KR101940430B1

KR101940430B1 - Il-18과 분자 표적 항체를 병용하는 암 치료약

Info

Publication number: KR101940430B1
Application number: KR1020177006235A
Authority: KR
Inventors: 하루키 오카무라; 쿄스케 야마니시; 웬 리
Original assignee: 가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠
Priority date: 2014-08-07
Filing date: 2015-08-07
Publication date: 2019-01-18
Also published as: KR20170038923A; EP3178484B1; WO2016021720A1; JP6245622B2; CN106687124A; JPWO2016021720A1; US20170224791A1; AU2015300006B2; EP3178484A1; CN106687124B; AU2015300006A1; CA2957387A1; EP3178484A4; US11219672B2; NZ729395A

Abstract

본 발명에 관련된 암 치료약은, IL-18과, 항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체를 유효 성분으로서 함유한다.

Description

IL-18과 분자 표적 항체를 병용하는 암 치료약 {THERAPEUTIC AGENT FOR CANCER WHICH COMPRISES COMBINATION OF IL-18 AND MOLECULE-TARGETING ANTIBODY}

본 발명은 인터루킨 18(이하, "IL-18"이라고 한다)과 분자 표적 항체를 병용하는 암 치료약에 관한 것이다. 보다 상세하게는, IL-18과 분자 표적 항체를 함유함으로써, 상승적(相乘的)인 우수한 항종양 효과를 나타낼 수 있으며, 또한 부작용이 적은 암 치료약에 관한 것이다.

종양의 복막 파종은 위암, 대장암, 난소암 등에 수반하여 발생하고, 수술에 의해서 종양을 절제한 경우에서도 발증하는 경우가 있어, 치료가 매우 곤란하다는 것이 알려져 있다. 복막 파종의 치료에는, 종래, 화학 요법제에 의한 치료, 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF)를 표적으로 하는 치료, 비스포스폰산을 사용하는 증감작용요법 등이 시도되고 있다.

또한, 최근, 면역 반응 및/또는 염증 반응을 억제하는 림프구(regulatory cells) 및 마크로파지에 발현되는 항원인 CTLA-4 항원 또는 PD-1/PD-L1 항원을 표적으로 하여, 상기 림프구(억제성 림프구)를 감소시키는 항체가 임상에 있어서 실용화되기 시작하고 있다(특허문헌 1, 2).

상기 항체는 상기 억제성 림프구를 감소시키는 한편, CD28이나 NKG2D 등을 발현하는 이펙터 림프구를 증강시켜, 이펙터 림프구에 의한 종양 세포의 배제 또는 병원체 감염 세포의 배제를 실시한다.

이와 같이, 상기 항체를 사용한 치료는, 자연 면역 및 획득 면역을 활성화하여, 종양 세포를 파괴하는 림프구(이펙터 림프구 또는 이펙터 세포라고도 한다)를 지속적으로 늘려, 종양으로의 유주성(遊走性)을 높이는 것에 의해서 종양의 퇴축이나 소멸을 목표로 하는 것이다. 그리고, 상기 항체는 종래 치료법에서는 치료 곤란하였던 흑색종 등의 악성 종양에 대하여 유효한 것이 증명되어, 그 유효성의 증대와, 다수의 종양에 대한 적용의 확대가 기대되고 있다.

또한, GM-CSF, IL-15 및 항 CTLA-4 항체를 사용하여 항종양 효과를 확인하는 시도도 행해지고 있다(비특허문헌 1). 그리고, IL-18과, 리툭시맙 또는 HERCEPTIN(등록 상표)과의 조합이 단일제를 사용한 경우보다 우수한 치료 효과를 나타내는 것이 개시되어 있다(특허문헌 3). 또한, 소정의 화학식으로 나타내는 화합물, 하나 이상의 분자 표적 항체, 및 면역 자극 화합물을 조합한 조성물을 사용하여 암 면역 치료를 실시하는 것도 개시되어 있다(특허문헌 4).

특허문헌 1: 국제 공개 공보WO2004/004771호(2004년 1월 15일 공개) 특허문헌 2: 일본 공표특허공보 특표2004-512005호(2004년 4월 22일 공표) 특허문헌 3: 일본 공표특허공보 특표2010-52239호(2010년 7월 1일 공표) 특허문헌 4: 일본 공표특허공보 특표2008-539249호(2008년 11월 13일 공표)

비특허문헌 1: Fong L. et. al., Cancer Res, 2009, 69: 609-615.

그러나, 상기 특허문헌 1, 2에 개시된 항체를 사용한 경우의 치료 효과는 아직 개량의 여지가 있는 것으로 생각된다. 나아가서는, 상기 억제성 림프구를 감소시키고, 이펙터 림프구를 증강시킨 결과, 자기면역 질환의 발증 등의 부작용이 생길 수 있다는 문제도 있다. 요컨대, 특허문헌 1, 2에 개시된 기술에는, 치료 효과를 높이고, 또한 부작용을 경감시킨다는 관점에서 개량의 여지가 남겨져 있다고 할 수 있다.

또한, 상기 비특허문헌 1에 개시된 방법은, 약제의 투여량이 매우 많아, 현실적인 방법이 아니라는 문제가 있다.

특허문헌 3은, IL-18과, 리툭시맙 또는 HERCEPTIN(등록 상표)을 동시 또는 축차적으로 환자에게 개별 투여하여, 단일제보다도 조합한 쪽이 치료 효과가 우수했던 것을 개시한다. 또한, 특허문헌 4는, 소정의 화학식으로 나타내는 특정 화합물 및 하나 이상의 분자 표적 항체(리툭시맙, HERCEPTIN(등록 상표) 등)에 면역 증강제를 추가함으로써 면역 반응이 증대될 수 있는 것을 개시한다. 또한, "분자 표적 항체"란, 림프구의 기능에 관여하는 표면 항원이나 암 세포의 표면 항원을 인식할 수 있는 항체를 말한다.

그러나, 특허문헌 3, 4에서 사용되고 있는 항체 이외의 다른 항체를 사용한 경우에 어떠한 효과가 얻어지는가 하는 것, 및 부작용의 정도에 대해서는 분명하지 않다. 따라서, 치료 효과를 높이고, 또한 부작용을 경감시킬 수 있는 암 치료약을 제공하는 것에 관하여, 특허문헌 3 및 4는 아직 충분한 지견을 제공하는 것이 아니라고 말할 수 있다.

본 발명은 상기 종래의 문제점을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, IL-18과 소정의 항체를 함유함으로써 우수한 항종양 효과를 나타낼 수 있고, 부작용을 경감시킬 수 있는 신규 암 치료약을 제공하는 것에 있다.

본 발명자는, 치료 효과를 높이고, 또한 부작용을 경감시킬 수 있는 암 치료약에 대해서 예의 검토하였다. 그 결과, IL-18을, 항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체와 병용함으로써 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 도달하였다.

즉, 상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에 관련된 암 치료약은, IL-18과, 항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약은, IL-18과, 항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체를 유효 성분으로서 함유하기 때문에, 상기 항체에 의한 항종양 효과를 현저히 향상시킬 수 있다. 그 결과, 치료 효과가 높고, 또한 부작용이 적은 암 치료약을 제공할 수 있다는 효과를 나타낸다.

도 1은 CT-26 세포를 이식한 날의 3일후부터 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약을 투여했을 때의 효과를 마우스의 생존율로서 관찰한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 항 CTLA-4 항체 및 IL-18의 용량 효과를 실시예 1과 동일하게, CT-26 세포를 복강내 투여한 마우스의 생존율로서 나타내는 도이다.
도 3은 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약의 효과를 실시예 1과 동일하게, 마우스의 생존율로서 나타내는 도이다.
도 4는 CT-26 세포를 이식한 날로부터 7일 후에, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약 등을 투여하고, 그 후, 4일마다 합계 4회 투여한 경우의 효과를 마우스의 생존율로서 나타내는 도이다.
도 5는 CT-26 세포를 이식한 날로부터 14일 후에, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약 등을 투여한 경우의 효과를 마우스의 생존율로서 나타내는 도이다.
도 6은 CT-26 세포를 이식한 날의 3일 후에 항 CTLA-4 항체 및 IL-18; 항 PD-L1 항체 및 IL-18; 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 각각 투여한 마우스의 4일간의 복강 삼출 세포(PEC)수(數)의 변화를 나타내는 도이다.
도 7은 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체; 항 CTLA-4 항체 및 IL-18; 항 PD-L1 항체 및 IL-18; 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 각각 암 치료약으로서 투여한 4일 후에, 재차 이들 암 치료약을 각각 투여한 마우스의 PEC 수의 변화를 나타내는 도이다.
도 8은 종양을 가진 마우스에게 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체, 및 IL-18에 의해서 유도된 PEC를 양자 세포 이입한 경우의 연명 효과를 나타내는 도이다.
도 9는 항 PD-L1 항체; IL-18; 항 PD-L1 항체 및 IL-18; 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체; 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 마우스에게 복강내 투여함으로써 유도된 PEC의, B220(CD45R), NKG2D, 및 DX5(CD49b)의 발현 강도를 검토한 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체, 또는, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 마우스에게 복강내 투여함으로써 유도된 PEC의, B220(CD45R), NKG2D 및 DX5(CD49b)의 발현 강도를 검토한 결과를 나타내는 도이다.
도 11은 본 발명에 관련된 치료약이, CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 수를 감소시키는 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 12는 내츄럴킬러(NK) 세포를 파괴하여 제거하는 항아시알로 GM1 항체가, 본 발명에 관련된 치료약을 투여한 마우스의 생존율에 미치는 영향을 나타내는 도이다.
도 13은 항아시알로 GM1 항체의 투여의 유무에 의한, 마우스 유래 PEC의 해석 결과의 차이를 나타내는 도이다.
도 14는 항아시알로 GM1 항체의 투여의 유무에 의한, 마우스 유래 PEC에 있어서의 표면 마커의 해석 결과의 차이를 나타내는 도이다.
도 15는 항아시알로 GM1 항체의 투여의 유무에 의한, 마우스 유래 PEC에 있어서의 CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 T 세포의 발현 강도, 및, CD25 양성 T 세포의 세포수를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 16은 CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일 후에 있어서의, 대조 또는 치료약을 투여한 각 군의 마우스에 관해서, 복수(腹水)의 유무를 나타내는 외관 사진이다.
도 17은 대조 또는 치료약을 투여한 각 군의 마우스의 복위(腹圍)의 변화를 나타내는 도이다.
도 18은 대조 또는 치료약을 투여한 각 군의 마우스의 체중의 변화를 나타내는 도이다.
도 19는 대조와, 항 CTLA-4 항체를 투여한 마우스에 관해서, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 복강의 상태를 나타내는 도이다.
도 20은 대조와, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스에 관해서, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 복강의 상태를 나타내는 도이다.
도 21은 대조 마우스의, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 소장의 외관을 나타내는 도이다.
도 22는 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스의, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 소장의 외관을 나타내는 도이다.
도 23은 대조와, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스에 관해서, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 십이지장, 소장, 대장의 일부분의 외관을 나타내는 도이다.
도 24는 실시예 16에 있어서의 CT-26 세포의 이식과, 치료약의 투여 스케줄을 나타내는 도이다.
도 25는 실시예 16에 있어서 혈액 중의 알부민 농도(도 25의 (a)), 총 빌리루빈 농도(도 25의 (b)), AST(GOT) 농도(도 25의 (c)) 및 ALT(GPT) 농도(도 25의 (d))를 측정한 결과를 나타내는 도이다.
도 26은 실시예 16에 있어서 혈액 중의 LD(LDH) 농도(도 26의 (a)), 크레아티닌 농도(도 26의 (b)), ALP 농도(도 26의 (c)), 및 요산 농도(도 26의 (d))를 측정한 결과를 나타내는 도이다.
도 27은 실시예 16에 있어서 혈액 중의 요소질소 농도를 측정한 결과를 나타내는 도이다.
도 28은 실시예 16에 있어서의 군 1 내지 군 4의 마우스의 간장의, 헤마톡실린 에오진(HE)에 의한 조직 염색 결과를 나타내는 도이다.
도 29는 실시예 16에 있어서의 군 1 내지 군 4의 마우스의 위의, 헤마톡실린 에오진(HE)에 의한 조직 염색 결과를 나타내는 도이다.
도 30은 실시예 16에 있어서의 군 1 내지 군 4의 마우스의 위의, 헤마톡실린 에오진(HE)에 의한 조직 염색 결과를 나타내는 도이다.
도 31은 실시예 16에 있어서의 군 1 내지 군 4의 마우스의 십이지장의, 헤마톡실린 에오진(HE)에 의한 조직 염색 결과를 나타내는 도이다.
도 32는 실시예 16에 있어서의 군 1 내지 군 4의 마우스의 소장의, 헤마톡실린 에오진(HE)에 의한 조직 염색 결과를 나타내는 도이다.
도 33은 실시예 16에 있어서의 군 1 내지 군 4의 마우스의 대장의, 헤마톡실린 에오진(HE)에 의한 조직 염색 결과를 나타내는 도이다.
도 34는 실시예 16에 있어서의 군 1 내지 군 4의 마우스의 신장의, 헤마톡실린 에오진(HE)에 의한 조직 염색 결과를 나타내는 도이다.
도 35는 실시예 17에 있어서의 B16 흑색종 세포의 이식과, 치료약의 투여 스케줄을 나타내는 도이다.
도 36은 실시예 17에 있어서의 군 1의 마우스의 폐에 생긴 소결절을 관찰한 결과를 나타내는 도이다.
도 37은 실시예 17에 있어서의 군 2의 마우스의 폐에 생긴 소결절을 관찰한 결과를 나타내는 도이다.
도 38은 실시예 17에 있어서의 군 3의 마우스의 폐에 생긴 소결절을 관찰한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명의 실시형태에 관해서 상세히 설명한다. 범위를 나타내는, 예를 들어 "A 내지 B"와 같은 기재는, A 이상 B 이하인 것을 나타낸다. 또한, 본 명세서 중에 기재된 특허문헌 및 비특허문헌 모두가, 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.

〔실시형태 1: 본 발명에 관련된 암 치료약〕

(1) 유효 성분

IL-18은, IFN-γ의 유도 인자로서 오카무라 등에 의해서 1995년에 발견되어(Okamura et. al, Nature, 378:88-91, 1995), 최근 여러 가지 생물학적 작용을 갖는 것이 밝혀져 있는 사이토카인이다.

IL-18은, 영양 결핍, 산소 부족, 자외선 등의 스트레스에 의한 소포체 스트레스 응답의 결과, 인플라마솜(단백질의 복합체로서, NLRP3, ASC, 카스파제-1 등을 함유한다)이 활성화되고, 당해 인플라마솜에 의해서 카스파제-1이 활성화되어, 당해 카스파제-1에 의해서 pro-IL-18이 프로세싱되어, 활성형의 IL-18로 변화함으로써 생성된다.

그리고, IL-18은, 항원이나 사이토카인에 의해서 활성화된 CD8 양성 T 세포, 내츄럴킬러 세포(이하, NK 세포라고 한다), γδT 세포 등의 이펙터 세포에 작용하여, 이들 세포의 수를 현저히 증가시킬 수 있는 것과 동시에, 이들 세포의 사멸을 억제하고, 생존, 분화를 촉진하는 것이 알려져 있다(예를 들어, Li Wen et. al, J. Leukoc. Biol., 82, 142-151, 2007.).

IL-18로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 특허문헌 3에 기재되어 있는 인간 IL-18 폴리펩티드(서열번호 1), 마우스 IL-18 폴리펩티드(서열번호 2) 등을 사용할 수 있다. 인간 IL-18과 마우스 IL-18 사이의 아미노산 배열의 상동성은 65％이다. 인간 IL-18 폴리펩티드에 관해서는, 특허문헌 3에 기재되어 있는 바와 같이, EP0692536A2, EP0712931A2, EP0767178A1및 WO97/2441 등에 개시되어 있다. 또한, 이하, 본 명세서에서는, IL-18 폴리펩티드를 간단히 "IL-18"이라고 부른다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 바와 같이, 상기 인간 IL-18은, 대장균 비병원성 세포주에 있어서 발현되는 인간 IL-18의 재조합 성숙 형태이다. 마우스 및 인간의 IL-18cDNA는, 192 아미노산 및 193 아미노산으로 이루어지는 전구체 단백질(각각, 서열번호 2 및 1)을 코딩한다.

IL-18은, 황산암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피법, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피법, 소수성 상호 작용 크로마토그래피법, 어피니티 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피법, 및 고속 액체 크로마토그래피 등의 공지된 방법에 의해, 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다.

세포내의 합성, 단리, 및/또는 정제시에 IL-18가 변성되는 경우에는, 단백질의 리폴딩에 관한 잘 알려진 기법을 사용하여, 활성인 입체 배좌를 재생할 수 있다. 활성형의 인간 IL-18을 정제 및 제작하는 방법은, WO01/098455에 개시되어 있다. IL-18은 시판품을 사용해도 상관없다.

본원 발명에 관련된 암 치료약은, 항체로서, 항 PD-L1 항체, 항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체를 함유한다.

항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체에 관해서는, 특허문헌 1에 상세히 기술되어 있다. 특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 인간 PD-1cDNA는 EMBL/GenBank Acc.No.NM_005018에 나타내는 염기 서열로 구성되고, 마우스 PD-1cDNA는 Acc.No.X67914에 나타내는 염기 서열로 구성되며, 그들의 발현은, 흉선 세포에 있어서는 CD4^－CD8^－로부터 CD4^＋CD8^＋ 세포로 분화될 때에 확인된다(Int. Immunol., 1996년, 제18권, 제5호, p.773 내지 780, J. Exp. Med. 2000년, 제191권, 제5호, p.891 내지 898).

또한, 말초에 있어서의 PD-1의 발현은, 항원 리셉터로부터의 자극에 의해 활성화된 T 세포, B 세포 (Int. Immunol., 1996년, 제18권, 제5호, p.765 내지 772) 또는 활성화 마크로파지를 포함하는 골수 세포에서 확인되었음이 보고되었다. 또한, PD-1은, 항원 리셉터(TCR) 시그널을 억제하는 시그널을 전달하고 있는 것도 알려져 있다.

PD-L1은 PD-1의 리간드로, 종양 세포 외에 활성화된 단구(單球)나 수상 세포 등의 이른바 항원 제시 세포에서 발현된다(J. Exp. Med. 2000년, 제191권, 제7호, p.1027 내지 1034). 특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 인간 PD-L1cDNA는, EMBL/GenBank Acc.No.AF233516, 마우스 PD-L1cDNA는 NM_021893으로 나타내는 염기 서열로 구성된다.

이들 세포는, T 림프구 세포에 대하여 여러 가지 면역 유도 시그널을 유도하는 상호 작용 분자를 제시하고 있고, PD-L1은, PD-1에 의한 억제 시그널을 유도하는 분자의 하나이다.

특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, PD-L2는 PD-1의 2번째 리간드로서 동정되었는데, 그 발현 및 기능은 PD-L1과 거의 동일하다는 것이 보고되어 있다. 또한, 인간 PD-L2cDNA는 EMBL/GenBank Acc.No.NM_025239, 마우스 PD-L2cDNA는 NM_021896으로 나타내는 염기 서열로 구성된다(Nature Immunology, 2001년, 제2권, 제3호, p.261 내지 267).

PD-1로 대표되는 공액(共役) 억제 분자로부터의 억제 시그널은, 항원 리셉터(TCR) 및 공액 자극 분자에 의한 적극적인 시그널을 적정하게 제어하는 메카니즘에 의해서, 림프구 발생 또는 성숙 과정에서의 면역 관용 또는 자기 항원에 대한 비정상적인 면역 반응을 제어하고 있는 것으로 생각되고 있다.

항 CTLA-4 항체에 관해서는, 예를 들어 일본 공개특허공보 2007-277242호에 기재되어 있다. CTLA-4란, 세포 상해성 T 림프구 관련 항원 4(CD152)를 말한다. 일본 공개특허공보 2007-277242호에 기재되어 있는 바와 같이, CTLA-4가 그 천연의 리간드인 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86)과 결합하면, 부(負)의 제어 시그널이 T 세포에 송달되고, 이 부의 제어 시그널을 차단하면 동물 모델에서 T 세포의 면역 기능 및 항종양 활성이 항진된다(Thompson 및 Allison, Immunity, 7, 445 내지 450페이지(1997); McCoy 및 LeGros, Immunol. & Cell Biol.77: 1 내지 10페이지(1999)).

항체를 사용하여 CTLA-4의 부의 제어 시그널을 차단하면, T 세포가 매개하는 종양의 사멸이 항진하여, 항종양성 면역을 유도할 수 있음이 개시되어 있다(예를 들어, Leach 등, Science 271:1734 내지 1736페이지(1996) 등). 인간 CTLA-4의 완전한 배열은 GenBank Accession Number L15006에 기재되어 있다.

CD25는, 분자량 55kDa의 단쇄 당단백으로, 성인 T 세포성 백혈병 세포의 표면 항원으로서 알려져 있다. CD33은, 급성 골수성 백혈병 세포의 표면 항원으로서 알려져 있고, CD52는, B 세포성 만성 림프성 백혈병 세포의 표면 항원으로서 알려져 있다.

항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체, 항 CD52 항체는 각각, PD-L1, PD-1, PD-L2, CTLA-4, CD25, CD33, CD52에 의한 면역 억제 시그널을 저해하는 것이면, 인간 유래 항체, 마우스 유래 항체, 래트 유래 항체, 토끼 유래 항체 또는 염소 유래 항체 등의 어느 항체여도 되고, 또한 그들의 폴리클로날 혹은 모노클로날 항체, 완전형 혹은 단축형(예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab 또는 Fv 단편. 이들을 이하, "항체 단편"이라고도 한다.) 항체, 키메라화 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간형 항체 중 어느 것이라도 상관없다.

이들 항체는, PD-L1, PD-1, PD-L2, CTLA-4, CD25, CD33 또는 CD52의 세포외 영역의 부분 단백질을 항원으로 하여, 공지된 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라서 제조할 수 있다. 세포외 영역의 부분 단백질은, 공지된 단백질 발현 및 정제법에 의해서 조제할 수 있다.

폴리클로날 항체는 공지된 방법에 의해서 제조할 수 있다. 예를 들어, 항원 단백질, 또는 항원 단백질과 캐리어 단백질의 혼합물로 적당한 동물에게 면역을 실시하고, 그 면역 동물로부터 항원 단백질에 대한 항체 함유물을 채취하여, 항체의 분리 정제를 실시함으로써 제조할 수 있다.

사용되는 동물로는, 마우스, 래트, 양, 염소, 토끼, 및 모르모트를 일반적으로 들 수 있다. 항체 생성능을 높이기 위해서, 완전 프로인트 아쥬반트나 불완전 프로인트 아쥬반트를 항원 단백질과 함께 투여할 수 있다. 투여는, 통상 약 2주마다 1회씩, 합계 약 3 내지 10회 정도 실시하는 것이 일반적이다.

폴리클로날 항체는, 상기 방법으로 면역된 동물의 혈액, 복수 등으로부터 채취할 수 있다. 항혈청 중의 폴리클로날 항체가(價)는, ELISA 법에 의해서 측정할 수 있다.

폴리클로날 항체의 분리 정제는, 예를 들어, 항원 결합 고상, 프로테인 A 또는 프로테인 G 등의 활성 흡착제를 사용한 정제법, 염석법, 알코올 침전법, 등전점 침전법, 전기 영동법, 이온 교환체에 의한 흡탈착법, 초원심법, 겔 여과법 등의 면역 글로불린의 분리 정제법에 따라서 실시할 수 있다.

상기 항체로는, 모노클로날 항체 또는 그 수식체(修飾體)를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 항원으로 면역된 동물로부터 항체가가 확인된 개체를 선택하여, 최종 면역의 2 내지 5일 후에 비장 또는 림프절을 채취하고, 그들에 포함되는 항체 생성 세포를 동종 또는 이종 동물의 골수종 세포와 융합시켜, 계대 배양 가능한 모노클로날 항체 생성 하이브리도마를 제작함으로써, 모노클로날 항체 생성 세포를 제작할 수 있다.

항원 단백질은, 항체 생성이 가능한 부위에 그 자체를 단독으로, 또는 담체, 희석제와 함께 투여한다. 이 때, 항체 생성능을 높이기 위해서 완전 프로인트 아쥬반트나 불완전 프로인트 아쥬반트를 투여하는 것이 일반적이다.

또한, "DNA 면역"이라고 불리는 방법에 의해서도 동물을 면역할 수 있다. 이 방법은, 면역 동물의 뒷다리 전경골근에 카디오톡신(Cardiotoxin)을 처치하고, 또 항원 단백질을 발현하는 벡터를 도입한 후, 조직 수복의 과정에서 벡터가 근세포안으로 들어가, 단백질을 발현하는 현상을 이용한 방법이다(Nature Immunology, 2001년, 제2권, 제3호, p.261 내지 267).

면역되는 동물로는, 마우스, 래트, 양, 염소, 토끼 또는 모르모트를 사용하는 것이 가능한데, 바람직하게는 마우스 또는 래트가 사용된다. 융합 조작은, 콜러와 밀스타인의 방법(Nature, 1975년, 제256권, 제5517호, p.495 내지 497)으로 실시할 수 있고, 융합 촉진제로는, 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 센다이바이러스 등이 사용된다. 골수종 세포로는, P3U1, NS1, SP2/0, 및, AP1 등의 골수종 세포를 들 수 있는데, 통상은 P3U1가 자주 이용된다.

모노클로날 항체 생성 세포의 선별은 특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 항원 단백질을 직접 또는 담체와 함께 흡착시킨 고상에 하이브리도마 배양 상청을 첨가하는 것에 의한 ELISA 법 등에 의해서 검출하여 실시할 수 있다. 또한, 하이브리도마 배양 상청의 항체가는, ELISA 법에 의해서 측정할 수 있다. 모노클로날 항체의 분리 정제는, 상기 폴리클로날 항체의 분리 정제와 동일한 면역 글로불린의 분리 정제법에 따라서 실시할 수 있다.

상기 하이브리도마로는, 상기 항체를 제조하기 위해서 통상적으로 사용되는 공지된 하이브리도마를 사용하면 된다. 예를 들어, 항 PD-L1 항체 또는 항 PD-1 항체를 제조하는 경우라면, 특허문헌 1에 개시된 하이브리도마를 사용할 수 있다.

상기 항체 단편은, 프로테아제 효소에 의해 항체를 처리하고, 경우에 따라서 환원하여 얻을 수 있다. F(ab')2 항체 단편은, 정제된 모노클로날 항체를 펩신으로 완전히 소화하여, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 어피니티 크로마토그래피 중 어느 공지된 방법에 의해 정제할 수 있다. Fab' 항체 단편은, 조제한 F(ab')2를 2-메르캅토에틸아민으로 부분 환원함으로써 제작할 수 있다. 또한, Fab 항체 단편는, 시스테인 존재하에서 소화 효소 파파인에 의해서 직접 소화하여, 정제하여 제작할 수 있다.

scFv 항체는, 예를 들어 조스트 등의 방법(J. Biol. Chem., 1994년, 제269권, 제42호, p.26267 내지 26273)에 의해서 조제할 수 있다.

인간 이외의 포유동물에게 면역하여 제작된 비인간 항체의 일부를 인간 항체의 일부에 치환함으로써, 상기 인간화 항체를 제작할 수 있다. 구체적으로는, 인간 항체의 정상 영역을 코딩하는 유전자와 비인간 항체의 가변 영역을 코딩하는 유전자의 키메라를 구축함으로써, 인간화 항체를 제작할 수 있음이 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 1987년, 제84권, p.3439 내지 3443, J. Immunol., 1987년, 제139권, 제1호, p.3521).

인간 항체의 정상 영역의 DNA 서열은 문헌에 기재되어 있으며, 당해 정상 영역의 유전자는 기존의 클론으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 계속해서, 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 인간 항체의 정상 영역의 서열에 융합시킨다. 인간 항체의 정상 영역의 아이소타입은 원하는 이펙터 기능 또는 항체 의존성 세포성 세포 독성(즉 항체 의존성 세포 상해)에 있어서의 활성에 의해서 선택할 수 있다. 바람직한 아이소타입은 IgG1, IgG3 및 IgG4이다. 또한, 인간 경쇄 정상 영역, κ사슬 또는 λ사슬 중 어느 것이나 사용할 수 있다. 이 인간화 키메라 항체는 통상적인 방법에 의해서 발현시킬 수 있다.

완전 인간형 항체는, 인간 면역 글로불린의 정상 영역 유전자가 도입된 마우스(제노마우스(Chemical Biology, 2000년, 제7권, 제8호, p.R 185-6)) 등을 이용하여 제작할 수 있고, 또한 상기 마우스로부터 단리된 항체 생성 림프구를 하이브리도마로 하여, 원하는 항체를 양산시킬 수 있다. 또한, 완전 인간형 항체는, 파지·디스플레이법(FEBS Letter, 1998년, 제441권, p.20-24)에 의해서도 제작할 수 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약은, (i) IL-18과, (ii) 항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체를 유효 성분으로서 함유한다. 상기 "1 이상의 항체"는, 상기 군에서 선택되는 항체라면 여러 가지를 사용해도 된다.

그 중에서도, 본 발명에 관련된 암 치료약에는, 암 치료약으로서 실적을 갖는 항 PD-L1 항체 및/또는 항 CTLA-4 항체가 함유되어 있는 것이 바람직하고, IL-18과, 항 PD-L1 항체와, 항 CTLA-4 항체를 함유하는 것이 가장 바람직하다.

한편, PD-L1은 전술한 바와 같이 PD-1의 리간드이고, PD-L2는 PD-1의 리간드이다. 그 때문에, 항 PD-1 항체 또는 항 PD-L2 항체를, 항 PD-L1 항체 대신에 사용한 경우도 항 PD-L1 항체를 사용한 경우와 동일한 효과가 얻어지는 것이 기대된다.

또한, CD33, CD52, 및, CD25는, 전술한 바와 같이 각각 급성 골수성 백혈병 세포의 표면 항원, B 세포성 만성 림프성 백혈병 세포의 표면 항원, 및 성인 T 세포성 백혈병 세포의 표면 항원으로서 알려져 있다. 이들의 암환자에 있어서의 종양화된 백혈구에는, MICA 및 MICB이라는 표면 항원이 많이 보인다.

본 발명에 관련된 암의 치료약이 IL-18과, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체를 함유하는 경우, 상기 항체는 각각 CD25, CD33, CD52를 표적으로 한다. 또한, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, IL-18은, NKG2D의 발현 강도가 높은 NK 세포의 유도를 강화할 수 있다. 그리고, 당해 NK 세포는 NKG2D에 의해서 MICA 및 MICB를 인식하고, 이들 표면 항원을 발현한 세포를 융해시킬 수 있다.

그러므로, 본 발명에 관련된 암의 치료약이 IL-18과, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체를 함유하는 경우, 당해 치료약은, 급성 골수성 백혈병, B 세포성 만성 림프성 백혈병, 및 성인 T 세포성 백혈병 치료에 유효하게 작용할 가능성이 있는 것으로 생각된다.

본 발명에 관련된 암 치료약에 있어서, IL-18과 상기 항체의 사용량의 비로는, 상기 항체를 1종류 사용하는 경우, IL-18과 상기 항체의 질량비가 1:10 내지 1:200인 것, 1:25 내지 1:200인 것, 1:25 내지 1:50인 것, 또는, 1:30 내지 1:50인 것이 바람직하고, 투여하는 생체(피검체, 환자)의 체중 1㎏ 당 IL-18의 투여량을 0.1㎎/㎏으로 했을 때, 상기 질량비로 항체를 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 항체를 2종류 이상 사용하는 경우, IL-18의 질량과, 2종류 이상의 항체의 질량을 합계한 값과의 비가 상기 질량비가 되도록 하고, 항체끼리의 질량비는 임의의 비로 하면 된다.

요컨대, IL-18의 질량과, 항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체의 질량(사용하는 항체의 질량의 합계)과의 비가 1:10 내지 1:200인 것, 1:25 내지 1:200인 것, 1:25 내지 1:50인 것, 또는, 1:30 내지 1:50인 것이 바람직하고, 항체끼리의 질량비는 임의의 비로 하면 된다.

예를 들어, 항체를 2종류 사용하는 경우, IL-18의 상기 투여량을 0.1 ㎎/㎏으로 했을 때에, IL-18과 첫 번째 종류의 항체와 두 번째 종류의 항체를, 질량비1:50:50으로 사용할 수 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약은, IL-18과, 상기 항체(항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체)를 유효 성분으로 한다. 상기 암 치료약은, IL-18과 상기 항체를 혼합한 조성물일 수 있다. 또한, IL-18과, 상기 항체는 혼합되어 있지 않고 따로따로 존재할 수 있다.

요컨대, 유효 성분으로서 IL-18과 상기 항체가 사용되는 한, IL-18과 상기 항체가 혼합되어 있지 않아도, 본 발명에 관련된 암 치료약의 범위에 포함된다.

예를 들어, IL-18과 상기 항체를, 환자에 대하여, IL-18을 먼저 투여한 후에 상기 항체를 투여하는 것과 같이, 따로따로 투여하는 경우라도, IL-18과 상기 항체를 유효 성분으로서 병용하고 있기 때문에, IL-18과 상기 항체가 혼합되어 있지 않은 형태도, IL-18과 상기 항체를 유효 성분으로서 함유하는 본 발명에 관련된 암 치료약에 해당한다. 단, 투여 순서는 이것에 한정되는 것이 아니라, 상기 항체를 환자에게 투여한 후에 IL-18을 투여해도 되고, 또는, 상기 항체와 IL-18을 동시에 환자에게 투여해도 된다.

상기 항체가 복수종의 항체인 경우, 당해 항체의 투여 형태는 복수종의 항체를 동시에 투여하는 형태일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 항체를 2종류 사용하는 경우, IL-18과, 첫 번째 종류의 항체와 두 번째 종류의 항체를, 환자에 대하여 임의의 순서로 각각 경시적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, IL-18, 항 PD-L1 항체, 및, 항 CTLA-4 항체의 순서, 또는, IL-18, 항 CTLA-4 항체, 및 항 PD-L1 항체의 순서로 환자에게 투여하는 형태 등일 수 있다. IL-18과 1종류 또는 복수종의 항체를 경시적으로 투여하는 경우, IL-18과 항체의 투여 간격, 또는 항체와 항체의 투여 간격은 2 내지 5일인 것이 바람직하다.

또한, 투여 부위는, IL-18과 각각의 항체에서 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, IL-18과 복수종의 항체를 모두 정맥 주사하는 투여 형태일 수 있고, IL-18을 정맥 주사하고, 첫 번째 종류의 항체를 피하 주사하고, 두 번째 종류의 항체를 피내 주사하는 것과 같은 투여 형태일 수 있다. 통상적으로는, 투여의 간편성을 감안하면, IL-18과 항체를 동일한 부위에 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에 관련된 암 치료약의 유효 성분(IL-18 및 상기 항체)의 용량은, 환자의 연령, 증상 등에 따라 다르기 때문에 일률적으로 말할 수는 없지만, 1회의 투여에서는 통상, 환자의 체중당, 유효 성분으로서 IL-18은 0.1 ㎎/㎏, 항체는 1 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 항체는 2.5 ㎎/㎏ 내지 5.0 ㎎/㎏인 것, 또는 3.0 ㎎/㎏ 내지 5.0㎎/㎏인 것이 보다 바람직하다. 또한, 유효 성분에서 차지하는 IL-18과 상기 항체의 질량비는 전술한 바와 같다.

또한, 후술하는 실시예에서는 피검체로서 마우스를 사용하고 있지만, 마우스의 체중당 투여량과, 인간의 체중당 투여량에 큰 차이는 없다. 인간에게 투여하는 경우, IL-18을 0.1 ㎎/㎏으로 했을 때에, 항체를 1㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏으로 하여 3주마다 4회 투여하는 투여 형태가 일례로서 고려된다.

(2) 그 밖의 성분

본 발명에 관련된 암 치료약은, 상기 유효 성분 이외에 필요에 따라서, 예를 들어 특허문헌 3에 기재되어 있는 것과 같은 의약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

상기 담체는, 물 및 피넛유, 대두유, 광유, 또는 참기름 등, 혹은, 석유, 동물, 식물, 또는 합성 유래의 기름을 포함하는 기름 등, 무균의 액체일 수 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약이 정맥내 투여되는 경우에는, 물을 담체로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 주사 용액용의 액체 담체로는, 생리 식염액 및 덱스트로스 및 글리세롤의 수용액도 또한 사용할 수 있다.

적절한 의약 부형제로는, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 호분(胡粉), 실리카 겔, 스테아르산마그네슘, 모노스테아르산글리세롤, 활석, 염화나트륨, 건조 스킴밀크, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 물, 및 에탄올 등을 들 수 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약은, 필요에 따라서 소량의 보습제 또는 유화제, 또는 pH 완충제도 함유할 수 있다. 본 발명에 관련된 암 치료약은, 용액, 현탁액, 유제, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 또는 서방 제제 등의 형태를 취할 수 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약은, 트리글리세리드 등 종래의 결합제 및 담체를 갖는 좌제로서 조합할 수 있다. 경구 제제는, 의약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로오스, 또는 탄산마그네슘 등, 표준 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 관련된 암 치료약은, 상기 유효 성분과 함께 적량의 담체를 함유하고 있어도 된다. 제제의 형식은, 투여 방식에 맞춰서 적절히 조정하면 된다.

본 발명에 관련된 암 치료약의 환자에 대한 투여 형태는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 암 치료약은 종래 공지된 순서에 따라서, 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 의약 조성물로서 처방된다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 바와 같이, 전형적으로 정맥내 투여용의 조성물은, 무균이고 등장성의 수성 완충액 중의 용액이다. 적절한 경우, 상기 조성물은, 가용화제 및 주사 부위에 있어서의 동통을 완화시키는 리그노카인 등의 국소 마취제도 함유할 수 있다.

일반적으로 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰플 또는 작은 봉지 등의 밀봉 용기 내에서의 건조 동결 분말 또는 물을 함유하지 않은 농축물로서, 단위 용량 형태로 개별적으로 또는 일괄 혼합되어 공급된다. 또한, 상기 암 치료약은 전술한 바와 같이, IL-18과 상기 항체는 반드시 혼합되어 있지 않아도 된다. 따라서, IL-18과 상기 항체가 개별적으로 공급되어도 된다.

상기 암 치료약을 주입(注入) 투여하는 경우, 무균의 의약 등급의 물 또는 생리 식염액을 저장하는 주입 보틀에 의해 분주(分注)할 수 있다. 상기 암 치료약을 주사 투여하는 경우, 무균의 주사용수 또는 생리 식염액의 앰플을 공급하여, 투여 전에 성분을 혼합할 수 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약은, 비경구 투여용의 용액 또는 동결 건조 분말로서 조합할 수 있다. 분말은, 사용 전에 적절한 희석제 또는 다른 의약상 허용되는 담체의 첨가에 의해 환원할 수 있다. 액체 제제는, 완충을 마친 등장성의 수용액일 수 있다. 적절한 희석제의 예는, 통상적인 등장성 생리 식염액, 물 또는 아세트산나트륨 완충액 또는 아세트산암모늄 완충액 중에 5％의 표준 덱스트로스이다.

상기 제제는 비경구 투여에 바람직하지만, 경구 투여에 사용할 수도 있어, 흡입용의 용량 계량형 흡입기 또는 분무기 중에 보관할 수도 있다. 상기 암 치료약에는, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 히드록시셀룰로오스, 아라비아 고무, 폴리에틸렌글리콜, 만니톨, 염화나트륨, 또는 시트르산나트륨 등의 부형제를 첨가하는 것이 바람직한 경우가 있다.

상기 암 치료약은, 경구 투여용으로 캡슐화할 수도, 정제화할 수도, 유제 또는 시럽으로 조제할 수도 있다. 의약상 허용되는 고체 또는 액체의 담체를 첨가하여 상기 암 치료약을 증강 또는 안정화시킬 수도 있고, 상기 암 치료약의 조제를 용이화할 수도 있다.

고체의 담체는, 전분, 락토스, 황산칼슘 이수화물, 백토, 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산, 활석, 펙틴, 아라비아 고무, 한천, 또는 젤라틴을 포함한다.

액체의 담체는, 시럽, 피넛유, 올리브유, 생리 식염액, 및 물을 포함한다. 담체는 또한, 단독으로 또는 왁스를 수반하는 모노스테아르산글리세릴 또는 디스테아르산글리세릴 등의 서방용 재료도 포함할 수 있다.

고체 담체의 양은 다양하지만, 용량 단위당 약 20 ㎎ 내지 약 1 g 이다. 의약 제제는 정제 형태의 경우, 적절하다면, 분쇄, 혼합, 조립(造粒), 및 압축, 경질 젤라틴 캡슐 형태의 경우, 분쇄, 혼합 및 충전을 포함하는 종래의 제약법에 따라서 제작된다.

액체의 담체를 사용하는 경우, 제제는 시럽, 엘릭시르제, 유제, 또는 수성 또는 비수성 현탁액의 형태이다. 이러한 액체 제제는, 경구(p.o.)에 의해 직접적으로 또는 연질 젤라틴 캡슐 중에 충전하여 투여할 수 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약은, 주사용으로 준비된 형태에 있어서의, 생리적 pH에서 완충한 상기 암 치료약을 함유하는 수성 현탁액 또는 수용액으로서 사용할 수 있다. 수성 담체로는, 예를 들어 0.4％ 생리 식염액 또는 0.3％ 글리신 등, 각종 수성 담체를 사용할 수 있다. 이들 용액은 무균이고, 일반적으로 입자상 물질을 포함하지 않는다.

상기 수성 현탁액 또는 수용액은, 종래 공지된 멸균법(예를 들어, 여과법)에 의해 멸균할 수 있다. 본 발명에 관련된 암 치료약은, pH 조정제 또는 완충제 등, 생리적 조건을 근사시키는 데 필요한 의약상 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다.

이러한, 담체, 보조 물질 등을 함유하는 의약 제제 중에 있어서의 본 발명에 관련된 암 치료약의 농도는, 선택되는 구체적인 투여 방식에 따라서, 유체 용량, 점조도 등에 기초하여 선택하면 된다.

〔실시형태 2: 본 발명에 관련된 암 치료약의 투여〕

본 발명에 관련된 암 치료약은, 어느 하나의 적절한 체내 경로에 의해 환자에게 투여할 수 있다.

투여 방법으로는, 예를 들어 특허문헌 3에 기재된 종래 공지된 각종 방법을 사용할 수 있다. 즉, 리포좀 중으로의 봉입, 미립자, 마이크로 캡슐, 화합물을 발현하는 능력을 갖는 재조합 세포, 수용체를 통한 엔도사이트-시스(예를 들어, Wu 등, J. Biol. Chem., 제262권, 4429 내지 4432페이지(1987)를 참조), 레트로바이러스 벡터 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 구축 등, 각종 딜리버리 시스템이 알려져 있으며, 본 발명에 관련된 암 치료약의 투여에 사용할 수 있다.

도입법은, 피내 경로, 근육내 경로, 복강내 경로, 정맥내 경로, 피하 경로, 비강내 경로, 경막외 경로, 및 경구 경로를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 상기 암 치료약은 임의의 바람직한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막 피부에 의한 내막(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있고, 다른 생물 활성제와 함께 투여할 수 있다.

투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 뇌실내 주사, 및 지주막하 주사를 포함하는 임의의 적절한 경로에 의해 중추신경계에 도입하는 것이 바람직한 경우가 있고, 뇌실내 주사는, 예를 들어, 옴마야 저장소(Ommaya reservoir) 등의 용기에 장착된 뇌실내 카테터에 의해 용이화할 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 분무기 및 에어졸제를 갖는 제제의 사용에 의해, 폐내 투여도 또한 사용할 수 있다.

투여는, 전술한 바와 같이 유효 성분(IL-18 및 상기 항체)의 용량이, 투여 1회당, 환자의 체중당, IL-18은 0.1 ㎎/㎏, 항체는 1 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 2.5 ㎎/㎏ 내지 5.0 ㎎/㎏ 또는 3.0 내지 5.0 ㎎/㎏이 되도록 실시하는 것이 바람직하다.

〔실시형태 3: 본 발명에 관련된 암 치료약의 항종양 효과〕

본 발명에 관련된 암 치료약은, 전술한 바와 같이 IL-18과 소정의 항체를 유효 성분으로서 병용한 것이다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 당해 병용을 실시하여 본 발명에 관련된 암 치료약을 투여함으로써, IL-18을 단독으로 사용한 경우 및 항체를 단독으로 사용한 경우와 비교하여, 복막 파종을 일으키는 대장암 세포를 이식한 마우스의 생존율을 상승적으로, 현저히 향상시킬 수 있다는 효과가 발휘되었다.

이 효과는, 실시예에서는, IL-18과 항 CTLA-4 항체를 질량비 1:25 내지 1:50이 되도록 하여, IL-18이 2 ㎍/25 g, 항 CTLA-4 항체가 50 내지 100 ㎍/25 g이 되도록 마우스에게 복강내 투여했을 때(후술하는 도 2), 그리고, IL-18, 항 PD-L1 항체, 및 항 CTLA-4 항체를 마우스에게 복강내 투여했을 때(후술하는 도 4)에 매우 강하게 발휘되었다.

즉, 대장암 세포의 이식 후 60일을 지나서도 시험에 사용한 마우스의 전부가 생존하고, 또한, 복수의 저장도 보이지 않으며, 자기면역과 비슷한 병변도 보이지 않고 건강한 상태를 유지하고 있었다. 즉, 부작용이 생기지 않은 것으로 생각되었다.

또한, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 상기 병용에 의해서 복강내 삼출 세포의 수를 장기간 지속적으로 증가시킬 수 있어, 상기 복강내 삼출 세포에 의한 마우스의 연명 효과도 관찰되었다. 그리고, 상기 복강내 삼출 세포 중에서는, 활성형의 NK 세포가 증식하여, 오래 지속적으로 존재하는 것과 동시에, CD4 양성 CD25 양성 T 세포와 같은, 염증 억제성의 세포가 감소하는 것이 관찰되었다.

요컨대, 본 발명에 관련된 암 치료약은, IL-18이 NK 세포 등의 이펙터 세포의 증강을 촉진하여, 활성화된 이펙터 세포를 오래 지속적으로 존재시키며, 또한 염증 억제성의 세포를 감소시키는 것에 의해, 병용하는 항체의 항종양 효과를 한층 더 증강시킬 수 있는 것으로 생각된다.

또한, 상기 항체의 단독 사용에 있어서는, 전술한 바와 같이 자기면역 질환의 발증 등의 부작용이 생길 수 있다는 문제가 있지만, 본 발명에 관련된 암 치료약에서는 그와 같은 부작용이 적다는 이점이 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약의 우수한 항종양 효과를 감안하면, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 각종 암의 치료에 적용하는 것이 가능하다. 적용 가능한 암종으로는, 예를 들어, 편평상피암(자궁경관, 눈꺼풀, 결막, 질, 허파, 구강, 피부, 방광, 혀, 후두, 식도), 및, 선암(예를 들어, 전립선, 소장, 자궁내막, 자궁경관, 대장, 허파, 췌장, 식도, 직장, 자궁, 위, 유방, 난소)을 들 수 있다. 또한, 육종(예를 들어, 근원성 육종), 백혈병, 신경종, 흑색종, 림프종도 적용 가능한 암종에 포함된다.

본원 발명은, 이하의 발명을 포함한다.

본 발명에 관련된 암 치료약은, IL-18과, 항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 CD25 항체, 항 CD33 항체 및 항 CD52 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기 구성에 의하면, 후술하는 실시예에 나타내는 결과로부터, IL-18이 이펙터 세포의 증식, 생존, 분화를 촉진하고, 또한 억제성 T 세포의 증식을 억제함으로써, 상기 항체의 항종양 효과를 현저히 높일 수 있는 것으로 추측된다. 그 결과, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 상기 항체만을 사용하는 경우 또는 IL-18만을 사용하는 경우와 비교하여 상승적인, 매우 우수한 항종양 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 치료가 곤란한 복막 파종의 억제에 매우 효과적인 한편, 부작용은 경감될 가능성이 있다.

따라서, 치료 효과가 매우 높은 암 치료약을 제공할 수 있음과 동시에, 부작용이 환자에게 주는 고통을 크게 저감할 수 있다.

또한, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 상기 항체가 항 PD-L1 항체 및/또는 항 CTLA-4 항체인 것이 바람직하다.

상기 구성에 의하면, IL-18을 병용하기 때문에, 항 PD-L1 항체 또는 항 CTLA-4 항체를 단독으로 사용하는 경우와 비교하여 현저히 우수한 항종양 효과를 얻을 수 있다. 따라서, 암 치료에 실적이 있는 이들 항체의 항종양 효과를 한층 더 높여, 보다 우수한 암 치료약을 제공할 수 있다.

그리고, 상기 구성 중, 상기 항체가 항 PD-L1 항체 및 항 CTLA-4 항체인 경우, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, IL-18과 항 PD-L1 항체 또는 항 CTLA-4 항체를 함유하는 암 치료약과 비교해도, 단순히 추가적 효과가 아니라 상승적인, 매우 우수한 항종양 효과를 얻을 수 있다.

따라서, 한층 더 항종양 효과가 우수하고, 또한 부작용이 적은 암 치료약을 제공할 수 있다.

본 발명에 관련된 암 치료약은, IL-18의 질량과, 상기 1 이상의 항체의 질량의 합계와의 비가 1:25 내지 1:200인 것이 바람직하다.

상기 구성에 의하면, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, IL-18과 항체의 생체에 대한 투여량을 정확한 양으로 할 수 있기 때문에, 상기 상승적인, 매우 우수한 항종양 효과를 얻는 데에 있어서 바람직하다.

그리고, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 위암, 대장암, 난소암, 골육종, 및 백혈병으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 암의 치료약인 것이 바람직하다.

상기 암은, 종양의 복막 파종을 수반하는 것이 많고, 종양을 절제한 경우라도 복막 파종이 발증하는 경우가 있다. 상기 구성에 의하면, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 복막 파종에 대한 높은 치료 효과를 나타낼 수 있다.

따라서, 복막 파종을 수반하는 상기 암에 대하여 특히 바람직하며, 또한 부작용이 적은 암 치료약을 제공할 수 있다.

본 발명은 전술한 각 실시형태에 한정되는 것이 아니라, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지 변경이 가능하고, 다른 실시형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻어지는 실시형태에 관해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 그리고, 각 실시형태에 각각 개시된 기술적 수단을 조합함으로써, 새로운 기술적 특징을 형성할 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 또한, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것이 아니다.

먼저, 실시예에 있어서 사용한 재료 및 실험 방법에 대해서 설명한다.

〔재료〕

(1) 마우스 및 셀라인

마우스로는, 일본 SLC(하마마쓰시)로부터 구입한 BALB/C 야생형 마우스(6 내지 8주령, 수컷)를 사용하였다. 상기 마우스를, 25℃에서, 12시간 밝은 곳, 12시간 어두운 곳이 되는 사이클로 조명을 제어한 조건하에서, 병원체 프리의 상태로 사육하였다. 마우스는, 물 및 펠릿상의 먹이를 자유롭게 섭취할 수 있는 상태로 하였다.

CT-26 마우스 결장암 세포의 셀라인은, American Type Culture Collection으로부터 구입하고, 37℃, 5％ CO₂ 함유 대기 분위기하에서, 10％ 소태아 혈청(FBS, Bio West) 및 페니실린/스트렙토마이신(Gibco BRL, USA)을 함유하는 RPMI1640 배지(나카라이 테스크(주) 제) 중에서 유지하였다.

상기 세포는, 0.05％ 트립신 및 0.01％ EDTA를 함유하는 Ca^2＋ 및 Mg^2＋ 프리의 둘베코 PBS(pH 7.4, 나카라이 테스크(주) 제. 이하, "트립신-EDTA"라고 부른다)를 사용하여 처리하고, 회수하였다.

(2) 시약

재조합 마우스 IL-18(글락소 스미스클라인 제, 품번 SB-528775, 이하 간단히 "IL-18"이라고 부른다)은, 글락소 스미스클라인 plc의 후의(厚意)를 받아 분배된 것을 사용하였다.

항 마우스 CD152/CTLA-4 모노클로날 항체(mAb, 클론 UC10-4F10-11. 이하 간단히 "항 CTLA-4 항체"라고 부른다) 및 항 마우스 PD-L1 항체(클론 10F.9G2. 이하 간단히 "항 PD-L1 항체"라고 부른다)는 BioXcell로부터 구입한 것을 사용하였다. 토끼 항아시알로 GM1 항체(카탈로그 번호: 014-09801, 와코 쥰야쿠(주) 제), 항 CD8 항체(카탈로그 번호 SC-18913, 산타크루즈 제) 및 토끼 IgG(카탈로그 번호: PM035, MBL 제)는 모두 시판되는 항체이다.

〔실험 방법〕

(1) In vivo 에서의 처치

트립신-EDTA를 사용하여 배양 용기로부터 서브컨플루언트 상태에 있는 CT-26 세포를 박리함으로써 회수하고, PBS를 사용하여 2번 세정하였다. 생세포의 수는 트리판 블루 색소 배제 시험에 의해 계산하고, 여러 가지 세포 농도로 생세포를 PBS 중에 현탁시켜, 현탁액을 조제하였다. 상기 세포 농도는, 5.0×10⁴개/0.25 ㎖이다.

상기 현탁액 0.25 ㎖를, 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하였다. CT-26 세포의 이식 후 적당한 날에, 다양한 양(25 내지 100 ㎍)의 항 CTLA-4 항체 또는 항 PD-L1 항체를, IL-18(1 내지 2 ㎍)과 함께, 또는, IL-18을 사용하지 않고서 상기 마우스에게 복강내 주사하였다. in vivo 에서의 NK 세포 또는 T 세포의 관여를 검토하기 위해서, 항 NK 세포 항체 또는 항 T 세포 항체도 투여하였다. 각 실시예에서 사용한 항체 및 IL-18의 구체적인 양, 투여 간격은 각 실시예에 기재한다.

(2) 세포의 조제 및 배양

마우스의 복강 삼출 세포(PEC)는, 5 ㎖의 PBS로 3회 세정함으로써 복강으로부터 회수하고, ACK 용해 버퍼(자가 제조)에 의해서 적혈구를 3회 제거하고, PBS로 3회 세정하였다.

림프구는, 10％ 소태아 혈청, L-글루타민(Gibco BRL 제), 페니실린/스트렙토마이신, 및 2-메르캅토에탄올(시그마사 제 M7154)을 함유하는 RPMI1640 배지(나카라이 테스크(주) 제) 중에서, 37℃, 5％ CO₂ 함유 대기 분위기하에서 배양하였다.

(3) 양자 세포 이입

양자 세포 이입 실험용의 PEC는, CT-26 세포를 이식한 마우스의 복강으로부터 조제하였다. 마우스에는, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체, 및 IL-18에 관련해서 여러 가지 조합으로 한 치료약을, CT-26 세포를 이식한 날의 3일 후에 복강내 주사하였다. PEC는, 상기 치료약을 복강내 주사한 날의 4일 후에 회수하였다. 회수한 세포의 대부분이 림프구였다. 당해 림프구를 세정하고, 2.5×10⁷cells/㎖의 세포 밀도가 되도록 PBS 중에 현탁시켜, 세포 현탁액을 조제하였다. 양자 세포 이입을 위해, CT-26 세포를 이식한 마우스의 복강내에 대하여, 상기 세포 현탁액 0.2 ㎖(약 5×10⁶ cells/마우스)를 이식한 날의 3일후, 7일후, 11일 후에 주사하였다.

(4) 플로 사이토메트리

PEC의 세포 표면 마커 및 비장 세포의 세포 표면 마커의 해석은 플로 사이토메트리를 사용하여 실시하였다. 세포 표면 마커는, FITC 표적 항 CD4 항체(eBioscience 제, 클론 GK1.5), APC 표적 항 CD8 항체(Biolegend 제, 클론 54-6.7), 비오틴 표적 항 CD8 항체(eBioscience 제, 클론 53-6.7), 비오틴 표적 항 CD11c 항체(Beckton Dickinson 제, 클론 HL3), APC 표적 항 CD45R/B220 항체(Biolegend 제, 클론 RA3-6B2), PE 표적 항 CD49b 항체(Beckton Dickinson 제, 클론 DX5)를 사용하여 염색하였다. 플로 사이토메트리에 의한 해석은, FACS Calibur flow cytometer (Beckton Dickinson Biosciences 제)를 사용하여 실시하였다.

즉, 세포를, CD4, CD8, CD11c, CD45R/B220, CD49b에 특이적인, FITC, PE, APC 또는 비오틴으로 표지한 모노클로날 항체로 염색하고, 다음으로, FACS Calibur flow cytometer를 사용하여 해석하였다. 또한, 항 마우스 CD16/32 항체(eBioscience 제, 클론93)를 Fc 블로커로서 사용하였다. 데이터는, Cell Quest 소프트웨어(등록 상표, Beckton Dickinson Biosciences 제)를 사용하여 해석하였다.

본 명세서에 있어서 플로 사이토메트리의 조건은 일정하며, Becton-Dickinson immunocytometry systems, 1995. 에 기재되어 있는 조건에 따라서 실시하였다. 또한, 본 명세서에 있어서, 세포 표면 마커의 발현 강도는, 모두 플로 사이토메트리에 의해서 측정한 발현 강도를 의미한다.

〔실시예 1: CT-26 세포를 복강내 투여한 마우스의 생존율에 대한, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약의 효과〕

상기 실험 방법의 (1)에 기재한 CT-26 세포에 관해서, 세포 농도 5.0×10⁴개/0.25 ㎖의 현탁액을 0.25 ㎖, 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하여, 이식하였다.

상기 마우스는, 치료약으로서, 대조로서의 토끼 IgG 100 ㎍을 투여하는 군; IL-18만 2 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체만 100 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군으로 나누고, 각 군은 5마리의 마우스로 구성하였다. 상기 CT-26 세포를 주사한 날의 3일후, 7일후, 10일후, 14일 후에, 합계 4회, 상기 치료약을 복강내 주사하였다. 이하, 모든 실시예에 있어서, 실험은 3회 반복하여 실시하였다.

또한, 상기 토끼 IgG 항체, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18의 투여량(㎍)은, 마우스의 체중 25 g 당의 투여량이다.

도 1은, CT-26 세포를 이식한 날의 3일후부터 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약을 투여했을 때의 효과를, 마우스의 생존율로서 관찰한 결과를 나타내는 도이다. 도 1에 있어서, 가로축은 CT-26 세포를 이식(복강내 주사)한 날로부터의 일수를 나타내고, 세로축은 마우스의 생존율을 나타내고 있다.

도 1에 나타내는 바와 같이, 대조는 CT-26 세포를 이식한 날로부터 24일 후에 생존율이 저하되기 시작하여, 27일 후에는 모든 마우스가 사망하였다. 또한, IL-18만을 투여한 군과, 항 CTLA-4 항체만을 투여한 군은 유사한 생존율의 저하 경향을 나타내고, 각각 42일후, 49일 후에 모든 마우스가 사망하였다.

한편, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 투여한 군에서는, 복수의 저장도 없고, 마우스의 사망이 전혀 보이지 않으며, CT-26 세포를 이식한 날로부터 60일 후에서도 모든 마우스가 생존해 있었다. 게다가, 쇠약한 마우스는 보이지 않고, 건강한 상태를 유지하고 있었다.

이상의 결과로부터, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 투여한 군에서는, IL-18과 항 CTLA-4 항체에 의한 단순한 상가적인 항종양 효과가 아니라, 매우 우수한 상승적인 항종양 효과가 나타나는 것이 분명해졌다. 요컨대, IL-18을 항 CTLA-4 항체와 병용함으로써, 항 CTLA-4 항체의 항종양 효과를 비약적으로 높일 수 있음이 분명해졌다.

〔실시예 2: 항 CTLA-4 항체 및 IL-18의 용량 효과〕

상기 〔실험 방법〕의 (1)에 기재한 CT-26 세포에 관해서, 세포 농도 5.0×10⁴개/0.25 ㎖의 현탁액 0.25 ㎖를 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하여, 이식하였다.

상기 마우스는, 치료약으로서, 대조로서의 토끼 IgG 100 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 25 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 50 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 IL-18 1 ㎍을 투여하는 군으로 나누고, 각 군은 5마리의 마우스로 구성하였다. 상기 CT-26 세포를 주사한 날의 3일후, 7일후, 10일후, 14일 후에, 합계 4회, 상기 치료약을 복강내 주사하였다.

도 2는, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18의 용량 효과를 실시예 1과 동일하게, CT-26 세포를 복강내 투여한 마우스의 생존율로서 나타내는 도이다. 가로축 및 세로축은 도 1과 같다.

도 2에 나타내는 바와 같이, 대조는 CT-26 세포를 이식한 날로부터 24일 후에 생존율이 저하되기 시작하여, 28일 후에는 모든 마우스가 사망하였다.

한편, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 투여한 군에서는, 항 CTLA-4 항체 25 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여한 군에 있어서, CT-26 세포의 이식일로부터 28일 후에 생존율이 저하되기 시작하여, 42일 후에 모든 마우스가 사망하였다. 그러나, 대조와 비교하면 연명 효과가 보였다.

항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 IL-18 1 ㎍을 투여한 군에서는, CT-26 세포의 이식일로부터 35일 후에 생존율이 80％로 저하되었지만, 그 후에는 60일 후에도 생존율은 유지되었다. 생존해 있는 마우스의 건강 상태는 양호하였다.

항 CTLA-4 항체 50 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여한 군, 및, 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여한 군에서는, 상기 투여일로부터 60일 후에도 모든 마우스가 생존해 있었다. 마우스의 건강 상태는 양호하였다.

이상과 같이, 항 CTLA-4 항체를 IL-18과 병용한 경우, 4개의 투여군 중 3개의 투여군에서 매우 우수한 항종양 효과가 얻어져, 높은 치료 효과가 얻어졌다. 또한, 항 CTLA-4 항체 25 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여한 군에서도, 연명 효과가 나타내는 것이 확인되었다.

〔실시예 3: CT-26 세포를 복강내에 이식한 마우스의 생존율에 대한, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 함유하는 치료약의 효과〕

실시예 1에서 사용한 것과 동일한 세포 농도(5.0×10⁴개/0.25 ㎖)를 갖는 CT-26 세포의 현탁액을 0.25 ㎖, 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하여, 이식하였다.

상기 마우스는, 치료약으로서, 대조로서의 토끼 IgG 100 ㎍을 투여하는 군; IL-18만 2 ㎍을 투여하는 군; 항 PD-L1 항체만 100 ㎍을 투여하는 군; 항 PD-L1 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군으로 나누고, 각 군은 5마리의 마우스로 구성하였다. 상기 CT-26 세포를 주사한 날의 3일후, 7일후, 10일후, 14일 후에, 합계 4회, 상기 치료약을 복강내 주사하였다. 또한, 상기 투여량은, 마우스의 체중 25 g 당의 양이다.

도 3은, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약의 효과를 실시예 1과 동일하게, 마우스의 생존율로서 나타내는 도이다. 가로축 및 세로축은 도 1과 같다.

도 3에 나타내는 바와 같이, 대조 및 IL-18만을 투여한 군의 생존율의 추이는 실시예 1과 동일하다. 항 PD-L1 항체와 IL-18을 투여한 군에서는, CT-26 세포를 이식한 날의 35일 후까지는 IL-18만을 투여한 군과 같은 경향을 나타내었지만, 35일 후 이후에는, IL-18만을 투여한 군에서 42일 후에 모든 마우스가 사망한 데 반하여, 60일 후에서도 생존율이 60％ 대로 유지되었다. 또한, 생존해 있는 마우스의 건강 상태는 양호하였다.

항 PD-L1 항체만을 투여한 군의 생존율은, IL-18만을 투여한 군보다 떨어졌다. 이 결과로부터, 항 PD-L1 항체와 IL-18을 투여한 것, 즉 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 함유하는 치료약을 사용함으로써, IL-18과 항 PD-L1 항체에 의한 단순한 상가적인 항종양 효과가 아니라, 매우 우수한 상승적인 항종양 효과가 나타내는 것이 분명해졌다.

요컨대, IL-18을 항 PD-L1 항체와 병용함으로써, 항 PD-L1 항체의 항종양 효과를 비약적으로 높일 수 있음이 분명해졌다. 또한, 항 PD-L1 항체는 항 CTLA-4 항체보다 부작용이 적은 것이 알려져 있기 때문에, 상기 상승적인 항종양 효과에 의해, 항종양 효과가 높고, 또한 부작용이 적은 암의 치료약을 제공할 수 있다.

〔실시예 4: CT-26 세포를 복강내에 이식한 마우스의 생존율에 대한, 항 PD-L1 항체, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약의 효과 (1)〕

상기 마우스는, 치료약으로서, 대조로서의 토끼 IgG 100 ㎍을 투여하는 군; IL-18만 2 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군; 항 PD-L1 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 항 PD-L1 항체 100 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍, 항 PD-L1 항체 100 ㎍, 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군으로 나누고, 각 군은 5마리의 마우스로 구성하였다. CT-26 세포를 주사한 날로부터 7일 후에, 상기 치료약을 복강내 주사하고, 그 후, 4일마다 합계 4회, 상기 치료약을 복강내 주사하였다.

도 4는, CT-26 세포를 이식한 날로부터 7일 후에, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약 등을 투여하고, 그 후, 4일마다 합계 4회 투여한 경우의 효과를 마우스의 생존율로서 나타내는 도이다. 가로축 및 세로축은 도 1과 같다. 또한, 상기 투여량은, 마우스의 체중 25 g 당의 양이다.

실시예 4에서는, 실시예 1 내지 3과는 달리, CT-26 세포를 복강내에 이식한 날의 7일 후에 치료약의 투여를 시작하고 있다. 즉, 실시예 1 내지 3보다 종양이 성장한 후에 치료약의 투여를 시작하였지만, 도 4에 나타내는 바와 같이, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체를 투여한 군보다도, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 투여한 군, 및, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 군의 쪽이 매우 높은 생존율을 나타내었다. 또한, 생존해 있는 마우스의 건강 상태는 양호하였다.

그리고, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 군에서는, CT-26 세포의 복강내로의 이식(종양 이식)으로부터 7일 후에 투여를 시작하고 있음에도 불구하고, 투여로부터 60일 후에도 모든 마우스가 생존해 있다고 하는 주목할 만한 결과가 얻어졌다. 뿐만아니라, 당해 마우스의 건강 상태는 매우 양호하였다.

〔실시예 5: CT-26 세포를 복강내에 이식한 마우스의 생존율에 대한, 항 PD-L1 항체, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약의 효과 (2)〕

도 5는, CT-26 세포를 이식한 날로부터 14일 후에, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 함유하는 암 치료약 등을 투여한 경우의 효과를 마우스의 생존율로서 나타내는 도이다. 가로축 및 세로축은 도 1과 같다.

치료약으로는, 실시예 4에서 사용한 상기 대조 100 ㎍; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 항 PD-L1 항체 100 ㎍; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍, 항 PD-L1 항체 100 ㎍, 및 IL-18 2 ㎍, 을 사용하여, CT-26 세포를 복강내에 이식한 날의 14일 후에 상기 치료약을 복강내 주사한 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게 하여 실험을 실시하였다. 또한, 상기 투여량은, 마우스의 체중 25 g 당의 양이다.

도 5에 나타내는 바와 같이, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체를 투여한 경우와 비교하여, 암 치료약으로서 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체, 및 IL-18을 투여한 경우의 쪽이 높은 생존율을 나타내는 것을 알 수 있다.

실시예 5에서는, 종양 이식의 14일 후에 암 치료약의 투여를 시작하고 있기 때문에, 암 치료약을 투여했을 때에는 이미 종양 덩어리가 형성되고, 복수의 저장도 관찰되어 있었다. 그럼에도 불구하고, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체, 및 IL-18을 사용한 경우에는 명확한 연명 효과가 관찰되었다. 이는, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체, 및 IL-18을 함유하는 치료약은, 종양 덩어리가 형성된 후부터 투여한 경우라도 치료 효과를 얻는 것이 가능하다는 것을 시사하고 있다.

〔실시예 6: 복강 삼출 세포수의 변화〕

실시예 6에서는, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18; 항 PD-L1 항체 및 IL-18; 및, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18이, CT-26 세포를 이식한 마우스의 복강 삼출 세포(PEC)의 수를 증가시킬 수 있는 것을 나타낸다.

실시예 1에서 사용한 것과 동일한 세포 농도(5.0×10⁴개/0.25 ㎖)를 갖는 CT-26 세포의 현탁액을 0.25 ㎖, 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하였다. 상기 주사한 날의 3일 후에, 하기 치료약을 각 마우스에게 복강내 주사하였다. 마우스는, 치료약의 종류마다 16마리 준비하여, 치료약을 투여한 날의 1일후 내지 4일 후에 각 일 4마리씩으로부터 PEC를 회수하고, 셀 카운터를 사용해서 PEC 수를 계산하여, 4마리의 PEC 수의 평균치를 구하였다.

도 6은, CT-26 세포를 이식한 날의 3일 후에 항 CTLA-4 항체 및 IL-18; 항 PD-L1 항체 및 IL-18; 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 각각 투여한 마우스의 4일간의 복강 삼출 세포(PEC)수의 변화를 나타내는 도이다. 가로축은 상기 치료약을 투여한 날로부터의 일수를 나타내고, 세로축은, 마우스 1마리당의 PEC 수(4마리의 평균치)를 나타낸다.

도 6의 (a)는, 치료약으로서, 대조로서의 토끼 IgG 100 ㎍을 투여한 군; 항 CTLA-4 항체만 100 ㎍을 투여한 군; IL-18만 2 ㎍을 투여한 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여한 군에 있어서의 PEC 수의 변화를 나타내는 것이다.

도 6의 (b)는, 치료약으로서, 상기 토끼 IgG 100 ㎍을 투여한 군; 항 PD-L1 항체만 100 ㎍을 투여한 군; IL-18만 2 ㎍을 투여한 군; 항 PD-L1 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여한 군에 있어서의 PEC 수의 변화를 나타내는 것이다.

도 6의 (c)는, 치료약으로서, 상기 토끼 IgG 100 ㎍을 투여한 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 항 PD-L1 항체 100 ㎍을 투여한 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍, 항 PD-L1 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여한 군에 있어서의 PEC 수의 변화를 나타내는 것이다. 도면에서, "NE-PEC"란, 대조로서의 토끼 IgG를 투여한 마우스의 복강 삼출 세포이다. 또한, 상기 투여량은, 마우스의 체중 25 g 당의 양이다.

도 6의 (a) 내지 (c)의 어느 것에 있어서도, 항체만을 투여한 경우와 비교하여 항체와 IL-18을 병용한 경우의 쪽이 PEC의 수를 대폭 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

또한, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체; 항 CTLA-4 항체 및 IL-18; 항 PD-L1 항체 및 IL-18; 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 각각 투여한 4일 후에, 재차 이들 암 치료약을 각각 투여한 마우스의 PEC 수의 변화도 관찰하였다. 상기 암 치료약의 투여량은, 1회째의 투여, 2회째의 투여 모두, 도 6에 나타낸 것과 동일하다.

도 7은 그 결과를 나타내는 것이다. 도 7의 (a)는, 상기 암 치료약의 1회째의 투여일을 0일째로 하여(도면 중, "Shot 1"으로 표시), CT-26 세포를 복강내에 이식한 날(도면 중, "CT-26 cell inoculated"로 표시), PEC의 회수 및 해석을 실시한 날(도면 중, 1 내지 8 및 Analysis 1 내지 7로 표시), 그리고 상기 암 치료약의 2회째의 투여일(도면 중, "Shot 2"로 표시)을 나타내고 있다.

도 7의 (b)는, 도 7의 (a)에 나타내는 0일째 내지 8일째에 있어서의 마우스 1마리당의 PEC 수(4마리의 평균치)를 나타낸다. 4일째까지는, 도 6에 나타내는 결과와 동일하다.

도 7의 (b)로부터, 상기 암 치료약을 투여한 날의 4일 후에 저하되기 시작한 PEC의 수가, 같은 날에 재차 상기 암 치료약을 투여함으로써 다시 상승 경향을 나타낸 것을 알 수 있다. 또한, PEC의 수는, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체를 사용한 경우보다도 IL-18을 항체와 병용한 경우의 쪽이 많아지고, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우에 가장 많아져 있었다.

〔실시예 7: 복강 삼출 세포에 의한 연명 효과〕

실시예 1에서 사용한 것과 동일한 세포 농도(5.0×10⁴개/0.25 ㎖)를 갖는 CT-26 세포의 현탁액을 0.25 ㎖, 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하여, 이식하였다. 그리고, 상기 〔실험 방법〕의 (3)에 기재한 바와 같이, CT-26 세포를 이식한 날의 3일 후에 암 치료약을 복강내에 주사하였다. 암 치료약으로는, 실시예 6의 도 6의 (c)에 대해서 언급한 부위에 기재한 양의 토끼 IgG; 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체; 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용하였다.

상기 〔실험 방법〕의 (3)에 기재한 바와 같이, 상기 치료약을 복강내 주사한 날의 4일 후에 PEC를 회수하고, PEC의 세포 현탁액을 조제하여, 당해 세포 현탁액 0.2 ㎖(약 5×10⁶ cells/마우스)를, CT-26 세포를 이식한 마우스의 복강내에, 이식한 날의 3일후, 7일후, 11일 후에 주사하였다.

도 8은, 종양을 가진 마우스에게 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체, 및 IL-18에 의해서 유도된 PEC를 양자 세포 이입한 경우의 연명 효과를 나타내는 도이다. 가로축은 PEC를 복강내 투여한 날로부터의 일수를 나타내고, 세로축은 마우스의 생존율을 나타내고 있다.

또한, 범례의 "control PECs"는 토끼 IgG를 치료약으로서 투여하여 얻은 PEC를, "αCTLA-4＋αPD-L1 induced PECs"는 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체를 치료약으로서 투여하여 유도한 PEC(이하, 본 항에서 "PEC-1"이라고 부른다)를, "αCTLA-4＋αPD-L1＋IL-18 induced PECs"는 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 치료약으로서 투여하여 유도한 PEC(이하, 본 항에서 "PEC-2"라고 부른다)를 각각 투여한 경우의 결과를 나타내고 있다.

도 8로부터 알 수 있듯이, 대조에서는 PEC를 복강내 투여한 날로부터 28일 후에는 모든 마우스가 사망하였다. PEC-1을 투여한 마우스에서는, 대조와 비교하여 연명 효과가 보였지만, PEC-1을 복강내 투여한 날로부터 35일 후에는 모든 마우스가 사망하였다. 한편, PEC-2를 투여한 마우스에서는, 투여한 날로부터 58일 후에도 20％의 생존율을 나타내어, PEC-1을 투여한 경우보다 약간의 연명 효과가 나타났다.

즉, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체에 IL-18을 병용함으로써, 보다 항종양 효과가 우수한 PEC를 유도할 수 있고, 그 결과, 항 CTLA-4및 항 PD-L1 항체를 사용한 경우보다 우수한 연명 효과를 나타낼 수 있었던 것으로 생각된다.

〔실시예 8: 복강내 삼출 세포에 있어서의 NK 세포의 증강〕

본 실시예에서는, 실시예 6에서 사용한 치료약 중, 항 PD-L1 항체만 ; IL-18만 ; 항 PD-L1 항체 및 IL-18; 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체; 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 실시예 6과 동일한 방법으로 마우스에게 복강내 투여함으로써 유도된 복강내 삼출 세포가 어떠한 형질의 세포인지를, 플로 사이토메트리에 의해서 조사하였다. 플로 사이토메트리에 제공된 복강내 삼출 세포로는, 각 치료약 당 5마리의 마우스를 사용하여, 상기 치료약을 투여한 날로부터 4일 후에 회수한 세포를 사용하였다.

플로 사이토메트리는, 상기 〔실험 방법〕의 (4)에 나타낸 APC 표적 항 CD45R/B220 항체(Biolegend 제, 클론 RA3-6B2), 항 NKG2D 항체(BD-pharmingem 562347) 및 PE 표적 항 CD49b 항체(Beckton Dickinson 제, 클론 DX5)를 사용하여, 상기 〔실험 방법〕의 (4)에 나타낸 방법으로 실시하였다.

도 9는, 각각 표면 마커인 B220(CD45R), NKG2D, 및 DX5(CD49b)의 발현 강도를 검토한 결과를 나타내는 도이다. (a) 내지 (j)의 가로축은 DX5의 발현 강도, (a) 내지 (e)의 세로축은 B220(CD45R)의 발현 강도, (f) 내지 (j)의 세로축은 NKG2D의 발현 강도를 나타낸다. (a) 내지 (j)의 "day 3.036"등의 표기는, 상기 치료약을 투여한 날의 3일 후에 회수한 PEC를 해석한 것을 나타내고 있다.

도 9의 (a) 내지 (e)는 각각, 도면 중에 나타내는 바와 같이 4개의 에어리어로 분할되어 있는데, 오른쪽 위의 에어리어에 존재하는 세포가 B220(CD45R)의 발현 강도가 높고, 또한, DX5의 발현 강도가 높다고 말할 수 있다. 그리고, 도 9의 (f) 내지 (j)도 각각 4개의 에어리어로 분할되어 있는데, 오른쪽 위의 에어리어에 존재하는 세포가 NKG2D의 발현 강도가 높고, 또한, DX5의 발현 강도가 높다고 말할 수 있다.

도 9의 (a) 및 (b)와 (c)를 비교하면, (c)에 나타내는 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우의 쪽이 오른쪽 위의 에어리어에 존재하는 세포가 많아져 있다. 또한, (d)와 (e)를 비교하면, (e)에 나타내는 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우의 쪽이 오른쪽 위의 에어리어에 존재하는 세포가 많아져 있다.

그리고, 도 9의 (h)에 나타내는 바와 같이, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우, (g)에 나타내는 IL-18만을 사용한 경우보다 오른쪽 위의 에어리어에 존재하는 세포의 비율이 적어져 있다. 그러나, 도 9의 (i)와 (j)를 비교하면 알 수 있듯이, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체를 사용한 경우보다, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우의 쪽이 오른쪽 위의 에어리어의 세포의 비율이 많아져 있다. 따라서, 항체와 IL-18을 병용함으로써, 항체에 의한 NK 세포의 복강내로의 유도가 더욱 강화되는 것을 알 수 있다.

이와 같이, 도 9의 (a) 내지 (j)에 나타내는 결과로부터, NK 세포 중에서도 B220(CD45R), NKG2D, 및 DX5의 발현 강도가 높은 NK 세포, 요컨대 활성형의 NK 세포의 복강내로의 유도가, 항체와 IL-18을 병용함으로써 강화되는 것이 분명해졌다. 이는, 본 발명에 관련된 치료약이 높은 항종양 효과를 나타내는 한가지 원인으로 생각된다.

〔실시예 9: 마우스 복강내에 유도된 NK 세포의 유지〕

본 실시예에서는, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 암 치료약으로서 투여한 경우에, 투여로부터 장기간 경과한 후에도 복강내에 유도된 NK 세포를 유지할 수 있는지 여부에 대해서 검토하였다.

실시예 1에서 사용한 것과 동일한 세포 농도(5.0×10⁴개/0.25 ㎖)를 갖는 CT-26 세포의 현탁액을 0.25 ㎖, 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하였다. 상기 주사한 날의 3일 후에, 하기 치료약을 복강내 주사하였다.

치료약으로는, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체, 또는, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 실시예 6과 동일한 방법으로 마우스에게 복강내 투여하고, 투여한 날로부터 11일 후에 회수한 PEC를 해석하였다.

플로 사이토메트리는, 상기 APC 표적 항 CD45R/B220 항체(Biolegend 제, 클론 RA3-6B2), PE 표적 항 CD49b 항체(Beckton Dickinson 제, 클론 DX5), 항 NKG2D 항체(BD Pharmingen 562349)를 사용하여, 상기 〔실험 방법〕의 (4)에 나타낸 방법으로 실시하였다.

도 10은, 각각 표면 마커인 B220(CD45R), NKG2D 및 DX5(CD49b)의, 상기 PEC에 있어서의 발현 강도를 검토한 결과를 나타내는 도이다. 도 10의 (a) 내지 (c)의 가로축은 DX5의 발현 강도, 세로축은 B220(CD45R)의 발현 강도를 각각 나타내고 있다.

도 10의 (a), (d)는 대조로서, CT-26 세포를 이식 후, 치료약을 투여하지 않고서 회수한 PEC의 데이터를 나타낸다. 도 10의 (b), (e)는 치료약으로서 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체를 사용한 경우, 도면의 (c), (f)는 치료약으로서 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우의 PEC의 데이터를 각각 나타낸다.

도 10의 (a) 내지 (c)에 있어서 테두리를 둘러서 "R5"라고 기재한 영역은, DX5의 발현 강도와 B220(CD45R)의 발현 강도가 모두 높다고 말할 수 있는 PEC를 나타내고 있고, 치료약을 투여하지 않은 대조(도 10의 (a))에서는 당해 PEC가 세포 전체에서 차지하는 비율이 43.93％ 이지만, 상기 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체를 투여한 날로부터 11일 후에 회수한 PEC에서는 상기 비율이 45.57％로 그다지 변하지 않았다(도 10의 (b)). 이에 반하여, 상기 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 날로부터 11일 후에 회수한 PEC에서는 상기 비율이 59.79％로 높았다(도 10의 (c)).

또한, 도 10의 (d) 내지 (f)의 가로축은 NKG2D의 발현 강도를 나타내고, 세로축은 세포의 수를 나타내고 있다. NKG2D의 발현 강도와 세포수의 관계는, 도 10의 (d) 내지 (f)에 있어서 그다지 변화가 없었다.

이상의 결과로부터, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 치료약으로서 투여한 경우, 투여로부터 11일이라는 장기간이 경과한 후에도, 복강내에 유도된 활성형의 NK 세포(DX5의 발현 강도와 B220(CD45R)의 발현 강도가 모두 높은 세포)를 유지할 수 있음이 분명해졌다.

요컨대, 본 발명에 관련된 치료약은, 종양 세포를 공격, 파괴하는 이펙터 세포를 증강시키고, 오래 지속적으로 존재시킬 수 있음이 분명해졌다.

〔실시예 10: CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 감소〕

본 실시예에서는, 본 발명에 관련된 암 치료약을 투여한 마우스에 있어서의 CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 수의 변화에 대해서 검토하였다.

실시예 1에서 사용한 것과 동일한 세포 농도(5.0×10⁴개/0.25 ㎖)를 갖는 CT-26 세포의 현탁액을 0.25 ㎖, 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하여, 이식하였다. 상기 주사한 날의 3일 후에, 하기 치료약을 복강내 주사하였다.

치료약으로는, 항 PD-L1 항체만 ; IL-18만 ; 항 PD-L1 항체 및 IL-18; 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체; 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용하고, 투여한 날로부터 7일 후에 회수한 PEC를 해석하였다. 투여량은, 실시예 6과 동일하다.

도 11은, 본 발명에 관련된 치료약이, CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 수를 감소시키는 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.

도 11의 (a) 내지 (e), (f) 내지 (j)는, 치료약으로서 각각 항 PD-L1 항체, IL-18, 항 PD-L1 항체 및 IL-18, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우의 결과를 나타내고, (a) 내지 (e)는 CD4 양성 T 세포가 상기 PEC 전체에서 차지하는 비율을 구한 결과를 나타낸다.

(a) 내지 (e)의 가로축은 TCR-β(T 세포 리셉터 β)의 발현 강도를 나타내고, 세로축은 CD4의 발현 강도를 나타낸다. 도 11의 (a) 내지 (e) 중, 원으로 둘러싼 영역은 CD4 양성 T 세포가 존재하는 영역이고, 예를 들어 도 11의 (a)의 "20.35％"라고 기재한 숫자는, 도 11의 (a)의 원으로 둘러싼 영역에 존재하는 CD4 양성 T 세포가 상기 PEC 전체에서 차지하는 비율이다.

또한, 도 11의 (f) 내지 (j)는, CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 검출 결과를 나타내고 있고, 가로축은 CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 발현 강도를, 세로축은 CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 세포수를 각각 나타내고 있다. (f) 내지 (j)의 도면 중의 수치는, 도 11의 (a) 내지 (e)에 원으로 둘러싼 영역에 존재하는 CD4 양성 T 세포에서 차지하는, CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 비율을 나타내고 있다.

CD4 양성 T 세포, CD25 양성 T 세포는, 암 세포가 증식할 때, 면역 반응, 염증 반응을 억제하는 기능을 갖는 억제성 림프구(Treg)이다. 요컨대, 상기 세포의 증가는 암 세포의 증식을 돕게 된다.

도 11의 (a) 내지 (c)로부터, 항 PD-L1 항체만, IL-18만을 사용한 경우보다, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우의 쪽이 CD4 양성 세포가 감소하고 있음을 알 수 있다. 또한, 도 11의 (d), (e)로부터, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체를 사용한 경우보다, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우의 쪽이 CD4 양성 세포가 감소하고 있음을 알 수 있다.

또한, 도 11의 (f) 내지 (j)로부터, CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 비율도, 항 PD-L1 항체만, IL-18만을 사용한 경우보다, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우의 쪽이 적은 것, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체를 사용한 경우보다, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우의 쪽이 적은 것을 알 수 있다.

이상의 결과로부터, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 항체만을 사용하는 경우보다도 억제성 림프구의 증식을 한층 더 억제하는 것을 알 수 있다. 이는, IL-18을 병용함으로써, 항체에 의한 억제성 림프구의 증식 억제 효과가 한층 더 높아진 것에 따른 것으로 생각된다.

또한, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 전술한 바와 같이 이펙터 세포의 증강, 증식을 촉진시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 억제성 림프구의 증식을 억제하고, 또한 이펙터 세포의 증강, 증식을 촉진할 수 있기 때문에, 매우 높은 항종양 효과를 발휘할 수 있는 것으로 생각된다.

〔실시예 11: 항종양 효과에 대한 NK 세포의 중요성에 대해서〕

본 실시예에서는, NK 세포에 대한 항체인 항아시알로 GM1 항체를 사용하여, 본 발명에 관련된 암 치료약의 항종양 효과에 NK 세포가 하는 역할에 대해서 검토하였다.

토끼 항아시알로 GM1 항체 50 ㎕ 또는 토끼 IgG 50 ㎍을 PBS에 의해 250 ㎕로 희석하고, CT-26 세포 이식의 1일 전에 마우스에게 복강내 주사하였다. 상기 토끼 항아시알로 GM1 항체 또는 토끼 IgG는, 상기 복강내 주사한 날의 3일 후에 재차 상기 250 ㎕의 희석액을 복강내 주사하고, 그 후, 4일마다 2회, 상기 250 ㎕의 희석액을 복강내 주사하였다. 요컨대, CT-26 세포 이식의 1일전, 2일후, 6일후, 10일 후에 상기 복강내 주사를 실시하였다.

마우스는, 치료약으로서, 대조로서의 토끼 IgG 50 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍, 항 PD-L1 항체 100 ㎍, 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군으로 나누고, 각 군은 5마리의 마우스로 구성하였다.

상기 항아시알로 GM1 항체 또는 토끼 IgG를 복강내 주사한 날의 1일후, 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 세포 농도(5.0×10⁴개/0.25 ㎖)를 갖는 CT-26 세포의 현탁액을 0.25 ㎖, 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하였다. 그리고, 상기 주사한 날의 3일 후에 상기 치료약을 복강내 주사하고, 그 후, 4일마다 합계 4회(요컨대, CT-26 세포를 이식한 날의 3일후, 7일후, 11일후, 15일후), 상기 치료약을 복강내 주사하였다.

도 12는, 내츄럴킬러(NK) 세포를 파괴하여 제거하는 항아시알로 GM1 항체가, 본 발명에 관련된 암 치료약을 투여한 마우스의 생존율에 미치는 영향을 나타내는 도이다. 도 12의 (a)는, 전술한 토끼 항아시알로 GM1 항체 또는 토끼 IgG, 및 상기 치료약의 투여 스케줄을 나타내는 것이다. 도 12의 (b)는 실험 결과를 나타내는 것이다.

도 12의 (a)의 상단은 CT-26 세포를 이식한 날을 제로일로 하여, 전술한 바와 같이, 그 3일후, 7일후, 11일후, 15일 후에 상기 치료약을 투여한다는 스케줄을 나타내고 있다. 도 12의 (a)의 하단은, 전술한 바와 같이, CT-26 세포 이식의 1일전, 2일후, 6일후, 10일 후에 토끼 항아시알로 GM1 항체 또는 토끼 IgG를 투여한다는 스케줄을 나타내고 있다.

도 12의 (b) 중, 흰 원은, 대조(CT-26 세포 이식의 1일전 및 이식의 2일후, 6일후, 10일 후에 토끼 IgG를 투여하고, 치료약으로도 전술한 바와 같이 토끼 IgG를 투여), 삼각형은, CT-26 세포 이식의 1일전 및 이식의 2일후, 6일후, 10일 후에 토끼 IgG를 투여하고, 치료약으로서 전술한 바와 같이 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 군(이하, "군 1"이라고 부른다), 사각형은, 삼각형으로 나타내는 것과 동일한 실험으로 토끼 IgG 대신에 항아시알로 GM1 항체를 투여한 군(이하, "군 2"라고 부른다)의 결과를 나타낸다. 도 12의 (b)의 가로축은 CT-26 세포를 투여한 날로부터의 일수를 나타내고, 세로축은 마우스의 생존율을 나타내고 있다.

상기 군 1에서는, 예를 들어 실시예 4에서 나타낸 것과 동일하게, 모든 마우스가 CT-26 세포를 이식한 날로부터 60일 경과후에도 생존하고, 건강 상태도 양호하였다. 한편, 군 2에서는, 대조보다 연명 효과는 보이고 있지만, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체, 및 IL-18을 사용하고 있음에도 불구하고 군 1보다 효과는 크게 떨어지며, CT-26 세포를 이식한 날로부터 35일 후에는 모든 마우스가 사망하였다.

실시예 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 활성형의 NK 세포의 복강내로의 유도를 촉진한다. 이는, 항체에 의한 상기 유도를 IL-18이 촉진하는 것에 따른 것으로 생각된다. 그러나, 항아시알로 GM1 항체를 투여한 군 2에서는, 당해 항체에 의해서 NK 세포가 감소되어 버리기 때문에, 도 12와 같은 결과가 얻어진 것으로 생각된다. 이와 같이, 본 발명에 관련된 암 치료약에 의한 항종양 효과에는, 항체와 IL-18에 의해 유도된 활성형 NK 세포가 중요한 역할을 하고 있음이 시사되었다.

〔실시예 12: 항아시알로 GM1 항체를 투여한 마우스에 있어서의 NK 세포수의 변화〕

본 실시예에서는, 항아시알로 GM1 항체를 투여한 마우스의 PEC를 플로 사이토메트리에 의해서 해석하여, NK 세포수의 변화에 대해서 검토하였다.

실시예 11의 군 1 및 군 2의 마우스를 각각 5마리 준비하여, 실시예 11과 동일한 스케줄로 항아시알로 GM1 항체 또는 토끼 IgG의 투여, CT-26 세포의 이식, 및 치료약의 투여를 실시하고, 치료약을 투여한 날의 4일 후에 PEC를 회수하여, 플로 사이토메트리에 제공하였다.

플로 사이토메트리는, 상기 APC 표적 항 CD45R/B220 항체(Biolegend 제, 클론 RA3-6B2), PE 표적 항 CD49b 항체(Beckton Dickinson 제, 클론 DX5)을 사용하여, 상기 〔실험 방법〕의 (4)에 나타낸 방법으로 실시하였다.

도 13은, 항아시알로 GM1 항체의 투여의 유무에 의한, 마우스 유래 PEC의 해석 결과의 차이를 나타내는 도이다. 도 13의 (a) 내지 (d)는, 항아시알로 GM1 항체를 투여하지 않은 마우스(상기 군 1) 유래의 PEC의 해석 결과를 나타내고, (e) 내지 (h)는, 항아시알로 GM1 항체를 투여한 마우스(상기 군 2) 유래의 PEC의 해석 결과를 나타낸다.

도 13의 (a) 및 (e)에 있어서 가로축은 DX5의 발현 강도를 나타내고, 세로축은 B220(CD45)의 발현 강도를 나타내고 있다. R4는 NKG2D를 발현하고 있는 세포, R5는 T 세포, R6은 NK 세포(Pre-mMK를 포함한다)를 나타내고 있다.

도 13의 (a)에 있어서, R4가 47.91％, R5가 21.99％, R6이 16.96％ 이다. 또한, 도 13의 (e)에 있어서, R4가 36.82％, R5가 48.97％, R6이 4.45％ 이다.

도 13의 (b) 및 (f)는 각각, (a), (e)의 R4에 존재하는 NKG2D를 발현하고 있는 세포의 수를 나타내고, 도 13의 (c) 및 (g)는 각각, (a), (e)의 R5에 존재하는 T 세포의 수를 나타내고, 도 13의 (d) 및 (h)는 각각, (a), (e)의 R6에 존재하는 NK 세포(Pre-mMK를 포함한다)의 수를 나타내고 있다.

도 13으로부터, 상기 군 2 유래의 PEC에서는, NK 세포의 비율이 대폭 감소하고, T 세포의 비율이 증가하고 있음을 알 수 있다. 이러한 NK 세포의 감소에 의해서, 도 12에 나타내는 결과가 초래된 것으로 생각된다. 요컨대, 본 발명에 관련된 암 치료약에 의한 항종양 효과에는, 항체 및 IL-18에 의해서 유도된 활성형의 NK 세포가 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각된다.

〔실시예 13: 항아시알로 GM1 항체의 투여에 의한, NK 세포에 특이적인 세포 표면 마커의 발현의 변화〕

본 실시예에서는, 항아시알로 GM1 항체를 투여한 마우스의 PEC를 플로 사이토메트리에 의해서 해석하여, NK 세포에 특이적인 세포 표면 마커의 발현의 변화에 대해서 검토하였다.

실시예 12와 동일하게, 상기 군 1 및 군 2의 마우스에 관해서 PEC를 회수하고, 플로 사이토메트리에 제공하였다. 플로 사이토메트리는, 상기 비오틴 표적 항 CD11c 항체(Beckton Dickinson 제, 클론 HL3), PE 표적 항 NK1.1 항체(BD Bioscience 제, 클론 PK136), APC 표적 항 CD62L 항체(BD Bioscience 제, 클론 MEL-14), PE 표적 항 CD69 항체(eBiocience 제, 클론 H1.2F3), PE 표적 항 CD49b 항체(Beckton Dickinson 제, 클론 DX5)를 사용하여, 상기 〔실험 방법〕의 (4)에 나타낸 방법으로 실시하였다.

도 14는, 항아시알로 GM1 항체의 투여의 유무에 의한, 마우스 유래 PEC에 있어서의 표면 마커의 해석 결과의 차이를 나타내는 도이다. 도 14의 (a) 내지 (d)는, 항아시알로 GM1 항체를 투여하지 않은 마우스(상기 군 1) 유래의 PEC의 표면 마커의 해석 결과를 나타내고, (e) 내지 (h)는, 항아시알로 GM1 항체를 투여한 마우스(상기 군 2) 유래의 PEC의 표면 마커의 해석 결과를 나타낸다. 가로축은 DX5의 발현 강도를 나타내고, 세로축은 각 표면 마커의 발현 강도를 나타낸다.

도 14에 나타내는 NK1.1, CD11c, CD62L, CD69는 모두, NK 세포(Pre-mMK를 포함한다)에 특유한 표면 마커이다. 도 14의 (a) 내지 (d)와, (e) 내지 (h)를 각각 대비하면, 상기 군 2 유래의 PEC에서는 어느 표면 마커를 발현하는 세포도 감소하고 있음을 알 수 있다. 이러한 NK 세포의 감소에 의해서, 도 12에 나타내는 결과가 초래된 것으로 생각된다. 요컨대, 본 발명에 관련된 암 치료약에 의한 항종양 효과에는, 항체 및 IL-18에 의해서 유도된 활성형의 NK 세포가 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각된다.

〔실시예 14: 항아시알로 GM1 항체의 투여에 의한, CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 증가〕

본 실시예에서는, 항아시알로 GM1 항체를 투여한 마우스의 PEC를 플로 사이토메트리에 의해서 해석하여, CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 세포수의 변화에 대해서 검토하였다.

실시예 12와 동일하게, 상기 군 1 및 군 2의 마우스에 관해서 PEC를 회수하여, 플로 사이토메트리에 제공하였다.

플로 사이토메트리는, 상기 FITC 표적 항 CD4 항체(eBioscience 제, 클론 GK1.5), APC 표적 항 CD8 항체(Biolegend 제, 클론 54-6.7), PE 표적 항 CD25 항체(BD Bioscience 제, 클론 PC-61)를 사용하여, 상기 〔실험 방법〕의 (4)에 나타낸 방법으로 실시하였다.

도 15는, 항아시알로 GM1 항체의 투여의 유무에 의한, 마우스 유래 PEC에 있어서의 CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 T 세포의 발현 강도, 및, CD25 양성 T 세포의 세포수를 확인한 결과를 나타내는 도이다.

도 15의 (a), (c)에 있어서 가로축은 TCR-β의 발현 강도를 나타내고, 세로축은 CD4의 발현 강도를 나타낸다. 도 15의 (b), (d)에 있어서 가로축은 CD25의 발현 강도를 나타내고, 세로축은, CD4 양성 CD25 양성 T 세포의 수를 나타낸다. 도 15의 (e), (f)에 있어서 가로축은 TCR-β의 발현 강도를 나타내고, 세로축은 CD8의 발현 강도를 나타낸다.

CD4 양성 T 세포, CD25 양성 T 세포는, 전술한 바와 같이 억제성의 T 림프구로, 상기 세포의 증가는 암 세포의 증식을 돕게 된다. 한편, CD8 양성 T 세포는 항종양 효과를 갖는 세포이다.

항아시알로 GM1 항체를 투여한 경우, 도 15의 (a)와 (c)의 대비로부터, 도면 중의 오른쪽 위의 에어리어에 존재하는 CD4 양성 T 세포가 전체 PEC에서 차지하는 비율은 7.59％에서 17.02％로 크게 증가되어 있음을 알 수 있다.

또한, 도 15의 (b)와 (d)의 대비로부터, CD4 양성 CD25 양성 세포가 전체 PEC에서 차지하는 비율도 2.34％에서 7.87％로 크게 증가되어 있었다. 한편, 도 15의 (e)와 (f)의 대비로부터, CD8 양성 T 세포가 전체 PEC에서 차지하는 비율은 2.26％에서 1.22％로 거의 반감되어 있는 것을 알 수 있었다.

이 결과는, 항아시알로 GM1 항체를 미리 투여한 마우스에서는, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체, 및 IL-18을 투여하더라도 억제성 림프구를 증가시켜, CD8 양성 T 세포가 감소해 버리는 것을 나타내고 있다. NK 세포는, CD8 양성 T 세포를 활성화하는 것이 알려져 있고, NK 세포가 감소하면 CD8 양성 T 세포도 감소해 버린다.

따라서, 본 실시예의 결과로부터, 본 발명에 관련된 암 치료약은 NK 세포를 활성화시키고, NK 세포를 활성형으로서 장기간 지속시켜, 그 결과 CD8 양성 T 세포를 활성화함으로써 우수한 항종양 효과를 나타내는 것이 시사된다.

〔실시예 15: 복수의 저장에 대한 치료 효과〕

본 실시예에서는, 종양 세포를 이식한 마우스에 있어서의 복수의 저장에 대한, 본 발명에 관련된 암 치료약의 효과를 검토하였다.

CT-26 세포의 현탁액(5.0×10⁴개/0.25 ㎖)을 0.25 ㎖, 상기 BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하였다. 마우스는, 치료약으로서, 대조로서의 토끼 IgG 100 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍을 투여하는 군; 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 IL-18 2 ㎍을 투여하는 군으로 나누고, 각 군은 5마리의 마우스로 구성하였다. CT-26 세포를 이식한 날로부터 3일 후에, 상기 치료약을 복강내 주사하고, 그 후, 4일마다 합계 4회, 상기 치료약을 복강내 주사하였다. 그리고, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일 후에 복수의 저장에 대한 치료 효과를 검토하였다.

도 16은, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일 후에 있어서의 상기 각 군 마우스에 관해서, 복수의 유무를 나타내는 외관 사진이다.

도 17은, 상기 각 군의 마우스의 복위의 변화를 나타내는 도이다. 가로축은 CT-26 세포를 이식한 날로부터의 일수를 나타내고, 세로축은 복위(㎜)를 나타낸다. 복위는 각 군을 구성하는 마우스에 관해서 측정하여, 그 평균치를 구하였다.

도 17에 나타내는 바와 같이, 대조는, CT-26 세포의 이식 후 26일째에는 복수의 저장에 수반하여 복위가 현저히 증가해서 115 ㎜에 이르고, 이후 유지되었다. 한편, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 투여한 마우스는, 복위가 80 ㎜ 전후라는 낮은 레벨에 그치고, CT-26 세포의 이식 후 56일째에도, 이식 후 1일째와 그다지 변화하지 않았다. 또한, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 투여한 마우스는, 항 CTLA-4 항체만을 투여한 마우스와 비교하더라도 복위가 크게 억제되어 있어, 복수의 저장가 인정되지 않았다.

도 18은, 상기 각 군의 마우스의 체중의 변화를 나타내는 도이다. 가로축은 도 17과 동일하고, 세로축은 체중(g)을 나타낸다. 체중은, 각 군을 구성하는 마우스에 관해서 측정하여, 그 평균치를 구하였다.

체중에 관해서도, 대조는 복수의 저장에 의해 현저한 상승이 보이고, 항 CTLA-4 항체만을 투여한 마우스에서도, CT-26 세포의 이식 후 42일째 이후에는 대조와 큰 차이가 없는 체중까지 증가하였다.

한편, 항 CTLA-4 항체 및 IL-18을 투여한 마우스는, 복수의 저장가 인정되지 않아, 도 18에 나타내는 바와 같이 분명히 체중이 낮게 억제되고, 낮은 상태로 유지되어 있었다.

도 19는, 상기 대조(도 19의 (a))와, 항 CTLA-4 항체를 투여한 마우스(도 19의 (b))에 관해서, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 복강의 모양을 나타내는 도이다. 도 19에 나타내는 바와 같이, 양자 모두 많은 종양 덩어리가 보이고, 장기의 유착도 보였다.

도 20은, 상기 대조(도 20의 (a) 및 그 확대도인 (b))와, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스(도 20의 (c) 및 그 확대도인 (d))에 관해서, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 복강의 상태를 나타내는 도이다. 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스에서는, 종양 덩어리 및 장기의 유착은 보이지 않고, 장기의 상태가 매우 양호하게 유지되어 있었다.

도 21은, 상기 대조의, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 소장의 외관을 나타내는 도이다. 도 22는, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스의, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 소장의 외관을 나타내는 도이다. 양자의 대비로부터 분명한 바와 같이, 대조에서는 다수의 종양 덩어리가 형성되어 있는 데 반하여, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스에서는, 거의 종양 덩어리는 관찰되지 않았다.

도 23은, 상기 대조(도 23의 (a) 내지 (c))와, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스(도 23의 (d) 내지 (f))에 관해서, CT-26 세포를 이식한 날로부터 21일후의 십이지장((a), (d)), 소장((b), (e)), 대장((c), (f))의 일부분의 외관을 나타내는 도이다.

도 23으로부터, 대장에서는 대조와, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스에서 그다지 차이는 보이고 있지 않지만, 십이지장 및 소장에서는, 대조에 있어서 종양 덩어리가 형성되어 있는 데 반하여, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 마우스에서는 깨끗한 상태가 유지되어 있었다.

도 20의 (c), (d), 도 22,도 23의 (d) 내지 (f)에 나타내는 바와 같이, 장 등에서 강한 자기면역과 비슷한 병변이 있는 것처럼은 보이지 않았다. 또한, 항 CTLA-4 항체 및/또는 항 PD-L1 항체, 및 IL-18을 투여한 마우스는, 관찰에 있어서는 건강하고, 체중의 감소 등도 보이지 않았다.

이상의 결과로부터, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 사용한 경우, 마우스 대장암 세포인 CT-26 세포를 이식한 것에 의한 복막 파종이 충분히 억제되어 있음을 알 수 있다. 위암, 대장암, 난소암, 골육종 및 백혈병 등은 복막 파종하여 치료 곤란을 일으키는 것이 알려져 있지만, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 복막 파종을 유효하게 억제할 수 있기 때문에, 이들 암의 치료에 매우 유효한 치료약이라고 말할 수 있다.

〔실시예 16: 본 발명에 관련된 암 치료약의 부작용에 관한 검토〕

실시예 15에서는, 본 발명에 관련된 암 치료약을 투여한 마우스에 있어서, 강한 자기면역과 비슷한 병변은 보이지 않고, 체중의 감소 등도 확인되지 않았기 때문에, 본 발명에 관련된 암 치료약은 부작용이 경감된 것임이 시사되었다. 그래서 본 실시예에서는, 본 발명에 관련된 암 치료약의 부작용에 관해서 보다 상세하게 검토하였다. 구체적으로는, IL-18이 상기 암 치료약의 유효 성분인 항체의 부작용을 증악시킬 가능성에 대해서 검토하였다.

실시예 1과 동일하게, CT-26 세포(세포 농도 5.0×10⁴개/0.25 ㎖)의 현탁액을 0.25 ㎖, BALB/C 야생형 마우스의 복강내에 주사하여, 이식하였다.

상기 마우스는, 치료약으로서, 대조로서의 PBS를 0.25 ㎖ 투여하는 군(군 1); 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 항 PD-L1 항체 200 ㎍을 투여하는 군(군 2); 항 CTLA-4 항체 100 ㎍, 항 PD-L1 항체 200 ㎍ 및 IL-18(2 ㎍)을 투여하는 군(군 3); 항 CTLA-4 항체 100 ㎍, 항 PD-L1 항체 200 ㎍ 및 IL-18(10 ㎍)을 투여하는 군(군 4)으로 나누고, 각 군은 5마리의 마우스로 구성하였다. 또한, PBS, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18의 투여량(㎍)은, 마우스의 체중 25 g 당의 투여량이다.

상기 CT-26 세포를 주사한 날의 3일후로부터 4일마다, 합계 4회, 상기 치료약을 상기 마우스에게 복강내 주사하였다. 상기 CT-26 세포를 주사한 날의 18일 후에 혈액 및 조직을 채취하여, 간 기능, 신 기능 외에, 장, 간장, 신장 등의 조직 병변에 관해서 조사하였다. 또한, 실험은 3회 반복하여 실시하였다.

도 24는, 전술한 CT-26 세포의 이식과 치료약의 투여 스케줄을 나타내는 도이고, CT-26 세포를 이식한 날을 "Day 0"으로 하여, 그 날의 3일후, 7일후, 11일후, 15일 후에 상기 치료약의 복강내 투여를 실시하고, 18일 후에 마우스를 도살하는 것을 나타내고 있다.

도 25는, 상기 혈액 중의 알부민 농도(도 25의 (a)), 총빌리루빈 농도(도 25의 (b)), AST(GOT) 농도(도 25의 (c)) 및 ALT(GPT) 농도(도 25의 (d))를 측정한 결과를 나타내는 도이다. 도 26은, 상기 혈액 중의 LD(LDH) 농도(도 26의 (a)), 크레아티닌 농도(도 26의 (b)), ALP 농도(도 26의 (c)), 및 요산 농도(도 26의 (d))를 측정한 결과를 나타내는 도이다. 도 27은, 상기 혈액 중의 요소질소 농도를 측정한 결과를 나타내는 도이다. 또한, 도면 중의 "Negative Control"은, CT-26 세포의 이식 및 치료약의 투여를 실시하지 않은 건강한 정상 마우스 (이하 "정상(健常) 컨트롤군"이라고 부른다)의 혈액을 사용한 경우의 결과이다.

도 25의 (a)의 "αCTLA-4＋αPD-L1"에 나타내는 바와 같이, 항 CTLA-4 항체 100㎍ 및 항 PD-L1 항체 200 ㎍을 투여한 상기 군 2에서는, 혈중 알부민 농도가, 정상 컨트롤군과 비교하여 유의하게 저하되어 있었다. 도 28의 (a) 내지 (d)는, 상기 군 1 내지 군 4의 마우스의 간장의, 헤마톡실린 에오진(HE)에 의한 조직 염색 결과를 나타내는 도이고, 배율은 200배이다.

상기 군 2의 간장 조직의 관찰 결과를 도 28의 (b)에 나타낸다. 이 군의 모든 마우스에 있어서, 도 28의 (b)와 동일하게, 다수의 세포 분열상(像)이 보였다. 도 25의 (a) 및 도 28의 (b)에 나타내는 결과는, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체가, 간 조직 장애 등의 부작용을 가지고 있을 가능성을 나타내고 있다.

또한, 도 26의 (b)의 "αCTLA-4＋αPD-L1"에 나타내는 바와 같이, 상기 군 2에서는 혈중 크레아티닌이 높은 경향이 있어, 신장에 대해서도 가벼운 정도의 장애를 야기했을 가능성이 고려된다.

한편, 항 CTLA-4 항체 및 항 PD-L1 항체와, IL-18을 조합하여 투여한 군(군 3, 군 4)에서는, 도 25의 (a)에 나타내는 바와 같이 혈중 알부민 농도는 정상 마우스의 것과 거의 동일하였다. 또한, 도 28의 (c), (d)에 나타내는 바와 같이, 간장 조직에 있어서의 세포 분열상도 보이지 않았다. 그리고, 도 26의 (b)에 나타내는 바와 같이, 혈중 크레아티닌에 관해서도, 군 3, 군 4에서는 정상 컨트롤군의 것과 거의 동일하였다. 혈중의 요소질소는, 도 27에 나타내는 바와 같이, 군 3에 있어서 억제 경향이 보였다.

도 26의 (c), 도 25의 (d)에 나타내는 바와 같이, 혈중 ALP 및 혈중 ALT(GPT)의 값은, 암 세포 이식만으로 치료를 실시하지 않은 군(도면 중 "PBS"로 나타낸 상기 군 1)에서는 현저히 저하되어 있지만, 군 3 및 군 4에서는 정상 컨트롤군의 값에 가까운 값을 나타내고 있었다. 한편, 군 2에 관해서는, 혈중 ALP는 군 1과 거의 변함이 없고, 혈중 ALT(GPT)는 군 1보다도 현저히 저하되어 있었다. 도 26의 (c), 도 25의 (d)의 결과로부터, 군 3및 군 4에서는, IL-18에 의해서 혈중 ALP 및 혈중 ALT(GPT)의 값이 개선되었음이 시사되었다.

본 실시예의 결과는, 항 CTLA-4 항체와 항 PD-L1 항체의 조합이 부작용으로서 간장, 신장 등에 장애를 일으킬 가능성을 나타내고 있고, IL-18은 상기 부작용을 억제하거나, 장애로부터의 수복을 촉진하는 것을 시사하고 있다. 항 CTLA-4 항체와 항 PD-L1 항체 중 어느 쪽이 조직 장애에 관여하고 있는지 등에 대해서는, 금후 추가적인 검토를 실시할 필요가 있다.

전술한 바와 같이, 상기 군 2에서는, 알부민, ALT(GPT), 및 ALP의 혈중 농도가 정상 컨트롤군보다 크게 저하되고, 크레아티닌의 혈중 농도가 정상 컨트롤군보다 크게 증가하였다. 한편, 상기 군 3및 군 4에 관해서는, 군 4에서 AST(GOT)가 정상 컨트롤군보다 증가하는 경향을 나타내고 (도 25의 (c)), 군 3에서 요소질소가 정상 컨트롤군보다 억제되는 경향을 나타내었다(도 27). 또한, 요산에 관해서는 군 3 및 군 4에서 정상 컨트롤군보다 증가되어 있었다(도 26의 (d)).

그러나, 도 25 내지 27에 나타내는 9항목 중, 군 2에서는 4항목이 정상 컨트롤군보다 크게 벗어나는 결과가 된 것; 군 3과 군 4가 모두 정상 컨트롤군보다 떨어지는 결과를 나타낸 것은 요산에 관해서만이었던 것; 을 고려하면, 종합적으로 보아, 상기 군 3 및 군 4에서 사용한 치료약은, 군 2에서 사용한 치료약보다 부작용이 적은 것으로 생각된다.

도 29 및 30은 위, 도 31은 십이지장, 도 32는 소장, 도 33은 대장, 도 34는 신장의, 헤마톡실린 에오진(HE)에 의한 조직 염색 결과를 나타내고 있고, 도 29 내지 34에 있어서, (a) 내지 (d)는 각각 상기 군 1 내지 군 4의 마우스의 조직을 관찰한 결과를 나타내고 있다. 도 29 내지 34로부터 알 수 있듯이, 위, 십이지장, 소장, 대장 및 신장의 조직은, 군 1 내지 군 4의 사이에서 거의 다름이 보이지 않았다.

〔실시예 17: B16 흑색종 세포의 전이에 대한 암 치료약의 효과〕

B16 흑색종 세포(흑색종)는 암의 전이 모델로서 종종 사용된다. 본 실시예에서는, B16 흑색종 세포(2×10⁵개)를 마우스(C57BL/6, 일본 SLC)의 꼬리정맥으로부터 이입하고, 수 주일 후에 폐에 생긴 검은 소결절(노듈)의 수를 세어 전이의 많고 적음을 측정하였다.

B16 흑색종 세포의 셀라인은, ATCC로부터 구입한 것을 사용하여, 실시예 1에 기재한 것과 동일한 방법에 의해, 세포 농도가 2×10⁵개/0.25 ㎖인 현탁액을 조제하고, 당해 현탁액 0.25 ㎖를 상기 C57BL/6 마우스의 꼬리정맥에 주사하였다.

상기 마우스는, 치료약으로서, 대조로서의 PBS를 0.25 ㎖ 투여하는 군(군 1); 항 CTLA-4 항체 100 ㎍ 및 항 PD-L1 항체 200 ㎍을 투여하는 군(군 2); 항 CTLA-4 항체 100 ㎍, 항 PD-L1 항체 200 ㎍ 및 IL-18(2 ㎍)을 투여하는 군(군 3); 으로 나누고, 각 군은 4마리의 마우스로 구성하였다. 또한, PBS, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18의 투여량(㎍)은, 마우스의 체중 25 g 당의 투여량이다.

도 35는, B16 흑색종 세포의 이식과, 치료약의 투여 스케줄을 나타내는 도이고, B16 흑색종 세포를 이식한 날을 "Day 0"으로 하여, 그 날의 3일후, 7일후, 11일후, 15일 후에 상기 치료약의 복강내 투여를 실시하고, 28일 후에 마우스를 도살하는 것을 나타내고 있다.

도살한 마우스로부터 폐를 적출하여, 폐에 생긴 검은 소결절(노듈)의 수를 세어 전이의 많고 적음을 측정하였다. 도 36 내지 38은 각각, 상기 군 1 내지 군 3의 마우스의 폐에 생긴 소결절을 관찰한 결과를 나타내는 도이고, 각 도면의 (a) 내지 (d)는, 시험에 사용한 4마리의 마우스의 결과를 나타내고 있다.

컨트롤군(상기 군 1)에 있어서의 폐 표면의 소결절의 수는 평균 233＋/－22.6이지만, 항 CTLA4 항체 및 항 PD-L1 항체를 B16 흑색종 세포의 이식 3일후로부터 4일마다 합계4회 투여한 군(상기 군 2)에서는 179＋/－14.0, 항 CTLA4 항체, 항 PD-L1 항체 및 IL-18을 투여한 군(상기 군 3)에서는 121＋/－42.7이었다.

상기 군 3의 결과는 상기 군 2의 결과에 대하여 통계학적인 유의차는 나타내지 않았지만, 도 37과 도 38의 대비로부터 알 수 있듯이, 장기로의 전이는 군 3이 군 2보다 억제되어 있다. 이 결과로부터, 본 실시예에서는 4마리의 마우스를 시험에 사용했지만, 시험한 마우스의 수를 보다 많게 하는 것, 또는 실시예 1 과 같이, B16 흑색종 세포를 이식한 날로부터의 마우스의 생존율을 경시적으로 구하는 것에 의해서 상기 유의차가 나타날 가능성은 충분히 있는 것으로 생각된다.

또한, 항 CTLA4 항체 및 항 PD-L1 항체를 복강내에 투여하고, IL-18을 피하에 투여한 경우도, 상기 군 3의 치료 효과는, 상기 항체 및 IL-18을 함께 복강내 투여한 경우와 차이는 없었다. 이는, 상기 항체 및 IL-18이 함께 혈중으로 이행되기 때문에, 투여 경로에 상관없이 동일한 효과를 나타낸 것으로 생각된다.

〔정리〕

실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 관련된 암 치료약은, 항 CTLA-4 항체, 항 PD-L1 항체 등의 분자 표적 항체와 IL-18을 병용함으로써, 암 복막 파종 모델에 있어서 매우 우수한 항종양 효과를 나타내는 것이 분명해졌다. 이밖에, 폐 전이 모델이나 고형 암 모델에 있어서도 동일하게 강한 항종양 효과를 나타내었다. 이는, IL-18이 분자 표적 항체의 치료 효과를 현저히 높이는 것에 의한 것으로 생각된다.

요컨대, IL-18이, 종양 세포가 이입된 마우스의 복강에서 CD8 양성 T 세포, NK 세포 등의 이펙터 세포의 활성화나 증식의 촉진을 실시함에 따라서 분자 표적 항체의 치료 효과가 높아지고 있는 것으로 생각된다.

특히, B220 양성, DX5 양성, CD11c 양성의 NK 유사 세포(IKDC라고 불린다. IKDC란 Interferon introducing killer dendritic cells의 약칭)가 IL-18에 의해서 증가하는 것이, 상기 병용에 의한 항종양 효과의 증대에 관계하고 있는 것이 시사된다.

한편, 상기 병용에 의해서 CD4 양성 T 세포의 증식은 억제되기 때문에, 상기 병용에 의해서 Treg 등의 면역/염증 억제 작용을 갖는 림프구의 증식을 촉진하는 일은 없을 것으로 생각된다.

또한, 항 CTLA-4 항체 및/또는 항 PD-L1 항체, 및 IL-18을 투여한 마우스는, 건강하고, 체중 감소 등은 보이지 않으며, 장 등에 강한 자기면역과 비슷한 병변이 있는 것처럼은 보이지 않았다. 또한, 간 기능, 신 기능, 및 조직 병변에 대해서 검토한 결과, 본 발명에 관련된 암 치료약의 부작용이 적다고 생각되는 것이 확인되었다.

이상의 사실로부터, 본 발명에 관련된 암 치료약은 우수한 항종양 효과를 나타내는 유용한 치료약이라고 할 수 있고, 특히, 복막 파종을 수반하는 암의 치료에 유효하다고 할 수 있다.

산업상 이용가능성

본 발명은 암의 치료, 특히, 복막 파종을 수반하는 암의 치료에 유효하게 이용할 수 있다. 의약 및 이와 관련된 분야에 있어서 널리 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> HYOGO COLLEGE OF MEDICINE <120> THERAPEUTIC AGENT FOR CANCER WHICH COMPRISES COMBINATION OF IL-18 AND MOLECULE-TARGETING ANTIBODY <130> IPA170168-JP <150> JP2014-161799 <151> 2014-08-07 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155 <210> 2 <211> 157 <212> PRT <213> Murine <400> 2 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155

Claims

IL-18 및,
항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 및 항 CTLA-4 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체
를 유효 성분으로서 병용하는 것을 특징으로 하는 암 치료약.
IL-18 및,
항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 및 항 CTLA-4 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체
를 유효 성분으로서 조합하는 것을 특징으로 하는 암 치료약.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 암 치료약은, IL-18과 상기 항체가 혼합되지 않고, 독립적으로 존재하는 것을 특징으로 하는 암 치료약.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 암 치료약은, IL-18과 상기 항체가 혼합된 조성물인 것을 특징으로 하는 암 치료약.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 항체가, 항 PD-L1 항체 및/또는 항 CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 암 치료약.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, IL-18의 질량과, 상기 1 이상의 항체의 질량의 합계와의 비가 1:25 내지 1:200인 것을 특징으로 하는 암 치료약.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 암 치료약이, 위암, 대장암, 난소암, 골육종, 백혈병 및 흑색종으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 암의 치료약인 것을 특징으로 하는 암 치료약.