CN101641116A

CN101641116A - 通过施用人il-18组合来治疗癌症的方法

Info

Publication number: CN101641116A
Application number: CN200880009463A
Authority: CN
Inventors: 兹登卡·哈斯科瓦; 兹登卡·L·乔纳克; 斯蒂芬·H·特鲁利; 玛格丽特·N·惠塔克里
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2010-02-03
Also published as: ZA200905693B; ZA200906292B

Abstract

一般地，本发明涉及人IL－18组合在治疗各种形式的实体瘤和淋巴瘤中的用途。具体地，本发明涉及：(1)人IL－18与针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体的组合；和(2)人IL－18与化疗剂的组合。

Description

通过施用人IL-18组合来治疗癌症的方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求两件较早的美国临时申请，2007年7月26日提交的美国申请No.60/952,002和2007年3月23日提交的美国申请No.60/896,855的优先权。

发明领域

一般地，本发明涉及与针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体组合的，或与化疗剂组合的IL-18(也称为干扰素-γ诱导因子，IGIF)治疗癌症的用途。

发明背景

白介素-18(IL-18)是在先天性免疫应答和获得性免疫应答中均起作用的一种有力细胞因子。在临床前研究中，IL-18诱导T细胞和天然杀伤(NK)细胞合成IFN-γ，提升NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的溶细胞活性，促进活化的CD4T细胞分化成辅助效应细胞，而且诱导免疫记忆。基于广谱的免疫刺激特性，已经在多种临床前肿瘤模型中研究了IL-18。在免疫原性肿瘤中观察到作为单一疗法使用的IL-18的抗肿瘤活性。在MOPC-315浆细胞瘤(高度免疫原性肿瘤)的晚期肿瘤(大于100cm³)模型中观察到最有力的抗肿瘤效果。因为肿瘤通常是非免疫原性的，所以临床前研究的焦点在于IL-18与单克隆抗体或化疗剂的联合疗法。这些研究显示了组合两种不同药剂的益处，其中每种药剂具有不同肿瘤杀伤机制，导致协同性抗肿瘤活性。

活性人IL-18含有157个氨基酸残基。它具有有力的生物学活性，包括诱导T细胞和脾细胞生成干扰素-γ，增强NK细胞的杀伤活性和促进幼稚CD4⁺T细胞分化成Th1细胞。另外，人IL-18提升GM-CSF的生成，并降低IL-10的生成。CD4⁺T细胞是所有免疫应答的中枢调控元件。它们分成两个子集，Th1和Th2。每个子集以其分泌不同细胞因子的能力来限定。有趣的是，最有力的分化诱导物是细胞因子自身。幼稚前体发育成Th2细胞是由IL-4诱导的。在发现IL-18前，认为IL-12是主要的Th1诱导性细胞因子。

Th1细胞分泌IL-2、干扰素-γ、和TNF-β。干扰素-γ(特征性的Th1细胞因子)直接对巨噬细胞起作用以增强它们杀微生物的和吞噬细胞的活性。结果，活化的巨噬细胞能有效地破坏胞内病原体和肿瘤细胞。Th2细胞生成IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，它们通过帮助B细胞发育成抗体生成细胞而起作用。总之，Th1细胞主要负责细胞介导的免疫，而Th2细胞负责体液免疫。

基于广谱的免疫刺激特性，已经在多种临床前肿瘤模型中研究了IL-18。在免疫原性肿瘤中观察到作为单一疗法使用的IL-18的抗肿瘤活性。在MOPC-315浆细胞瘤(高度免疫原性肿瘤)的晚期肿瘤(大于100cm³)模型中观察到最有力的抗肿瘤效果。在这种模型中，每日施用鼠IL-18(5mg/Kg)持续约30天导致可再现的肿瘤消退和治愈。用亲本肿瘤再次考验导致肿瘤排斥，提示对免疫记忆的诱导。关于此模型中牵涉细胞免疫的别的证据来自在携带晚期MOPC-315肿瘤的重度联合免疫缺陷小鼠(SCID)中进行的实验，所述晚期MOPC-315肿瘤在使用类似的IL-18日程表后未能消退。关于IL-18介导细胞免疫的进一步支持还来自对对照和经IL-18处理的小鼠中建立的MOPC-315肿瘤实施的免疫组织化学。这表明相对于对照而言，经IL-18处理的动物中由CD8⁺T淋巴细胞、NK细胞、活化的巨噬细胞、和树突细胞组成的细胞浸润增加。在体外，来自用IL-18处理的动物的PBMC或脾细胞显示了针对肿瘤的NK和CTL细胞毒性。另外，看起来完整的Fas/Fas配体途径对抗肿瘤应答是有益的。

利妥昔单抗(rituximab)是一种嵌合单克隆抗体，其由识别人CD20抗原的鼠抗原结合位点与人IgG1恒定区融合而组成。利妥昔单抗(作为单一药剂)在无痛性NHL中具有显著活性。在166名患有复发性或顽固性无痛性NHL的患者的枢要单臂临床研究(pivotal single-arm clinical study)中，总体应答率是48％，且完全应答(CR)率是6％。McLaughlin等，J.Clin.Oncol.16：2825-2833(1998)。在先前未治疗的患有无痛性NHL的患者中，利妥昔单抗疗法具有64-73％的总体应答率和15-26％的CR率。Hainsworth等，Blood 95：3052-3056(2000)；Colombat等，Blood 97：101-106(2001)。此外，多项随机化III期研究显示了，向常规化疗添加利妥昔单抗改善了NHL患者的存活。Marcus等，Blood105：1417-1423(2005)；Marcus等，Blood 104：3064-3071(2004)；Hiddemann等，Blood 106：3725-3732(2005)；Feugier等，J.Clin.Oncol.23：4117-4126(2005)。然而，由于化疗的毒性较高，利妥昔单抗单一疗法仍被认为是无痛性淋巴瘤患者中的一个选项。

正在进行研究，以确定增强抗肿瘤活性的方式，并改善利妥昔单抗的功效。数种机制可有助于利妥昔单抗的体内功效。利妥昔单抗对淋巴瘤细胞表面上的CD20的结合能触发胞内信号传导途径，导致凋亡或程序性细胞死亡。Shan等，Blood 91：1644-1652(1998)；Pedersen等，Blood 99：1314-1319(2002)。此外，利妥昔单抗能活化补体种类，引起补体依赖性细胞溶解。Cragg等，Blood 101：1045-1052(2003)；Manches等，Blood 101：949-954(2003)。然而，越来越多的证据提示，ADCC在施用利妥昔单抗后在消除肿瘤细胞中发挥支配性作用。Mabches等，见上文；Golay等，Haematologica 88：1002-1012(2003)；Clynes等，Nat.Med.6：443-446(2000)。在抗体的恒定(Fc)区结合至效应细胞(诸如NK细胞或单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)表面上的Fc受体时，ADCC被触发。

在人B细胞淋巴瘤的鼠模型中，在缺乏活化性Fc受体的小鼠中，利妥昔单抗的功效被消除。相比之下，在缺乏抑制性Fc受体的小鼠中，单克隆抗体疗法得到增强。携带Fc受体的效应细胞对于利妥昔单抗在此模型中的功效是至关重要的。人体内的主要活化性Fc受体是CD16(FcγRIIIA)，其由NK细胞和单核细胞表达。已经显示了，人FcγRIIIA基因中第158位的多态性(苯丙氨酸对缬氨酸)与对利妥昔单抗的响应相关。158VV纯合基因型与在体外较强的IgG结合人NK细胞和触发通过NK细胞进行的ADCC有关(Koene等，Blood 90：1109-1114(1997)；Dall’Ozzo等，Cancer Res.64：4664-4669(2004))，而且还与利妥昔单抗疗法后较高的应答率有关。Weng等，J.Clin.Oncol.21：3940-3947(2003)；Cartron等，Blood 104：2635-2642(2004)。这些数据支持如下假设，即NK细胞介导的ADCC对于利妥昔单抗疗法在淋巴瘤患者中的效力是重要的。

一种用于改善利妥昔单抗功效的策略是施用能引起携带Fc受体的效应细胞(包括NK细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)扩充和/或活化的细胞因子。I期临床试验显示了，利妥昔单抗能安全地与IL-2、IL-12、或GM-CSF组合地给予淋巴瘤患者。Rossi等，Blood 106：2760(abst 2432)(2005)；McLaughlin等，Ann.Oncol.16(Suppl 5)：v68(abstr 104)(2005)；Ansell等，Blood 99：67-74(2002)；Eisenbeis等，Clin.Cancer Res.10：6101-6110(2004)；Gluck等，Clin.Cancer Res.10：2253-2264(2004)；Friedberg等，Br.J.Haematol.117：828-834(2002)。在这些研究中观察到22-79％的总体客观应答率(overallobjective response rate)和5-45％的完全应答率(complete response rate)。另外，生物标志(诸如绝对NK计数和离体ADCC活性)与应答率相关。这些研究中的大多数主要包括患有复发性和顽固性疾病和患有攻击性淋巴瘤亚型(DLBCL和套细胞淋巴瘤)的患者。这些不利患者群体中相对较高的客观应答率指明，细胞因子和利妥昔单抗的组合值得在B细胞淋巴瘤中进一步调查。

发明概述

一方面，本发明涉及一种在有所需要的患者中治疗癌症的方法，包括分开给所述患者施用(或是同时地，或是序贯地)包含如下各项的组合物的步骤：(i)与载体组合的人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)；和(ii)针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体，其中所述抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能，且进一步地其中所述抗体不是抗CD20抗体。

这第一种方法可以牵涉施用包含针对选自下组的抗原的单克隆抗体的组合物：CD22、CD19、HER2、HER3、EGFR(Erbitux)、IGF-1R、AXL-1、FGFR、整联蛋白受体、CEA、CD44、和VEGFR。另一方面，所述抗原是HER-2，且所述单克隆抗体是

另外，这种方法牵涉治疗选自下组的癌症：何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、B细胞非何杰金氏淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin’s lymphoma)、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、T细胞非何杰金氏淋巴瘤(T-cell Non-Hodgkin’s lymphoma)、AML、CLL、MM、其它白血病(leukemias)、卵巢癌(ovarian cancer)、乳腺癌(breast cancer)、肺癌(lung cancer)、肉瘤(sarcoma)、膀胱癌(bladder cancer)、胰腺癌(pancreaticcancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、肝瘤(hepatoma)、胃癌(gastric cancer)、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms’tumor)、成神经细胞瘤(neuroblastoma)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)和其它脑瘤(brain tumors)、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectalcancer)、前列腺癌(prostate cancer)、黑素瘤(melanoma)、肾细胞癌(renal cellcarcinoma)、和皮肤癌(skin cancers)。

第二方面，本发明关于一种在有所需要的患者中治疗癌症的方法，包括分开给所述患者施用(或是同时地，或是序贯地)包含如下各项的组合物的步骤：(i)与载体组合的人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)；和(ii)化疗剂。这种方法中的化疗剂可以选自下组：doxil(盐酸多柔比星脂质体)、托泊替康(topotecan)、改变DNA的药物(例如卡铂(carboplatin))、抗代谢物(例如吉西他滨(gemcitabine))、阻止细胞分裂的药物(例如长春新碱(vincristine))和抗血管发生剂(例如帕唑帕尼(pazopanib))。在这种方法中，要治疗的癌症选自下组：何杰金氏淋巴瘤、B细胞非何杰金氏淋巴瘤、T细胞非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肉瘤、膀胱癌、甲状腺癌、肝瘤、胃癌、维尔姆斯氏肿瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、结肠直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、和肾细胞癌。

另一方面，本发明提供了供癌症治疗中使用的组合物，其包含人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)和针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体，其中所述抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能，且其中所述抗体不是抗CD20抗体。包含所述hIL-18多肽(SEQ ID NO：1)和所述抗体的组合物可以分开给所述患者施用，或任选地，同时地或序贯地。

另一方面，本发明提供了包含人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)和针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗患者中的癌症，其中所述单克隆抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能，且其中所述抗体不是抗CD20抗体。所述hIL-18多肽和所述抗体可以分开给所述患者施用，任选地，同时地或序贯地。

另一方面，本发明提供了包含人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)的组合物在制备药物中的用途，所述药物与针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体组合地用于治疗患者中的癌症，其中所述单克隆抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能，且其中所述抗体不是抗CD20抗体。

另一方面，本发明提供了针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体在制备药物中的用途，所述药物用于包含具有人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)的组合的组合物，用于治疗患者中的癌症，其中所述单克隆抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能，且其中所述抗体不是抗CD20抗体。

另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含：(i)人IL-18多肽(SEQ IDNO：1)，和(ii)化疗剂，其用于治疗癌症。包含所述hIL-18多肽(SEQ ID NO：1)和所述化疗剂的组合物可以分开给所述患者施用，任选地，同时地或序贯地。

另一方面，本发明提供了包含人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)和化疗剂的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。所述hIL-18多肽(SEQ ID NO：1)和化疗剂可以分开给所述患者施用，任选地，同时地或序贯地。

另一方面，本发明提供了人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)在制备药物中的用途，所述药物与化疗剂组合地用于组合物，用于治疗癌症。

另一方面，本发明提供了化疗剂在制备药物中的用途，所述药物用于包含具有人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)的组合的组合物，用于治疗癌症。

又一方面，本发明提供了一种在有所需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给所述患者施用包含与化疗剂或针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体组合的人IL-18(SEQ ID NO：1)的组合物的步骤，其中所述抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能，且进一步地其中所述抗体不是抗CD20抗体，由此所述治疗导致所述患者中的长期存活和/或对癌症复发的预防和对免疫记忆的诱导。

附图简述

图1显示了天然人IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2显示了鼠IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3显示了与

组合的mIL-18(SEQ ID NO：2)在人B细胞淋巴瘤鼠模型中的抗肿瘤活性。

图4显示了在使用GraphPad

对来自图3的数据进行绘图和分析时的统计学显著性。具体地，此图比较植入后第19天的肿瘤体积。

图5显示了人B细胞淋巴瘤模型中鼠IL-18(SEQ ID NO：2)/

组合的植入后第25天肿瘤体积。

图6A和图6B显示了人B细胞淋巴瘤模型中鼠IL-18(SEQ IDNO：2)/

组合的肿瘤生长体积中值和均值。

图7和图8显示了人B细胞淋巴瘤模型中鼠IL-18(SEQ IDNO：2)/

组合的植入后第27天肿瘤体积，与任一单独的药剂相比。

图9显示了与多柔比星组合的mIL-18(SEQ ID NO：2)处理后的EL-4T细胞存活，与单独的多柔比星和单独的IL-18两者相比。

图10显示了图9中所表明的数据的存活者概率曲线图，其显示了EL-4T细胞淋巴瘤模型中给定药物的剂量与抗肿瘤活性之间的相关性。

图11A和图11B显示了EL-4T细胞淋巴瘤模型中与单独的mIL-18(SEQID NO：2)和单独的多柔比星两者相比多柔比星/IL-18组合的植入后第13天的PBL(图11A)和脾细胞(图11B)的Facs分析。

图12显示了EL-4T细胞淋巴瘤模型中与单独的IL-18和单独的多柔比星两者相比多柔比星/mIL-18(SEQ ID NO：2)组合的处理后21小时的NK细胞毒性测定法。

图13显示了MOPC315.D3j005研究中mIL-18(SEQ ID NO：2)和

的联合疗法对SCID小鼠中MOPC315鼠浆细胞瘤生长的影响。(数据以均值+/-SD表示。)

图14显示了MOPC315.D3j005研究中mIL-18(SEQ ID NO：2)和

的联合疗法对SCID小鼠中MOPC315鼠浆细胞瘤生长的影响。(数据以中值+/-SD表示。)

图15显示了mIL-18(SEQ ID NO：2)和

的联合疗法对SCID小鼠中MOPC315鼠浆细胞瘤生长的植入后第24天的肿瘤体积的统计学差异。(数据以均值+/-SD表示。)

图16显示了mIL-18(SEQ ID NO：2)和

的联合疗法对SCID小鼠中MOPC315.D3j005鼠浆细胞瘤生长的植入后第24天的肿瘤体积。(数据以中值+/-SD表示。)

图17显示了MOPC315.D3j03研究中mIL-18(SEQ ID NO：2)和

图18显示了MOPC315.D3j03研究中mIL-18(SEQ ID NO：2)和

图19显示了MOPC315.D3j03研究中来自mIL-18(SEQ ID NO：2)和的联合疗法的SCID小鼠中植入后第24天的MOPC315浆细胞瘤体积。(数据以均值+/-SD表示。)

图20显示了MOPC315.D3j03研究中来自mIL-18(SEQ ID NO：2)和

的联合疗法的SCID小鼠中植入后第24天的MOPC315浆细胞瘤体积。(数据以中值+/-SD表示。)

图21显示了接种后第24天mIL-18(SEQ ID NO：2)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的联合疗法在同基因鼠Colo26结肠癌模型中的效果。(数据以均值+/-SD表示。)

图22显示了接种后第24天mIL-18(SEQ ID NO：2)和5-FU的联合疗法在同基因鼠Colo26结肠癌模型中的效果。(数据以中值+/-SD表示。)

图23显示了接种后第24天mIL-18(SEQ ID NO：2)和5-FU的联合疗法在同基因鼠Colo26结肠癌模型中的效果，并且为了更好地观察单独的IL-18和与5-FU的组合之间的统计学显著性而排除对照组。(数据以均值+/-SD表示。)

图24显示了mIL-18(SEQ ID NO：2)和5-FU的联合疗法在同基因鼠Colo26结肠癌模型中的效果。(数据以中值+/-SD表示。)

图25显示了mIL-18(SEQ ID NO：2)和5-FU的联合疗法在同基因鼠Colo26结肠癌模型中的效果。(数据以均值+/-SD表示。)

图26显示了接种后第24天mIL-18(SEQ ID NO：2)和5-FU的联合疗法在同基因鼠Colo26结肠癌模型中的效果。(数据以Kaplan-Meyer存活曲线表示。)

图27显示了小鼠肾癌瘤的晚期同基因模型中植入后第32天mIL-18(SEQID NO：2)和帕唑帕尼(GW786034)(VEGFR和PDGFR和c-kit酪氨酸激酶的一种抑制剂)的联合疗法对肿瘤生长的影响。(c-Kit受体属于III型酪氨酸激酶受体，其由胞外配体结合域和胞内激酶域组成。c-Kit受体在极其多种正常的和赘生性的组织中表达)。

图28显示了小鼠肾癌瘤的晚期同基因模型中植入后第32天mIL-18(SEQID NO：2)和帕唑帕尼(GW786034)的联合疗法对肿瘤生长的影响。此图比较所述组合与单独的IL-18或帕唑帕尼的单一疗法的统计学显著性。

图29显示了经IL-2处理的免疫缺陷小鼠的体重增加，所述小鼠接受来自EL-4肿瘤存活者或来自未接触抗原的对照的细胞的过继转移。

图30显示了接种EL-4肿瘤后用IL-2疗法处理的Pfp/Rag2接受者小鼠的百分比存活。

发明详述

因为肿瘤通常是非免疫原性的，所以临床前研究的焦点聚焦于IL-18与化疗剂或与单克隆抗体的联合疗法。在组合物中组合两种不同药剂(每种药剂具有不同的肿瘤杀伤机制)导致协同性抗肿瘤活性。下文呈现IL-18联合疗法的4个例子。

实施例1聚焦于与组合的IL-18在人B细胞淋巴瘤中的应用。此研究的目标是调查IL-18和的组合在人B细胞淋巴瘤模型中是否提供超过单独的IL-18或

的单一疗法的益处。利妥昔单抗是一种得到批准的嵌合单克隆抗体，其由识别人CD20抗原的鼠抗原结合位点和人IgG1恒定区组成。促成利妥昔单抗在体内的功效的作用机制包括结合至CD20阳性淋巴瘤细胞后对凋亡的诱导、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。越来越多的证据提示，ADCC在施用利妥昔单抗后在消除肿瘤细胞中发挥支配性作用。在抗体的恒定(Fc)区结合至效应细胞(诸如天然杀伤(NK)细胞、T细胞、或单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)表面上的Fc受体后，ADCC被触发。因为IL-18提升并活化ADCC效应细胞，所以预期这两种试剂的组合显示会导致卓越抗肿瘤活性的协同性。

利妥昔单抗

是一种嵌合单克隆抗体，其由识别人CD20抗原的鼠抗原结合位点与人IgG1恒定区融合而组成。CD20抗原在恶性和非恶性B淋巴细胞上表达。作为单一药剂，

在NHL中具有显著活性。

是商品化的。

多柔比星(Doxorubicin)(阿霉素(adriamycin))是一种商品化的化疗剂，并用于治疗乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、肝瘤、胃癌、维尔姆斯氏肿瘤、成神经细胞瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、和卵巢癌。

实施例2显示了EL-4T细胞淋巴瘤模型中的IL-18与多柔比星的组合。此研究的目标是调查同基因EL-4T细胞淋巴瘤肿瘤模型中的IL-18与多柔比星的组合，并证明联合疗法超过单独的IL-18或多柔比星的单一疗法的益处。这种同基因模型揭示IL-18对宿主免疫细胞的免疫刺激活性的全部益处。因为这两种试剂具有非常不同的作用机制，所以它们可以彼此互补，导致抗肿瘤活性升高。有提示的是，化疗剂提供直接的细胞毒性、肿瘤抗原的断裂和调控，而IL-18提升并活化效应细胞，导致卓越的抗原呈递和协同性抗肿瘤活性。

组合物中IL-18与单克隆抗体的组合(例如IL-18与利妥昔单抗

)在晚期肿瘤模型(SCID小鼠异种移植物)中显示协同性抗肿瘤活性。利妥昔单抗是一种得到批准的嵌合单克隆抗体，其由识别人CD20抗原的鼠抗原结合位点和人IgG1恒定区组成。作为单一药剂的利妥昔单抗在无痛性非何杰金氏淋巴瘤中具有显著活性。促成利妥昔单抗体内功效的作用机制包括结合至CD20阳性的淋巴瘤细胞后对凋亡的诱导、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。实施例1中所显示的临床前数据证明IL-18和利妥昔单抗的组合导致协同性抗肿瘤活性。因为利妥昔单抗仅结合表达CD20的人肿瘤细胞，所以对抗肿瘤活性的评估限于SCID小鼠异种移植物模型。认为IL-18和利妥昔单抗的抗肿瘤活性和协同性归于NK细胞，它们在SCID小鼠中应答IL-18和鼠CDC而活化。因为SCIDS没有活化T细胞的能力，所以不能在此模型中测试潜在CTL提升和记忆生成的分支(arm)。

组合中IL-18与化疗剂的组合在治疗各种形式的癌症中可能会具有有益的治疗效果。例如，实施例2显示，IL-18与多柔比星的组合在同基因晚期EL4T细胞淋巴瘤肿瘤模型中具有协同性抗肿瘤活性。此数据提示，IL-18的作用机制包括卓越的抗原呈递，在抗肿瘤活性中起关键作用的抗肿瘤CTL和NK细胞的扩充。基于这些结果，IL-18与其它化疗剂的组合可能会导致肿瘤消退、肿瘤治愈和对免疫记忆的诱导。

在临床试验中，显示IL-18单一疗法是安全的、耐受良好的、和有生物学活性的(如通过生物标志变化所测量的)。在临床前，IL-18单一疗法仅在免疫敏感性肿瘤模型中起作用。非免疫原性模型仅在IL-18与其它抗癌剂组合时才显示抗肿瘤活性。

重组鼠IL-18(SEQ ID NO：2)已经证明了经由多种机制的临床前抗肿瘤活性，包括CD4⁺、CD8⁺、和NK细胞以及Fas/FasL途径和细胞因子/趋化因子(诸如INFγ、GM-CSF、IP-10、MCP-1)的活化，和效应细胞在肿瘤中的浸润及对免疫记忆的诱导。在我们的临床前模型中已经证明了IL-18的益处，诸如对溶胞性T细胞的诱导，活化的NK细胞和在抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中起关键作用的细胞的扩充。

下文实施例调查IL-18与其它临床重要癌症治疗的组合是否会导致增强的抗肿瘤活性，其优于单独的人IL-18单一疗法。本申请例示了IL-18联合疗法的5个例子：(1)人B细胞淋巴瘤异种移植物模型中IL-18和

的组合；(2)同基因T细胞淋巴瘤模型中IL-18和多柔比星的组合；(3)鼠浆细胞瘤模型中IL-18和

的组合；和(4)鼠结肠肿瘤模型中IL-18和5-FU的组合；和(5)肾癌瘤的鼠模型中IL-18和帕唑帕尼(VEGFR、PDGFR、和c-kit酪氨酸激酶的一种抑制剂)的组合。所有的这些组合提供超过单独的IL-18、

多柔比星、

5-FU或帕唑帕尼的单一疗法的益处。

与单克隆抗体的组合提供增强杀死肿瘤细胞的ADCC机制的潜力。本申请中所公开的临床前数据支持这种机制，并显示

的抗肿瘤活性在与mIL-18(SEQ ID NO：2)组合时得到增强。数种机制可能促成

的功效；然而，越来越多的证据提示，ADCC在施用

后在消除肿瘤细胞中起支配性作用。在抗体的恒定(Fc)区结合至效应细胞(诸如天然杀伤(NK)细胞或单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)表面上的Fc受体后ADCC被触发。在人B细胞淋巴瘤的一种鼠模型中，在缺乏活化性Fc受体的小鼠中

的功效被消除。Cartron等，Blood 99：754-758(2002)；Dall’Ozzo等，Cancer Res 64：4664-4669(2004)；Koene等，Blood 90：1109-1114(1997)；Weng等，J Clin Oncol 21：3940-3947(2003)。如此，携带Fc受体的效应细胞对于

的功效是至关重要的。CD16(FcγRIIIA)在人体内是重要的Fc受体，其由NK细胞和巨噬细胞表达。同上。实施例1中的数据支持如下假设，即NK细胞介导的ADCC对于

疗法在淋巴瘤患者中的效力是重要的。

一种用于改善功效的有希望的策略是施用能引起携带Fc受体的效应细胞(包括NK细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞)扩充和/或活化的细胞因子，诸如IL-18。实施例1中用IL-18与

组合进行的临床前小鼠肿瘤模型研究显示了超过单一疗法的益处。在这种模型中，无法测试IL-18的全部益处，因为该模型要求仅具有NK功能细胞的SCID免疫受损小鼠中的人异种移植物。然而，实施例1中的数据支持的是，这些ADCC NK效应细胞的扩充在IL-18和

组合中显示益处。

作为单一疗法在所测试的最高剂量是有活性的。然而，在与mIL-18(SEQ ID NO：2)联合使用较低剂量的

时能看到类似水平的活性，指明两点，即该模型对的机制敏感，和响应可以由IL-18增强。认为IL-18与其它针对诸如CD22、CD19、HER2、HER3、EGFR(Erbitux)、IGF-1R、IGF-1R、AXL-1、FGFR、整联蛋白受体、CEA、CD44和VEGFR等抗原的单克隆抗体和其它抗血管发生剂的组合会显示相同协同效应。事实上，进一步设想IL-18与针对肿瘤细胞表面上所找到的抗原的其它单克隆抗体的类似组合会以相同方式起作用，所述肿瘤细胞表达所生成的单克隆抗体所针对的受体。理想的是，此类受体会结合NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、和任何其它含有Fc受体并参与ADCC效应器活性的细胞。

实施例1和2中的数据提示，抗癌剂与IL-18的组合可显示临床益处，因为这些组合提供了两种不同作用机制：一种对肿瘤细胞直接作用，而IL-18能够提升患者的免疫细胞。这两种机制能彼此互补，而且潜在地导致持久的、卓越的抗肿瘤活性，这是由于IL-18产生免疫记忆的能力。总的来说，实施例1和2证明IL-18与抗肿瘤剂(或是单克隆抗体或是化疗剂)的组合导致协同性和卓越的活性。

IL-18与化疗剂多柔比星的组合显示了超过单独的IL-18或多柔比星的卓越抗肿瘤活性。值得注意的是，实施例2显示IL-18与多柔比星的组合不破坏响应IL-18处理而扩充的活化的免疫细胞。令人惊讶的是，与此相反，实施例2证明该组合提升活化的T和NK细胞，并维持它们的溶胞功能。

实施例3是目前正在进行的I期临床方案，用以评估IL-18与利妥昔单抗组合在CD20⁺B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)患者中的安全性和生物学活性。此研究使用利妥昔单抗与渐增剂量的IL-18组合的标准治疗方案以鉴定安全的且可耐受的，而且给出最大限度的生物学效应(如由选定的生物标志例如活化的NK细胞所表明的)的剂量。自此研究选定的剂量会在将来的II期研究中使用，所述II期研究评估IL-18/利妥昔单抗组合在复发性滤泡性淋巴瘤患者中的功效。鉴于IL-18在以单一疗法给转移性黑素瘤患者施用时优良的安全性和耐受性概况，预期不会在本研究中达到组合的最大限度耐受剂量(MTD)；然而，若在非何杰金氏淋巴瘤患者中鉴定出剂量限制性毒性，则将此研究设计成限定MTD。

实施例4提供了人IL-18与

的联合疗法对鼠浆细胞瘤(用ErbB2(HER2)转染的MoPC315细胞)生长的分析和数据。对数据的详细分析揭示IL-18和

的联合疗法优于单独的

的单一疗法。基于这些数据，认为人IL-18与肿瘤细胞上所表达的抗原的其它抗体会是有效的治疗组合。

实施例5评估IL-18与5-氟尿嘧啶(5-FU)的联合疗法的功效，与单独的5-FU或mIL-18的单一疗法相比。5-FU是目前在临床中作为用于治疗结肠直肠癌和胰腺癌的一线化疗剂之一使用的嘧啶类似物。然而，这种化疗剂具有多种严重的副作用，而且希望使用与其它药剂的联合疗法来降低其剂量的可能性。在BALB/c小鼠中在鼠结肠癌瘤的完善建立的同基因皮下模型Colo26中实施此研究。实施例5中对肿瘤体积数据的详细分析揭示，与对照组相比，10μg IL-18和75μg 5-FU的联合疗法是对肿瘤生长具有显著效果的唯一处理组。这意味着联合疗法(75μg/10μg)优于单独的5-FU或单独的mIL-18的单一疗法组，因为单一疗法没有显示好于对照的治疗效果。与IL-18组合的其它化疗剂，诸如doxil、托泊替康、改变DNA的药物(例如卡铂)、抗代谢物(例如吉西他滨)、阻止细胞分裂的药物(例如长春新碱)和抗血管发生剂(例如帕唑帕尼)。

实施例6提供了小鼠肾细胞癌瘤模型中IL-18和帕唑帕尼(GW786034)(VEGFR和PDCFR和c-kit酪氨酸激酶的一种抑制剂)的联合疗法的功效的研究。c-Kit受体属于III型酪氨酸激酶受体，其由胞外配体结合域和胞内激酶域组成。c-Kit受体在极其多种正常的和赘生性的组织中表达。这些数据显示帕唑帕尼与IL-18的组合导致在与每种单独的单一疗法相比时在统计学上显著的抗肿瘤活性(协同性)。

实施例7是解决IL-18作为记忆诱导物的作用的研究，所述记忆会导致长期存活和预防肿瘤复发。此实施例测试在EL-4肿瘤模型中的功效，其中用鼠IL-18(SEQ ID NO：2)和多柔比星的组合处理小鼠。接受存活者淋巴细胞的EL-4接受者小鼠比接受来自正常的、未接触抗原的供体的淋巴细胞的对照小鼠存活得显著更长。数据暗示，来自存活小鼠的过继转移对EL-4肿瘤接受者具有保护效应。这些数据提供EL-4肿瘤存活者中的记忆T细胞的间接证明(图29和图30)。这是一项重要发现，能使任何化疗剂或单抗与IL-18的组合成为优于任何单一疗法的癌症治疗。对能将肿瘤识别为“外来的”并预防复发的记忆T细胞的诱导会是高度有益的，并且具有优良安全概况的IL-18是供任何潜在联合疗法用的药物。

人IL-18多肽披露于EP 0692536A2、EP 0712931A2、EP0767178A1、和WO 97/2441。天然人IL-18(“hIL-18”)的氨基酸序列列于SEQ ID NO：1中。人IL-18多肽是干扰素-γ诱导多肽。它们在对细胞介导的免疫的诱导中起主要作用，包括诱导T细胞和脾细胞生成干扰素-γ、增强NK细胞的杀伤活性、和促进未接触抗原的CD4⁺T细胞分化成Th1细胞。

可以通过公知方法自重组细胞培养物回收并纯化本发明的多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析、凝集素层析、和高效液相层析。多肽在胞内合成、分离和/或纯化过程中变性后，可采用用于重折叠蛋白质的公知技术来重建活性构象。用于纯化和生成活性人IL-18的方法在WO01/098455中列出。

本发明还提供了包含人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)及其组合的药用组合物。此类组合物包含治疗有效量的化合物，并可进一步包含药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类药用载体可以是无菌的液体，诸如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成起源的，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。可在静脉内施用药用组合物时使用水作为载体。也可采用盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液作为液体载体，例如用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。若想要的话，组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放配制剂等形式。组合物可用传统的粘合剂和载体(诸如甘油三酸酯)配制成栓剂。口服配制剂可包括标准的载体，诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药用载体的例子记载于E.W.Martin的REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES。此类组合物会含有治疗有效量的化合物(通常以纯化形式)以及合适量的载体，以便提供用于向患者正确施用的形式。配制剂应当适合施用模式。

在本发明的一个实施方案中，依照常规规程将组合物配制成适宜向人类静脉内施用的药用组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌的、等张的水缓冲液中的溶液。在合适的情况中，组合物还可以包括增溶剂和在注射位置减轻疼痛的局部麻醉剂诸如利多卡因(lignocaine)。一般而言，以单位剂量形式分开地或混合在一起地提供各成分，例如指明活性剂数量的密封容器诸如安瓿或小袋(sachette)中的干燥的冻干粉或无水浓缩液。若通过输注来施用组合物，则其可用含有无菌的药用级水或盐水的输液瓶来分配。若通过注射来施用组合物，则可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可在施用前混合各成分。

因而，可以在药物制造中使用所述多肽。本发明的药物组合物可以配制成供胃肠外施用的溶液或冻干粉。使用前可通过添加合适的稀释剂或其它药学可接受载体来使粉末重建。液体配制剂可以是缓冲的、等张的水溶液。合适的稀释剂的例子是正常的、等张的盐水溶液、水中的标准的5％右旋糖或缓冲的醋酸钠或醋酸铵溶液。此类配制剂尤其适合于胃肠外施用，但也可用于口服施用或包含于供吸入用的定量吸入器或雾化器中。可能希望向此类药物组合物添加赋形剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠、或柠檬酸钠。

或者，可以以乳剂或糖桨包囊、制片或制备多肽，供口服施用。可添加药学可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂、或明胶。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐水、和水。载体还可包括单独的或与蜡一起的持续释放物质，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固体载体的量有所不同，但是会在每剂量单位约20mg-约1g之间。药物制剂遵循常规药学技术来制备，对于片剂形式，在合适时牵涉碾磨、混合、粒化、和压紧；或者对于明胶硬胶囊形式，牵涉碾磨、混合和填料。在使用液体载体时，制剂会处于糖浆、酏剂、乳剂、或水的、或非水的悬浮液形式。这样的液体配制剂可通过口(p.o.)直接施用或填充入明胶软胶囊中。

人IL-18多肽可制备为在药学可接受载体中含有有效量的作为活性成分的多肽的药物组合物。在本发明的组合物中，可以采用含有多肽的、缓冲于生理学pH的、准备好进行注射的形式的水悬浮液或溶液。供胃肠外施用的组合物通常会在药学可接受的载体(诸如水性载体)中包含所溶解的本发明多肽或其混合物的溶液。可以采用多种水性载体，例如0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的，且通常没有颗粒物。这些溶液可以通过常规的、公知的灭菌技术(例如过滤)来灭菌。组合物可以含有接近生理学条件所要求的药学可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂等。依照选定的特定施用模式，本发明的多肽在此类药物配制剂中的浓度可以有广泛变化，即从小于约0.5％，通常为或至少约1％，至多达15或20％(按重量计算)，并且主要会根据液体体积、粘度等来选择。

如此，用于肌肉内注射的本发明药物组合物可以制备成含有1mL无菌缓冲水，和约1ng-约100mg之间(例如约50ng-约30mg，或约5mg-约25mg)的本发明多肽。类似地，用于供静脉内输注的本发明药物组合物可以制成含有约250mL无菌Ringer氏溶液，和约1mg-约30mg、或约5mg-约25mg本发明多肽。用于制备可胃肠外施用的组合物的现行方法是公知的或者对于本领域技术人员会是显而易见的，而且更详细地记载于例如REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCE，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。

本发明的多肽在药物制剂中制备时可以以单位剂量形式存在。本领域技术人员能容易地确定合适的治疗有效剂量。若合适的话，可以在响应期期间以内科医生酌情选定的合适时间间隔重复这样的剂量。另外，任选的是，可以采用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。配制剂中要采用的精确剂量还会取决于施用路径、和疾病或病症的严重性，并且应当依照从业人员的判断和每名患者的情况决定。有效剂量可以从自体外或动物模型测试系统衍生的剂量-响应曲线外推。

对于多肽，给患者施用的剂量通常是0.1mg/kg至100mg/kg患者体重。给患者施用的剂量可以在0.1mg/kg和20mg/kg患者体重之间，或者，1mg/kg至10mg/kg患者体重。一般而言，人多肽具有比来自其它物种的多肽要长的人体内半衰期，这是由于对外来多肽的免疫应答。如此，人多肽的较低剂量和较不频繁的施用通常是有可能的。此外，可通过修饰诸如例如脂化(lipidation)来增强抗体的摄取和组织穿透(例如进入脑中)，从而降低本发明多肽的施用剂量和频率。

本发明还提供了药物包或试剂盒，其包含装有本发明药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。任选地，此类容器可以结合有由管理药物或生物学产品的制备、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映该机构对针对人体施用的制备、使用或销售的批准。在本发明的另一个实施方案中，试剂盒可以装备有满足用于治疗特定适应症的剂量要求所需要的合适数目的容器。

在另一个实施方案中，化合物或组合物可以在媒介物(特别是脂质体)中投递(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，于LIPOSOMESIN THE THERAPY OF INFECTIOUS DI SEASE AND CANCER，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss，New York，页353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上，页317-327；通常参见同上)。

在又一个实施方案中，化合物或组合物可以在受控释放系统中投递。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，见上文；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参见MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE，Langer和Wise(编)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)；CONTROLLED DRUGBIOAVAILABILITY，DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE，Smolen和Ball(编)，Wiley，New York(1984)；Ranger等，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；还可参见Levy等，Science 228：190(1985)；During等，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71：105(1989))。在又一个实施方案中，受控释放系统可放置在治疗靶(即脑)的附近，如此仅需要系统剂量的一部分(参见例如Goodson，于MEDICALAPPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE，见上文，卷2，页115-138(1984))。Langer(Science 249：1527-1533(1990))的综述中讨论了其它受控释放系统。

人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)可以通过任何合适的内部路径施用，而且可以根据需要重复，例如频率为每天1-3次持续1天-约3周之间至每周一次或两周一次。或者，可改变所述肽以降低电荷密度，如此容许口服生物利用度。治疗的剂量和持续时间与本发明的分子在人循环中的相对持续时间有关，并且可由本领域技术人员根据所治疗的疾患和患者的一般健康来调整。

本发明提供了通过给人患者施用有效量的包含人IL-18多肽(SEQ IDNO：1)的本发明药物组合物或化合物来治疗、抑制和预防的方法。在本发明的一个实施方案中，化合物是基本上纯化的(例如基本上没有限制其效果或产生不想要的副作用的物质)。可在化合物包含上文所描述的多肽时采用配制剂和施用方法；可从那些下文中所描述的之中选择别的合适的配制剂和施用路径。

多种投递系统是已知的，并且可用于施用本发明的化合物，例如脂质体、微粒、微胶囊中的包囊，能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的胞吞(参见例如Wu等，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。导入方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、和口服路径。化合物或组合物可通过任何常规路径，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(mucocutaneouslining)(例如口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)的吸收来施用，并且可以与其它生物学活性剂一起施用。施用可以是系统的或局部的。另外，可能想要的是，通过任何合适的路径(包括脑室内和鞘内注射)将本发明的药物化合物或组合物导入中枢神经系统中；可用例如附接至贮器(诸如Ommaya贮器)的脑室内导管来促进脑室内注射。还可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器和含雾化剂的配制剂实现。

在不背离本发明的精神或本质属性的前提下，本发明可以以其它特定的形式体现，因而，应当参考指明本发明范围的所附的权利要求书，而非上述说明书或下列实施例。

术语表

提供了下列定义以便于理解上文中频繁使用的某些术语。

如本文中所使用的，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”和“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能”都属于细胞介导的免疫的机制，由此免疫系统的效应细胞活跃地溶解已经被特定抗体所结合的靶细胞。ADCC是抗体(作为体液免疫应答的一部分)可经由它们而起作用以限制并遏制感染的机制之一。经典的ADCC是由天然杀伤(NK)细胞介导的，但是嗜曙红细胞使用另一种ADCC来杀死某些称为蠕虫的寄生虫。由于ADCC依赖于在先抗体应答，其是适应性免疫应答的一部分。

典型的ADCC牵涉NK细胞的活化，并依赖于NK细胞表面上的Fc受体对抗体包被的感染细胞的识别。Fc受体识别结合至病原体感染的靶细胞的表面的抗体(诸如IgG)的Fc(恒定的)部分。NK细胞表面上存在的Fc受体称为CD16或FcγRIII。一旦结合至IgG的Fc受体，天然杀伤细胞便释放细胞因子(诸如IFN-γ)和细胞毒性颗粒(诸如穿孔素和粒酶)，它们进入靶细胞并通过触发凋亡来促进细胞死亡。这种ADCC效应器功能类似于，但不依赖于细胞毒性T细胞(CTL)的应答。

如本文中所使用的，术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。

如本文中所使用的，术语“完全响应”指癌症的所有迹象响应治疗而消失。本领域技术人员也称“完全响应”为“完全消退”。在下文实施例中所采用的模型中，实现“完全响应”的动物指可测量的肿瘤消退至测量不到的阶段。换言之，它意味着动物被“治愈”，并表现出健康。

“分离的”指自其天然状态“人为”改变的，即若它在自然界中存在，则它已经自其最初环境改变或取出，或改变和取出两者。例如，在本文中采用该术语时，活生物体中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与其天然状态中至少一种其共存的细胞物质分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。此外，通过转化、遗传操作或通过任何其它重组方法导入生物体中的多核苷酸或多肽是“分离的”，即使它仍存在于所述生物体中，所述生物体可以是活的或无生命的。

如本文中所使用的，术语“药用的”包括本发明的兽医应用。术语“治疗有效量”指对缓和选定的疾患有用的治疗剂的量。

如本文中所使用的，术语“药学可接受的”意味着获得联邦或州政府管理机构批准的或美国药典或其它普遍认可的药典中所列的在动物中，更具体地在人中使用的。

“多肽”指任何包含两个或更多个彼此由肽键或修饰的肽键(即肽等排体)相连接的氨基酸的多肽。“多肽”指短链(通常称为肽、寡肽或寡聚物)和较长的链(通常称为蛋白质)两者。多肽可以含有20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通过天然过程(诸如翻译后加工)或通过本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰详细记载于基础教科书和更详细的专著，以及多卷的研究文献中。修饰可以在多肽中的任何地方发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以领会的是，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的数个位点。还有，给定多肽可以含有许多类型的修饰。多肽可以由于遍在蛋白化而分支，并且它们可以是环状的、有分支的或没有分支的。环状的、分支的和分支环状的多肽可以源自翻译后天然过程或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素化、黄素的共价附着、血红素模块的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(诸如精氨酰化)、和遍在蛋白化(参见例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；Wold，F.，Post-translational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，1-12，于POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，编，Academic Press，New York，1983；Seifter等，Meth Enzymol，182，626-646，1990；Rattan等，Ann.NYAcad.Sci.，663：48-62(1992))。

如本文中所使用的，术语“存活动物”指不因自发的肿瘤相关死亡而死亡的、或不因肿瘤体积达到预先确定的非人道的巨大体积而实施安乐死的、或不因药物毒性相关原因而实施安乐死的动物。

生物学方法/实施例

实施例1：用于鼠人B细胞淋巴瘤模型中IL-18与

联合疗法的实验方案

人IL-18(SEQ ID NO：1)是大肠杆菌(Escherichia coli)的非病原性菌株中所表达的人白介素-18的重组成熟形式。IL-18是18Kd的非糖基化单体，具有与IL-1β和IL-1三叶(trefoil)亚家族最紧密相关的一级结构。鼠和人IL-18cDNA编码由192个和193个氨基酸(分别是SEQ ID NO：2和1)组成的前体蛋白。IL-18原要求由胱天蛋白酶加工成有生物活性的成熟蛋白质(157个氨基酸)，以便介导其生物学活性。人和鼠IL-18之间的同源性是65％。在下文所概述的临床前研究中，使用鼠IL-18(SEQ ID NO：2)，以便提供体内同基因系统，在那里可以分析IL-18的全部免疫学潜力。

在缺乏T细胞和B细胞两者的远交雌性纯合SCID小鼠(ICR-Prkdc^scid)中实施该研究。使用远交系与使用近交系相比的优点在于远交的ICR SCID系不展现泄漏(leakiness)(即使在10-12月龄小鼠中)。

给小鼠注射最初自患有伯基特氏淋巴瘤的3岁患者衍生的人Ramos B细胞淋巴瘤系(ATCC目录，CRL 1596)。将肿瘤1∶10匀浆物以每只小鼠0.5ml的剂量接种入6-8周龄小鼠中。一周2-3次测量肿瘤体积，并将小鼠随机分配入处理组中以使得各组具有相等的肿瘤体积分配。在每组肿瘤体积中值达到80-150mm³时(接种肿瘤后第12天时)启动疗法。另外，从该研究中排除那些生长体积在设置限度以外的肿瘤的小鼠。

在第一项研究中，处理组(n＝6)包括对照组(没有疗法)、3个

I.V.单一疗法组(分别为12.5、25、和50μg/小鼠BIW)、mIL-18 S.C.单一疗法组(100μg/小鼠q.d.)、和3个联合疗法组，每组分别接受100μg/小鼠IL-18S.C.q.d.加上12.5、25、或50μg/小鼠

在第二项研究中，剂量给药由以SID日程表的100μg/小鼠mIL-18(SEQ IDNO：2)和以qd4/3日程表的25和12.5μg

组成。动物数目增加至n＝12，以便具有测量统计学显著性的更好窗口。使用viener测径器一周2-3次测量肿瘤体积。

在人B细胞淋巴瘤模型中IL-18和

的联合疗法提供超过单独的IL-18或

的单一疗法的益处。下文详述的两个实验显示联合疗法在此模型中的统计学显著益处。

在图3中所捕获的第一项实验中，高剂量的

(100μg/剂)显示了作为单一药剂疗法的强烈抗肿瘤活性，而在较低的剂量(12.5g/剂)，

没有活性。鼠IL-18(SEQ ID NO：2)作为单一药剂(100μg/剂)没有活性。然而，在与较低剂量的组合时，mIL-18(SEQ ID NO：2)显示加性/协同性活性(12.5μg/剂

与100μg mIL-18(SEQ ID NO：2)组合)。

在使用GraphPad

对数据绘图并分析后，在下图4和图5中表明统计学显著性。在这些图的第一幅(图4)中，在植入后第19天比较肿瘤体积。统计学分析显示与未处理对照组相比所有处理组中肿瘤生长的显著降低(^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)。第二幅图(图5)显示了联合疗法比单独的单一疗法更有效(统计学上显著的，^*p＜0.05，^**p＜0.01)。

在第二项实验中，增加动物的数目(n＝12)提供响应联合疗法的加性/协同性性抗肿瘤活性的更好的统计学显著性。图6A和图6B中的图代表肿瘤生长体积中值和均值。在植入肿瘤后第27天分析该研究。此研究正在进行中，并会在肿瘤体积中值达到2000mm³时终止(ACUC方案)。然而，植入后第27天的数据分析(图7和8)表明与单独的

(25μg/小鼠)或单独的mIL-18(SEQ ID NO：2)单一疗法(100μg/小鼠)相比，用联合疗法(25/100μg/小鼠)处理的小鼠中有肿瘤体积的统计学显著降低。

此临床前数据表明IL-18与利妥昔单抗的组合导致协同性抗肿瘤活性。利妥昔单抗作为单一疗法在所测试的最高剂量是有活性的。然而，在与鼠IL-18(“mIL-18”)联合使用较低剂量的利妥昔单抗时能看到类似水平的活性，指明该模型对利妥昔单抗是敏感的，并且该响应可由IL-18增强。鼠IL-18增强利妥昔单抗的活性，推测通过提升NK细胞中的ADCC活性来实现。因为SCID小鼠缺乏B和T细胞应答两者，所以IL-18经由NK细胞活化来提升抗肿瘤应答。

另外，对非人灵长类施用IL-18产生体内对NK细胞和单核细胞的活化，并导致单核细胞上Fc受体(FcγRI)的上调。Herzyk等，Cytokine 20：38-48(2002)。在SCID小鼠模型中与HERCEPTIN^TM联合使用IL-18时也观察到协同性抗肿瘤活性，这支持如下假设，即IL-18经由NK细胞活化来提高ADCC活性。

实施例2：用于EL-4T细胞淋巴瘤中IL-18与多柔比星的组合的实验方案

在雌性C57/BL/6小鼠中实施研究。作为一般性方案，给C57/BL小鼠I.P.注射0.2cc EL-4细胞储液。在RPMI w/10％FCS中扩充EL-4鼠T-淋巴瘤细胞。将所有的动物随机化成每研究组6或7只小鼠，无限制供应食物和水。

在第0天收获EL-4细胞，计数，并I.P.植入5x10⁵个EL-4淋巴瘤细胞。在第3天将动物随机化成6/7只动物的处理组。在植入后第3天和第10天IV施用多柔比星。在第3-16天S.C.施用mIL-18(SEQ ID NO：2)。每天对动物观察毒性和死亡率。

通过大体观察，所有的动物良好地耐受剂量给药日程表和水平。第16天，终止所有的剂量给药，而且媒介死亡中值出现在第17.5天。所有的媒介小鼠在植入后16-18天之间死亡。通过研究组/媒介组-1 x100％来计算寿命的增加。对于EL-4T细胞淋巴瘤中mIL-18(SEQ ID NO：2)与多柔比星的联合疗法，在存活时间中值和寿命增加方面分析数据。

在携带EL-4T细胞淋巴瘤的雌性C57Bl/6小鼠的同基因肿瘤模型中评估响应mIL-18(SEQ ID NO：2)和多柔比星的联合疗法的寿命延长。在下文详述的数个实验中表明联合疗法超过单独的mIL-18(SEQ ID NO：2)或单独的多柔比星的单一疗法的益处。图9中表明抗肿瘤活性和寿命延长的例子。如下文所描述的，在媒介动物死亡时(在第16天)，终止所有的剂量给药。媒介死亡中值出现在第17.5天，并且所有的媒介小鼠在植入后16-18天之间死亡。

这些结果显示，在EL-4T细胞淋巴瘤中多柔比星和mIL-18(SEQ ID NO：2)的组合导致协同性抗肿瘤活性，且存活延长。多柔比星单一疗法在12mg/kg剂量显示最低限度的寿命延长。1、5和25ug/剂的各剂量IL-18单一疗法没有显示寿命的任何延长。在12mg/kg多柔比星与25μg/剂量IL-18组合时，有朝向存活延长和治愈增加的转变。在用肿瘤再次考验这些动物时，它们显示保护作用。

然后，发明人为IL-18和多柔比星的联合疗法检查了存活的可预测性，认识到为这两种试剂鉴定会导致协同性抗肿瘤活性的最佳剂量会是有利的。图10中显示了图9中所显示的数据的存活者概率曲线。

对于这种分析，我们使用了来自组合或单一疗法研究的数据，所述组合或单一疗法研究使用0、4.2、7.2、12mg/kg剂量的多柔比星，和/或0、1、5、25μg/小鼠剂量的mIL-18(SEQ ID NO：2)。曲线图使用与使死亡风险最小化的治疗组合对应的表面概率最大值。在每种治疗组合，此表面给出存活至少30天的预测概率。

在分析淋巴细胞的生存力、扩充、活化和功能性的一组实验中解决对响应IL-18和多柔比星的联合疗法的免疫细胞的影响。在用多柔比星(12mg/kg)、mIL-18(SEQ ID NO：2)(25μg/剂)，或者通过两者的组合处理的动物中测量淋巴细胞的表型概况。测试活化的CD8阳性T细胞、NK和活化的NK的概况，并在图11A和图11B中显示了数据。

mIL-18(SEQ ID NO：2)和多柔比星的组合增加/维持与单独的多柔比星相同数目的活化的CD8阳性T细胞(CTL)、NK和活化的NK细胞。这些细胞可在细胞介导的细胞毒性(特异性肿瘤杀伤)中发挥关键作用。与脾细胞相比，响应多柔比星/IL-18组合的活化的CD8阳性T细胞和NK细胞的增强在循环PBL中得到更多的增强。

运行一个实验以显示多柔比星没有降低IL-18增强的NK细胞活性(非特异性肿瘤杀伤)是重要的。图12表明NK细胞毒性在仅用多柔比星处理的动物中受到损害，而接受单独的或与多柔比星的组合的mIL-18(SEQ ID NO：2)的动物都显示强烈的NK细胞毒性。

实施例3：用于IL-18与利妥昔单抗的组合的I期临床试验的方案

此I期是与标准利妥昔单抗疗法组合的人IL-18的标签公开的(open-label)、剂量递增(dose-escalation)研究，其调查12剂每周一次上升剂量(1-100μg/kg)的人IL-18(SEQ ID NO：1)在CD20⁺B细胞NHL受试者中的安全性和耐受性。

利妥昔单抗和人IL-18(SEQ ID NO：1)的剂量给药是交错的。因此，在第1-4周的第1天，受试者每周一次地接受利妥昔单抗(375mg/m²)的IV输注。在第1-4周的第2天和第5-12周的第2天(+/-1天)，以每周一次的IV输注物施用人IL-18(SEQ ID NO：1)。人IL-18(SEQ ID NO：1)的起始剂量是1μg/kg，并且计划将剂量扩大进行至名义上的最大限度剂量100μg/kg。

每个分组(cohort)内的剂量给药是交错的，其中一名受试者在第1天接受首剂利妥昔单抗，在第2天接受首剂人IL-18(SEQ ID NO：1)，然后内部监测至少24小时。若没有安全性或耐受性顾虑，则在至少24小时后给分组内的下一名受试者服药，并也会在其人IL-18(SEQ ID NO：1)首剂后内部监测24小时。在随后的各周(第2周-第12周)，人IL-18服药后对受试者监测6小时，然后可以自临床释放。所有受试者相隔至少2小时进行给药。可以在任何分组中每天给不超过两名受试者服药。

以首剂水平(1μg/kg/周)处理3名受试者。若完成分组中的剂量给药后没有与研究药物具有“怀疑的”或“可能的”关系的、大于等级2的毒性的证据(即所有3名受试者都完成了第1周-第6周的研究)，则在每个随后的分组中以下列剂量水平处理3名受试者：3μg/kg/周、10μg/kg/周、20μg/kg/周、30μg/kg/周、和100μg/kg/周。

对于利妥昔单抗的所有输注，整个剂量投递(自输注启动至输注结束)必须不小于4小时。人IL-18输注在2小时期间里发生。

本研究的目标是确定人IL-18在CD20⁺B细胞淋巴瘤受试者中与标准利妥昔单抗处理联合使用时安全的最大限度生物学有效剂量。为了对人IL-18(SEQ ID NO：1)评估剂量-响应相关性(发现其在先前的I期研究中是钟形的)，使用1-100μg/kg的剂量范围来检查CD20⁺B细胞淋巴瘤患者中的生物学活性范围的下端(低剂量)和上端(中程或高剂量)。

利妥昔单抗的剂量是批准用于CD20⁺B细胞NHL患者的标签中所推荐的标准方案。根据来自牵涉肾细胞癌瘤和转移性黑素瘤患者的研究的先前的I期安全性、药动学、和药效学数据选择人IL-18(SEQ ID NO：1)的剂量。要在本研究中使用的利妥昔单抗剂量是批准用于CD20⁺B细胞NHL患者的标签中所推荐的标准方案。

根据来自牵涉肾细胞癌瘤和转移性黑素瘤患者的研究的先前的I期安全性、药动学、和药效学数据选择人IL-18(SEQ ID NO：1)的剂量。Robertson等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22：178(摘要713)(2003)；Robertson等，J.Clin.Oncol.22：176s(摘要2553)(2004)；Robertson等，J.Clin.Oncol.23：169s(摘要2513)(2005)；Koch等，J.Clin.Oncol.23：174s(摘要2535)(2005)；Koch等，Eur.J.Cancer 4(12)：86(270)(2006)。所测试的最高剂量(每周一次施用2000mg/kg，可长至24周)没有产生显著的毒性，使得没有鉴定出最大限度的耐受剂量；因此，使用药效学数据来为本研究选择剂量范围的上限。

所测试的最高剂量(每周一次施用2000mg/kg，可长至24周)没有产生显著的毒性，使得没有鉴定出最大限度的耐受剂量；因此，使用药效学数据来为本研究选择剂量范围的上限。

实施例4：小鼠浆细胞瘤模型中的IL-18和

组合

分析MOPC315.D3j005和MOPC.D3j03研究两者以评估鼠IL-18(SEQ IDNO：2)与

的联合疗法对鼠浆细胞瘤生长的影响。对于此实验，我们必须用ErbB2(HER2)转染MoPC315细胞。为了转染，我们在6孔板中使用1.5ugErbB2表达载体(BioCat-108912-pcdna3.1(-)ErbB2)，使用用来自Gibco的Lipofectamine^TM和Optimem^TM培养基进行的脂质体转染，如所描述的。2天后，将选择压力新霉素(450ug/ml G418 Sigma G6816)添加至培养物。通过对用Alexafluor488标记的

单克隆抗体染色的原位培养物的荧光显微镜检查来选择最初的阳性群体，并通过有限稀释来克隆(206434p70-72)。用Alexafluor488标记的

流式细胞术测试D3 ErbB2表达。选择MOPC.D3细胞系，并用于评估

和IL-18抗肿瘤功效。

测量抗肿瘤活性，并且对数据的详细分析揭示IL-18和

的联合疗法优于单独的

的单一疗法。值得注意的是，这种差异是统计学显著的且强烈的；它是使用非参数检验确定的，所述非参数检验在确定统计学差异上不太灵敏且不太有力。

对数据的详细分析揭示IL-18和

的联合疗法优于单独的的单一疗法。值得注意的是，这种差异是统计学显著的且强烈的；它是使用非参数检验确定的，所述非参数检验在确定统计学差异上不太灵敏且不太有力。

a.研究#MOPC315.D3j005

本研究采用mIL-18(SEQ ID NO：2)和

(一种抗Her2/neu受体抗体)的组合，目标在于在临床试验中在乳腺癌中使用此疗法。在完善建立的鼠浆细胞瘤细胞系MOPC315中测试联合疗法。肿瘤系自ATCC获得，并在内部用Her2受体转导。这种肿瘤系是BALB/c同基因细胞系。施药如下：鼠IL-18(SEQ ID NO：2)(100μg/小鼠q.d.，s.c.)、

(200、100或50μg/小鼠，一周两次，i.v.)。肿瘤开始生长后(其是在植入后第14天)启动MOPC315.D3j005研究中的处理。

图13和图14中显示了本研究的结果，以均值+/-SD(图13)和中值+/-范围(图14)表示数据。我们首先进行检查以证实数据是否遵循正态分布(高斯近似)，并且我们比较标准偏差值以确保有相等的方差(即图14和图15)。我们发现原始数据有正态分布，然而处理组之间的标准偏差是高度可变的(大于3x)，因此我们不能使用参数检验(诸如ANOVA)进行分析。我们使用log10和ln来转换数据以察看转换后的数据是否通过正态性和等方差检验(下文所展示的样品分析--针对第24天的选定组)。转换后的数据没有通过正态性检验。因此，我们选择非参数检验(Kruskal-Wallis分析)进行统计学评估。图13和图14中显示了详细的数据和p值。

统计学分析揭示，mIL-18(SEQ ID NO：2)和

的联合疗法好于单独的

的单一疗法。图15显示了服用单独的

200μg/小鼠的组和用

200μg/小鼠和人IL-18 100μg/小鼠两者处理的组之间的统计学差异(Kruskal-Wallis分析，p＜0.05)。图16显示了与单独的

和IL-18相比，

和IL-18的联合处理显示最好的抗肿瘤活性窗。

b.研究#MOPC.D3J03

本研究与上文MOPC315.D3J005研究(实施例4.a.)相同，只是本疗法在肿瘤在宏观上变得明显前开始，即植入后第7天。另外，在本研究中，HERCEPTIN的最大剂量是100μg/小鼠，而最小剂量是25μg/小鼠。

数据以均值+/-SD(图17)和中值+/-范围(图18)表示。我们首先检查数据是否遵循正态分布(高斯近似)，并且我们比较标准偏差值以确保通过等方差检验。我们发现原始数据不遵循正态分布；转换后的数据(log10或ln)也不遵循高斯分布，它们也没有通过等方差检验。因此我们不能使用参数检验(诸如ANOVA)，并且我们选择非参数检验(Kruskal-Wallis分析)进行统计学评估。下文图19和图20中显示了详细的数据和p值。

总之，本研究的统计学分析揭示，mIL-18(SEQ ID NO：2)和

的联合疗法好于单独的

的单一疗法。图19和图20中的图显示了与单独的

(100μg/小鼠)的单一疗法相比，联合疗法组(mIL-18(SEQ ID NO：2)100μg/小鼠和

100μg/小鼠)中的肿瘤消退显著更好。作为单一疗法的

具有最低限度的活性，然后其由IL-18联合处理提升。因为HER2被转染入细胞中，所以

仅能提供对HER2的结合，但是没有诱导凋亡(肿瘤细胞死亡)。因此，抗肿瘤活性是联合疗法的结果，其中IL-18提升在ADCC和CDC活性中发挥关键作用的细胞(通过IL-18处理提升的细胞)，而HERCEPTIN提供对HER2的特异性结合并充当ADCC/CDC靶物。

实施例5：在鼠结肠癌的同基因模型Colo26中对IL-18和5-氟尿嘧啶(5-FU)联合疗法的分析

本研究的目的是与单独的5-FU或mIL-18(SEQ ID NO：2)的单一疗法相比，评估mIL-18(SEQ ID NO：2)与5-氟尿嘧啶(5-FU)的联合疗法的功效。在BALB/c小鼠中在鼠结肠癌瘤的完善建立的同基因皮下模型Colo26中实施我们的研究。接种肿瘤后第10天-第30天每天以10μg/小鼠皮下实施mIL-18(SEQID NO：2)的剂量给药。以上升的剂量：27、45和74μg/小鼠一周两次地腹膜内实施5-FU的剂量给药。

对肿瘤体积数据的详细分析揭示，与对照组相比，10μg mIL-18(SEQ IDNO：2)和75μg 5-FU的联合疗法是唯一对肿瘤生长具有显著效果的处理组。这意味着联合疗法(75μg/10μg)优于单独的5-FU或单独的mIL-18(SEQ ID NO：2)的单一疗法组，因为单一疗法没有显示好于对照的治疗效果。重要的是，知道这种差异是统计学显著的且强烈的--它是使用非参数检验确定的，所述非参数检验在确定统计学差异上不太灵敏且不太有力。另外，存活分析表明联合疗法(75μg/10μg)显著好于单一疗法组(75μg)。显著性是极强烈的，且p＜0.0001。

在选定的代表性时间点评估比较不同处理组中的肿瘤体积的数据，并以均值+/-SD(图21)和中值+/-范围(图22)表示。首先对数据检查正态分布(高斯近似)，并比较标准偏差值以确保有相等的方差。然后，一些原始数据的分布不遵循高斯曲线，处理组之间的标准偏差也是高度可变的(大于3x)，因此参数检验不能用于分析。使用log10转换数据，并且它们仍没有通过正态性和等方差检验(下文所展示的样品分析--针对选定组)。因此，使用非参数检验(Kruskal-Wallis分析和Dunn氏比较检验)进行统计学评估。在下文图23的图中显示了详细的数据和p值。图24(中值+/-SD)和图25(均值+/-SD)显示了IL-18和5-FU联合疗法在相同的Colo26同基因结肠肿瘤模型中的效果。清楚的是，在肿瘤体积达到80-100mm³之间大小(晚期肿瘤模型)时，用单独的IL-18、单独的5-FU或两种药物的联合处理动物。图26中呈现了联合处理的抗肿瘤活性和协同性的较好视图。

在Kaplan-Meyer存活曲线分析中将不同处理组中携带Colo26的小鼠的存活绘图，通过Logrank检验评估，并显示于图26中。处理组之间在存活方面有统计学差异，其中最好的组是10μg mIL-18(SEQ ID NO：2)和75μg 5-FU的联合疗法。

实施例6：IL-18和帕唑帕尼(GW786034)的联合疗法在小鼠肾细胞癌瘤模型中的功效

本研究(RENJ02研究)测试mIL-18(SEQ ID NO：2)和帕唑帕尼(VEGFR和PDGFR和c-kit酪氨酸激酶的一种抑制剂)的联合疗法在小鼠肾癌瘤的晚期同基因模型中的功效。这种动物模型是鼠皮下实体肾癌瘤模型。将与BALB/c小鼠同基因的鼠RENCA细胞系植入BALB/c接受者中。在下表1中描绘了所采用的剂量给药日程表。在第14天-第42天每天一次皮下给药IL-18。在第14天-第42天每天一次口服给药帕唑帕尼。

首先，对于统计学分析，确定各组之间用于比较的良好时间点。然后，对数据进行正态性检验以确定适于分析的统计学检验。选择第32天作为代表性时间点(到此时间点，一些小鼠因毒性或肿瘤大小不得不实施安乐死，因此各组显示5-7只小鼠，虽然最初每组以7只小鼠开始)。数据没有显示高斯(正态)分布，因此使用非参数检验。确定单一疗法和联合疗法之间的统计学差异，并显示于图28中，即使不得不使用非参数检验(检测差异的能力比参数检验低)。用于评估的统计学软件包括Prism GraphPad和SigmaStat。

表1

组	小鼠数目	帕唑帕尼(μg)	IL-18(μg)
组	小鼠数目	帕唑帕尼(μg)	IL-18(μg)	1	7	10	0
2	7	30	0	1	7	10	0
2	7	30	0	3	7	100	0
4	7	10	100	3	7	100	0

5	7	30	100
5	7	30	100	6	7	100	100
7	7	0	100	6	7	100	100
7	7	0	100	8	7	0	0

图28分析与图27相同的数据。不过，在图28中，不包括对照组。完成这幅额外的图以通过仅仅比较单一疗法和联合疗法组来实施“清洁”(cleaner)分析。这些数据显示帕唑帕尼(GW786034)和IL-18的联合处理导致统计学上显著的抗肿瘤活性。

实施例7：解决IL-18作为会导致长期存活和预防肿瘤复发的记忆的诱导物的作用

我们通过在EL-4肿瘤模型中测试功效来解决此疑问，其中通过鼠IL-18(SEQ ID NO：2)和多柔比星的组合来治疗小鼠。那些治愈的小鼠在用肿瘤再次考验时对肿瘤成活(take)/生长有抗性，提示它们具有由IL-18和多柔比星处理所诱导的记忆机制。下文实验中呈现EL-4肿瘤小鼠中T记忆细胞的存在，所述EL-4肿瘤小鼠存活且它们的肿瘤通过IL-18和多柔比星处理而治愈(图29和图30)。

此实验设计如下：Pfp/Rag2小鼠(NK细胞和CTL活性严重消减的H2b单倍型)接受来自经IL-2(每只小鼠3000U q.d.，s.c.)处理的存活者，或对照C57BL/6小鼠(存活者和对照小鼠都接受IL-2)的2.5x10⁷个脾和淋巴结细胞的过继转移。过继转移后2周，用EL-4肿瘤细胞考验所有的小鼠(EL-4是致癌原诱导的、C57BL/6(H2b)起源的小鼠淋巴瘤)。过继转移后(过继转移当天开始)用IL-2(每只小鼠3000U q.d.，s.c.)处理所有受体达3天。有目的地选择接受者系，以具有与所接种的肿瘤相同的遗传背景。记录小鼠的重量和存活以建立重量减轻/增加的时间线(time-line)，并在接种EL-4后的各周期间触摸腹腔以确定可触知的肿瘤块的存在。

以可获得的最大数量购买Pfp/Rag2小鼠--4只雄性和4只雌性。我们还有自先前研究剩下的2只较老的小鼠。为了尽可能多地增加每组样品的数目，我们决定利用所有这些小鼠：为了避免性别和年龄对结果的影响，使性别和年龄在两组之间均匀分布：一组接受来自EL-4存活者的淋巴细胞，而另一组接受来自正常对照B6小鼠的细胞。

结果指明EL-4考验后的第一周期间两组小鼠间在重量方面没有显著性差异，并且所有小鼠的重量增加停滞(图29)。此结果可能是由于如下实情，即前3天期间所有小鼠都接受IL-2s.c.来加强它们的免疫应答。EL-4考验后的第2周和第3周期间，我们在对照组中观察到快速的体重增加和可触知的肿瘤和/或腹水形成。所有的对照小鼠在2周内死亡，然而所有的存活者细胞接受者存活，虽然2只(5只中的)在腹部具有可触知的肿瘤。由于肿瘤的快速生长，出于伦理原因，不得不对一只小鼠实施安乐死。

表2

过继转移的来源(IL-2s.c.3000IU/m 3天)	细胞数目	用IL-2s.c.3000IU/m处理接受者3天	对EL-4的易感性
过继转移的来源(IL-2s.c.3000IU/m 3天)	细胞数目	用IL-2s.c.3000IU/m处理接受者3天	对EL-4的易感性	经IL-18和Dox处理的C57BL/6存活者	2.5x10⁷	是	受保护的
正常的C57BL/6小鼠	2.5x10⁷	是	不受保护的	经IL-18和Dox处理的C57BL/6存活者	2.5x10⁷	是	受保护的

表2显示了关于经IL-18/多柔比星处理的小鼠中(与正常对照动物相比)针对肿瘤考验的保护的发现的汇总表。接受来自经IL-18/多柔比星处理的动物的淋巴细胞的小鼠受到保护，而来自对照动物的淋巴细胞显示肿瘤成活(take)/生长。

接受存活者淋巴细胞的EL-4接受者小鼠比接受来自未接触抗原的正常供体的淋巴细胞的对照小鼠存活得显著更长。数据暗示来自存活者小鼠的过继转移对EL-4肿瘤接受者具有保护效果。这些数据提供了EL-4肿瘤存活者中记忆T细胞的间接证明(图29和图30)。

这是一项重要的发现，其能使任何化疗剂或单抗与IL-18的组合成为优于任何单一疗法的癌症治疗。对能将肿瘤识别为“外来的”并预防复发的记忆T细胞的诱导会是高度有益的，并且具有优良安全性概况的IL-18是供任何潜在联合疗法用的药物。

Claims

1.一种在有所需要的患者中治疗癌症的方法，包括分开给所述患者施用包含如下各项的组合物的步骤：(i)与载体组合的人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)；和(ii)针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体，其中所述抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能，且其中所述抗体不是抗CD20抗体。

2.权利要求1的方法，其中包含所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)和所述单克隆抗体的组合物的施用是同时的。

3.权利要求1的方法，其中包含所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)和所述单克隆抗体的组合物的施用是序贯的，且其中首先施用所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)。

4.权利要求1的方法，其中包含所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)和所述单克隆抗体的组合物的施用是序贯的，且首先施用所述单克隆抗体。

5.权利要求1的方法，其中所述抗原选自下组：CD22、CD19、HER2、HER3、EGFR、IGF-1R、AXL-1、FGFR、整联蛋白受体、CEA、CD44、和VEGFR。

7.权利要求5的方法，其中所述抗原是HER-2，且所述单克隆抗体是

8.权利要求1的方法，其中所述癌症选自下组：何杰金氏淋巴瘤、B细胞非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T细胞非何杰金氏淋巴瘤、AML、CLL、MM、其它白血病、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肉瘤、膀胱癌、胰腺癌、甲状腺癌、肝瘤、胃癌、维尔姆斯氏肿瘤、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤和其它脑瘤、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、肾细胞癌和皮肤癌。

9.一种在有所需要的患者中治疗癌症的方法，包括分开给所述患者施用包含如下各项的组合物的步骤：(i)与载体组合的人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)；和(ii)化疗剂。

10.权利要求9的方法，其中包含所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)和所述化疗剂的组合物的施用是同时的。

11.权利要求9的方法，其中包含所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)和所述化疗剂的组合物的施用是序贯的，且其中首先施用所述人IL-18多肽(SEQ IDNO：1)。

12.权利要求9的方法，其中包含所述人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)和所述化疗剂的组合物的施用是序贯的，且其中首先施用所述化疗剂。

13.权利要求9的方法，其中所述化疗剂选自下组：Doxil、托泊替康、改变DNA的药物、卡铂、抗代谢物、吉西他滨、阻止细胞分裂的药物、长春新碱、抗血管发生剂、和帕唑帕尼。

14.权利要求9的方法，其中所述癌症选自下组：何杰金氏淋巴瘤、B细胞非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T细胞非何杰金氏淋巴瘤、AML、CLL、MM、其它白血病、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肉瘤、膀胱癌、胰腺癌、甲状腺癌、肝瘤、胃癌、维尔姆斯氏肿瘤、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤和其它脑瘤、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、肾细胞癌和皮肤癌。

15.一种在有所需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给所述患者施用包含与化疗剂组合的人IL-18(SEQ ID NO：1)的组合物的步骤，由此所述治疗导致所述患者中的长期存活和/或对癌症复发的预防和对免疫记忆的诱导。

16.权利要求15的方法，其中所述化疗剂选自下组：Doxil、托泊替康、改变DNA的药物、卡铂、抗代谢物、吉西他滨、阻止细胞分裂的药物、长春新碱、抗血管发生剂、和帕唑帕尼。

17.权利要求15的方法，其中所述癌症选自下组：何杰金氏淋巴瘤、B细胞非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T细胞非何杰金氏淋巴瘤、AML、CLL、MM、其它白血病、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肉瘤、膀胱癌、胰腺癌、甲状腺癌、肝瘤、胃癌、维尔姆斯氏肿瘤、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤和其它脑瘤、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、肾细胞癌和皮肤癌。

18.一种在有所需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给所述患者施用包含与针对癌细胞表面上所表达的抗原的单克隆抗体组合的人IL-18多肽(SEQ ID NO：1)的组合物的步骤，其中所述抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应器功能，且其中所述抗体不是抗CD20抗体，由此所述治疗导致所述患者中的长期存活和/或对癌症复发的预防和对免疫记忆的诱导。

19.权利要求18的方法，其中所述抗原选自下组：CD22、CD19、HER2、HER3、EGFR、IGF-1R、AXL-1、FGFR、整联蛋白受体、CEA、CD44、和VEGFR。

20.权利要求18的方法，其中所述癌症选自下组：何杰金氏淋巴瘤、B细胞非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T细胞非何杰金氏淋巴瘤、AML、CLL、MM、其它白血病、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肉瘤、膀胱癌、胰腺癌、甲状腺癌、肝瘤、胃癌、维尔姆斯氏肿瘤、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤和其它脑瘤、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、肾细胞癌和皮肤癌。