CN102066403B - 抗人死亡受体dr5单克隆抗体ad5-10所识别的抗原决定簇、其衍生物及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了抗人死亡受体DR5单克隆抗体AD5-10所识别的抗原决定簇、其衍生物及其用途。该抗原决定簇具有氨基酸序列：LITQQDLAPQQRA，其中核心多肽为QDLAP。含有该抗原决定簇的多肽与单克隆抗体AD5-10结合后可激活DR5下游的信号通路，引起细胞凋亡。该抗原决定簇及其衍生物可用于筛选和制备抗人DR5激动性抗体、与DR5结合的小分子化合物以及DR5疫苗。它们的核苷酸编码序列可用于制备用于肿瘤和/或艾滋病等疾病的治疗和预防的反义核苷酸和小分子核糖核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过多肽芯片(peptide array)技术鉴定得到的一段核心多肽序列，该序列同人肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(tumornecrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的受体5(deathreceptor 5，DR5)的N末端第4至第16位氨基酸残基具有高度同源性，是AD-10(中国专利号：ZL02104519.4)所识别的抗原决定簇。本发明并涉及该多肽及其衍生物在研制激动性抗人DR5单克隆抗体、与DR5结合的小分子化合物、预防性疫苗或者治疗性疫苗中的用途。最后，本发明还涉及该多肽及其衍生物的反义核苷酸和小分子核糖核苷酸在肿瘤和/或艾滋病等相关疾病的治疗和预防中的用途。
背景技术
死亡受体(death receptor)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因超家族的成员，其结构特点是具有富含半胱氨酸的胞外结构域(extracellular domain，ECD)和胞内死亡结构域(death domain，DD)。肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand，TRAIL)是死亡受体DR4和DR5的天然配体，其与死亡受体结合后可以激活细胞凋亡的死亡受体途径和线粒体途径，从而诱导细胞发生死亡。TRAIL对多种肿瘤具有杀伤活性，而对大多数正常细胞没有毒副作用。此外，感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)的T淋巴细胞对TRAIL及其受体介导的细胞毒作用敏感性增加。这些研究结果表明TRAIL及其受体在癌症和艾滋病的治疗方面具有诱人的前景。
至今发现TRAIL有5种天然受体，分别是DR4(死亡受体4，TRAIL-R1)、DR5(死亡受体5，TRAIL-R2)、DcR1(诱骗受体1，TRID，TRAIL-R3)、DcR2(诱骗受体2，TRUNDD，TRAIL-R4)和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)。其中DR4和DR5由于含有完整的胞外区和胞内区结构域，因此可以传递TRAIL介导的细胞凋亡信号；而诱骗受体DcR1和DcR2缺少胞内区或者胞内区结构域不完整，因而不能传递TRAIL介导的细胞凋亡信号；OPG是分泌型受体，具有抑制破骨细胞和增加骨密度的作用，在转基因小鼠中表达能使脾肿大，它能抑制TRAIL和死亡受体结合而调节TRAIL诱导的细胞凋亡，因此，OPG是TRAIL可溶性的“诱骗”受体。总而言之，诱骗受体都可以通过与DR4和DR5竞争性结合TRAIL，阻断TRAIL诱导的细胞凋亡。
研究发现，在人正常组织和肿瘤组织中均有死亡受体DR4和DR5的表达，在肿瘤组织中往往表达较高。诱骗受体DcR1多表达于人正常组织(其转录本存在于外周血淋巴细胞、脾、肺、胎盘、骨骼组织、前列腺、胸腺、睾丸、大肠、小肠和卵巢中)，在外周血淋巴细胞与脾脏中表达较高，但在肿瘤细胞和转化细胞中不表达或极低水平表达；DcR2在许多正常组织中均有表达，在胎肝组织和成人睾丸组织表达较高，提示DcR2对这些部位可能有保护作用。DcR2在绝大多数肿瘤细胞中不表达。
正是由于死亡受体在正常组织和肿瘤组织分布的不对称性，使TRAIL能杀伤许多肿瘤细胞，而对大多数正常细胞没有毒性，因此，使用TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到特异性治疗肿瘤的目的是当今生物医学领域的一大热点。然而随着研究的不断深入，人们发现一些肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡具有抵抗作用，但抗死亡受体的特异性、激动性抗体则更加特异、安全，为肿瘤的治疗带来了新的希望。
研究表明，抗DR4或DR5的单克隆抗体对肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，但对正常细胞没有毒性。目前文献报道的各种针对DR4或DR5的单克隆抗体或单链抗体，其识别的抗原决定簇多与DR4或DR5分子上的TRAIL结合位点重合或部分重合，因此，这些单克隆抗体大都能与TRAIL竞争性地结合死亡受体DR4或DR5。
根据文献报道，DR5分子的胞外区有2个TRAIL的结合位点(高亲和力结合位点和低亲和力结合位点)，分别位于2个富含半胱氨酸的结构域内(CRD1和CRD2)。中国专利ZL02104519.4中所公开的单克隆抗体AD-10虽也针对DR5分子的胞外区，但其结合位点与文献已报道的单克隆抗体均不同，且AD-10与DR5的结合不影响TRAIL与DR5结合，因而AD-10和TRAIL在诱导肿瘤细胞凋亡时具有协同作用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一条多肽的氨基酸序列或称核心多肽序列QDLAP(SEQ ID No：1)及其衍生物，其与人死亡受体DR5胞外区N末端第8至12位氨基酸残基具有完全一致的氨基酸序列或其从所述的氨基酸序列N端到C末端依照DR5的氨基酸序列扩展，扩展后的氨基酸序列选自如SEQ ID NOs：3至8所示的序列，而且所述核心多肽或其衍生物均包含人DR5分子上的单克隆抗体AD5-10所识别的抗原决定簇，其中SEQ ID NO：3-8的序列如下所示：
SEQ ID No：3：ESALITQQDLAP (a.a.1-12)
SEQ ID No：4：ALITQQDLAPQQ (a.a.3-14)
SEQ ID No：5：ITQQDLAPQQRA (a.a.5-16)
SEQ ID No：6：QQDLAPQQRAAP (a.a.7-18)
SEQ ID No：7：LITQQDLAPQQRA (a.a.4-16)
SEQ ID No：8：ESALITQQDLAPQQRAAP (a.a.1-18)。
本发明的第二个目的是提供一条核心多肽及其衍生物，其具有包含上述核心多肽的如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列通式X1X2X3X4X5 DLAX6X7X8X9X10，其中：
X1可以存在或不存在，为任意氨基酸残基，
X2可以为除赖氨酸之外的任意氨基酸残基，
X3可以为任意氨基酸残基，
X4可以为任意氨基酸残基，
X5可以为任意氨基酸残基，可以与X4相同或不同，
X6可以为除碱性氨基酸和侧链氨基酸之外的任意氨基酸残基，
X7可以为除碱性氨基酸残基之外的任意氨基酸残基，
X8可以为除碱性氨基酸残基之外的任意氨基酸残基，可与X7相同或不同，
X9可以存在或不存在，为任意氨基酸残基，以及
X10可以存在或不存在，为任意氨基酸残基。
本发明的第三个目的是提供编码所述核心多肽的核苷酸序列，其具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，该序列如下所示：5’-CA(A/G)GA(T/C)CTNGCNCCN-3’，其中N代表A、T、C或G四种碱基。
本发明的第四个目的是提供一种诱导肿瘤细胞凋亡的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以QDLAP作为核心序列，依照如SEQ ID No：7所示的序列LITQQDLAPQQRA合成多肽序列C LITQQDLAPQQRA，并在N末端半胱氨酸残基上偶联钥孔嘁蓝蛋白(KLH)，获得抗原肽；
2)以所述抗原肽免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，制备杂交瘤细胞，经筛选获得能产生该多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明的第五个目的是提供根据本发明第四个目的所述方法产生的杂交瘤细胞株。优选地，所述能产生诱导肿瘤细胞凋亡的单克隆抗体的杂交瘤细胞株为Adie-1和Adie-2，该2株杂交瘤细胞株已于2009年3月20日保存在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(CGMCC)，分类名称为BALB/c小鼠杂交瘤细胞，其编号为分别为2938和2939；更优选地，所述杂交瘤细胞株Adie-1和Adie-2分别产生单克隆抗体Adie-1或Adie-2。
本发明的第六个目的是提供由本发明第五个目的所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。优选地，所述单克隆抗体为Adie-1或Adie-2。
本发明第七个目的是上述核心多肽及其衍生物在制备与DR5结合的单克隆抗体中的用途。
本发明的第八个目的是上述核心多肽及其衍生物在筛选与DR5结合的、用于肿瘤和/或艾滋病的治疗的小分子化合物中的用途。
本发明的第九个目的是上述核心多肽及其衍生物在制备肿瘤和/或艾滋病预防性疫苗或者治疗性疫苗中的用途。
本发明的第十个目的是提供根据本发明第三个目的所述的核苷酸序列在制备用于肿瘤和/或艾滋病的治疗和/或预防的反义核苷酸和小分子核糖核苷酸中的用途。
本发明的第十一个目的是提供根据本发明第六个目的所述的单克隆抗体在制备抗肿瘤和/或抗艾滋病药物中的用途。
换言之，本发明涉及多肽的氨基酸序列，或者称核心多肽序列，其氨基酸序列为：QDLAP(SEQ ID No：1)。
术语：所述的核心多肽的氨基酸序列是指以QDLAP(SEQ ID No：1)为基础的氨基酸序列。
本发明通过运用定向多肽芯片文库(Oriented Peptide Array Library，OPAL)技术并在化学合成人死亡受体DR5(NCBI Acc #：NP_671716.1)的“交叉重叠(overlapping)”肽库的基础上，结合分子生物学和细胞生物学方法而完成。
详述之，本发明首先利用多肽芯片文库筛选得到一条核心多肽，该多肽的氨基酸序列与目前已知的人死亡受体DR5胞外区非CRD结构域有100％的同源性。用含有该序列的多肽制备的单克隆抗体，具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力，提示该多肽序列的功能与人死亡受体DR5密切相关，而且DR5受体的N末端线性序列可能具有引起DR5分子发生构象改变的潜力和募集胞内信号分子的能力。此外，进一步的研究发现小鼠抗人死亡受体DR5的单克隆抗体AD5-10(中国专利公开号：CN 1673232A)能够特异性地同该多肽结合，提示该核心多肽可能包含AD5-10识别的抗原决定簇。随后利用分子生物学、细胞生物学以及定向多肽芯片文库(Oriented Peptide Array Library，OPAL)技术，高通量地验证了该核心多肽序列为AD5-10以及由其生成的其它单克隆抗体所识别的抗原决定簇；本发明进一步利用多肽合成技术及基因工程定点突变技术验证该核心多肽确为单克隆抗体AD5-10的抗原决定簇。随后，参照DR5分子的氨基酸序列，合成含有该核心多肽的抗原肽免疫小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞，经筛选后获得一批能产生特异性识别抗原肽(代表性结果见图1)并且具有肿瘤杀伤活性(代表性结果见图2)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中2株杂交瘤细胞株命名为Adie-1和Adie-2。这2株杂交瘤细胞株已经于2009年3月20日保存在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(CGMCC)，分类名称为BALB/c小鼠杂交瘤细胞，其编号为分别为2938和2939。随后应用分子生物学和细胞生物学的方法，确定AD5-10(中国专利公开号：CN 1673232A)也能够特异性地识别并结合该段核心序列(代表性结果见图3)。由此证明该核心序列中含有AD5-10所识别的线性抗原决定簇。在此基础上，通过采用定向多肽芯片文库(Oriented Peptide Array Library，OPAL)技术从“交叉重叠(overlapping)”多肽库中筛选得到上述特异性抗原决定簇(代表性结果见图4)。根据上述实验结果指导化学合成含有该抗原决定簇的多肽以及将关键位置氨基酸突变后的突变体多肽，随后检测其与AD5-10的结合情况，发现含该抗原决定簇的多肽均能结合AD5-10，而关键位置氨基酸突变的突变体多肽不能结合AD5-10(代表性结果见图5)。最后，构建表达全长野生型DR5以及含有上述突变的全长突变体DR5的真核表达载体，随后采用蛋白免疫印迹(Western blotting)技术检测AD5-10识别并结合抗原决定簇的情况，发现全长野生型DR5能识别AD5-10并结合抗原决定簇，而含有上述突变的全长突变体DR5则不能(代表性结果见图6)。根据本发明获得的该核心多肽及其衍生物可用于研制与DR5结合的单克隆抗体，用于筛选与DR5结合的、用于肿瘤和/或艾滋病的治疗的小分子化合物，用于制备肿瘤和/或艾滋病预防性疫苗或者治疗性疫苗。编码根据本发明所述的核心多肽及其衍生物的核苷酸序列可用于制备用于肿瘤和/或艾滋病的治疗和预防的反义核苷酸和小分子核糖核苷酸。根据本发明所述的单克隆抗体也可用于制备抗肿瘤和/或抗艾滋病药物。
附图说明
图1：显示经N末端偶联钥孔嘁蓝蛋白(KLH)的抗原肽免疫小鼠得到的单克隆抗体识别并结合抗原肽和DR5的情况。A图和C图显示产生相应单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清同抗原肽或重组DR5胞外区蛋白分子的结合情况。B图和D图显示的是单克隆抗体Adie-1和Adie-2在不同稀释浓度下同抗原肽或重组DR5胞外区蛋白分子的结合情况。
图2：显示同TRAIL及AD5-10相比，单克隆抗体Adie-1和Adie-2针对人结肠癌细胞HCT116具有肿瘤杀伤活性。A图显示不同处理组的细胞在显微镜下(40×)的形态学特征。B图和C图显示不同处理条件下，HCT116细胞的细胞活力。
图3：显示同TRAIL及AD5-10相比，单克隆抗体Adie-1和Adie-2同样具有激活Jurkat和HCT116细胞内半胱天冬蛋白酶(Caspase)级联反应的能力。
图4：显示通过采用定向多肽芯片库(Oriented Peptide Array Library，OPAL)技术筛选确定AD5-10能够特异性地识别并结合含有核心多肽序列的多肽。这些核心多肽衍生序列主要集中分布在DR5胞外区N末端的非富含半胱氨酸结构域(non-Cysteine-Rich Domain)。这些多肽衍生物的氨基酸序列分别为：
ESALITQQDLAP (a.a.1-12) (SEQ ID No：3)
ALITQQDLAPQQ (a.a.3-14) (SEQ ID No：4)
ITQQDLAPQQRA (a.a.5-16) (SEQ ID No：5)
QQDLAPQQRAAP (a.a.1-12) (SEQ ID No：6)
其中ALITQQDLAPQQ(a.a.3-14) (SEQ ID NO：4)和ITQQDLAPQQRA(a.a.5-16)(SEQ ID NO：5)与AD5-10的结合能力最强(即抗原性最强)。由此确定AD5-10所识别的抗原决定簇的氨基酸序列为LITQQDLAPQQRA(a.a.4-16)(SEQ ID No：7)。而AD5-10识别的抗原决定簇的最短氨基酸序列为核心多肽QDLAP(SEQ IDNo：1)。B图显示针对上述抗原决定簇LITQQDLAPQQRA(a.a.4-16)(SEQ ID No：7)进行丙氨酸突变扫描(alanine mutation scan)，依次将13个氨基酸残基替换成丙氨酸(A)残基。发现当抗原决定簇及其多肽衍生物中紧密相邻的天门冬氨酸(D)、亮氨酸(L)和丙氨酸(A)突变后，其与AD5-10结合的能力降低或失去结合能力，证明这3个氨基酸残基在该抗原决定簇中起关键作用，且亮氨酸(L)是至关重要的。同样，上述3个氨基酸残基中亮氨酸(L)和丙氨酸(A)残基在Adie-1和Adie-2识别并结合抗原肽的过程中扮演着重要角色。C图显示针对AD5-10识别的抗原决定簇LITQQDLAPQQRA(a.a.4-16)(SEQ ID No：7)构建突变文库，用20种常见氨基酸残基对上述多肽序列进行逐一替换。结果证明AD5-10识别的抗原决定簇包含一个以下通式(I)所示的氨基酸序列：
X1X2X3X4X5 DLAX6X7X8X9X10(SEQ ID NO：9)
其中，
X1可以存在或不存在，为任意氨基酸残基，
X2可以为除赖氨酸之外的任意氨基酸残基，
X3可以为任意氨基酸残基，
X4可以为任意氨基酸残基，
X5可以为任意氨基酸残基，可以与X4相同或不同，
X6可以为除碱性氨基酸和侧链氨基酸之外的任意氨基酸残基，
X7可以为除碱性氨基酸残基之外的任意氨基酸残基，
X8可以为除碱性氨基酸残基之外的任意氨基酸残基，可与X7相同或不同，
X9可以存在或不存在，为任意氨基酸残基，
X10可以存在或不存在，为任意氨基酸残基。
图5：显示含有上述抗原决定簇的合成多肽(见表3)与AD-10结合，并可阻断其杀伤肿瘤细胞的作用。A图显示以不同浓度的AD5-10和重组可溶性TRAIL(rsTRAIL)处理人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞8小时后的细胞存活率；B图显示用AD5-10(250ng/ml)和7条合成多肽处理Jurkat细胞8小时后的细胞存活率；C图显示2种不同浓度的野生型表位1(w.t.epitope 1)和野生型表位2(w.t.epitope 2)与AD5-10结合并阻断其细胞毒作用；D图显示野生型表位1(w.t.epitope1，10μM)与AD5-10结合并阻断其细胞毒作用，而其相应突变型表位1(mutant epitope 1)(10μM)则不能与AD5-10结合；E图显示野生型表位2(w.t.epitope 2，10μM)与AD5-10结合并阻断其细胞毒作用，而其相应突变型表位2(mutant epitope 2，10μM)则不能与AD5-10结合。G图和H图显示无论是野生型表位或其突变型表位，均不能阻断rsTRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。I图和J图显示含有人DR5胞外区富含半胱氨酸结构域氨基酸的多肽不能阻断AD5-10或rsTRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。
图6：显示AD5-10能够识别并结合全长野生型DR5分子，而不能结合其DR5抗原决定簇的突变体。
具体实施方式
实验例1 酶联免疫分析(ELISA)技术鉴定抗原肽免疫小鼠得到单克隆抗体识别并结合抗原肽和DR5的情况
收集不同编号的杂交瘤培养上清或者纯化的抗体，按照一定稀释比例稀释后，进行ELISA检测。具体步骤如下：
1)用抗原肽或原核表达的重组DR5按照100ng/well的包被酶标板；
2)5％的BSA，37℃条件下封闭1小时；
3)加入不同浓度的抗体，37℃条件下孵育1小时；
4)PBS-T洗3～5次；
5)加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃条件下孵育1小时；
6)PBS-T洗3～5次；
7)加入显色底物，待出现显著差异时加入2M硫酸终止反应测定OD值。
实验结果如图1所示，图1A和图1C表明经N末端偶联钥孔嘁蓝蛋白(KLH)的抗原肽免疫小鼠，所产生相应单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清同抗原肽或重组DR5胞外区蛋白分子的结合情况。图1B和图1D显示的是单克隆抗体Adie-1(克隆编号为56#)和Adie-2(克隆编号为64#)在不同稀释浓度下同抗原肽或重组DR5胞外区蛋白分子的结合情况。
实验例2 TRAIL、AD5-10及单克隆抗体Adie-1和Adie-2针对人结肠癌细胞HCT116的肿瘤杀伤活性
用不同浓度的TRAIL、AD5-10及单克隆抗体Adie-1和Adie-2处理HCT116细胞。24小时后镜下观察并加入CCK-8试剂(日本同仁化学研究所)，反应2小时后测OD值(波长570nm)。将无细胞孔的OD值设定为“0”，细胞存活率等于处理孔的OD值与未处理孔OD值的比值。
实验结果如图2所示，HCT116细胞在用TRAIL(500ng/ml)、AD5-10(500ng/ml)及单克隆抗体Adie-1(500ng/ml)和Adie-2(500ng/ml)处理8小时后，在显微镜下可观察到明显的形态学改变和细胞死亡特征(A图)。图2B和图2C显示不同处理条件下，HCT116细胞的细胞活力随着处理浓度的增加而显著降低。
实验例3 蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测TRAIL、AD5-10及单克隆抗体Adie-1和Adie-2激活半胱天冬蛋白酶(Caspase)级联反应
对数生长期的Jurkat和HCT116细胞用TRAIL(500ng/ml)、AD5-10(500ng/ml)及Adie-1(1μg/ml)和Adie-2(1μg/ml)处理0、30、60分钟，收集细胞，裂解，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上的蛋白转到PVDF膜上，加入特定的抗体进行杂交，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，加入发光底物显影。
实验结果如图3所示，同TRAIL及AD5-10相比，单克隆抗体Adie-1和Adie-2同样能激活Jurkat和HCT116细胞内半胱天冬蛋白酶(Caspase)级联反应。
实验例4 采用定向多肽芯片库(Oreinted Peptide Array Library，OPAL)技术筛选鉴定出AD5-10所识别的抗原决定簇及其衍生物
依照NCBI蛋白质数据库提供的人DR5(NCBI Acc#：NP_671716.1)的氨基酸序列，合成一系列含有核心多肽的衍生多肽(表1和2所示)。随后利用ASP222 SPOT机器人工作站将上述多肽库均匀点样于硝酸纤维膜上(一个斑点对应一条多肽，其浓度约为5nmol)，进行相应检测前用茚三酮染色确定蛋白量的均一性。用TBS-T溶液配制的含3％的BSA的封闭液室温封闭1小时，然后加入相应的特异性一抗(终浓度2μg/ml)4℃孵育过夜。随后加入HRP标记的山羊抗小鼠多克隆抗体，室温孵育2小时后加入发光底物ECL显影。
表1依照人DR5分子的氨基酸序列构建含有核心多肽的衍生多肽库
表2丙氨酸突变肽库扫描
其中，黑体加下划线表示的序列代表抗原决定簇的最核心序列；方框框起来的字母表示突变后的氨基酸残基。
实验结果如图4所示，AD5-10能够特异性的识别并结合含有核心多肽序列的多肽(图4A)。这些核心多肽衍生序列主要集中分布在DR5胞外区N末端的非富含半胱氨酸结构域(non-Cysteine-Rich Domain)。这些多肽衍生物的氨基酸序列分别为：
ESALITQQDLAP (a.a.1-12)(SEQ ID No：3)
ALITQQDLAPQQ (a.a.3-14)(SEQ ID No：4)
ITQQDLAPQQRA (a.a.5-16)(SEQ ID No：5)
QQDLAPQQRAAP (a.a.1-12)(SEQ ID No：6)
其中ALITQQDLAPQQ(a.a.3-14)(SEQ ID NO：4)和ITQQDLAPQQRA(a.a.5-16)(SEQ ID NO：5)与AD5-10的结合能力最强(即抗原性最强)。由此确定AD5-10所识别的抗原决定簇的氨基酸序列为LITQQDLAPQQRA(a.a.4-16)(SEQ ID No：7)。而AD5-10识别的抗原决定簇的最短氨基酸序列为核心多肽QDLAP(SEQ IDNo：1)。图4B显示针对上述抗原决定簇LITQQDLAPQQRA(a.a.4-16)(SEQ ID No：7)进行丙氨酸突变扫描(alanine mutation scan)，依次将13个氨基酸残基替换成丙氨酸(A)残基。发现当抗原决定簇及其多肽衍生物中紧密相邻的天门冬氨酸(D)、亮氨酸(L)和丙氨酸(A)突变后，其与AD5-10结合的能力降低或失去结合能力，证明这3个氨基酸残基在该抗原决定簇中起关键作用，且亮氨酸(L)是至关重要的。同样，上述3个氨基酸残基中亮氨酸(L)和丙氨酸(A)残基在Adie-1和Adie-2识别并结合抗原肽的过程中扮演者重要角色。C图显示针对AD5-10识别的抗原决定簇LITQQDLAPQQRA(a.a.4-16)(SEQ ID No：7)构建突变文库，用20种常见氨基酸残基对上述多肽序列进行逐一替换。结果证明AD5-10识别的抗原决定簇包含一个以下通式(I)所示的氨基酸序列：
X1X2X3X4X5 DLAX6X7X8X9X10(SEQ ID NO：9)
其中，
X1可以存在或不存在，为任意氨基酸残基，
X2可以为除赖氨酸之外的任意氨基酸残基，
X3可以为任意氨基酸残基，
X4可以为任意氨基酸残基，
X5可以为任意氨基酸残基，可以与X4相同或不同，
X6可以为除碱性氨基酸和侧链氨基酸之外的任意氨基酸残基，
X7可以为除碱性氨基酸残基之外的任意氨基酸残基，
X8可以为除碱性氨基酸残基之外的任意氨基酸残基，可与X7相同或不同，
X9可以存在或不存在，为任意氨基酸残基，
X10可以存在或不存在，为任意氨基酸残基。
实验例5 化学合成含有本发明涉及的抗原决定簇的多肽衍生物并检测其与AD-10结合并阻断其肿瘤细胞毒作用的能力
在运用多肽芯片的方法将AD5-10所识别的抗原决定簇范围锁定在氨基酸序列为“LITQQDLAPQQRA”这一范围内之后，采用化学合成法合成该多肽。同时，构建野生型序列和含有突变序列多肽衍生物，从而进一步明确AD5-10识别的抗原表位。从前面的实验结果中我们可以得知，第4位亮氨酸(L)对AD5-10与DR5的结合不起作用，因此，为了增加合成肽段的水溶性，我们将其替换为极性不带电荷的氨基酸(例如谷氨酰胺，Gln)或丙氨酸(A)。多肽合成的具体信息如表3所示：
表3多肽合成
其中，黑体加下划线表示的序列代表抗原决定簇的最核心序列；方框框起来的字母表示突变后的氨基酸残基。
将处于对数生长期的人淋巴细胞白血病Jurkat细胞按照每孔2×104个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中。随后把合成多肽与AD5-10按照相应浓度充分混合，37℃孵育1小时后加入到含有肿瘤细胞的培养孔中处理8小时。加入CCK-8试剂(日本同仁化学研究所)，反应2小时后测OD值(波长570nm)。将无细胞孔的OD值设定为“0”，细胞存活率等于处理孔的OD值与未处理孔OD值的比值。
结果如图5所示，图5A表明以AD5-10和重组可溶性TRAIL(rsTRAIL)可以以剂量依赖的方式抑制人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞的细胞活力；图5B表明，同AD5-10(250ng/ml)相比，7条合成多肽对Jurkat细胞的细胞活力没有影响；图5C显示2种不同浓度的野生型表位1(w.t.epitope 1)和野生型表位2(w.t.epitope 2)与AD5-10结合并阻断其细胞毒作用；图5D显示野生型表位1(w.t.epitope 1，10μM)与AD5-10结合并阻断其细胞毒作用，而其相应突变型表位1(mutant epitope 1)(10μM)则不能与AD5-10结合；图5E显示野生型表位2(w.t.epitope 2，10μM)与AD5-10结合并阻断其细胞毒作用，而其相应突变型表位2(mutant epitope 2，10μM)则不能与AD5-10结合。图5G和图5H显示无论是含有抗原决定簇的野生型表位或其突变型表位，均不能阻断rsTRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。图5I和5J显示含有人DR5胞外区富含半胱氨酸结构域氨基酸的多肽不能阻断AD5-10或rsTRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。
实验例6蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测AD5-10与全长野生型DR5以及全长突变体DR5的结合能力
构建表达带有3×FLAG标签的全长野生型DR5以及全长突变体DR5的真核表达载体，转染293T-17细胞。转染48小时后收集细胞，裂解，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上的蛋白转到PVDF膜上，加入特定的抗体进行杂交，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，加入发光底物ECL显影。
结果如图6所示，AD5-10能够识别并结合全长野生型DR5分子，而不能结合其DR5抗原决定簇的突变体。
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Claims (11)
1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.一种编码如权利要求1所述的多肽的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，其中N选自A、T、C或G。
3.一种制备如权利要求1所述的多肽的单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：
1）以QDLAP作为核心序列，依照如SEQ ID No:7所示的序列LITQQDLAPQQRA合成多肽序列CLITQQDLAPQQRA，并在N末端半胱氨酸残基上偶联钥孔嘁蓝蛋白，获得抗原肽；
2）以所述抗原肽免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，制备杂交瘤细胞，经筛选获得该多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞。
4.一种BALB/c小鼠杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2009年3月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：2938。
5.一种BALB/c小鼠杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2009年3月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：2939。
6.由权利要求4或5所述的BALB/c小鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
7.如权利要求1所述的多肽在制备与DR5结合的单克隆抗体中的用途。
8.如权利要求1所述的多肽在制备肿瘤预防性疫苗和/或治疗性疫苗中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，所述肿瘤来自结肠癌或T淋巴细胞白血病。
10.如权利要求6所述单克隆抗体在制备抗肿瘤的药物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，所述肿瘤来自结肠癌或T淋巴细胞白血病。
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