CN1610696A - 免疫特异性结合trail受体的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫特异性结合TRAIL受体TR7的抗体和相关分子。这些抗体在例如预防和治疗癌症和其它增生性疾病中有用。本发明还涉及编码抗TR7抗体的核酸分子，含有这些核酸的载体和宿主细胞，以及产生这些材料的方法。本发明涉及用于预防、检测、诊断、治疗或改善疾病或紊乱、特别是癌症和其它过度增生性疾病的方法和组合物，包括为动物、优选人类施用有效量的一或多种免疫特异性结合TRAIL受体TR7的抗体或其片段或变体或者相关分子。
Description
发明领域
本发明涉及免疫特异性结合TRAIL受体，TR7的抗体及相关分子。这些抗体具有，例如预防和治疗癌症和其它增殖性紊乱的用途。本发明还涉及编码抗TR7抗体的核酸分子，含有这些核酸的载体和宿主细胞，及生产它们的方法。本发明涉及用于预防、检测、诊断、治疗或减轻疾病或紊乱，尤其癌症和其它过度增殖性紊乱的方法及组合物，包括给予动物，优选人有效量的免疫特异性结合TR7的一或多种抗体或其片段或变体，或者相关分子。
发明背景
许多生物学功能，例如对某些刺激的应答及天然生物学过程，是由一些因子如细胞因子控制的。许多细胞因子通过结合受体并产生细胞内应答而通过受体起作用。
例如，肿瘤坏死因子(TNF)α和β是通过TNF受体起作用的细胞因子，其调节许多生物学过程，包括防止感染及诱导休克和炎性疾病。TNF分子属于“TNF-配体”超家族，并与其受体或反配体即“TNF-受体”超家族一起发挥作用。迄今为止，已经鉴别了TNF-配体超家族的至少18个成员，并且定性了TNF-受体超家族的至少19个成员(见例如Locksley等，Cell(2001)104：487-501)。
在这些配体中，包括TNF-α，淋巴毒素-α(LT-α，也已知为TNF-β)，LT-β(在复合异源三聚体LT-α2-β中发现)，FasL，CD40L，CD27L，CD30L，4-1BBL，OX40L和神经生长因子(NGF)。TNF受体的超家族包括p55TNF受体，p75TNF受体，TNF受体相关蛋白，FAS抗原或APO-1，CD40，CD27，CD30，4-1BB，OX40，低亲和性p75和NGF-受体(Meager，A.，Biologicals 22：291-295(1994))。
TNF配体超家族的许多成员由激活的T细胞表达，提示它们是T细胞与构成细胞个体发生和功能基础的其它类型细胞的相互作用所必需的(Meager，A.，如前)。
从废除这些蛋白质表达的突变体的鉴别和产生中获得了对TNF受体家族一些成员基本功能的相当多的认识。例如，在FAS抗原及其配体中天然存在的突变导致淋巴增殖性疾病(Watanabe-Fukunaga，R.等，Nature 356：314(1992))，这也许反映了编程性细胞死亡的失败。CD40配体的突变导致X连锁的免疫缺陷状态，其特征在于血浆中高水平的免疫球蛋白M和低水平的免疫球蛋白G，表明错误的(faulty)T细胞依赖性B细胞激活(Allen，R.C.等，Science 259：990(1993))。低亲和性神经生长因子受体的定向突变导致特征在于错误感觉周围结构更新的病变(Lee，K.F.等，Cell 69：737(1992))。
TNF和LT-α能结合两种TNF受体(55-kd和75-kd TNF受体)。由TNF和LT-α通过其受体作用而激发的大量生物学作用包括移植肿瘤的出血性坏死，胞毒性，在内毒性休克中的作用，炎症，免疫调节，增殖和抗病毒应答，以及抗致电离辐射的有害影响的保护作用。TNF和LT-α参与许多疾病的发病机制，包括内毒性休克，脑型疟，肿瘤，自身免疫疾病，AIDS和移植物—宿主排斥(Beutler，B.和Von Huffel，C.，Science 264：667-668(1994))。p55受体中的突变导致对微生物感染的易感性增加。
另外，TNFR1(p55)和Fas的C末端附近的一个大约80个氨基酸的结构域被报道为“死亡结构域”，其负责转导编程性细胞死亡的信号(Tartaglia等，Cell 74：845(1993))。
凋亡，或编程性细胞死亡是多细胞生物体正常发育和稳态所必需的一种生理学过程(H.Steller，Science 267，1445-1449(1995))。编程性细胞死亡的紊乱是一些人体疾病的发病机制，所述疾病包括癌症，神经退行性紊乱及获得性免疫缺陷综合征(C.B.Thompson，Science 267，1456-1462(1995))。最近，两种细胞表面死亡受体Fas/APO-1和TNFR-1的信号转导和生物学功能受到许多关注(J.L.Cleveland等，Cell 81，479-482(1995)；A.Fraser等，Cell 85，781-784(1996)；S.Nagata等，Science 267，1449-56(1995))。这两者均是TNF受体家族成员，该家族还包括TNFR-2，低亲和性NGFR，CD40和CD30等(C.A.Smith等，Science 248，1019-23(1990)；M.Tewari等，in Modular Texts in Molecular and Cell Biology M.Purton，Heldin，Carl编辑(Chapman和Hall，伦敦，1995)。虽然家族成员通过在胞外结构域中存在富半胱氨酸重复而鉴定，但Fas/APO-1和TNFR-1还共有一个胞内同源区域，其合适地被称为“死亡结构域”，其与果蝇自杀基因reaper远缘相关(P.Golstein等，Cell81，185-6(1995)；K.White等，Science 264，677-83(1994))。这个共有的死亡结构域提示这两种受体均与直至最近仍未鉴别的一相关系列的信号转导分子相互作用。Fas/APO-1的激活募集含有死亡结构域的衔接(adapter)分子FADD/MORT1(A.M.Chinnaiyan等，Cell 81，505-12(1995)；M.P.Boldin等，J.Biol Chem 270，7795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO 14，5579-5588(1995))，其继而结合并可能激活FLICE/MACH1，FLICE/MACH1是促凋亡蛋白酶ICE/CED-3家族的成员(M.Muzio等，Cell 85，817-827(1996)；M.P.Boldin等，Cell 85，803-815(1996))。尽管Fas/APO-1的中心作用是触发细胞死亡，但TNFR-1还可以引发一系列不同生物活性，其中许多活性是基于其激活NF-κB的能力(L.A.Tartaglia等，ImmunolToday 13，151-3(1992))。因此，TNFR-1募集多价衔接分子TRADD，其类似于FADD，也含有一个死亡结构域(H.Hsu等，Cell 81，495-504(1995)；H.Hsu等，Cell 84，299-308(1996))。通过其与许多信号分子包括FADD，TRAF2和RIP的缔合，TRADD可以引发编程性细胞死亡和NF-κB激活(H.Hsu等，Cell 84，299-308(1996)；H.Hsu等，Immunity 4，387-396(1996))。
一种TNF相关的编程性细胞死亡诱导配体已经由一些研究小组报道，并已经命名为凋亡诱导分子I(AIM-I)(国际申请No.WO97/33899)及TNF相关凋亡诱导配体或(TRAIL)(Wiley，S.R.等，Immunity 3：673-682(1995))。Pitti，R.M.等将这种新分子称为Apo-2配体或(Apo-2L)。为方便起见，本文中称为TRAIL。TRAIL的氨基酸序列示于SEQ ID NO：72。
与转录物似乎大部分限制于激活的T细胞中的FAS配体不同，在许多组织中均可见高水平的TRAIL，并且其由一些细胞系组成型转录。已经示出TRAIL不依赖于FAS配体而起作用(Wiley，S.R.等(1995)，如前)。Marsters，S.A.等的研究已经表明TRAIL迅速激活凋亡，其时间框架与FAS/Apo-1L发出的死亡信号相似，但比TNF诱导的凋亡快得多(Current Biology 6：750-752(1996))。
已经鉴别了5种TRAIL受体，包括TR7(也称为TRAIL受体1(TRAIL-R1)和死亡受体4(DR4)，Pan等，Science 276：111-3(1997)，国际专利申请No.WO98/32856，WO00/67793，WO99/37684，WO2000/34355；WO99/02653，SEQ ID NO：1)；TR7(也称为TRAIL受体2(TRAIL-R2)，DR5和KILLER，Pan等，Science 277：815-8(1997)，Sheridan等，Science 277：818-21(1997)，Chaudhury等，Immunity 7：821-30(1997)，国际专利申请No.WO98/46643，WO99/09165，WO99/11791，WO98/41629，WO00/66156和WO98/35986，SEQ ID NO：3)；TR1(也称为蚀骨抑制蛋白(Osteoprotegrin)(OPG)破骨细胞发生抑制因子(OCIF)，TNFRSF11B和FTHMA-090(国际专利申请No.WO98/12344，WO2000/54651，WO2001/04137，WO66/26217，WO98/07840，WO2000/21554，WO99/53942和WO2001/03719，SEQ ID NO：5)；TR5(也称为TRAIL受体3(TRAIL-R3)，decoy受体1(DcR1)和TRID)(Degli-Esposti等，J.Exp.Med.186：1165-70(1997)，国际专利申请No.WO98/30693，WO00/71150，WO99/00423，EP867509，WO98/58062，SEQ ID NO：2)；和TR10(也称为TRAIL受体4(TRAIL-R4)，DcR2和TRUNDD，Pan等，FEBS Lett.424：41-5(1998)，Degli-Eposti等，Immunity 7：813-20(1997)，国际专利申请No.WO98/54202，WO00/73321，WO2000/08155，WO99/03992，WO2000/34355和WO9910484，SEQ ID NO：4)。TR7和TR7在其胞质尾区中含有死亡结构域，这些受体的触发引起凋亡。另一方面，TR1，TR5和TR10可以分别抑制由胞毒性配体TRAIL诱导的编程性细胞死亡，部分是由于其不存在胞质死亡结构域或胞质死亡结构域截短所致。上述引用的所有出版物和专利在此均以其全文并入参考，特别是这些文献中所揭示的TRAIL受体的核苷酸和氨基酸序列。
在哺乳动物的生物学过程中，TNF家族配体和TNF家族受体的作用多种多样，并影响许多正常及异常功能。因此明显需要对在正常和病理状态下影响TNF受体生物学活性的组合物如抗体进行鉴别和定性。特别是需要分离和定性调节TRAIL受体生物学活性的抗体。
发明概述
本发明涵盖了免疫特异性结合TR7多肽或TR7多肽片段或TR7变体的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。本发明特别涵盖了免疫特异性结合人TR7多肽如SEQ ID NO：3所示的人TR7多肽或多肽片段或变体的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。在一些实施方案中，本发明的免疫特异性结合TR7多肽的抗体也结合TR7(例如SEQ ID NO：3)，但不结合其它蛋白质，包括TR1，TR5和TR10(SEQ ID NO：5，2和4)。
本发明涉及预防，治疗或减轻疾病或紊乱的方法和组合物，包括给予动物、优选人以有效量的免疫特异性结合TR7或其片段或变体的一或多种抗体或其片段或变体，或者相关分子。在特异性实施方案中，本发明涉及预防，治疗或减轻与TR7功能或TR7配体功能或者异常TR7或TR7配体表达相关的疾病或紊乱的方法和组合物，包括给予动物、优选人以有效量的免疫特异性结合TR7或其片段或变体的一或多种抗体或其片段或变体或者相关分子。在特别优选的实施方案中，本发明涉及基于抗体的预防，治疗或减轻癌症及其它过度增殖性紊乱(例如白血病，癌和淋巴瘤)的方法和组合物。可以用本发明抗体治疗，预防或减轻的其它疾病和紊乱包括但不限于神经退行性紊乱(例如帕金森病，阿耳茨海默氏病和亨廷顿舞蹈病(Huntington’sdisease))，免疫紊乱(例如狼疮，类风湿性关节炎，多发性硬化，重症肌无力，桥本病(Hashimoto’s disease)和免疫缺陷综合征)，炎性紊乱(例如哮喘，过敏性紊乱和类风湿性关节炎)，传染病(例如AIDS，疱疹病毒感染及其它病毒感染)及增殖性紊乱。
本发明还涵盖了检测，诊断或预后疾病或紊乱的方法或组合物，包括给予动物、优选人以有效量的免疫特异性结合TR7或其片段或变体的一或多种抗体或其片段或变体或者相关分子。在特异性实施方案中，本发明还涵盖了检测，诊断或预后与TR7功能或TR7配体功能或者异常TR7或TR7配体表达相关的疾病或紊乱的方法和组合物，包括给予动物、优选人以有效量的免疫特异性结合TR7或其片段或变体的一或多种抗体或其片段或变体或者相关分子。在特别优选的实施方案中，本发明涉及基于抗体的方法和组合物，以检测，诊断或预后癌症及其它过度增殖性紊乱(例如白血病，癌和淋巴瘤)。可以用本发明抗体检测，诊断或预后的其它疾病和紊乱包括但非限于神经退行性紊乱(例如帕金森病，阿耳茨海默氏病和亨廷顿舞蹈病)，免疫紊乱(例如狼疮，类风湿性关节炎，多发性硬化，重症肌无力，桥本病和免疫缺陷综合征)，炎性紊乱(例如哮喘，过敏性紊乱和类风湿性关节炎)，传染病(例如AIDS，疱疹病毒感染及其它病毒感染)及增殖性紊乱。
在特别优选的实施方案中，本发明的抗体用于预防，诊断，预后，治疗或减轻以下类型癌症的方法和组合物中：乳腺癌，肺癌(包括非小细胞肺癌)，结肠癌，尿道癌，膀胱癌，肾癌，胰腺癌，肝癌，胃癌，前列腺癌，白血病，非霍奇金淋巴瘤，食管癌，脑癌，白血病，卵巢癌，睾丸癌，黑素瘤，子宫癌，宫颈癌，喉癌，直肠癌，及口腔癌。在特异的实施方案中，本发明的抗体与化疗剂如紫杉醇(Taxol)，依立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)，依立替康类似物及吉西他滨(gemcitabine)(GEMZARTM)组合施用。
本发明的另一实施方案包括本发明抗体作为监测TR7在细胞上表达的诊断工具的应用。
本发明人产生了免疫特异性结合TR7多肽(例如SEQ ID NO：3)的单链Fv(scFv)。因此，本发明涵盖了表1中列举的这些scFv。另外，本发明还涵盖了工程化表达相应于这些scFv的抗体的细胞系，这些细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日如表1所示，ATCC保藏号也示于表1。ATCC位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801号，邮编20110-2209。ATCC保藏物是根据国际认可的微生物保藏专利程序的布达佩斯条约进行保藏。
另外，本发明涵盖了编码scFv的多核苷酸以及scFv的氨基酸序列。本发明还涵盖了免疫特异性结合TR7或其片段或变体的包含或者由这些scFv的片段或变体(例如具有表1所示任一scFv的氨基酸序列的VH结构域，VH CDR，VL结构域或VL CDR)组成的分子，及编码这些抗体和/或分子的核酸分子。在特别优选的实施方案中，本发明涵盖了结合TR7或其片段或变体的胞外区域/结构域的抗体或其片段或变体。
本发明还提供了结合TR7多肽的抗体，该TR7多肽偶联于一个可检测标记如酶，荧光标记，发光标记或生物发光标记。本发明还提供了结合TR7多肽的抗体，该TR7多肽偶联于一治疗性或胞毒性制剂。本发明还提供了结合TR7多肽的抗体，该TR7多肽偶联于一种放射性物质。
本发明还提供了结合TR7多肽的抗体，其作为TR7兴奋剂或TR7拮抗剂起作用。在特异性实施方案中，本发明的抗体刺激TR7表达细胞的编程性细胞死亡。在其它特异性实施方案中，本发明的抗体抑制TRAIL结合TR7。在另外的特异性实施方案中，本发明的抗体上调TR7表达。
本发明还提供了抑制TR7表达细胞的编程性细胞死亡的抗体。在其它特异性实施方案中，本发明的抗体下调TR7表达。
在另外的实施方案中，本发明的抗体的解离常数(KD)为10-7M或更低。在优选的实施方案中，本发明的抗体的解离常数(KD)为10-9M或更低。
本发明还提供了在相同浓度下比TRAIL多肽刺激TR7表达细胞编程性细胞死亡更好的刺激TR7表达细胞凋亡的抗体。
本发明还提供了在有或无抗体交联剂的情况下同样地刺激TR7表达细胞编程性细胞死亡的抗体；和/或在没有交联抗体或其它交联剂的情况下与相同浓度TRAIL相比以同样或更好的强度刺激编程性细胞死亡的抗体。
在另外的实施方案中，本发明的抗体的解离速率(off rate，Koff)为10-3/秒或更低。在优选的实施方案中，本发明的抗体的解离速率(Koff)为10-4/秒或更低。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体的解离速率(Koff)为10-5/秒或更低。
本发明还提供了相对于它们结合其它蛋白质(包括TR1，TR5和TR10)的能力优先结合TR7和/或TR7的抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体的性质，如以下实施例中所述，使它们成为比先前揭示的TR7结合抗体更好的治疗剂。
本发明还提供了抗体组(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，其中组中成员相应于本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多个不同的抗体(例如完整抗体，Fabs，F(ab’)2片段，Fd片段，二硫键连接的Fvs(sdFvs)，抗独特型(抗Id)抗体和scFvs)。本发明还提供了抗体的混合物，其中该混合物相应于本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多个不同的抗体(例如完整抗体，Fabs，F(ab’)2片段，Fd片段，二硫键连接的Fv(sdFv)，抗独特型(抗Id)抗体和scFv))。本发明还提供了包含或由本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多个抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)组成的组合物。本发明的组合物可包含或由一或多个抗体或其片段或变体的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多个氨基酸序列组成。或者，本发明的组合物可包含或由编码本发明的一或多个抗体的核酸分子组成。
本发明还提供了融合蛋白，其包含一种本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)和一种异源多肽(即与抗体或抗体结构域不相关的一种多肽)。本发明也涵盖了编码这些融合蛋白的核酸分子。本发明的组合物可包含或由本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多种融合蛋白组成。或者，本发明的组合物可包含或由编码本发明的一，二，三，四，五，十，十五，二十或更多种融合蛋白的核酸分子组成。
本发明还提供了编码本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子如scFv，VH结构域或VL结构域)的核酸分子，其通常是分离的。本发明还提供了用本发明的核酸分子转化的一种宿主细胞及其子代。本发明还提供了生产本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)的方法。本发明进一步提供了从核酸分子中表达本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)的一种方法。本发明的这些及其它方面在下文进一步详细描述。
附图说明
图1A-C：示出在体外在存在或不存在环己酰亚胺的情况下，抗TR7抗体诱导MD-MBA-231和SW480细胞凋亡的能力。
图2：示出在Swiss nu/nu小鼠中抗TRAIL受体抗体处理对SW480肿瘤形成的作用。
发明详述
定义
本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。由此，术语抗体不仅涵盖了完整抗体分子，还涵盖了抗体多聚体和抗体片段以及抗体、抗体多聚体及抗体片段的变体(包括衍生物)。在此术语“抗体”描述的分子例如包括但非限于单链Fv(scFv)，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2，二硫键连接的Fv(sdFv)，Fv，及包含或由VL或VH结构域组成的片段。术语“单链Fv”或“scFv”是指一种多肽，其包含与抗体VH结构域连接的抗体VL结构域。免疫特异性结合TR7的抗体与其它抗原可有交叉反应性，例如另一种TRAIL受体。优选地，免疫特异性结合TR7的抗体与其它抗原(例如其它TRAIL受体或肿瘤坏死因子受体超家族的其它成员)不交叉反应。免疫特异性结合TR7的抗体可以例如通过免疫分析或其它本领域已知技术鉴别，例如以下实施例中描述的免疫分析。
本发明的抗体包括但非限于单克隆抗体，多特异性抗体，人抗体或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab’)片段，抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本发明抗体的抗Id抗体)，胞内产生的抗体(即内抗体)，及上述任一种抗体的表位结合片段。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA，和IgY)，类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。优选地，本发明的抗体包含或由具有表1所示任一氨基酸序列的VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR、或其片段或变体组成。在一个优选的实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG1同种型。在另一个优选的实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG4同种型。免疫球蛋白可以既具有重链又具有轻链。IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY一系列重链可以与κ或λ形式的轻链成对。
本发明的抗体还可以包括抗体的多聚体形式。例如，本发明的抗体可采取单体免疫球蛋白分子的二聚体、三聚体或更高等级多聚体抗体形式。完整免疫球蛋白分子或F(ab’)2片段的二聚体是四价的，而Fab片段或scFV分子的二聚体是二价的。抗体多聚体内的各个单体可以相同或不同，即它们可以是异源或同源抗体多聚体。例如，多聚体内的各个抗体可以具有相同或不同结合特异性。抗体的多聚体化可以通过抗体的自然聚合或者通过本领域已知的化学或重组连接技术实现。例如，一些纯化的抗体制品(例如纯化的IgG1分子)自然形成含有抗体同源二聚体及其它较高等级抗体多聚体的蛋白质集合体。或者，抗体同源二聚体可以通过本领域已知的化学连接方法形成。例如，可以使用异源双重功能交联剂包括但非限于SMCC(琥珀酰亚氨基-4-(马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧基酯(succinimidyl-4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)和SATA(N-琥珀酰亚氨基S-乙酰硫代乙酸酯(N-succinimidylS-acetylthio-acetate))(可例如得自Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL))以形成抗体多聚体。形成抗体同源二聚体的一个方案例如由Ghetie等，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA(1997)94：7509-7514所提供，在此以其全文并入参考。抗体同源二聚体可通过用胃蛋白酶消化而转变为Fab’2同源二聚体。形成抗体同源二聚体的另一种方式是通过使用Zhao和Kohler，The Journalof Immunology(2002)25：396-404所述autophilic T15肽形成抗体同源二聚体，在此以其全文并入参考。
或者，抗体可以通过重组DNA技术而产生多聚体。IgM和IgA通过与J链多肽相互作用而天然形成抗体多聚体。非IgA或非IgM分子，如IgG分子可以工程化为含有IgA或IgM的J链相互作用结构域，从而赋予在非IgA或非IgM分子上形成较高等级多聚体的能力(见例如Chintalacharuvu等(2001)Clinical Immunology 101：21-31，及Frigerio等(2000)Plant Physiology 1483-94，这两个文献在此全文并入参考)。ScFv二聚体也可通过本领域已知重组技术形成，构建scFV二聚体的一个实施例由Goel等(2000)Cancer Research 60：6964-6971提供，在此全文并入参考。抗体多聚体可以使用本领域已知的任何合适的方法纯化，包括但非限于大小排阻层析。
除非在该说明书特别限定，抗TR7抗体的特异性结合或免疫特异性结合是指抗TR7抗体结合TR7但不明显结合(即交叉反应)除了TR7之外的蛋白质，如相同蛋白质家族的其它蛋白质。结合TR7蛋白质及与其它蛋白质不交叉反应的抗体非必需是在所有条件均不结合所述其它蛋白质的抗体，而是本发明的TR7特异性抗体与其结合所述其它蛋白质的能力相比优先结合TR7，因此适用于至少一种类型的分析或治疗中，即在治疗中给出低背景水平或者不产生不适当的不利作用。本领域熟知蛋白质由抗体结合的部分称为表位。表位可以是线性(即包含蛋白质序列中的连续氨基酸残基)或构象的(即包含在蛋白质原始结构中不连续的一或多个氨基酸残基，但在蛋白质的二级，三级或四级结构中相连续)。已知TR7特异性抗体结合TR7的表位，因此根据TR7片段或变体中已知TR7特异性抗体结合的表位的存在与否，特异性结合TR7的抗体可以或不可以结合TR7和/或TR7变体(例如与TR7至少90％相同的蛋白质)的片段。另外，根据同源物中所述抗体识别的表位的存在与否，本发明的TR7特异性抗体可以结合TR7的同源物种(包括其片段)。另外，本发明的TR7特异性抗体可以结合修饰形式的TR7，例如TR7融合蛋白。在这种情况中，当本发明的抗体结合TR7融合蛋白时，所述抗体必须与融合蛋白的TR7部分接触以特异性结合。特异性结合TR7的抗体可例如通过免疫分析或本领域技术人员已知的其它方法鉴别，例如以下实施例中所述免疫分析。
在一些实施方案中，本发明涵盖了免疫特异性或特异性结合TR7和TR4的抗体。免疫特异性结合TR7和TR4的抗体特异性结合或免疫特异性结合是指所述抗体结合TR7和TR4，但不明显结合(即交叉反应)除了TR7或TR4之外的蛋白质，如相同蛋白质家族中的其它蛋白质。结合TR7和TR4蛋白质及与其它蛋白质不交叉反应的抗体非必需是在所有条件均不结合所述其它蛋白质的抗体，而是免疫特异性或特异性结合TR7和TR4的抗体与其结合所述其它蛋白质的能力相比优先结合TR7和TR4，因此适用于至少一种类型的分析或治疗中，即在治疗中给出低背景水平或者不产生不适当的不利作用。本领域熟知蛋白质由抗体结合的部分称为表位。表位可以是线性(即包含蛋白质序列中的连续氨基酸残基)或构象的(即包含在蛋白质原始结构中不连续的一或多个氨基酸残基，但在蛋白质的二级，三级或四级结构中相连续)。已知结合TR7和TR4的抗体结合TR7和TR4的共同表位，因此根据TR7或TR4片段或变体中已知抗体结合的表位的存在与否，特异性结合TR7和TR4的抗体可以或不可以结合TR7，TR4和/或TR7或TR4的变体(例如分别与TR7或TR4至少90％相同的蛋白质)的片段。另外，根据同源物中所述抗体识别的表位的存在与否，免疫特异性结合TR7和TR4的本发明抗体可以结合TR7和/或TR4(包括其片段)的同源物种。另外，免疫特异性结合TR7或TR4的本发明抗体可以结合修饰形式的TR7或TR4，例如TR7或TR4融合蛋白。在这种情况中，当本发明的抗体结合融合蛋白时，所述抗体必须与融合蛋白的TR7或TR4部分接触以特异性结合。特异性结合TR7或TR4的抗体可例如通过免疫分析或本领域技术人员已知的其它方法鉴别，例如以下实施例中所述的免疫分析。
本文所用术语“变体”是指一种多肽，其与TR7多肽、TR7多肽片段、抗TR7抗体或其抗体片段具有相似或相同功能，但不必需包含与TR7多肽、TR7多肽片段、抗TR7抗体或其抗体片段相似或相同的氨基酸序列，或者不是必需具有分别与TR7多肽、TR7多肽片段、抗TR7抗体或其抗体片段相似或相同的结构。具有相似氨基酸序列的变体是指满足以下至少一项条件的多肽：(a)包含或由一种氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与本文所述的TR7多肽(SEQID NO：3)或其片段、抗TR7抗体或其抗体片段(包括具有表1所示任一或多个scFv的氨基酸序列的VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)的氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的相同性；(b)由一种核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列的互补序列在严格条件下与编码本文所述TR7(SEQ ID NO：3)、TR7多肽片段、抗TR7抗体或其抗体片段(包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)的核苷酸序列杂交，所述多肽具有至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少125个、或至少150个氨基酸残基；及(c)由一种核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列与编码本文所述TR7多肽、TR7多肽片段、抗TR7抗体或其抗体片段(包括具有表1所示任一或多个scFv的氨基酸序列的VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR)的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同。与本文所述TR7多肽、TR7多肽的片段、抗TR7抗体或其抗体片段具有相似结构的多肽是指一种多肽，其具有与本文所述TR7多肽、TR7多肽的片段、抗TR7抗体或其抗体片段相似的二级、三级或四级结构。多肽的结构可以通过本领域已知方法确定，包括但非限于X射线结晶学，核磁共振，及晶体学电子显微术。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分率，将序列为进行最佳对比目的而排列(例如可以在第一个氨基酸序列或核酸序列中引入一个缺口，以便与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳对比)，随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的一个位置在第二个序列中的相应位置由相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在这个位置是相同的。两个序列之间的相同性百分率是两个序列共享的相同位置数的函数(即％相同性＝相同的重叠位置数/总位置数×100％)。在一个实施方案中，两个序列等长。
确定两个序列之间的相同性百分率可以使用本领域已知的一种数学算法进行。用于对比两个序列的数学算法的一个实施例是Karlin和Altschul的算法，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 87：2264-2268(1990)，Karlin和Altschul，Proceedings of theNational Academy ofSciences USA 90：5873-5877(1993)中加以修改。Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)的BLASTn和BLASTx程序中已经加入了这个算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTn程序(score＝100，wordlength＝12)进行以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTx程序(score＝50，wordlength＝3)进行以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得进行对比的缺口排列，可以利用Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3589-3402(1997)所述的Gapped BLAST程序。或者，可以使用PSI-BLAST以进行反复搜索，其检测分子之间的远缘关系(文献同上)。当利用BLAST，Gapped BLAST和PSI-BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTx和BLASTn)的默认参数(见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
用于序列对比的另一个数学算法实施例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。ALIGN程序(版本2.0)其是GCG序列对比软件包的一部分，其中已经加入了这个算法。本领域已知的其它序列分析算法包括如Torellis和Robotti，Comput.Appl.Biosci.，10：3-5(1994)所述的ADVANCE和ADAM；及Pearson和Lipman，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85：2444-8(1988)所述的FASTA。在FASTA中，ktup是设定搜索的灵敏性和速度的一个控制选项。
本文所用术语“衍生物”是指本发明的一种变体多肽，其包含或由TR7多肽、TR7多肽片段或免疫特异性结合TR7多肽的本发明抗体的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列已经通过导入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变。本文中术语“衍生物”还指已经例如通过将任何类型分子共价附着于所述多肽而修饰的TR7多肽、TR7多肽片段或免疫特异性结合TR7多肽的抗体。例如，但非限制性地，TR7多肽，TR7多肽片段，或抗TR7抗体可以通过例如以下方式修饰：糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/阻断基团衍生化，蛋白酶解，与细胞配体或其它蛋白质连接等。TR7多肽、TR7多肽的片段或抗TR7抗体的衍生物可以使用本领域已知技术通过化学修饰加以修饰，包括但非限于，特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素代谢合成等。另外，TR7多肽、TR7多肽的片段或抗TR7抗体的衍生物可以含有一或多个非典型氨基酸。多肽衍生物具有与本文所述TR7多肽、TR7多肽片段或抗TR7抗体相似或相同的功能。
本文术语“表位”是指在动物、优选哺乳动物中具有抗原性或免疫原性活性的TR7的部分。具有免疫原性活性的表位是激发动物体内的抗体应答的TR7的一部分。具有抗原性活性的表位是通过本领域已知的任何方法，例如通过本文所述免疫分析确定的与抗体免疫特异性结合的TR7的一部分。抗原性表位非必需是免疫原性的。
本文所用术语“片段”是指一种多肽，其包含免疫特异性结合TRAIL受体的TR7或抗TR7抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子如scFv)的氨基酸序列的至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个或至少250个氨基酸残基。
本文所用术语“融合蛋白”是指一种多肽，其包含或由本发明的抗TR7抗体的氨基酸序列和一种异源多肽(即与抗体或抗体结构域不相关的多肽)的氨基酸序列组成。
本文所用术语“宿主细胞”是指用一种核酸分子转染的特定细胞及这种细胞的子代或潜在子代。子代与用核酸分子转染的亲代细胞可以不同，因为在随后的传代或者核酸分子整合入宿主细胞基因组中时可能发生突变或环境影响。
本发明的抗体优选以分离形式提供，并优选是基本纯化的。“分离的”是指从其天然环境中分离的一种抗体。因此，例如在重组宿主细胞内产生和/或包含于重组细胞中的多肽被认为是适合本发明目的而分离的。
“分离的抗体”是指从其天然环境中分离的抗体。因此，在重组宿主细胞内产生的和/或包含的抗体被认为是适合本发明目的而分离的。
抗体结构
已知基本抗体结构单位包含一种四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻链”(大约25kDa)和一个“重链”(大约50-70kDa)。每个链的氨基末端部分包括一个主要负责抗原识别的大约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每个链的羧基末端部分是一个主要负责效应器功能的恒定区。人轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ，δ，γ，α，或ε重链，并由此限定抗体同种型分别为IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。见Fundamental Immunology第7章(Paul，W.编辑，第二版，Raven出版社，N.Y.(1989))(以其全文并入参考)。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。
因此，一个完整的IgG抗体有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体之外，这两个结合位点是相同的。
所述链均呈现相同的一般结构，即通过三个高变区结合起来的相对保守的构架区(FR)，也称为互补决定区或CDR。来自每对重链和轻链的CDR通过构架区排列，使其能结合特异性表位。从N末端至C末端，轻链和重链均包含结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸排布符合Kabat，Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或者Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等，Nature 342：878-883(1989)的定义。
双特异性或双功能抗体是一种人工杂合抗体，其具有两个不同重链/轻链对和两个不同的结合位点。双特异性抗体可以通过许多方法产生，包括杂交瘤融合或Fab’片段的连接，见例如Songsivilai及Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)，Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。另外，双特异性抗体可以形成为“diabodies”(Holliger等，““diabodies”：small bivalent and bispecificantibody fragments”，PNAS USA 90：6444-6448(1993))或“Janusins”(Traunecker等，“Bispecific single chain molecules(Janusins)targetcytotoxic lymphocytes on HIV infected cells”，EMBO J.10：3655-3659(1991)及Traunecker等“Janusin：new molecular design for bispecificreagents”，Int J Cancer Suppl 7：51-52(1992))。
与生产常规抗体相比，生产双特异性抗体相对费力，而且产量和纯度通常较低。双特异性抗体不以具有单一结合位点的片段形式(例如Fab，Fab’和Fv)存在。
抗TR7抗体
使用噬菌体展示技术，本发明人鉴别了免疫特异性结合TR7(或其片段或变体)的单链抗体分子(scFv)。本发明还涵盖了包含或由这些scFv的片段或变体(例如包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH结构域，VH CDR，VL结构域或VL CDR)组成的分子，以及编码这些scFv和/或分子的核酸分子。
特别地，本发明涉及包含或由选自下表1所示SEQ ID NO：42-56、优选地SEQ ID NO：42，50和56的氨基酸序列组成的scFv。本发明还涵盖了免疫特异性结合TR7的包含或由这些scFv的片段或变体(例如包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH结构域，VH CDR，VL结构域或VL CDR)组成的分子，以及编码这些scFv和/或分子的核酸序列(例如SEQ ID NO57-71)。
相应于SEQ ID NO：42-56的scFv根据其结合TR7的能力而被选择。
本发明提供了免疫特异性结合TR7多肽或多肽片段的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。本发明特别提供了相应于表1所示scFv的抗体。这些scFv可以通过将例如编码scFv的VH和/或VL结构域的核苷酸序列插入一个含有恒定区序列的表达载体中而常规地“转变”为免疫球蛋白分子，并工程化而指导免疫球蛋白分子表达，如以下实施例4中详细描述。
表达包含本发明scFv的VH和VL结构域的IgG1抗体的NSO细胞系保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日期示于表1，ATCC保藏号也示于表1。ATCC位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，邮编20110-2209。ATCC保藏物是根据国际认可的微生物保藏专利程序的布达佩斯条约而保藏。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明scFv的VH和VL结构域的抗体。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是由细胞系NSO TR72521#140p：12表达的抗体，所述细胞系于2002年3月25日保藏在ATCC，保藏号PTA-4178(见表1)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体是由细胞系NSO TR72521(5G08)#176-41，p：10表达的抗体，所述细胞系于2002年7月10日保藏在ATCC，保藏号PTA-4539(见表1)。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是由细胞系NSO TR72654(84A02)#62 p：10表达的抗体，所述细胞系于2002年5月21日保藏在ATCC，保藏号PTA-4376(见表1)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体是由细胞系NSO TR7Ab 2834#10，p12表达的抗体，所述细胞系于2002年7月17日保藏在ATCC，保藏号PTA-4547(见表1)。
表1：免疫特异性结合TRAIL受体的scFvs
| ScFv | scFv蛋白质SEQ IDNO： | scFvDNASEQ IDNO： | AAs ofVH结构域 | AAs ofVHCDR1 | AAs ofVHCDR2 | AAs ofVHCDR3 | AAs ofVL结构域 | AAs ofVLCDR1 | AAs ofVLCDR2 | AAs ofVLCDR3 | 细胞系表达抗体 | ATCC保藏号 | ATCC保藏日期 |
| CM005G08 | 42 | 57 | 1-121 | 26-35 | 50-66 | 99-110 | 136-244 | 158-168 | 184-190 | 223-233 | NSOTR72521#140p：12NSOTR72521(5G08)#176-41p：10 | PTA-4178PTA-4539 | 2002年3月25日2002年7月10日 |
| CM005A08 | 43 | 58 | 1-122 | 26-35 | 50-66 | 99-111 | 137-245 | 159-169 | 185-191 | 224-234 | |||
| CM014C10 | 44 | 59 | 1-119 | 26-35 | 50-66 | 99-108 | 136-246 | 158-170 | 186-192 | 225-235 | |||
| CM029B01 | 45 | 60 | 1-121 | 26-35 | 50-66 | 99-110 | 136-244 | 158-168 | 184-190 | 223-233 | |||
| CM033D06 | 46 | 61 | 1-114 | 26-35 | 50-66 | 99-103 | 129-235 | 151-161 | 177-183 | 216-224 | |||
| CM013A11 | 47 | 62 | 1-121 | 26-35 | 50-66 | 99-110 | 139-245 | 161-171 | 187-193 | 226-234 | |||
| CM013F04 | 48 | 63 | 1-120 | 26-35 | 50-66 | 99-109 | 137-247 | 159-172 | 188-194 | 227-236 | |||
| CM088F10 | 49 | 64 | 1-128 | 26-35 | 50-63 | 99-117 | 145-255 | 167-180 | 196-202 | 235-244 | |||
| CM084A02 | 50 | 65 | 1-120 | 26-35 | 50-66 | 99-109 | 137-248 | 159-171 | 187-193 | 226-237 | NSOTR72654(84A02)#62p：10 | PTA-4376 | 2002年5月21日 |
| CM087C06 | 51 | 66 | 1-116 | 26-35 | 50-66 | 99-105 | 133-243 | 155-167 | 183-189 | 222-232 | |||
| CM055A01 | 52 | 67 | 1-117 | 26-35 | 50-66 | 99-106 | 133-240 | 154-164 | 180-186 | 219-229 | |||
| CM085C11 | 53 | 68 | 1-116 | 26-35 | 50-66 | 99-105 | 133-243 | 155-167 | 183-189 | 222-232 | |||
| CM089A03 | 54 | 69 | 1-126 | 26-35 | 50-66 | 99-115 | 143-253 | 165-178 | 194-200 | 233-242 | |||
| CM075A01 | 55 | 70 | 1-115 | 26-35 | 50-66 | 99-104 | 133-243 | 155-167 | 183-189 | 224-231 |
| CM059H03 | 56 | 71 | 1-121 | 26-35 | 50-66 | 99-110 | 139-247 | 162-173 | 189-195 | 228-236 | NSOTR7Ab2834#10p12 | PTA-4547 | 2002年7月17日 |
本发明涵盖了免疫特异性结合TR7多肽或其片段、变体或融合蛋白的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。TR7多肽包括但非限于TR7(SEQ ID NO：3)，或者由保藏日为1997年3月7日的ATCC保藏物97920中所含的克隆HLYBX88中的cDNA编码的多肽。在一些实施方案中，本发明的抗体可以免疫特异性结合上述TR7及TR4(SEQ ID NO：1)或由保藏日为1997年1月21日的ATCC保藏物97853中所含的克隆HCUDS60中的cDNA编码的多肽。TRAIL受体可以通过重组表达编码SEQ ID NO：1-5的多肽(分别为TR4，TR5，TR7，TR10和TR1)的核酸，例如ATCC保藏号97853(TR4)，97798(TR5，于1996年11月20日保藏)，97920(TR7)或209040(TR10，于1997年5月15日保藏)中的cDNA而产生。
在一个实施方案中，相对于结合其它蛋白质包括TR1，TR4，TR5或TR10(SEQ ID NO：5，1，2和4)或其片段、变体或融合蛋白的能力，本发明的抗体优先结合TR7(SEQ ID NO：3)或其片段、变体或融合蛋白(例如融合于Fc结构域的TR7胞外区)。在其它优选的实施方案中，相对于结合其它蛋白质包括TR1，TR5或TR10(SEQ IDNO：5，2和4)或其片段、变体或融合蛋白的能力，本发明的抗体优先结合TR7和TR4(SEQ ID NO：3和1)或其片段、变体。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合TR1，TR4，TR5，TR7和TR10(SEQ ID NO：5，1，2，3和4)。与结合另一个抗原相比，抗体优先结合一个抗原的能力可使用本领域已知的任何方法确定。
TR7多肽
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗体结合TR7多肽，或其片段或变体。以下部分更详细描述了可以由本发明抗体结合的TR7多肽，片段和变体。可以由本发明抗体结合的TR7多肽，片段和变体也见于例如国际公开号WO98/41629，WO00/66156和WO98/35986所述，在此以其全文并入参考。
在一些实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合TR7多肽。在一些实施方案中，免疫特异性结合TR7多肽的抗体可以结合TR7的片段，变体(包括TR7的同源物种)，多聚体或修饰形式。例如，对TR7有免疫特异性的抗体可以结合包含全部或部分TR7的融合蛋白中的TR7部分。
TR7蛋白可见作为单体或多聚体(即二聚体，三聚体，四聚体和更高的多聚体)形式。因此，本发明涉及结合呈单体或多聚体的一部分的TR7蛋白的抗体。在特异的实施方案中，所述TR7多肽是单体，二聚体，三聚体或四聚体。在另外的实施方案中，本发明的多聚体是至少二聚体，至少三聚体或至少四聚体。
本发明的抗体可以结合TR7同聚体(homomer)或异聚体(heteromer)。本文所用术语同聚体是指只含有本发明TR7蛋白(包括本文所述TR7片段，变体和融合蛋白)的多聚体。这些同聚体可含有具有相同或不同多肽序列的TR7蛋白质。在一个特异的实施方案中，本发明的同聚体是只含有具有相同多肽序列的TR7蛋白的多聚体。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合含有具有不同多肽序列的TR7蛋白的TR7同聚体。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合一种TR7同源二聚体(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR7蛋白)。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合TR7的至少一个同源二聚体，至少一个同源三聚体或至少一个同源四聚体。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7同源三聚体(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR7蛋白)。
本文所用术语异聚体是指这样的多聚体，其除了含有本发明TR7蛋白之外，还含有异源蛋白(即含有与TR7多肽序列不相应的多肽序列的蛋白质)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合一种异源二聚体，异源三聚体或异源四聚体。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合含有一或多个TR7多肽的至少一个同源二聚体，至少一个同源三聚体或至少一个同源四聚体。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合一种TR7异源三聚体(例如分别含有1或2个TR7蛋白及2或1个TR4蛋白)。
由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以是疏水性、亲水性、离子性和/或共价结合的，和/或可以间接通过例如脂质体形成而连接。因此，在一个实施方案中，当TR7蛋白在溶液中互相接触时，会形成由本发明的一或多个抗体结合的多聚体，例如同源二聚体或同源三聚体。在另一个实施方案中，当TR7蛋白质与TR7多肽的抗体(或融合蛋白中的异源多肽序列的抗体)在溶液中接触时，形成由本发明的一或多个抗体结合的异源多聚体，例如异源三聚体或异源四聚体。在其它实施方案中，由本发明的一或多个抗体结合的多聚体通过与本发明TR7蛋白的共价结合和/或在本发明TR7蛋白之间的共价结合而形成。这种共价结合可以涉及所述蛋白质多肽序列(例如SEQ IDNO：3所示多肽序列，或由ATCC保藏物97920的cDNA克隆编码的多肽)中包含的一或多个氨基酸残基。在一个例子中，所述共价结合是位于蛋白质多肽序列内的在天然(即天然存在的)多肽中相互作用的半胱氨酸残基之间的交联。在另一个例子中，所述共价结合是化学或重组操作的结果。或者，这种共价结合可以涉及TR7融合蛋白中异源多肽序列中包含的一或多个氨基酸残基。在一个实施例中，共价结合发生在融合蛋白包含的异源序列之间(见例如美国专利No.5478925)。在一个特异的实施例中，共价结合发生在TR7-Fc融合蛋白(如本文所述)中包含的异源序列之间。在另一个特异的实施例中，融合蛋白的共价结合发生在异源多肽序列之间，所述异源多肽序列来自能形成共价结合的多聚体的另一个TNF家族配体/受体成员，例如oseteoprotegerin(见例如国际公开No.WO98/49305，在此以其全文并入参考)。
可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的化学方法产生。例如，希望包含于本发明多聚体中的蛋白质可以使用本领域已知的接头(linker)分子和接头分子长度优化技术进行化学交联(见例如美国专利No.5478925，在此以其全文并入参考)。另外，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的方法产生，以在位于希望包含于多聚体中的蛋白质的多肽序列内的半胱氨酸残基之间形成一或多个分子间交联(见例如美国专利No.5478925，在此以其全文并入参考)。另外，可以由本发明的一或多个抗体结合的蛋白质可以通过将半胱氨酸或生物素加入所述蛋白质多肽序列的C或N末端而常规修饰，而且可以使用本领域已知技术产生含有一或多个这些修饰蛋白质的多聚体(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。再者，可以使用本领域已知技术产生含有希望包含于可由本发明的一或多种抗体结合的多聚体中的蛋白质组分的脂质体(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。
或者，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的基因工程技术产生。在一个实施方案中，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体中包含的蛋白质是使用本文所述的融合蛋白技术或本领域已知其它技术重组产生的(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在一个特异的实施方案中，通过将编码TR7多肽的多核苷酸序列与编码接头多肽的序列连接，然后进一步与一种编码从起始C末端至N末端的反方向的多肽翻译产物(缺失前导序列)的合成多核苷酸连接，产生编码可以由本发明的一或多个抗体结合的同源二聚体的多核苷酸(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在另一个实施方案中，使用本文所述重组技术或本领域已知的其它技术产生重组TR7多肽，其含有一个跨膜结构域并可以通过膜重构技术整合入脂质体中(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在另一个实施方案中，两或多个TR7多肽通过合成接头(例如肽，碳水化合物或可溶聚合物接头)连接。实施例包括美国专利No.5073627(在此并入参考)中所述那些肽接头。包含由肽接头分离的多个TR7多肽的蛋白质可以使用常规重组DNA技术产生。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合包含由肽接头分离的多个TR7多肽的蛋白质。
制备多聚体TR7多肽的另一种方法涉及使用融合于亮氨酸拉链或异亮氨酸多肽序列的TR7多肽。亮氨酸拉链结构域和异亮氨酸拉链结构域是促进含有这些结构域的蛋白质多聚体化的多肽。亮氨酸拉链最初在一些DNA结合蛋白质中鉴别(Landschulz等，Science240：1759(1988))，至今已经在许多不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链是天然存在的二聚体化或三聚体化的肽及其衍生物。适于生产可溶多聚体TR7蛋白质的亮氨酸拉链结构域的实施例是PCT申请WO94/10308中所述的那些，在此并入参考。将包含与在溶液中二聚体化或三聚体化的肽融合的可溶TR7多肽的重组融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，并使用本领域已知技术从培养上清中回收所得可溶多聚体TR7。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7-亮氨酸拉链融合蛋白单体和/或TR7-亮氨酸拉链融合蛋白多聚体。
据信蛋白质TNF家族的一些成员以三聚体形式存在(Beutler和Huffel，Science 264：667，1994；Banner等，Cell 73：431，1993)。因此，三聚体TR7可能具有生物活性增强的优点。优选的亮氨酸拉链部分是优先形成三聚体的那些部分。一个实施例是衍生自肺表面活性剂蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链，如Hoppe等(FEBSLetters 344：191(1994))，及美国专利申请No.08/446922所述，在此以其全文并入参考。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7-亮氨酸拉链融合蛋白三聚体。
衍生自天然存在的三聚体蛋白质的其它肽可以用于制备三聚体TR7。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7融合蛋白单体和/或TR7融合蛋白三聚体。
本发明的结合TR7受体多肽的抗体可以结合分离的或天然存在状态的多肽。“分离的多肽”是指从其天然环境中分离的一种多肽。因此，对于本发明的目的，在重组宿主细胞中产生的和/或包含于重组细胞中的多肽是被认为是分离的。另外，“分离的多肽”也指已经从重组宿主细胞中部分或基本纯化的多肽。例如，一种重组产生的TR7多肽通过一步方法基本纯化，所述方法如Smith和Johnson，Gene67：31-40(1988)所述。因此，本发明的抗体可以结合重组产生的TR7受体多肽。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合在细胞表面上表达的TR7受体，其中所述TR7多肽由编码SEQ ID NO：3的1-411位氨基酸的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操纵地与控制所述多核苷酸表达的一个调节序列结合。
本发明的抗体可以结合TR7多肽或多肽片段，所述TR7多肽或多肽片段包括包含或由包含于SEQ ID NO：3中的由ATCC保藏号97920中包含的cDNA编码，或者由与ATCC保藏物No.97920中包含的核苷酸序列或其互补链杂交(例如在严格杂交条件下)的核酸编码的氨基酸序列组成的多肽，。蛋白质片段可以是“游离存在的”，或包含于一个较大的多肽中，在该较大的多肽中该片段形成一个部分或一个区域，最优选作为一个单一的连续区域。本发明的抗体可以结合多肽片段，包括，例如包含或由大约以下氨基酸残基组成的片段：SEQID NO：3的第1-51，52-78，79-91，92-111，112-134，135-151，152-178，179-180，181-208，209-218，219-231，232-251，252-271，272-291，292-311，312-323，324-361，362-391，392-411位氨基酸。文中“大约”包括特别指出的范围，在一端或两端多或少几个(5，4，3，2或1)氨基酸。另外，多肽片段的长度可以是至少大约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150个氨基酸。文中“大约”包括特别指出的数值，在一端或两端多或少几个(5，4，3，2或1)氨基酸。
优选地，本发明的多肽片段包括选自以下一组的成员：一种包含或由TR7受体胞外结构域(预测组成SEQ ID NO：3的约第52至约第184位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由两个TR7富半胱氨酸结构域(这两个结构域可见于由SEQ ID NO：3的约第84至约第179位氨基酸残基组成的蛋白质片段中)组成的多肽；一种包含或由SEQID NO：3的约第84至约第131位氨基酸残基组成的TR7富半胱氨酸结构域组成的多肽；一种包含或由SEQ ID NO：3的约第132至约第179位氨基酸残基组成的TR7富半胱氨酸结构域组成的多肽；一种包含或由TR7受体跨膜结构域(预测组成SEQ ID NO：3的约第185至约第208位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由预测的成熟TR7多肽的片段组成的多肽，其中所述片段具有TR7功能活性(例如抗原性活性或生物学活性)；一种包含或由TR7受体胞内结构域(预测组成SEQ ID NO：3的约第209至约第411位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由全部或部分缺失跨膜结构域的TR7受体胞外和胞内结构域组成的多肽；一种包含或由TR7受体死亡结构域(预测组成SEQID NO：3的约第324至约第391位氨基酸残基)组成的多肽；及一种包含或由TR7受体蛋白的1，2，3，4或多个携带表位部分组成的多肽。在另外的实施方案中，本发明的多肽片段包含或由上述的1，2，3，4，5，6，7或全部8个成员的任意组合组成。如上，具有前导序列的，组成TR7受体胞外、跨膜和胞内结构域的氨基酸残基由计算机分析预测。因此，本领域技术人员应意识到组成这些结构域的氨基酸残基基于用于限定每个结构域的标准而可以略微变化(例如变化大约1至大约15个氨基酸残基)。这些核酸分子编码的多肽也涵盖在本发明内。
如上所述，确信TR7的一或两个胞外富半胱氨酸基序对TR7与其配体(例如TRAIL)之间的相互作用很重要。因此，在特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由SEQ ID NO：3的第84至131位，和/或第132至179位氨基酸残基组成的TR7多肽片段。在另一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由两个胞外富半胱氨酸基序(SEQ ID NO：3的第84至179位氨基酸残基)组成的TR7多肽。在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由TR7的胞外可溶结构域(SEQ ID NO：2的第52至184位氨基酸残基)组成的TR7多肽。在其它特别优选的实施方案中，结合TR7的全部或部分胞外可溶结构域(例如，一或两个富半胱氨酸结构域)的本发明抗体激动(agonize)TR7受体。
在其它特别优选的实施方案中，结合TR7的全部或部分胞外可溶结构域(例如，一或两个富半胱氨酸结构域)的本发明的抗体诱导表达TR7受体的细胞细胞死亡。
本发明的抗体还可以结合包含或由TR7的结构或功能属性部分组成的片段。这些片段包括包含TR7的α-螺旋及α-螺旋形成区(“α-区”)，β-折叠及β-折叠形成区(“β-区”)，转角及转角形成区(“转角区”)，卷曲及卷曲形成区(“卷曲区”)，亲水区，疏水区，α两性区，β两性区，表面形成区及高抗原指数区(即由抗原指数高于或等于1.5的氨基酸残基组成的多肽区域，使用Jameson-Wolf程序的默认参数鉴别)的氨基酸残基。一些优选的区域是表2中所揭示的那些区域，并包括但非限于通过分析SEQ ID NO：3的氨基酸序列而鉴别的上述类型的区域，这些优选的区域包括：Gamier-Robson预测的α-区，β-区，转角区及卷曲区；Chou-Fasman预测的α-区，β-区和转角区；Kyte-Doolittle预测的亲水区及Hopp-Woods预测的疏水区；Eisenbergα和β两性区；Emini表面形成区；及Jameson-Wolf高抗原指数区，使用这些计算机程序的默认参数预测。
表2示出的代表如上所述的TR7的结构和功能属性的数据，是使用多种DNA*STAR的模块和算法按默认参数产生的。第I栏表示α螺旋区的Garnier-Robson分析结果；第II栏表示α螺旋区的Chou-Fasman分析结果；第III栏表示β折叠区的Garnier-Robson分析结果；第IV栏表示β折叠区的Chou-Fasman分析结果；第V栏表示转角区的Garnier-Robson分析结果；第VI栏表示转角区的Chou-Fasman分析结果；第VII栏表示卷曲区的Garnier-Robson分析结果；第VIII栏表示Kyte-Doolittle亲水性图；第IX栏表示Hopp-Woods疏水性图；第X栏表示α两性区的Eisenberg分析结果；第XI栏表示β两性区的Eisenberg分析结果；第XII栏表示柔性区的Karplus-Schultz分析结果；第XIII栏表示Jameson-Wolf抗原指数分值；及第XIV栏表示Emini表面概率图。
在一个优选的实施方案中，表2中第VIII，IX，XIII和XIV栏所示数据可以用于确定呈现高度抗原性潜力的TR7区域。通过选择表示在一种在免疫应答的初始过程中抗原识别可能发生的环境中很可能暴露于多肽表面的多肽区域的数值，从第VIII，IX，XIII和/或XIV栏所示数据中确定高抗原性区域。
表2所示上述优选的区域包括但非限于通过分析SEQ ID NO：3所示氨基酸序列而鉴别的上述类型的区域。如表2所示，这些优选的区域包括Garnier-Robson α-区，β-区，转角区和卷曲区，Chou-Fasmanα-区，β-区和转角区，Kyte-Doolittle亲水区，Eisenbergα-和β-两性区，Karplus-Schulz柔性区，Jameson-Wolf高抗原指数区及Emini表面形成区。优选的，本发明的抗体结合TR7多肽或TR7多肽片段或变体，所述多肽或片段或变体包含组合了若干结构特征如上述及表2所示的若干(例如1，2，3或4个)相同或不同区域特征的TR7区域。
表2
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Met 1 A . . . . . . 1.11 -0.70 . * . 1.29 2.18
Glu 2 A . . . . . . 1.50 -0.70 . * . 1.63 1.69
Gln 3 A . . . . T . 1.89 -0.73 . * . 2.17 2.28
Arg 4 . . . . T T . 1.69 -0.76 . * . 2.91 3.71
Gly 5 . . . . T T . 1.87 -0.87 . * F 3.40 2.17
Gln 6 . . . . T T . 1.88 -0.44 . * F 2.76 1.93
Asn 7 . . . . . . C 1.29 -0.34 . * F 1.87 1.00
Ala 8 . . . . . . C 0.99 -0.16 . . F 1.08 1.02
Pro 9 . . . . . . C 0.53 0.11 . * . 0.44 0.79
Ala 10 A . . . . . . 0.29 0.14 . * . -0.10 0.48
Ala 11 A . . . . T . 0.40 0.24 . . . 0.10 0.48
Ser 12 A . . . . T . 0.44 -0.26 . * F 0.85 0.61
Gly 13 A . . . . T . 1.14 -0.69 . * F 1.30 1.22
Ala 14 A . . . . T . 1.32 -1.19 . * F 1.30 2.36
Arg 15 A . . . T . . 1.57 -1.19 . * F 1.50 2.39
Lys 16 . . . . T . . 1.94 -1.14 . . F 1.50 2.39
Arg 17 . . . . T . . 1.90 -1.14 . * F 1.80 3.66
His 18 . . . . . . C 2.03 -1.21 * * F 1.90 1.85
Gly 19 . . . . . T C 2.73 -0.79 * * F 2.40 1.43
Pro 20 . . . . . T C 2.62 -0.79 * * F 2.70 1.43
Gly 21 . . . . . T C 1.99 -0.79 * . F 3.00 1.82
Pro 22 . . . . . T C 1.99 -0.79 . * F 2.70 1.86
Arg 23 . A . . . . C 1.68 -1.21 * . F 2.30 2.35
Glu 24 . A B . . . . 1.43 -1.21 * . F 2.10 2.35
Ala 25 . A . . T . . 1.76 -1.14 * . F 2.50 1.54
Arg 26 . A . . T . . 1.89 -1.57 * . F 2.50 1.54
Gly 27 . . . . T . . 1.76 -1.14 * . F 3.00 1.37
Ala 28 . . . . T . C 1.43 -0.71 * * F 2.70 1.35
Arg 29 . . . . . T C 1.54 -0.79 * * F 2.66 1.06
Pro 30 . . . . . T C 1.28 -0.79 * * F 2.62 2.10
Gly 31 . . . . . T C 0.96 -0.57 * * F 2.58 1.54
Pro 32 . . . . . T C 1.34 -0.64 * * F 2.54 1.22
Arg 33 . . . . . . C 1.62 -0.64 * * F 2.60 1.58
Val 34 . . . . . . C 0.70 -0.59 * * F 2.34 2.30
Pro 35 . . B . . . . 0.06 -0.33 * * F 1.58 1.23
Lys 36 . . B B . . . -0.41-0.11 * . F 0.97 0.46
Thr 37 . . B B . . . -1.060.57 * * F -0.19 0.52
Leu 38 . . B B . . . -2.020.57 * * . -0.60 0.25
Val 39 . . B B . . . -1.760.79 . . . -0.60 0.09
Leu 40 A . . B . . . -2.131.29 . . . -0.60 0.06
Val 41 A . . B . . . -3.031.30 . . . -0.60 0.08
Val 42 A . . B . . . -3.531.26 . . . -0.60 0.08
Ala 43 A . . B . . . -3.531.30 . . . -0.60 0.08
Ala 44 A . . B . . . -3.491.30 . . . -0.60 0.09
Val 45 A . . B . . . -3.531.34 . . . -0.60 0.10
Leu 46 A . . B . . . -2.981.34 . . . -0.60 0.07
Leu 47 A . . B . . . -2.711.23 . . . -0.60 0.09
Leu 48 A . . B . . . -2.121.23 . . . -0.60 0.13
Val 49 A . . B . . . -1.830.59 . . . -0.60 0.27
Ser 50 A . . B . . . -1.570.29 . * . -0.30 0.44
表2(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Ala 51 A A . . . . . -1.57 0.10 . . . -0.30 0.54
Glu 52 A A . . . . . -1.64 0.10 . . . -0.30 0.60
Ser 53 A A . B . . . -1.14 0.14 . . . -0.30 0.31
Ala 54 A A . B . . . -0.29 0.24 . . . -0.30 0.45
Leu 55 A A . B . . . 0.01 0.14 . . . -0.30 0.45
Ile 56 A A . B . . . 0.60 0.54 . . . -0.60 0.58
Thr 57 A A . B . . . -0.21 0.16 . . F -0.15 0.96
Gln 58 A A . B . . . -0.50 0.34 . . F -0.15 0.96
Gln 59 A A . B . . . -0.12 0.16 . . F 0.00 1.38
Asp 60 . A . B T . . 0.69 -0.10 . . F 1.00 1.48
Leu 61 . A . . . . C 1.58 -0.19 . * F 0.80 1.48
Ala 62 . A . . . . C 2.00 -0.19 . * F 0.80 1.48
Pro 63 . A . . . . C 1.41 -0.59 . * F 1.10 1.73
Gln 64 . A . . T . . 0.82 -0.09 . * F 1.00 2.13
Gln 65 A A . . . . . 0.61 -0.27 . * F 0.60 2.13
Arg 66 A A . . . . . 1.42 -0.34 . * F 0.60 2.13
Ala 67 A A . . . . . 2.01 -0.37 . * F 0.94 2.13
Ala 68 A A . . . . . 2.27 -0.37 * * F 1.28 2.13
Pro 69 A A . . . . . 2.38 -0.77 * * F 1.92 2.17
Gln 70 . A . . T . . 2.08 -0.77 * . F 2.66 4.21
Gln 71 . . . . T T . 1.67 -0.89 * * F 3.40 5.58
Lys 72 . . . . T T . 2.04 -1.00 . . F 3.06 4.84
Arg 73 . . . . T T . 2.33 -1.00 . . F 2.97 4.32
Ser 74 . . . . . T C 2.54 -1.01 . . F 2.68 3.34
Ser 75 . . . . . T C 2.20 -1.41 . . F 2.59 2.89
Pro 76 . . . . T T . 1.39 -0.99 . . F 2.70 1.46
Ser 77 . . . . T T . 0.68 -0.30 . . F 2.50 0.90
Glu 78 . . . . T T . 0.36 -0.11 . * F 2.25 0.36
Gly 79 . . . . T . . 0.44 -0.07 . . F 1.80 0.36
Leu 80 . . . . T . . 0.40 -0.07 . . F 1.55 0.42
Cys 81 . . . . . . C 0.58 -0.03 . . . 0.95 0.24
Pro 82 . . . . . T C 0.84 0.47 * . F 0.15 0.33
Pro 83 . . . . T T . -0.04 0.54 * . F 0.35 0.54
Gly 84 . . . . T T . 0.00 0.54 * . . 0.20 0.70
His 85 . . . . . T C 0.81 0.36 * . . 0.30 0.61
His 86 . . . . . . C 1.48 -0.07 * . . 0.70 0.68
Ile 87 . . . . . . C 1.34 -0.50 * * . 1.19 1.15
Ser 88 . . . . . . C 1.67 -0.50 * * F 1.53 0.84
Glu 89 . . . . T . . 2.01 -1.00 * * F 2.52 1.21
Asp 90 . . . . T . . 1.38 -1.50 * * F 2.86 2.88
Gly 91 . . . . T T . 0.52 -1.61 * * F 3.40 1.15
Arg 92 . . . . T T . 1.11 -1.31 * * F 2.91 0.47
Asp 93 . . . . T T . 0.74 -0.93 . * F 2.57 0.37
Cys 94 . . . . T T . 0.79 -0.36 . * . 1.78 0.20
Ile 95 . . . . T . . 0.54 -0.79 . * . 1.54 0.21
Ser 96 . . . . T . . 0.54 -0.03 . * . 1.18 0.19
Cys 97 . . . . T T . 0.43 0.40 . * . 0.76 0.36
Lys 98 . . . . T T . 0.43 0.23 . . . 1.34 0.88
Tyr 99 . . . . T T . 0.86 -0.46 . * F 2.52 1.10
Gly 100 . . . . T T . 1.44 -0.09 . * F 2.80 3.22
表2(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Gln 101 . . . . T T . 1.43 -0.27 * . F 2.52 2.16
Asp 102 . . . . T T . 2.07 0.21 * * F 1.64 1.99
Tyr 103 . . . . T T . 1.73 -0.04 * * F 1.96 2.73
Ser 104 . . . . T T . 1.98 0.44 * . F 0.78 1.66
Thr 105 . . . . T . . 2.32 0.44 * . F 0.30 1.60
His 106 . . . . T . . 1.51 0.44 * . . 0.15 1.70
Trp 107 . . . . T T . 0.70 0.37 * . . 0.65 1.05
Asn 108 . . . . T T . 0.24 0.67 . . . 0.20 0.60
Asp 109 . . . . T T . -0.12 0.97 * . . 0.20 0.38
Leu 110 A . . . . T . -0.62 1.04 * * . -0.20 0.19
Leu 111 . . . B T . . -0.48 0.81 * * . -0.20 0.10
Phe 112 . . . B T . . -0.86 0.41 * * . -0.20 0.12
Cys 113 . . . B T . . -1.17 0.99 * * . -0.20 0.08
Leu 114 . . . B T . . -1.06 0.79 . * . -0.20 0.13
Arg 115 . . . B T . . -0.91 0.10 . * . 0.10 0.30
Cys 116 . . . B T . . -0.10 -0.11 . . . 0.70 0.30
Thr 117 . . . B T . . 0.30 -0.69 . * . 1.00 0.61
Arg 118 . . . B T . . 0.62 -0.99 . . F 1.49 0.42
Cys 119 . . . . T T . 1.43 -0.56 * . F 2.23 0.77
Asp 120 . . . . T T . 0.47 -1.13 * . F 2.57 0.92
Ser 121 . . . . T T . 1.13 -0.97 . * F 2.91 0.35
Gly 122 . . . . T T . 0.63 -0.97 . * F 3.40 1.13
Glu 123 . A . . T . . 0.22 -0.86 . * F 2.51 0.56
Val 124 A A . . . . . 0.68 -0.47 . * F 1.47 0.56
Glu 125 . A . . T . . 0.01 -0.43 . * . 1.38 0.87
Leu 126 . A . . T . . 0.00 -0.29 . * . 1.04 0.27
Ser 127 . . . . . T C 0.03 0.20 . * F 0.45 0.52
Pro 128 . . . . T T . -0.28 0.04 . * F 0.93 0.44
Cys 129 . . . . T T . 0.69 0.53 . * F 0.91 0.77
Thr 130 . . . . T T . 0.69 -0.16 . * F 2.24 1.12
Thr 131 . . . . T . . 1.19 -0.14 . * F 2.32 1.16
Thr 132 . . . . T T . 0.63 -0.09 . * F 2.80 3.13
Arg 133 . . . . T T . 0.18 -0.01 . . F 2.52 1.61
Asn 134 . . . . T T . 0.84 0.07 . . F 1.49 0.60
Thr 135 . . . . T T . 0.49 -0.01 . . F 1.81 0.72
Val 136 . . . . T . C 0.80 0.07 * . . 0.58 0.20
Cys 137 . A . . T . . 1.11 0.07 * . . 0.10 0.21
Gln 138 . A B . . . . 0.66 -0.33 * . . 0.30 0.25
Cys 139 . A . . T . . 0.34 -0.39 . . . 0.70 0.34
Glu 140 A A . . . . . -0.04 -0.54 * * F 0.75 0.91
Glu 141 A A . . . . . 0.92 -0.33 * * F 0.45 0.46
Gly 142 . A . . T . . 1.59 -0.73 . * F 1.30 1.67
Thr 143 A A . . . . . 1.59 -1.30 . * F 0.90 1.67
Phe 144 A A . . . . . 2.26 -1.30 . * F 0.90 1.67
Arg 145 A A . . . . . 1.96 -1.30 . * F 0.90 2.81
Glu 146 A A . . . . . 1.74 -1.34 . * F 0.90 2.61
Glu 147 A A . . . . . 2.09 -1.40 . * F 0.90 4.66
Asp 148 A A . . . . . 1.80 -2.19 . * F 0.90 4.12
Ser 149 A . . . . T . 1.83 -1.57 . * F 1.30 2.35
Pro 150 A . . . . T . 1.83 -1.00 . . F 1.15 0.73
表2(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Glu 15l A . . . . T . 1.88 -1.00 * . F 1.15 0.85
Met 152 A . . . . T . 1.21 -1.00 * * . 1.49 1.28
Cys 153 A . . . . T . 1.32 -0.81 * * . 1.68 0.44
Arg 154 A . . . . T . 1.31 -1.24 * . . 2.02 0.50
Lys 155 . . . . T T . 1.18 -0.76 * * F 2.91 0.73
Cys 156 . . . . T T . 0.51 -0.94 * . F 3.40 1.35
Arg 157 . . . . T . . 0.90 -0.94 * . F 2.71 0.37
Thr 158 . . . . T . . 1.68 -0.51 * . F 2.37 0.28
Gly 159 . . . . T . . 1.22 -0.51 * . F 2.43 1.04
Cys 160 . . . . . T C 0.58 -0.66 . * F 2.19 0.53
Pro 161 . . . . T T . 0.39 -0.04 . * F 2.00 0.36
Arg 162 . . . . T T . 0.32 0.11 . * F 1.65 0.27
Gly 163 . . . . T T . -0.22 -0.31 * * . 2.50 1.01
Met 164 . . B B . . . -0.22 -0.24 * * . 1.30 0.48
Val 165 . . B B . . . 0.44 -0.24 * * . 1.30 0.24
Lys 166 . . B B . . . -0.01 -0.24 * * . 1.30 0.41
Val 167 . . B . . T . -0.43 -0.10 * * F 1.85 0.22
Gly 168 . . . . T T . -0.30 -0.23 . . F 2.25 0.44
Asp 169 . . . . T T . 0.01 -0.44 . . F 2.50 0.34
Cys 170 . . . . T T . 0.57 0.47 . * F 1.35 0.48
Thr 171 . . . . . T C 0.52 0.21 . * F 1.20 0.65
Pro 172 . . . . T T . 0.49 -0.21 . * F 1.75 0.65
Trp 173 . . . . T T . 0.83 0.47 . * F 0.60 0.84
Ser 174 A . . . . T . 0.17 -0.10 . * F 1.00 1.01
Asp 175 A A . . . . . -0.02 -0.01 . . F 0.45 0.35
Ile 176 A A . . . . . 0.26 0.20 * * . -0.30 0.25
Glu 177 A A . . . . . 0.51 -0.21 * . . 0.30 0.25
Cys 178 A A . . . . . 0.80 -0.60 * . . 0.60 0.30
Val 179 A A . . . . . 0.80 -0.60 * * . 0.60 0.74
His 180 A A . . . . . 0.46 -0.90 . * . 0.60 0.58
Lys 181 A A . . . . . 0.46 -0.47 * . F 0.60 1.06
Glu 182 A . . . . T . -0.43 -0.36 * . F 1.00 1.00
Ser 183 A . . . . T . -0.66 -0.31 . . F 0.85 0.52
Gly 184 A . . . T T . -0.14 -0.13 . . F 1.25 0.18
Ile 185 A . . . . T . -0.97 0.30 . . . 0.10 0.10
Ile 186 . . B B . . . -1.32 0.94 . * . -0.60 0.06
Ile 187 . . B B . . . -2.18 1.04 . . . -0.60 0.08
Gly 188 . . B B . . . -2.47 1.26 . * . -0.60 0.09
Val 189 . . B B . . . -2.71 1.07 . . . -0.60 0.13
Thr 190 A . . B . . . -2.68 0.89 . * . -0.60 0.18
Val 191 A . . B . . . -2.64 0.84 . . . -0.60 0.14
Ala 192 A . . B . . . -2.57 1.06 . * . -0.60 0.14
Ala 193 A . . B . . . -3.11 1.10 . . . -0.60 0.08
Val 194 A . . B . . . -3.11 1.30 . . . -0.60 0.07
Val 195 A . . B . . . -3.39 1.30 . . . -0.60 0.05
Leu 196 A . . B . . . -3.39 1.30 . . . -0.60 0.05
Ile 197 A . . B . . . -3.50 1.44 . . . -0.60 0.05
Val 198 A . . B . . . -3.77 1.59 . . . -0.60 0.06
Ala 199 A . . B . . . -3.58 1.59 . . . -0.60 0.06
Val 200 A . . B . . . -2.68 1.47 . . . -0.60 0.04
表2(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Phe 201 A . . B . . . -2.17 0.79 . . . -0.60 0.12
Val 202 A . . B . . . -2.09 0.53 . . . -0.60 0.16
Cys 203 A . . . . T . -2.04 0.71 . . . -0.20 0.17
Lys 204 A . . . . T . -1.74 0.76 . . . -0.20 0.17
Ser 205 A . . . . T . -0.84 0.89 . . . -0.20 0.24
Leu 206 A . . . . T . -0.10 0.24 . . . 0.10 0.88
Leu 207 A A . . . . . -0.10 -0.33 . . . 0.30 0.88
Trp 208 A A . . . . . -0.24 0.31 . . . -0.30 0.49
Lys 209 A A . . . . . -0.50 0.61 . . . -0.60 0.49
Lys 210 A A . . . . . -0.44 0.36 * . . -0.30 0.91
Val 211 A A . . . . . -0.44 0.43 * * . -0.45 1.36
Leu 212 . A B . . . . 0.41 0.20 * * . -0.30 0.56
Pro 213 . A B . . . . 0.36 0.20 * . . -0.30 0.56
Tyr 214 . . . B T . . -0.58 0.63 * . . -0.20 0.75
Leu 215 . . . B T . . -1.29 0.67 * * . -0.20 0.64
Lys 216 . . . B T . . -0.73 0.56 * . . -0.20 0.22
Gly 217 . . B B . . . -0.27 0.51 * . . -0.60 0.19
Ile 218 . . B B . . . -0.40 0.19 * . . -0.30 0.23
Cys 219 . . B . . T . -0.50 -0.07 * . . 0.70 0.11
Ser 220 . . . . T T . -0.03 0.36 . * F 0.65 0.11
Gly 221 . . . . T T . -0.08 0.36 . . F 0.65 0.16
Gly 222 . . . . T T . 0.06 -0.33 . . F 1.25 0.49
Gly 223 . . . . . . C 0.94 -0.47 . . F 0.85 0.57
Gly 224 . . . . . . C 1.72 -0.86 * . F 1.15 0.99
Asp 225 . . . . . T C 1.17 -1.29 . * F 1.50 1.97
Pro 226 . . . . . T C 1.51 -1.07 * . F 1.84 1.47
Glu 227 . . B . . T . 1.97 -1.50 * . F 1.98 2.49
Arg 228 . . B . . T . 2.01 -1.93 * . F 2.32 2.92
Val 229 . . . . T . . 2.06 -1.54 * . F 2.86 2.53
Asp 230 . . . . T T . 2.06 -1.59 * . F 3.40 1.96
Arg 231 . . . . T T . 2.38 -1.19 * * F 3.06 1.73
Ser 232 . . . . T T . 2.17 -1.19 * . F 2.72 4.57
Ser 233 . . . . T T . 1.71 -1.40 * * F 2.72 4.23
Gln 234 . . . . . . C 1.98 -0.97 * * F 2.32 2.14
Arg 235 . . . . . T C 1.98 -0.47 * * F 2.22 1.61
Pro 236 . . . . . T C 1.87 -0.86 * * F 2.86 2.08
Gly 237 . . . . T T . 2.17 -1.24 . * F 3.40 2.01
Ala 238 . . . . . T C 1.61 -1.24 . * F 2.86 1.65
Glu 239 A . . . . . . 0.80 -0.60 . * F 1.97 0.79
Asp 240 A . . . . . . 0.69 -0.34 . * F 1.33 0.66
Asn 241 A . . . . . . 0.90 -0.37 * . . 0.99 1.05
Val 242 A . . . . . . 0.36 -0.87 * . . 0.95 1.05
Leu 243 A . . . . . . 0.09 -0.19 * . . 0.50 0.44
Asn 244 A . . B . . . -0.21 0.46 * . . -0.60 0.20
Glu 245 A . . B . . . -1.10 0.44 * . . -0.60 0.37
Ile 246 A . . B . . . -1.91 0.49 * . . -0.60 0.31
Val 247 A . . B . . . -1.06 0.49 * . . -0.60 0.16
Ser 248 . . B B . . . -0.46 0.49 * . . -0.60 0.16
Ile 249 . . B B . . . -0.77 0.91 * . . -0.60 0.35
Leu 250 . . . B . . C -0.77 0.71 . . . -0.40 0.69
表2(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Gln 251 . . . . . T C -0.73 0.47 . . F 0.15 0.89
Pro 252 . . . . . T C -0.09 0.73 . . F 0.15 0.94
Thr 253 . . . . . T C 0.21 0.47 . . F 0.30 1.76
Gln 254 . . . . . T C 1.10 -0.21 . . F 1.20 1.76
Val 255 . A . . . . C 1.91 -0.21 . . F 0.80 1.97
Pro 256 . A . . . . C 1.31 -0.64 . . F 1.10 2.37
Glu 257 A A . . . . . 1.52 -0.51 . * F 0.90 1.35
Gln 258 A A . . . . . 0.98 -0.91 . * F 0.90 3.16
Glu 259 A A . . . . . 0.98 -0.91 . * F 0.90 1.51
Met 260 A A . . . . . 1.83 -0.94 . * F 0.90 1.51
Glu 261 A A . . . . . 1.83 -0.94 . * . 0.75 1.51
Val 262 A A . . . . . 1.24 -0.91 . * F 0.90 1.35
Gln 263 A A . . . . . 1.24 -0.41 . * F 0.60 1.38
Glu 264 A A . . . . . 1.03 -1.03 . * F 0.90 1.38
Pro 265 A A . . . . . 1.32 -0.60 . * F 1.18 2.88
Ala 266 A A . . . . . 0.98 -0.76 . * F 1.46 2.40
Glu 267 A . . . . T . 0.98 -0.73 . * F 2.14 1.37
Pro 268 A . . . . T . 0.98 -0.09 . . F 1.97 0.66
Thr 269 . . . . T T . 0.38 -0.11 . . F 2.80 1.05
Gly 270 A . . . . T . -0.22 0.00 . . F 1.37 0.60
Val 271 A . . . . . . 0.07 0.69 . . . 0.44 0.32
Asn 272 . . B . . . . -0.14 0.64 . . . 0.16 0.30
Met 273 . . B . . . . -0.28 0.59 . . . 0.18 0.46
Leu 274 . . . . . . C 0.03 0.59 . . . 0.40 0.62
Ser 275 . . . . . T C 0.08 -0.06 . . F 1.95 0.66
Pro 276 . . . . . T C 0.93 -0.07 . . F 2.25 0.90
Gly 277 . . . . . T C 0.90 -0.69 . . F 3.00 1.89
Glu 278 A . . . . T . 0.69 -0.87 . . F 2.50 1.92
Ser 279 A A . . . . . 0.69 -0.57 . . F 1.80 1.02
Glu 280 A A . . . . . 0.99 -0.31 . . F 1.05 0.85
His 281 A A . . . . . 0.99 -0.74 . . F 1.05 0.85
Leu 282 A A . . . . . 0.74 -0.31 . . . 0.30 0.98
Leu 283 A A . . . . . 0.74 -0.20 . . . 0.30 0.57
Glu 284 A A . . . . . 0.46 -0.20 . . F 0.45 0.73
Pro 285 A A . . . . . 0.46 -0.20 . . F 0.45 0.89
Ala 286 A A . . . . . 0.60 -0.89 . . F 0.90 1.88
Glu 287 A A . . . . . 1.11 -1.57 . . F 0.90 2.13
Ala 288 A A . . . . . 1.92 -1.19 . . F 0.90 1.84
Glu 289 A A . . . . . 2.03 -1.21 * . F 0.90 3.16
Arg 290 A A . . . . . 2.36 -1.71 * . F 0.90 3.57
Ser 291 A . . . . T . 3.06 -1.71 * . F 1.30 6.92
Gln 292 A . . . . T . 2.24 -2.21 * . F 1.30 7.83
Arg 293 A . . . . T . 2.02 -1.53 . . F 1.30 3.30
Arg 294 A . . . . T . 1.17 -0.84 . . F 1.30 2.03
Arg 295 . . . B T . . 0.84 -0.59 . * F 1.15 0.87
Leu 296 . . B B . . . 0.56 -0.56 . * . 0.60 0.69
Leu 297 . . B B . . . 0.56 -0.06 . * . 0.30 0.35
Val 298 . . . B . . C 0.44 0.34 * * . 0.20 0.29
Pro 299 . . . . . T C -0.01 0.34 * . . 0.90 0.61
Ala 300 . . . . . T C -0.12 0.09 * * F 1.35 0.73
表2(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Asn 301 . . . . . T C 0.48 -0.60 . . F 2.70 1.65
Glu 302 . . . . . T C 0.98 -0.81 . . F 3.00 1.65
Gly 303 . . . . . . C 1.83 -0.76 . . F 2.50 2.35
Asp 304 . . . . . T C 1.73 -1.26 . . F 2.40 2.54
Pro 305 . . . . . T C 1.51 -1.17 . * F 2.10 2.11
Thr 306 A . . . . T . 1.62 -0.49 . * F 1.30 1.76
Glu 307 A . . . . T . 1.62 -0.91 * * F 1.30 2.07
Thr 308 A . . B . . . 1.30 -0.51 * * F 0.90 2.31
Leu 309 A . . B . . . 0.60 -0.37 * * F 0.45 0.86
Arg 310 A . . B . . . 0.81 -0.07 * * . 0.30 0.43
Gln 311 A . . B . . . 1.12 -0.07 * * . 0.30 0.50
Cys 312 A . . . . T . 0.42 -0.56 * * . 1.15 1.01
Phe 313 A . . . . T . 0.14 -0.46 * * . 0.70 0.45
Asp 314 . . . . T T . 0.96 0.04 * * . 0.50 0.26
Asp 315 A . . . . T . 0.03 -0.36 * * . 0.70 0.81
Phe 316 A A . . . . . -0.82 -0.24 * . . 0.30 0.77
Ala 317 A A . . . . . -0.37 -0.39 * . . 0.30 0.34
Asp 318 A A . . . . . -0.37 0.04 * * . -0.30 0.32
Leu 319 A A . . . . . -0.37 0.83 . . . -0.60 0.32
Val 320 . A . . . . C -0.67 0.04 . . . -0.10 0.52
Pro 321 . A . . . . C -0.26 -0.07 . . . 0.50 0.42
Phe 322 . . . . T T . 0.33 0.84 . . . 0.20 0.54
Asp 323 A . . . . T . 0.12 0.16 . . . 0.25 1.25
Ser 324 A . . . . T . 0.12 -0.06 . . F 1.00 1.25
Trp 325 A . . . . T . 0.38 0.20 * * F 0.40 1.19
Glu 326 A A . . . . . 0.70 0.03 * . F -0.15 0.71
Pro 327 A A . . . . . 1.44 0.03 * . . -0.15 1.03
Leu 328 A A . . . . . 0.63 -0.36 * . . 0.45 1.96
Met 329 A A . . . . . 0.59 -0.59 * . . 0.60 0.93
Arg 330 A A . . . . . 0.07 -0.16 * . . 0.30 0.60
Lys 331 A A . . . . . -0.53 0.10 * . . -0.30 0.60
Lau 332 A A . . . . . -0.32 0.03 * . . -0.30 0.60
Gly 333 A A . . . . . 0.49 -0.59 * . . 0.60 0.51
Leu 334 A A . . . . . 1.09 -0.19 * . . 0.30 0.41
Met 335 A A . . . . . 0.09 -0.19 * * . 0.30 0.86
Asp 336 A A . . . . . 0.09 -0.19 . * F 0.45 0.61
Asn 337 A A . . . . . 0.04 -0.6L * * F 0.90 1.48
Glu 338 A A . . . . . -0.20 -0.66 * * F 0.90 1.11
Ile 339 A A . . . . . 0.66 -0.77 * * F 0.75 0.67
Lys 340 A A . . . . . 0.67 -0.77 . * F 0.75 0.83
Val 341 A A . . . . . 0.67 -0.67 . * . 0.60 0.49
Ala 342 A A . . . . . 0.08 -0.67 . . . 0.75 1.20
Lys 343 A A . . . . . -0.51 -0.86 . * . 0.60 0.61
Ala 344 A A . . . . . 0.03 -0.36 . * . 0.30 0.83
Glu 345 A A . . . . . -0.04 -0.57 * . . 0.60 0.81
Ala 346 A A . . . . . 0.92 -0.57 * . . 0.60 0.55
Ala 347 A A . . . . . 1.51 -0.57 . * . 0.75 1.07
Gly 348 A . . . . . . 1.16 -1.07 . * . 0.95 1.03
His 349 A . . . . T . 0.93 -0.59 . . . 1.15 1.47
Arg 350 A . . . . T . 0.69 -0.40 . . F 1.00 1.20
表2(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Asp 351 A . . . . T . 0.97 -0.14 . . F 1.00 1.90
Thr 352 A . . . . T . 0.96 -0.09 . . F 1.00 2.02
Leu 353 A . . B . . . 0.49 0.03 . . . -0.15 1.02
Tyr 354 A . . B . . . -0.37 0.71 . * . -0.60 0.50
Thr 355 A . . B . . . -0.43 1.40 . * . -0.60 0.24
Met 356 A . . B . . . -0.72 0.91 * . . -0.60 0.59
Leu 357 A . . B . . . -1.27 1.14 * . . -0.60 0.40
Ile 358 A . . B . . . -0.46 1.03 * * . -0.60 0.20
Lys 359 A . . B . . . -0.17 0.94 * * . -0.60 0.33
Trp 360 A . . B . . . -0.17 0.33 * * . 0.00 0.81
Val 361 A . . B . . . 0.09 0.13 * * . 0.45 1.66
Asn 362 . . . . . T C 1.01 -0.13 * . F 1.95 0.82
Lys 363 . . . . . T C 1.90 -0.13 * * F 2.40 1.53
Thr 364 . . . . . T C 1.27 -1.04 * . F 3.00 3.44
Gly 365 . . . . . T C 1.26 -1.19 * . F 2.70 2.16
Arg 366 . A . . T . . 1.26 -1.20 * . F 2.20 1.45
Asp 367 . A . . . . C 1.22 -0.56 * . F 1.55 0.75
Ala 368 A A . . . . . 0.87 -0.54 . . F 1.20 1.03
Ser 369 A A . . . . . 0.37 -0.49 . . . 0.30 0.76
Val 370 A A . . . . . -0.10 0.20 . * . -0.30 0.37
His 371 A A . . . . . -0.21 0.89 . * . -0.60 0.30
Thr 372 A A . . . . . -0.80 0.39 * * . -0.30 0.38
Leu 373 A A . . . . . -1.02 0.50 * * . -0.60 0.52
Leu 374 A A . . . . . -0.72 0.54 * . . -0.60 0.31
Asp 375 A A . . . . . -0.18 0.04 * . . -0.30 0.38
Ala 376 A A . . . . . -0.96 0.04 * . . -0.30 0.66
Leu 377 A A . . . . . -0.99 0.04 * . . -0.30 0.66
Glu 378 A A . . . . . -0.18 -0.21 * . . 0.30 0.39
Thr 379 A A . . . . . 0.74 -0.21 * * F 0.45 0.67
Leu 380 A A . . . . . -0.07 -0.71 * . F 0.90 1.59
Gly 381 A A . . . . . -0.07 -0.71 * . F 0.75 0.76
Glu 382 A A . . . . . 0.79 -0.21 * . F 0.45 0.53
Arg 383 A A . . . . . 0.79 -0.70 * . F 0.90 1.28
Leu 384 A A . . . . . 1.14 -0.99 * * F 0.90 2.24
Ala 385 A A . . . . . 1.07 -1.41 * * F 0.90 2.59
Lys 386 A A . . . . . 1.41 -0.73 * . F 0.75 0.93
Gln 387 A A . . . . . 1.41 -0.73 * * F 0.90 1.95
Lys 388 A A . . . . . 1.27 -1.41 * * F 0.90 3.22
Ile 389 A A . . . . . 1.27 -1.41 . * F 0.90 2.19
Glu 390 A A . . . . . 1.04 -0.73 * * F 0.90 1.04
Asp 391 A A . . . . . 0.70 -0.44 . * F 0.45 0.43
His 392 A A . . . . . 0.40 -0.06 * * . 0.30 0.82
Leu 393 A A . . . . . 0.01 -0.36 * * . 0.30 0.64
Leu 394 A A . . . . . 0.94 0.07 * * F -0.15 0.38
Ser 395 A . . . . T . 0.24 0.07 * * F 0.25 0.55
Ser 396 A . . . . T . -0.36 0.36 * * F 0.25 0.58
Gly 397 . . . . T T . -0.57 0.29 . . F 0.65 0.70
Lys 398 A . . . . T . -0.57 0.36 . . F 0.25 0.82
Phe 399 A A . . . . . 0.24 0.66 . . . -0.60 0.50
Met 400 . A B . . . . 0.20 0.27 . * . -0.30 0.88
表2(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Tyr 401 . A B . . . . 0.50 0.27 . * . -0.30 0.44
Leu 402 A A . . . . . 0.26 0.67 . * . -0.60 0.81
Glu 403 A A . . . . . 0.21 0.39 . * . -0.30 0.82
Gly 404 A . . . . . . 0.61 -0.23 . * F 0.65 0.88
Asn 405 A . . . . T . 0.62 -0.60 . * F 1.30 1.43
Ala 406 A . . . . T . 0.27 -0.79 . * F 1.15 0.83
Asp 407 A . . . . T . 0.78 -0.17 . * F 0.85 0.83
ser 408 A . . . . T . 0.39 -0.21 . * F 0.85 0.69
Ala 409 A . . . . . . 0.34 -0.19 . * . 0.50 0.88
Met 410 A . . . . . . -0.04 -0.26 . . . 0.50 0.67
Ser 411 A . . . . . . 0.16 0.17 . . . -0.10 0.64
在另一个方面中，本发明提供了一种抗体，其结合包含或由TR7一，二，三，四，五或多个表位携带部分组成的肽或多肽。这种多肽部分的表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指当整个蛋白质是免疫原时激发抗体应答的蛋白质部分。另一方面，抗体可以结合的蛋白质分子的区域是“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位数一般少于抗原性表位数。见，例如，Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(1983)。
为选择携带抗原性表位(即含有抗体可以结合的蛋白质分子的区域)的肽或多肽，本领域熟知模拟蛋白质序列一部分的相对短的合成肽通常能激发与所述被部分模拟的蛋白质反应的抗血清。见，例如，J.G.Sutcliffe等，“Antibodies That React With Predetermined Sites onProteins，”Science 219：660-666(1983)。。能激发蛋白质反应性血清的肽通常在蛋白质的初级序列中呈现，可以通过一系列简便的化学规则定性，而且既不限于完整蛋白质的免疫显性区域(即免疫原性表位)，也不限于氨基或羧基末端。
因此携带抗原性表位的肽和多肽可用于产生结合TR7多肽的抗体，包括单克隆抗体。见，例如，Wilson等，Cell 37：767-778(1984)的第777页所述。携带抗原性表位的肽和多肽优选含有一种序列，所述序列具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列中包含的至少7个，更优选至少9个及最优选至少大约15至大约30个氨基酸。
本发明的抗体可以结合一或多种抗原性TR7多肽或肽，包括但非限于：包含或由SEQ ID NO：3的大约第62至大约110位，SEQ ID NO：3的大约第119至大约164位，SEQ ID NO：3的大约第224至大约271位，SEQ ID NO：3的大约第275至大约370位，SEQ ID NO：3的大约第69至大约80位，SEQ ID NO：3的大约第88至大约95位，SEQ IDNO：3的大约第99至大约103位，SEQ ID NO：3的大约第119至大约123位，SEQ ID NO：3的大约第130至大约135位，SEQ ID NO：3的大约第152至大约163位，SEQ ID NO：3的大约第226至大约238位，SEQ ID NO：3的大约第275至大约279位，SEQ ID NO：3的大约第301至大约305位氨基酸残基组成的多肽；和/或包含或由SEQ ID NO：3的大约第362至大约367位氨基酸残基的多肽。文中“大约”包括特别指定的范围，及在一端或两端多或少几个(5，4，3，2或1个)核苷酸。如上所述，本发明人已经确定了上述多肽片段是TR7受体蛋白的抗原性区域。
携带表位的TR7肽和多肽可以通过任何常规方法产生。R.A.Houghten，“General Method for the Rapid Solid-Phase Synthesis ofLarge Numbers of Peptides：Specificity of Antigen-Antibody Interactionat the Level of Individual Amino Acids，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5131-5135(1985)。这个“同时多个肽合成(SMPS)”方法在Houghten等(1986)的美国专利No.4631211中进一步描述。
本领域技术人员能意识到，本发明所述TR7受体多肽及其携带表位的片段(例如相应于胞外结构域的一部分，例如SEQ ID NO：3的第52至184位氨基酸残基)可以与免疫球蛋白(IgG)的恒定结构域的部分组合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白便于纯化并示出体内半衰期延长。这已经，例如由人CD4多肽的前两个结构域与哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链恒定区的多个结构域组成的嵌合蛋白示出(EPA394827；Traunecker等，Nature 331：84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白比单独的单体TR7蛋白或蛋白质片段更有效结合及中和其它分子(Fountoulakis等，J.Biochem.270：3958-3964(1995))。TR7融合蛋白可用作免疫原以激发抗TR7抗体。因此，本发明的抗体可以结合包含完整或部分TR7多肽的融合蛋白的TR7部分。
本领域已知的重组DNA技术可以用于产生新的突变蛋白质或“突变蛋白(muteins)”，所述突变蛋白包括单个或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出，例如增强的活性或提高的稳定性。另外，至少在一定的纯化和贮存条件下，它们可以以较高产量纯化，并示出比相应的天然多肽更好的溶解性。本发明的抗体也可以结合这些修饰的TR7多肽或TR7多肽片段或变体。
例如，就许多蛋白质，包括膜结合蛋白的胞外结构域或者分泌蛋白的成熟形式，本领域已知可以在N末端或C末端缺失一或多个氨基酸而基本不丧失生物学功能，或者不丧失被特异性抗体结合的能力。然而，即使蛋白质N末端或C末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质的一或多种生物学功能被修饰或丧失，但仍可保留其它TR7功能活性。例如，在许多情况中，不管缺失的大小或位置，缩短的蛋白质的诱导和/或结合识别TR7的抗体(优选特异性结合TR7的抗体)的能力仍保留。事实上，由少如6个TR7氨基酸残基组成的肽通常就可能激发免疫应答。缺失完整蛋白质N末端和/或C末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫学活性，可以通过本文所述常规方法及本领域已知的其它方法容易地确定。
如上所述，即使蛋白质N末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质的一或多种生物学功能被修饰或丧失，但仍可保留其它功能活性(例如生物学活性，多聚体化能力，结合TR7配体的能力)。例如，当完整或成熟多肽的少于大部分的残基从N末端除去时，缩短的TR7多肽诱导和/或结合识别完整或成熟形式多肽的抗体的能力一般仍保留。缺失完整多肽N末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫学活性，可以通过本文所述常规方法及本领域已知的其它方法容易地确定。大量缺失N末端氨基酸残基的TR7多肽仍可保留一些生物学或免疫学活性不是不可能的。
因此，本发明进一步提供了结合多肽的抗体及编码这种多肽的多核苷酸，所述多肽中自SEQ ID NO：3的TR7氨基酸序列的氨基末端直至第406位丙氨酸残基缺失一或多个残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：3的第n5-411位残基的氨基酸序列，其中n5是相当于SEQ ID NO：3中氨基酸残基位置2-406之间的一个整数。
更特别地，本发明提供了结合包含或由以下氨基酸序列组成的多肽的抗体：SEQ ID NO：3所示的TR7序列的E2至S-411；Q-3至S-411；R-4至S-411；G-5至S-411；Q-6至S-411；N-7至S-411；A-8至S-411；P-9至S-411；A-10至S-411；A-11至S-411；S-12至S-411；G-13至S-411；A-14至S-411；R-15至S-411；K-16至S-411；R-17至S-411；H-18至S-411；G-19至S-411；P-20至S-411；G-21至S-411；P-22至S-411；R-23至S-411；E-24至S-411；A-25至S-411；R-26至S-411；G-27至S-411；A-28至S-411；R-29至S-411；P-30至S-411；G-31至S-411；P-32至S-411；R-33至S-411；V-34至S-411；P-35至S-411；K-36至S-411；T-37至S-411；L-38至S-411；V-39至S-411；L-40至S-411；V-41至S-411；V-42至S-411；A-43至S-411；A-44至S-411；V-45至S-411；L-46至S-411；L-47至S-411；L-48至S-411；V-49至S-411；S-50至S-411；A-51至S-411；E-52至S-411；S-53至S-411；A-54至S-411；L-55至S-411；I-56至S-411；T-57至S-411；Q-58至S-411；Q-59至S-411；D-60至S-411；L-61至S-411；A-62至S-411；P-63至S-411；Q-64至S-411；Q-65至S-411；R-66至S-411；A-67至S-411；A-68至S-411；P-69至S-411；Q-70至S-411；Q-71至S-411；K-72至S-411；R-73至S-411；S-74至S-411；S-75至S-411；P-76至S-411；S-77至S-411；E-78至S-411；G-79至S-411；L-80至S-411；C-81至S-411；P-82至S-411；P-83至S-411；G-84至S-411；H-85至S-411；H-86至S-411；I-87至S-411；S-88至S-411；E-89至S-411；D-90至S-411；G-91至S-411；R-92至S-411；D-93至S-411；C-94至S-411；I-95至S-411；S-96至S-411；C-97至S-411；K-98至S-411；Y-99至S-411；G-100至S-411；Q-101至S-411；D-102至S-411；Y-103至S-411；S-104至S-411；T-105至S-411；H-106至S-411；W-107至S-411；N-108至S-411；D-109至S-411；L-110至S-411；L-111至S-411；F-112至S-411；C-113至S-411；L-114至S-411；R-115至S-411；C-116至S-411；T-117至S-411；R-118至S-411；C-119至S-411；D-120至S-411；S-121至S-411；G-122至S-411；E-123至S-411；V-124至S-411；E-125至S-411；L-126至S-411；S-127至S-411；P-128至S-411；C-129至S-411；T-130至S-411；T-131至S-411；T-132至S-411；R-133至S-411；N-134至S-411；T-135至S-411；V-136至S-411；C-137至S-411；Q-138至S-411；C-139至S-411；E-140至S-411；E-141至S-411；G-142至S-411；T-143至S-411；F-144至S-411；R-145至S-411；E-146至S-411；E-147至S-411；D-148至S-411；S-149至S-411；P-150至S-411；E-151至S-411；M-152至S-411；C-153至S-411；R-154至S-411；K-155至S-411；C-156至S-411；R-157至S-411；T-158至S-411；G-159至S-411；C-160至S-411；P-161至S-411；R-162至S-411；G-163至S-411；M-164至S-411；V-165至S-411；K-166至S-411；V-167至S-411；G-168至S-411；D-169至S-411；C-170至S-411；T-171至S-411；P-172至S-411；W-173至S-411；S-174至S-411；D-175至S-411；I-176至S-411；E-177至S-411；C-178至S-411；V-179至S-411；H-180至S-411；K-181至S-411；E-182至S-411；S-183至S-411；G-184至S-411；I-185至S-411；I-186至S-411；I-187至S-411；G-188至S-411；V-189至S-411；T-190至S-411；V-191至S-411；A-192至S-411；A-193至S-411；V-194至S-411；V-195至S-411；L-196至S-411；I-197至S-411；V-198至S-411；A-199至S-411；V-200至S-411；F-201至S-411；V-202至S-411；C-203至S-411；K-204至S-411；S-205至S-411；L-206至S-411；L-207至S-411；W-208至S-411；K-209至S-411；K-210至S-411；V-211至S-411；L-212至S-411；P-213至S-411；Y-214至S-411；L-215至S-411；K-216至S-411；G-217至S-411；I-218至S-411；C-219至S-411；S-220至S-411；G-221至S-411；G-222至S-411；G-223至S-411；G-224至S-411；D-225至S-411；P-226至S-411；E-227至S-411；R-228至S-411；V-229至S-411；D-230至S-411；R-231至S-411；S-232至S-411；S-233至S-411；Q-234至S-411；R-235至S-411；P-236至S-411；G-237至S-411；A-238至S-411；E-239至S-411；D-240至S-411；N-241至S-411；V-242至S-411；L-243至S-411；N-244至S-411；E-245至S-411；I-246至S-411；V-247至S-411；S-248至S-411；I-249至S-411；L-250至S-411；Q-251至S-411；P-252至S-411；T-253至S-411；Q-254至S-411；V-255至S-411；P-256至S-411；E-257至S-411；Q-258至S-411；E-259至S-411；M-260至S-411；E-261至S-411；V-262至S-411；Q-263至S-411；E-264至S-411；P-265至S-411；A-266至S-411；E-267至S-411；P-268至S-411；T-269至S-411；G-270至S-411；V-271至S-411；N-272至S-411；M-273至S-411；L-274至S-411；S-275至S-411；P-276至S-411；G-277至S-411；E-278至S-411；S-279至S-411；E-280至S-411；H-281至S-411；L-282至S-411；L-283至S-411；E-284至S-411；P-285至S-411；A-286至S-411；E-287至S-411；A-288至S-411；E-289至S-411；R-290至S-411；S-291至S-411；Q-292至S-411；R-293至S-411；R-294至S-411；R-295至S-411；L-296至S-411；L-297至S-411；V-298至S-411；P-299至S-411；A-300至S-411；N-301至S-411；E-302至S-411；G-303至S-411；D-304至S-411；P-305至S-411；T-306至S-411；E-307至S-411；T-308至S-411；L-309至S-411；R-310至S-411；Q-311至S-411；C-312至S-411；F-313至S-411；D-314至S-411；D-315至S-411；F-316至S-411；A-317至S-411；D-318至S-411；L-319至S-411；V-320至S-411；P-321至S-411；F-322至S-411；D-323至S-411；S-324至S-411；W-325至S-411；E-326至S-411；P-327至S-411；L-328至S-411；M-329至S-411；R-330至S-411；K-331至S-411；L-332至S-411；G-333至S-411；L-334至S-411；M-335至S-411；D-336至S-411；N-337至S-411；E-338至S-411；I-339至S-411；K-340至S-411；V-341至S-411；A-342至S-411；K-343至S-411；A-344至S-411；E-345至S-411；A-346至S-411；A-347至S-411；G-348至S-411；H-349至S-411；R-350至S-411；D-351至S-411；T-352至S-411；L-353至S-411；Y-354至S-411；T-355至S-411；M-356至S-411；L-357至S-411；I-358至S-411；K-359至S-411；W-360至S-411；V-361至S-411；N-362至S-411；K-363至S-411；T-364至S-411；G-365至S-411；R-366至S-411；D-367至S-411；A-368至S-411；S-369至S-411；V-370至S-411；H-371至S-411；T-372至S-411；L-373至S-411；L-374至S-411；D-375至S-411；A-376至S-411；L-377至S-411；E-378至S-411；T-379至S-411；L-380至S-411；G-381至S-411；E-382至S-411；R-383至S-411；L-384至S-411；A-385至S-411；K-386至S-411；Q-387至S-411；K-388至S-411；I-389至S-411；E-390至S-411；D-391至S-411；H-392至S-411；L-393至S-411；L-394至S-411；S-395至S-411；S-396至S-411；G-397至S-411；K-398至S-411；F-399至S-411；M-400至S-411；Y-401至S-411；L-402至S-411；E-403至S-411；G-404至S-411；N-405至S-411；和/或A-406至S-411。
在另一个实施方案中，TR7多肽的N末端缺失可以用通式n6-184描述，其中n6是相当于SEQ ID NO：3所鉴别的氨基酸序列的1-179之间的一个数。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由以下残基的氨基酸序列组成的TR7的N末端缺失：SEQ ID NO：3所示的TR7胞外结构域序列的E-2至G-184；Q-3至G-184；R-4至G-184；G-5至G-184；Q-6至G-184；N-7至G-184；A-8至G-184；P-9至G-184；A-10至G-184；A-11至G-184；S-12至G-184；G-13至G-184；A-14至G-184；R-15至G-184；K-16至G-184；R-17至G-184；H-18至G-184；G-19至G-184；P-20至G-184；G-21至G-184；P-22至G-184；R-23至G-184；E-24至G-184；A-25至G-184；R-26至G-184；G-27至G-184；A-28至G-184；R-29至G-184；P-30至G-184；G-31至G-184；P-32至G-184；R-33至G-184；V-34至G-184；P-35至G-184；K-36至G-184；T-37至G-184；L-38至G-184；V-39至G-184；L-40至G-184；V-41至G-184；V-42至G-184；A-43至G-184；A-44至G-184；V-45至G-184；L-46至G-184；L-47至G-184；L-48至G-184；V-49至G-184；S-50至G-184；A-51至G-184；E-52至G-184；S-53至G-184；A-54至G-184；L-55至G-184；I-56至G-184；T-57至G-184；Q-58至G-184；Q-59至G-184；D-60至G-184；L-61至G-184；A-62至G-184；P-63至G-184；Q-64至G-184；Q-65至G-184；R-66至G-184；A-67至G-184；A-68至G-184；P-69至G-184；Q-70至G-184；Q-71至G-184；K-72至G-184；R-73至G-184；S-74至G-184；S-75至G-184；p-76至G-184；S-77至G-184；E-78至G-184；G-79至G-184；L-80至G-184；C-81至G-184；P-82至G-184；P-83至G-184；G-84至G-184；H-85至G-184；H-86至G-184；I-87至G-184；S-88至G-184；E-89至G-184；D-90至G-184；G-91至G-184；R-92至G-184；D-93至G-184；C-94至G-184；I-95至G-184；S-96至G-184；C-97至G-184；K-98至G-184；Y-99至G-184；G-100至G-184；Q-101至G-184；D-102至G-184；Y-103至G-184；S-104至G-184；T-105至G-184；H-106至G-184；W-107至G-184；N-108至G-184；D-109至G-184；L-110至G-184；L-111至G-184；F-112至G-184；C-113至G-184；L-114至G-184；R-115至G-184；C-116至G-184；T-117至G-184；R-118至G-184；C-119至G-184；D-120至G-184；S-121至G-184；G-122至G-184；E-123至G-184；V-124至G-184；E-125至G-184；L-126至G-184；S-127至G-184；P-128至G-184；C-129至G-184；T-130至G-184；T-131至G-184；T-132至G-184；R-133至G-184；N-134至G-184；T-135至G-184；V-136至G-184；C-137至G-184；Q-138至G-184；C-139至G-184；E-140至G-184；E-141至G-184；G-142至G-184；T-143至G-184；F-144至G-184；R-145至G-184；E-146至G-184；E-147至G-184；D-148至G-184；S-149至G-184；P-150至G-184；E-151至G-184；M-152至G-184；C-153至G-184；R-154至G-184；K-155至G-184；C-156至G-184；R-157至G-184；T-158至G-184；G-159至G-184；C-160至G-184；P-161至G-184；R-162至G-184；G-163至G-184；M-164至G-184；V-165至G-184；K-166至G-184；V-167至G-184；G-168至G-184；D-169至G-184；C-170至G-184；T-171至G-184；P-172至G-184；W-173至G-184；S-174至G-184；D-175至G-184；I-176至G-184；E-177至G-184；C-178至G-184；和/或V-179至G-184。
如上所述，即使蛋白质C末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质被修饰而丧失一或多种生物学功能，但其它功能活性(例如生物学活性，多聚体化能力，结合TR7配体(例如TRAIL)的能力)仍可保留。例如当从C末端除去完整或成熟多肽的少部分(less than a majority)残基时，缩短的TR7多肽诱导和/或结合识别完整或成熟形式TR7多肽的抗体的能力仍会保留。缺失完整多肽C末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫学活性可以通过本文所述常规方法及本领域已知的其它方法确定。缺失大量C末端氨基酸残基的TR7多肽仍保留一些生物学活性或免疫原性活性不是不可能的。事实上，由少如6个TR7氨基酸残基组成的肽通常就能激发免疫应答。
因此，本发明进一步提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽自SEQ ID NO：3的TR7多肽氨基酸序列的羧基末端直至第52位谷氨酸残基缺失一或多个残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：3的第52-m5位残基的氨基酸序列，其中m5是相当于SEQ ID NO：3中氨基酸残基位置57-410之间的一个整数。
更特别地，本发明提供了结合包含或由以下残基的氨基酸序列组成的多肽的抗体：SEQ ID NO：3所示的TR7序列的E-52至M-410；E-52至A-409；E-52至S-408；E-52至D-407；E-52至A-406；E-52至N-405；E-52至G-404；E-52至E-403；E-52至L-402；E-52至Y-401；E-52至M-400；E-52至F-399；E-52至K-398；E-52至G-397；E-52至S-396；E-52至S-395；E-52至L-394；E-52至L-393；E-52至H-392；E-52至D-391；E-52至E-390；E-52至I-389；E-52至K-388；E-52至Q-387；E-52至K-386；E-52至A-385；E-52至L-384；E-52至R-383；E-52至E-382；E-52至G-381；E-52至L-380；E-52至T-379；E-52至E-378；E-52至L-377；E-52至A-376；E-52至D-375；E-52至L-374；E-52至L-373；E-52至T-372；E-52至H-371；E-52至V-370；E-52至S-369；E-52至A-368；E-52至D-367；E-52至R-366；E-52至G-365；E-52至T-364；E-52至K-363；E-52至N-362；E-52至V-361；E-52至W-360；E-52至K-359；E-52至I-358；E-52至L-357；E-52至M-356；E-52至T-355；E-52至Y-354；E-52至L-353；E-52至T-352；E-52至D-351；E-52至R-350；E-52至H-349；E-52至G-348；E-52至A-347；E-52至A-346；E-52至E-345；E-52至A-344；E-52至K-343；E-52至A-342；E-52至V-341；E-52至K-340；E-52至I-339；E-52至E-338；E-52至N-337；E-52至D-336；E-52至M-335；E-52至L-334；E-52至G-333；E-52至L-332；E-52至K-331；E-52至R-330；E-52至M-329；E-52至L-328；E-52至P-327；E-52至E-326；E-52至W-325；E-52至S-324；E-52至D-323；E-52至F-322；E-52至P-321；E-52至V-320；E-52至L-319；E-52至D-318；E-52至A-317；E-52至F-316；E-52至D-315；E-52至D-314；E-52至F-313；E-52至C-312；E-52至Q-311；E-52至R-310；E-52至L-309；E-52至T-308；E-52至E-307；E-52至T-306；E-52至P-305；E-52至D-304；E-52至G-303；E-52至E-302；E-52至N-301；E-52至A-300；E-52至P-299；E-52至V-298；E-52至L-297；E-52至L-296；E-52至R-295；E-52至R-294；E-52至R-293；E-52至Q-292；E-52至S-291；E-52至R-290；E-52至E-289；E-52至A-288；E-52至E-287；E-52至A-286；E-52至P-285；E-52至E-284；E-52至L-283；E-52至L-282；E-52至H-281；E-52至E-280；E-52至S-279；E-52至E-278；E-52至G-277；E-52至P-276；E-52至S-275；E-52至L-274；E-52至M-273；E-52至N-272；E-52至V-271；E-52至G-270；E-52至T-269；E-52至P-268；E-52至E-267；E-52至A-266；E-52至P-265；E-52至E-264；E-52至Q-263；E-52至V-262；E-52至E-261；E-52至M-260；E-52至E-259；E-52至Q-258；E-52至E-257；E-52至P-256；E-52至V-255；E-52至Q-254；E-52至T-253；E-52至P-252；E-52至Q-251；E-52至L-250；E-52至I-249；E-52至S-248；E-52至V-247；E-52至I-246；E-52至E-245；E-52至N-244；E-52至L-243；E-52至V-242；E-52至N-241；E-52至D-240；E-52至E-239；E-52至A-238；E-52至G-237；E-52至P-236；E-52至R-235；E-52至Q-234；E-52至S-233；E-52至S-232；E-52至R-231；E-52至D-230；E-52至V-229；E-52至R-228；E-52至E-227；E-52至P-226；E-52至D-225；E-52至G-224；E-52至G-223；E-52至G-222；E-52至G-221；E-52至S-220；E-52至C-219；E-52至I-218；E-52至G-217；E-52至K-216；E-52至L-215；E-52至Y-214；E-52至P-213；E-52至L-212；E-52至V-211；E-52至K-210；E-52至K-209；E-52至W-208；E-52至L-207；E-52至L-206；E-52至S-205；E-52至K-204；E-52至C-203；E-52至V-202；E-52至F-201；E-52至V-200；E-52至A-199；E-52至V-198；E-52至I-197；E-52至L-196；E-52至V-195；E-52至V-194；E-52至A-193；E-52至A-192；E-52至V-191；E-52至T-190；E-52至V-189；E-52至G-188；E-52至I-187；E-52至I-86；E-52至I-185；E-52至G-184；E-52至S-183；E-52至E-182；E-52至K-181；E-52至H-180；E-52至V-179；E-52至C-178；E-52至E-177；E-52至I-176；E-52至D-175；E-52至S-174；E-52至W-173；E-52至P-172；E-52至T-171；E-52至C-170；E-52至D-169；E-52至G-168；E-52至V-167；E-52至K-166；E-52至V-165；E-52至M-164；E-52至G-163；E-52至R-162；E-52至P-161；E-52至C-160；E-52至G-159；E-52至T-158；E-52至R-157；E-52至C-156；E-52至K-155；E-52至R-154；E-52至C-153；E-52至M-152；E-52至E-151；E-52至P-150；E-52至S-149；E-52至D-148；E-52至E-147；E-52至E-146；E-52至R-145；E-52至F-144；E-52至T-143；E-52至G-142；E-52至E-141；E-52至E-140；E-52至C-139；E-52至Q-138；E-52至C-137；E-52至V-136；E-52至T-135；E-52至N-134；E-52至R-133；E-52至T-132；E-52至T-131；E-52至T-130；E-52至C-129；E-52至P-128；E-52至S-127；E-52至L-126；E-52至E-125；E-52至V-124；E-52至E-123；E-52至G-122；E-52至S-121；E-52至D-120；E-52至C-119；E-52至R-118；E-52至T-117；E-52至C-116；E-52至R-115；E-52至L-114；E-52至C-113；E-52至F-112；E-52至L-111；E-52至L-110；E-52至D-109；E-52至N-108；E-52至W-107；E-52至H-106；E-52至T-105；E-52至S-104；E-52至Y-103；E-52至D-102；E-52至Q-101；E-52至G-100；E-52至Y-99；E-52至K-98；E-52至C-97；E-52至S-96；E-52至I-95；E-52至C-94；E-52至D-93；E-52至R-92；E-52至G-91；E-52至D-90；E-52至E-89；E-52至S-88；E-52至I-87；E-52至H-86；E-52至H-85；E-52至G-84；E-52至P-83；E-52至P-82；E-52至C-81；E-52至L-80；E-52至G-79；E-52至E-78；E-52至S-77；E-52至P-76；E-52至S-75；E-52至S-74；E-52至R-73；E-52至K-72；E-52至Q-71；E-52至Q-70；E-52至P-69；E-52至A-68；E-52至A-67；E-52至R-66；E-52至Q-65；E-52至Q-64；E-52至P-63；E-52至A-62；E-52至L-b1；E-52至D-60；E-52至Q-59；E-52至Q-58；和/或E-52至T-57。
在另一个实施方案中，本发明的抗体结合可以用通式52-m6描述的TR7多肽的C末端缺失，其中m6是相当于SEQ ID NO：3所鉴别的氨基酸序列位置57-183之间的一个数。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由以下氨基酸残基组成的TR7多肽的C末端缺失：SEQ ID NO：3所示TR7胞外结构域序列的E-52至S-183；E-52至E-182；E-52至K-181；E-52至H-180；E-52至V-179；E-52至C-178；E-52至E-177；E-52至I-176；E-52至D-175；E-52至S-174；E-52至W-173；E-52至P-172；E-52至T-171；E-52至C-170；E-52至D-169；E-52至G-168；E-52至V-167；E-52至K-166；E-52至V-165；E-52至M-164；E-52至G-163；E-52至R-162；E-52至P-161；E-52至C-160；E-52至G-159；E-52至T-158；E-52至R-157；E-52至C-156；E-52至K-155；E-52至R-154；E-52至C-153；E-52至M-152；E-52至E-151；E-52至P-150；E-52至S-149；E-52至D-148；E-52至E-147；E-52至E-146；E-52至R-145；E-52至F-144；E-52至T-143；E-52至G-142；E-52至E-141；E-52至E-140；E-52至C-139；E-52至Q-138；E-52至C-137；E-52至V-136；E-52至T-135；E-52至N-134；E-52至R-133；E-52至T-132；E-52至T-131；E-52至T-130；E-52至C-129；E-52至P-128；E-52至S-127；E-52至L-126；E-52至E-125；E-52至V-124；E-52至E-123；E-52至G-122；E-52至S-121；E-52至D-120；E-52至C-119；E-52至R-118；E-52至T-117；E-52至C-116；E-52至R-115；E-52至L-114；E-52至C-113；E-52至F-112；E-52至L-111；E-52至L-110；E-52至D-109；E-52至N-108；E-52至W-107；E-52至H-106；E-52至T-105；E-52至S-104；E-52至Y-103；E-52至D-102；E-52至Q-101；E-52至G-100；E-52至Y-99；E-52至K-98；E-52至C-97；E-52至S-96；E-52至I-95；E-52至C-94；E-52至D-93；E-52至R-92；E-52至G-91；E-52至D-90；E-52至E-89；E-52至S-88；E-52至I-87；E-52至H-86；E-52至H-85；E-52至G-84；E-52至P-83；E-52至P-82；E-52至C-81；E-52至L-80；E-52至G-79；E-52至E-78；E-52至S-77；E-52至P-76；E-52至S-75；E-52至S-74；E-52至R-73；E-52至K-72；E-52至Q-71；E-52至Q-70；E-52至P-69；E-52至A-68；E-52至A-67；E-52至R-66；E-52至Q-65；E-52至Q-64；E-52至P-63；E-52至A-62；E-52至L-61；E-52至D-60；E-52至Q-59；E-52至Q-58；和/或E-52至T-57。
本发明还提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽具有自SEQ IDNO：3的TR7多肽的氨基和羧基末端缺失一或多个氨基酸，其一般可描述为具有SEQ ID NO：3的n5-m5和/或n6-m6残基，其中n5，n6，m5和m6是如上述的整数。
本发明还包括结合如下多肽的抗体，所述多肽由ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA克隆所编码的完整TR7氨基酸序列的一部分组成，其中该部分不包括ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列的氨基末端的1至约78个氨基酸，或者不包括ATCC保藏物No.97920中包含的cDNA克隆所编码的完整TR7氨基酸序列羧基末端的1至约233个氨基酸，或者是上述氨基末端和羧基末端缺失的任意组合。
优选地，本发明抗体结合N末端和C末端缺失突变体，所述突变体仅包含胞外结构域的一部分，即在SEQ ID NO：3的第52至184位残基内，因为在此残基范围内的任何部分均预期是可溶的。
本领域能意识到TR7的一些氨基酸序列可以加以变化而不明显影响该蛋白质的结构和功能。如果这种序列差异是预期的，应记得蛋白质上应存在决定活性的关键区域。这种区域通常包含组成配体结合位点或死亡结构域的残基，或者形成影响这些结构域的三级结构的残基。
因此，本发明进一步包括结合TR7蛋白变体的抗体，所述变体示出基本的TR7蛋白活性或包括诸如下述蛋白质片段的TR7区域。这些突变体包括缺失，插入，翻转，重复和典型取代。关于氨基酸变化可能是表型沉默的指导可见于Bowie，J.U.等，Science 247：1306-1310(1990)。
因此，本发明抗体可以结合SEQ ID NO：3的多肽或者由ATCC保藏物No.97920中的cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物。这类片段，变体或衍生物可以是(i)这样的片段、变体或衍生物，其中至少一或多个氨基酸残基由保守或非保守的氨基酸残基(优选保守氨基酸残基，更优选至少1个但少于10个保守氨基酸残基)取代，而且这种取代的氨基酸残基可以是或不是遗传密码编码的氨基酸残基，或者(ii)这样的片段、变体或衍生物，其中一或多个氨基酸残基包括一个取代基团，或者(iii)这样的片段、变体或衍生物，其中成熟多肽与另一种化合物融合，如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)这样的片段、变体或衍生物，其中额外的氨基酸融合于成熟多肽，如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。根据本发明的指导，相信这些片段，衍生物和类似物在本领域技术人员技术范围内。
特别感兴趣的是荷电氨基酸由另一种荷电氨基酸及由中性或负电荷氨基酸的取代。后者产生正电荷减少的蛋白质，以改良TR7蛋白的特性。特别需要防止聚集。蛋白质的聚集不仅导致活性丧失，而且当制备药物配方时也会产生问题，因为它们可以是免疫原性的(Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2：331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36：838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier System 10：307-377(1993))。
氨基酸置换也可以改变与细胞表面受体结合的选择性。Ostade等，Nature 361：266-268(1993)描述了导致TNF-α只选择性结合两种已知类型TNF受体之一的一些突变。因此，本发明的抗体可以结合一种TR7受体，其含有来自天然突变或人工操纵的一或多个氨基酸取代、缺失或添加。
正如所表明的，氨基酸变化优选是性质改变小的变化，如不明显影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代(见表3)。
表3：保守氨基酸取代
| 芳香族疏水性极性碱性酸性小型 | 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸亮氨酸异亮氨酸缬氨酸谷氨酰胺天冬酰胺精氨酸赖氨酸组氨酸天冬氨酸谷氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸甘氨酸 |
在特异的实施方案中，SEQ ID NO：3的氨基酸序列和/或本发明所述任何多肽片段(例如胞外结构域)中的取代、添加或缺失数是75，70，60，50，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或30-20，20-15，20-10，15-10，10-1，5-10，1-5，1-3或1-2个。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体(尤其包含或由TR7的胞外可溶结构域组成的片段)，所述多肽或其片段或变体含有任意一个或多个以下TR7中的保守突变：SEQID NO：3的残基的如下置换，M1用A，G，I，L，S，T或V代替；E2用D代替；Q3用N代替；R4用H或K代替；G5用A，I，L，S，T，M或V代替；Q6用N代替；N7用Q代替；A8用G，I，L，S，T，M或V代替；A10用G，I，L，S，T，M或V代替；A11用G，I，L，S，T，M或V代替；S12用A，G，I，L，T，M或V代替；G13用A，I，L，S，T，M或V代替；A14用G，I，L，S，T，M或V代替；R15用H或K代替，K16用H或R代替；R17用H或K代替；H18用K或R代替；G19用A，G，I，L，S，T，M或V代替；G21用A，I，L，S，T，M或V代替；R23用H或K代替；E24用D代替；A25用G，I，L，S，T，M或V代替；R26用H或K代替；G27用A，I，L，S，T，M或V代替；A28用G，I，L，S，T，M或V代替；R29用H或K代替；G31用A，I，L，S，T，M或V代替；R33用H或K代替；V34用A，G，I，L，S，T或M代替；K36用H或R代替；T37用A，G，I，L，S，M或V代替；L38用A，G，I，S，T，M或V代替；V39用A，G，I，L，S，T或M代替；L40用A，G，I，S，T，M或V代替；V41用A，G，I，L，S，T或M代替；V42用A，G，I，L，S，T或M代替；A43用G，I，L，S，T，M或V代替；A44用G，I，L，S，T，M或V代替；V45用A，G，I，L，S，T或M代替；L46用A，G，I，S，T，M或V代替；L47用A，G，I，S，T，M或V代替；L48用A，G，I，S，T，M或V代替；V49用A，G，I，L，S，T或M代替；S50用A，G，I，L，T，M或V代替；A51用G，I，L，S，T，M或V代替；E52用D代替；S53用A，G，I，L，T，M或V代替；A54用G，I，L，S，T，M或V代替；L55用A，G，I，S，T，M或V代替；I56用A，G，L，S，T，M或V代替；T57用A，G，I，L，S，M或V代替Q58用N代替；Q59用N代替；D60用E代替；L61用A，G，I，S，T，M或V代替；A62用G，I，L，S，T，M或V代替；Q64用N代替；Q65用N代替；R66用H或K代替；A67用G，I，L，S，T，M或V代替；A68用G，I，L，S，T，M或V代替；Q70用N代替；Q71用N代替；K72用H或R代替；R73用H或K代替；S74用A，G，I，L，T，M或V代替；S75用A，G，I，L，T，M或V代替；S77用A，G，I，L，T，M或V代替；E78用D代替；G79用A，I，L，S，T，M或V代替；L80用A，G，I，S，T，M或V代替；G84用A，I，L，S，T，M或V代替；H85用K或R代替；H86用K或R代替；I87用A，G，L，S，T，M或V代替；S88用A，G，I，L，T，M或V代替；E89用D代替；D90用E代替；G91用A，I，L，S，T，M或V代替；R92用H或K代替；D93用E代替；I95用A，G，L，S，T，M或V代替；S96用A，G，I，L，T，M或V代替；K98用H或R代替；Y99用F或W代替；G100用A，I，L，S，T，M或V代替；Q101用N代替；D102用E代替；Y103用F或W代替；S104用A，G，I，L，T，M或V代替；T105用A，G，I，L，S，M或V代替；H106用K或R代替；W107用F或Y代替；N108用Q代替；D109用E代替；L110用A，G，I，S，T，M或V代替；L111用A，G，I，S，T，M或V代替；F112用W或Y代替；L114用A，G，I，S，T，M或V代替；R115用H或K代替；T117用A，G，I，L，S，M或V代替；R118用H或K代替；D120用E代替；S121用A，G，I，L，T，M或V代替；G122用A，I，L，S，T，M或V代替；E123用D代替；V124用A，G，I，L，S，T或M代替；E125用D代替；L126用A，G，I，S，T，M或V代替；S127用A，G，I，L，T，M或V代替；T130用A，G，I，L，S，M或V代替；T131用A，G，I，L，S，M或V代替；T132用A，G，I，L，S，M或V代替；R133用H或K代替；N134用Q代替；T135用A，G，I，L，S，M或V代替；V136用A，G，I，L，S，T或M代替；Q138用N代替；E140用D代替；E141用D代替；G142用A，I，L，S，T，M或V代替；T143用A，G，I，L，S，M或V代替；F144用W或Y代替；R145用H或K代替；E146用D代替；E147用D代替；D148用E代替；S149用A，G，I，L，T，M或V代替；E151用D代替；M152用A，G，I，L，S，T或V代替；R154用H或K代替；K155用H或R代替；R157用H或K代替；T158用A，G，I，L，S，M或V代替；G159用A，I，L，S，T，M或V代替；R162用H或K代替；G163用A，I，L，S，T，M或V代替；M164用A，G，I，L，S，T或V代替；V165用A，G，I，L，S，T或M代替；K166用H或R代替；V167用A，G，I，L，S，T或M代替；G168用A，I，L，S，T，M或V代替；D169用E代替；T171用A，G，I，L，S，M或V代替；W173用F或Y代替；S174用A，G，I，L，T，M或V代替；D175用E代替；I176用A，G，L，S，T，M或V代替；E177用D代替；V179用A，G，I，L，S，T或M代替；H180用K或R代替；K181用H或R代替；E182用D代替；S183用A，G，I，L，T，M或V代替；G184用A，I，L，S，T，M或V代替；I185用A，G，L，S，T，M或V代替；I186用A，G，L，S，T，M或V代替；I187用A，G，L，S，T，M或V代替；G188用A，I，L，S，T，M或V代替；V189用A，G，I，L，S，T或M代替；T190用A，G，I，L，S，M或V代替；V191用A，G，I，L，S，T或M代替；A192用G，I，L，S，T，M或V代替；A193用G，I，L，S，T，M或V代替；V194用A，G，I，L，S，T或M代替；V195用A，G，I，L，S，T或M代替；L196用A，G，I，S，T，M或V代替；I197用A，G，L，S，T，M或V代替；V198用A，G，I，L，S，T或M代替；A199用G，I，L，S，T，M或V代替；V200用A，G，I，L，S，T或M代替；F201用W或Y代替；V202用A，G，I，L，S，T或M代替；K204用H或R代替；S205用A，G，I，L，T，M或V代替；L206用A，G，I，S，T，M或V代替；L207用A，G，I，S，T，M或V代替；W208用F或Y代替；K209用H或R代替；K210用H或R代替；V211用A，G，I，L，S，T或M代替；L212用A，G，I，S，T，M或V代替；Y214用F或W代替；L215用A，G，I，S，T，M或V代替；K216用H或R代替；G217用A，I，L，S，T，M或V代替；I218用A，G，L，S，T，M或V代替；S220用A，G，I，L，T，M或V代替；G221用A，I，L，S，T，M或V代替；G222用A，I，L，S，T，M或V代替；G223用A，I，L，S，T，M或V代替；G224用A，I，L，S，T，M或V代替；D225用E代替；E227用D代替；R228用H或K代替；V229用A，G，I，L，S，T或M代替；D230用E代替；R231用H或K代替；S232用A，G，I，L，T，M或V代替；S233用A，G，I，L，T，M或V代替；Q234用N代替；R235用H或K代替；G237用A，I，L，S，T，M或V代替；A238用G，I，L，S，T，M或V代替；E239用D代替；D240用E代替；N241用Q代替；V242用A，G，I，L，S，T或M代替；L243用A，G，I，S，T，M或V代替；N244用Q代替；E245用D代替；I246用A，G，L，S，T，M或V代替；V247用A，G，I，L，S，T或M代替；S248用A，G，I，L，T，M或V代替；I249用A，G，L，S，T，M或V代替；L250用A，G，I，S，T，M或V代替；Q251用N代替；T253用A，G，I，L，S，M或V代替；Q254用N代替；V255用A，G，I，L，S，T或M代替；E257用D代替；Q258用N代替；E259用D代替；M260用A，G，I，L，S，T或V代替；E261用D代替；V262用A，G，I，L，S，T或M代替；Q263用N代替；E264用D代替；A266用G，I，L，S，T，M或V代替；E267用D代替；T269用A，G，I，L，S，M或V代替；G270用A，I，L，S，T，M或V代替；V271用A，G，I，L，S，T或M代替；N272用Q代替；M273用A，G，I，L，S，T或V代替；L274用A，G，I，S，T，M或V代替；S275用A，G，I，L，T，M或V代替；G277用A，I，L，S，T，M或V代替；E278用D代替；S279用A，G，I，L，T，M或V代替；E280用D代替；H281用K或R代替；L282用A，G，I，S，T，M或V代替；L283用A，G，I，S，T，M或V代替；E284用D代替；A286用G，I，L，S，T，M或V代替；E287用D代替；A288用G，I，L，S，T，M或V代替；E289用D代替；R290用H或K代替；S291用A，G，I，L，T，M或V代替；Q292用N代替；R293用H或K代替；R294用H或K代替；R295用H或K代替；L296用A，G，I，S，T，M或V代替；L297用A，G，I，S，T，M或V代替；V298用A，G，I，L，S，T或M代替；A300用G，I，L，S，T，M或V代替；N301用Q代替；E302用D代替；G303用A，I，L，S，T，M或V代替；D304用E代替；T306用A，G，I，L，S，M或V代替；E307用D代替；T308用A，G，I，L，S，M或V代替；L309用A，G，I，S，T，M或V代替；R310用H或K代替；Q311用N代替；F313用W或Y代替；D314用E代替；D315用E代替；F316用W或Y代替；A317用G，I，L，S，T，M或V代替；D318用E代替；L319用A，G，I，S，T，M或V代替；V320用A，G，I，L，S，T或M代替；F322用W或Y代替；D323用E代替；S324用A，G，I，L，T，M或V代替；W325用F或Y代替；E326用D代替；L328用A，G，I，S，T，M或V代替；M329用A，G，I，L，S，T或V代替；R330用H或K代替；K331用H或R代替；L332用A，G，I，S，T，M或V代替；M335用A，G，I，L，S，T或V代替；D336用E代替；N337用Q代替；E338用D代替；I339用A，G，L，S，T，M或V代替；K340用H或R代替；V341用A，G，I，L，S，T或M代替；A342用G，I，L，S，T，M或V代替；K343用H或R代替；A344用G，I，L，S，T，M或V代替；E345用D代替；A346用G，I，L，S，T，M或V代替；A347用G，I，L，S，T，M或V代替；G348用A，I，L，S，T，M或V代替；H349用K或R代替；R350用H或K代替；D351用E代替；T352用A，G，I，L，S，M或V代替；L353用A，G，I，S，T，M或V代替；Y354用F或W代替；T355用A，G，I，L，S，M或V代替；M356用A，G，I，L，S，T或V代替；L357用A，G，I，S，T，M或V代替；I358用A，G，L，S，T，M或V代替；K359用H或R代替；W360用F或Y代替；V361用A，G，I，L，S，T或M代替；N362用Q代替；K363用H或R代替；T364用A，G，I，L，S，M或V代替；G365用A，I，L，S，T，M或V代替；R366用H或K代替；D367用E代替；A368用G，I，L，S，T，M或V代替；S369用A，G，I，L，T，M或V代替；V370用A，G，I，L，S，T或M代替；H371用K或R代替；T372用A，G，I，L，S，M或V代替；L373用A，G，I，S，T，M或V代替；L374用A，G，I，S，T，M或V代替；D375用E代替；A376用G，I，L，S，T，M或V代替；L377用A，G，I，S，T，M或V代替；E378用D代替；T379用A，G，I，L，S，M或V代替；L380用A，G，I，S，T，M或V代替；G381用A，I，L，S，T，M或V代替；E382用D代替；R383用H或K代替；L384用A，G，I，S，T，M或V代替；A385用G，I，L，S，T，M或V代替；K386用H或R代替；Q387用N代替；K388用H或R代替；I389用A，G，L，S，T，M或V代替；E390用D代替；D391用E代替；H392用K或R代替；L393用A，G，I，S，T，M或V代替；L394用A，G，I，S，T，M或V代替；S395用A，G，I，L，T，M或V代替；S396用A，G，I，L，T，M或V代替；G397用A，I，L，S，T，M或V代替；K398用H或R代替；F399用W或Y代替；M400用A，G，I，L，S，T或V代替；Y401用F或W代替；L402用A，G，I，S，T，M或V代替；E403用D代替；G404用A，I，L，S，T，M或V代替；N405用Q代替；A406用G，I，L，S，T，M或V代替；D407用E代替；S408用A，G，I，L，T，M或V代替；A409用G，I，L，S，T，M或V代替；M410用A，G，I，L，S，T或V代替；或/和S411用A，G，I，L，T，M或V代替。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体(尤其是包含或由TR7的胞外可溶结构域组成的片段)，所述多肽或其片段或变体含有任意一个或多个以下TR7中的非保守突变：SEQ ID NO：3的残基的如下置换，M1用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E2用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q3用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；R4用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G5用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q6用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；N7用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；A8用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P9用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；A10用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A11用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S12用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G13用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A14用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R15用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K16用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R17用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H18用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G19用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P20用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G21用D，E，H，K，R，N，Q，F，Q，Y，P或C代替；P22用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；R23用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E24用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A25用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R26用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G27用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A28用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R29用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P30用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G31用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P32用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；R33用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V34用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P35用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；K36用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T37用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C；L38用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V39用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L40用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V41用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V42用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A43用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A44用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V45用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L46用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L47用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L48用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V49用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S50用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A51用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E52用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S53用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A54用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L55用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I56用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T57用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q58用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；Q59用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；D60用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L61用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A62用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P63用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；Q64用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；Q65用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；R66用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A67用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A68用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P69用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；Q70用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；Q71用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；K72用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R73用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S74用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S75用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P76用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；S77用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E78用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G79用D，E，H， K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L80用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C81用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；P82用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；P83用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G84用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H85用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H86用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I87用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S88用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E89用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D90用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G91用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R92用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D93用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C94用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；I95用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S96用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C97用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；K98用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Y99用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；G100用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q101用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；D102用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Y103用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；S104用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T105用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H106用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；W107用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；N108用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；D109用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L110用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L111用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F112用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；C113用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；L114用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R115用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C116用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；T117用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R118用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C119用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；D120用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S121用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G122用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E123用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V124用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E125用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L126用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S127用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P128用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；C129用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；T130用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T131用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T132用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R133用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N134用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；T135用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V136用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C137用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；Q138用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；C139用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；E140用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E141用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；0142用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T143用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F144用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；R145用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E146用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E147用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D148用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S149用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P150用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；E151用H，K，R，A，G，I，L，S.T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M152用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C153用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；R154用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K155用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C156用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；R157用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T158用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G159用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C160用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；P161用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；R162用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G163用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M164用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V165用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K166用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V167用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G168用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D169用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C170用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；T171用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P172用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；W173用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；S174用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D175用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I176用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E177用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C178用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；V179用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H180用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V.N，Q，F，W，Y，P或C代替；K181用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E182用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S183用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G184用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I185用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I186用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I187用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G188用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V189用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T190用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V191用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A192用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A193用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V194用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V195用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L196用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I197用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V198用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A199用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V200用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F201用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V202用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C203用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；K204用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S205用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L206用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L207用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；W208用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；K209用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K210用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V211用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L212用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P213用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；Y214用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；L215用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K216用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G217用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I218用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C219用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；S220用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G221用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G222用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G223用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G224用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D225用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P226用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；E227用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R228用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V229用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D230用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R231用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S232用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S233用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q234用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；R235用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P236用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G237用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A238用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E239用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D240用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N241用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；V242用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L243用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N244用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；E245用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I246用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V247用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S248用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I249用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L250用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q251用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；P252用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；T253用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q254用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；V255用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P256用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；E257用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q258用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；E259用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M260用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E261用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V262用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q263用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；E264用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P265用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；A266用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E267用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P268用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；T269用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G270用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V271用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N272用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；M273用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L274用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S275用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P276用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G277用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E278用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S279用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P280用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H281用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L282用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L283用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E284用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P285用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；A286用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E287用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A288用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E289用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R290用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S291用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q292用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；R293用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R294用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R295用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L296用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L297用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V298用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P299用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；A300用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N301用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；E302用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G303用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D304用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P305用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C；T306用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E307用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T308用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L309用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R310用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q311用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；C312用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；F313用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D314用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D315用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F316用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；A317用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D318用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C代替；L319用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V320用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P321用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；F322用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D323用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S324用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；W325用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；E326用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P327用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；L328用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M329用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R330用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C；K331用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L332用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G333用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L334用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M335用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D336用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N337用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；E338用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I339用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K340用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V341用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A342用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K343用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A344用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E345用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A346用D，R，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A347用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G348用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H349用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，P，W，Y，P或C代替；R350用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D351用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T352用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L353用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Y354用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；T355用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M356用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L357用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I358用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K359用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；W360用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V361用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N362用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；K363用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T364用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G365用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R366用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D367用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A368用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S369用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V370用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H371用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T372用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L373用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L374用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D375用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A376用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L377用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E378用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T379用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L380用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G381用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E382用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R383用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L384用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C，A385用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K386用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q387用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；K388用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I389用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E390用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D391用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H392用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L393用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L394用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S395用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S396用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G397用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K398用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F399用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S.T，M，V，P或C代替；M400用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Y401用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；L402用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E403用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G404用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N405用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；A406用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D407用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S408用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A409用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M410用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；和/或S411用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C代替。
本发明TR7蛋白质中为功能所需的氨基酸可以通过本领域已知方法鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后一方法是在分子的每个残基导入单一的丙氨酸突变。然后将所得突变分子测试生物学活性如受体结合或者体外或体内增殖活性。对配体-受体结合非常关键的位点也可以通过结构分析确定，如结晶，核磁共振或光亲和标记(Smith等，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)及de Vos等，Science 255：306-312(1992))。在优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR7功能所必需的TR7区域。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR7功能所必需的TR7区域并抑制或消除了TR7功能。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR7功能所必需的TR7区域并增强的TR7功能。
另外，可以应用蛋白质工程以改良或改变TR7多肽的特性。可以使用本领域已知的重组DNA技术产生新的突变蛋白或多肽，其包括单一或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出，例如增强的活性或提高的稳定性。另外，至少在一定的纯化和贮存条件下，它们可以高产量纯化而且比相应的天然多肽示出更好的溶解性。本发明的抗体可以结合这种修饰的TR7多肽。
本发明的抗体可以结合的非天然发生的TR7变体可以使用本领域已知的诱变技术产生，包括但非限于寡核苷酸介导的诱变，丙氨酸扫描，PCR诱变，定点诱变(见，例如Carter等，Nucl.Acids Res.13：4331(1986)；及Zoller等，Nucl.Acids Res.10：6487(1982))，盒式诱变(见例如Wells等，Gene 34：315(1985))，限制选择诱变(见例如Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317：415(1986))。
因此，本发明还涵盖了结合TR7衍生物和类似物的抗体，所述衍生物和类似物具有一或多个氨基酸残基缺失、添加或取代以产生更适于在所选择的宿主细胞中表达、放大等的TR7多肽。例如，半胱氨酸残基可以缺失或用另一种氨基酸残基取代以去除二硫键；N连接的糖基化位点可以改变或去除以实现例如表达更易于从已知超糖基化N连接位点的酵母宿主中回收及纯化的同源产物。为此，在TR7多肽中任一或多个糖基化识别序列的第一个或第三个氨基酸位置之一或这两个位置上的多种氨基酸取代，和/或在任一或多个这种识别序列的第二个位置的氨基酸缺失，将防止TR7在修饰的三肽序列糖基化(见例如Miyajimo等，EMBO J.5(6)：1193-1197)。另外，TR7多肽的一或多个氨基酸残基(例如精氨酸和赖氨酸残基)可以缺失或用另一种残基取代，以消除非所需的蛋白酶加工，例如弗林蛋白酶或kexin加工。
本发明的抗体还包括结合如下一种多肽的抗体，所述多肽包含或由包括引导序列的由保藏的cDNA(ATCC保藏号97920的保藏物)编码的多肽组成的多肽；包含或由减去引导序列的由保藏的cDNA编码的成熟多肽(即成熟蛋白)组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约1至大约411位氨基酸组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约2至大约411位氨基酸组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：3的大约52至大约411位氨基酸组成的多肽；包含或由TR7胞外结构域组成的多肽；包含或由TR7富半胱氨酸结构域组成的多肽；包含或由TR7跨膜结构域组成的多肽；包含或由TR7胞内结构域组成的多肽；包含或由胞外和胞内结构域组成的多肽，但所述结构域缺少全部或部分跨膜结构域；及包含或由TR7死亡结构域组成的多肽；以及与上述这些多肽有至少80％相同，更优选至少90％或95％相同，更优选至少96％，97％，98％或99％相同的多肽，及还包括这些多肽的至少30个，更优选至少50个氨基酸的部分。
具有与TR7多肽的参比氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽，是指所述多肽序列可以包括每100个所述TR7多肽的参比氨基酸序列的氨基酸中最多5个氨基酸变化，除此之外该多肽的氨基酸序列与参比氨基酸序列相同。换而言之，为获得具有与参比氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参比序列中最多有5％的氨基酸残基可以缺失或用另一种氨基酸取代，或者最多占参比序列中氨基酸总数5％的氨基酸可以插入参比序列中。参比序列的这些变化可以发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或者在两个末端位置之间的任何位置，它们单独分散在参比序列的残基中或在参比序列内呈一或多个连续的组。
实际上，任何特定的多肽与例如图1A-B(SEQ ID NO：3)所示氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列或其片段是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，可以使用已知的计算机程序常规确定，如Bestfit程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Unix版本8，Genetics Computer Group，University ResearchPark，575 Science Drive，Madison，WI53711)。当使用Bestfit或任何其它序列对比程序以确定一个特定序列与本发明的参比序列是否例如至少95％相同时，参数的设定当然是计算在全长参比氨基酸序列基础上的相同性百分率，并最多允许占参比序列氨基酸残基总数5％的同源性缺口。
在一个特异的实施方案中，确定参比(查询)序列(本发明的序列)和一个对象序列之间的相同性，也称全局序列比对，可以利用基于Brutlag等的算法(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))的FASTDB计算机程序。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数为：Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或者对象氨基酸序列的长度，取两者中较短的。根据这个实施方案，如果对象序列因N或C末端缺失而非由于内部缺失而比查询序列短，那么必须对结果作手工修正，因为FASTDB程序在计算全局相同性百分比时不计算对象序列的N和C末端的截短。对于对象序列相对于查询序列在N或C末端截短，则相同性百分比的修正是通过计算和相应对象残基不匹配的位于对象序列N或C末端的查询序列的残基数作为查询序列总碱基数的百分比而进行。通过FASTDB序列比对的结果来确定一个残基是否匹配。然后将此百分比从使用特别参数通过上述FASTDB程序计算的相同性百分比中减去，从而获得最终的相同性百分比数值。这一最终相同性百分比分值是用于本实施方案目的的百分比。进行手工调节相同性百分比数值时，只有在不与查询序列相匹配的对象序列的N或C末端的碱基才被考虑，也就是只有在查询残基位置位于对象序列的最N端和C端残基之外才予以考虑。例如，将一个90个氨基酸残基的对象序列与一个100个残基的查询序列比对以确定相同性百分比。缺失发生于对象序列的N末端，因此FASTDB比对不能显示出N末端前10个残基的匹配/比对。这10个不匹配的残基相当于序列的10％(N或C端不匹配的残基数/查询序列中的残基总数)，因而从FASTDB程序计算的相同性百分比值中减去这10％。如果剩余的90个碱基都完全匹配，那么最终的相同性百分比就是90％。在另一个实施例中，将一个90个碱基的对象序列与一个100个碱基的查询序列相比较，这时的缺失是内部缺失，因而对象序列的N或C末端残基没有与查询序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB计算的相同性百分比不需手工修正。再强调一次，只有如FSATDB对比中所展示的与查询序列不匹配的位于对象序列的N或C末端以外的残基才需要手工修正。对于这一实施方案不需要进行其他的手工修正。
本发明的多肽在SDS-PAGE凝胶上或者在分子筛凝胶过滤柱上可用作分子量标记，及作为生产结合TR7多肽的抗体的来源，使用本领域熟知的方法进行。
本申请还涉及结合如下蛋白质的抗体，所述蛋白质含有与本文以n5-m5，和/或n6-m6表示的TR7多肽序列至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的多肽。在优选的实施方案中，本申请涉及结合如下蛋白质的抗体，所述蛋白质含有与具有本文所述特异的TR7 N和C末端缺失的氨基酸序列的多肽至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的多肽。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体结合本发明的TR7蛋白，包括上述的融合蛋白，其中TR7多肽是本文所述的n5-m5和/或n6-m6所示的那些。
TR4多肽
在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体。以下段落更详细描述了可由本发明抗体结合的TR4多肽，片段和变体。可由本发明抗体结合的TR4多肽，片段和变体也见于例如国际公开号No.WO98/32856和WO00/67793所描述，这些文献以其全文并入本文作参考。
在某些实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合TR4多肽。在一些实施方案中，免疫特异性结合TR4的抗体可以结合TR4的片段，变体(包括TR4的同源物)，多聚体或修饰形式。例如，TR4的免疫特异性抗体可以结合包含全部或部分TR4的融合蛋白的TR4部分。
TR4蛋白可以以单体或多聚体(即二聚体，三聚体，四聚体和更高的多聚体)形式发现。因此，本发明涉及结合呈单体或多聚体的一部分的TR4蛋白的抗体。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4单体，二聚体，三聚体或四聚体。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合含有一或多种TR4多肽的至少二聚体，至少三聚体，或至少四聚体。
本发明的抗体可以结合TR4同聚体或异聚体。本文所用术语同聚体是指只含有本发明TR4蛋白(包括本文所述TR4片段，变体和融合蛋白)的多聚体。这些同聚体可含有具有相同或不同多肽序列的TR4蛋白质。在一个特异的实施方案中，本发明的同聚体是只含有具有相同多肽序列的TR4蛋白的多聚体。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合含有具有不同多肽序列的TR4蛋白的TR4同聚体。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4同源二聚体(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR4蛋白)或同源三聚体(例如含有具有相同或不同多肽序列的TR4蛋白)。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合TR4的至少一个同源二聚体，至少一个同源三聚体或至少一个同源四聚体。
本文所用术语异聚体是指这样的多聚体，其除了含有本发明TR4蛋白之外，还含有异源蛋白(即含有与TR4基因编码的多肽序列不相应的多肽序列的蛋白质)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合一种异源二聚体，异源三聚体或异源四聚体。在另外的实施方案中，本发明的抗体结合含有一或多个TR4多肽的至少一个同源二聚体，至少一个同源三聚体或至少一个同源四聚体。
由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以是疏水性、亲水性、离子性和/或共价结合的，和/或可以间接通过例如脂质体形成而连接。因此，在一个实施方案中，当TR4蛋白在溶液中互相接触时，会形成由本发明的一或多个抗体结合的多聚体例如同源二聚体或同源三聚体。在另一个实施方案中，当本发明的蛋白质与TR4多肽的抗体(包括抗融合蛋白中的异源多肽序列的抗体)在溶液中接触时，形成由本发明的一或多个抗体结合的异源多聚体，例如异源三聚体或异源四聚体。在其它实施方案中，由本发明的一或多个抗体结合的多聚体通过与本发明TR4蛋白的共价结合和/或在本发明TR4蛋白之间的共价结合而形成。这种共价结合可以涉及所述蛋白质多肽序列(例如SEQ ID NO：1所示多肽序列，或由ATCC保藏物97853的cDNA克隆编码的多肽)中包含的一或多个氨基酸残基。在一个例子中，所述共价结合是位于蛋白质多肽序列内的在天然(即天然存在的)多肽中相互作用的半胱氨酸残基之间的交联。在另一个例子中，所述共价结合是化学或重组操作的结果。或者，这种共价结合可以涉及TR4融合蛋白中异源多肽序列中包含的一或多个氨基酸残基。在一个实施例中，共价结合发生在融合蛋白包含的异源序列之间(见例如美国专利No.5478925)。在一个特异的实施例中，所述共价结合发生在TR4-Fc融合蛋白(如本文所述)中包含的异源序列之间。在另一个特异的实施例中，融合蛋白的共价结合发生在异源多肽序列之间，所述异源多肽序列来自能形成共价结合的多聚体的另一个TNF家族配体/受体成员，例如oseteoprotegerin(见例如国际公开No.WO98/49305，在此以其全文并入参考)。
可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的化学方法产生。例如，希望包含于本发明多聚体中的蛋白质可以使用本领域已知的接头分子和接头分子长度优化技术进行化学交联(见例如美国专利No.5478925，在此以其全文并入参考)。另外，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的方法产生，以在位于希望包含于多聚体中的蛋白质多肽序列内的半胱氨酸残基之间形成一或多个分子间交联(见例如美国专利No.5478925，在此以其全文并入参考)。另外，可以由本发明的一或多个抗体结合的蛋白质可以通过将半胱氨酸或生物素加入所述蛋白质多肽序列的C或N末端而常规修饰，而且可以使用本领域已知方法产生含有一或多个这些修饰蛋白质的多聚体(见，例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。再者，可以使用本领域已知方法产生含有希望包含于可由本发明的一或多个抗体结合的多聚体中的蛋白质组分的脂质体(见，例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。
或者，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体可以使用本领域已知的基因工程技术产生。在一个实施方案中，可以由本发明的一或多个抗体结合的多聚体中包含的蛋白质是使用本文所述的融合蛋白技术或本领域已知其它技术重组产生的(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在一个特异的实施方案中，通过将编码TR4多肽的多核苷酸序列与编码接头多肽的序列连接，然后进一步与一种编码从起始C末端至N末端的反方向的该多肽翻译产物(缺失前导序列)的合成多核苷酸连接，产生编码可以由本发明的一或多个抗体结合的一种同源二聚体的多核苷酸(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在另一个实施方案中，使用本文所述重组技术或本领域已知的其它方法产生重组TR4多肽，其含有一个跨膜结构域并可以通过膜重构技术整合入脂质体中(见例如美国专利5478925，在此以其全文并入参考)。在另一个实施方案中，两或多个TR4多肽通过合成接头(例如肽，碳水化合物或可溶聚合物接头)连接。实施例包括美国专利No.5073627(在此并入参考)中所述那些肽接头。包含由肽接头分离的多个TR4多肽的蛋白质可以使用常规重组DNA技术产生。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合包含由肽接头分离的多个TR4多肽的蛋白质。
另一种制备多聚体TR4多肽的方法涉及使用融合于亮氨酸拉链或异亮氨酸多肽序列的TR4多肽。亮氨酸拉链结构域和异亮氨酸拉链结构域是促进含有这些结构域的蛋白质多聚体化的多肽。亮氨酸拉链最初在一些DNA结合蛋白质中鉴别(Landschulz等，Science240：1759(1988))，至今已经在许多不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链是天然存在的二聚体化或三聚体化的肽及其衍生物。适于生产可溶多聚体TR4蛋白质的亮氨酸拉链结构域的实施例是PCT申请WO94/10308中所述的那些，在此并入参考。将包含与在溶液中二聚体化或三聚体化的肽融合的可溶TR4多肽的重组融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，并使用本领域已知技术将所得可溶多聚体TR4从培养上清中回收。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4-亮氨酸拉链融合蛋白单体和/或TR4-亮氨酸拉链融合蛋白多聚体。
据信蛋白质TNF家族的一些成员以三聚体形式存在(Beutler和Huffel，Science 264：667，1994；Banner等，Cell 73：431，1993)。因此，三聚体TR4可能具有生物活性增强的优点。优选的亮氨酸拉链部分是优先形成三聚体的那些部分。一个实施例是衍生自肺表面活性剂蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链，如Hoppe等(FEBSLetters 344：191(1994))及美国专利申请No.08/446922所述，在此并入参考。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4-亮氨酸拉链融合蛋白三聚体。
衍生自天然存在的三聚体蛋白质的其它肽可以用于制备三聚体TR4。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4融合蛋白单体和/或TR4融合蛋白三聚体。
结合TR4受体多肽的抗体可以结合分离的或天然存在状态的多肽。“分离多肽”是指从其天然环境中分离的一种多肽。因此，本发明中，在重组宿主细胞中产生的和/或包含于重组细胞中的多肽被认为是分离的。另外，“分离的多肽”也指已经从重组宿主细胞中部分或基本纯化的多肽。例如，一种重组产生的TR4多肽通过一步方法基本纯化，所述方法如Smith和Johnson，Gene 67：31-40(1988)所述。因此，本发明的抗体可以结合重组产生的TR4受体多肽。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体结合在一种细胞表面上表达的TR4受体，该细胞包含可操纵地与控制基因表达的调节序列结合的编码SEQ ID NO：1的1-468位氨基酸的多核苷酸。
本发明的抗体可以结合包含或由一种氨基酸序列组成的TR4多肽片段，所述氨基酸序列包含于SEQ ID NO：1中，由ATCC保藏号97853中包含的cDNA编码，或者由与ATCC保藏号97853中包含的核苷酸序列或其互补链杂交(例如在严格杂交条件下)的核酸编码。蛋白质片段可以是“游离存在的”，或包含于一个较大的多肽中，在该较大的多肽中该片段形成其一部分或一个区域，最优选作为一个单一的连续区域。本发明的抗体可以结合多肽片段，包括例如，包含或由大约以下氨基酸残基组成的片段：SEQ ID NO：1的第1-23，24-43，44-63，64-83，84-103，104-123，124-143，144-163，164-183，184-203，204-223，224-238，239-264，265-284，285-304，305-324，325-345，346-366，367-387，388-418，419-439，和/或440-468位氨基酸残基。文中“大约”包括特别指出的数值，在一端或两端多或少几个(5，4，3，2或1)氨基酸。另外，由本发明抗体结合的多肽片段的长度可以是至少大约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，175或200个氨基酸。文中“大约”包括特别指出的数值，在一端或两端多或少几个(5，4，3，2或1)氨基酸。
优选地，本发明的抗体结合选自以下一组的多肽片段：一种包含或由TR4受体胞外结构域(预测组成SEQ ID NO：1的约第24至约第238位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由两个TR4富半胱氨酸结构域(这两个结构域可见于由SEQ ID NO：1的约第131至约第229位氨基酸残基组成的蛋白质片段中)组成的多肽；一种包含或由SEQID NO：1的约第131至约第183位氨基酸残基组成的TR4富半胱氨酸结构域组成的多肽；一种包含或由SEQ ID NO：1的约第184至约第229位氨基酸残基组成的TR4富半胱氨酸结构域组成的多肽；一种包含或由TR4受体跨膜结构域(预测组成SEQ ID NO：1的约第239至约第264位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由预测的成熟TR4多肽的片段组成的多肽，其中所述片段具有TR4功能活性(例如，抗原性活性或生物学活性)；一种包含或由TR4受体胞内结构域(预测组成SEQ ID NO：1的约第265至约第468位氨基酸残基)组成的多肽；一种包含或由全部或部分缺失跨膜结构域的TR4受体胞外和胞内结构域组成的多肽；一种包含或由TR4受体死亡结构域(预测组成SEQ ID NO：1的约第379至约第422位氨基酸残基)组成的多肽；和一种包含或由TR4受体蛋白的1，2，3，4或更多个表位携带部分组成的多肽。在另外的实施方案中，本发明的多肽片段包含或由上述的1，2，3，4，5，6，7或全部8个成员的任意组合组成。组成TR4受体胞外、跨膜和胞内结构域的氨基酸残基由计算机分析预测。因此，本领域技术人员应意识到组成这些结构域的氨基酸残基根据限定每个结构域的标准可以略微变化(例如变化大约1至大约15个氨基酸残基)。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
据信TR4的一或两个胞外富半胱氨酸基序对TR4与其配体(例如TRAIL)之间的相互作用很重要。因此，在特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由SEQ ID NO：1的第131至183位，和/或第184-229位氨基酸残基组成的TR4多肽片段。在另一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由两个胞外富半胱氨酸基序(SEQ ID NO：1的第131至229位氨基酸残基)组成的TR4多肽。在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由TR4的胞外可溶结构域(SEQ ID NO：1的第24至238位氨基酸残基)组成的TR4多肽。在特别优选的实施方案中，结合TR4的全部或部分胞外可溶结构域(例如一或两个富半胱氨酸结构域)的本发明抗体阻止TRAIL配体与TR4结合。在其它特别优选的实施方案中，结合TR4的全部或部分胞外可溶结构域(例如一或两个富半胱氨酸结构域)的本发明抗体拮抗TR4受体。在其它特别优选的实施方案中，结合TR4的全部或部分胞外可溶结构域(例如一或两个富半胱氨酸结构域)的本发明抗体诱导表达TR4受体细胞的细胞死亡。
本发明的抗体还可以结合包含或由TR4的结构或功能属性部分组成的片段。这些片段包括包含完整(即全长)TR4的α-螺旋及α-螺旋形成区(“α-区”)，β-折叠及β-折叠形成区(“β-区”)，转角及转角形成区(“转角区”)，卷曲及卷曲形成区(“卷曲区”)，亲水区，疏水区，α两性区，β两性区，表面形成区，及高抗原指数区(即含有抗原指数高于或等于1.5的四或多个连续氨基酸，使用Jameson-Wolf程序的默认参数鉴别)的氨基酸残基。一些优选的区域是表4所述的那些区域，并包括但非限于通过分析SEQ ID NO：1所示氨基酸序列而鉴别的上述类型的区域，这些优选的区域包括：Gamier-Robson预测的α-区，β-区，转角区及卷曲区；Chou-Fasman预测的α-区，β-区和转角区；Kyte-Doolittle预测的亲水区；Eisenbergα和β两性区；Emini表面形成区；及Jameson-Wolf高抗原指数区，使用这些计算机程序的默认参数预测。
表4示出的代表如上所述的TR4的结构和功能属性的数据是使用多种DNA*STAR模块和算法按默认参数产生的。第I栏表示α螺旋区的Garnier-Robson分析结果；第II栏表示α螺旋区的Chou-Fasman分析结果；第III栏表示β折叠区的Garnier-Robson分析结果；第IV栏表示β折叠区的Chou-Fasman分析结果；第V栏表示转角区的Garnier-Robson分析结果；第VI栏表示转角区的Chou-Fasman分析结果；第VII栏表示卷曲区的Garnier-Robson分析结果；第VIII栏表示Kyte-Doolittle亲水性图；第IX栏表示α两性区的Eisenberg分析结果；第X栏表示β两性区的Eisenberg分析结果；第XI栏表示柔性区的Karplus-Schultz分析结果；第XII栏表示Jameson-Wolf抗原指数分值；及第XIII栏表示Emini表面概率图。
在一个优选的实施方案中，表4中第VIII，XII和XIII栏所示数据可以用于确定呈现高度抗原性潜力的TR4区域。通过选择表示在免疫应答的初始过程时可能发生抗原识别的环境中很可能暴露于多肽表面的多肽区域的数值，从第VIII，XII和/或XIII栏所示数据中确定高抗原性区域。
表4所示上述优选的区域包括但非限于通过分析SEQ ID NO：1所示氨基酸序列鉴别的上述类型区域。如表4所示，这种优选的区域包括Garnier-Robsonα-区，β-区，转角区和卷曲区，Chou-Fasmanα-区，β-区和转角区，Kyte-Doolittle亲水区，Eisenbergα-和β-两性区，Karplus-Schulz柔性区，Jameson-Wolf高抗原指数区及Emini表面形成区。本发明的一或多个抗体结合的多肽片段优选是包含组合一些结构特征的TR4区域的那些片段，如上述及表4所示一些(例如1，2，3或4个)相同或不同区域特征。
表4
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Met 1 . . B . . . . 0.12 . . . -0.10 0.90
Ala 2 . . . . . . C -0.08 * * . 0.25 1.08
Pro 3 . . . . . . C 0.42 * * . 0.10 0.86
Pro 4 . . . . . T C -0.04 * * . 1.05 1.69
Pro 5 A . . . . T . 0.31 . * F 1.00 1.24
Ala 6 A . . . . T . 0.10 . * F 1.00 1.10
Arg 7 A . . . . T . 0.34 . * . 0.10 0.58
Val 8 . . B B . . . -0.03 . * . -0.30 0.37
His 9 . . B B . . . -0.52 . * . -0.30 0.37
Leu 10 . . B B . . . -1.12 . * . -0.60 0.17
Gly 11 . . B B . . . -1.12 . * . -0.60 0.18
Ala 12 . . B B . . . -2.09 . * . -0.60 0.14
Phe 13 . . B B . . . -1.54 . * . -0.60 0.12
Leu 14 . . B B . . . -1.72 . . . -0.60 0.18
Ala 15 . . B B . . . -0.91 . . . -0.60 0.27
Val 16 . . B B . . . -0.78 . . . -0.60 0.51
Thr 17 . . B B . . . -0.53 . . F -0.45 0.95
Pro 18 . . . B . . C -0.13 . . F 0.05 0.93
Asn 19 . . . . . T C 0.09 . . F 0.60 1.69
Pro 20 . . . . . T C 0.09 . . F 0.60 1.18
Gly 21 . . . . T T . 0.64 . . F 0.65 0.77
Ser 22 . . . . . T C 0.61 . . F 0.45 0.64
Ala 23 . . . . . . C 0.51 . . F 0.25 0.41
Ala 24 . . . . . T C 0.51 . . F 0.45 0.60
Ser 25 . . B . . T . 0.13 . . F 0.85 0.78
Gly 26 A . . . . T . -0.11 . . F 0.85 0.78
Thr 27 A . . . . T . -0.40 . . F 0.85 0.78
Glu 28 A A . . . . . -0.40 . . F 0.45 0.58
Ala 29 A A . . . . . -0.12 . . . 0.30 0.60
Ala 30 A A . . . . . -0.03 . . . 0.30 0.60
Ala 31 A A . . . . . 0.01 . . . 0.30 0.53
Ala 32 A A . . . . . 0.37 . . . -0.30 0.71
Thr 33 A . . . . T . -0.49 * . F 1.00 1.40
Pro 34 A . . . . T . -0.19 . . F 1.00 1.03
Ser 35 . . B . . T . 0.06 . . F 0.40 1.07
Lys 36 . . B . . T . 0.34 . . F 0.25 0.73
Val 37 . . B B . . . 0.63 . . F -0.15 0.64
Trp 38 . . B B . . . 0.36 . . F -0.15 0.64
Gly 39 . . B B . . . 0.22 * * F -0.15 0.32
Ser 40 . . . . . . C 0.63 * * F -0.05 0.43
Ser 41 . . . . . T C -0.30 * * F 0.45 0.80
Ala 42 . . . . . T C 0.56 * * F 1.05 0.57
Gly 43 . . . . . T C 0.63 * * F 1.35 0.73
Arg 44 . . B . . T . 1.09 * * F 1.49 0.84
Ile 45 . . B . . . . 1.04 * * F 1.78 1.63
Glu 46 . . B . . . . 1.00 * * F 2.12 1.63
Pro 47 . . B . . T . 1.24 * * F 2.51 0.83
Arg 48 . . . . T T . 1.70 * * F 3.40 1.17
Gly 49 . . . . T T . 1.24 * * F 3.06 1.32
Gly 50 . . . . T T . 1.54 * * F 2.57 0.84
表4(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Gly 51 . . . . . T C 0.73 * * F 2.03 0.44
Arg 52 . . . . . T C 0.73 * * F 1.39 0.36
Gly 53 . . B . . T . 0.31 * * F 0.85 0.57
Ala 54 . . B . . T . 0.36 . * F 0.85 0.83
Leu 55 . . B . . . . 0.10 . * F 0.65 0.57
Pro 56 . . B . . . . 0.10 . * F -0.25 0.57
Thr 57 . . B . . . . -0.01 . * F -0.25 0.55
Ser 58 . . B . . T . 0.30 . . F 0.10 1.16
Met 59 . . B . . T . 0.54 . . F 0.40 1.02
Gly 60 . . B . . T . 1.14 . . F 0.25 0.70
Gln 61 . . . . T T . 1.06 . . F 0.65 0.81
His 62 . . . . . . C 0.78 . * F 0.40 1.10
Gly 63 . . . . . T C 1.19 . * F 0.60 1.12
Pro 64 . . . . . T C 1.20 . * F 1.20 1.27
Ser 65 . . . . . T C 1.66 . * F 1.05 0.94
Ala 66 . . B . . T . 1.07 . * F 1.30 1.86
Arg 67 . . B . . . . 0.76 * * . 1.29 1.22
Ala 68 . . B . . . . 1.21 * * . 1.48 0.90
Arg 69 . . B . . T . 0.83 . * . 2.17 1.74
Ala 70 . . B . . T . 0.92 . * F 2.51 0.90
Gly 71 . . . . T T . 1.17 . * F 3.40 1.37
Arg 72 . . . . . T C 0.84 . * F 2.71 0.69
Ala 73 . . . . . T C 1.54 * . F 2.48 1.06
Pro 74 . . . . . T C 1.22 * . F 2.70 2.10
Gly 75 . . . . . T C 1.22 * . F 2.62 1.66
Pro 76 . . . . . T C 1.68 * * F 2.24 1.66
Arg 77 . . . . . . C 1.57 * . F 2.60 2.10
Pro 78 . A B . . . . 1.57 * . F 1.94 3.68
Ala 79 . A B . . . . 1.48 * . F 1.68 2.40
Arg 80 . A B . . . . 1.61 * * F 1.42 1.64
Glu 81 . A B . . . . 1.93 * * F 1.16 1.64
Ala 82 A A . . . . . 1.01 * * F 0.90 3.19
Ser 83 A . . . . T . 1.33 * * F 1.30 1.34
Pro 84 A . . . . T . 1.07 * * F 1.30 1.52
Arg 85 A . . . . T . 0.92 * * F 1.00 1.12
Leu 86 A . . . . T . 0.97 . * . 0.85 1.13
Arg 87 A . . B . . . 1.24 . * . 0.75 1.46
Val 88 A . . B . . . 0.84 * * . 0.75 1.08
His 89 A . . B . . . 1.10 . * . -0.15 1.13
Lys 90 A . . B . . . 0.29 * * F 0.90 1.16
Thr 91 . . B B . . . 0.24 * * F 0.00 1.35
Phe 92 . . B B . . . -0.72 * * . -0.30 0.74
Lys 93 . . B B . . . -0.72 * * . -0.30 0.27
Phe 94 . . B B . . . -1.03 * . . -0.60 0.14
Val 95 . . B B . . . -1.93 * . . -0.60 0.16
Val 96 . . B B . . . -2.43 . * . -0.60 0.06
Val 97 . . B B . . . -2.54 . * . -0.60 0.06
Gly 98 . . B B . . . -2.59 . * . -0.60 0.06
Val 99 . . B B . . . -2.74 . . . -0.60 0.15
Leu 100 . . B B . . . -2.74 * . . -0.60 0.15
表4(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Leu 101 . . B B . . . -2.10 * . . -0.60 0.11
Gln 102 . . B B . . . -1.54 * . . -0.60 0.23
Val 103 . . B B . . . -1.50 . . . -0.60 0.37
Val 104 . . B . . T . -1.23 . . . -0.20 0.61
Pro 105 . . B . . T . -1.01 * . F 0.25 0.35
Ser 106 A . . . . T . -0.51 * . F -0.05 0.48
Ser 107 A . . . . T . -1.40 * * F 0.25 0.94
Ala 108 A . . . . . . -0.50 . * F 0.05 0.43
Ala 109 A . . . . . . -0.46 . * . 0.50 0.63
Thr 110 A . . . . . . -0.28 . * . -0.10 0.39
Ile 111 A . . . . . . 0.02 . * . -0.10 0.53
Lys 112 . . B . . . . 0.32 . * . 0.50 0.87
Leu 113 . . B . . . . 0.61 . * F 1.05 1.04
His 114 . . B . . . . 0.31 . * F 1.30 1.99
Asp 115 . . . . . T C 0.28 * * F 1.80 0.70
Gln 116 . . . . T T . 0.86 . * F 1.65 0.84
Ser 117 . . . . T T . 0.81 . . F 2.50 0.89
Ile 118 . . . . T T . 1.62 . . F 2.25 0.92
Gly 119 . . . . . . C 1.37 . . F 1.00 0.92
Thr 120 . . . . . . C 1.37 . . F 0.45 0.72
Gln 121 . . B . . . C 1.33 . . F 0.65 1.79
Gln 122 . . B . . . . 1.33 . . F 0.20 2.46
Trp 123 . . B . . . . 2.01 . . . 0.05 2.28
Glu 124 . . . . . . C 1.54 . . . 0.25 2.04
His 125 . . . . . . C 1.51 . . . 0.10 0.97
Ser 126 . . . . . T C 1.51 . . F 0.45 0.91
Pro 127 . . . . T T . 0.70 . . F 1.55 0.91
Leu 128 . . . . T T . 0.32 . . F 0.65 0.55
Gly 129 . . . . T T . 0.11 . . F 0.65 0.22
Glu 130 . . . . T . . -0.07 . . F 0.45 0.22
Leu 131 . . B . . . . -0.11 * . . 0.18 0.42
Cys 132 . . B . . . . -0.20 * . F 1.21 0.42
Pro 133 . . B . . T . 0.58 * * F 1.69 0.32
Pro 134 . . . . T T . 1.03 . * F 1.47 0.53
Gly 135 . . . . T T . 0.73 . * F 2.80 1.94
Ser 136 . . . . . T C 1.54 * . F 2.32 1.68
His 137 . . . . . . C 2.32 * . F 2.48 1.88
Arg 138 . . B . . . . 2.32 * . F 2.34 3.72
Ser 139 . . B . . . . 2.19 * . F 2.40 4.29
Glu 140 . . . . T . . 1.94 * . F 2.86 3.12
Arg 141 . . . . T T . 1.58 * . F 3.40 1.61
Pro 142 . . . . T T . 1.61 . * F 2.91 0.64
Gly 143 . . . . T T . 1.61 . * F 2.57 0.60
Ala 144 . . . . T T . 1.24 . * . 2.08 0.60
Cys 145 . . . . T . . 0.93 . * . 1.41 0.21
Asn 146 . . B . . . . 0.82 . * . 0.84 0.30
Arg 147 . . B . . . . 0.69 * . . 1.01 0.52
Cys 148 . . B . . T . 0.18 * . F 1.83 0.96
Thr 149 . . B . . T . 0.42 * . F 1.70 0.44
Glu 150 . . B . . T . 0.84 * . F 1.53 0.22
表4(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Gly 151 . . B . . T . 0.53 * . F 0.76 0.65
Val 152 . . B B . . . 0.42 . * F 0.19 0.65
Gly 153 . . B B . . . 0.50 . . . -0.13 0.61
Tyr 154 . . B B . . . 0.51 . . . -0.60 0.62
Thr 155 . . B B . . . 0.51 . . F -0.30 1.12
Asn 156 . . . B . . C 0.86 . . F 0.20 1.81
Ala 157 . . . . T T . 0.90 . . F 0.80 1.86
Ser 158 . . . . T T . 0.54 . . F 0.80 1.06
Asn 159 . . . . T T . 0.20 . . F 0.35 0.57
Asn 160 . . . . T T . -0.16 * . F 0.35 0.57
Leu 161 . A B . . . . -0.97 * . . -0.60 0.23
phe 162 . A B . . . . -0.59 . . . -0.60 0.12
Ala 163 . A B . . . . -0.96 . . . -0.60 0.11
Cys 164 . A B . . . . -1.27 * . . -0.60 0.07
Leu 165 . . B . . T . -1.86 . . . -0.20 0.12
Pro 166 . . B . . T . -1.71 * . . -0.20 0.12
Cys 167 . . . . T T . -0.97 * . . 0.20 0.12
Thr 168 A . . . . T . -0.68 . . . 0.10 0.30
Ala 169 A . . . . . . -0.01 . . . 0.50 0.26
Cys 170 A . . . . T . 0.80 . . . 0.70 0.80
Lys 171 A . . . . T . 1.01 . . F 1.15 0.96
Ser 172 A . . . . T . 1.68 . * F 1.30 1.65
Asp 173 A . . . . T . 2.10 . * F 1.30 5.33
Glu 174 A A . . . . . 2.39 . * F 0.90 5.22
Glu 175 A A . . . . . 2.84 . * F 1.24 5.22
Glu 176 A A . . . . . 2.13 . * F 1.58 4.83
Arg 177 . A . . T . . 2.12 . . F 2.32 1.50
Ser 178 . . . . . T C 1.81 . . F 2.86 1.25
Pro 179 . . . . T T . 1.50 * . F 3.40 1.04
Cys 180 . . . . T T . 1.61 * . F 2.61 0.77
Thr 181 . . . . T T . 1.61 * . F 2.67 1.12
Thr 182 . . . . T . . 1.19 * * F 2.38 1.16
Thr 183 . . . . T T . 0.90 . . F 2.49 3.13
Arg 184 . . . . T T . 0.44 . . F 2.40 2.19
Asn 185 . . . . T T . 1.11 . . F 2.50 0.81
Thr 186 . . . . T T . 0.76 * . F 2.25 0.98
Ala 187 . . . . T . . 1.11 * . . 1.65 0.27
Cys 188 . . . . T . . 1.21 * . . 1.40 0.33
Gln 189 . . B . . . . 0.76 * . . 0.75 0.36
Cys 190 . . B . . . . 0.44 . . . 0.50 0.35
Lys 191 . . B . . T . 0.06 . * F 0.85 0.94
Pro 192 . . . . T T . 0.76 . . F 0.65 0.47
Gly 193 . . . . T T . 1.42 . * F 1.74 1.72
Thr 194 . . B . . T . 1.42 . * F 1.68 1.38
Phe 195 . . B . . . . 2.09 . * F 1.82 1.49
Arg 196 . . . . T . . 1.74 . * F 2.56 2.42
Asn 197 . . . . T T . 1.37 . * F 3.40 2.25
Asp 198 . . . . T T . 1.71 . * F 3.06 2.63
Asn 199 . . . . . T C 1.42 . * F 2.52 2.32
Ser 200 A . . . . T . 1.46 . * F 1.98 1.43
表4(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Ala 201 A . . . . . . 1.46 . * . 1.14 0.46
Glu 202 A . . . . . . 1.50 * . . 0.80 0.56
Met 203 A . . . . . . 0.83 * . . 1.11 0.83
Cys 204 A . . . . T . 0.53 * . . 1.62 0.44
Arg 205 . . . . T T . 0.52 * . . 2.33 0.34
Lys 206 . . . . T T . 0.77 * . F 2.49 0.50
Cys 207 . . . . T T . 0.10 * . F 3.10 0.92
Ser 208 . . . . T . . 0.49 * * F 2.59 0.25
Thr 209 . . . . T . . 1.27 * * F 1.98 0.19
Gly 210 . . . . T . . 0.81 * . F 1.67 0.71
Cys 211 . . B . . T . 0.17 * * F 1.16 0.53
Pro 212 . . . . T T . -0.02 * * F 1.25 0.36
Arg 213 . . . . T T . 0.32 * * F 0.65 0.27
Gly 214 . . B . . T . -0.22 * * . 0.85 1.01
Met 215 . . B B . . . 0.17 * * . 0.30 0.48
Val 216 . . B B . . . 0.83 * * . 0.79 0.49
Lys 217 . . B B . . . 0.38 * * . 0.98 0.83
Val 218 . . B B . . . -0.04 * * F 1.32 0.45
Lys 219 . . B B . . . 0.09 . * F 1.51 0.88
Asp 220 . . B . . . . 0.40 . * F 1.90 0.68
Cys 221 . . B . . . . 0.96 . * F 0.81 0.96
Thr 222 . . . . . T C 0.91 . * F 1.62 0.65
Pro 223 . . . . T T . 0.88 . * F 1.63 0.65
Trp 224 . . . . T T . 0.83 . * F 0.54 0.84
Ser 225 A . . . . T . 0.17 . . F 1.00 1.01
Asp 226 A A . . . . . -0.02 . . F 0.45 0.35
Ile 227 A A . . . . . 0.26 * . . -0.30 0.25
Glu 228 A A . . . . . 0.51 * . . 0.30 0.25
Cys 229 . A B . . . . 0.80 * . . 0.60 0.30
Val 230 A A . . . . . 0.80 * * . 0.60 0.74
His 231 A A . . . . . 0.46 * * . 0.60 0.58
Lys 232 A A . . . . . 1.34 * . F 0.60 1.06
Glu 233 . A . . T . . 1.00 * . F 1.30 2.30
Ser 234 . . . . T T . 1.63 * . F 1.70 1.68
Gly 235 . . . . T T . 2.49 * . F 1.70 1.14
Asn 236 . . . . T T . 1.63 * . F 1.40 1.06
Gly 237 . . . . . T C 1.30 * . F 0.45 0.55
His 238 . . . B . . C 0.44 . . . -0.40 0.59
Asn 239 . . . B . . C -0.14 . . . -0.40 0.27
Ile 240 . . B B . . . -0.61 . . . -0.60 0.19
Trp 241 . . B B . . . -1.47 . . . -0.60 0.12
Val 242 . . B B . . . -1.98 . . . -0.60 0.05
Ile 243 . . B B . . . -2.26 . . . -0.60 0.06
Leu 244 . . B B . . . -3.07 . . . -0.60 0.08
Val 245 . . B B . . . -3.03 . . . -0.60 0.09
Val 246 . . B B . . . -3.60 . . . -0.60 0.09
Thr 247 . . B B . . . -2.96 . . . -0.60 0.08
Leu 248 . . B B . . . -2.88 . . . -0.60 0.17
Val 249 . . B B . . . -2.88 . * . -0.60 0.19
Val 250 . . B B . . . -2.83 . . . -0.60 0.11
表4(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Pro 251 . . B B . . . -2.83 . . . -0.60 0.11
Leu 252 . . B B . . . -3.11 . . . -0.60 0.11
Leu 253 A . . B . . . -3.16 . . . -0.60 0.15
Leu 254 A . . B . . . -3.11 . . . -0.60 0.07
Val 255 A . . B . . . -3.14 . . . -0.60 0.07
Ala 256 A . . B . . . -3.79 . . . -0.60 0.06
Val 257 . . B B . . . -3.64 . . . -0.60 0.05
Leu 258 . . B B . . . -3.50 . . . -0.60 0.04
Ile 259 . . B B . . . -3.36 . . . -0.60 0.02
Val 260 . . B B . . . -3.39 . . . -0.60 0.02
Cys 261 . . B B . . . -3.14 . . . -0.60 0.01
Cys 262 . . B B . . . -2.59 . . . -0.60 0.02
Cys 263 . . B B . . . -2.12 . . . -0.60 0.03
Ile 264 . . B B . . . -1.90 . . . -0.60 0.06
Gly 265 . . . . T T . -1.39 . . F 0.35 0.06
Ser 266 . . . . T T . -1.07 . . F 0.35 0.11
Gly 267 . . . . T T . -0.40 . . F 0.65 0.16
Cys 268 . . . . T T . 0.06 . . F 1.25 0.27
Gly 269 . . . . T . . 0.99 . * F 1.39 0.31
Gly 270 . . . . T . . 0.67 . . F 2.03 0.62
Asp 271 . . . . . T C 0.37 . . F 2.37 0.62
Pro 272 . . . . T T . 0.71 * * F 2.91 0.62
Lys 273 . . . . T T . 1.49 * * F 3.40 1.05
Cys 274 . . B . . T . 0.98 * * . 2.51 1.23
Met 275 . . B B . . . 0.66 * * . 1.62 0.59
Asp 276 . . B B . . . -0.04 * * . 1.28 0.16
Arg 277 . . B B . . . -0.12 . * . 0.04 0.26
Val 278 . . B B . . . -0.06 . * . -0.60 0.27
Cys 279 . . B B . . . -0.20 . . . 0.30 0.32
Phe 280 . . B B . . . 0.06 . * . -0.60 0.13
Trp 281 . . B B . . . -0.76 . . . -0.60 0.18
Arg 282 . . B B . . . -1.68 . . . -0.60 0.28
Leu 283 . . B B . . . -0.71 . . . -0.60 0.26
Gly 284 . . . B T . . -0.39 . * . -0.20 0.49
Leu 285 . . . B . . C 0.10 . * . 0.50 0.25
Leu 286 . . . B . . C 0.04 . * . 0.20 0.46
Arg 287 . . . B . . C -0.66 . . F 0.65 0.46
Gly 288 . . . . . T C 0.16 . . F 1.35 0.57
Pro 289 . . . . . T C 0.50 . * F 2.70 1.19
Gly 290 . . . . . T C 1.31 * * F 3.00 1.01
Ala 291 A . . . . T . 1.53 . * F 2.50 1.65
Glu 292 A . . . . . . 1.39 . . F 2.00 1.08
Asp 293 A . . . . . . 1.73 . . F 1.70 1.48
Asn 294 A . . . . T . 1.94 . * . 1.45 2.36
Ala 295 A . . . . T . 1.40 . . . 1.15 2.36
His 296 A . . . . T . 1.18 * . . 1.00 0.99
Asn 297 A . . . . T . 0.88 . . . 0.10 0.51
Glu 298 A . . . . . . 0.88 * . . -0.10 0.67
Ile 299 A . . . . . . 0.29 * * . -0.10 0.80
Leu 300 A . . . . . . 0.88 * * . -0.10 0.50
表4(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Ser 301 A . . . . . . 0.61 * . F 0.65 0.48
Asn 302 A . . . . T . -0.20 * . F 0.25 0.92
Ala 303 A . . . . T . -0.50 * . F 0.25 0.92
Aso 304 A . . . . T . 0.08 * . F 0.85 0.92
Ser 305 . . . . . T C 0.19 * . F 1.05 0.83
Leu 306 . . . B . . C -0.37 * . F 0.05 0.71
Ser 307 . . B B . . . -0.67 * . F -0.15 0.31
Thr 308 . . B B . . . -0.08 * . . -0.60 0.31
Phe 309 . . B B . . . -0.08 * . . -0.30 0.66
Val 310 A . . B . . . 0.22 . . F -0.15 0.85
Ser 311 A A . . . . . 0.43 . . F 0.00 1.03
Glu 312 A A . . . . . 0.73 . . F 0.00 1.17
Gln 313 A A . . . . . 0.74 . . F 0.90 2.73
Gln 314 A A . . . . . 1.44 . . F 0.90 2.73
Met 315 A A . . . . . 2.30 . . F 0.90 2.73
Glu 316 A A . . . . . 2.39 . . F 0.90 2.73
Ser 317 A A . . . . . 1.80 . * F 0.90 2.44
Gln 318 A A . . . . . 1.80 . * F 0.90 2.49
Glu 319 A A . . . . . 0.99 . * F 0.90 2.40
Pro 320 A A . . . . . 1.28 . * F 0.90 1.48
Ala 321 A A . . . . . 0.93 . . F 0.60 1.23
Asp 322 A A . B . . . 0.38 . . F 0.45 0.70
Lau 323 A A . B . . . 0.07 . . F -0.15 0.34
Thr 324 . A B B . . . -0.79 . . F -0.15 0.48
Gly 325 . A B B . . . -0.58 . . . -0.30 0.21
Val 326 . . B B . . . -0.29 . . . -0.60 0.45
Thr 327 . . B B . . . -0.50 . . . -0.60 0.42
Val 328 . . B B . . . -0.03 . * F -0.17 0.65
Gln 329 . . B B . . . 0.28 . * F 0.11 0.87
Ser 330 . . . . . T C 0.03 . * F 2.04 1.05
Pro 331 . . . . . T C 0.89 . * F 2.32 1.42
Gly 332 . . . . T T . 0.53 . * F 2.80 1.42
Glu 333 A . . . . T . 0.58 . * F 1.97 0.57
Ala 334 . . B . . . . -0.23 . * . 0.74 0.30
Gln 335 . . B . . . . -0.28 . . . 0.46 0.25
Cys 336 . . B . . . . -0.28 . . . 0.18 0.14
Leu 337 . . B . . . . -0.52 . * . -0.40 0.22
Leu 338 . . B . . . . -0.52 . * . -0.40 0.13
Gly 339 . A . . . . C -0.52 . * F 0.05 0.42
Pro 340 A A . . . . . -0.52 . * F -0.15 0.51
Ala 341 A A . . . . . -0.20 . * F 0.60 1.07
Glu 342 A A . . . . . 0.31 . * F 0.90 1.07
Ala 343 A A . . . . . 1.12 * * F 0.75 0.93
Glu 344 A A . . . . . 1.58 . * F 0.90 1.60
Gly 345 A A . . . . . 1.90 . * F 0.90 1.80
Ser 346 A . . . . T . 2.60 . * F 1.30 3.50
Gln 347 A . . . . T . 1.79 . * F 1.30 3.96
Arg 348 A . . . . T . 1.57 . * F 1.30 3.30
Arg 349 . . B . . T . 0.71 . * F 1.30 2.03
Arg 350 . . B B . . . 0.84 . * F 0.75 0.87
表4(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Leu 351 . . B B . . . 0.56 . * . 0.60 0.69
Leu 352 . . B B . . . 0.56 . * . 0.30 0.35
Val 353 . . B B . . . 0.10 * * . -0.30 0.29
Pro 354 . . B . . T . -0.60 * . . -0.20 0.35
Ala 355 . . . . T T . -0.71 . * . 0.50 0.43
Asn 356 . . . . . T C -0.11 . . F 1.65 0.96
Gly 357 . . . . . T C 0.39 . . F 1.95 0.96
Ala 358 . . . . . . C 1.24 . . F 2.20 1.37
Asp 359 . . . . . T C 1.14 . . F 3.00 1.48
Pro 360 A . . . . T . 0.92 * . F 2.50 2.16
Thr 361 A . . . . T . 0.32 . . F 1.90 1.76
Glu 362 A . . . . T . -0.14 . . F 1.60 1.04
Thr 363 A . . B . . . -0.26 . . F 0.15 0.56
Leu 364 A . . B . . . -0.96 * . . -0.60 0.33
Met 365 A . . B . . . -0.74 * . . -0.60 0.17
Leu 366 A . . B . . . -0.39 * . . -0.60 0.19
Phe 367 A . . B . . . -1.09 * . . -0.60 0.47
Phe 368 A . . B . . . -1.37 * . . -0.60 0.41
Asp 369 A . . B . . . -0.56 * . . -0.60 0.50
Lys 370 A A . . . . . -0.84 * . . -0.30 0.93
Phe 371 A A . B . . . -0.89 * . . -0.30 0.75
Ala 372 A A . B . . . -0.40 * . . -0.30 0.34
Asn 373 . A B B . . . -0.40 * . . -0.60 0.26
Ile 374 . A B B . . . -0.40 * . . -0.60 0.26
Val 375 . A B B . . . -0.74 . . . -0.60 0.43
Pro 376 . A . B . . C -0.33 . . . -0.10 0.36
Phe 377 . . . . T T . 0.26 . . . 0.20 0.54
Asp 378 . . . . T T . 0.26 . . F 0.80 1.21
Ser 379 . . . . T T . 0.33 . . F 1.40 1.35
Trp 380 A . . . . T . 0.59 * * F 0.40 1.29
Asp 381 A A . . . . . 0.91 * . F -0.15 0.76
Gln 382 A A . . . . . 1.61 * . . -0.15 1.11
Leu 383 A A . . . . . 0.80 * . . -0.15 1.84
Met 384 A A . . . . . 1.10 * . . 0.30 0.91
Arg 385 A A . . . . . 0.58 * . . 0.30 0.87
Grn 386 A A . . . . . 0.27 * . . -0.30 0.87
Leu 387 A A . . . . . 0.31 * . . 0.45 1.27
ASp 388 A A . . . . . 1.12 * . . 0.75 1.30
Leu 389 A A . . . . . 1.72 * . F 0.60 1.21
Thr 390 A . . . . T . 0.72 * . F 1.30 2.54
Lys 391 A . . . . T . 0.72 . * F 1.30 1.07
Asn 392 A . . . . T . 0.68 * * F 1.30 2.16
Glu 393 A . . . . T . -0.18 * . F 1.30 1.11
Ile 394 . . B B . . . 0.74 * . F 0.75 0.41
Asp 395 . . B B . . . 0.47 * * . 0.60 0.50
Val 396 . . B B . . . 0.08 * * . 0.60 0.29
Val 397 . . B B . . . -0.23 . . . 0.51 0.41
Arg 398 . . B . . T . -0.82 * . . 1.12 0.36
Ala 399 . . B . . T . -0.28 * . . 0.73 0.49
Gly 400 . . . . T T . -0.49 * . F 2.09 0.65
表4(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Thr 401 . . . . . T C 0.02 * * F 2.10 0.51
Ala 402 . . . . . . C 0.88 * * F 1.09 0.50
Gly 403 . . . . . T C 0.18 * * F 1.68 0.85
Pro 404 . . . . . T C -0.04 . . F 1.47 0.59
Gly 405 . . . . . T C 0.06 . . F 1.26 0.48
Asp 406 A . . . . T . -0.22 . . F 0.25 0.76
Ala 407 A A . . . . . -0.23 . . . -0.30 0.50
Leu 408 A A . . . . . -0.70 . . . -0.60 0.50
Tyr 409 A A . . . . . -1.09 * . . -0.60 0.25
Ala 410 A A . . . . . -0.70 * . . -0.60 0.24
Met 411 A A . . . . . -0.99 * . . -0.60 0.59
Leu 412 A A . . . . . -1.26 * . . -0.60 0.39
Met 413 A A . . . . . -0.44 * . . -0.60 0.29
Lys 414 A A . B . . . -0.16 * . . -0.60 0.47
Trpo 415 A A . B . . . 0.12 * . . 0.15 1.14
Val 416 A A . B . . . 0.38 * * . 0.45 1.66
Asn 417 A . . . . T . 1.30 * . F 1.75 0.82
Lys 418 A . . . . T . 1.90 * . F 2.20 1.53
Thr 419 . . . . . T C 1.27 * . F 3.00 3.32
Gly 420 . . . . . T C 1.26 * . F 2.70 2.08
Arg 421 . . . . T . . 1.22 * . F 2.40 1.40
Asn 422 . . . . . T C 1.19 * . F 1.65 0.68
Ala 423 . . B . . T . 0.83 . . . 1.00 0.93
Ser 424 . . B . . T . 0.33 . . . 0.70 0.69
Ile 425 . . B . . T . -0.13 . * . -0.20 0.35
His 426 . A B . . . . -0.24 . * . -0.60 0.29
Thr 427 . A B . . . . -0.83 * * . -0.60 0.36
Leu 428 A A . . . . . -1.06 * * . -0.60 0.52
Leu 429 A A . . . . . -0.76 * * . -0.60 0.31
Asp 430 A A . . . . . 0.24 * * . -0.30 0.38
Ala 431 A A . . . . . -0.32 * * . 0.30 0.89
Leu 432 A A . . . . . -0.01 * * . 0.75 1.07
Glu 433 A A . . . . . 0.80 * * . 0.75 1.11
Arg 434 A A . . . . . 1.72 * * F 0.90 1.90
Met 435 A A . . . . . 1.69 * * F 0.90 4.52
Glu 436 A A . . . . . 1.69 * * F 0.90 3.55
Glu 437 A A . . . . . 2.54 * . F 0.90 1.83
Arg 438 A A . . . . . 2.54 * * F 0.90 3.70
His 439 A A . . . . . 2.48 * * F 0.90 3.70
Ala 440 A A . . . . . 2.19 * * F 0.90 4.28
Lys 441 A A . . . . . 2.19 * * F 0.90 1.53
Glu 442 A A . . . . . 2.19 * . F 0.90 1.95
Lys 443 A A . . . . . 1.27 * * F 0.90 3.22
Ile 444 A A . . . . . 0.49 * * F 0.90 1.33
Gln 445 A A . . . . . 0.22 * * F 0.75 0.63
Asp 446 A A . . . . . 0.18 * * F -0.15 0.23
Leu 447 A A . . . . . -0.12 * . . -0.30 0.56
Leu 448 A A . . . . . -0.51 * . . 0.55 0.43
Val 449 A A . . . . . 0.42 * . F 0.95 0.26
Asp 450 A . . . . T . -0.28 * . F 1.60 0.62
表4(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Ser 451 . . . . T T . -1.17 * . F 2.25 0.65
Gly 452 . . . . T T . -0.60 * . F 2.50 0.62
Lys 453 . . B . . T . -0.60 . . F 1.25 0.58
Phe 454 . A B . . . . 0.26 . . . 0.15 0.36
Ile 455 . A B . . . . 0.26 . . . 0.20 0.62
Tyr 456 . A B . . . . 0.21 . . . 0.55 0.52
Leu 457 . A B . . . . 0.24 . . . -0.03 0.59
Glu 458 . A B . . . . -0.14 . . F 0.54 1.22
Asp 459 . A . . T . . 0.26 . . F 1.66 0.77
Gly 460 . . . . T T . 0.56 . . F 2.78 1.26
Thr 461 . . . . . T C -0.06 * . F 2.70 0.73
Gly 462 . . . . . T C 0.46 * . F 2.13 0.33
Ser 463 . . . . . T C -0.36 . . F 1.26 0.44
Ala 464 A . . . . . . -0.36 . . . 0.14 0.25
Val 465 . . B . . . . -0.40 . . . 0.17 0.44
Ser 466 . . B . . . . -0.48 . . . -0.10 0.42
Leu 467 . . B . . . . -0.52 . . . -0.10 0.53
Glu 468 A . . . . . . -0.61 . . . 0.50 0.92
另一方面，本发明提供了一种抗体，其结合包含本发明所述多肽的携带表位部分的一种肽或多肽。这种多肽部分的表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指当整个蛋白质是免疫原时激发抗体应答的蛋白质部分。另一方面，抗体可以结合的蛋白质分子的区域是“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位数一般少于抗原性表位数。见例如Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(1983)。
为选择携带抗原性表位(即含有抗体可以结合的蛋白质分子的区域)的肽或多肽，本领域熟知的是，模拟蛋白质序列一部分的相对短的合成肽通常能激发与所述被部分模拟的蛋白质反应的抗血清。见例如Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.(1983)Antibodies that react with predetermined sites on proteins.Science219：660-666。能激发蛋白质反应性血清的肽通常在蛋白质的初级序列中呈现，可以通过一系列简便的化学规则定性，而且既不限于完整蛋白质的免疫显性区域(即免疫原性表位)，也不限于氨基或羧基末端。
因此携带抗原性表位的肽和多肽可用于产生结合本发明TR4多肽的抗体，包括单克隆抗体。见，例如Wilson等，Cell 37：767-778(1984)的第777页所述。携带抗原性表位的肽和多肽优选含有一种序列，所述序列具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中包含的至少7个，更优选至少9个及最优选至少大约15至大约30个氨基酸之间。
本发明的抗体可以结合一或多种抗原性TR4多肽或肽，包括但非限于：包含SEQ ID NO：1的大约第35至大约第92位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：1的大约第114至大约第160位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：1的大约第169至大约第240位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：1的大约第267至大约第298位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：1的大约第330至大约第364位氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：1的大约第391至大约第404位氨基酸残基的多肽；和/或包含SEQ ID NO：1的大约第418至大约第465位氨基酸残基的多肽。文中“大约”包括所述特定范围，及在一端或两端多或少几个(5，4，3，2或1个)氨基酸的范围。如上所述，本发明人已经确定了上述多肽片段是TR4蛋白的抗原性区域。携带表位的TR4肽和多肽可以通过任何常规方法产生。Houghten，R.A.，“Generalmethod for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides：specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual aminoacids，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135(1985)。这个“同时多个肽合成(SMPS)”方法在Houghten等(1986)的美国专利No.4631211中进一步描述。
本领域技术人员能意识到，本文所述TR4多肽及其携带表位的片段(例如相应于胞外结构域的一部分，例如SEQ ID NO：1的第1至240位氨基酸残基)，可以与免疫球蛋白(IgG)的恒定区结构域的部分结合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白便于纯化并示出体内半衰期延长。这已经由例如由人CD4多肽的前两个结构域与哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链恒定区的多个结构域组成的嵌合蛋白示出(EPA394827；Traunecker等，Nature 331：84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白比单独的单体TR4蛋白或蛋白质片段能够更有效结合及中和其它分子(Fountoulakis等，J.Biochem 270：3958-3964(1995))。因此，本发明的抗体可以结合包含完整或部分TR4多肽如TR4的融合蛋白。
本领域已知的重组DNA技术可以用于产生新的突变蛋白质或称“突变蛋白(muteins)”，所述突变蛋白包括单个或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出例如增强的活性或提高的稳定性。另外，至少在一定的纯化和贮存条件下，它们可以比相应的天然多肽以较高产量纯化，并示出更好的溶解性。本发明的抗体也可以结合这些修饰的TR4多肽或TR4多肽片段或变体。
例如，就许多蛋白质，包括膜结合蛋白的胞外结构域或者分泌蛋白的成熟形式而言，本领域已知可以从N末端或C末端缺失一或多个氨基酸而基本不丧失生物学功能，或者不丧失由特异性抗体结合的能力。例如Ron等，J.Biol.Chem.268：2984-2988(1993)报道了修饰的KGF蛋白，其即使缺失3，8或27个氨基末端氨基酸仍具有肝素结合活性。在目前的情况中，由于TR4是含有死亡结构域受体(DDCR)多肽家族的一个成员，因此N末端氨基酸直至SEQ ID NO：1中第109位半胱氨酸残基的缺失仍可保留一些生物学活性，如诱导凋亡的能力。具有进一步N末端缺失包括SEQ ID NO：1中第109位(C-109)的半胱氨酸残基缺失的多肽不期望保留这种生物学活性，因为这个残基在家族成员中是保守的，而且是形成二硫键以提供配体结合所需要的结构稳定性所需的。
然而，即使蛋白质的N末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质被修饰或丧失一或多种生物学功能，但其它功能活性仍可保留(例如生物学活性，多聚化能力，结合TR4配体(例如TRAIL)的能力)。例如，当完整或成熟多肽的少于大部分的残基从N末端除去时，缩短的TR4多肽诱导和/或结合能识别完整或成熟形式TR4多肽的抗体的能力一般仍保留。缺失完整多肽N末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫原性活性，可易于通过在此所述常规方法及本领域已知其它方法确定。大量缺失N末端氨基酸残基的TR4多肽仍保留一些生物学或免疫原性活性不是不可能的。事实上，由少如6个TR4氨基酸残基组成的肽通常仍可激发免疫应答。
因此，本发明进一步提供了结合如下多肽的抗体及编码这种多肽的多核苷酸，所述多肽具有自SEQ ID NO：1的TR4氨基酸序列的氨基末端直至第463位丝氨酸残基缺失一或多个残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：1的第n1-468位的氨基酸序列，其中n1是相当于SEQ ID NO：1中氨基酸残基位置2-463之间的整数。
更特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含或由以下残基的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：1的TR4序列的A-2至E-468；P-3至E-468；P-4至E-468；P-5至E-468；A-6至E-468；R-7至E-468；V-8至E-468；H-9至E-468；L-10至E-468；G-11至E-468；A-12至E-468；F-13至E-468；L-14至E-468；A-15至E-468；V-16至E-468；T-17至E-468；P-18至E-468；N-19至E-468；P-20至E-468；G-21至E-468；S-22至E-468；A-23至E-468；A-24至E-468；S-25至E-468；G-26至E-468；T-27至E-468；E-28至E-468；A-29至E-468；A-30至E-468；A-31至E-468；A-32至E-468；T-33至E-468；P-34至E-468；S-35至E-468；K-36至E-468；V-37至E-468；W-38至E-468；G-39至E-468；S-40至E-468；S-41至E-468；A-42至E-468；G-43至E-468；R-44至E-468；I-45至E-468；E-46至E-468；P-47至E-468；R-48至E-468；G-49至E-468；G-50至E-468；G-51至E-468；R-52至E-468；G-53至E-468；A-54至E-468；L-55至E-468；P-56至E-468；T-57至E-468；S-58至E-468；M-59至E-468；G-60至E-468；Q-61至E-468；H-62至E-468；G-63至E-468；P-64至E-468；S-65至E-468；A-66至E-468；R-67至E-468；A-68至E-468；R-69至E-468；A-70至E-468；G-71至E-468；R-72至E-468；A-73至E-468；P-74至E-468；G-75至E-468；P-76至E-468；R-77至E-468；P-78至E-468；A-79至E-468；R-80至E-468；E-81至E-468；A-82至E-468；S-83至E-468；P-84至E-468；R-85至E-468；L-86至E-468；R-87至E-468；V-88至E-468；H-89至E-468；K-90至E-468；T-91至E-468；F-92至E-468；K-93至E-468；F-94至E-468；V-95至E-468；V-96至E-468；V-97至E-468；G-98至E-468；V-99至E-468；L-100至E-468；L-101至E-468；Q-102至E-468；V-103至E-468；V-104至E-468；P-105至E-468；S-106至E-468；S-107至E-468；A-108至E-468；A-109至E-468；T-110至E-468；I-111至E-468；K-112至E-468；L-113至E-468；H-114至E-468；D-115至E-468；Q-116至E-468；S-117至E-468；I-118至E-468；G-119至E-468；T-120至E-468；Q-121至E-468；Q-122至E-468；W-123至E-468；E-124至E-468；H-125至E-468；S-126至E-468；P-127至E-468；L-128至E-468；G-129至E-468；E-130至E-468；L-131至E-468；C-132至E-468；P-133至E-468；P-134至E-468；G-135至E-468；S-136至E-468；H-137至E-468；R-138至E-468；S-139至E-468；E-140至E-468；R-141至E-468；P-142至E-468；G-143至E-468；A-144至E-468；C-145至E-468；N-146至E-468；R-147至E-468；C-148至E-468；T-149至E-468；E-150至E-468；G-151至E-468；V-152至E-468；G-153至E-468；Y-154至E-468；T-155至E-468；N-156至E-468；A-157至E-468；S-158至E-468；N-159至E-468；N-160至E-468；L-161至E-468；F-162至E-468；A-163至E-468；C-164至E-468；L-165至E-468；P-166至E-468；C-167至E-468；T-168至E-468；A-169至E-468；C-170至E-468；K-171至E-468；S-172至E-468；D-173至E-468；E-174至E-468；E-175至E-468；E-176至E-468；R-177至E-468；S-178至E-468；P-179至E-468；C-180至E-468；T-181至E-468；T-182至E-468；T-183至E-468；R-184至E-468；N-185至E-468；T-186至E-468；A-187至E-468；C-188至E-468；Q-189至E-468；C-190至E-468；K-191至E-468；P-192至E-468；G-193至E-468；T-194至E-468；F-195至E-468；R-196至E-468；N-197至E-468；D-198至E-468；N-199至E-468；S-200至E-468；A-201至E-468；E-202至E-468；M-203至E-468；C-204至E-468；R-205至E-468；K-206至E-468；C-207至E-468；S-208至E-468；T-209至E-468；G-210至E-468；C-211至E-468；P-212至E-468；R-213至E-468；G-214至E-468；M-215至E-468；V-216至E-468；K-217至E-468；V-218至E-468；K-219至E-468；D-220至E-468；C-221至E-468；T-222至E-468；P-223至E-468；W-224至E-468；S-225至E-468；D-226至E-468；I-227至E-468；E-228至E-468；C-229至E-468；V-230至E-468；H-231至E-468；K-232至E-468；E-233至E-468；S-234至E-468；G-235至E-468；N-236至E-468；G-237至E-468；H-238至E-468；N-239至E-468；I-240至E-468；W-241至E-468；V-242至E-468；I-243至E-468；L-244至E-468；V-245至E-468；V-246至E-468；T-247至E-468；L-248至E-468；V-249至E-468；V-250至E-468；P-251至E-468；L-252至E-468；L-253至E-468；L-254至E-468；V-255至E-468；A-256至E-468；V-257至E-468；L-258至E-468；I-259至E-468；V-260至E-468；C-261至E-468；C-262至E-468；C-263至E-468；I-264至E-468；G-265至E-468；S-266至E-468；G-267至E-468；C-268至E-468；G-269至E-468；G-270至E-468；D-271至E-468；P-272至E-468；K-273至E-468；C-274至E-468；M-275至E-468；D-276至E-468；R-277至E-468；V-278至E-468；C-279至E-468；F-280至E-468；W-281至E-468；R-282至E-468；L-283至E-468；G-284至E-468；L-285至E-468；L-286至E-468；R-287至E-468；G-288至E-468；P-289至E-468；G-290至E-468；A-291至E-468；E-292至E-468；D-293至E-468；N-294至E-468；A-295至E-468；H-296至E-468；N-297至E-468；E-298至E-468；I-299至E-468；L-300至E-468；S-301至E-468；N-302至E-468；A-303至E-468；D-304至E-468；S-305至E-468；L-306至E-468；S-307至E-468；T-308至E-468；F-309至E-468；V-310至E-468；S-311至E-468；E-312至E-468；Q-313至E-468；Q-314至E-468；M-315至E-468；E-316至E-468；S-317至E-468；Q-318至E-468；E-319至E-468；P-320至E-468；A-321至E-468；D-322至E-468；L-323至E-468；T-324至E-468；G-325至E-468；V-326至E-468；T-327至E-468；V-328至E-468；Q-329至E-468；S-330至E-468；P-331至E-468；G-332至E-468；E-333至E-468；A-334至E-468；Q-335至E-468；C-336至E-468；L-337至E-468；L-338至E-468；G-339至E-468；P-340至E-468；A-341至E-468；E-342至E-468；A-343至E-468；E-344至E-468；G-345至E-468；S-346至E-468；Q-347至E-468；R-348至E-468；R-349至E-468；R-350至E-468；L-351至E-468；L-352至E-468；V-353至E-468；P-354至E-468；A-355至E-468；N-356至E-468；G-357至E-468；A-358至E-468；D-359至E-468；P-360至E-468；T-361至E-468；E-362至E-468；T-363至E-468；L-364至E-468；M-365至E-468；L-366至E-468；F-367至E-468；F-368至E-468；D-369至E-468；K-370至E-468；F-371至E-468；A-372至E-468；N-373至E-468；I-374至E-468；V-375至E-468；P-376至E-468；F-377至E-468；D-378至E-468；S-379至E-468；W-380至E-468；D-381至E-468；Q-382至E-468；L-383至E-468；M-384至E-468；R-385至E-468；Q-386至E-468；L-387至E-468；D-388至E-468；L-389至E-468；T-390至E-468；K-391至E-468；N-392至E-468；E-393至E-468；I-394至E-468；D-395至E-468；V-396至E-468；V-397至E-468；R-398至E-468；A-399至E-468；G-400至E-468；T-401至E-468；A-402至E-468；G-403至E-468；P-404至E-468；G-405至E-468；D-406至E-468；A-407至E-468；L-408至E-468；Y-409至E-468；A-410至E-468；M-411至E-468；L-412至E-468；M-413至E-468；K-414至E-468；W-415至E-468；V-416至E-468；N-417至E-468；K-418至E-468；T-419至E-468；G-420至E-468；R-421至E-468；N-422至E-468；A-423至E-468；S-424至E-468；I-425至E-468；H-426至E-468；T-427至E-468；L-428至E-468；L-429至E-468；D-430至E-468；A-431至E-468；L-432至E-468；E-433至E-468；R-434至E-468；M-435至E-468；E-436至E-468；E-437至E-468；R-438至E-468；H-439至E-468；A-440至E-468；K-441至E-468；E-442至E-468；K-443至E-468；I-444至E-468；Q-445至E-468；D-446至E-468；L-447至E-468；L-448至E-468；V-449至E-468；D-450至E-468；S-451至E-468；G-452至E-468；K-453至E-468；F-454至E-468；I-455至E-468；Y-456至E-468；L-457至E-468；E-458至E-468；D-459至E-468；G-460至E-468；T-461至E-468；G-462至E-468；和/或S-463至E-468。
在另一个实施方案中，TR4多肽的N末端缺失可以用通式n2-238描述，其中n2是相当于SEQ ID NO：1所鉴别的氨基酸序列的2-238位的一个数目。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合包含或由以下残基的氨基酸序列组成的TR4的N末端缺失：SEQ ID NO：1的TR4胞外结构域序列的A-2至H-238；P-3至H-238；P-4至H-238；P-5至H-238；A-6至H-238；R-7至H-238；V-8至H-238；H-9至H-238；L-10至H-238；G-11至H-238；A-12至H-238；F-13至H-238；L-14至H-238；A-15至H-238；V-16至H-238；T-17至H-238；P-18至H-238；N-19至H-238；P-20至H-238；G-21至H-238；S-22至H-238；A-23至H-238；A-24至H-238；S-25至H-238；G-26至H-238；T-27至H-238；E-28至H-238；A-29至H-238；A-30至H-238；A-31至H-238；A-32至H-238；T-33至H-238；P-34至H-238；S-35至H-238；K-36至H-238；V-37至H-238；W-38至H-238；G-39至H-238；S-40至H-238；S-41至H-238；A-42至H-238；G-43至H-238；R-44至H-238；I-45至H-238；E-46至H-238；P-47至H-238；R-48至H-238；G-49至H-238；G-50至H-238；G-51至H-238；R-52至H-238；G-53至H-238；A-54至H-238；I-55至H-238；P-56至H-238；T-57至H-238；S-58至H-238；M-59至H-238；G-60至H-238；Q-61至H-238；H-62至H-238；G-63至H-238；P-64至H-238；S-65至H-238；A-66至H-238；R-67至H-238；A-68至H-238；R-69至H-238；A-70至H-238；G-71至H-238；R-72至H-238；A-73至H-238；P-74至H-238；G-75至H-238；P-76至H-238；R-77至H-238；P-78至H-238；A-79至H-238；R-80至H-238；E-81至H-238；A-82至H-238；S-83至H-238；P-84至H-238；R-85至H-238；L-86至H-238；R-87至H-238；V-88至H-238；H-89至H-238；K-90至H-238；T-91至H-238；F-92至H-238；K-93至H-238；F-94至H-238；V-95至H-238；V-96至H-238；V-97至H-238；G-98至H-238；V-99至H-238；L-100至H-238；L-101至H-238；Q-102至H-238；V-103至H-238；V-104至H-238；P-105至H-238；S-106至H-238；S-107至H-238；A-108至H-238；A-109至H-238；T-110至H-238；I-111至H-238；K-112至H-238；L-113至H-238；H-114至H-238；D-115至H-238；Q-116至H-238；S-117至H-238；I-118至H-238；G-119至H-238；T-120至H-238；Q-121至H-238；Q-122至H-238；W-123至H-238；E-124至H-238；H-125至H-238；S-126至H-238；P-127至H-238；L-128至H-238；G-129至H-238；E-130至H-238；L-131至H-238；C-132至H-238；P-133至H-238；P-134至H-238；G-135至H-238；S-136至H-238；H-137至H-238；R-138至H-238；S-139至H-238；E-140至H-238；R-141至H-238；P-142至H-238；G-143至H-238；A-144至H-238；C-145至H-238；N-146至H-238；R-147至H-238；C-148至H-238；T-149至H-238；E-150至H-238；G-151至H-238；V-152至H-238；G-153至H-238；Y-154至H-238；T-155至H-238；N-156至H-238；A-157至H-238；S-158至H-238；N-159至H-238；N-160至H-238；L-161至H-238；F-162至H-238；A-163至H-238；C-164至H-238；L-165至H-238；P-166至H-238；C-167至H-238；T-168至H-238；A-169至H-238；C-170至H-238；K-171至H-238；S-172至H-238；D-173至H-238；E-174至H-238；E-175至H-238；E-176至H-238；R-177至H-238；S-178至H-238；P-179至H-238；C-180至H-238；T-181至H-238；T-182至H-238；T-183至H-238；R-184至H-238；N-185至H-238；T-186至H-238；A-187至H-238；C-188至H-238；Q-189至H-238；C-190至H-238；K-191至H-238；P-192至H-238；G-193至H-238；T-194至H-238；F-195至H-238；R-196至H-238；N-197至H-238；D-198至H-238；N-199至H-238；S-200至H-238；A-201至H-238；E-202至H-238；M-203至H-238；C-204至H-238；R-205至H-238；K-206至H-238；C-207至H-238；S-208至H-238；T-209至H-238；G-210至H-238；C-211至H-238；P-212至H-238；R-213至H-238；G-214至H-238；M-215至H-238；V-216至H-238；K-217至H-238；V-218至H-238；K-219至H-238；D-220至H-238；C-221至H-238；T-222至H-238；P-223至H-238；W-224至H-238；S-225至H-238；D-226至H-238；I-227至H-238；E-228至H-238；C-229至H-238；V-230至H-238；H-231至H-238；K-232至H-238；和/或E-233至H-238。
如上所述，即使蛋白质C末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质被修饰而丧失一或多种生物学功能，但其它功能活性(例如生物学活性，多聚体化能力，结合DR4配体(例如TRAIL)的能力)仍可保留。例如当从C末端除去完整或成熟多肽的一少部分(less than the majority)残基时，缩短的TR4多肽诱导和/或结合识别完整或成熟形式TR4多肽的抗体的能力仍保留。缺失完整多肽C末端残基的一种特定多肽是否保留这种免疫学活性可以通过本发明所述常规方法及本领域已知的其它方法确定。缺失大量C末端氨基酸残基的TR4多肽仍保留一些生物学活性或免疫原性活性不是不可能的。事实上，由少如6个TR4氨基酸残基组成的肽通常就能激发免疫应答。
因此，本发明进一步提供了结合如下多肽的抗体及编码这种多肽的多核苷酸，所述多肽中自SEQ ID NO：1的TR4多肽氨基酸序列的羧基末端直至第30位丙氨酸残基缺失一或多个残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：1的24-m1残基的氨基酸序列，其中m1是相当于SEQ ID NO：1中氨基酸残基位置30-467之间的一个整数。
更特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽包含或由以下残基的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：1的TR4序列的A-24至L-467；A-24至S-466；A-24至V-465；A-24至A-464；A-24至S-463；A-24至G-462；A-24至T-461；A-24至G-460；A-24至D-459；A-24至E-458；A-24至L-457；A-24至Y-456；A-24至I-55；A-24至F-454；A-24至K-453；A-24至G-452；A-24至S-451；A-24至D-450；A-24至V-449；A-24至L-448；A-24至L-447；A-24 D-446；A-24至Q-445；A-24至I-444；A-24至K-443；A-24至E-442；A-24至K-441；A-24至A-440；A-24至H-439；A-24至R-438；A-24至E-437；A-24至E-436；A-24至M-435；A-24至R-434；A-24至E-433；A-24至L-432；A-24至A-431；A-24至D-430；A-24至L-429；A-24至L-428；A-24至T-427；A-24至H-426；A-24至I-425；A-24至S-424；A-24至A-423；A-24至N-422；A-24至R-421；A-24至G-420；A-24至T-419；A-24至K-418；A-24至N-417；A-24至V-416；A-24至W-415；A-24至K-414；A-24至M-413；A-24至L-412；A-24至M-411；A-24至A-410；A-24至Y-409；A-24至L-408；A-24至A-407；A-24至D-406；A-24至G-405；A-24至P-404；A-24至G-403；A-24至A-402；A-24至T-401；A-24至G-400；A-24至A-399；A-24至R-398；A-24至V-397；A-24至V-396；A-24至D-395；A-24至I-394；A-24至E-393；A-24至N-392；A-24至K-391；A-24至T-390；A-24至L-389；A-24至D-388；A-24至L-387；A-24至Q-386；A-24至R-385；A-24至M-384；A-24至L-383；A-24至Q-382；A-24至D-381；A-24至W-380；A-24至S-379；A-24至D-378；A-24至F-377；A-24至P-376；A-24至V-375；A-24至I-374；A-24至N-373；A-24至A-372；A-24至F-371；A-24至K-370；A-24至D-369；A-24至F-368；A-24至F-367；A-24至L-366；A-24至M-365；A-24至L-364；A-24至T-363；A-24至E-362；A-24至T-361；A-24至P-360；A-24至D-359；A-24至A-358；A-24至G-357；A-24至N-356；A-24至A-355；A-24至P-354；A-24至V-353；A-24至L-352；A-24至L-351；A-24至R-350；A-24至R-349；A-24至R-348；A-24至Q-347；A-24至S-346；A-24至G-345；A-24至E-344；A-24至A-343；A-24至E-342；A-24至A-341；A-24至P-340；A-24至G-339；A-24至L-338；A-24至L-337；A-24至C-336；A-24至Q-335；A-24至A-334；A-24至E-333；A-24至G-332；A-24至P-331；A-24至S-330；A-24至Q-329；A-24至V-328；A-24至T-327；A-24至V-326；A-24至G-325；A-24至T-324；A-24至L-323；A-24至D-322；A-24至A-321；A-24至P-320；A-24至E-319；A-24至Q-318；A-24至S-317；A-24至E-316；A-24至M-315；A-24至Q-314；A-24至Q-313；A-24至E-312；A-24至S-311；A-24至V-310；A-24至F-309；A-24至T-308；A-24至S-307；A-24至L-306；A-24至S-305；A-24至D-304；A-24至A-303；A-24至N-302；A-24至S-301；A-24至L-300；A-24至I-299；A-24至E-298；A-24至N-297；A-24至H-296；A-24至A-295；A-24至N-294；A-24至D-293；A-24至E-292；A-24至A-291；A-24至G-290；A-24至P-289；A-24至G-288；A-24至R-287；A-24至L-286；A-24至L-285；A-24至G-284；A-24至L-283；A-24至R-282；A-24至W-281；A-24至F-280；A-24至C-279；A-24至V-278；A-24至R-277；A-24至D-276；A-24至M-275；A-24至C-274；A-24至K-273；A-24至P-272；A-24至D-271；A-24至G-270；A-24至G-269；A-24至C-268；A-24至G-267；A-24至S-266；A-24至G-265；A-24至I-264；A-24至C-263；A-24至C-262；A-24至C-261；A-24至V-260；A-24至I-259；A-24至L-258；A-24至V-257；A-24至A-256；A-24至V-255；A-24至L-254；A-24至L-253；A-24至L-252；A-24至P-251；A-24至V-250；A-24至V-249；A-24至L-248；A-24至T-247；A-24至V-246；A-24至V-245；A-24至L-244；A-24至I-243；A-24至V-242；A-24至W-241；A-24至I-240；A-24至N-239；A-24至H-238；A-24至G-237；A-24至N-236；A-24至G-235；A-24至S-234；A-24至E-233；A-24至K-232；A-24至H-231；A-24至V-230；A-24至C-229；A-24至E-228；A-24至I-227；A-24至D-226；A-24至S-225；A-24至W-224；A-24至P-223；A-24至T-222；A-24至C-221；A-24至D-220；A-24至K-219；A-24至V-218；A-24至K-217；A-24至V-216；A-24至M-215；A-24至G-214；A-24至R-213；A-24至P-212；A-24至C-211；A-24至G-210；A-24至T-209；A-24至S-208；A-24至C-207；A-24至K-206；A-24至R-205；A-24至C-204；A-24至M-203；A-24至E-202；A-24至A-201；A-24至S-200；A-24至N-199；A-24至D-198；A-24至N-197；A-24至R-196；A-24至F-195；A-24至T-194；A-24至G-193；A-24至P-192；A-24至K-191；A-24至C-190；A-24至Q-189；A-24至C-188；A-24至A-187；A-24至T-186；A-24至N-185；A-24至R-184；A-24至T-183；A-24至T-182；A-24至T-181；A-24至C-180；A-24至P-179；A-24至S-178；A-24至R-177；A-24至E-176；A-24至E-175；A-24至E-174；A-24至D-173；A-24至S-172；A-24至K-171；A-24至C-170；A-24至A-169；A-24至T-168；A-24至C-167；A-24至P-166；A-24至L-165；A-24至C-164；A-24至A-163；A-24至F-162；A-24至L-161；A-24至N-160；A-24至N-159；A-24至S-158；A-24至A-157；A-24至N-156；A-24至T-155；A-24至Y-154；A-24至G-153；A-24至V-152；A-24至G-151；A-24至E-150；A-24至T-149；A-24至C-148；A-24至R-147；A-24至N-146；A-24至C-145；A-24至A-144；A-24至G-143；A-24至P-142；A-24至R-141；A-24至E-140；A-24至S-139；A-24至R-138；A-24至H-137；A-24至S-136；A-24至G-135；A-24至P-134；A-24至P-133；A-24至C-132；A-24至L-131；A-24至E-130；A-24至G-129；A-24至L-128；A-24至P-127；A-24至S-126；A-24至H-125；A-24至E-124；A-24至W-123；A-24至Q-122；A-24至Q-121；A-24至T-120；A-24至G-119；A-24至I-118；A-24至S-117；A-24至Q-116；A-24至D-115；A-24至H-114；A-24至L-113；A-24至K-112；A-24至I-111；A-24至T-110；A-24至A-109；A-24至A-108；A-24至S-107；A-24至S-106；A-24至P-105；A-24至V-104；A-24至V-103；A-24至Q-102；A-24至L-101；A-24至L-100；A-24至V-99；A-24至G-98；A-24至V-97；A-24至V-96；A-24至V-95；A-24至F-94；A-24至K-93；A-24至F-92；A-24至T-91；A-24至K-90；A-24至H-89；A-24至V-88；A-24至R-87；A-24至L-86；A-24至R-85；A-24至P-84；A-24至S-83；A-24至A-82；A-24至E-81；A-24至R-80；A-24至A-79；A-24至P-78；A-24至R-77；A-24至P-76；A-24至G-75；A-24至P-74；A-24至A-73；A-24至R-72；A-24至G-71；A-24至A-70；A-24至R-69；A-24至A-68；A-24至R-67；A-24至A-66；A-24至S-65；A-24至P-64；A-24至G-63；A-24至H-62；A-24至Q-61；A-24至G-60；A-24至M-59；A-24至S-58；A-24至T-57；A-24至P-56；A-24至L-55；A-24至A-54；A-24至G-53；A-24至R-52；A-24至G-51；A-24至G-50；A-24至G-49；A-24至R-48；A-24至P-47；A-24至E-46；A-24至I-45；A-24至R-44；A-24至G-43；A-24至A-42；A-24至S-41；A-24至S-40；A-24至G-39；A-24至W-38；A-24至V-37；A-24至K-36；A-24至S-35；A-24至P-34；A-24至T-33；A-24至A-32；A-24至A-31；和/或A-24至A-30。
在另一个实施方案中，本发明的抗体结合可以用通式24-m2描述的TR4多肽的C末端缺失体，其中m2是相当于SEQ ID NO：1所鉴别的氨基酸序列的30-238位的一个数。在特异的实施方案中，本发明提供了结合包含或由以下残基氨基酸序列组成的TR4多肽的抗体：SEQ ID NO：1的TR4胞外结构域序列的A-24至G-237；A-24至N-236；A-24至G-235；A-24至S-234；A-24至E-233；A-24至K-232；A-24至H-231；A-24至V-230；A-24至C-229；A-24至E-228；A-24至I-227；A-24至D-226；A-24至S-225；A-24至W-224；A-24至P-223；A-24至T-222；A-24至C-221；A-24至D-220；A-24至K-219；A-24至V-218；A-24至K-217；A-24至V-216；A-24至M-215；A-24至G-214；A-24至R-213；A-24至P-212；A-24至C-211；A-24至G-210；A-24至T-209；A-24至S-208；A-24至C-207；A-24至K-206；A-24至R-205；A-24至C-204；A-24至M-203；A-24至E-202；A-24至A-201；A-24至S-200；A-24至N-199；A-24至D-198；A-24至N-197；A-24至R-196；A-24至F-195；A-24至T-194；A-24至G-193；A-24至P-192；A-24至K-191；A-24至C-190；A-24至Q-189；A-24至C-188；A-24至A-187；A-24至T-186；A-24至N-185；A-24至R-184；A-24至T-183；A-24至T-182；A-24至T-181；A-24至C-180；A-24至P-179；A-24至S-178；A-24至R-177；A-24至E-176；A-24至E-175；A-24至E-174；A-24至D-173；A-24至S-172；A-24至K-171；A-24至C-170；A-24至A-169；A-24至T-168；A-24至C-167；A-24至P-166；A-24至L-165；A-24至C-164；A-24至A-163；A-24至F-162；A-24至L-161；A-24至N-160；A-24至N-159；A-24至S-158；A-24至A-157；A-24至N-156；A-24至T-155；A-24至Y-154；A-24至G-153；A-24至V-152；A-24至G-151；A-24至E-150；A-24至T-149；A-24至C-148；A-24至R-147；A-24至N-146；A-24至C-145；A-24至A-144；A-24至G-143；A-24至P-142；A-24至R-141；A-24至E-140；A-24至S-139；A-24至R-138；A-24至H-137；A-24至S-136；A-24至G-135；A-24至P-134；A-24至P-133；A-24至C-132；A-24至L-131；A-24至E-130；A-24至G-129；A-24至L-128；A-24至P-127；A-24至S-126；A-24至H-125；A-24至E-124；A-24至W-123；A-24至Q-122；A-24至Q-121；A-24至T-120；A-24至G-119；A-24至I-118；A-至S-117；A-24至Q-116；A-24至D-115；A-24至H-114；A-24至L-113；A-24至K-112；A-24至I-111；A-24至T-110；A-24至A-109；A-24至A-108；A-24至S-107；A-24至S-106；A-24至P-105；A-24至V-104；A-24至V-103；A-24至Q-102；A-24至L-101；A-24至L-100；A-24至V-99；A-24至G-98；A-24至V-97；A-24至V-96；A-24至V-95；A-24至F-94；A-24至K-93；A-24至F-92；A-24至T-91；A-24至K-90；A-24至H-89；A-24至V-88；A-24至R-87；A-24至L-86；A-24至R-85；A-24至P-84；A-24至S-83；A-24至A-82；A-24至E-81；A-24至R-80；A-24至A-79；A-24至P-78；A-24至R-77；A-24至P-76；A-24至G-75；A-24至P-74；A-24至A-73；A-24至R-72；A-24至G-71；A-24至A-70；A-24至R-69；A-24至A-68；A-24至R-67；A-24至A-66；A-24至S-65；A-24至P-64；A-24至G-63；A-24至H-62；A-24至Q-61；A-24至G-60；A-24至M-59；A-24至S-58；A-24至T-57；A-24至P-56；A-24至L-55；A-24至A-54；A-24至G-53；A-24至R-52；A-24至G-51；A-24至G-50；A-24至G-49；A-24至R-48；A-24至P-47；A-24至E-46；A-24至I-45；A-24至R-44；A-24至G-43；A-24至A-42；A-24至S-41；A-24至S-40；A-24至G-39；A-24至W-38；A-24至V-37；A-24至K-36；A-24至S-35；A-24至P-34；A-24至T-33；A-24至A-32；A-24至A-31；和/或A-24至A-30。
本发明还提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽具有SEQ IDNO：1的TR4多肽氨基酸序列的羧基末端直至SEQ ID NO：1的C-221的一或多个氨基酸残基。特别地，本发明提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的1-m9残基的氨基酸序列，其中m9是221-468之间的任何整数，而且残基C-221确信是TR4蛋白的受体结合活性所需的完整TR4多肽(SEQ ID NO：1所示)的C末端的第一个残基位。
本发明还提供了结合如下多肽的抗体，所述多肽具有自TR4多肽氨基和羧基末端缺失一或多个氨基酸，其可以一般描述为具有SEQID NO：1的第n1-m1位残基和/或第n2-m2位残基，其中n1，n2，m1和m2是如上所述的整数。
本发明还包括结合如下多肽的抗体，所述多肽由ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆编码的完整TR4氨基酸序列的一部分组成，其中该部分不包括ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的氨基末端的1至大约108个氨基酸，或者不包括ATCC保藏物No.97853中包含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列羧基末端的1至大约247个氨基酸，或者上述氨基末端和羧基末端缺失的任意组合。
优选地，本发明抗体结合包含一部分胞外结构域；即在SEQ IDNO：1的第24-238位残基内的TR4片断，因为在此范围之间的任何部分均预期是可溶的。
本领域意识到TR4的一些氨基酸序列可以加以变化而不明显影响该蛋白质的结构和功能。如果这种序列差异是预期的，应记得蛋白质之上应存在决定活性的关键区域。这种区域通常包含组成配体结合位点或死亡结构域的残基，或者形成影响这些结构域的三级结构的残基。
因此，本发明进一步包括结合TR4蛋白变体的抗体，所述变体示出基本的TR4蛋白活性或包括TR4区域如下述蛋白质片断。这种突变体包括缺失，插入，翻转，重复和典型取代。关于氨基酸变化可以是表型沉默的指导可见于Bowie，J.U.等，Science 247：1306-1310(1990)。
因此，本发明抗体可以结合SEQ ID NO：1所示多肽的片段，衍生物或类似物，或者由ATCC保藏物97853中cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物。这种片段，变体或衍生物可以是(i)这样的片段、变体或衍生物，其中至少一或多个氨基酸残基由保守或非保守的氨基酸残基(优选保守氨基酸残基，更优选至少1个但少于10个保守氨基酸残基)取代，而且这种取代的氨基酸残基可以由或不由遗传密码编码，或者(ii)这样的片段、变体或衍生物，其中一或多个氨基酸残基包括一个取代基团，或者(iii)这样的片段、变体或衍生物，其中成熟多肽与另一种化合物，如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或者(iv)这样的片段、变体或衍生物，其中附加的氨基酸融合于成熟多肽，如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或前蛋白序列。根据本发明教导，这些片段，衍生物和类似物在本领域技术人员所知的范围内。
特别感兴趣的是一种荷电氨基酸由另一种荷电氨基酸及中性或负电氨基酸取代。后者产生正电荷减少的蛋白质，以改良TR4蛋白的特性。特别需要防止聚集。蛋白质的聚集不仅导致活性丧失，而且当制备药物配方时也存在问题，因为它们可以是免疫原性的(Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2：331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36：838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystem10：307-377(1993))。
氨基酸置换也可以改变与细胞表面受体结合的选择性。Ostade等，Nature 361：266-268(1993)描述了导致TNF-α只选择性结合两种已知类型TNF受体之一的一些突变。因此，本发明的抗体可以结合一种TR4受体，该受体含有来自天然突变或人工操纵的一或多个氨基酸取代，缺失或添加。
正如所表明的，变化优选是微小的，如不明显影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代(见上表3)。
在特异的实施方案中，SEQ ID NO：1的氨基酸序列和/或本发明所述任何多肽片段(例如胞外结构域或胞内结构域)中的取代、添加或缺失的数目是75，70，60，50，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或30-20，20-15，20-10，15-10，10-1，5-10，1-5，1-3或1-2个。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体(尤其包含或由TR4的胞外可溶结构域组成的片段)，所述多肽或片段或变体含有任一个或多个以下TR4中的保守突变：SEQ IDNO：1的M1用A，G，I，L，S，T或V代替；A2用G，I，L，S，T，M或V代替；A6用G，I，L，S，T，M或V代替；R7用H或K代替；V8用A，G，I，L，S，T或M代替；H9用K或R代替；L10用A，G，I，S，T，M或V代替；G11用A，I，L，S，T，M或V代替；A12用G，I，L，S，T，M或V代替；F13用W或Y代替；L14用A，G，I，S，T，M或V代替；A15用G，I，L，S，T，M或V代替；V16用A，G，I，L，S，T或M代替；T17用A，G，I，L，S，M或V代替；N19用Q代替；G21用A，I，L，S，T，M或V代替；S22用A，G，I，L，T，M或V代替；A23用G，I，L，S，T，M或V代替；A24用G，I，L，S，T，M或V代替；S25用A，G，I，L，T，M或V代替；G26用A，I，L，S，T，M或V代替；T27用A，G，I，L，S，M或V代替；E28用D代替；A29用G，I，L，S，T，M或V代替；A30用G，I，L，S，T，M或V代替；A31用G，I，L，S，T，M或V代替；A32用G，I，L，S，T，M或V代替；T33用A，G，I，L，S，M或V代替；S35用A，G，I，L，T，M或V代替；K36用H或R代替；V37用A，G，I，L，S，T或M代替；W38用F或Y代替；G39用A，I，L，S，T，M或V代替；S40用A，G，I，L，T，M或V代替；S41用A，G，I，L，T，M或V代替；A42用G，I，L，S，T，M或V代替；G43用A，I，L，S，T，M或V代替；R44用H或K代替；I45用A，G，L，S，T，M或V代替；E46用D代替；R48用H或K代替；G49用A，I，L，S，T，M或V代替；G50用A，I，L，S，T，M或V代替；G51用A，I，L，S，T，M或V代替；R52用H或K代替；G53用A，I，L，S，T，M或V代替；A54用G，I，L，S，T，M或V代替；L55用A，G，I，S，T，M或V代替；T57用A，G，I，L，S，M或V代替；S58用A，G，I，L，T，M或V代替；M59用A，G，I，L，S，T或V代替；G60用A，I，L，S，T，M或V代替；Q61用N代替；H62用K或R代替；G63用A，I，L，S，T，M或V代替；S65用A，G，I，L，T，M或V代替；A66用G，I，L，S，T，M或V代替；R67用H或K代替；A68用G，I，L，S，T，M或V代替；R69用H或K代替；A70用G，I，L，S，T，M或V代替；G71用A，I，L，S，T，M或V代替；R72用H或K代替；A73用G，I，L，S，T，M或V代替；G75用A，I，L，S，T，M或V代替；R77用H或K代替；A79用G，I，L，S，T，M或V代替；R80用H或K代替；E81用D代替；A82用G，I，L，S，T，M或V代替；S83用A，G，I，L，T，M或V代替；R85用H或K代替；L86用A，G，I，S，T，M或V代替；R87用H或K代替；V88用A，G，I，L，S，T或M代替；H89用K或R代替；K90用H或R代替；T91用A，G，I，L，S，M或V代替；F92用W或Y代替；K93用H或R代替；F94用W或Y代替；V95用A，G，I，L，S，T或M代替；V96用A，G，I，L，S，T或M代替；V97用A，G，I，L，S，T或M代替；G98用A，I，L，S，T，M或V代替；V99用A，G，I，L，S，T或M代替；L100用A，G，I，S，T，M或V代替；L101用A，G，I，S，T，M或V代替；Q102用N代替；V103用A，G，I，L，S，T或M代替；V104用A，G，I，L，S，T或M代替；S106用A，G，I，L，T，M或V代替；S107用A，G，I，L，T，M或V代替；A108用G，I，L，S，T，M或V代替；A109用G，I，L，S，T，M或V代替；T110用A，G，I，L，S，M或V代替；I111用A，G，L，S，T，M或V代替；K112用H或R代替；L113用A，G，I，S，T，M或V代替；H114用K或R代替；D115用E代替；Q116用N代替；S117用A，G，I，L，T，M或V代替；I118用A，G，L，S，T，M或V代替；G119用A，I，L，S，T，M或V代替；T120用A，G，I，L，S，M或V代替；Q121用N代替；Q122用N代替；W123用F或Y代替；E124用D代替；H125用K或R代替；S126用A，G，I，L，T，M或V代替；L128用A，G，I，S，T，M或V代替；G129用A，I，L，S，T，M或V代替；E130用D代替；L131用A，G，I，S，T，M或V代替；G135用A，I，L，S，T，M或V代替；S136用A，G，I，L，T，M或V代替；H137用K或R代替；R138用H或K代替；S139用A，G，I，L，T，M或V代替；E140用D代替；R141用H或K代替；G143用A，I，L，S，T，M或V代替；A144用G，I，L，S，T，M或V代替；N146用Q代替；R147用H或K代替；T149用A，G，I，L，S，M或V代替；E150用D代替；G151用A，I，L，S，T，M或V代替；V152用A，G，I，L，S.T或M代替；G153用A，I，L，S，T，M或V代替；Y154用F或W代替；T155用A，G，I，L，S，M或V代替；N156用Q代替；A157用G，I，L，S，T，M或V代替；S158用A，G，I，L，T，M或V代替；N159用Q代替；N160用Q代替；L161用A，G，I，S，T，M或V代替；F162用W或Y代替；A163用G，I，L，S，T，M或V代替；L165用A，G，I，S，T，M或V代替；T168用A，G，I，L，S，M或V代替；A169用G，I，L，S，T，M或V代替；K171用H或R代替；S172用A，G，I，L，T，M或V代替；D173用E代替；E174用D代替；E175用D代替；E176用D代替；R177用H或K代替；S178用A，G，I，L，T，M或V代替；T181用A，G，I，L，S，M或V代替；T182用A，G，I，L，S，M或V代替；T183用A，G，I，L，S，M或V代替；R184用H或K代替；N185用Q代替；T186用A，G，I，L，S，M或V代替；A187用G，I，L，S，T，M或V代替；Q189用N代替；K191用H或R代替；G193用A，I，L，S，T，M或V代替；T194用A，G，I，L，S，M或V代替；F195用W或Y代替；R196用H或K代替；N197用Q代替；D198用E代替；N199用Q代替；S200用A，G，I，L，T，M或V代替；A201用G，I，L，S，T，M或V代替；E202用D代替；M203用A，G，I，L，S，T或V代替；R205用H或K代替；K206用H或R代替；S208用A，G，I，L，T，M或V代替；T209用A，G，I，L，S，M或V代替；G210用A，I，L，S，T，M或V代替；R213用H或K代替；G214用A，I，L，S，T，M或V代替；M215用A，G，I，L，S，T或V代替；V216用A，G，I，L，S，T或M代替；K217用H或R代替；V218用A，G，I，L，S，T或M代替；K219用H或R代替；D220用E代替；T222用A，G，I，L，S，M或V代替；W224用F或Y代替；S225用A，G，I，L，T，M或V代替；D226用E代替；I227用A，G，L，S，T，M或V代替；E228用D代替；V230用A，G，I，L，S，T或M代替；H231用K或R代替；K232用H或R代替；E233用D代替；S234用A，G，I，L，T，M或V代替；G235用A，I，L，S，T，M或V代替；N236用Q代替；G237用A，I，L，S，T，M或V代替；H238用K或R代替；N239用Q代替；I240用A，G，L，S，T，M或V代替；W241用F或Y代替；V242用A，G，I，L，S，T或M代替；I243用A，G，L，S，T，M或V代替；L244用A，G，I，S，T，M或V代替；V245用A，G，I，L，S，T或M代替；V246用A，G，I，L，S，T或M代替；T247用A，G，I，L，S，M或V代替；L248用A，G，I，S，T，M或V代替；V249用A，G，I，L，S，T或M代替；V250用A，G，I，L，S，T或M代替；L252用A，G，I，S，T，M或V代替；L253用A，G，I，S，T，M或V代替；L254用A，G，I，S，T，M或V代替；V255用A，G，I，L，S，T或M代替；A256用G，I，L，S，T，M或V代替；V257用A，G，I，L，S，T或M代替；L258用A，G，I，S.T，M或V代替；I259用A，G，L，S，T，M或V代替；V260用A，G，I，L，S，T或M代替；I264用A，G，L，S，T，M或V代替；G265用A，I，L，S，T，M或V代替；S266用A，G，I，L，T，M或V代替；G267用A，I，L，S，T，M或V代替；G269用A，I，L，S，T，M或V代替；G270用A，I，L，S，T，M或V代替；D271用E代替，K273用H或R代替；M275用A，G，I，L，S，T或V代替；D276用E代替；R277用H或K代替；V278用A，G，I，L，S，T或M代替；F280用W或Y代替；W281用F或Y代替；R282用H或K代替；L283用A，G，I，S，T，M或V代替；G284用A，I，L，S，T，M或V代替；L285用A，G，I，S，T，M或V代替；L2186用A，G，I，S，T，M或V代替；R287用H或K代替；G288用A，I，L，S，T，M或V代替；G290用A，I，L，S，T，M或V代替；A291用G，I，L，S，T，M或V代替；E292用D代替；D293用E代替；N294用Q代替；A295用G，I，L，S，T，M或V代替；H296用K或R代替；N297用Q代替；E298用D代替；I299用A，G，L，S，T，M或V代替；L300用A，G，I，S，T，M或V代替；S301用A，G，I，L，T，M或V代替；N302用Q代替；A303用G，I，L，S，T，M或V代替；D304用E代替；S305用A，G，I，L，T，M或V代替；L306用A，G，I，S，T，M或V代替；S307用A，G，I，L，T，M或V代替；T308用A，G，I，L，S，M或V代替；F309用W或Y代替；V310用A，G，I，L，S，T或M代替；S311用A，G，I，L，T，M或V代替；E312用D代替；Q313用N代替；Q314用N代替；M315用A，G，I，L，S，T或V代替；E316用D代替；S317用A，G，I，L，T，M或V代替；Q318用N代替；E319用D代替；A321用G，I，L，S，T，M或V代替；D322用E代替；L323用A，G，I，S，T，M或V代替；T324用A，G，I，L，S，M或V代替；G325用A，I，L，S，T，M或V代替；V326用A，G，I，L，S，T或M代替；T327用A，G，I，L，S，M或V代替；V328用A，G，I，L，S，T或M代替；Q329用N代替；S330用A，G，I，L，T，M或V代替；G332用A，I，L，S，T，M或V代替；E333用D代替；A334用G，I，L，S，T，M或V代替；Q335用N代替；L337用A，G，I，S，T，M或V代替；L338用A，G，I，S，T，M或V代替；G339用A，I，L，S，T，M或V代替；A341用G，I，L，S，T，M或V代替；E342用D代替；A343用G，I，L，S，T，M或V代替；E344用D代替；G345用A，I，L，S，T，M或V代替；S346用A，G，I，L，T，M或V代替；Q347用N代替；R348用H或K代替；R349用H或K代替；R350用H或K代替；L351用A，G，I，S，T，M或V代替；L352用A，G，I，S，T，M或V代替；V353用A，G，I，L，S，T或M代替；A355用G，I，L，S，T，M或V代替；N356用Q代替；G357用A，I，L，S，T，M或V代替；A358用G，I，L，S，T，M或V代替；D359用E代替；T361用A，G，I，L，S，M或V代替；E362用D代替；T363用A，G，I，L，S，M或V代替；L364用A，G，I，S，T，M或V代替；M365用A，G，I，L，S，T或V代替；L366用A，G，I，S，T，M或V代替；F367用W或Y代替；F368用W或Y代替；D369用E代替；K370用H或R代替；F371用W或Y代替；A372用G，I，L，S，T，M或V代替；N373用Q代替；I374用A，G，L，S，T，M或V代替；V375用A，G，I，L，S，T或M代替；F377用W或Y代替；D378用E代替；S379用A，G，I，L，T，M或V代替；W380用F或Y代替；D381用E代替；Q382用N代替；L383用A，G，I，S，T，M或V代替；M384用A，G，I，L，S，T或V代替；R385用H或K代替；Q386用N代替；L387用A，G，I，S，T，M或V代替；D388用E代替；L389用A，G，I，S，T，M或V代替；T390用A，G，I，L，S，M或V代替；K391用H或R代替；N392用Q代替；E393用D代替；I394用A，G，L，S，T，M或V代替；D395用E代替；V396用A，G，I，L，S，T或M代替；V397用A，G，I，L，S，T或M代替；R398用H或K代替；A399用G，I，L，S，T，M或V代替；G400用A，I，L，S，T，M或V代替；T401用A，G，I，L，S，M或V代替；A402用G，I，L，S，T，M或V代替；G403用A，I，L，S，T，M或V代替；G405用A，I，L，S，T，M或V代替；D406用E代替；A407用G，I，L，S，T，M或V代替；L408用A，G，I，S，T，M或V代替；Y409用F或W代替；A410用G，I，L，S，T，M或V代替；M411用A，G，I，L，S，T或V代替；L412用A，G，I，S，T，M或V代替；M413用A，G，I，L，S，T或V代替；K414用H或R代替；W415用F或Y代替；V416用A，G，I，L，S，T或M代替；N417用Q代替；K418用H或R代替；T419用A，G，I，L，S，M或V代替；G420用A，I，L，S，T，M或V代替；R421用H或K代替；N422用Q代替；A423用G，I，L，S，T，M或V代替；S424用A，G，I，L，T，M或V代替；I425用A，G，L，S，T，M或V代替；H426用K或R代替；T427用A，G，I，L，S，M或V代替；L428用A，G，I，S，T，M或V代替；L429用A，G，I，S，T，M或V代替；D430用E代替；A431用G，I，L，S，T，M或V代替；L432用A，G，I，S，T，M或V代替；E433用D代替；R434用H或K代替；M435用A，G，I，L，S，T或V代替；E436用D代替；E437用D代替；R438用H或K代替；H439用K或R代替；A440用G，I，L，S，T，M或V代替；K441用H或R代替；E442用D代替；K443用H或R代替；I444用A，G，L，S，T，M或V代替；Q445用N代替；D446用E代替；L447用A，G，I，S，T，M或V代替；L448用A，G，I，S，T，M或V代替；V449用A，G，I，L，S，T或M代替；D450用E代替；S451用A，G，I，L，T，M或V代替；G452用A，I，L，S，T，M或V代替；K453用H或R代替；F454用W或Y代替；I455用A，G，L，S，T，M或V代替；Y456用F或W代替；L457用A，G，I，S，T，M或V代替；E458用D代替；D459用E代替；G460用A，I，L，S，T，M或V代替；T461用A，G，I，L，S，M或V代替；G462用A，I，L，S，T，M或V代替；S463用A，G，I，L，T，M或V代替；A464用G，I，L，S，T，M或V代替；V465用A，G，I，L，S，T或M代替；S466用A，G，I，L，T，M或V代替；L467用A，G，I，S，T，M或V代替；和/或E468用D代替。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR4多肽或其片段或变体(特别是包含或由TR4的胞外可溶结构域组成的片段)，所述多肽或其片段或变体含有以下任一或多个TR4中的非保守突变；SEQID NO；1的M1用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A2用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P3用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；P4用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；P5用D，B，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；A6用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R7用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V8用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H9用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L10用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G11用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A12用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F13用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；L14用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A15用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V16用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T17用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P18用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；N19用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；P20用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G21用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S22用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A23用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A24用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S25用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G26用D，B，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T27用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E28用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A29用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A30用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A31用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A32用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T33用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P34用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；S35用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K36用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V37用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；W38用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；G39用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S40用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S41用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A42用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G43用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R44用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P.或C代替；I45用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E46用H，K，R，A，G，I，L，S.T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P47用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；R48用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G49用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P.或C，G50用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C，G51用D，B，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R52用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G53用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A54用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L55用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P56用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；T57用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S58用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M59用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G60用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q61用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；H62用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G63用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P64用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；S65用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A66用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R67用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A68用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R69用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A70用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G71用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R72用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A73用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C代替；P74用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G75用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P76用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；R77用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P78用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；A79用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R80用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E81用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A82用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C代替；S83用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P84用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；R85用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L86用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R87用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V88用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H89用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K90用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T91用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F92用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；K93用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F94用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V95用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V96用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V97用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G98用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V99用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L100用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L101用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q102用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；V103用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V104用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P105用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；S106用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S107用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A108用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A109用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T110用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I111用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K112用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L113用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H114用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D115用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q116用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；S117用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I118用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G119用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T120用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q121用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；Q122用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；W123用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；E124用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H125用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S126用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P127用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；L128用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G129用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E130用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L131用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C132用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；P133用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；P134用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G135用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S136用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H137用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R138用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S139用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E140用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R141用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P142用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G143用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A144用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C145用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；N146用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；R147用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C148用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；T149用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E150用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G151用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V152用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G153用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Y154用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；T155用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N156用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；A157用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S158用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N159用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；N160用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；L161用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F162用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；A163用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C164用D，E，H，K，R，A，G，I，I，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；L165用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P166用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；C167用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；T168用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A169用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C170用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；K171用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S172用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D173用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E174用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E175用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E176用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R177用D，E，A，G，l，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S178用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P179用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；C180用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；T181用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T182用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T183用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P.或C代替；R184用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N185用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；T186用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A187用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C188用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；Q189用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；C190用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；K191用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P192用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G193用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T194用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F195用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；R196用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N197用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；D198用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N199用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；S200用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A201用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E202用H，K，R，A，G，I，L，ST，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M203用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C204用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；R205用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K206用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C207用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；S208用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T209用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G210用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C211用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；P212用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；R213用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G214用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M215用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P.或C代替；V216用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K217用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V218用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K219用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D220用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C221用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；T222用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P223用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，Y，N，Q，F，W，Y或C代替；W224用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；S225用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D226用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I227用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E228用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C229用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；V230用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H231用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K32用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E233用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S234用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G235用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N236用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；G237用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H238用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N239用D，B，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；I240用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；W241用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V242用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I243用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L244用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V245用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V246用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T247用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L248用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V249用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V250用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P251用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；L252用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L253用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L254用D，B，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P.或C代替；V255用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A256用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V257用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L258用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I259用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V260用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C261用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；C262用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；C263用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；I264用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G265用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S266用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G267用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C268用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；G269用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G270用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D271用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P272用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；K273用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C274用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；M275用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D276用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R277用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V278用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；C279用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；F280用D，E，H，K，R，N，Q，A，U，I，L，S，T，M，V，P或C代替；W281用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；R282用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P.或C代替；L283用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G284用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L285用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L286用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R287用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G288用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P289用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G290用D，E，H，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A291用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E292用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D293用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N294用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；A295用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H296用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N297用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；B298用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I299用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C代替；L300用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S301用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N302用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；A303用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D304用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S305用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L306用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S307用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T308用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F309用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；V310用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S311用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E312用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q313用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；Q314用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；M315用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E316用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S317用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q318用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；E319用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P320用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；A321用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D322用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L323用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T324用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G325用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V326用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T327用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V328用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q329用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，，VF，W，Y，P或C代替；S330用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P331用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G332用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E333用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A334用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q335用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；C336用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，I，M，V，N，Q，F，W，Y或P代替；L337用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L338用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G339用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P340用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；A341用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E342用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A343用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E344用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；O345用D，B，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S346用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q347用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；R348用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R349用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R350用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L351用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L352用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V353用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P354用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；A355用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N356用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；G357用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P.或C代替；A358用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D359用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P360用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；T361用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E362用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T363用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L364用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M365用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L366用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F367用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；F368用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D369用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K370用D，E，A，U，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P371用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；A372用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P.或C代替；N373用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；I374用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V375用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P376用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；F377用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D378用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S379用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；W380用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；D381用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q382用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；L383用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M384用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R385用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q386用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；L387用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D388用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L389用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T390用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K391用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N392用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；E393用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I394用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D395用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V396用D，B，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V397用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R398用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A399用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G400用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T401用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A402用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G403用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；P404用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y或C代替；G405用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D406用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A407用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L408用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Y409用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；A410用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M411用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L412用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M413用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K414用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；W415用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，VP或C代替；V416用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N417用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；K418用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T419用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G420用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R421用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；N422用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；A423用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S424用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I425用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H426用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T427用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L428用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L429用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D430用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A431用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L432用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E433用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R434用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；M435用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E436用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E437用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；R438用D，E，A，G，I，L，S.T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；H439用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A440用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K441用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E442用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K443用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；I444用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Q445用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C代替；D446用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L447用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L448用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V449用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D450用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S451用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G452用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；K453用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；F454用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；I455用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；Y456用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C代替；L457用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；E458用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；D459用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G460用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；T461用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；G462用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S463用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；A464用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；V465用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；S466用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；L467用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C代替；和/或E468用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C代替。
本发明TR4蛋白质中为功能所需的氨基酸可以通过本领域已知方法鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后一方法是在分子的每个残基导入单丙氨酸突变。然后测试所得突变分子生物学活性如受体结合或者体外或体内增殖活性。对配体-受体结合非常关键的位点也可以通过结构分析确定，如结晶，核磁共振或光亲和标记(Smith等，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)及de Vos等，Science 255：306-312(1992))。在优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR4功能所必需的TR4区域。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR4功能所必需的TR4区域并抑制或消除TR4的功能。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合为TR4功能所必需的TR4区域并增强TR4的功能。
另外，可以应用蛋白质工程以改良或改变TR4多肽的特性。可以使用本领域已知的重组DNA技术产生新的突变蛋白质或多肽，其包括单个或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出例如增强的活性或提高的稳定性。另外，它们至少在一定的纯化和贮存条件下可以高产量纯化而且比相应的天然多肽示出更好的溶解性。本发明的抗体可以结合这种修饰的TR4多肽。
TR4的非天然发生的变体可以使用本领域已知的诱变技术产生，包括但非限于寡核苷酸介导的诱变、丙氨酸扫描、PCR诱变、定点诱变(见例如Carter等，Nucl.Acids Res.13：4331(1986)；及Zoller等，Nucl.Acids Res.10：6487(1982))、盒式诱变(见例如Wells等，Gene 34：315(1985))、限制选择诱变(见例如Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317：415(1986))。
因此，本发明还涵盖了结合TR4衍生物和类似物的抗体，所述衍生物和类似物具有一或多个氨基酸残基缺失，添加或取代，以产生更适于在选择的宿主细胞中表达、放大等的TR4多肽。例如，半胱氨酸残基可以缺失或用另一种氨基酸残基取代以去除二硫键；N连接的糖基化位点可以改变或去除以实现例如更易于从已知超糖基化N连接位点的酵母宿主中回收及纯化的一种同源产物的表达。结果，在TR4多肽中任一或多个糖基化识别序列的第一个或第三个氨基酸位置之一或这两个位置上的多种氨基酸取代和/或在任一或多个这种识别序列的第二个位置的一个氨基酸缺失将防止TR4在修饰的三肽序列糖基化(见例如Miyajimo等，EMBO J.5(6)：1193-1197)。另外，TR4多肽的一或多个氨基酸残基(例如精氨酸和赖氨酸残基)可以缺失或用另一种残基取代，以去除由蛋白酶例如弗林蛋白酶或kexin的非希望的处理。
本发明的抗体还包括结合如下一种多肽的抗体，所述多肽包含或由包括前导序列的保藏的cDNA(ATCC保藏号97853)编码的多肽组成的多肽；包含或由保藏的cDNA编码的成熟多肽减去前导序列组成的多肽(即成熟蛋白)；包含或由包括前导序列的SEQ ID NO：1多肽组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：1多肽减去氨基末端甲硫氨酸组成的多肽；包含或由SEQ ID NO：1多肽减去前导序列组成的多肽；包含或由TR4胞外结构域组成的多肽；包含或由TR4富半胱氨酸结构域组成的多肽；包含或由TR4跨膜结构域组成的多肽；包含或由TR4胞内结构域组成的多肽；包含或由TR4死亡结构域组成的多肽；包含或由包含全部或部分胞外和胞内结构域但缺失跨膜结构域的可溶多肽组成的多肽；以及与上述多肽(例如保藏的cDNA克隆(具有ATCC保藏号97853的保藏物)编码的多肽)，SEQ ID NO：1所示的多肽及具有至少30个氨基酸及更优选至少50个氨基酸的这些多肽的部分有至少80％相同，更优选至少90％或95％相同，更优选至少96％，97％，98％或99％相同的多肽。
具有与TR4多肽的参比氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽，是指所述多肽的氨基酸序列除了所述多肽可以包括在TR4多肽的参比氨基酸序列的每100个氨基酸中最多5个氨基酸变化之外，与参比序列相同。换言之，为获得具有与参比氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参比序列中最多有5％的氨基酸残基可以缺失或用另一种氨基酸取代，或者占参比序列中氨基酸总数最多5％的氨基酸可以插入参比序列中。参比序列的这些变化可以发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或者在两个末端位置之间的任何位置，单独分散在参比序列残基中或在参比序列内呈连续的一或多组。
实际上，任何特定的多肽与例如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同可以使用已知的计算机程序常规测定，如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix版本8，GeneticsComputer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)。当使用Bestfit或任何其它序列对比程序以确定一个特定序列与本发明的参比序列是否例如95％相同时，参数的设定当然是计算在全长参比氨基酸序列基础上的相同性百分率，并允许占参比序列中氨基酸残基总数最多5％的同源性缺口。
在一个特异的实施方案中，确定参比(查询)序列(本发明的序列)和一个对象序列之间的相同性，也称全局序列比对，可以利用基于Brutlag等的算法(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))的FASTDB计算机程序。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数为：Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，Mismath Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或者对象氨基酸序列的长度，取两者中较短的。根据这个实施方案，如果对象序列因N或C末端缺失而非由于内部缺失而比查询序列短，那么必须对结果作手工修正，这是因为FASTDB程序在计算全局相同性百分比时不计算对象序列N或C末端的截短。对于对象序列相对于查询序列的N或C末端的截短，相同性百分比的修正是通过计算与相应对象残基不匹配/比对的位于对象序列N或C末端的查询序列的残基数，作为查询序列总碱基数的百分比。通过FASTDB序列比对的结果来确定一个残基是否匹配。然后将此百分数从使用特定参数通过FASTDB程序计算的相同性百分比中减去，从而获得最终的相同性百分比分值结果。这一最终相同性百分比分值结果是用于这一实施方案的目的的。只有不与查询序列相匹配/比对的对象序列N或C末端的碱基才用于手工调节相同性百分比分值结果。也就是仅位于对象序列最N端和最C端残基之外的查询残基位置。例如，一个90个碱基的对象序列与一个100个残基的查询序列比对以确定相同性百分比。缺失发生于对象序列的N末端，因此，FASTDB比对不显示N末端前10个碱基的匹配/比对。这10个不匹配的残基相当于序列的10％(N和C端不匹配的残基数/查询序列中的碱基总数)，因而从FASTDB程序计算的相同性百分比分值中减去这10％。如果剩余的90个碱基都完全匹配，那么最终的相同性百分比就是90％。再例如，一个90个残基的对象序列与一个100个残基的查询序列相比较。这时的缺失是内部缺失，因而对象序列的N或C末端碱基没有与查询序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB程序计算的相同性百分比不需手工修正。再强调一次，只有位于对象序列的N和C末端外侧的残基位置，如FSATDB对比中所展示，与查询序列不匹配/比对的才需要手工修正。这一实施方案不需要进行其他的手工修正。
本申请还涉及结合如下蛋白质的抗体，所述蛋白质含有与本文中用n1-m1和/或n2-m2表示的TR4多肽序列有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的多肽。在优选的实施方案中，本申请涉及结合如下蛋白质的抗体，所述蛋白质含有与具有本文所述的特异TR4 N末端和C末端缺失的氨基酸序列的多肽有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的多肽。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体结合上述TR4融合蛋白，其中融合蛋白的TR4部分是如n1-m1和/或n2-m2所描述的那些序列。
本发明的抗体可以结合修饰的TRAIL受体多肽
应特别理解的是本发明的抗体可以结合修饰形式的TR7蛋白(SEQ ID NO：3)。在本发明抗体特异性结合TR7(SEQ ID NO：3)和TR4(SEQ ID NO：1)的那些实施方案中，还应特别理解的是那些抗体可以结合修饰形式的TR7和/或TR4。TR4的修饰形式包括例如相应于下述TR7修饰形式的TR4修饰形式。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7多肽(如上述那些)，包括但非限于天然纯化的TR7多肽，经化学合成方法生产的TR7多肽，及通过重组技术从原核或真核宿主中产生的TR7多肽，所述宿主包括例如细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞，使用例如上述重组组合物和方法进行。根据在重组生产方法中应用的宿主，多肽可以是糖基化或非糖基化的。另外，TR7多肽还可以包括一个最初的修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况中是宿主介导的过程的结果。
另外，由本发明抗体结合的TR7蛋白可以使用本领域已知方法化学合成(例如见Creighton，Protein：Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman&Co.，N.Y.1983)，及Hunkapiller等，Nature 310：105-111(1984))。例如，相应于TR7多肽片段的一种肽可以使用肽合成仪合成。另外，如果需要，非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为取代或添加导入TR7多肽序列中。非经典氨基酸包括但非限于常见氨基酸的D-异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，磺基丙氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，b-丙氨酸，氟代氨基酸，设计氨基酸如b-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸及氨基酸类似物。另外，所述氨基酸可以是D氨基酸(右旋)或L氨基酸(左旋)。
本发明另外涵盖了结合如下TR7多肽的抗体，所述多肽在翻译期间或之后被差异修饰，例如通过糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/阻断基团衍生化，蛋白酶解，连接于抗体分子或其它细胞配体等。任何多种化学修饰均可以通过已知技术进行，包括但非限于通过溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4，乙酰化，甲酰化，氧化，还原，在衣霉素存在情况下的代谢合成等的特异性化学裂解。
对TR7多肽的额外翻译后修饰例如N-连接的或O-连接的碳水化合物链，N或C末端加工，将化学部分附着于氨基酸主链，化学修饰N连接的或O连接的碳水化合物链，及作为原核宿主细胞表达的结果而加入或缺失N末端甲硫氨酸残基。所述多肽也可以用一种可检测标记修饰，如酶标记，荧光标记，同位素标记或亲和标记，以检测及分离蛋白质。
本发明还提供了结合经化学修饰的TR7多肽衍生物的抗体，所述修饰的衍生物可提供另外的优势如多肽的溶解性、稳定性和循环时间增加，或者免疫原性降低(见美国专利No.4179337)。用于衍生的化学部分可以选自水溶性聚合物如聚乙二醇，1，2-亚乙基二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇及类似的等。所述多肽可以在分子内的随机位置修饰，或者在分子内预定位置修饰，而且可以包括1、2、3或多个附着的化学部分。
所述聚合物可以是任何分子量的，而且可以是分支或不分支的。针对聚乙二醇，优选的分子量为大约1kDa至大约100kDa(术语“大约”是指在制备聚乙二醇中，一些分子比规定分子量多或少)之间，以易于处理和生产。根据所需治疗方案(例如所希望的持续释放时间、对生物学活性作用(如果有)、处理的简便性、抗原性程度或丧失、及聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物的其它已知作用)，可以使用其它大小的分子。例如，所述聚乙二醇的平均分子量可以为大约200，500，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10000，10500，11000，11500，12000，12500，13000，13500，14000，14500，15000，15500，16000，16500，17000，17500，18000，18500，19000，19500，20000，25000，30000，35000，40000，50000，55000，60000，65000，70000，75000，80000，85000，90000，95000或100000kDa。
如上所述，所述聚乙二醇可以具有分支结构。分支的聚乙二醇例如美国专利No.5643575；Morpurgo等，Appl.Biochem.Biotechnol.56：59-72(1996)；Vorobjev等，Nucleosides Nucleotides 18：2745-2750(1999)；及Caliceti等，Bioconjug.Chem.10：638-646(1999)所述，所述内容在此并入参考。
考虑到对蛋白质的功能结构域或抗原结构域的作用，所述聚乙二醇分子(或其它化学部分)应附着于蛋白质。有许多本领域技术人员可利用的附着方法，例如EP0401384所述，在此并入参考(将PEG与G-CSF偶联)，也见于Malik等，Exp Hematol.20：1028-1035(1992)(使用tresyl氯化物对GM-CSF进行PEG化)。例如，聚乙二醇可以通过一个反应性基团与氨基酸残基共价结合，所述反应性基团例如游离的氨基或羧基基团。反应性基团是激活的聚乙二醇分子可以结合的那些基团。具有游离氨基基团的氨基酸残基可以包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；具有游离羧基基团的那些残基可以包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基基团也可以用作反应性基团以附着聚乙二醇分子。针对治疗目的优选在氨基基团附着，如在N末端或赖氨酸基团附着。
如上所提示，聚乙二醇可以通过与任何数目的氨基酸残基连接而附着于蛋白质。例如，聚乙二醇可以通过与赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸残基的共价键而与蛋白质连接。可以应用一或多种化学反应以将聚乙二醇附着于蛋白质的特异氨基酸残基(例如赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸)，或者附着于蛋白质的一种以上类型的氨基酸残基(例如赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸及其组合)。
可能特别希望在N末端经化学修饰的蛋白质。使用聚乙二醇作为该组合物的例证，可以选择多种聚乙二醇分子(通过分子量，分支等)，反应混合物中聚乙二醇分子与蛋白质(或肽)分子的比例，要进行的peg化反应类型，及获得所选择的N末端peg化蛋白的方法。获得N末端peg化制品的方法(即如果需要从其它非peg化部分中分离这种部分)，可以从一群peg化蛋白质分子中纯化N末端peg化物质。在N末端经选择性化学修饰可以通过还原烷化作用而实现，其使用不同类型的初级氨基酸基团的不同反应性(赖氨酸对N末端)以在特定蛋白质中发生衍生作用。在适当反应条件下，用含有羰基基团的聚合物在N端实现蛋白质充分的选择性衍生作用。
如上所示，本发明蛋白质的peg化可以通过许多方法实现。例如，可以将聚乙二醇直接或通过一个间插接头而附着于蛋白质。将聚乙二醇附着于蛋白质的无接头系统见Delgado等，Crit.Rev.Thera.DrugCarrier Sys 9：249-304(1992)；Francis等，Intern.J.of Hematol.68：1-18(1998)；美国专利No.4002531；美国专利No.5349052；WO95/06058及WO98/32466所述，所述文献在此并入参考。
将聚乙二醇不用间插接头而直接附着于蛋白质的氨基酸残基的一个系统是应用tresylated MPEG，其是通过使用tresyl氯(ClSO2CH2CF3)修饰单甲氧基聚乙二醇(MPEG)而产生的。在蛋白质与tresylated MPEG反应时，聚乙二醇直接附着于蛋白质的氨基基团。因此，本发明包括蛋白质-聚乙二醇缀合物，其通过本发明蛋白质与具有2，2，2-三氟乙烷磺酰(2，2，2-trifluoreothane)基团的聚乙二醇分子反应而产生。
聚乙二醇也可以使用一些不同的间插接头附着于蛋白质。例如，在此并入参考的美国专利No.5612460揭示了连接聚乙二醇与蛋白质的氨基甲酸乙酯接头。聚乙二醇通过接头附着于蛋白质的蛋白质-聚乙二醇缀合物也可以通过将蛋白质与化合物反应而产生，所述化合物如MPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸、用1，1’-羰酰二咪唑活化的MPEG、MPEG-2，4，5-三氯penyl碳酸酯(MPEG-2，4，5-trichloropenylcarbonate)、MPEG-p-硝基酚碳酸酯及多种MPEG-琥珀酸衍生物。将聚乙二醇附着于蛋白质的一些另外的聚乙二醇衍生物及反应化学见WO98/32466所述，其全部内容在此并入参考。使用本文所述反应化学产生的peg化蛋白质产物包括在本发明范围内。
附着于每一TR7多肽的聚乙二醇部分的数目(即取代的程度)也可以变化。例如，本发明peg化蛋白质可以连接于平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20或更多个聚乙二醇分子。相似地，平均取代程度在每个蛋白质分子1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19或18-20个聚乙二醇部分的范围内。确定取代程度的方法见例如Delgado等，Crit.Rev.Thera.DrugCarrier Sys.9：249-304(1992)所述。
如所提及的，本发明的抗体可以结合如下TR7多肽，所述TR7多肽通过天然加工修饰，如翻译后加工，或者通过本领域熟知的化学修饰技术修饰。应意识到，相同类型的修饰可以以相同或不同程度在给定的TR7多肽中的一些位点存在。TR7多肽可以是分支的，例如作为遍在蛋白化的结果，而且其可以是有或无分支的环形。环形、分支及分支环形的TR7多肽可得自翻译后天然加工，或可以通过合成方法产生。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，共价附着黄素，共价附着血红素部分，共价附着一种核苷酸或核苷酸衍生物，共价附着一种脂或脂衍生物，共价附着磷脂酰肌醇，交联，环化，二硫键形成，去甲基化，共价交联形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟化，碘化，甲基化，肉豆蔻酰化，氧化，peg化，蛋白酶解加工，磷酸化，异戊二烯化，外消旋化，硒化(selenoylation)，硫化，转移RNA介导的将氨基酸加入蛋白质如精氨酰化，及遍在蛋白化(见例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROTEINS，，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，纽约(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS，B.C.Johnson编辑，Academic Press，纽约，pgs.1-12(1983)；Seifter等，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan等，Ann.NYAcad Sci 663：48-62(1992))。
抗TR7抗体
在一个实施方案中，本发明提供了免疫特异性结合TR7(SEQ IDNO：3)或其片段或变体的抗体(例如，包含通过二硫键连接在一起的两个重链和两个轻链的抗体)，其中所述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列与由表1所示一或多个scFv或细胞系表达的重链和轻链的氨基酸序列相同。在另一个实施方案中，本发明提供了免疫特异性结合TR7或其片段或变体的抗体(均由通过二硫键连接在一起的两个重链和两个轻链组成以形成抗体)，其中所述重链氨基酸序列或轻链氨基酸序列与由表1所示一或多个scFv或细胞系表达的重链或轻链的氨基酸序列相同。与TR7多肽的免疫特异性结合可以通过本领域已知或者在此描述的免疫分析确定，以分析特异性抗体-抗原结合。包含或由免疫特异性结合TR7的这些抗体的片段或变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些抗体分子，片段和/或变体(例如SEQ IDNO：57-71)的核酸分子也包括在本发明内。
在本发明的一个实施方案中，免疫特异性结合TR7或其片段或变体的抗体包含一种多肽，所述多肽具有由表1所示至少一种scFv或细胞系表达的任一重链的氨基酸序列和/或表1所示至少一种scFv或细胞系表达的任一轻链的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，免疫特异性结合TR7或其片段或变体的抗体包含一种多肽，所述多肽具有由表1所示至少一种scFv的任一VH结构域的氨基酸序列和/或表1所示至少一种scFv的任一VL结构域的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的抗体包含表1所示一个单一scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在另一些实施方案中，本发明的抗体包含表1所示不同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。免疫特异性结合TR7的包含或由表1所示至少一种scFv的VH和/或VL结构域的抗体片段或变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些VH和VL结构域，分子，片段和/或变体的核酸分子也包括在本发明内。
本发明还提供了免疫特异性结合一种TR7多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VH结构域中含有的任意1，2，3或多个VH CDR的氨基酸序列。特别地，本发明提供了免疫特异性结合TRAIL受体的抗体，所述抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VH结构域中含有的VH CDR1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，免疫特异性结合TR7的抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VH结构域中含有的VHCDR2的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，免疫特异性结合TR7的抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VH结构域中含有的VH CDR3的氨基酸序列。包含或由免疫特异性结合TR7或TR7片段或其变体的这些抗体或抗体片段或其变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些抗体，分子，片段和/或变体(SEQ ID NO：57-71)的核酸分子也包括在本发明内。
本发明还提供了免疫特异性结合一种TR7多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VL结构域中含有的任意1，2，3或多个VL CDR的氨基酸序列。特别地，本发明提供了免疫特异性结合TR7的抗体，所述抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VL结构域中含有的VL CDR1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，免疫特异性结合TR7的抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VL结构域中含有的VL CDR2的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，免疫特异性结合TR7的抗体包含或由一种多肽组成，所述多肽具有表1所示一或多个scFv的VL结构域中含有的VL CDR3的氨基酸序列。包含或由免疫特异性结合TR7或TR7片段或其变体的这些抗体或抗体片段或其变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些抗体，分子，片段和/或变体(SEQID NO：57-71)的核酸分子也包括在本发明内。
本发明还提供了免疫特异性结合TR7多肽或TR7片段或变体的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，其中所述抗体包含或由表1所示一或多个scFv的VH结构域或VL结构域中含有的1，2，3或多个VH CDR和1，2，3或多个VL CDR组成。特别地，本发明提供了免疫特异性结合一种TR7多肽或多肽片段或变体的抗体，其中所述抗体包含或由表1所示一或多个scFv的VH结构域或VL结构域中含有的VH CDRs和VL CDRs的VH CDR1和VL CDR1，VH CDR1和VL CDR2，VH CDR1和VL CDR3，VH CDR2和VLCDR1，VH CDR2和VL CDR2，VH CDR2和VL CDR3，VH CDR3和VH CDR1，VH CDR3和VL CDR2，VH CDR3和VL CDR3，或者其任意组合组成。在一个优选的实施方案中，一或多种这些组合来自表1所示相同的scFv。包含或由免疫特异性结合TR7的这些抗体的片段或变体组成的分子也涵盖在本发明内，编码这些抗体，分子，片段或变体(SEQ ID NO：57-71)的核酸分子也包括在本发明内。
编码抗TR7抗体的核酸分子
本发明还提供了编码本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)的核酸分子，其一般是分离的。在特异的实施方案中，编码本发明抗体的核酸分子包含或由SEQ ID NO：57-71或其片段或变体组成。在一个特异的实施方案中，本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，所述抗体包含或由具有表1所示至少一种scFv的任一VH结构域的氨基酸序列的VH结构域及具有表1所示至少一种scFv的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域组成。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，所述抗体包含或由具有表1所示至少一种scFv的任一VH结构域的氨基酸序列的VH结构域或具有表1所示至少一种scFv的VL结构域的氨基酸序列的VL结构域组成。
本发明还提供了包含或由在此所述抗体分子(例如VH结构域和/或VL结构域)的变体(包括衍生物)组成的抗体，该抗体免疫特异性结合TR7或其片段或变体。可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明分子的核苷酸序列中导入突变，包括例如导致氨基酸取代的定点诱变及PCR介导的诱变。优选地，所述变体(包括衍生物)编码与参比VH结构域，VHCDR1，VHCDR2，VHCDR3，VL结构域，VLCDR1，VLCDR2或VLCDR3相比少于50，少于40，少于30，少于25，少于20，少于15，少于10，少于5，少于4，少于3或少于2个氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有相似电荷侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似电荷侧链的氨基酸残基家族在本领域已经确定。这些家族包括具碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸)，具有无电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰氨，谷氨酰氨，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)及具芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。或者，如通过饱和诱变，突变可以随机在全部或部分编码序列中产生，并可以筛选所得突变体的生物学活性以鉴别保留活性的突变体(例如结合TR7的能力)。
例如，可以只在抗体分子的构架区或CDR区域内进行突变。产生的突变可以是沉默或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力无影响或很小影响。这些类型的突变可以用于最佳化密码子使用，或者改良杂交瘤抗体的产生。或者，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默及中性错义突变的位置很可能在构架区内，而大多数非中性错义突变的位置很可能在CDR内，尽管这不是绝对要求的。本领域技术人员能设计并测试具有希望性质的突变体分子，如抗原结合活性无改变或者结合活性改变(例如抗原结合活性改进或抗体特异性改变)。在诱变后，编码的蛋白质可以常规表达，而且编码的蛋白质的功能和/或生物学活性(例如免疫特异性结合TR7的能力)可以使用在此所述方法或通过本领域已知的常规修饰方法确定。
在一个特异的实施方案中，免疫特异性结合TR7或其片段或变体的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)包含或由一种核苷酸序列编码的氨基酸序列组成，所述核苷酸序列与互补于编码表1所示一或多种scFv的一个VH或VL结构域的核苷酸的核苷酸序列杂交，所述杂交在严格条件下，在高严格条件下，或在其它严格条件下进行，所述严格条件例如在大约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤膜结合的DNA杂交，随后在大约50-65℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤一或多次；高严格杂交条件例如在大约45℃在6×SSC中与滤膜结合的核酸杂交，随后在大约68℃在0.1×SSC/0.2％SDS中洗涤一或多次；其它严格杂交条件为本领域已知那些(见例如Ausubel，F.M.等编辑，1989，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.，及John Wiley &Sons公司，纽约，在第6.3.1-6.3.6和2.10.3页所述)。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本领域熟知具有相似氨基酸序列的多肽或其片段或变体通常具有相似结构及许多相同的生物学活性。因此，在一个实施方案中，免疫特异性结合TR7或TR7片段或变体的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)，包含或由具有与表1所示至少一种scFv的VH结构域的氨基酸序列有至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％相同性的氨基酸序列的VH结构域组成。
在另一个实施方案中，免疫特异性结合TR7或TR7片段或变体的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，包含或由具有与表1所示至少一种scFv的VL结构域的氨基酸序列有至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％相同性的氨基酸序列的VL结构域组成。
生产抗体的方法
本发明的抗体优选利用噬菌体scFv展示文库制备。用于实现此目的的方法见于在此揭示的专利，申请及参考文献所述。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面展示。特别地，编码VH和VL结构域的DNA序列从动物cDNA文库(例如人或鼠淋巴组织的cDNA文库)或合成的cDNA文库中扩增。编码VH和VL结构域的DNA通过一个scFv接头经PCR连接在一起，并克隆入一个噬菌粒载体中(例如pCANTAB6或pComb3 HSS)。将该载体电穿孔入大肠杆菌中，并将该大肠杆菌用辅助噬菌体感染。这些方法中使用的噬菌体典型是包括fd和M13的丝状噬菌体，VH和VL结构域通常重组融合于噬菌体基因III或基因VIII。表达与感兴趣的抗原(即TRAIL受体多肽或其片段)结合的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原选择或鉴别，例如使用标记的抗原或与一种固体表面或珠结合或捕捉的抗原。可以用于生产本发明抗体的噬菌体展示方法的实施例包括但非限于Brinkman等，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等，Gene 187：9-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请No.PCT/GB91/O1 134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO92/01047；WO 92/18719；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 97/13844及美国专利No.5698426；5223409；5403484；5580717；5427908；5750753；5821047；5571698；5427908；5516717；5780225；5658727；5735743及5969108所揭示，所述文献在此以其全文并入参考。
针对一些应用，如本发明抗体的体外亲和性成熟，有利的是表达表1所示一或多种scFv的VH和VL结构域，作为噬菌体展示文库中的单链抗体或Fab片段。例如，编码表1所示scFv的VH和VL结构域的cDNA可以使用噬菌体展示文库以所有可能的组合表达，以选择具有优选的结合特性如改进的亲和性或改善的解离速率的结合TR7多肽的VH/VL组合。另外，VH和VL片段，特别是表1所示scFv的VH和VL结构域的CDR区域，可以在体外突变。在噬菌体展示文库中具有“突变”CDR的VH和VL结构域的表达使得能选择具有优选的结合特性如改进的亲和性或改善的解离速率的结合TR7多肽的VH/VL组合。
生产抗体的其它方法
本发明的抗体(包括抗体片段或变体)可以通过本领域已知的任何方法生产。例如，应意识到本发明的抗体可以在杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列可以例如用于转化一种合适的哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞，或者用于产生噬菌体展示文库。另外，本发明的多肽抗体可以经化学合成或通过使用重组表达系统产生。
生产本发明抗体的一种方式是克隆表1所示scFv的VH和/或VL结构域。为从用含有scFv的载体转染的细菌中分离VH和VL结构域，可以使用互补于VH或VL核苷酸序列的PCR引物(见实施例4)以扩增VH和VL序列。PCR产物然后可以使用载体克隆，所述载体例如具有由5’和3’单个T核苷酸突出端(overhang)组成的PCR产物克隆位点，所述突出端与通过用于PCR反应的许多DNA聚合酶加入到PCR产物的5’和3’末端上的突出的单个腺苷酸互补。VH和VL结构域然后可以使用本领域已知常规方法测序。或者，VH和VL结构域可以使用设计为扩增全部scFv(即VH结构域，接头和VL结构域)的载体特异性引物扩增。
克隆的VH和VL基因可以置于一或多种合适的表达载体中。作为非限制性实施例，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点及保护限制性位点的侧翼序列的PCR引物扩增VH或VL序列。利用本领域已知的克隆技术，PCR扩增的VH结构域可以克隆入表达适当的免疫球蛋白恒定区的载体中，所述恒定区例如分别是VH结构域的人IgG1或IgG4恒定区，κ和λVL结构域的人κ或λ恒定区。优选地，表达VH或VL结构域的载体包含一个适于指导在选择的表达系统中表达重链和轻链的启动子、分泌信号、用于免疫球蛋白可变区和免疫球蛋白恒定区的克隆位点及选择标记如新霉素。VH和VL结构域还可以克隆入表达必需恒定区的单个载体中。重链转化载体和轻链转化载体然后使用本领域已知的方法共转染入细胞系中以产生稳定或瞬时表达全长抗体例如IgG的细胞系(见例如Guo等，J.Clin.Endocrinol.Metab.82：925-31(1997)，及Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-86(1995)所述，在此以其全文并入参考)。
本发明提供了包含或由编码本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)的核苷酸序列组成的多核苷酸。本发明还涵盖了在高度严格杂交条件下或者在中等或较低严格杂交条件下(如前述)，与互补于具有编码本发明抗体或其片段或变体的多核苷酸序列的核酸的多核苷酸杂交的多核苷酸。
通过本领域已知的任何方法，可以获得所述多核苷酸及确定所述多核苷酸的核苷酸序列。如果已知VH结构域，VL结构域及其CDR的氨基酸序列，则可以使用本领域熟知的方法确定编码这些抗体的核苷酸序列，即以这种方式装配已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生编码本发明抗体的核酸。编码所述抗体的这种多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸中装配(例如Kutmeier等，BioTechniques 17：242(1994)所述)，简而言之，这包括合成含有部分编码所述抗体的序列的重叠寡核苷酸，退火并连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码一种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)的多核苷酸可以从合适来源的核酸中产生。如果不能获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但已知所述抗体分子的序列，则编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成或得自一个合适来源(例如抗体cDNA文库，或者从表达所述抗体的任何组织或细胞中产生的cDNA文库，或从中分离的核酸优选poly A+RNA，所述组织或细胞如表达本发明抗体的杂交瘤细胞或Epstein Barr病毒转化的B细胞系)，通过使用与所述序列3’和5’末端杂交的合成引物进行PCR扩增，或者通过使用特异于特定基因序列的寡核苷酸探针进行克隆，以例如从编码所述抗体的cDNA文库中鉴别cDNA克隆。通过PCR产生的扩增的核酸然后可以使用本领域熟知的任何方法克隆入可复制克隆载体中。
一旦确定抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)的核苷酸序列，则该抗体的核苷酸序列可以使用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法进行操作，例如重组DNA技术，定点诱变，PCR等(见例如Sambrook等，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，NY及Ausubel等编辑，1998，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY，在此均以其全文并入参考)以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代，缺失和/或插入。
在一个特异的实施方案中，使用本领域已知的重组DNA技术将表1所示一或多种scFv的VH和VL结构域或其片段或变体插入构架区中。在一个特异的实施方案中，使用本领域已知的重组DNA技术将表1所示一或多种scFv的VH和/或VL结构域的1，2，3，4，5，6或多个CDR或其片段或变体插入构架区中。该构架区可以是天然发生的或共有的构架区，优选人构架区(见例如Chothia等，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)所列出的人构架区表，其全部内容在此并入参考)。优选地，通过将所述构架区与CDR组合产生的多核苷酸编码一种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，所述抗体特异性结合TRAIL受体。优选地，如前所述，编码具有一或多个氨基酸取代的所述抗体变体或抗体片段的多核苷酸可以在构架区内产生，优选所述氨基酸取代不明显改变抗体与抗原的结合。另外，这种方法可以用于产生参与链内二硫键的一或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以产生缺失一或多个链内二硫键的抗体分子或抗体片段或抗体变体。多核苷酸的其它改变也涵盖在本发明范围内并为本领域技术人员所已知。
在YAC中克隆并重建兆碱基(Mb)大小的人基因座并将它们导入小鼠种系中的能力提供了一种有力方法以阐明非常大的或粗略作图的基因座的功能成分以及产生人体疾病的有用模型。另外，利用这种用其人等价物取代小鼠基因座的技术可以提供关于人体基因产物在发育期间的表达和调节，其与其它系统的通讯及其参与疾病产生和进展的独特认识。
这种策略的一个重要的实际应用是“人源化”小鼠体液免疫系统。将人免疫球蛋白(Ig)基因座导入内源性Ig基因已经失活的小鼠中，可以有机会研究抗体的程序化表达及装配机制，以及其在B细胞产生中的作用。另外，这种策略可以提供一种理想来源以产生完全人单克隆抗体(Mabs)，这是实现用抗体治疗人体疾病的一个重要里程碑。
完全人抗体预期使对小鼠或小鼠衍生的单克隆抗体固有的免疫原性和变态反应应答最小化，并因此提高施用的抗体的效力和安全性。完全人抗体的应用可以预期在治疗需要反复施用抗体的人体慢性及复发疾病如癌症中提供大的优势。
关于这个目的的一个方案是用人Ig基因座的大量片段工程化小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系，预期这种小鼠在无小鼠抗体的情况下产生大量的人抗体。大的人Ig片段可以保持大量可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当调节。通过使用小鼠抗体多样化和选择机制及对人体蛋白丧失免疫学耐受性，在这些小鼠品系中再生产的人抗体应产生对包括人抗原在内的任何感兴趣的抗原的高亲和性抗体。使用杂交瘤技术，可以易于生产并选择具有所需特异性的抗原特异性人单克隆抗体。
这种一般策略因1994年公布的第一个XenoMouseTM品系的产生而证明。见Green等，Nature Genetics 7：13-21(1994)。XenoMouseTM品系用酵母人工染色体(YAC)工程化，所述YAC分别含有人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和10190kb大小的种系构型片段，其含有核心可变区和恒定区序列。文献同上。已证实含有YAC的人Ig与小鼠系统在抗体重排和表达方面均相容，而且能取代失活的小鼠Ig基因。这通过其诱导B细胞发育，产生完全人抗体的类成人所有组成成分，及产生抗原特异性人单克隆抗体的能力而证实。这些结果还提示导入含有较多V基因的人Ig基因座的较大部分，额外的调节元件及人Ig恒定区，可以基本上重现全部的所有组成成分，这是人体对感染和免疫的体液应答的特征。Green等的研究最近延伸到通过分别导入兆碱基大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系构型YAC片段而导入大约80％以上的人体抗体所有组成成分，以产生XenoMouseTM小鼠。见Mendez等，Nature Genetics 15：146-156(1997)，Green和Jakobovits，J Exp.Med.188：483-495(1998)，Green，Journal of Immunological Methods 231：11-23(1999)及1996年12月3日申请的美国专利申请No.08/759620，所述文献在此全文并入参考。
这种方法在以下文献进一步论述及描绘：1990年1月12日申请的美国专利申请No.07/466008，1990年11月8日申请的07/710515，1992年7月24日申请的07/919297，1992年7月30日申请的07/922649，1993年3月15日申请的08/031801，1993年8月27日申请的08/112848，1994年4月28日申请的08/234145，1995年1月20日申请的08/376279，1995年4月27日申请的08/430938，1995年6月5日申请的08/464584，1995年6月5日申请的08/464582，1995年6月5日申请的08/471191，1995年6月5日申请的08/462837，1995年6月5日申请的08/486853，1995年6月5日申请的08/486857，1995年6月5日申请的08/486859，1995年6月5日申请的08/462513，1996年10月2日申请的08/724752，及1996年12月3日申请的08/759620。也见于Mendez等，Nature Genetics 15：146-156(1997)，及Green和Jakobovits，J Exp.Med.188：483-495(1998)。也见于1996年6月12日授权公布的欧洲专利No.EP 047115181，1994年2月3日公布的国际专利申请No.WO94/02602，1996年10月31日公布的国际专利申请No.WO 96/34096，及1998年6月11日公布的WO98/24893所述。上述专利，申请及参考文献在此均以其全文并入参考。
人抗小鼠抗体(HAMA)应答导致业界制备嵌合的或其它人源化抗体。尽管嵌合抗体具有人恒定区和鼠可变区，但预期可以观测到一些人抗嵌合抗体(HACA)应答，尤其在长期或多剂量利用这些抗体的情况中。因此，需要提供抗TR7多肽的完全人抗体以降低HAMA或HACA应答的关注和/或影响。
特异于TR7多肽的单克隆抗体可以使用杂交瘤技术制备(Kohler等，Nature 256：495(1975)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：292(1976)；Hammerling等，in：MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，pp571-681(1981))。简而言之，XenoMouseTM小鼠可以用TR7多肽免疫。在免疫后，提取该小鼠的脾细胞并与一种合适的骨髓瘤细胞系融合。根据本发明可以使用任何合适的骨髓瘤细胞系；然而，优选应用得自ATCC的亲代骨髓瘤细胞系(SP2O)。在融合后，所得杂交瘤细胞选择性地保持在HAT培养基中，然后通过限制性稀释克隆，如Wands等所述(Gastroenterology 80：225-232(1981))。然后分析通过这种选择获得的杂交瘤细胞，以鉴别分泌能结合TR7多肽的抗体的克隆。
对于一些应用，包括在人体体内应用抗体及在体外检测分析中的应用，优选使用人或嵌合抗体。特别需要完全人抗体用于治疗人类患者。也见于美国专利4444887和4716111；及PCT公开WO 98/46645，WO 98/50435，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO96/35735及WO 91/10741；所述文献在此均以全文并入参考。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体包含本发明的一或多个VH和VL结构域及来自另一种免疫球蛋白分子优选人免疫球蛋白分子的恒定区。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体包含一或多个相应于本发明VH和VL结构域的CDR及来自另一种免疫球蛋白分子优选人免疫球蛋白分子的构架区。在其它的实施方案中，本发明的抗体包含相应于表1所示一或多种scFv的一或多个VH或VL结构域的1，2，3，4，5，6或更多个VL CDR或VH CDR或其片段或变体，及来自人免疫球蛋白分子的构架区(及任选不是衍生自表1所示scFv表达的抗体的一或多个CDR)。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含相应于选自表1所示scFv的相同的scFv或不同的scFv的VHCDR3，VL CDR3或两者，或其片段或变体，及来自人免疫球蛋白的构架区。
嵌合抗体是一种分子，其中抗体的不同部分衍生自不同的免疫球蛋白分子，如具有衍生自人抗体的可变区及非人(例如鼠)免疫球蛋白恒定区的抗体或反之的抗体。本领域已知生产嵌合抗体的方法。见例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利No.5807715；4816567及4816397，在此以其全文并入参考。包含人物种的一或多个CDR及非人免疫球蛋白分子的构架区(例如来自鼠，犬或猫免疫球蛋白分子的构架区)的嵌合抗体(或相反情况的嵌合抗体)可以使用本领域已知的多种方法生产，包括例如CDR移植(grafting)(EP239400；PCT公开WO9I/09967；美国专利No.5225539；5530101和5585089)，镶嵌(veneering)或表面再处理(resurfacing)(EP592106；EP519596；Padlan，Molecular Immunology28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，Protein Engineering7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS 91：969-973(1994))，及链改组(shuffling)(美国专利No.5565352)。在一个优选的实施方案中，嵌合抗体包含一个人CDR3和非人构架区或不同于表1所示相应的scFv中的构架区的人构架区，所述人CDR3具有表1所示一或多种scFv的VH或VL结构域的任一VH CDR3或VL CDR3的氨基酸序列。通常，构架区中的构架残基用来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变，优选改良抗原结合性。这些构架取代通过本领域熟知方法鉴别，例如通过建立CDR与构架残基的相互作用的模型以鉴别对抗原结合而言重要的构架残基，以及进行序列对比以鉴别在特定位置的不寻常的构架残基(见，例如Queen等，美国专利No.5585089；Riechmann等，Nature 352：323(1988)，在此以其全文并入参考)。
内抗体(Intrabody)是从重组核酸分子中表达并被工程化而保留在胞内(例如保留在胞质，内质网或周质中)的抗体，通常为scFvs。可以使用内抗体例如消除内抗体结合的蛋白质的功能。内抗体的表达还可以通过使用包含所述内抗体的核酸表达载体中的可诱导启动子进行调节。本发明的内抗体可以使用本领域已知方法生产，参见如下文献：Chen等，Hum.Gene Ther.5：595-601(1994)；Marasco，W.A.，Gene Ther.4：11-15(1997)；Rondon和Marasco，Annu.Rev.Microbiol.51：257-283(1997)；Proba等，J.Mol.Biol.275：245-253(1998)；Cohen等，Oncogene 17：2445-2456(1998)；Ohage和Steipe，J.Mol.Biol.291：1119-1128(1999)；Ohage等，J.Mol.Biol.291：1129-1134(1999)；Wirtz和Steipe，Protein Sci.8：2245-2250(1999)；Zhu等，J.Immunol.Methods 231：207-222(1999)，及这些文献所引述的参考文献。
本发明抗体的重组表达(包括抗体片段或其变体(例如本发明抗体的重链或轻链))，需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的一种表达载体。一旦获得编码本发明抗体分子(例如完整抗体，抗体的重链或轻链，或其部分(优选但非必需含有重链或轻链可变结构域))的多核苷酸，则可以使用本领域熟知技术通过重组DNA技术生产所述抗体分子的载体。因此，在此描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸而制备蛋白质的方法。可以使用本领域熟知的方法构建含有抗体编码序列及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术，合成技术及体内遗传重组。本发明因此提供了可复制的载体，所述载体包含编码本发明抗体分子(例如完整抗体，抗体的重链或轻链，抗体的重链或轻链可变结构域，或其部分，或重链或轻链CDR，单链Fv，或其片段或变体)的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操纵地连接于一个启动子。这种载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见例如PCT公开WO86/05807；PCT公开WO89/01036；及美国专利5122464，所述文献在此以其全文并入参考)，抗体的可变结构域可克隆入这种载体中以表达完整重链，完整轻链，或完整的重链和轻链。
将表达载体通过常规方法移至宿主细胞中，然后将转染的细胞通过常规方法培养以产生本发明抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体(例如完整抗体，其重链或轻链，或其部分，或单链抗体，或其片段或变体)的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操纵地连接于一个异源启动子。在优选的实施方案中，为表达完整的抗体分子，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达，以表达完整的免疫球蛋白分子，如以下详细描述。
可以利用多种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分子。这种宿主表达系统代表可以用以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体，但也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达本发明抗体分子的细胞。这些载体包括但非限于工程化表达抗体片段或其变体(单链抗体)的噬菌体颗粒，微生物如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌，枯草芽抱杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(Saccharomyces，Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的植物细胞系统，或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS，CHO，BHK，293，3T3，NSO胞)，所述构建体含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)，或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。优选地，细菌细胞如大肠杆菌，及更优选地，尤其是表达完整重组抗体分子的真核细胞，用于表达重组抗体分子。例如，结合了一种载体如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种抗体的有效表达系统(Foecking等，Gene 45：101(1986)；Cockett等，Bio/Technology 8：2(1990)；Bebbington等，Bio/Technology 10：169(1992)；Keen和Hale，Cytotechnology 18：207(1996))。这些参考文献在此以其全文并入参考。
在细菌系统中，可以有利地根据待表达的抗体分子的应用，选择一些表达载体。例如，当需产生大量这种蛋白质时，为产生抗体分子的药物组合物，需要指导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这种载体包括但非限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO1.2：1791(1983))，其中所述抗体编码序列可以单独连接于载体中使其与具有lacZ编码区同框，以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye& Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke &Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))和类似的。pGEX载体也可以用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常地，这种融合蛋白是可溶的，而且，通过吸附并结合于基质谷胱甘肽琼脂糖珠，随后在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱而易于从裂解的细胞中纯化。pGEX载体设计为包含凝血酶或因子Xa蛋白酶解位点，以便克隆的靶基因产物可以从GST部分中释防出来。
在一个昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可以用作表达外源基因的载体。所述病毒在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可以单独克隆入病毒的非必需区域(例如多角蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况中，感兴趣的抗体编码序列可以连接于一个腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。这个嵌合的基因然后可以通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。在病毒基因组的一个非必需区域中(例如E1或E3区)的插入将产生能在感染的宿主中存活并表达所述抗体分子的重组病毒(例如参见Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359(1984))。特异性起始信号也可以是有效翻译插入的抗体编码序列所需的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。另外，所述起始密码子必须与所需编码序列的读框同相，以保证完整插入体的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的，可以是天然的和合成的。表达效率可以通过包含适当的转录增强子元件，转录终止子等而加强(见例如Bittner等，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。
另外，可以选择以所需特异方式调节插入序列表达或者修饰和加工基因产物的宿主细胞株。这种蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对所述蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有特有的和特异的翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以保证正确修饰和加工表达的外源蛋白。为此，可以使用具有合适的加工原始转录物，糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但非限于CHO，VERY，BHK，Hela，COS，NSO，MDCK，293，3T3，W138，尤其乳腺癌细胞系如BT483，Hs578T.HTB2，BT2O和T47D，及正常乳腺细胞系如CRL7O3O和HsS78Bst。
为长期高产量生产重组的蛋白质，优选稳定的表达。例如，可以将稳定表达所述抗体的细胞系工程化。除了使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用由适当表达控制元件(例如启动子，增强子，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和一个选择标记转化。在导入外源DNA后，可以使工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移至选择性培养基。重组质粒中可选择的标记产生对选择条件的抗性，并使细胞稳定地将所述质粒整合入其染色体中，并生长形成转化灶(foci)，然后将所述转化灶克隆及扩展入细胞系中。这个方法可用于工程化表达抗体分子的细胞系。这种工程化细胞系可特别用于筛选和评价与所述抗体分子直接或间接相互作用的组合物。
可以使用许多筛选系统，包括但非限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11：223(1977))，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell 22：817(1980))基因，它们可以分别用于tk-，hgprt-或aprt-细胞中。同样，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择基础：dhfr，其产生对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其产生对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其产生对氨基糖苷G-418抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH11(5)：155-215(May，1993))；及hygro，其产生对潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30：147(1984))。可以常规使用重组DNA技术领域已知的常规方法选择所需的重组克隆，这种方法见例如Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecualr Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton出版社NY(1990)；及Dracopoli等(编辑)，Current Protocolsin Human Genetics，第12和13章，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.150：1(1981)，这些文献以其全文并入参考。
抗体分子的表达水平可以通过载体扩增而提高(参见Bebbington和Hentschel，″The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells″in DNA Cloning，第3卷(学术出版社，纽约，1987))。当表达抗体的载体系统中的一个标记是可扩增的时候，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的提高将会提高标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的编码序列相关，因此抗体的产生也将增加(Crouse等，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为选择标记的载体可以在分别存在药物甲硫氨酸sulphoximine或氨甲蝶呤的情况下扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优势是可利用谷氨酰胺合酶阴性的细胞系(例如鼠骨髓瘤细胞系，NS0)。谷氨酰胺合酶表达系统还可以在谷氨酰胺合酶表达细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中发挥作用，其通过提供另外的抑制剂阻止内源基因的作用而起作用。谷氨酰胺合酶表达系统及其成分详见于PCT公开WO87/04462，WO86/05807，WO89/01036，WO89/10404，和WO91/06657所述，这些文献在此全文并入参考。另外，本发明可以使用的谷氨酰胺合酶表达载体可商购自供应商，例如Lonza Biologics，Inc.(Portsmouth，NH)。使用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达及产生单克隆抗体见Bebbington等，Bio/technology 10：169(1992)及Biblia和Robinson，Biotechnol.Prog.11：1(1995)所述，这些文献全文并入参考。
所述宿主细胞可以用本发明的两种表达载体共转染，第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可以含有相同的选择标记，其能等量表达重链和轻链多肽。或者，可以使用编码而且能同时表达重链和轻链多肽的一个载体。在这种情况中，轻链优选置于重链之前，以避免毒性游离重链过量(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2 197(1980))。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的抗体分子(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)已经通过化学合成或重组表达，可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的方法纯化，或更普遍地，使用纯化蛋白质分子的方法纯化，例如层析(例如离子交换，亲和性，特别是在蛋白质A及大小排阻层析后对特异性抗原的亲和性)，离心，不同的溶解性，或纯化蛋白质的任何其它标准方法。另外，本发明的抗体可以与本发明所述或本领域已知的其它异源多肽序列融合以易于纯化。
本发明的抗体包括天然纯化的产物，化学合成方法的产物，及通过重组方法从原核或真核宿主中产生的产物，所述宿主包括例如细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞。根据在重组生产方法中应用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化或非糖基化的。另外，本发明的抗体还可以包括一个最初的修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况中是宿主介导的过程的结果。
本发明的抗体可以使用本领域已知方法化学合成(例如见Creighton，1983，Proteins：Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman&Co.，N.Y.及Hunkapiller等，1984 Narure 310：105-111)。例如，相应于本发明抗体片断的一种肽可以使用肽合成仪合成。另外，如果需要，非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为取代或添加导入抗体多肽序列中。非经典氨基酸包括但非限于常见氨基酸的D-异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，半胱磺酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，b-丙氨酸，氟氨基酸，设计氨基酸如b-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸及氨基酸类似物。另外，所述氨基酸可以是D氨基酸(右旋)或L氨基酸(左旋)。
本发明涵盖了在翻译期间或之后被差异修饰的抗体，例如通过糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/阻断基团衍生化，蛋白酶解，连接于抗体分子或其它细胞配体等。任何化学修饰均可以通过已知技术进行，包括但非限于通过以下物质的特异性化学裂解：溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4，乙酰化，甲酰化，氧化，还原，在存在衣霉素情况下代谢合成等。
本发明涵盖的额外翻译后修饰包括例如N-连接的或O-连接的碳水化合物链，N或C末端加工，将化学部分附着于氨基酸主链，化学修饰N连接的或O连接的碳水化合物链，及作为原核宿主细胞表达的结果而加入或缺失一个N末端甲硫氨酸残基。所述抗体也可以用一种可检测标记修饰，如酶标记，荧光标记，同位素标记或亲和标记，以检测及分离所述抗体。
合适的酶的实施例包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖氧化酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的实施例包括链亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光材料的实施例包括生物素，伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料实施例包括鲁米诺；生物发光材料实施例包括萤光素酶，萤光素，和水母发光蛋白；合适的放射性物质实施例包括放射性金属离子，例如α-发射物例如213Bi，或者其它放射性同位素例如碘(131I，125I，123I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115mIn，113mIn，112In，111In)，和锝(99Tc，99mTc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn和117Tin。
在特异的实施方案中，本发明的抗体可用铕标记。例如，本发明的抗体可以使用DELFIA Eu-标记试剂盒(目录号#1244-302，PerkinElmer Life Sciences，Boston，MA)根据厂商指导用铕标记。
在特异的实施方案中，本发明的抗体附着于大环类螯合剂，用于将放射性金属离子包括但非限于111In，177Lu，90Y，166Ho，153Sm，215Bi和225Ac缀合于多肽。在一个优选的实施方案中，与附着于本发明抗体的大环类螯合剂相关的放射性金属离子是111In。在另一个优选的实施方案中，与附着于本发明抗体多肽的大环类螯合剂相关的放射性金属离子是90Y。在特异的实施方案中，大环类螯合剂是1，4，7，10-四氮环化十二烷-N，N’，N’′，N’″-四乙酸(DOTA)。在特异的实施方案中，大环类螯合剂是α-(5-异硫氰酸-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮环化十二烷-1，4，7，10-四乙酸。在其它特异的实施方案中，DOTA通过一个接头分子附于本发明抗体。用于将大环类螯合剂如DOTA缀合于多肽的接头分子的实施例是本领域已知的，见例如DeNardo等，Clin CancerRes.4(10)：2483-90，1998；Peterson等，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，1999，所述文献以其全文并入参考。另外，美国专利5652361和5756065揭示了可与抗体缀合的螯合剂及生产和使用它们的方法，在此以其全文并入参考。
在一个实施方案中，本发明的抗体用生物素标记。在其它相关的实施方案中，生物素标记的本发明的抗体可以例如用作一种显影剂或作为鉴别一或多个TRAIL受体共同受体或配体分子的一种手段。
本发明还提供了本发明抗体的化学修饰的衍生物，所述修饰的衍生物可提供另外的优势如多肽的溶解性、稳定性及体内或体外循环时间增加，或者免疫原性降低(见美国专利No.4179337)。用于衍生的化学部分可以选自水溶性聚合物如聚乙二醇，1，2亚乙基二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇等。所述抗体可以在分子内的随机位置修饰，或者在分子内预定位置修饰，而且可以包括1、2、3或多个附着的化学部分。
所述聚合物可以是任何分子量的，而且可以是分支或不分支的。针对聚乙二醇，优选的分子量为大约1kDa至大约100kDa(术语“大约”是指在制备聚乙二醇中，一些分子比规定分子量多或少)之间，以易于处理和生产。根据所需治疗方案(例如所希望的持续释放时间、对生物学活性作用(如果有)、处理的简便性、抗原性程度或丧失、及聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物的其它已知作用)，可以使用其它大小的分子。例如，所述聚乙二醇的平均分子量为大约200，500，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10000，10500，11000，11500，12000，12500，13000，13500，14000，14500，15000，15500，16000，16500，17000，17500，18000，18500，19000，19500，20000，25000，30000，35000，40000，50000，55000，60000，65000，70000，75000，80000，85000，90000，95000或100000kDa。
如上所述，所述聚乙二醇可以具有分支结构。分支的聚乙二醇例如美国专利No.5643575；Morpurgo等，Appl.Biochem.Biotechnol.56：59-72(1996)；Vorobjev等，Nucleosides Nucleotides 18：2745-2750(1999)；及Caliceti等，Bioconjug.Chem.10：638-646(1999)所述，所述内容在此并入参考。
考虑到对蛋白质的功能结构域或抗原结构域的作用，所述聚乙二醇分子(或其它化学部分)应附着于所述抗体。有许多本领域技术人员可利用的附着方法，例如EP0401384所述，在此并入参考(将PEG与G-CSF偶联)，也见于Malik等，Exp Hematol 20：1028-1035(1992)(使用tresyl氯化物对GM-CSF进行PEG化)。例如，聚乙二醇可以通过一个反应性基团与氨基酸残基共价结合，所述反应性基团例如一种游离的氨基或羧基基团。反应性基团是激活的聚乙二醇分子可以结合的那些基团。具有游离氨基基团的氨基酸残基可以包括，例如赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；具有游离羧基基团的那些残基可以包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基基团也可以用作反应性基团以附着聚乙二醇分子。针对治疗目的优选在氨基基团附着，如在N末端或赖氨酸基团附着。
如上所提示，聚乙二醇可以通过与任何数目的氨基酸残基连接而附着于蛋白质，例如，抗体。例如，聚乙二醇可以通过与赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸残基的共价键而与蛋白质连接。可以应用一或多种反应化学以将聚乙二醇附着于蛋白质的特异氨基酸残基(例如赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸)，或者附着于蛋白质的一种以上类型的氨基酸残基(例如赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸及其组合)。
特别希望的是在重链或轻链或这两者的N末端经化学修饰的抗体。使用聚乙二醇作为例证，可以从多种聚乙二醇分子(通过分子量，分支等)，反应混合物中聚乙二醇与蛋白质(或肽)分子的比例，进行peg化反应类型，及获得所选择的N末端peg化蛋白的方法中加以选择。获得N末端peg化制品的方法(即如果需要从其它单peg化部分中分离这种部分)可以通过从一群peg化蛋白质分子中纯化N末端peg化材料进行。在N末端的选择性化学修饰可以通过还原烷化而实现，其使用不同类型的初级氨基酸基团的不同反应性(赖氨酸和N末端)以在特殊蛋白质中衍生化。在适当反应条件下，用含有羰基基团的聚合物实现蛋白质N端基本上选择性的衍生化。
如上所示，本发明抗体的peg化可以通过许多方法实现。例如，可以将聚乙二醇直接或通过一个间插接头而附着于抗体。将聚乙二醇附着于蛋白质的无接头系统见Delgado等，Crit.Rev.Thera.Drug CarrierSys.9：249-304(1992)；Francis等，Intern.J.of Hematol.68：1-18(1998)；美国专利No.4002531；美国专利No.5349052；WO95/06058及WO98/32466所述，所述文献在此并入参考。
将聚乙二醇不用间插接头而直接附着于抗体的氨基酸残基的一个系统是应用tresylated MPEG，其是通过使用tresyl氯(ClSO2CH2CF3)修饰单甲氧基聚乙二醇(MPEG)而产生的。在蛋白质与tresylated MPEG反应时，聚乙二醇直接附着于蛋白质的氨基基团。因此，本发明包括抗体-聚乙二醇缀合物，其通过本发明抗体与具有2，2，2-三氟乙烷磺酰基团的聚乙二醇分子反应而产生。
聚乙二醇也可以使用一些不同的间插接头而附着于抗体。例如，在此并入参考的美国专利No.5612460揭示了连接聚乙二醇与蛋白质的氨基甲酸乙酯接头。聚乙二醇通过接头附着于抗体的抗体-聚乙二醇缀合物也可以通过将抗体与化合物反应而产生，所述化合物如MPEG-琥珀酰亚氨基琥珀酸酯、用1，1’-羰基二咪唑活化的MPEG、MPEG-2，4，5-三氯penyl碳酸酯、MPEG-p-硝基酚碳酸酯及多种MPEG-琥珀酸酯衍生物。将聚乙二醇附着于蛋白质的一些另外的聚乙二醇衍生物及反应化学见WO98/32466所述，其全部内容在此并入参考。使用本文所述反应化学产生的peg化抗体产物包括在本发明范围内。
附着于本发明每一抗体的聚乙二醇部分的数目(即取代的程度)也可以变化。例如，本发明peg化抗体可以连接于平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20或更多个聚乙二醇分子。相似地，平均取代程度在每个抗体分子1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19或18-20个聚乙二醇部分的范围内。确定取代程度的方法见例如Delgado等，Crit.Rev.Thera.CarrierSys.9：249-304(1992)所述。
抗TR7抗体的定性
本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)还可以根据其与TR7多肽或TR7多肽片段或变体的结合而描述或说明。在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体，解离常数KD小于或等于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M或10-5M。更优选地，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体，解离常数或KD小于或等于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M或10-8M。更优选地，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体，解离常数或KD小于或等于5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M或10-15M。本发明涵盖了以解离常数或KD在每个具体列出数值之间任一范围内结合TR7多肽的抗体。
在特异的实施方案中，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体，解离速率(off rate)(koff)小于或等于5×10-2/秒，10-2/秒，5×10-3/秒或10-3/秒。更优选地，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体，解离速率(koff)小于或等于5×10-4/秒，10-4/秒，5×10-5/秒或10-5/秒，5×10-6/秒，10-6/秒，5×10-7/秒或10-7/秒。本发明涵盖了以解离速率(koff)在每个具体列出的数值之间的任一范围内结合TR7多肽的抗体。
在其它实施方案中，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体，结合速率(on rate，kon)高于或等于103M-1/秒，5×103M-1/秒，104M-1/秒或5×104M-1/秒。更优选地，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体，结合速率(kon)高于或等于105M-1/秒，5×105M-1/秒，106M-1/秒，或5×106M-1/秒或107M-1/秒。本发明涵盖了以结合速率(kon)在每个具体列出的数值之间的任一范围内结合TR7多肽的抗体。
本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)免疫特异性结合人TR7多肽(SEQ ID NO：3)或多肽片段或变体。在另一个实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合猿TR7多肽或多肽片段或变体。在又一个实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合鼠TR7多肽或多肽片段或变体。在一个实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合人和猿TR7多肽。在另一个实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合人TR7多肽和鼠TR7多肽。更优选地，与鼠TR7多肽相比，本发明的抗体优先结合人TR7多肽。
在优选的实施方案中，本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)免疫特异性结合TR7，但与任何其它抗原不交叉反应。在优选的实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合TR7多肽(例如SEQ ID NO：3或其片段或变体)，但与肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子受体家族多肽(例如TR1，TR5，TR10 BCMA，TACI，CD30，CD27，OX40，4-1BB，CD40，NGFR，TNFR1，TNFR2，Fas和NGFR)的一或多个成员不交叉反应。
在另一个实施方案中，本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)免疫特异性结合TR7多肽并与其它抗原交叉反应。在其它实施方案中，本发明的抗体免疫特异性结合TR7多肽(例如SEQ ID NO：3或其片段或变体)，并与肿瘤坏死因子受体家族(例如TR1，TR5，TR10，BCMA，TACI，CD30，CD27，OX40，4-1BB，CD40，NGFR，TNFR1，TNFR2，Fas及NGFR)的一或多个另外的成员交叉反应。
在一个优选的实施方案中，相对于结合TR1，TR4，TR5或TR10(SEQ ID NO：5，1，2和4)或其片段或变体的能力，本发明的抗体优先结合TR7多肽(SEQ ID NO：3)或其片段或变体。在其它优选的实施方案中，相对于结合TR1，TR5或TR10(SEQ ID NO：5，2和4)或其片段或变体的能力，本发明的抗体优先结合TR7和TR4(SEQ IDNO：3和1)或其片段或变体。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体结合TR1，TR7，TR5，TR4和TR10(SEQ ID NO：5，1，2，3，和4)。与另一种抗原相比，抗体优先结合一种抗原的能力可以使用本领域已知的任何方法测定。
非限制性的实施例是，如果一种抗体结合第一种抗原的解离常数(KD)低于该抗体结合第二种抗原的KD，则认为其优先结合第一种抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的亲和性(即KD)比该抗体与第二种抗原的KD至少低一个数量级，则认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的亲和性(即KD)比该抗体与第二种抗原的KD至少低两个数量级，则认为该抗体优先结合第一种抗原。
在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的解离速率(koff)低于该抗体与第二种抗原的koff，则认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的koff比该抗体与第二种抗原的koff至少低一个数量级，则认为该抗体优先结合第一种抗原。在另一个非限制性实施方案中，如果一种抗体结合第一种抗原的koff比该抗体与第二种抗原的koff至少低两个数量级，则认为该抗体优先结合第一种抗原。
本发明还涵盖了与本发明所述一或多种抗体具有一或多种相同生物学特征的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。“生物学特征”是指所述抗体在体外或体内的活性或性质，例如结合TR7多肽(例如膜包埋的TRAIL受体)的能力，刺激TR7介导的生物学活性的能力(例如刺激TR7表达细胞的凋亡，见实施例3)，基本阻断TR7配体(例如TRAIL(SEQ ID NO：72)，也称为AIM-I，国际申请No.WO97/35899和美国专利申请5771223)的能力，或其片段、变体或融合蛋白的结合TRAIL受体的能力，见实施例2；或上调TR7在细胞表面表达的能力。TR7多肽的抗体的其它生物学活性可包括但非限于抑制TR7介导的生物学活性的能力(例如抑制TR7表达细胞的凋亡)，或者下调TR7在细胞表面表达的能力。任选地，本发明的抗体与在此特别描述的至少一种抗体结合相同的表位。这种表位结合可以使用本领域已知的分析常规确定。
本发明还提供了刺激TR7介导的生物学活性的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。在一个实施方案中，刺激TR7介导的生物学活性的抗体包含或由表1所示至少一种scFv的VH和/或VL结构域或其片段或变体组成。在一个特异的实施方案中，刺激TR7介导的生物学活性的抗体包含或由表1所示任一种scFv的VH和VL结构域或其片段或变体组成。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还提供了刺激TR7表达细胞凋亡的抗体(包含包含或由抗体片段或变体组成的分子)(见实施例3)。在一个实施方案中，刺激TR7表达细胞凋亡的抗体包含或由表1所示至少一种scFv的VH和/或VL结构域或其片段或变体组成。在一个特异的实施方案中，刺激TR7表达细胞凋亡的抗体包含或由表1所示任一种scFv的VH和VL结构域或其片段或变体组成。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在优选的实施方案中，本发明还提供了在有或无抗体交联剂的情况下均同等良好地刺激TR7表达细胞凋亡的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，所述交联剂如抗IgFc反应细胞(见例如实施例3)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体在有或无抗IgFc抗体交联剂的情况下均等同良好地刺激HeLa细胞凋亡。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体在存在2μg/ml环己酰亚胺、有或无抗IgFc抗体交联剂的情况下均等同良好地刺激HeLa细胞凋亡。在另一个实施方案中，本发明的抗体在有或无抗IgFc抗体交联剂的情况下均等同良好地刺激SW480细胞凋亡。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体在存在2μg/ml环己酰亚胺、有或无抗IgFc抗体交联剂的情况下均等同良好地刺激SW480细胞凋亡。
在其它优选的实施方案中，本发明还提供了刺激TR7表达细胞凋亡的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，其与等浓度的(例如ng/ml)TRAIL多肽(包括TRAIL多肽片段，变体或融合蛋白)刺激TR7表达细胞凋亡的程度至少相同(见例如实施例3)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体刺激TR7表达细胞凋亡的程度好于等浓度的(例如ng/ml)TRAIL多肽(包括TRAIL多肽片段，变体或融合蛋白)刺激的TR7表达细胞的凋亡。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体刺激HeLa细胞凋亡的程度好于等浓度的(例如ng/ml)TRAIL多肽(包括TRAIL多肽片段，变体或融合蛋白)刺激的TR7表达细胞的凋亡。在另一个特异的实施方案中，在存在2μg/ml环己酰亚胺下，本发明的抗体刺激HeLa细胞凋亡的程度好于等浓度的(例如ng/ml)TRAIL多肽(包括TRAIL多肽片段，变体或融合蛋白)刺激的TR7表达细胞的凋亡。
在其它优选的实施方案中，本发明还提供了抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，当其与一种化疗药物组合施用时，其刺激的TR7表达细胞的凋亡比单独施用化疗药物或由所述抗体单独刺激受体表达细胞的凋亡要多。在特异的实施方案中，当本发明的抗体与Topotecan组合施用时，与Topotecan或抗体单独刺激受体表达细胞凋亡相比，其刺激更多的TR7表达细胞凋亡。在特异的实施方案中，当本发明的抗体与环己酰亚胺组合施用时，与环己酰亚胺或所述抗体单独刺激受体表达细胞的凋亡相比，其刺激更多的TR7表达细胞凋亡。
本发明还提供了阻断或抑制TRAIL与TR7多肽结合的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)(见实施例2)。在一个实施方案中，阻断或抑制TRAIL与TR7多肽结合的抗体包含或由表1所示至少一种scFv的VH和/或VL结构域或其片段或变体组成。在一个特异的实施方案中，阻断或抑制TRAIL与TR7结合的抗体包含或由表1所示任一种scFv的VH和VL结构域或其片段或变体组成。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还提供了融合蛋白，其包含或由免疫特异性结合TR7的一种抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)和一个异源多肽。优选地，与抗体融合的所述异源多肽对发挥功能或对定向TR7表达细胞是有用的。在特异的实施方案中，本发明涵盖了双特异性抗体，其中一个抗体结合位点特异于TR7而第二个抗体结合位点特异于一种异源多肽如TR4或肿瘤特异性抗原。在另一个优选的实施方案中，与抗体融合的异源多肽定位抗体于肿瘤细胞是有用的。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由一种多肽和一个异源多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的任一或多个VH结构域的氨基酸序列或者本发明抗体的任一或多个VL结构域的氨基酸序列或其片段或变体组成。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由一种多肽和一个异源多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的任一个，两个，三个或多个VH CDR的氨基酸序列，或本发明抗体的任一个，两个，三个或多个VL CDR的氨基酸序列或其片段或变体。在一个优选的实施方案中，所述融合蛋白包含或由一种多肽和一个异源多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的VH CDR3的氨基酸序列或其片段或变体，这种融合蛋白免疫特异性结合TR7。在另一个实施方案中，融合蛋白包含或由一种多肽和一个异源多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的至少一个VH结构域的氨基酸序列和本发明抗体的至少一个VL结构域的氨基酸序列或其片段或变体组成。优选地，融合蛋白的VH和VL结构域相当于本发明的一个单一抗体(或scFv或Fab片段)。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由一种多肽和一个异源多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的任一个，两个，三个或多个VH CDR的氨基酸序列及本发明抗体的任一个，两个，三个或多个VL CDR的氨基酸序列或其片段或变体。优选地，两个，三个，四个，五个，六个或多个VH CDR(s)或VLCDR(s)相应于本发明的一个单一抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明的抗体(包括抗体片段或其变体)可以通过多种方式定性。特别地，可以分析本发明的抗体和相关分子免疫特异性结合TR7或其片段或变体的能力，使用在此所述技术或本领域已知方法的常规修改的技术而进行。分析本发明抗体免疫特异性结合TR7或其片段或变体的能力，可以在溶液中(例如Houghten，Bio/Techniques 13：412-421(1992))，在珠上(例如Lam，Nature 354：82-84(1991))，在芯片上(例如Fodor，Nature 364：555-556(1993))，在细菌上(例如美国专利No.5223409)，在孢子上(例如专利号No.5571698，5403484和5223409)，在质粒上(例如Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：1865-1869(1992))或在噬菌体上(例如Scott和Smith，Science249：386-390(1990)；Devlin，Science 249：404-406(1990)；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：7178-7182(1990)；及Felici，J.Mol.Biol.222：301-310(1991))进行，在此所有文献并入参考。然后可以分析已经鉴别为免疫特异性结合TR7或其片段或变体的抗体对TR7或其片段或变体的特异性和亲和性，使用本发明所述或本领域已知的技术或加以常规修饰的技术进行。
可以通过本领域已知的任何方法分析本发明的抗体与TR7多肽的免疫特异性结合及与其它抗原的交叉反应性。可以用于分析免疫特异性结合及交叉反应性的免疫分析包括但非限于竞争性及非竞争性分析系统，使用如下技术：BIAcore分析(见例如实施例1)，FACS(荧光激活的细胞分选仪)分析(见例如实施例3)，免疫荧光，免疫细胞化学，放射免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”(sandwich)免疫分析，免疫沉淀分析，western印迹，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散分析，凝集分析，补体固定分析，免疫放射分析，荧光免疫分析及蛋白质A免疫分析等。这种分析是本领域常规使用并熟知的(见例如Ausubel等编辑1994，CurrentProtocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，纽约，在此以其全文并入参考)。以下简要阐述了举例的免疫分析(非限制性)。
ELISA包括制备抗原，用所述抗原包被一个96孔酶标板，洗去未结合孔的抗原，在所述孔中加入缀合于一种可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的感兴趣的抗体，并温育一段时间，洗去未结合的抗体或非特异性结合的抗体，并检测特异性结合包被孔的抗原的抗体的存在情况。在ELISAs中，感兴趣的抗体不用缀合于可检测化合物；取而代之，将缀合于可检测化合物的第二抗体(其识别感兴趣的抗体)加入所述孔中。或者，不用所述抗原直接包被孔，而是用抗Ig Fc抗体包被ELISA平板，这种形式的抗原或TRAIL受体-Fc融合蛋白可以结合包被平板的该抗Ig-Fc。这是需要的，因为可以维持所述抗原蛋白(例如TR7多肽)比其直接包被于平板时呈更天然的构象。另外，与抗原包被孔相反，所述抗体可以包被孔。在这种情况中，可检测分子可以是缀合可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗原。本领域技术人员已知对参数可以加以修改，以提高检测信号以及本领域已知的其它ELISA变化。关于ELISA的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，纽约，在11.2.1章节。
抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的scFv或其它分子)与抗原的结合亲和性，和抗体-抗原相互作用的解离速率，可以通过竞争性结合分析测定。竞争性结合分析的一个实施例是放射免疫分析，包括将感兴趣抗体在未标记抗原数量增加的情况下，与标记的抗原(例如用3H或125I标记的抗原)或其片段或变体孵育，并检测与标记的抗原结合的抗体。本发明抗体对TR7的亲和性及结合解离速率可以从Scatchard作图分析的数据确定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫分析测定。在这种情况中，TR7多肽在未标记的第二抗TR7抗体量增加的情况下，与缀合于标记的化合物(例如3H或125I标记的化合物)的本发明抗体孵育。两种抗体之间的这种竞争性分析也可以用于确定这两种抗体是否结合相同或不同的表位。
在一个优选的实施方案中，使用BIAcore动力学分析确定抗体(包括抗体片段或其变体)与TRAIL受体或其片段的结合速率及解离速率。BIAcore动力学分析包括分析来自芯片的抗体与其表面上固定的TRAIL受体的结合和解离，详见于实施例1所述。
免疫沉淀方法通常包括在裂解缓冲液中裂解一群细胞，所述裂解缓冲液如是补加了蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA，PMSF，抑酶肽，钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％ NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％ SDS，0.15 M NaCl，0.01 M磷酸钠pH 7.2，1％抑肽酶(Trasylol))，将感兴趣的抗体加入细胞裂解物中，在40℃孵育一段时间(例如1-4小时)，在所述细胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，在40℃孵育大约1或更长，在裂解缓冲液中洗涤珠，并将珠重悬于SDS/样品缓冲液中。感兴趣的抗体免疫沉淀一种特定抗原的能力可以通过例如Western印迹分析测定。本领域技术人员已知可以对参数加以修改，以提高抗体与抗原的结合并降低背景(例如用琼脂糖珠预先清洁细胞裂解物)。关于免疫沉淀方法的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，John Wiley & Sons公司，纽约，在10.16.1章节。
Western印迹分析一般包括制备蛋白质样品，将所述蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳(例如，根据所述抗原的分子量采用8％-20％ SDS-PAGE)，将来自聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质样品移至一个膜上，如硝酸纤维素膜，PVDF或尼龙膜上，在封闭溶液(例如具有3％BSA或脱脂奶的PBS)中将此膜封闭，在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween20)洗涤此膜，在封闭溶液中用稀释的初级抗体(感兴趣的抗体)封闭此膜，在洗涤缓冲液中洗涤此膜，在封闭溶液中用稀释的第二抗体(其识别初级抗体，例如抗人抗体)封闭此膜，所述第二抗体缀合于酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或125I)，将此膜在洗涤缓冲液中洗涤，并检测抗原的存在情况。本领域技术人员已知可以对参数加以修改，以提高信号检测并降低背景干扰。关于Western印迹的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994.Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley &Sons公司，纽约，在10.8.1章。
抗体缀合物
本发明涵盖了抗体(包括抗体片段或其变体)，其重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)于一种异源多肽(或其一部分，优选所述多肽的至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70，至少80，至少90，或至少100个氨基酸)，以产生融合蛋白。所述融合非必需是直接产生的，可以通过接头序列产生。例如，本发明的抗体可以用于将异源多肽在体外或体内定向于特定的细胞类型(例如癌细胞)，这通过将所述异源多肽与本发明抗体融合或缀合进行，所述的本发明抗体特异于特定细胞表面抗原，或与结合特定细胞表面受体的抗原结合。本发明的抗体还可以融合于白蛋白(包括但非限于重组人血清白蛋白(见例如1999年3月2日授权的美国专利No.5876969，EP专利0413622及1998年6月16日授权的美国专利No.5766883所述，在此全文并入参考))，产生嵌合多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)与成熟形式的人血清白蛋白(即EP专利0322094的图1和图2所示人血清白蛋白的1-585位氨基酸，在此全文并入参考)融合。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)与如下多肽片段融合，所述多肽片段包含或由美国专利5766883所述的人血清白蛋白的第1-z位氨基酸残基组成，其中z是369-419之间的一个整数，该专利全文并入参考。本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)可以融合于异源蛋白质(例如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N或C末端。编码本发明融合蛋白的多核苷酸也涵盖在本发明内。这种融合蛋白可例如易于纯化并提高体内半衰期。融合或缀合于异源多肽的抗体还可以用于使用本领域已知的方法的体外免疫分析和纯化方法中。见例如Harbor等，如前，和PCT公开WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，Immunol.Lett.39：91-99(1994)；美国专利No.5,474,981；Gillies等，PNAS 89：1428-1432(1992)；Fell等，J.Immunol.146：2446-2452(1991)所述，所述文献以其全文并入参考。
本发明还包括组合物，所述组合物包含或由融合或缀合于抗体片段的异源多肽组成。例如，所述异源多肽可以融合或缀合于Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab)2片段，或其一部分。本领域已知将多肽融合或缀合于抗体部分的方法。见例如美国专利Nos.5,356,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；PCT公开WO 96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Zheng等，J.Immunol.154：5590-5600(1995)；和Vil等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11357-11341(1992)(所述文献以其全文并入参考)。
本发明的另外的融合蛋白可以通过基因改组(gene shuffling)，基序改组，外显子改组和/或密码子改组方法产生(统称为“DNA改组”)。可以采用DNA改组以调节抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)的活性，可以使用这种方法产生活性改变的抗体(例如具有高亲和性和低解离速率的抗体)。见美国专利Nos.5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458及Patten等，Curr.OpinionBiotechnol.8：724-35(1997)；Harayama，Trends Biotechnol.16(2)：76-82(1998)；Hansson等，J.Mol.Biol.287：265-76(1999)；及Lorenzo和Blasco，Biotechniques 24(2)：308-13(1998)(每个专利和出版物在此均以全文并入参考)。在一个实施方案中，在重组前可以通过错误倾向的PCR，随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变以改变编码本发明抗体的多核苷酸。在另一个实施方案中，编码部分免疫特异性结合TR7的抗体的多核苷酸的一或多个部分可以与一或多个异源分子的一或多个成分，基序，节段，部分，结构域，片段等重组。
另外，本发明的抗体(包括抗体片段或其变体)可以融合于标记序列，如一种促进纯化的多肽。在优选的实施方案中，所述标记氨基酸序列是一个6组氨酸多肽，如pQE载体中提供的标签(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，许多标记是可以商购的。例如如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)所述，提供6组氨酸以方便纯化融合蛋白。用于纯化的其它肽标签包括但非限于血凝素“HA”标签，其相应于衍生自流感血凝素蛋白的一个表位(Wilson等，Cell37：767(1984))，和FLAG_标记(Stratagene，LaJolla，CA)。
本发明还涵盖了缀合于一种诊断或治疗剂的抗体(包括抗体片段或其变体)。所述抗体可以诊断性用于例如监测或预后肿瘤的发生和进展，以作为临床测试程序的一部分，以例如确定给予的治疗方案的效力。可以通过将所述抗体偶联于一种可检测物质而易于检测。可检测物质的实施例包括但非限于多种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性物质，使用多种正电子发射X线断层术的正电子发射金属，和非放射性顺磁性金属离子。可以使用本领域已知方法，将所述可检测物质直接偶联于或缀合于所述抗体，或间接通过中间物(例如本领域已知的接头)偶联或缀合于所述抗体。见例如美国专利No.4,741,900阐述了本发明的可以用作诊断剂的可以缀合于抗体的金属离子。适当的酶的实施例包括但非限于辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物实施例包括但非限于链亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光材料实施例包括但非限于伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料实施例包括但非限于鲁米诺；生物发光材料实施例包括但非限于萤光素酶，萤光素，和水母发光蛋白；合适的放射性物质的实施例包括但非限于碘(121I，123I，125I，131I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(111mIn，112mIn，113In，115In)，和锝(99Tc，99mTc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(135Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh和97Ru。
另外，本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的scFv和其它分子)可以偶联或缀合于一种治疗部分如胞毒素，例如抑制细胞生长的或杀细胞的制剂，一种治疗剂或一种放射性金属离子，例如α发射体，例如213Bi，或其它放射性同位素例如103Pd，135Xe，131I，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，35S，90Y，153Sm，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn，90Y，117Tin，186Re，188Re和166Ho。在特异的实施方案中，本发明的抗体或其片段附着于大环类螯合剂，用于将放射性金属离子包括但非限于177Lu，90Y，166Ho和153Sm缀合于多肽。在特异的实施方案中，大环类螯合剂是1，4，7，10-四氮环化十二烷-N，N’，N’′，N’″-四乙酸(DOTA)。在其它特异的实施方案中，DOTA通过一个接头分子附着于本发明抗体或其片段。用于将DOTA缀合于多肽的接头分子的实施例是本领域已知的，见例如DeNardo等，Clin Cancer Res.4(10)：2483-90，1998；Peterson等，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，1999，所述文献以其全文并入参考。
螯合分子是本领域已知的。螯合分子可以附着于本发明的抗体以便于用金属离子包括荧光标记或放射性核素标记所述抗体。例如见Subramanian，R.和Meares，C.F.，“Bifunctional Chelating Agents forRadiometal-labeled monoclonal Antibodies”，Cancer Imaging withRadiolabeled Antibodies(D.M.Goldenberg编辑)，Kluwer AcademicPublications，Boston；Saji，H.，“Targeted delivery of radiolabeled imagingand therapeutic agents：bifunctional radiopharmaceuticals”，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.16：209-244(1999)；Srivastava S.C.和Mease R.C.，“Progress in research on ligands，nuclides and techniques forlabeling monoclonal antibodies”，Int.J.Rad.Appl.Instrum.B 18：589-603(1991)；及Liu，S.和Edwards，D.S.，“Bifunctional chelators fortherapeutic lanthanide radiopharmaceuticals”，Bioconjug.Chem.12：7-34(2001)。根据本发明可以使用与抗体共价结合的任何螯合剂。所述螯合剂还进一步包含将螯合部分与所述抗体连接的一个接头部分。
在一个实施方案中，本发明的抗体附着于无环螯合剂如二亚乙基三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酸(DPTA)，DPTA的类似物及DPTA的衍生物。非限制性实施例是螯合剂可以是2-(p-异硫氰基苄基)-6-甲基二亚乙基三胺五乙酸(1B4M-DPTA，也称为MX-DTPA)，2-甲基-6-(rho-硝基苄基)-1，4，7-三氮杂庚烷-N，N，N’，N”，N”-5乙酸(硝基-1B4M-DTPA或硝基-MX-DTPA)；2-(p-异硫氰基苄基)-环己基二亚乙基三胺五乙酸(CHX-DTPA)或N-[2-氨基-3-(rho-硝基苯基)丙基]-反式-环己烷-1，2-二胺-N，N’，N”-五乙酸(硝基-CHX-A-DTPA)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体附着于一个无环三联吡啶(terpyridine)螯合剂如6，6”-双[[N，N，N”，N”-四(羧甲基)氨基]甲基-4’-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-2，2’：6’，2”-三联吡啶(TMT-胺)。
在特异的实施方案中，与本发明抗体附着的大环类螯合剂是1，4，7，10-四氮环化十二烷-N，N’，N’′，N’″-四乙酸(DOTA)。在其它特异的实施方案中，DOTA通过一个接头分子附于本发明抗体。用于将DOTA缀合于多肽的接头分子的实施例是本领域已知的，见例如DeNardo等，Clin.Cancer Res.4(10)：2483-90，1998；Peterson等，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，1999，所述文献以其全文并入参考。另外，美国专利5652361和5756065揭示了可与抗体缀合的螯合剂及生产和使用它们的方法，在此以其全文并入参考。尽管美国专利5652361和5756065针对螯合剂与抗体的缀合，但本领域技术人员能易于改变所述方法以将螯合剂与其它多肽缀合。
可以应用基于大环类配体的双功能的螯合剂，其中缀合通过一个激活臂或功能基团与所述配体的碳骨架附着，如M.Moi.等，J.Amer.Chem.Soc.49：2639(1989)(2-p-硝基苄基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N_-四乙酸)；S.V.Deshpande等，J.Nucl.Med.31：473(1990)；G.Ruser等，Bioconj.Chem.1：345(1990)；C.J.Broan等，J.C.S.Chem.Comm.23：1739(1990)；及C.J.Anderson等，J.Nucl.Med.36：850(1995)所述。
在一个实施方案中，一种大环类螯合剂，如任选含有一或多个羧基，氨基，氧肟酸(Hydroxamate)，磷酸酯或磷酸盐基团的多氮(polyaza)大环类螯合剂与本发明的抗体附着。在另一个实施方案中，所述螯合剂是选自由DOTA，DOTA类似物及DOTA衍生物组成的一组的螯合剂。
在一个实施方案中，可以与本发明抗体附着的合适的螯合剂分子包括DOXA(1-oxa-4，7，10-三氮杂环十二烷三乙酸)，NOTA(1，4，7-三氮杂环壬烷三乙酸)，TETA(1，4，8，11-四氮杂环十四烷四乙酸)和THT(4’-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6”-双(N’，N’-二羧甲基-N-甲肼)-2，2’：6’，2”-三联吡啶)，及其类似物和衍生物。见例如Ohmono等，J.Med.Chem.35：157-162(1992)；Kung等，J.Nucl.Med.25：326-332(1984)；Jurisson等，Chem.Rev.93：1137-1156(1993)，及美国专利No.5367080。其它合适的螯合剂包括美国专利No.4647447，4687659，4885363，EP-A-71564，WO89/00557，及EP-A-232751所揭示的螯合剂。
在另一个实施方案中，可用于本发明中的合适的大环类羧酸螯合剂包括1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N_-四乙酸(DOTA)；1，4，8，12-四氮杂环十五烷-N，N’，N”，N_-四乙酸(15N4)；1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N’，N”-三乙酸(9N3)；1，5，9-三氮杂环十二烷-N，N’，N”-三乙酸(12N3)及6-溴乙酰氨基-苄基-1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N’，N”，N_-四乙酸(BAT)。
可与本发明抗体附着的优选的螯合剂是α-(5-异硫氰基-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸，其也称为MeO-DOTA-NCS。也可以使用α-(5-异硫氰基-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸的盐或酯。
螯合剂如所描述的那些螯合剂共价附着于本发明抗体的可以用适于治疗，诊断或治疗与诊断目的的放射性核素标记(通过螯合剂的配位点(coordination site))。合适的金属实施例包括Ag，At，Au，Bi，Cu，Ga，Ho，In，Lu，Pb，Pd，Pm，Pr，Rb，Re，Rh，Sc，Sr，Tc，Tl，Y和Yb。用于诊断目的的放射性核素实施例是Fe，Gd，111In，67Ga或68Ga。在另一个实施方案中，用于诊断目的的放射性核素是111In或67Ga。用于治疗目的的放射性核素实施例是166Ho，165Dy，90Y，115mIn，52Fe或72Ga。在一个实施方案中，用于诊断目的的放射性核素是166Ho或90Y。用于治疗和诊断目的的放射性核素实施例包括153Sm，177Lu，159Gd，175Yb，或47Sc。在一个实施方案中，放射性核素是153Sm，177Lu，175Yb或159Gd。
优选的金属放射性核素包括选自90Y，99mTc，111In，47Sc，67Ga，51Cr，177mSn，67Cu，167Tm，97Ru，188Re，177Lu，199Au，47Sc，67Ga，51Cr，177mSn，67Cu，167Tm，95Ru，188Re，177Lu，199Au，203Pb和141Ce的放射性核素。
在一个特殊的实施方案中，螯合剂共价附着的本发明抗体可以用选自90Y，111In，177Lu，166Ho，215Bi和225Ac的金属离子标记。
另外，发射γ射线的放射性核素如99mTc，111In，67Ga和169Yb可用于诊断显影，而发射β射线的放射性核素如67Cu，111Ag，186Re和90Y用于肿瘤治疗。其它有用的放射性核素还包括发射γ射线的放射性核素如99mTc，111In，67Ga，和169Yb，及发射β射线的放射性核素如67Cu，111Ag，186Re，188Re和90Y，以及感兴趣的其它放射性核素如211At，212Bi，177Lu，86Rb，105Rh，153Sm，198Au，149Pm，85Sr，142Pr，214Pb，109Pd，166Ho，208Tl和44Sc。螯合剂共价附着的本发明抗体可以用上述放射性核素标记。
在另一个实施方案中，螯合剂共价附着的本发明抗体可以用顺磁性的金属离子标记，所述顺磁性的金属离子包括过渡态和镧系金属，如具有原子数21-29，42，43，44，或57-71的金属，特别是离子Cr，V，Mn，Fe，Co，Ni，Cu，La，Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb和Lu。用于核磁共振显影的组合物中的顺磁性金属包括具有原子数22到29，42，44和58-70的元素。
在另一个实施方案中，螯合剂共价附着的本发明抗体可以用荧光金属离子标记，所述荧光金属离子包括镧系金属，特别是La，Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu(例如152Eu)，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，和Lu。
在另一个实施方案中，螯合剂共价附着的本发明抗体可以用包括Mo，Bi，Si和W原子的含有重金属的报道分子标记。
放射性标记的本发明抗体不仅可以用于杀死其结合的细胞，还可以用于杀死相邻细胞。例如，TR7的表达不是在肿瘤的所有细胞上遍在。然而，因为某些放射性衰变的能量可以超过细胞直径，因此放射标记的本发明抗体可用于杀死不表达TR7的细胞，例如癌细胞，但细胞附近的表达TR7的细胞也被杀死了。
细胞毒素或胞毒剂包括对细胞有害的任何制剂。实施例包括但非限于paclitaxol，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙啶，吐根碱，丝裂霉素，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，鬼臼噻吩甙，长春新碱，长春碱，秋水仙素，阿霉素，道诺霉素，二羟基炭疽菌素dione，米托蒽醌，光神霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，心得安，胸苷激酶，核酸内切酶，RNAse，和嘌呤霉素及其片段，变体或类似物。治疗剂包括但非限于抗代谢物(例如氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化剂(例如二氯甲基二乙酸(mechlorethamine)，thioepa苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，亚硝基脲氮芥(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)，环磷酰胺(cyclothosphamide)，二甲磺酸丁酯，二溴甘露醇，链脲菌素，丝裂霉素C，和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂，蒽环霉素(蒽环类)(例如道诺霉素(从前的道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如放线菌素(从前的放线菌素)，博来霉素，光神霉素和氨茴霉素(AMC))，及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
可使用本领域已知的技术标记本发明的抗体。这种技术包括但非限于使用双功能缀合剂(见例如美国专利Nos.5,756,065；5,714,711；5,696,239；5,652,371；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560和5,808,003所述；所述文献均以全文并入参考)及直接偶联反应(例如Bolton-Hunter和氯胺-T反应)。
缀合的本发明的抗体可以用于修饰给定的生物应答，治疗剂或药物部分不必受传统化学治疗剂的限制。例如，所述药物部分可以是具有所需生物学活性的一种蛋白质或多肽。这种蛋白质可以包括但非限于例如毒素，例如相思豆毒素，蓖麻毒素A，α毒素，假单胞菌外毒素，或白喉毒素，皂草素，木鳖子皂苷，白树素(gelonin)，美洲商陆抗病毒蛋白，α-八叠球菌和霍乱毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经生长因子，血小板衍生生长因子，组织纤溶酶原激活物，凋亡介质例如TNF-α，TNF-β，AIMI(见，国际公开No.WO 97/35899)，AIM II(见国际公开No.WO 97/34911)，Fas配体(Takahashi等，Int.Immunol.6：1567-1574(1994))，VEGI(见国际公开No.WO 99/23105)，血栓形成剂或抗血管发生剂，例如制管张素或血管抑制素(endostatin)；或者生物应答修饰因子例如淋巴因子，白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-6(IL-6)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，或其它生长因子。
本发明的抗体(包括抗体片段或其变体)还可以附于固体支持物，其对于免疫分析或靶抗原纯化特别有用。这种固体支持物包括但非限于玻璃，纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。
将治疗部分缀合于抗体的技术是熟知的，见例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“AntibodiesFor Drug Delivery”，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等(编辑)，pp.623-53(Marcel Dekker公司，1987)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，Monoclonal Antibodies‘84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(eds.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，pp.303-16(学术出版社1985)，和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
或者，本发明的抗体可以缀合于第二抗体形成抗体异源缀合物，如Segal在美国专利No.4,676,980中所述，以其全文并入参考。
单独或与胞毒因子和/或细胞因子组合施用的有或无治疗部分缀合于其的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的其它分子)可以用作一种治疗剂。
本发明抗体的应用
本发明的抗体可以用于例如但非限于包括在体外和体内诊断和治疗方法中纯化，检测及定向本发明的多肽。例如，抗体可用于免疫分析中以定性和定量测定生物学样品中TR7多肽水平。见例如Harlow等，Antibodies：Alaboratory Manual(冷泉港实验室出版社，第2版，1988)(在此全文并入参考)。
免疫分型
本发明的抗体可以用于对细胞系和生物学样品进行免疫分型(见例如实施例3)。本发明基因的翻译产物可用作细胞特异性标记，或更特别地用作细胞标记，其在特殊类型细胞尤其肿瘤和癌细胞的分化和/或成熟的不同阶段差异表达。抗一个特异表位或表位组合的单克隆抗体可以筛选表达该标记的细胞群。可以利用多种技术使用单克隆抗体筛选表达该标记的细胞群，包括使用抗体包被磁珠磁性分离，用附于固体基质(即平板)的抗体“淘选(panning)”，及流式细胞计量术(见例如美国专利5985660；及Morrison等，Cell 96：737-49(1999))。
这些技术可筛选特殊的细胞群，如可以发现血液恶性肿瘤细胞(即急性白血病患者中的最小存活疾病(MRD))，及移植中的“非自身”细胞以预防移植物抗宿主疾病(GVHD)。或者，这些技术可以筛选能增殖和/或分化的造血干细胞和祖细胞，可在人脐带血中发现。
表位作图
本发明提供了可用于鉴别TR7多肽表位的抗体(包括抗体片段或其变体)。特别地，本发明的抗体可用于鉴别以下多肽的表位：人TR7多肽(例如，SEQ ID NO：3)或在人体细胞上表达的TR7多肽；小鼠TR7或在小鼠细胞上表达的TR7多肽；大鼠TR7多肽受体或在大鼠细胞上表达的TR7多肽；或者猴TR7多肽或在猴细胞上表达的TR7多肽，使用本发明所述和本领域已知的其它技术进行。作为表位的片段可以通过任何常规方式产生(见例如Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135(1985)，另外见于美国专利No.4,711,211)。鉴别的本发明抗体的表位可例如用作疫苗候选物，即免疫一个个体以激发抗天然发生形式的TR7多肽的抗体。
抗体的诊断性应用
特异性结合TR7多肽的本发明标记的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)可以用于诊断目的以检测，诊断，预后或监测疾病和/或紊乱。在特异的实施方案中，特异性结合TR7多肽的本发明标记的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)可以用于诊断目的以检测，诊断，预后或监测与TR7异常表达和/或活性相关的疾病和/或紊乱。
TR7在原代细胞及组织样品上表达，其包括T细胞(静止和激活的T细胞，例如用重组IL-2激活的T细胞)，静止和激活的单核细胞，例如用GM-CSF激活的单核细胞，平滑肌细胞，软骨细胞，成纤维细胞，内皮细胞，上皮细胞和骨骼肌细胞。TR7也在一些细胞系上表达，所述细胞系包括但非限于人纤维肉瘤细胞系HT-1080，人宫颈癌细胞系ME-180和HeLa，人恶性黑素瘤细胞系RPMI-7951，SK-MEL-1和G361，成人T细胞白血病细胞系Jurkat，人子宫癌细胞系SK-UT-1和RL-95，人肺癌细胞系SK-MES-1，人结肠癌细胞系，LS174T，HT29，和HCT116，su.86.86和CFPAC胰腺癌细胞系，人卵巢癌细胞系TOV21G，及人肝细胞癌细胞系HepG2和SNU449，及人成神经细胞瘤细胞系SK-N-SH。用本发明的抗体组合物可以诊断或治疗组织癌症以及其它疾病，所述组织相应于这些细胞系衍生自其中的组织。
本发明提供了检测TR7多肽表达的方法，包括：(a)使用免疫特异性结合TR7的一或多种本发明抗体分析来自个体的生物学样品中TR7多肽的表达；(b)将生物学样品中TR7多肽的水平与TR7多肽标准水平(例如正常生物学样品中的表达水平)进行对比。
本发明提供了检测TR7多肽异常表达的方法，包括：(a)使用免疫特异性结合TR7多肽的一或多种本发明抗体分析来自个体的生物学样品中TR7多肽的表达；(b)将生物学样品中TR7多肽的水平与TR7多肽标准水平(例如正常生物学样品中的表达水平)进行对比，从而分析的TR7多肽水平与标准TR7多肽水平相比提高或降低，表明异常表达。
“生物学样品”是指得自个体，体液，机体组织，机体细胞，细胞系，组织培养物，或含有TR7多肽蛋白或mRNA的其它来源的任何液体和/或细胞。体液包括但非限于血清，血浆，尿液，滑液，脑脊液，唾液和粘液。组织样品可以取自机体的任何组织。组织样品还可以得自尸检。本领域熟知从哺乳动物中获得活检组织和体液的方法。在所述生物样品包括mRNA时，活检组织是优选的来源。
特异性结合TR7多肽的本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)可以用于诊断目的以检测，诊断，预后或监测癌症或其它过度增殖性紊乱，和/或与其相关的疾病或状态。本发明提供了检测TR7多肽异常表达的方法，包括：(a)使用免疫特异性结合TR7多肽的一或多种本发明抗体分析来自个体的生物学样品中TR7多肽的表达；(b)将TR7多肽水平与TR7多肽标准水平(例如正常生物学样品中的)进行对比，从而分析的TR7多肽水平与标准TR7多肽水平相比提高或降低，表示存在癌症和/或过度增殖性紊乱。
TRAIL已经示出在一些情况中选择性杀死肿瘤细胞(见例如，Oncogene 19：3363-71(2000))。这也许是TRAIL受体在正常细胞和癌细胞上的表达不同所致。因此，在特异性实施方案中，分析的TR7多肽水平提高表明存在癌症和/或过度增殖性紊乱。
其它报道提示肿瘤细胞表达TR7水平降低也许是肿瘤细胞逃避免疫系统的机制(见例如，Int.J.Oncol.16：917-25(2000))。因此，在其它特异实施方案中，分析的TR7多肽水平降低表明存在癌症和/或过度增殖性紊乱。
本发明的一方面是检测及诊断与动物优选哺乳动物更优选人体内TR7多肽异常表达相关的疾病或紊乱。在一个实施方案中，诊断包括：a)为对象施用(例如非肠道，皮下或腹膜内施用)有效量的免疫特异性结合TR7多肽的标记的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)；b)施用后等待一段时间，使标记的抗体优先在所述对象的TR7多肽表达部位浓缩(并将未结合的标记的分子从背景水平中清除)；c)确定背景水平；及d)检测所述对象中标记的抗体，这样检测标记的抗体或其片段高于背景水平及高于或低于在没有疾病或紊乱的人体内观测到的水平，表明所述对象患有与TR7多肽异常表达相关的疾病或紊乱。背景水平可以通过多种方法确定，包括将检测的标记的分子数量与针对特定系统预先测定的标准值对比而确定。
本领域知晓所述对象的大小和所用的成像系统决定产生诊断性成像需要的成像部分的数量。在放射性同位素部分的情况下，针对人，注射的放射活性物质数量通常为大约5到20毫居里范围的99Tc。然后所述标记的抗体优先在含有特异蛋白质的细胞特定区域积累。体内肿瘤成像如S.W.Burchiel等，“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments”(Tumor Imaging：TheRadiochemical Detection of Cancer，第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，Masson出版公司(1982)所述。
根据一些变量，包括所用标记的类型和施用模式，施用后间隔一段时间以使标记的分子优先在对象的部位积累并将未结合的标记分子从背景中清除，所述间隔为6-48小时，或6-24小时或6-12小时。在另一个实施方案中，施用后的时间间隔为5-20天或5-10天。
在一个实施方案中，监测疾病或紊乱是通过重复诊断疾病和紊乱的方法进行的，例如，在初次诊断一个月后，在初次诊断六个月后，在初次诊断一年后等重复进行。
标记分子的存在可以通过用本领域已知的体内扫描方法在患者体内检测。这些方法依赖于所用标记的类型。技术人员能确定检测特殊标记的合适方法。可以用于本发明诊断方法中的方法和设备包括但非限于计算机X线断层摄影(CT)，整体扫描如正电子发射X线断层摄影(PET)，磁共振成像(MRI)，及超声波扫描术。
在特异的实施方案中，所述分子是用放射性同位素标记的，并使用辐射响应外科设备在患者体内检测(Thurston等，美国专利No.5,441,050)。在另一个实施方案中，所述分子是用一种荧光化合物标记的，并用荧光响应扫描设备在患者体内检测。在另一个实施方案中，所述分子是用一种正电子发射金属标记的，并用正电子发射X线断层摄影在患者体内检测。在另一个实施方案中，所述分子是用一种顺磁性标记标记的，并用磁共振成像(MRI)在患者体内检测。
抗体的治疗应用
免疫特异性结合TR7多肽的本发明的一或多种抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)可以作为治疗剂局部或系统使用。本发明进一步涉及基于抗体的治疗方法，包括将本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)施用于动物，优选哺乳动物，最优选人，以预防或治疗一或多种所述疾病，紊乱或状态。本发明的治疗化合物包括但非限于本发明的抗体及编码本发明抗体(及抗独特型抗体)的核酸。在一个实施方案中，本发明的抗体可以用于治疗，缓解或预防疾病，紊乱或状态，包括但非限于本文所述的任一种或多种疾病，紊乱或状态。疾病，紊乱或状态的治疗和/或预防包括但非限于减轻与那些疾病相关的征状。本发明的抗体可以在本领域已知的或本发明所述的药剂学可接受的组合物中提供。在某些实施方案中，在以下实施例中详细描述的本发明抗体的性质使所述抗体是比先前所述的TR7结合抗体更好的治疗剂。
抗体在治疗癌症中的应用
在特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善癌症。在其它特别优选的实施方案中，结合TR7多肽的本发明的抗体用于治疗，预防活改善癌症。在特别的实施方案中，本发明的抗体用于抑制癌症及其它相关紊乱的进展或转移。癌症及相关紊乱包括但非限于结肠癌，宫颈癌，白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞性白血病，早幼粒细胞性白血病，髓单核细胞性白血病，单核细胞性白血病及红白血病))及慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)性白血病和慢性淋巴细胞性白血病))，真性红细胞增多，淋巴瘤(例如Hodgkin’s病和非Hodgkin’s病)，多发性骨髓瘤，Waldenstrom’s巨球蛋白血症，重链病变，及固体肿瘤包括但非限于肉瘤和癌如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索癌，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮细胞肉瘤，滑膜肉瘤，间皮瘤，Ewing′s肿瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状上皮细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳突癌，乳突腺癌，囊腺癌，骨髓癌，原发性支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，Wilms′肿瘤，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮细胞癌，神经胶质瘤，星细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室鼓膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑膜瘤(menangioma)，黑素瘤，成神经细胞瘤，和眼癌。
在特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善肾癌。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善肾癌。
在特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善黑素瘤。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善黑素瘤
在特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善肝癌如肝细胞癌。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善肝癌如肝细胞癌。
在特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善中枢神经系统癌如成神经管细胞瘤，成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善中枢神经系统癌如成神经管细胞瘤，成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤。
在特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善多发性骨髓瘤。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善多发性骨髓瘤。
在其它特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善非Hodgkin’s淋巴瘤。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善非Hodgkin’s淋巴瘤。
在特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善前列腺癌和前列腺转移癌。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善前列腺癌和前列腺转移癌。
与本发明一致，已经证实TRAIL受体TR7在肺癌组织，膀胱癌组织和卵巢癌组织上的表达。另外，与本发明一致，已经证实TRAIL受体TR7在原代乳腺，结肠，肺和胃癌组织上表达。
因此，在特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗肺癌，包括但非限于非小细胞肺癌。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗肺癌，包括但非限于非小细胞肺癌。
在另外的特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗膀胱癌。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗膀胱癌。
在另外的特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗卵巢癌。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗卵巢癌。
在另外的特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗乳腺癌及已经转移的乳腺癌。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗乳腺癌及已经转移的乳腺癌。
在另外的特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗结肠癌或结肠直肠癌。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗结肠癌或结肠直肠癌。
在另外的特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗胃癌。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗胃癌。
在其它特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善肾癌，黑素瘤，胰腺癌及肝癌如肝细胞瘤。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善肾癌，黑素瘤，胰腺癌及肝癌如肝细胞瘤。
在另外的特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善白血病。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善白血病。
在另外的特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在另外的特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善骨髓发育不良综合征。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善骨髓发育不良综合征。
在另外的特别优选的实施方案中，结合TR7并刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗，预防或改善骨癌包括但非限于Ewing’s肉瘤和骨肉瘤。在其它优选的实施方案中，结合TR7的本发明抗体用于治疗，预防或改善骨癌包括但非限于Ewing’s肉瘤和骨肉瘤。
在另一个实施方案中，结合TR7并任选地刺激TR7表达细胞凋亡的本发明抗体用于治疗与细胞存活力提高或抑制凋亡相关的疾病和/或紊乱，包括癌症(如滤泡淋巴瘤，p53突变癌，激素依赖性肿瘤，包括但非限于结肠癌，心肌瘤(cardiac tumors)，胰腺癌，黑素瘤，眼癌，成胶质细胞瘤，肺癌，肠癌，睾丸癌，胃癌，成神经细胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，内皮瘤，成骨细胞瘤，破骨细胞瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，Kaposi’s肉瘤和卵巢癌)；自身免疫紊乱(如多发性硬化，Siogren’s综合征，Hashimoto’s甲状腺炎，胆囊硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多肌炎，系统性红斑狼疮及免疫相关的血管球性肾炎，风湿性关节炎)，及病毒感染(如疱疹病毒，痘病毒和腺病毒)，移植物抗宿主病变，急性移植物排斥及慢性移植物排斥。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物用于抑制癌症的生长，进展和/或转移，特别是上述那些。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物在体外或体内均是非肝毒性的。
在优选的实施方案中，用于治疗，预防或改善上述癌症的本发明抗体特异性和/或优先结合TR7。在其它优选的实施方案中，用于治疗，预防或改善上述癌症的本发明抗体特异性和/或优先结合TR7和TR4。
抗体的其它治疗性应用
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制TR7表达细胞生长或杀死其的方法和组合物，包括或由为其中需要抑制TR7表达细胞生长或杀死TR7表达细胞的动物施用有效抑制TR7表达细胞生长或杀死TR7表达细胞的数量的本发明抗体或抗体组合物(例如本发明的抗体片段和变体，抗体混合物，抗体多聚物，融合蛋白，及抗体与其它治疗化合物如化疗剂的组合)组成。
一方面，本发明涉及一种增强通过TNF家族配体(尤其是TRAIL(SEQ ID NO：72))诱导的细胞凋亡的方法，其包括对表达TR7多肽的细胞施用有效量的本发明抗体，优选能诱导或提高TR7介导的信号传导的一种兴奋性的抗TR7抗体。另一方面，本发明涉及一种增强通过TNF家族配体(尤其是TRAIL(SEQ ID NO：72))诱导的细胞凋亡的方法，其包括对表达TR7和/或TR4多肽的细胞施用有效量的本发明抗体，优选能诱导或提高TR7和/或TR4介导的信号传导的特异性结合TR7和TR4的一种兴奋性的抗体。优选地，TR7和/或TR4介导的信号传导通过本发明抗体提高或诱导以治疗呈现凋亡降低或细胞因子和粘附分子表达降低的疾病。
一方面，本发明涉及诱导TR7和/或TR4表达细胞凋亡的方法，包括为表达TR7和/或TR4的细胞施用有效量的本发明抗体，优选兴奋性抗TR7，和/或抗TR7和TR4抗体(即免疫特异性结合TR7和TR4的抗体)，所述抗体能诱导或提高TRAIL受体介导的信号传导，特别是TR7和TR4介导的信号传导。
另一方面，本发明涉及一种抑制TNF家族配体(尤其是TRAIL(SEQ ID NO：72))诱导的凋亡的方法，包括为表达TR7多肽的细胞施用有效量的本发明抗体，优选能降低TR7介导的信号传导的一种拮抗性的抗TR7抗体。另一方面，本发明涉及一种抑制TNF家族配体(尤其是TRAIL(SEQ ID NO：72))诱导的凋亡的方法，包括为表达TR7和/或TR4多肽的细胞施用有效量的本发明抗体，优选能降低TR7和/或TR4介导的信号传导的特异性结合TR7和TR4的一种拮抗性抗体。优选地，降低TR7和/或TR4介导的信号传导以治疗表现为凋亡或NFκB表达增加的疾病。
一方面，本发明涉及抑制TR7和/或TR4表达细胞凋亡的一种方法，包括为表达TR7和/或TR4细胞施用有效量的本发明抗体，优选拮抗性抗TR7，和/或抗TR7和TR4抗体(即免疫特异性结合TR7和TR4的抗体)，所述抗体能降低TRAIL受体介导的信号传导，尤其是TR7和TR4介导的信号传导。
TR7“兴奋剂”是指能增强或加强TRAIL受体介导的凋亡的天然发生的及合成的化合物。TR7“拮抗剂”是指能抑制TRAIL受体介导的凋亡的天然发生的及合成的化合物。本发明的任何候选“兴奋剂”或“拮抗剂”是否能分别增强或抑制细胞凋亡可以使用本领域已知的TNF家族配体/受体细胞应答分析而确定，包括在以下详细描述的那些方法。
本发明的抗体可以用于治疗，改善或预防与TR7或TR7配体异常表达和/或活性相关的疾病，紊乱或状态，包括但非限于在此所述那些疾病，紊乱或状态。治疗和/或预防与异常TR7表达和/活性或异常TR7配体表达和/或活性相关的疾病，紊乱或状态包括但非限于那些疾病，紊乱或状态相关的减轻的症状。本发明的抗体可以以药剂学可接受的组合物形式提供，如本领域已知或如本发明所述。
另外，激活TRAIL受体介导的生物学活性(例如在TRAIL受体表达细胞中诱导凋亡)的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)可以施用于动物以治疗，预防或改善在此所述疾病或紊乱，特别是癌症及其它过度增殖性紊乱。这些抗体可以加强或激活TRAIL受体的所有或一部分生物学活性，例如通过诱导TRAIL受体构象变化而进行。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体施用于动物以治疗，预防或改善疾病或紊乱，所述抗体使TR7活性在无所述抗体施用时提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。在另一个实施方案中，将本发明的抗体组合，抗体片段组合，抗体变体组合，或抗体，抗体片段和/或抗体变体的组合施用于动物以治疗，预防或改善疾病或紊乱，所述组合使TR7活性在无所述抗体或抗体片段和/或抗体变体施用时提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。
另外，激活TR7介导的生物学活性(例如在TR7表达细胞中诱导细胞凋亡)的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达，或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱。这些抗体可以加强或激活TRAIL受体的所有或一部分生物学活性，例如通过诱导TRAIL受体构象变化而进行。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达，或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱，所述抗体使TR7活性在无所述抗体施用时提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。在另一个实施方案中，本发明的抗体组合，抗体片段组合，抗体变体组合，或抗体，抗体片段和/或抗体变体的组合施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达，或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱，所述组合使TR7活性在无所述抗体或抗体片段和/或抗体变体施用时提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。
作为TRAIL受体优选TR7信号转导的兴奋剂或拮抗剂的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱。例如，全部或部分模拟TRAIL与TR7结合作用的本发明抗体，TR7兴奋剂，可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱。再例如，阻断或阻止TR7与其配体之间的相互作用或者抑制，降低或阻止通过TR7的信号转导的本发明抗体可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱。不阻止TR7与其配体结合但抑制或下调TR7信号转导的本发明抗体可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱。本发明抗体增强，抑制，上调或下调TR7信号转导的能力可以通过在此所述技术或本领域已知的其它技术确定。例如，TRAIL诱导的受体激活和信号分子的激活可以通过免疫沉淀随后进行Western印迹分析检测衔接(adapter)蛋白如FADD和TRADD与TR7的关系而确定(例如本发明所述)。
另外，激活TR7介导的生物学活性(例如在TR7表达细胞中诱导凋亡)的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达，或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱。这些抗体可以加强或激活TRAIL受体的所有或一部分生物学活性，例如通过诱导TRAIL受体构象变化而进行。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达，或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱，所述抗体使TR7活性在无所述抗体施用时提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。在另一个实施方案中，本发明的抗体组合，抗体片段组合，抗体变体组合，或抗体，抗体片段和/或抗体变体的组合施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，缺乏TR7功能，TR7配体异常表达，或缺乏TR7配体功能相关的疾病或紊乱，所述组合使TR7活性在无所述抗体或抗体片段和/或抗体变体施用时提高至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％.60％，65％，70％.75％，80％，85％，90％，95％，99％，至少两倍，三倍，四倍，五倍，十倍，二十倍，五十倍或至少一百倍。
在一个特异的实施方案中，全部或部分抑制或下调TR7活性(例如刺激凋亡)的本发明抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)可以施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，过度TR7功能，TR7配体异常表达，或过度TR7配体功能相关的疾病或紊乱，所述抗体使TR7活性在无所述抗体施用时抑制或下调至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％，50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％或至少10％。在另一个实施方案中，本发明的抗体组合，抗体片段组合，抗体变体组合，或抗体，抗体片段和/或抗体变体的组合施用于动物以治疗，预防或改善与TR7异常表达，过度TR7功能，TR7配体异常表达，或过度TR7配体功能相关的疾病或紊乱，所述组合使TR7活性在无所述抗体，抗体片段和/或抗体变体施用时抑制或下调至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，50％，45％，40％，45％，35％，30％，25％，20％或至少10％。
在一个实施方案中，本发明的治疗或药物组合物施用于动物以治疗，预防或改善与细胞凋亡增加相关的疾病或紊乱，包括但非限于AIDS，神经退行性紊乱(如阿耳茨海默病，Parkinson’s病，肌萎缩性脊髓侧索硬化，色素性视网膜炎，小脑退化)，骨髓发育不良综合征(如再生障碍性贫血)，缺血性损伤(如由心梗，休克和再灌注损伤引起的)，毒素导致的肝病(如由乙醇导致的)，脓毒性休克，恶病质和厌食。在另一个实施方案中，将本发明的治疗或药物组合物施用于动物以治疗，预防或改善骨髓病变，例如再生障碍性贫血和骨髓发育不良综合征。
还可以施用本发明的治疗或药物组合物以治疗，预防或改善器官排斥或移植物抗宿主疾病(GVHD)和/或与之相关的状态。宿主免疫细胞通过免疫应答破坏移植的组织而发生器官排斥。相似地，免疫应答还包含在GVHD中，但在这种情况中，外源移植的免疫细胞破坏宿主组织。由免疫细胞效应功能诱导的细胞死亡是凋亡。因此，施用本发明抗体(例如抑制凋亡的那些抗体)在预防器官排斥或GVHD时可以是一种有效疗法。
在另一个实施方案中，将本发明的治疗或药物组合物施用于动物以治疗，预防或改善感染性疾病。感染性疾病包括与酵母，真菌，病毒和细菌感染相关的疾病。与可以根据本发明治疗或预防的病毒感染相关的病毒包括但非限于逆转录病毒(例如I型和II型人T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV)和人免疫缺陷病毒(HIV))，疱疹病毒(例如I型和II型单纯疱疹病毒(HSV)，Epstein-Barr病毒，HHV6-HHV8，和巨细胞病毒)，沙粒病毒(例如拉沙热病毒)，副粘病毒(例如麻疹病毒，人呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒，和肺病毒)，腺病毒，布尼奥罗病毒(bunyavirus)(例如汉坦病毒)，冠状病毒，线状病毒(例如Ebola病毒)，黄病毒(例如丙肝病毒(HCV)，黄热病病毒，和日本脑炎病毒)，嗜肝DNA病毒(例如乙肝病毒(HBV))，正粘病毒(例如流感病毒A，B和C)，乳多空病毒(例如乳头瘤病毒)，小核糖核酸病毒(例如鼻病毒，肠道病毒和甲肝病毒)，痘病毒，呼肠弧病毒(例如轮状病毒)，外衣病毒(例如风疹病毒)，棒状病毒(例如狂犬病毒)。和细菌感染相关的微生物病原包括但非限于化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoea)，脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)，白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，破伤风杆菌(Clostridiumtetani)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(Klebsiellaozaenae)，克雷伯氏菌鼻硬结亚种(Klebsiella rhinoscleromotis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，大肠杆菌(Escherichia coli)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，胚胎弯曲杆菌(弧菌)(Campylobacter(Vibrio)fetus)，空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejuni)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)，痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)，弗氏志贺氏(Shigella flexneri)，索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，梅毒密螺旋体(Treponemapallidum)，极细密螺旋体(Treponema pertenue)，Treponemacarateneum，奋森氏疏螺旋体(Borrelia vincentii)，布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，出血黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohemorrhagiae)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，Toxoplasma gondii，Pneumocystis carinii，土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)，猪布鲁氏菌(Brucella suis)，马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)，枝原体属(Mycoplasma spp.)，普氏立克次氏体(Rickettsia prowazeki)，恙虫热立克次氏体(Rickettsia tsutsugumushi)，衣原体属(Chlamydiaspp.)，和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物用于治疗，预防或改善与凋亡提高相关的疾病，包括但非限于AIDS，神经退行性紊乱(如阿耳茨海默病，帕金森病，肌萎缩性脊髓侧索硬化，色素性视网膜炎，小脑退化)，脑肿瘤或朊病毒相关疾病)；自身免疫紊乱(如多发性硬化，类风湿性关节炎，Sjogren’s综合征，Hashimoto’s甲状腺炎，胆囊硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多肌炎，系统性红斑狼疮及免疫相关的血管球性肾炎和类风湿性关节炎)，骨髓发育不良综合征(如再生障碍性贫血)，移植物抗宿主病，缺血性损伤(如由心梗，休克和再灌注损伤引起的)，肝脏损伤(如肝炎相关的肝脏损伤，缺血/再灌注损伤，胆固醇沉着病(cholestosis)(胆管损伤)和肝癌)；毒素诱导的肝病(如乙醇所致)，脓毒性休克，恶病质和厌食。在优选的实施方案中，抗TR7拮抗性抗体阻止TRAIL结合抗体结合的TRAIL受体，但不转导产生凋亡的生物信号，可用于治疗上述疾病和紊乱。
许多与HIV相关的病理学是由凋亡介导的，包括HIV诱导的肾病及HIV脑炎。因此，在另外的优选实施方案中，本发明的抗体优选拮抗性抗TR7抗体用于治疗AIDS及与AIDS相关的病变。本发明的另一个实施方案涉及本发明抗体在HIV感染的患者中降低TRAIL介导的T细胞死亡中的应用。
在另外的实施方案中，本发明的抗体尤其拮抗性抗TR7抗体与T细胞凋亡的其它抑制剂组合施用。例如，Fas介导的凋亡与HIV个体的T细胞丧失有关(Katsikis等，J.Exp.Med.181：2029-2036，1995)。因此，对Fas配体介导的和TRAIL介导的T细胞死亡均敏感的患者可以既可用阻断TRAIL/TR7相互作用的制剂治疗，也可以用阻断Fas配体/Fas相互作用的制剂治疗。阻断Fas配体与Fas结合的合适制剂包括但非限于可溶的Fas多肽；可溶的Fas多肽的多聚体形式(例如sFas/Fc的二聚体)；结合Fas但不转导引起凋亡的生物信号的抗Fas抗体；阻断Fas配体结合Fas的抗Fas配体抗体；及结合Fas但不转导引起凋亡的生物信号的Fas配体突变蛋白。优选地，根据这种方法应用的抗体是单克隆抗体。阻断Fas配体/Fas相互作用的合适制剂包括阻断抗Fas单克隆抗体的制剂，例如国际申请公开WO95/10540所描述，在此并入参考。
可以与本发明抗体施用的也阻断TRAIL与TR7结合的合适制剂包括但非限于可溶的TR7多肽(例如可溶形式的OPG，TR5(国际申请公开WO98/30693)；可溶形式的TR7(国际公开WO98/32856)；TR4/DR5(国际申请公开WO98/41629)；及TR10(国际申请公开WO98/54202))；多聚体形式的可溶TR7多肽；及结合TR7但不转导引起凋亡的生物信号的TR7抗体，阻断TRAIL与一或多个TRAIL受体结合的抗TRAIL抗体，及结合TRAIL受体但不转导引起凋亡的生物信号的TRAIL的突变蛋白。
在异源移植的排斥中，受体动物的免疫系统未预先引发应答，因为免疫系统大部分只由环境抗原引发。来自相同物种其它成员的组织未以例如病毒和细菌呈递的相同方式呈递。在异源移植排斥情况中，设计免疫抑制方案以防止免疫系统达到效应状态。然而，异种移植排斥的免疫情况比异源移植更类似于疾病复发。在疾病复发的情况中，免疫系统已经激活，由天然小岛(islet)细胞破坏而证实。因此，在疾病复发情况中，免疫系统已经处于效应状态。本发明的抗体(例如本发明的兴奋性抗体)能抑制对异源移植和异种移植的免疫应答，因为激活的和分化为效应细胞的淋巴细胞表达TR7多肽，从而对增强凋亡的化合物敏感。因此，本发明还提供了一种产生具有免疫特权的组织。本发明的拮抗剂进一步可用于治疗炎症性肠道疾病。
本发明的抗体和抗体组合物可用于治疗炎症性疾病，如类风湿性关节炎，骨关节炎，银屑癣，败血病及炎症性肠道疾病。
另外，由于成淋巴细胞表达TR7多肽，因此本发明的抗体和抗体组合物可用于治疗这种形式的癌症。另外，本发明的抗体和抗体组合物可用于治疗多种慢性和急性形式的炎症，如类风湿性关节炎，骨关节炎，银屑癣，败血病和炎症性肠道疾病。
在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物可用于治疗心血管疾病，包括周围动脉疾病如肢体缺血。
心血管疾病包括心血管畸形，如动脉-动脉瘘，动脉-静脉瘘，脑动静脉畸形，先天性心脏病，肺动脉闭锁及Scimitar综合征。先天性心脏病包括主动脉缩窄，cor triatriatum，冠状动脉异常，十字形心，右位心，动脉导管未闭，Ebstein’s异常，Eisenmenger复合征，左心发育不全综合征，左位心，法乐(fallot)四联症，大血管错位，右心室双出口，三尖瓣闭锁，持续躯干动脉导管未闭，及心间隔缺损如主动脉肺动脉间隔缺损，心内膜垫缺损，Lutembacher’s综合征，法乐三联症，心室间隔缺损。
心血管疾病还包括心脏病，如心律不齐，类癌瘤心脏病，高心输出量，低心输出量，心包填塞，心内膜炎(包括细菌性)，心动脉瘤，心搏停止，充血性心衰，充血性心肌病，发作性呼吸困难，心源性水肿，心肌肥大，充血性心肌病，左心室肥大，右心室肥大，心肌梗塞后破裂，心室间隔破裂，心瓣膜病，心肌病，心肌缺血，心包积液(pericardiac effusion)，心包炎(包括缩窄性心包炎和结核性心包炎)，心包积气，心包膜切开术后综合征，肺心病，风湿性心脏病，心室机能不良，充血，妊娠心血管复合征，Scimitar综合征，梅毒心血管疾病，结核性心血管疾病。
心律不齐包括窦性心律不齐，心房纤维性颤动，心房扑动，心动过缓，期前收缩，Adams-Stokes综合征，束支传导阻滞，窦房阻滞，长QT综合征，并行收缩，Lown-Ganong-Levine综合征，Mahaim型预激综合征，Wolff-Parkinson-White综合征，病态窦房结综合征，心动过速，及心室颤动。心动过速包括阵发性心动过速，室上性心动过速，心室自身节律加速，房室结再活动心动过速，异位房性心动过速，异位房室交界处心动过速，窦房结再活动心动过速，窦性心动过速，尖端扭转性室速及室性心动过速。
心瓣膜病包括主动脉瓣关闭不全，主动脉瓣狭窄，心脏杂音，主动脉瓣脱垂，二尖瓣脱垂，三尖瓣脱垂，二尖瓣关闭不全，二尖瓣狭窄，肺动脉闭锁，肺动脉瓣关闭不全，肺动脉瓣狭窄，三尖瓣闭锁，三尖瓣关闭不全及三尖瓣狭窄。
心肌病包括乙醇性心肌病，充血性心肌病，肥大性心肌病，主动脉瓣下狭窄，肺动脉瓣下狭窄，限制性心肌病，Chagas心肌病，心内膜弹力纤维增生症，心内膜心肌纤维化，Kearns综合征，心肌再灌注损伤，及心肌炎。
心肌缺血包括冠心病如心绞痛，冠状动脉瘤，冠状动脉硬化，冠状动脉血栓形成，冠状动脉痉挛，心肌梗塞及心肌顿抑。
心血管疾病还包括血管疾病如动脉瘤(aneurysms)，血管发育异常，血管瘤，血管瘤杆菌，Hippel-Lindau病，Klippel-Trenaunay-Weber综合征，Sturge-Weber综合征，血管神经性水肿，主动脉病变，Takayasu’s主动脉炎，Leriche’s综合征，动脉闭塞疾病，动脉炎，动脉内膜炎(enarteritis)，多动脉炎结节，脑血管疾病，糖尿病血管病变，糖尿病视网膜病，栓塞，血栓症，红斑性肢痛病，痔，肝静脉闭塞疾病，高血压，低血压，缺血，周围血管疾病，静脉炎，肺静脉闭塞疾病，Raynaud’s疾病，CREST综合征，视网膜血管闭塞，Scimitar综合征，上腔静脉综合征，毛细血管扩张，共济失调性毛细血管扩张，遗传性出血性毛细血管扩张，精索静脉曲张，静脉曲张，静脉曲张溃疡，脉管炎及静脉闭锁不全(venous insufficiency)。
动脉瘤包括分割性动脉瘤，疑似动脉瘤，感染性动脉瘤，破裂的动脉瘤，主动脉瘤，脑动脉瘤，冠状动脉瘤，心动脉瘤和髂动脉瘤。
动脉闭塞疾病包括动脉硬化，间歇性跛行，颈动脉狭窄，纤维肌性发育不良，肠系膜血管闭塞，Moyamoya疾病，肾动脉阻塞，视网膜动脉闭塞及闭塞性血栓血管炎。
脑血管疾病包括颈动脉系疾病，脑血管淀粉样血管病，脑动脉瘤，脑缺氧，脑动脉硬化，脑动静脉畸形，脑动脉疾病，脑梗塞及脑血栓形成，颈动脉血栓形成，窦血栓形成，Wallenberg’s综合征，脑出血，硬膜外血肿，硬膜下血肿，subaraxhnoid出血，脑梗塞，脑缺血(包括瞬时脑缺血)，锁骨下窃血症状，脑室周围白质软化，血管性头痛，簇发性头痛，偏头痛，及基底动脉供血不足。
栓塞包括气体栓塞，羊水栓塞，胆固醇栓塞，蓝趾综合征，脂肪栓塞，肺栓塞及血栓性栓塞(thromoboembolism)。血栓形成包括冠脉血栓形成，肝静脉血栓形成，视网膜静脉闭塞，颈动脉血栓形成，窦(sinus)血栓形成，Wallenberg’s综合征及血栓性静脉炎。
缺血包括脑缺血，缺血性大肠炎，腔隙综合征(compartmentsyndromes)，前腔隙综合征，心肌缺血，再灌注损伤及周围肢体缺血。脉管炎包括主动脉炎，动脉炎，Behcet’s综合征，Churg-Strauss综合征，粘膜皮肤淋巴结综合征，闭塞性血栓脉管炎，超敏性脉管炎，Schoenlein-Henoch紫癜，过敏性皮肤脉管炎及Wegener’s肉芽肿病。
在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物用于治疗血栓形成性微血管病。一个这种病是血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)(Kwaan，H.C.，Semin.Hematol.24：71(1987)；Thompson等，Blood80：1890(1992))。TTP相关的死亡率增加已经由美国疾病控制中心(U.S.Centers for Disease Control)报道(Torok等，Am.J.Hematol.50：84(1995))。来自患有TTP患者(包括HIV+和HIV-患者)的血浆诱导人皮肤微血管起源而非大血管起源的人内皮细胞凋亡(Laurence等，Blood 87：3245(1996))。TTP患者的血浆因此认为含有一或多种直接或间接诱导凋亡的因子。如国际专利申请书WO97/01715所述(在此全文并入参考)，TRAIL存在于TTP患者血清中，而且很可能在诱导微血管内皮细胞凋亡中起作用。另一种血栓形成性微血管病是溶血性尿毒症综合征(HUS)(Moake，J.L.，Lancet，343：393(1994))；Melnyk等，(Arch.Intern.Med.155：2077(1995)；Thompson等，如前)。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明抗体和抗体组合物在治疗通常称为“成人HUS”的病变(尽管其也可以侵犯儿童)中的应用。称为儿童/腹泻相关的HUS的紊乱与成人HUS在病因学方面不同。在另一个实施方案中，特征在于小血管血栓的病变可以用本发明的抗体和抗体组合物治疗。这种病变包括但非限于在此所述那些病变。例如，在大约5-10％小儿AIDS患者中可见的心脏问题确信包含小血管血栓。在多发性硬化患者中已经报道心脏中微血管破坏。再例如，本发明抗体和抗体组合物预期可以治疗系统性红斑狼疮(SLE)。在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物，优选本发明的拮抗性抗TR7抗体，可以在体内施用于患有血栓形成性微血管病的患者。因此，本发明提供了治疗血栓形成性微血管病的一种方法，包括应用有效量的本发明抗体或抗体组合物。
本发明抗体和抗体组合物可以与治疗特殊紊乱的其它制剂组合应用。例如，在由Laurence等(Blood 87：3245(1996))报道的体外研究中，通过使用抗Fas阻断抗体，金精三羧酸或耗空冷凝蛋白质的正常血浆可以减少TTP血浆介导的微血管内皮细胞凋亡。因此，患者可以用本发明抗体或抗体组合物组合抑制Fas配体介导的内皮细胞凋亡的制剂进行治疗，所述制剂如上述那些制剂。在一个实施方案中，将本发明的抗体和抗Fas阻断抗体均施用于患有特征在于血栓形成性微血管病的患者，如TTP或HUS。抗Fas抗原的阻断单克隆抗体(CD95)的实施例如国际专利申请公开WO95/10540所述，在此并入参考。
在血管发生的内源性刺激因子和抑制因子之间天然出现的平衡是抑制影响占优势的平衡(Rastinejad等，Cell 56：345-355(1989))。在正常生理条件下出现新血管化的那些极少情况中，如伤口愈合，器官再生，胚胎发育及雌性生殖过程中，血管发生是严密调控的并受时间和空间限制。在病理性血管发生的情况下，如特征为固体肿瘤生长的情况下，这些调节控制失败。未调节的血管发生成为病理性的并持续进展为许多肿瘤性或非肿瘤性疾病。许多严重的疾病显现为异常的新血管化，包括固体肿瘤生长和转移，关节炎，一些类型的眼部病变，及银屑癣。见例如Moses等，Biotech.9：710-714(1991)；Folkman等，N.Engl.J.Med.353：1757-1771(1995)；Auerbach等，J.Microvasc.Res.29：401-411(1985)；Folkman，Advances in CancerResearch，Klein和Weinhouse编辑，学术出版社，纽约，pp175-203(1985)；Patz，Am.J.Opthalmol 94：715-743(1982)；及Folkman等，Science 221：719-725(1983)。在许多病理学状态中，血管发生的过程决定了疾病状态。例如，已经积累了许多有意义的数据提示固体肿瘤的生长依赖于血管发生。Folkman和Klagsbrun，Science 235：442-447(1987)。
本发明提供了通过施用本发明的抗体或抗体组合物治疗与新血管化相关的疾病或病变的方法。可以用本发明多核苷酸和多肽治疗的恶性肿瘤和癌转移包括但非限于那些本发明所述及本领域已知的其它的恶性肿瘤，固体肿瘤及癌症(这种病变综述见Fishman等，Medicine，第2版，J.B.Lippincott公司，Philadelphia(1985))。
另外，可以用本发明抗体或抗体组合物治疗的与新血管化相关的眼部病变包括但非限于：新血管化青光眼，糖尿病视网膜病，成视网膜细胞瘤，晶状体后纤维素增生，眼色素层炎，早熟斑推行性视网膜病，角膜移植新血管化，以及其它眼部炎症疾病，眼部肿瘤及与脉络膜或虹膜新血管化相关的疾病。见例如Waltman等，Am.J.Opthalmol85：704-710(1978)，及Gartner等，Surv.Ophthal 22.291-312(1978)所述。
另外，可以用本发明抗体或抗体组合物治疗的病变包括但非限于血管瘤，关节炎，银屑癣，血管纤维瘤，动脉粥样硬化斑，伤口愈合延迟，肉芽发生(granulation)，血友病性关节，肥大性疤痕，骨不连骨折(nonunion fractures)，Osler-Weber综合征，化脓性肉芽肿，硬皮病，沙眼，及血管粘连。
本发明的抗体和抗体组合物在许多疾病和/或病变的诊断和治疗或预防中有用。这种疾病和病变包括但非限于癌症(例如免疫细胞相关的癌症，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，滤泡淋巴瘤，与p53突变或改变相关的癌症，脑肿瘤，膀胱癌，子宫子宫颈癌，结肠癌，结肠直肠癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，胃癌等)，淋巴增殖性病变(例如淋巴结病)，微生物(例如病毒，细菌等)感染(例如HIV-1感染，HIV-2感染，疱疹病毒感染(包括但非限于HSV-1，HSV-2，CMV，VZV，HHV-6，HHV-7，EBV)，腺病毒感染，痘病毒感染，人乳头瘤病毒感染，肝炎感染(例如HAV，HBV，HCV等)，幽门螺杆菌感染，侵染性葡萄球菌(Staphylococcia)等感染)，寄生虫感染，肾炎，骨疾病(例如骨质疏松)，动脉粥样硬化，疼痛，心血管病变(例如新血管化，血管化减少或循环血量减少(例如缺血性疾病(例如心肌梗塞，中风等)))，AIDS，过敏，炎症，神经退行性疾病(例如阿耳茨海默病，帕金森病，肌萎缩性脊髓侧索硬化，色素性视网膜炎，小脑退化)，移植排斥(急性和慢性)，移植物抗宿主病，由于骨髓发育不良所致疾病(例如再生障碍性贫血等)，风湿病中关节组织破坏，肝病(例如急性和慢性肝炎，肝损伤和肝硬化)，自身免疫疾病(例如多发性硬化，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)，免疫复合物血管球性肾炎，自身免疫性糖尿病，自身免疫性血小板减少性紫癜，Grave’s疾病，Hashimoto’s甲状腺炎等)，心肌病(例如扩张性心肌病)，糖尿病，糖尿病并发症(例如糖尿病肾病，糖尿病神经病变，糖尿病视网膜病)，流感，哮喘，银屑癣，血管球性肾炎，败血病休克及溃疡性大肠炎。
本发明的抗体和抗体组合物在促进血管发生，伤口愈合(例如创伤，烧伤和骨折)中有用。
本发明的抗体和抗体组合物在作为增强对特异抗原免疫应答如抗病毒免疫应答的佐剂中有用。
更一般地，本发明的抗体和抗体组合物在调节(即增强或降低)免疫应答中有用。例如，本发明的抗体和抗体组合物可在预备或从手术，外伤，放疗，化疗和移植中恢复时有用，或者可用于在老年人和免疫应答损伤的个体中加强免疫应答和/或恢复应答。或者，本发明的抗体和抗体组合物用作免疫抑制剂，例如在治疗或预防自身免疫疾病中。在特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物用于治疗或预防慢性炎症，过敏性或自身免疫性病变，如在此所述那些及本领域已知的其它病变。
治疗/预防组合物及施用
本发明提供了通过为对象施用有效量的本发明抗体(或其片段或变体)或药物组合物，优选本发明抗体的治疗，抑制和预防方法。在优选的一方面，抗体或其片段或变体是基本纯化的(即基本上没有限制其作用或产生非所需副作用的物质)。所述对象优选是动物，包括但非限于如牛，猪，马，鸡，猫，狗，优选是哺乳动物，最优选是人。
当所述化合物包含一种核酸或免疫球蛋白时可以应用的配方和施用方法如上述；其它合适的配方和施用途径可以选自以下所述那些。
本领域已知许多输送系统并可以用于施用本发明抗体或其片段或变体，例如在脂质体中形成胶囊，微颗粒，微囊，能表达抗体或抗体片段的重组细胞，受体介导的胞吞(见例如Wu和Wu等，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))，构建作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸等。导入方法包括但非限于皮内，肌内，腹膜内，静脉内，皮下，鼻内，脑内，硬脑膜外及口服途径。所述组合物可以通过任何常规途径施用，例如通过灌输或丸剂注射，通过上皮或皮肤粘膜分界线(mucocutaneous linings)吸收(例如口腔粘膜，直肠和小肠粘膜等)，并可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是系统或局部施用。另外，也许需要将本发明的药物组合物通过任何适当的途径导入中枢神经系统，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可以通过心室内导管辅助进行，例如所述导管附于一个贮器(reservoir)如Ommaya贮器上。也可以应用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，及含有雾状制剂的配方。
在一个特异的实施方案中，需要将本发明的药物组合物局部施用需要治疗的部位；这可以通过例如但非限于以下方式实现：在手术期间局部灌注，局部应用，例如在手术后与伤口敷料一起应用，通过注射，利用导管，利用栓剂，或者利用移植体，所述移植体是有孔，无孔或凝胶物质，包括膜，如sialastic膜或纤维。优选地，当施用一种蛋白质包括本发明抗体时，必须注意施用蛋白质不吸附的材料。
在另一个实施方案中，所述组合物可以在载体(vesicle)中输送，特别是在脂质体中(见Langer，Science 249：1527-1535(1990)；Treat等，Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，纽约，pp353-365(1989)；Lopez-Berestein，如前，pp317-327；见如前)。
在又一个实施方案中，所述组合物可以在控制释放系统中输送。在一个实施方案中，可以使用一个泵(见Langer，如前；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(见Medical Applications of ControlledRelease，Langer和Wise(编辑)，CRC出版社，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；另见Levy等，Science 228：190(1985)；During等，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71：105(1989))。在另一个实施方案中，可以将一种控制释放的系统置于接近治疗靶位即脑的附近，这样只需要全身用量的一部分(见例如Goodson，Medical Applications ofControlled Release，如前，第2卷pp.115-138(1984))。
其它控制释放系统见于Langer所述(Science 249：1527-1533(1990))。
在本发明组合物是一种编码抗体的核酸的一个特异实施方案中，所述核酸可以体内施用以促进其编码的抗体的表达，通过将其构建为一种适当的核酸表达载体的一部分并施用，以便成为胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体(见美国专利No.4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过将其与已知进入核的一种类同源框肽(homeobox-like peptide)连接而施用(见例如Joliot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868(1991))等。或者，可以通过同源重组将核酸导入胞内并掺入宿主细胞DNA内表达。
本发明还提供了药物组合物。这种组合物包含一种治疗有效量的抗体或其片段，及一种药物可接受的载体。在一个特异的实施方案中，术语“药物可接受的”是指联邦或州政府管理机构认可的或美国药典或其它认可的药典里列出的可以使用于动物尤其人体。术语“载体(carrier)”是指通过其施用治疗剂的一种稀释剂，佐剂，赋形剂或运载体。这种药物载体可以是无菌液体如水和油，包括那些源于石油，动物，植物或合成来源的，如花生油，豆油，矿物油，芝麻油等。当所述药物组合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐溶液和葡萄糖溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，凝胶，麦芽，米，面粉，石灰，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙烯，水，乙醇等。如果需要，本发明的组合物还可以包含微量增湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液，悬浮液，乳化液，片剂，药丸，胶囊，粉末，缓释配方等。所述组合物可以配制为栓剂，用传统的结合剂和载体如甘油三酸酯配制。口服配方可以包括标准载体如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。适当的药物载体实施例见E.W.Martin“Remington′s Pharmaceutical Sciences”所述。这种组合物含有治疗有效量的抗体或其片段，优选是纯化形式，及适量的载体以为患者提供正确的施用方式。所述配方应适于施用模式。
在一个优选的实施方案中，所述组合物是根据配制静脉内施用于人体的药物组合物的常规方式配制的。典型地，静脉内施用的组合物是于无菌等渗水相缓冲液中的溶液。如果需要，所述组合物还可以包括一种增溶剂和一种局部麻醉剂如lignocamne，以减轻注射部位的疼痛。通常地，所述成分在单位剂量中是单独或混合在一起，例如在密封容器的冻干粉末或无水浓缩物，所述容器如是指示活性剂数量的安瓿或小袋(sachette)。在所述组合物是通过灌注施用时，其可以灌注瓶分配，所述灌注瓶中含有无菌药物级水或盐水。在所述组合物是通过注射施用时，提供一安瓿的注射用水或盐水，以便所述成分可以在施用之前混合。
本发明的组合物可以配制为中性或盐形式。药物可接受的盐包括与阴离子形成的盐，如盐酸盐，磷酸盐，乙酸盐，草酸盐，酒石酸盐等，及与阳离子形成的盐如来自钠盐，钾盐，铵盐，钙盐，氢氧化铁，异丙胺，三乙胺，2-乙氨乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。
有效治疗，抑制和预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病或紊乱的本发明组合物的数量可以通过标准临床技术确定。另外，可任选地应用体外分析以助于鉴别最佳剂量范围。配方中应用的准确剂量还依赖于施用途径，及疾病或紊乱的严重性，而且应根据医生的判断和每个患者的情况确定。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统产生的剂量应答曲线中推断出。
就抗体而言，施用于患者的剂量典型地为0.1mg/kg体重至100mg/kg体重。优选地，施用于患者的剂量在0.1mg/kg和20mg/kg体重之间，更优选在1mg/kg至10mg/kg(例如，3mg/kg或5mg/kg)体重之间。通常地，人抗体在人体内比其它物种抗体的半衰期长，这归因于对外源多肽的免疫应答。因此，使用较低剂量的人抗体和较少的施用频率通常是可能的。另外，本发明的治疗或药物组合物的施用剂量和频率可以通过增强抗体的吸收和组织渗透力(例如进入脑)而降低，这可以通过对抗体加以修饰例如通过脂化而进行。
本发明的抗体可以在药物可接受的载体中配制。本发明抗体的配方可包含一种缓冲液。缓冲液是本领域熟知的并可常规应用以保持本发明组合物溶液的所需pH值。用于制备本发明药物组合物的合适缓冲液包括例如如下所述那些。
用于制备本发明抗体组合物的合适缓冲液可包括但非限于柠檬酸盐，乙酸盐，磷酸盐，碳酸盐，二磷酸盐，氨基乙酰-甘氨酸-哌嗪-2HCl-NaOH；MES-NaOH-NaCl；TRIS-苹果酸-NaOH；MES-NaOH；ACES-NaOH-NaCl；BES-NaOH-NaCl；MOPS-NaOH-NaCl；TES-NaOH-NaCl；MOPS-KOH；HEPES-NaOH-NaCl；TRIS-HCl；HEPPSO-NaOH；TAPS-NaOH-NaCl；HEPPS(EPPS)-NaOH；柠檬酸-磷酸氢二钠；硼酸-柠檬酸-KH2PO4-二乙基-巴比妥酸-NaOH；柠檬酸-柠檬酸钠；乙酸钠-乙酸；组氨酸；磷酸；邻苯二甲酸氢钾-NaOH；二甲基砷酸钠-HCl；KH2PO4-Na2HPO4；KH2PO4-NaOH；NaH2PO4-Na2HPO4；咪唑-HCl；四硼酸钠-硼酸；2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇-HCl；二乙醇胺-HCl；KCl-硼酸-NaOH；硼酸-NaOH-KCl；甘氨酸-NaOH；及碳酸钠-碳酸氢钠。
在一个实施方案中，所述缓冲液是柠檬酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液。在另一个实施方案中，所述缓冲液包括浓度为大约1到大约50mM的乙酸盐缓冲液及NaCl浓度为大约1到大约500mM。在另一个实施方案中，所述缓冲液包括浓度为大约10mM的乙酸盐缓冲液，及NaCl浓度为大约140mM。合适的乙酸盐缓冲液包括浓度为大约1，20，25，50，75，100，200，250，300，400或500mM的乙酸盐缓冲液。合适的缓冲液和溶液包括NaCl浓度为大约1，50，75，100，125，140，150，175，200，225，250，275，300，350，400，450，或500mM的那些缓冲液。另一种合适的缓冲液是HEPES缓冲液，尤其是浓度为大约10，20，30，40，50，60，70，80，90或100mM的HEPES缓冲液。在另一个实施方案中，所述溶液包括浓度为大约50mM的HEPES缓冲液。
在其它实施方案中，本发明的抗体在pH为5.5-6.5范围的柠檬酸盐缓冲溶液中配制。在另外的实施方案中，本发明的抗体在pH接近或正好为6.0的柠檬酸盐缓冲溶液中配制。在其它实施方案中，本发明的抗体在pH为5.5-6.5并还含有0-2.0％，优选0-0.1％及更优选低于0.05％的表面活性剂如Tween 80或聚山梨醇酯80的柠檬酸盐缓冲溶液中配制。
在一个实施方案中，本发明的抗体在10mM柠檬酸钠，1.9％甘氨酸，0.5％蔗糖，0.02％聚山梨醇酯80，pH6.5中配制。
在其它实施方案中，本发明的抗体在pH为6.5-7.5之间的组氨酸缓冲溶液中配制。在其它实施方案中，本发明的抗体在pH为6.5-7.5并还含有0-2.0％，优选0-0.1％及更优选低于0.05％的表面活性剂如Tween 80或聚山梨醇酯80的组氨酸缓冲溶液中配制。
在其它实施方案中，本发明的抗体在pH7.0-8.0之间的磷酸盐缓冲溶液中配制。在其它实施方案中，本发明的抗体在pH为7.0-8.0并还含有0-2.0％，优选0-0.1％及更优选低于0.05％的表面活性剂如Tween 80或聚山梨醇酯80的磷酸盐缓冲溶液中配制。
通常优选施用与患者相同物种起源或物种反应性(在抗体情况下)的产物。因此，在一个优选的实施方案中，将人抗体，其片段或变体(例如衍生物)或核酸施用于人类患者以进行治疗或预防。
针对免疫分析及治疗与TR7多核苷酸或多肽包括其片段相关的紊乱，优选使用免疫特异性结合TR7的本发明高亲和性和/或强力体内抑制和/或中和抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)，或者编码免疫特异性结合TR7的抗体的多核苷酸编码。这种抗体优选与TR7和/或TR7多肽片段具有亲和性。优选的结合亲和性包括解离常数或KD小于或等于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M或10-5M的那些。更优选地，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体，解离常数或KD小于或等于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M或10-8M。更优选地，本发明的抗体结合TR7多肽或其片段或变体，解离常数或KD小于或等于5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M或10-15M。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体诱导TR7表达细胞凋亡。
如以下更详细阐述，本发明的抗体可单独或与其它组合物组合使用。所述抗体还可以进一步重组融合于一种异源多肽的N或C末端或者化学缀合于(包括共价和非共价缀合)多肽或其它组合物。例如，本发明抗体可以重组融合于或缀合于在检测分析中用作标记的分子及效应分子如异源多肽，药物，放射性核素或毒素。见例如PCT公开WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利No.5314995及EP396387。
本发明的抗体和抗体组合物可以单独或与其它治疗剂组合施用，包括但非限于化疗剂，抗生素，抗病毒剂，抗逆转录病毒剂，甾类和非甾类抗炎剂，常规免疫治疗剂和细胞因子。所述组合可以伴随施用，例如作为混合物，单独但同时施用；或者相继施用。这包括其中组合制剂作为治疗混合物一起施用的说明书，及其中组合制剂单独但同时施用的步骤，例如通过单独的静脉通道进入同一个体。“组合”施用还包括首先单独施用给定的化合物或制剂之一，然后再施用另一种。
在优选的实施方案中，施用于动物优选人以进行治疗的本发明抗体是多聚体抗体。在特异的实施方案中，本发明的抗体是同源二聚体IgG分子。在其它特异的实施方案中，本发明的抗体是同源二聚体IgG1分子。在特异的实施方案中，本发明的抗体是同源三聚体IgG分子。在其它特异的实施方案中，本发明的抗体是同源三聚体IgG1分子。在其它特异的实施方案中，本发明的抗体是IgG分子的更高等级多聚体(例如四聚体，五聚体和六聚体)。在更特异的实施方案中，包含IgG分子更高等级多聚体的IgG分子的抗体是IgG1分子。
或者，用于治疗目的的本发明抗体可以与本领域已知的交联剂组合施用，包括但非限于抗IgG抗体。
与抗TR4抗体，TRAIL，凋亡诱导肽和/或化疗剂的组合治疗
抗TR7抗体可以与其它抗TR7抗体，TRAIL和/或化疗剂组合施用。
在特异的实施方案中，特异性结合TR7的本发明抗体与另一种特异性结合TR4的抗体组合使用或施用。在另一个实施方案中，特异于TR7和TR4的抗体是诱导TR7和/或TR4表达细胞(例如表达TR7和TR4的细胞)凋亡的兴奋性抗体。在一个特异的实施方案中，与单独施用抗TR7抗体或抗TR4抗体治疗相比，抗TR7治疗与抗TR4治疗的组合诱导更多的TR7和TR4表达细胞的凋亡。抗TR7和抗TR4抗体可以同时，相继施用或者根据剂量方案组合同时或相继施用。在另一个特异的实施方案中，抗TR7和抗TR4抗体与化疗药物组合施用或使用，所述化疗药物如本发明所述那些(见例如下文和实施例3所述)。在一个特殊的实施方案中，当抗TR7和抗TR4抗体与化疗药物和/或交联剂组合使用或施用时，得自抗TR7和抗TR4抗体治疗的协同诱导的凋亡更明显或更显著。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物与一种化疗剂组合施用。可以与本发明组合物组合施用的化疗剂包括但非限于抗生素衍生物(例如阿霉素(亚德里亚霉素)，博来霉素，道诺霉素，和更生霉素)；抗雌激素(例如三苯氧胺)；抗代谢物(例如氟尿嘧啶，5-FU，氨甲蝶呤，5-氟脱氧尿苷，干扰素α-2b，谷氨酸，普卡霉素，巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤)；胞毒剂(例如亚硝基脲氮芥，BCNU，洛莫司汀(lomustine)，CCNU，胞核嘧啶阿拉伯糖苷，环磷酰胺，雌莫司汀(estramustine)，羟基脲，甲基苄肼，丝裂霉素，甲磺酸丁二醇二酯，顺铂和硫酸长春新碱)；激素(例如甲孕酮，雌莫司汀磷酸钠，乙炔雌二醇，雌二醇，醋酸甲地孕酮，甲基睾酮，二乙基乙烯雌酚二磷酸酯(diethylstilbestrol diphosphate)，三对甲氧苯氯乙烯和睾内酪)；氮芥衍生物(例如mephalen，chorambucil，二氯甲基二乙胺(氮芥)和三胺硫磷)；类固醇及组合物(例如bethamethasone磷酸钠)；及其它物质(例如dicarbazine，天冬酰胺酶，米托坦(mitotane)，硫酸长春新碱，硫酸长春碱和表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)，拓扑替康(Topotecan)，5-氟尿嘧啶，太平洋紫杉醇(paclitaxel)(紫杉醇)，顺铂，阿糖胞苷及IFN-γ，伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)，伊立替康类似物，吉西他汀(gemcitabine)(GEMZARTM)及奥沙利铂(oxaliplatin)，nitosourea化合物)。
在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与CHOP(环磷酰胺，阿霉素，长春新碱，和强的松)或CHOP组分的任意组合组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与美罗华(Rituximab)组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与美罗华和CHOP，或者美罗华与CHOP组分的任意组合组合施用。
在另外优选的实施方案中，本发明的组合物与TRAIL多肽或其片段或变体组合施用，尤其是TRAIL的胞外可溶结构域。
在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与其它TNF家族成员或特异于TNF受体家族成员的抗体组合施用。可以与本发明组合物施用的TNF，TNF相关的或类TNF分子包括但非限于可溶形式的TNF-o，淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)，LT-β(见于异源三聚体复合物LT-α2-β中)，OPGL，FasL，CD27L，CD30L，CD40L，4-1BBL，DcR3，OX40L，TNF-γ(国际公开No.WO 96/14328)，TRAIL，AIM-II(国际公开No.WO 97/34911)，APRIL(J.Exp.Med.188(6)：1185-1190(1998))，内因子-α(国际公开No.WO98/07880)，TR6(国际公开WO98/30694)，OPG，及Neutrokine-α(国际申请公开No.WO98/18921)，OX40，和神经生长因子(NGF)，及可溶形式的Fas，CD30，CD27，CD40和4-IBB，TR2(国际公开No.WO 96/34095)，DR3(国际公开No.WO97/35904)，TR5(国际公开No.WO98/30693)，TR6(国际公开No.WO98/30694)，TR4(国际公开No.WO98/41629)，TRANK，TR9(国际公开No.WO98/56892)，TR10(国际公开No.WO98/54202)，312C2(国际公开No.WO98/06842)，和TR12，及可溶形式的CD154，CD70，和CD153。
在一个实施方案中，本发明的抗体组合物与凋亡诱导多肽组合施用。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体与Smac(caspases的二级线粒体衍生的激活剂)蛋白组合施用，所述Smac蛋白也称为DIABLO(低pI的直接IAP(凋亡抑制剂)结合蛋白(GenBank AccessionNo.：NP_063940，在此以其全部内容并入参考)。Smac是一种239个氨基酸的蛋白质。N末端的55个氨基酸作为线粒体定向序列，其在进入线粒体后被切割。凋亡诱导多肽可以使用本领域已知技术输送。例如，输送Smac蛋白的一个途径是通过输送编码全长或成熟形式Smac(GenBank Accession No.：NP_063940的56-239位的氨基酸，通过线粒体加工的胞质形式)的核酸而进行。或者，本发明的抗体组合物可以与细胞可通透的合成的Smac肽组合施用，所述肽能抑制IAP蛋白(例如含有GenBank Accession No.：NP_063940的52-62位氨基酸残基的那些蛋白质，AVPIAQK，如Chai等(2000)，Nature406：855-862和Fulda等(2002)Nature Medicine 8：808-815，所述文献在此均以全文并入参考。
其它治疗组合
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与一种抗疟药，氨甲蝶呤，抗TNF抗体，ENBRELTM和/或硫酸水杨嗪(suflasalazine)组合施用的。在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与氨甲蝶呤组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抗TNF抗体组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与氨甲蝶呤和抗TNF抗体组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与硫酸水杨嗪组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与氨甲蝶呤，抗TNF抗体，和硫酸水杨嗪组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ENBRELTM组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ENBRELTM和氨甲蝶呤组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ENBRELTM，氨甲蝶呤和硫酸水杨嗪组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ENBRELTM，氨甲蝶呤和硫酸水杨嗪组合施用。在其它实施方案中，一或多种抗疟药与上述组合之一组合施用。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种抗疟药(例如羟化氯喹)，ENBRELTM，氨甲蝶呤和硫酸水杨嗪组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种抗疟药(例如羟化氯喹)，硫酸水杨嗪，抗TNF抗体和氨甲蝶呤组合施用。
本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)可以单独施用或与其它治疗或预防方案(例如放疗，化疗，激素治疗，免疫治疗，抗肿瘤剂，抗血管发生剂和抗炎剂)组合施用。这种组合治疗可以相继和/或伴随施用。
可以与本发明抗体或抗体组合物组合施用的常规非特异性免疫抑制剂包括但非限于类固醇，环孢霉素，环孢霉素类似物环磷酰胺，环磷酰胺IV，甲基强的松龙，脱氢皮质甾醇，咪唑硫嘌呤，FK-506，15-脱氧精胍啉(deoxyspergualin)，及通过抑制反应性T细胞功能而起作用的其它免疫抑制剂。
在特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与免疫抑制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的免疫抑制剂制品包括但非限于ORTHOCLONETM(OKT3)，SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(环孢霉素)，PROGRAFTM(他克莫司(tacrolimus))，CELLCEPTTM(霉酚酸酯)，硝基咪唑硫嘌呤，糖皮质激素(glucorticosteroid)和RAPAMUNETM(西罗莫司(sirolimus))。在一个特异的实施方案中，可以使用免疫抑制剂防止器官或骨髓移植排斥。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与类固醇治疗组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的类固醇包括但非限于口服皮质类固醇，强的松和甲基强的松龙(例如甲基强的松龙IV)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与强的松组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与强的松和一种免疫抑制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物和强的松组合施用的免疫抑制剂是本文所述的那些，并包括但非限于咪唑硫嘌呤，环磷酰胺和环磷酰胺IV。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与甲基强的松龙组合施用。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与甲基强的松龙和一种免疫抑制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的免疫抑制剂是本文所述的那些，并包括但非限于咪唑硫嘌呤，环磷酰胺和环磷酰胺IV。
本发明还涵盖了本发明多核苷酸和/或多肽(和/或其激动剂或拮抗剂)与其它提议或常规的造血疗法的组合。因此，例如本发明多核苷酸和/或多肽(和/或其激动剂或拮抗剂)可以与只具有红细胞生成刺激作用的化合物组合，所述化合物如红细胞生成素，睾酮，祖细胞刺激因子，胰岛素样生长因子，前列腺素，5-羟色胺，环AMP，泌乳刺激素和三碘甲腺原氨酸(triiodothyzonine)。本发明还涵盖了本发明抗体和抗体组合物与一般用于治疗再生障碍性贫血的化合物组合施用，所述化合物例如是methenolene，司坦唑(stanozolol)和诺龙(nandrolone)；治疗缺铁性贫血的化合物组合施用，所述化合物例如铁制品；治疗恶性贫血的化合物组合施用，所述化合物例如维生素B12和/或叶酸；及治疗溶血性贫血的化合物组合施用，所述化合物例如肾上腺皮质激素例如肾上腺皮质类脂醇。见例如Resegotti等，Panminerva Medica，23：243-248(1981)；Kurtz，FEBSLetters，14a：105-108(1982)；McGonigle等，Kidney Int.25：437-444(1984)；及Pavlovic-Kantera，Expt.Hematol.，8(supp.8)283-291(1980)，所述文献以其全文并入参考。
增强或协同红细胞生成素作用的化合物在此也用作佐剂，包括但非限于肾上腺素激动剂，甲状腺素，雄激素，肝红细胞生成因子，和红细胞生成素，见例如Dunn，″Current Concepts in Erythropoiesis″，John Wiley及Sons(英格兰奇切斯特，1983)；Kalmani，Kidney Int.22：383-391(1982)；Shahidi，New Eng.J.Med.，289：72-80(1973)；Urabe等，J.Exp.Med.149：1314-1325(1979)；Billat等，Expt.Hematol.，10：135-140(1982)；Naughton等，Acta Haemat，69：171-179(1983)；Cognote等，abstract 364，Proceedings 7th Intl.Cong.of Endocrinology(Quebec City，Quebec，July 1-7，1984)；及Rothman等，1982，J.Surg.Oncol.20：105-108(1982)。刺激红细胞生成的方法包括为患者施用一种造血有效量(即影响血细胞形成的量)的药物组合物，所述组合物含有本发明的多核苷酸和/或多肽(和/或其激动剂或拮抗剂)。通过任何适当技术将本发明的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂或拮抗剂施用于患者，包括但非限于非肠道，舌下，局部，肺内和鼻内施用，及那些本发明进一步揭示的方法。所述药物组合物任选地含有选自以下的一或多种成分：红细胞生成素，睾丸激素，原细胞刺激因子(progenitor cell stimulator)，胰岛素样生长因子，前列腺素，5-羟色胺，环AMP，泌乳刺激素，三碘甲腺原氨酸，methenolene，司坦唑，和诺龙，铁制品，维生素B12，叶酸和/或肾上腺皮质类脂醇。
在另一个实施方案中，本发明抗体和抗体组合物与造血生长因子组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的造血生长因子包括但非限于LEUKINETM(SARGRAMOSTIMTM)和NEUPOGENTM(FILGRASTIMTM)。
在另外的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物单独施用或与一种抗血管发生剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的抗血管发生剂，包括但非限于血管抑制素(angiostatin)(Entremed，Rockville，MD)，肌钙蛋白-1(Boston Life Sciences，Boston，MA)，抗侵袭因子(anti-invasive factor)，维甲酸及其衍生物，太平洋紫杉醇(紫杉醇)，苏拉明，金属蛋白酶-1的组织抑制剂，金属蛋白酶-2的组织抑制剂，VEGI，血纤溶酶原激活物抑制剂-1，血纤溶酶原激活物抑制剂-2，及多种形式的较轻的“d组”过渡金属。
较轻的“d组”过渡金属包括例如钒，钼，钨，钛，铌，和钽。这种过渡金属可以形成过渡金属复合物。上述过渡金属的适当复合物包括含氧过渡金属复合物。
钒复合物的代表性实施例包括含氧钒复合物如钒酸盐和氧钒复合物。适当的钒酸盐复合物包括偏钒酸盐和原钒酸盐复合物例如偏钒酸铵，偏钒酸钠和原钒酸钠。适当的氧钒复合物包括例如乙酰丙酮氧钒，硫酸氧钒包括硫酸氧钒水合物如硫酸单氧钒(vanadyl sulfatemono-)和三水合物。
钨和钼复合物的代表性实施例包括含氧复合物。适当的含氧钨复合物包括钨酸盐和钨氧化物复合物。适当的钨酸盐复合物包括钨酸铵，钨酸钙，钨酸钠二水合物，和钨酸。适当的钨氧化物包括钨(四价)氧化物和钨(六价)氧化物。适当的含氧钼复合物包括钼酸盐，钼氧化物，和氧钼基复合物。适当的钼酸盐复合物包括钼酸铵及其水合物，钼酸钠及其水合物，及钼酸钾及其水合物。适当的钼氧化物包括钼(六价)氧化物，和钼酸。适当的氧钼基复合物包括，例如氧钼基乙酰丙酮。其它适当的钨和钼复合物包括衍生自，例如甘油，酒石酸和糖的hydroxo衍生物。
许多其它抗血管发生因子也可用于本发明中。代表性实施例包括但非限于血小板因子4；硫酸鱼精蛋白；硫酸壳多糖衍生物(从雪花蟹壳中制备的)(Murata等，Cancer Res.51：22-26，1991)；硫酸多糖肽聚糖复合物(SP-PG)(这个化合物的功能可以通过类固醇如雌激素和三苯氧胺柠檬酸盐加强)；星形孢菌素；基质代谢调节剂包括例如脯氨酸类似物，顺羟脯氨酸，d，L-3，4-脱羟脯氨酸，硫脯氨酸(Thiaproline)，α-α-二吡啶基，氨基丙腈延胡索酸盐；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-唑酮；氨甲蝶呤；米托蒽醌(Mitoxantrone)；肝素；干扰素；2血清巨球蛋白；ChIMP-3(Pavloff等，J.Bio.Chem.267：17321-17326，1992)；胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymostatin)(Tomkinson等，Biochem J.286：475-480，1992)；环式糊精十四烷硫酸酯；Eponemycin；喜树碱；烟曲霉素(Ingber等，Nature 348：555-557，1990)；硫代苹果酸钠金(″GST″；Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.79：1440-1446，1987)；抗胶原酶血清；α2-抗血纤溶酶(Holmes等，J.Biol.Chem.262(4)：1659-1664，1987)；Bisantrene(National CancerInstitute)；Lobenzarit二钠(N-(2)-羧基苯基-4-氯蒽酮酸二钠(Lobenzaritdisodium(N-(2)-carboxyphenyl-4-chloroanthronilic acid disodium))，或“CCA”；(Takeuchi等，Agents Actions 36：312-316，1992)；和金属蛋白酶抑制剂如BB94。
也可以用于本发明的其它抗血管发生因子包括Thalidomide，(Celgene，Warren，NJ)；血管抑制素激素；AGM-1470(H.Brem和J.Folkman，J.Pediatr.Surg.28：445-51(1993))；一种整合素αvβ3拮抗剂(C.Storgard等，J.Clin.Invest.103：47-54(1999))；carboxynaminolmidazole；羧基氨基三唑(CAI)(National CancerInstitute，Bethesda，MD)；Conbretastatin A-4(CA4P)(OXiGENE，Boston，MA)；角鲨胺(Squalamine)(Magainin Pharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA)；TNP-470，(Tap Pharmaceuticals，Deerfield，IL)；ZD-0101 AstraZeneca(London，UK)；APRA(CT2584)；氟草胺(Benefin)，Byrostatin-1(SC359555)；CGP-41251(PKC 412)；CM101；Dexrazoxane(ICRF187)；DMXAA；血管内皮抑素(Endostatin)；Flavopridiol；Genestein；GTE；ImmTher；Iressa(ZD1839)；奥曲肽(Octreotide)(生长激素抑制素)；Panretin；Penacillamine；Photopoint；PI-88；Prinomastat(AG-3340)Purlytin；Suradista(FCE26644)；三苯氧胺(Nolvadex)；Tazarotene；四硫钼酸盐；Xeloda(Capecitabine)；和5-氟尿嘧啶。
可以与本发明化合物组合施用的抗血管发生剂可以通过多种机制起作用，包括但非限于抑制胞外基质的蛋白酶解，阻断内皮细胞-胞外基质粘附分子的功能，通过拮抗血管发生诱导剂如生长因子的功能，及抑制在增殖的内皮细胞上表达的整合素受体。干扰胞外基质蛋白酶解，及可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗血管发生抑制剂实施例包括但非限于AG-3540(Agouron，La Jolla，CA)，BAY-12-9566(Bayer，West Haven，CT)，BMS-275291(Bristol MyersSquibb，Princeton，NJ)，CGS-27032A(Novartis，East Hanover，NJ)，Marimastat(British Biotech，Oxford，UK)，和Metastat(Aeterna，St-Foy，Quebec)。通过阻断内皮细胞-胞外基质粘附分子的功能而起作用，及可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗血管发生抑制剂实施例包括但非限于EMD-121974(Merck KcgaA Darmstadt，Germany)和Vitaxin(Ixsys，La Jolla，CA/Medimmune，Gaithersburg，MD)。通过直接拮抗或抑制血管发生诱导剂而起作用，及可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗血管发生剂实施例包括但非限于Angiozyme(Ribozyme，Boulder，CO)，抗-VEGF抗体(Genentech，S.San Francisco，CA)，PTK-787/ZK-225846(Novartis，Basel，Switzerland)，SU-101(Sugen，S.San Francisco，CA)，SU-5416(Sugen/Pharmacia Upjohn，Bridgewater，NJ)和SU-6668(Sugen)。其它抗血管发生剂通过间接抑制血管发生而起作用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的血管发生的间接抑制剂实施例包括但非限于IM-862(Cytran，Kirkland，WA)，α-干扰素，IL-12(Roche，Nutley，NJ)，和多硫酸戊聚糖酯(Georgetown University，华盛顿DC)。
在特殊的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抗血管发生剂的组合施用预期可以治疗，预防和/或改善癌症及其它过渡增殖性紊乱。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抗病毒剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗病毒剂包括但非限于阿昔洛韦(acyclovir)，三唑核苷，金刚烷胺和remantidine。
在一些实施方案中，本发明的治疗剂与抗逆转录病毒剂，核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTIs)，非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)，和/或蛋白酶抑制剂(PIs)组合施用。可以与本发明治疗剂组合施用的NRTIs包括但非限于RETROVIRTM(叠氮胸苷/AZT)，VIDEXTM(去羟肌苷/ddI)，HIVIDTM(扎西他滨(zalcitabine)/ddC)，ZERITTM(司他夫定(stavudine)/d4T)，EPIVIRTM(拉米夫定(lamivudine)/3TC)，和COMBIVIRTM(叠氮胸苷/拉米夫定)。可以与本发明治疗剂组合施用的NNRTIs包括但非限于VIRAMUNETM(nevirapine)，RESCRIPTORTM(delavirdine)，和SUSTIVATM(efavirenz)。可以与本发明治疗剂组合施用的蛋白酶抑制剂包括但非限于CRIXIVANTM(indinavir)，NORVIRTM(ritonavir)，INVIRASETM(saquinavir)和VIRACEPTTM(nelfinavir)。在特异的实施方案中，抗逆转录病毒剂，核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂，和/或蛋白酶抑制剂，可以与本发明治疗剂任意组合使用，以治疗AIDS和/或预防或治疗HIV感染。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抗生素制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗生素制剂包括但非限于羟氨苄青霉素(amoxicillin)，氨基糖苷，β-内酰胺(糖肽)，β-内酰胺酶，氯洁霉素，氯霉素，头孢菌素，环丙沙星(ciprofloxacin)，红霉素，氟喹啉酮，大环内酯类药物，甲硝哒唑，青霉素，喹啉酮，，利福霉素，链霉素，磺胺类药物，四环素，甲氧苄啶，甲氧苄啶-联磺甲氧苄啶(sulfamthoxazole)，和万古霉素。
在其它实施方案中，本发明抗体和抗体组合物可以与抗机会感染制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗机会感染剂包括但非限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，ATOVAQUONETM，ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，ETHAMBUTOLTM，RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，AZITHROMYCINTM，GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM，CIDOFOVIRTM，FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，KETOCONAZOLETM，ACYCLOVIRTM，FAMCICOLVIRTM，PYRIMETHAMINETM，LEUCOVORINTM，NEUPOGENTM(filgrastim/G-CSF)和LEUKINETM(sargramostim/GM-CSF)。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物可以与TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，和/或ATOVAQUONETM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)肺部机会感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，和/或ETHAMBUTOLTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)复合物机会感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，和/或AZITHROMYCINTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性肺结核杆菌感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM，和/或CIDOFOVIRTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性巨细胞病毒感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，和/或KETOCONAZOLETM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性真菌感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与ACYCLOVIRTM和/或FAMCICOLVIRTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性I型和II型单纯疱疹病毒感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PYRIMETHAMINETM和/或LEUCOVORINTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性刚地弓形体(Toxoplasma gondii)感染。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与LEUCOVORINTM和/或NEUPOGENTM任意组合施用，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性细菌感染。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物单独施用或与抗炎剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗炎剂包括但非限于糖皮质激素和非甾类抗炎剂，氨基芳香基羧酸(aminoarylcarboxylic)衍生物，芳香基乙酸衍生物，芳香基丁酸衍生物，芳香基羧酸，芳香基丙酸衍生物，吡唑，吡唑啉酮，水杨酸衍生物，噻嗪氨甲酰(thiazinecarboxamides)，e-乙酰氨基己酸，S-腺苷甲硫氨酸，3-氨基-4-羟丁酸，amixetrine，苄达酸(bendazac)，苄达明(benzydamine)，布可隆(bucolome)，吡啶基联苯基乙酰胺，ditazol，emorfazone，guaiazulene，萘丁美酮(nabumetone)，nimesulide，orgotein，oxaceprol，paranyline，哌立索唑(perisoxal)，哌福肟(pifoxime)，proquazone，普罗沙唑(proxazole)，和tenidap。
本发明的抗体或抗体组合物可以单独施用或与其它佐剂组合施用。可以与本发明的抗体和抗体组合物一起施用的佐剂包括但非限于明矾，明矾加上脱氧胆酸盐(ImmunoAg)，MTP-PE(Biocine公司)，QS21(Genentech公司)，BCG，和MPL。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与明矾组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与QS-21组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的其它佐剂包括但非限于单磷脂免疫调节剂，AdjuVax 100a，QS-21，QS-18，CRL1005，铝盐，MF-59，和仿病毒颗粒佐剂技术。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的疫苗包括但非限于保护性直接抗MMR(麻疹，腮腺炎，风疹)，脊髓灰质炎，水痘，破伤风/白喉，甲肝，乙肝，流感嗜血杆菌B，百日咳，肺炎，流感，Lyme′s病，轮状病毒，霍乱，黄热病，日本脑炎，脊髓灰质炎，狂犬病，伤寒症，和百日咳，和/或PNEUMOVAX-23TM的疫苗。组合物可以例如作为混合物，单独但同时伴随施用；或相继施用。这包括其中所述组合的制剂作为治疗混合物一起施用，也包括其中所述组合的制剂单独但同时施用，例如通过单独的静脉内途径进入相同个体内。“组合”施用还包括首先单独施用一种给定的化合物或制剂，随后再施用第二种。
在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断感染和/或相关的任何疾病，紊乱和/或病变。在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断任何革兰氏阳性菌感染和/或任何相关的疾病，紊乱和/或病变。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断与肠球菌属和/或链球菌属的一或多个成员相关的感染和/或任何疾病，紊乱和/或病变。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断与链球菌B组的一或多个成员相关的感染和/或任何疾病，紊乱和/或病变。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用，以治疗，预防和/或诊断肺炎链球菌感染和/或任何疾病，紊乱和/或病变。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与以下物质组合施用：CD40配体(CD40L)，可溶形式的CD40L(例如AVRENDTM)，CD40L的生物活性片段，变体或衍生物，抗CD40L抗体(例如兴奋性抗体或拮抗性抗体)，和/或抗CD40抗体(例如兴奋性抗体或拮抗性抗体)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种抗凝血剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的抗凝血剂包括但非限于肝素，杀鼠灵(warfarin)和阿斯匹林。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与肝素和/或杀鼠灵组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与杀鼠灵组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与杀鼠灵和阿斯匹林组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与肝素组合施用。在另一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与肝素和阿斯匹林组合施用。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与抑制抗心磷脂抗体产生的一种制剂组合施用。在特异的实施方案中，本发明的多核苷酸与一种制剂组合施用，所述制剂阻断和/或降低抗心磷脂抗体与磷脂结合血浆蛋白β2-糖蛋白I(b2GPI)的结合能力。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与一种抗疟疾药物组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗疟药包括但非限于羟化氯喹，氯喹和/或奎纳克林。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与NSAID组合施用。
在一个非唯一的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与一，二，三，四，五，十或多种以下药物组合施用的：NRD-101(HoechstMarion Roussel)，双氯芬酸(Dimethaid)，恶丙嗪钾(Monsanto)，mecasermin(Chiron)，T-614(Toyama)，培美曲塞二钠(EliLilly)，atreleuton(Abbott)，valdecoxib(Monsanto)，eltenac(Byk Gulden)，campath，AGM-1470(Takeda)，CDP-571(Celltech Chiroscience)，CM-101(CarboMed)，ML-3000(Merckle)，CB-2431(KS Biomedix)，CBF-BS2(KS Biomedix)，IL-1Ra基因治疗(Valentis)，JTE-522(日本烟草)，太平洋紫杉醇(Angiotech)，DW-166HC(Dong Wha)，darbufelone mesylate(Warner-Lambert)，可溶的TNF受体1(synergen；Amgen)，IPR-6001(Institute for Pharmaceutical Research)，trocade(Hoffman-La Roche)，EF-5(Scotia Pharmaceuticals)，BIIL-284(Boehringer Ingelheim)，BIIF-1149(Boehringer Ingelheim)，LeukoVax(Inflammatics)，MK-663(Merck)，ST-1482(Sigma-Tau)和butixocortpropionate(WarnerLambert)。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与一，二，三，四，五或多种以下药物组合施用的：氨甲蝶呤，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，金硫丁二钠(sodium aurothiomalate)，auranofin，环孢霉素，青霉胺，咪唑硫嘌呤，一种抗疟药(例如本文所述)，环磷酰胺，苯丁酸氮芥，金，ENBRELTM(Etanercept)，抗-TNF抗体，LJP 394(La Jolla Pharmaceutical Company，San Diego，California)和强的松龙。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物单独施用或与一或多种静脉内免疫球蛋白制品组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的静脉内免疫球蛋白制品包括但非限于GAMMARTM，IVEEGAMTM，SANDOGLOBULINTM，GAMMAGARDS/DTM，和GAMIMUNETM。在一个特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物在移植治疗(例如骨髓移植)中与静脉内免疫球蛋白制品组合施用。
CD40配体(CD40L)，一种可溶形式的CD40L(例如AVRENDTM)))))，CD40L的生物活性片段，变体或衍生物，抗CD40L抗体(例如兴奋性抗体或拮抗性抗体)，和/或抗CD40抗体(例如兴奋性抗体或拮抗性抗体)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与细胞因子组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的细胞因子包括但非限于GM-CSF，G-CSF，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL12，IL13，IL15，抗-CD40，CD40L，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，TNF-α，和TNF-β。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与TRAIL受体组合施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物可以与任何白细胞介素组合施用，所述白细胞介素包括但非限于IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21，和IL-22。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与IL4和IL10组合施用。在其它优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与IL2组合施用。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与G-CSF组合施用。
在一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物是与一或多种趋化因子组合施用的。在特异的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与选自以下的α(CxC)趋化因子组合施用：γ干扰素可诱导蛋白-10(γIP-10)，白细胞介素-8(IL-8)，血小板因子4(PF4)，嗜中性粒细胞激活蛋白(NAP-2)，GRO-α，GRO-β，GRO-γ，嗜中性粒细胞激活肽(ENA-78)，粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)，和基质细胞衍生因子-1(SDF-1，或前-B细胞刺激因子(PBSF))；和/或一种β(CC)趋化因子组合施用，选自RANTES(调节活化，正常T细胞表达和分泌)，巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)，巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，单核细胞趋化蛋白-2(MCP-2)，单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)，单核细胞趋化蛋白-4(MCP-4)巨噬细胞炎症蛋白-1γ(MIP-1γ)，巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)，巨噬细胞炎症蛋白-3β(MIP-3β)，巨噬细胞炎症蛋白-4(MIP-4/DC-CK-1/PARC)，eotaxin，Exodus和I-309；和/或γ(C)趋化因子，淋巴细胞趋化因子组合施用。在优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与提高INF-γ和/或caspase活性尤其caspase-8活性的制剂组合施用。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与趋化因子β-8，趋化因子β-1，和/或巨噬细胞炎症蛋白-4组合施用。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与趋化因子β-8组合施用。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与IL-4拮抗剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的IL-4拮抗剂包括但非限于：可溶的IL-4受体多肽，聚合形式的可溶IL-4受体多肽；结合IL-4而不转导由IL-4激发的生物信号的抗IL-4受体抗体，阻断IL-4与一或多种IL-4受体结合的抗IL4抗体，和结合IL-4受体但不转导由IL-4激发的生物信号的IL-4突变蛋白。优选地，根据这种方法应用的抗体是单克隆抗体(包括抗体片段，例如本发明所述)。
在另一个实施方案中，本发明的抗体和抗体组合物与成纤维细胞生长因子组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的成纤维细胞生长因子包括但非限于FGF-1，FGF-2，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8，FGF-9，FGF-10，FGF-11，FGF-12，FGF-13，FGF-14和FGF-15。
论证组合物的治疗或预防用途
本发明的化合物优选在体外测试，然后在体内测试希望的治疗或预防活性，之后用于人体。例如，可以用于确定是否需要施用本发明特异抗体或组合物的体外分析，包括体外细胞培养分析，其中将患者组织样品在培养物中生长，并暴露于或另外施用本发明的抗体或组合物，观测本发明这种抗体或组合物对所述组织样品的作用。在多种特异的实施方案中，可以用患者病变中包含的代表性细胞进行体外分析，以确定本发明的抗体或组合物对这种细胞是否具有希望的作用。优选地，本发明的抗体或组合物也在体外分析和动物模型系统中进行测试，之后施用于人体。
用于治疗的本发明抗体或组合物可以在适当的动物模型系统中测试其毒性，包括但非限于大鼠，小鼠，鸡，牛，猴和兔。针对体内测试抗体或组合物毒性，可以使用本领域已知的任何动物模型系统。
可以在体外，源于体内(ex vivo)和体内分析中测试本发明抗体或组合物降低肿瘤形成的能力。还可以在体外和体内分析中测试本发明抗体或组合物抑制病毒复制或降低病毒荷载的能力。还可以在本领域已知的体外和体内分析中测试本发明抗体或组合物降低细菌数目的能力。还可以测试本发明的抗体或组合物减轻与癌症，免疫紊乱(例如炎症疾病)，神经紊乱或感染性疾病相关的一或多种症状的能力。还可以测试本发明抗体或组合物降低感染性疾病时程的能力。另外，还可以测试本发明的抗体或组合物提高患病动物的存活期的能力，所患疾病包括癌症，免疫紊乱或感染性疾病。可以使用本领域已知的技术分析本发明抗体或组合物在体内的功能。
治疗或预防病毒感染的效力，可以通过检测本发明抗体或组合物抑制病毒复制，抑制传播或阻止病毒在其宿主中安置，或预防，改善或减轻疾病进展的能力而证实。如果在施用本发明抗体或组合物后，病毒荷载减少，改善一或多个症状，或死亡率和/或发病率降低，则认为所述处理具有治疗效力。
可以测试本发明抗体或组合物调节免疫细胞生物活性的能力，通过将免疫细胞优选人免疫细胞(例如T细胞，B细胞和天然杀伤细胞)与本发明的抗体或组合物或一种对照化合物接触，并确定本发明抗体或组合物调节(即提高或降低)免疫细胞生物活性的能力。本发明抗体或组合物调节免疫细胞生物活性的能力可以通过检测抗原的表达，检测免疫细胞的增殖(即B细胞增殖)，检测信号分子的活化，检测免疫细胞的效应功能，或检测免疫细胞的分化而确定。可以使用本领域已知的技术测定这些活性。例如，细胞增殖可以通过3H-胸苷掺入分析和台盼蓝(trypan blue)细胞计数确定。抗原表达可以通过例如免疫分析确定，所述分析包括但非限于竞争性和非竞争性分析系统，使用如Werstern印迹，免疫组织化学放射免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫分析，免疫沉淀分析，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散分析，凝集反应，补体固定分析，免疫放射性分析，荧光免疫分析，蛋白A免疫分析和FACS分析。信号分子的活化可以通过例如激酶分析和电泳迁移分析(EMSAs)确定。在一个优选的实施方案中，测定本发明的抗体或组合物诱导B细胞增殖的能力。在另一个优选的实施方案中，测定本发明的抗体或组合物调节免疫球蛋白表达的能力。
实验对象/混合物
本发明还提供了免疫特异性结合TR7或其片段或变体的抗体混合物(包括scFvs及包含或由抗体片段或变体组成的其它分子)，其中所述混合物具有至少1，2，3，4，5或多种不同的本发明抗体。在特异的实施方案中，本发明提供了至少2种，优选至少4，至少6，至少8，至少10，至少12，至少15，至少20或至少25种免疫特异性结合TR7的不同抗体或其片段或变体，其中混合物的至少1，至少2，至少4，至少6，或至少10种抗体是本发明的抗体。在一个特异的实施方案中，混合物的每种抗体均是本发明的抗体。
本发明还提供了免疫特异性结合TR7或其片段或变体的抗体(包括scFvs及包含或由抗体片段或变体组成的其它分子)实验组，其中所述实验组具有至少1，2，3，4，5或多种不同的本发明抗体。在特异的实施方案中，本发明提供了抗体实验组，其对TRAIL受体的具有不同亲和性，对TRAIL受体的具有不同特异性，或不同的解离速度。本发明提供了至少10种，优选至少25，至少50，至少75，至少100，至少125，至少150，至少175，至少200，至少250，至少300，至少350，至少400，至少450，至少500，至少550，至少600，至少650，至少700，至少750，至少800，至少850，至少900，至少950，或至少1000种抗体。抗体实验组可以用于例如96孔平板中进行分析，例如ELISA。
本发明还提供了包含一或多种抗体(包括包含或由本发明抗体片段或变体组成的分子)的组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs的任一或多个VH结构域的氨基酸序列的多肽或其变体组成。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs的VH结构域的任一或多个VH CDR1的氨基酸序列的多肽或其变体组成。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs的VH结构域的任一或多个VH CDR2的氨基酸序列的多肽或其变体组成。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs的VH结构域的任一或多个VH CDR3的氨基酸序列的多肽或其变体组成。
本发明提供了包含一或多种抗体(包括包含或由本发明抗体片段或变体组成的分子)的组合物的其它实施方案，如下所述。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs的任一或多个VL结构域的氨基酸序列的多肽或其变体组成。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs的任一或多个VL CDR1结构域的氨基酸序列的多肽或其变体组成。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs的任一或多个VL CDR2的氨基酸序列的多肽或其变体组成。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含1，2，3，4，5或多种抗体，所述抗体包含或由具有表1所示一或多种scFvs的任一或多个VL CDR3结构域的氨基酸序列的多肽或其变体组成。
试剂盒
本发明还提供了一种药物包装或试剂盒，其包含一或多个充填一或多种本发明药物组合物成分的容器。任选地与这种容器相关的是一个由管理药物或生物制品的生产，使用和销售的政府机构规定的告示，其告知了针对人体施用的生产，使用或销售机构的许可。
本发明提供了可用于上述方法中的试剂盒。在一个实施方案中，一个试剂盒在一或多个容器中含有本发明的抗体，优选纯化的抗体。在另一个实施方案中，试剂盒含有免疫特异性结合TR7多肽或其片段或变体的抗体片段。在一个特异的实施方案中，本发明的试剂盒含有一种基本分离的TR7多肽或其片段或变体作为对照。优选地，本发明的试剂盒还包含与任何，一些或全部TRAIL受体不反应的一种对照抗体。在另一个特异的实施方案中，本发明的试剂盒含有一种检测抗体与TR7多肽结合的手段(例如抗体可以缀合于一种可检测底物如荧光化合物，酶底物，放射性化合物或发光化合物，或识别第一种抗体的第二种抗体可缀合于一种可检测底物)。在特异的实施方案中，所述试剂盒可以包括一种重组产生的或化学合成的TRAIL受体。试剂盒中的TR7多肽还可以附着于一种固体支持物。在一个更特异的实施方案中，所述试剂盒的检测手段包括TR7多肽附着的一种固体支持物。这种试剂盒还可以包括一种未附着的报道子标记的抗人抗体。在这个实施方案中，抗体与TR7的结合可以通过所述报道子标记的抗体的结合而检测。
在另一个实施方案中，本发明包括一种诊断试剂盒，用于筛选含有本发明多肽的抗原的血清。所述诊断试剂盒包括与TARIL受体特异性免疫反应的一种基本分离的抗体，及检测TR7多肽与抗体结合的方法。在一个实施方案中，所述抗体附着于一种固体支持物。在一个特异的实施方案中，所述抗体可以是一种单克隆抗体。所述试剂盒的检测方法可以包括另一种标记的单克隆抗体。或者，或另外，所述检测方法可以包括一种标记的竞争抗原。
在一个诊断性方法中，将测试血清与一种固相试剂反应，所述固相试剂具有通过本发明方法获得的表面结合的TRAIL受体。在TR7多肽与特异性抗体结合后，通过冲洗除去未结合的血清成分，加入报道子标记的抗人抗体，通过冲洗除去未结合的抗人抗体，将一种试剂与报道子标记的抗人抗体反应，报道子与所述试剂的结合与在固体支持物上结合的抗TR7多肽抗体的数量成比例。典型地，所述报道子是一种酶，其是通过在存在适当的荧光，发光或显色底物的情况下，孵育所述固相试剂而检测的。
上述分析中的所述固相表面试剂是通过本领域已知的将蛋白质物质吸附于固相物质如聚合物珠，蘸棒，96孔平板或滤膜的方法制备的。这些附着方法通常包括将所述蛋白质非特异性吸附于支持物，或蛋白质的共价附着，典型地通过一个游离氨基基团附着于固相支持物上的一个化学反应基团，如激活的羧基，羟基或醛基基团。或者，链亲和素包被的平板可以与生物素化的抗原联合使用。
因此，本发明提供了一种分析系统或试剂盒以进行这种诊断方法。所述试剂盒一般包括表面结合有重组TRAIL受体的支持物，和报道子标记的抗人抗体，以检测表面结合的抗TR7抗体。
TRAIL受体的胎盘表达
肿瘤坏死因子家族受体和配体在整个胎盘及胎盘巨噬细胞和滋养层细胞系中的表达已经进行仔细检测。示出表达TR7和TR5但不表达TR10滋养层细胞对通过重组TRAIL的杀伤具有完全抗性，而表达TR4，TR7和TR10但不表达TR5的巨噬细胞是敏感的(Phillips等，J.Immunol.15：6053-9(1999)，在此以其全文并入参考)。因此，使用所述抗TR7抗体的方法也可以用于胎盘和胎盘细胞类型上(例如巨噬细胞和滋养层细胞)，以预防，治疗，诊断，改善或监测胎盘细胞类型的疾病或紊乱。
基因治疗
在一个特异的实施方案中，通过基因治疗，施用包含编码抗体或其功能衍生物的序列的核酸以治疗，抑制或预防与TRAIL受体和/或其配体(例如TRAIL)异常表达和/或活性相关的疾病或紊乱。基因治疗是指通过为对象施用一种表达的或可表达的核酸进行治疗。在本发明的这个实施方案中，所述核酸产生其编码的介导治疗作用的蛋白质。
根据本发明，可以使用本领域可用的基因治疗的任何方法。例如以下阐述了一些方法。
针对基因治疗的一般方法，参见Goldspiel等，Clinical Pharmacy12：488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science260：926-932(1993)；及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)：155-215(1993)所述。可以使用的重组DNA技术领域已知的的方法见于Ausubel等编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；及Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton出版社，NY(1990)。
在一个优选方面，本发明的组合物包含或者由编码抗体的核酸组成，所述核酸是在适当的宿主中表达抗体或其片段或嵌合蛋白或重链或轻链的表达载体的一部分。特别地，这种核酸具有启动子，优选异源启动子，可操纵地连于抗体编码区，所述启动子是可诱导的或组成型的，并任选地是组织特异性的。在另一个特别的实施方案中，所使用的核酸分子其中所述抗体编码序列和任何其它所需序列在两侧存在促进在基因组中希望位点同源重组的区域，因此提供抗体编码核酸在染色体内表达(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342：435-438(1989)。在一个特异的实施方案中，表达的抗体分子是scFv；或者，所述核酸序列包括编码抗体重链和轻链或其片段或变体的序列。
将所述核酸可以直接或间接输送进入患者，直接输送是将患者直接暴露于所述核酸或携带核酸的载体，间接输送是将细胞首先用所述核酸在体外转化，然后移植入患者体内。这两种方法分别称为体内或源于体内基因治疗。
在一个特异的实施方案中，所述核酸序列直接在体内施用，其中其表达产生编码的产物。这可以通过本领域已知的任何方法完成，例如通过将它们构建为适当的核酸表达载体的一部分，并施用以使其成为胞内的，例如通过使用缺陷的或减毒的逆转录病毒载体或其它病毒载体感染(见美国专利No.4,980,286)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，包装在脂质体，微粒或微囊中，或通过将其与已知进入核的肽连接施用，通过将其与配体连接进行受体介导的胞吞(见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))(其可以用于定向特异性表达所述受体的细胞)等。在另一个实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中所述配体包含一种融合(fusogenic)病毒肽以破坏内涵体，使所述核酸免于被溶酶体降解。在另一个实施方案中，所述核酸可以在体内定向以进行细胞特异性吸收和表达，通过定向一个特异性受体进行(见例如PCT公开WO 92/06 180；WO92/22715；WO92/203 16；WO93/14188，WO 93/20221)。或者，所述核酸可以导入细胞内，并掺入宿主细胞DNA内以表达，通过同源重组进行(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature 342：435-438(1989))。
在一个特异的实施方案中，使用含有编码本发明抗体或其片段或变体的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(见Miller等，Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。这些逆转录病毒含有正确包装病毒基因组及整合入宿主细胞DNA所必需的成分。将编码基因治疗中所用抗体的核酸序列克隆入一或多个载体中，所述载体促进所述基因输送至患者体内。关于逆转录病毒载体的更详细阐述可见于Boesen等，Biotherapy 6：29 1-302(1994)，其阐述了使用一种逆转录病毒载体将mdr1基因输送至造血干细胞中，以使所述干细胞对化疗更有抗性。其它例证了在基因治疗中使用逆转录病毒载体的参考文献见于：Clowes等，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Klein等，Blood83：1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，Human Gene Therapy4：129-141(1993)；及Grossman和Wilson，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3：110-114(1993)。
腺病毒是可用于基因治疗中的其它病毒载体。腺病毒是将基因输送于呼吸道上皮的特别有效的运载体。腺病毒自然感染呼吸道上皮，在此其导致轻微的疾病。基于腺病毒的输送系统的其它靶位是肝，中枢神经系统，内皮细胞和肌。腺病毒具有能感染非分裂的细胞的优点。Kozarsky和Wilson，Current Opinion in Genetics and Development3：499-503(1993)提出了一种关于基于腺病毒的基因治疗的回顾。Bout等，Human Gene Therapy 5：3-10(1994)论证了腺病毒载体将基因转移至恒河猴呼吸道上皮的应用。腺病毒在基因治疗中应用的其它例子可见于Rosenfeld等，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld等，Cell68：143-155(1992)；Mastrangeli等，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT公开WO94/12649；及Wang，等，Gene Therapy 2：775-783(1995)。在一个优选的实施方案中，使用腺病毒载体。
腺病毒相关病毒(AAV)已经被提议用于基因治疗中(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；美国专利No.5,436,146)。
基因治疗的另一种方法包括将基因通过如电穿孔，脂染，磷酸钙介导的转染，或病毒感染等方法移至组织培养的细胞中。通常地，所述转移方法包括将一个可选择标记移至所述细胞。然后将此细胞置于选择条件下以分离已经吸收并表达转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞输送于患者。
在这个实施方案中，在体内施用所得重组细胞之前，将所述核酸导入细胞中。这种导入可以通过本领域已知的任何方法进行，包括但非限于转染，电穿孔，微注射，用含有所述核酸序列的病毒或噬菌体载体感染，细胞融合，染色体介导的基因转移，微细胞介导的基因转移，原生质体融合等。本领域已知许多将外源基因导入细胞的技术(见例如Loeffler和Behr，Meth.Enzymol.217：599-718(1993)；Cohen等，Meth.Enzymol.217：718-644(1993)；Clin.Pharma.Ther.29：69-92m(1985))，根据本发明可以使用这些方法，使受体细胞的必需发育和生理功能不被破坏。所述技术应稳定地将所述核酸移至细胞，以便所述核酸由细胞表达，及优选地可由其子代继承和表达。
所得重组细胞可以通过本领域已知的多种方法输送于患者。重组的血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选通过静脉内注射施用。所用细胞数量依赖于所希望的效果，患者状态等，并可以由本领域技术人员确定。
将核酸导入其中以进行基因治疗的细胞涵盖了任何希望的可获得的细胞类型，包括但非限于上皮细胞，内皮细胞，角化细胞，成纤维细胞，肌细胞，肝细胞；血细胞如T淋巴细胞，B淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，嗜曙红细胞，巨核细胞，粒细胞；多种干细胞或原细胞，尤其造血干细胞或祖细胞，例如得自骨髓，脐带血，周围血，胎儿肝脏的细胞等。
在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞与患者是自体同源的。
在一个使用重组细胞进行基因治疗的实施方案中，将编码抗体或其片段的核酸序列导入细胞中，这样其可由该细胞或其子代表达，然后将所述重组的细胞体内施用以进行治疗。在一个特异的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。根据本发明的这个实施方案，使用可以在体外分离并维持的任何干细胞和/或祖细胞(见例如PCT公开WO94/08598；Stemple和Anderson，Cell 71：973-985(1992)；Rheinwald，Meth.Cell Bio.21A：229(1980)；及Pittelkow和Scott，Mayo ClinicProc.61：771(1986))。
在一个特异的实施方案中，导入的以进行基因治疗的核酸包含一个可诱导启动子，其可操纵地连接于编码区，这样可通过控制存在或不存在适当的转录诱导因子而控制所述核酸的表达。
实施例
实施例1：TR7结合多肽的亲和性和特异性的Biacore分析
材料
BIAcore2000设备
BIAcore2000控制软件，版本3.1.1
BIAevaluation，版本3.1
BIAcore CM5传感器芯片，Cat#BR-1000-14Lot#0364(BIAcore)
HBS-EP缓冲液
胺偶联试剂盒Cat#BR-1000-50(BIAcore)
EDC，#1048-950345(BIAcore)
NHS，#1048-950345(BIAcore)
乙醇胺，#1048-950345(BIAcore)
10mM乙酸，pH4.0，Cat#BR1003-50 Lot#1821-9503844(BIAcore)
TRAIL-FLAG(Alexis Biochemical Cat#522-003-C010#L04793/a)
所有实验温度均为25℃。
一般方法
以下方案是可用于确定抗TR7抗体与TR7多肽的亲和性的方案的一个实例。另外，以下方案可用于确定本发明抗体的特异性。
将TR4，TR5，TR7和TR10(Fc融合蛋白形式)固定于BIAcore传感器芯片的各个流式(flow)细胞上。TR7-Fc融合蛋白包含TR7(SEQ ID NO：3)的E52-G184残基。这种蛋白质在利用GP信号肽的杆状病毒表达系统中表达。因此，这种融合蛋白的翻译后加工产生TR7-Fc融合蛋白，其包含融合于TR5(SEQ ID NO：3)的E52-G184残基的GP信号肽的后3个残基(Ala-Asp-Pro)，所述残基融合于Fc区域。TR4-Fc融合蛋白包含TR4(SEQ ID NO：1)的M1-I240残基。这种融合蛋白质的翻译后加工产生TR4-Fc融合蛋白，其包含TR4(SEQ ID NO：1)的A109-I240残基。TR5-Fc融合蛋白包含TR5(SEQ ID NO：2)的R70-S282残基。这种蛋白质在利用GP信号肽的杆状病毒表达系统中表达。因此，这种融合蛋白的翻译后加工产生TR5-Fc融合蛋白，其包含融合于TR5(SEQ ID NO：2)的R70-S282残基的GP信号肽的后3个残基(Ala-Asp-Pro)，所述残基融合于Fc区域。TR10-Fc融合蛋白包含TR10(SEQ ID NO：4)的M1-G204残基。这种融合蛋白的翻译后加工产生TR10-Fc融合蛋白，其包含TR10(SEQ ID NO：4)的A56-G204残基。
胺偶联用于将每个受体(Fc)共价结合于CM5传感器芯片上的葡聚糖基质。这种偶联的最佳pH使用在pH4-7范围进行的预选实验分析，并基于结合斜率确定。
使用手工注射模式进行实际偶联。针对所有流式细胞设定目标为大约2000RU的靶水平(根据受体的分子量可以在2000-3100范围内变化)。进行固定的所有受体浓度为10mM乙酸(pH4.0)中10μg/ml。在5μl/分钟流速进行全部固定实验。EDC/NHS注射的接触时间为7分钟。注射乙醇胺7分钟。
用以下程序进行筛选。完整结合循环的流速为25μl/分钟。相当于scFvs的抗体在HBS-EP中稀释，并流经具有固定的TRAIL受体的所有四种细胞。将每种样品与受体接触4分钟。使用15μl的25mMNaOH进行再生。成功的再生认为不仅除去抗体，而且还不变性固定的受体。
这种筛选实验的阳性对照是同样(流速和时间长度)注射可溶的TRAIL配体。浓度为1μg/ml。阴性对照是在HBS-EP中1:10稀释的抗体稀释剂。使用BIAevaluation软件包分析数据。
抗TR7抗体的Biacore分析
在基于上述一般方法的以下实验中，某些抗体(相当于本发明的scFvs)与TR7的亲和性使用“双参考扣除(double referencesubtraction)”方法确定，在实验的流式细胞中使用TR7-Fc受体，TR2-Fc(包含TR2的1-192位氨基酸，也称为疱疹病毒进入介导子(Herpes Virus Entry Mediator)(HVEM)，如WO96/34095所揭示，其全文并入参考)作为阴性对照。
将TR7-Fc和TR2-Fc固定于BIAcore传感器芯片(BIAcore，Cat#BR-1000-14)的各个流式细胞上。胺偶联(BIAcore，Cat#BR-1000-50)用来将每个受体共价结合于传感器芯片上的葡聚糖基质。这种偶联的最佳pH使用在pH4-7范围进行的预选实验分析，并基于结合斜率确定为pH4.0。使用手工注射模式进行实际偶联。针对这两种流式细胞设定目标为大约200相对单位(RU)的靶水平。1000RU的应答与大约1ng/mm2蛋白质的表面浓度中的变化相关。TR7和TR2融合蛋白的分子量几乎相同。进行固定的这两种受体浓度为于10mM乙酸中5μg/ml，pH4.0(BIAcore，Cat#BR-1003-49)。以5μL/分钟流速进行全部实验。盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基胺丙基)盐酸碳二亚胺/盐酸乙醇胺-NaOH，pH8.5(EDC/NHS)注射的接触时间为3分钟。注射乙醇胺3分钟。
使用BIAcore 2000设备，用2000控制软件版本3.1.1进行CM005G08动力学分析。全部结合循环的流速为25μL/分钟。纯化的抗体于0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20(HBS-EP运行缓冲液；BIAcoore，Cat#BR-1001-88)中从3.75μg/mL(25nM)稀释到0.023μg/mL(0.015nM)。每个浓度，重复3次，在5分钟的结合相过程中和两个受体接触。CM005G08的解离速度通过将该复合物在存在HBS-EP缓冲液的情况下洗涤10分钟而确定。在每次循环结束时进行再生，使用可变体积(5-12μL)的25mM NaOH以50μL/分钟流速进行。全部分析的温度保持恒定在25℃。
结合数据使用BIAevaluation软件版本3.1进行分析。使用1∶1Langmuir结合模型。由于相对高的结合和解离速度，使用适应结合及解离相的单独曲线而不使用总体适应的曲线。结合数据通过减去对照流式细胞以及缓冲液注射针对特异性作用进行校准，称为双参考扣除(Myszka，(1999)Improving BiosensorAnalysis.J.Molec.Recognition12，1-6)。以下符号和解释用于描述结合参数的特性(BIAevaluationSoftware Handbook，第三版，1997，BIAcore)。
RU BIAcore设备的原始读数，表示共振信号的强度，与传感器芯片结合的物质的重量成比例
RL 定性与芯片结合的TR7量的共振信号值
ka(M-1s-1)结合速度常数
kd(s-1) 解离速度常数
KA(1/M) 平衡结合常数
KD(M) 平衡解离常数
Rmax(RU) 被分析的芯片的最大结合能力
为保证准确评估不同批次的CM005G08或TRAIL与共价固定在葡聚糖基质上的TR7的结合的动力学参数，每个实验分别进行三次。基于预备的最佳化实验选择传感器芯片的密度和流速，以避免抗体的二价结合及质量转移限制作用。观测的结合特异于TR7，因为针对CM005G08与对照蛋白TR2-Fc的结合未观测到共振信号(图A.1)。所述结合遵循第一级动力学并适应1∶1 Langmuir结合模型。基于三个独立实验估计抗体与TRAIL2的整体亲和性。所有动力学参数以三个单独实验的平均数值±STD表示。两种独立的CM005G08分别定性为KD值为0.25±0.013nM和0.33±0.003nM，解离速度为2.66×10-3±0.12×10-3/s及2.68×10-3±0.05×10-3/s。与CM005G08相比，TRAIL以较高整体亲和性与TR7结合(KD＝0.04±0.003nM)，主要因为解离速度较慢(kd＝1.37×10-4±0.10×10-4/s)。
实施例2：抑制生物素化的TRAIL与TR7结合
I.材料：
10×PBS(Quality Biological Cat 130-069-161，Lot 708712)
Immulon4微平板(Dynex Cat 3855，Lot ND540319)
牛血清白蛋白级分V(Sigma，#58H0456)
三羟基甲基氨基甲烷(TRIS BASE)
Tween20(Sigma)
羊抗人Fc(Sigma，I-2136，#89H4871)
TR-7：Fc(如上述)
生物素化的TRAIL(AM100200-Peprotech)
HRP-链亲和素(载体，#L0328)
TMB过氧化酶微孔底物系统(KPL，Kirkegaard&Perry实验室
公司)
H2SO4(Fisher)
96孔稀释平板(Costar)
II.缓冲液
包被缓冲液(1×PBS)
封闭缓冲液(于PBS中3％BSA)
通用稀释剂(于PBST中1％BSA)
洗涤缓冲液(0.1％Tween20和1×PBS)
III.方法
将羊抗人Fc在包被缓冲液中稀释为0.1μg/ml。将Immulon 4微平板用100μl/孔的羊抗人Fc溶液包被，并在4℃孵育过夜。从平板中轻轻倒出包被溶液，并以200μl/孔加入封闭溶液。将平板在室温孵育1小时。孵育1小时后，从平板中轻轻倒出封闭溶液，并以100μl/孔加入1μg/mL的TR7-Fc，在室温孵育2小时。孵育后，将平板用Wheaton manifold人工洗涤5次。
相当于本发明scFvs的抗体在低结合稀释平板中使用稀释剂(预先)制备。制备两份该抗体并针对随后的7个孔从原液浓度以2.5倍稀释。如果获得纯化形式的抗体，起始浓度为5μg/mL。将阳性对照(TR7-Fc)从5μg/mL稀释。将100μl移至ELISA平板中，并在室温预孵育30分钟。向100μL上清中加入20μl的5μg/mL生物素化的TRAIL并混合。将组合的120μl溶液在室温孵育2小时。
孵育2小时后，重复洗涤循环并将平板轻轻倒出及印迹。将HRP-链亲和素以1∶2000稀释并加入100μl/孔。在室温孵育1小时。同时，组合等量的TMB过氧化酶底物和过氧化酶溶液B，将溶液在室温下平衡。
孵育1小时后，轻轻倒空平板并用PBST洗涤5次及印迹。组合TMB过氧化酶底物和过氧化酶溶液B，并在每个孔中加入100μl。在室温生色15分钟。向每个孔中加入50μl的1M H2SO4中止生色。使用得自Molecular Devices的分光计在450nm立即读数平板。
然后测定IC-50，即引起平台结合抑制50％的纯化的抗体浓度。为进行对比，在该分析中使用TR7多肽作为样品。
使用上述分析示出包含CM005G08的VH和VL结构域的完整IgGl抗体强烈抑制生物素化的TRAIL与TR7结合，表明CM005G08和TRAIL竞争结合TR7。两组CM005G08的IC-50值为5.30和6.89nM，对比之下，TRAIL的IC-50值为1.77nM。IC-50值的不同反映了CM005G08与TRAIL相比对TR7具有较低结合亲和性的事实。
实施例3：分析抗TRAIL-TR7抗体诱导凋亡的能力
一般方法：
测试抗TR7抗体单独或者组合环己酰亚胺，化疗剂或交联剂诱导TR7表达细胞凋亡的能力。简而言之，测试抗体诱导TR7介导的TR7表达细胞系，SW480，MDA-MB-231和Colo205凋亡的活性。不表达TR7的细胞系用作阴性对照。
为诱导凋亡，将MDA-MB-231，SW480或Colo205细胞用指定浓度的本发明单克隆抗体或人对照抗体孵育。在分析前一天，将细胞(1.5×105个MDA-MB-231细胞/ml；4×105个SW480个细胞/ml或者4×105个Colo205个细胞/ml；100μl/孔)种植于96孔平板的孔中并使其贴壁过夜。第二天，在有或无环己酰亚胺(1.0-2.0μg/ml，Sigma R75010-7)情况下加入测试抗体。在一些实验中，将抗TR7单克隆抗体的效力与rhuTRAIL-FLAG蛋白(Alexis Biochemicals)或在HGS中产生的非标签的可溶rhuTRAIL对比。在存在2μg/ml抗FLAG增强子抗体的情况下以指定浓度使用rhuTRAIL-FLAG。二级交联的作用通过测定单克隆抗体单独或者存在二级羊抗人IgFc特异性抗体(SIGMA)情况下杀死细胞的能力而确定。二级交联抗体以与测试的单克隆抗体相同浓度加入细胞中。
用MDA-MB-231或SW480的分析在37℃进行16-18小时，之后使用试剂Alamar Blue(Biosource，cat.#DAL1100)显示存活，使用厂商建议的条件。Alamar Blue荧光使用CytoFluor荧光读数器在530nm激发和590nm发射下检测。结果以与未用抗体处理的细胞对比的存活百分率表示。用Colo205的分析在37℃进行48小时，之后使用生色试剂CellTiter96_Aqueous One Solution(Promega，cat.#G3581)显示存活，使用厂商建议的条件。使用96孔SPECTRAmax Plus384Molecular Devices平板读数器(或等价物)在490nm检测吸光度。
可以在这个分析中使用(及用于结合本发明抗体的治疗方案中)的其它化疗剂包括例如5-氟尿嘧啶，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，紫杉醇，顺铂，Cytabarine(Cytosar)，IFN-γ，喜树碱，irinotecan(camptosar，CPT-11)，阿霉素，氨甲蝶呤，paraplatinin，α-干扰素，β-干扰素，太平洋紫杉醇，docetaxel，NF-κ-B抑制剂SN50，及gemcitabine(GemzarTM)。可以在这个分析中可以使用的其它细胞系包括例如人纤维肉瘤细胞系HT-1080，人宫颈癌细胞系ME-180和HeLa，人恶性黑素瘤细胞系RPMI-7951，SK-MEL-1和G361；人成人T细胞白血病细胞系Jurkat，人子宫癌细胞系SK-UT-1和RL-95，人肺癌细胞系SK-MES-1，人结肠癌细胞系，LS174T，HT29和HCT116，su.86.86和CFPAC胰腺癌细胞系，人卵巢癌细胞系TOV21G，及人肝细胞癌细胞系HepG2和SNU449及人成神经细胞瘤细胞系SK-N-SH。相当于这些癌细胞衍生自其中的组织的组织癌症可以用本发明的治疗组合物治疗。
抗TR7抗体分析
使用上述分析，对已经转变为整个IgG1分子的本发明的一些scFvs测试其诱导TR7表达细胞凋亡的能力。在上述分析中测试相当于scFvs CM083C12，CM014C10，CM088F10，CM084G02，CM084A02，CM005G08和CM059H03的IgG1抗体。不相关特异性的人IgG1抗体用作阴性对照，TRAIL用作阳性对照。
CM005G08，CM084A02和CM084G02的IgG1形式在存在1μg/ml环己酰亚胺的情况下诱导人结肠癌细胞系SW480和人乳腺癌细胞系MDA-MB231凋亡。在没有环己酰亚胺的情况下，在这个分析中观测到抗TR7抗体或TRAIL很少或不杀死MDA-MB231或SW480细胞，除了TRAIL在没有环己酰亚胺的情况下能杀死MDA-MBA231细胞之外。针对人结肠癌细胞系Colo205，测试的抗TR7抗体，CM005G08，CM084A02和CM059H03在没有环己酰亚胺和额外的交联剂的情况下诱导凋亡。TRAIL还在Colo205细胞系中诱导凋亡(见图1A-1D，数据未示出)。抗TR7抗体降低测试细胞存活的能力通过加入交联剂而增强(数据未示出)。
另外，这个实施例中描述的分析还可用于测试一种以上抗TRAIL受体抗体对TRAIL受体表达细胞的作用。例如，细胞可以用特异性结合TR4的抗体和特异性结合TR7的抗体处理。如上所述，可以在有或无一或多种化疗剂或交联剂的情况下进行实验。在另一种变化的实验中，可以测试本发明的抗体当在存在TRAIL的情况下使用时诱导凋亡的能力。与单独用抗TR4或抗TR7处理相比，用抗TR4和抗TR7双重处理诱导的凋亡的数量更多。当在存在化疗剂和/或交联剂的情况下进行实验时，这种作用更明显。
实施例4：鉴别及克隆VH和VL结构域
从表达特殊抗体的细胞系中鉴别和克隆VH和VL结构域的一种方法是使用VH和VL特异性引物对从抗体表达细胞中产生的cDNA进行PCR。简而言之，从所述细胞系中分离RNA，并用作RT-PCR的模板，所述RT-PCR设计为扩增EBV细胞系表达的抗体的VH和VL结构域。细胞可以在TRIzol_试剂(Life Technologies，Rockville，MD)中裂解，并用1/5体积的氯仿提取。在加入氯仿后，将溶液在室温孵育10分钟，然后在4℃在桌面离心器中以14000rpm离心15分钟。收集上清，使用等体积的异丙醇沉淀RNA。沉淀的RNA通过在4℃在桌面离心器中以14000rpm离心15分钟而沉淀。在离心后，弃去上清并用75％乙醇洗涤。在洗涤后，将RNA在4℃在800rpm再离心5分钟。弃去上清并将沉淀在空气中干燥。将RNA溶解于DEPC水中，并在60℃加热10分钟。使用光密度测定可以确定RNA的数量。
根据本领域熟知的方法，可以从1.5-2.5μg RNA中合成cDNA，使用逆转录酶和随机六聚体引物。然后将cDNA用作扩增VH和VL结构域的PCR模板。用于扩增VH和VL基因的引物示于表6。典型地，PCR反应使用一个5’引物和一个3’引物。有时当可利用的RNA模板数量有限，或者为达到更高效力时，可以使用5’和/或3’引物组。例如，有时在一个PCR反应中，使用所有5个VH-5’引物和所有JH3，引物。PCR反应在50μl体积中进行，所述体积中含有1×PCR缓冲液，2mM的每种dNTP，0.7单位的高保真Taq聚合酶，5’引物混合物，3’引物混合物和7.5μl的cDNA。VH和VL的5’和3’引物混合物可以通过集合分别为22pmol和28pmol的各个引物而产生。PCR条件是：96℃5分钟；随后进行25次94℃1分钟，50℃1分钟及72℃1分钟循环；接着进行一次72℃10分钟的延伸循环。在反应完成后，将样品管贮存于4℃。
表6：用于扩增VH和VL结构域的引物序列
引物名称 SEQ ID NO 引物序列(5’-3’)
VH引物
Hu VH1-5’ 6 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
Hu VH2-5’ 7 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG
Hu VH3-5’ 8 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
Hu VH4-5’ 9 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG
Hu VH5-5’ 10 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC
Hu VH6-5’ 11 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG
Hu JH1，2-5’ 12 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC
Hu JH3-5’ 13 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC
Hu JH4，5-5’ 14 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC
Hu JH6-5’ 15 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC
VL引物
Hu Vkappa1-5’ 16 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
Hu Vkappa2a-5’ 17 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC
Hu Vkappa2b-5’ 18 GATATTGTGATGACTCAGTCTCC
Hu Vkappa3-5’ 19 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC
Hu Vkappa4-5’ 20 GACATCGTGATGACCCAGTCTCC
Hu Vkappa5-5’ 21 GAAACGACACTCACGCAGTCTCC
Hu Vkappa6-5’ 22 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC
Hu Vlambda1-5’ 23 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC
Hu Vlambda2-5’ 24 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC
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Hu Vlambda4-5’ 27 CACGTTATACTGACTCAACCGCC
Hu Vlambda5-5’ 28 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC
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Hu Jkappa1-3’ 30 ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC
Hu Jkappa2-3’ 31 ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC
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Hu Jlambda3b-3’ 38 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC
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Hu Jlambda5-3’ 40 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC
Hu Jlambda6-3’ 41 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
然后将PCR样品在1.3％琼脂糖凝胶上电泳。可以从凝胶中切下预期大小的(针对VH结构域为大约506bp，针对VL结构域为大约344bp)DNA条带，并使用本领域熟知的方法纯化。纯化的PCR产物可以连接于PCR克隆载体(TA载体，来自Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。在大肠杆菌转染及蓝/白筛后，可以分离各个克隆的PCR产物。克隆的PCR产物然后使用本领域熟知的方法测序。
实施例5：抗TR7抗体在裸鼠中阻止肿瘤细胞生长
将9周龄的雌性无胸腺小鼠(Balb/c nu/nu小鼠，体重20-25g，购自Taconic，Germantown，NY)在第0天，在侧腹部皮下注射对数期生长的107个Colo 205(结肠直肠腺癌，ATCC No.CCL-222)肿瘤细胞。使肿瘤生长5天，之后用抗体处理，此时肿瘤大小为大约100mm3。
将小鼠用包含来自CM005G08(抗TR7抗体，见表1)或T1014G03(抗TR4抗体，见例如美国申请No 60/341237所述，在此以其全文并入参考)的VH和VL结构域的抗体处理，或者用CM005G08和T1014G03这两种抗体处理，或者只用PBS稀释剂处理。在这个实施例及以下的实施例6和8中，包含来自CM005G08或T1014G03的VH和VL结构域的抗体分别称为CM005G08或T1014G03。抗体处理如下：荷载剂量0.4mg(20mg/kg)，注射肿瘤细胞后6天开始静脉内注射，两次维持剂量0.2mg(10mg/kg)，静脉内注射，间隔一周给予。在第11，14，18，21和25天测定肿瘤大小。使用测径器一式三份在2个轴测定肿瘤直径，使用公式(宽度2×长度)/2计算肿瘤体积。只用T1014G03处理的小鼠与对照PBS处理组在第14天相比，肿瘤体积明显较小。用CM005G08或CM005G08和T1014G03处理的小鼠在第18天无明显的肿瘤(数据未示出)。
上述分析也可以用于测试一或多种抗TRAIL受体抗体与化疗剂组合的治疗作用。可以用于这个分析(及用于联合本发明抗体的治疗方案)的化疗剂包括例如5-氟尿嘧啶，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，紫杉醇，顺铂，Cytabarine(Cytosar)，IFN-γ，喜树碱，irinotecan(camptosar，CPT-11)，阿霉素，氨甲蝶呤，paraplatinin，α-干扰素，太平洋紫杉醇，docetaxel，NF-κ-B抑制剂SN50，及gemcitabine(GemzarTM)。可用于这个分析的其它细胞系包括例如人结肠癌细胞系SW480，LS174T和HCT116；人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(见实施例8)；人宫颈癌细胞系Hela；人肺癌细胞系SK-MES-1；CFPAC，HPAF-II，MPANC-96和su.86.86和胰腺癌细胞系；人肝细胞癌细胞系SNU449，Hep3B2.1-7和HepG2；及人卵巢癌细胞系OV90，Caov-3，TOV21G和SKOV3。相当于这些癌细胞衍生的组织的组织癌症可以用本发明的治疗组合物治疗。
在该实验的另一种变化中，本发明的抗体可以与TRAIL组合施用。这种组合治疗与用单独抗体治疗相比抑制肿瘤细胞生长的能力可以使用上述方法分析，并将得自组合治疗的结果与得自用抗TR4，抗TR7或抗TR4和抗TR7治疗的结果进行对比。
实施例6：抗TR7抗体在裸鼠中阻止肿瘤细胞生长
将SW480(结肠直肠腺癌)肿瘤细胞系在体外保持在Leibovitz’sL-15培养基中，所述培养基中补加了胎牛血清，谷氨酰胺和抗生素，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)的指导。3-10代的细胞用于体内研究。从T-150培养瓶中收获肿瘤细胞，用无菌PBS漂洗，然后以5×104个细胞/μl的密度重悬于无菌盐水中。
将SW480肿瘤细胞皮下种植于雄性Swiss无胸腺小鼠(6-8周龄，体重20-25g，购自Taconic，Germantown，NY)的上背部或侧部，密度为107个细胞/位点，每只动物2个位点。在预防性(de novo)肿瘤模型中，在接种肿瘤细胞后24小时开始进行化疗剂和抗体处理。
T1014G03，CM005G08或不相关特异性的IgGl对照抗体经腹膜内注射(i.p.)施用，剂量为在第1，3和5天10mg/kg，然后每周施用3次。所述抗体和对照处理的作用通过间隔3-4天用测径器在2个轴测定肿瘤大小而评估。
与对照IgG1治疗相比，T1014G03和CM005G08治疗均明显降低肿瘤形成(见图2)。
上述分析也可以用于测试一或多种抗TR7和/或TR4抗体在体内对肿瘤细胞生长的治疗作用。例如，对已经注射肿瘤细胞的动物可以用特异结合TR4的抗体和特异结合TR7的抗体处理。如上所述，这个实验可以在有或无一或多种化疗剂的情况下进行。在该实验的另一种变化中，本发明的抗体可以与TRAIL组合施用。这种组合治疗抑制肿瘤细胞生长的能力与单独用抗体处理的对比，可以使用上述方法加以分析，并对比组合治疗与单独用抗TR4或抗TR7抗体处理的结果。
实施例7：抗TR7抗体对人肝细胞的作用
以下方案是本发明抗TR7抗体怎样对人原代肝细胞的存活起作用的示例，例如通过测定caspase激活或细胞存活进行。
将人肝细胞用15.6，62.5，250或1000ng/ml的TRAIL(氨基酸残基114-281，Biomol Research Laboratories公司，Plymouth Meeting，PA)，62.5，125，250或1000ng/ml的同种型对照mAb(hIgG1，CAT002)，或者62.5，125，250或1000ng/ml抗TR7抗体处理。在处理6小时后测定caspase激活，在处理24小时后测定存活。
Caspase活性利用caspase底物罗丹明缀合的DEVD使用荧光分析测定(例如得自Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)的同源荧光caspase分析)。细胞存活使用ALAMAR BlueTM分析(Biosource International，Camarillo，CA)测定。
实施例8：抗TR7抗体对MDA-MB-231乳腺癌模型的作用
MDA-MB-231细胞系是一种表达TR7的人乳腺癌细胞系。基于这个发现，选择无胸腺小鼠中MDA-MB-231模型以测试CM005G08(IgG1形式)在体内对降低预先存在的肿瘤体积的作用。
这个实验的目的是检测当单一使用CM005G08时，其是否能以剂量依赖的形式改变无胸腺小鼠中预先建立的MDA-MB-231肿瘤的生长模式。为评估CM005G08对MDA-MB-321肿瘤的作用，在多种浓度单独测试CM005G08，与阴性对照抗体(CAT002)进行对比。将Swiss裸鼠分为6组，每组10只小鼠。在第0天，将小鼠在右侧乳房下方部位(腹股沟部位)皮下注射(SC)1×106 MDA-MB-231细胞。在第6，11，16和21天，将二组小鼠静脉内(IV)施用阴性对照抗体(CAT002)，剂量为10或0.1mg/kg，四组静脉内施用CM005G08，剂量为10，5，1和0.1mg/kg。一周测定两次肿瘤体积，直至在接种肿瘤后第46天。
CM005G08从1.0至10mg/kg剂量以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长。在全部46天的时期分析肿瘤生长示出与两组阴性对照抗体组相比，在小鼠中施用10，5和1mg/kg的CM005G08均高度明显延迟肿瘤进展。在实验结束的第46天分析肿瘤体积，示出用10和5mg/kg的CM005G08处理的小鼠与10mg/kg的阴性对照组相比，肿瘤体积明显减小(分别为p＝0.0025，和p＝0.0036)。在这个实验中施用0.1mg/kg CM005G08的小鼠未示出任何有益作用。这些数据提示单独的CM005G08能以剂量依赖性形式有效延迟肿瘤生长。
应了解本发明可以用与前述描述和实施例不同的方式进行。因此根据上述教导对本发明进行的各种修改和变化均在所附权利要求的范围内。
在本发明背景，详细描述和实施例中引用的文献(包括专利，专利申请，杂志文章，摘要，实验指导，书籍或其它参考文献)的全部内容在此均并入参考。
另外，本文提交了的序列表均以其全文并入参考。
以下美国专利申请的全部内容(包括说明书，序列表和附图)在此以其全文并入参考：美国临时申请No.60/341237，2001年12月20日申请；No.60/369877，2002年4月5日申请；No.60/384828，2002年6月4日申请；No.60/396591，2002年7月18日申请；No.60/403370，2002年8月15日申请；No.60/425737，2002年11月13日申请。
序列表
<110>人体基因组科学有限公司
<120>免疫特异性结合TRAIL受体的抗体
<130>PF585PCT
<140>Unassigned
<141>2002-12-19
<150>60/341,237
<151>2001-12-20
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20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Leu Arg Gly Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
130 135 140
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
145 150 155 160
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
165 170 175
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser
210 215 220
Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Ser Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala
130 135 140
Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn
145 150 155 160
Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala
165 170 175
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile
195 200 205
Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp
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Val Leu Gly
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Asn Asn
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Ile Pro Lys Phe Gly Thr Thr Asn His Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Asp Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Tyr Cys Gly Gly Gly Arg Cys Tyr Leu Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala
130 135 140
Val Val Ile Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val
145 150 155 160
Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr
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Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile
180 185 190
Tyr Asp Thr Ser Asn Lys Arg Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro
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Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Val Ser Tyr Ser Gly Ser Leu
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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
245 250
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<212>PRT
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Gly Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Ala Leu Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu
130 135 140
Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ala Arg Asn Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala
165 170 175
Pro Thr Ile Val Ile Tyr Glu Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro
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Gly Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu
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Thr Ile Ser Gly Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
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Ser Tyr Asn Tyr Asn Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
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Val Leu Gly
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<212>PRT
<213>Artificial sequence
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Lys Thr Asn Tyr Val Gln Glu Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asn Asn Tyr Arg Phe Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Glu Thr Thr Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser
180 185 190
Arg Ala Ile Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val
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Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly
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Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
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gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggt gtggaacggc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag cacaggatat 180
gcagactctg tgaagggccg agtcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaatcctg 300
ggtgccggac ggggctggta cttcgatctc tgggggaagg ggaccacggt caccgtctcg 360
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agcctcagaa gctattatgc aagctggtac cagcagaagc caggacaggc ccctgtactt 540
gtcatctatg gtaaaaacaa ccggccctca gggatcccag accgattctc tggctccagc 600
tcaggaaaca cagcttcctt gaccatcact ggggctcagg cggaagatga ggctgactat 660
tactgtaact cccgggacag cagtggtaac catgtggtat tcggcggagg gaccaagctg 720
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gaggtgcagc tggtggagac cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct atcactgtgc gagagggggt 300
tatagcagca gccggtccgc tgcttatgat atctggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360
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cttgtcatct atggtaaaaa caaccggccc tcagggatcc cagaccgatt ctctggctcc 600
agctcaggaa acacagcttc cttgaccatc actggggctc aggcggaaga tgaggctgac 660
tattactgta actcccggga cagcagtggt aaccatgtgg tattcggcgg agggaccaag 720
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caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaagatt 60
tcctgcgagg gttctggata caccttcaat agttacactc tccattggtt gcgccaggcc 120
cccggacaga ggcttgagtg gatgggacgg atcaacgctg gcaatggtaa cacaaaatat 180
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atggagttga gcagcctgag atctgaagac acgggtgttt attactgtgc gagggtcttc 300
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aaactcatct tgtatagcaa taatcagcgg ccctcagggg tccctgaccg attctctggc 600
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caggtccagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt cctgacgcca tgcactgggt ccgccaggct 120
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gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attcccagaa tacactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag atctgatgac acggctgtct attactgtgc gagagccccc 300
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cctgtccttg tcaactatcc taaagacagt cggccctcgg ggatcccaga ccgattttct 600
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ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagggatttt 300
tctggctacg gtgactactt ggactactgg ggcaagggca ccctggtcac cgtctcgagt 360
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gcccccaaac tcatgattta tgaagtcaat gagcggccct caggggtccc tgatcgcttc 600
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caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact acccatgcta tgcattgggt gcgccaggcc 120
cccggacaaa gccttgagtg gatgggatgg atcaacactg gcaatggtaa cacaaaatat 180
tcacagagtt tccagggcag agtcagcatt accagagaca catccgcgaa cacagcctac 240
atggaattga gcagccttaa atctgaagac acggctatgt attactgtgc gagggctagt 300
cgtgatagta gtggttatta ctacgttccc cccggcgatt tttttgatat ctggggccaa 360
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ggcggaagtg cacagtctgc cctgactcag cctgcctccg tgtctgggtc tcctggacag 480
tcgatcacca tctcctgcac tggaagcaga agtgacattg gtggttataa ctttgtctcc 540
tggtaccaac aacacccagg caaagccccc aaactcctga tctatgatgt ctataatcgg 600
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atctctggcc tccagtctga ggacgacgct gattattact gcagttcata tgcaggctac 720
cacacctgga ttttcggcgg ggggaccaag gtcaccgtcc taggt 765
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gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaactt 60
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cctggacaag ggcctgagtg gatgggaatg atcaacccta gtggtggtac tacaaagaac 180
agacagaagt tccaggacag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag aacagtctat 240
atggagttga gtggtctgac atctgaagac acggccgtct attactgtgc gaccgacttt 300
aaggggaccg atattctctt ccgggactgg ggccggggca ccctggtcac cgtctcgagt 360
ggaggcggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gaagtgcaca gtctgtgttg 420
acgcagccgc cctccgcgtc tgggaccccc gggcagaggg tctccatctc ttgttctggc 480
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cccaaactcc tcatgtatag taatgatcgc cggccctcag gggtccctga ccgattctct 600
ggctccaagt ctggcacctc agcctccctg gccatcagtg ggctccagtc tgaggatgag 660
gctgattatt actgtgcaac atgggatgac agcctgaatg gccattatgt cttcggaact 720
gggaccaagc tgaccgtcct aggt 744
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cagatgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc aagaggagga 300
tccacttttg atatctgggg ccgggggaca atggtcaccg tctcgagtgg aggcggcggt 360
tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga agtgcacagc ctgtgctgac tcagccaccc 420
tcagcgtctg ggacccccgg gcagagggtc accatctctt gttctggaag caactccaac 480
atcggaagca ggcctgtaaa ttggtaccag cagctcccag gaacggcccc caaactcctc 540
attcaaggta acaatcagcg gccctcaggg gtccctgacc gattctctgg ctccaagtct 600
ggcacctcag cctccctggc catcagtggg ctccagtctg aggatgaggc tgattattac 660
tgtgcagctt gggatgacag cctgactggt tatgtcttcg gacctgggac caagctgacc 720
gtcctaggt 729
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cagatgcagc tggtgcagtc tgggggagcc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cttctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtat taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaacgg 300
ttacggggcc tcgacccctg gggccagggg acaatggtca ccgtctcgag tggtggaggc 360
ggttcaggcg gaggtggcag cggcggtggc ggatcgtctg agctgactca ggaccctgct 420
gtgtctgtgg ccttgggaca gacagtcagg atcacatgcc aaggagacag cctcagaagc 480
tattatgcaa gctggtacca gcagaagcca ggacaggccc ctgtactcgt catctatggt 540
aaaaacaacc ggccctcagg gatcccagac cgattctctg gctccagctc aggaaacaca 600
gcttccttga ccatcactgg ggctcaggcg gaagatgagg ctgactatta ctgtaactcc 660
cgggacagca gtggtaacca tgtggtattc ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt 720
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<400>68
gaggtgcagc tggtggagac cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ccctattaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag tatatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccctat attactgtgc gagaggggca 300
tctggccctg actactgggg cagagggaca atggtcaccg tctcgagtgg aggcggcggt 360
tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga agtgcacagt ctgtgttgac gcagccgccc 420
tcagtgtctg cggccccagg acagaaggtc accatctcct gctctggaag cacctccaac 480
attgggaata attatgtatc ctggtaccag caggtcccag gaacagcccc caaactcctc 540
atttatgaca ataataagcg accctcaggg attcctgacc gattctctgg ctccaagtct 600
ggcacgtcag ccaccctggg catcaccggg ctccagactg gggacgaggc cgattattac 660
tgcggaacat gggatagtag cctgagtgct ctggtattcg gcggagggac caaggtcacc 720
gtcctaggt 729
<210>69
<211>759
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>DNA encoding CM089A03 scFv
<400>69
caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaccc ctgggtcctc ggtgaaagtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagg aacaacgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gccttgagtg gatgggaggg ttcatcccta agtttggaac aacaaaccac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatg accgcggacg actccacgaa cacagtctac 240
atggaactga gcagtctgag atctgaggac acggccgtgt attattgtgc gagggggggc 300
gcatattgtg gtggtggtag atgctatctt tacggtatgg acgtctgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcgagtgg aggcggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga 420
agtgcacagg ctgtggtgat ccaggagccc tcactgactg tgtccccagg agggacagtc 480
actctcacct gtggctccag cactggagct gtcaccagtg gtcattatcc ctactggttc 540
cagcagaagc ctggccaagc ccccaggaca ctgatttatg acacaagtaa taaacgctcc 600
tggacccctg cccggttctc aggctccctc cttgggggca aagctgccct gaccctttcg 660
ggtgcgcagc ctgaggatga ggctgaatat tactgcttgg tctcctatag tggttctctt 720
gtggtattcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggt 759
<210>70
<211>729
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>DNA encoding CM075A01 scFv
<400>70
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgt caaaggagct 300
tggcttgact actggggccg ggggacaatg gtcaccgtct cgagtggagg cggcggttca 360
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggaagt gcacttaatt ttatgctgac tcagccccac 420
tctgtgtcgg agtctccggg gaagacggta accatctcct gcaccggcag cagtggcagt 480
gttgccagaa actatgtgca gtggtaccaa cagcgcccgg gcagtgcccc caccattgtt 540
atttatgagg ataaccgaag accctctggg gtccctggtc ggttctctgg ctccatcgac 600
aggtcctcca attctgcctc cctcaccatc tcaggactgc agactgagga cgaggctgac 660
tactactgtc agtcttataa ttacaacact tgggtgttcg gcggagggac caagctgacc 720
gtcctaggt 729
<210>71
<211>741
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>DNA encoding CM059H03 scFv
<400>71
gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaggg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggaaa gacaaactat 180
gtacaggagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagtctac 240
atggagctga cgagcctgag atctgacgac acggccgtat attactgtgc gagacgggga 300
aacaactata ggttcggtta ttttgacttc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcg 360
agtggaggcg gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggaagtgc acttgaaacg 420
acactcacgc agtctccagg caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 480
tgcagggcca gtcagagtat tagtagcagt aacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 540
cgggctccca ggctcctcat ctatggtgcg tccagcaggg ccattggcat cccagacagg 600
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggaggctgaa 660
gattttgcag tgtattactg tcagcagtat ggtagctctc cgatcacctt cggccaaggg 720
acacgactgg agattaaacg t 741
<210>72
<211>281
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>72
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
85 90 95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
100 105 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
180 185 190
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
210 215 220
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
260 265 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
275 280
Claims (78)
1.一种分离的抗体或其片段，其包含与选自以下一组的第二种氨基酸序列至少95％相同的第一种氨基酸序列，所述的组由以下(a)和(b)组成：
(a)SEQ ID NO：42-56任一个的VHCDR1，VHCDR2或VHCDR3的氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO：42-56任一个的VLCDR1，VLCDR2或VLCDR3的氨基酸序列；
其中所述抗体或其片段免疫特异性结合TR7。
2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述第二种氨基酸序列由SEQ ID NO：42-56任一个的VHCDR3的氨基酸序列组成。
3.权利要求1的抗体或其片段，相对于其结合TR1、TR5、TR4和TR10的能力，其优先结合TR7。
4.权利要求1的抗体或其片段，其结合在细胞表面表达的TR7。
5.一种分离的抗体或其片段，其包含：
(a)与SEQ ID NO：42-56任一个的VH结构域至少90％相同的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：42-56任一个的VL结构域至少90％相同的氨基酸序列；或
(c)(a)和(b)；
其中所述抗体或其片段免疫特异性结合TR7。
6.权利要求5的抗体或其片段，其中所述VH结构域具有SEQ IDNO：42的VH结构域的氨基酸序列，所述VL结构域具有SEQ ID NO：42的VL结构域的氨基酸序列。
7.权利要求5的抗体或其片段，其中所述VH结构域具有SEQ IDNO：50的VH结构域的氨基酸序列，所述VL结构域具有SEQ ID NO：50的VL结构域的氨基酸序列。
8.权利要求5的抗体或其片段，其中所述VH结构域具有SEQ IDNO：56的VH结构域的氨基酸序列，所述VL结构域具有SEQ ID NO：56的VL结构域的氨基酸序列。
9.权利要求5的抗体或其片段，相对于其结合TR1、TR5、TR4和TR10的能力，其优先结合TR7。
10.权利要求5的抗体或其片段，其结合在细胞表面表达的TR7。
11.权利要求5的抗体或其片段，其包含：
(a)SEQ ID NO：42-56任一个的VH结构域的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：42-56任一个的VL结构域的氨基酸序列；或
(c)(a)和(b)；
其中所述抗体或其片段免疫特异性结合TR7。
12.权利要求11的抗体或其片段，其中所述VH结构域具有SEQID NO：42的VH结构域的氨基酸序列，所述VL结构域具有SEQ IDNO：42的VL结构域的氨基酸序列。
13.权利要求11的抗体或其片段，其中所述VH结构域具有SEQID NO：50的VH结构域的氨基酸序列，所述VL结构域具有SEQ IDNO：50的VL结构域的氨基酸序列。
14.权利要求11的抗体或其片段，其中所述VH结构域具有SEQID NO：56的VH结构域的氨基酸序列，所述VL结构域具有SEQ IDNO：56的VL结构域的氨基酸序列。
15.权利要求11的抗体或其片段，相对于其结合TR1、TR4、TR5和TR10的能力，其优先结合TR7。
16.权利要求11的抗体或其片段，其结合在细胞表面表达的TR7。
17.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段选自以下一组：
(a)完整免疫球蛋白分子；
(b)scFv；
(c)单克隆抗体；
(d)人抗体；
(e)嵌合抗体；
(f)人源化抗体；
(g)Fab片段；
(h)Fab’片段；
(i)F(ab’)2；
(j)FV；和
(k)二硫键连接的Fv。
18.权利要求5的抗体或其片段，其包含选自以下一组的一个重链免疫球蛋白恒定结构域：
(a)人IgM恒定结构域；
(b)人IgG1恒定结构域；
(c)人IgG2恒定结构域；
(d)人IgG3恒定结构域；
(e)人IgG4恒定结构域；和
(f)人IgA恒定结构域。
19.权利要求5的抗体或其片段，其包含选自以下一组的一个轻链免疫球蛋白恒定结构域：
(a)人Igκ恒定结构域；和
(b)人Igλ恒定结构域。
20.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的解离常数(KD)选自以下一组：
(a)在10-7M(包含)和10-8M之间的解离常数(KD)；和
(b)在10-8M(包含)和10-9M之间的解离常数(KD)。
21.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的解离常数(KD)小于或等于10-9M。
22.权利要求21的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的KD在10-9M(包含)和10-10M之间。
23.权利要求21的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的KD在10-10M(包含)和10-11M之间。
24.权利要求21的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的KD在10-11M(包含)和10-12M之间。
25.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与一种可检测标记缀合。
26.权利要求25的抗体或其片段，其中所述可检测标记是一种放射标记。
27.权利要求26的抗体或其片段，其中所述放射标记是125I，131I，111In，90Y，99Tc，177Lu，166Ho，或153Sm。
28.权利要求25的抗体或其片段，其中所述可检测标记是一种酶，荧光标记，发光标记或生物发光标记。
29.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是生物素化的。
30.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段缀合于一种治疗剂或胞毒剂。
31.权利要求30的抗体或其片段，其中所述治疗剂或胞毒剂选自以下一组：
(a)抗代谢物；
(b)烷化剂；
(c)抗生素；
(d)生长因子；
(e)细胞因子；
(f)抗血管发生剂；
(g)抗有丝分裂剂；
(h)蒽环类；
(i)毒素；
(j)凋亡剂。
32.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段附着于一种固体支持物。
33.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段在Western印迹中免疫特异性结合TR7。
34.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段在ELISA中免疫特异性结合TR7。
35.一种分离的细胞，其产生权利要求11的抗体或其片段。
36.权利要求5的抗体或其片段，其不抑制TRAIL与TR7结合的能力。
37.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是TR7的一种激动剂。
38.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段刺激TR7表达细胞凋亡。
39.权利要求38的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段刺激TR7表达细胞的凋亡比等浓度的TRAIL多肽刺激的TR7表达细胞的凋亡更好。
40.权利要求38的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段刺激TR7表达细胞凋亡在有或无抗体交联剂的情况下一样好。
41.权利要求38的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段不是肝毒性的。
42.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段上调TRAIL受体表达。
43.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段抑制TRAIL与TR7结合。
44.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是TR7的拮抗剂。
45.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段抑制TR7表达细胞的凋亡。
46.权利要求5的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段下调TRAIL受体表达。
47.一种抗体或其片段，其与权利要求11的抗体或其片段结合TR7多肽上的相同表位。
48.一种抗体或其片段，其与权利要求12的抗体或其片段结合TR7多肽上的相同表位。
49.一种抗体或其片段，其与权利要求13的抗体或其片段结合TR7多肽上的相同表位。
50.一种抗体或其片段，其与权利要求14的抗体或其片段结合TR7多肽上的相同表位。
51.权利要求5的抗体或其片段，其在一种药物学可接受的载体中。
52.一种治疗、预防或改善癌症的方法，包括为动物施用权利要求5的抗体或其片段或者含有所述抗体或其片段的组合物。
53.权利要求52的方法，其中所述动物是人。
54.权利要求52的方法，其中所述癌症是结肠癌。
55.权利要求52的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
56.权利要求52的方法，其中所述癌症是子宫癌。
57.权利要求52的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
58.权利要求52的方法，其中所述癌症是肺癌。
59.权利要求52的方法，其中所述癌症是胃肠道癌。
60.权利要求52的方法，其中所述癌症是Kaposi肉瘤。
61.权利要求52的方法，其中所述癌症是中枢神经系统癌症。
62.权利要求61的方法，其中所述中枢神经系统癌症是成神经管细胞瘤。
63.权利要求61的方法，其中所述中枢神经系统癌症是成神经细胞瘤。
64.权利要求61的方法，其中所述中枢神经系统癌症是成胶质细胞瘤。
65.权利要求52的方法，其中所述抗体或其片段与一种化疗剂组合施用。
66.权利要求65的方法，其中所述化疗剂选自以下一组：
(a)irinotecan；
(b)paclitaxel(TAXOL)_；和
(c)gemcitabine。
67.一种治疗、预防或改善选自以下一组疾病或紊乱的方法：
(a)移植物抗宿主疾病(GVHD)；
(b)AIDS；和
(c)神经退行性疾病；
所述方法包括为动物施用权利要求5的抗体或其片段或者含有所述抗体或其一部分的组合物。
68.权利要求67的方法，其中所述动物是人。
69.一种抑制TR7表达细胞生长或杀死TR7表达细胞的方法，包括为需要这种抑制TR7受体表达细胞生长或杀死TR7受体表达细胞的动物施用权利要求5的抗体或其片段或者含有所述抗体或其片段的组合物，施用量为有效抑制TR7表达细胞生长或杀死TR7受体表达细胞的量。
70.一种检测TR7多肽表达的方法，包括：
(a)使用权利要求5的抗体或其片段分析来自个体的生物学样品中TR7多肽的表达；
(b)将TR7多肽的水平与TRAIL受体多肽的标准水平相对比。
71.一种检测、诊断、预后或监测癌症或其它过度增殖性紊乱的方法，包括：
(a)使用权利要求5的抗体或其片段分析来自个体的生物学样品中TR7多肽的表达；
(b)将TR7多肽的水平与TR7多肽的标准水平相对比。
72.一种试剂盒，其包含权利要求5的抗体或其片段。
73.权利要求72的试剂盒，其包含一种对照抗体。
74.权利要求72的试剂盒，其中所述抗体或其片段偶联或缀合于一种可检测标记。
75.由ATCC保藏物PTA-4178的细胞系表达的抗体。
76.由ATCC保藏物PTA-4539的细胞系表达的抗体。
77.由ATCC保藏物PTA-4376的细胞系表达的抗体。
78.由ATCC保藏物PTA-4547的细胞系表达的抗体。
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