ES2308836T3 - Sinergia de los anticuerpos anti-her-2 y de los ligands para l'apo-2. - Google Patents
Sinergia de los anticuerpos anti-her-2 y de los ligands para l'apo-2. Download PDFInfo
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Abstract
Uso del ligando Apo-2 y de un anticuerpo anti-Her-2 para la preparación de un medicamento para inducir la apóptosis en células cancerosas de mamífero que sobre-expresan el receptor Her-2, en el que el ligando Apo-2 y el anticuerpo anti-Her-2 inducen sinérgicamente una apóptosis.
Description
Sinergia de los anticuerpos
anti-Her-2 y de los ligandos
Apo-2.
Esta invención se refiere en general a
procedimientos para inducir la apóptosis en células de mamífero. En
concreto, pertenece al uso del ligando Apo-2 y de un
anticuerpo anti-Her-2 para inducir
sinérgicamente la apóptosis en células de mamífero.
Se cree que el control de los números de células
en mamíferos está determinado, en parte, por un equilibrio entre la
proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte
celular, algunas veces denominada muerte celular necrótica, se
caracteriza comúnmente por una forma patológica de muerte celular
como resultado de algún traumatismo o lesión celular. Por el
contrario, hay otra forma "fisiológica" de muerte celular que
habitualmente tiene lugar de un modo ordenado o controlado. Este
modo ordenado o controlado de muerte celular es habitualmente
denominado "apóptosis" [véase, p. ej., Barr et al.
Bio/Technology, 12:487-493 (1994)]. La
muerte celular apoptótica ocurre de forma natural en muchos procesos
fisiológicos que incluyen el desarrollo embrionario y la selección
clonal del sistema inmunológico [Itoh et al., Cell,
66:233-243 (1991)]. Sin embargo, la disminución de
los niveles de muerte celular apoptótica se ha asociado con una
variedad de condiciones patológicas que incluyen el cáncer, el
lupus y la infección por el virus del herpes [Thompson,
Science, 267:1456-1462 (1995)].
La muerte celular apoptótica está comúnmente
acompañada por uno o más cambios bioquímicos y morfológicos
característicos en células, tales como la condensación del
citoplasma, la pérdida de microvellosidades de la membrana
plasmática, la segmentación el núcleo, la degradación del ADN
cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Se cree que
hay una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas que
desencadenan o provocan tales cambios celulares morfológicos y
bioquímicos [Raff, Nature, 356:397-400
(1992); Steller, Science, 267:1445-1449
(1995); Sachs et al., Blood, 82:15 (1993)]. Por
ejemplo, pueden ser desencadenados por estímulos hormonales, tales
como las hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, así
como la retirada de ciertos factores de crecimiento
[Watanabe-Fukunaga et al., Nature,
356:314-317 (1992)]. También se ha informado de que
algunos oncogenes identificados tales como myc, rel y
EIA, así como supresores tumorales, como el p53,
tienen un papel en la inducción de la apóptosis. Asimismo, se ha
observado que hay fármacos quimioterapéuticos y algunas formas de
radiación que tienen actividad inductora de la apóptosis [Thompson,
supra].
Se han identificado diversas moléculas, tales
como el factor-\alpha de la necrosis tumoral
("FNT-\alpha"),
factor-\beta de la necrosis tumoral
("FNT-\beta" o "linfotoxina"), el
ligando CD30, el ligando CD27, el ligando CD40, el ligando
OX-40, el ligando 4-1BB y el ligando
Apo-1 (también denominado ligando Fas o ligando
CD95), como miembros de la familia de factores de la necrosis
tumoral ("FNT") de las citoquinas [Véase, por ejemplo, Gruss y
Dower. Blood, 85:3378-3404 (1995)].Entre
estas moléculas, se ha informado que el
FNT-\alpha, el FNT-\beta, el
ligando CD30, el ligando 4-1BB y el ligando
Apo-1 están implicados en la muerte celular
apoptótica. Se ha informado de que tanto el
FNT-\alpha como el FNT-\beta
inducen a la muerte apoptótica a células tumorales susceptibles
[Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986):
Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)].
Recientemente, se identificaron más moléculas
consideradas miembros de la familia de los TNF de las citoquinas,
informando de su implicación en la apóptosis. Por ejemplo, en Pitti
et al., J. Biol. Chem.271:12687-12690
(1996), se describe una molécula denominada ligando
Apo-2. Véase también el documento WO 97/25428
publicado el 17 de julio de 1997. Se informa que el ligando
Apo-2 humano de longitud completa es un polipéptido
de 281 aminoácidos que induce la apóptosis en diversas células de
mamífero. Otros investigadores han descrito polipéptidos
relacionados denominados TRAIL [Wiley et al., Immunity,
3:673-682 (1995): WO 97/01633 publicado el 16 de
enero de 1997] y AGP-1 [WO 97/46686 publicado el 11
de diciembre de 1997)].
Se han descrito varios receptores del ligando
Apo-2. Estos receptores incluyen el
Apo-2 (también denominado DR5) [Sheridan et al.,
Science. 277:818-821 (1997); Pan et al.,
Science. 277:815-818 (1997)], DR4 [Pan et
al., Science, 276:111-113 (1997)], DcR1 (también
denominado TRID) [Sheridan et al., Science,
277:818-821 (1997); Pan et al., Science.
277:815-818 (1997)] y DcR2 (también denominado
TRAIL-4) [Marsters et al., Current Biology,
7:1003-1006 (1997):Degli-Esposti
et al., Immunity, 7:813-820 (1997)].
También se ha informado de que moléculas
dirigidas a un número de proteínas quinasas receptoras de factores
de crecimiento inducen a la apóptosis. Se cree que las proteínas
receptoras tirosinas quinasas, que se dividen en un número de
subfamilias, tienen la función principal de dirigir el crecimiento
celular a través de la fosforilación de la tirosina estimulada por
ligandos de sustratos intracelulares. La subfamilia de clase I de
las proteínas receptoras de factores de crecimiento tirosina
quinasas incluye el receptor del factor de crecimiento epidérmico
de 170 kDa (RFCE) codificado por el gen erbB1. El
erbB1 ha sido causalmente implicado en los tumores malignos
humanos. En concreto, se ha observado un aumento de la expresión de
este gen en carcinomas de mama, de vejiga, de pulmón, de cabeza, de
cuello y de estómago. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra
el RFCE han sido evaluados como agentes terapéuticos en el
tratamiento de tales tumores malignos. Por ejemplo, Wu et al.,
J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995) informaron
recientemente de que el anticuerpo monoclonal (Acm)
anti-RFCE 225 (que inhibe competitivamente la unión
al FCE y bloquea la activación de este receptor) podría inducir a
la línea celular de carcinoma colorrectal humano DiFi (que expresa
altos niveles de RFCE) a crecer, a detener su ciclo celular y a la
apóptosis. Véase Baselga et al., Pharmac. Ther.,
64:127-154 (1994); Masui et al., Cancer
research. 44:1002-1007 (1984).
El segundo miembro de la subfamilia de clase I,
el p185^{neu}, se identificó originariamente como el
producto del gen de transformación de neuroblastomas de ratas
tratadas químicamente. La forma activada del
proto-oncogén neu resulta de una mutación
puntual (valina a ácido glutámico) en la región transmembrana de la
proteína codificada. La amplificación del homólogo humano de
neu (denominado Her-2 o erbB2) se
observa en cánceres de mama y ovario, y generalmente guarda
correlación con un pronóstico pobre [Slamon et al., Science,
235:177-182 (1987); Slamon et al.,
Science, 244:707-712 (1989)]. Por
consiguiente, Slamon et al., en la patente estadounidense
N.º: 4.968.603, describen análisis de diagnóstico para determinar
la amplificación o la expresión del gen Her-2 en
células tumorales. Hasta la fecha, no se ha informado de otra
mutación puntual análoga a la del proto-oncogén
neu para los tumores humanos. También se ha observado la
sobre-expresión (frecuentemente, pero no
uniformemente debida a la amplificación) de Her-2 en
otros carcinomas incluyendo carcinomas de estómago, de endometrio,
de glándula salival, de pulmón, de riñón, de colon, de tiroide, de
páncreas y de vejiga. Véase entre otros: King et al.,
Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet,
1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol.
Cell. Biol., 6:955-958 (1986); Geurin
et al., Oncogene Research. 3:21-31 (1988);
Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989);
Yonemura et al., Cancer Research, 51:1034 (1991); Borst
et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al.,
Cancer Research, 50:421-425 (1990); Kern et
al., Cancer Research, 50:5184 (1990): Park et al., Cancer
Research. 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog.,
3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J.
Cancer, 57:358-363 (1988); Williams et al.,
Pathobiology. 59:46-52 (1991); y McCann et
al., Cancer. 65:88-92 (1990).
Se han descrito ciertos anticuerpos dirigidos
contra los productos proteicos Her-2 humano y
neu de rata. Drebin et al., Cell,
41:695-706 (1985) se refieren a un anticuerpo
monoclonal IgG2a que está dirigido contra el producto génico
neu de rata. Este anticuerpo denominado 7.16.4 causa la
modulación secuencia abajo de la expresión de p185 de la superficie
celular sobre células B104-1-1
(células NIH-3T3 transfectadas con el
proto-oncogén neu) e inhibe la formación de
colonias de estas células. En Drebin et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., 83:9129-9133 (1986), se demostró que el
anticuerpo 7.16.4 inhibe el crecimiento tumorigénico de las células
NIH-3T3 transformadas por neu, así como las
células de neuroblastoma de rata (de las que se aisló inicialmente
el oncogén neu) implantadas en ratones desnudos. Drebin et
al., Oncogene, 2:387-394 (1988) describen la
producción de un panel de anticuerpos contra el producto génico
neu de rata. Se descubrió que todos los anticuerpos ejercían
un efecto citostático sobre el crecimiento de las células
transformadas por neu suspendidas en agar disuelto. Los
anticuerpos de los isotipos IgM, IgG2a e IeG2b eran capaces de
mediar la lisis in vitro de células transformadas por
neu en presencia de complemento, mientras que ninguno de los
anticuerpos era capaz de mediar niveles relativamente elevados de
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) de células
transformadas por neu. Drebin et al., Oncogene,
2:273-277 (1988) informan que las mezclas de
anticuerpos reactivos con dos regiones distintas de la molécula p185
resultan en efectos antitumorales sinérgicos sobre células
NIH-3T3 transformadas por neu implantadas en
ratones desnudos. En Myers et al., Meth. Enzym.,
198:277-290 (1991), se revisan los efectos
biológicos de anticuerpos anti-neu. Véase también el
documento WO94/22478 publicado el 13 de octubre de 1994.
Hudziak et al., Mol. Cell. Biol.,
9(3):1165-1172 (1989) describen la generación
de un panel de anticuerpos
anti-Her-2 que fueron caracterizados
usando la línea celular de tumor de mama humano SKBR3. Se determinó
la proliferación celular relativa de las células SKBR3 tras una
exposición a los anticuerpos mediante tinción con violeta cristal
de las monocapas transcurridas 72 horas. Usando este análisis, se
obtuvo la inhibición máxima con el anticuerpo denominado 4D5 que
inhibió la proliferación celular en un 56%. Otros anticuerpos del
panel, incluyendo el 7C2 y el 7F3, redujeron la proliferación
celular hasta un grado menor en este análisis. Hudziak et
al. concluyen que el efecto del anticuerpo 4D5 sobre las células
SKBR3 fue citostático más que citotóxico, pues las células SKBR3
reanudaron el crecimiento a una velocidad casi normal tras la
retirada del anticuerpo del medio. También se descubrió que el
anticuerpo 4D5 sensibiliza a líneas celulares de tumor de mama que
sobre-expresan p185^{erbB2} a los efectos
citotóxicos del FNT-\alpha. Véase también el
documento WO89/06692 publicado el 27 de julio de 1989. Los
anticuerpos anti-Her-2 tratados en
Hudziak et al. se caracterizan en mayor profundidad en
Fendly et al., Cancer Research,
50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro.
26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation,
1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin.
Immunol., 11(3):117-127 (1991); Kumar
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11(2):979-986 (1991); Lewis et al.,
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(1993): Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838
(1994); Vitetta et al., Cancer Research.
54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol.
Chem., 692(20): 14661-14665 (1994);
Scott et al., J. Biol. Chem., 266:14300-5
(1991); y D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:
7202-7206
(1994).
(1994).
Ciertos anticuerpos
anti-Her-2 pueden inducir a la
muerte de una célula de sobreexpresión de Her-2
(por ejemplo, la célula BT474, SKBR3, SKOV3 o Calu 3) mediante
apóptosis. Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
94:7509-7514 (1997) describen la producción de un
anticuerpo anti-Her-2 que, cuando es
homodimerizado, induce la apóptosis en células tumorales. Además,
Kita et al., Biochem. Biophys. Research Commun. describen la
generación de un anticuerpo
anti-Her-2 que provoca cambios de la
morfología celular y la apóptosis en células transfectadas con el
gen Her-2. Al contrario que el anticuerpo
anti-RFCE apoptótico descrito en Wu et al., J.
Clin. Investigation. 95:1897-1905 (1995), no se
cree que esos anticuerpos anti-Her-2
provoquen la apóptosis afectando a un bucle autocrino.
Se han descrito en la técnica otros anticuerpos
específicos para Her-2. Tagliabue et al., Int. J.
Cancer, 47:933-937 (1991) describen dos
anticuerpos que fueron seleccionados por su reactividad sobre la
línea celular de adenocarcinoma de pulmón (Calu-3)
que sobre-expresa Her-2. Se
descubrió que uno de los anticuerpos, denominado MGR3, interioriza,
induce a la fosforilación de Her-2 e inhibe el
crecimiento celular tumoral in vitro.
McKenzie et al., Oncogene,
4:543-548 (1989) generaron un panel de anticuerpos
anti-Her-2, que incluía el
anticuerpo denominado TA1. Se descubrió que este anticuerpo TA1
induce a la endocitosis acelerada de Her-2 [Véase
Maier et al., Cancer Research, 51:5361-5369
(1991)]. Bacus et al., Mol. Carcinogenesis,
3:350-362 (1990) informaron de que el anticuerpo
TA1 inducía a la maduración de las líneas celulares de cáncer de
mama AU-565 (que sobre-expresa el
gen Her-2) y MCF-7. Se descubrió que
la inhibición del crecimiento y la adquisición de un fenotipo
maduro en estas células estaban asociados con niveles reducidos de
receptor Her-2 en la superficie celular y aumentos
transitorios de los niveles en el citoplasma.
Stancovski et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., 88:8691-8695 (1991) generaron un panel de
anticuerpos anti-Her-2, los
inyectaron i.p. en ratones desnudos y evaluaron su efecto sobre el
crecimiento tumoral de fibroblastos murinos transformados por la
sobre-expresión del gen Her-2. Se
detectaron varios niveles de inhibición tumoral para cuatro de los
anticuerpos, pero uno de los anticuerpos (N28) estimulaba
sistemáticamente el crecimiento tumoral. El anticuerpo monoclonal
N28 indujo a una fosforilación significativa del receptor
Her-2, mientras que los otros cuatro anticuerpos
mostraron en general una actividad inductora de la fosforilación
baja o nula. También se evaluó el efecto de los anticuerpos
anti-Her-2 sobre la proliferación de
las células SKBR3. En este análisis de proliferación de células
SKBR3, dos de los anticuerpos (N12 y N29) causaron una reducción de
la proliferación celular en relación con el control. Se evaluó la
capacidad de diversos anticuerpos para inducir a la lisis celular
in vitro por medio de la citotoxicidad dependiente de
complemento (CDC) y la citotoxicidad dependiente de células mediada
por anticuerpos (CDCA), concluyendo los autores del informe que la
función inhibidora de los anticuerpos no se atribuía
significativamente a la CDC ni a la CDCA.
Bacus et al., Cancer Research,
52:2580-2589 (1992) caracterizaron en mayor
profundidad los anticuerpos descritos en Bacus et al. (1990)
y Stancovski et al. citados anteriormente. Partiendo de los
estudios de i.p. de Stancovski et al., se evaluó el efecto
de los anticuerpos tras una inyección i.v. en ratones desnudos que
albergaban fibroblastos de ratón que
sobre-expresaban el Her-2 humano.
Según lo observado en su trabajo anterior, N28 aceleraba el
crecimiento tumoral, mientras que N12 y N29 inhibían
significativamente el crecimiento de las células que expresan
Her-2. También se observó la inhibición tumoral
parcial con el anticuerpo N24. Bacus et al. también
analizaron la capacidad de los anticuerpos para promover un fenotipo
maduro en las líneas celulares de cáncer de mama humano
AU-565 y MOA-MB453 (que
sobre-expresa Her-2) así como
MCF-7 (que contenía niveles bajos del receptor).
Bacus et al. observaron la correlación entre la inhibición
tumoral in vivo y la diferenciación celular; el anticuerpo
estimulador tumoral N28 no tuvo ningún efecto en la diferenciación
ni en la acción inhibidora tumoral de N12. Los anticuerpos N29 y N24
mostraron una correlación con el grado de diferenciación que
inducían.
Xu et al., Int. J. Cancer,
53:401-408 (1993) evaluaron un panel de anticuerpos
anti-Her-2 en cuanto a sus
especificidades de unión a epítopos, así como a su capacidad para
inhibir el crecimiento independiente del anclaje y dependiente del
anclaje de las células SKBR3 (por anticuerpos individuales y en
combinaciones), para modular Her-2 de la superficie
celular e inhibir el crecimiento independiente del anclaje
estimulado por ligandos. Véase también el documento WO94/00136
publicado el 6 de enero de 1994 y Kasprzyk et al., Cancer
Research, 52:2771-2776(1992) sobre las
combinaciones de anticuerpos
anti-Her-2. En Hancock et al.,
Cancer Research, 51:4575-4580 (1991); Shawver
et al., Cancer Research, 54:1367-1373 (1994);
Arteaga et al., Cancer Research,
54:3758-3765 (1994); y Harwerth et al., J. Biol.
Chem., 267:15160-15167 (1992), se describen
otros anticuerpos anti-Her-2.
También se ha descrito otro gen relacionado con
Her-2, denominado erbB3 o HER3. Véanse, por
ejemplo, las patentes estadounidenses n.º: 5.183.884 y 5.480.968.
ErbB3 es único entre la familia de receptores ErbB en tanto en
cuanto posee poca o ninguna actividad de la tirosina quinasa
intrínseca. Sin embargo, cuando ErbB3 es
co-expresado con Her2, se forma un complejo de
señalización activa y los anticuerpos dirigidos contra
Her-2 son capaces de afectar a este complejo
[Sliwkowski et al., J. Biol. Chem.,
269(20):14661-14665 (1994)]. Además, la
afinidad de ErbB3 por la heregulina (HRG) es aumentada hasta un
estado de afinidad más elevado cuando se co-expresa
con Her-2. Véase también, Levi et al., J.
Neuroscience, 15: 1329-1340 (1995); Morrissey
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:1431-1435
(1995); y Lewis et al., Cancer Research,
56:1457-1465 (1996) con respecto al complejo de
proteína ErbB3-
Her-2.
Her-2.
La subfamilia de clase I de las proteínas
receptoras de factores de crecimiento tirosina quinasas ha sido
ampliada para que incluya al receptor
HER4/p180^{erbB-1}. Véase la solicitud de patente
EP N.º: 599.274: Plowman et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., 90: 1746-1750 (1993): y Plowman et al.,
Nature, 366:473-475 (1993). Plowman et
al. encontraron ese aumento de la expresión de HER4
correlacionado con ciertos carcinomas de origen epitelial,
incluyendo adenocarcinomas de mama. Este receptor, como el ErbB3,
forma un complejo de señalización activa con Her-2
[Carraway y Cantley, Cell, 78:5-8
(1994)].
Los solicitantes han descubierto que,
sorprendentemente, el ligando Apo-2 y un anticuerpo
anti-Her-2 pueden actuar
sinérgicamente para inducir la apóptosis en células de mamífero que
sobre-expresan Her-2.
\newpage
La invención proporciona según las
reivindicaciones, el uso del ligando Apo-2 y un
anticuerpo anti-Her-2 en la
preparación de un medicamento para su uso en un procedimiento para
inducir la apóptosis en células de mamífero. Un procedimiento para
inducir la apóptosis comprende exponer una célula cancerosa de
mamífero que sobre-exprese Her-2 al
ligando Apo-2 y a un anticuerpo
anti-Her-2 en una cantidad eficaz
para inducir sinérgicamente la apóptosis. La célula puede estar en
un cultivo celular o en un mamífero, por ejemplo, en un mamífero que
padezca cáncer. De este modo, la invención incluye el uso de una
cantidad eficaz de ligando Apo-2 y anticuerpo
anti-Her-2, según lo revelado en la
presente memoria, en la preparación de un medicamento para su uso en
un procedimiento para tratar un mamífero que padezca una condición
caracterizada por una sobre-expresión del receptor
Her-2. Según cualquiera de los procedimientos, se
pueden usar uno o más anticuerpos
anti-Her-2. Por ejemplo, se pueden
emplear un primer anticuerpo
anti-Her-2 tal como el anticuerpo
7C2 y un segundo anticuerpo
anti-Her-2 (diferente del primer
anticuerpo, tal como un anticuerpo que se una a un epítopo de
Her-2 diferente). Preferiblemente, al menos uno de
los anticuerpos anti-Her-2 es un
anticuerpo que induce a la apóptosis.
La invención también proporciona composiciones
que comprenden ligando Apo-2 y anticuerpo/s
anti-Her-2. Opcionalmente, las
composiciones de la invención incluirán vehículos o diluyentes
farmacéuticamente aceptables. Las composiciones incluirán ligando
Apo-2 y anticuerpo
anti-Her-2 en una cantidad eficaz
para inducir sinérgicamente la induce la apóptosis en células de
mamífero.
La invención también proporciona artículos de
fabricación y equipos que incluyen ligando Apo-2 y
anticuerpo/s anti-Her-2 según lo
definido en las reivindicaciones.
La figura 1A muestra un diagrama de barras que
ilustra el aumento de la actividad apoptótica (según lo determinado
por la unión a la anexina V y la reabsorción de PI) del
Apo-2L y del anticuerpo 7C2 sobre las células de
tumor de mama BT474 y MCF7/HER2.
La figura 1B muestra un diagrama de barras que
ilustra el aumento de la actividad apoptótica (según lo determinado
por la unión a la anexina V y la reabsorción de PI) del
Apo-2L y del anticuerpo 7C2 sobre las células de
tumor de mama SKBR3.
La figura 2A muestra un gráfico de barras que
muestra el descenso del número de células viables de SKBR3 y el
aumento del número de células muertas (medido mediante la
reabsorción de tinte azul de tripano) tras un tratamiento con el
Apo-2L y anticuerpo 7C2 sobre las células de tumor
de mama SKBR3 tras 3 días.
La figura 2B muestra un gráfico de barras que
muestra el descenso del número de células viables de SKBR3 y el
aumento del número de células muertas (medido mediante la
reabsorción de tinte azul de tripano) tras un tratamiento con el
Apo-2L y el anticuerpo 7C2 sobre las células de
tumor de mama SKBR3 tras 6 días.
La figura 3 muestra un gráfico de barras que
ilustra los cambios en el número de células de tumor de mama BT474
(número de células viables y muertas determinado por la reabsorción
de tinte azul de tripano) tras un tratamiento con
Apo-2L y anticuerpo 7C2.
Los términos "apóptosis" y "actividad
apoptótica" se usan en un sentido amplio y se refieren a la forma
ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que está
comúnmente acompañada por uno o más cambios celulares
característicos, incluyendo la condensación del citoplasma, la
pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, la
segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la
pérdida de la función mitocondrial. Esta actividad se puede
determinar y medir, por ejemplo, mediante análisis de viabilidad
celular, análisis FACS o electroforesis de ADN, y más
específicamente, mediante la unión de la anexina V, la fragmentación
del ADN, el encogimiento celular, la dilatación del retículo
endoplasmático, la fragmentación celular y/o la formación de
vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos).
Como se usa en la presente memoria, el término
"sinergia" o "sinergismo" o "sinérgicamente" se
refiere a la interacción de dos o más agentes tal que su efecto
combinado es mayor que la suma de sus efectos individuales.
Los términos "ligando
Apo-2" y "Apo-2L" se usan en
la presente memoria para referirse a un polipéptido que incluye los
residuos de aminoácido 114-281 inclusive, los
residuos 91-281 inclusive, los residuos
92-281 inclusive, los residuos
41-281 inclusive, los residuos
15-281 inclusive, o los residuos
1-281 inclusive de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la figura 1A de Pitti et al., J. Biol. Chem.,
271:12687-12690 (1996), así como las variantes
delecionales, insercionales o substitucionales de las secuencias
anteriores. En una realización, la secuencia polipeptídica tiene al
menos los residuos 114-281. Opcionalmente, la
secuencia polipeptídica tiene al menos los residuos
91-281 o los residuos 92-281. En
otra realización preferida, las variantes biológicamente activas
tienen al menos una identidad secuencial del aproximadamente 80%,
más preferiblemente, una identidad secuencial del al menos
aproximadamente 90%, y todavía más preferiblemente, una identidad
secuencial del al menos aproximadamente 95% con una cualquiera de
las secuencias anteriores. La definición engloba el ligando
Apo-2 aislado de una fuente de ligandos
Apo-2, tal como de tipos de tejidos humanos o de
otra fuente, o preparado mediante procedimientos recombinantes o
sintéticos. El término "ligando Apo-2" también
se refiere a los polipéptidos descritos en el documento WO
97/25428; supra.
A no ser que se indique lo contrario, el término
"Her-2", cuando se usa en la presente memoria,
se refiere a proteína Her-2 humana y a gen
Her-2 humano. En Semba et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al.,
Nature, 319:230-234 (1986), se describen el gen
Her-2 humano y la proteína Her-2
(número de acceso del banco de genes X03363). Por ejemplo,
Her-2 comprende cuatro dominios (Dominios
1-4). El "dominio 1" está en el terminal amino
del dominio extracelular de Her-2. Véase Plowman
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:
1746-1750 (1993).
El "epítopo 7C2/7F3" es la región del
terminal N del dominio extracelular de Her-2 a la
que se unen los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno depositado en la
ATCC, véase a continuación). Para rastrear los anticuerpos que se
unen al epítopo 7C2/7F3, se puede realizar un análisis de bloqueo
cruzado rutinario tal como el descrito en "Antibodies, A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y
David Lane (1988). Alternativamente, se pueden realizar una
cartografía de epítopos para establecer si el anticuerpo se une al
epítopo 7C2/7F3 sobre Her-2 (es decir, uno
cualquiera o más de los residuos de la región desde aproximadamente
el residuo 22 hasta aproximadamente el residuo 53 de
Her-2).
El "epítopo 4D5" es la región del dominio
extracelular de Her-2 a la que se une el anticuerpo
4D5 (CRL de la ATCC 10463). Este epítopo está cerca de la región
transmembrana de Her-2. Para rastrear los
anticuerpos que se unen al epítopo 4D5, se puede realizar un
análisis de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en
"Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, se
puede realizar una cartografía de epítopos para establecer si el
anticuerpo se une al epítopo 4D5 de Her-2 (es
decir, uno cualquiera o más de los residuos de la región desde
aproximadamente el residuo 529, por ejemplo, aproximadamente el
residuo 561, hasta aproximadamente el residuo 625 inclusive).
Una célula que
"sobre-expresa" Her-2 tiene
niveles de Her-2 significativamente mayores de lo
normal en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de
tejido. Comúnmente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo,
una célula de mama, de ovario, de estómago, de endometrio, de
glándula salival, de pulmón, de riñón, de colon, de tiroide, de
páncreas o de vejiga. La célula también puede ser una línea celular
tal como SKBR3, BT474, Calu 3,
MDA-MB-453,
MDA-MB-361 o SKOV3.
La "heregulina" (HRG), cuando se usa en la
presente memoria, se refiere a un polipéptido que activa los
complejos proteínico Her-2-ErbB3 y
Her-2-ErbB4 (es decir, induce la
fosforilación de residuos de tirosina en el complejo tras la unión
al mismo). Diversos polipéptidos de heregulina englobados por este
término se revelan en, por ejemplo, Holmes et al., Science,
256:1205-1210 (1992); WO 92/20798: Wen et al.,
Mol. Cell. Biol., 14(3):1909-1919
(1994): y Marchionni et al. Nature,
362:312-318 (1993). El término incluye fragmentos
biológicamente activos y/o variantes de un polipéptido de HRG
natural, tales como un fragmento del dominio de tipo FCE del mismo
(por ejemplo, HRG\beta1_{177-244}).
El "complejo proteínico
Her-2-ErbB3" y el "complejo
proteínico Her-2-ErbB4" son
oligómeros asociados de forma no covalente del receptor
Her-2 y el receptor ErbB3 o el receptor ErbB4
respectivamente. Los complejos se forman cuando una célula que
expresa ambos de estos receptores se expone a la HRG, y se pueden
aislar mediante la inmunoprecipitación y analizar mediante
SDS-PAGE según lo descrito en Sliwkowski et al.,
J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665
(1994).
Los "anticuerpos" (Ac) y las
"inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteínas que tienen las
mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos
presentan una especificidad de unión hacia un antígeno específico,
las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas
de tipo anticuerpo que carecen de especificidad antigénica. Los
polipéptidos del último tipo son producidos, por ejemplo, a niveles
bajos por el sistema linfático y a niveles elevados por los
mielomas.
Los "anticuerpos nativos" y las
"inmunoglobulinas nativas" son habitualmente glicoproteínas
heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas
por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H)
idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada
mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de
enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes
isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene
también puentes disulfuro entre cadenas espaciados regularmente.
Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable
(V_{H}) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena
ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un
dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la
cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la
cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está
alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que
determinados residuos de aminoácido forman una interfase entre los
dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertas porciones de los dominios variables difieren
extensamente en la secuencia entre anticuerpos, y se usan en la
unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su
antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye
igualmente por los dominios variables de los anticuerpos. Se
concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de la
complementariedad (CDR, Complementarity Determining Region)
o regiones hipervariables, ambas en los dominios variables de la
cadena ligera y de la cadena pesada. Las porciones más altamente
conservadas de los dominios variables se denominan el marco (FR,
Framework). Los dominios variables de las cadenas pesada y
ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan
en buena parte una configuración de lámina \beta, conectada por
tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman
parte de, la estructura de lámina \beta. Las CDR de cada cadena
son mantenidas muy próximas entre sí por las regiones FR, y con las
CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de
unión a antígenos de los anticuerpos (véase Kabat et al.,
NIH Publ. No.91-3242, Vol. 1, páginas
647-669 (1991)). Los dominios constantes no están
implicados directamente en la unión de un anticuerpo con un
antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la
participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente
del anticuerpo.
La digestión de la papaína de los anticuerpos
produce dos fragmentos de unión a antígenos idénticos, denominados
fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a
antígenos y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su
capacidad por cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina
produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de
combinación con antígenos y no ha perdido su capacidad de
entrecruzar antígenos.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio de reconocimiento de y de unión a antígenos
completo. Esta región está constituida por un dímero de un dominio
variable de una cadena pesada y de una cadena ligera en estrecha
asociación no covalente. Es en esta configuración en la que las tres
CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de
unión a antígenos sobre la superficie del dímero
V_{H}-V_{L}. Conjuntamente, las seis CDR
confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígenos. Sin
embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que
comprenda sólo tres CDR específicas de un antígeno) tiene la
capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque a una afinidad
más baja que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos
Fab en la adición de unos cuantos residuos en el terminal carboxilo
del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas
de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la
denominación de la presente memoria para los Fab' en los que el/los
residuo/s de cisteína de los dominios constantes portan un grupo
tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} fueron
producidos originariamente como pares de los fragmentos Fab' que
tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros
acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados se puede
asignar a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados
kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basados en las secuencias de
aminoácidos de sus dominios constantes.
Las inmunoglobulinas se pueden asignar a clases
diferentes en función de la secuencia de aminoácidos del dominio
constante de sus cadenas pesadas. Hay cinco clases principales de
inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de éstas se
pueden dividir en subclases (isotipos), por ejemplo: IgG1. IgG2,
IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada
que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas
se denominan \alpha, \Delta, \varepsilon, \gamma y \mu,
respectivamente. Las estructuras subunitarias y las
configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de
inmunoglobulinas son conocidas.
El término "anticuerpo" se usa en el
sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos
monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos
multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados
por al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo
siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada.
"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una
porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente, la región de
unión a antígenos o la región variable del anticuerpo intacto. Los
ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab,
Fab', F(ab')_{2} y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales
(Zapata et al., Protein Eng.
8(10):1057-1062 (1995)); moléculas de
anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multiespecíficos
formados por fragmentos de anticuerpo.
El término "anticuerpo monoclonal", como se
usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de
una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir,
los anticuerpos individuales que comprenden la población son
idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden
estar presentes en cantidades traza. Los anticuerpos monoclonales
son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo sitio
antigénico. Además, al contrario de las preparaciones de anticuerpos
(policlonales) convencionales que incluyen comúnmente diferentes
anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos),
cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante
sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos
monoclonales son ventajosos en tanto en cuanto se sintetizan
mediante el cultivo de hibridomas, no contaminado por otras
inmunoglobulinas. El adjetivo "monoclonal" indica que el
anticuerpo se obtiene de una población sustancialmente homogénea de
anticuerpos, y no se interpretará que implique la necesidad de
producir el anticuerpo mediante cualquier procedimiento en
particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán
según la presente invención pueden ser elaborados mediante el
procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler
et al., Nature, 256:495 (1975) o pueden ser elaborados
mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo: la
patente estadounidense n.º: 4.816.567). Los "anticuerpos
monoclonales" también pueden ser aislados de genotecas de
anticuerpos expresados en fagos usando, por ejemplo, las técnicas
descritas en Clackson et al., Nature,
352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol.
Biol., 222:581-597 (1991).
Los anticuerpos monoclonales de la presente
memoria incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos"
(inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de
los anticuerpos derivados de una determinada especie o
pertenecientes a una determinada clase o subclase de anticuerpos,
mientras que el resto de la/s cadena/s es idéntico u homólogo a las
secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de otras
especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos,
así como los fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando
presenten la actividad biológica deseada (patente estadounidense
n.º: No. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 81:6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas" de los anticuerpos
no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas o fragmentos de inmunoglobulinas de los mismos (tales como
Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras secuencias de unión a
antígenos de los anticuerpos) que contienen la secuencia mínima
derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los
anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo
receptor) en las que los residuos de una región determinante de la
complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos
de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como el
ratón, la rata, el conejo con la especificidad, la afinidad y la
capacidad deseadas. En algunos ejemplo, los residuos de la región
marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana están reemplazados por
los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos
humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el
anticuerpo receptor ni en la CDR importada ni en las secuencias
marco. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar y
maximizar el rendimiento de los anticuerpos. En general, el
anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de
al menos un, y comúnmente dos, dominios variables en los que todas o
sustacialmente todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de
una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las
regiones FR son aquéllas de una secuencia de inmunoglobulina
humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al
menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc),
comúnmente, aquélla de una inmunoglobulina humana. Para más
información, véase Jones et al., Nature,
321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature,
332:323-329 (1988): y Presta. Curr. Op. Struct.
Biol., 2:593-596 (1992). El anticuerpo
humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED^{TM} en el que la
región de unión a antígenos del anticuerpo está derivada de un
anticuerpo producido inmunizando monos macacos con el antígeno de
interés.
Los fragmentos de anticuerpos "Fv de una sola
cadena" o "scFv" comprenden dominios V_{H} y V_{L} del
anticuerpo, estando estos dominios presentes en una sola cadena
polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además
un ligador de polipéptidos entre los dominios V_{H} y V_{L} que
permite a scFv formar la estructura deseada para la unión a
antígenos. Para hacer un repaso sobre los scFv, véase Pluckthun en
"The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113,
Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag. Nueva
York. pp. 269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a
antígenos, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de
cadena pesada (V_{H}) conectado con un dominio variable de cadena
ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica
(V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un ligador
que sea demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los
dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a
aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear
dos sitios de unión a antígenos. Los diacuerpos se describen más
detalladamente en, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO
93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
90:6444-6448 (1993).
Como se usa en la presente memoria, el término
"epítopo silvestre de unión a receptores" se refiere a un
epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1,
IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media en
suero in vivo de la molécula de IgG.
"Aislado", cuando se usa para describir las
diversas proteínas reveladas en la presente memoria, significa
proteína que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un
componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su
medio natural son materiales que interferirían comúnmente con los
usos de diagnóstico o terapéuticos de la proteína, y pueden incluir
enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos y no proteínicos. En
realizaciones preferidas, la proteína será purificada (1) hasta un
grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de
aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de
un secuenciador de taza giratoria o (2) hasta su homogeneización
mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras y
reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinte
plata. La proteína aislada incluye proteína in situ de
células recombinantes, pues al menos habrá un componente del medio
natural de la proteína que no estará presente. Sin embargo,
normalmente, la proteína aislada será preparada mediante al menos
una etapa de purificación.
"Tratamiento" o "terapia" se refiere
tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o
preventivas.
"Mamífero" a efectos de tratamiento o
terapia se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero,
incluyendo seres humanos, animales domésticos o de granja y de zoo,
deportivos o animales de compañía, tales como perros, caballos,
gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser
humano.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se
refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que
está comúnmente caracterizada por un crecimiento celular no
regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a,
carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más
concretos de tales cánceres incluyen cáncer de las células
espinales, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de
células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer
de páncreas, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario,
cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer
de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de
las glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer
de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático
y diversos tipos de cáncer de cabeza y de cuello.
En general, en los usos médicos de la invención,
los procedimientos para inducir la apóptosis en células de mamífero
comprenden exponer las células a una cantidad eficaz de ligando
Apo-2 y anticuerpo
anti-Her-2. La cantidad de
Apo-2L y anticuerpo
anti-Her-2 empleada estará en
cantidades eficaces para inducir sinérgicamente la apóptosis. Esto
se puede realizar in vivo o ex vivo según, por
ejemplo, los procedimientos descritos a continuación y en el
ejemplo. Se contempla la posibilidad de usar la presente invención
para tratar diversas condiciones caracterizadas por una
sobre-expresión y/o una activación del receptor
Her-2. Los ejemplos de condiciones o trastornos por
ser tratados con ligando Apo-2 y anticuerpo
anti-Her-2 incluyen cáncer benigno
y maligno. Los procedimientos para determinar los niveles de
expresión de Her-2 antes de exponer las células al
ligando Apo-2 y al anticuerpo
anti-Her-2 son conocidos en la
técnica. Por ejemplo, Slamon et al., patente estadounidense
n.º: 4.968.603, describen diversos análisis de diagnóstico para
determinar la amplificación o la expresión del gen
Her-2 en células tumorales.
El Apo-2L que se puede emplear
en los procedimientos incluye los polipéptidos
Apo-2L descritos en Pitti et al.,
supra, y en el documento WO 97/25428, supra. Se
contempla el uso de diversas formas de Apo-2L,
tales como el polipéptido de longitud completa, así como las formas
solubles de Apo-2L que comprenden una secuencia del
dominio extracelular (ECD, Extracellular Domain). Los
ejemplos de tales secuencias solubles del DEC incluyen polipéptidos
que comprenden los aminoácidos 114-281;
91-281 o 92-281 de la secuencia de
Apo-2L mostrada en la figura 1A de Pitti et al.,
J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996).
Actualmente, se cree que el polipéptido que comprende los
aminoácidos 92-281 es una forma escindida de forma
natural del Apo-2L. Los solicitantes han expresado
el Apo-2L humano en células CHO y han descubierto
que el polipéptido de 92-281 es la forma expresada
de Apo-2L. Se incluyen las formas modificadas de
Apo-2L, tales como las formas modificadas
covalentemente descritas en el documento WO 97/25428. En concreto,
se incluye el Apo-2L ligado a un polímero no
proteínico tal como polietilenglicol para su uso en los presentes
procedimientos. El polipéptido Apo-2L se puede
elaborar según cualquiera de los procedimientos descritos en el
documento WO 97/25428.
Se contempla el empleo alternativo de una
molécula que imite la actividad apoptótica de Apo-2L
en los procedimientos revelados actualmente. Los ejemplos de tales
moléculas incluyen anticuerpos agonistas que pueden inducir la
apóptosis de una manera similar a Apo-2L. En
concreto, estos anticuerpos agonistas comprenderían anticuerpos
frente a uno o más de los receptores de Apo-2L y que
pudieran estimular la apóptosis. Los anticuerpos agonistas
dirigidos contra al menos uno de estos receptores, denominados
Apo-2, se han preparado usando técnicas de fusión
tales como las descritas a continuación. Uno de los anticuerpos
agonistas del receptor Apo-2 se denomina 3F11.39.7
y ha sido depositado en la CCTA con el número de depósito
HB-12456 el 13 de enero de 1998. La actividad
agonista de los anticuerpos de receptor Apo-2L se
puede determinar usando diversos procedimientos de análisis de la
actividad apoptótica. Muchos de estos análisis de la apóptosis se
describen más detalladamente en la presente memoria.
Los anticuerpos
anti-Her-2 que se pueden emplear en
los procedimientos incluyen los anticuerpos monoclonales 7C2 y 7F3.
Se contempla la posibilidad de usar uno o más anticuerpos
anti-Her-2. Al menos uno de los
anticuerpos anti-Her-2 será un
anticuerpo inductor de la apóptosis. Preferiblemente, el anticuerpo
que induce la apóstosis es uno que da como resultado de
aproximadamente 2 a 50 veces más, preferiblemente, de
aproximadamente 5 a 50 veces más y, lo más preferible, de
aproximadamente 10 a 50 veces más, de inducción de la unión a la
anexina en comparación con células no tratadas. Un segundo
anticuerpo anti-Her-2 usado en
combinación con un primer anticuerpo
anti-Her-2 puede, por ejemplo, ser
un anticuerpo que inhiba el crecimiento celular pero que no induzca
la apóptosis. Opcionalmente, los anticuerpos se unirán a una región
del dominio extracelular de Her-2, por ejemplo, a
un epítopo del dominio 1 de Her-2. Preferiblemente,
los anticuerpos se unirán al epítopo Her-2 unido
mediante los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 descritos en la presente
memoria. Los anticuerpos de particular interés son aquellos que,
además de las propiedades anteriormente descritas, se unen al
receptor Her-2 con una afinidad de al menos
aproximadamente 10 nM, más preferiblemente de al menos
aproximadamente 1 nM.
El anticuerpo seleccionado puede ser uno como
7C2 que se une específicamente al Her-2 humano y no
reacciona significativamente por cruzamiento con otras proteínas
tales como aquéllas codificadas por los genes erbB1,
erbB3 y/o erbB4. A veces, el anticuerpo puede no
reaccionar significativamente por cruzamiento con la proteína
neu de rata, por ejemplo, según lo descrito en Schecter et
al., Nature, 312:513 (1984) y Drebin et al., Nature,
312:545-548 (1984). En tales realizaciones, el grado
de unión del anticuerpo a estas proteínas (por ejemplo, unión en la
superficie celular al receptor endógeno) será menor del
aproximadamente 10% determinado mediante una clasificación celular
activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación
(RIA).
Opcionalmente, el anticuerpo será uno que
bloquee la unión a HRG/la activación del complejo
Her-2/ErbB3 (por ejemplo, anticuerpo 7F3).
Alternativamente, el anticuerpo es uno que no bloquea
significativamente la activación del complejo receptor
Her-2/ErbB3 mediante HRG (por ejemplo, 7C2). Además,
el anticuerpo puede ser uno como 7C2 que no provoca una gran
reducción del porcentaje de células en fase S (por ejemplo, uno que
sólo provoque una reducción del aproximadamente
0-10% en el porcentaje de estas células en relación
con el control).
En una realización, el segundo anticuerpo
seleccionado inhibirá el crecimiento de células SKBR3 en cultivo
celular en aproximadamente el 50% al 100% y, opcionalmente, se unirá
al epítopo sobre Her-2 al que se une el anticuerpo
4D5.
El antígeno Her-2 para ser usado
para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma
soluble del dominio extracelular de Her-2; un
péptido tal como un péptido del dominio 1 o una porción del mismo
(por ejemplo, que comprenda el epítopo 7C2 o 7F3). Alternativamente,
se pueden usar células que expresen Her-2 en su
superficie celular; o una línea celular de carcinoma tal como
células SKBR3, véase Stancovski et al., PNAS (EE.UU.),
88:8691-8695 (1991)), para generar anticuerpos.
Otras formas de Her-2 útiles para generar
anticuerpos resultarán evidentes para aquéllos expertos en la
técnica.
Para identificar o seleccionar anticuerpos que
induzcan la apóptosis, se evalúa en comparación con un control la
pérdida de integridad de la membrana según lo indicado por, por
ejemplo, PI, azul de tripano o reabsorción de 7AAD. El análisis
preferido es el "análisis de reabsorción de PI usando células
BT474". Según este análisis, se cultivan células BT474 (que se
pueden obtener de la Colección Americana de Cultivos Tipo
(Manassas, VA)) en medio Eagle modificado por Dulbecco
(D-MEM): HAM F-12 (50:50)
complementado con SBF desactivado por calor al 10% (Hyclone) y
L-glutamina 2 mM. (Así, el análisis se realiza en
ausencia de complemento y de células efectoras inmunes). Se
siembran las células BT474 a una densidad de 10^{6} por placa en
placas de 60 x 15 mm y se permite la unión durante
2-3 días. Luego se retira el medio y se reemplaza
con medio recién preparado solo o medio que contiene 10 \mug/ml
del Acm apropiado. Se incuban las células durante un período de 3
días. Tras cada tratamiento, se lavan las monocapas con PBS y se
separan mediante tripsinización. Entonces se centrifugan las
células a 1.200 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se vuelve a suspender
la pella en 1 ml de tampón de unión a Ca^{2+} enfriado con hielo
(Hepes 10 mM; pH 7,4; NaCl 140 mM; CaCl_{2} 2,5 mM) y se extraen
alícuotas en tubos de 12 x 75 tapados con filtro de 35 mm (1 ml por
tubo) para la eliminación de los agregados celulares. Entonces los
tubos reciben PI (0,1 \mug/ml). Se pueden analizar las muestras
usando un citómetro de flujo de FACSCAN^{TM} y el programa
informático CellQuest de FACSCONVERT^{TM} (Becton Dickinson). Se
pueden seleccionar aquellos anticuerpos que induzcan niveles
estadísticamente significativos de apóptosis determinados mediante
la reabsorción de PI.
Para seleccionar los anticuerpos que induzcan la
apóptosis, se puede realizar un análisis de unión a anexina usando
células BT474 según lo descrito en el ejemplo que se presenta a
continuación. Las células BT474 se cultivan y se siembran en placas
según lo descrito en el párrafo anterior. Luego se retira el medio
y se reemplaza con medio recién preparado solo o medio que contiene
10 \mug/ml del Acm. Tras un período de incubación de tres días,
se lavan las monocapas con PBS y se separan mediante tripsinización.
Entonces se centrifugan las células, se vuelven a suspender en
tampón de unión a Ca^{2+} y se extraen en tubos según lo descrito
anteriormente para el análisis de la muerte celular. Los tubos
reciben entonces anexina marcada (por ejemplo, anexina
V-FITC) (1 \mug/ml). Se pueden analizar las
muestras usando un citómetro de flujo de FACSCAN^{TM} y el
programa informático CellQuest de FACSCONVERT^{TM} (Becton
Dickinson). Aquellos anticuerpos que induzcan niveles
estadísticamente significativos de unión a anexina en comparación
con el control se seleccionan como anticuerpos inductores de la
apóptosis.
Además del análisis de unión a anexina descrito
en el párrafo anterior, se puede utilizar un análisis de tinción de
ADN usando células BT474. Para realizar este análisis, se incuban
células BT474 que han sido tratadas con el anticuerpo de interés
según lo descrito en los dos párrafos anteriores con 9 \mug/ml de
HOECHST 33342^{TM} durante 2 horas a 37ºC, luego se analizan en un
citómetro de flujo de EPICS ELITE^{TM} (Coulter Corporation)
usando el programa informático MODFIT LT^{TM} (Verity Software
House). Con este análisis, los anticuerpos que induzcan un cambio
en el porcentaje de células apoptóticas que sea dos veces mayor o
más (y preferiblemente, 3 veces mayor o más) que las células sin
tratar (hasta 100% de células apoptóticas) se pueden seleccionar
como anticuerpos apoptóticos.
Para identificar o seleccionar los anticuerpos
que se unen a un epítopo sobre Her-2 unido por un
anticuerpo de interés, se puede realizar un análisis de bloqueo
cruzado rutinario tal como el descrito en "Antibodies, A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y
David Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar una
cartografía de epítopos.
Para identificar anticuerpos
anti-Her-2 que inhiban el
crecimiento de las células SKBR3 en cultivo celular en un
50-100%, se puede realizar el análisis de SKBR3
descrito en el documento WO89/06692. Según este análisis, las
células SKBR3 se cultivan en una mezcla 1:1 de F12 y de medio DMEM
complementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina y
penicilina/estreptomicina. Se colocan las células SKBR3 en placas a
20.000 células en una placa de cultivo celular de 35 mm (placa de 2
ml/35 mm). Se añaden 2,5 \mug/ml de anticuerpo
anti-Her-2 por placa. Tras seis
días, se cuenta el número de células, en comparación con células no
tratadas usando un contador celular electrónico de COULTER^{TM}.
Se pueden seleccionar aquellos anticuerpos que inhiban el
crecimiento de las células SKBR3 en un 50-100% para
su combinación con anticuerpos apoptóticos según lo deseado.
También se conocen en la técnica metodologías alternativas para
evaluar la inhibición del crecimiento de células tales como SKBR3,
por ejemplo, aquéllas que utilizan violeta cristal para teñir las
células. Véase, por ejemplo, Phillips et al., Cancer Immunol.
Immunother. 37: 255-263 (1993).
Se pueden usar diversos tipos de anticuerpos
Her-2 en los procedimientos, describiéndose tales
tipos de anticuerpos de manera general a continuación en los
subapartados (i)-(vii).
Los anticuerpos policlonales se elevan
preferiblemente en animales mediante múltiples inyecciones
subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y
un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una
proteína que sea inmunogénica en la especie por ser inmunizada, por
ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero,
tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de semilla de soja
usando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo,
maleimidobenzoil-sulfosuccinimida-éster (conjugación
a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a
través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico,
SOCl_{2} o R^{1}N=C=NR, en el que R y R' son grupos alquilo
diferentes.
Se inmunizan los animales frente al antígeno,
los conjugados inmunogénicos o los derivados combinando, por
ejemplo, 100 \mug o 5 \mug de la proteína o del conjugado (para
conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante
completo de Freund y se les inyecta la solución intradérmicamente en
múltiples zonas. Un mes más tarde, se vuelve a inyectar a los
animales 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o el
conjugado en adyuvante completo de Freund mediante la inyección
subcutánea en múltiples zonas. De siete a 14 días después, se
sangran los animales y se analiza el suero para determinar los
niveles de anticuerpos. Se vuelve a inyectar a los animales hasta
que los niveles se estancan. Preferiblemente, se aplica al animal
una inyección complementaria del conjugado del mismo antígeno, pero
conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de
entrecruzamiento diferente. También se pueden elaborar los
conjugados en cultivo celular recombinante como fusiones de
proteínas. Además, se usan adecuadamente agentes de agregación tales
como alumbre para aumentar la respuesta inmune.
Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una
población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a
excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar
presentes en cantidades traza. De este modo, el adjetivo
"monoclonal" indica que el anticuerpo no es una mezcla de
anticuerpos diferenciados.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se
pueden elaborar usando el procedimiento del hibridoma descrito por
primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o
pueden ser elaborados mediante procedimientos de ADN recombinante
(véase, por ejemplo: la patente estadounidense n.º: 4.816.567).
En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza
un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, para
hacer que los linfocitos que producen o que son capaces de producir
anticuerpos se unan específicamente a la proteína usada para la
inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar
in vitro. Entonces se fusionan los linfocitos con células de
mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como
polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding,
"Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", pp.
59-103 (Academic Press, 1986)).
Se siembran y se cultivan las células de
hibridoma así preparadas en un medio de cultivo adecuado que
contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales
no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales
carecen de enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas comúnmente
incluirá hipoxantina, aminopterina y timidita (medio HAT) cuyas
sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en
HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquéllas
que se fusionan eficazmente, que soportan una producción a un alto
nivel estable de anticuerpo por las células productoras del
anticuerpo seleccionado y son sensibles a un medio tal como el
medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas
son las líneas de mieloma murino, tales como aquéllas derivadas de
tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11
disponibles en Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego,
California EE.UU., y las células SP-2 o
X63-Ag8-653 disponibles en la
Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia, EE.UU.
Para la producción de anticuerpos monoclonales, también se han
descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de
ratón-humano (Kozbor, J. Immunol., 133:3001
(1984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications", pp. 51-63 (Marcel
Dekker. Inc., Nueva York. 1987)).
Se analiza el medio de cultivo en el que están
cultivadas las células de hibridoma en cuanto a la producción de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno.
Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos
monoclonales producidos por células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante análisis de unión in
vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o análisis
inmunoabsorbente ligada a enzimas (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal
se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard
de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Una vez identificadas las células de hibridoma
que producen anticuerpos de la especificidad, la afinidad y/o la
actividad deseadas, se pueden subclonar los clones mediante
procedimientos de dilución restrictivos y cultivarlos mediante
procedimientos estándar (Goding, "Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice", pp. 59-103 (Academic
Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado a este efecto incluye,
por ejemplo, medio D-MEM o
RPMI-1640. Además, se pueden cultivar las células de
hibridoma in vivo como tumores Ascitis de un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones son separados adecuadamente del medio de cultivo, del
fluido ascítico o del suero mediante procedimientos de purificación
de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, la
proteína A-Sefarosa, cromatografía en
hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de
afinidad.
El ADN codificante de anticuerpos monoclonales
se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos
convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótido que
son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de
cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de
hibridoma sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado,
se puede colocar el ADN en vectores de expresión que luego son
transfectados a células huésped, tales como, células de E.
coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino
(CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína
inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en células huésped recombinante. Los artículos de
revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN
codificante del anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinion
in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pluckthun,
Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
En otra realización más, se pueden aislar
anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de genotecas de anticuerpos
expresados en fagos generadas usando técnicas descritas en
McCafferty et al., Nature. 348:552-554
(1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628
(1991) y Marks et al., J. Mol. Biol.,
222:581-597 (1991) describen el aislamiento de
anticuerpos humanos y murinos, respectivamente, usando genotecas de
fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de
anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de los nM) mediante
el intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology,
10:779-783 (1992)), así como mediante la infección
combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia de
construcción de genotecas de fagos de muy grandes dimensiones
(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res.,
21:2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas
son alternativas viables a las técnicas del hibridoma de
anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de
anticuerpos monoclonales.
También se puede modificar el ADN, por ejemplo,
sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de
cadena pesada y cadena ligera humanos en lugar de las secuencias
murinas homólogas (Patente estadounidense n.º: 4.816.567: Morrison,
et al., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 81:851 (1984)), o
mediante la unión con enlace covalente a una secuencia codificante
de inmunoglobulinas de toda o parte de la secuencia codificante de
un polipéptido que no sea una inmunoglobulina.
Comúnmente tales polipéptidos que no son
inmunoglobulinas están sustituidos para los dominios constantes de
un anticuerpo, o están sustituidos para los dominios variables de un
sitio de combinación con antígenos de un anticuerpo para crear un
anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un sitio de combinación
con antígenos que tenga una especificidad por un antígeno y otro
sitio de combinación con antígenos que tenga una especificidad por
otro antígeno diferente.
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son conocidos en la técnica. Preferiblemente, un anticuerpo
humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en su
interior procedentes de una fuente que no es humana. Estos residuos
de aminoácido no humanos son habitualmente denominados residuos
"de importación", que son comúnmente tomados de un dominio
variable de "importación". La humanización se puede realizar
esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores
(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986);
Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536
(1988)), sustituyendo secuencias CDR o CDR de roedores por las
secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por
consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos
quiméricos (patente estadounidense n.º: 4.816.567) en los que se ha
sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano
intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana.
En la práctica, los anticuerpos humanizados son comúnmente
anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos de
la CDR y, posiblemente, algunos residuos de la región FR por
residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedor.
La selección de dominios variables humanos,
tanto ligeros como pesados, para ser usados en la fabricación de
anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la
antigenicidad. Según el procedimiento denominado del "mejor
ajuste", se rastrea la secuencia del dominio variable de un
anticuerpo de roedor frente a una genoteca completa de secuencias
humanas de dominios variables conocidas. Entonces de acepta como
marco (FR) humano la secuencia humana que sea más próxima a la del
roedor para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J.
Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol.
Biol., 196:901 (1987)). Otro procedimiento usa un determinado
marco derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos
humanos de un determinado subgrupo de cadenas ligeras o pesadas. Se
puede usar el mismo marco para varios anticuerpos humanizados
diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623
(1993)).
Es más importante que los anticuerpos sean
humanizados conservando la afinidad alta por el antígeno y otras
propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según
un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan
mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y
diversos productos humanizados conceptuales usando modelos
tridimensionales de las secuencias humanizadas y parentales. Los
modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran comúnmente
disponibles y resultan familiares a los expertos en la técnica. Hay
programas informáticos disponibles que ilustran y muestran
estructuras conformacionales tridimensionales posibles de
secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. El examen de
estas muestras permite el análisis del posible papel de los
residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina
candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la
capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su
antígeno. De este modo, se pueden seleccionar los residuos de la FR
y combinarlos desde el receptor e importar secuencias, tal que se
logre obtener la característica deseada del anticuerpo, tal como
una mayor afinidad por el/los antígeno/s diana. En general, los
residuos de la CDR están directamente y más sustancialmente
implicados en influir sobre la unión a
antígenos.
antígenos.
Alternativamente, ahora es posible producir
animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras
una inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos
humanos en ausencia de una producción endógena de inmunoglobulina.
Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen
de la región de unión a cadenas pesadas de anticuerpos (J_{H}) en
ratones mutantes de la línea germinal y quimérica resulta en la
inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La
transferencia del alineamiento de genes de inmunoglobulina de la
línea germinal humana de tales ratones mutantes de la línea germinal
dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el
desafío antigénico. Véase, por ejemplo: Jakobovits et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90:2551 (1993); Jakobovits et al.,
Nature, 362:255-258 (1993): Bruggermann et
al., Year in Immuno., 7:33 (1993). También es posible
derivar anticuerpos humanos de genotecas de expresión en fagos
(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991):
Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597
(1991)).
Se han desarrollado diversas técnicas para la
producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos
fragmentos se derivaban mediante la digestión proteolítica de
anticuerpos intactos (véase, por ejemplo: Morimoto et al.,
"Journal of Biochemical and Biophysical Methods",
24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science,
229:81 (1985)). Sin embargo, actualmente es posible producir estos
fragmentos directamente mediante células huésped recombinantes. Por
ejemplo, se pueden aislar los fragmentos de anticuerpos de las
genotecas de anticuerpos expresados en fagos descritas
anteriormente. Alternativamente, se pueden recuperar fragmentos
Fab'-SH directamente de E. coli y acoplarlos
químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter
et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)).
Según otro enfoque, es posible aislar fragmentos F(ab')_{2}
directamente de un cultivo de células huésped recombinantes. Otras
técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos resultarán
evidentes al experto en la técnica. En otras realizaciones, el
anticuerpo seleccionado es un fragmento Fv de una sola cadena
(scFv). Véase el documento WO 93/16185.
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos
distintos. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden unir a
dos epítopos distintos de la proteína Her-2. Por
ejemplo, un brazo se puede unir a un epítopo del dominio 1 de
Her-2, tal como el epítopo 7C2/7F3, y el otro se
puede unir a un epítopo de Her-2 distinto, por
ejemplo: el epítopo 4D5. Otros de tales anticuerpos pueden combinar
un sitio de unión a Her-2 con un sitio/s de unión
para RFCE, ErbB3 y/o ErbB4. Alternativamente, se puede combinar un
brazo de anti-Her-2 con un brazo que
se una a una molécula desencadenante sobre un leucocito tal como
una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2 o CD3) o
receptores Fc para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64),
Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para enfocar los
mecanismos de defensa celulares hacia la célula que expresa
Her-2. También es posible usar los anticuerpos
biespecíficos para ubicar agentes citotóxicos hacia células que
expresen Her-2. Estos anticuerpos poseen un brazo de
unión a Her-2 y un brazo que se une al agente
citotóxico (por ejemplo, saporina,
anti-interferón-\alpha, alcaloide
de la vinca, cadena A del ricino, metotrexato o hapteno de isótopo
radiactivo). Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como
anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por
ejemplo, anticuerpos biespecíficos de F(ab')_{2}).
Opcionalmente, los anticuerpos biespecíficos
pueden incluir anticuerpos que combinan un sitio de unión a
Her-2 con un sitio/s de unión para un receptor del
Apo-2L. Tales receptores incluirían el receptor
Apo-2 y el receptor DR4 (que están descritos en al
apartado de antecedentes). Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico
puede tener un brazo que se una a un epítopo de
Her-2 y otro brazo que se una a un receptor del
ligando Apo-2.
Los procedimientos para fabricar anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción
tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se
basa en la co-expresión de dos pares de cadena
ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, teniendo
las dos cadenas especificidades distintas (Milstein et al.,
Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la
variedad aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de las
inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla
potencial de 10 moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales
sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación
de la molécula correcta, que habitualmente se hace mediante etapas
de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda de realizar,
siendo los rendimientos del producto bajos. En el documento WO
93/08829 y en Traunecker et al., EVIBO J.,
10:3655-3659 (1991), se revelan
procedimientos
similares.
similares.
Según un enfoque diferente, se fusionan dominios
variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas
(sitios de combinación de anticuerpo y antígeno) con secuencias de
dominios constantes de inmunoglobulina. Es preferible que la fusión
sea con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que
comprenda al menos parte de las regiones bisagra CH2 y CH3. Es
preferible tener la primera región constante de cadena pesada (CH1)
que contenga el sitio necesario para unirse a cadenas ligeras,
presente en al menos una de las fusiones. Los ADN codificantes de
de las fusiones de cadenas pesadas de inmunoglobulina y, si se
desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores
de expresión separados y se co-transfectan a un
organismos huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad
del ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos
polipeptídicos en realizaciones en las que las proporciones
desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la
construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es
posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres
cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la
expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones
iguales dé como resultado rendimientos elevados o cuando las
proporciones no sean de particular
relevancia.
relevancia.
En una realización preferida de este enfoque,
los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada
de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en
un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de
inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad
de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura
asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico
deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no
deseadas, pues la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina
en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo
fácil de separación. Este enfoque se revela en el documento WO
94/04690. Para más información sobre la generación de anticuerpos
biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., "Methods
in Enzymology", 121:210 (1986). Según otro enfoque descrito en
el documento WO96/27011, se puede diseñar genéticamente la interfase
entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el
porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo celular
recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte
del domino C_{H}3 de un dominio constante de anticuerpo. En este
procedimiento, se reemplazan una o más cadenas pequeñas laterales de
aminoácidos de la interfase de la primera molécula de anticuerpo
por cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano).
Se crean "cavidades" compensatorias de un tamaño idéntico o
similar a la/s cadena/s lateral/es larga/s en la interfase de la
segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas largas
laterales de aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo,
alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar la
producción del heterodímero frente a otros productos finales no
deseados tales como
homodímeros.
homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen
anticuerpos "heteroconjugados" o entrecruzados. Por ejemplo,
se puede acoplar uno de los anticuerpos del heteroconjugado con
avidina, el otro, con biotina. Se han propuesto tales anticuerpos,
por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunológico hacia
células no deseadas (Patente estadounidense n.º: 4.676.980) y para
el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO
92/200373 y EP 03089). Se pueden preparar anticuerpos de
heteroconjugados usando cualquier procedimiento de entrecruzamiento
conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son conocidos
en la técnica y se revelan en la patente estadounidense n.º:
4.676.980 junto con un número de técnicas de entrecruzamiento.
También se han descrito en la bibliografía
técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar
anticuerpos biespecíficos usando un enlace químico. Brennan et
al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el
que anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para
generar fragmentos de F(ab')_{2}. Estos fragmentos son
reducidos en presencia del agente complejante de ditiol arsenita de
sodio para estabilizar ditioles vecinales y evitar la formación de
disulfuros intermoleculares. Los fragmentos de Fab' generados son
entonces convertidos en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de
los derivados de Fab'-TNB es entonces reconvertido
en el Fab'-tiol mediante la reducción con
mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro
derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden
usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Los progresos recientes han facilitado la
recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E.
coli que pueden ser apareados químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med, 175:
217-225 (1992) describen la producción de una
molécula de F(ab')_{2} de anticuerpo biespecífico
completamente humanizado. Cada fragmento Fab' fue secretado por
separado de E. coli y sometido a un acoplamiento químico
dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El
anticuerpo biespecífico así formado era capaz de unirse a células
que sobre-expresaban el receptor
Her-2 y células T humanas normales, así como
desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos
frente a dianas tumorales de mama humana.
También se han descrito diversas técnicas para
fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos
directamente de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han
producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina.
Kostelny et al., J. Immunol.,
148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos
cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun fueron unidas a
las porciones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión
génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región
bisagra para formar monómeros y luego se volvieron a oxidar para
formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también
se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo.
La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90:6444-6448
(1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar
fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden
un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado con un
dominio variable de cadena ligera (V_{L}) por un ligador que es
demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos
dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios de
V_{H} y V_{L} de un fragmento son forzados a aparearse con los
dominios de V_{L} Y V_{H} complementarios de otro fragmento,
formando así dos sitios de unión a antígenos. También se ha descrito
otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecífico
mediante el uso de dímeros Fv de una sola cadena (scFv). Véase
Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Quedan englobados los anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos
triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991).
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la
invención con respecto a la función efectora para, por ejemplo,
aumentar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer.
Por ejemplo, se puede(n) introducir residuo/s de cisteína en
la región Fc permitiendo así la formación de enlaces de tipo
disulfuro entre las cadenas de esta región. El anticuerpo
homodimérico así generado puede tener una mejor capacidad de
interiorización y/o una mayor capacidad de matar células mediada
por complementos y una citotoxicidad celular dependiente del
anticuerpo (CCDA). Véase Caron et al., J. Exp Med.
176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J.
Immunol., 148:2918-2922 (1992). También se
pueden preparar anticuerpos homodiméricos con una mayor actividad
antitumoral usando ligadores de entrecruzamiento
heterobifuncionales según lo descrito en Wolff et al., Cancer
Research, 53:2560-2565 (1993).
Alternativamente, se puede diseñar genéticamente un anticuerpo que
tenga regiones Fc duales y pueda así tener mayores capacidades de
lisis de complementos y de CCDA. Véase Stevenson et al.,
Anti-Cancer Drug Design,
3:219-230 (1989).
En ciertas realizaciones de la invención, puede
ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un
anticuerpo intacto para, por ejemplo, aumentar la penetración
tumoral. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de
anticuerpo para aumentar su vida media en suero. Esto se puede
lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de
unión a receptores silvestres en un fragmento de anticuerpo (por
ejemplo, mediante la mutación de la región apropiada del fragmento
de anticuerpo o mediante la incorporación del epítopo en una
etiqueta peptídica que luego sea fusionada con el fragmento de
anticuerpo en cualquier extremo o en el medio, por ejemplo,
mediante síntesis de ADN o de péptidos).
Los procedimientos sistemáticos para preparar
tales variantes de anticuerpo que tengan una mayor vida media in
vivo comprenden varias etapas. La primera implica identificar la
secuencia y la configuración de un epítopo de unión a receptores
silvestres de una región Fc de una molécula de IgG. Una vez
identificado este epítopo, se modifica el anticuerpo de interés
para que incluya la secuencia y la configuración del epítopo de
unión identificado. Una vez mutada la secuencia, se analiza la
variante de anticuerpo para ver si tiene una mayor vida media in
vivo que la del anticuerpo original. Si la variante de
anticuerpo no tiene una vida media in vivo mayor tras el
análisis, se sigue alterando la secuencia para que incluya la
secuencia y la configuración del epítopo de unión identificado. Se
analiza el anticuerpo modificado en cuanto a una vida media más
prolongada, y se sigue realizando el procedimiento hasta que se
obtenga una molécula que presente una vida media in vivo más
larga.
El epítopo de unión a receptores silvestres así
incorporado en el anticuerpo de interés es cualquiera de tales
epítopos adecuados según lo definido anteriormente, y su naturaleza
dependerá, por ejemplo, del tipo de anticuerpo que esté siendo
modificado. La transferencia se realiza tal que el anticuerpo de
interés siga poseyendo las actividades biológicas descritas en la
presente memoria.
Preferiblemente, el epítopo constituye una
región en la que uno cualquiera o más residuos de aminoácidos de
uno o dos bucles de un dominio Fc sean transferidos a una posición
análoga del fragmento de anticuerpo. Todavía más preferiblemente,
se transfieren tres o más residuos de uno o dos bucles del dominio
Fc. Todavía más preferiblemente, se toma el epítopo del dominio CH2
de la región Fc (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la
región CH1, CH3 o V_{H}, o a más de una de tales regiones del
anticuerpo. Alternativamente, se toma el epítopo del dominio CH2 de
la región Fc y se transfiere a la región C_{L} o a la región
V_{L}, o a ambas, del fragmento de anticuerpo.
El ligando Apo-2 y el anticuerpo
anti-Her-2 son preferiblemente
administrados en un vehículo. Es posible administrar ambos en un
solo vehículo o, alternativamente, se pueden incluir en vehículos
separados. En "Remington's Pharmaceutical Sciences", XVI ed.,
1980. Mack Publishing Co., editado por Oslo et al, se
describen vehículos adecuados y sus formulaciones. Comúnmente, se
usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable
en el vehículo para volver la formulación isotónica. Los ejemplos de
vehículo incluyen solución salina, solución de Ringer y solución de
dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente
5 a aproximadamente 8, y más preferiblemente de aproximadamente 7,4
a aproximadamente 7,8. Resultará evidente a aquéllos expertos en la
técnica que ciertos vehículos pueden ser más preferibles en función
de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración del
agente que esté siendo administrado. El vehículo puede
\hbox{estar en forma de una formulación liofilizada o una solución acuosa.}
Los vehículos, excipientes o estabilizadores son
preferiblemente no tóxicos para las células y/o receptores en las
dosis y a las concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales
como fosfato, citrato y ácidos orgánicos; antioxidantes que
incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como
cloruro de octadecildimetilbencil-amonio; cloruro
de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio;
alcohol fenólico, butílico o bencílico;
alquil-parabenos tales como metil- o
propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol;
3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo
peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas,
tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas;
polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos
tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o
lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que
incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como
EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol;
contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos
metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína);
y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN^{TM},
PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG).
La formulación también puede contener más de un
compuesto activo según lo que sea necesario para la indicación
concreta que esté siendo tratada, preferiblemente, aquéllos con
actividades complementarias que se no afecten negativamente entre
sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un
agente citotóxico, citoquina o un agente inhibidor del crecimiento.
Tales moléculas se presentan adecuadamente en combinación en
cantidades que son eficaces a los efectos deseados.
El Apo-2L y/o el anticuerpo
anti-Her-2 también pueden estar
confinados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por
ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas de administración de fármacos coloidales, (por ejemplo,
liposomas, microesféras de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se revelan en
"Remington's Pharmaceutical Sciences" XVI edición, Osol, A.
Ed. (1980).
Las formulaciones para ser usadas en una
administración in vivo deberían ser estériles. Esto se
consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos
sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en
forma de artículos con una determinada forma, por ejemplo: películas
o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida
incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o alcohol poli(vinílico), polilactidas (Patente
estadounidense n.º 3.773.919), copolímeros de ácido
L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico
y ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT^{TM}
(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico
y ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que los polímeros tales como acetato de
etilen-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico
permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días,
ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos de
tiempo.
El Apo-2L y el anticuerpo
Her-2 se pueden administrar conforme a
procedimientos conocidos, tales como una administración intravenosa
como un bolo o mediante infusiones continuas durante un período de
tiempo, mediante vía intramuscular, intraperitoneal,
intracero-brospinal, subcutánea,
intra-arterial, intrasinovial, intratecal, oral,
tópica o por inhalación. Opcionalmente, se puede realizar la
administración a través de una infusión con
mini-bomba usando diversos dispositivos disponibles
comercialmente.
Las dosis y los regímenes posológicos eficaces
para la administración del ligando Apo-2 y del
anticuerpo Her-2 se pueden determinar
empíricamente, siendo la realización de tales determinaciones
competencia del experto en la técnica. Actualmente, se cree que una
dosis o una cantidad eficaz de ligando Apo-2 usado
solo puede variar de aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente
100 mg/kg de peso corporal o más al día. Se puede realizar un
ajuste de la escala de las dosis entre especies de una manera
conocida en la técnica, por ejemplo: según lo revelado en Mordenti
et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991). Los expertos en la
técnica entenderán que la dosis de ligando Apo-2
que debe ser administrada variará en función de, por ejemplo, el
mamífero que reciba el ligando Apo-2, de la vía de
administración y de otros fármacos o terapias que estén siendo
administradas al mamífero.
En función del tipo de células y/o de la
gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg
(por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una
dosis candidata inicial para la administración, bien, por ejemplo,
mediante una o más administraciones separadas o mediante una
infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de
aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, en función de
factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas
durante varios días o más, dependiendo de la condición, se mantiene
el tratamiento hasta que se produzca la supresión deseada de los
síntomas de la enfermedad. Sin embargo, hay otros regímenes
posológicos que pueden ser útiles.
Para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de
enfermedad por ser tratada, según lo definido anteriormente, de la
gravedad y del curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se
administra con objetivos preventivos o terapéuticos, de la terapia
previa, del historial clínico el paciente y de la respuesta al
anticuerpo, y del criterio del médico. El anticuerpo se administra
adecuadamente al paciente en un determinado momento o durante una
serie de tratamientos.
Se contempla el empleo de todavía más terapias
en los procedimientos. La terapia o las terapias del resto de
terapias pueden incluir, pero no se limitan a, quimioterapia y/o
terapia de radiación, inmunoadyuvantes, citoquinas y otras terapias
basadas en anticuerpos no Her-2. Los ejemplos
incluyen interleuquinas (por ejemplo, IL-1,
IL-2, IL-3, IL-6),
factor inhibidor de la leucemia, interferones,
FCT-heta-eritropoietina,
trombopoietina y anticuerpo anti-FCEV. También se
pueden emplear otros agentes conocidos por inducir la apóptosis en
células de mamífero, y tales agentes incluyen
FNT-\alpha, FNT-\beta
(linfotoxina-\alpha), ligando CD30, ligando
4-1BB y ligando Apo-1.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Las quimioterapias contempladas por la invención
incluyen sustancias químicas o fármacos que son conocidos en la
técnica y se encuentran comercialmente disponibles, tales como la
Adriamicina, Doxorrubicina, 5-Fluorouracil,
Arabinósido de citosina ("Ara-C"),
Ciclofosfamida, Camptotecina, Leucovorina, Tiotepa, Busulfán,
Citoxina, Taxol, Toxotere, Metotrexato, Cisplatina, Melfalán,
Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C,
Mitoxantrona, Vincreistina, Vinorrelbina, Carboplatina, Tenipósido,
Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina,
Mitomicinas, Esperamicinas (véase la patente estadounidense N.º:
4.675.187). Melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas.
También están incluidos agentes que actúan para regular o inhibir la
acción hormonal sobre tumores tales como tamoxifén y
onapristona.
La preparación o los regímenes posológicos para
tal quimioterapia se pueden usar según las instrucciones de los
fabricantes o según lo determinado empíricamente por el experto en
la técnica. La preparación o los regímenes posológicos para tal
quimioterapia también se describen en "Chemotherapy Service"
Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El
agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración
con el Apo-2L y/o anticuerpo Her-2,
o se puede administrar simultáneamente a la misma.
La quimioterapia se administra preferiblemente
en un vehículo, tal como aquéllos descritos anteriormente. El modo
de administración de la quimioterapia puede ser el mismo empleado
para el ligando Apo-2 o el anticuerpo
Her-2, o puede ser administrada mediante un modo
diferente.
La terapia de radiación se puede administrar
según protocolos comúnmente empleados en la técnica y conocidos por
el experto en la técnica. Tal terapia puede incluir radiación de
cesio, iridio, yodo o cobalto. La terapia de radiación puede ser
una radiación a todo el cuerpo o puede ser dirigida localmente a una
zona o a un tejido específico del o sobre el cuerpo. Comúnmente, la
terapia de radiación se administra en pulsos durante un período de
tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas. La terapia
de radiación se puede administrar, sin embargo, durante períodos de
tiempo más prolongados. Opcionalmente, la terapia de radiación se
puede administrar en una sola dosis o en múltiples dosis
consecutivas.
El ligando Apo-2 y el anticuerpo
anti-Her-2 (y una o más de otras
terapias) se pueden administrar simultáneamente o consecutivamente.
Tras la administración del ligando Apo-2 y del
anticuerpo Her-2, se pueden analizar las células
tratadas in vitro. Cuando se ha realizado un tratamiento
in vivo, se puede controlar al mamífero tratado de diversos
modos conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, se puede
observar la masa tumoral físicamente, mediante biopsia o mediante
técnicas estándar de formación de imágenes por rayos X.
En otra realización de la invención, se
proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales
útiles para el tratamiento de trastornos descritos anteriormente. El
artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta. Los
envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas
y tubos de ensayo. Los envases pueden estar formados por una
variedad de materiales tales como vidrio y plástico. El envase
contiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la
condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo,
el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que
tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica).
Los agentes activos de la composición son el ligando
Apo-2 y el anticuerpo
anti-Her-2. La etiqueta del o
asociada con el envase indica que la composición se usa para tratar
la condición seleccionada. El artículo de fabricación puede
comprender además un segundo envase que comprenda un tampón
farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con
fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede
incluir otros materiales deseables desde un punto de vista
comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes,
filtros, agujas, jeringas y prospectos con las instrucciones de
uso.
Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de
ilustración y sin fines restrictivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Líneas celulares. Las células de tumor de mama
humano establecidas BT474 (disponibles en la ATCC) y MCF7/
HER-2 (línea celular de tumor de mama de MCF7 transfectada a HER-2; células SKBR3 y MCF7 disponibles en la ATCC) se cultivaron en DMEM:HAM F-12 (50:50) (Gibco, Grand Island, NY) complementado con suero bovino fetal desactivado por calor al 10% (SBF) (HyClone, Logan, UT) y L-glutamina (2 mM).
HER-2 (línea celular de tumor de mama de MCF7 transfectada a HER-2; células SKBR3 y MCF7 disponibles en la ATCC) se cultivaron en DMEM:HAM F-12 (50:50) (Gibco, Grand Island, NY) complementado con suero bovino fetal desactivado por calor al 10% (SBF) (HyClone, Logan, UT) y L-glutamina (2 mM).
Reactivos bioquímicos. Los reactivos bioquímicos
usados para los estudios de la apóptosis fueron: Anexina
V-FITC (BioW-hittaker, Inc.), yoduro
de propidio (PI, Molecular Probes, Inc.) y HOECHST 33342^{TM}
(Calbiochem).
Ligando Apo-2. El
Apo-2L marcado con His que comprende los aminoácidos
114-281 de Apo-2L (según lo
mostrado en la figura 1A de Pitti et al., J. Blot. Chem.,
271:12687-12690 (1996)) se preparó según lo
descrito en el documento WO97/25428.
Anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales
murinos de la IgG_{l}K de
anti-Her-2 específicos del dominio
extracelular de Her-2 se produjeron según lo
descrito en Fendly et al., Cancer Research,
50:1550-1558 (1990) y el documento WO89/06692. En
síntesis, se cultivaron células NIH
3T3/HER-2-3_{400} (que expresaban
aproximadamente 1 x 10^{6} moléculas de
Her-2/célula) producidas según lo descrito en
Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 84:7159
(1987) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía
EDTA 25 mM y se usaron para inmunizar ratones BALB/c. Los ratones
recibieron inyecciones i.p. de 10^{7} células en 0,5 ml de PBS en
las semanas 0, 2, 5 y 7. Los ratones con antisuero que hizo
inmunoprecipitar Her-2 marcado con ^{32}P
recibieron inyecciones i.p. de aglutinina de germen de
trigo-sefarosa (WGA) purificadas con extracto de
membrana de Her-2 en las semanas 9 y 13. A
continuación se aplicó una inyección i.v. de 0,1 ml de la
preparación de Her-2 y se fusionaron los
esplenocitos con línea de mieloma de ratón
X63-Ag8.653. Se rastrearon los sobrenadantes de
hibridoma en cuanto a la unión a Her-2 mediante
ELISA y radioinmunoprecipitación. Se usó MOPC-21
(IgG1) (Cappell, Durham. NC), como un control combinado con
isótopo.
El Acm
anti-Her-2 usado se denomina 7C2. El
Acm de control combinado con isótopo 1766 se dirige contra la
glicoproteína D del virus del herpes simple (VHS-1).
Experimentos de citometría de flujo para medir la inducción a la
apóptosis. Se sembraron células BT474 a una densidad de 10^{6} por
placa en placas de 60 x 15 mm y se permitió la unión durante
2-3 días. Se sembraron células SKBR3 a una densidad
de 5,0 x 10^{5} por placa en placas de 60 x 15 mm y se permitió
la unión durante 2-3 días. Luego se retiró el medio
y se reemplazó con medio recién preparado solo o medio que contenía
ligando Apo-2 y el Acm denominado 7C2. Para la
mayoría de los experimentos, se incubaron las células durante un
período de 3 días. Las concentraciones de Acm usadas en los
experimentos fueron de 0,25; 0,5, 1 y 10 \mug/ml. La concentración
de ligando Apo-2 usada en los experimentos fue de 1
\mug/ml. Tras cada tratamiento, se recogieron individualmente los
sobrenadantes y se mantuvieron en hielo, se separaron las monocapas
mediante tripsinización y se mezclaron con el correspondiente
sobrenadante. Entonces se centrifugaron las células a 1.200 rpm
durante 5 minutos a 4ºC, se volvió a suspender la pella en 1 ml de
tampón de unión a Ca^{2+} enfriado con hielo (Hepes 10 mM; pH 7,4;
NaCl 140 mM; CaCl_{2} 2,5 mM) y se extrajeron alícuotas en tubos
de 12 x 75 tapados con un filtro de 35 mm (1 ml por tubo) para la
eliminación de los agregados de células. Cada tubo recibió entonces
Anexina V-FITC (0,1 \mug/ml) o PI (10 \mug/ml)
o anexina V-FITC más PI o azul de tripano. Se
analizaron las muestras usando un citómetro de flujo de
FACSCAN^{TM} y el programa informático CellQuest de
FACSCONVERT^{TM} (Becton Dickinson).
Los resultados de los experimentos se muestran
en las figuras 1-3. Las combinaciones del ligando
Apo-2 y del Acm
anti-Her-2 7C2 indujeron
sinérgicamente la apóptosis en las líneas celulares que
sobre-expresan Her-2 tal y como se
demuestra mediante la unión a la anexina V, la reabsorción de PI o
la reabsorción de azul de tripano.
Los siguientes materiales han sido depositados
en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University
Boulevard, Manassas, Virginia, EE.UU. (ATCC):
La realización de estos depósitos fue en virtud
de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los
fines del Procedimiento en materia de Patentes y de las
Regulaciones en virtud del mismo (Tratado de Budapest). Esto
garantiza el mantenimiento de cultivos viables durante 30 años
desde la fecha del depósito. Los depósitos serán puestos a
disposición del público por parte de la ATCC en virtud de los
términos y las condiciones del Tratado de Budapest, estando
sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc. Y la ATCG que garantiza
(a) que el acceso a los cultivos será posible mientras dure el
proceso de solicitud de la patente para la persona determinada por
el Comisionado con derecho a ello en virtud de 37 CFR \NAK1.14 y
35 USC \NAK122, y (b) que todas las restricciones sobre la
disponibilidad al público de los cultivos así depositados serán
irrevocablemente retiradas tras la concesión de la patente.
El cesionario de la presente solicitud ha
acordado que en caso de que los cultivos en depósito murieran o se
perdieran o se destruyeran al ser cultivados bajo condiciones
adecuadas, serán reemplazados de inmediato bajo notificación por
una muestra viable del mismo cultivo. La disponibilidad de los
depósitos no será interpretada como una licencia de práctica de la
invención en contravención de los derechos concedidos en virtud de
la autoridad de cualquier gobierno según su legislación en materia
de patentes.
Se considera que la memoria escrita precedente
es suficiente para permitir que cualquier experto en la técnica
ponga en práctica la invención. La presente invención no pretende
ser limitada en cuanto al ámbito por los materiales depositados. El
depósito del material de la presente memoria no implica que la
descripción escrita contenida en la presente memoria sea inadecuada
para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención,
incluyendo el mejor modo de la misma, ni pretende restringir el
ámbito de las reivindicaciones a la ilustración específica que ésta
representa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se proporciona únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el
máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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Claims (17)
1. Uso del ligando Apo-2 y de un
anticuerpo anti-Her-2 para la
preparación de un medicamento para inducir la apóptosis en células
cancerosas de mamífero que sobre-expresan el
receptor Her-2, en el que el ligando
Apo-2 y el anticuerpo
anti-Her-2 inducen sinérgicamente
una apóptosis.
2. Uso de la reivindicación 1, en el que el
ligando Apo-2 está ligado a un polímero no
proteínico.
3. Uso de la reivindicación 2, en el que el
polímero es polietilenglicol.
4. Uso de la reivindicación 1, en el que el
anticuerpo anti-Her-2 se une al
dominio 1 de Her-2.
5. Uso de la reivindicación 1, en el que el
anticuerpo anti-Her-2 se une al
epítopo 7C2 sobre Her-2.
6. Uso de la reivindicación 1, en el que el
anticuerpo anti-Her-2 es un
anticuerpo monoclonal.
7. Uso de la reivindicación 1, en el que el
anticuerpo anti-Her-2 tiene residuos
de la región determinante de la complementariedad (CDR) no humanos
y residuos de la región marco (FR) humanos.
8. Uso de la reivindicación 1, en el que el
anticuerpo anti-Her-2 tiene regiones
determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo 7C2
depositado como N.º de ATCC: ATCC HB-12215.
9. Uso de la reivindicación 1, en el que el
medicamento comprende además uno o más agentes inhibidores del
crecimiento.
10. Uso de la reivindicación 1, en el que el
medicamento comprende además uno o más agentes
quimioterapéuticos.
11. Uso de la reivindicación 1, en el que el
medicamento es para la administración con radiación.
12. Uso de la reivindicación 1, en el que las
células cancerosas comprenden células de cáncer de mama, de cáncer
de ovario y de cáncer de pulmón.
13. Uso del ligando Apo-2 y de
un anticuerpo anti-Her-2 para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en
un mamífero, caracterizado por la
sobre-expresión del receptor Her-2,
en el que el ligando Apo-2 y el anticuerpo
anti-Her-2 inducen sinérgicamente la
apóptosis en células cancerosas.
14. Uso de la reivindicación 13, en el que el
cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovario o cáncer de pulmón.
15. Composición que comprende el ligando
Apo-2 y un anticuerpo
anti-Her-2 y un vehículo para
inducir sinérgicamente la apóptosis en células cancerosas de
mamífero que sobre-expresan el receptor
Her-2.
16. Composición de la reivindicación 15, en la
que el anticuerpo anti-Her-2 se une
al dominio 1 de Her-2.
17. Equipo que comprende el ligando
Apo-2 y un anticuerpo
anti-Her-2 para su uso en
combinación para inducir sinérgicamente la apóptosis en células
cancerosas de mamífero que sobre-expresan el
receptor Her-2.
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