시되지 않는다면, 치료하는 행위를 말한다.
"치료 방법" 이라는 용어 또는 이와 동등한 용어는 예를 들어 암에 적용되는 경우 환자에서 암 세포의 수를 감소 또는 제거하기 위해, 또는 암 증상을 경감시키기 위해 설계된 작용 절차 또는 과정을 말한다. 암 또는 기타 증식성 장애의 "치료 방법" 은 암 세포 또는 기타 장애가 사실상 제거될 것임, 세포의 수 또는 장애가 사실상 감소될 것임 또는, 암 또는 기타 장애의 증상이 사실상 경감될 것임을 반드시 의미하지는 않는다. 종종, 암 치료 방법은 심지어 성공 가능성이 낮아도 수행될 것이나, 그렇기는 하지만 환자의 제시된 의료 기록 및 추정 생존 기대치가 작용의 전체적인 유리한 과정을 유도할 것으로 생각된다. "공동-투여" 또는 "공동-투여하기" 라는 용어는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 Bcl-2 억제제의 하나의 단일 제형으로서 또는 2 개의 분리 제형으로서의 투여를 말한다. 공동-투여는 동시에 또는 서로 연속으로 이뤄질 수 있고, 이 때 바람직하게는 두 가지 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 시간대가 있다. 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 Bcl-2 억제제는 동시에 또는 연속으로 공동-투여된다 (예를 들어, 연속 주입을 통한 정맥 (i.v.) 을 통해 (항체에 대해 한번 그리고 최종적으로 Bcl-2 억제제에 대해 한번; 또는 Bcl-2 억제제를 경구로 투여함). 2 가지 치료제가 연속으로 공동-투여되는 경우 투여량은 동일한 날에 2 개의 개별 투여로, 또는 작용제 중 하나를 제 1 일에 투여하고, 두번째 것을 제 2 일 내지 제 7 일, 바람직하게는 제 2 일 내지 제 4 일에 공동-투여한다. 그러므로 "연속으로" 라는 용어는 제 1 항체의 투여 후 7 일 내에, 바람직하게는 제 1 항체의 투여 후 4 일 내에를 의미하고; "동시에" 라는 용어는 동시각에를 의미한다. 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 Bcl-2 억제제의 유지 투여량과 관련된 "공동-투여" 라는 용어는 치료 주기가 2 가지 약물에 적합한 경우 유지 투여량을 예를 들어 매주 동시에 공동-투여할 수 있다는 것을 의미한다. 또는 예를 들어, Bcl-2 억제제는 예를 들어 매 제 1 일 내지 제 3 일에 투여되고 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 매주 투여된다. 또는 유지 투여량은 1 주 내에 또는 수 주 내에, 연속으로 공동-투여된다.
항체는 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 찾아진 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의료적 반응을 도출할 각 화합물 또는 조합의 양인 "치료적 유효량" (또는 간단히 "유효량") 으로 환자에게 투여하는 것이 자명하다.
상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 Bcl-2 억제제의 공동-투여 양 및 공동-투여 타이밍은 치료되는 환자의 유형 (종, 성별, 연령, 체중, 등) 및 상태 및 치료되는 질환 또는 상태의 중등도에 따라 상이할 것이다. 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 Bcl-2 억제제는 환자에게 1 회 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 공동-투여된다. 질환의 유형 및 중등도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예를 들어, 0.1 ~ 20 mg/kg) 의 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 1 mg/kg 내지 200 mg/kg (예를 들어, 10 ~ 150 mg/kg) 의 상기 Bcl-2 억제제가 환자에게 모든 약물의 공동-투여에 대한 초기 후보 투여량이다. 정맥 투여의 경우, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 또는 상기 Bcl-2 억제제에 대한 초기 주입 시간은 후속 주입 시간 보다 길 수 있고, 예를 들어 초기 주입 대략 90 분, 및 후속 주입 대략 30 분 (초기 주입이 잘 용인되는 경우) 일 수 있다.
상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 바람직한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 30 mg/kg 의 범위일 것이다. 그러므로, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 의 하나 이상의 투여량이 환자에게 공동-투여될 수 있다. 상기 Bcl-2 억제제의 바람직한 투여량은 20 mg/kg 내지 약 150 mg/kg 의 범위일 것이다. 환자의 유형 (종, 성별, 연령, 체중, 등) 및 상태 및 항-CD20 항체 및 Bcl-2 억제제의 유형에 따라, 상기 항-CD20 항체의 투여량 및 투여 스케줄은 Bcl-2 억제제의 투여량에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 항-CD20 항체는 예를 들어 매 1 내지 3 주에 투여될 수 있고, 상기 Bcl-2 억제제는 매일 또는 매 2 내지 7 일에 투여될 수 있다. 초기 높은 적하 투여량 후, 하나 이상의 적은 투여량을 또한 투여할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 의약은 이러한 CD20 발현 암 환자에서의 전이 또는 추가 파종의 예방 또는 감소에 유용하다. 상기 의약은 이러한 환자의 생존 기간 증가, 이러한 환자의 무진행 생존 증가, 반응 지속 증가에 유용하며, 생존 지속, 무진행 생존, 반응 비율 또는 반응 지속에 의해 측정되는 바와 같이 치료되는 환자의 통계학적으로 유의하고 임상적으로 중요한 개선을 야기하였다. 바람직한 구현예에서, 상기 의약은 환자 그룹에서 반응 비율을 증가시키는데 유용하다.
본 발명의 문맥에서, 부가적인 기타 세포독성제, 화학치료제 또는 항암제, 또는 이러한 작용제의 효과를 향상시키는 화합물 (예를 들어, 사이토카인) 이 CD20 발현 암의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 Bcl-2 억제제 조합 치료에 사용될 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도되는 목적에 유효한 양으로 조합으로 존재한다. 바람직하게는 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 Bcl-2 억제제 조합 치료는 이러한 부가적인 세포독성제, 화학치료제 또는 항암제, 또는 이러한 작용제의 효과를 향상시키는 화합물 없이 사용된다.
이러한 작용제에는 예를 들어: 알킬화제 또는 알킬화 작용을 갖는 작용제, 예컨대 시클로포스파미드 (CTX; 예를 들어, Cytoxan®), 클로람부실 (CHL; 예를 들어, leukeran®), 시스플라틴 (CisP; 예를 들어, platinol®) 부술판 (예를 들어, myleran®), 멜팔란, 카르무스틴 (BCNU), 스트렙토조토신, 트리에틸렌멜라민 (TEM), 미토마이신 C, 등; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트 (MTX), 에토포시드 (VP16; 예를 들어, vepesid®), 6-메르캅토퓨린 (6MP), 6-티오구아닌 (6TG), 시타라빈 (Ara-C), 5-플루오로우라실 (5-FU), 카페시타빈 (예를 들어, Xeloda®), 다카르바진 (DTIC), 등; 항생제, 예컨대 악티노마이신 D, 독소루비신 (DXR; 예를 들어, adriamycin®), 다우노루비신 (다우노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 등; 알칼로이드, 예컨대 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴 (VCR), 빈블라스틴 등; 및 기타 항종양제, 예컨대 파클리탁셀 (예를 들어, taxol®) 및 파클리탁셀 유도체, 세포증식억제제, 글루코코르티코이드, 예컨대 덱사메타손 (DEX; 예를 들어, decadron®) 및 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 뉴클레오시드 효소 억제제, 예컨대 히드록시우레아, 아미노산 고갈 효소, 예컨대 아스파라기나아제, 류코보린 및 기타 엽산 유도체, 및 유사체, 다양한 항종양제가 포함된다. 하기 작용제가 또한 부가적인 작용제로서 사용될 수 있다: 아르니포스틴 (예를 들어, ethyol®), 다크티노마이신, 메클로레타민 (질소 머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 로무스틴 (CCNU), 독소루비신 리포 (예를 들어, doxil®), 겜시타빈 (예를 들어, gemzar®), 다우노루비신 리포 (예를 들어, daunoxome®), 프로카르바진, 미토마이신, 도세탁셀 (예를 들어, taxotere®), 알데스류킨, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, CPT 11 (이리노테칸), 10-히드록시 7-에틸-캄프토테신 (SN38), 플록스우리딘, 플루다라빈, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 인터페론 베타, 인터페론 알파, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가세, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 타목시펜, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 클로람부실. 바람직하게는 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 Bcl-2 억제제 조합 치료는 이러한 부가적인 작용제 없이 사용된다.
화학치료 섭생에서 상기 기재된 세포증식억제제 및 항암제 뿐 아니라 단백질 키나아제 억제제와 같은 항증식 표적-특이적 항암 약물의 사용은 일반적으로 암치료 업계에서 잘 특징화되어 있고, 본원에서 이들의 사용은 내성 및 효과의 모니터링 및 투여 경로 및 투여량의 조절에 대해 일부 조정이 있으면서 동일하게 고려된다. 예를 들어, 세포증식억제제의 실제 투여량은 조직 배양법을 사용하여 측정되는 환자의 배양 세포 반응에 따라 다를 수 있다. 일반적으로, 투여량은 부가적인 기타 작용제의 부재시 사용되는 양에 비해 감소할 것이다.
효과적인 세포증식억제제의 전형적인 투여량은 제조업자가 권고하는 범위 내에 있을 수 있고, 시험관 내 반응 또는 동물 모델에서의 반응에 의해 지시되는 경우 약 1 배수 이하의 농도 또는 양으로 감소될 수 있다. 따라서, 실제 투여량은 주치의의 판단, 환자의 상태, 및 1 차 배양된 악성 세포 또는 조직학적 배양된 조직 샘플의 시험관 내 반응성, 또는 적절한 동물 모델에서 관찰된 반응을 바탕으로 한 치료 방법의 효능에 따라 다를 것이다.
본 발명의 문맥에서, 이온화 방사선의 효과적인 양이 수행될 수 있고/거나, 또는 방사성약제 (radiopharmaceutical) 가 CD20 발현 암의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 Bcl-2 억제제 조합 치료에 더해져서 사용될 수 있다. 방사선원은 치료되는 환자의 외부 또는 내부에 있을 수 있다. 공급원이 환자의 외부에 있는 경우, 상기 치료는 외부 방사선 요법 (EBRT) 으로서 알려져 있다. 방사선 공급원이 환자 내부인 경우, 상기 치료는 근접조사요법 (BT) 으로서 알려져 있다. 본 발명의 문맥에서 사용되는 방사성 원자는 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 요오드-123, 요오드-131, 및 인듐-111 을 포함하나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 방사성 동위원소로 항체를 표지하는 것이 또한 가능하다. 바람직하게는 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 Bcl-2 억제제 조합 치료는 상기 이온화 방사선 없이 사용된다.
방사선 요법은 제거불가능한 또는 수술불가능한 종양 및/또는 종양 전이의 조절을 위한 표준 치료법이다. 방사선 요법을 화학요법과 조합하였을 때, 개선된 결과가 나타났다. 방사선 요법은 고-선량 방사선을 표적 영역에 쬐었을 때, 종양 및 정상 조직 둘 다에서 생식 세포가 사멸할 것이라는 원리를 바탕으로 한다. 방사선량 섭생은 일반적으로 방사선 흡수 선량 (Gy), 시간 및 분별법 (fractionation) 에 관해 정의되고, 종양학자에 의해 주의 깊게 정의되어야 한다. 환자가 받는 방사선 양은 다양한 고려사항에 따라 다를 것이나, 2 가지 가장 중요한 점은 신체의 다른 중요 구조 또는 기관과 관련된 종양의 위치, 및 종양이 퍼펴 있는 범위이다. 방사선 요법을 받는 환자에 대한 전형적인 치료 코스는 1 내지 6 주에 걸친 치료 스케줄로서, 총 선량은 10 내지 80 Gy 이고, 약 1.8 내지 2.0 Gy 의 단일 일일 분획으로 1 주 당 5 일로 환자에 쬐어진다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 인간 환자의 종양이 본 발명 및 방사선의 조합 치료로 치료되는 경우, 상승 효과가 있다. 즉, 본 발명의 조합을 포함하는 작용제를 이용하는 종양 성장의 억제는 방사선, 임의로 추가의 화학요법제 또는 항암제와 조합되었을 때 향상된다. 보조 방사선 요법의 파라미터는 예를 들어, WO　99/60023 호에 기재되어 있다.
유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 공지된 방법에 따라, 일시의 정맥내 투여 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입, 근육내, 복강내, 뇌척수내 (intracerobrospinal), 피하, 관절내, 활액막내 (intrasynovial), 또는 수강내 (intrathecal) 경로에 의해 투여된다. 정맥내 또는 피하 항체 투여가 바람직하다.
Bcl-2 억제제는 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 일시의 정맥내 투여 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액막내, 수강내, 또는 경구 경로에 의해 투여된다. Bcl-2 억제제의 정맥내, 피하 또는 경구 투여가 바람직하다.
본 발명은 CD20 발현 암 환자의 조합 치료를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 Bcl-2 억제제를 포함하는 키트를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 키트 용기는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 멸균 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 바람직하게는 별도의 추가 용기에서 보관된다. 상기 키트에는, CD20 발현 암 질환, 바람직하게는 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL) 에 대한 방법으로서 조합 치료를 사용하는 것에 관한 인쇄된 지시물이 든 포장 삽입물이 추가로 포함될 수 있다.
"포장 삽입물" 이라는 용어는 치료 제품의 시판의 포장 내에 관례상 포함된 지시물을 말하고, 이에는 상기 치료 제품의 사용과 관련한 지시사항, 용법, 투여량, 투여, 사용 중지 사유 및/또는 주의사항에 대한 정보가 포함될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제조 용기 물품은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품은 멸균 희석제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 바람직하게는 별도의 추가 용기 내에 보관된다.
본원에 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용가능한 담체" 라는 용어는 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제, 및 약학적 투여와 상용성인 기타 물질 및 화합물을 비롯하여 약학적 투여와 상용성인 임의의 및 모든 물질을 포함하는 것으로 의도된다. 임의의 통상의 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성이라는 점을 제외한다면, 본 발명의 조성물에서의 이의 용도가 고려된다. 보조 활성 화합물이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다.
약학 조성물:
약학 조성물은 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및/또는 본 발명에 따른 항-Bcl-2 활성제와 약학적으로 허용가능한, 무기 또는 유기 담체를 가공함으로써 수득될 수 있다. 락토오스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 탈크, 스테아르산 또는 이의 염 등이 예를 들어, 정제, 코팅 정제, 당의정 및 경질 젤라틴 캡슐용 상기 담체로서 사용될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐에 적합한 담체는 예를 들어, 식물성유, 왁스, 지방, 반-고체 및 액체 폴리올 등이다. 그러나, 활성 성분의 특성에 따라, 연질 젤라틴 캡슐의 경우에는 보통 담체가 필요하지 않다. 용액 및 시럽 제조에 적합한 담체는 예를 들어, 물, 폴리올, 글리세롤, 식물성유 등이다. 좌제에 적합한 담체는 예를 들어, 천연유 또는 경화유, 왁스, 지방, 반-액체 또는 액체 폴리올 등이다.
더욱이, 약학 조성물은 방부제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 삼투압을 다양하게 하기 위한 염, 완충제, 차폐제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한, 다른 치료학적으로 가치있는 성분을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예는 특히 CD20 발현 암에서 사용하기 위한, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 항-Bcl-2 활성제 모두를 포함하는 약학 조성물이다.
상기 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하기를 포함하는, 특히 암에서 사용하기 위한 약학 조성물을 추가로 제공한다: (i) 제 1 유효량의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체, 및 (ii) 제 2 유효량의 항-Bcl-2 활성제. 이러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 임의로 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 단독의 약학 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태 내에서, 목적하는 순도를 갖는 항체를 임의의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) 와 함께 혼합함으로써, 보관용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성인 것으로, 여기에는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 M-크레졸); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 포함된다.
항-Bcl-2 활성제 단독의 약학 조성물은 그의 약학적 특성에 의존하는데; 예를 들어, ABT-737 및 ABT-263 과 같은 작은 화학 화합물의 경우, 하나의 제형은 예를 들어, 하기일 수 있다:
a) 정제 제형 (습식 과립화 ):
목록 성분 mg/정제
1. 화학식 (I) 의 화합물 5 25 100 500
2. 락토오스 무수 DTG 125 105 30 150
3. Sta-Rx 1500 6 6 6 30
4. 미세결정질 셀룰로오스 30 30 30 150
5. 마그네슘 스테아레이트 1 1 1 1
총 167 167 167 831
제조 과정:
1. 목록 1, 2, 3 및 4 를 혼합하고, 정제수로 과립화시킴.
2. 상기 과립을 50℃ 에서 건조시킴.
3. 상기 과립을 적합한 분쇄 장치에 통과시킴.
4. 목록 5 를 첨가하고, 3 분 동안 혼합시키고; 적합한 압축기 상에서 압축시킴.
b) 캡슐 제형:
목록 성분 mg/캡슐
1. 화학식 (I) 의 화합물 5 25 100 500
2. 수화 락토오스 159 123 148 ---
3. 옥수수 전분 25 35 40 70
4. 탈크 10 15 10 25
5. 마그네슘 스테아레이트 1 2 2 5
총 200 200 300 600
제조 과정:
1. 목록 1, 2 및 3 을 적합한 혼합기 내에서 30 분 동안 혼합함.
2. 목록 4 및 5 를 첨가하고, 3 분 동안 혼합함.
3. 적합한 캡슐에 충전시킴.
본 발명의 하나의 추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 Bcl-2 억제제에 대한 2 개의 별도의 제형이다.
활성 성분은 또한, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐), 또는 마크로에멀젼 내에서, 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 이종 (interracial) 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 에 기재되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반침투성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태로 있다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드 (US　3,773,919 호), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해가능 에틸렌-비닐 아세테이트, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 (leuprolide) 아세테이트로 구성되는 주입가능 마이크로스피어) 과 같은 분해가능 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
본 발명은 (i) 제 1 유효량의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체; 및 (ii) 제 2 유효량의 항-Bcl-2 활성제를 암 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 (i) 제 1 유효량의 유형 Ⅱ 항-CD20 항체; 및 (ii) 제 2 유효량의 항-Bcl-2 활성제를 암 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 추가로 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "환자" 라는 용어는 바람직하게는 임의의 목적을 위해 유형 Ⅱ 항-CD20 항체를 사용하는 치료를 필요로 하는 인간 (예를 들어, CD20 발현 암 환자), 더욱 바람직하게는 암, 또는 전암성 상태 또는 병변을 치료하기 위해 상기 치료를 필요로 하는 인간을 말한다. 그러나, "환자" 라는 용어는 또한, 비-인간 동물, 바람직하게는 그 중에서도 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류와 같은 비-인간 동물을 말할 수 있다.
본 발명은 항-Bcl-2 활성제와 조합으로, CD20 발현 암의 치료를 위해 유형 Ⅱ 항-CD20 항체를 추가로 포함한다.
본 발명은 항-Bcl-2 활성제와 조합으로, CD20 발현 암 환자의 치료를 위해 유형 Ⅱ 항-CD20 항체를 추가로 포함한다.
본 발명은 CD20 발현 암의 치료에 사용하기 위해 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 항-Bcl-2 활성제를 추가로 포함한다.
본 발명은 CD20 발현 암 환자의 치료에 사용하기 위해 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 항-Bcl-2 활성제를 추가로 포함한다.
바람직하게는 상기 항-Bcl-2 활성제는 오블리메르센 (Oblimersen), SPC-2996, RTA-402, 고시폴 (Gossypol), AT-101, 오바토클락스 메실레이트 (Obatoclax mesylate), A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-메톡시안티마이신 (2-Methoxyantimycin) A3, HA-14-1, KF-67544, 푸르푸로갈린 (Purpurogallin), TP-TW-37, YC-137 및 Z-24 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 항-Bcl-2 활성제는 5 μM 이하의 항-Bcl-2 억제 활성의 IC50 을 갖는 Bcl-2 단백질 결합 억제제이다. 이러한 Bcl-2 단백질 결합 억제제는 바람직하게는 고시폴 (Gossypol), AT-101, 오바토클락스 메실레이트 (Obatoclax mesylate), ABT-263 및 ABT-737, 더욱 바람직하게는 ABT-263 또는 ABT-737 로부터 선택된다.
바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 리툭시맙에 비한, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비가 0.3 내지 0.6, 더욱 바람직하게는 0.35 내지 0.55, 더욱 더 바람직하게는 0.4 내지 0.5 이다.
바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 인간화 B-Ly1 항체이다.
바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 증가된 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 을 갖는다.
바람직하게는 CD20 발현 암은 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL) 이다.
바람직하게는 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 단일클론 항체이다.
하기 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 이의 참 범주는 특허 청구의 범위에 언급되어 있다. 본 발명의 취지로부터 벗어나지 않고 언급되는 절차에 대한 변경이 이루어질 수 있다는 것으로 이해된다.
서열 목록
SEQ ID NO : 1 쥣과 단일클론 항-CD20 항체 B-Ly1 의 중쇄 가변 영역 (VH) 의 아미노산 서열.
SEQ ID NO : 2 쥣과 단일클론 항-CD20 항체 B-Ly1 의 경쇄 가변 영역 (VL) 의 아미노산 서열.
SEQ ID NO : 3-19 인간화 B-Ly1 항체의 중쇄 가변 영역 (VH) 의 아미노산 서열 (B-HH2 ~ B-HH9, B-HL8, 및 B-HL10 ~ B-HL17)
SEQ ID NO : 20 인간화 B-Ly1 항체 B-KV1 의 경쇄 가변 영역 (VL) 의 아미노산 서열
도 1 SU-DHL-4 DLBCL B-세포 비호지킨 림프종 (NHL) 에 대한 Bcl-2 억제제 (ABT-737) (IC50 의 Bcl-2 억제 활성: 0.040 μM) 로의, 리툭시맙에 비한, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비가 0.44 인 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 (B-HH6-B-KV1 GE) 의 조합 치료의 항종양 활성. 종양 부피의 평균 값 [㎣] 은 y-축에 작성되고; 종양 세포의 주입 후 날짜는 x-축에 작성되어 있다. 설명: A) 비히클 (원형), B) 주 1 회 인간화 B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) 10 mg/kg (사각형), C) 매주 제 2 일 Bcl-2 억제제 ABT-737 100 mg/kg (삼각형) 및 D) Bcl-2 억제제 ABT-737 (100 mg/kg 매주 제 2 일) 와 주 1 회 공동-투여되는 인간화 B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) 10 mg/kg (엑스표)
도 2 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 유형 Ⅰ 항-CD20 항체 (Cy5-리툭시맙 = 흰색 막대) 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 (Cy5 인간화 B-Ly1 B-HH6-B-KV1 GE = 검은색 막대) 의 평균 형광 강도 (MFI, 좌측 y-축); 리툭시맙에 비한, 유형 Ⅰ 항-CD20 항체 (리툭시맙) 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 (B-HH6-B-KV1 GE) 의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비 (우측 y-축 눈금)
도 3 Z138 인간 비호지킨 림프종 (NHL) 에 대한 2 가지 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 치료의 항종양 활성. 모든 항체는 인간화 B-Ly] 항-CD20 항체이다; 1) B-HH6-B-KV1 당조작 (GE) 및 2) B-HH6-B-KV1 야생형 (wt, 비-당조작). 종양 부피의 평균 값 [㎣] 은 y-축에 작성되고; 종양 세포의 주입 후 날짜는 x-축에 작성되어 있다. 설명: A) 비히클 (원형), B) 주 1 회 인간화 B-Ly1 GE (B-HH6-B-KV1 GE) 30 mg/kg (삼각형) 및 C) 주 1 회 인간화 B-Ly1 wt (B-HH6-B-KV1 wt) 30 mg/kg (엑스표)
실시예 1
Bcl -2 억제제 ( ABT -737) 와 유형 Ⅱ 항- CD20 항체 (B- HH6 -B- KV1 GE ) 의 조합 치료의 항종양 활성
시험 작용제
유형 Ⅱ 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 GE (= 인간화 B-Ly1, 당조작 B-HH6-B-KV1, WO 2005/044859 호 및 WO 2007/031875 호 참조) 는 저장액 (c=9.4 mg/㎖) [GlycArt, Schlieren, Switzerland] 으로서 제공되었다. 항체 완충액에는 히스티딘, 트레할로오스 및 폴리소르베이트 20 이 포함되어 있었다. 항체 용액을, 주입 전 저장액으로부터 PBS 에 적합하게 희석하였다.
Bcl-2 억제제 ABT-737 는 약품 분말로서 제공되고, c=10 mg/㎖ 의, 5% 글루코오스 용액 중 1.5% DMSO, 5% Tween 80, 30% 1,2-프로판디올로 제형화되어 있었다.
세포주 및 배양 조건
SU-DHL-4 인간 비호지킨 림프종 (NHL) 세포 (Chang, H., et al., Leuk. Lymphoma.8 (1992) 129-136) 는 [DSMZ, Braunschweig] 로부터 친절히 제공받았다. 종양 세포주를 37℃, 5 % CO2 의 수-포화 분위기에서 10% 우태 혈청 (PAA Laboratories, Austria) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 배지 (PAA, Laboratories, Austria) 에 정규적으로 배양하였다. 계대 5 를 이식에 사용하였다.
동물
암컷 SCID 베이지 마우스; 도착시 4~5 주령 (Bomholtgard, Ry, Denmark 로부터 구입함) 를 특이적-병원균이 없는 조건하에서 위원회 지침에 따라 (GV-Solas; Felasa; TierschG) 일일 12 h 광주기/12 h 암주기로 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지역 정부에 의해 검토되고 승인되었다. 도착 후 동물을, 관찰을 위해 그리고 새로운 환경에 적응하도록 1 주일 동안 동물 설비의 격리 부분에서 유지하였다. 정기 검진으로 지속적인 건강 모니터링을 수행하였다. 식이 음식 (Provimi Kliba 3337) 및 물 (산성화됨 pH 2.5-3) 은 자유롭게 제공되었다.
모니터링
동물을 매일 임상적 증상 및 부작용 검출을 위해 통제하였다. 모니터링을 위해 실험 내내 동물의 체중을 주 2 회씩 기록하였고 병기화 후 종양 부피를 캘리퍼로 측정하였다.
동물의 치료
동물 치료를 랜덤화 날에, 세포 이식 후 22 일에 시작하였다. 단일 작용제로서 또는 조합으로 인간화 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 GE 를 수여받은 군 및 상응하는 비히클 군을 i.v. q7d 로 연구일 22, 29, 36 및 43 일에 표시 투여량 10 mg/kg 으로 처리하였다. Bcl-2 억제제 ABT-737 을 i.p. 로 매 2 일마다 (제 23 일 ~ 제 33 일, q2d,) 100 mg/kg 로, 그리고 제 41 일까지는 낮은 내성으로 인해 50 mg/kg 의 감소된 투여량으로 제공하였다.
생체 내 종양 성장 억제 연구
비히클 대조군을 수여받은 종양을 갖고 있는 동물을 종양 적재로 인해 치료 개시 후 15 일에 배재하였다. 주당 B-HH6-B-KV1 GE (10 mg/kg) 로 주 1 회 단일 작용제로서 동물을 치료하면 대조군에 비해 14 일 동안 이종이식 성장이 유의하게 억제되었다 (TGI 87%). 그러나, 주당 항체 치료에도 불구하고 SU-DHL-4 이종이식은 계속해서 진행되었다. 반대로 매 2 일마다 100 mg/kg 로 제공되는 bcl-2 억제제로의 단일 작용제 요법으로는 오직 약간만이 활성이었고 종양은 대조군과 유사하게 진행되어 성장하였다. 단일 작용제로서의 모든 화합물의 적당한 활성에도 불구하고, SU-DHL-4 림프종 이종이식은 조합시 완전한 차도를 보이게 되었다. 매 2 일마다 B-HH6-B-KV1 GE (10 mg/kg) 로의 주당 치료 및 Bcl-2 억제제 ABT-737 의 주입은 제 1 주 및 추후 조합 치료 기간 내에 림프종 퇴행을 야기시켰고, 모든 SU-DHL-4 종양은 재성장이 관찰되지 않으면서 완전한 종양 퇴행을 나타내었다.
실시예 2
리툭시맙에 비한, 유형 Ⅱ 항- CD20 항체의 라지 ( Raji ) 세포 ( ATCC - No . CCL -86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비의 측정
라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 를 10% FCS (Gibco, Cat.-No.10500-064) 를 함유하는 RPMI-1640 배지 (PanBiotech GmbH, Cat.-No. PO4-18500) 에서 배양하여 유지하였다. 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 (인간화 B-Ly1 항체) 및 리툭시맙을 제조자의 지침에 따라 Cy5 Mono NHS 에스테르 (Amersham GE Healthcare, Catalogue No. PA15101) 를 사용하여 표지하였다. Cy5-공액 리툭시맙은 항체 당 2.0 분자 Cy5 의 표지 비를 가졌다. Cy5-공액 B-HH6-B-KV1 은 항체 당 2.2 분자 Cy5 의 표지 비를 가졌다. 모든 항체의 결합 수용력 및 방식을 결정하고 비교하기 위해, 결합 곡선 (Cy5-공액 리툭시맙 및 Cy5-공액 B-HH6-B-KV1 의 적정에 의함) 을 버킷 림프종 세포주 라지 (Raji) (ATCC-No. CCL-86) 를 사용하는 직접 면역형광에 의해 작성하였다. 평균 형광 강도 (MFI) 를 Cy5-공액 리툭시맙 및 Cy5-공액 B-HH6-B-KV1, 각각에 대해 EC50 (최대 강도의 50%) 으로서 분석하였다. 샘플 당 5×105 세포 를 4℃ 에서 30 분 동안 염색하였다. 이후, 세포를 배양 배지로 세정하였다. 사멸 세포를 배제하기 위해 요오드화프로피듐 (PI) 염색을 사용하였다. FACSArray (Becton Dickinson) 를 사용하여 측정하고, 요오드화프로피듐 (PI) 을 Far Red A 에서 및 Red-A 에서 Cy5 를 측정하였다. 도 2 는 Cy5-표지 B-HH6-B-KV1 (검은색 막대) 및 Cy5-표지 리툭시맙 (흰색 막대) 의 EC50 (최대 강도의 50%) 에서의 결합에 대한 평균 형광 강도 (MFI) 를 보여준다.
그 후 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비는 하기 식에 따라 계산된다:
라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비 =
Figure pct00010
Figure pct00011
그러므로 전형적인 유형 Ⅱ 항-CD20 항체로서의 B-HH6-B-KV1 은 리툭시맙에 비해, 결합 수용력이 감소함을 보여준다.
실시예 3
Bcl -2 억제제 ( ABT -737) 의 항- Bcl -2 억제 활성의 IC50 값의 측정
Bcl -2 및 Bcl - xL 결합- HTRF 어세이 절차:
화합물 준비 플레이트:
화합물을 100% DMSO 중의 10 mM 저장액으로부터 1.8 mM 로부터 시작하여 연속 희석한다 (3 배, 10 단위).
시약:
Bcl -2 어세이
1) Bcl-2 어세이용 비오티닐화-BAD 펩티드 (Bio-BAD) (BAD = Bcl-2-antagonist of cell death: 세포 사멸의 Bcl-2-길항제; BAD 단백질은 BCL2 및 BAX 와 연관된 세포자멸사 유도제이다):
· 50 mM Tris-HCL 완충액, 소혈청 알부민 (BSA) 0.2 mg/mL, 디티오트레이톨 1 mM 및 9% DMSO 를 함유하는 어세이 완충액 중의 Bio-BAD 펩티드 (73.64 nM) 를 제조한다 .
2) His6-Bcl2:
·50 mM Tris-HCL, 소혈청 알부민 (BSA) 0.2 mg/mL, 디티오트레이톨 1 mM 를 함유하는 어세이 완충액 중의 His6-Bcl2 (180 nM) 를 제조한다.
3) 란스 유로퓸-스트렙타비딘 (Lance Europium-Streptavidin: EU-SA) 및 항-6His APC
·검출 완충액 50 mM Tris-HCL, BSA 0.2 mg/mL, Eu-SA 4.5 nM 및 항-6His APC 67.5 nM 중의 용액을 제조한다.
최종 어세이 농도: Bio-BAD (22.5 nM), His6-Bc-12 (80 nM), EU-SA (1 nM), APC (15 nM)
Bcl-xL
1) Bcl-xL 어세이용 비오티닐화-BAD 펩티드 (Bio-BAD):
·50 mM Tris-HCL, BSA 0.2mg/mL, 디티오트레이톨 1 mM 및 9% DMSO 를 함유하는 어세이 완충액 중의 Bio-BAD 펩티드 (9.82 nM) 를 제조한다.
2) HisBcl-xL:
·50 mM Tris-HCL 완충액, BSA 0.2mg/mL, 디티오트레이톨 1 mM 를 함유하는 어세이 완충액 중의 His6-Bcl-xL (22.5 nM) 를 제조한다.
3) 란스 유로퓸-스트렙타비딘 (EU-SA) 및 항-6His APC
·검출 완충액 50 mM Tris-HCL, BSA 0.2 mg/mL, Eu-SA 3.4 nM 및 항-6His APC 45 nM 중의 용액을 제조한다.
최종 어세이 농도: Bio-BAD (3 nM), His6-Bcl-xL (10 nM), EU-SA (0.75 nM), 항-6His APC (10 nM)
절차:
이동 플레이트: 384 웰 플레이트 이동 플레이트 내에 화합물 준비 플레이트로부터의 화합물 5 ㎕ (또는 약물 대조군이 없는 웰 내의 100% DMSO 5 ㎕) 를 이동시키고 Bio-BAD 용액 55 ㎕ 을 첨가한다. 어세이 플레이트 내로 이동 플레이트로부터 12 ㎕ 를 이동시키고, 시험 웰에는 His6-Bcl2 또는 His6-BclXL, 또는 블랭크용 어세이 완충액 16 ㎕ 을 첨가한다. 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. EU-SA/APC 용액 8㎕/웰을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 340 nm 여기 및 665/615 nm 방출에서, 균일 시분해 형광 (HTRF) 포맷에 적합한 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독한다.
최종 화합물 농도: 50, 16.7, 5.6, 1.85, 0.62, 0.21, 0.07, 0.03, 0.01, 0.004 μM.
혼선 교정: 다중 웰에 어세이 완충액 16 ㎕, Bio-BAD 12 ㎕, 검출 완충액 8 ㎕ 를, EU-SA/APC 를 첨가 및 미첨가하여 첨가한다.
결과: Bcl-2 및 Bcl-xL 억제에 대해 ABT-737 을 시험하였다; 비선형 곡선 맞춤 (XLfit 소프트웨어 (ID Business Solution Ltd., Guilford, Surrey, UK)) 을 사용하여 IC50 값을 계산하였다
ABT-737 의 IC50 (Bcl-2): 0.040 μM
ABT-737 의 IC50 (Bcl-xL): 0.019 μM
실시예 4
SCID 베이지 마우스에서의 Z138 MCL 이종이식에 대한 당조작 ( GE ) 및 비- 당 조작 (야생형, wt ) 항- CD20 항체 (B- HH6 -B- KV1 GE 및 wt ) 의 유사한 항종양 활성
시험 작용제
유형 Ⅱ 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 (당조작 (GE) 및 야생형 (wt)) 은 [GlycArt, Schlieren, Switzerland] 로부터의 저장 용액 (c=9.4 mg/㎖ 및 12.5 mg/㎖) 으로서 제공된다. 항체 완충액에는 히스티딘, 트레할로오스 및 폴리소르베이트 20 이 포함되어 있었다.
모든 용액을, 주입 전 저장액으로부터 PBS 에 적합하게 희석하였다.
세포주 및 배양 조건
Z138 인간 비호지킨 림프종 (NHL) 세포는 [Glycart] 로부터 본래 입수하였다 (덮개 세포 림프종-MCL). 종양 세포주를 37℃, 5 % CO2 의 수-포화 분위기에서 10% 우태 혈청 (PAA Laboratories, Austria) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM 배지 (PAA, Laboratories, Austria) 에 정규적으로 배양하였다. 계대 2 를 이식에 사용하였다.
동물
암컷 SCID 베이지 마우스; 도착시 4~5 주령 (Bomholtgard, Ry, Denmark 로부터 구입함) 를 특이적-병원균이 없는 조건하에서 위원회 지침에 따라 (GV-Solas; Felasa; TierschG) 일일 12 h 광주기/12 h 암주기로 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지역 정부에 의해 검토되고 승인되었다. 도착 후 동물을, 관찰을 위해 그리고 새로운 환경에 적응하도록 1 주일 동안 동물 설비의 격리 부분에서 유지하였다. 정기 검진으로 지속적인 건강 모니터링을 수행하였다. 식이 음식 (Provimi Kliba 3337) 및 물 (산성화됨 pH 2.5-3) 은 자유롭게 제공되었다.
모니터링
동물을 매일 임상적 증상 및 부작용 검출을 위해 통제하였다. 모니터링을 위해 실험 내내 동물의 체중을 주 2 회씩 기록하였고 병기화 시작 시 종양 부피를 캘리퍼로 측정하였다.
동물의 치료
동물 치료를 랜덤화 날에, s.c. 세포 이식 후 14 일에 시작하였다. 인간화 항-CD20 항체 (B-HH6-B-KV1 GE 및 wt) 를 수여받은 군 및 상응하는 비히클 군을 i.v. q7d 로 연구일 14, 20, 27 및 34 일에 표시 투여량 10 mg/kg 으로 처리하였다.
생체 내 종양 성장 억제 연구
비히클 대조군을 수여받은 종양을 갖고 있는 동물을 종양 적재로 인해 치료 개시 후 19 일에 배재하였다. 주당 wt 또는 당조작으로서 B-HH6-B-KV1 (B-HH6-B-KV1 GE 및 wt) (10 mg/kg) 로 동물을 치료하면 치료 시작 직후부터 이종이식 성장이 억제되었다. 대조군 종료시 모든 항체 종양이 퇴행되었고 이후 대부분의 Z138 종양 이종이식이 완전한 차도를 보였다. 상기 이종이식 모델에서 wt 와 당조작 형태의 항-CD20 항체 B-HH6-B-KV1 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이것은 마우스가 그들의 NK 세포 상에서 올바른 Fc 수용체를 발현하지 않을 뿐 아니라, SCID 베이지 마우스는 극심한 삼중 면역결핍으로 인해 NK-매개 ADCC 가 무능한 것으로 생각되므로 예상 밖의 결과였다. 그러므로 SCID 베이지 마우스에서의 s.c. 이종이식 모델은 당조작 변형 항체로 인간 ADCC 매개 효과를 흉내내기에는 적합하지 않다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Combination therapy of a type II anti-CD20 antibody with an anti-Bcl-2 active agent <130> 24555 <150> EP 07020120 <151> 2007-10-15 <160> 20 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of the heavy chain (VH) of murine monoclonal anti-CD20 antibody B-Ly1 <400> 1 Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys 1 5 10 15 Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Leu 20 25 30 Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp 35 40 45 Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 50 55 60 Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr 65 70 75 80 Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly 85 90 95 Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 100 105 110 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of 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Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL8) <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL10) <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL11) <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL12) <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr 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70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of variable region of the heavy chain (VH) of humanized B-Ly1 antibody (B-HL17) <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of variable region of the light chain (VL) of humanized B-Ly1 antibody B-KV1 <400> 20 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val 115

Claims (13)

  1. 항-Bcl-2 활성제와 조합으로의, CD20 발현 암의 치료용 의약의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도.
  2. 항-Bcl-2 활성제와 조합으로의, CD20 발현 암 환자의 치료용 의약의 제조를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 용도.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가, 리툭시맙에 비한, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 라지 (Raji) 세포 (ATCC-No. CCL-86) 상의 CD20 에 대한 결합 수용력의 비가 0.3 내지 0.6 인 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가 인간화 B-Ly1 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가 증가된 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 Fc 영역의 올리고당의 적어도 40% 이상이 비-푸코실화되는 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-Bcl-2 활성제가 오블리메르센 (Oblimersen), SPC-2996, RTA-402, 고시폴 (Gossypol), AT-101, 오바토클락스 메실레이트 (Obatoclax mesylate), A-371191, A-385358, A-438744, ABT-737, AT-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-메톡시안티마이신 (2-Methoxyantimycin) A3, HA-14-1, KF-67544, 푸르푸로갈린 (Purpurogallin), TP-TW-37, YC-137 및 Z-24 로 이루어지는 군, 바람직하게는 ABT-263 및 ABT-737 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-Bcl-2 활성제가 5 μM 이하의 항-Bcl-2 억제 활성의 IC50 을 갖는 Bcl-2 단백질 결합 억제제인 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 Bcl-2 단백질 결합 억제제가 ABT-263 또는 ABT-737 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적인 기타 세포독성제, 화학치료제 또는 항암제, 또는 이러한 작용제의 효과를 향상시키는 화합물 중 하나 이상이 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, CD20 발현 암이 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL) 인 것을 특징으로 하는 용도.
  12. CD20 발현 암 환자의 조합 치료를 위한 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 항-Bcl-2 활성제를 포함하는 키트.
  13. 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는, 특히 CD20 발현 암에서 사용하기 위한 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체 및 상기 항-Bcl-2 활성제 모두를 포함하는 약학 조성물.
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