DE69735888T2

DE69735888T2 - Mittel gegen myelome, welches zusammen mit antitumorwirkstoffen auf der basis von stickstoffsenfgasen verwendet werden kann

Info

Publication number: DE69735888T2
Application number: DE69735888T
Authority: DE
Inventors: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Akito Gotenba-shi NAKAMURA; Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Kenichi Gotenba-shi AKAMATSU
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-06-27
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2017-06-28
Also published as: US7566453B2; EP0923941A2; DE69735888D1; US20040247621A1; JP3471195B2; EP0923941B1; DK0923941T3; US7771723B2; JPH1087510A; ATE326238T1; US20020131967A1; US6692742B1; ES2263178T3; EP0923941A4; AU3276297A; PT923941E; WO1997049428A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung für die kombinierte Verwendung eines Stickstofflost-Antikrebsmittels mit einem Anti-IL-6-Rezeptorantikörper für die Behandlung des Myeloms.
Stand der Technik
Für die Chemotherapie menschlicher Tumoren wurden Alkylierungsmittel, Antimetaboliten, Antitumorantibiotika, Platinverbindungen und ähnliches verwendet. Wenn einzelne Verwendungen dieser aktivierenden Mittel keine deutlichen therapeutischen Wirkungen zeigten, wurden Therapien mit in die Betrachtung einbezogen, worin multiple Arzneimittel in Kombination verwendet wurden (Frei, E. III, Cancer Res. (1992) 32, 2593-2607). Als Antikrebsmittel, die zu den Alkylierungsmitteln gehören, werden Stickstofflost-Antikrebsmittel erwähnt, was eine allgemeine Bezeichnung ist, die für Antikrebsmittel verwendet wird, die eine als Stickstofflost bezeichnete Partialstruktur aufweisen. Von den Stickstofflost-Antikrebsmitteln wurde Melphalan der praktischen Verwendung zugeführt. Eine Melphalantherapie wurde in Kombination mit IFN-α untersucht (Manning et al., Immunology and Cell Biology (1995) 73, 326-332).
IL-6 ist ein multifunktionales Cytokin, das als B-Zell-stimulatorischer Faktor 2 oder Interferon β2 bezeichnet wird. IL-6 wurde als differenzierender Faktor, der für die Aktivierung von B-Lymphozyten verantwortlich ist, entdeckt (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76). Danach erwies es sich als multifunktionales Cytokin, das die Funktion verschiedener Zellen beeinflusst (Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78). IL-6 verleiht seine biologische Aktivität über zwei Proteine auf der Zellmembran.
Eines davon ist ein Liganden-Bindungsprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 80 kD, der IL-6-Rezeptor, an den IL-6 bindet. Der IL-6-Rezeptor tritt nicht nur in membrangebundener Form auf, die die Zellmembran penetriert und darauf exprimiert wird, sondern auch als löslicher IL-6-Rezeptor, bestehend im wesentlichen aus der extrazellulären Region. Das andere ist ein nicht-Liganden-bindendes gp130 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 130 kD, das an der Signalübertragung teilnimmt. IL-6 und IL-6- Rezeptor bilden einen IL-6/IL-6-Rezeptorkomplex, woran ein anderes Membranprotein gp130 gebunden ist und dadurch wird die biologische Aktivität von IL-6 auf die Zelle übertragen (Taga et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967).
Antikörper gegen den IL-6-Rezeptor (Anti-IL-6-Rezeptorantikörper) waren bekannt (Novick D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146 Huang, Y.W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630, internationale Patentveröffentlichung WO95/09873, französische Patentanmeldung FR 2694767, US-Patent 5216128); einer von diesen ist PM-1, der von Mäusen abstammt (Hirata et al., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906). Es wurde gezeigt, dass Anti-menschlicher-IL-6-Rezeptorantikörper das menschliche Myelomwachstum in vivo inhibiert (Suzuki et al.: European Journal of Immunology, (1992), Band 22, Nr. 8, Seiten 1989-93).
Weiterhin war auch ein umgeformter Antikörper bekannt, erhältlich durch Ersatz der Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) des Maus-Antikörpers durch die CDRs des menschlichen Antikörpers (SATO et al.: Cancer Research, (1993), Band 53, Nr. 4, Seiten 851-6).
Die kombinierte Verwendung eines Stickstofflost-Antikrebsmittels und des IL-6-Rezeptors als Therapeutikum zur Behandlung von Myelom war jedoch nicht bekannt.
Offenbarung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Art eines Myelom-Therapeutikums bereitzustellen, das effektiver ist als die konventionell bekannten Myelom-Therapeutika.
Als Ergebnis intensiver Studien, um die obigen Probleme zu lösen, haben die Anmelder festgestellt, dass die Kombination des Stickstofflost-Antikrebsmittels, Melphalan, einem konventionell bekannten Antikrebsmittel und einem Anti-IL-6-Rezeptorantikörper eine synergistische Wirkung hat, d.h. effektiver ist als die einfache Verwendung von Melphalan oder die einfache Verwendung von Anti-IL-6-Rezeptorantikörper für die Behandlung von Myelom und haben die vorliegende Erfindung vervollständigt.
So stellt die vorliegende Erfindung ein Therapeutikum für die Behandlung von Myelom bereit, umfassend Anti-IL-6-Rezeptorantikörper in Kombination mit Melphalan.
Der Antikörper kann die Bindung von IL-6 an den IL-6-Rezeptor blockieren und daher die Signalübertragung von IL-6 inhibieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Therapeutikum für die Behandlung von Myelom bereit, umfassend Anti-IL-6-Rezeptor-monoklonalen Antikörper in Kombination mit Melphalan.
Der Antikörper kann von dem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2998 erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Therapeutikum zur Behandlung von Myelom bereit, umfassend einen umgeformten Antikörper in Kombination mit Melphalan.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Therapeutikum für die Behandlung von Myelom bereit, umfassend einen umgeformten menschlichen PM-1-Antikörper, erhältlich von dem Hybridom FERM BP-2998 in Kombination mit Melphalan.
Weitere Aspekte der Erfindung werden in den begleitenden Ansprüchen angegeben.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 ist eine Grafik, die die Beziehung der Konzentration des Antimenschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers und der Konzentration von Melphalan zu dem Wachstum (Einbau von ³H-markierten Thymidin) einer menschlichen Myelomzelllinie in Gegenwart von 0,1 ng/ml IL-6 darstellt.
2 ist eine Grafik, die die Beziehung der Konzentration von Antimenschlichem-IL-6-Rezeptorantikörper und der Konzentration von Melphalan zu dem Wachstum (Einbau von ³H-markiertem Thymidin) einer menschlichen Myelomzelllinie in Gegenwart von 1 ng/ml IL-6 darstellt.
3 ist eine Grafik, die die Beziehung der Konzentration von Antimenschlichem-IL-6-Rezeptorantikörper und der Konzentration von Adriamycin zu dem Wachstum (Einbau von ³H-markiertem Thymidin) einer menschlichen Myelomzelllinie in Gegenwart von 0,1 ng/ml IL-6 darstellt.
4 ist eine Grafik, die die Beziehung der Konzentration von Antimenschlichem-IL-6-Rezeptorantikörper und der Konzentration von Adriamycin zu dem Wachstum (Einbau von ³H-markiertem Thymidin) einer menschlichen Myelomzelllinie in Gegenwart von 1 ng/ml IL-6 darstellt.
5 ist eine Grafik, die die Beziehung der Konzentration von Antimenschlichem-IL-6-Rezeptorantikörper und der Konzentration von Vincristin zu dem Wachstum (Einbau von ³H-markiertem Thymidin) einer menschlichen Myelomzelllinie in Gegenwart von 0,1 ng/ml IL-6 darstellt.
6 ist eine Grafik, die die Beziehung der Konzentration von Antimenschlichem-IL-6-Rezeptorantikörper und der Konzentration von Vincristin zu dem Wachstum (Einbau von ³H-markiertem Thymidin) einer menschlichen Myelomzelllinie in Gegenwart von 1 ng/ml IL-6 darstellt.
7 ist eine Grafik, die die Überlebenstage von Mäusen darstellt, denen menschliche Myelomzellen implantiert wurden, mit einer Einzel-Arznei mittelverabreichung (1 mg/kg) eines Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers (hPM-1) und Melphalan oder kombinierter Verwendung davon.
8 ist eine Grafik, die die Menge an M-Protein in den Mäusen darstellt, denen menschliche Myelomzellen implantiert wurden, bei einer Einzel-Arzneimittelverabreichung (1 mg/kg) des Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers (hPM-1) und Melphalan oder einer kombinierten Verwendung davon.
9 ist eine Grafik, die die Überlebenstage von Mäusen darstellt, denen menschliche Myelomzellen implantiert wurden, mit einer Einzel-Arzneimittelverabreichung (3 mg/kg) eines anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers (hPM-1) und Melphalan oder kombinierter Verwendung davon mit einer synergistischen Wirkung, die durch die kombinierte Verwendung erhalten wird.
10 ist eine Grafik, die die Veränderungen des Körpergewichts von Mäusen darstellt, denen menschliche Myelomzellen implantiert wurden, bei einer Einzel-Arzneimittelverabreichung von anti-menschlichem-IL-6-Rezeptorantikörper (hPM-1) und Melphalan oder einer kombinierten Verwendung davon.
11 ist eine Grafik, die die Menge an M-Protein im Serum von Mäusen darstellt, implantiert mit menschlichen Myelomzellen, 30 Tage nach der Tumorimplantation, in der anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörper (hPM1) Einzel-Arzneimittelverabreichungsgruppe und der Melphalan-Einzel-Arzneimittelverabreichungsgruppe.
12 ist eine Grafik, die die Menge an M-Protein im Serum von Mäusen darstellt, implantiert mit menschlichen Myelomzellen, 35 Tage nach der Tumorimplantation, in der anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörper (hPM1) kombinierten Arzneimittelverabreichungsgruppe und der Melphalan-Einzel-Arzneimittelverabreichungsgruppe.
13 ist eine Grafik, die die Menge an M-Protein im Serum von Mäusen darstellt, implantiert mit menschlichen Myelomzellen, 42 Tage nach der Tumorimplantation, in der anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörper (hPM1) kombinierten Arzneimittelverabreichungsgruppe und der Melphalan-Einzel-Arzneimittelverabreichungsgruppe.
14 ist eine Grafik, die eine Überlebenszeitspanne durch eine Überlebenskurve von Mäusen darstellt, denen menschliche Myelomzellen implantiert wurden, bei der Melphalan-Einzel-Arzneimittelverabreichungsgrupe und bei der anti-menschlichen-IL-6-Rezeptorantikörper (hPM1)-kombinierten Verabreichungsgruppe, was eine verstärkte Wirkung durch die kombinierte Verwendung anzeigt.
15 ist eine Grafik, die die Veränderungen des Körpergewichts bei Mäusen darstellt, denen menschliche Myelomzellen implantiert wurden, in der anti-menschlichen IL-6-Rezeptor-Antikörper-Einzelverabreichungsgruppe.
16 ist eine Grafik, die die Veränderungen des Körpergewichts bei Mäusen darstellt, denen menschliche Myelomzellen implantiert wurden, in der Melphalan-Einzel-Arzneimittelverabreichungsgruppe und der anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörper (hPM1)-kombinierten Verabreichungsgruppe.
Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Stickstofflost-Antikrebsmittel, das verwendet wird, Melphalan, das auch als Sarcolysin oder L-Phenylalaninlost bezeichnet wird und die folgende Struktur aufweist:
Melphalan-(p-[Bis(2-chlorethyl)amino-L-phenylalanin) kann allein oder in Kombination mit einem anderen Stickstofflost-Antikrebsmittel verwendet werden.
"Stickstofflost-Antikrebsmittel" ist eine allgemeine Bezeichnung für die Antikrebsmittel, die eine Partialstruktur aufweisen, die Stickstofflost genannt wird und Beispiele beinhalten:
Mechlorethamin, Stickstofflost N-Oxid (Methyl-bis(β-chlorethyl)amin-N-oxid-hydrochlorid), Chlorambucil (p-Bis(2-chlorethyl)amino-phenylbuttersäure), Uramustin (5-Bis(2-chlorethyl)aminouracil), Ifosmid (N,N'-Bis(2-chlorethyl)-N', O-Propylenphosphorsäureesterdiamid, Cyclophosphamid (N,N'-Nis(β-chlorethyl)-N', O-Propylenphosphorsäureesterdiamid und ähnliche.
Mechlorethamin kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, z.B. das in Abrams et al., J. Soc. Chem. Ind. (London) (1949) 68, 280 beschriebene Verfahren.
Stickstofflost-N-oxid kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, z.B. durch das bei Aiko et al., J. Pharm. Soc. Japan (1952) 72, 1297 beschriebene Verfahren.
Melphalan kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, z.B. durch das bei Bergel, F. et al., J. Chem. Soc. (1954) 2409 beschriebene Verfahren.
Chlorambucil kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, z.B. durch das bei Balazc, M.K. et al., J. Pharm. Sci. (1970) 59, 563 beschriebene Verfahren.
Uramustin kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, z.B. durch das bei Lyttle und Petering, J. Am. Chem. Soc. (1958) 80, 6459 beschriebene Verfahren.
Ifosfamid kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, z.B. durch das bei Arnold H. et al., U.S.pat. (1973 von Asta) 3, 732, 340 oder Brassfield, HJ.A. et al., J. Am. Chem. Soc. (1975) 97, 4143 beschriebene Verfahren.
Cyclophosphamid kann durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, z.B. durch das bei Arnold H. et al., Angew. Chem. (1958) 70, 539 beschriebene Verfahren.
1. Anti-IL-6-Rezeptorantikörper
Anti-IL-6-Rezeptorantikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können von jedem Ursprung, jeder Art (monoklonal oder polyklonal) und jeder Form sein, solange sie eine höhere therapeutische Wirkung für Myelom aufweisen, wenn sie in Kombination mit Melphalan verabreicht werden, als wenn ein Anti-IL-6-Rezeptorantikörper allein oder ein Stickstofflost-Antikrebsmittel allein verabreicht wird.
Anti-IL-6-Rezeptorantikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können als polyklonale oder monoklonale Antikörper unter Verwendung eines bekannten Verfahrens erhalten werden. Als Anti-IL-6-Rezeptorantikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden monoklonale Antikörper von insbesondere Säugerursprung bevorzugt. Monoklonale Antikörper von Säugerursprung beinhalten diejenigen, die von einem Hybridom erzeugt werden und rekombinante Antikörper, erzeugt von einem Wirt, der mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, enthaltend genetisch manipulierte Antikörpergene. Anti-IL-6-Rezeptorantikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, blockieren über Bindung an den IL-6-Rezeptor, die Bindung von IL-6 an den IL-6-Rezeptor und inhibieren so die Signalübertragung von IL-6 und sind daher Antikörper, die die biologische Aktivität von IL-6 inhibieren.
Beispiele für solche Antikörper beinhalten den PM-1-Antikörper (Hirata, et al., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906) oder den AUK12-20-Antikörper, AUK64-7-Antikörper oder AUK146-15-Antikörper (internationale Patentanmeldung WO92/19759) und ähnliche. Unter diesen wird der PM-1-Antikörper besonders bevorzugt.
Nebenbei gesagt wurde die Hybridomzelllinie, die den PM-1-Antikörper erzeugt, international gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages als PM-1 am 10. Juli 1990 beim National Institute of Bioscience and Human Tech nology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, als FERM BP-2998 hinterlegt.
2. Durch das Hybridom erzeugte Antikörper
Monoklonale Antikörper können durch Konstruktion eines Hybridoms unter Verwendung grundlegender bekannter Verfahren, wie unten beschrieben, erhalten werden. So wird der IL-6-Rezeptor als immunisierendes Antigen verwendet und wird durch ein konventionelles Verfahren einer Immunisierung immunisiert. Die so erhaltenen immunen Zellen werden mit bekannten Elternzellen durch konventionelle Zellfusionsverfahren fusioniert und dann durch konventionelle Screeningverfahren für ein Screening auf monoklonale Antikörper erzeugende Zellen gescreent.
Spezifisch können monoklonale Antikörper auf die folgende Weise erhalten werden.
Zum Beispiel ist der als immunisierendes Antigen zum Erhalt eines Antikörpers verwendete IL-6-Rezeptor nicht auf irgendeine Tierart begrenzt, jedoch wird insbesondere ein IL-6-Rezeptor, der vom Menschen abstammt, bevorzugt. Für den menschlichen IL-6-Rezeptor kann ein IL-6-Rezeptorprotein unter Verwendung einer Gensequenz erhalten werden, die in der europäischen Patentanmeldung EP 325474 offenbart wird. Es gibt zwei Arten von IL-6-Rezeptor: einen IL-6-Rezeptor, der auf der Zellmembran exprimiert wird und einen IL-6-Rezeptor, der von der Zellmembran losgelöst ist (löslicher IL-6-Rezeptor; Yasukawa et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676).
Der lösliche IL-6-Rezeptor besteht im wesentlichen aus dem extrazellulären Bereich des IL-6-Rezeptors, der an die Zellmembran gebunden ist und der lösliche IL-6-Rezeptor unterscheidet sich von dem membrangebundenen IL-6-Rezeptor darin, dass dem Ersteren der Transmembranbereich oder sowohl der Transmembranbereich als auch der intrazelluläre Bereich fehlt. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der als immunisierendes Antigen verwendete IL-6-Rezeptor entweder der membrangebundene oder der lösliche IL-6-Rezeptor sein. Alternativ kann es sich um eine Mutante davon handeln.
Nachdem ein Gen, das den IL-6-Rezeptor kodiert, in einen wohlbekannten Expressionsvektor inseriert wurde, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, wird das gewünschte IL-6-Rezeptorprotein aus der Wirtszelle oder einem Kulturüberstand davon gereinigt, wobei bekannte Verfahren verwendet werden und das so gereinigte IL-6-Rezeptorprotein kann als Immunisierungsantigen verwendet werden. Alternativ können Zellen, die das IL-6-Rezeptorprotein exprimieren, als Immunisierungsantigen verwendet werden.
Vorzugsweise werden die Säuger, die mit dem Immunisierungsantigen immunisiert werden wollen, unter Einbezug ihrer Kompatibilität mit den Elternzellen zur Verwendung bei der Zellfusion gewählt und sie beinhalten im allgemeinen Nager, Logomorpha und Primaten, sind jedoch nicht auf diese begrenzt.
Als Nager werden z.B. Mäuse, Ratten, Hamster usw. verwendet. Als Logomorpha werden z.B. Kaninchen verwendet. Als Primaten werden z.B. Affen verwendet. Als Affen werden z.B. Catarrhine (Affen der alten Welt), wie z.B. Cynomolgus-Affen (Krabben essende Makaken), Rhesusaffen, heilige Paviane, Schimpansen usw. verwendet.
Die Immunisierung von Tieren mit einem immunisierenden Antigen wird unter Verwendung eines bekannten Verfahrens durchgeführt. Ein allgemeines Verfahren involviert z.B. eine intraperitoneale oder subkutane Verabreichung eines immunisierenden Antigens an den Säuger. Spezifisch wird ein immunisierendes Antigen, das in einer geeigneten Menge einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) oder physiologischer Salzlösung verdünnt und suspendiert wurde, mit einer geeigneten Menge von Freunds komplettem Adjuvans vermischt. Nach einer Emulgation wird dies vorzugsweise einem Säuger etliche Male alle 4 bis 21 Tage verabreicht. Zusätzlich kann ein geeigneter Träger zum Zeitpunkt der Immunisierung mit dem immunisierenden Antigen verwendet werden.
Nach der Immunisierung und der Bestätigung des Anstiegs der Niveaus des gewünschten Antikörpers im Serum durch ein konventionelles Verfahren werden Immunzellen aus dem Säuger entnommen und einer Zellfusion unterzogen, wobei besonders bevorzugte Immunzellen die Milzzellen sind.
Die Säuger-Myelomzellen als andere Elternzellen, die der Zellfusion, unter Verwendung der oben erwähnten Immunzellen unterzogen werden, beinhalten vorzugsweise verschiedene bekannte Zelllinien, wie z.B. P3 (P3x63Ag8.653) (Kearney, J.F. et al., J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.U1 (Yelton, D.E. et al., Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Köhler, G. und Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S.F, und Scheidegger, D., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), 5194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 217, 131-133) und ähnliche.
Die Zellfusion zwischen den obigen Immunzellen und den Myelomzellen kann im wesentlichen gemäß bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie z.B. dem bei Milstein et al. (Galfre, G. und Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) beschriebenen.
Genauer gesagt wird die obige Zellfusion in einem konventionellen Nährmedium in Gegenwart von z.B. einem Zellfusionsbeschleuniger durchgeführt. Als Zellfusionsbeschleuniger können z.B. Polyethylenglykol (PEG), Sendai-Virus (HVJ) und ähnliche verwendet werden, und ein Adjuvans, wie Dimethylsulfoxid, kann hinzugefügt werden je nach Wunsch, um die Effizienz der Fusion zu erhöhen.
Das bevorzugte Verhältnis von Immunzellen und Myelomzellen zur Verwendung liegt z.B. bei 1- bis 10mal mehr Immunzellen als Myelomzellen. Beispiele für Kulturmedien, die für die obige Zellfusion verwendet werden können, beinhalten RPMI 1640-Medium und MEM-Kulturmedium, die für das Wachstum der obigen Myelomzelllinien geeignet sind und konventionelle Kulturmedien, die für diese Art einer Zellkultur verwendet werden und daneben kann ein Serumzusatz, wie z.B. fötales Kälberserum (FCS) zugefügt werden.
Bei der Zellfusion werden bestimmte Mengen der obigen Immunzellen und der Myelomzellen in der obigen Kulturflüssigkeit gut vermischt, wozu eine vorher auf ungefähr 37°C erwärmte PEG-Lösung, z.B. eine PEG-Lösung mit einem mittleren Molekulargewicht von 1.000 bis 6.000, mit einer Konzentration von 30 bis 60% (G/V) zugefügt wurde und vermischt wird, um die gewünschten Fusionszellen (Hybridome) zu erhalten. Es können dann durch Wiederholung der sequenziellen Zugabe einer geeigneten Kulturflüssigkeit und Zentrifugation zum Entfernen des Überstands Zellfusionsmittel, die für das Wachstum des Hybridoms unerwünscht sind, entfernt werden.
Das Hybridom wird durch Kultivierung in konventionellem Selektionsmedium selektiert, z.B. HAT-Kulturmedium (eine Kulturflüssigkeit, die Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält). Die Kultivierung in dem HAT-Kulturmedium wird allgemein für eine ausreichende Zeitspanne fortgesetzt, um ein Abtöten von anderen Zellen als dem gewünschten Hybridom (Nicht-Fusionszellen) zu bewirken, allgemein etliche Tage bis etliche Wochen. Das konventionelle limitierende Verdünnungsverfahren wird durchgeführt, worin die Hybridome, die den gewünschten Antikörper erzeugen, einem Screening unterworfen und monoklonal kloniert werden.
Zusätzlich zum Erhalt des obigen Hybridoms durch Immunisieren eines anderen Tieres als den Menschen mit einem Antigen ist es auch möglich, menschliche Lymphozyten in vitro mit dem IL-6-Rezeptorprotein oder den IL-6-Rezeptorprotein-exprimierenden Zellen zu immunisieren und die resultierenden immunisierten Lymphozyten werden mit einer Myelomzelle, z.B. U266, die die Fähigkeit zur permanenten Teilung aufweist, fusioniert, um ein Hybridom zu erhalten, das den gewünschten menschlichen Antikörper mit einer Aktivität zur Bindung an den IL-6-Rezeptor und Neutralisieren desselben aufweist (japanische geprüfte Patentveröffentlichung (Kokoku) 1-59878). Weiterhin wird ein transgenes Tier mit einem Repertoire an menschlichen Antikörpergenen mit dem Antigen-IL-6-Rezeptor oder den IL-6-Rezeptor-exprimierenden Zellen immunisiert, um die Anti-IL-6-Rezeptorantikörper erzeugenden Zellen zu erhalten. Die Zellen werden dann mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridome zu erhalten, die verwendet werden, um menschlichen Antikörper gegen IL-6-Rezeptor zu erhalten (siehe internationale Patentanmeldungen WO92/03918, WO93/12227, WO94/02602, WO94/25585, WO96/33735 und WO96/34096).
Die so konstruierten monoklonalen Antikörper erzeugenden Hybridome können in der konventionellen Kulturflüssigkeit gehalten werden oder können für eine längere Zeitspanne in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
Um monoklonale Antikörper von diesen Hybridomen zu erhalten, kann ein Verfahren erwähnt werden, worin das Hybridom in dem konventionellen Verfahren kultiviert und die Antikörper als Überstand erhalten werden oder ein Verfahren, worin das Hybridom auf einen Säuger transplantiert und in diesem gezüchtet wird, der mit dem Hybridom kompatibel ist und die Antikörper als Aszites erhalten werden. Das erstere Verfahren ist zum Erhalt hochgereinigter Antikörper geeignet, während das letztere für eine Erzeugung von Antikörpern in großem Umfang geeignet ist.
Zusätzlich zu einer Verwendung eines Hybridoms für eine Antikörperproduktion können Immunzellen, wie z.B. Antikörper erzeugende immunisierte Lymphozyten, die mit einem Onkogen unsterblich gemacht wurden, verwendet werden.
3. Rekombinanter Antikörper
Monoklonale Antikörper können auch als rekombinante Antikörper erhalten werden, die durch die rekombinante Gentechnologie erzeugt wurden. Zum Beispiel können rekombinante Antikörper durch Klonieren eines Gens eines Antikörpers von einem Hybridom oder einer Immunzelle, wie z.B. Antikörper erzeugender immunisierter Lymphozyten, erhalten werden und dann in einen geeigneten Vektor integriert werden, der dann in einen Wirt eingeführt wird, um diesen Antikörper zu erzeugen (siehe z.B. Borrebaeck, C.A.K. und Larrick, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, veröffentlicht in Großbritannien von MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).
Spezifisch wird mRNA, kodierend den variablen Bereich (V-Bereich) des Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers aus dem Hybridom isoliert, das den Anti-IL-6- Rezeptorantikörper erzeugt. Die Isolation der mRNA wird durch Herstellung von Gesamt-RNA durchgeführt, wobei z.B. ein bekanntes Verfahren, wie z.B. das Guanidin-Ultrazentrifugenverfahren verwendet wird (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), das AGPC-Verfahren (Chomczynski, P. und Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) und dann wird mRNA aus der Gesamt-RNA unter Verwendung des mRNA-Purification Kits (Pharmacia) und ähnlichem gereinigt. Alternativ kann die mRNA direkt unter Verwendung des Quick Prep mRNA Purification Kits (Pharmacia) hergestellt werden.
cDNA des V-Bereichs des Antikörpers kann aus der so erhaltenen mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase synthetisiert werden. Die cDNA kann unter Verwendung des AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kits (Seikagaku Kogyo) und ähnlichen synthetisiert werden. Alternativ kann zur Synthese und Amplifikation von cDNA das 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) und das 5'-RACE-Verfahren (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), das eine Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, verwendet werden.
Das gewünschte DNA-Fragment wird aus dem erhaltenen PCR-Produkt gereinigt und kann in eine Vektor-DNA ligiert werden. Weiterhin wird daraus ein rekombinanter Vektor konstruiert und dann in E. coli usw. transfiziert, der gewählt wird, um den gewünschten rekombinanten Vektor herzustellen. Die Basensequenz des gewünschten rekombinanten Vektors kann durch ein bekanntes Verfahren, wie z.B. das Dideoxynukleotid-Kettenterminationsverfahren, bestätigt werden.
Sobald die DNA, die den V-Bereich des gewünschten Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers kodiert, erhalten wurde, kann sie mit einer DNA ligiert werden, die den konstanten Bereich (C-Bereich) des gewünschten Antikörpers kodiert, was dann in einen Expressionsvektor integriert wird. Alternativ kann die DNA, die den V-Bereich des Antikörpers kodiert, in einen Expressionsvektor integriert werden, der bereits DNA enthält, die den C-Bereich des Antikörpers kodiert. Der C-Bereich des Antikörpers kann von derselben Tierart abstammen wie der V-Bereich oder von einer anderen Tierart als der des V-Bereichs.
Um den Anti-IL-6-Rezeptorantikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, wird das Antikörpergen in einen Expressionsvektor integriert, um unter der Kontrolle einer expressionsregulatorischen Region exprimiert zu werden, z.B. eines Enhancers und/oder Promotors. Darauf folgend wird der Expressionsvektor in eine Wirtszelle transformiert und der Antikörper wird dann darin exprimiert.
Das Antikörpergen kann durch separate Integration von DNA, kodierend eine schwere Kette (H-Kette) und eine leichte Kette (L-Kette) des Antikörpers in einen Expressionsvektor und Cotransformation der Wirtszelle oder durch Integration von DNA, kodierend eine H-Kette und eine L-Kette in einen einzelnen Expressionsvektor und Transformation der Wirtszelle exprimiert werden (internationale Patentanmeldung WO94/11523).
4. Veränderter Antikörper
Als rekombinante Antikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können künstlich veränderte rekombinante Antikörper, wie z.B. chimäre Antikörper und humanisierte Antikörper zum Zweck der Erniedrigung der xenogenen Antigenizität gegen den Menschen verwendet werden. Veränderte Antikörper können die C-Bereiche von menschlichem Antikörper aufweisen und Antikörper, wie chimäre oder humanisierte Antikörper können verwendet werden. Diese veränderten Antikörper können unter Verwendung bekannter Verfahren erzeugt werden.
Chimäre Antikörper können durch Ligation der so erhaltenen DNA, kodierend den V-Bereich eines Antikörpers, wobei es sich nicht um einen menschlichen Antikörper handelt, an DNA, kodierend den C-Bereich eines menschlichen Antikörpers, erhalten werden, was dann in einen Expressionsvektor integriert und in einen Wirt eingeführt wird, um einen Antikörper darin zu erzeugen (siehe europäische Patentanmeldung EP 125023 und die internationale Patentanmeldung WO92/19759). Unter Verwendung dieses bekannten Verfahrens kann ein chimärer Antikörper, der für die vorliegende Erfindung geeignet ist, erhalten werden.
Ein Plasmid, kodierend den V-Bereich der L-Kette oder den V-Bereich der H-Kette des PM-1-Antikörpers, wurde jeweils als pPM-k3 bzw. pPM-h1 bezeichnet und E. coli mit dem jeweiligen Plasmid wurde international gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags als NCIMB40366 und NCIMB40362 am 11. Februar 1991 bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited hinterlegt.
Ein humanisierter Antikörper, der auch umgeformter menschlicher Antikörper genannt wird, wurde durch Transplantation der die Komplementarität bestimmenden Bereiche (CDRs) eines Antikörpers eines Säugers, wobei es sich nicht um einen Menschen handelte, z.B. einem Maus-Antikörper, in die CDRs des menschlichen Antikörpers, hergestellt. Die allgemeine rekombinante DNA-Technologie zur Herstellung solcher Antikörper ist ebenfalls bekannt (siehe europäische Patentanmeldung EP 125023 und die internationale Patentanmeldung WO92/19759).
Spezifisch wird eine DNA-Sequenz, die entworfen wurde, um die CDRs vom Mäuse-Antikörper mit den Grundgerüstregionen (FRs) von menschlichem Antikörper zu ligieren aus etlichen getrennten Oligonukleotiden mit überlappenden Sektionen an den Enden synthetisiert und die Oligonukleotide werden dann in eine integrierte DNA synthetisiert. Die so erhaltene DNA wird mit einer DNA ligiert, kodierend einen C-Bereich von menschlichem Antikörper und dann in einen Expressionsvektor integriert, der in einen Wirt zur Antikörperproduktion eingeführt wird (siehe europäische Patentanmeldung EP 239400 und internationale Patentanmeldung WO92/19759).
Für die FRs von menschlichem Antikörper, die mit den CDRs ligiert werden, werden FRs selektiert, die für CDRs eine günstige Antigen-Bindungsstelle bieten. Wenn gewünscht, können Aminosäuren in den FRs von dem Antikörper-V-Bereich so substituiert werden, dass der CDR des humanisierten Antikörpers eine geeignete Antigen-Bindungsstelle bilden kann (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
Eine bevorzugte Ausführungsform des humanisierten Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhaltet humanisierten PM-1-Antikörper (siehe internationale Patentanmeldung WO92/19759). Bei dem humanisierten PM-1-Antikörper wurden CDRs des PM-1-Antikörpers, abstammend von einer Maus, mit den FRs des menschlichen Antikörpers REI für die L-Kette ligiert und den FRs des menschlichen Antikörpers NEW und ein Teil der Aminosäurereste der FRs wurde substituiert, um eine Antigen-Bindungsaktivität zu erhalten.
Um einen Anti-IL-6-Rezeptorantikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, wird das Antikörpergen in einen Expressionsvektor integriert, um unter der Kontrolle eine Expressions-regulatorischen Region exprimiert zu werden, z.B. einem Enhancer und/oder einem Promotor. Darauffolgend wird der Expressionsvektor in eine Wirtszelle transformiert und der Antikörper dann darin exprimiert.
Das Antikörpergen kann durch separate Integration von DNAs exprimiert werden, kodierend eine schwere Kette (H-Kette) und eine leichte Kette (L-Kette) eines Antikörpers in einen Expressionsvektor und Cotransformation der Wirtszelle oder durch Integration einer DNA, kodierend eine H-Kette und eine L Kette in einen einzelnen Expressionsvektor und Transformation der Wirtszelle (internationale Patentveröffentlichung WO94/11523).
Ein chimärer Antikörper besteht aus den V-Bereichen eines Antikörpers, abstammend von einem anderen Säuger als einem Menschen und den C-Bereichen, abstammend von menschlichem Antikörper, wobei der humanisierte Antikörper aus den CDRs von Antikörpern besteht, abstammend von einem anderen Säuger als dem Menschen und den FRs und C-Bereichen eines Antikörpers, abstammend von einem menschlichen Antikörper. Dementsprechend ist die Antigenizität im menschlichen Körper reduziert, da die Aminosäuresequenzen, die von einem anderen Säuger als dem Menschen abstammen, in dem obigen Antikörper auf ein Minimum reduziert sind, so dass diese als aktiver Bestandteil von Therapeutika gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
Als C-Bereich des menschlichen Antikörpers kann z.B. Cγ1, Cγ2, Cγ3 oder Cγ4 verwendet werden. Der C-Bereich des menschlichen Antikörpers kann auch modifiziert werden, um die Stabilität des Antikörpers oder seine Produktion zu verbessern.
5. Antikörperfragmente und modifizierte Antikörper
Antikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können Fragmente eines Antikörpers sein oder modifizierte Versionen davon, solange sie an den IL-6-Rezeptor binden und dadurch die Bindung von IL-6 an den IL-6-Rezeptor inhibieren, um die Signalübertragung zu blockieren und die biologische Aktivität von IL-6 zu inhibieren. Sie sind Antikörperfragmente oder modifizierte Antikörper, die, wenn sie in Kombination mit einem Stickstofflost-Antikrebsmittel verwendet werden, eine höhere therapeutische Wirkung gegen Myelom aufweisen als der IL-6-Rezeptor-Antikörper allein oder ein Stickstofflost-Antikrebsmittel allein.
Beispielsweise können als Fragmente von Antikörpern Fab, F(ab')2, Fv oder Einzelketten-Fv (scFv) erwähnt werden, worin die Fvs der H-Kette und L-Kette über einen geeigneten Linker ligiert wurden. Spezifisch werden Antikörper mit einem Enzym, z.B. Papain oder Pepsin behandelt, um Antikörperfragmente zu erzeugen oder Gene, kodierend diese Antikörperfragmente werden konstruiert und dann in einen Expressionsvektor integriert, der in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird (siehe z.B. Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. und Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Plucktrun, A. und Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R.E. und Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).
scFv kann durch Ligation eines V-Bereichs einer H-Kette und eines V-Bereichs einer L-Kette eines Antikörpers erhalten werden. Bei scFv werden der V-Bereich der H-Kette und der V-Bereich der L-Kette vorzugsweise über einen Linker ligiert, vorzugsweise einen Peptidlinker (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). Der V-Bereich der H-Kette und der V-Bereich der L-Kette in scFv können von irgendeinem der oben erwähnten Antikörper abstammen. Als Peptidlinker zur Ligation der V-Bereiche kann irgendein einzelkettiges Peptid, umfassend z.B. 12 bis 19 Aminosäurereste, verwendet werden.
DNA, die scFv kodiert, kann unter Verwendung einer DNA erhalten werden, die eine H-Kette kodiert oder eines V-Bereichs einer H-Kette des obigen Antikörpers und einer DNA, kodierend eine L-Kette oder einen V-Bereich einer L-Kette des obigen Antikörpers als Matrize durch Amplifikation des Teils der DNA, kodierend die gewünschte Aminosäuresequenz unter den obigen Sequenzen durch das PCR-Verfahren mit dem Primerpaar, das die beiden Enden spezifiziert und durch weitere Amplifikation der Kombination von DNA, kodierend den Peptidlinkerbereich und das Primerpaar, das die beiden Enden der mit der H-Kette bzw. der L-Kette zu ligierenden DNA definiert.
Sobald DNAs, kodierend scFv, konstruiert sind, kann ein Expressionsvektor, der sie enthält und ein Wirt, transformiert mit dem Expressionsvektor, durch konventionelle Verfahren erhalten werden und scFv kann unter Verwendung des resultierenden Wirts durch konventionelle Verfahren erhalten werden.
Antikörperfragmente können diejenigen Antikörperfragmente sein, bei denen ein Teil ihrer Sequenz eine Mutation, Substitution, Deletion oder Insertion durchlaufen hat. Diese Antikörperfragmente können erhalten werden, indem das Gen hierfür auf ähnliche Weise, wie oben erwähnt, erhalten wird und indem man es in einem Wirt exprimieren läßt. "Antikörper", wie in dem Anspruch der vorliegenden Anmeldung verwendet, umfasst diese Antikörperfragmente.
Als modifizierte Antikörper können Anti-IL-6-Rezeptorantikörper, assoziiert mit verschiedenen Molekülen, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) verwendet werden. "Antikörper", wie in dem Anspruch der vorliegenden Anmeldung verwendet, umfasst diese modifizierten Antikörper. Diese modifizierten Antikörper können durch chemische Modifikation der so erhaltenen Antikörper erhalten werden. Diese Verfahren wurden bereits auf dem Gebiet etabliert.
6. Expression und Produktion von rekombinanten Antikörpern, veränderten Antikörpern und Antikörperfragmenten
Antikörpergene, die wie oben erwähnt konstruiert wurden, können auf bekannte Weise exprimiert und erhalten werden. Im Fall von Säugerzellen kann die Expression unter Verwendung eines Expressionsvektors bewirkt werden, der einen üblicherweise verwendeten nützlichen Promotor enthält, ein zu exprimierendes Antikörpergen und eine DNA, worin das Poly-A-Signal operabel an das 3'-stromabwärts gelegene Ende gebunden wurde. Beispiele für einen Promotor/Enhancer beinhalten den menschlichen Zytomegalievirus-Immediate-Early-Promotor/Enhancer.
Zusätzlich kann als Promotor/Enhancer, der für die Expression eines Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ein viraler Promotor/Enhancer verwendet werden, wie z.B. ein Retrovirus, Polyomavirus, Adenovirus und Simianvirus 40 (SV40) und Promotor/Enhancer, die von Säugerzellen abstammen, wie z.B. dem menschlichen Elongationsfaktor 1α (HEF1α).
Beispielsweise kann eine Expression einfach durch das Verfahren von Mulligan, R.C. et al. (Nature (1979) 277, 108-114) bewirkt werden, wenn der SV40-Promotor/Enhancer verwendet wird und durch das Verfahren von Mizushima, S. et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), wenn der HEF1α-Promotor/Enhancer verwendet wird.
Im Fall von E. coli kann die Expression durch operables Anbinden eines üblicherweise verwendeten Promotors, einer Signalsequenz für die Antikörpersekretion und eines Antikörpergens, das exprimiert werden soll, durchgeführt werden, gefolgt von der Expression. Als Promotor kann beispielsweise der lacZ-Promotor und der araB-Promotor erwähnt werden. Das Verfahren von Ward, E.S. et al. (Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) kann verwendet werden, wenn der lacZ-Promotor verwendet wird und das Verfahren von Better, M. et al. (Science (1988) 240, 1041-1043) kann verwendet werden, wenn der araB-Promotor verwendet wird.
Als Signalsequenz für die Antikörpersekretion kann die pelB-Signalsequenz (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) verwendet werden, wenn im Periplasma von E. coli produziert wird. Nach Abtrennung des im Periplasma erzeugten Antikörpers kann die Struktur des Antikörpers auf geeignete Weise neu gefaltet werden, bevor er verwendet wird (siehe z.B. internationale Patentanmeldung WO96/30394).
Als Replikationsursprung können diejenigen verwendet werden, die von SV40, Polyomavirus, Adenovirus, Rinder-Papillomvirus (BPV) und ähnlichem abstammen. Weiterhin können für die Genamplifikation in dem Wirtszellsystem Expressionsvektoren als Selektionsmarker, das Aminoglycosidtransferase (APH) -Gen, das Thymidinkinase (TK) -Gen, das E. coli-Xanthinguaninphos phoribosyltransferase (Ecogpt) -Gen, das Dihydrofolatreduktase (dhfr) -Gen und ähnliche enthalten.
Für die Produktion von Antikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann jedes Produktionssystem verwendet werden und das Produktionssystem für die Antikörperherstellung umfasst in vitro- oder in vivo-Produktionssysteme.
Als in vitro-Produktionssystem kann ein Produktionssystem erwähnt werden, das eukaryontische Zellen verwendet und ein Produktionssystem, das prokaryontische Zellen verwendet.
Wenn eukaryontische Zellen verwendet werden gibt es Produktionssysteme, die tierische Zellen, Pflanzenzellen und Pilzzellen verwenden. Bekannte tierische Zellen beinhalten (1) Säugerzellen, wie z.B. CHO-Zellen, COS-Zellen, Myelomzellen, Baby-Hamster-Nieren (BHK) -Zellen, HeLa-Zellen und Verozellen, (2) amphibische Zellen, wie z.B. Xenopus-Oozyten oder (3) Insektenzellen, wie z.B. sf9, sf21 und Tn5. Bekannte Pflanzenzellen beinhalten z.B. diejenigen, die von der Nicotiana-Familie abstammen, genauer gesagt Zellen, abgeleitet von Nicotiana tabacum, der einer Calluskultur unterzogen wurde. Bekannte Pilzzellen beinhalten (1) Hefen, wie z.B. die der Saccharomyces-Familie, genauer gesagt Saccharomyces cerevisiae oder (2) Schimmelpilze, wie z.B. die der Gattung Aspergillus, genauer gesagt Aspergillus niger.
Wenn prokaryontische Zellen verwendet werden, gibt es Produktionssysteme, die bakterielle Zellen verwenden. Bekannte bakterielle Zellen beinhalten Escherichia coli und Bacillus subtilis.
Durch Einführung des Gens des gewünschten Antikörpers durch Transformation in diese Zellen und Kultivierung der transformierten Zellen in vitro kann der Antikörper erhalten werden. Die Kultivierung wird durch bekannte Verfahren durchgeführt. Beispielsweise kann als Kulturflüssigkeit für die Säugerzellen DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM und ähnliches verwendet werden und Serumzusätze wie fötales Kälberserum (FCS) können damit in Kombination verwendet werden. Zusätzlich können Antikörper in vivo durch Implantation von Zellen, worin das Antikörpergen eingeführt wurde, in die Peritonealhöhlung eines Tiers und ähnliches erzeugt werden.
Als in vivo-Produktionssysteme können diejenigen erwähnt werden, die Tiere verwenden und diejenigen, die Pflanzen verwenden. Wenn Tiere verwendet werden, gibt es Produktionssysteme, die Säuger und Insekten verwenden.
Als Säuger können Ziegen, Schweine, Schafe, Mäuse und Rinder verwendet werden (Glaster, V., SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
Wenn Säuger verwendet werden, können transgene Tiere verwendet werden. Zum Beispiel werden Antikörpergene in das Gen inseriert, das Protein kodiert, das inhärent in der Milch produziert wurde, wie z.B. Ziegen-β-Casein, um Fusionsgene zu erzeugen. DNA-Fragmente, enthaltend das Fusionsgen, in das das Antikörpergen inseriert wurde, werden in einen Ziegen-Embryo injiziert und der Embryo wird in eine weibliche Ziege eingeführt. Der gewünschte Antikörper wird von der durch die transgene Ziege erzeugten Milch erhalten, die der Ziege geboren wurde, die den Embryo erhielt oder seine Nachkommen. Um die Menge der erzeugten Milch zu steigern, die den gewünschten Antikörper enthält, erzeugt von der transgenen Ziege, können der trangenen Ziege Hormone, je nach Bedarf, verabreicht werden (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
Als Insekten können Seidenwürmer verwendet werden. Wenn Seidenwürmer verwendet werden, wird Baculovirus, in das das gewünschte Antikörpergen inseriert wurde, in den Seidenwurm infiziert und der gewünschte Antikörper kann aus der Körperflüssigkeit des Seidenwurms erhalten werden (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
Wenn weiterhin Pflanzen verwendet werden, kann z.B. Tabak verwendet werden. Wenn Tabak verwendet wird, wird das gewünschte Antikörpergen in einen Expressionsvektor für Pflanzen inseriert, z.B. pMON 530, und dann wird der Vektor in ein Bakterium, wie z.B. Agrobacterium tumefaciens, eingeführt. Das Bakterium wird dann in Tabak infiziert, wie z.B. Nicotiana tabacum, um den gewünschten Antikörper aus den Blättern des Tabaks zu erhalten (Ma, J.K. et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
Ein Antikörpergen wird wie oben erwähnt in diese Tiere oder Pflanzen eingeführt und dann wird der Antikörper in solchen Tieren und Pflanzen erzeugt und daraus gesammelt.
Wenn Antikörper in in vitro- oder in vivo-Produktionssystemen, wie oben erwähnt, erzeugt wird, werden DNAs, kodierend eine H-Kette und eine L-Kette des Antikörpers separat in Expressionsvektoren integriert und der Wirt wird simultan transformiert oder eine DNA, kodierend eine H-Kette und eine L-Kette eines Antikörpers wird in einen einzelnen Expressionvektor integriert und der Wirt wird damit transformiert (internationale Patentanmeldung WO94/11523).
7. Abtrennung und Reinigung eines Antikörpers
Antikörper, die wie oben beschrieben exprimiert und produziert wurden, können von innen oder außen von der Wirtszelle getrennt und dann zur Homogenität gereinigt werden. Die Abtrennung und Reinigung des Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann durch Abtrenn- und Reinigungsverfahren bewirkt werden, die konventionell für Proteine verwendet werden, ohne irgendeine Begrenzung.
Zum Beispiel kann die Abtrennung und Reinigung des Antikörpers durch Kombination in geeigneter Weise einer Säulenchromatographie, wie z.B. einer Affinitätschromatographie, Filtration, Ultrazentrifugation, Aussalzen, Dialyse und ähnlichem bewirkt werden (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow und David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Als Säule, die für die Affinitätschromatographie verwendet wird, können eine Protein A-Säule und eine Protein G-Säule erwähnt werden. Beispiele für Säulen, die eine Protein A-Säule verwenden sind Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia) und ähnliche.
Eine andere als eine Affinitätschromatographie beinhaltet z.B. eine Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration, Umkehrphasenchromatographie, Absorptionschromatographie und ähnliche (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Ed Daniel, R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Weiterhin kann die Chromatographie unter Verwendung einer Flüssigphasenchromatographie, wie z.B. HPLC, FPLC und ähnlichem durchgeführt werden.
8. Messung der Antikörperkonzentration
Die Konzentration eines wie oben erhaltenen Antikörpers kann durch Messung der Absorption oder durch einen enzymgebundenen Immunosorbentassay (ELISA) und ähnliches bestimmt werden. Wenn so eine Absorptionsmessung verwendet wird, wird der erhaltene Antikörper in geeigneter Weise mit PBS verdünnt und dann wird die Absorption bei 280 nm gemessen, gefolgt von einer Berechnung unter Verwendung des Absorptionskoeffizienten von, obwohl dies je nach Art und Subklassen unterschiedlich ist, 1,4 OD bei 1 mg/ml im Fall eines menschlichen Antikörpers.
Wenn das ELISA-Verfahren verwendet wird, wird die Messung wie folgt durchgeführt. So werden 100 μl of Ziegen-anti-menschlicher IgG-Antikörper, verdünnt auf 1 μg/ml in 0,1 M Bicarbonatpuffer, pH 9,6 zu einer Platte mit 96 Vertiefungen (Nunc) zugefügt und dieses wird über Nacht bei 4°C zum Immobilisieren des Antikörpers inkubiert. Nach dem Blockieren werden 100 μl von jeweils dem geeignet verdünnten Antikörper der vorliegenden Erfindung oder Proben, enthaltend den Antikörper oder 100 μl menschliches IgG mit bekannter Konzentration als Konzentrationsstandard zugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach dem Waschen werden 100 μl eines 5.000fach verdünnten alkalischen Phosphatase-markierten anti-menschlichen IgG-Antikörpers zugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wird die Substratlösung zugefügt und inkubiert, gefolgt von einer Messung der Absorption bei 405 nm unter Verwendung des MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad), um die Konzentration des gewünschten Antikörpers, basierend auf der Absorption des Konzentrationsstandard-IgGs zu berechnen.
Zur Bestimmung der Antikörperkonzentration kann BIAcore (Pharmacia) verwendet werden.
9. Bestätigung der Aktivität des Antikörpers
Die Bewertung der Aktivität eines Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung eines üblichen bekannten Verfahrens durchgeführt werden. IL-6 wird einer Platte zugefügt, worin IL-6-reaktive Zellen, wie HN60.BSF2-Zellen, kultiviert wurden. Dann wird die Bewertung in Gegenwart von Anti-IL-6-Rezeptorantikörper unter Verwendung eines Einbaus von ³H-markiertem Thymidin durch IL-6-abhängige Zellen als Index durchgeführt.
Alternativ werden ¹²⁵I-markiertes IL-6 und Anti-IL-6-Rezeptorantikörper einer Platte zugefügt, worin IL-6-Rezeptor-exprimierende Zellen, wie z.B. U266, kultiviert wurden und dann wird die Menge von ¹²⁵I-markiertem IL-6, das an die IL-6-exprimierenden Zellen gebunden ist, zur Bewertung bestimmt (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow und David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Als Verfahren zur Bestimmung der Antigen-Bindungsaktivität des Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können ein ELISA, EIA (Enzymimmunoassay), RIA (Radioimmunoassay) oder das fluoreszierende Antikörperverfahren verwendet werden.
Wenn ein ELISA verwendet wird, wird beispielsweise der IL-6-Rezeptor einer Platte mit 96 Vertiefungen zugefügt, worauf Antikörper gegen IL-6-Rezeptor immobilisiert wurde und dann werden Proben, enthaltend den gewünschten Anti-IL-6-Rezeptorantikörper, z.B. ein Kulturüberstand von Anti-IL-6-Rezeptorantikörper-erzeugenden Zellen oder gereinigter Antikörper hinzugefügt. Ein sekundärer Antikörper, der den gewünschten Anti-IL-6-Rezeptorantikörper erkennt, markiert mit einem Enzym, wie z.B. einer alkalischen Phosphatase, wird zugefügt und die Platte wird inkubiert, gewaschen und dann wird das Enzymsubstrat, wie z.B. p-Nitrophenylphosphat zugefügt. Daraufhin wird die Absorption gemessen, um die Antigen-Bindungsaktivität zu bewerten. Ein löslicher IL-6-Rezeptor kann als IL-6-Rezeptor verwendet werden.
Als Verfahren zur Messung der Inhibitionsaktivität der Liganden-Rezeptorbindung des Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann der konventionelle Zell-ELISA oder der Ligandenrezeptor-Bindungsassay verwendet werden.
Im Fall eines Zell-ELISAs werden z.B. Zellen, die IL-6-Rezeptor exprimieren, in einer Platte mit 96 Vertiefungen kultiviert und dann mit Paraformaldehyd usw. immobilisiert. Alternativ werden Membranfraktionen von Zellen, die IL-6-Rezeptor exprimieren hergestellt und eine Platte mit 96 Vertiefungen, worauf IL-6-Rezeptoren immobilisiert wurden, wird hergestellt. Hierzu wird eine Probe zugefügt, die den gewünschten Anti-IL-6-Rezeptorantikörper enthält, z.B. ein Kulturüberstand von Anti-IL-6-Rezeptorantikörper erzeugenden Zellen und gereinigte Antikörper und IL-6, markiert mit einem Radioisotop, wie z.B. ¹²⁵I, woraufhin die Platte inkubiert und gewaschen wird und die Radioaktivität zur Bestimmung der Menge von IL-6, gebunden an den IL-6-Rezeptor gemessen wird, um dadurch die Inhibitionsaktivität der Ligangen-Rezeptorbindung des Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers zu bewerten.
Der Inhibitionsassay der IL-6-Bindung an den IL-6-Rezeptor auf den Zellen, Zellen, die IL-6-Rezeptoren exprimieren, werden durch Zentrifugation usw. abgetrennt und resuspendiert, um eine Zellsuspension herzustellen. Eine Lösung von IL-6, markiert mit einem Radioisotop, wie z.B. ¹²⁵I oder eine Mischung von nicht-markiertem IL-6 und markiertem IL-6 und eine Lösung, enthaltend Anti-IL-6-Rezeptorantikörper, dessen Konzentration eingestellt wurde, werden der Zellsuspension zugefügt. Nach einer Inkubation für eine bestimmte Zeitspanne werden die Zellen abgetrennt und die Radioaktivität des markierten IL-6, gebunden an die Zelle, wird gemessen.
Zur Bewertung der Aktivität des obigen Antikörpers kann BIAcore (Pharmacia) verwendet werden.
10. Verabreichungsverfahren und pharmazeutische Präparation
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Melphalan und Anti-IL-6-Rezeptorantikörper in Kombination verwendet. "In Kombination verwendet", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Fall, worin pharmazeutische Zusammensetzungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten verabreicht werden, einen Fall, worin pharmazeutische Zusammensetzungen gleichzeitig verabreicht werden und einen Fall, worin eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend sowohl Melphalan als auch Anti-IL-6-Rezeptorantikörper, verabreicht wird.
In den ersteren beiden Fällen kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Melphalan und eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Anti-IL-6-Rezeptorantikörper, auf demselben Verabreichungsweg oder auf unterschiedlichen Verabreichungswegen verabreicht werden. Jede dieser pharmazeutischen Zusammensetzungen wird verabreicht, um zumindest teilweise die pathologischen Symptome von Patienten, die an Erkrankungen leiden, zu heilen oder zu inhibieren. Die Verabreichungszeitspanne kann je nach Bedarf abhängig vom Alter und Zustand des Patienten gewählt werden.
Vorzugsweise können pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend einen Anti-IL-6-Rezeptorantikörper parenteral, z.B. über eine intravenöse Injektion, Tropf, intramuskuläre Injektion, intraperitoneale Injektion, subkutane Injektion und ähnliches entweder systemisch oder lokal verabreicht werden. Als lokale Dosierungsformen werden vorzugsweise externe Präparationen, lokale Injektionen und ähnliches verwendet. Externe Präparationen werden aus Einreibungsmitteln wie Salben, Gels, Cremes, Emulsionen und Flüssigkeiten, Pflastern, Heftpflastern, wie z.B. Klappen und Sprühvorrichtungen wie Sprays und Pulvern gewählt.
Die effektive Dosierung eines Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers wird aus einem Bereich von 0,001 mg bis 1.000 mg pro kg Körpergewicht pro Tag gewählt. Vorzugsweise wird die Dosierung aus einem Bereich von 0,01 bis 50 mg pro Körpergewicht gewählt. Die obigen Dosierungen hängen von den pathologischen Zuständen ab und sind daher nicht auf diese Werte begrenzt. Die Anzahl der Verabreichungen wird üblicherweise gewählt aus ein- oder zweimal täglich, einmal pro zwei oder einige Tage oder einmal pro ein bis vier Wochen, ist jedoch nicht hierauf begrenzt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Melphalan umfassen, werden vorzugsweise oral verabreicht, jedoch können sie abhängig von der Natur des Wirkstoffs, dem Zustand des Patienten und ähnlichen ebenfalls parenteral verabreicht werden. Zum Beispiel als intravenöse Injektion, Tropf, interarterielle Injektion, intramuskuläre Injektion, Intratumorinjektion, Intratoraxinjektion oder intraperitoneale Injektion, entweder systemisch oder lokal.
Die effektive Dosis von Melphalan für eine orale Verabreichung liegt bei 1 bis 20 mg pro Tag, jeden Tag oder 1- bis 6mal pro Woche oder als hochdosierte intravenöse Injektion oder Infusion, einzelne oder multiple Dosierungen von 20 bis 200 mg/m² werden verwendet.
Melphalan kann nicht nur allein verabreicht werden, sondern auch in Kombination mit Vincristin, Adriamycin, Prednisolon und ähnlichen, je nach Bedarf.
Wenn eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Melphalan umfasst, simultan mit dem Anti-IL-6-Rezeptorantikörper verabreicht wird, liegt das Verhältnis, wenn mit einer täglichen oralen Verabreichung von Melphalan kombiniert wird, bei dem 0,01- bis 1.000fachen (Gewichtsverhältnis) relativ zu der Melphalandosis, obwohl dies sich je nach Bedingung des Patienten und Verabreichungsvorschrift unterscheidet. Alternativ kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein bestimmtes Verhältnis der beiden Mittel, verabreicht werden. Jedoch, wie oben erwähnt, variiert das Dosisverhältnis je nach Zustand des Patienten usw. und ist daher nicht auf das oben erwähnte Verhältnis begrenzt.
Es ist auch möglich, eine Behandlungsvorschrift vorzusehen, worin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Melphalan und einen Anti-IL-6-Rezeptorantikörper umfasst, zu unterschiedlichen Zeitpunkten verabreicht wird. Bei Patienten, bei denen z.B. durch Anwendung von Melphalan oder eine kombinierte Therapie, beinhaltend das Mittel als konstituierendes Element, eine Remission eingeführt wurde, kann der Anti-IL-6-Rezeptorantikörper verabreicht werden, um die Remission aufrechtzuerhalten. Weiterhin kann eine Verabreichung von Melphalen oder eine kombinierte Therapie mit diesem Mittel als konstituierendem Element und eine Verabreichung des Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers alle 1 bis 4 Wochen wiederholt werden. Für Melphalan und den Anti-IL-6-Rezeptorantikörper wird vorzugsweise das Erstere zuerst gegeben, jedoch kann auch das Letztere zuerst gegeben werden, abhängig vom Zustand des Patienten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die Melphalan umfassen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die Anti-IL-6-Rezeptorantikörper umfassen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die Melphalan und Anti-IL-6-Rezeptorantikörper gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, können pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Additive, abhängig vom Verabreichungsweg, enthalten.
Beispiele für solche Träger oder pharmazeutische Additive beinhalten Wasser, ein pharmazeutisch akzeptables organisches Lösungsmittel, Collagen, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, ein Carboxyvinylpolymer, Natriumcarboxymethylcellulose, Natrium, Polyacrylatnatriumalginat, wasserlösliches Dextran, Natriumcarboxymethylstärke, Pektin, Methylcellulose, Ethylcellulose, Xanthangummmi, Gummi arabicum, Casein, Gelatine, Agar, Diglycerin, Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol, Vaseline, Paraffin, Stearylalkohol, Stearinsäure, menschliches Serumalbumin (HSA), Mannit, Sorbit, Lactose, pharmazeutisch akzeptable Tenside und ähnliches.
Die tatsächlichen Additive werden aus dem obigen oder Kombinationen davon gewählt, abhängig von der Dosierungsform des Therapeutikums der vorliegenden Erfindung, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine simultane oder sequenzielle kombinierte Verabreichung eines Pharmazeutikums der vorliegenden Erfindung mit einem anderen Mittel, einem biologischen Mittel oder einem synthetischen Mittel. Andere Mittel werden aus anti-entzündlichen Mitteln, Antiallergika, Antiblutplättchenmitteln, anderen Antikrebsmitteln oder denjenigen gewählt, die die Aktivität des Ziels der vorliegenden Erfindung erhöhen oder unterstützen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Referenzbeispiele, experimentellen Beispiele und Arbeitsbeispiele erklärt. Es sollte festgehalten werden, dass die vorliegende Erfindung in keiner Weise auf diese Beispiele begrenzt ist.
Referenzbeispiel 1
Konstruktion des Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers PM-1
Der gemäß dem Verfahren von Hirata et al. (J. Immunol. (1989) 143, 2000-2006) hergestellte Anti-IL-6-Rezeptorantikörper MT18 wurde an CNBraktivierte Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) gemäß den beigefügten Anweisungen, um IL-6-Rezeptor zu reinigen (Yamasaki et al, Science (1988) 241, 825-828), gebunden.
So wurde eine menschliche Myelomzelllinie U266 in 1 mM p-Paraaminophenylmethansulfonylfluoridhydrochlorid (hergestellt von Wako Chemicals) (Digitoninpuffer) löslich gemacht, enthaltend 1% Digitonin (hergestellt von Wako Chemicals), 10 mM Triethanolamin (pH 7,8) und 0,15 M NaCl und dann mit einem MT18-Antikörper vermischt, konjugiert an Sepharose 4B-Kügelchen. Die Kügelchen wurden dann sechsmal mit dem Digitoninpuffer gewaschen, um einen teilweise gereinigten IL-6-Rezeptor, der für die Immunisierung verwendet werden sollte, herzustellen.
BALB/c-Mäuse wurden viermal alle 10 Tage mit dem oben erwähnten teilweise gereinigten IL-6-Rezeptor, erhalten von 3 × 10⁹ U266-Zellen, immunisiert und dann wurden Hybridome gemäß einem konventionellen Verfahren hergestellt. Ein Kulturüberstand der Hybridome von wachstumspositiven Vertiefungen wurde im Hinblick auf seine Fähigkeit zur Bindung an IL-6-Rezeptor durch das unten beschriebene Verfahren bewertet. 5 × 10⁷ U266-Zellen wurden mit ³⁵S-Methionin (2,5 mCi) markiert und in dem obigen Digitoninpuffer löslich gemacht.
Die löslich gemachten U266-Zellen wurden mit 0,04 ml MT18-Antikörper vermischt, konjugiert an Sepharose 4B-Kügelchen und dann sechsmal in dem Digitoninpuffer gewaschen. Unter Verwendung von 0,25 ml des Digitoninpuffers (pH 3,4), wurde ³⁵S-Methionin-markierter IL-6-Rezeptor eluiert, der mit 0,025 ml 1 M Tris, pH 7,4 neutralisiert wurde. Der Hybridom-Kulturüberstand, 0,05 ml wurde mit 0,01 ml Protein G-Sepharose (hergestellt von Pharmacia) vermischt.
Nach einem Waschen wurde die Sepharose mit 0,005 ml Lösung des oben hergestellten ³⁵S-markierten IL-6-Rezeptors inkubiert. Immunpräzipitierende Substanzen wurden durch SDS-PAGE analysiert, um die Kulturüberstände von Hybridomen zu suchen, die mit dem IL-6-Rezeptor reagierten. Im Ergebnis wurde ein reaktionspositiver Hybridomklon PM-1 etabliert. Der Anti-IL-6-Rezeptorantikörper PM-1, der von dem Hybridom PM-1 produziert wurde, hat den IgG1-κ-Subtyp.
Die Aktivität des Antikörpers, der von dem Hybridom PM-1 erzeugt wurde, um die Bindung von IL-6 an den IL-6-Rezeptor zu inhibieren, wurde unter Verwendung einer menschlichen Myelomzelllinie U266 bewertet. Rekombinantes menschliches IL-6 wurde aus E. coli hergestellt (Hirano et al., Immunol. Lett. (1988) 17, 41) und mit ¹²⁵I unter Verwendung des Bolton-Hunter-Reagenzes markiert (New England Nclear, Boston, MA) (Taga et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967).
4 × 10⁵ U266-Zellen wurden mit einem Kulturüberstand von 70% (V/V) Hybridom PM-1 und 14.000 CPM von ¹²⁵I-markiertem IL-6 bei Raumtemperatur für eine Stunde in Gegenwart eines 100fachen Überschusses von nichtmarkiertem IL-6 kultiviert. Siebzig Mikroliter einer Probe wurden auf 300 μl FCS in ein 400 μl Mikrozentrifugen-Polyethylenröhrchen geschichtet, zentrifugiert und dann wurde die Radioaktivität der Zellen gemessen. Das Ergebnis zeigte, dass der von dem Hybridom PM-1 erzeugte Antikörper die Bindung von IL-6 an den IL-6-Rezeptor inhibiert.
Referenzbeispiel 2
Konstruktion eines umgeformten menschlichen PM-1-Antikörpers
Ein umgeformter menschlicher PM-1-Antikörper wurde durch das in der internationalen Patentanmeldung WO92/19759 beschriebene Verfahren erhalten. Aus dem Hybridom PM-1, hergestellt gemäß Referenzbeispiel 1, wurde Gesamt-RNA gemäß dem konventionellen Verfahren hergestellt, woraus eine einzel strängige cDNA synthetisiert wurde. Durch das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR) wurde eine DNA, die den V-Bereich des Maus-PM-1-Antikörpers kodierte, amplifiziert. Die in dem PCR-Verfahren verwendeten Primer sind die in Jones, S.T. et al., Bio/Technology (1991) 9, 88-89, beschriebenen.
Die PCR-amplifizierten DNA-Fragmente wurden gereinigt, um DNA-Fragmente zu erhalten, die das Gen enthielten, das den V-Bereich der Maus-κ-Typ-L-Kette kodierte und DNA-Fragmente, enthaltend das Gen, das den V-Bereich der Maus-γ-Typ-H-Kette kodierte. Diese DNA-Fragmente wurden in das Plasmid pUC19 ligiert, das dann in kompetente E. coli-Zellen CH5α transfiziert wurde, um einen E. coli-Transformanten zu erhalten. Aus dem so erhaltenen Transformanten wurde das obige Plasmid erhalten und die Basensequenz des die V-Region kodierenden Bereichs in dem Plasmid wurde in einem konventionellen Verfahren bestimmt und die komplementaritätsbestimmende Region (CDR) von jeder V-Region wurde identifiziert.
Um Vektoren zu konstruieren, die Chimären PM-1-Antikörper exprimieren, wurden cDNAs, die den V-Bereich der κ-L-Kette und H-Kette von Maus-PM-1 kodierten, separat in HCMV-Expressionsvektoren inseriert. Um einen umgeformten menschlichen PM-1-Antikörper zu konstruieren, wurde die CDR des V-Bereichs von Maus-PM-1 in einen menschlichen Antikörper durch das CDR-Graftingverfahren implantiert. Damit die CDR des menschlichen Antikörpers geeignete Antigen-Bindungsstellen bilden konnte, wurde eine Substitution von Aminosäuren der Grundgerüstregion (FR) des Antikörper V-Bereiches durchgeführt.
Um die Gene der L-Kette und der H-Kette des umgeformten menschlichen PM-1-Antikörpers, der so konstruiert worden war zu exprimieren, wurde DNA, die die L-Kette oder die H-Kette kodierte, separat in einen Vektor inseriert, der den menschlichen Elongationsfaktor 1α (HEF-1α) -Promotor enthielt und ein Vektor, der die L-Kette oder die H-Kette des umgeformten menschlichen PM-1 (hPM-1) -Antikörpers exprimierte, wurde konstruiert. Durch simultane Insertion dieser beiden Expressionsvektoren in CHO-Zellen wurde eine Zelllinie, die umgeformten menschlichen PM-1-Antikörper (hPM-1) erzeugt, etabliert. Die Fähigkeit des so erhaltenen hPM-1 an den menschlichen IL-6-Rezeptor zu binden, wurde durch ELISA bestätigt. Weiter inhibierte hPM-1 die Bindung von menschlichem IL-6 an menschlichen IL-6-Rezeptor auf ähnliche Weise wie der Maus-Antikörper und der Chimäre Antikörper.
Beispiel 1:
Die Wirkungen der kombinierten Verwendung von Anti-menschlichem-IL-6-Rezeptorantikörper und einem chemotherapeutischen Mittel auf das Wachstum menschlicher Myelomzellen
Die Wirkungen des Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers auf die Empfindlichkeit von KPMM2-Zellen gegenüber Chemotherapeutika, die für die Behandlung von Myelom verwendet werden, wie z.B. Adriamycin (ADR, hergestellt von Kyowa Hakko), Vincristin (VCR, hergestellt von Sigma Chemical Co.) und Melphalan (L-PAM, hergestellt von Sigma Chemical Co.) wurden bewertet.
KPMM2 ist eine multiple Myelomzelllinie, abgeleitet von dem Aszites eines menschlichen Patienten mit Myelom (siehe japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 7-236475). Der Patient mit dem Myelom hatte eine Remission durch eine MCNU (Ranimustin) und MP (Melphalan, Prednisolon) -Therapie aufrechterhalten, jedoch kehrte die Erkrankung zurück und die darauffolgende VAD (Vincristin, Adriamycin, Dexamethason) -Therapie war ineffektiv. Das Wachstum der KPMM2-Zellen wird durch IL-6 unterstützt und durch den Anti-IL-6-Antikörper oder den Anti-IL-6-Rezeptorantikörper (Rinsho Ketueki [The Japanese Journal of Clinical Hematology] (1994) 35, 1361-1365) deutlich inhibiert. Die Wachstumsaktivität der Zelle wurde durch Einbau von ³H-markiertem Thymidin (hergestellt von Amersham) in die Zelle bewertet.
Die KPMM2-Zellen, die erhalten worden waren, wurden vollständig mit frischem Medium (RPMI1640-Medium, supplementiert mit 20% FBS) gewaschen und dann auf 4 × 10⁵/ml eingestellt, was in 50 μl Aliquots auf eine Mikrotiterplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen (hergestellt von Falcon) verteilt wurde. Weiterhin wurden ein Medium, enthaltend ein rekombinantes menschliches IL-6 (Asagoe, Y. et al., Bio/Technology (1988) 6, 806-809), Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörper hPM-1 (siehe obiges Referenzbeispiel 1 oder internationale Patentanmeldung WO92/15759) und die obigen Chemotherapeutika oder ein frisches Medium als Kontrolle zugefügt, um 200 μl in jeder Vertiefung zu erhalten.
Die Platte wurde 4 Tage bei 37°C inkubiert und zwar unter angefeuchteten Bedingungen in Gegenwart von 5% CO₂. Vier Stunden vor Ende der Inkubation wurden 10 μl einer ³H-markierten Thymidinlösung (100 μCi/ml) jeder Vertiefung zugefügt und dann für weitere 4 Stunden inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurden die Zellen auf dem Glasfilter gesammelt (hergestellt von Printed Filtermat A, WALLAC), wobei eine Erntevorrichtung (Micro 96 Harvester, hergestellt von SKATRON Instruments) verwendet wurde. Die in die Zellen eingebaute Radioaktivität wurde durch ein Microbeta (1450 MicroBeta, hergestellt von WALLAC) gemessen.
Die Aktivität der Wachstumsinhibition auf KPMM2 wurde unter Verwendung der Wirkung eines Chemotherapeutikums allein als Kontrolle ausgedrückt. Unter Verwendung des Einbaus von ³H-markiertem Thymidin in die Zelle für jede experimentelle Gruppe, worin jede Konzentration eines Chemotherapeutikums als 100 zugefügt wurde, wurde die Menge von ³H-markiertem Thymidin, eingebaut in die Zelle, in einer experimentellen Gruppe, worin ein Anti-menschlicher-IL-6-Rezeptorantikörper simultan zugefügt worden war, als Index verglichen.
Im Ergebnis ergab ein Vergleich der Beziehung zwischen der Konzentration eines Chemotherapeutikums in Gegenwart einer fixierten Konzentration eines Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers, dass der Index von Adriamycin und Vincristin fast konstant war, unabhängig von ihrer Konzentration (3 bis 6), während der Index abnahm mit einem Anstieg der Melphalankonzentration (1 und 2). In Gegenwart von 1 ng/ml IL-6 lag der Wachstumsindex von 10 μg/ml Anti-IL-6-Rezeptorantikörper allein bei 33,9, während er auf 15,5 in Coexistenz von 1 μg/ml Melphalan abfiel. Ähnliche Ergebnisse wurden in Gegenwart von 0,1 μg/ml IL-6 erhalten und der Index des Antikörpers allein lag bei 28,4, während er in Coexistenz mit 1 μg/ml Melphalan bei 15,9 lag. So konnte gezeigt werden, dass die kombinierte Verwendung des Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers und Melphalan eine synergistische Wirkung hat.
Beispiel 2
Die Wirkungen der kombinierten Verwendung von Anti-menschlichem-IL-6-Rezeptorantikörper und einem Chemotherapeutikum bei einem menschlichen Myelomzell-implantierten SCID-Maus-System
Es wurde in Arbeitsbeispiel 1 gezeigt, dass der Anti-menschliche-IL-6-Rezeptorantikörper die Antitumorwirkung von Chemotherapeutika verstärkt. Unter diesen zeigte sich, dass Melphalan (hergestellt von Sigma Chemical Co.) in synergistischer Weise wirkt und es wurde verwendet, um eine in vivo-Wirkung einer kombinierten Verwendung zu untersuchen.
Für die Bewertung einer Antitumoraktivität wurde ein Xenograftmodell verwendet. So wurde eine menschliche Myelomzelllinie, abstammend vom Aszites eines Patienten mit multiplem Myelom in eine männliche SCID-Maus implantiert (FOX CHASE C. B17/Icr-Scid Jcl, gekauft von Nippon Klea), und zwar über die Schwanzvene. Zu diesem Zeitpunkt wachsen die Tumorzellen im Knochenmark und beginnen, Myelomprotein (M-Protein) im peripheren Blut zu erzeugen. Weiterhin ähnelt dieses Modellsystem den tatsächlichen klinischen Zuständen sehr, nämlich darin, dass es Hauptsymptome eines multiplen Myeloms beim Menschen entwickelt, wie z.B. Knochenstörungen, erhöhtes Blutcalcium und ähnliches.
Eine Einzelzellsuspension von Myelomzellen für die Implantation wurde hergestellt, indem gut zerkleinerte KPMM2-Zellen durch ein Sieb geführt wurden, die vorher in vivo gehalten worden waren. Die Zelldichte wurde auf 3 × 10⁷/ml eingestellt, und dann wurde mit 0,2 ml pro Maus über die Schwanzvene implantiert (6 × 10⁷ Zellen pro Maus). Der Tag der Implantation der Zellen wurde als Tag 0 festgelegt.
Im Hinblick auf einen Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörper wurde eine Grundlösung, die mit 12,1 mg/ml konserviert worden war, in sterilem Phosphatpuffer zur Herstellung von 5 mg/ml verdünnt. Dies wurde den Mäusen mit 0,2 ml pro Tier über die Schwanzvene am Tag 8 (1 mg pro Maus) verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt den sterilen Phosphatpuffer, der keinen Antikörper enthielt, auf ähnliche Weise.
Melphalan (L-PAM, hergestellt von Sigma Chemical Co.), suspendiert mit 0,3 oder 0,1 mg/ml in 0,2% CMC (Carboxymethylcellulose) -Lösung in Wasser wurde verwendet. Dies wurde oral mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht der Maus (3 oder 1 mg/kg Gewicht) an 5 aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend am Tag 1, verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt 0,2% CMC-Lösung in Wasser, enthaltend kein Melphalan und zwar auf ähnliche Weise.
Das Experiment wurde mit den folgenden sechs Gruppen durchgeführt: (1) eine Gruppe, der kein Melphalan und kein Antikörper verabreicht wurde; (2) eine Gruppe, der nur 1 mg/kg Melphalan als Arzneimittel verabreicht wurde; (3) eine Gruppe, der nur 3 mg/kg Melphalan als Arzneimittel verabreicht wurde; (4) eine Gruppe, der Antikörper einzeln verabreicht wurde; (5) eine Gruppe, der 1 mg/kg Melphalan und Antikörper in Kombination verabreicht wurde und (6) eine Gruppe, der 3 mg/kg Melphalan und Antikörper in Kombination verabreicht wurde. Die Gruppe 1 beinhaltete 9 Mäuse, während jede der anderen Gruppen 7 Mäuse beinhaltete. Weiterhin wurde ein Tumor bei Mäusen derselben Linie, die am selben Tag erworben worden waren und die als Negativkontrolle für dem M-Protein-Nachweis verwendet wurden, nicht implantiert.
Indizes für die Arzneimittelwirksamkeit beinhalteten die Überlebenszeitspanne, das Überlebensverhältnis ohne Erkrankung am Tag 120 und die M-Proteinmenge am Tag 30. Für eine Analyse unter Verwendung einer Über lebenskurve wurde ein generalisierter Wilcoxon-Test (SPSS für Windows Version 6, SPSS Inc.) verwendet. Ein Signifikanzniveau von 5% oder niedriger wurde als signifikant angesehen.
Serum-M-Protein wurde als menschliches IgG unter Verwendung des ELISA-Verfahrens nachgewiesen. Weiterhin wurde Mausserum in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt, die vorher mit Anti-menschlichem-IgG-Antiserum beschichtet worden war und dies lieb man stehen. Dann wurde alkalische Posphatase konjugierter menschlicher IgG-Antikörper daran gebunden und ein SIGMA104-Phosphatasesubstrat wurde für die Farbentwicklung zugefügt, deren Absorption unter Verwendung eines Mikrotiterplattenablesers abgelesen wurde. Der M-Proteingehalt im Serum wurde unter Verwendung einer Standardkurve, die mit normalem menschlichen IgG erhalten worden war, berechnet.
Bei der Gruppe, der nur Anti-IL-6-Rezeptorantikörper verabreicht wurde oder der nur 1 mg/ml Melphalan verabreicht wurde, konnte keine lebensverlängernde Wirkung im Vergleich mit der Gruppe ohne Verabreichung beobachtet werden. Die kombinierte Verwendung der beiden verlängerte die Lebensspanne im Vergleich mit der Gruppe ohne Verabreichung jedoch signifikant oder im Vergleich mit beiden Gruppen, denen nur ein einzelnes Arzneimittel verabreicht wurde (7). Weiterhin reduzierte bei der Messung des M-Proteins im Serum am Tag 30 nach der Implantation die kombinierte Verwendung der beiden das M-Proteinniveau (8). Im Fall von 3 mg/kg Melphalan wurde eine signifikante, das Leben verlängernde Wirkung für die Gruppe mit einer Verabreichung von nur Melphalan im Vergleich mit der Gruppe ohne Verabreichung beobachtet, jedoch wurde unter Verwendung eines Antikörpers in Kombination selbst dann eine signifikante, das Leben verlängernde Wirkung beobachtet, wenn mit der Verabreichung mit nur einem Arzneimittel verglichen wurde (9). Die Überlebensrate ohne Erkrankung am Tag 120 betrug 2/7 in der 3 mg/kg Melphalan-Verabreichungsgruppe, jedoch verbesserte sich das Verhältnis auf 4/7 in der mit dem Antikörper kombinierten Verabreichungsgruppe (Table 1).
Die Verabreichung von Melphalan führte zu einer Toxizität bei Mäusen und inhibierte eine Körpergewichtszunahme (10). Wenn Melphalan in Kombination mit Anti-IL-6-Rezeptorantikörper verwendet wurde, verstärkte sich eine Antitumorwirkung, jedoch vergrößerte sich nicht die Toxizität (Inhibition der Körpergewichtszunahme). Tabelle 1 Verlängerung der Überlebenszeitspanne durch kombinierte Verwendung des Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers hPM-1 und Melphalan

Lebensverlängerungsverhältnis *: 100 × (Arzeimittelverabreichungsgruppe/keine Arzneimittelverabreichungsgruppe)

Die Überlebenszeitspanne wurde als Mittel ± Standardabweichung ausgedrückt.
Es ergab sich, dass die lebensverlängernde Wirkung durch Verwendung einer Kombination von Anti-IL-6-Rezeptorantikörper und Melphalan signifikant bei KPMM2 verlängert war, wobei es sich um eine Zelllinie handelt, die von einem Patienten abstammt, der gegenüber einer MP- und VAD-Therapie resistent war.
Beispiel 3
Die Wirkungen der kombinierten Verwendung eines Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers und eines Chemotherapeutikums bei einem mit menschlichen Myelomzellen implantierten SCID-Maussystem – eine Studie im Hinblick auf die in vivo-Dosisabhängigkeit des Antikörpers
Beispiel 2 hat gezeigt, dass Anti-menschlicher-IL-6-Rezeptorantikörper die Antitumorwirkungen von Melphalan verstärkt. Dementsprechend untersuchten wir die Dosisabhängigkeit des Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers bei kombinierter Verabreichung des Anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörpers und Melphalan.
Für die Bewertung der Antitumorwirkungen wurde ein Xenograft-Modell-Tier verwendet, das durch Implantation von KPMM2-Zellen über die Schwanzvene, wie in Arbeitsbeispiel 2, erzeugt worden war. So wurden Einzelzellsuspensionen, die hergestellt worden waren, indem KPMM2-Zellen durch ein Sieb geführt wurden, die vorher zerkleinert worden waren, nachdem sie in vivo aufrechterhalten wurden, mit 0,2 ml pro Maus über die Schwanzvene (6 × 10⁶ Zellen pro Maus) implantiert. Der Tag der Zellimplantation wurde als Tag 0 festgelegt.
Im Hinblick auf den anti-menschlichen IL-6-Rezeptorantikörper hPM-1 wurde eine Grundlösung, die mit 6,57 mg/ml konserviert worden war, in Natriumphosphatpuffer verdünnt, um eine Lösung von 5, 1, 0,2 und 0,04 mg/ml zu ergeben. Diese wurden den Mäusen mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht der Maus über die Schwanzvene am Tag 14 verabreicht, um 50, 10, 2 und 0,4 mg/kg Verabreichungsgruppen zu erzeugen. Die Kontrollgruppe erhielt denselben Puffer ohne Antikörper auf ähnliche Weise.
Melphalan (L-PAM, hergestellt von Sigma Chemical Co.) wurde als Suspension mit 0,1 mg/ml in einer 0,2%igen CMC-Lösung in Wasser verwendet. Dieses wurde oral mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht der Maus (1 mg/kg Gewicht) an 5 aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend am Tag 7, verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt 0,2% CMC-Lösung in Wasser ohne Melphalan auf ähnliche Weise.
Das Experiment wurde mit den folgenden 10 Gruppen durchgeführt: (A) Gruppe, der weder Melphalan noch Antikörper verabreicht wurde, (B) Gruppe, der nur Melphalan verabreicht wurde; (C) Gruppe, der nur jeweilige Dosen Antikörper verabreicht wurde, 4 Gruppen (50, 10, 2 und 0,4 mg/kg Gewicht) und (D) die Gruppe, der Melphalan und die jeweiligen Dosierungen des Antikörpers kombiniert verabreicht wurde, 4 Gruppen (50, 10, 2, 0,4 mg/kg Gewicht). Die Gruppe ohne Verabreichung beinhaltet 12 Mäuse pro Gruppe, die Gruppe mit der Melphalan-Verabreichung 6 Mäuse pro Gruppe, während die beiden anderen Gruppen jeweils 7 Mäuse beinhalteten. Weiterhin wurden Mäuse derselben Linie und die am selben Tag erworben worden waren, ohne Implantation eines Tumors gezüchtet und die Tiere wurden als Negativkontrolle für den M-Proteinnachweis verwendet. Die Menge des M-Proteins wurde wie in Beispiel 2 beschrieben berechnet.
Die Indizes der Arzneimitteleffizienz beinhalteten die Überlebenszeitspanne und die Menge an M-Protein am Tag 30, Tag 35 und Tag 42. Für die Analyse der Überlebenszeitspanne wurde ein generalisierter Wilcoxon-Test (SPSS für Windows Ver. 6, SPSS Inc.) verwendet. Ein Signifikanzniveau von 5% oder niedriger wurde als signifikant angesehen. Für die Analyse der M-Proteinmenge im Serum wurde zunächst ein ANOVA (Analyse der Varianz, SPSS für Windows Ver. 6, SPSS Inc.) durchgeführt. Nach Bestätigung der Signifikanz wurde das Bonferroni-Verfahren (SPSS für Windows Ver. 6, SPSS Inc.) verwendet und ein Signifikanzniveau von 5% oder weniger wurde als signifikant angesehen.
Da am Tag 35 bei der Gruppe ohne Verabreichung Todesfälle auftraten und auch bei der Gruppe mit den jeweiligen Dosierungen des Antikörpers allein, wurden sie im Hinblick auf die Menge des M-Proteins am Tag 30 verglichen. Andererseits war bei der Verabreichungsgruppe mit nur Melphalan und der Verabreichungsgruppe von kombiniert Melphalan und Antikörper die M-Proteinmenge am Tag 30 sehr niedrig. Da der anti-menschliche IL-6-Rezeptorantikörper, der verabreicht worden war, als M-Protein nachgewiesen wurde, und so den Assay beeinflusste, wurden sie im Hinblick auf die Daten am Tag 35 und Tag 42 verglichen.
Am Tag 30 inhibierte bei der Gruppe mit nur der Antikörperverabreichung keine der Dosierungen signifikant die Menge an M-Protein, jedoch tat dies die Einzelverabreichung von Melphalan signifikant (11). Dann wurde an den Tagen 35 und 42 die Wirkung der kombinierten Verwendung der Antikörperverabreichung relativ zur Melphalanverabreichung untersucht. Das Ergebnis ergab, dass die kombinierte Verwendung von anti-menschlichem IL-6-Rezeptorantikörper mit 10 mg/kg, 2 mg/kg und 0,4 mg/kg die Menge des M-Proteins signifikant reduzierte (12, 13).
Für die Überlebenszeitspanne ergab keine der Dosierungen der Verabreichungsgruppe von nur Antikörper eine signifikante lebensverlängernde Wirkung. Weiterhin zeigte Melphalan allein eine signifikante, das Leben verlängernde Wirkung, was weiter durch kombinierte Verwendung mit dem Antikörper verstärkt wurde (Tabelle 2). Bei jeder Dosis neigte die lebensverlängernde Wirkung zu einem Anstieg. Weiterhin wurde bei den Gruppen mit Verabreichungen von 0,4 mg/kg und 50 mg/kg eine Signifikanz relativ zu der Gruppe mit einer Nur-Melphalan-Verabreichung beobachtet, und zwar bei dem generalisierten Wilcoxon-Test (14). Tabelle 2 Verlängerung der Überlebenszeitspanne durch kombinierte Verwendung von anti-menschlichem IL-6-Rezeptorantikörper hPM-1 und Melphalan

Lebensverlängerungsverhältnis: 100 × (Arzneimittelverabreichungsgruppe/Gruppe ohne Arzneimittelverabreichung).

Die Werte in den Klammern wurden unter Verwendung der Verabreichungsgruppe von nur Melphalan als Kontrolle erhalten.
Die Überlebenszeitspanne wurde als Mittel ± Standardabweichung ausgedrückt.
Durch das Vorstehende wurde demonstriert, dass die kombinierte Verwendung von IL-6-Rezeptorantikörper und Melphalan eine Antitumorwirkung bei jeder Dosis von 0,4 mg/kg bis 50 mg/kg zeigt.
Die Verabreichung von Melphalan führte zu einer Toxizität bei den Mäusen und inhibierte die Körpergewichtszunahme. Wenn Melphalan in Kombination mit anti-menschlichem IL-6-Rezeptorantikörper verwendet wurde, verstärkte sich die Antitumorwirkung, jedoch verstärkte sich nicht die Toxizität (Inhibition der Körpergewichtszunahme). Daher wurde vorgeschlagen, dass die Verabreichung von Melphalan bei der Behandlung von Myelom für verstärkende Wirkungen, Reduktion der Dosierung und ein Durchbrechen der Melphalan-Resistenz nützlich sein kann.
Referenz auf Mikroorganismen, hinterlegt gemäß dem Patentzusammenarbeitungsvertrag, Regel 13(2):
Name und Adresse des Hinterlegungsinstituts:
Hinterlegungsorganisation: The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology Adresse: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan

Hinterlegungsnummer Hinterlegungsdatum

FERM BP-2998 10. Juli 1990
Hinterlegungsorganisation: National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited, Adresse: 23 St Macher Drive, Aberdeen AB2 IRY, UNITED KINGDOM

NCIMB 40366 11. Februar 1991

NCIMB 40362 11. Februar 1991

Claims

Therapeutikum zur Behandlung des Myeloms, umfassend ein Melphalan und einen Anti-IL-6-Rezeptorantikörper, der die Bindung von IL-6 an den IL-6-Rezeptor blockieren kann und dadurch die Signalübertragung von IL-6 inhibiert.
Therapeutikum zur Behandlung des Myeloms gemäß Anspruch 1, wobei der Anti-IL-6-Rezeptorantikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Therapeutikum zur Behandlung des Myeloms gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper ein Antikörper ist, erhältlich von dem Hybridome mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2998.
Therapeutikum zur Behandlung des Myeloms gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper ein umgeformter menschlicher Antikörper ist.
Therapeutikum zur Behandlung des Myeloms gemäß Anspruch 1, wobei der Anti-IL-6-Rezeptorantikörper ein umgeformter menschlicher Antikörper eines Antikörpers ist, erhältlich von dem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2998.
Verwendung eines Anti-IL-6-Rezeptorantikörpers, der die Bindung von IL-6 an den IL-6-Rezeptor blockieren kann und dadurch die Signalübertragung von IL-6 inhibiert, zur Erzeugung eines Therapeutikums zur Behandlung des Myeloms zur Verwendung in Kombination mit Melphalan.
Verwendung von Melphalan zur Erzeugung eines Therapeutikums zur Behandlung des Myeloms zur Verwendung in Kombination mit einem Anti-IL-6-Rezeptorantikörper, der die Bindung von IL-6 an den IL-6-Rezeptor blockieren kann und dadurch die Signalübertragung von IL-6 inhibiert.
Verwendung von Melphalan und einem Anti-IL-6-Rezeptorantikörper, der die Bindung von IL-6 an den IL-6-Rezeptor blockieren und dadurch die Signalübertragung von IL-6 inhibieren kann, zur Erzeugung eines Therapeutikums zur Behandlung des Myeloms.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, worin der Anti-IL-6-Rezeptorantikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, worin der Antikörper ein Antikörper ist, erhältlich von dem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2998.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10, worin der Antikörper ein umgeformter menschlicher Antikörper ist.
Verwendung gemäß Anspruch 6, worin der Anti-IL-6-Rezeptorantikörper ein umgeformter menschlicher Antikörper eines Antikörpers ist, erhältlich von dem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2998.