ES2277683T3 - Combinacion de anticuerpo anti-ep-cam con un agente quimioterapeutico. - Google Patents
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Abstract
Un kit de partes de un anticuerpo anti-Ep-CAM con uno o más agentes quimioterapéuticos que es capaz de detener a las células que expresan el antígeno Ep-CAM en S o G2/M, seleccionándose dicho agente quimioterapéutico entre el grupo constituido por: capecitabina, camptotecina, oxaliplatino, paclitaxel, docetaxel, ciclofosfamida, metotrexato, vinorelbina, epirrubicina, mitoxantrona, tomudex, cisplatino, carboplatino, gemcitabina, etopósido y topotecan.
Description
Combinación de anticuerpo
anti-Ep-CAM con un agente
quimioterapéutico.
La presente invención se refiere a la
combinación de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno
Ep-CAM con agentes quimioterapéuticos que afectan
al crecimiento celular bloqueando la progresión del ciclo celular
en G_{2}/M y a su uso en la terapia de cánceres que expresan el
antígeno.
Las estrategias terapéuticas convencionales para
el cáncer incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia en
diversas combinaciones; sin embargo, los porcentajes de respuesta no
han mejorado significativamente en los últimos 20 años. La
principal limitación de la quimioterapia y la radioterapia es la
dirección no selectiva hacia las células normales y tumorales, que
tiene como resultado efectos secundarios tóxicos. En la búsqueda de
alternativas de tratamiento menos tóxicas y más específicas, se han
investigado diversos tipos de inmunoterapia. Entre estas
modalidades, se han aplicado estrategias basadas en anticuerpos
monoclonales a una amplia serie de malignidades (Riethmüller y col.
Curr Opin Immun 1992, 4, 647-655 y Riethmüller y
col. Curr Opin Immunol 1993, 5.732-739). La
utilidad de los anticuerpos monoclonales se basa en su especificidad
por antígenos clonales, es decir, el reconocimiento molecular de
epítopos específicos que pueden comprender un antígeno y la unión a
esos antígenos con alta afinidad. Los anticuerpos monoclonales
pueden unirse a los antígenos expresados de forma única o
preferentemente en la superficie de células malignas, y por lo tanto
pueden usarse para dirigirse específicamente y destruir células
tumorales. Los anticuerpos pueden construirse como vehículos de
liberación para fármacos o ADN, o como conjugados con
radionúclidos. La unión de un anticuerpo desnudo a células diana
también puede activar funciones inmunes antitumorales innatas tales
como la citotoxicidad mediada por células dependiente de
anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad mediada por el complemento
(CMC), pudiendo dar como resultado cualquiera de ellas la lisis o
fagocitosis de la célula a la que se han dirigido. Tanto ADCC como
CMC son funciones inmunes relacionadas con la dosis de anticuerpo
y, por lo tanto, es deseable conseguir que se una tanto anticuerpo
a las células diana como sea posible. Una forma de conseguir este
objetivo es aumentar el nivel de expresión del antígeno relevante
que puede aumentar eficazmente las funciones del anticuerpo tales
como, por ejemplo, ADCC de las células diana gracias a que se une
más anticuerpo a las células (Fogler y col. Cancer Research 48:
6303-6308 (1988)).
Un antígeno importante en la terapia del cáncer
es el antígeno Ep-CAM (antígeno de pancarcinoma
humano). Este antígeno es una glicoproteína transmembrana que,
según se ha publicado, funciona como una molécula de adhesión
celular (Litvinow y col. J. Cell Biology 125:
437-446, 1994) y también se conoce como antígeno
17-1A, antígeno 40kD, EGP40,
GA733-2, KSA y ESA, pero también puede conocerse por
otros nombres o descripciones en la bibliografía. Se expresa en la
superficie basolateral de la mayor parte del epitelio cuboidal o
columnar simple, columnar pseudoestratificado y transicional y
generalmente a mayores niveles en células tumorales. Se sabe que las
células epiteliales son el tipo celular más importante en el
desarrollo de malignidades humanas. De esta manera, más del 90% de
todos los tumores malignos son carcinomas, y por lo tanto de origen
epitelial (Acta Anatomica; 156 (3); 217-226
(1996)). Aunque el antígeno Ep-CAM se expresa en la
mayoría de las células tumorales de origen epitelial, hay ejemplos
de células de origen epitelial que no expresan
Ep-CAM tales como tejidos epiteliales adultos,
queratinocitos epidérmicos adultos, células parietales gástricas,
epitelio cortical tímico, células mioepiteliales y hepatocitos. El
fenotipo de una célula maligna juega un papel importante en la
eficacia de los anticuerpos monoclonales. Aunque se ha demostrado
que ciertos antígenos tumorales específicos son esquivos, las
diferencias en la expresión de los antígenos entre células normales
y células tumorales han proporcionado una forma para conseguir
anticuerpos contra tumores. Sería clínicamente ventajoso conseguir
una mejora basándose en estas diferencias aumentando la
homogeneidad de antígenos y la densidad de expresión en células
tumorales.
Es bien conocido que los interferones alteran
los fenotipos celulares aumentando la expresión de antígenos
tumorales así como muchos antígenos normales, por ejemplo, HLA de
Clase I. Por ejemplo, el interferón-\alpha y el
interferón-\gamma humanos recombinantes pueden
aumentar la expresión de antígenos tumorales humanos
TAG-72 y CEA (Greiner y col. Cancer Res 44:
3208-3214 (1984)). La exposición al interferón
indujo una población de células tumorales
CEA-positivas más homogénea que liberaba más CEA de
la superficie celular, lo cual se confirmó por estudios in
vivo con xenoinjertos de carcinoma humano en ratones atímicos.
El tratamiento con interferón-\gamma mejoró la
expresión de TAG-72 y de CEA en células de tumor de
ovario o gastrointestinal en fluido ascítico maligno de pacientes
(Greiner y col. J Clin Oncol 10: 735-746 (1992)).
Los efectos de los interferones sobre las células son innumerables
y varían desde una citotoxicidad directa a inmunopotenciación y a
una actividad antiproliferativa. Ninguno de los efectos de los
interferones sobre la expresión de antígenos se ha atribuido
directamente a la interferencia con la progresión del ciclo
celular.
En resumen, la progresión del ciclo celular se
refiere a la secuencia de acontecimientos entre una división
mitótica y otra en una célula. Una fase de reposo quiescente
(G_{0}) va seguida de una fase de crecimiento (G_{1}), y
después de una fase de síntesis de ADN (S). Una segunda fase de
crecimiento de aumento celular (G_{2}) y replicación de ADN (fase
M) va seguida de división de la célula en dos células hijas.
Cualquier interferencia con la maquinaria celular puede inhibir la
progresión del ciclo en cualquier fase del ciclo celular. Por
ejemplo, ciertos agentes quimioterapéuticos específicos pueden
bloquear la progresión en G_{2} o M o tanto en G_{2} como en M
(G_{2}/M). En otras palabras, la exposición a ciertos fármacos,
por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, detendrá, por ejemplo, a
células individuales en G_{2} y/o M hasta que finalmente la
mayoría o todas las células de una población se hayan detenido en
G_{2} y/o M (G_{2}/M). En células HeLa, por ejemplo, la fase
G_{1}, S, G_{2} y M tardan 8,2, 6,2, 4,6 y 0,6 horas,
respectivamente. El período entre mitosis se denomina interfase.
Las células pueden tener diferentes tiempos de duplicación,
dependiendo de su fase de desarrollo o tipo de tejido. La variación
en los tiempos de duplicación normalmente es una función del tiempo
empleado en G_{1} (A Dictionary of Genetics, 5ª edición, RC King
and WD Stansfield, Oxford University Press, 1997).
Aunque algunas proteínas se han identificado
como proteínas que se producen únicamente en ciertas fases del
ciclo celular y por lo tanto pueden servir como marcadores del
estado del ciclo celular, la mayoría se producen a lo largo de todo
el ciclo celular pero a mayores o menores niveles en ciertos
momentos. La variación de la densidad de antígenos a lo largo del
ciclo celular es típica para los antígenos de sarcoma p102 y p200
(Song S, Anticancer Research 16(3A): 1171-5
(1996)), el antígeno asociado con leucemia/linfoma JD118 (Czuczman
y col. Cancer Immunology, Immunotherapy 36(6):
387-96 (1993)), y el antígeno de tumor gástrico PC1
(Wei y col., J of Oncology 9(3): 179-82
(1987)). Se ha notificado que algunos antígenos tumorales son
independientes del ciclo celular, por ejemplo, la metástasis
hepática 3H4 (Wulf y col., J. Cancer Research and Clinical Oncology
122(8): 476-82 (1996)) y los antígenos de
cáncer microcítico de pulmón (Fargion y col., Cancer Research 46:
2633-2638 (1986)).
Sorprendentemente, se ha descubierto que el
pretratamiento con un fármaco, por ejemplo un agente
quimioterapéutico que se sabe que bloquea la progresión del ciclo
celular en S y/o G_{2}/M tiene como resultado un aumento
significativo de la densidad de la población de antígeno
Ep-CAM y por lo tanto una mayor dirección de
anticuerpos anti-Ep-CAM a tumores
que expresan Ep-CAM. En anticuerpos líticos, esto se
traduce en una mayor susceptibilidad a la citolisis dependiente de
anticuerpo. Esta perturbación del fenotipo de las células tumorales
tiene un impacto significativo sobre la eficacia biológica de
anticuerpos terapéuticos y proporciona un efecto beneficioso
sinérgico a regímenes quimioterapéuticos convencionales. Además,
este aumento en la expresión de antígenos Ep-CAM
parece tener especificidad de tumor. En otras palabras, el
pre-tratamiento con agentes quimioterapéuticos que
bloquean el ciclo celular en S y/o G_{2}/M no parece afectar a la
expresión del antígeno Ep-CAM en células no
tumorales.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona una combinación de un anticuerpo Ep-CAM
y un agente quimioterapéutico que puede detener a las células que
expresan el antígeno Ep-CAM en S o G_{2}/M,
preferiblemente en G_{2}/M.
Son ejemplos de anticuerpos
anti-Ep-CAM ING1 (Colcher y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (5), 3199 a 3203 (1981) y Laio y
col., Human Antibody Hybridomas 1(2), 66-76
(1990)); 17-1A, por ejemplo Panorex (Herlyn y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1438-1452 (1979) y
Herlyn y col., Hybridoma 1985; 5 (suppl. 1) S3 a S10); y
NR-LU-10 (Okabe y col, Cancer
Research, 44, 5273 a 5278 (1984)).
Panorex (Adjuqual®) es un anticuerpo monoclonal
de ratón 17.1A. Se comercializa por Glaxo Wellcome en Alemania para
la terapia adyuvante post-operatoria del cáncer
colorrectal.
Un ejemplo de un anticuerpo
anti-Ep-CAM es uno con la secuencia
de ADNc de cadena ligera variable indicado en la Figura 15 y la
secuencia de ADNc de cadena pesada presentada en la Figura 16
(conocido como 323/A3/IgG_{1} humanizado). Son otros dos ejemplos
preferidos de anticuerpos
anti-Ep-CAM los que tienen la
secuencia de ADNc de cadena ligera variable indicada en la Figura
15 y las secuencias de ADNc de cadena pesada indicadas en las
Figuras 17 ó 18 respectivamente (conocidos como 323/A3/IgG_{4} e
IgG_{2cys} humanizados respectivamente).
Un ejemplo preferido de anticuerpo
anti-Ep-CAM es 17.1A, más
preferiblemente Panorex.
Los anticuerpos
anti-Ep-CAM específicos pueden
administrarse por sí mismos o en combinación con otros anticuerpos
anti-Ep-CAM. Son ejemplos de estas
combinaciones de anticuerpos
anti-Ep-CAM un anticuerpo
anti-Ep-CAM con la secuencia de
ADNc de cadena ligera variable indicada en la Figura 15 y la
secuencia de ADNc de cadena pesada indicada en la Figura 16 en
combinación con ING1. De esta manera, a lo largo de la memoria
descriptiva la referencia a un anticuerpo
anti-Ep-CAM incluye combinaciones de
anticuerpos de diversos anticuerpos
anti-Ep-CAM, preferiblemente
anticuerpos anti-Ep-CAM no
competitivos que se dirigen a diferentes epítopos del mismo antígeno
Ep-CAM.
Son ejemplos de agentes quimioterapéuticos que
pueden detener a las células que expresan el antígeno
Ep-CAM en G_{2}/M vinorelbina, cisplatino,
paclitaxel, carboplatino, oxaliplatino y CPT-II
(camptotecina).
El tartrato de vinorelbina es un alcaloide de la
vinca semisintético con el nombre químico
[R-(R*,R*)-2,3-dihidroxibutanodioato
(1:2)(sal)] de
3',4'-dideshidro-4'-desoxi-C'-norvincaleucoblastina.
El tartrato de vinorelbina se usa en combinación con otros agentes
quimioterapéuticos tales como cisplatino o como un solo agente en el
tratamiento de diversos tumores sólidos, particularmente cáncer
macrocítico de pulmón, cáncer de mama avanzado y cáncer de próstata
refractario a hormonas. El nombre comercial Navelbine® se usa en
Norteamérica y Europa, Navelbine® se administra por vía intravenosa
como un solo agente o en una terapia combinada típicamente a dosis
de 20-30 mg/m^{2} en una base semanal.
Actualmente está en desarrollo clínico una formulación oral de
vinorelbina.
El cisplatino tiene el nombre químico
cis-diaminodicloroplatino. El cisplatino se usa en
el tratamiento de tumores testiculares metastásicos como una
terapia combinada, como una terapia individual y combinada en
tumores de ovario metastásicos, y como un solo agente en el cáncer
de vejiga avanzado. El cisplatino se fabrica por
Bristol-Myers Squibb con los nombres comerciales de
Platinol® y Platinol-AQ®. El cisplatino también se
usa en los siguientes tipos de cáncer, típicamente en terapia
combinada: cánceres de pulmón macrocíticos y microcíticos, cáncer
de cabeza y cuello, endometrial, cervical y linfoma no Hodgkin. El
cisplatino típicamente se administra por vía intravenosa en dosis
que varían de 15 a 150 mg/m^{2} una vez cada 3 a 4 semanas, o
diariamente durante 5 días repitiéndose el ciclo cada 3 ó 4
semanas. Sin embargo, ocasionalmente se administran dosis superiores
y más frecuentes y la vía de administración podría ser diferente de
la intravenosa, tal como intraarterial o intraperitoneal.
El carboplatino tiene el nombre químico de
platino, diamina
[1,1-ciclobutano-dicarboxilato(2)-0,0']-(SP-4-2).
El carboplatino normalmente se administra en combinación con otras
citotoxinas tales como paclitaxel y etopósido. Se usa en el
tratamiento de cáncer de ovario avanzado, cáncer macrocítico de
pulmón, así como en muchos de los mismos tipos de cánceres en los
que se usa el cisplatino. El nombre comercial del carboplatino
fabricado por Bristol-Myers Squibb es Paraplatin®.
El carboplatino típicamente se administra por vía intravenosa a
300-400 mg/m^{2} o en un área diana bajo la curva
de concentración de fármaco frente al tiempo (AUC) de
4-6 mg/ml-min usando la velocidad
de filtración glomerular (GFR) estimada del paciente. También pueden
administrarse dosis superiores de hasta aproximadamente 1600
mg/m^{2} divididas a lo largo de varios, normalmente cinco,
días.
El paclitaxel tiene el nombre químico
4,10-diacetato2-benzoato 13-éster de
5\beta, 20
epoxi-1,2\alpha,4,7\beta,10\beta,13\alpha-hexahidroxitax-11-en-9-ona
con
(2R,3S)-N-benzoil-3-fenilisoserina.
El paclitaxel se fabrica por Bristol-Myers Squibb
como Taxol®. Se usa para tratar una diversidad de carcinomas
incluyendo el cáncer de ovario, mama, macrocítico de pulmón y de
cabeza y cuello. Las dosis típicas incluyen 135-175
mg/m^{2} como una infusión intravenosa de 3 ó 24 horas
administrada cada 3 ó 4 semanas. También se han administrado dosis
superiores de hasta aproximadamente 300 mg/m^{2}.
Aparte del ingrediente activo, los productos
farmacéuticos proporcionados por los fabricantes típicamente
contienen un diluyente tal como agua estéril, dextrosa al 5% en agua
o cloruro sódico al 0,9% en agua con excipientes adicionales tales
como vehículo Cremophor añadido para hacer que el paclitaxel, por
ejemplo, sea soluble.
Puede obtenerse una información más detallada
sobre los regímenes de tratamiento, las dosificaciones y las
composiciones, etc., en libros de referencia convencionales tales
como: Martindale. The extra Pharmacopoeia, 31ª edición, editado por
JEF Reynolds, London. Royal Pharmaceutical Society, 1996 y the
Physicians Desk reference, 49ª Edición, 1995, Medical Economics
Data Production Company, Montvale.
Otros agentes quimioterapéuticos que pueden
hacer que las células se acumulen en G_{2}/M incluyen
antraciclinas, por ejemplo, aclarubicina; carmustina (BCNU),
camptotecina, 9-nitro-camptotecina,
ciclofosfamida y sus derivados, docetaxel, etopósido, Razoxane
(ICRF-187), alquiliso-fosfolípidos,
por ejemplo ilmofosina, metotrexato, MST-16,
taxanos, vinblastina, vincristina y tenipósido
(VM-26) (véase de nuevo Martindale, The Extra
Pharmacopoeia, 31ª edición, editado por JEF Reynolds, London, Royal
Pharmaceutical Society, 1996) y flavonoides, por ejemplo, apigenina
y genisteína (véase The Merck Index, 12ª edición, Merck Research
Laboratories, Merck and Co Inc, 1998). Además, también se cree que
hacen que se acumulen las células en G_{2}/M la adozelesina (una
clase de compuestos de pirazol) (Cancer Research, 15 de octubre de
1992; 52 (2): 5687 a 5692)), Bristratene A (Mutation Research, 1 de
marzo de 1996; 367 (3): 169 a 175), cicloxazolina (Cancer
Chemoterapy & Pharmacology 1994; 33(5): 399 a 409),
imidazoacridinona, melfalán (Experimental Cell Biology 1986; 54 (3):
138 a 148 e International Journal of Cancer, 17 de julio de 1995;
62 (2): 170 a 175), merbarona (Environmental & Molecular
Mutagenesis 1997; 29 (1): 16 a 27 y Cancer Research 1 de abril de
1995; 55 (7): 1509 a 1516) y oracin (FEBS Letters 2 de enero de
1997; 400 (1): 127 a 130), en general, se cree que también detienen
a las células en G_{2}/M todos los inhibidores de topo II, por
ejemplo, topotecan
(abpi, 1998-1999), todos los derivados de la vinca y todos los agentes que dañan el ADN incluyendo radiación.
(abpi, 1998-1999), todos los derivados de la vinca y todos los agentes que dañan el ADN incluyendo radiación.
Se cree que el UFT, metotrexato, capecitabina y
Gemcitabina aumentarán la expresión de Ep-CAM en
algunos tejidos. De manera similar, se cree que tomudex
(Raloxifeno), que se sabe que detiene a las células en la fase S,
aumenta la expresión de Ep-CAM.
La expresión "agente quimioterapéutico", a
lo largo de la memoria descriptiva, por lo tanto, no se limita a la
terapia citotóxica, sino que también incluye la terapia citostática
y cualquier otro fármaco capaz de detener a las células en
G_{2}/M. Además, debería indicarse que la radioterapia puede
detener a las células en G_{2}/M y que a lo largo de la memoria
descriptiva el término quimioterapéutico por lo tanto puede
sustituirse por "radioterapia".
A lo largo de la memoria descriptiva, la
referencia a un agente quimioterapéutico incluye combinaciones de
uno o más agentes quimioterapéuticos específicos que detienen a las
células tumorales que expresan Ep-CAM en G_{2}/M.
Son ejemplos de combinaciones típicas vinorelbina con cisplatino y
paclitaxel con carboplatino; oxaliplatino con 5FU; ciclofosfamida
con metotrexato y 5FU; y ciclofosfamida con doxorrubicina y 5FU.
Aunque es posible que el agente
quimioterapéutico se administre solo, es preferible presentarlo como
una composición farmacéutica que comprende un ingrediente activo,
como se ha definido anteriormente, junto con un vehículo aceptable
para el mismo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido
de ser compatible con los demás ingredientes de la composición y no
perjudicial para el receptor.
Son combinaciones preferidas de un anticuerpo
Ep-CAM y un agente quimioterapéutico capaces de
detener a las células que expresan el antígeno
Ep-CAM en S o G_{2}/M: Panorex en combinación con
cualquiera de los siguientes agentes quimioterapéuticos: UFT,
Capecitabina, CPT-11, Oxaliplatino, 5FU, infusión
continua de 5FU, Paclitaxel, Docetaxel, Gidofosfamida, Metotrexato,
Navelbine (iv y oral), Epirrubicina, Mitoxantrona, Raloxifeno,
Cisplatino, Carboplatino, Gemcitabina, Etopósido y Topotecan.
Son combinaciones particularmente preferidas
Panorex con CPT-II, Oxaliplatino, Capecitibina, UFT
y Tomudex (Raloxifeno).
Estas combinaciones de Panorex son útiles en el
tratamiento de cáncer, particularmente en el tratamiento de cáncer
colorrectal, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de próstata y
cáncer macrocítico de pulmón.
Específicamente, se prefieren particularmente
para el cáncer colorrectal las siguientes combinaciones: Panorex en
combinación con: UFT (opcionalmente con Leucovorin); Capecitabina,
Oxaliplatino (opcionalmente con 5FU); CPT-II, 5FU
(opcionalmente con Eniluracil o Levamisol o Leucovorin); infusión
continua prolongada de 5FU.
Son combinaciones preferidas para el tratamiento
del cáncer de mama: Panorex en combinación con Paclitaxel;
Docetaxel; Ciclofosfamida (opcionalmente con 5FU y Metotrexato o
Doxorrubicina); Navelbine (iv y/u oral); Epirrubicina;
Mitoxantrona: y Raloxifin.
Son combinaciones preferidas para el tratamiento
del cáncer gástrico: Panorex en combinación con cisplatino; y
carboplatino.
Una combinación preferida para el tratamiento
del cáncer de próstata es: Panorex en combinación con
Mitoxantrona.
Son combinaciones preferidas para el tratamiento
del cáncer macrocítico de pulmón Panorex en combinación con:
Navelbine; Cisplatino; Carboplatino; Paclitaxel; Docetaxel;
Gemcitabine; Topotecan; y Etopósido.
Puede encontrarse una información con respecto a
la dosificación de Panorex y los agentes quimioterapéuticos
anteriores administrados en combinación con Panorex en libros de
referencia convencionales tales como ABPI, Compendium of Data
Sheets and Summaries of Product Characteristics, Datapharm
Publications Limited, 1998-1999.
Las comparaciones incluyen las adecuadas para
administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y
sublingual), vaginal, parenteral, (incluyendo subcutánea,
intramuscular, intravenosa e intradérmica) o transdérmica. Las
composiciones convenientemente pueden presentarse en forma de
dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquier
procedimiento bien conocido en la técnica de la farmacia. Estos
procedimientos incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo
con el vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares.
Además, las composiciones se preparan asociando uniforme e
íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o
vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después si es
necesario dando forma al producto.
Las composiciones del agente qumioterapéutico
adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades
discretas tales como cápsulas, sellos o comprimidos que contienen
una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un polvo o
gránulos; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no
acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una
emulsión líquida de agua en aceite. El ingrediente activo también
puede presentarse como un bolo, electuario o pasta.
Un comprimido puede obtenerse por compresión o
moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Los
comprimidos de compresión pueden prepararse comprimiendo en una
máquina adecuada el ingrediente activo en una forma fluida tal como
un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante (por
ejemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa),
lubricantes, diluyentes inertes, conservantes, disgregantes (por
ejemplo, almidón glicolato sódico, povidona reticulada,
carboximetilcelulosa sódica reticulada), un agente tensioactivo o
dispersante. Los comprimidos de moldeo pueden obtenerse moldeando en
una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido
con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos opcionalmente
pueden recubrirse o marcarse con rayas o pueden formularse para
proporcionar la liberación lenta o controlada del ingrediente
activo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en
proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación
deseado. Opcionalmente, los comprimidos pueden proporcionarse con un
recubrimiento entérico para proporcionar la liberación en partes
del sistema digestivo distintas del estómago.
Las composiciones adecuadas para uso oral como
se ha descrito anteriormente también pueden incluir agentes
tamponantes diseñados para neutralizar la acidez del estómago. Estos
tampones pueden elegirse entre una diversidad de agentes orgánicos
o inorgánicos tales como ácidos o bases débiles mezclados con sus
sales conjugadas.
Las composiciones adecuadas para administración
tópica en la boca incluyen grageas que comprenden el ingrediente
activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga
o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una
base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga
y colutorios que comprenden el ingrediente activo en un vehículo
adecuado.
Las composiciones para administración rectal
pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que
comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato.
Las composiciones adecuadas para administración
vaginal pueden presentarse como supositorios vaginales, tampones,
cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que
contienen, además del ingrediente activo, vehículos conocidos en la
técnica y considerados adecuados.
Las composiciones adecuadas para administración
parenteral incluyen soluciones de inyección estéril isotónicas
acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones,
bacteriostatos y solutos que hacen que las composiciones sean
isotónicas con la sangre del receptor para el que están destinadas;
y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir
agentes de suspensión y agentes espesantes, tales como liposomas u
otros sistemas de micropartículas que están diseñados para dirigir
los compuestos a componentes sanguíneos o a uno o más órganos. Las
composiciones pueden presentarse en recipientes sellados de una sola
dosis o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales, y
pueden almacenarse en un estado secado por congelación
(liofilizado) que requiere únicamente la adición de un vehículo
líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente
antes del uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones de
inyecciones extemporáneas a partir de polvos estériles, gránulos y
comprimidos del tipo descrito previamente.
Las composiciones adecuadas para administración
transdérmica pueden presentarse como parches discretos adaptados
para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor
durante un período de tiempo prolongado. Estos parches
convenientemente contienen el ingrediente activo como una solución
acuosa opcionalmente tamponada de, por ejemplo, una concentración
de 0,1 o 0,2 M con respecto a dicho compuesto. Como posibilidad
particular, el ingrediente activo puede suministrarse desde el
parche por iontoforesis como se describe en general en
Pharmaceutical Research, 3 (6), 318 (1986).
Debe entenderse que además de los ingredientes
mencionados de forma particular anteriormente, las composiciones en
cuestión, por ejemplo, las adecuadas para administración oral pueden
incluir agentes adicionales tales como agentes edulcorantes,
espesantes y aromatizantes.
El intervalo de dosificación del agente
quimioterapéutico a co-administrar con el anticuerpo
típicamente puede estar comprendido entre aproximadamente 1 y 1000
mg/m^{2} (con respecto al área de superficie corporal del
paciente) o puede ser de aproximadamente 2-30 mg/kg
(con respecto al peso corporal del paciente), dependiendo del
agente quimioterapéutico usado. De esta manera, por ejemplo, la
vinorelbina (navelbine), típicamente se administrará a una
dosificación de aproximadamente 20 a 30 mg/m^{2}, el cisplatino a
aproximadamente 15-100 mg/m^{2}, el carboplatino
a aproximadamente 300-600 mg/m^{2} y el paclitaxel
a aproximadamente 100-300 mg/m^{2},
preferiblemente a aproximadamente 135-175
mg/m^{2}. Otra forma de expresar la dosificación es por su valor
de AUC. Por ejemplo, el carboplatino, típicamente se administrará a
una dosis calculada como AUC = 4 a 6 mg/ml-min.
Generalmente, las dosis de agentes quimioterapéuticos son menores
cuando se administran en combinación con otro agente
quimioterapéutico y/o anticuerpo que cuando se administran de forma
individual como único agente quimioterapéutico. Las dosis de
agentes quimioterapéuticos que se co-administrarán
con uno o más anticuerpos
anti-Ep-CAM probablemente serán las
dosis convencionales para el tipo de carcinoma tratado o dosis
inferiores. En general, las mayores dosis toleradas de los agentes
quimioterapéuticos se administran solas o en combinación.
Los anticuerpos
anti-Ep-CAM de la presente invención
preferiblemente tienen la estructura de un anticuerpo natural o un
fragmento del mismo. Los anticuerpos típicamente comprenden dos
cadenas pesadas unidas entre sí con enlaces disulfuro y dos cadenas
ligeras. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada
respectiva por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un
extremo un dominio variable seguido de varios dominios constantes.
Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un
dominio constante en su otro extremo. El dominio variable de cadena
ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. El
dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer
dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes de
las cadenas ligera y pesada no están implicados directamente en la
unión del anticuerpo al antígeno.
Los dominios variables de cada par de cadenas
ligera y pesada forman el sitio de unión al antígeno. Los dominios
en las cadenas ligera y pesada tienen la misma estructura general y
cada dominio comprende una zona flanqueante de cuatro regiones,
cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas por
tres regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las cuatro
regiones flanqueantes adoptan en gran medida una conformación de
lámina beta y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos
casos forman parte de la estructura de lámina beta. Las CDR se
mantienen próximas por las regiones flanqueantes y con las CDR del
otro dominio, contribuyen a la formación del sitio de unión al
antígeno, que en el caso de la presente invención es la formación de
un sitio de unión de anti-Ep-CAM.
Las CDR y las regiones flanqueantes de los anticuerpos pueden
determinarse haciendo referencia a Kabat y col ("Sequences
of proteins of Immunological interest" US Dept. of Health and
Human Services, US Government Printing Office, 1987).
En el documento
EP-A-0239400 se describe la
preparación de un anticuerpo en el que las CDR proceden de una
especie diferente que la región flanqueante de los dominios
variables del anticuerpo. Las CDR pueden proceder de un anticuerpo
monoclonal de roedor o primate. La región flanqueante de los
dominios variables y los dominios constantes de estos anticuerpos
alterados normalmente proceden de un anticuerpo humano. Este
anticuerpo humanizado no induciría una respuesta inmune tan grande
cuando se administrara a un ser humano en comparación con la
respuesta inmune creada por un ser humano contra un anticuerpo
totalmente extraño tal como el procedente de un roedor.
El anticuerpo preferiblemente tiene la
estructura de un anticuerpo natural o un fragmento del mismo. A lo
largo de la memoria descriptiva, la referencia a anticuerpo, por lo
tanto, comprende no sólo un anticuerpo completo, sino también
fragmentos tales como un fragmento (Fab') 2, un fragmento Fab, un
dímero de cadenas ligeras o un dímero de cadenas pesadas. El
anticuerpo puede ser una IgG tal como IgG_{1}, IgG_{2},
IgG_{3} o IgG_{4}; o IgM, IgA, IgE o IgD o una variante
modificada de las mismas, incluyendo las que pueden conjugarse con
otras moléculas tales como radionúclidos, enzimas, etc. Típicamente,
la región constante se selecciona de acuerdo con la funcionalidad
requerida. Normalmente, una IgG_{1} demostrará capacidad lítica
por medio de la unión al complemento y mediará la ADCC
(citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo). Un anticuerpo
IgG_{4} se preferirá si se requiere un anticuerpo no citotóxico.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también
incluyen anticuerpos biespecíficos tales como, por ejemplo, el
anticuerpo 17-1A descrito en Mack y col, The
journal of Immunology, 1997, 158: 3965-3970. Los
anticuerpos de la presente invención pueden ser murinos, quiméricos
o humanizados, siendo el anticuerpo preferido un anticuerpo
humanizado.
Hay cuatro etapas generales para humanizar un
anticuerpo monoclonal. Éstas son:
(1) la determinación de la secuencia de
nucleótidos y de aminoácidos prevista de los dominios variables de
cadena ligera y pesada del anticuerpo de partida;
(2) el diseño del anticuerpo humanizado, es
decir, decidir la región flanqueante de anticuerpo que se va a usar
durante el procedimiento de humanización;
(3) las metodologías/técnicas de humanización
propiamente dichas; y
(4) la transfección y expresión del anticuerpo
humanizado.
Más específicamente,
Etapa
1
Para humanizar un anticuerpo, sólo necesita
conocerse la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de
cadena pesada y ligera del anticuerpo. La secuencia de los dominios
constantes es irrelevante porque éstos no contribuyen a la
estrategia de reorganización. El procedimiento más sencillo para
determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de un
anticuerpo es a partir del ADNc clonado que codifica el dominio
variable de cadena pesada y ligera.
Hay dos procedimientos generales para clonar un
ADNc de dominio variable de cadena pesada y ligera: (1) a través de
una biblioteca de ADNc convencional o (2) a través de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Estos dos procedimientos son muy
conocidos. Dada la secuencia de nucleótidos de los ADN, es muy
sencillo traducir esta información en la secuencia de aminoácidos
prevista de los dominios variables de anticuerpos.
Etapa
2
Hay varios factores a considerar para decidir la
secuencia de anticuerpo humana a usar durante la humanización. La
humanización de las cadenas ligera y pesada se consideran
independientemente entre sí, pero el razonamiento es básicamente
similar para cada uno.
Este procedimiento de selección se basa en el
siguiente fundamento: la especificidad y afinidad por un antígeno
de un anticuerpo dado se determinan principalmente por la secuencia
de aminoácidos de las CDR de la región variable. Los restos
flanqueantes del dominio variable tienen una contribución directa
muy pequeña o nula. La función primaria de las regiones
flanqueantes es mantener las CDR en su orientación espacial
apropiada para reconocer el antígeno. De esta manera, la
sustitución de CDR de roedor en una región flanqueante de dominio
variable humano probablemente dará como resultado la retención de su
orientación espacial correcta si la región flanqueante del dominio
variable humano es muy homóloga al dominio variable de roedor del
que procedían. Por lo tanto, debe elegirse un dominio variable
humano que sea muy homólogo al dominio o dominios variables de
roedor.
Una secuencia de dominio variable de anticuerpo
humano adecuado puede seleccionarse como se indica a
continuación:
1. Usando un programa informático, buscar todas
las bases de datos de proteínas (y ADN) disponibles para las
secuencias de dominio variable de anticuerpo humano más homólogas a
los dominios variables de anticuerpo de roedor. El resultado de un
programa adecuado es una lista de secuencias con la máxima homología
al anticuerpo de roedor, el porcentaje de homología con cada
secuencia y una alineación de cada secuencia con la secuencia de
roedor. Esto se hace independientemente tanto para las secuencias de
dominio variable de cadena pesada como de cadena ligera. Los
análisis anteriores se realizan más fácilmente si sólo se incluyen
secuencias de inmunoglobulina humanas.
2. Indicar las secuencias de dominio variable de
anticuerpo humano y comparar para deducir la homología.
Principalmente, la comparación se realiza en longitudes de CDR,
excepto la CDR 3 de la cadena pesada que es bastante variable. Las
cadenas pesadas humanas y las cadenas ligeras Kappa y Lambda se
dividen en subgrupos; la cadena pesada en 3 subgrupos, la cadena
Kappa en 4 subgrupos y la cadena Lambda en 6 subgrupos. Los tamaños
de CDR dentro de cada subgrupo son similares pero varían entre
subgrupos. Normalmente es posible hacer corresponder una CDR de
anticuerpo de roedor con uno de los subgrupos humanos como primera
aproximación de homología. Después se comparan anticuerpos que
llevan CDR de longitud similar con respecto a la homología de
secuencias de aminoácidos, especialmente dentro de las CDR, pero
también en las regiones flanqueantes circundantes. El dominio
variable humano con la máxima homología se elige como región
flanqueante para la humanización.
Etapa
3
Un anticuerpo puede humanizarse por injerto de
las CDR deseadas en una región flanqueante humana de acuerdo con el
documento EP-A-0239400 (véase
también P.T. Jones y col, Nature 321:522 (1986); L. Reichman y col,
Nature 332: 323 (1988); Verhoeyen M. y col, Science 239: 1534
(1988) y J. Ellis et al, The Journal of Immunology, 155:
925-937 (1995)). Por lo tanto, puede obtenerse una
secuencia de ADN que codifica el anticuerpo reorganizado deseado
empezando con el ADN humano cuyas CDR se desean reorganizar. La
secuencia de aminoácidos del dominio variable de roedor que
contiene las CDR deseadas se compara con la secuencia del dominio
variable de anticuerpo humano elegido. Se marcan los restos del
dominio variable humano que se necesitan cambiar por el resto
correspondiente en el roedor para hacer que la región variable
humana incorpore las CDR de roedor. También puede haber restos que
necesiten sustituirse, añadirse o delecionarse de la secuencia
humana.
Se sintetizan oligonucleótidos que puedan usarse
para mutagenizar la región flanqueante del dominio variable humano
para que contenga los restos deseados. Esos oligonucleótidos pueden
ser de cualquier tamaño conveniente. Normalmente sólo están
limitados en longitud por las capacidades del sintetizador
particular que esté disponible. El procedimiento de mutagénesis
in vitro dirigida a oligonucleótidos es bien conocido.
Como alternativa, la humanización puede
conseguirse usando la metodología de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) recombinante del documento WO92/07075. Usando esta
metodología, una CDR puede unirse entre las regiones flanqueantes
de un anticuerpo humano.
En general, la técnica del documento WO92/07075
puede realizarse usando una plantilla que comprende dos regiones
flanqueantes humanas, AB y CD y entre ellas, la CDR que se va a
reemplazar por una CDR donadora. Los cebadores A y B se usan para
amplificar la región flanqueante AB, y los cebadores C y D se usan
para amplificar la región flanqueante CD. Sin embargo, los
cebadores B y C también contienen, en sus extremos 5', una secuencia
adicional que corresponde a todo o al menos a parte de la secuencia
de CDR donadora. Los cebadores B y C solapan en una longitud
suficiente para permitir la hibridación de sus extremos 5' entre sí
en condiciones que permiten realizar una PCR. De esta manera, las
regiones amplificadas AB y CD pueden experimentar corte y empalme
génico por extensión solapante para producir el producto humanizado
en una sola reacción.
Etapa
4
Después de las reacciones de mutagénesis para
reorganizar el anticuerpo, los ADN mutagenizados pueden unirse a un
ADN apropiado que codifica una región constante de cadena ligera o
pesada, clonarse en un vector de expresión e introducirse por
transfección en células hospedadoras, preferiblemente células de
mamífero. Estas etapas pueden realizarse de una manera rutinaria.
Un anticuerpo reorganizado por lo tanto puede prepararse por un
procedimiento que comprende:
(a) preparar un primer vector de expresión
replicable que incluye un promotor adecuado unido operativamente a
una secuencia de ADN que codifica al menos un dominio variable de
una cadena pesada o ligera de Ig, comprendiendo el dominio variable
regiones flanqueantes de un anticuerpo humano y las CDR requeridas
para el anticuerpo humanizado de la invención;
(b) preparar un segundo vector de expresión
replicable que incluye un promotor adecuado unido operativamente a
una secuencia de ADN que codifica al menos el dominio variable de
una cadena ligera o pesada de Ig complementaria respectivamente;
(c) transformar una línea celular con el primero
o los dos vectores preparados; y
(d) cultivar dicha línea celular transformada
para producir dicho anticuerpo alterado.
Preferiblemente, la secuencia de ADN de la etapa
(a) codifica tanto el dominio variable como el o cada dominio
constante de la cadena de anticuerpo humano. El anticuerpo
humanizado puede recuperarse y purificarse. La línea celular que se
transforma para producir el anticuerpo alterado puede ser una línea
celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) o una línea celular de
mamífero inmortalizada, que ventajosamente es de origen linfoide,
tal como una línea celular de mieloma, hibridoma, trioma o cuadroma.
La línea celular también puede comprender células linfoides
normales, tales como células B, que se han inmortalizado por
transformación con un virus, tal como el virus
Epstein-Barr. Más preferiblemente, la línea celular
inmortalizada es una línea celular de mieloma o un derivado de la
misma. El sistema de expresión elegido es el sistema de expresión de
glutamina sintetasa descrito en el documento WO87/00462 (véase
también P.E. Stephens y col, Nucleic Acid Res. 17: 7110 (1989) y
C.R. Bebbington y col, Bio/Technology 10: 169 (1992)).
Aunque la línea celular usada para producir el
anticuerpo humanizado preferiblemente es una línea celular de
mamífero, como alternativa puede usarse cualquier otra línea celular
adecuada, tal como una línea celular bacteriana o una línea celular
de levadura. Para cadenas de anticuerpo individuales, se prevé el
uso de cepas de bacterias derivadas de E. coli. Se comprueba
la funcionalidad del anticuerpo obtenido. Si se ha perdido la
funcionalidad, es necesario volver a la etapa (2) y alterar la
región flanqueante del anticuerpo.
Una vez expresados, los anticuerpos enteros, sus
dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de
inmunoglobulina de la presente invención pueden purificarse de
acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo
precipitación con sulfato amónico, columnas de afinidad,
cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase,
en general, Scopes, R, Protein Purification,
Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Se prefieren
inmunoglobulinas sustancialmente puras con una homogeneidad de al
menos aproximadamente un 90 a un 95% y son aún más preferidas las
que tienen una homogeneidad del 98 al 99% o mayor, para usos
farmacéuticos. Una vez purificado, parcialmente o hasta la
homogeneidad según se desee, un anticuerpo puede usarse
terapéuticamente.
Los anticuerpos típicamente se proporcionan como
una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable y, como ingrediente activo, un
anticuerpo de acuerdo con la invención. El anticuerpo y las
composiciones farmacéuticas del mismo son particularmente útiles
para administración parenteral, es decir, por vía subcutánea,
intramuscular o intravenosa.
Las composiciones para administración parenteral
comúnmente comprenderán una solución del anticuerpo o un cóctel del
mismo disuelto en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo
acuoso. Pueden usarse diversos vehículos acuosos, por ejemplo, agua
estéril para inyección, cloruro sódico al 0,9% en agua, dextrosa al
5% en agua y solución de Ringer Lactada. Estas soluciones son
estériles y generalmente carecen de materia en forma de partículas.
Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de
esterilización bien conocidas convencionales. Las composiciones
pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables
como las requeridas para aproximarse a condiciones fisiológicas
tales como agentes de ajuste del pH y tamponantes, agentes de
ajuste toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro
sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico, etc. La
concentración de anticuerpo en estas formulaciones puede variar
ampliamente, por ejemplo, de menos de aproximadamente 0,5%,
normalmente al menos aproximadamente 1%, a una cantidad de hasta un
15 o 20% en peso, y se seleccionará principalmente basán-
dose en volúmenes de fluido, viscosidades etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.
dose en volúmenes de fluido, viscosidades etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.
De esta manera, podría obtenerse una composición
farmacéutica típica para inyección intramuscular que contuviera 1
ml de agua tamponada estéril y 50 mg de anticuerpo. Podría obtenerse
una composición típica para infusión intravenosa que contuviera 250
mg de solución de Ringer estéril y 150 mg de anticuerpo. Los
procedimientos reales para preparar composiciones que pueden
administrarse por vía parenteral serán conocidos o evidentes para
los especialistas en la técnica, particularmente, para los que han
recibido una formación específica en la preparación de productos
parenterales, y se describen con más detalle, por ejemplo, en
Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing
Company, Easton, Pennsylvania (1990).
Los anticuerpos de esta invención pueden
liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo
adecuado antes del uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz
con inmunoglobulinas convencionales. Puede emplearse cualquier
técnica de liofilización y reconstitución adecuada. Los
especialistas en la técnica apreciarán que la liofilización y
reconstitución puede conducir a grados variables de pérdida de
actividad de anticuerpo (por ejemplo, con inmunoglobulinas
convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener una pérdida de
actividad mayor que los anticuerpos IgG) y que los niveles de uso
pueden tener que ajustarse para compensar.
El intervalo de dosificación del anticuerpo de
acuerdo con la invención es de aproximadamente 0,5 a 1000
mg/m^{2}, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 250
mg/m^{2}, más preferiblemente está comprendido entre 0,5 y 100
mg/m^{2} y 0,5 y 50 mg/m^{2} y aún más preferiblemente entre 5 y
25 mg/m^{2}, tal como por ejemplo 15 mg/m^{2}.
De manera similar, expresadas en mg por dosis,
las dosificaciones del anticuerpo pueden ser de aproximadamente 1 a
2000 mg por dosis, preferiblemente de aproximadamente 1 a 500 mg por
dosis, más preferiblemente entre 1 y 200 mg por dosis y entre 1 y
100 mg por dosis y aún más preferiblemente entre 10 y 50 mg por
dosis, tal como, por ejemplo, 30 mg por dosis.
Las administraciones individuales o múltiples de
las composiciones pueden realizarse con niveles de dosificación y
modelos que se seleccionan por el médico a cargo del tratamiento. En
cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deben proporcionar
una cantidad del anticuerpo (anticuerpos) suficiente para tratar
eficazmente al paciente.
Típicamente, el agente quimioterapéutico y el
anticuerpo se presentarán como composiciones farmacéuticas separadas
para co-administración, pero también pueden
formularse como una sola formulación farmacéutica. De esta forma,
tanto el anticuerpo como el agente quimioterapéutico se presentan al
paciente dentro de la misma composición.
En todos los aspectos de la presente invención
pueden coadministrarse uno o más agentes quimioterapéuticos
distintos y uno o más anticuerpos
anti-Ep-CAM distintos. De esta
manera, la referencia a un agente quimioterapéutico comprende uno o
más agentes quimioterapéuticos distintos. Si hay más de un agente
quimioterapéutico, pueden administrarse individualmente cada uno
por separado y/o juntos como un cóctel de agentes
quimioterapéuticos. De manera similar, la referencia al anticuerpo
comprende uno o más anticuerpos
anti-Ep-CAM distintos. Si hay más
de un anticuerpo, estos pueden administrarse individualmente cada
uno por separado y/o juntos como un cóctel. Además, el agente o
agentes quimioterapéuticos típicamente se administran por separado
del anticuerpo o anticuerpos, pero también pueden administrarse
juntos como un cóctel de agente(s)
quimioterapéutico(s)/anticuerpo(s).
La co-administración del agente
quimioterapéutico/radioterapia con el anticuerpo comprende la
administración sustancialmente simultánea del agente
quimioterapéutico/radioterapia y el anticuerpo. Esencialmente, el
fundamento subyacente a la co-administración es
permitir una exposición suficiente de células tumorales que expresan
Ep-CAM a un agente quimioterapéutico/radioterapia
que se sabe que bloquea la progresión del ciclo celular en
G_{2}/M para conseguir el aumento deseado en la densidad de
antígenos Ep-CAM antes de la exposición de las
mismas células tumorales a un anticuerpo
anti-Ep-CAM para conseguir de esta
manera una mayor dirección de anticuerpos
anti-Ep-CAM a tumores que expresan
Ep-CAM. Por lo tanto, la
co-administración comprende cualquier modo de
administración de un agente quimioterapéutico/radioterapia junto con
un anticuerpo anti-Ep-CAM que
conseguirá este resultado. A lo largo de la memoria descriptiva, la
expresión "combinación de anticuerpo
anti-Ep-CAM con un agente
quimioterapéutico" se refiere a una combinación en la que el
agente quimioterapéutico/radioterapia y el anticuerpo
anti-Ep-CAM se han
co-administrado.
Preferiblemente, el agente quimioterapéutico se
administra simultáneamente con el anticuerpo o más preferiblemente
antes del anticuerpo. De esta manera, el agente quimioterapéutico
puede administrarse el mismo día que el anticuerpo, junto o en unas
horas de diferencia entre sí, pero también puede administrarse hasta
aproximadamente dos meses antes, típicamente, aproximadamente una o
dos semanas antes y más típicamente con una antelación de menos de
una semana, por ejemplo de uno a tres días antes.
Además, la co-administración
también incluye la administración de más de una dosis de anticuerpo
dentro de un período de varias semanas después de una o más dosis
de agente quimioterapéutico, en otras palabras, el agente
quimioterapéutico no necesita readministrarse de nuevo con cada
administración posterior del anticuerpo, sino que puede
administrarse una vez o intermitentemente durante el curso de
tratamiento de anticuerpo. La co-administración
también comprende la administración del agente quimioterapéutico
hasta 3 semanas después del anticuerpo, preferiblemente en la
semana posterior y más preferiblemente en los días posteriores, tal
como de uno a cinco días después.
El anticuerpo puede administrarse varias veces
al día. De forma similar, el agente quimioterapéutico puede
infundirse de forma continua durante varias horas o incluso
días.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para tratar pacientes mamíferos, preferiblemente
seres humanos, que padecen cáncer, que comprende
co-administrar un agente quimioterapéutico que es
capaz de detener a las células que expresan el antígeno
Ep-CAM en G_{2}/M en combinación con un anticuerpo
anti-Ep-CAM. Preferiblemente, el
agente quimioterapéutico se administra simultáneamente y más
preferiblemente antes de la administración del anticuerpo.
Los cánceres que pueden tratarse de una forma
particularmente eficaz con esta terapia de combinación son cánceres
primarios o metastásicos de cualquier origen histológico o
histogenético que expresan el antígeno Ep-CAM. Esto
incluye, por ejemplo, cánceres de próstata, cánceres de pulmón,
cánceres de mama, cánceres de colon, cánceres pancreáticos y
cánceres de ovario.
Los programas de dosificación para el
procedimiento de tratamiento de la presente invención pueden
ajustarse para responder a las características del paciente, el
estado de enfermedad, las características del agente
quimioterapéutico y las características del anticuerpo
anti-Ep-CAM. El objetivo de los
programas de dosificación de esta invención será administrar un
anticuerpo anti-Ep-CAM de una manera
que exponga las células tumorales que expresan
Ep-CAM al anticuerpo
anti-Ep-CAM en un momento en el que
es probable que la expresión del antígeno esté aumentada debido a
la exposición a una quimioterapia que se sabe que bloquea la
progresión del ciclo celular en G_{2}/M. Además, en la medida de
lo posible deberá mantenerse un programa de dosificación conveniente
para el paciente.
Los programas de dosificación preferidos para
administración del anticuerpo
anti-Ep-CAM y quimioterapia
incluyen: administración del anticuerpo
anti-Ep-CAM una vez cada una o dos
semanas, preferiblemente una vez cada tres o cuatro semanas o una
combinación de los mismos en la medida en la que sea necesario. El
agente quimioterapéutico se administra de acuerdo con el régimen
establecido para ese agente o un régimen que permite la exposición
de células tumorales que expresan Ep-CAM para que se
detengan en G_{2}/M. Los programas de dosificación preferidos
varían con el agente quimioterapéutico y el estado de enfermedad,
pero incluyen, por ejemplo, una vez por semana, una vez cada tres o
cuatro semanas o diariamente durante varios (por ejemplo
3-5) días, repetidos cada tres o cuatro semanas
durante el periodo de tiempo necesario. La dosificación del
anticuerpo anti-Ep-CAM puede
realizarse en el mismo día o en diferentes días según se indique
para el agente quimioterapéutico. El ajuste del programa de
dosificación o la concentración de la dosificación para prevenir o
reducir la toxicidad o los efectos secundarios puede realizarse por
el anticuerpo anti-Ep-CAM o el
agente quimioterapéutico.
Por ejemplo, el programa de dosificación
preferido para la co-administración de vinorelbina y
cisplatino en combinación con 323/A3 (IgG_{1}) humanizado es la
administración de 323/A3 humanizado (IgG_{1}) a una dosis de 30
mg/m^{2} una vez por semana durante el período que sea necesario,
pero típicamente durante un período de 3 a 4 semanas, seguido de
una dosis de 30 mg/m^{2} una semana sí y otra no posteriormente
durante el tiempo necesario. La vinorelbina se administra a una
dosis de 25 mg/m^{2} los días 1, 8, 15 y 22. El cisplatino se
administra únicamente una vez a una dosis de 100 mg/m^{2} el día
1. Posteriormente, el régimen de vinorelbina/cisplatino se repite
cada 28 días durante el período de tiempo necesario.
Preferiblemente, la vinorelbina, el cisplatino y el 323/A3
humanizado (IgG_{1}) se administran al mismo tiempo el día 1
durante un período de aproximadamente 2 a 3 horas.
Otro ejemplo de un programa de dosificación
preferido es la administración de paclitaxel/carboplatino en
combinación con 323/A3 humanizado (IgG_{1}), donde 323/A3
(IgG_{1}) se administra como en el ejemplo de
vinorelbina/cisplatino anterior y el paclitaxel y carboplatino se
administran a una dosis de 225 mg/m^{2} y AUC = 6,0
respectivamente, el día 1, con una dosificación de repetición cada
28 días posteriormente durante el período necesario. De nuevo, el
paclitaxel, el carboplatino y 323/A3 humanizado (IgG_{1})
preferiblemente se administran conjuntamente el día 1 durante un
período de aproximadamente 2 a 3 horas.
Otros programas de dosificación preferidos que
comprenden la combinación de 323/A3 (IgG_{1}) con cualquiera de
navelbine, cisplatino o taxol por separado comprendería
dosificaciones y programas de administración similares, usando un
solo agente anticanceroso en lugar de dos.
Cuando el anticuerpo
anti-Ep-CAM preferido es Panorex, la
dosificación del anticuerpo está comprendida entre 10 y 500 mg por
dosis, preferiblemente es de 100 mg por dosis.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para aumentar la unión de anticuerpos
anti-Ep-CAM a células que expresan
Ep-CAM por medio de la
co-administración a un paciente de un agente
quimioterapéutico capaz de detener a las células en G_{2}/M junto
con dicho anticuerpo
anti-Ep-CAM.
Por medio de la
co-administración de un agente quimioterapéutico de
acuerdo con la presente invención junto con un anticuerpo contra
Ep-CAM es posible aumentar la unión del anticuerpo
en aproximadamente 2 a 10 veces, preferiblemente en más de 4 veces,
más preferiblemente en más de 6 veces y aún más preferiblemente en
más de 8 veces.
Figura
1
Ep-CAM se expresa a lo largo de
todo el ciclo celular, pero a mayor densidad y mayor homogeneidad en
células en fase S (línea de puntos) y en fase G_{2}/M (línea de
trazos) que en células G_{0}/G_{1} (línea continua). Este
patrón de expresión se ha documentado en varias líneas celulares
distintas de tumor de colon, de próstata y de pulmón humano.
Figura
2
La detención del ciclo celular es una
característica importante de células de adenocarcinoma expuestas
in vitro a Navelbine (NVB; 30 nM) más Cisplatino (CDDP; 5
\muM) o Taxol (TAX; 80 nM) más Carboplatino (CPBDA; 10 \muM),
en comparación con medio solo, 5-Fluorouracilo
(5FU), interferón-alfa (IFN-alfa;
100 U/,ml) o interferón-gamma
(IFN-gamma; 100 U/ml). El área de cada barra se
divide para indicar el porcentaje de células en fase
G_{0}/G_{1} y en fase S + G_{2}/M; la altura de cada barra
indica el número medio de moléculas de Ep-CAM por
célula dentro de la población. Las células en fase S y en fase
G_{2}/M expresan mayores niveles de Ep-CAM
(Figura 1), y los agentes que bloqueaban la progresión del ciclo
celular tenían una mayor expresión global de
Ep-CAM.
Figura
3
La expresión de antígeno Ep-CAM
se cuantificó en una diversidad de líneas celulares de
adenocarcinoma así como en cultivos primarios de células humanas
normales. Las células cultivadas se expusieron secuencialmente a
medio o a Navelbine 30 nM seguido de cisplatino 5 \muM (NVB +
CDDP) o a Taxol 80 nM seguido de Carboplatino 100 \muM (TAX +
CPBDA). Las 4 células de adenocarcinoma expresaban mayores niveles
de antígeno después de la exposición a combinaciones de fármaco con
especificidad de ciclo, mientras que las 4 células normales no
mostraron ningún aumento en la expresión de antígeno, que se mantuvo
a niveles indetectables en dos de las poblaciones de células
normales.
Figura
3a
La unión de Panorex, un anticuerpo monoclonal
murino relacionado con especificidad por el antígeno
Ep-CAM, se evaluó después de 15 minutos de
incubación con células de adenocarcinoma HT29 se que habían
cultivado con Navelbine más Cisplatino o con Taxol como se ha
descrito previamente. Se observó un aumento significativo (34%) en
la unión de anticuerpo en las células tratadas con Navelbine más
Cisplatino; un 82% de estas células se detuvieron en la fase del
ciclo S o G_{2}/M en comparación con un 21% de las células de
control. (Se observó un aumento menor (8%) en la unión de
anticuerpos para las células tratadas con Taxol, pero en este
experimento sólo el 57% de las células detuvieron su ciclo) como se
muestra en la Figura 3a.
Figura
4
La capacidad de células efectoras ADCC de sangre
periférica humana de lisar células tumorales diana incubadas con
323/A3 humanizado (IgG_{1}) (un anticuerpo monoclonal humanizado
que tiene especificidad por el antígeno Ep-CAM y
que es capaz de interaccionar con receptores Fc en células efectoras
humanas) in vitro era mejor cuando las células diana se
habían pre-tratado con NAVELBINE (30 nM) más
Cisplatino (5 \muM).
Figura
5
El tratamiento de ratones portadores de
xenoinjertos de tumores humanos con un agente citotóxico con
especificidad de ciclo celular mejoró la localización del anticuerpo
específico por Ep-CAM en los tumores.
Figura
6
Secuencia de Aminoácidos de Cadena Ligera Kappa
de 323/A3 Humanizado (IgG_{1})
Figura
7
Secuencia de Aminoácidos de Cadena Pesada de
323/A3 Humanizado (IgG_{1})
Figura
8
Vector Map de pEE6.
Figura
9
Vector Map de pEE12.
Figura
10
Vector Map de pEE18.
Figura
11
Secuencia de Aminoácidos de Cadena Ligera Kappa
de 323/A3 Humanizado (IgG_{4cys}).
Figura
12
Secuencia de Aminoácidos de Cadena Pesada
variante de 323/A3 Humanizado (IgG_{4cys}).
Figura
13
Secuencia de Aminoácidos de Cadena Ligera Kappa
de 323/A3 Humanizado (IgG_{2cys}).
Figura
14
Secuencia de Aminoácidos de Cadena Pesada de
323/A3 Humanizado (IgG_{2cys}).
Figura
15
Secuencia de ADNc de Cadena Ligera de 323/A3
Humanizado (IgG_{1}).
Figura
16
Secuencia de ADNc de Cadena Pesada de 323/A3
Humanizado (IgG_{1}).
Figura
17
Secuencia de ADNc de Cadena Pesada de 323/A3
Humanizado (IgG_{4}).
Figura
18
Secuencia de ADNc de Cadena Pesada de 323/A3
Humanizado (IgG_{2cys}).
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
En poblaciones de células de adenocarcinoma
prostático PC-3 se evaluó la distribución en las
fases G_{0}/G_{1}, S y G_{2}/M del ciclo celular así como la
expresión de Ep-CAM. Las células se tripsinizaron
suavemente y se separaron mecánicamente de los matraces de cultivo
y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato sin
calcio y magnesio que contenía albúmina de suero bovino y NaN_{3}.
Se tiñeron exactamente 2 x 10^{5} células con anticuerpo IgG
murino 323/A3 conjugado con FITC o IgG murina-FITC
(control). Las células se fijaron con paraformaldehído frío, y
después se permeabilizaron para la tinción del ADN con
Tween-20. El ADN celular se tiñó con yoduro de
propidio y RNasa A. Se adquirieron datos en forma de lista en un
citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry
Systems) equipado con un láser de 488 nm usando el software Cell
Fit. El análisis del ciclo celular se realizó usando modelado SOBR
(cuando fue posible, se emplearon estimaciones manuales) en Cell
Fit. La expresión del antígeno Ep-CAM detectada por
la unión de 323/A3 se evaluó por separado usando un análisis de
histograma en Win List (Verity Software House).
La Figura 1 demuestra que Ep-CAM
se expresa a lo largo del ciclo celular, pero a mayor densidad y
mayor homogeneidad en células en la fase S (línea de puntos) y en
la fase G_{2}/M (línea de trazos) que en las células
G_{0}/G_{1} (línea continua). Este patrón de expresión se ha
documentado en varias líneas celulares distintas de tumor de colon,
próstata y pulmón.
Se expusieron líneas de células de
adenocarcinoma a los diversos fármacos o combinaciones de fármacos
indicados en la Figura 2. Se expusieron células subconfluentes a
Navelbine o Taxol durante un período de hasta 24 horas, y después
se lavaron y se expusieron a Cisplatino o Carboplatino,
respectivamente, durante una noche. Las células se expusieron a 5FU
durante 24 horas y durante 2-5 días a los
interferones. Las células se lavaron y se cultivaron durante otros
2-5 días antes del análisis de la expresión de
antígeno y el estado del ciclo celular descrito en el Ejemplo 1. La
expresión de antígenos se cuantificó por comparación de la unión de
323/A3 conjugado con fluoresceína a células cultivadas con la unión
a patrones de microperlas calibrados.
El análisis del ciclo celular demostró que sólo
el 6,3% de las células de control del medio estaban en fase S y
G_{2}/M combinadas, en comparación con un 39,4% de NVB+CDDP y un
82,6% de células TAX + CPBDA, produciendo las dos combinaciones
aumentos significativos en la expresión del antígeno
Ep-CAM (como se demuestra en la Figura 2). La
expresión de antígeno no aumentó significativamente en las células
expuestas a 5FU, IFN-\alpha o
IFN-\gamma, que sólo tenían un 7,9%, 12% y 11,5%,
respectivamente, de células en fase S + G_{2}/M. De esta manera,
sólo los fármacos que produjeron acumulación de células en fase S o
G_{2}/M pudieron producir un aumento significativo en la
expresión del antígeno Ep-CAM.
Ejemplo
2a
La unión de Panorex, un anticuerpo monoclonal
murino relacionado con especificidad por el antígeno
Ep-CAM, se evaluó después de una incubación de 15
minutos con células de adenocarcinoma HT29 que se habían cultivo
con Navelbine más Cisplatino o con Taxol como se ha descrito
previamente. Se observó un aumento significativo (34%) en la unión
de anticuerpo en las células tratadas con Navelbine más Cisplatino;
el 82% de estas células se detuvieron en fase de ciclo S o
G_{2}/M en comparación con 21% de las células de control. (Se
observó un menor aumento (8%) en la unión de anticuerpo para las
células tratadas con Taxol, pero en este experimento sólo el 57% de
las células habían detenido su ciclo) como se muestra en la Figura
3a.
La expresión de antígeno Ep-CAM
se cuantificó en una diversidad de líneas celulares de
adenocarcinoma así como en cultivos primarios de células humanas
normales. Se expusieron células subconfluentes cultivadas
secuencialmente a medio o a Navelbine 30 nM seguido de Cisplatino 5
\muM (NVB + CDDP), o a Taxol 80 nM seguido de Carboplatino 100
\muM (TAX + CPBDA). Las células se lavaron con medio y se
cultivaron durante otros 2-5 días antes del
análisis de la expresión de antígeno como se describe en los
Ejemplos 1 y 2.
La Figura 3 demuestra claramente que las 4
células de adenocarcinoma expresaban mayores niveles de antígeno
después de la exposición a combinaciones de fármaco con
especificidad de ciclo, mientras que las 4 células normales no
mostraron ningún aumento en la expresión de antígeno, que se mantuvo
indetectable en 2 de las poblaciones celulares normales.
Se expusieron células de adenocarcinoma a
fármacos como se describe en los Ejemplos 1 y 2 anteriores y después
se recogieron y se sembraron en placas de 96 pocillos para uso como
células diana en un ensayo de citotoxicidad de liberación de
^{51}Cr. Las células diana se cultivaron durante una noche con
^{51}Cr y después se lavaron. Se añadieron células mononucleares
de sangre periférica humana que se habían dejado adherir durante una
noche a una relación de efector:diana de 50:1, y los cultivos de
ADCC se incubaron durante 6 horas. Se recogieron los sobrenadantes,
se contó la radiactividad y se calculó el porcentaje de liberación
específica (véase la Figura 4).
La Figura 4 demuestra claramente que las células
de adenocarcinoma de próstata PC-3 son mejores
dianas para la actividad ADCC humana después de la exposición a
Navelbine/Cisplatino en comparación con los controles que no se han
expuesto a estos agentes quimioterapéuticos. Este efecto puede
deberse directamente al aumento de la expresión de antígeno y, por
lo tanto, al aumento de la unión de anticuerpo, a la reducción de la
modulación del antígeno Ep-CAM, la mayor fragilidad
de las células diana o una combinación de los anteriores.
Se iniciaron tumores de adenocarcinoma de colon
humano (HT-29) por implantación subcutánea en
ratones desnudos CD-1 hembra (Charles River).
Cuando los tumores alcanzaron 200-300 mg, los
animales se dividieron en grupos de cinco. Se inyectó Navelbine por
vía intravenosa a una dosificación de 28 mg/kg los días 1 y 5. Un
grupo de control recibió 5-fluorouracilo
(F-FU) por vía intraperitoneal a 20 mg/kg los días 1
y 5. El día 6, 323/A3 humanizado IgG_{4cys-TMT}
(un conjugado de anticuerpo monoclonal
humanizado-quelante con especificidad por el
antígeno Ep-CAM) se marcó con
lutecio-177 y se inyectó por vía intravenosa a
través de la vena lateral de la cola. Cada ratón recibió 4,1 \mug
de proteína/2,09 \muCi de lutecio-177/0,2 ml de
inyección. Se recogieron sangre, bazo, hígado, pulmón, riñón, fémur
y tumor los días 1, 3 y 5 después de la administración de
anticuerpo para el recuento gamma directo (véanse los resultados en
la Figura 5).
La Figura 5 demuestra que el pretratamiento con
Navelbine aumenta la dirección de anticuerpo a tumores
Ep-CAM positivos mientras que el
pre-tratamiento con 5-FU no lo
hace.
Se obtuvieron por ingeniería genética los ADNc
que codificaban las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 323/A3
humanizado (véanse las Figuras 15 y 16 respectivamente) en un solo
plásmido de expresión de glutamina sintasa (GS) Celltech, pEE18
(véase la Figura 10) y se usaron para transfectar células NSO
murinas.
Se obtuvieron células NSO a partir de Celltech
Biologics plc, Slough, SL1 4EN, Berkshire, UK. Los plásmidos de
expresión pEE6HCMV y pEE12 (véanse las Figuras 8 y 9) se obtuvieron
en Celltech Biologics plc, Slough.
2.2 El plásmido pEE6hmcv (véase la Figura 8) que
codifica el ADN de cadena pesada humanizada de longitud completa se
digirió con Bam HI y Bgl II para liberar el fragmento
de 3,2 kb que contenía el ADN que codificaba la cadena pesada bajo
el control transcripcional del promotor temprano inmediato principal
del citomegalovirus humano. Este fragmento se clonó en el sitio
Bam HI de pEE12 (Figura 9) que contenía el ADN que codificaba
la cadena ligera humanizada. (Véase la secuencia de aminoácidos de
la cadena ligera Kappa de 323/A3 humanizado (IgG_{1}) en la
Figura 6 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 323/A3
humanizado (IgG_{1}) en la Figura 7). Véase en la Figura 10 la
representación esquemática del plásmido pEE18 que codifica las
cadenas pesada y ligera de 323/A3 (IgG_{1}).
Todas las actividades de cultivo celular
individuales se realizaron en salas aisladas que contenían una sola
campana de flujo laminar y un solo incubador especializado
únicamente en el uso de células NSO en la producción de líneas
celulares estables que secretaban 323/A3 humanizado (IgG_{1}).
Dentro de este medio no se usó ninguna otra línea celular NSO,
línea celular humana o línea celular transformada con virus. Se
revivió un vial de células NSO y se cultivó en medio 1:1:1
compuesto de DMEM:RPMI-1640:Sigma PFHM (1:1:1) a una
densidad celular comprendida entre 0,5 y 1 x 10^{6} ml. Para la
electroporación, las células se recogieron por centrifugación y se
lavaron una vez con PBS. El ADN del plásmido pEE18 que codificaba
323/A3 (IgG_{1}) se digirió con sal I, se inactivó con calor a
65ºC durante 15 minutos, se precipitó con etanol y se secó al aire.
El sedimento de ADN seco se resuspendió en PBS a una concentración
de 0,5 \mug/ml y se introdujeron alícuotas de 100 \mul en una
cubeta de electroporación de 2 ml (BTX). Se resuspendieron células
NSO lavadas a 1,2 x 10^{7}/ml y se añadieron 400 \mul a la
cubeta para dar una densidad final de 10^{6} ml en un volumen
final de 0,5 ml. La electroporación se realizó a 300 V durante 1
mseg en un GenePulser BTX 8209 seguido de incubación en hielo
durante 5-10 minutos. La mezcla de electroporación
se resuspendió a 10^{5} células/ml con medio 1:1:1 y se
distribuyó en placas de 96 pocillos a 50 \mul/pocillo. Al día
siguiente, en los pocillos se suministraron 150 \mul de medio GS
(IMDM sin Gin, 1 = X GS y suplemento de nucleósidos, 5% de DFBS)
para empezar el procedimiento de selección de GS de tal forma que
todos los pocillos tuvieran una concentración final de un 3% de
DFBS.
2.2.2.2 Las líneas celulares seleccionadas con
una velocidad de producción específica (SPR) cultivadas en medio GS
(3% de DFBS) se sembraron a una densidad de 0,2 x 10^{6}
células/ml en matraces T-25 (Costar) que contenían
5 ml de medio GS (3% de DFBS). Las células se incubaron durante una
noche a 37ºC durante 24 horas, después de lo cual se retiró una
alícuota de cada sobrenadante de cultivo. Los sobrenadantes se
usaron en el ensayo ELISA de IgG humana para determinar la
concentración de 323/A3 humanizado secretado (IgG_{1}). El valor
de SPR se obtuvo multiplicando la concentración de anticuerpo 323/A3
(IgG_{1}) en el sobrenadante por el volumen (5,0) y se expresa
como \mug/10^{6} células/24 horas.
Las líneas celulares seleccionadas se recogieron
rutinariamente cuando la densidad celular era mayor de 0,2 x
10^{6} células/ml. Se retiró un volumen apropiado de células y se
sometió a centrifugación a 1000 x g durante 5 minutos a 22ºC. El
sedimento celular se resuspendió suavemente a 1-4 x
10^{6} células/ml con medio de congelación enfriado con hielo que
constaba de un 20% (v/v) de FBS/10% (v/v) de Medio DMSO/GS (filtrado
de forma estéril). Cada 1,0 ml de la suspensión celular se
introdujo como una alícuota en un vial de crioconservación de 1,8
ml (NUNC) y se congeló gradualmente durante una noche en un
recipiente de congelación Cryo a 1ºC (Nalgene) que se había puesto
en un congelador de -70ºC. Los viales después se retiraron del
recipiente y se almacenaron en la fase de vapor de un congelador de
nitrógeno líquido.
Veinte viales de cada línea celular, incluyendo
un productor de 323/A3 humanizado (IgG_{1}) se congelaron como se
ha descrito anteriormente y se almacenaron inicialmente en la fase
de vapor de un congelador de nitrógeno líquido MVE Cryogenics
XLC440. Las células posteriormente se transfirieron y se almacenaron
en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido MVE
Cryogenics XLC500.
Los ADNc que codifican las cadenas ligera y
pesada del anticuerpo humanizado 323/A3 (IgG_{4cys}) (un
anticuerpo 323/A3 humanizado) (véanse las Figuras 15 y 17) se
introdujeron por ingeniería genética en un solo plásmido de
expresión de glutamina sintetasa (GS) Celltech, pEE18, y se usaron
para transfectar células NSO murinas.
2.2 Creación del plásmido de expresión pEE18 de
323/A3 humanizado (IgG_{4cys}). El plásmido pEE6HMCV (véase la
Figura 8) que codifica el ADN de cadena pesada humanizada de
longitud completa se digirió con Bam HI y Bgl II para
liberar un fragmento de 3,2 kb que contenía el ADN que codificaba la
cadena pesada bajo el control transcripcional del promotor temprano
inmediato principal del citomegalovirus humano. Este fragmento se
clonó en el sitio Bam HI de pEE12 que contenía el ADN que
codificaba la cadena ligera humanizada (véase la secuencia de
aminoácidos de cadena ligera Kappa de 323/A3 humanizado (IgG_{4})
en la Figura 11 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada
variante de 323/A3 (IgG_{4cys}) en la Figura 12). Véase la Figura
10 la representación esquemática del plásmido pEE18 que codifica
las cadenas pesada y ligera de 323/A3.
2.2.2 Transfección y selección de células NSO:
véase el Ejemplo 6 anterior.
Los ADNc que codifican las cadenas pesada y
ligera del anticuerpo 323/A3 humanizado (IgG_{2cys}) se
introdujeron por ingeniería genética en un solo plásmido de
expresión de glutamina sintasa (GS) Celltech, pEE18, y se usaron
para transfectar células NSO murinas.
2.1 Materiales como en los Ejemplos 6 y 7
anteriores.
El plásmido pEEE6 hcmv que codifica el ADN de
cadena pesada humanizado de longitud completa se digirió con Bam
HI y Bgl II para liberar un fragmento de 3,2 kb que
contenía el ADN que codificaba la cadena pesada bajo el control
transcripcional del promotor temprano inmediato principal del
citomegalovirus humano. Este fragmento se clonó en el sitio Bam
II de pEE12 que contenía el ADN que codificaba la cadena ligera
humanizada (véase la Secuencia de Aminoácidos de Cadena Ligera
Kappa de 323/A3 (IgG_{2cys}) en la Figura 13 y la Secuencia de
Aminoácidos de Cadena Pesada de 323/A3 (IgG_{2cys}) en la Figura
14). Véase en la Figura 10 la representación esquemática del
plásmido pEE18 que codifica cadenas pesada y ligera de 323/A3
(IgG_{2cys}).
2.2.2 Transfección y Selección de células NSO -
Véase los Ejemplos 6 y 7 anteriores.
<110> Glaxo Group Limited
\hskip1cmKnick, Vincent C
\hskip1cmStimmel, Julie B
\hskip1cmThurmond, Linda M
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Combinación de anticuerpo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PU3513
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9816280.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
27-07-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 740
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(740)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Secuencia sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Secuencia sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 740
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1418
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(1418)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Secuencia sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<400> 16
Claims (5)
1. Un kit de partes de un anticuerpo
anti-Ep-CAM con uno o más agentes
quimioterapéuticos que es capaz de detener a las células que
expresan el antígeno Ep-CAM en S o G_{2}/M,
seleccionándose dicho agente quimioterapéutico entre el grupo
constituido por:
capecitabina, camptotecina, oxaliplatino,
paclitaxel, docetaxel, ciclofosfamida, metotrexato, vinorelbina,
epirrubicina, mitoxantrona, tomudex, cisplatino, carboplatino,
gemcitabina, etopósido y topotecan.
2. El kit de la reivindicación 1, donde el
anticuerpo es Panorex.
3. El kit de la reivindicación 1 ó 2, en el que
el agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo constituido
por camptotecina, Oxaliplatino, Capecitabina, tomudex.
4. Un kit de acuerdo con la reivindicación 1
para uso en el tratamiento de tumores de próstata, pulmón, mama,
gástrico o colon.
5. Uso de un anticuerpo
anti-Ep-CAM y uno o más agentes
quimioterapéuticos capaces de detener a las células que expresan el
antígeno Ep-CAM en la fase S o G_{2}/M
seleccionados entre el grupo constituido por: capecitibina,
camptotecina, oxaliplatino, paclitaxel, docetaxel, ciclofosfamida,
metotrexato, vinorelbina, epirubicina, mitoxantrona, tomudex,
cisplatino, carboplatino, gemcitabina, etopósido y topotecan en la
fabricación de un kit de partes para el tratamiento de cánceres que
expresan antígeno Ep-CAM.
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